[RU]

В заявке описаны CX3CR1-связывающие полипептиды, в частности полипептиды, которые содержат конкретные иммуноглобулиновые домены. В заявке описаны также нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды; способы получения указанных полипептидов; клетки-хозяева, которые экспрессируют или обладают способностью экспрессировать указанные полипептиды; композиции, содержащие указанные полипептиды; и применения указанных полипептидов или указанных композиций, в частности, для профилактических, терапевтических и диагностических целей.

(57) Реферат / Формула:

В заявке описаны CX3CR1-связывающие полипептиды, в частности полипептиды, которые содержат конкретные иммуноглобулиновые домены. В заявке описаны также нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды; способы получения указанных полипептидов; клетки-хозяева, которые экспрессируют или обладают способностью экспрессировать указанные полипептиды; композиции, содержащие указанные полипептиды; и применения указанных полипептидов или указанных композиций, в частности, для профилактических, терапевтических и диагностических целей.

---

120984
Заявка № 201400964
Заявитель Бёрингер Ингельхайм
Интернациональ ГмбХ, DE
CX3CR1-СВЯЗЫВАЮЩИЕ ПОЛИПЕПТИДЫ
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к CX3CR1-связывающим полипептидам, в частности, полипептидам, которые содержат специфические иммуноглобулиновые домены. Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, которые кодируют указанные полипептиды; к способам получения указанных полипептидов; к клеткам-хозяевам, которые экспрессируют или обладают способностью экспрессировать указанные полипептиды; к композициям, которые содержат указанные полипептиды; и к применениям указанных полипептидов или указанных композиций, в частности, для профилактических, терапевтических и диагностических целей.
Предпосылки создания изобретения
CX3CR1 представляет собой сопряженный с G-белком интегральный мембранный белок, который является хемокиновым рецептором. Он
экспрессируется главным образом на таких клеточных типах как моноциты, дендритные клетки и Т-клетки, которые ассоциированы с инициацией и развитием атеросклеротических бляшек. На моноцитах имеет место его повышающая регуляция с помощью окисленных липидов, и он опосредует 5 миграцию указанных клеток в бляшки и их выживание внутри бляшек. Его уникальный лиганд фракталкин (FKN) экспрессируется на поверхности сосудистых эндотелиальных и гладкомышечных клеток в областях повреждений, в которых он модулирует адгезию лейкоцитов. В результате протеолитического расщепления фракталкин высвобождается также в кровоток, где он
10 функционирует в качестве хемотаксического агента.
Установлено, что у людей вариант CX3CR1 (V249I/T280M) с пониженной активностью ассоциирован с более низким риском сердечнососудистого заболевания (коронарная болезнь сердца, цереброваскулярная болезнь или заболевание периферических сосудов) (McDermott, Circ Res 89, 2001, с. 401),
15 заболевания коронарной артерии (ангиографическое проявление стеноза) (McDermott, J. Clin. Invest. Ill, 2003, с. 1241) и окклюзивного заболевания сонной артерии (Ghilardi, Stroke 35, 2004, с. 1276). CX3CR1 локализуется совместно с фракталкином, что проявляется по усиленному иммуноокрашиванию поликлональными антителами в атеросклеротических
20 бляшках (Wong, Cardiovasc. Path. 11, 2002, с.332). В областях артерий, в которых отсутствуют бляшки, не обнаружено никакого окрашивания фракталкина.
В нескольких независимых проведенных на мышах генетических исследованиях продемонстрировано благоприятное действие дефицита CX3CR1 на атеросклероз. Более низкие уровни повреждений дуги аорты и брюшной
25 аорты, а также снижение накопления моницитов/макрофагов в бляшках
обнаружено в опытах на двух независимо выведенных линиях мышей CX3CR1" ~ ароЕ_/", выращенных на корме с высоким содержанием жира (Combadiere, Circulation, 107, 2003, с. 1009; Lesnik, J. Clin. Invest. Ill, 2003, c. 333).
Установлено, что CX3CR1 принимает участие в сердечнососудистых
30 заболеваниях, и модуляция его активности может представлять собой
перспективную терапию. Поэтому существует необходимость в молекулах, являющихся антагонистами CX3CR1, обладающих благоприятными фармакологическими свойствами, которые можно применять в качестве
терапевтических агентов для лечения заболеваний, в частности, сердечнососудистых заболеваний, у людей.
Таким образом, одной из задач, положенных в основу настоящего изобретения, было разработать молекулы, обладающие антагонистической активностью в отношении CX3CR1 (анти-СХЗСК1 антагонистические молекулы), в частности, молекулы, обладающие антагонистической активностью в отношении CX3CR1, для которых характерна высокая аффинность связывания с CX3CR1.
Другой задачей, положенной в основу настоящего изобретения, было разработать молекулы, обладающие антагонистической активностью в отношении CX3CR1, которые являются высоко специфическими в отношении CX3CR1.
Еще одной задачей, положенной в основу настоящего изобретения, было разработать антагонисты CX3CR1, обладающие высокой активностью.
Другой задачей, положенной в основу настоящего изобретения, было разработать антагонисты CX3CR1, обладающие благоприятными биодоступностью и временем полужизни.
Еще одной задачей, положенной в основу настоящего изобретения, было разработать антагонисты CX3CR1, обладающие благоприятными биофизическими свойствами.
В качестве других задач настоящего изобретения рассматривали комбинации, включающие любые из указанных выше задач.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые связываются с человеческим CX3CR1 и обладают способностью блокировать связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1. В одном из объектов изобретения полипептид представляет собой иммуноглобулин, который содержит антигенсвязывающий домен, содержащий три гипервариабельных участка CDR1, CDR2 и CDR3, где указанный иммуноглобулин связывается с человеческим CX3CR1 и обладает способностью блокировать связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1. Согласно следующему объекту изобретения полипептид содержит один или несколько aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, где указанный
полипептид обладает способностью блокировать связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1.
В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
изобретении, отличается одним или несколькими следующими свойствами:
5 • связывается с высокой аффинностью с человеческим CX3CR1;
• блокирует связывание растворимого фракталкина с человеческим CX3CR1;
• ингибирует индуцированный фракталкином хемотаксис;
• ингибирует индуцированную фракталкином интернализацию рецептора 10 CX3CR1;
• обладает перекрестной реактивностью с CX3CR1 обезьян циномолгус (супо), при этом величина E/IC50, характеризующая связывание и функциональное ингибирование человеческого CX3CR1, в 10 раз превышает соответствующую величину для cynoCX3CRl.
15 Согласно следующему объекту изобретения полипептид, предлагаемый в
настоящем изобретении, содержит aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен и дополнительно содержит удлиняющий время полужизни фрагмент, например, альбуминсвязывающий фрагмент, молекулу полиэтиленгликоля или Fc-домен. Согласно следующему объекту изобретения
20 полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два или большее количество aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В одном из объектов изобретения два aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена связаны ковалентно через линкерный пептид. В одном из объектов изобретения два aHTH-CX3CRl
25 иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена в полипептиде,
предлагаемом в настоящем изобретении, имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В другом объекте изобретения два aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена в полипептиде, предлагаемом в настоящем изобретении, имеют различные аминокислотные
30 последовательности. В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена и дополнительно
содержит удлиняющий время полужизни фрагмент, например, альбуминсвязывающий фрагмент, молекулу полиэтиленгликоля или Fc-домен.
В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
изобретении, содержит первый анти-СХЗСШ иммуноглобулиновый единичный
5 вариабельный домен, ковалентно связанный с альбуминсвязывающим
фрагментом с помощью первого линкерного пептида, где указанный
альбуминсвязывающий фрагмент дополнительно ковалентно связан со вторым
анти-СХЗСШ иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом с
помощью второго линкерного пептида.
10 В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
изобретении, содержит анти-СХЗСШ иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, ковалентно связанный с Fc-доменом с помощью линкерного пептида. В одном из объектов изобретения указанный полипептид, содержащий анти-СХЗСШ иммуноглобулиновый единичный вариабельный 15 домен, ковалентно связанный с Fc-доменом с помощью линкерного пептида, имеет форму димера, например, связанного дисульфидными мостиками.
Полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, применяют для лечения, облегчении и/или диагностирования ассоциированных с CX3CR1 заболеваний, нарушений или состояний, в частности, сердечнососудистых 20 заболеваний, таких как атеросклероз.
Следующим объектом настоящего изобретения являются:
Вариант осуществления изобретения 1: Иммуноглобулин, содержащий антигенсвязывающий домен, который содержит три гипервариабельных участка CDR1, CDR2 и CDR3, где указанный иммуноглобулин связывается с 25 человеческим CX3CR1 и обладает способностью блокировать связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1.
Вариант осуществления изобретения 2: Полипептид, содержащий один или несколько aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, где указанный полипептид обладает способностью блокировать 30 связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1.
Вариант осуществления изобретения 3: Полипептид по варианту осуществления изобретения 2, в котором указанный aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен практически состоит из
четырех каркасных участков (FR1, FR2, FR3 и FR4) и трех гипервариабельных участков (CDR1, CDR2 и CDR3).
Вариант осуществления изобретения 4: Полипептид по варианту осуществления изобретения 3, в котором указанный aHTH-CX3CRl 5 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен имеет структуру FR1 -CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.
Вариант осуществления изобретения 5: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 2-4, в котором указанный aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой 10 домен антитела.
Вариант осуществления изобретения 6: Полипептид по варианту осуществления изобретения 5, в котором указанный aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VH, VL, VHH, камелизированный VH, или VHH, который является 15 оптимизированным в отношении стабильности, эффективности,
технологичности и/или сходства с человеческими каркасными участками.
Вариант осуществления изобретения 7: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 1-6, где указанный полипептид обладает
аффинностью к человеческому CX3CR1, что характеризуется:
20 а) величиной ЕС50, более низкой или равной ЮнМ, более низкой или
равной 5нМ, более низкой или равной 2,5нМ, или более низкой или равной 1нМ, по данным, полученным путем анализа клеточного связывания с помощью FACS; или
б) величиной IC50, более низкой или равной ЮнМ, более низкой или равной 25 5нМ, более низкой или равной 2,5нМ, или более низкой или равной 1нМ, по данным, полученным с помощью FACS в условиях конкуренции.
Вариант осуществления изобретения 8: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-7, где указанный полипептид блокирует связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1, что 30 характеризуется величиной IC50, более низкой или равной ЗООнМ, или более
низкой или равной ЮОнМ, или более низкой или равной 20нМ, или более низкой или равной ЮнМ, или более низкой или равной 5нМ, или более низкой или равной 2,5нМ, или более низкой или равной 1нМ.
Вариант осуществления изобретения 9: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-8, где указанный полипептид ингибирует индуцированный фракталкином хемотаксис, опосредуемый человеческим CX3CR1, что характеризуется величиной IC50, более низкой или 5 равной 500нМ, или более низкой или равной ЮОнМ, или более низкой или
равной 75нМ, или более низкой или равной 50нМ, или более низкой или равной ЮнМ, или более низкой или равной 5нМ.
Вариант осуществления изобретения 10: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1 -9, где указанный полипептид 10 ингибирует интернализацию фракталкина, опосредуемую человеческим
CX3CR1, что характеризуется величиной IC50, более низкой или равной ЮнМ, или более низкой или равной 5нМ, или более низкой или равной 1нМ.
Вариант осуществления изобретения 11: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 3-Ю, в котором указанный CDR3 имеет 15 аминокислотную последовательность Asp-Xaal-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Хаа4-Хаа5 (SEQ ID NO: 197), в которой:
- Xaal обозначает Pro, Ala или Gly;
- Хаа2 обозначает Asp или Asn;
- ХааЗ обозначает Thr или Ser;
20 - Хаа4 обозначает Arg, Lys, Ala или Gly; и
- Хаа5 обозначает Туг или Phe.
Вариант осуществления изобретения 12: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 3-11, в котором: а)
25 - Xaal обозначает Pro, Ala или Gly;
- Хаа2 обозначает Asp или Asn;
- ХааЗ обозначает Thr;
- Хаа4 обозначает Arg или Lys; и
- Хаа5 обозначает Туг, 30 и/или
б) в котором указанный CDR3 выбран из любой из SEQ ID NO: 186-190. Вариант осуществления изобретения 13: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 3-12, в котором указанный CDR3 имеет
аминокислотную последовательность Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 186).
Вариант осуществления изобретения 14: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 3-10, в котором:
5 I) указанный CDR1:
а) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141;
б) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на
80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 141;
в) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 2 или 1
10 аминокислотных(ое) различия (е) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 141, в которой
- в положении 2 S заменен на Т или G;
- в положении 6 S заменен на R;
- положении 7 N заменен на Т; и/или 15 - в положении 9 М заменен на К; или
г) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной
из SEQ IDNO: 141-145 и 213;
II) CDR2:
а) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164;
20 б) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на
70% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 164;
в) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 4, 3, 2 или 1
аминокислотных (ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ
ID NO: 164, в которой
25 - в положении 1 G заменен на A, L, V или S;
- в положении 3 N заменен на D, S, Q, G или Т;
- в положении 4 S заменен на Т, К, G или Р;
- в положении 5 V заменен на А;
- в положении 6 G заменен D;
30 - в положении 7 I заменен на Т или V;
- в положении 8 Т заменен на А; и/или
- в положении 9 К заменен на R; или
г) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной из SEQ ID NO: 162-175 и 214-221; и III) указанный CDR3:
а) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 186;
б) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на
70% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 186;
в) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 3, 2 или 1
аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ
ID NO: 186, в которой
- в положении 2 Р заменен на А или G;
- в положении 7 D заменен на N; и/или
- в положении 9 R заменен на К; или
г) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной
из SEQ ID NO: 186-190.
Вариант осуществления изобретения 15: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 3-10, в котором
I) указанный CDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:
146;
И) указанный CDR2 имеет аминокислотную последовательность, которая а) по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 176 или б) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176 или 177; и
III) указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 191.
Вариант осуществления изобретения 16: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 3-10, в котором I) указанный CDR1:
а) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 147; или
б) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 6, 5, 4, 3, 2
или 1 аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью
SEQ ID NO: 147, в которой
- в положении 1 G заменен на К, R или А;
- в положении 2 Т заменен на I, Р, S или L;
- в положении 3 I заменен на V или Т;
- в положении 4 F заменен на L;
- в положении 5 S заменен на R или D;
- в положении 6 N заменен на S, Т или D; и/или
- в положении 7 N заменен на Т или Y; или
в) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной из SEQ ID NO: 147-161;
II) указанный CDR2:
а) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179; или
б) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 4, 3, 2 или 1
аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ
ID NO: 179, в которой
- в положении 3 S заменен на Т или G;
- в положении 4 N заменен на S или I;
- в положении 5 S заменен на Т;
- в положении 6 G заменен на Y; и/или
- в положении 8 Т заменен на А; или
в) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной
из SEQ IDNO: 178-185; и
III) указанный CDR3:
а) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192; или
б) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на
80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 192; или
в) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 2 или 1
аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ
ID NO: 192, в которой
- в положении 2 А заменен на G;
- в положении 8 Т заменен на S;
- в положении 9 А заменен на G; и/или
- в положении 10 Y заменен на F; или
г) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной
из SEQ IDNO: 192-196.
Вариант осуществления изобретения 17: Полипептид по варианту осуществления изобретения 3, в котором аминокислотные последовательности указанных CDR1, CDR2 и CDR3 представлены в:
- SEQ ID NO: 141, 162 и 186 соответственно; или 5 - SEQ ID NO: 141, 163 и 187 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 164 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 166 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 167 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 167 и 189 соответственно; или 10 - SEQ ID N0: 141, 168 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 168 и 187 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 169 и 190 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 170 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 171 и 186 соответственно; или 15 - SEQ ID NO: 141, 174 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 175 и 187 соответственно; или
- SEQ ID NO: 142, 165 и 188 соответственно; или
- SEQ ID NO: 142, 173 и 188 соответственно; или
- SEQ ID NO: 143, 164 и 186 соответственно; или 20 - SEQ ID NO: 144, 172 и 187 соответственно; или
- SEQ ID NO: 145, 172 и 187 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 214 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 215 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 216 и 186 соответственно; или 25 - SEQ ID NO: 141, 217 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 218 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 219 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 220 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 213, 221 и 186 соответственно; или 30 - SEQ ID NO: 213, 214 и 186 соответственно.
Вариант осуществления изобретения 18: Полипептид по варианту осуществления изобретения 3, в котором аминокислотные последовательности указанных CDR1, CDR2 и CDR3 представлены в:
- SEQ ID NO: 146, 176 и 191, соответственно; или
- SEQ ID NO: 146, 177 и 191, соответственно.
Вариант осуществления изобретения 19: Полипептид по варианту осуществления изобретения 3, в котором аминокислотные последовательности 5 указанных CDR1, CDR2 и CDR3 представлены в:
- SEQ ID NO: 147, 178 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 147, 179 и 192, соответственно; или
- SEQ ID NO: 147, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 148, 179 и 193 соответственно; или 10 - SEQ ID NO: 149, 179 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 180 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 181 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 183 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 185 и 192 соответственно; или 15 - SEQ ID NO: 150, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 150, 182 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 151, 179 и 193 соответственно; или
- SEQ ID NO: 151, 182 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 151, 184 и 196 соответственно; или 20 - SEQ ID NO: 152, 179 и 195 соответственно; или
- SEQ ID NO: 153, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 154, 182 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 155, 179 и 195 соответственно; или
- SEQ ID NO: 156, 181 и 192 соответственно; или 25 - SEQ ID NO: 157, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 158, 179 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 159, 178 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 160, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 161, 179 и 194 соответственно.
30 Вариант осуществления изобретения 20: Полипептид по варианту
осуществления изобретения 3, в котором аминокислотные последовательности указанных CDR1, CDR2 и CDR3 представлены в: SEQ ID NO: 141, 164 и 186 соответственно или SEQ ID NO: 141, 162 и 186 соответственно.
Вариант осуществления изобретения 21: Полипептид по варианту
осуществления изобретения 3, в котором аминокислотные последовательности
указанных CDR1, CDR2 и CDR3 представлены в: SEQ ID NO: 213, 214 и 186
соответственно или SEQ ID NO: 141, 162 и 186 соответственно.
5 Вариант осуществления изобретения 22: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 2-10, в котором указанный aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VHH-домен, который содержит такие последовательности, как:
а) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3;
10 б) аминокислотная последовательность, которая по меньшей мере на 90%
идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3;
в) аминокислотная последовательность, которая имеет 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,
3,2 или 1 аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO: 3; или
15 г) аминокислотная последовательность, представленная в любой одной из
SEQ ID NO: 1-48, 121-140 или 222-224.
Вариант осуществления изобретения 23: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 2-10, в котором указанный aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой 20 VHH-домен, который содержит такие последовательности, как:
а) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 49;
б) аминокислотная последовательность, которая по меньшей мере на 95%
идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49;
в) аминокислотная последовательность, которая имеет 5, 4, 3,2 или 1
25 аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 49; или
г) аминокислотная последовательность, представленная в любой одной из
SEQ ID NO: 49-52.
Вариант осуществления изобретения 24: Полипептид по одному из 30 вариантов осуществления изобретения 2-10, в котором указанный aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VHH-домен, который содержит такие последовательности, как:
а) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 67;
б) аминокислотная последовательность, которая по меньшей мере на 90%
идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67;
в) аминокислотная последовательность, которая имеет 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6,
5, 4, 3,2 или 1 аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной
5 последовательностью SEQ ID NO: 67; или
г) аминокислотная последовательность, представленная в любой одной из
SEQ IDNO: 53-120.
Вариант осуществления изобретения 25: Полипептид по варианту осуществления изобретения 2, в котором указанный анти-СХЗСЮ 10 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.
Вариант осуществления изобретения 26: Полипептид по варианту осуществления изобретения 2, в котором указанный анти-СХЗСШ иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит 15 последовательность, представленную в любой одной из SEQ ID NO: 121-140 или SEQ ID NO: 222-224.
Вариант осуществления изобретения 27: Полипептид по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, который гуманизирован и/или оптимизирован в отношении стабильности, эффективности, 20 технологичности и/или сходства с человеческими каркасными участками.
Вариант осуществления изобретения 28: Полипептид по варианту
осуществления изобретения 27, который гуманизирован и/или
последовательность которого оптимизирована в одном или нескольких из
следующих положений (нумерация по Кэботу): 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108.
25 Вариант осуществления изобретения 29: Полипептид по варианту
осуществления изобретения 28, содержащий одну или несколько из следующих мутаций: E1D, SI 1L, А14Р, E16G, A74S, K83R, Q108L.
Вариант осуществления изобретения 30: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 3-29, в котором:
30 I) FR1 выбран из SEQ ID NO: 198-204;
II) FR2 выбран из SEQ ID NO: 205-208;
III) FR3 выбран из SEQ ID NO: 209-210; и/или
IV) FR4 выбран из SEQ ID NO: 211-212.
II)
Вариант осуществления изобретения 31: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 3-30, который гуманизирован и/или
последовательность которого оптимизирована в одном или большем количестве
из следующих положений (нумерация по Кэботу): 52, 53.
5 Вариант осуществления изобретения 32: Полипептид по варианту
осуществления изобретения 31, содержащий одну или большее количество из следующих мутаций: N52S, S53T.
Вариант осуществления изобретения 33: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 3-32, в котором CDR2 выбран из SEQ ID 10 N0:214-221.
Вариант осуществления изобретения 34: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 2-33, в котором указанный анти-СХЗСЯ1 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 138-140 или 22215 224.
Вариант осуществления изобретения 35: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 22-26, в котором VHH-домен состоит из любой одной из указанных аминокислотных последовательностей.
Вариант осуществления изобретения 36: Полипептид по одному из 20 вариантов осуществления изобретения 2-35, в котором указанный
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен перекрестно блокирует связывание по меньшей мере одного из иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, имеющих SEQ ID NO: 1-120, 121-140 и 222-224, с CX3CR1.
25 Вариант осуществления изобретения 37: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 2-35, в котором связывание указанного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена с CX3CR1 перекрестно блокируется по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-120, 121-140 и 222-224.
30 Вариант осуществления изобретения 38: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 2-37, где полипептид содержит также удлиняющий время полужизни фрагмент.
Вариант осуществления изобретения 39: Полипептид по варианту осуществления изобретения 38, в котором удлиняющий время полужизни фрагмент ковалентно связан с указанным полипептидом и выбран из группы, включающей альбуминсвязывающий фрагмент, такой как антиальбуминовый 5 иммуноглобулиновый домен, трансферринсвязывающий фрагмент, такой как антитрансферриновый иммуноглобулиновый домен, молекулу полиэтиленгликоля, рекомбинантную молекулу полиэтиленгликоля, человеческий сывороточный альбумин, фрагмент человеческого сывороточного альбумина, альбуминсвязывающий пептид или Fc-домен.
10 Вариант осуществления изобретения 40: Полипептид по варианту
осуществления изобретения 38 или 39, в котором удлиняющий время полужизни фрагмент состоит из антиальбуминового иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.
Вариант осуществления изобретения 41: Полипептид по варианту
15 осуществления изобретения 40, в котором иммуноглобулиновый единичный
вариабельный домен выбран из VHH-домена, гуманизированного VHH-домена, камелизированного VH-домена, доменного антитела, однодоменного антитела и/или "dAb".
Вариант осуществления изобретения 42: Полипептид по варианту 20 осуществления изобретения 41, в котором антиальбуминовый
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен выбран из SEQ ID NO: 230-232.
Вариант осуществления изобретения 43: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 2-39, где указанный полипептид сцеплен
25 с Fc-областью (такой как человеческая Fc, например, представленная в SEQ ID NO: 252) необязательно через приемлемый линкер или шарнирную область.
Вариант осуществления изобретения 44: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 2-39, где указанный полипептид дополнительно сцеплен с одним или несколькими константными доменами
30 (например, 2 или 3 константными доменами, которые можно применять в качестве части и/или для формирования Fc-области), с Fc-областью и/или с одним или несколькими участками антител, фрагментами или доменами, которые придают одну или несколько эффекторных функций полипептиду,
предлагаемому в изобретении, и/или могут придавать способность связываться с одним или несколькими Fc-рецепторами, необязательно через приемлемый линкер или шарнирную область.
Вариант осуществления изобретения 45: Полипептид по одному из 5 вариантов осуществления изобретения 2-37, где указанный полипептид дополнительно содержит второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предпочтительно второй анти-СХЗСШ иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен.
Вариант осуществления изобретения 46: Полипептид по варианту 10 осуществления изобретения 45, в котором указанный первый и указанный второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены ковалентно связаны с помощью линкерного пептида.
Вариант осуществления изобретения 47: Полипептид по варианту осуществления изобретения 45 или 46, в котором указанный второй 15 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен практически состоит из четырех каркасных участков (FR1-FR4) и трех гипервариабельных участков (CDR1-CDR3).
Вариант осуществления изобретения 48: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 45-47, в котором указанный первый и 20 указанный второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены представляют собой домены антитела.
Вариант осуществления изобретения 49: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 45-48, в которой указанные первый и второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены представляют 25 собой VH, VL, VHH, камелизированный VH или VHH, оптимизированный в отношении стабильности, эффективности, технологичности и/или сходства с человеческими каркасными участками.
Вариант осуществления изобретения 50: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 45-49, в котором указанные CDR1-CDR3 30 указанного второго иммуноглобулинового единичного вариабельного домена представлены в одном из вариантов осуществления изобретения 11-21.
Вариант осуществления изобретения 51: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 45-50, в котором указанный первый и
указанный второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены содержат одинаковый CDR3.
Вариант осуществления изобретения 52: Полипептид по варианту осуществления изобретения 51, в котором CDR3 представлен в одном из 5 вариантов осуществления изобретения 11-13.
Вариант осуществления изобретения 53: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 45-53, в котором указанный первый и
указанный второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены
содержат одинаковые CDR1, CDR2 и CDR3.
10 Вариант осуществления изобретения 54: Полипептид по варианту
осуществления изобретения 53, в котором указанные CDR1-CDR3 представлены в одном из вариантов осуществления изобретения 11-21.
Вариант осуществления изобретения 55: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 45-54, в котором указанный первый и 15 указанный второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены содержат одинаковый VHH-домен.
Вариант осуществления изобретения 56: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 45-55, в котором указанный VHH-домен
представлен в одном из вариантов осуществления изобретения 22-37.
20 Вариант осуществления изобретения 57: Полипептид, содержащий первый
и иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который содержит
CDR1, CDR2 и CDR3, представленные в SEQ ID NO: 141, 164 и 186 или SEQ ID
NO: 141, 162 и 186, и второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный
домен, представленный в одном из вариантов осуществления изобретения 2-37.
25 Указанный полипептид может представлять собой, в частности, полипептид
по одному из вариантов осуществления изобретения 45-56.
Вариант осуществления изобретения 58: Полипептид по варианту осуществления изобретения 57, в котором указанный первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит CDR1, CDR2 и 30 CDR3, представленные в SEQ ID NO: 213, 214 и 186, SEQ ID NO: 213, 221 и 186 или SEQ ID NO: 141, 162 и 186.
Вариант осуществления изобретения 59: Полипептид по варианту осуществления изобретения 57 или 58, в котором указанный второй
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, представленные в SEQ ID NO: 141, 164 и 186 или SEQ ID NO: 141, 162 и 186.
Вариант осуществления изобретения 60: Полипептид по варианту 5 осуществления изобретения 57 или 58, в котором указанный второй
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит CDR1, CDR2 и CDR3, представленные в: SEQ ID NO: 213, 214 и 186, SEQ ID NO: 213, 221 и 186 или SEQ ID NO: 141, 162 и 186.
Вариант осуществления изобретения 61: Полипептид, содержащий первый
10 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, в котором указанный
первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет
собой VHH-домен, который содержит последовательность, представленную в
SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, и второй иммуноглобулиновый единичный
вариабельный домен по одному из вариантов осуществления изобретения 2-37.
15 Указанный полипептид может представлять собой, в частности, полипептид
по одному из вариантов осуществления изобретения 45-60.
Вариант осуществления изобретения 62: Полипептид по варианту осуществления изобретения 61, в котором указанный первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой 20 VHH-домен, содержащий последовательность, представленную в любой одной из SEQ ID N0: 121-140 или 222-224.
Вариант осуществления изобретения 63: Полипептид по варианту осуществления изобретения 61 или 62, в котором указанный второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой 25 VHH-домен, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.
Вариант осуществления изобретения 64: Полипептид по варианту осуществления изобретения 63, в котором указанный второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой 30 VHH-домен, содержащий последовательность, представленную в любой одной из SEQ ID NO: 121-140 или 222-224.
Вариант осуществления изобретения 65: Полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 45- 64, где полипептид содержит дополнительно удлиняющий время полужизни фрагмент.
Вариант осуществления изобретения 66: Полипептид по варианту 5 осуществления изобретения 65, в котором удлиняющий время полужизни
фрагмент ковалентно связан с указанным полипептидом и выбран из группы, включающей альбуминсвязывающий фрагмент, такой как антиальбуминовый иммуноглобулиновый домен, трансферринсвязывающий фрагмент, такой как антитрансферриновый иммуноглобулиновый домен, молекулу 10 полиэтиленгликоля, рекомбинантную молекулу полиэтиленгликоля,
человеческий сывороточный альбумин, фрагмент человеческого сывороточного альбумина, альбуминсвязывающий пептид или Fc-домен.
Вариант осуществления изобретения 67: Полипептид по варианту осуществления изобретения 66, в котором указанный удлиняющий время 15 полужизни фрагмент состоит из антиальбуминового иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.
Вариант осуществления изобретения 68: Полипептид по варианту осуществления изобретения 67, в котором иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен выбран из VHH-домена, гуманизированного VHH-домена, 20 камелизированного VH-домена, доменного антитела, однодоменного антитела и/или "dAb".
Вариант осуществления изобретения 69: Полипептид по варианту осуществления изобретения 68, в котором антиальбуминовый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен выбран из SEQ ID N0: 25 230-232.
Вариант осуществления изобретения 70: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 45-64, где указанный полипептид сцеплен
с Fc-областью (такой как человеческая Fc, например, представленная в SEQ ID
NO: 252) необязательно через приемлемый линкер или шарнирную область.
30 Вариант осуществления изобретения 71: Полипептид по одному из
вариантов осуществления изобретения 45-66, где указанный полипептид дополнительно сцеплен с одним или несколькими константными доменами (например, 2 или 3 константными доменами, которые можно применять в
качестве части и/или для формирования Fc-области), с Fc-областью и/или с одним или несколькими участками антител, фрагментами или доменами, которые придают одну или несколько эффекторных функций полипептиду, предлагаемому в изобретении, и/или могут придавать способность связываться с 5 одним или несколькими Fc-рецепторами, необязательно через приемлемый линкер или шарнирную область.
Вариант осуществления изобретения 72: Полипептид, содержащий любую одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 225-227.
Вариант осуществления изобретения 73: Полипептид, содержащий любую 10 одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 249 или 277-281.
Вариант осуществления изобретения 74: Полипептид, содержащий любую одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 257-262.
Вариант осуществления изобретения 75: Полипептид, содержащий любую
одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 253 или 254.
15 Вариант осуществления изобретения 76: Полипептид, содержащий любую
одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 263 или 266.
Вариант осуществления изобретения 77: Полипептид, содержащий любую одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 267-276 и 282.
Вариант осуществления изобретения 78: Молекула нуклеиновой кислота, 20 содержащая область, которая кодирует полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77.
Вариант осуществления изобретения 79: Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по варианту осуществления изобретения 78.
25 Вариант осуществления изобретения 80: Клетка-хозяин, несущая
экспрессионный вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит область, которая кодирует полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77, где указанная клетка-хозяин обладает способностью экспрессировать полипептид по
30 одному из вариантов осуществления изобретения 1-77, и где указанная клетка-хозяин представляет собой прокариотическую или эукариотическую клетку.
Вариант осуществления изобретения 81: Фармацевтическая композиция, содержащая (I) в качестве действующего вещества один или несколько из
полипептидов по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77 и (II) фармацевтически приемлемый носитель, и необязательно (III) разбавитель, эксципиент, адъювант и/или стабилизатор.
Вариант осуществления изобретения 82: Способ получения полипептида по 5 одному из вариантов осуществления изобретения 1-77, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых
- культивируют клетку-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77,
где указанная клетка-хозяин несет экспрессионный вектор, который 10 содержит молекулу нуклеиновой кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит область, которая кодирует полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77, и где указанная клетка-хозяин представляет собой прокариотическую или эукариотическую клетку;
- выделяют указанный полипептид; и 15 - очищают указанный полипептид.
Вариант осуществления изобретения 83: Способ применения полипептида
по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77 для лечения,
предупреждения или облегчения заболевания, нарушения или состояния, в
частности у человека.
20 Вариант осуществления изобретения 84: Способ по варианту
осуществления изобретения 83, в котором указанное заболевание, нарушение или состояние представляет собой ассоциированное с CX3CR1 заболевание, нарушение или состояние.
Вариант осуществления изобретения 85: Способ по варианту 25 осуществления изобретения 83, в котором указанное заболевание, нарушение или состояние представляет собой атеросклероз.
Вариант осуществления изобретения 86: Инъецируемая фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77, где указанную композицию можно применять для 30 внутривенной или подкожной инъекции человеку.
Вариант осуществления изобретения 87: Способ предупреждения и/или лечения заболевания или нарушения, которое ассоциировано с CX3CR1, заключающийся в том, что вводят индивидууму, который нуждается в этом, в
фармацевтически активном количестве по меньшей мере один полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1- 77.
Вариант осуществления изобретения 88: Способ по варианту осуществления изобретения 85, заключающийся также в том, что вводят 5 дополнительное терапевтическое средство, выбранное из группы, включающей статин, антитромбоцитарное средство, антикоагулянт, противодиабетическое средство и гипотензивное средство.
