(57) Реферат / Формула:
Данным изобретением предлагаются антигенные полипептиды или антигены ротавирусов, вызывающие у животных или человека иммунный ответ, направленный против ротавирусов; композиции, содержащие указанные ротавирусные полипептиды; способы вакцинации от ротавирусов и наборы для применения таких способов и композиций. Также предлагаются новые экспрессионные векторы для получения антигенных полипептидов для вакцины.
1411399
РОТАВИРУСНАЯ СУБЪЕДИНИЧНАЯ ВАКЦИНА И СПОСОБЫ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
Данная заявка испрашивает приоритет по отношению к предварительной заявке на патент США под серийным номером USNN 61/598624, представленной 14 февраля 2012 г., которая целиком включается в настоящий документ путем отсылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение в широком смысле относится к субъединичным вакцинам, в частности - к вакцинам, содержащим ротавирусные пептиды, которые сконструированы так, чтобы генетически или по антигенным свойствам быть почти идентичными пептидам, экспрессирующимися вирусами, заражающими чувствительную к ним популяцию животных. Плазмиды, обеспечивающие экспрессию антигенных пептидов или субъединичного белка (белков), поддерживаются в популяции бактериальных клеток с помощью селекционной системы токсин/антидот. Бактериальные клетки производят белок-токсин, которому противодействует белок-антидот, кодируемый плазмидой, несущей нуклеотидные последовательности для антигенных пептидов, так что не трансформированные клетки оказываются нежизнеспособными.
Уровень техники
Ротавирусы - наиболее распространенная причина тяжелой диареи у грудных и маленьких детей (Dennehy РН, 2000). Эти вирусы входят в число возбудителей инфекции, часто называемой желудочным гриппом, хотя к собственно гриппу она не имеет никакого отношения. Ротавирусы - род семейства Reoviridae; их генетический материал -двухцепочечная РНК. Известны пять видов (групп) этих вирусов, обозначаемые А, В, С, D и Е (см. классификацию вирусов Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV), 2009) В таблице 1 представлены известные ротавирусные белки. Чаще всего встречается ротавирус А, на долю которого приходится 90% случаев ротавирусной инфекции у людей. Эти вирусы передаются фекально-оральным путем, заражают и повреждают клетки слизистой оболочки тонкого кишечника, вызывая гастроэнтерит. Ротавирусы поражают не только человека, но и животных; они являются патогенным агентом для домашнего скота (Dubovi EJ, 2010).
Так, по данным недавно проведенных исследований, ротавирусы часто (в 65% случаев) обнаруживаются в экскрементах или содержимом кишечника у свиней,
страдающих поносом. В большинстве случаев инфекция у животных вызывается каким-то одним вирусом (А, В, С), но случается и смешанная инфекция ротавирусами более чем одной группы (Yoon, KJ, Epidemiology of rotaviruses, ISUVDL submissions, 2010-2011, Iowa State). Почти треть случаев ротавирусной инфекции у животных вызывается вирусами группы С по меньшей мере. До сих пор профилактика ротавирусной инфекции у свиней сводилась к довольно сомнительной практике скармливания тканей инфицированных поросят здоровым животным. К этому методу вынуждало то, что ротавирусы группы С не удается культивировать in vitro, и, соответственно, нет возможности получать обычного типа вакцины на основе инактивированных/ослабленных цельных вирусных частиц. Таким образом, имеется несомненная и настоятельная необходимость в более безопасных и эффективных средствах предотвращения ротавирусной инфекции.
Альтернативный подход состоял бы в получении вакцин, содержащих иммуногенные субъединичные белки ротавирусов или антигены. На момент подачи
настоящей заявки авторам данного изобретения не известно о работах, в которых описывались бы методы получения субъединичных ротавирусных вакцин (аутогенных или иных) для иммунизации свиней против ротавирусов, в частности, против ротавирусов группы С. В перечисленных ниже патентах и патентных заявках отражен достигнутый на сегодня уровень знаний в отношении ротавирусов в плане субъединичньгх вакцин.
В патенте США № 7790178 (Intervet) описываются трехвалентные вакцины, включающие инактивированный ротавирус собак.
В патентах США № 7311918 и 6589529 (Детская больница шт. Огайо) описываются рекомбинантные гибридные (слитые) ротавирусные белки, включающие фрагмент белка VP6, предназначенные для вакцинации людей. Данные, полученные в исследованиях на мышах, показали, что эти вакцины вызывают иммунный ответ, направленный против гибридного белка VP6.
В патенте США № 6867353 (Exploregen) в основном описывается экспрессия фрагмента кДНК, кодирующая структурный белок ротавируса человека, с использованием трансформированных томатов.
В патенте США № 6716431 (Wyeth, теперь входит в Pfizer) описываются альтернативные формы NSP4 (полиморфизмы однонуклеотидных фрагментов, приводящие к заменам аминокислот), сохраняющие антигенность, но обладающие пониженной цитотоксичностью.
Патенты США № 6673355 и US6210682 (Медицинский колледж Бэйлора) относятся к использованию NSP4 и его фрагментов (NSP4 114-135, NSP4 120-147, NSP4 112-174 или NSP4 112-150) для предотвращения и/или лечения заболеваний, вызываемых ротавирусами. Также описаны композиции, содержащие энтеротоксин с адъювантом. В патентах США № 5891676 и US5827696 (Медицинский колледж Бэйлора) описывается экспрессия ротавирусных белков VP2 и VP7, соответственно.