Вариант осуществления изобретения 89: Способ ингибирования связывания CX3CR1 с фракталкином в клетке млекопитающего, заключающийся в том, что 10 вводят в клетку полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77, ингибируя тем самым передачу сигналов, опосредуемую фракталкином.
Вариант осуществления изобретения 90: Способ детекции и/или количественной оценки уровней CX3CR1 в биологическом образце, заключающийся в том, что приводят в контакт образец с полипептидом по 15 одному из вариантов осуществления изобретения 1-77 и определяют связывание полипептида с CX3CR1.
Вариант осуществления изобретения 91 .'Способ диагностирования ассоциированного с CX3CR1 нарушения или решения вопроса о том, имеет ли пациент риск развития ассоциированного с CX3CR1 нарушения, заключающийся 20 в том, что приводят в контакт биологический образец из организма пациента с полипептидом по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77 и определяют связывание полипептида с CX3CR1 для оценки уровня экспрессии или концентрации CX3CR1.
Вариант осуществления изобретения 92. Полипептид по одному из 25 вариантов осуществления изобретения 1-77, предназначенный для применения для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, нарушения или состояния, в частности у человека.
Вариант осуществления изобретения 93. Полипептид, предназначенный для применения согласно варианту осуществления изобретения 92, где заболевание, 30 нарушение или состояние представляет собой ассоциированное с CX3CR1 заболевание, нарушение или состояние.
Вариант осуществления изобретения 94. Полипептид, предназначенный для применения согласно варианту осуществления изобретения 92, где заболевание,
нарушение или состояние выбирают из кардио- и цереброваскулярных атеросклеротических нарушений, заболевания периферических артерий, рестеноза, диабетической нефропатии, гломерулонефрита, человеческого серповидного гломерулонефрита, IgA-нефропатии, мембранозной нефропатии, 5 волчаночного нефрита, васкулита, включая пурпуру Геноха-Шенлейна и гранулематоз Вегенера, ревматоидного артрита, остеоартрита, отторжения трансплантата, системного склероза, нейродегенеративных нарушений и демиелинизирующего заболевания, рассеянного склероза (PC), болезни Альцгеймера, легочных заболеваний, таких как ХОЗЛ, астма, нейропатической 10 боли, связанной с воспалением боли или рака.
Вариант осуществления изобретения 95. Полипептид, предназначенный для применения согласно варианту осуществления изобретения 92, где заболевание, нарушение или состояние представляет собой атеросклероз.
Вариант осуществления изобретения 96. Применение полипептида по 15 одному из вариантов осуществления изобретения 1-77 для приготовления
лекарственного средства, предназначенного для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, нарушения или состояния у человека.
Вариант осуществления изобретения 97. Способ по варианту осуществления изобретения 87, в котором заболевание или нарушение выбирают 20 из кардио- и цереброваскулярных атеросклеротических нарушений, заболевания периферических артерий, рестеноза, диабетической нефропатии, гломерулонефрита, человеческого серповидного гломерулонефрита, IgA-нефропатии, мембранозной нефропатии, волчаночного нефрита, васкулита, включая пурпуру Геноха-Шенлейна и гранулематоз Вегенера, ревматоидного 25 артрита, остеоартрита, отторжения трансплантата, системного склероза, нейродегенеративных нарушений и демиелинизирующего заболевания, рассеянного склероза (PC), болезни Альцгеймера, легочных заболеваний, таких как ХОЗЛ, астма, нейропатической боли, связанной с воспалением боли или рака.
30 Вариант осуществления изобретения 98. Способ по варианту
осуществления изобретения 87, в котором заболевание, нарушение или состояние представляет собой атеросклероз.
Вариант осуществления изобретения 99. Диагностический набор или диагностический способ, включающий полипептид по одному из вариантов осуществления изобретения 1-77, или его применение.
Вариант осуществления изобретения 100. Диагностический набор или 5 диагностический способ по варианту осуществления изобретения 99,
предназначенный для диагностирования по меньшей мере одного из кардио- и цереброваскулярных атеросклеротических нарушений, заболевания периферических артерий, рестеноза, диабетической нефропатии, гломерулонефрита, человеческого серповидного гломерулонефрита, IgA-
10 нефропатии, мембранозной нефропатии, волчаночного нефрита, васкулита, включая пурпуру Геноха-Шенлейна и гранулематоз Вегенера, ревматоидного артрита, остеоартрита, отторжения трансплантата, системного склероза, нейродегенеративных нарушений и демиелинизирующего заболевания, рассеянного склероза (PC), болезни Альцгеймера, легочных заболеваний, таких
15 как ХОЗЛ, астма, нейропатической боли, связанной с воспалением боли или рака.
Подробное описание изобретения Определения
Указанные выше и другие объекты и варианты осуществления изобретения 20 должны стать очевидными после ознакомления с дополнительным описанием, в котором:
а) Если не указано или не определено иное, то все применяемые понятия употребляются в их обычном значении, принятом в данной области, которое очевидно специалистам в данной области. В качестве ссылки можно указать,
25 например, стандартные руководства, такие как Sambrook и др., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2-е изд., тома 1-3, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Lewin, "Genes IV", изд-во Oxford University Press, New York, 1990, и Roitt и др., "Immunology" (2-е изд.), изд-во Gower Medical Publishing, London, New York, 1989, а также документы, касающиеся общего
30 уровня техники, процитированные в настоящем описании; кроме того, если не указано иное, то все методы, стадии, процессы и манипуляции, которые не описаны конкретно в деталях, можно осуществлять (и их осуществляли) хорошо известными методами, что должно быть очевидно специалисту в данной
области. И в этом случае также в качестве ссылки можно, например, указать на известные руководства, сведения, касающиеся общего уровня техники, указанные выше, и дополнительные процитированные в них ссылки, б) Если не указано иное, то понятия "иммуноглобулин" и 5 "последовательность иммуноглобулина", если их используют в контексте
настоящего описания касательно состоящего только из тяжелых цепей антитела или канонического состоящего из 4 цепей антитела, применяют в качестве общих понятий, которые включают полноразмерное антитело, его индивидуальные цепи, а также все его области, домены или фрагменты (включая
10 (но, не ограничиваясь только ими) антигенсвязывающие домены или фрагменты, такие как VHH-домены или VH/VL-домены соответственно). Кроме того, понятие "последовательность" в контексте настоящего описания (например, в понятиях типа "последовательность иммуноглобулина", "последовательность антитела" "последовательность (единичного) вариабельного домена,
15 "последовательность VHH" или "последовательность белка"), как это обычно принято, относится как к соответствующим аминокислотным последовательностям, так и к последовательностям нуклеиновых кислот или нуклеотидным последовательностям, которые их кодируют, если из контекста не следует более ограниченная интерпретация.
20 в) Понятие "домен (область)" (полипептида или белка) в контексте
настоящего описания относится к складчатой белкой структуре, которая обладает способностью сохранять свою третичную структуру, независимо от остального белка. Как правило, домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях их можно добавлять,
25 удалять или переносить в другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена.
г) Понятие "иммуноглобулиновый домен" в контексте настоящего описания относится к глобулярной области цепи антитела (такой, например, как цепь канонического состоящего из 4 цепей антитела или состоящего из тяжелых
30 цепей антитела) или к полипептиду, который состоит практически из указанной глобулярной области. Иммуноглобулиновые домены отличаются тем, что они сохраняют присущую иммуноглобулину складчатую структуру молекул антитела, которая представляет собой 2-слойный "сэндвич", состоящий
примерно из 7 антипараллельных бета-цепей, образующих две бета-складки, необязательно стабилизированные с помощью консервативного дисульфидного мостика.
д) Понятие "иммуноглобулиновый вариабельный домен" в контексте
5 настоящего описания относится к иммуноглобулиновому домену, состоящему практически из четырех "каркасных участков", как они определены в данной области, и обозначены ниже как "каркасный участок 1" или "FR1"; "каркасный участок 2" или "FR2"; "каркасный участок 3" или "FR3" и"каркасный участок 4" или "FR4" соответственно; указанные каркасные участки перемежаются
10 тремя "гипервариабельными участками", или "CDR", как они определены в данной области, и обозначены ниже как "гипервариабельный участок 1" или "CDR1"; "гипервариабельный участок 2" или "CDR2" и "гипервариабельный участок 3" или "CDR3" соответственно. Таким образом, общую структуру или последовательность вариабельного домена иммуноглобулина можно обозначать
15 как: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Именно вариабельный(ые) домен(ы) иммуноглобулина придает(ют) специфичность антителу в отношении антигена, поскольку он(они) несут антигенсвязывающий центр.
е) Понятия "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен" и
"единичный вариабельный домен" в контексте настоящего описания относится к
20 иммуноглобулиновому вариабельному домену, который обладает способностью специфически связываться с эпитопом антигена без спаривания с дополнительным иммуноглобулиновым вариабельным доменом. Одним из примеров иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов согласно настоящему изобретению являются "доменные антитела", такие как единичные
25 вариабельные домены VH и VL (VH-домены и VL-домены). Другим примером иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов являются "VHH-домены" (или просто "VHH") из представителей верблюдовых, как указано ниже в настоящем описания.
В свете вышеуказанных определений антигенсвязывающий домен
30 канонического состоящего их 4 цепей антитела (такого как молекула IgG, IgM, IgA, IgD или IgE; известная в данной области) или Fab-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, Fv-фрагмента, такого как связанный дисульфидным мостиком Fv или scFv-фрагмент, или димерного антитела (диабоди) (которые все известны в
данной области), выведенный из указанного канонического состоящего из 4 цепей антитела, не следует рассматривать как иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, поскольку в этих случаях связывание с соответствующим эпитопом антигена в норме не может осуществляться с помощью одного 5 (единичного) иммуноглобулинового домена, а должно происходить посредством спаривания (ассоциации) иммуноглобулиновых доменов, таких как вариабельные области легкой и тяжелой цепей, т.е. с помощью пары VH-VL иммуноглобулиновых доменов, которые совместно связываются с эпитопом соответствующего антигена.
10 el) "VHH-домены", которые обозначают также как VHH, УнН-домены,
фрагменты VHH-антитела и VHH-антитела, впервые были описаны как антигенсвязывающие иммуноглобулиновые (вариабельные) домены "состоящих из тяжелых цепей антител" (т.е. "антител, в которых отсутствуют легкие цепи", Hamers-Casterman С, Atarhouch Т, Muyldermans S., Robinson G., Hamers С,
15 Songa E.B., Bendahman N., Hamers R. в: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 1993, cc. 446-448). Понятие "VHH-домен" было выбрано для того, что можно было отличать эти вариабельные домены от вариабельных доменов тяжелых цепей, которые присутствуют в канонических состоящих из 4 цепей антителах (они обозначены далее как "Ун-домены
20 (области)" или "VH-домены (области)") и от вариабельных доменов легких
цепей, которые присутствуют в канонических состоящих из 4 цепей антителах (они обозначены далее как "Уь-домены (области)" или "VL-домены (области)"). VHH-домены могут специфически связываться с эпитопом без дополнительного антигенсвязывающего домена (в отличие от VH- или VL-доменов в
25 каноническом состоящем из 4 цепей антителе, в котором для распознавания эпитопа требуется присутствие VL-домена в сочетании с VH-доменом). VHH-домены представляют собой небольшие, сильные и эффективные распознающие антиген структуры (единицы), образованные единичным иммуноглобулиновым доменом.
30 В контексте настоящего изобретения понятия VHH-домен, VHH, VHH-
домен, фрагмент VHH-антитела, VHH-антитело, а также "Nanobody(r)" и "домен Nanobody(r)" ("Nanobody" (нанободи) является товарным знаком компании Ablynx N.V.; Гент, Бельгия) применяют взаимозаменяемо, и они относятся к
иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменам (которые имеют следующее строение: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и которые специфически связываются с эпитопом, не требуя присутствия второго иммуноглобулинового вариабельного домена), и они отличаются от VH-доменов 5 наличием так называемых "отличительных остатков, остатков-маркеров", как они определены, например, в WO 2009/109635, фиг. 1.
Аминокислотные остатки VHH-домена нумеруют согласно общей номенклатуре Кэбота для Ун-доменов (((Sequence of proteins of immunological interest", изд-во US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, публикация № 91), 10 в том виде, в котором ее применяют для VHH-доменов верблюдовых, например, как продемонстрировано на фиг 2 у Riechmann и Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 1999, cc. 25-38. Согласно этой нумерации:
FR1 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 130,
15 CDR1 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях
31-35,
FR2 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 3649,
CDR2 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 20 50-65,
FR3 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 6694,
CDR3 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях 95-102 и
25 FR4 содержит аминокислотные остатки, присутствующие в положениях
103-113.
Однако следует отметить, что, как хорошо известно для Ун-доменов и для VHH-доменов, общее количество аминокислотных остатков в каждом CDR может варьироваться и может не соответствовать общему количеству 30 аминокислотных остатков, указанных в номенклатуре Кэбота (т.е. одно или
несколько положений согласно номенклатуре Кэбота может быть незанятым в фактической последовательности, или фактическая последовательность может содержать большее количество аминокислотных остатков, чем количество
остатков, которое должно присутствовать согласно номенклатуре Кэбота). Это
означает, что, в целом, нумерация по Кэботу может как соответствовать, так и не
соответствовать фактической нумерации аминокислотных остатков в
фактической последовательности.
5 В данной области известны альтернативные методы нумерации
аминокислотных остатков Ун-доменов, указанные методы также можно применять аналогичным образом к VHH-доменам. Однако, в настоящем описании, формуле изобретения и на чертежах нумерация соответствует номенклатуре Кэбота, и ее применяют к описанным выше VHH-доменам, если
10 специально не указано иное.
Общее количество аминокислотных остатков в VHH-домене, как правило, составляет от 110 до 120, чаще от 112 до 115. Однако следует отметить, что для целей настоящего изобретения можно применять также как более короткие, так и более длинные последовательности.
15 Другие структурные характеристики и функциональные свойства VHH-
доменов и полипептидов, содержащих их, можно обобщить следующим образом:
VHH-домены (которые "созданы" природой таким образом, что они могут функционально связываться с антигеном без присутствия или без какого-либо взаимодействия с вариабельным доменом легкой цепи) могут функционировать
20 как единичная относительно небольшая функциональная антигенсвязывающая структурная единица, домен или полипептид. Это отличает VHH-домены от VH-и VL-доменов канонических состоящих из 4-цепей антител, которые сами по себе, как правило, не пригодны для практического применения в виде единичных антигенсвязывающих белков или иммуноглобулиновых единичных
25 вариабельных доменов, а нуждаются в объединении в той или иной форме для создания функциональной антигенсвязывающей единицы (как, например, фрагменты канонических антител, такие как Fab-фрагменты в scFv, который состоит из VH-домена, ковалентно связанного с VL-доменом).
Благодаря их уникальным свойствам применение VHH-доменов - либо
30 индивидуально, либо в качестве части более крупного полипептида - обладает рядом важных преимуществ по сравнению с применением канонических VH- и VL-доменов, scFv или фрагментов канонических антител (таких как Fab- или Р(аЬ')2-фрагменты):
- только один домен необходим для связывания антигена с высокой аффинностью и высокой селективностью, поэтому отсутствует как необходимость в наличии двух отдельных доменов, так и необходимость в требовании, чтобы эти два домена находились в правильной пространственной конформации и конфигурации (т.е. необходимость в применении специально созданных линкеров, как в случае scFv);
- VHH-домены можно экспрессировать с одного гена и при этом отсутствует необходимость в пост-трансляционном фолдинге или модификации;
- VHH-домены легко можно конструировать в многовалентных и мультиспецифических форматах (что подробно обсуждено ниже в настоящем описании);
- VHH обладают высокой растворимостью и не имеют тенденции к агрегации (что имеет место в случае полученных из антител мышей антигенсвязывающих доменов, описанных у Ward и др., Nature 341, 1989, сс. 544-546));
- VHH-домены обладают высокой устойчивостью к нагреванию, рН, протеазам и другим денатурирующим агентам или условиям и поэтому их можно получать, хранить или транспортировать без применения охлаждающего оборудования, что позволяет экономить затраты, время и сберегать окружающую среду;
- VHH-домены можно легко и относительно дешево получать, в том числе в даже в требуемом масштабе. Например, VHH-домены и полипептиды, содержащие их, можно получать с использованием ферментации микроорганизмов (что более подробно описано ниже) и для этой цели не требуется применения экспрессионных систем млекопитающих, что имеет место в случае фрагментов канонических антител;
- VHH-домены являются относительно небольшими (примерно 15 кДа или в 10 раз меньше, чем канонический IgG) по сравнению с каноническими состоящими из 4 цепей антителами и их антигенсвязывающими фрагментами, и поэтому для них
-характерна высокая (более высокая) способность проникать в ткани
- и их можно вводить в более высоких дозах, чем дозы канонических состоящих из 4 цепей антител и их антигенсвязывающих фрагментов;
-
- VHH-домены могут обладать так называемой "способностью связываться с сайтом, расположенном в расщелине (бороздке)" (в том числе благодаря их удлиненной СОЯЗ-петле, в отличие от канонических VH-доменов), и поэтому для них являются доступными также мишени и эпитопы, которые не доступны 5 для канонических состоящих из 4 цепей антител и их антигенсвязывающих фрагментов.
Методы получения VHH-доменов, связывающихся со специфическим антигеном или эпитопом, описаны ранее, например, в WO 2006/040153 и WO 2006/122786. Как описано подробно в указанных документах, VHH-домены,
10 выведенные из представителей верблюдовых, можно "гуманизировать" путем замены одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности исходной последовательности VHH на один или несколько аминокислотных остатков, которые присутствуют в соответствующем(их) положении(ях) в VH-домене канонического состоящего из 4 цепей
15 человеческого антитела. Гуманизированный VHH-домен может содержать одну или несколько полностью человеческих последовательностей каркасных участков и в еще более конкретном варианте осуществления изобретения может содержать последовательности человеческих каркасных участков, выведенные из DP-29, DP-47, DP-51 или их фрагментов необязательно в сочетании с JH-
20 последовательностями, такими как JH5.
е2) "Доменные антитела", которые обозначают также как "Dab" или "dAb" (понятия "доменные" антитела" и "dAb" являются товарным знаком группы компаний GlaxoSmithKline), описаны, например, у Ward E.S. и др. в: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from
25 Escherichia coli", Nature 341, 1989, cc. 544-546; у Holt L.J. и др. в: "Domain
antibodies: proteins for therapy", TRENDS in Biotechnology 21(11), 2003, cc. 484490 и в WO 2003/002609.
Доменные антитела в основном соответствуют VH- или VL-доменам антител из представителей млекопитающих, не относящихся к верблюдовым, в
30 частности человеческих состоящих из 4 цепей антител. Для придания
способности связываться с эпитопом в виде единичного антигенсвязывающего домена, т.е. без спаривания с VL- или VH-доменом соответственно, требуется осуществлять специфическую селекцию в отношении указанных
антигенсвязывающих свойств, например, с использованием библиотек человеческих последовательностей единичных VH- или VL-доменов. Доменные антитела подобно VHH имеют молекулярную массу, составляющую от примерно 13 до примерно 16 кДа, если их выводят из полностью человеческих 5 последовательностей, и они не нуждаются в гуманизации, например, для
терапевтического применения на людях. Также как и в случае VHH-доменов, их можно с успехом экспрессировать также в прокариотических системах экспрессии, что приводит к существенному снижению общей стоимости производства.
10 Доменные антитела, а также VHH-домены, можно подвергать процессу
созревания аффинности путем интродукции одного или нескольких изменений в аминокислотную последовательность одного или нескольких CDR, указанные изменения приводят к повышенной аффинности образовавшегося иммуноглобулинового единичного вариабельного домена к соответствующему
15 антигену по сравнению с соответствующей родительской молекулой. Молекулы иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов с созревшей аффинностью, предлагаемые в изобретении, можно получать методами, известными в данной области, например, описанными у Marks и др., Biotechnology 10, 1992, cc. 779-783 или у Barbas и др., Proc. Nat. Acad. Sci, USA
20 91, 1994, cc. 3809-3813.; Shier и др., Gene 169, 1995, cc. 147-155; Yelton и др., Immunol. 155, 1995, cc. 1994-2004; Jackson и др., J. Immunol. 154(7), 1995, cc. 3310-3319 и у Hawkins и др., J. Mol. Biol. 226(3), 1992, cc. 889-896; у K.S. Johnson и R.E. Hawkins в: "Affinity maturation of antibodies using phage display", изд-во Oxford University Press, 1996.
25 еЗ) Кроме того, что также должно быть очевидно специалисту в данной
области, можно "трансплантировать" один или несколько указанных выше CDR в другие "каркасы", включая (но, не ограничиваясь только ими) человеческие каркасы или неиммуноглобулиновые каркасы. Приемлемые каркасы и методики такой трансплантации CDR известны в данной области.
30 ж) Понятия "эпитоп" и "антигенная детерминанта", которые можно
применять взаимозаменяемо, относятся к участку макромолекулы, такой как полипептид, который распознается антигенсвязывающими молекулами, такими как канонические антитела или полипептиды, предлагаемые в изобретении, и
более конкретно антигенсвязывающими центрами указанных молекул. Эпитопы представляют собой минимальный сайт связывания для иммуноглобулина и поэтому представляют собой специфическую мишень для иммуноглобулина. Часть антигенсвязывающей молекулы (такой как каноническое антитело 5 или полипептид, предлагаемый в изобретении), которая распознает эпитоп, называют паратопом.
з) Понятие "бипараптопная" (антиген)связывающая молекула или
"бипаратопный полипептид" в контексте настоящего описания означает
полипептид, который содержит первый иммуноглобулиновый единичный
10 вариабельный домен и второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, как они определены в настоящем описании, при этом два указанных вариабельных домена обладают способностью связываться с двумя различными эпитопами одного антигена, при этом, указанные эпитопы в норме не связываются одновременно одним моноспецифическим иммуноглобулином,
15 таким, например, как каноническое антитело или один иммуноглобулиновый
единичный вариабельный домен. Бипараптопные полипептиды могут состоять из вариабельных доменов, которые обладают различными эпитопными специфичностями, и не содержат общие пары комплементарных вариабельных доменов, которые связываются с одним и тем же эпитопом. Следовательно, два
20 вариабельных домена не конкурируют друг с другом за связывание с мишенью.
и) Считается, что полипептид (такой как иммуноглобулин, антитело,
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, полипептид,
предлагаемый в изобретении, или в целом антигенсвязывающая молекула или ее
фрагмент), который может "связываться с" или "специфически связываться с",
25 обладает "аффинностью к" и/или "специфичностью к" определенному эпитопу, антигену или белку (или по меньшей мере одному его участку, фрагменту или эпитопу), "действует против" или является "направленным против" указанного эпитопа, антигена или белка, или является "связывающей" молекулой в отношении указанного эпитопа, антигена или белка или, как говорят, является
30 "анти"-эпитопным, "анти"-антигенным или "анти"-белковым (например, анти-СХЗСШ).
к) Как правило, понятие "специфичность" относится к ряду антигенов или эпитопов различных типов, с которыми конкретная антигенсвязывающая
молекула или антигенсвязывающий белок (такой как иммуноглобулин, антитело, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или полипептид, предлагаемый в изобретении) может связываться. Специфичность антигенсвязывающего белка можно определять на основе его аффинности и/или 5 авидности. Аффинность, характеризующаяся константной равновесия реакции диссоциации комплекса антиген: антигенсвязывающий белок (KD), является мерой силы связывания между эпитопом и антигенсвязывающим центром антигенсвязывающего белка: чем меньше величина KD, тем выше сила связывания между эпитопом и антигенсвязывающей молекулой (альтернативно
10 этому, аффинность можно выражать в виде константы аффиннности (КА),
которая представляет собой 1/KD). Как должно быть очевидно специалисту в данной области (например, после ознакомления с представленным ниже описанием), аффинность можно определять хорошо известным методом в зависимости от специфичности представляющего интерес антигена. Авидность
15 представляет собой меру силы связывания между антигенсвязывающей молекулой (такой как иммуноглобулин, антитело, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или полипептид, предлагаемый в изобретении) и соответствующего антигена. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и его антигенсвязывающим центром антигенсвязывающей молекулы,
20 так и с количеством соответствующих сайтов связывания, которые присутствует в антигенсвязывающей молекуле.
л) Аминокислотные остатки обозначают согласно стандартному трехбуквенному или однобуквенному коду аминокислот, что хорошо известно и является общепризнанным в данной области. При сравнении двух
25 аминокислотных последовательностей понятие "аминокислотное различие (различие в аминокислотах)" относится к инсерциям, делециям или заменам указанного количества аминокислотных остатков в определенном положении референс-последовательности по сравнению со второй последовательностью. В случае замен(ы) указанные(ая) замены(а) предпочтительно должны(а)
30 представлять собой консервативные(ую) аминокислотные(ную) замены(у), это означает, что аминокислотный остаток заменяют на другой аминокислотный остаток сходного химического строения, который оказывает незначительное влияние или практически не оказывает влияния на функцию, активность или
другие биологические свойства полипептида. Указанные консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области, например, они описаны в WO 98/49185, при этом консервативные аминокислотные замены предпочтительно представляют собой замены, при которых одну из аминокислот из следующих групп (I) - (V) заменяют на другой аминокислотный остаток, входящий в эту же группу: (I) небольшие алифатические неполярные или имеющие невысокую полярность остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (II) полярные отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gin; (III) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (IV) крупные алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Не, Val и Cys; и (V) ароматические остатки: Phe, Туг и Тгр. Наиболее предпочтительными являются следующие аминокислотные замены:
Ala на Gly или на Ser;
Arg на Lys;
Asn на Gin или на His;
Asp на Glu;
Cys на Ser;
Gin на Asn;
Glu на Asp;
Gly на Ala или на Pro;
His на Asn или на Gin;
He на Leu или на Val;
Leu на lie или на Val;
Lys на Arg, на Gin или на Glu;
Met на Leu, на Туг или на Не;
Phe на Met, на Leu или на Туг;
Ser на Thr;
Thr на Ser;
Тгр на Туг;
Туг на Тгр или на Phe; Val на Не или на Leu.
м) Молекула нуклеиновой кислоты или пептида рассматривается как "практические выделенная" (находится в "практически выделенной" форме),
например, из ее нативного биологического источника и/или реакционный среды или среды для культивирования, из которой ее получают, когда она отделена по меньшей мере от одного компонента, с которым она обычно ассоциирована в указанном источнике или указанной среде, такого как другая нуклеиновая 5 кислота, другой белок/полипептид, другой биологический компонент или
макромолекула или по меньшей мере один загрязнитель, примесь или минорный компонент. В частности, молекула нуклеиновой кислоты или полипептида рассматривается как "практически выделенная", когда степень ее чистоты повышена по меньшей мере в 2 раза, в частности по меньшей мере в 10 раз,
10 более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз и вплоть до 1000 раз или более. Молекула нуклеиновой кислоты или полипептида, которая находится в "практически выделенной форме", предпочтительно является практически гомогенной, что определяют с помощью приемлемого метода, такого как приемлемый хроматографический анализ, электрофорез в полиакриламидном
15 геле.
н) "Идентичность последовательностей", например, двух последовательностей иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, означает процент аминокислот, идентичных для двух указанных последовательностей. Его можно рассчитывать или определять согласно методу, 20 изложенному в разделе f) на с. 49 и с. 50 WO 2008/020079. "Сходство
последовательностей" означает процент аминокислот, которые либо идентичны, либо представляют собой консервативные аминокислотные замены.
Специфичность в отношении мишени
Полипептиды, предлагаемые в изобретении, обладают специфичностью в 25 отношении человеческого CX3CR1. Так, полипептиды, предлагаемые в
изобретении, предпочтительно связываются с человеческим CX3CR1 (SEQ ID NO: 255). В одном из объектов изобретения полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, связываются также с CX3CR1 обезьян циномолгус (SEQ ID NO: 256).
30 Полипептиды, предлагаемые в изобретении
Изобретение относится к новым фармацевтически активным агентам, предназначенным для предупреждения, лечения, облегчения и/или диагностирования ассоциированных с CX3CR1 заболеваний, нарушений или
состояний, таких как сердечнососудистые заболевания. В частности, изобретение относится к полипептидам, которые связываются с человеческим CX3CR1 и обладают способностью блокировать связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1. В одном из объектов изобретения 5 полипептид представляет собой иммуноглобулин, содержащий
антигенсвязывающий домен, который содержит три гипервариабельных участка CDR1, CDR2 и CDR3, где указанный иммуноглобулин связывается с человеческим CX3CR1 и обладает способностью блокировать связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1. В предпочтительном
10 объекте изобретения полипептид содержит один или несколько aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, где указанный полипептид обладают способностью блокировать связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1.
В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
15 изобретении, отличается одним или несколькими из следующих свойств:
• связывается с высокой аффинностью с человеческим CX3CR1, что характеризуется, например, величиной ЕС50, более низкой или равной Юнм, более низкой или равной 5нМ, более низкой или равной 2,5нМ или более низкой или равной 1нМ, по данным, полученным путем анализа клеточного связывания
20 с помощью FACS;
• блокирует связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1, что характеризуется, например, величиной IC50, более низкой или равной ЗООнмМ, или более низкой или равной ЮОнМ, или более низкой или равной 20нМ, или более низкой или равной ЮнМ, или более низкой или равной
25 5нМ, или более низкой или равной 2,5нМ или более низкой или равной 1нМ;
• ингибирует индуцированный фракталкином хемотаксис, опосредуемый человеческим CX3CR1, что характеризуется, например, величиной IC50, более низкой или равной 500нМ, или более низкой или равной ЮОнМ, или более низкой или равной 75нМ, или более низкой или равной 50нМ, или более низкой
30 или равной ЮнМ, или более низкой или равной 5нМ; обнаруженная
эффективность ингибирования превышает или равна 15% или превышает или равна 50%, или превышает или равна 80%, или превышает или равна 95%;
• ингибирует индуцированную фракталкином интернализацию, опосредуемую человеческим CX3CR1, что характеризуется, например, величиной IC50, более низкой или равной ЮнМ или более низкой или равной 5нМ;
5 • обладает перекрестной реактивностью с CX3CR1 обезьян циномолгус
(супо), при этом величина E/IC50, характеризующая связывание и функциональное ингибирование человеческого CX3CR1, в 10 раз превышает соответствующую величину для cynoCX3CRl.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
10 изобретении, дополнительно содержит удлиняющий время полужизни фрагмент, например, альбуминсвязывающий фрагмент, молекулу полиэтиленгликоля или Fc-домен. В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два или большее количество aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В одном из объектов
15 изобретения два aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена ковалентно связаны с помощью линкерного пептида. В одном из объектов изобретения два aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена в полипептиде, предлагаемом в настоящем изобретении, имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В другом объекте
20 изобретения два aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена в полипептиде, предлагаемом в настоящем изобретении, имеют различные аминокислотные последовательности. В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена и
25 дополнительно содержит удлиняющий время полужизни фрагмент, например, альбуминсвязывающий фрагмент, молекулу полиэтиленгликоля или Fc-домен.
В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит первый aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, ковалентно связанный с альбуминсвязывающим
30 фрагментом с помощью первого ликерного пептида, в котором указанный
альбуминсвязывающий фрагмент дополнительно ковалентно связан со вторым aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменом с помощью второго линкерного пептида.
В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит анти-СХЗСШ иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, ковалентно связанный с Fc-доменом с помощью линкерного пептида. В одном из объектов изобретения указанный полипептид, 5 содержащий анти-СХЗСШ иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, ковалентно связанный с Fc-доменом с помощью линкерного пептида, образует димер, например, посредством связывания дисульфидными мостиками.
Полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, получают согласно изложенному ниже методу. В целом, единичные вариабельные домены,
10 предлагаемые в настоящем изобретении, идентифицировали в библиотеке, экспрессирующей единичные вариабельные домены (VHH), выведенные из ламы, иммунизированной ДНК, которая кодирует человеческий CX3CR1. Осуществляли пэннинг фаговой библиотеки на содержащих hCX3CRl вирусных липидных частицах и осуществляли скрининг связывания фага в отношении его
15 способности конкурировать за связывание с рецептором с меченным с помощью красителя Alexa-fluor фракталкином (AF-FKN). Репрезентативные единичные вариабельные домены, предлагаемые в настоящем изобретении, описаны более подробно ниже.
В одном из объектов изобретения иммуноглобулиновый единичный 20 вариабельный домен, предлагаемый в настоящем изобретении, практически состоит из четырех каркасных участков (FR1, FR2, FR3 и FR4) и трех гипервариабельных участков (CDR1, CDR2 и CDR3). В частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен имеет структуру FR1 -CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. В одном из объектов изобретения 25 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой домен антитела.
В одном из объектов изобретения CDR3 полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, в частности, иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, предлагаемого в настоящем изобретении, имеет 30 аминокислотную последовательность Asp-Xaal-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Хаа4-Хаа5, представленную в SEQ ID NO: 197, в которой:
- Xaal обозначает Pro, Ala или Gly;
- Хаа2 обозначает Asp или Asn;
- ХааЗ обозначает Thr или Ser;
- Хаа4 обозначает Arg, Lys, Ala или Gly; и
- Хаа5 обозначает Туг или Phe.
В одном из объектов изобретения CDR3 полипептида, предлагаемого в 5 настоящем изобретении, в частности, иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, предлагаемого в настоящем изобретении, имеет аминокислотную последовательность Asp-Xaal-Arg-Arg-Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Хаа4-Хаа5, представленную в SEQ ID NO: 197, в которой:
- Xaal обозначает Pro, Ala или Gly; 10 - Хаа2 обозначает Asp или Asn;
- ХааЗ обозначает Thr;
- Хаа4 обозначает Arg или Lys; и
- Хаа5 обозначает Туг.