Патент США № 6187319 (Массачусетский университет) в основном относится к способам индуцирования иммунного ответа против первого ротавируса у животных путем введения изолированного полипептида VP6 второго ротавируса, который поражает другой вид, отличный от того, к которому принадлежит вакцинируемое животное.
В патенте США № 5298244 (Саскачеванский университет) описываются сборные вирусные частицы, содержащие VP4, VP6 и VP7.
В патенте США № 20110171316 (Служба здравоохранения США) описываются вирусоподобные частицы рекомбинантного ротавируса человека группы С.
В патенте США № 20100047763 (Goes et al.) описывается плазмидная ДНК, кодирующая ротавирусные белки, предназначенная для использования в диагностических
наборах.
В патенте США №5186933 (Медицинский колледж Бэйлора) описывается экспрессия ротавирусных генов, в частности, кодирующих VP3 и VP7, с использованием бакуловирусной экспрессионной системы.
До настоящего документа авторам данного изобретения не были известны эффективные ротавирусные субъединичные вакцины для свиней, полученные путем экспрессии антигенов ротавирусов типа С в клетках Е. coll Также не было описаний способов для получения безопасных и эффективных вакцин для свиней. Таким образом, цель настоящего документа - предложить такие вакцины.
Литература
Dennehy РН (2000). "Transmission of rotavirus and other enteric pathogens in the home". Pediatr. Infect. Dis. J. 19 (10 Suppl): S103-5. doi:l0.1097/00006454-200010001-00003. РМШ 11052397.
Bernstein DI (March 2009). "Rotavirus overview". The Pediatric Infectious Disease Journal 28 (3 Suppl): S50-3.
Grimwood K, Lambert SB (February 2009). "Rotavirus vaccines: opportunities and challenges". Human Vaccines 5 (2): 57-69. PMID 18838873.
Bishop R (October 2009). "Discovery of rotavirus: Implications for child health". Journal of Gastroenterology and Hepatology 24 Suppl 3: S81-5.
Rheingans RD, Heylen J, Giaquinto С (2006). "Economics of rotavirus gastroenteritis and vaccination in Europe: what makes sense?". Pediatr. Infect. Dis. J. 25 (1 Suppl): S48-55.
Simpson E, Wittet S, Bonilla J, Gamazina K, Cooley L, Winkler JL (2007). "Use of formative research in developing a knowledge translation approach to rotavirus vaccine introduction in developing countries". BMC Public Health 7: 281.
Edward J Dubovi; Nigel James MacLachlan (2010). Fenner's Veterinary Virology, Fourth Edition. Boston: Academic Press, p. 288. ISBN 0-12-375158-6.
Раскрытие изобретения
Цель данного изобретения состоит в том, чтобы предложить субъединичные вакцины, а также способы лечения и профилактики ротавирусных инфекций.
Данное изобретение также относится к новым векторам и их применению для получения желаемых гетерологичных белков или генов, которые можно использовать, например, в области иммунизации. В конкретных воплощениях данного изобретения гетерологичный белок является белком ротавируса. Более конкретно, в некоторых воплощениях данного изобретения гетерологичный белок является белком ротавируса свиней, выбираемым из NSP4, VP4 или VP6. В другом воплощении данного изобретения
ротавирусный белок является тройным гибридным (слитым) белком NSP4-VP4-VP6.
Еще одна цель данного изобретения состоит в том, чтобы предложить новый вектор, который можно использовать как в небольших, так и в промышленных масштабах (например, в культурах объемом 1-10000 литров) и преимуществом которого является обеспечение высокого выхода желаемого продукта экспрессии, причем это достигается без применения антибиотиков.
Данным изобретение предлагается самореплицирующийся вектор, не несущий никаких генов устойчивости к антибиотикам и содержащий: (а) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ccdA, функционально связанный с первым промотором; (Ь) гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально связанную со вторым промотором. В одном из воплощений данного изобретения первый промотор является конститутивным промотором. В другом воплощении данного изобретения второй промотор является индуцируемым промотором, в частности, второй промотор является промотором Т7. В другом воплощении данного изобретения этот промотор является промотором Т5.
В одном из воплощений данного изобретения гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует антиген вакцины.
В другом своем аспекте данное изобретение относится к прокариотическим клеткам, несущим описанный выше вектор, в которых экспрессируется белок ccdB.
В одном из вариантов данного изобретения указанные прокариотические клетки являются клетками Е. coli.
В другом своем аспекте данное изобретение относится к способу получения гетерологичного белка, включающего следующие этапы:
(a) инокуляция прокариотических клеток, несущих описанный выше вектор, в которых экспрессируется белок ccdB, в подходящую культуральную среду;
(b) культивирование трансформированных таким образом клеток в ферментере в отсутствие антибиотиков; и
(c) выделение гетерологичного белка, образовавшегося на этапе (Ь) из супернатанта или из осадка клеток.
В одном из своих воплощений данное изобретение относится к способу для получения рекомбинантных ротавирусных пептидов.
В другом своем варианте данное изобретение относится к способу получения описанного выше самореплицирующегося вектора, включающему следующие этапы:
(а) инокуляция прокариотических клеток, несущих описанный выше вектор, в которых экспрессируется белок ccdB, в подходящую культуральную среду;
(b) культивирование трансформированных таким образом клеток в ферментере в отсутствие антибиотиков; и
(c) выделение вектора, образовавшегося на этапе (Ь).
В другом своем варианте данное изобретение относится к способу конструирования описанного выше самореплицирующегося вектора, включающему следующие этапы:
(a) начинают с самореплицирующегося вектора, содержащего функциональный ген устойчивости к антибиотику и ген ccdA;
(b) проводят обратную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации нуклеотидной последовательности плазмиды без гена устойчивости к антибиотику;
(c) фосфорилируют и лигируют продукт ПЦР для получения не содержащего гена устойчивости к антибиотику варианта вектора, упомянутого в пункте (а);
(d) трансформируют прокариотические клетки, в которых экспрессируется белок
ccdB;
(e) выделяют указанные прокариотические клетки, содержащие
самореплицирующийся вектор.
В другом аспекте данного изобретения биологические образцы берут у продуктивных животных, включая свиней. Из образцов получают РНК и осуществляют обратную транскрипцию, используя геноспецифичные ротавирусные праймеры. Затем клонируют продукты ПЦР в описанных выше самореплицирующихся плазмидах и новыми плазмидами, содержащими специфичные для популяции животных или географической области ротавирусные гены, трансформируют прокариотические клетки, в которых экспрессируется ccdB. Из этих клеток выделяют ротавирусные пептиды и включают их в состав аутогенных и/или предназначенных для продажи вакцин по данному изобретению.
В одном из воплощений данного изобретения аутогенная субъединичная ротавирусная вакцина содержит адъювант. Этим адьювантом может быть масло, эмульсия, соль металла (например, А1(ОН)з) или их комбинация. В одном из воплощений данного изобретения адьювантом служат продукты TPJGEN(r) или ULTRAGEN(r), или PrimaVant(r) (TPJGEN + Quil A), TS6 (описанный в патенте США № 7371 395 US (Merial)), LR4 (описанный в патенте США № 7691368 (Merial)), или какой-либо из препаратов, описанных в патенте СШАВ № 2011-0129494 Al (Merial).
В одном из воплощений данного изобретения предлагаемая вакцина может содержать смесь ротавирусных белков VP4, VP6 и NSP4 и достаточное для консервации количество формальдегида и/или противомикробных агентов.
Данным изобретением также предлагаются способы для индуцирования иммунологической (или иммуногенной) реакции или протективного иммунного ответа против ротавирусов, а также способы для предотвращения или лечения ротавирусной инфекции или болезненных состояний, вызванных ротавирусами, включающие введение соответствующих субъединиц или композиций, содержащих такие субъединицы.
Данное изобретение также относится к продуктам экспрессии, обеспечиваемой указанными плазмидами, и антител, образовавшихся на эти продукты, или к применениям таких продуктов и антител, например, в диагностических целях.
Предлагаются также наборы, включающие по меньшей мере один ротавирусный полипептид или его фрагмент, или его вариант и инструкции по применении.
Эти и другие воплощения данного изобретения раскрываются или ясны из нижеследующего раздела "Осуществление изобретения" и охватываются им.
Краткое описание фигур
Из остального описания, включающего ссылки на прилагаемые фигуры, явствует полное практическое раскрытие данного изобретения, в том числе наилучшего образа действия для рядового специалиста в данной области техники.
Фигура 1 изображает рестрикционную карту вектора pStabyl.2 (предоставленную поставщиком).
Фигура 2 изображает удаление гена устойчивости к ампициллину из вектора pStabyl.2.
Фигура 3 изображает встраивание гена глутатион-8-трансферазы (GST) в вектор pNPLl с образованием вектора pNPL2.
Фигура 4 представляет карту фланкирующих участков и сайтов встраивания ротавирусных генов в вектор pNPL2.
Фигура 5 представляет схему выделения донорной ДНК.
Фигура 6 представляет схему выделения ротавирусных генов-кандидатов для аутогенной вакцины из клинических образцов.
Фигура 7 представляет схему встраивания донорной ДНК pNPL2 с образованием pNPL2-Rota.
Фигура 8 представляет результаты электрофореза в полиакриламидном геле, подтверждающие экспрессию и размеры ротавирусных белков VP4, VP6 и NSP4.
Фигура 9А представляет выравнивание нуклеотидных последовательностей и последовательностей пептидов для изолятов NSP4 (в таблице указана идентичность в процентах).
Фигура 9В представляет выравнивание нуклеотидных последовательностей и
последовательностей пептидов для изолятов VP4 (в таблице указана идентичность в процентах).
Фигура 9С представляет выравнивание нуклеотидных последовательностей и последовательностей пептидов для изолятов VP6 (в таблице указана идентичность в процентах).
Фигура 10 - диаграмма, демонстрирующая результаты общего серологического исследования эффективности вакцины.