В одном из объектов изобретения CDR3 полипептида, предлагаемого в 15 настоящем изобретении, в частности, иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, предлагаемого в настоящем изобретении, имеет аминокислотную последовательность Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr, представленную в SEQ ID NO: 186.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем 20 изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный
домен, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет следующие CDR1, CDR2 и CDR3:
CDR1:
а) имеет аминокислотную последовательность GSIFSSNAMA (SEQ ID NO:
25 141); или
б) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на
80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 141; или
в) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 2 или 1
аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ
30 IDNO: 141, в которой
- в положении 2 S заменен на Т или G;
- в положении 6 S заменен на R;
- в положении 7 N заменен на Т; и/или
- в положении 9 М заменен на К; или
г) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной из SEQ ID NO: 141-145 и 213; CDR2:
5 а) имеет аминокислотную последовательность GINSVGITK (SEQ ID NO:
164); или
б) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на
70% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 164; или
в) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 4, 3, 2 или 1
10 аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ
ID NO: 164, в которой
- в положении 1 G заменен на A, L, V или S;
- в положении 3 N заменен на D, S, Q, G или Т;
- в положении 4 S заменен на Т, К, G или Р; 15 - в положении 5 V заменен на А;
- в положении 6 G заменен на D;
- в положении 7 I заменен на Т или V;
- в положении 8 Т заменен на А; и/или
- в положении 9 К заменен на R; или
20 г) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной
из SEQ ID NO: 162-175 и 214-221; и CDR3:
а) имеет аминокислотную последовательность DPRRGWDTRY (SEQ ID NO: 186); или
25 б) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на
70% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 186; или
в) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 186, в которой
30 - в положении 2 Р заменен на А или G;
- в положении 7 D заменен на N; и/или
- в положении 9 R заменен на К; или
г) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной из SEQ IDNO: 186-190.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный 5 домен, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет следующие CDR1, CDR2 и CDR3, в которых:
указанный CDR1 имеет аминокислотную последовательность GRTFSSYAMG (SEQ ID NO: 146);
указанный CDR2 имеет аминокислотную последовательность, которая а) по 10 меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности GISGSASRKY (SEQ ID NO: 176), или б) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 176 или 177; и
указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность
SNSYPKVQFDY (SEQ ID NO: 191).
15 В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет следующие CDR1, CDR2 и CDR3:
указанный CDR1:
20 а) имеет аминокислотную последовательность GTIFSNNAMG (SEQ ID NO:
147); или
б) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 6, 5, 4, 3, 2
или 1 аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью
SEQ ID NO: 147, в которой
25 - в положении 1 G заменен на К, R или А;
- в положении 2 Т заменен на I, Р, S или L;
- в положении 3 I заменен на V или Т;
- в положении 4 F заменен на L;
- в положении 5 S заменен на R или D;
30 - в положении 6 N заменен на S, Т или D; и/или
- в положении 7 N заменен на Т ил Y; или
в) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной
из SEQ ID NO: 147-161;
указанный CDR2:
а) имеет аминокислотную последовательность SISNSGSTN (SEQ ID NO:
179); или
б) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 4, 3, 2 или 1
аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ
ID NO: 179, в которой
- в положении 3 S заменен на Т или G;
- в положении 4 N заменен на S или I;
- в положении 5 S заменен на Т;
- в положении 6 G заменен на Y; и/или
- в положении 8 Т заменен на А; или
в) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной
из SEQ IDNO: 178-185; и
указанный CDR3:
а) имеет аминокислотную последовательность DARRGWNTAY (SEQ ID
NO: 192); или
б) имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на
80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 192; или
в) имеет аминокислотную последовательность, которая имеет 2 или 1
аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ
IDNO: 192, в которой
- в положении 2 А заменен на G;
- в положении 8 Т заменен на S;
- в положении 9 А заменен на G; и/или
- в положении 10 Y заменен на F; или
г) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из любой одной
из SEQ IDNO: 192-196.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет следующие CDR1, CDR2 и CDR3:
- SEQ ID NO: 141, 162 и 186 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141, 163 и 187 соответственно; или
- SEQ ID NO: 141
- SEQ IDNO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141 -SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 142 -SEQ IDNO: 142
- SEQ ID NO: 143 -SEQ ID NO: 144 -SEQ ID NO: 145
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 141
- SEQ ID NO: 213
- SEQ ID NO: 213
164 и 186 соответственно
166 и 186 соответственно
167 и 186 соответственно
167 и 189 соответственно
168 и 186 соответственно
168 и 187 соответственно
169 и 190 соответственно
170 и 186 соответственно
171 и 186 соответственно
174 и 186 соответственно
175 и 187 соответственно
165 и 188 соответственно
173 и 188 соответственно
164 и 186 соответственно
172 и 187 соответственно
172 и 187 соответственно
214 и 186 соответственно
215 и 186 соответственно
216 и 186 соответственно
217 и 186 соответственно
218 и 186 соответственно
219 и 186 соответственно
220 и 186 соответственно
221 и 186 соответственно
или или или или или или или или или или или или или или или или или или или или или или или или
домен, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет следующие CDR1, CDR2 и CDR3:
- SEQ ID NO: 147, 178 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 147, 179 и 192 соответственно; или 5 - SEQ ID NO: 147, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 148, 179 и 193 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 179 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 180 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 181 и 192 соответственно; или 10 - SEQ ID NO: 149, 183 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 185 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 150, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 150, 182 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 151, 179 и 193 соответственно; или 15 - SEQ ID NO: 151, 182 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 151, 184 и 196 соответственно; или
- SEQ ID NO: 152, 179 и 195 соответственно; или
- SEQ ID NO: 153, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 154, 182 и 194 соответственно; или 20 - SEQ ID NO: 155, 179 и 195 соответственно; или
- SEQ ID NO: 156, 181 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 157, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 158, 179 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 159, 178 и 192 соответственно; или 25 - SEQ ID NO: 160, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 161, 179 и 194 соответственно.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет CDR1, CDR2 и CDR3, 30 представленные в:
- SEQ ID NO: 141, 164 и 186; или
- SEQ IDNO: 141, 162 и 186.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный
домен, предлагаемый в настоящем изобретении, имеет CDRl, CDR2 и CDR3,
представленные в:
5 - SEQ IDNO: 213, 214 и 186; или
- SEQ ID NO: 213, 221 и 186; или
- SEQ IDNO: 141, 162 и 186.
Репрезентативные полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, которые имеют CDR, указанные выше, представлены в таблицах 1, 2, 3 10 (репрезентативные полипептиды из семейств 101, 9 и 13 соответственно) и в таблице 4 (репрезентативные полипептиды оптимизированных вариантов из семейства 101).
Нанотело
SEQ
CDRl*
SEQ CDRl
CDR2*
SEQ CDR2
CDR3*
SEQ CDR3
CX3CR1BII PMP61F10
GTIFSSNA MA
142
GINSVDIT К
165
DPRRGWN TRY
188
CX3CR1BII PMP61D1
GSIFSSNA MA
141
LINSVGIT К
167
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BI1 PMP61D5
GSIFSSNA MA
141
LINSVGIT К
167
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII РМР61Е2
GSIFSSNA MA
141
GINSVGIT К
164
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII PMP61F11
GSIFSSNA MA
141
AINSVGIT К
166
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII PMP61G2
GSIFSSNA MA
141
LINSVGIT К
167
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII PMP61G3
GSIFSSNA MA
141
AINSVGIT К
166
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII PMP61G4
GSIFSSNA MA
141
AINSVGIT К
166
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII PMP61F4
GSIFSSNA MA
141
VINTVGIT К
168
DARRGWD TRY
187
CX3CR1BII РМР61А11
GSIFSSNA MA
141
VINSVGIT К
163
DARRGWD TRY
187
CX3CR1BII РМР61В2
GSIFSSNA MA
141
VINTVGIT К
168
DARRGWD TRY
187
CX3CR1BII РМР61С9
GSIFSSNA MA
141
LIDSAGIT К
169
DARRGWN TKY
190
CX3CR1BII РМР65Н02
GSIFSSNA MA
141
AINSVGIT К
166
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII РМР65Е11
GSIFSSNA MA
141
GINSVGIA К
170
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII РМР65Е10
GSIFSSNA KA
143
GINSVGIT К
164
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII РМР65Е05
GSIFSSNA MA
141
GINSVGIT К
164
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII РМР65В11
GSIFSSNA MA
141
VINKVGIT К
171
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII РМР65В07
GSIFSSNA MA
141
AINSVGIT К
166
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII РМР65В09
GSIFSRNA MA
144
SINSVGIT К
172
DARRGWD TRY
187
CX3CR1BII РМР65Н01
GGIFSRNA MA
145
SINSVGIT К
172
DARRGWD TRY
187
CX3CR1BII PMP65G07
GTIFSSNA MA
142
GINSVDIT R
173
DPRRGWN TRY
188
CX3CR1BII РМР66Н08
GSIFSSNA MA
141
LINSVGIT К
167
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII РМР66Н04
GSIFSSNA MA
141
AINSVGIT К
166
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII PMP66F02
GSIFSSNA MA
141
LINSVGIT К
167
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII РМР66Е11
GSIFSSNA MA
141
AINSVGTT К
174
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII PMP66D10
GSIFSSNA MA
141
LINSVGIT К
167
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII PMP66D08
GSIFSSNA MA
141
GINSVGIT К
164
DPRRGWD TRY
186
Нанотело
SEQ
CDRl*
SEQ CDRl
CDR2*
SEQ CDR2
CDR3*
SEQ CDR3
CX3CR1BII РМР66А04
GSIFSSNA MA
141
LINSVGIT К
167
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII PMP66D04
GTIFSSNA MA
142
GINSVDIT К
165
DPRRGWN TRY
188
CX3CR1BII PMP66D02
GSIFSSNA MA
141
VINSVGIT К
163
DARRGWD TRY
187
CX3CR1BII PMP66D06
GSIFSSNA MA
141
SIDSVGIT К
175
DARRGWD TRY
187
CX3CR1BII PMP66G01
GSIFSSNA MA
141
LINSVGIT К
167
DGRRGWD TRY
189
^DR-последовательности определяли согласно "Antibody Engineering)), т. 2 под ред. Konetermann и Diibel, изд-во Springer Verlag Heidelberg Berlin. 2010. Номера последовательностей в таблице (SEQ) соответствуют номерам последовательностей в перечне 5 последовательностей, прилагаемом к настоящей заявке.
^DR-последовательности определяли согласно "Antibody Engineering)), т. 2, под ред. 10 Konetermann и Diibel, изд-во Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Номера
последовательностей в таблице (SEQ) соответствуют номерам последовательностей в перечне последовательностей, прилагаемом к настоящей заявке.
Нанотело
SEQ
CDRl*
SEQ CDRl
CDR2*
SEQ CDR2
CDR3*
SEQ CDR3
CX3CR1BII РМР18А9
GIIFSNNA MG
149
SISSTYSTN
181
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР18В7
GTIFRSNA MG
151
SISNSGST N
179
DARRGWN SGY
193
CX3CR1BII РМР18В9
GTIFSNNA MG
147
SISSSGSTN
178
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР18С6
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР18С9
GIIFSNNA MG
149
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP18D1
GIIFSNNA MG
149
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP18D10
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP18D12
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP18F1
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP18F5
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP18F6
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP18F9
GTIFRTNA MG
152
SISNSGST N
179
DGRRGWN TGY
195
CX3CR1BII PMP18G5
RTIFRSNA MG
150
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР18Н1
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР18Н10
KTIFRSNA MG
153
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР18Н7
GIIFSNNA MG
149
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР18Н9
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР20ВЗ
GIIFSNNA MG
149
SIGSTYST N
180
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР20С12
GTIFRSNA MG
151
SISNSGST N
179
DARRGWN SGY
193
CX3CR1BII РМР20СЗ
GIIFSNNA MG
149
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР20С6
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP20D8
GTTFRSNA MG
154
SITNSGST N
182
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР20Е11
RTIFRSNA MG
150
SITNSGST N
182
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР20Е5
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII PMP20F3
GTIFSNNA MG
147
SISSSGSTN
178
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP20F4
ATIFRSNA MG
155
SISNSGST N
179
DGRRGWN TGY
195
CX3CR1BII PMP20F5
ATIFRSNA MG
155
SISNSGST N
179
DGRRGWN TGY
195
Нанотело
SEQ
CDRl*
SEQ CDRl
CDR2*
SEQ CDR2
CDR3*
SEQ CDR3
CX3CR1BII РМР21В6
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР24А12
GIIFSNNA MG
149
SISNSGSA N
183
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР24А6
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР24В9
GTIFRSNA MG
151
SISISGSTN
184
DARRGWN TGF
196
CX3CR1BII PMP24D3
GIIFSNNA MG
149
SISSTYSTN
181
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP24F7
GLIFSNNA MG
156
SISSTYSTN
181
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР28В4
ATIFRSNA MG
155
SISNSGST N
179
DGRRGWN TGY
195
CX3CR1BII PMP28F1
GIIFSNNA MG
149
SIGSTYST N
180
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP28F6
GIIFSNNA MG
149
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP28F9
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР29А5
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII PMP29D5
GTIFRSNA MG
151
SISNSGST N
179
DARRGWN SGY
193
CX3CR1BII РМР29ЕЗ
KTIFRSNA MG
153
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР29Е7
KTIFRSNA MG
153
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII PMP29G10
GTIFRSNA MG
151
SITNSGST N
182
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII PMP29G7
100
GIIFSNNA MG
149
SITNTGST N
185
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР29Н1
101
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР37А8
102
RTIFRSNA MG
150
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР37В9
103
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР37С12
104
GSIFRSNA MG
157
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР37С7
105
RTIFSNNA MG
158
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BI1 PMP37D9
106
GTVFSNN AMG
159
SISSSGSTN
178
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР37Е12
107
KPIFRSNA MG
160
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР41В10
108
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР41В11
109
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР41В8
GIIFSNNA MG
149
SIGSTYST N
180
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР41С10
111
RTIFRSNA MG
150
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
Нанотело
SEQ
CDRl*
SEQ CDRl
CDR2*
SEQ CDR2
CDR3*
SEQ CDR3
CX3CR1BII PMP41F9
112
GIIFSNNA MG
149
SIGSTYST N
180
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР41Н10
113
GLTLDDY AMG
161
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР46В5
114
RTIFRSNA MG
150
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII PMP46D3
115
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР46Н5
116
GIIFSNNA MG
149
SISSTYSTN
181
DARRGWN TAY
192
CX3CR1BII РМР48В8
117
KTIFRSNA MG
153
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII PMP48D11
118
RTIFRSNA MG
150
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII PMP48G8
119
RTIFRSNA MG
150
SISNSGST N
179
DARRGWN TGY
194
CX3CR1BII РМР48Н9
120
GTIFSNNA MG
147
SISNSGST N
179
DARRGWN TAY
192
^DR-последовательности определяли согласно "Antibody Engineering)), т. 2, под ред. Konetermann и Diibel, изд-во Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Номера последовательностей в таблице (SEQ) соответствуют номерам последовательностей в переч последовательностей, прилагаемом к настоящей заявке.
Нанотело
SEQ
CDRl
SEQ CDRl
CDR2
SEQ CDR2
CDR3
SEQ CDR3
CX3CR1BII 067
132
GSIFSSNA MA
141
AIQSVGVT К
215
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII 068
133
GSIFSSNA MA
141
AIGSVGVT К
216
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII 074
134
GSIFSSNA MA
141
AITSVGVT К
217
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII 118
135
GSIFSSNA MA
141
AINTVGVT К
218
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII 129
136
GSIFSSNA MA
141
AINGVGVT К
219
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII 158
137
GSIFSSNA MA
141
AINPVGVT К
220
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII 306
138
GSIFSSTA MA
213
AISSVGVT К
214
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII 307
139
GSIFSSTA MA
213
AISTVGVT К
221
DPRRGWD TRY
186
CX3CR1BII 308
140
GSIFSSNA MA
141
AINSVGVT К
162
DPRRGWD TRY
186
"'CDR-последовательности определяли согласно "Antibody Engineerings т. 2, под ред. Konetermann и Diibel, изд-во Springer Verlag Heidelberg Berlin, 2010. Номера последовательностей в таблице (SEQ) соответствуют номерам последовательностей в перечне 5 последовательностей, прилагаемом к настоящей заявке.
Следующим объектом настоящего изобретения являются полипептиды, имеющие один или несколько VHH-доменов.
В одном из объектов изобретения VHH-домен, предлагаемый в настоящем 10 изобретении, содержит или практически состоит из последовательности, представленной в:
а) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; или
б) аминокислотных последовательностях, которые по меньшей мере на 90%
идентичны аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; или
15 в) аминокислотных последовательностях, которые имеют 11, 10, 9, 8, 7, 6,
5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO: 3, или
г) любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-48
или SEQ ID NO: 121-140, или SEQ ID NO: 222-224.
20 В другом объекте изобретения VHH-домен, предлагаемый в настоящем
изобретении, содержит или практически состоит из последовательности,
представленной в:
а) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49; или
б) аминокислотных последовательностях, которые по меньшей мере на 95%
идентичны аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49; или
в) аминокислотных последовательностях, которые имеют 5, 4, 3, 2 или 1
аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной последовательностью SEQ
ID NO: 49, или
г) любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 49-
52.
В другом объекте изобретения VHH-домен, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит или практически состоит из последовательности, представленной в:
а) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67; или
б) аминокислотных последовательностях, которые по меньшей мере на 90%
идентичны аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67; или
в) аминокислотных последовательностях, которые имеют 12, 11, 10, 9, 8, 7,
6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотных(ое) различия(е) с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO: 67, или
г) любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 53-
102.
В другом объекте изобретения VHH-домен, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит или практически состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID NO: 121-140 или SEQ ID NO: 222-224.
В другом объекте изобретения VHH-домен, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит или практически состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID NO: 138-140.
В другом объекте изобретения VHH-домен, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит или практически состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой одной из SEQ ID NO: 222-224.
Репрезентативные VHH-домены, предлагаемые в настоящем изобретении, представлены ниже в таблице 5, а репрезентативные оптимизированные VHH-домены, предлагаемые в настоящем изобретении, представлены ниже в таблице 6:
Таблица 5: VHH-домены
SEQ ID NO: 1-48 представляют собой VHH-домены семейства 101. SEQ ID NO: 49-52 представляют собой VHH-домены семейства 9. SEQ ID NO: 53-120
представляют собой VHH-домены семейства 13.
CX3CR1BII РМР66В02
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54А12
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54АЗ
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54А4
EVQLVESGRGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54А5
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54А7
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54В1
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54В2
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54ВЗ
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54В5
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP54D5
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISSD NAKNTVYLEMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP54D8
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP54F6
KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP54G3
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54Н1
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTVSRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР54Н4
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP61F10
KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP61D1
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAFGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP61D5
KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAFGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР61Е2
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDMAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP61F11
KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQPPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTIFRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP61G2
EVQLVKSGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP61G3
KVQLVESGGGSMQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMMSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP61G4
KVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMMSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP61F4
EVQLVESGGGSVQAGASLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAVINTVGITKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР61А11
EVQLVESRGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTISGD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР61В2
EVQLVESRGGSVQAGASLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAVINTVGITKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР61С9
EVQLVKSGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQALGKQRDLVALIDSAGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNRLKPEDTAVYYCASDARRGWNTKY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР65Н02
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVHLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР65Е11
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGIAKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР65Е10
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAKAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР65Е05
KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР65В11
EVQLVKSGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAVINKVGITKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
CX3CR1BII РМР65В07
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР65В09
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSRNAMAW YRQAPGKQRDLVASINSVGITKYGDSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР65Н01
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGGIFSRNAMAW YRQAPGKQRDLVASINSVGITKYGDSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
CX3CR1BII PMP65G07
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITRYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР66Н08
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
CX3CR1BII РМР66Н04
EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMMSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP66F02
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVALINSVGITKYAGSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР66Е11
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGTTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP66D10
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQALGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFT1SRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
CX3CR1BII PMP66D08
EVQLMESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
CX3CR1BII РМР66А04
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQALGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP66D04
KVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGTIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAGINSVDITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWNTRYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP66D02
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAVINSVGITKYADSVKGRFTTSGD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP66D06
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVASIDSVGITKYRDSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDARRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP66G01
EMQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDN AKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР1Ш11
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMG WFRQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVS RDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQ FDYYGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР12В6
EVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMG WFRQAPGRERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVS RDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQ FDYYGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP12G9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGW FRQAPGKEREFVAGISGSGSRKYYADSVKGRFTISRD NARNTVYLQMNSLKPEDRAVYYCAASNSYPKVQFD YYGQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
CX3CR1BII PMP15G11
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMG WFRQAPGKEREFVAGISGSGSRKYYADSVKGRFTISR DNARNTVYLQMNSLKPEDRAVYYCAASNSYPKVQF DYYGQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
CX3CR1BII РМР18Е6
KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAY WGQGAQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР12С2
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNTAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNSG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18А10
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSAKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA Y WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18А2
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGW YRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAY WGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18А8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18А9
EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGW YRQGPGKKRDLVASISSTYSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAY WGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18В7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNSG Y WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18В9
EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18С6
EVQLMESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA Y WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18С9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA Y WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP18D1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKSTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP18D10
EVQLVESGGGLVQPGGSLGLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP18D12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP18F1
KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP18F5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP18F6
EVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP18F9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRTNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDGRRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP18G5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18Н1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQALGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18Н10
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSKTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР18Н7
EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BI1 РМР18Н9
EVQLVKSGGGLVQPGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР20ВЗ
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGW YRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAY WGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР20С12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNSG YWGQGTRVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР20СЗ
KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР20С6
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP20D8
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCATSGTTFRSNAMGW YRQGPGKKRDLVASITNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMSSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР20Е11
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGW YRQGPGKKRDLVASITNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDRNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР20Е5
KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQVPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP20F3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP20F4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSATIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCT1DGRRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP20F5
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSATIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRSTVSRD NDKNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDGRRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР21В6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDMGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР24А12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSANYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР24А6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSGD NDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР24В9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISISGSTNYADSVKGRFTVSRDN DKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGF WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP24D3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGW YRQGPGKKRDLVASISSTYSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAY WGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP24F7
EVQLMESGGGMVQVGGSLRLSCTASGLIFSNNAMG WYRQGPGKKRDLVASISSTYSTNYADSVKGRFTVSR DNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTA YWGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР28В4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAISATIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTAYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDGRRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP28F1
EMQLVESGGGVVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGW YRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAY WGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP28F6
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNHADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP28F9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQVPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР29А5
EVQLVESRGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP29D5
KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNSG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BI1 РМР29ЕЗ
EVQLVESEGGLVQPGGSLRLPCATSKTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII РМР29Е7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSKTIFRSNAMGW YRQAPGKKRGLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP29G10
EVQLMESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFRSNAMGW YRQGPGKKRDLVASITNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMSSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
CX3CR1BII PMP29G7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGIIFSNNAMGW YRQGPGKKRDLVASITNTGSTNYADSVKGRFTVSRD NDRNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
100
CX3CR1BII РМР29Н1
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDN DKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
101
CX3CR1BII РМР37А8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSAKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
102
CX3CR1BII РМР37В9
EVQLVESGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGWY RQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRDN DKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTAY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
103
CX3CR1BII РМР37С12
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGSIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
104
CX3CR1BII РМР37С7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRT1FSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
105
CX3CR1BII PMP37D9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTVFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISSSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTAY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
106
CX3CR1BII РМР37Е12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSKPIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
107
CX3CR1BII РМР41В10
EVQLVESEGGLVQPGGSLRLSCTTSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNNLKPEDTGVYYCTLDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
108
CX3CR1BII РМР41В11
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSPKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
109
CX3CR1BII РМР41В8
EVQLVESEGGVVQPGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGW YRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAY WGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:
110
CX3CR1BII РМР41С10
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKSTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
111
CX3CR1BII PMP41F9
EVQLVESGGGVVQPGESLRLSCVTSGIIFSNNAMGW YRQGPGKKRDLVASIGSTYSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAY WGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:
112
CX3CR1BII РМР41Н10
KVQLVESGGGLVQPGDSLRLSCAASGLTLDDYAMG WYRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSR DNDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
113
CX3CR1BII РМР46В5
KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTGY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
114
CX3CR1BII PMP46D3
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQVPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLRMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
115
CX3CR1BII РМР46Н5
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVTSGIIFSNNAMGW YRQGPGKKRDLVASISSTYSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTIDARRGWNTAY WGQGTPVTVSS
SEQ ID NO:
116
CX3CR1BII РМР48В8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSKTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYTDSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
117
CX3CR1BII PMP48D11
KVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
118
CX3CR1BII PMP48G8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSRTIFRSNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADSVKGRFAVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTG YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
119
CX3CR1BII РМР48Н9
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGTIFSNNAMGW YRQAPGKKRDLVASISNSGSTNYADFVKGRFTVSRD NDKNTGYLQMNSLKPEDTGVYYCTVDARRGWNTA YWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
120
CX3CR1BII 048
EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
124
CX3CR1BII 049
EVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
125
CX3CR1BII 050
EVQLVESGGGSVQPGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRELVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
126
CX3CR1BII 061
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
127
CX3CR1BII 056
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
128
CX3CR1BII 057
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRELVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
129
CX3CR1BII 060
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKQRELVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
130
CX3CR1BII 065
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
131
CX3CR1BII 067
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGS1FSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAIQSVGVTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
132
CX3CR1BII 068
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAIGSVGVTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
133
CX3CR1BII 074
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAITSVGVTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
134
CX3CR1BII 118
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAINTVGVTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
135
CX3CR1BII 129
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAINGVGVTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
136
CX3CR1BII 158
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAINPVGVTKYADSVKGRFTISRD NAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
137
CX3CR1BII 306
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAW YRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
138
CX3CR1BII 307
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAW YRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
139
CX3CR1BII 308
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
140
CX3CR1BII 00306 (DIE)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAW YRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
222
CX3CR1BII 00307 (DIE)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAW YRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
223
CX3CR1BII 00308 (DIE)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW YRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRD NSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
224
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в настоящем изобретении, гуманизируют и/или оптимизируют в отношении его стабильности, эффективности, технологичности и/или сходства с человеческими каркасными участками. Например, полипептид гуманизируют и/или оптимизируют его последовательность в одном или нескольких следующих положениях (согласно нумерации по Кэботу): 1, 11, 14, 16, 74, 83, 108. В одном из объектов изобретения полипептид содержит одну или несколько следующих мутаций: E1D, S11L, А14Р, E16G, A74S, K83R, Q108L.
В одном из объектов изобретения один или несколько каркасных участков в полипептиде, предлагаемом в настоящем изобретении, в частности, последовательность иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, предлагаемого в настоящем изобретении, гуманизируют и/или оптимизируют. В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит каркасные участки (FR), например, представленные ниже:
I) FR1, выбранный из любой одной из SEQ ID NO: 198-204;
II) FR2, выбранный из любой одной из SEQ ID NO: 205-208;
III) FR3, выбранный из любой одной из SEQ ID NO: 209-210; и/или
IV) FR4, выбранный из любой одной из SEQ ID NO: 211-212. Последовательности человеческих каркасных участков иммуноглобулинов
5 (FR), которые можно применять также в качестве последовательностей каркасных участков для иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, описанных выше, известны в данной области. В данной области известны также методы гуманизации каркасных участков иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, выведенных из видов, отличных от человека.
10 В другом объекте изобретения последовательность одного или нескольких
CDR-участков полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, в частности, в иммуноглобулиновом единичном вариабельном домене, предлагаемом в настоящем изобретении, гуманизируют и/или оптимизируют. В одном объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
15 изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в настоящем изобретении, гуманизируют и/или оптимизируют его последовательность в одном или в большем количестве следующих положений (нумерация согласно Кэботу): 52, 53.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
20 изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит одну или большее количество следующих мутаций: N52S, S53T.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, в частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный
25 домен, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит CDR2, выбранный из любой одной из SEQ ID NO: 214-221.
Репрезентативные гуманизированные и/или оптимизированные последовательности, предлагаемые в настоящем изобретении, представлены выше в таблицах 4 и 6 и ниже в таблице 7.
30 Таблица 7: Варианты с оптимизированной последовательностью
В таблице 7а представлены FR1-CDR1-FR2-CRD2 вариантов с оптимизированной последовательностью, в таблице 76 представлены FR3-CDR3-FR4-CDR4 указанных вариантов. Номера последовательностей в таблицах (SEQ)
CDR1-FR2-CDR2)
соответствуют номерам последовательностей в перечне последовательностей, прилагаемом к настоящей заявке.
Нанотело
SEQ
FRl
SEQ FRl
CDRl
SEQ CDRl
FR2
SEQ FR2
CDR2
SEQ CDR2
CX3CR1 BII068
133
EVQLVES GGGSVQA GESLRLS CAAS
198
GSIFSS NAMA
141
WYRQ
APGKR
RDLVA
205
A1GSV GVTK
216
CX3CR1 BII074
134
EVQLVES GGGSVQA GESLRLS CAAS
198
GSIFSS NAMA
141
WYRQ
APGKR
RDLVA
205
AITSV GVTK
217
CX3CR1 Bill 18
135
EVQLVES GGGSVQA GESLRLSCAAS
198
GSIFSS NAMA
141
WYRQ
APGKR
RDLVA
205
AINTV GVTK
218
CX3CR1 ВП129
136
EVQLVES GGGSVQA GESLRLS CAAS
198
GSIFSS NAMA
141
WYRQ
APGKR
RDLVA
205
AING VGVT К
219
CX3CR1 BII158
137
EVQLVES GGGSVQA GESLRLS CAAS
198
GSIFSS NAMA
141
WYRQ
APGKR
RDLVA
205
AINPV GVTK
220
CX3CR1 BII306
138
DVQLVES GGGLVQP GGSLRLS CAAS
204
GSIFSS TAMA
213
WYRQ
APGKR
RDLVA
205
AISSV GVTK
214
CX3CR1 BII307
139
DVQLVES GGGLVQP GGSLRLS CAAS
204
GSIFSS TAMA
213
WYRQ
APGKR
RDLVA
205
AISTV GVTK
221
CX3CR1 B1I308
140
DVQLVES GGGLVQP GGSLRLS CAAS
204
GSIFSS NAMA
141
WYRQ
APGKR
RDLVA
205
AINSV GVTK
162
Нанотело
SEQ
FR3
SEQ FR3
CDR3
SEQ CDR3
FR4
SEQ FR4
CX3CR1 BII049
125
YADSVKGRFTIS RDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAV YYCTS
210
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BI1050
126
YADSVKGRFTIS RDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAV YYCTS
210
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BII061
127
YADSVKGRFTIS RDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAV YYCTS
210
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BII056
128
YADSVKGRFTIS RDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAV YYCTS
210
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 ВП057
129
YADSVKGRFTIS RDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAV YYCTS
210
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BII060
130
YADSVKGRFTIS RDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAV YYCTS
210
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BII065
131
YADSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAV YYCTS
209
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BII067
132
YADSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAV YYCTS
209
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BI1068
133
YADSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAV YYCTS
209
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BII074
134
YADSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAV YYCTS
209
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BUI 18
135
YADSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAV YYCTS
209
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BII129
136
YADSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAV YYCTS
209
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 ВИ158
137
YADSVKGRFTIS RDNAKNTVYLQ MNSLKPEDTAV YYCTS
209
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
Нанотело
SEQ
FR3
SEQ FR3
CDR3
SEQ CDR3
FR4
SEQ FR4
CX3CR1 BII306
138
YADSVKGRFTIS RDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAV YYCTS
210
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BII307
139
YADSVKGRFTIS RDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAV YYCTS
210
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
CX3CR1 BII308
140
YADSVKGRFTIS RDNSKNTVYLQ MNSLRPEDTAV YYCTS
210
DPRRGW DTRY
186
WGQGTL VTVSS
212
В одном из объектов настоящего изобретения, полипептид, предлагаемый в
изобретении, может дополнительно содержать модификации, такие как
гликозильные остатки, модифицированные аминокислотные боковые цепи и т.п.
5 Специалисту в данной области должно быть очевидно, что для
фармацевтического применения на людях мишенью полипептидов, предлагаемых в изобретении, предпочтительно должен быть человеческий CX3CR1, в то время как для применения в ветеринарии мишенью полипептидов, предлагаемых в изобретении, предпочтительно должен быть CX3CR1 из вида,
10 подлежащего лечению.
Специалисту в данной области должно быть очевидно, что иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, входящие в полипептиды, предлагаемые в изобретении, в том случае, когда их применяют в качестве терапевтического агента на людях, предпочтительно представляют
15 собой гуманизированные иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены.
Согласно изобретению иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может представлять собой доменное антитело, т.е. содержащее VL или VH антитело, и/или VHH-домены, описанные выше, и/или любой другой вид 20 иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, например,
камелизированный VH, при условии, что указанные иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены представляют собой aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены.
В одном из объектов изобретения иммуноглобулиновый единичный 25 вариабельный домен практически состоит из любой последовательности
доменного антитела или последовательности VHH-домена, описанной выше. В частности, иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен практически состоит из последовательностей VHH-домена.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем 5 изобретении, содержит два или большее количество анти-СХЗСШ
иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два анти-СХЗСШ иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена, например, анти-СХЗСШ VHH. В одном из объектов изобретения два анти-
10 CX3CR1 иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена в полипептиде, предлагаемом в настоящем изобретении, имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В другом объекте изобретения два анти-СХЗСК1 иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена в полипептиде, предлагаемом в настоящем изобретении, имеют различные аминокислотные
15 последовательности.
Согласно другому варианту осуществления изобретения по меньшей мере два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена, которые присутствуют в полипептиде, предлагаемом в изобретении, могут быть связаны друг с другом либо непосредственно (т.е. без применения линкера), либо через
20 линкер. Линкер предпочтительно представляет собой пептидный линкер, и
согласно изобретению он должен быть выбран так, чтобы он давал возможность связываться по меньшей мере двум иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменам с CX3CR1, либо в одной и той же молекулы CX3CR1, либо в двух различных молекулах.