Фигура 11 - диаграммы, демонстрирующие результаты специфичного по VP4, VP6, и NSP4 серологического исследования методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Фигура 12 представляет результаты анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле, подтверждающие экспрессию тройного слитого белка Rota С NSP4-VP4-VP6. L - "линейка"; 1 - до индукции (OD=0,6); 2 - не индуцированные культуры (OD=l,5); 3 - индуцированные культуры (OD=l,5).
Фигура 13 представляет результаты анализа методом вестерн-блоттинга (слева) и электрофореза в полиакриламидном геле (справа), подтверждающие экспрессию слитого белка. L - "линейка"; 1-BSA 1,5 мкг; 2 - слитый белок, разведение 1:20; 3 - слитый белок, разведение 1:40; 4 - GST 0,5 мкг.
Осуществление изобретения
Данное изобретение охватывает субъединицы ротавирусов (которые в настоящем документе определяются как, например, ротавирусные полипептиды, белки антигены, эпитопы или иммуногенные агенты), вызывающие у животных иммуногенную реакцию, в частности, субъединицы ротавирусов, вызывающие, индуцирующие или стимулирующие такую реакцию у свиней.
Особый интерес представляют такие субъединицы ротавирусов, как VP4, VP6 и NSP4, в частности, кодируемые нуклеотидными последовательностями, имеющимися у свиней, зараженных ротавирусом группы С. Считается, что предшественники любого из этих антигенов можно использовать при реализации данного изобретения.
В одном из воплощений данного изобретения предлагается способ амплификации ротавирусных нуклеотидных последовательностей, источником которых являются зараженные ротавирусом свиньи, и применение хорошо известных молекулярных методов для включения указанных амплифицированных последовательностей в экспрессионные векторы. В одном конкретном воплощении данного изобретения амплификация осуществляется путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, комплементарных высоко консервативным участкам ротавирусных генов, так что эти
гены, принадлежащие различным штаммам ротавирусов, можно амплифицировать, используя те же праймеры. В одном из воплощений данного изобретения эти праймеры комплементарны ротавирусным нуклеотидным последовательностям, кодирующим белки VP4, VP6 и/или NSP4, и имеют последовательность, представленную SEQ ID № 8-13).
В другом аспекте данного изобретения предлагаются способы получения экспрессионных векторов, которые содержатся в прокариотическом организме-хозяине и делают возможной экспрессию гена антидота, обеспечивающего жизнеспособность бактериальных клеток, в которых экспрессируются белковые токсины. В одном из воплощений данного изобретения указанный антидот является белком ccdA, а токсин -белком ccdB.
В другом аспекте данного изобретения новые ротавирусные нуклеотидные последовательности включаются в экспрессионные векторы, чтобы производить субъединицы ротавирусов для использования в составе субъединичных вакцин.
В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые субъединичные вакцины содержат также адъювант. В одном из конкретных воплощений данного изобретения адъювант представляет собой систему "масло-в-воде". В некоторых воплощениях данного изобретения адьювантом служат продукты под названиями TPJGEN, ULTRAGEN, PrimaVant, TS6, LR4 или их сочетания. В одном из воплощений данного изобретения предлагаемые вакцины также содержат соль алюминия в количестве, достаточном, чтобы служить адьювантом. В субъединичные вакцины по данному изобретению также можно добавлять другие вещества, способные служить адьювантом, в том числе (не ограничиваясь перечисленным здесь) сапонин и гидроксид алюминия. Эти дополнительные адъюванты могут улучшить стабильность вакцины в процессе хранения или ее эффективность, или и то и другое.
В другом аспекте данного изобретения предлагаются способы обеспечения защитного иммунитета у поросят против ротавирусов, включающие введение предлагаемых субъединичных вакцин свиноматкам и подсвинкам до опороса.
652
NSP4 прямой с сайтом BamHI
653
NSP4, обратный с сайтом Hindlll
654
VP4, прямой с сайтом BamHI
655
VP4, обратный с сайтом Hindlll
656
VP6, прямой с сайтом BamHI
657
VP6, обратный с сайтом Hindlll
760
KSN760 - обратный VP4
761
KSN761 - прямой VP4
762
KSN762 - обратный VP4
763
KSN763 - прямой VP4
772
Праймер 1 для введения His Tag в pNPLl
773
Праймер 2 для введения His Tag в pNPLl
774
Rota С NSP4 прямой для pNPL3
775
Rota С NSP4 ОБРАТНЫЙ для pNPL3 или pNPLl
776
Rota С VP4 ПРЯМОЙ для pNPL3
777
Rota С VP4 ОБРАТНЫЙ для pNPL3 или pNPLl
778
Rota С VP6 ПРЯМОЙ для pNPL3
779
Rota С VP6 ОБРАТНЫЙ для pNPL3 или pNPLl
780
Rota С NSP4 ПРЯМОЙ для pNPLl
781
Rota С VP4 ПРЯМОЙ для pNPLl
782
Rota С VP6 ПРЯМОЙ для pNPLl
783
Rota С VP7 ПРЯМОЙ для pNPL3
784
Rota С VP7 ОБРАТНЫЙ для pNPL3 или pNPLl
Антигенные полипептиды или белки по данному изобретению способны защищать от ротавирусов. Это значит, что они могут стимулировать у животного иммунный ответ. Под антигеном или иммуногеном понимается вещество, вызывающее специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может представлять собой цельный организм - убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть этого организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; участок или фрагмент ДНК, способный вызывать иммунный ответ после представления в животном-хозяине; полипептид, эпитоп, гаптен или любое их сочетание. Или же иммуноген/антиген может представлять собой токсин либо антитоксин.