25 Выбор приемлемых линкеров среди прочего должен зависеть от эпитопов,
и, в частности, от расстояния между эпитопами на CX3CR1, с которыми связываются иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, и он должен быть очевиден специалисту в данной области на основе представленного описания необязательно после некоторых ограниченных общепринятых
30 экспериментов.
Кроме того, когда два или большее количество aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов представляют собой доменные антитела или VHH-домены, то их можно также связывать друг с
другом через третье доменное антитело или VHH-домен (где два или большее количество иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов могут быть соединены непосредственно с третьим доменным антителом или VHH-доменом или через приемлемые линкеры). Указанное третье доменное антитело или 5 указанный VHH-домен может представлять собой, например, доменное антитело или VHH-домен, обеспечивающий удлиненное время полужизни, что будет дополнительно представлено в настоящем описании. Например, последнее доменное антитело или последний VHH-домен может представлять собой доменное антитело или VHH-домен, которое/который обладает способностью
10 связываться с (человеческим) сывороточным белком, таким как (человеческий) сывороточный альбумин или (человеческий) трансферрин, что будет дополнительно указано в настоящем описании.
Альтернативно этому, два или большее количество анти-СХЗСШ иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, можно соединять в
15 серии (либо непосредственно, либо с помощью приемлемого линкера) и третье (одно) доменное антитело или третий VHH (которые могут обеспечивать увеличенное время полужизни, как указано выше) можно соединять непосредственно или с помощью линкера с одной из этих двух или большего количества вышеуказанных иммуноглобулиновых последовательностей.
20 Приемлемые линкеры представлены в настоящем описании в сочетании со
специфическими полипептидами, предлагаемыми в изобретении, и они могут, например, содержать (но, не ограничиваясь только ею) аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность предпочтительно состоит из 5 или большего количества аминокислот, 7 или большего количества
25 аминокислот, 9 или большего количества аминокислот, 11 или большего
количества аминокислот, 15 или большего количества аминокислот или по меньшей мере из 17 аминокислот, например, примерно из 20-40 аминокислот. Однако, хотя верхний предел не имеет решающего значения, но его выбирают, исходя из соображений пригодности, например, для биофармацевтического
30 производства таких полипептидов.
Линкерная последовательность может представлять собой встречающуюся в естественных условиях последовательность или не встречающуюся в естественных условиях последовательность. Для применения в терапевтических
целях линкер предпочтительно является неиммуногенным для индивидуума, которому вводят полипептид, предлагаемый в изобретении.
Одной из пригодных групп линкерных последовательностей являются линкеры, выведенные из шарнирной области тяжелой цепи антител, описанные в 5 WO 1996/34103 и WO 1994/04678.
Другими примерами являются полиаланиновые линкерные последовательности, такие как А1а-А1а-А1а.
Другими предпочтительными примерами линкерных последовательностей являются Gly/Ser-линкеры различной длины, такие как (glyxsery)z^HHKepbi, 10 включая (gly4ser)3 , (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3 и (gly3ser2)3.
Если полипептид, предлагаемый в изобретении, модифицируют путем присоединения полимера, например, полиэтиленгликольного (ПЭГ) остатка, то линкерная последовательность предпочтительно включает аминокислотный остаток, такой как цистеин или лизин, что позволяет осуществлять указанную 15 модификацию, например, ПЭГилирование, в линкерной области.
Примерами линкеров являются: GGGGS (5 GS-линкер, SEQ ID NO: 233), SGGSGGS (708-линкер, SEQ ID NO: 234), GGGGCGGGS (SGS-линкер, SEQ ID NO: 235), 20 GGGGSGGGS (908-линкер, SEQ ID NO: 236),
GGGGSGGGGS (lOGS-линкер, SEQ ID NO: 237), GGGGSGGGGSGGGGS (1 SGS-линкер, SEQ ID NO: 238), GGGGSGGGGSGGGGGGGS (1 SGS-линкер, SEQ ID NO: 239), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (20О8-линкер, SEQ ID NO: 240), 25 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (2508-линкер, SEQ ID NO: 241),
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (30О8-линкер, SEQ ID NO: 242), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (3508-линкер, SEQ ID NO: 243),
EPKSCDKTHTCPPCP (Gl-линкер из шарнирной области, SEQ ID NO: 244), 30 GGGGSGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (9GS-G1 -линкер из шарнирной области, SEQ ID NO: 245),
EPKTPKPQPAAA (верхняя длинная шарнирная область антител ламы, SEQ ID NO: 246),
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPP CPRCP (ОЗ-шарнирная область, SEQ ID NO: 247), AAA (Ala-линкер, SEQ ID NO: 248).
Кроме того, линкер может представлять собой также поли(этиленгликольный) фрагмент, что описано, например, в WO 2004/081026.
Примеры полипептидов, содержащих или состоящих из двух или большего количества aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов, представлены (но, не ограничиваясь только ими) в таблице 8а.
CX3CR1 BII018
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWY
RQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNA
KNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQ
GTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGG
GSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSS
NAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRF
TISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRYWGQGTQVTVSS
SEQ IDNO:
272
CX3CR1 BII019
EMQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWY
RQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAK
NTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDTRYWGQG
TQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG
SGGGGSEMQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSN
AMAWYRQAPGKQRDLVALINSVGITKYADSVKGRFTI
SRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDGRRGWDT
RY WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
273
CX3CR1 BII020
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWY
RQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTISRDNAK
NTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQG
TLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
GGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNA
MAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKGRFTIS
RDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTR
YWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
274
CX3CR1 BII026
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWF
RQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDN
ARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYY
GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
GGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIF
SSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKG
RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRG
WDTRYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
275
CX3CR1 BII027
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWF
RQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDN
ARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYY
GQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
GGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIF
SSNAMAWYRQAPGKQRDLVAGINSVGITKYADSVKG
RFTISRDNAKNTAYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRG
WDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
276
CX3CR1 BII006
EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRTFSSYAMGWF
RQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVKGRFTVSRDN
ARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSYPKVQFDYY
GQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
GGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRT
FSSYAMGWFRQAPGKERAFVAGISGSASRKYYADSVK
GRFTVSRDNARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAASNSY
PKVQFDYYGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
282
В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена полипептида, предлагаемого в изобретении, соединены друг с другом через другой фрагмент (необязательно посредством одного или двух линкеров), такой как другой полипептид, который в предпочтительном, но не ограничивающем объем
изобретения варианте осуществления изобретения, может представлять собой дополнительный иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, описанный выше. Указанный фрагмент может либо являться практически неактивным, либо может обладать биологической активностью, такой как 5 улучшение требуемых свойств полипептида, либо может придавать полипептиду одно или несколько дополнительных требуемых свойств. Например, фрагмент может (но, не ограничиваясь только этим) удлинять время полужизни белка или полипептида и/или снижать их иммуногенность или улучшать любое другое требуемое свойство.
10 В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в
изобретении, включает, прежде всего, если он предназначен для применения в качестве терапевтического агента, фрагмент, который удлиняет время полужизни полипептида, предлагаемого в изобретении, в сыворотке или другой общей воде организма пациента. Понятие "время полужизни" определяют как
15 время, необходимое для снижения концентрации (модифицированного)
полипептида на 50% in vivo, например, в результате расщепления полипептида и/или клиренса, и/или секвестрования с помощью естественных механизмов.
Согласно другому варианту осуществления изобретения два иммуноглобулиновых единичных вариабельных домена можно сливать с
20 молекулой сывороточного альбумина, как описано, например, в WO01/79271 и WO03/59934.
Альтернативно этому, указанный удлиняющий время полужизни фрагмент можно ковалентно связывать или сливать с указанным полипептидом, и он может представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) Fc-область,
25 остаток альбумина, фрагмент остатка альбумина, альбуминсвязывающий остаток, такой как антиальбуминовый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, трансферринсвязывающий остаток, такой как антитрансферриновый иммуноглобулиновый единичный вариабельный, полиоксиалкиленовую молекулу, такую как, молекула полиэтиленгликоля,
30 альбуминсвязывающий пептид или производное гидроксиэтилкрахмала (HES).
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в изобретении, содержит фрагмент, который связывается с антигеном, присутствующим в крови, таким как сывороточной альбумин, сывороточные иммуноглобулины,
тироксинсвязывающий белок, фибриноген или трансферрин, что приводит к удлинению времени полужизни in vivo образовавшегося полипептида, предлагаемого в изобретении. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения указанный фрагмент представляет собой альбуминсвязывающий 5 иммуноглобулин и более конкретно альбуминсвязывающий
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, такой как альбуминсвязывающий VHH-домен.
В другом варианте осуществления изобретения полипептид, предлагаемый в изобретении, содержит фрагмент, который связывается с сывороточным 10 альбумином, где указанный фрагмент представляет собой
альбуминсвязывающий пептид, описанный, например, в публикациях международных заявок на патент WO 2008/068280 и WO 2009/127691.
Указанный альбуминсвязывающий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен (который обозначают также как антиальбуминовый 15 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен), если он предназначен для применения на людях, должен предпочтительно связываться с человеческим сывороточным альбумином и предпочтительно представляет собой гуманизированный альбуминсвязывающий VHH-домен.
Иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены, которые
20 связываются с человеческим сывороточным альбумином, известны в данной
области и описаны более подробно, например, в WO 2006/122786. Наиболее
предпочтительный альбуминсвязывающий VHH-домен состоит из или содержит
аминокислотную последовательность, представленную в любой одной из SEQ ID
NO: 230-232:
25 Таблица 86
ALB-1
AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMS WVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRS SQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
230
ALB-11 (гуманизированная версия ALB-1)
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMS WVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTI SRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRS SQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
231
ALB-2
AVQLVESGGGLVQGGGSLRLACAASERIFDLNLM GWYRQGPGNERELVATCITVGDSTNYADSVKGRF TISMDYTKQTVYLHMNSLRPEDTGLYYCKIRRTW HSEL WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:
232
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения полипептид, предлагаемый в изобретении, можно связывать с одним или несколькими участками антитела, фрагментами или доменами, которые придают одну или несколько эффекторных функций полипептиду, предлагаемому в изобретении, 5 и/или могут придавать способность связываться с одним или несколькими Fc-рецепторами. Для этой цели, например (но, не ограничиваясь только указанным) участки антитела могут представлять собой или содержать СН2- и/или СНЗ-домены антитела, например, из тяжелой цепи антитела (что описано выше), и более предпочтительно из канонического человеческого состоящего из 4 цепей
10 антитела; в частности, полипептид, предлагаемый в изобретении, можно
связывать с Fc-областью, например, из человеческого IgG, из человеческого IgE или другого человеческого Ig. Например, в WO 94/04678, описаны состоящие из тяжелой цепи антитела, содержащие верблюжий VHH-домен или его гуманизированное производное, в котором СН2- и/или СНЗ-домен антитела из
15 представителей верблюдовых заменен человеческим СН2- и/или СНЗ-доменами с образованием иммуноглобулина, который состоит из двух тяжелых цепей, каждая из которых содержит - необязательно гуманизированный - VHH-домен и человеческие СН2- и СНЗ-домены (но не СН1-домен), указанный иммуноглобулин обладает эффекторной функцией, обусловленной СН2- и СНЗ-
20 доменами, может функционировать без присутствия каких-либо легких цепей и обладает удлиненным временем полужизни по сравнению с соответствующими VHH-доменами без указанной модификации.
В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит два анти-СХЗСШ VHH и VHH, способный связываться с
25 сывороточным альбумином. В одном из объектов изобретения VHH сливают с помощью линкерных пептидов. Репрезентативные примеры указанных полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, представлены ниже.
В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит первый анти-СХЗСШ VHH, слитый с первым линкерным
30 пептидом, который в свою очередь слит с VHH, обладающим способностью связываться с сывороточным альбумином, который в свою очередь слит со вторым линкерным пептидом, который в свою очередь слит со вторым анти-СХЗСШ VHH. В одном из объектов изобретения первый или второй линкерный
пептид представляет собой 908-линкер, в одном из объектов изобретения первый и второй линкерный пептид представляют собой 908-линкер. В одном из объектов изобретения VHH, который обладает способностью связываться с сывороточным альбумином, обладает способностью связываться с человеческим сывороточным альбумином. В одном из объектов изобретения VHH, который обладает способностью связываться с сывороточным альбумином, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 231. В одном из объектов изобретения первый и второй анти-СХЗСШ VHH имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В одном из объектов изобретения первый или второй анти-СХЗСШ VHH имеет CDRl, CDR2 и CDR3, представленные в:
- SEQ ID NO: 213, 214 и 186; или
- SEQ ID NO: 213, 221 и 186; или
- SEQIDNO: 141, 162 и 186.
В одном из объектов изобретения первый и второй aHTH-CX3CRl VHH имеет CDRl, CDR2 и CDR3, представленные в:
- SEQ ID NO: 213, 214 и 186; или
- SEQ ID NO: 213, 221 и 186; или -SEQ ID NO: 141, 162 и 186.
В одном из объектов изобретения первый или второй aHTH-CX3CRl VHH имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой одной из SEQ ID NO: 138-140 или SEQ ID NO: 222-224. В одном из объектов изобретения первый и второй aHTH-CX3CRl VHH имеют одинаковую аминокислотную последовательность, где указанная аминокислотная последовательность представляет собой последовательность, представленную в любой одной из SEQ ID NO: 138-140 или SEQ ID NO: 222-224.
Примерами полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, являются (но, не ограничиваясь только ими) полипептиды, представленные в любой одной из SEQ ID NO: 225-227, 249 или 277-281.
CX3CR1BII 036
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMA
WYRQAPGKRRDLVAA1NSVGVTKYADSVKGRFTIS
RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGL
VQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLE
WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ
MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG
GGSGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIF
SSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSV
KGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSD
PRRGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
249
CX3CR1BII 040
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMA
WYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTIS
RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGS
VQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRD
LVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQ
MNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQV
TVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
GGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFS
SFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVK
GRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGS
LSRSSQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
279
CX3CR1BII 041
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMA
WYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTIS
RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQAGESLR
LSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSV
GVTKYADSVKGRFT1SRDNAKNTVYLQMNSLKPE
DTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQGTQVTVSSGGG
GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEV
QLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWV
RQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRD
NAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQG
TLVTVSS
SEQ ID NO:
280
CX3CR1BII 042
EVQLVESGGGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMA
WYRQAPGKRRDLVAA1NSVGVTKYADSVKGRFTIS
RDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
GGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLR
LSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGS
GSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPE
DTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGG
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESG
GGSVQAGESLRLSCAASGSIFSSNAMAWYRQAPGK
RRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISRDNAKNTV
YLQMNSLKPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQG
TQVTVSS
SEQ ID NO:
281
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит анти-СХЗСШ VHH и Fc-домен. В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит анти-СХЗСШ VHH, слитый с линкерным пептидом, который в свою очередь
слит с Fc-доменом. В одном из объектов изобретения линкерный пептид представляет собой 1 SGS-линкер. В одном из объектов изобретения Fc-домен имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 250 или 252. В одном из объектов изобретения VHH имеет CDRl, CDR2 и CDR3, представленные в:
- SEQ ID NO: 213, 214 и 186; или
- SEQ ID NO: 213, 221 и 186; или
- SEQ IDNO: 141, 162 и 186.
В одном из объектов изобретения VHH имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой одной из SEQ ID NO: 138-140 или SEQ ID NO: 222-224. В одном из объектов изобретения полипептид находится в форме димера, при этом, например, димер образуется с помощью одного или нескольких дисульфидных мостиков.
Примерами полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, являются (но, не ограничиваясь только ими) полипептиды, представленные в любой одной из SEQ ID NO: 251, 253 или 254.
306D-hFc
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMA
WYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTIS
RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCP
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK
SEQ ID NO:
253
307D-hFc
DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMA
WYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTIS
RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCP
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY
RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK
SEQ ID NO:
254
Полипептид, предлагаемый в изобретении, можно модифицировать для улучшения его свойств. В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, можно модифицировать с целью 5 повышения его стабильности при хранении. В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, можно модифицировать с целью облегчения его экспрессии в конкретной системе-хозяине. Например, можно модифицировать первый кодон полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении. В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в
10 настоящем изобретении, начинается с глутаминовой кислоты (glu) в качестве его первой аминокислоты. В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, начинается с аспарагиновой кислоты (asp) в качестве его первой аминокислоты, например, для снижения образования пироглутамата на N-конце в процессе хранения и повышения тем самым стабильности
15 продукта. В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в
настоящем изобретении, начинается с аланина (ala) или валина (val) в качестве его первой аминокислоты, например, для облегчения экспрессии полипептида в прокариотической экспрессионной системе, такой как Escherichia coli. Указанную модификацию полипептида, предлагаемого в настоящем
20 изобретении, осуществляют с помощью методик, известных в данной области.
Репрезентативные примеры полипептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, с модифицированным первым кодоном, представлены в любой одной из SEQ ID NO: 257-262 и 263-266 и в таблицах 11 и 12, ниже:
Таблица!1
CX3CR1BII
00312
(D1A)
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMA
WYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTIS
RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRY WGQGTL VTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGL
VQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLE
WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ
MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG
GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIF
SSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSV
KGRFT1SRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSD
PRRGWDTRYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
257
CX3CR1BII
00313
(D1A)
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMA
WYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTIS
RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGL
VQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLE
WVSS1SGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ
MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG
GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIF
SSTAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSV
KGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSD
PRRGWDTRYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:
258
CX3CR1BII
00314
(D1A)
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMA
WYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTIS
RDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWD
TRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGL
VQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLE
WVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQ
MNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGG
GGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIF
SSNAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSV
KGRFT1SRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSD
PRRGWDTRYWGQGTLVTVSS
SEQ IDNO:
259
CX3CR1BII
00312
(DIV)
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAW
YRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKGRFTISR
DNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDT
RYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV
QPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW
VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQM
NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGG
SGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSS
TAMAWYRQAPGKRRDLVAAISSVGVTKYADSVKG
RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPR
RGWDTRY WGQGTLVTVSS
SEQ IDNO:
260
CX3CR1BII
00313
(DIV)
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAW
YRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISR
DNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDT
RYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV
QPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW
VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQM
NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGG
SGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSS
TAMAWYRQAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVK
GRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDP
RRGWDTRY WGQGTL VTVSS
SEQ IDNO:
261
CX3CR1BII
00314
(DIV)
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMAW
YRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVKGRFTISR
DNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDT
RYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLV
QPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEW
VSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQM
NSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGG
SGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSS
NAMAWYRQAPGKRRDLVAAINSVGVTKYADSVK
GRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDP
RRGWDTRYWGQGTL VTVSS
SEQ ID NO:
262
307D-hFc (DIV)
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSSTAMAWYR
QAPGKRRDLVAAISTVGVTKYADSVKGRFTISRDNSK
NTVYLQMNSLRPEDTAVYYCTSDPRRGWDTRYWGQG
TLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSCPPCPAPEAAGGPSVF
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP
PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ IDNO:
266
Еще в одном объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, отличается наличием одного или нескольких из следующих свойств:
5 • связывается с высокой аффинностью с человеческим CX3CR1;
• ингибирует связывание растворимого фракталкина с человеческим CX3CR1;
• ингибирует индуцированный фракталкином хемотаксис;
• ингибирует индуцированную фракталкином интернализацию 10 человеческого рецептора CX3CR1;
• обладает перекрестной реактивностью с CX3CR1 обезьян циномолгус (супо), при этом величина E/IC50, характеризующая связывание и функциональное ингибирование человеческого CX3CR1, в 10 раз превышает соответствующую величину для cynoCX3CRl.
15 Таким образом, в одном из объектов изобретения полипептид,
предлагаемый в настоящем изобретении, обладает аффинностью к человеческому CX3CR1, что характеризуется величиной ГС50, меньшей или равной ЮнМ, или меньшей или равной 5нМ, или меньшей или равной 2,5нМ или меньшей или равной 1нМ, по данным, полученным с помощью FACS в условиях
20 конкуренции.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, обладает аффинностью к человеческому CX3CR1, что характеризуется величиной ЕС50, меньшей или равной ЮнМ, или меньшей или равной 5нМ, или меньшей или равной 2,5нМ, или меньшей или равной 1нМ, по
25 данным, полученным путем анализа клеточного связывания с помощью FACS.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, блокирует связывание человеческого CX3CR1 с человеческим
фракталкином на 50% или более, или на 60% или более, или на 70% или более,
или на 80% или более, или на 90% или более, или на 95% или более, по данным,
полученным с помощью FACS в условиях конкуренции с использованием
человеческого фракталкина.
5 В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем
изобретении, блокирует связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1, что характеризуется величиной IC50, меньшей или равной ЗООнМ, или меньшей или равной ЮОнМ, или меньшей или равной 20нМ, или меньшей или равной ЮнМ, меньшей или равной 5нМ, меньшей или равной 2,5нМ или 10 меньшей или равной 1нМ по данным, полученным с помощью FACS в условиях конкуренции с использованием человеческого фракталкина.
В другом объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, ингибирует индуцированный фракталкином хемотаксис, опосредуемый человеческим CX3CR1, на 10% или более, или на 30% или более, 15 или на 40% или более, или на 50% или более, или на 60% или более, или на 70% или более, или на 80% или более, или на 90% или более.
В следующем объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, ингибирует индуцированный фракталкином хемотаксис, опосредуемый человеческим CX3CR1, что характеризуется величиной IC50, 20 меньшей или равной 500нМ, или меньшей или равной ЮОнМ, или меньшей или равной 75нМ, или меньшей или равной 50нМ, или меньшей или равной ЮнМ, или меньшей или равной 5нМ.
В следующем объекте изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, ингибирует индуцированную фракталкином интернализацию 25 человеческого рецептора CX3CR1, что характеризуется величиной IC50,
меньшей или равной ЮнМ, или меньшей или равной 5нМ, или меньшей или равной 1нМ.
Согласно другому варианту осуществления изобретения приводящая к удлинения времени полужизни модификация полипептида, предлагаемого в 30 изобретении (указанная модификация снижает также иммуногенность
полипептида), заключается в присоединении пригодного фармакологически приемлемого полимера, такого как поли(этиленгликоль) (ПЭГ) с прямой или разветвленной цепью или его производные (например,
метоксиполи(этиленгликоль) или мПЭГ). Как правило, можно использовать любую приемлемую форму ПЭГилирования, такую как ПЭГилирование, известное в данной области для антител и фрагментов антител (включая (но, не ограничиваясь только ими) "доменные" антитела и scFv-фрагменты); в качестве 5 ссылки можно указать, например, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 2002, cc. 531545; Veronese и Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 2003, cc. 453-456; Harris и Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2, 2003; WO 2004/060965 и US 6875841.
Кроме того, в продажу поступают различные реагенты для ПЭГилирования полипептидов, например, от фирм Nektar Therapeutics, США или NOF
10 Corporation, Япония, такие как продукты серии Sunbright(r) ЕА, серии SH, серии МА, серии СА и серии ME, такие как Sunbright(r) МЕ-100МА, Sunbright(r) МЕ-200МА и Sunbright(r) МЕ-400МА.
Предпочтительно применяют сайтнаправленное ПЭГилирование, в частности через остаток цистеина (см., например, Yang и др., Protein Engineering
15 16, 2003, cc. 761-770). Например, для этой цели ПЭГ можно присоединять к остатку цистеина, который в естественных условиях присутствует в полипептиде, предлагаемом в изобретении, полипептид, предлагаемый в изобретении, можно модифицировать так, чтобы в него можно было вводить один или несколько остатков цистеина для присоединения ПЭГ, или
20 аминокислотную последовательность, содержащую один или несколько остатков цистеина, предназначенных для присоединения ПЭГ, можно сливать с N- и/или С-концом и/или ПЭГ можно присоединять к линкерной области, соединяющей два или большее количество доменов полипептида, предлагаемого в изобретении, для всех указанных подходов можно применять методики
25 конструирования белков, хорошо известные специалисту в данной области. Предпочтительно для полипептидов, предлагаемых в изобретении, применяют ПЭГ с молекулярной массой, превышающей 5 кДа, например превышающей 10 кДа, но более низкой чем 200 кДа, например, более низкой чем 100 кДа; например, составляющей от 20 до 80 кДа.
30 Касательно ПЭГилирования следует отметить, что, как правило,
изобретение относится также к любому полипептиду, предлагаемому в изобретении, который ПЭГилирован в одном или нескольких аминокислотных положениях, предпочтительно таким образом, что ПЭГилирование (1) удлиняет
время полужизни in vivo; или (2) снижает иммуногенность; или (3) обеспечивает одно или несколько дополнительных ценных свойств, хорошо известных для ПЭГилирования; или (4) не оказывает существенного воздействия на аффинность полипептида к CX3CR1 (например, не снижает указанную аффинность более чем на 50% и более предпочтительно более чем на 10% при определении с помощью приемлемого анализа, описанного в данной области, например, анализа, описанного в представленных ниже примерах); и/или (5) не оказывает влияния на любое другое из требуемых свойств полипептидов, предлагаемых в изобретении. Приемлемые ПЭГ-группы и методы их присоединения, как специфические, так и неспецифические, хорошо известны специалисту в данной области.
Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения ПЭГилированный полипептид, предлагаемый в изобретении, включает один ПЭГ-остаток линейного ПЭГ с молекулярной массой 40 или 60 кДа, при этом остаток ПЭГ присоединен к полипептиду в линкерной области, в частности, присоединен к остатку Cys в положении 5 GSS-линкерного пептида, как представлено в SEQ ID NO: 235.
Предпочтительными примерами ПЭГилированных полипептидов, предлагаемых в изобретении, являются пептиды, ПЭГилированные с помощью одного из указанных выше реагентов для ПЭГилирования, такого как "Sunbright(r) МЕ-400МА", химическая формула которого представлена ниже:
который имеет среднюю молекулярную массу 40 кДа. Терапевтические применения
Одним из объектов настоящего изобретения является полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, или фармацевтическая композиция, которая содержит указанный полипептид, предназначенный/предназначенная для применения в качестве лекарственного средства.
Одним из объектов настоящего изобретения является применение полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, или фармацевтической
композиции, содержащей указанный полипептид, для лечения или профилактики кардио- и цереброваскулярных атеросклеротических нарушений, заболевания периферических артерий, рестеноза, диабетической нефропатии, гломерулонефрита, человеческого серповидного гломерулонефрита, IgA-5 нефропатии, мембранозной нефропатии, волчаночного нефрита, васкулита, включая пурпуру Геноха-Шенлейна и гранулематоз Вегенера, ревматоидного артрита, остеоартрита, отторжения трансплантата, системного склероза, нейродегенеративных нарушений и демиелинизирующего заболевания, рассеянного склероза (PC), болезни Альцгеймера, легочных заболеваний, таких 10 как ХОЗЛ, астма, нейропатической боли, связанной с воспалением боли или рака.
Другим объектом настоящего изобретения является применение полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, или фармацевтической композиции, содержащей указанный полипептид, для лечения или профилактики 15 атеросклероза.
Другим объектом настоящего изобретения является применение полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, или фармацевтической композиции, содержащей указанный полипептид, для лечения или профилактики атеросклероза путем предупреждения и/или снижения образования новых 20 атеросклеротических повреждений или бляшек и/или путем предупреждения или замедления развития существующих повреждений и бляшек.
Другим объектом настоящего изобретения является применение полипептида, предлагаемого в настоящем изобретении, или фармацевтической композиции, содержащей указанный полипептид, для лечения или профилактики 25 атеросклероза путем изменения состава бляшек для снижения риска разрушения бляшек и атеротромботических случаев.
Одним из объектов настоящего изобретения является также способ лечения или снижения риска кардио- и цереброваскулярных атеросклеротических нарушений, заболевания периферических артерий, рестеноза, диабетической 30 нефропатии, гломерулонефрита, человеческого серповидного гломерулонефрита, IgA-нефропатии, мембранозной нефропатии, волчаночного нефрита, васкулита, включая пурпуру Геноха-Шенлейна и гранулематоз Вегенера, ревматоидного артрита, остеоартрита, отторжения трансплантата, системного склероза,
нейродегенеративных нарушений и демиелинизирующего заболевания, рассеянного склероза (PC), болезни Альцгеймера, легочных заболеваний, таких как ХОЗЛ, астма, нейропатической боли, связанной с воспалением боли или рака, у индивидуума, который имеет риск указанного заболевания или 5 состояния, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, или фармацевтическую композицию, содержащую указанный полипептид.
Одним из объектов настоящего изобретения является также способ лечения или снижения риска атеросклероза, у индивидуума, который страдает или имеет
10 риск указанного заболевания или состояния, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, или фармацевтическую композицию, содержащую указанный полипептид.
Одним из объектов настоящего изобретения является также способ лечения
15 или снижения риска атеросклероза, путем предупреждения и/или снижения
образования новых атеросклеротических повреждений или бляшек и/или путем предупреждения или замедления развития существующих повреждений и бляшек у индивидуума, который страдает или имеет риск указанного заболевания или состояния, заключающийся в том, что вводят индивидууму в
20 терапевтически эффективном количестве полипептид, предлагаемый в
настоящем изобретении, или фармацевтическую композицию, содержащую указанный полипептид.
Одним из объектов настоящего изобретения является также способ лечения или снижения риска атеросклероза, путем изменения состава бляшек таким
25 образом, чтобы снижать риск разрушения бляшек и атеротромботических случаев у индивидуума, который страдает или имеет риск указанного заболевания или состояния, заключающийся в том, что вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, или фармацевтическую композицию, содержащую
30 указанный полипептид.
В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, показан для применения при лечении или профилактике заболевания или нарушения, ассоциированного с CX3CR1.
В одном из объектов изобретения полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении, показан для применения при лечении или профилактике заболеваний или нарушений, при которых желательной является модуляция активности CX3CR1-рецептора. Одном из объектов настоящего изобретения 5 является также способ лечения или снижения риска заболеваний или состояний, при которых антагонистическое действие в отношении CX3CR1-рецептора оказывает благоприятное воздействие, заключающийся в том, что вводят индивидууму, который страдает или имеет риск указанного заболевания или состояния, полипептид, предлагаемый в настоящем изобретении.
10 Ожидается, что профилактика является наиболее важной для лечения
индивидуумов, которые имели эпизод или рассматриваются как имеющие повышенный риск рассматриваемого заболевания или состояния. К индивидуумам, имеющим риск развития конкретного заболевания или состояния, как правило, относятся индивидуумы, у которых в семейном
15 анамнезе встречается указанное заболевание или состояние, или у которых с помощью генетического тестирования или скрининга установлена высокая чувствительность к развитию указанного заболевания или состояния.
В контексте настоящего изобретения понятие "предупреждение, лечение и/или облегчение" включает не только предупреждение и/или лечение, и/или
20 облегчение заболевания, но, как правило, включает также предупреждение
возникновения заболевания, замедление или реверсию развития заболевания, предупреждение или замедление возникновения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием, уменьшение и/или облегчение одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заболеванием, снижение
25 серьезности и/или продолжительности любого из симптомов, ассоциированных с ним, и/или предупреждение дополнительного повышения серьезности заболевания и/или любых симптомов, ассоциированных с ним, предупреждение, снижение или реверсию любого физиологического повреждения, вызванного заболеванием, и, как правило, любое фармакологическое действие, которые
30 является благоприятным для пациента, подлежащего лечению.
Подлежащий лечению индивидуум представляет собой млекопитающее и более конкретно человека. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, индивидуум, подлежащий лечению, должен представлять собой прежде
всего индивидуума, который страдает или имеет риск заболеваний, нарушений или состояний, упомянутых в настоящем описании.
Специалисту в данной области должно быть очевидно, что указанные выше способы лечения заболевания включают приготовление лекарственного 5 средства, предназначенного для лечения заболевания. Кроме того, очевидно, что полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно применения в качестве действующего вещества в лекарственном средстве или фармацевтической композиции, предназначенном/предназначенной для лечения указанных выше заболеваний. Таким образом, изобретение относится также к применению
10 полипептида, предлагаемого в изобретении, для приготовления
фармацевтической композиции, предназначенной для предупреждения, лечения и/или облегчения любого из упомянутых выше заболеваний, нарушений или состояний. Изобретение относится также к полипептиду, предлагаемому в изобретении, для терапевтического или профилактического применения и, в
15 частности, для предупреждения, лечения и/или облегчения любого из
упомянутых выше заболеваний, нарушений или состояний. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, предназначенной для предупреждения, лечения и/или облегчения любого из упомянутых выше заболеваний, нарушений или состояний, где указанная композиция содержит по
20 меньшей мере один полипептид, предлагаемый в изобретении.
Полипептиды, предлагаемые в изобретении, и/или содержащие их композиции можно вводить пациенту, который нуждается в этом, любым приемлемым путем в зависимости от подлежащей применению конкретной фармацевтической формы или композиции. Так, полипептиды, предлагаемые в
25 изобретении, и/или содержащие их композиции можно вводить в эффективном количестве или эффективной дозе внутривенно, подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно, трансдермально, орально, подъязычно (например, в форме подъязычной таблетки, спрея или капли, помещаемых под язык, которые адсорбируются через слизистые мембраны в капиллярную сеть под языком),
30 (внутри)назально (например, в форме назального спрея и/или в виде аэрозоля), местно, с помощью суппозитория, путем ингаляции в стекловидное тело (прежде всего для лечения сухой AMD (дегенерация желтого пятна) или глаукомы), или любым другим приемлем путем.
Полипептиды, предлагаемые в изобретении, и/или содержащие их композиции вводят согласно схеме лечения, которая пригодна для предупреждения, лечения и/или облегчения заболевания, нарушения или состояния, подлежащего предупреждению, лечению или облегчению. Как 5 правило, клиницист может определять приемлемую схему лечения в
зависимости от таких факторов, как заболевание, нарушение или состояние, подлежащее предупреждению, лечению или облегчению, серьезность заболевания, серьезность его симптомов, конкретный полипептид, предлагаемый в изобретении, подлежащий применению, конкретный путь введения
10 фармацевтической формы или композиции, подлежащей применению, возраст, пол, диета, общее состояние пациента и аналогичные факторы, хорошо известные клиницисту. Как правило, схема лечения должна включать введение одного или нескольких полипептидов, предлагаемых в изобретении, или одной или нескольких композиций, содержащих их, в терапевтически и/или
15 профилактически эффективных количествах или дозах.
Как правило, для предупреждения, лечения и/или облегчения любого из упомянутых выше заболеваний, нарушений или состояний и в зависимости от конкретного заболевания, нарушения или состояния, подлежащего лечению, эффективности конкретного подлежащего применению полипептида,
20 предлагаемого в изобретении, конкретного пути введения и конкретной применяемой фармацевтической формы или композиции полипептиды, применяемые в изобретении, как правило, можно вводить в количестве, составляющем от 0,005 до 20,0 мг на килограмм веса тела в дозе, предпочтительно от 0,05 до 10,0 мг/кг/дозу и более предпочтительно от 0,5 до 10
25 мг/кг/дозу, либо непрерывно (например, путем инфузии) или в виде единичных доз (таких, например, как ежедневные, еженедельные или ежемесячные дозы; ср. ниже), но их можно в значительной степени изменять, прежде всего в зависимости от указанных выше параметров.
Для профилактических применений композиции, содержащие полипептиды,
30 предлагаемые в изобретении, можно вводить также в аналогичных или
несколько более низких дозах. Дозу может также регулировать каждый лечащий врач в случае любого осложнения.
В зависимости от конкретного полипептида, предлагаемого в изобретении, и его специфических фармакокинетических и других свойств, его можно вводить ежедневно, каждый второй, третий, четвертый, пятый или шестой день, еженедельно, ежемесячно и т.п. Схема введения может включать 5 пролонгированное еженедельное применение. Под "пролонгированным" подразумевают применение в течение периода времени, составляющего по меньшей мере две недели и предпочтительно несколько месяцев или лет.
Эффективность полипептидов, предлагаемых в изобретении, и содержащих их композиций можно тестировать с использованием любого приемлемого
10 анализа in vitro, клеточного анализа, анализа in vivo и/или на хорошо известных животных моделях, или с помощью любой их комбинации в зависимости от специфического представляющего интерес заболевания. Приемлемые анализы и животные модели очевидны специалисту в данной области, и они представляют собой анализы, применяемые ниже в примерах.
15 Для фармацевтического применения полипептиды, предлагаемые в
изобретении, можно приготавливать в виде фармацевтического препарата, содержащего (I) по меньшей мере один полипептид, предлагаемый в изобретении, и (И) по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, эксципиент, адъювант и/или стабилизатор, и (III)
20 необязательно один или несколько дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. Под "фармацевтически приемлемым" подразумевается, что соответствующий продукт не обладает какими-либо биологическими или другими нежелательными побочными действиями при введении индивидууму и не оказывает вредного действия при взаимодействии с
25 любым из остальных компонентов фармацевтической композиции (такой,
например, как фармацевтическое действующее вещество), в которую он входит. Конкретные примеры можно обнаружить в стандартных справочниках, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-ое изд., изд-во Mack Publishing Company, США, 1990. Например, полипептиды, предлагаемые в изобретении,
30 можно включать в препаративную форму и вводить любым методом, хорошо известным для канонических антител и фрагментов антител и других фармацевтически активных белков. Так, согласно следующему варианту осуществления изобретения изобретение относится к фармацевтической
композиции или препарату, которая/который содержит по меньшей мере один полипептид, предлагаемый в изобретении, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, эксципиент, адъювант и/или стабилизатор и необязательно одну или несколько дополнительных 5 фармацевтически активных субстанций.
Например, указанная препаративная форма может представлять собой (но, не ограничиваясь только указанной) форму, пригодную для орального введения, для парентерального введения (например, путем внутривенной, внутримышечной, внутриоболочечной, внутрипросветной или
10 внутрибрюшинной инъекции или внутривенной инфузии), для местного, для подъязычного введения, для введения путем ингаляции, с помощью кожного пластыря, путем имплантации, с помощью суппозитория, для трансдермального, назального введения, введения в стекловидное тело, ректального или вагинального введения и т.п. Указанные приемлемые формы введения - которые
15 могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими, в зависимости от пути
введения -а также методы и носители, применяемые при их получении, должны быть очевидны специалисту в данной области.
Фармацевтические препараты для парентерального введения, такого как внутривенная, внутримышечная, подкожная инъекция или внутривенная
20 инфузия, могут представлять собой, например, стерильные растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии или порошки, содержащие действующее вещество, и которые можно применять для инфузии или инъекции необязательно после дополнительной стадии растворения или разведения. Приемлемыми носителями или разбавителями для таких препаратов являются, например (но, не
25 ограничиваясь только ими) стерильная вода и фармацевтически приемлемые
водные буферы и растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнкса; водные растворы масел; глицерин; этанол; гликоли, такие как пропиленгликоль, или также минеральные масла, животные масла и растительные масла, например,
30 арахисовое масло, соевое масло, а также их приемлемые смеси.
Растворы действующего вещества или его солей могут содержать также консерванты для предупреждения роста микроорганизмов, такие как антибактериальные и противогрибковые агенты, например, парабены,
хлорбутанол, фенол, сорбиновая кислота, тимеросал (тиомерсал) и т.п. Во многих случаях может оказаться предпочтительным включать изотонические агенты, например, сахара, буферы или хлорид натрия. Требуемую текучесть можно поддерживать, например, путем образования липосом, путем 5 поддерживания требуемого размера частиц в случае дисперсий или путем
применения поверхностно-активных веществ. Можно добавлять также другие агенты, замедляющие абсорбцию, например, моностеарат алюминия и желатин.
Во всех случаях конечная лекарственная форма должна быть стерильной, текучей и стабильной в условиях производства и хранения. Стерильные
10 инъецируемые растворы получают путем включения действующего вещества в требуемом количестве в соответствующий растворитель при необходимости с различными другими перечисленными выше ингредиентами, с последующей стерилизацией фильтрацией. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов предпочтительными методами получения
15 являются методы вакуумной сушки и сушки вымораживанием, которые позволяют получать порошок действующего вещества плюс любого дополнительного ингредиента, присутствующего раньше в стерилизованных фильтрацией растворах.
Как правило, предпочтительными являются водные растворы или
20 суспензии. В целом, приемлемыми формами для терапевтических белков, таких как полипептиды, предлагаемые в изобретении, являются забуференные растворы белка, например, растворы, включающие белок в приемлемой концентрации (например, от 0,001 до 400 мг/мл, предпочтительно от 0,005 до 200 мг/мл, более предпочтительно от 0,01 до 200 мг/мл, более предпочтительно
25 1,0 - 100 мг/мл, например, 1,0 мг/мл (i.v.-введение) или 100 мг/мл (s.c-введение), и водный буфер, такой как
- забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,4,
- другие фосфатные буферы, рН 6,2-8,2,
- гистидиновые буферы, рН 5,5-7,0, 30 - сукцинатные буферы, рН 3,2-6,6 и
- цитратные буферы, рН 2,1-6,2,
и необязательно соли (например, NaCl) и/или сахара или многоатомные спирты (такие как трегалоза, маннит или глицерин) для придания изотоничности раствору.
Предпочтительными забуференными растворами белка являются растворы, 5 включающие полипептид, предлагаемый в изобретении, в концентрации 0,05 мг/мл, растворенный в 25мМ фосфатном буфере, рН 6,5, для достижения изотоничности которого добавляют трегалозу в концентрации 220мМ. Кроме того, в указанные растворы можно включать другие агенты, такие как поверхностно-активное вещество, например, Твин-20 или Твин-80 в
10 концентрации 0,02%. Формы для подкожного введения могут включать полипептид, предлагаемый в изобретении, в существенно более высоких концентрациях, например, вплоть до 100 мг/мл или даже превышающих 100 мг/мл. Однако, как должно быть очевидно специалисту в данной области, ингредиенты и их количества, указанные выше, представляют собой только один
15 предпочтительный вариант. Другие варианты и их модификации должны быть очевидны специалисту в данной области или их легко можно определять на основе представленного выше описания.
Полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно вводить также с помощью приемлемого депо, препаративных форм с медленным
20 высвобождением или пролонгированным высвобождением, например,
пригодных для инъекции, с использованием контролирующих высвобождение устройств для имплантации под кожу и/или с использованием дозирующего насоса или других устройств, применение которых для введения фармацевтически активных субстанций или действующих веществ хорошо
25 известно. Кроме того, полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно включать в форму в виде геля, крема, спрея, капель, пластыря или пленки, которые при их нанесении на кожу обеспечивают проникновение действующего вещества через кожу.
Кроме того, по сравнению с каноническими антителами или фрагментами
30 антител одним из основных преимуществ применения полипептидов,
предлагаемых в изобретении, является то, что их легко можно вводить с помощью путей, отличных от парентерального введения, и легко включать в препаративные формы для такого введения. Например, как описано в
международной заявке на патент WO 2004/041867, указанные полипептиды можно включать в формы, предназначенные для орального, интраназального, внутрилегочного и трансдермального введения.
Другим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая 5 композиция, содержащая по меньшей мере один полипептид, предлагаемый в изобретении, который указан в настоящем описании, и по меньшей мере одно другое терапевтическое средство, выбранное из группы, включающей статины, антитромбоцитарные средства, антикоагулянты, противодиабетические средства и гипотензивные средства.
10 Указанная фармацевтическая комбинация может необязательно содержать
также разбавитель, эксципиент, адъювант и/или стабилизатор.
Когда две или большее количество субстанций или действующих веществ подлежат применению в виде компонента комбинированной схемы лечения, то их можно вводить посредством одинакового пути введения или разных путей
15 введения, практически одновременно или в различное время (например, практически одновременно, последовательно или согласно чередующейся схеме). Когда субстанции или действующие вещества подлежат одновременному введению посредством одинакового пути введения, то их можно вводить в виде различных фармацевтических препаратов или композиций или в виде
20 компонента объединенного фармацевтического препарата или композиции. Кроме того, когда два или большее количество активных субстанций или действующих веществ подлежат применению в качестве компонента комбинированной схемы лечения, то каждую из субстанций или действующих веществ можно вводить в таком же количество и согласно такой же схеме, что и
25 применяемые при индивидуальном применении соединения или действующего вещества, и указанное совместное применение может приводить к получению синергетического действия или может не приводить к нему. Однако, когда совместное применение двух или большего количество активных субстанций или действующих веществ приводит к получению синергетического действия, то
30 может оказаться возможным также уменьшать количество одного, нескольких
или всех субстанций или действующих веществ, подлежащих введению, все еще достигая при этом требуемого терапевтического действия. Это может быть ценным, например, для избегания, ограничения или снижения любых
нежелательных побочных действий, которые ассоциированы с применением
одной или нескольких субстанций или действующих веществ, когда их
используют в принятых количествах, все еще достигая при этом требуемого
фармацевтического или терапевтического действия.
5 Таким образом, следующим вариантом осуществления изобретения
является способ лечения заболеваний и нарушений, указанных выше, заключающийся в том, что вводят индивидууму в эффективном количестве одновременно, раздельно или последовательно по меньшей мере один полипептид, предлагаемый в изобретении, и по меньшей мере одно средство,
10 выбранное из группы, включающей статин, антитромбоцитарное средство, антикоагулянт, противодиабетическое средство и гипотензивное средство.
Согласно другому объекту изобретения полипептид, предлагаемый в изобретении, приготавливают так, чтобы его можно было вводить в сочетании с другими лекарственными средствами, применяемыми для лечения заболеваний и
15 нарушений, указанных выше, где другие лекарственные средства выбраны из группы, включающей статин, антитромбоцитарное средство, антикоагулянт, противодиабетическое средство и гипотензивное средство.
Согласно еще одному объекту изобретения, лекарственные средства, применяемые для лечения указанных выше заболеваний и нарушений, где
20 лекарственные средства выбраны из группы, включающей статин,
антитромбоцитарное средство, антикоагулянт, противодиабетическое средство и гипотензивное средство, приготавливают так, чтобы их можно было вводить в сочетании с полипептидом, предлагаемым в изобретении.
Согласно еще одному объекту изобретения полипептид, предлагаемый в
25 изобретении, применяют в сочетании с устройством, пригодным для введения полипептида, таким как шприц, ручка-инъектор или другое устройство.
Следующим вариантом осуществления изобретения является способ диагностирования заболевания, нарушения или состояния, опосредуемого дисфункцией CX3CR1, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на
30 которых:
а) получают образец из организма индивидуума и
б) приводят в контакт in vitro образец с указанным выше полипептидом,
предлагаемым в изобретении, и
в) определяют связывание указанного полипептида с указанным образцом и
г) сравнивают связывание, определенное на стадии (в), со стандартом, где
различие в связывании относительно указанного образца является
диагностическим признаком заболевания, нарушения или состояния,
5 характеризующегося дисфункцией CX3CR1.
Таким образом, другим вариантом осуществления изобретения является
способ диагностирования заболевания, нарушения или состояния,
опосредуемого дисфункцией CX3CR1, заключающийся в том, что осуществляют
стадии, на которых:
10 а) получают образец из организма индивидуума и
б) приводят в контакт образец с указанным выше полипептидом,
предлагаемым в изобретении, и
в) определяют количество CX3CR1 в образце; и
г) сравнивают количество, определенное на стадии (в), со стандартом, где
15 различие в количестве относительно указанного образца является
диагностическим признаком заболевания, нарушения или состояния, характеризующегося дисфункцией CX3CR1.
Указанные выше диагностические способы можно применять для мониторинга эффективности терапевтического лечения индивидуума.
20 Другим вариантом осуществления изобретения является набор для
диагностирования заболевания, нарушения или состояния, опосредуемого дисфункцией CX3CR1, для применения в указанном выше способе, указанный набор содержит по меньшей мере один полипептид, предлагаемый в изобретении, и необязательно одну или несколько сред, средства детекции и/или
25 агенты для визуализации in vitro или in vivo, а также необязательно инструкции по применению. Приемлемыми агентами для визуализации in vivo являются
99m~ 111Т 123т
1 с, In, 1, а для визуализации магнитного резонанса - парамагнитные соединения.
Изобретение относится также к набору, содержащему по меньшей мере 30 один полипептид, предлагаемый в изобретении, и дополнительно один или несколько других компонентов, выбранных из группы, включающей другие лекарственные средства, которые применяют для лечения описанных выше заболеваний и нарушений, и описанные выше устройства.
Изобретение относится также к способам получения полипептидов, предлагаемых в изобретении, указанные способы, как правило, включают стадии, на которых:
- культивируют клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту, которая 5 может кодировать полипептид, предлагаемый в изобретении (далее в контексте
настоящего описания "нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении"), в условиях, которые позволяют осуществлять экспрессию полипептида, предлагаемого в изобретении; и,
- извлекают или выделяют полипептид, экспрессируемый клетками-10 хозяевами из культуры; и
- необязательно дополнительно очищают и/или модифицируют, и/или включают в препаративную форму полипептид, предлагаемый в изобретении.
Нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, может представлять собой геномную ДНК, кДНК или синтетическую ДНК (такую как ДНК с
15 наиболее часто встречающимися ко донами, которая специально адаптирована для экспрессии в выбранной клетке-хозяине или организме-хозяине). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, находится в практически выделенной форме, как указано выше в настоящем описании.
20 Нуклеиновая кислота, предлагаемая в изобретении, может иметь также
форму вектора, может присутствовать в векторе и/или представлять собой часть вектора, такого, например, как плазмида, космида или YAC. Вектор может представлять собой, прежде всего, экспрессионный вектор, т.е. вектор, который может обеспечивать экспрессию полипептида in vitro и/или in vivo (т.е. в
25 приемлемой/приемлемом клетке-хозяине, организме-хозяине и/или
экспрессионной системе). Указанный экспрессионный вектор, как правило, содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, которая функционально связана с одним или несколькими приемлемыми регуляторными элементами, такими как промотор(ы),
30 энхансер(ы), терминатор(ы) и т.п. Конкретные примеры регуляторных элементов и других элементов, пригодных или необходимых для экспрессии полипептидов, предлагаемых в изобретении, таких как промоторы, энхансеры, терминаторы, факторы интеграции, маркеры для селекции, сигнальные или лидерные
последовательности, репортерные гены и т.п., описаны, например, на сс. 131-133 WO 2006/040153.
Нуклеиновые кислоты, предлагаемые в изобретении, можно создавать или получать хорошо известным методом (например, путем автоматического синтеза 5 ДНК и/или методом рекомбинантной ДНК) на основе информации об аминокислотных последовательностях полипептидов, предлагаемых в изобретении, которая представлена в настоящем описании, и/или их можно выделять из пригодного встречающегося в естественных условиях источника. Следующим вариантом осуществления изобретения является хозяин или
10 клетка-хозяин, который/которая экспрессирует или обладает способностью экспрессировать полипептид, предлагаемый в изобретении; и/или содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, предлагаемый в изобретении. В конкретном предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные клетки-хозяева представляют собой бактериальные
15 клетки, клетки дрожжей, клетки грибов или клетки млекопитающих. Приемлемыми бактериальными клетками являются клетки грамотрицательных штаммов бактерий, таких как штаммы Escherichia coli, Proteus и Pseudomonas, и грамположительных штаммов бактерий, таких как штаммы Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus и Lactococcus. Приемлемыми
20 грибными клетками являются клетки видов Trichoderma, Neurospora и Aspergillus. Приемлемыми клетками дрожжей является клетки видов Saccharomyces (^например, Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (например, Schizosaccharomyces pombe), Pichia (например, Pichia pastoris и Pichia methanolicd) и Hansenula.
25 Приемлемыми клетками млекопитающих являются, например, СНО-клетки,
ВНК-клетки, HeLa-клетки, COS-клетки, NSO-клетки, НЕК-клетки и т.п. Однако можно использовать также клетки амфибий, клетки насекомых, клетки растений и любые другие клетки, которые применяют в данной области для экспрессии гетерологичных белков.
30 Для производства в промышленном масштабе предпочтительными
гетерологичными хозяевами для (промышленного) производства терапевтических продуктов, содержащих включающие иммуоглобулиновые единичные вариабельные домены полипептиды и белки, являются штаммы Е.
coli, Pichia pastoris и S. cerevisiae, которые пригодны для крупномасштабной
экспрессии, производства и ферментации, и прежде всего для
крупномасштабной экспрессии, производства и ферментации
(био)фармацевтических продуктов.
5 Выбор конкретной экспрессионной системы зависит, в частности, от
требований к определенным пост-трансляционным модификациям, более конкретно к гликозилированию. Для получения полипептида, предлагаемого в изобретении, для которого гликозилирование является желательным или необходимым, требуется применять для экспрессии клетки-хозяева
10 млекопитающих, обладающие способностью гликозилировать экспрессируемый белок. В этом плане специалисту в данной области должно быть очевидно, что полученная схема гликозилирования (т.е. вид, количество и положение присоединенных остатков) должна зависеть от клетки или клеточной линии, применяемой для экспрессии.
15 Полипептиды, предлагаемые в изобретении, можно получать либо в клетке,
согласно описанному выше методу, либо внутриклеточно (например, в цитозоле, периплазме или в тельцах включения), а затем выделять из клеток-хозяев и необязательно дополнительно очищать; либо их можно получать внеклеточно (например, в виде секретируемых в среду, в которой культивируют клетки-
20 хозяева), а затем выделять из культуральной среды и необязательно дополнительно очищать.
Другие методы и реагенты, которые применяют для получения полипептидов с помощью рекомбинантной ДНК, такие как специфические приемлемые экспрессионные векторы, методы трансформации или трансфекции,
25 маркеры для селекции, методы индукции экспрессии белков, условия
культивирования и т.п., известны в данной области. Аналогично этому, методики выделения и очистки белков, применяемые в методе производства полипептида, предлагаемого в изобретении, хорошо известны специалисту в данной области.
30 Получение полипептидов, предлагаемых в изобретении, посредством
ферментации в общепринятых рекомбинантных организмах-хозяевах, таких как Е. coli и дрожжи, является эффективным по стоимости по сравнению с каноническими антителами, для которых требуются также дорогостоящее
оборудование для культивирования клеток млекопитающих. Кроме того, можно достигать высоких уровней экспрессии, и выход полипептидов, предлагаемых в изобретении, составляет от 1 до 10 г/л {Е. coli) и вплоть до 10 г/л (дрожжи) и более. 5 Примеры
Создание линий клеток СНО, Baf/3, Caki и НЕК293, сверхэкспрессирующих CX3CR1 человека или CX3CR1 обезьян циномолгус
СНО- и Baf/З-клетки, сверхэкспрессирующие CX3CR1 человека или обезьян циномолгус, создавали с использованием методик, известных в данной 10 области. Создавали также клетки, экспрессирующие человеческий CCR2 или CCR5, с использованием методик, известных в данной области.
Для экспрессии человеческого CX3CR1 кДНК клонировали в pCDNA3.1(+)-пео, а для мышиного CX3CR1 применяли pcDNA-DEST40-neo.
Аминокислотные последовательности человеческого CX3CR1 и CX3CR1 15 обезьян циномолгус представлены в SEQ ID NO: 255 и SEQ ID NO: 256 соответственно.
Для создания клеток верблюжьей почки (Caki), сверхэкспрессирующих человеческий CX3CR1 или мышиный CX3CR1, встраивали путем электропорации в родительские клетки Caki плазмиды pCDNA3.1(+)-neo-
20 hCX3CRl или pcDNA-DEST40-neo-mCX3CRl соответственно. Для всех
вариантов для отбора трансфектантов добавляли 1 мг/мл генетицина (фирма Invitrogen, Карлсбад, шт. Калифорния, США).
Клетки почки человеческого эмбриона (НЕК293), сверхэкспрессирующие CX3CR1 человека или CX3CR1 обезьян циномолгус, создавали путем
25 опосредуемой липидом трансфекции родительской клеточной линии НЕК293 плазмидами pCDNA3.1(+)-neo-hCX3CRl или cyCX3CRl соответственно с использованием реагента Fugene (фирма Roche). Эти клетки применяли в качестве временных трансфектантов и их самих не подвергали селекции. В целом, метод состоял в следующем: высевали по 2x10Е6 клеток в колбы Т75 и
30 инкубировали в течение ночи до трансфекции. После удаления культуральной
среды клетки трансфектировали соответствующими плазмидами (9 мкг) и Fugene (27 мкл) согласно инструкциям производителя. Через 48 ч после трансфекции клетки собирали и замораживали для дальнейшего применения.
Пример 1: Иммунизация с использованием CX3CR1 индуцирует гуморальный иммунный ответ у лам 1.1 Иммунизации
После одобрения Комитетом по этике (Университет Антверпена, Бельгия, 5 UA2008A1, 2008/096, 2007/068), иммунизировали 9 лам (обозначены №№ 368, 369, 370, 381, 382, 384, 312, 313 и 314).
Иммунизировали шесть лам (312, 313, 314, 381, 382 и 384), осуществляя 4 внутримышечные инъекции (2 мг/дозу еженедельно или с двухнедельными интервалами) плазмидным вектором pVAXl-huCX3CRl (фирма Invitrogen, 10 Карлсбад, шт. Калифорния, США). Трем ламам (381, 382 и 384) вводили последовательно путем 4 подкожных инъекций сверхэкспрессирующие человеческий CX3CR1 Caki-клетки, созданные согласно описанному выше методу. Клетки ресуспендировали в D-ЗФР и выдерживал на льду до инъекции.
Еще трех лам (обозначены №№ 368, 369 и 370) иммунизировали согласно 15 стандартным протоколам, вводя путем 4 подкожных инъекций
сверхэкспрессирующие человеческий CX3CR1 Caki-клетки, созданные согласно описанному выше методу. Клетки ресуспендировали в D-ЗФР и выдерживали на льду до инъекции.
Затем этим ламам вводили путем двух инъекций рекомбинантный CX3CR1 20 NT/EC3-фрагмент, сшитый с БСА (таблица 13). Пептиды заказывали на фирме NeoMPS (Polypeptidegroup, Страсбург, Франция) и сшивали с БСА согласно стандартным протоколам.
Для первой инъекции применяли форму в полном адъюванте Фрейнда (фирма Difco, Детройт, шт. Мичиган, США), а для последующих инъекций применяли форму в неполном адъюванте Фрейнда (фирма Difco, Детройт, шт. Мичиган, США).
1.2 Оценка индуцированных иммунных ответов у лам Для оценки индукции иммунных ответов у животных на человеческий CX3CR1 с использованием ELISA или FACS, собирали образцы сыворотки у лам 312, 313и314в день 0 (не иммунная) и в различные моменты времени согласно 5 протоколу иммунизации (время сбора лимфоцитов периферической крови [PBL]).
В целом, метод состоял в следующем: Иммобилизовали нейтравидин (2 мкг/мл) в течение ночи при 4°С в 96-луночном планшете Maxisorb (фирма Nunc, Висбаден, Германия). Лунки блокировали раствором казеина (1%) в ЗФР. Затем
10 "захватывали" биотинилированный рекомбинантный NT-фрагмент (фирма Polypeptide, Страсбург, Франция) или биотинилированные ЕСЗ-фрагменты CX3CR1 (фирма Polypeptide, Страсбург, Франция) в концентрации 2 мкг/мл. После добавления разведений сыворотки выявляли специфически связанные иммуноглобулины, используя конъюгированное с пероксидазой из хрена (HRP)
15 козье антитело к иммуноглобулину лам (фирма Bethyl Laboratories Inc.,
Монтгомери, шт. Техас, США), и последующая ферментативная реакция в присутствии субстрата ТМВ One (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) (фирма Promega, Мюнхен, Германия), продемонстрировала, что после иммунизаций пептидами индуцировался выраженный гуморальный иммунный ответ против
20 CX3CR1.
Кроме того, сывороточные титры иммунизированных клетами животных подтверждали с помощью FACS-анализа на находящихся на стадии активного роста СНО-клетахк, сверхэкспрессирующих человеческий CX3CR1. Ответы в виде сывороточного титра CX3CR1 для лам 368, 369 и 370 определяли, отбирая
25 образцы сыворотки после четырех иммунизаций клетками (день 49), четырех
иммунизаций клетками и одной бустер-инъекции пептидом (день 77) и четырех иммунизаций клетками и двух бустер-инъекций (день 81). Клетки собирали и промывали перед инкубацией с разведениями сыворотки. Для детекции использовали козье антитело к иммуноглобулину лам (фирма Bethyl Laboratories
30 Inc., Монтгомери, шт. Техас, США), а затем ослиное антикозье антитело, сшитое с РЕ (фикоэритрин) (фирма Jackson Laboratories, графство Суффолк, Великобритания), и получали результаты анализа с помощью устройства FACSArray (фирма BD Biosciences). Обобщенные результаты полученных
сывороточных ответов, которые определяли либо с помощью ELISA, либо с помощью FACS, представлены в таблице 14 и таблице 15.
Таблица 14. Анализ сывороточных титров у животных, иммунизированных
У лам, иммунизированных только ДНК (312, 313 и 314), сывороточные 10 титры не определяли. Пример 2
Клонирование популяций содержащих только тяжелую цепь фрагментов антител и получение фага
После последней инъекции каждого из подвидов иммуногена получали 15 образцы иммунных тканей иммунизированных лам в качестве источника В-
клеток, которые продуцировали антитела с тяжелой цепью. У каждой из лам 312, 313 и 314 собирали по два 150-миллилитровых образца крови через 4 и 8 дней после последней инъекции антигена. У лам 368, 369 и 370 собирали по четыре
150-миллилитровых образца крови через 5 и 7 дней после последней иммунизации клетками и дополнительно через 4 и 8 дней после последней иммунизации пептидом. Затем получали две биопсии лимфатических узлов через 12 дней после последней иммунизации клетками и через 12 дней после 5 последней иммунизации пептидом. У лам 381, 382 и 384 собирали по пять 150-миллилитровых образцов крови через 8 дней после последней иммунизации ДНК и дополнительно через 4 дня после первой бустер-иммунизации клетками, через 8 и 11 дней после второй бустер-иммунизации клетками и через 8 дней после последней иммунизации клетками. Затем через 8 дней после второй
10 иммунизации клетками получали одну биопсию лимфатического узла.
Из образцов крови получали лимфоциты периферической крови (PBL), используя фиколл-пак согласно инструкциям производителя (фирма Amersham Biosciences, Пискатавей, шт. Нью-Джерси, США). Из PBL и биопсии лимфатических узлов (LN) экстрагировали общую РНК, которую применяли в
15 качестве исходного материала для амплификации с помощью ОТ-ПЦР кодирующих VHH ДНК-сегментов.
Для каждой иммунизированной ламы конструировали библиотеку путем объединения общей РНК, выделенной из образцов, полученных после определенного подвида схемы иммунизации, т.е. после иммунизации одним из
20 типов иммуногенов, и для некоторых лам образцы из различных животных объединяли в одну библиотеку (таблица 16).
Таблица 16. Объединение различных образцов для создания библиотеки
Название библиотеки
Лама
Образец
368-PBL1+2+LN-V-100209
368
PBL 1 и 2, LN
369+370-PBL1+2+LN-V-100209
369, 370
PBL 1 и 2, LN
368-PBL3+4-V-280909
368
PBL 3 и 4
369-PBL3+4-V-070409
369
PBL 3 и 4
370-PBL3+4-V-070409
370
PBL 3 и 4
381-PBL1-V-180310
381
PBL 1
382-PBL1-V-180310
382
РВЫ
384-PBL1-V-180310
384
РВЫ
381-PBL1+2+3+4+5+LN-V-280909
381
PBL 1, 2, 3, 4, 5 и LN
382-PBL1+2+3+4+5+LN-V-280909
382
PBL 1, 2, 3, 4, 5 и LN
384-PBLl+2+3+4+5+Ln-V-280909
384
PBL 1, 2, 3, 4, 5 и LN
312+313+314-PBL1+2-V-220210
312,313 и 314
PBL 1 и 2
312-PBL1+2-V-180310
312
PBL 1 и 2
313-PBL1+2-V-180310
313
PBL 1 и 2
314-PBL1+2-V-180310
314
PBL 1 и 2
- по -
В целом, метод состоял следующем: популяцию амплифицированных с помощью ПЦР VHH клонировали с использованием специфических сайтов рестрикции в векторе, созданном для облегчения фагового дисплея библиотеки VHH. Вектор выводили из pUCl 19, и он содержал промотор LacZ, 5 последовательность, кодирующую белок gill фага М13, ген, обусловливающий устойчивость к ампициллину или карбенициллину, сайт множественного клонирования и гибридную лидерную последовательность glll-pelB (рАХ050). В рамке считывания с кодирующей последовательностью VHH вектор кодировал С-концевую c-myc-метку и His6-MeTKy. Фаги получали согласно стандартным 10 протоколам и хранили после стерилизации фильтрацией при 4°С или при -80°С в 20%-ном глицерине для последующего применения.
Пример 3: Селекция CX3CR1-специфических VHH с помощью фагового дисплея
Популяцию VHH, полученную их всех лам и клонированную в виде
15 фаговой библиотеки, применяли в различных стратегиях селекции, используя разнообразные условия селекции. Варьирующие параметры включали I) форму презентации белка CX3CR1 (на различных клеточных основах или на липосомах/VLP (вирусоподобные частицы), II) метод презентации антигена (в растворе при применении клеток или в покрытии на планшетах при применении
20 VLP), III) концентрацию антигена, IV) применяемый ортолог (человеческий или обезьян циномолгус), V) количество циклов селекции и VI) различные методы элюции (неспецифическая с использованием трипсина или специфическая с использованием лиганда фракталкина). Все селекции с использованием твердой фазы с покрытием осуществляли в 96-лучночных планшетах Maxisorp (фирма
25 Nunc, Висбаден, Германия).
Селекции осуществляли следующим образом: препараты антигена CX3CR1, предназначенные для селекции в форматах селекции в твердой или жидкой фазе, презентовали согласно описанному выше методу в нескольких концентрациях. После инкубации в течение 2 ч с фаговыми библиотеками с последующей
30 интенсивной отмывкой связанные фаги элюировали с использованием трипсина (1 мг/мл) в течение 15 мин. Когда для элюции фага применяли трипсин, то протеазную активность сразу же нейтрализовали, используя 0,8мМ протеазный
ингибитор ABSF. В качестве контроля параллельно осуществляли селекции без антигена.
Сборы фага применяли для заражения Е. coli, которых затем в свою очередь применяли для получения фага для следующего цикла селекции (сохранение 5 ("спасение") фага). После второго цикла селекции сборы фага применяли для заражения Е. coli, которые затем высевали на агаровые пластины (LB+amp+глюкоза (2%)) для анализа индивидуальных клонов VHH. Для скрининга продукта селекции в отношении специфических связывающих агентов индивидуальные колонии изымали из агаровых пластин и выращивали в объеме
10 1 мл в 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Контролируемую LacZ
экспрессию VHH индуцировали, добавляя ИПТГ (конечная концентрация 1мМ) в отсутствии глюкозы. Получали экстракты содержимого периплазматического пространства (периплазматические экстракты) (в объеме -80 мкл) согласно стандартным методам.