В настоящем документе термины "белок", "пептид", "полипептид" и "фрагмент полипептида/полипептидный фрагмент" употребляются взаимозаменяемо и относятся к полимерной молекулы, состоящей из мономеров - аминокислот, любой длины. Такой полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты или аналоги аминокислот; в нем могут быть вставки иных нежели аминокислоты химических группировок. Эти термины также включают полимеры из аминокислот, модифицированные естественным образом или путем стороннего вмешательства: например, путем образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, ацетилирования, фосфорилирования или любых
других манипуляций или модификаций, например, конъюгирования с мечеными или биологически активными компонентами.
В настоящем документе термин "иммуногенньш/антигенный полипептид" включает полипептиды, иммунологически активные в том смысле, что, попав в организм животного-хозяина, они способны вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ, направленный против данного белка. Предпочтительно фрагмент белка берется такой, чтобы он обладал в основном такой же иммунологической активностью, что и цельный белок. Таким образом, белковый фрагмент по данному изобретению содержит эпитоп или антигенную детерминанту, или состоит в основном из эпитопа или антигенной детерминанты, или состоит по меньшей мере из одного эпитопа или одной антигенной детерминанты. Термин "иммуногенный белок" или "иммуногенный полипептид" в настоящем документе включает полную аминокислотную последовательность данного белка, его аналогов или иммуногенных фрагментов. Под иммуногенным фрагментом понимается фрагмент белка, включающий один или более эпитопов, и таким образом вызывающий иммунологическую реакцию, описанную выше. Такие фрагменты можно идентифицировать, применяя любое число методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники; см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Например, в случае линейных эпитопов можно параллельно синтезировать множество пептидов на твердой подложке, соответствующих участкам белковой молекулы, и с находящимися на подложке пептидами проводить реакцию с антителами. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 4708 871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. В случае конформационных эпитопов идентификация достигается путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и двумерной ЯМР-спектроскопии; см., например, Epitope Mapping Protocols (см. выше). Методы, особенно подходящие для белков Т. parva, исчерпывающе описаны в заявке на патент США № 2004/022605, которая целиком включается в настоящий документ путем отсылки.
В настоящем описании данное изобретение включает активные фрагменты и варианты антигенных полипептидов. Таким образом, термин "иммуногенньгй/антигенньш полипептид" также охватывает делеции, вставки и замены в последовательности, если с такими изменениями данный полипептид иммунологически функционирует, то есть вызывает иммунологическую реакцию, описанную выше. Термин "консервативная вариация" означает замену аминокислотного остатка другим, биологически сходным, или замену нуклеотида в нуклеотидной последовательности, не приводящую к замене
аминокислотного остатка или приводящую к замене на биологически сходный аминокислотный остаток. В этой связи особенно предпочтительные замены, имеющие место в природе, консервативны, то есть на место заменяемой аминокислоты встает член того же семейства аминокислот. Аминокислоты обычно разделяют на четыре семейства: (1) кислые - аспарагиновая кислота (аспартат) и глутаминовая кислота (глутамат); (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин. триптофан; (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда объединяют в группу ароматических аминокислот. Консервативные вариации включают замену одного гидрофобного аминокислотного остатка, например, изолейцина, валина, лейцина или метионина, на другой гидрофобный остаток; или замену одного полярного аминокислотного остатка на другой полярный остаток, например, замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты - на аспарагиновую кислоту или глутамина - на аспарагин и т.п.; Консервативной заменой будет и такая, когда аминокислота заменяется на структурно родственную, что не влияет существенно на биологическую активность. Таким образом, белки, имеющие такую же в основном аминокислотную последовательность, как и эталонная молекула, но только с незначительными заменами аминокислот, не влияющими существенно на иммуногенность белка, охватываются понятием "эталонный полипептид". В эту категорию включаются все полипептиды, порожденные указанными модификациями. Термин "консервативная вариация" также включает использование замещенных аминокислот вместо исходных незамещенных - при условии, что антитела, образовавшиеся в ответ на такой замещенный полипептид также реагируют с незамещенным полипептидом.
Термин "эпитоп" относится к участку антигена или гаптена, на который отвечают специфичные В- и/или Т-клетки. Этот термин используется как синоним (взаимозаменяемо) термину "антигенная детерминанта" или "участок антигенной детерминанты". Антитела, узнающие один и тот же эпитоп, можно идентифицировать простым иммунологическим методом, демонстрирующим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.