15 Пример 4: Скрининг периплазматических экстрактов с помощью FACS-
анализа в условиях конкуренции с использованием CX3CR1-фракталкина
Периплазматические экстракты подвергали скринингу с помощью FACS-анализа в условиях конкуренции с использованием человеческого СХЗСК1/человеческого фракталкина для оценки блокирующей активности
20 экспрессированных VHH. Человеческий CX3CR1 презентовали на СНО-клетках, сверхэкспрессирующих CX3CR1. Применяли как систему, в которой использовали клетки, собранные на фазе активного роста культуры, так и систему, в которой использовали замороженные клетки. В качестве идентифицирующего реагента применяли фракталкин (фирма R &D Systems,
25 Миннеаполис, шт. Миннесота, США), меченный с помощью alexa647 (А647-
фракталкин) с уровнем мечения, равным 1. Для осуществления анализа сначала проводили серии титрования меченого фракталкина в отношении СНО-huCX3CRl-клеток для определения величины ЕС50, характеризующей связывание. Сначала скрининг осуществляли в присутствии более высокой
30 концентрации фракталкина (ЗнМ) для повышения робастности анализа. Для повышения до максимума чувствительности скрининга для последующего скрининга была выбрана концентрация, соответствующая ЕС30 (1нМ). В целом, метод состоял в следующем: 50 мкл периплазматического экстракта добавляли к
."ie> sj*" ^vswjfc'i*"";
6нМ меченому фракталкину (50 мкл) и 200000 CHO-huCX3CRl-клеткам. После инкубации в течение 1 ч при 4°С клетки отмывали трижды перед считыванием результатов с помощью устройства FACSArray (фирма Becton Dickinson). Сначала дискриминационное окно устанавливали на интактные клетки, что 5 определяли на основе профиля рассеяния. Затем устанавливали
дискриминационное окно на мертвые клетки на основе их профиля флуоресценции после окрашивания PI (йодид пропидия) (фирма Sigma, Сент-Луис, США). Профиль флуоресценции для метки alexa647 определяли для каждого образца и использовали для расчета блокирующей способности. В
10 качестве контролей применяли такие же условия, но в отсутствии VHH в периплазматическом экстракте, или в присутствии известного несоответствующего VHH, и включали образцы, в которых присутствовал "холодный" (немеченый) фракталкин в избыточном количестве. Для каждого образца определяли блокирование в процентах, используя контрольные образцы
15 для определения анализируемого окна.
С помощью указанного скрининга отбирали VHH, и анализ их последовательности позволил выявить 120 уникальных VHH, принадлежащих к 3 различным В-клеточным линиям дифференцировки. Общее количество вариантов, обнаруженных для каждой В-клеточной линии дифференцировки,
20 представлено в таблице 17.
Таблица 17. Параметры селекции, применяемые для идентификации
специфических в отношении человеческого CX3CR1 VHH, принадлежащих к В-клеточных линиям дифференцировки
В-клеточная линия дифференцировки
Репрезентативный VHH, ID
Кол-во вариантов
Библиотеки
CX3CR1BII11H11
368-PBL1+2+LN-V-100209
CX3CR1BII18E06
368-PBL1+2+LN-V-100209
368-PBL3+4-V-280909
101
CX3CR1BII66B02
312+313+314-PBL1+2-V-220210
314-PBL1+2-V-180310
25 Обзор процедур селекции и характеристик на начальной стадии скрининга
всех VHH представлены в таблице 18.
VHH, ID
Семейство
Библиотека
Селекции
Блокада
(в %)
Первый цикл
Второй цикл
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
68,4
PMP61D1
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2мкМ)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
94,9
PMP61D5
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2мкМ)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
70,3
PMP61E2
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
96,5
PMP61F11
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
82,0
PMP61G2
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
92,1
PMP61G3
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
94,5
PMP61G4
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
94,4
PMP61F4
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
78,0
PMP61A11
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
94,5
PMP61B2
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
Полный
VLPs-
Полный
69,4
PMP61C9
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(трипсин)
hCX3CRl (10 ед.)
(трипсин)
CX3CR1BII
101
312+313+314
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP65H02
-PBL1+2-V-220210
hCX3CRl (10 ед.)
(2мкМ)
hCX3CRl (10 ед.)
(2мкМ)
CX3CR1BII
101
312+313+314
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP65E11
-PBL1+2-V-220210
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
312+313+314
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP65E10
-PBL1+2-V-220210
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
312+313+314
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP65E05
-PBL1+2-V-220210
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
312+313+314
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP65B11
-PBL1+2-V-220210
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
312+313+314
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP65B07
-PBL1+2-V-220210
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
312+313+314
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP65B09
-PBL1+2-V-220210
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
312+313+314
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP65H01
-PBL1+2-V-220210
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
VHH, ID
Семейство
Библиотека
Селекции
Блокада
(в %)
Первый цикл
Второй цикл
CX3CR1BII
101
312+313+314
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP65G07
-PBL1+2-V-220210
hCX3CRl (10 ед.)
(2мкМ)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66H08
V-180310
hCX3CRI (10 ед.)
(2мкМ)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66H04
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66F02
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66E11
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66D10
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66D08
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66B02
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66A04
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66D04
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66D02
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66D06
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
CX3CR1BII
101
314-PBL1+2-
VLPs-
hFrac
VLPs-
hFrac
#N/A
PMP66G01
V-180310
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
hCX3CRl (10 ед.)
(2MKM)
Аминокислотные последовательности всех полученных уникальных VHH представлены в перечне последовательностей и выше (указанные CDR и каркасные участки).
Пример 5: Характеризация очищенных VHH
Обладающие ингибирующим действием анти-СХЗСК1 VHH, отобранные в результате скрининга, описанного в примере 4, дополнительно очищали и характеризовали. Отобранные VHH экспрессировали в штамме Е. coli TGI в виде меченных с помощью c-myc, His6 белков. Экспрессию индуцировали путем добавления 1мМ ИПТГ и давали протекать в течение 4 ч при 37°С. После центрифугирования клеточных культур получали периплазматические экстракты
путем замораживания-оттаивания дебриса. Указанные экстракты применяли в
качестве исходного продукта и VHH очищали с помощью IMAC (аффинная
хроматография на иммобилизованном металле) и гель-фильтрации (SEC),
получая продукт чистотой 95% по данным ДСН-ПААГ.
5 Ингибирование с помощью анти-СХЗСШ VHH связывания человеческого
фракталкина с человеческим CX3CR1, экспрессируемым на ВA/F3-клетках
Блокирующую активность VHH в отношении лиганда фракталкина оценивали с помощью FACS-анализа в условиях конкуренции с использованием человеческого CX3CR1 согласно методу, изложенному в примере 4. Применяли
10 либо CHO-huCX3CRl-клетки, либо BA/F3-huCX3CRl-клетки, либо
кратковременно трансфектированные НЕК293Т-клетки. Варьировали также количество меченого лиганда в различных сериях конкурентного анализа. Величины IC50, характеризующие способность VHH блокировать взаимодействие человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1,
15 представлены в таблице 19.
Таблица 19. Активность и эффективность VHH по данным FACS в условиях
VHH, ID
Семейство
Клеточная линия
IC50
Блокада
Количество
(в %)
повторов
54H01
101
HEK293-huCX3CRl
1,0 E-8
54A04
101
HEK293-huCX3CRl
4,9 E-8
100
61F11
101
HEK293-huCX3CRl
4,6 E-8
61G03
101
HEK293-huCX3CRl
6,0 E-8
61G04
101
HEK293-huCX3CRl
4,2 E-8
66B02
101
HEK293-huCX3CRl
2,5 E-9
102
66G01
101
HEK293-huCX3CRl
1,4 E-8
Ингибирование с помощью анти-СХЗСШ VHH индуцированного
человеческим фракталкином хемотаксиса ВA/F3-клеток, сверхэкспрессирующих
человеческий CX3CR1
5 Для оценки ингибирования индуцированного фракталкином хемотаксиса
осуществляли анализ хемотаксиса с помощью одноразовой камеры ChemoTx с размером пор 5 мкм (фирма Neuroprobe, Гейтерсбург, США). Клетки собирали на стадии активного роста культуры и промывали перед применением в среде для анализа, RPMI (фирма Gibco, Карлсбад, США), дополненной 0,1% БСА.
10 Нижнюю часть камеры заполняли 320пМ человеческим фракталкином,
используя общий объем 300 мкл. После наложения мембраны 0,13Е6 клеток помещали поверх мембраны в общем объеме 70 мкл. Хемотаксису давали проходить в течение 3 ч при 37°С в увлажняющей камере с СО2. После указанного периода инкубации мембрану удаляли и ресуспендировали клетки в
15 нижней части камеры. Количество АТФ, присутствующего в лунках, определяли с помощью набора CellTiter-Glo (фирмаРгоше?а, Мэдисон, шт. Висконсин, США). Считывание осуществляли с помощью устройства (фирма Perkin Elmer, шт. Массачусетс, США) с набором стандартов для определения люминисценции. Осуществляли серии титрований в трех повторностях и каждый планшет
20 содержал также контрольные образцы в трех повторностях. В качестве контроля использовали образец без VHH, а также образец, в котором на дно камеры не добавляли человеческий фракталкин. Обобщение результатов представлено в таблице 20.
Таблица 20. Активность и эффективность VHH в отношении блокирования 25 индуцированного фракталкином хемотаксиса
VHH, ID
Семейство
1С50
Блокада(в %)
Количество повторов
ПНИ
2 Е-7
18Е06
54А12
101
8 Е-8
VHH, ID
Семейство
ic5o
Блокада(в %)
Количество повторов
54D08
101
54A07
101
5 E-8
54D05
101
7 E-8
54B03
101
1 E-7
54G03
101
66B02
101
2 E-8
66G01
101
4 E-7
Оценка перекрестной реактивности анти-СХЗСШ VHH с CX3CR1 обезьян циномолгус
Сначала для оценки перекрестной реактивности с рецептором обезьян 5 циномолгус применяли основанную на использовании FACS систему
связывания. Для этой цели VHH инкубировали с соответствующими клетками в течении 30 мин при 4°С с последующими тремя стадиями отмывки, а затем инкубировали с идентифицирующими реагентами. Для детекции использовали мышиное антитело к с-myc (фирма Serotec, МСА2200), а затем козье 10 антимышиное антитело, сцепленное с РЕ (фирма Jackson 115-116-071), каждый раз инкубацию осуществляли в течение 30 мин при 4°С с тремя последующими стадиями отмывки. Результаты анализа представлены в таблице 21.
Для идентифицированных позднее VHH осуществляли FACS-анализ в условиях конкуренции в присутствии человеческого фракталкина с использованием CX3CR1 человека или обезьян циномолгус, экспрессированных 20 в НЕК293Т-клетках. И человеческим, и обезьяньим рецептором кратковременно трансфектировали НЕК293Т-клетки и результаты трансфекции сопоставляли на основе связывания меченого лиганда, т.е. человеческого фракталкина. Конкуренцию оценивали, используя концентрацию фракталкина, соответствующую ЕСзо, таким образом, чтобы полученные величины IC50 можно
было с успехом применять для расчета величины Ki, т.е. меры аффинности (таблица 22). Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 4. Соотношение величин IC50 для CX3CR1 обезьян циномолгус и человека применяли для оценки возможных различий в величине аффинности к 5 CX3CR1 обоих видов.
Таблица 22, Эффективность и активность VHH при оценке с помощью
Связывание VHH к человеческому CX3CR1 с человеческим CCR2,
10 человеческим CCR5 или мышиным CX3CR1
Специфичность в отношении huCX3CRl-рецептора оценивали, осуществляя эксперимент по связыванию с оценкой с помощью FACS с использованием родительских клеток СНО-К1 или СНО-клеток, экспрессирующих huCCR2, huCCR5 или msCX3CRl. VHH инкубировали с соответствующими клеточными
15 линиями в течение 30 мин при 4°С с последующими тремя стадиями отмывки, а затем инкубировали с идентифицирующими реагентами. Для детекции использовали мышиное антитело к с-тус (фирма Serotec, МСА2200), а затем козье антимышиное антитело, сцепленное с РЕ (фирма Jackson 115-116-071), каждый раз инкубацию осуществляли в течение 30 мин при 4°С с тремя
20 последующими стадиями отмывки. Для каждой клеточной линии включали в
качестве контроля качества специфическое для рецептора антитело. Кроме того, в качестве положительного контроля каждый VHH в наиболее высокой
концентрации инкубировали также с СНО-клетками, экспрессирующими huCX3CRl. Не удалось обнаружить связывание с msCX3CRl, huCCR2 или huCCR5.
Определение группировки эпитопов
5 Осуществляли эксперимент по связыванию в условиях конкуренции для
решения вопроса о том, связываются ли VHH с перекрывающимися эпитопами на CX3CR1. Для этой цели VHH 66В02, меченный alexa647, применяли в FACS в условиях конкуренции с использованием BA/F3, экспрессирующих huCX3CRl. Репрезентативные VHH из трех функциональных семейств применяли в качестве 10 конкурентов меченого 66В02 за связывание. Полученные величины IC50 представлены в таблице 23.
Таблица 23. Группировка эпитопов по данным FACS в условиях конкуренции
VHH, ID
Семейство
1С50(М)
Блокада(в %)
ПНИ
4,9Е-09
100
18Е06
2,ЗЕ-09
100
66В02
101
1,5Е-09
100
15 Поскольку было обнаружено полное ингибирование связывания 66В02 при
использовании всех репрезентативных VHH из различных блокирующих лиганд семейств, то можно заключить, что все функциональные семейства связываются в достаточной близости друг от друга, в результате чего они конкурируют за связывание с 66В02.
20 Пример 6: Форматирование VHH с получением двухвалентных молекул
Конструирование двухвалентных молекул
Для повышения активности и/или эффективности полученных в результате селекции VHH конструировали двухвалентные молекулы с помощью генной инженерии. Два VHH генетически связывали с помощью 3508-линкера между 25 двумя конструктивными элементами и затем экспрессировали в E.coli согласно методу, описанному выше для одновалентных VHH. Создавали различные двухвалентные конструкции, которые представлены в таблице 24.
Конструкция, ID
VHH,
идентификационный №
Семейство
Линкер
VHH
идентификационный №
Семейство
CX3CR1BII009
CX3CR1BII18E6
35GS
CX3CR1BII11H11
CX3CR1BII012
CX3CR1BII54D08
101
35GS
CX3CR1BII18E06
101
CX3CR1BII016
CX3CR1BII54A12
101
35GS
CX3CR1BII54A12
101
CX3CR1BII017
CX3CR1BII54D5
101
35GS
CX3CR1BII54D5
101
CX3CR1BII018
CX3CR1BII66B02
101
35GS
CX3CR1BII66B02
101
CX3CR1BII019
CX3CR1BII66G01
101
35GS
CX3CR1BII66G01
101
CX3CR1BII020
CX3CR1BII54B5
101
35GS
CX3CR1BII54B5
101
CX3CR1BII026
CX3CR1BII11H11
35GS
CX3CR1BII66B02
101
CX3CR1BII027
CX3CR1BII11H11
35GS
CX3CR1BII54B5
101
Ингибирование с помощью анти-СХЗСЯ! VHH связывания человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1, экспрессируемым на ВA/F3-клетках
Изучали ингибирование связывания лиганда с человеческим CX3CR1 для 5 различных форматов согласно методу, описанному в примере 4. Для этой
конкуренции с лигандом
характеризации использовали клеточную линию BA/F3-huCX3CRl, для которой продемонстрирована стабильная экспрессия человеческого CX3CR1-рецептора. Применяли меченный с помощью alexa647 лиганд фракталкин в концентрации, соответствующей ЕС30, с получением тем самым величин IC50, которые 10 отражают величины Ki. Обобщение полученных данных представлено в таблице 25.
15 Ингибирование с помощью aHTH-CX3CRl VHH индуцированного
человеческим фракталкином хемотаксиса ВA/F3-клеток, сверхэкспрессирующих человеческий CX3CR1
Аналогично методу, описанному для одновалентных aHTH-CX3CRl VHH, оценивали ингибирование индуцированного фракталкином хемотаксиса BA/F3
huCX3CRl-клеток двухвалентными конструкциями. Применяли схему анализа, идентичную описанной выше, и полученные результаты обобщены в таблице 26. Таблица 26. Ингибирование индуцированного фракталкином хемотаксиса
Оценка перекрестной реактивности анти-СХЗСЯ! VHH с CX3CR1 обезьян циномолгус
Кроме того, оценивали перекрестную реактивность двухвалентных конструкций с CX3CR1 обезьян циномолгус и сравнивали с реактивностью в
10 отношении человеческого рецептора. Как описано ранее, использовали либо
оценку связывания (таблица 27), либо оценку конкуренции с лигандом (таблица 28) с применением трансфектированных НЕК293Т-клеток. Кратковременно трансфектированные клетки разделяли на партии в зависимости от уровня экспрессии в них рецептора.
15 Таблица 27. Связывание двухвалентных конструкций с CX3CR1 человека и
Конструкция, ID
Клеточная линия
Человеческий
Циномолгус
Отношение
Количество повторов
1С50 (М)
Блокада(в %)
1С50 (М)
Блокада (в %)
CX3CR1BII018
НЕК293Т
3,0 fill
102
1,0 Е-10
3,33
CX3CR1BII019
НЕК293Т
2,9 Е-10
100
8,2 Е-10
2,86
CX3CR1BII020
НЕК293Т
2,2 Е-10
102
3,2 Е-10
1,47
Пример 7: Исследование длины линкера и удлинения времени полужизни Оценка длины линкера и позиционирования albl 1 VHH Поскольку длина линкера, применяемого в двухвалентном формате, может оказывать значительное воздействие на полученную активность, оценивали линкеры, имеющие различную длину.
Кроме того, для увеличения времени полужизни in vivo форматированных молекул (WO 06/122787) включали Albl 1, т.е. нанотело, связывающееся с человеческим сывороточным альбумином. Создавали различные форматы, включающие вариации в длине применяемых линкеров, а также позиционировании в них различных составляющих VHH. Обобщение о применяемых форматах представлено в таблице 29.
Таблица 29. Конструкции, применяемые при исследования удлинения
Кодирующие последовательности форматированных VHH клонировали в созданной в лаборатории заявителей плазмиде, обеспечивающей экспрессию в Pichia pastoris и секрецию в среду для культивирования. Экспрессионный вектор выводили из PICZa (фирма Invitrogen), и он содержал промотор АОХ1 для сильно регулируемой индуцированной метанолом экспрессии, ген, обусловливающий устойчивость к Zeocin(tm), сайт множественного клонирования и секреторный сигнал а-фактора. После трансформации выращивали
экспрессионные культуры и экспрессию VHH индуцировали путем добавления метанола и давали протекать в течение 48 ч при 30°С.
Активность указанных различных форматов оценивали, используя анализ конкуренции с лигандом, описанный выше. С учетом того, что применяли 5 лиганд в концентрации, более низкой чем ЕС50, полученные величины IC50
эквиваленты величинам Ki. Данные о полученных величинах Ki для различных форматов обобщены в таблице 30.
Таблица 30. Активность форматов с удлиненным временем полужизни в анализе конкуренции с лигандом
Конструкция, ID
Клеточная линия
IC50 (M)
Блокада(в %)
Количество повторов
CX3CR1BII032
BA/F3-huCX3CRl
5,8 E-10
CX3CR1BII034
BA/F3-huCX3CRl
5,2 E-10
CX3CR1BII036
BA/F3-huCX3CRl
5,6 E-10
CX3CR1BII040
BA/F3-huCX3CRl
5,9 E-10
104
CX3CR1BII041
BA/F3-huCX3CRl
6,4 E-10
102
CX3CR1BII042
BA/F3-huCX3CRl
8,9 E-10
100
Воздействие человеческого сывороточного альбумина на активность Связывание человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) с albl 1 VHH может влиять на активность формата и поэтому анализ конкуренции с лигандом повторяли в присутствии ЧСА. В целом, метод состоял в следующем: для того,
15 чтобы дать возможность связываться ЧСА с albl 1 VHH, изучаемые конструкции и фракталкин предварительно инкубировали с ЧСА в течение 30 мин перед добавлением к клеткам. Кроме того, клетки ресуспендировали с FACS-буфере, дополненном ЧСА. Конечная применяемая концентрация ЧСА превышала в 50 раз наиболее высокую из применяемых концентраций VHH. Затем давали в
20 течение 2 ч проходить связыванию в условиях конкуренции и осуществляли также метод, описанный в примере 4.
Конструкция, ID
Клеточная линия
1С50 (М)
Блокада(в %)
Количество повторов
CX3CR1BII032
BA/F3-huCX3CRl
1,4 Е-9
100
CX3CR1BII034
BA/F3-huCX3CRl
1,3 Е-9
100
CX3CR1BII036
BA/F3-huCX3CRl
1,4 Е-9
100
Потенциальное воздействие ЧСА оценивали также с использованием адаптированного анализа хемотаксиса, включая в анализ ЧСА в различных 25 концентрациях. И в этом случае применяемая концентрация ЧСА в 50 раз
превышала наиболее высокую из концентраций применяемой конструкции и к
конструкциям добавляли ЧСА в течение 30 мин до начала анализа. Буфер для анализа дополняли также ЧСА, в результате чего ЧСА присутствовал в течение всего времени эксперимента. Согласно описанному выше методу применяли одноразовую камеру ChemoTx с размером пор 5 мкм (фирма Neuroprobe, 5 Гейтерсбург, шт. Мэриленд, США). Клетки собирали на фазе активного роста культуры и отмывали до применения в среде для анализа RPMI (фирма Gibco, Карлсбад, США), дополненной 0,1% БСА и 62,5мкМ ЧСА (фирма Sigma, А8763). Дно камеры заполняли 320пМ человеческим фракталкином, используя общий объем 300 мкл. После наложения мембраны 0,1 ЗЕ6 клеток помещали поверх
10 мембраны в общем объеме 70 мкл. Хемотаксису давали проходить в течение 3 ч при 37°С в увлажняющей камере с СО2. После указанного периода инкубации мембрану удаляли и клетки в нижнем отделе камеры ресуспендировали. Количество АТФ, присутствующего в лунках, определяли с помощью набора CellTiter-Glo (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин, США). Считывание
15 осуществляли с помощью устройства (фирма Perkin Elmer, Валтам, шт.
Массачусетс, США) с набором стандартов для определения люминисценции. Осуществляли серии титрований в трех повторностях, и каждый планшет содержал также контрольные образцы в трех повторностях. В качестве контроля использовали образец без VHH, а также образец, в котором на дно камеры не
ЧСА
20 добавляли человеческий фракталкин. Обобщение результатов представлено в таблице 31.
25 Ингибирование интернализации фракталкина форматированными
двухвалентными полипептидами с удлиненным временем полужизни
Осуществляли дополнительные функциональные анализы для демонстрации антагонистистической активности двухвалентных полипептидов с удлиненным временем полужизни. Оценивали способность полипептидов
30 ингибировать интернализацию А647-фракталкина в клетки СНО huCX3CRl. В целом, метод состоял в следующем: высевали 1Е4 клеток/лунку в черные 96
луночные планшеты с прозрачным дном (фирма BD, Франклин-Леикс, шт. Нью-Джерси, США) и выращивали в течение ночи. Клетки однократно промывали и затем уравновешивали в буфере для анализа (HBSS с кальцием и магнием (фирма Gibco), дополненный ЮмМ HEPES и 0,1% БСА). Добавляли 5 форматированные полипептидные конструкции и планшеты инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Затем добавляли А647-фракталкин в конечной концентрации 8нМ и клетки инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Среду удаляли и клетки фиксировали в течение 10 мин с помощью 3,7%-ного раствора формальдегида (фирма Polysciences, Варрингтон, шт. Пенсильвания, США).
10 Клетки однократно отмывали ЗФР и ядра метили с помощью красителя Хёхста (фирма Life Technologies, Град-Айленд, шт. Нью-Йорк, США). Для количественной оценки интерализированного меченого фракталкина клетки визуализировали, используя систему для биовизуализации BD Pathway. Сегментацию изображений осуществляли путем идентификации меченых
15 клеточных ядер и рисуя окружность размером 3 пикселя вокруг указанной
метки. Среднюю интенсивность А647 измеряли в цитоплазматическом кольце. Установлено, что форматированные полипептиды эффективно ингибировали интернализацию фракталкина, что обобщено в таблице 32.
У анти-СХЗСЮ форматированных двухвалентных полипептидов с удлиненным временем полужизни отсутствует агонистическая активность
Для подтверждения того, что двухвалентные анти-СХЗСШ полипептиды с удлиненным временем полужизни не обладают агонистической активностью, 25 CX3CR1BII036 оценивали в отношении индукции притока кальция в СНО huCX3CRl-клетки. Фракталкин опосредовал повышение уровней кальция в цитозоле в этих клетках CX3CR1-зависимым образом, а конструкция CX3CR1BII036 ингибировала этот ответ.
СНО huCX3CRl-клетки высевали из расчета 5Е4-клеток/лунку в черные 96-луночные планшеты с прозрачным дном (фирма BD) и выращивали в течение ночи. Клетки инкубировали с красителем Calcium-4 /2мМ пробенцид (фирма Molecular Devices, Саннивейл, шт. Калифорния, США) в HBSS, дополненном 5 20мМ HEPES, в течение 60 мин при 37°С. Для демонстрации антагонизма
полипептид CX3CR1BII036 предварительно инкубировали с клетками в течение 15 мин перед добавлением фракталкина, используя его в концентрации, соответствующей ECso- Осуществляли мониторинг мобилизации кальция с помощью системы FLIPR(r) Terra (фирма Molecular Devices) согласно
10 инструкциям производителя. Для определения агонистического действия не осуществляли предварительную инкубацию с полипептидом, а вместо этого применяли CX3CR1BII036, а не стимуляцию фракталкином. В то время как CX3CR1BII036 ингибировал опосредуемый фракталкином приток кальция с IC50 1,ЗнМ, не обнаружено никакого повышения в цитозоле уровней кальция, когда
15 добавляли только полипептид в концентрациях вплоть до 1мкМ.
Пример 8: Исследование форматов с удлиненным временем полужизни, полученных с использованием мышиного Fc-домена
Для изучения альтернативных средств для удлинения времени полужизни получали 66В02 VHH-домен в виде слитого белка с Fc-доменом мышиного IgG2
20 (66B02-mFc). Мутацию, приводящую к замене аспарагиновой кислоты на аланин (D265A), встраивали в СН2-домен для аннулирования потенциальной Fc-опосредуемой эффекторной функции в этой конструкции (Baudino, J. Immunol., 181, 2008, cc. 6664-6669). 66B02-mFc экспрессировали в НЕК293Т-клетках или NSO-клетках и очищали с помощью аффинной хроматографии на белке А с
25 последующей ионообменной хроматографией. Оценивали активность указанной молекулы, используя форматы анализа, которые описаны в примере 7. Результаты обобщены в таблице 33.
Анализ
Клеточная линия
1С50 (М)
Количество повторов
Анализ
интернализации лиганда
CHO-huCX3CRl
5,2 Е-10
Анализ притока кальция
CHO-huCX3CRl
9,8 Е-10
Хотя конструкция 66B02-mFc эффективно ингибировала индуцированную фракталкином активацию CX3CR1, она не проявляла агонистической активности. Не обнаружено никакого повышения уровней кальция в цитозоле, 5 когда эту молекулу добавляли в концентрациях вплоть до 1мкМ.
Пример 9: Ингибирование развития бляшек на мышиной модели атеросклероза двухвалентными полипептидами с удлиненным временем полужизни
Создание мышей линии Аро Е-/" с встроенным человеческим CX3CR1
10 С учетом отсутствия перекрестной реактивности идентифицированных
VHH с мышиным CX3CR1 (пример 5) создавали мышиную линию с встроенным человеческим CX3CR1 (hu CX3CR1 KI) на фирме TaconicArtemis (Кельн, Германия) для тестирования указанных молекул на мышиных моделях заболеваний. Применяли стратегию, которая позволяет осуществлять
15 экспрессию человеческого хемокинового рецептора под контролем
соответствующего мышиного промотора, нарушая при этом экспрессию эндогенного мышиного белка. В целом, метод состоял в следующем: создавали обеспечивающий направленный перенос вектор, в котором кодирующую область мышиного CX3CR1 в экзоне 2 заменяли на полную открытую рамку считывания
20 человеческого CX3CR1 и фланкировали маркерами селекции и сайтами 1охР. Обеспечивающий направленный перенос вектор интродуцировали в мышиные ES-клетки и клоны, полученные в результате успешной гомологичной рекомбинации, применяли для создания химерных мышей. Этих мышей скрещивали с высокоэффективной линией мышей Flp-deleter для удаления
25 маркера селекции и переноса зародышевой линии. Затем полученных в
результате мышей линии hu CX3CR1 KI на основе C57BL/6 скрещивали с мышами линии Аро Е_/" (фирма The Jackson Laboratory, Бар-Харбор, шт. Мэн, США) с получением мышей линии hu CX3CR1 KI Аро Е_/". Мышиная модель Аро Е_/ представляет собой робастный метод выявления процесса экстенсивного
формирования атеросклеротических бляшек, который в целом в значительной
степени совпадает с заболеванием человека с точки зрения сайтспецифической
локализации формирования бляшек, гистологического состава и известных
факторов риска (холестернин, воспаление, гипертензия и т.д.).
5 Оценка анти-СХЗСЫ! двухвалентных полипептидов с удлиненным
временем полужизни на модели атросклероза, созданной на мышах Аро Е-/"
Самок мышей линии hu CX3CR1KI АроЕ"/_ содержали на корме с высоким содержанием жиров/высоким содержанием холестерина, содержащем 1,5% холестерина, в течение 16 недель, начиная с четырехнедельного возраста. Через
10 10 недель животным вводили путем i.р.-инъекции наполнитель (20мМ цитрат
натрия, рН 6,0, 115мМ NaCl), 66B02-mFc из расчета 10 мг/кг один или два раза в неделю или 30 мг/кг CX3CR1BII036 дважды в неделю в течение 6 недель. Животных анестезировали посредством газовой анестезии и осуществляли перфузию с помощью 0,9% физиологического раствора. Нисходящую часть
15 аорты до бифуркации подвздошной артерии осторожно изымали и фиксировали в формалине. Затем ее вскрывали с помощью продольного разреза и окрашивали Суданом IV в течение 15 мин, затем 70%-ным метанолом в течение 2 мин. Сосуды промывали в потоке текущей воды и покрывали ЗФР. Ткани фотографировали с помощью цифровой камеры, используя программное
20 обеспечение SPOT Advanced (фирма SPOT Imaging Solutions, Стерлинг-Хайтс, шт. Мичиган, США). Окрашивание жиров в процентах определяли с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Image-Pro Plus, фирма MediaCybernetics, Роквилл, шт. Мэриленд, США) и выражали в виде процента позитивного окрашивания сосуда. Результаты этого исследования обобщены в
аорты у самок мышей линии hu CX3CR1 KI Аро Е
25 таблице 34.
Группа
Доза
Кол-во животных
% площади бляшек
Снижение площади бляшек (в %)
CX3CR1BII036
30 мг/кг (2 х неделю)
10,1
41 (р <0,05)
Обе конструкции, как 66B02-mFc, так и CX3CR1BII036, значимо ингибировали развитие бляшек при дозировании дважды в неделю. Это коррелировало с зоной распространения, поскольку, как удалось установить, 5 уровни этих молекул в плазме поддерживались в течение опыта. При
дозировании 66B02-mFc один раз в неделю уровни в плазме не поддерживались, и это коррелировало с отсутствием значимой эффективности, обнаруженной после лечения в течение 6 недель. На активность молекул не оказывали существенного воздействия ни уровни в плазме холестерина, ни уровни 10 триглицеридов.
Пример 10: Оптимизация последовательности родительского VHH
В целом, в процессе оптимизации последовательности VHH родительские последовательности VHH дикого типа изменяли путем мутации с получением последовательностей VHH, которые обладают более высокой степенью 15 идентичности с человеческими консенсусными последовательностями
зародышевой линии VH3-JH. Конкретные аминокислоты в каркасных участках, которые являются различными между VHH и человеческой консенсусной последовательностью зародышевой линии VH3-JH, изменяли на человеческую копию таким образом, чтобы сохранять без изменения структуру белка, его 20 активность и стабильность. Для изучения этого, все последовательности
оптимизированных вариантов сравнивали с родительским VHH с помощью трех различных анализов: (I) определение температуры плавления (Тпл) с помощью анализа термального сдвига (Thermal Shift Assay) (TSA), (II) анализ активности in vitro с помощью FACS-анализа в конкурентных условиях в присутствии 25 фракталкина, и для некоторых конструкций (III) анализ активности in vitro на основе анализа индуцированного фракталкином хемотаксиса.
Мутация каркасных остатков
Для оптимизации последовательности исследовали следующие мутации: E1D, SI 1L, А14Р, E16G, R44Q, D46E, A74S, K83R и Q108L. Индивидуальные 30 мутанты, которые создавали в родительской последовательности CX3CR1BII66B02, представлены в таблице 35.
Все конструкции клонировали в экспрессионном векторе Е. coli и 5 экспрессировали в Е. coli в виде меченных с помощью myc/His белков в среду ТВ, используя объем культуры 0,25-0,5 л. Экспрессию индуцировали, добавляя 1мМ ИПТГ, и давали проходить в течение 4 ч при 37°С и 250 об/мин. Клетки пеллетировали и получали периплазматические экстракты путем цикла замораживания-оттаивания и ресуспендировали в d-ЗФР. Указанные экстракты
10 применяли в качестве исходного продукта для аффинной хроматографии на
иммобилизованном металле (IMAC), используя неочищенные колонки Histrap FF (фирма GE healthcare). Нанотела элюировали из колонки с помощью 250мМ имидазода и затем обессоливали в противотоке d-ЗФР. Чистоту и целостность нанотел подтверждали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях.
15 Как представлено в обобщенном виде в таблице 36, мутации А14Р, A74S,
K83R и Q108L не оказывали заметного воздействия на активность по данным FACS в условиях конкуренции. Аналогично этому, дополнительные мутации E1D, S11L и E16G не оказывали воздействия на активность. С другой стороны, интродукция либо R44Q, либо D46E приводила к значительному снижению
20 активности, что было даже еще более выраженном при интродукции обеих мутаций.
Номер клона
ic50
Блокада(в %)
ТПл при рН 7
C100CX3CR1BII048
1,9Е-09
101,2
67,74
C100CX3CR1BII049
1,8Е-08
101,2
66,07
C100CX3CR1BII050
1,7Е-08
101,1
71,90
C100CX3CR1BII061
1,4Е-09
98,9
68,57
C100CX3CR1BII056
1,6Е-08
101,1
68,57
C100CX3CR1BII057
1,4Е-08
99,4
74,39
C100CX3CR1BII060
1,9Е-07
98,4
74,81
Кроме того, оценивали температуру плавления, на основе которой можно прогнозировать стабильность VHH. Большинство индивидуальных мутаций оказывали ограниченное действие или не оказывали его вообще, за 5 исключением мутации D46E, которая приводила к повышению температуры плавления примерно на 6°С. Интродукция объединенных мутаций также повышала термостабильность (ср. 057 и 060).
Из-за значительных воздействий на активность при оценке с помощью FACS в условиях конкуренции с лигандом мутации R44Q и D46E не включали в 10 конечную последовательность.
Мутация CDR-остатков
На основе анализа методом компьютерного моделирования ("ш silicon) родительской последовательности прогнозировалось, что сайт гликозилирование находится в положении 52. Для изучения этого вопроса создавали две
15 библиотеки; одну для положения 52 и одну для положения 53, которые
конструировали так, чтобы они включали все возможные аминокислоты в соответствующем положении. Библиотеки подвергали скринингу в виде периплазматических экстрактов с использованием FACS в условиях конкуренции с лигандом. Сначала приготавливали серии разведений
20 периплазматического материала, полученного при изучении родительской
последовательности, и отбирали три разведения для дополнительного скрининга. Первую точку разведения (двукратного) выбирали для получения полной блокады взаимодействия лиганда, а две другие точки разведения (128- и 512-кратные) должны обеспечивать 70%-ную и 40%-ную блокаду соответственно.
25 После получения периплазматических экстрактов из библиотеки все образцы разделяли на два, и один из них подвергали тепловой обработке. Затем как необработанные, так и подвергнутые тепловой обработке три точки разведения образцов анализировали с использованием FACS в условиях конкуренции с
-> о J J -
лигандом. Влияние мутации можно оценивать путем сравнения полученной
блокады с блокадой, полученной в результате применения родительской
последовательности. Анализ подвергнутых тепловой обработке образцов
позволял определять потенциальное воздействие мутации на стабильность.
5 Основываясь на первоначальных результатах скрининга, для дальнейшей
характеризации отбирали семь мутаций. Данные об активности, полученные с помощью FACS в условиях конкуренции с лигандом, представлены в таблице 37. Таблица 37. Удаленный сайт гликозилирования в положении 52
Конструкция
IC50 (М)
Блокада(в %)
Тпл при рН 7
C100CX3CR1BII66B02
2,5Е-09
98,0
65,66
CX3CR1BII66B02 (N52S, Q108L)
1.7Е-09
98,0
66,07
CX3CR1BII66B02 (N52Q, Q108L)
2.1Е-09
97,9
59,83
CX3CR1BII66B02 (N52G, Q108L)
1ДЕ-09
98,0
59,83
CX3CR1BII66B02 (N52T, Q108L)
2,8Е-09
98,0
66,07
CX3CR1BII66B02 (S53T, Q108L)
1,ЗЕ-09
98,1
66,07
CX3CR1BII66B02 (S53G, Q108L)
1,2Е-09
98,3
64,83
CX3CR1BII66B02 (S53P, Q108L)
8,0Е-10
98,2
66,91
10 На основе этого анализа, сравнительного анализа первичной структуры
последовательностей с человеческой референс-последовательностью и на основе анализа с использованием прогностической программы, позволяющей распознавать Т-клеточные эпитопы, при создании изобретения приято решение о включении мутаций N52S и S53T в последовательность.
15 Для более подробного анализа стабильности создавали дополнительную
библиотеку для положения 32. Осуществляли скрининг в отношении конкуренции с лигандом, аналогичный описанному выше. И в этом варианте подвергали скринингу три разведения периплазматических экстрактов и полученный % блокады сравнивали с установленным для родительской
20 последовательности. После анализа различных мутаций выбирали замену N32T и включали в конечный вариант оптимизированной последовательности. Пример 11: Анализ оптимизированных вариантов
В конечном цикле характеризации конструкций определяли характеристики конструкций, перечисленных в таблице 38.
Осуществляли эксперимент с анализом с помощью FACS в условиях 5 конкуренции согласно описанному выше методу, а также определяли
температуру плавления. Полученные данные представлены в таблице 39.
10 Указанные конструкции характеризовали также в отношении
индуцированного фракталкином хемотаксиса согласно описанному выше методу (таблица 40).
Отобранные конструкции оценивали также в отношении ингибирования индуцированной А647-фракталкином интернализации в СНО huCX3CRl-клетки. Результаты обобщены в таблице 41.
Таблица 41. Индуцированная лигандом интернализация при использовании вариантов с оптимизированной последовательностью
Конструкция
1С50(М)
CX3CR1BII00312
5,5 Е-10
CX3CR1BII00313
3,ЗЕ-10
У анти-СХЗСЯ! полипептида с удлиненным временем полужизни с оптимизированной последовательностью отсутствует агонистическая активность
Для подтверждения того, что анти-СХЗСЮ полипептиды с удлиненным временем полужизни с оптимизированной последовательностью не обладают агонистической активностью, CX3CR1BII00313 оценивали в отношении индукции притока кальция в СНО huCX3CRl-клетки. Хотя предварительная инкубация с CX3CR1BII00313 ингибировала опосредуемый фракталкином приток кальция с IC50 1,ЗнМ, не было обнаружено никакого повышения уровней кальция в цитозоле, когда пептид добавляли индивидуально в концентрациях вплоть до 1мкМ.
Пример 12: Исследование форматов с удлиненным временем полужизни, полученных с использованием человеческого Fc-домена
Для изучения альтернативных средств для удлинения времени полужизни получали VHH-домены с оптимизированными последовательностями CX3CR1BII00306 и CX3CR1BII00307 в виде слитых белков с Fc-доменом человеческого IgGl (306D-hFc и 307D-hFc). Две мутации встраивали в СН2-домен для аннулирования потенциальной Fc-опосредуемой эффекторной функции в этой конструкции. 306D-hFc и 307D-hFc экспрессировали в НЕК293Т-клетках или NSO-клетках и очищали с помощью аффинной хроматографии на белке А с последующей ионообменной хроматографией. Оценивали функциональную активность указанных молекул, используя форматы анализа, которые описаны в примере 7. Результаты обобщены в таблице 42.
Хотя указанные молекулы эффективно ингибировали опосредуемую фракталкином активацию CX3CR1, они не проявляли агонистической 5 активности. Не обнаружено никакого повышения в цитозоле уровней кальция, когда эти нанотела добавляли в концентрациях вплоть до 1мкМ.
Пример 13: Ингибирование развития бляшек на мышиной модели
атеросклероза анти-СХЗСК! нанотелом с оптимизированной
последовательностью
10 Самок мышей линии hu CX3CR1KI АроЕ_/" содержали на корме с высоким
содержанием жиров/высоким содержанием холестерина, содержащем 1,5% холестерина, в течение 16 недель, начиная с четырехнедельного возраста. Через 10 недель животным вводили путем i.р.-инъекции наполнитель (20мМ цитрат натрия, рН 6,0, 115мМ NaCl), CX3CR1BII00313 из расчета 30 мг/кг один или два 15 раза в неделю или CX3CR1BII036 из расчета 30 мг/кг дважды в неделю в течение 6 недель. Животных умерщвляли посредством газовой анестезии и определяли площадь бляшек в нисходящей части аорты согласно описанному выше методу. Результаты этого исследования обобщены в таблице 43.
Группа
Доза
Кол-во животных
% площади бляшек
Снижение площади бляшек (в %)
CX3CR1BII036
30 мг/кг (2 х неделю)
6,8
52 (р <0,01)
Как CX3CR1BII00313, так и CX3CR1BII036 значительно ингибировали развитие бляшек при дозировании дважды в неделю. Это коррелировало с зоной распространения, поскольку, как удалось установить, уровни этих молекул в 5 плазме должны поддерживаться в течение опыта. При дозировании
CX3CR1BII00313 один раз в неделю уровни в плазме не поддерживались, и это коррелировало с отсутствием выраженной эффективности, обнаруженной после лечения в течение 6 недель. На активность молекул не оказывали существенного воздействия ни уровни в плазме холестерина, ни уровни триглицеридов.
10 Пример 14: Нанотело связывается с первичными СР14+-клетками человека
и обезьян циномолгус в цельной крови
Анализ FACS в условиях конкуренции aHTH-CX3CRl нанотела с форматированной оптимизированной последовательностью
Для подтверждения связывания aHTH-CX3CRl нанотела, имеющего
15 форматированную оптимизированную последовательность, с человеческими
первичными клетками, с помощью FACS-анализа в условиях конкуренции было продемонстрировано, что конструкция CX3CR1BII00313 конкурировала с меченным А647 CX3CR1BII018 (А647-018) за связывание с СБ14+-клетками в цельной крови. В целом, метод состоял в следующем: мышиное антитело к
20 человеческому CD 14, конъюгированное в eFluor 450 (фирма eBioscience, Сан-Диего, шт. Калифорния, США), разводили в соотношении 1:10 в обработанной ЭДТК цельной кровью здорового донора. Добавляли по 40 мкл/лунку в 96-луночный полистирольный круглодонный планшет, после чего добавляли по 10 мкл/лунку конструкцию CX3CR1BII00313, разведенную в буфере для
25 окрашивания, дополненном БСА (фирма BD Pharmingen), в конечной
концентрации от ЮОнМ до 0,002пМ и образцы инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляли по 10 мкл/лунку А647-018 в буфере для окрашивания с получением конечной концентрации 1нМ (что соответствует ECgo связывания А647-018) и образцы инкубировали в течение
30 еще 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляли по 220 мкл/лунку
раствора 1 -Step Fix/Lyse (фирма eBioscience). После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре клетки пеллетировали, отмывали дважды буфером для окрашивания и ресуспендировали в указанном буфере. Образцы анализировали с помощью проточного цитометра BD LSR II. Медианную 5 интенсивность флуоресценции для AlexaFluor 647 оценивали в
дискриминационном окне, установленном на СЭН-позитивную клеточную популяцию. Установлено, что конструкция CX3CR1BII00313 эффективно ингибировала связывание А647-018 с СВ14-позитивными клетками в человеческой крови, что характеризовалось величиной IC50 0,35нМ (п=8).
10 Для подтверждения связывания aHTH-CX3CRl нанотела, имеющего
форматированную оптимизированную последовательность, с первичными клетками обезьян циномолгус с помощью FACS-анализа в условиях конкуренции было продемонстрировано, что конструкция CX3CR1BII00313 конкурировала с меченным А647 CX3CR1BII018 (А647-018) за связывание с
15 СВ14+-клетками в цельной крови обезьян циномолгус. Применяемый метод был аналогичен описанному ранее за исключением того, что конечная концентрация А647-018 составляла ЗнМ (что соответствует ECso связывания А647-018) и буфер для лизиса АСК (фирма Life Technologies) применяли вместо раствора 1-Step Fix/Lyse. Перед анализом клетки ресуспендировали в буфере для
20 окрашивания, дополненном 1% формальдегида. Установлено, что конструкция CX3CR1BII00313 эффективно ингибировала связывание А647-018 с CD 14-позитивными клетками в крови обезьян циномолгус, что характеризовалось величиной IC50, равной 0,43нМ (п=4).
Пример 15: Изучение фармакокинетики (ФК) на обезьянах циномолгус
25 Фармакокинетическое исследование проводили на необработанных
(наивных) самцах обезьян циномолгус (Масаса fascicularis (яванский макак -крабоед) возрастом 2-5 лет, вес тела которых составлял 2,4-3,5 кг. Обезьян подразделяли на четыре группы обработки. Группу 1 (п=3) обрабатывали 0,2 мг/кг CX3CR1BII00313 i.v.; группу 2 (п=3) обрабатывали 2 мг/кг
30 CX3CR1BII00313 i.v.; группу 3 (п=3) обрабатывали 2 мг/кг CX3CR1BII00313 s.c. и группу 4 (п=3) обрабатывали 5 мг/кг CX3CR1BII00313 i.v. Конструкцию CX3CR1BII00313 вводили в виде раствора с концентрацией 2 мг/мл в цитратном буфере (20мМ цитрат натрияе/115мМ хлорид натрия, рН 6,0). Для ФК-анализа
образцы крови отбирали в течение 6 недель из периферической вены в пробирки-сепараторы для сыворотки.
Образцы сыворотки анализировали, используя формат MSD (фирма Meso Scale Discovery). В целом, метод состоял в следующем: биотинилированное 5 антитело к нанотелу связывали со стандартным стрептавидиновым планшетом (фирма Meso Scale Discovery, Роквилл, шт. Мэриленд, США). Планшеты отмывали 0,05% Твин 20 в забуференном фосфатом физиологическом растворе и блокировали с помощью 5% (масс./об) БСА SeraCare (фирма SeraCare Life Sciences, Милфорд, шт. Массачусетс, США) перед инкубацией с образцами
10 сыворотки. Для детекции CX3CR1BII00313 применяли меченное серой нанотело к нанотелу и планшеты анализировали с помощью устройства Sector Imager 2400 (фирма Meso Scale Discovery). В качестве стандартов применяли различные концентрации CX3CR1BII0313, составляющие от 5000 до 0,5 нг/мл, в 5%-ной обезьяньей сыворотке. Привлечение к мишени оценивали путем мониторинга
15 уровней свободного CX3CR1 на находящихся в дискриминационном окне С014+-моноцитах. Указанный анализ является аналогом FACS-анализа в условиях конкуренции, который описан в примере 14, за исключением того, что дополнительно не вводили CX3CR1BII00313. Осуществляли также мониторинг образцов сыворотки в отношении присутствия античеловеческих антител
20 приматов (РАНА), так как они могут влиять на оценку ФК и свободного CX3CR1.
Для детекции РАНА применяли устройство ForteBio RED96. В целом, метод состоял в следующем: биотинилованное нанотело CX3CR1BII0313 иммобилизовали на стрептавидиновых сенсорах. Затем объединенную сыворотку
25 необработанных обезьян применяли в качестве отрицательного контроля для
расчета отсекающего значения (контрольная сыворотка с минимальным рабочим разведением) (определено как превышающее в 2 раза средней сигнал связывания в необработанной сыворотке). Все образцы сыворотки разводили в 20 раз буфером и принимали, что РАНА-ответ является положительным, если сигнал
30 связывание превышал указанное отсекающее значение.
Данные для моментов времени после детекции РАНА исключали из ФК/ФД (фармакодинамика) анализа. Данные ФК-анализа обобщены ниже в таблице 44.
** недостаточно данных для характеризации конечной фазы
Клиренс и время полужизни при введении дозы 2,0 мг/кг i.v. составляли 9,4 5 мл/день/кг и 9,6 дней соответственно. При дозе 0,2 мг/кг i.v. клиренс оказался существенно более высоким (113 мл/день/кг), что согласовывалось с таким фармакокинетическим параметром, как способное к насыщению мишень-опосредованное распределение (лекарственного средства) (TMD). Величины AUC(0-14 дней), стандартизованные относительно дозы, сравнивали для доз 2 и
10 5 мг/кг i.v. и полученные данные позволили предположить, что TMD-насыщение имеет место при дозе 2 мг/кг. Экспозиция через 2 недели либо после i.v.-, либо после s.c- введения нанотела, составляла > 70нМ, а биодоступность после s.c-введения составляла 54%. При экспозиции отслеживался свободный рецептор, при этом зона распространения, охватывающая более 90% мишеней,
15 поддерживалась при экспозициях > ЮнМ.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БЁРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ИНТЕРНАЦИОНАЛЬ ГМБХ
<120> СХЗСШ-связывающие полипептиды
<130> 09-0569
<150> 61/603,622
<151> 2012-02-27
<160> 282
<170> Patentln, версия 3.5
<210> 1 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 1
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Тгр Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 2 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 2
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 3 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <4 00> 3
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 4 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 4
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Arg Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела <400> 5
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 6
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Asp lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asn Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 7 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 7
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 8 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 8
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Asp lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asn Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 9 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 9
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 10 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 10
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 11 <211> 119 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 11
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu
35 40 45
Val Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 12 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 12
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 13 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 13
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 14 <211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 14
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 15
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 15
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Asp lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asn Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 16 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 16
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 17 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 17
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Asp lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asn Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 18 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 18
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Phe Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 19 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 19
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Phe Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 20 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 20
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 21 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 21
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 22 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 22
Glu Val Gin Leu Val Lys Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 23 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 23
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Met Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Met Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 24
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела <400> 24
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Met Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 25
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Ala
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val lie Asn Thr Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 26 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 26
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 27 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 27
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Ala
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val lie Asn Thr Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 28
Glu Val Gin Leu Val Lys Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Leu Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asp Ser Ala Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Lys Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 29 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 29
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val His Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 30 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 30
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Ala Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 31 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 31
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Lys Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 32 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 32
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 33 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 33
Glu Val Gin Leu Val Lys Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val lie Asn Lys Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<4 00> 34
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 35 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 35
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Gly Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 36 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 36
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly lie Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Gly Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 37 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 37
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Asp lie Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asn Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 38 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 38
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 39 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 39
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Met Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 40 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 40
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 41 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 41
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala lie Asn Ser Val Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 42
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Leu Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 43
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Последовательность нанотела
<400> 43
Glu Val Gin Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 44
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 44
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Leu Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 45 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 45
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly lie Asn Ser Val Asp lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asn Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 46 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 46
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Val lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Thr Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 47 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 47
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Asp Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 48 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 48
Glu Met Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser lie Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Leu lie Asn Ser Val Gly lie Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 49 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 49
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val
35 40 45
Ala Gly lie Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 50 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 50
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Arg Glu Arg Ala Phe Val
35 40 45
Ala Gly lie Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 51 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 51
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly lie Ser Gly Ser Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Arg Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела <400> 52
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly lie Ser Gly Ser Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Arg Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 53
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400>
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Ala
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 54
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 54
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Thr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 55 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 55
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 56 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 56
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Gly Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 57 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 57
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Arg Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 58 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 58
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
lie Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 59 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 59
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 ¦ 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 60 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 60
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
<210> 61 <211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 61
Glu Val Gin Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 62
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 62
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 63 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 63
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Ser Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 64 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 64
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Gly Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 65 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 65
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 66 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 66
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 67 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 67
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 68 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 68
Glu Val Gin Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 69 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 69
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Arg Thr Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
<210> 70 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 70
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Arg Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 71
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела <400> 71
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Leu Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 72
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 72
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Lys Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 73 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 73
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 74 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 74
Glu Val Gin Leu Val Lys Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 75 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 75
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Gly Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 76 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 76
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Arg Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 77 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 77
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 78 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 78
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 79 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 79
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr Thr Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Thr Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 80 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 80
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Arg Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Thr Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Arg Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 81
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 81
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Val Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 82 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 82
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 83 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 83
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Ala Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 84 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 84
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Ala Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Ser Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 85 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 85
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 86 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 86
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 87 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 87
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Gly Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 88 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 88
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser lie Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Phe Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
<211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 89
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 90
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Последовательность нанотела
<400> 90
Glu Val Gin Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gin Val Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 91
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 91
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala lie Ser Ala Thr lie Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 92 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 92
Glu Met Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Gly Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
lie Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 93 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 93
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly lie lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn His Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 94 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 94
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr lie Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Val Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser lie Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 95 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 95
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Arg Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 96 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 96
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 97 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 97
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Pro Cys Ala Thr Ser Lys Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 . 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
<210> 98 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 98
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Lys Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Gly Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 99
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела <400> 99
Glu Val Gin Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Thr Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 100
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 100
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly He He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Thr Asn Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Arg Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 101 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 101
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 102 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 102
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Arg Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 103 <211> 117 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 103
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser
15 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn Ala
20 25 30
Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gin
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Val
85 90 95
Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 104 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 104
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
He Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 105 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 105
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Arg Thr He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 106 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 106
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr Val Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 107 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 107
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Lys Pro He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
<210> 108 <211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 108
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 109
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 109
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 110 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 110
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly He He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Gly Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
He Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 111 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 111
Glu Met Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Arg Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Ser Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 112 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 112
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly lie He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Ser He Gly Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
He Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 HO
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 113 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 113
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asp
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Leu Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
He Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 114 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 114
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Arg Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
He Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 115 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 115
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Val Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 116 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 116
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly He He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
He Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
<210> 117 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 117
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Lys Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Thr Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 118
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела <400> 118
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Arg Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 119
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 119
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Arg Thr He Phe Arg Ser Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 120 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 120
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Phe Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 121
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела <400> 121
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 122 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 122
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 123 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 123
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 ' 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 124 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 124
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 НО
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 125 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 125
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
<210> 126 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 126
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
<210> 127 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 127
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 128
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 128
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 129 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 129
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 130 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 130
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 131 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 131
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 132 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 132
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Gin Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 133 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 133
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Gly Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 134 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 134
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Thr Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 135 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 135
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
<211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 136
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Gly Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 ' 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 137
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Последовательность нанотела <400> 137
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Pro Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 138
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 138
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 139 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 139
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 140 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 140
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
10 Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
15 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 141
<211> 10
<212> PRT
25 <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
30 <400> 141
Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala 15 10
<210> 142 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 142
<210> 143 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 143
Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Lys Ala 15 10
<210> 144 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 144
Gly Ser He Phe Ser Arg Asn Ala Met Ala 15 10
<210> 145 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 145
Gly Gly He Phe Ser Arg Asn Ala Met Ala 15 10
<210> <211> <212>
146
PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 146
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly 15 10
<210> 147 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 147
Gly Thr He Phe Ser Asn Asn Ala Met Gly 15 10
<210> 148 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 148
Gly Thr He Phe Ser Asn Thr Ala Met Gly 15 10
<210> 149
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 149
Gly Не Не Phe Ser Asn Asn Ala Met Gly 15 10
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
10 <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
15 <400> 150
Arg Thr He Phe Arg Ser Asn Ala Met Gly 15 10
<210> 151 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 151
Gly Thr He Phe Arg Ser Asn Ala Met Gly 15 10
35 <210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
40 <220>
<223> Последовательность CDR
<400> 152
45 Gly Thr He Phe Arg Thr Asn Ala Met Gly 15 10
<210> 153 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 153
Lys Thr He Phe Arg Ser Asn Ala Met Gly 15 10
<210> 154 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 154
Gly Thr Thr Phe Arg Ser Asn Ala Met Gly 15 10
<210> 155 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 155
Ala Thr He Phe Arg Ser Asn Ala Met Gly 15 10
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<210> 157 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 157
Gly Ser He Phe Arg Ser Asn Ala Met Gly 15 10
25 <210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
30 <220>
<223> Последовательность CDR
<400> 158
35 Arg Thr He Phe Ser Asn Asn Ala Met Gly 15 10
<210> 159
40 <211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
45 <223> Последовательность CDR
<400> 159
Gly Thr Val Phe Ser Asn Asn Ala Met Gly 15 10
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 160
Lys Pro He Phe Arg Ser Asn Ala Met Gly
1 5 10
<210> 161 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 161
Gly Leu Thr Leu Asp Asp Tyr Ala Met Gly 15 10
<210> 162
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 162
<210> 163
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 163
Val He Asn Ser Val Gly He Thr Lys 1 5
<210> 164
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 164
Gly He Asn Ser Val Gly He Thr Lys 1 5
<210> 165
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 165
Gly He Asn Ser Val Asp He Thr Lys 1 5
<210> 166
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR <400> 166
Ala Не Asn Ser Val Gly He Thr Lys 1 5
<210> 167
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 167
Leu He Asn Ser Val Gly He Thr Lys 1 5
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 168
Val He Asn Thr Val Gly He Thr Lys 1 5
<210> 169
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 169
Leu He Asp Ser Ala Gly He Thr Lys 1 5
<210> 170
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 170
Gly He Asn Ser Val Gly He Ala Lys 1 5
<210> 171
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 171
Val He Asn Lys Val Gly He Thr Lys 1 5
<210> 172
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 172
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 173
Gly He Asn Ser Val Asp He Thr Arg 1 5
<210> 174
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 174
Ala He Asn Ser Val Gly Thr Thr Lys 1 5
<210> 175
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 175
Ser He Asp Ser Val Gly He Thr Lys 1 5
<210> 176
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Последовательность CDR <400> 176
Gly Не Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr 15 10
<210> 177 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 177
Gly He Ser Gly Ser Gly Ser Arg Lys Tyr 15 10
<210> 178
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 178
Ser He Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn 1 5
<210> 179
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 179
Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Thr Asn
<210> 180
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 180
Ser He Gly Ser Thr Tyr Ser Thr Asn 1 5
<210> 181
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 181
Ser He Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Asn 1 5
<210> 182
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 182
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 183
Ser He Ser Asn Ser Gly Ser Ala Asn 1 5
<210> 184
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 184
Ser He Ser He Ser Gly Ser Thr Asn 1 5
<210> 185
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 185
Ser He Thr Asn Thr Gly Ser Thr Asn 1 5
<210> 186
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 186
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr
5 1 5 10
<210> 187
<211> 10
10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 187
Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr 15 10
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
25 <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
30 <400> 188
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asn Thr Arg Tyr 15 10
<210> 189 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 189
<210> 190 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 190
Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Lys Tyr 15 10
<210> 191 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 191
Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr 15 10
<210> 192 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 192
Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr 15 10
<210> <211> <212>
193
PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 193
Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Ser Gly Tyr 15 10
<210> 194 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 194
Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr 15 10
<210> 195 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 195
Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr 15 10
<210> 196
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 196
Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Phe 15 10
<210> 197
<211> 10
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2) . . (2)
<223> X = Pro, Ala или Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7) . . (7)
<223> X = Asp или Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8) . . (8)
<223> X = Thr или Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X = Arg, Lys, Ala или Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10) . . (10)
<223> X = Туг или Phe
<400> 197
Asp Xaa Arg Arg Gly Trp Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10
<210> 198
<211> 25 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность каркасного участка <400> 198
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25
<210> 199 <211> 25 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность каркасного участка <400> 199
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25
<210> 200 <211> 25 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность каркасного участка <400> 200
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25
<210> 201 <211> 25 <212> PRT
10 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность каркасного участка 15 <400> 201
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25
25 <210> 202 <211> 25 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность 30 <220>
<223> Последовательность каркасного участка <400> 202
35 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
40 20 25
<210> 203
<211> 25
45 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность каркасного участка <400> 203
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
10 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 204
15 <211> 25
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
20 <223> Последовательность каркасного участка
<400> 204
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
25 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25
<210> 205 <211> 14 <212> PRT
35 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность каркасного участка
40 <400> 205
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
5 <223> Последовательность каркасного участка <400> 206
Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val Ala
10 1 5 10
<210> 207
<211> 14
15 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность каркасного участка
<400> 207
Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val Ala 15 10
<210> 208
<211> 14
<212> PRT
30 <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность каркасного участка
35 <400> 208
Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Glu Leu Val Ala 15 10
<210> 209
<211> 39
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность каркасного участка
<400> 209
Туг Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala
15 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser 35
<210> 210 <211> 39 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность каркасного участка <400> 210
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser
15 10 15
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
20 25 30
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser 35
<210> 211
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность каркасного участка
Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 212 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность каркасного участка <400> 212
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 15 10
<210> 213 <211> 10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность CDR <400> 213
Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala 15 10
<210> 214
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 214
Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys 1 5
<210> 215
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 215
Ala He Gin Ser Val Gly Val Thr Lys 1 5
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 216
Ala He Gly Ser Val Gly Val Thr Lys 1 5
<210> 217
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 217
Ala He Thr Ser Val Gly Val Thr Lys 1 5
<210> 218
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Последовательность CDR <400> 218
Ala Не Asn Thr Val Gly Val Thr Lys 1 5
<210> 219
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 219
Ala He Asn Gly Val Gly Val Thr Lys 1 5
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 220
Ala He Asn Pro Val Gly Val Thr Lys 1 5
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность CDR
<400> 221
<210> 222 <211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 222
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 223
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 224
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 224
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 225
<211> 369
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
<400> 225
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
195 200 205
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Ser Ser
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
<210> 226 <211> 369 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 226
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser
130 135 140
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Ser Thr
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
305 310 315 320
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 227 <211> 369 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 227
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
100 105 НО
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Asn Ser
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 228 <211> 21 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> N-концевая последовательность CX3CR1 <400> 228
Met Asp Gin Phe Pro Glu Ser Val Thr Glu Asn Phe Glu Tyr Asp Asp
15 10 15
Leu Ala Glu Ala Cys 20
<210> 229
<211> 17
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CX3CR1-EC3 <400> 229
Lys Leu Туг Asp Phe Phe Pro Ser Cys Asp Met Arg Lys Asp Leu Arg
15 10 15
Leu
<210> 230 <211> 115 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 230
Ala Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Thr He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Gin Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 231 <211> 115 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 231
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
<210> 232 <211> 117 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 232
Ala Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Gly Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg He Phe Asp Leu Asn
20 25 30
Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Cys He Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gin Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Lys He Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gin Gly Thr Gin
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 233 <211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность
<400> 233
Gly Gly Gly Gly Ser 1 5
<210> 234
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность
<400> 234
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5
<210> 235
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность
<400> 235
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5
<210> 236
<211> 9
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность
<400> 236
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 5 1 5
<210> 237
<211> 10
10 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность
<400> 237
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10
<210> 238
<211> 15
<212> PRT
25 <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность
30 <400> 238
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
15 10 15
<210> 239 <211> 18 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Линкерная последовательность <400> 239
Gly Ser
<210> 240 <211> 20 <212> PRT
10 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Линкерная последовательность 15 <400> 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
15 10 15
Gly Gly Gly Ser 20
25 <210> 241
<211> 25
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
30 <220>
<223> Линкерная последовательность
<400> 241
35 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
15 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
40 20 25
<210> 242
<211> 30
45 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность <400> 242
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
15 10 15
10 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 243
15 <211> 35
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
20 <223> Линкерная последовательность
<400> 243
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
25 1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser 35
<210> 244 <211> 15 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность <400> 244
<210> 245
<211> 24
5 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность <400> 245
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
15 10 15
<210> 246 <211> 12 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Линкерная последовательность <400> 246
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gin Pro Ala Ala Ala 15 10
35 <210> 247
<211> 62
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
40 <220>
<223> Линкерная последовательность
<400> 247
45 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys
15 10 15
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
35 40 45
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 248
<211> 3
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкерная последовательность
<400> 248
Ala Ala Ala 1
<210> 249 <211> 369 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 249
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Asn Ser
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
325 330 335
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 250
<211> 223
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<2 2 3> Мышиный Fc-домен
<400> 250
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
15 10 15
Phe He Phe Pro Pro Lys He Lys Asp Val Leu Met He Ser Leu Ser
20 25 30
Pro He Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
35 40 45
Val Gin He Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gin
50 55 60
Thr Gin Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Ala Leu Pro He Gin His Gin Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
85 90 95
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro He Glu Arg Thr He
100 105 110
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gin Val Tyr Val Leu Pro
115 120 125
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gin Val Thr Leu Thr Cys Met
130 135 140
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp He Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
145 150 155 160
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
165 170 175
180 185 190
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
195 200 205
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 251 <211> 356 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Нанотело с Fc-доменом <400> 251
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
130 135 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Lys He Lys Asp Val Leu
145 150 155 160
Met He Ser Leu Ser Pro He Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser
165 170 175
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gin He Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
180 185 190
Val His Thr Ala Gin Thr Gin Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
195 200 205
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro He Gin His Gin Asp Trp Met Ser
210 215 220
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
225 230 235 240
He Glu Arg Thr He Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gin
245 250 255
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gin Val
260 265 270
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp He Tyr Val
275 280 285
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
290 295 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
305 310 315 320
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
325 330 335
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
340 345 350
Thr Pro Gly Lys 355
<210> 252 <211> 222 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Человеческий Fc-домен <400> 252
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
15 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
195 200 205
Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 253
<211> 355
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Нанотело с Fc-доменом
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
225 230 235 240
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Pro Gly Lys 355
<211> 355 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Нанотело с Fc-доменом <400> 254
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
130 135 140
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
225 230 235 240
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
340 345 350
Pro Gly Lys 355
<210> 255
<211> 355
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 255
Met Asp Gin Phe Pro Glu Ser Val Thr Glu Asn Phe Glu Tyr Asp Asp
15 10 15
Leu Ala Glu Ala Cys Tyr He Gly Asp He Val Val Phe Gly Thr Val
20 25 30
Phe Leu Ser He Phe Tyr Ser Val He Phe Ala He Gly Leu Val Gly
35 40 45
Asn Leu Leu Val Val Phe Ala Leu Thr Asn Ser Lys Lys Pro Lys Ser
50 55 60
Val Thr Asp He Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Phe
65 70 75 80
Val Ala Thr Leu Pro Phe Trp Thr His Tyr Leu He Asn Glu Lys Gly
85 90 95
Leu His Asn Ala Met Cys Lys Phe Thr Thr Ala Phe Phe Phe He Gly
100 105 110
Phe Phe Gly Ser He Phe Phe He Thr Val He Ser He Asp Arg Tyr
115 120 125
130 135 140
His Gly Val Thr He Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Ala He Leu Val
145 150 155 160
Ala Ala Pro Gin Phe Met Phe Thr Lys Gin Lys Glu Asn Glu Cys Leu
165 170 175
Gly Asp Tyr Pro Glu Val Leu Gin Glu He Trp Pro Val Leu Arg Asn
180 185 190
Val Glu Thr Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Pro Leu Leu He Met Ser
195 200 205
Tyr Cys Tyr Phe Arg He He Gin Thr Leu Phe Ser Cys Lys Asn His
210 215 220
Lys Lys Ala Lys Ala He Lys Leu He Leu Leu Val Val He Val Phe
225 230 235 240
Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Val Met He Phe Leu Glu Thr Leu
245 250 255
Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Pro Ser Cys Asp Met Arg Lys Asp Leu Arg
260 265 270
Leu Ala Leu Ser Val Thr Glu Thr Val Ala Phe Ser His Cys Cys Leu
275 280 285
Asn Pro Leu He Tyr Ala Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu
290 295 300
His Val Asp Phe Ser Ser Ser Glu Ser Gin Arg Ser Arg His Gly Ser
325 330 335
Val Leu Ser Ser Asn Phe Thr Tyr His Thr Ser Asp Gly Asp Ala Leu
340 345 350
Leu Leu Leu 355
<210> 256 <211> 355 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 256
Met Asp Pro Phe Pro Glu Ser Val Thr Glu Asn Phe Glu Tyr Asp Asp
15 10 15
Ser Ala Glu Ala Cys Tyr He Gly Asp He Val Ala Phe Gly Thr Val
20 25 30
Phe Leu Ser He Phe Tyr Ser Val Val Phe Ala He Gly Leu Val Gly
35 40 45
Asn Leu Leu Val Val Phe Ala Leu Thr Asn Ser Lys Lys Pro Lys Ser
50 55 60
Val Thr Asp He Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Phe
65 70 75 80
Val Ala Thr Leu Pro Phe Trp Thr His Tyr Val He Asn Glu Glu Gly
85 90 95
Phe Phe Gly Ser He Phe Phe He Thr He He Ser He Asp Arg Tyr
115 120 125
Leu Ala He Val Leu Ala Ala Asn Ser Met Asn Asn Arg Thr Val Gin
130 135 140
His Gly Val Thr He Ser Leu Gly Val Trp Ala Ala Ala He Leu Val
145 150 155 160
Ala Ala Pro Gin Phe Met Phe Thr Lys Gin Lys Glu Asn Glu Cys Leu
165 170 175
Gly Asp Tyr Pro Glu Val Leu Gin Glu He Trp Pro Val Leu Arg Asn
180 185 190
Val Glu Ala Asn Phe Leu Gly Phe Leu Leu Pro Leu Leu He Met Ser
195 200 205
Tyr Cys Tyr Phe Arg He He Gin Thr Leu Phe Ser Cys Lys Asn His
210 215 220
Lys Lys Ala Lys Ala He Lys Leu He Leu Leu Val Val Val Val Phe
225 230 235 240
Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Val Met He Phe Leu Glu Thr Leu
245 250 255
Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Pro Ser Cys Asp Met Arg Arg Asp Leu Arg
260 265 270
Leu Ala Leu Ser Val Thr Glu Thr Val Ala Phe Ser His Cys Cys Leu
275 280 285
Tyr His Leu Tyr Gly Lys Cys Leu Ala Val Leu Cys Gly Arg Ser Val
305 310 315 320
His Val Asp Phe Ser Pro Ser Glu Ser Gin Arg Ser Arg Gin Gly Ser
325 330 335
Val Leu Ser Ser Asn Phe Thr Tyr His Thr Ser Asp Gly Asp Ala Ser
340 345 350
Leu Leu Leu 355
<210> 257 <211> 369 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 257
Ala Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Ser Ser
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 258 <211> 369 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 258
Ala Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Ser Thr
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 259
<211> 369
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела <400> 259
Ala Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
145 150 155 160
Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Asn Ser
290 295 300
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
340 345 350
Ser
<210> 260 <211> 368 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 260
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser
15 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
85 90 95
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu
100 105 110
Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
165 170 175
He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gin
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr He
210 215 220
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
260 265 270
Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr Arg
275 280 285
Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Ser Ser Val
290 295 300
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg
325 330 335
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly
340 345 350
Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
<210> 261 <211> 368 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 261
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser
15 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin
65 70 75 80
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
165 170 175
He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gin
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr He
210 215 220
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
260 265 270
Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Ser Thr Val
290 295 300
Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser
305 310 315 320
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg
325 330 335
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly
340 345 350
Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
<210> 262 <211> 368 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 262
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser
15 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
85 90 95
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
165 170 175
He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gin
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys. Thr He
210 215 220
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
260 265 270
Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg
275 280 285
Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Asn Ser Val
290 295 300
Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser
305 310 315 320
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg
325 330 335
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly
340 345 350
Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
<210> 263 <211> 355 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 263
Ala Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
225 230 235 240
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Pro Gly Lys 355
<210> 264
<211> 355
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
Ala Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
225 230 235 240
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Pro Gly Lys 355
<211> 354 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 265
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser
15 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Ala He Ser Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
85 90 95
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
130 135 140
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu
225 230 235 240
Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
340 345 350
Gly Lys
<210> 266 <211> 354 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 266
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser
15 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
35 40 45
Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
85 90 95
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
180 185 190
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys
210 215 220
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu
225 230 235 240
Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr
245 250 255
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp
275 280 285
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
290 295 300
305 310 315 320
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
325 330 335
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
340 345 350
Gly Lys
<210> 267 <211> 273 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 267
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val
35 40 45
Ala Gly He Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Val Gin Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn Ala Met Gly Trp Tyr
180 185 190
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val Ala Ser He Ser Ser
195 200 205
Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val
210 215 220
Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
225 230 235 240
Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Asp Ala Arg Arg
245 250 255
<210> 268 <211> 273 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 268
Lys Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ser He Ser Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Ala
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val
165 170 175
Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val Ala Gly He Ser Gly Ser Ala
195 200 205
Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro
245 250 255
Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
<210> 269
<211> 271
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly He Asn Ser Val Gly He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Val Gin Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val Ala Ser He Ser Ser Ser Gly
195 200 205
Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg
210 215 220
Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp
245 250 255
Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Ala Gin Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 270 <211> 271 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 270
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Gly Arg Phe Thr He Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val Ala Val He Asn Ser Val Gly
195 200 205
He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Gly
210 215 220
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 271 <211> 273 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 271
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu
35 40 45
Val Ala Leu He Asn Ser Val Gly He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg
180 185 190
Gin Ala Pro Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val Ala Leu He Asn Ser
195 200 205
Val Gly He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
210 215 220
Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu
225 230 235 240
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Gly Arg Arg
245 250 255
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
<210> 272
<211> 271
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> Последовательность нанотела <400> 272
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Asn Ser Val Gly
195 200 205
Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg
210 215 220
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp
245 250 255
Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 273 <211> 271 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 273
Glu Met Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Leu He Asn Ser Val Gly He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Met Gin Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val Ala Leu He Asn Ser Val Gly
195 200 205
He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Gly Arg Arg Gly Trp
245 250 255
Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 274 <211> 271 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 274
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Gly He Asn Ser Val Gly He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val Ala Gly He Asn Ser Val Gly
195 200 205
He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg
210 215 220
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp
245 250 255
Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 275
<211> 273
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<400> 275
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val
35 40 45
Ala Gly He Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
180 185 190
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Asn Ser
195 200 205
Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
210 215 220
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
225 230 235 240
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
245 250 255
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
<210> 276 <211> 273 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 276
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
35 40 45
Ala Gly lie Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
180 185 190
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val Ala Gly He Asn Ser
195 200 205
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
225 230 235 240
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg
245 250 255
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
<210> 277 <211> 369 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 277
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala
145 150 155 160
Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
165 170 175
Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin
195 200 205
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
210 215 220
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val
245 250 255
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
275 280 285
Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
290 295 300
He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
305 310 315 320
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gin
325 330 335
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr He
340 345 350
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Ser
<210> 278 <211> 395 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 278
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
35 40 ' 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin
180 185 190
Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Asn Ser Val Gly
195 200 205
Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg
210 215 220
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp
245 250 255
Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
290 295 300
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala
305 310 315 320
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser He Ser Gly Ser Gly Ser
325 330 335
Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg
340 345 350
Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro
355 360 365
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr He Gly Gly Ser Leu Ser Arg
370 375 380
Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
385 390 395
<210> 279 <211> 395 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 279
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser
130 135 140
Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
165 170 175
Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin
195 200 205
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
210 215 220
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly
275 280 285
Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
290 295 300
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala
305 310 315 320
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser He Ser Gly Ser Gly Ser
325 330 335
Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro
355 360 365
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr He Gly Gly Ser Leu Ser Arg
370 375 380
Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
385 390 395
<210> 280 <211> 421 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 280
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
5 Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
10 130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin
180 185 190
25 Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala Ala He Asn Ser Val Gly
195 200 205
Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg
30 210 215 220
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp
245 250 255
Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin Val Thr Val Ser Ser Gly
260 265 270
45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro
305 310 315 320
Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
325 330 335
Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
340 345 350
Trp Val Ser Ser He Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp
355 360 365
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr
370 375 380
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
385 390 395 400
Tyr Cys Thr He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu
405 410 415
Val Thr Val Ser Ser 420
<210> 281
<211> 421
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нанотела
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu Ser
145 150 155 160
Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser He Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser
210 215 220
Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr He Gly Gly Ser Leu Ser
245 250 255
Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
290 295 300
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala
325 330 335
Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala
340 345 350
Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
355 360 365
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
385 390 395 400
Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Gin
405 410 415
Val Thr Val Ser Ser 420
<210> 282 <211> 275 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нанотела <400> 282
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val
35 40 45
Ala Gly He Ser Gly Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Ala Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val
145 150 155 160
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
165 170 175
Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe
180 185 190
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val Ala Gly He Ser Gly
195 200 205
Ser Ala Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
210 215 220
Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser
225 230 235 240
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Asn Ser
245 250 255
Tyr Pro Lys Val Gin Phe Asp Tyr Tyr Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser 275
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полипептид, содержащий анти-СХЗСШ иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, где указанный полипептид обладает способностью блокировать связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1.