Иммунологическая реакция на композицию или вакцину - это развитие в организме-хозяине клеточного и/или гуморального (опосредованного антителами) иммунного ответа, направленного на данную композицию или вакцину. Обычно понятие "иммунологическая реакция" включает (но не ограничивается перечисленным здесь) один или более из следующих феноменов: образование антител, В-клеток, хелперных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, направленных специфично на антиген или антигены,
содержащиеся в данной композиции или вакцине. Предпочтительно, в организме-хозяине возникает терапевтическая иди протективная иммунологическая реакция, так что усиливается сопротивляемость новой инфекции и/или снижается степень тяжести клинических проявлений заболевания. Такая защита демонстрируется ослабление или отсутствием симптомов и/или клинических признаков заболевания, обычно имеющих место у зараженного организма-хозяина, более быстрым выздоровлением и/или пониженной концентрацией вируса в зараженном организме-хозяине.
Термин "животное" в настоящем документе подразумевает млекопитающих, птиц и проч. Термины "животное" или "хозяин" в настоящем документе включают млекопитающих, в том числе человека. Животное может быть выбрано из группы, состоящей из представителей семейства лошадиных (например, лошади), собачьих (например, собаки, волка, лисицы, койота, шакала), кошачьих (например, льва, тигра и других "больших кошек", в том числе гепарда и рыси, домашней кошки, дикой кошки), полорогих (например, овцы и крупного рогатого скота), нежвачных парнокопытных (например, свиньи), птиц (например, курицы, утки, гуся, индейки, куропатки и перепела, фазана, попугаев, вьюрков, ястребиных, страусов, включая казуара и эму), приматов (например, полуобезьян, включая долгопятов, низших приматов, человекообразных обезьян, включая гиббонов), хорьков, тюленей и рыб. Термин "животное" включает также понятие особи (индивида) на всех стадиях развития, включая периоды новорожденное(tm) и внутриутробного развития.
Если особо не оговорено иного, все технические и научные термины в настоящем документе употребляются в тех же значениях, которые общеприняты у рядовых специалистов в области техники, к которой относится данное описание. Артикли (неопределенные a/an и определенный the) при существительном в единственном числе включают значение множественного числа, если только из контекста не следует значение исключительно единственного числа. Союз "или" подразумевает также соединительное значение ("и"), если только из контекста не следует значение исключительно альтернативы.
В настоящем описании и, в особенности, в формуле изобретения и/или пунктах выражения "содержать" и его производные ("содержащий" и проч.) имеют значение, придаваемое им согласно патентному законодательству США; например, значение "включать" ("включающий", "включенный" и проч.); выражение "состоять в основном из" и его производные ("состоящий в основном из") имеют значение, придаваемое им согласно патентному законодательству США; например, они означают, что подразумеваются не только буквально названные элементы, но исключают элементы,
ранее фигурировавшие в данной области техники или влияющие на основные или новые отличительные признаки данного изобретения. Композиции
Данное изобретение относится к ротавирусным вакцинам или композициям, содержащим ротавирусный полипептид, антиген, эпитоп или иммуногенный агент, и фармацевтически (для людей или для животных) приемлемый носитель или иной эксципиент. Ротавирусный полипептид, белок, антиген, эпитоп или иммуногенный агент может быть любым ротавирусным полипептидом, белком, антигеном, эпитопом или иммуногенньгм агентом, например (не ограничиваясь перечисленным здесь), белком, пептидом или их фрагментом, который вызывает или стимулирует реакцию со стороны организма животного.
Данное изобретение относится к ротавирусным вакцинам или композициям, содержащим ротавирусный полипептид VP1, VP2, VP3, VP4, NSP1, VP6, NSP3, NSP2, VP7, NSP4, NSP5 или NSP6 и фармацевтически (для людей или для животных) приемлемый носитель или иной эксципиент. В одном из воплощений данного изобретения предлагаемый экспрессионный вектор может также содержать полинуклеотид. кодирующий полипептид VP4, VP6 или NSP4 или их комбинацию. В одном из конкретных воплощений данного изобретения полинуклеотид в составе вектора содержит последовательность, представленную SEQ ID N0:16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или их сочетаниями.
В другом воплощении данного изобретения фармацевтически (для людей или для животных) приемлемый носитель или иной эксципиент может представлять собой эмульсию типа "вода в масле". В еще одном воплощении данного изобретения эта эмульсия типа "вода в масле" может быть тройной эмульсией вода/масло/вода (W/O/W).
В одном из воплощений данного изобретения ротавирусный полипептид или антиген, или его фрагмент, или его вариант содержит какой-либо ротавирусный полипептид или его фрагмент, или его вариант. В одном из вариантов этого воплощения данного изобретения указанный ротавирусный полипептид или его фрагмент, или его вариант является рекомбинантным полипептидом - продуктом ротавирусного гена. В другом варианте этого воплощения указанный ротавирусный ген по меньшей мере на 70% идентичен последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или их сочетаниями. В другом варианте этого воплощения указанный ротавирусный ген по меньшей мере на 80% идентичен последовательности, представленной SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39,41,43,45,47, 49, 51, 53, 55, 57, 59,61, 63, 65, 67, 69 или
71, причем указанный полипептид или его фрагмент, или его вариант играет ту же функциональную роль (то есть указанный полипептид является ротавирусным полипептидом VP4, VP6 или NSP4, принадлежащим ротавирусу другого штамма группы С).