2. Полипептид по п. 1, в котором указанный анти-СХЗСК1 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен практически состоит из четырех каркасных участков (FRl, FR2, FR3 и FR4) и трех гипервариабельных участков (CDRl, CDR2 и CDR3).
3. Полипептид по п. 1 или п. 2, в котором указанный aHTH-CX3CRl иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VH, VL, VHH, камелизированный VH или VHH, оптимизированный в отношении стабильности, эффективности, технологичности и/или сходства с человеческими каркасными участками.
4. Полипептид по одному из п.п. 1-3, где указанный полипептид обладает аффинностью к человеческому CX3CR1, которая характеризуется:
а) величиной ЕС50, более низкой или равной ЮнМ, более низкой или
равной 5нМ, более низкой или равной 2,5нМ, или более низкой или равной 1нМ,
по данным, полученным путем анализа клеточного связывания с помощью
FACS; или
б) величиной IC50, более низкой или равной ЮнМ, более низкой или равной
5нМ, более низкой или равной 2,5нМ, или более низкой или равной 1нМ, по
данным, полученным с помощью FACS в условиях конкуренции.
5. Полипептид по одному из п.п. 1-4, где указанный полипептид блокирует связывание человеческого фракталкина с человеческим CX3CR1 с величиной IC50, более низкой или равной ЗООнМ, или более низкой или равной ЮОнМ, или более низкой или равной 20нМ, или более низкой или равной ЮнМ,
или более низкой или равной 5нМ, более низкой или равной 2,5нМ, или более низкой или равной 1нМ.
6. Полипептид по одному из п.п. 1-5, где указанный полипептид содержит
5 CDR3, который имеет аминокислотную последовательность Asp-Xaal-Arg-Arg-
Gly-Trp-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5 (SEQ ID NO: 197), в которой:
- Xaal обозначает Pro, Ala или Gly;
- Xaa2 обозначает Asp или Asn;
- ХааЗ обозначает Thr или Ser;
10 - Xaa4 обозначает Arg, Lys, Ala или Gly; и
- Xaa5 обозначает Туг или Phe.
7. Полипептид по n. 6, в котором указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность Asp-Pro-Arg-Arg-Gly-Trp-Asp-Thr-Arg-Tyr (SEQ ID NO:
15 186).
8. Полипептид по одному из п.п. 1-6, где указанный полипептид содержит CDRl, CDR2 и CDR3, которые имеют аминокислотные последовательности,
представленные в:
- SEQ
NO:
213,
221
186
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
162
186
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
163
187
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
164
186
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
166
186
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
167
186
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
167
189
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
168
186
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
168
187
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
169
190
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
170
186
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
171
186
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
174
186
соответственно;
или
- SEQ
NO:
141,
175
187
соответственно;
или
- SEQ ID NO: 142, 165 и 188 соответственно
- SEQ ID NO: 142, 173 и 188 соответственно
- SEQ ID NO: 143, 164 и 186 соответственно
- SEQ ID NO: 144, 172 и 187 соответственно 5 - SEQ ID NO: 145, 172 и 187 соответственно
- SEQ ID NO: 141, 214 и 186 соответственно
- SEQ ID NO: 141, 215 и 186 соответственно
- SEQ ID NO: 141, 216 и 186 соответственно
- SEQ ID NO: 141, 217 и 186 соответственно 10 - SEQ ID NO: 141, 218 и 186 соответственно
- SEQ ID NO: 141, 219 и 186 соответственно
- SEQ ID NO: 141, 220 и 186 соответственно
- SEQ ID NO: 213, 214 и 186 соответственно.
15 9. Полипептид по одному из п.п. 1-5, где указанный полипептид содержит
CDRl, CDR2 и CDR3, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в:
- SEQ ID NO: 146, 176 и 191 соответственно; или
- SEQ ID NO: 146, 177 и 191, соответственно.
10. Полипептид по одному из п.п. 1-5, где указанный полипептид содержит CDRl, CDR2 и CDR3, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в:
- SEQ ID NO: 147, 178 и 192 соответственно; или 25 - SEQ ID NO: 147, 179 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 147, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ ID NO: 148, 179 и 193 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 179 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 180 и 192 соответственно; или 30 - SEQ ID NO: 149, 181 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 183 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 149, 185 и 192 соответственно; или
- SEQ ID NO: 150, 179 и 194 соответственно; или
- SEQ
ID NO:
150,
182 и
194 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
151,
179 и
193 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
151,
182 и
194 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
151,
184 и
196 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
152,
179 и
195 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
153,
179 и
194 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
154,
182 и
194 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
155,
179 и
195 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
156,
181 и
192 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
157,
179 и
194 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
158,
179 и
192 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
159,
178 и
192 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
160,
179 и
194 соответственно;
или
- SEQ
ID NO:
161,
179 и
194 соответственно.
11. Полипептид по п. 1, где полипептид содержит CDRl, CDR2 и CDR3, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в: SEQ ID NO: 141, 164 и 186 соответственно, SEQ ID NO: 141, 162 и 186 соответственно, SEQ ID NO: 213, 214 и 186 соответственно или SEQ ID NO: 213, 221 и 186 20 соответственно.
12. Полипептид по одному из п.п. 1-5, в котором указанный aHTH-CX3CRl
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой
VHH-домен, который содержит последовательность, представленную в:
25 а) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3;
б) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%
идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; или
в) любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-48, 121-
140 или 222-224.
13. Полипептид по одному из п.п. 1-5, в котором указанный aHTH-CX3CRl
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой
VHH-домен, который содержит последовательность, представленную в:
а) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49;
б) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95%
идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49; или
в) любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 49-52.
14. Полипептид по одному из п.п. 1-5, в котором указанный анти-СХЗСШ
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой
VHH-домен, который содержит последовательность, представленную в:
а) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67;
10 б) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 90%
идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 67; или
в) любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 53-120.
15. Полипептид по п. 1, в котором указанный анти-СХЗСШ 15 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит
последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 121-140 или SEQ ID NO: 222-224.
16. Полипептид по одному из п.п. 1-15, в котором указанный
20 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен либо
а) перекрестно блокирует связывание, либо
б) перекрестно блокируется связыванием
по меньшей мере одного из иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов SEQ ID NO: 1-120, 121-140 и 222-224 с CX3CR1.
17. Полипептид по одному из п.п. 1-16, где полипептид содержит также
удлиняющий время полужизни фрагмент.
18. Полипептид по п. 17, в котором указанный удлиняющий время 30 полужизни фрагмент ковалентно связан с указанным полипептидом и выбран из группы, включающей альбуминсвязывающий фрагмент, такой как антиальбуминовый иммуноглобулиновый домен, трансферринсвязывающий фрагмент, такой как антитрансферриновый иммуноглобулиновый домен,
молекулу полиэтиленгликоля, рекомбинантную молекулу полиэтиленгликоля, человеческий сывороточный альбумин, фрагмент человеческого сывороточного альбумина, альбуминсвязывающий пептид или Fc-домен.
5 19. Полипептид по п. 17 или п. 18, в котором указанный удлиняющий время
полужизни фрагмент состоит из антиальбуминового иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.
20. Полипептид по п. 19, в котором иммуноглобулиновый единичный
10 вариабельный домен выбран из VHH-домена, гуманизированного VHH-домена, камелизированного VH-домена, доменного антитела, однодоменного антитела и/или "dAb".
21. Полипептид по п. 20, в котором антиальбуминовый
15 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит последовательность, выбранную из любой из SEQ ID NO: 230-232.
22. Полипептид по одному из п.п. 1-18, где указанный полипептид сцеплен с Fc-областью необязательно через приемлемый линкер или шарнирную область.
23. Полипептид по одному из п.п. 1-16, где указанный полипептид содержит также второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен.
24. Полипептид по п. 23, в котором указанный второй
25 иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит второй анти-СХЗСШ иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен.
25. Полипептид по п. 23 или п. 24, в котором указанные первый и второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены представляют собой VH,
30 VL, VHH, камелизированный VH или VHH, оптимизированный в отношении
стабильности, эффективности, технологичности и/или сходства с человеческими каркасными участками.
26. Полипептид по одному из п.п. 23-25, в котором указанный второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит CDRl, CDR2 и CDR3, аминокислотные последовательности которых представлены в одном из п.п. 6-11.
27. Полипептид по п. 26, в котором указанные первый и второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены содержат одинаковые CDRl, CDR2 и CDR3.
10 28. Полипептид по одному из п.п. 23-27, в котором указанные первый и
второй иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены содержат VHH-домен, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в одном из п.п. 12-15.
15 29. Полипептид по п. 28, в котором указанные первый и второй
иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены содержат одинаковый VHH-домен.
30. Полипептид по п. 1, содержащий первый иммуноглобулиновый
20 единичный вариабельный домен, который содержит CDRl, CDR2 и CDR3,
имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 141, 164 и 186 или SEQ ID NO: 141, 162 и 186, или SEQ ID NO: 213, 214 и 186, или SEQ ID NO: 213, 221 и 186, и второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, представленный в одном из п.п. 1-16.
31. Полипептид по п. 30, в котором указанный второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит CDRl, CDR2 и CDR3, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 141, 164 и 186 или SEQ ID NO: 141, 162 и 186, или SEQ ID NO: 213,
30 214 и 186, или SEQ ID NO: 213, 221 и 186.
32. Полипептид по п. 1, содержащий первый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, в котором указанный первый
32.
иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VHH-домен, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или в любой из SEQ ID NO: 121-140 или 222-224, и второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по одному из п.п. 1-16.
33. Полипептид по п. 32, в котором указанный второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой VHH-домен, который содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, или любой одной из SEQ ID NO: 121-140 или 222-224.
34. Полипептид по одному из п.п. 23-33, где полипептид содержит также удлиняющий время полужизни фрагмент.
35. Полипептид по п. 34, в котором указанный удлиняющий время полужизни фрагмент ковалентно связан с указанным полипептидом и выбран из группы, включающей альбуминсвязывающий фрагмент, такой как антиальбуминовый иммуноглобулиновый домен, трансферринсвязывающий фрагмент, такой как антитрансферриновый иммуноглобулиновый домен, молекулу полиэтиленгликоля, рекомбинантную молекулу полиэтиленгликоля, человеческий сывороточный альбумин, фрагмент человеческого сывороточного альбумина, альбуминсвязывающий пептид или Fc-домен.
36. Полипептид по п. 35, в котором указанный удлиняющий время полужизни фрагмент состоит из антиальбуминового иммуноглобулинового единичного вариабельного домена.
37. Полипептид по п. 36, в котором иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен выбран из VHH-домена, гуманизированного VHH-домена, камелизированного VH-домена, доменного антитела, однодоменного антитела и/или "dAb".
33.
38. Полипептид по п. 37, в котором антиальбуминовый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен выбран из SEQ ID NO: 230-232.
5 39. Полипептид по п. 35, где указанный полипептид сцеплен с Fc-областью
необязательно через приемлемый линкер или шарнирную область.
40. Полипептид по одному из п.п. 1-5 , содержащий любую одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 225-227 или 257-262.
41. Полипептид по одному из п.п. 1-5 , содержащий любую одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 253, 254 или 263-266.
42. Полипептид по одному из п.п. 1-5 , содержащий любую одну из
15 аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 249, 277-281 и 267-276.
43. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по одному из
п.п. 1-42.
20 44. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты
по п. 43.
45. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по одному из п.п. 1-42, где указанная клетка-хозяин
25 обладает способностью экспрессировать указанный полипептид.
46. Фармацевтическая композиция, содержащая (I) полипептид по одному из п.п. 1-42 и (II) фармацевтически приемлемый носитель, и необязательно (III) разбавитель, эксципиент, адъювант и/или стабилизатор.
47. Фармацевтическая композиция по п. 46, где указанная
фармацевтическая композиция пригодна для внутривенной или подкожной
инъекции человеку.
48. Способ получения полипептида по одному из п.п. 1-42, включающий стадии, на которых
- культивируют клетку-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию 5 полипептида по одному из п.п. 1-42,
где указанная клетка-хозяин несет экспрессионный вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает область, которая кодирует полипептид по одному из п.п. 1-42, и где указанная клетка-хозяин представляет собой прокариотическую или 10 эукариотическую клетку.
49. Способ по п. 48, который включает дополнительные этапы
- выделяют указанный полипептид; и
- очищают указанный полипептид.
50. Полипептид по одному из п.п. 1-42, предназначенный для применения при лечении, предупреждении или облегчении заболевания, нарушения или состояния у человека.
20 51. Полипептид, предназначенный для применения по п. 50, где
заболевание, нарушение или состояние представляет собой ассоциированное с CX3CR1 заболевание, нарушение или состояние.
52. Полипептид, предназначенный для применения по п. 51, где указанное 25 заболевание, нарушение или состояние выбрано из кардио- или
цереброваскулярных атеросклеротических нарушений, заболевания периферических артерий, рестеноза, диабетической нефропатии, гломерулонефрита, человеческого серповидного гломерулонефрита, IgA-нефропатии, мембранозной нефропатии, волчаночного нефрита, васкулита, 30 включая пурпуру Геноха-Шенлейна и гранулематоз Вегенера, ревматоидного артрита, остеоартрита, отторжения трансплантата, системного склероза, нейродегенеративных нарушений и демиелинизирующего заболевания, рассеянного склероза (PC), болезни Альцгеймера, легочных заболеваний, таких
как ХОЗЛ, астма, нейропатической боли, связанной с воспалением боли или рака.
53. Полипептид, предназначенный для применения по п. 52, где указанное
5 заболевание, нарушение или состояние представляет собой атеросклероз.
54. Применение полипептида по одному из п.п. 1-42 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения, предупреждения или облегчения заболевания, нарушения или состояния у человека.
55. Способ лечения или предупреждения ассоциированного с CX3CR1 заболевания или нарушения, включающий введение в фармацевтически активном количестве полипептид по одному из п.п. 1-42 индивидууму, нуждающемуся в этом.
56. Способ по п. 55, в котором заболевание или нарушение выбирают из кардио- или цереброваскулярных атеросклеротических нарушений, заболевания периферических артерий, рестеноза, диабетической нефропатии, гломерулонефрита, человеческого серповидного гломерулонефрита, IgA-
20 нефропатии, мембранозной нефропатии, волчаночного нефрита, васкулита, включая пурпуру Геноха-Шенлейна и гранулематоз Вегенера, ревматоидного артрита, остеоартрита, отторжения трансплантата, системного склероза, нейродегенеративных нарушений и демиелинизирующего заболевания, рассеянного склероза (PC), болезни Альцгеймера, легочных заболеваний, таких
25 как ХОЗЛ, астма, нейропатической боли, связанной с воспалением боли или рака.
57. Способ по п. 55, в котором заболевание или нарушение представляет собой атеросклероз.
58. Диагностический набор или способ диагностики, включающий
полипептид по одному из п.п. 1-42, или его применение.
59. Диагностический набор или способ диагностики по п. 58, предназначенный для диагностирования по меньшей мере одного из кардио- или цереброваскулярных атеросклеротических нарушений, заболевания периферических артерий, рестеноза, диабетической нефропатии, 5 гломерулонефрита, человеческого серповидного гломерулонефрита, IgA-нефропатии, мембранозной нефропатии, волчаночного нефрита, васкулита, включая пурпуру Геноха-Шенлейна и гранулематоз Вегенера, ревматоидного артрита, остеоартрита, отторжения трансплантата, системного склероза, нейродегенеративных нарушений и демиелинизирующего заболевания, 10 рассеянного склероза (PC), болезни Альцгеймера, легочных заболеваний, таких как ХОЗЛ, астма, нейропатической боли, связанной с воспалением боли или рака.
- 5 -
- 8 -
-11 -
-11 -
- 12 -
- 12 -
-16 -
- 15 -
- 18 -
- 18 -
- 44 -
- 45 -
- 44 -
- 45 -
- 46 -
- 45 -
- 47 -
- 47 -
- 48 -
- 48 -
- 49 -
- 49 -
- 50 -
- 50 -
- 52 -
- 52 -
- Ill -
- Ill -
- 112 -
-113-
- 112 -
-113-
-116 -
- 115 -
- 118 -
- 118 -
- 134 -
- 134 -
- 135 -
- 135 -
- 141 -
- 141 -
115
- 152 -
- 151 -
- 154 -
- 154 -
- 158 -
- 159-
-161 -
-161 -
- 162 -
- 162 -
-166 -
- 165 -
- 168 -
- 168 -
- 177 -
- 177 -
<210> 42
<210> 42
- 178 -
- 178 -
<220>
<220>
- 179 -
- 179 -
- 188 -
- 187 -
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
- 188 -
- 187 -
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
- 188 -
- 187 -
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
190
190
- 191 -
- 191 -
- 192 -
- 192 -
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
- 193 -
- 193 -
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 194 -
- 194 -
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
- 196 -
- 195 -
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
- 198 -
- 198 -
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
- 199 -
- 199 -
- 200 -
- 200 -
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
- 201 -
- 201 -
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 202 -
- 202 -
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
- 203 -
- 203 -
- 206 -
- 205 -
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
- 208 -
- 208 -
- 210 -
- 209 -
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 212 -
- 213 -
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
- 215 -
- 215 -
- 216 -
- 216 -
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
- 217 -
- 217 -
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
- 218 -
- 218 -
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 219 -
- 219 -
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 89
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 89
- 220 -
- 220 -
<220>
<220>
- 221 -
- 221 -
- 222 -
- 223 -
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
- 225 -
- 225 -
- 226 -
- 226 -
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 227 -
- 227 -
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
- 228 -
- 228 -
- 230 -
- 229 -
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Ala Gly Gly
15 10 15
- 232 -
- 232 -
- 234 -
- 234 -
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
- 235 -
- 235 -
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 236 -
- 236 -
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
Gin Val Thr Val Ser Ser 115
- 238 -
- 237 -
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
- 240 -
- 240 -
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin Gly Pro Gly Lys Lys Arg Asp Leu Val
35 40 45
- 241 -
- 241 -
- 242 -
- 242 -
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
- 243 -
- 243 -
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Val Asp Ala Arg Arg Gly Trp Asn Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 244 -
- 244 -
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
Pro Val Thr Val Ser Ser 115
- 245 -
- 245 -
- 248 -
- 247 -
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
- 250 -
- 250 -
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
- 251 -
- 251 -
- 252 -
- 252 -
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
- 253 -
- 253 -
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
- 254 -
- 255 -
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
- 257 -
- 257 -
- 259 -
- 259 -
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
- 260 -
- 260 -
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 261 -
- 261 -
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 136
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 136
- 262 -
- 262 -
<220>
<220>
- 263 -
- 263 -
- 265 -
- 265 -
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
- 266 -
- 266 -
Gly Thr He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala 15 10
Gly Thr He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala 15 10
- 266 -
- 266 -
Gly Thr He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala 15 10
Gly Thr He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala 15 10
- 267 -
- 267 -
- 267 -
- 267 -
- 268 -
- 268 -
- 272 -
- 271 -
Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys 1 5
- 272 -
- 271 -
Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys 1 5
- 274 -
- 274 -
275 -
275 -
Ser He Asn Ser Val Gly He Thr Lys 1 5
<210> 173
Ser He Asn Ser Val Gly He Thr Lys 1 5
<210> 173
- 276 -
- 276 -
<220>
<220>
- 278 -
- 277 -
Ser He Thr Asn Ser Gly Ser Thr Asn 1 5
<210> 183 <211> 9
- 280 -
- 280 -
Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr 15 10
Asp Gly Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr 15 10
- 281 -
- 281 -
- 281 -
- 281 -
- 282 -
- 282 -
- 284 -
- 283 -
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
- 284 -
- 283 -
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
- 284 -
- 285 -
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gin Pro Gly Glu
15 10 15
- 286 -
- 286 -
Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala 15 10
<210> 206 <211> 14
Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val Ala 15 10
<210> 206 <211> 14
- 287 -
- 287 -
- 288 -
- 288 -
<400> 211
<400> 211
- 289 -
- 289 -
- 290 -
- 290 -
<220>
<220>
- 291 -
- 291 -
Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys
Ala He Ser Thr Val Gly Val Thr Lys
- 292 -
- 292 -
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 223 <211> 118
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 223 <211> 118
- 293 -
- 293 -
- 294 -
- 294 -
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
- 295 -
- 295 -
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
- 296 -
- 296 -
Ser
Ser
- 297 -
- 297 -
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
- 298 -
- 298 -
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
325 330 335
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
325 330 335
- 299 -
- 299 -
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
- 300 -
- 300 -
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala Met Ala Trp Tyr
275 280 285
- 301 -
- 301 -
- 302 -
- 302 -
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
- 303 -
- 303 -
Thr He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
Thr He Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gin Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
304 -
115
304 -
- 306 -
- 305 -
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
15 10 15
- 306 -
- 305 -
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
15 10 15
- 306 -
- 305 -
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
15 10 15
- 306 -
- 307 -
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
15 10 15
- 308 -
- 308 -
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
15 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
15 10 15
- 309 -
- 309 -
- 309 -
- 309 -
- 309 -
- 309 -
- 310 -
- 310 -
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
35 40 45
-311-
-311-
- 312 -
- 312 -
- 313 -
- 313 -
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
- 314 -
- 314 -
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 315 -
- 315 -
- 316 -
- 316 -
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
- 317 -
- 317 -
<400> 253
<400> 253
- 318 -
- 318 -
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
- 319 -
- 319 -
<210> 254
<210> 254
- 320 -
- 320 -
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
- 321 -
- 321 -
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
- 322 -
- 322 -
Leu Ala He Val Leu Ala Ala Asn Ser Met Asn Asn Arg Thr Val Gin
Leu Ala He Val Leu Ala Ala Asn Ser Met Asn Asn Arg Thr Val Gin
- 323 -
- 323 -
Tyr His Leu Tyr Gly Lys Cys Leu Ala Val Leu Cys Gly Arg Ser Val
305 310 315 320
Tyr His Leu Tyr Gly Lys Cys Leu Ala Val Leu Cys Gly Arg Ser Val
305 310 315 320
- 324 -
- 324 -
Leu Gin Asn Ala Met Cys Lys Phe Thr Thr Ala Phe Phe Phe He Gly
100 105 110
Leu Gin Asn Ala Met Cys Lys Phe Thr Thr Ala Phe Phe Phe He Gly
100 105 110
- 325 -
- 325 -
Asn Pro Leu He Tyr Ala Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu
290 295 300
Asn Pro Leu He Tyr Ala Phe Ala Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu
290 295 300
- 326 -
- 326 -
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
- 327 -
- 327 -
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
- 328 -
- 328 -
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
- 329 -
- 329 -
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Gin Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
- 330 -
- 330 -
- 331 -
- 331 -
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
355 360 365
- 333 -
- 333 -
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val
115 120 125
- 334 -
- 334 -
Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser
305 310 315 320
Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser
305 310 315 320
- 335 -
- 335 -
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
85 90 95
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
85 90 95
Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr Arg
275 280 285
Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr Ala Met Ala Trp Tyr Arg
275 280 285
- 337 -
- 337 -
Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Ala He Asn Ser Val Gly Val Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
- 338 -
- 338 -
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gin Leu Val Glu
245 250 255
- 339 -
- 339 -
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Thr
20 25 30
- 340 -
- 340 -
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
- 341 -
- 341 -
<400> 264
<400> 264
- 342 -
- 342 -
- 343 -
- 343 -
<210> 265
<210> 265
- 344 -
- 344 -
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He
145 150 155 160
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He
145 150 155 160
- 345 -
- 345 -
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
- 346 -
- 346 -
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
- 347 -
- 347 -
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
- 348 -
- 348 -
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
- 349 -
- 349 -
Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Ala Gin Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
Gly Trp Asn Thr Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Ala Gin Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser
- 350 -
- 350 -
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
- 351 -
- 351 -
269
<400>
269
<400>
- 352 -
- 352 -
Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin
180 185 190
Thr Ser Gly Thr He Phe Ser Asn Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gin
180 185 190
- 353 -
- 353 -
Ala Val He Asn Ser Val Gly He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Ala Val He Asn Ser Val Gly He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
- 354 -
- 354 -
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ser Asp Ala Arg Arg Gly Trp
245 250 255
- 355 -
- 355 -
Thr Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Gin Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
- 356 -
- 356 -
<220>
<220>
- 357 -
- 357 -
Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Val Gin Ala Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
165 170 175
- 358 -
- 358 -
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gin Arg Asp Leu Val
35 40 45
- 359 -
- 359 -
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
- 360 -
- 360 -
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Ser Asp Pro Arg Arg Gly Trp Asp Thr Arg Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
- 361 -
- 361 -
<220>
<223> Последовательность нанотела
<220>
<223> Последовательность нанотела
- 362 -
- 362 -
- 363 -
- 363 -
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val
- 364 -
- 364 -
Val Gly He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
210 215 220
Val Gly He Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He
210 215 220
- 365 -
- 365 -
- 366 -
- 366 -
Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser Leu
260 265 270
Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Asn Ser Leu
260 265 270
- 367 -
- 367 -
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gin Ala Pro Gly Lys Arg Arg Asp Leu Val
- 368 -
- 368 -
- 370 -
- 370 -
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala
145 150 155 160
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser He Phe Ser Ser Asn Ala
145 150 155 160
- 371 -
- 371 -
Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg
340 345 350
Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg
340 345 350
- 372 -
- 372 -
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
- 373 -
- 373 -
- 374 -
- 374 -
<400> 281
<400> 281
- 375 -
- 375 -
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gin
180 185 190
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gin
180 185 190
- 376 -
- 376 -
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin
370 375 380
Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gin
370 375 380
- 377 -
- 377 -
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
- 378 -
- 378 -
- 379 -
- 379 -
- 382 -
- 381 -
- 384 -
- 384 -
- 386 -
- 387 -
- 386 -
- 387 -