Приведенное определение охватывает также синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие производные антигенов, полученные рекомбинантным или синтетическим путем (см., например, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998). Для целей данного изобретения иммуногенные фрагменты обычно включают по меньшей мере около 3 аминокислотных остатка, по меньшей мере около 5 аминокислотных остатков, по меньшей мере около 1015 аминокислотных остатков или по меньшей мере около 15-25 или более аминокислотных остатков исходной молекулы. Что касается длины фрагмента, то верхнего предела здесь нет: он может содержать почти всю аминокислотную последовательность данного белка или даже гибридного (слитого) белка, содержащую по меньшей мере один эпитоп данного белка.
Соответственно, минимальная структура полинуклеотида, проявляющаяся как эпитоп, содержит нуклеотиды, кодирующие эпитоп, или антигенную детерминанту, ротавирусного полипептида (или состоит из этих нуклеотидов. или в основном состоит из этих нуклеотидов). Полинуклеотид, кодирующий фрагмент ротавирусного полипептида, может содержать минимум 15 нуклеотидов, около 30-45 нуклеотидов, около 45-75 или по меньшей мере 57, 87 или 150 последовательно или непрерывно расположенных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности, кодирующей данный полипептид (или состоять из них, или в основном состоять из них). При осуществлении на практике данного изобретения могут применяться такие подходы к определению эпитопов, как, например, создание библиотек перекрывающихся пептидов (Hemmer et al., 1998), пептидное сканирование (метод PEPSCAN) (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) и использование алгоритмов (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605).
Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" относятся к РНК или ДНК -линейным или разветвленным, одно- или двухцепочечным, или их гибридам. Эти термины охватывают также гибридные молекулы ДНК/РНК. Ниже приведены примеры (не имеющие ограничительного характера) полинуклеотидов: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, матричные РНК (мРНК), транспортные РНК (тРНК), рибосомные РНК (рРНК), рибозимы, комплементарные ДНК (кДНК), рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированная ДНК с любой
нуклеотидной последовательностью, изолированная РНК с любой нуклеотидной последовательностью, ДНК- или РНК-пробы (зонды) и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, например, метилированные нуклеотиды; или аналоги нуклеотидов; урацил; сахара и связывающие группировки, отличные от рибозы и дезоксирибозы, например, фторрибозу и тиолаты; и нуклеотидные ответвления. Нуклеотидная последовательность может модифицироваться после полимеризации, например, путем конъюгации с компонентом-меткой. Другие модификации такого рода включают кэпирование, замену одного или более природных нуклеотидов на аналоги, включение средств для присоединения полинуклеотида к белкам, ионам металлов, компонентам-меткам, другим полинуклеотидам или твердой подложке. Полинуклеотиды по данному изобретению могут быть получены путем химического синтеза или произведены микроорганизмами.
Термин "ген" употребляется в широком смысле для обозначения любого участка полинуклеотида, связанного с той или иной биологической функцией. Так, понятие гена включает интроны и экзоны как геномные последовательности или только кодирующие нуклеотидные последовательности, например, кДНК и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, термин "ген" также относится к фрагментам нуклеиновых кислот, обеспечивающим образование мРНК или функциональной РНК, или кодирующим определенный белок, которые включают регуляторные последовательности.
Данное изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, комплементарные полинуклеотидам, кодирующим антиген, эпитоп или иммуногенный агент. Комплементарная последовательность может быть полимером любой длины и может содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любых сочетаниях.
Определение "изолированный" ("выделенный") применительно к биологическому компоненту (например, нуклеиновой кислоте, белку или клеточной органелле) означает, что данный компонент в основном отделен или очищен от других биологических компонентов клеток того организма, в котором данный компонент присутствует от природы, например, от других хромосомных или нехромосомньгх ДНК или РНК, белков и органелл. Изолированные (выделенные) нуклеиновые кислоты и белки включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные стандартными методами очистки такого рода веществ. Определение "изолированный" ("выделенный") также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью методов рекомбинантной ДНК/РНК или путем химического синтеза.
Определение "очищенный" в настоящем документе не подразумевает абсолютной чистоты - это скорее относительная характеристика. Так, например, препарат частично очищенного полипептида - это такой препарат, в котором относительное содержание данного полипептида выше, чем в его естественном окружении. Иными словами, данный полипептид отделен от других клеточных компонентов. Выражение "в основном очищенный" ("практически очищенный") подразумевает, что по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или более клеточного материала или клеточных компонентов удалены. Сходным образом определяется понятие "частично очищенный полипептид". Это выражение подразумевает, что удалены менее 60% клеточного материала или клеточных компонентов. То же относится к полинуклеотидам. Описанные в настоящем документе полипептиды могут быть очищены любыми известными в данной области техники способами.
Также в объем данного изобретения входят гомологи ротавирусных полипептидов. В настоящем документе термин "гомологи" включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин "аналог" применительно к двум полипептидам или полинуклеотидам означает, что они выполняют одну и ту же функцию или сходные функции, но в ходе эволюции возникли независимо друг от друга у неродственных организмов. Термин "ортологи" употребляется в отношении полинуклеотидов или полипептидов из разных видов, подразумевая, что два полипептида (полинуклеотида) разделились в результате видообразования и происходят от общего предкового гена. Обычно ортологи кодируют полипептиды с одной и той же функцией или со сходными функциями. Термин "паралоги" употребляется в отношении полипептидов или полинуклеотидов, разделившихся в результате дупликации в геноме. У двух паралогичных полипептидов (полинуклеотидов) обычно разные функции, но эти функции могут быть связаны. Например, аналоги, ортологи и паралоги ротавирусного полипептида дикого типа могут отличаться от ротавирусного полипептида дикого типа в результате посттрансляционной модификации различий в аминокислотной последовательности или того и другого вместе. В частности, гомологи по данному изобретению в основном по меньшей мере на 80-85%, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичны по последовательности всему полипептиду или полинуклеотиду ротавируса дикого типа (или его части) и выполняют сходные функции.
В другом аспекте данного изобретения предлагается полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 70%", по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей
мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида, представленного SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71. В еще одном аспекте данного изобретения предлагаются фрагменты и варианты ротавирусных полипептидов, о которых говорилось выше (SEQ ID N0:17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71); они могут быть достаточно легко получены специалистом в данной области техники с помощью хорошо известных молекулярно-биологических методов.
Варианты - это гомологичные полипептиды, у которых аминокислотная последовательность по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID N0:17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43,45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71.
Варианты включают аллельные варианты. Термин "аллельный вариант" относится к существующим в природной популяции (например, виды или штаммы вируса) полинуклеотидам или полипептидам, в которых имеются полиморфизмы, приводящие к изменениям аминокислотной последовательности белка. В силу существования таких аллельных вариантов обычно имеет место 1-5%-ная изменчивость полинуклеотидов или полипептидов. Аллельные варианты можно идентифицировать путем секвенирования данной нуклеотидной последовательности у ряда различных видов живых организмов, что можно легко осуществить с помощью гибридизационных зондов, чтобы идентифицировать у этих видов один и тот же генный локус. В объем данного изобретения входят любые (и все) такие вариации нуклеотидных последовательностей и следующий из них полиморфизм аминокислотных последовательностей или вариации, являющиеся результатом природных аллельных вариантов, которые не влияют на функциональную активность данного гена.
В настоящем документе термины "производное" или "вариант" относятся к полипептиду (или к кодирующей его нуклеиновой кислоте), в котором имеются одна или более консервативных вариаций аминокислот или иные незначительные модификации -такие, что функционирование соответствующего полипептида практически не изменяется по сравнению с полипептидом дикого типа или (2) антитела против данного полипептида иммунореактивны в отношении полипептида дикого типа. Эти варианты или производные включают полипептиды с незначительными модификациями по сравнению с исходными аминокислотными последовательностями ротавирусных полипептидов, в результате чего пептиды обладают практически такой же активностью, как соответствующие не
модифицированные полипептады. Такие модификации могут создаваться намеренно, например, путем направленного (сайт-специфичного) мутагенеза, или же быть спонтанными. Термин "вариант" также включает делеции, вставки и замены в последовательности, не влияющие на функционирование полипептида, а именно на иммунологическую реакцию, как это описано в настоящем документе.
Термин "консервативная вариация" означает замену аминокислотного остатка на другой, биологически сходный аминокислотный остаток или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, не приводящую к замене аминокислотного остатка в соответствующем полипептиде или приводящую к замене на биологически сходный аминокислотный остаток. В этой связи особенно предпочтительные замены, как правило, консервативны, о чем говорилось выше.
Иммуногенный фрагмент ротавирусного полипептида включает по меньшей мере 8, 10, 13, 14, 15 или 20 расположенных подряд аминокислотных остатков, по меньшей мере* 21 аминокислотный остаток, по меньшей мере 23 аминокислотных остатка, по меньшей мере 25 аминокислотных остатков или по меньшей мере 30 аминокислотных остатков ротавирусного полипептида с последовательностью, представленной SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или их вариантами, или функциональными фрагментами.
В другом аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, кодирующий ротавирусный полипептид, например, полинуклеотид, кодирующий полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или их вариантами, или функциональными фрагментами. В еще одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид. кодирующий полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%" или 99% идентична последовательности полипептида, представленной SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72 или консервативным вариантом, аллельньгм вариантом, гомологом или иммуногенным фрагментом, содержащим по меньшей мере восемь или по меньшей мере десять расположенных подряд аминокислотных остатков одного из этих полипептидов или их сочетаний.
В другом аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID N0:17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71, или их
вариантами, или функциональными фрагментами. В еще одном аспекте данного изобретения предлагается полинуклеотид. кодирующий полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида, представленной SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71, или их вариантом.
В настоящем описании полинуклеотиды включают нуклеотидные последовательности, вырожденные в смысле генетического кода в результате, например, использования оптимизированных кодонов для определенного организма-хозяина. В настоящем документе определение "оптимизированный" относится к полинуклеотидам, которым методами генетической инженерии придана способность к усиленной экспрессии у данного вида живых организмов. Для получения кодон-оптимизированных полинуклеотидов. кодирующих ротавирусные полипептиды, последовательность ДНК ротавирусного гена может быть модифицирована, чтобы 1) содержать ко доны, предпочтительные для генов с высоким уровнем экспрессии в экспрессионной системе данных клеток-хозяев (например, бактериальных); 2) иметь содержание А+Т или G+C близкое к обычно имеющему место у данных клеток-хозяев; 3) образовывать инициаторную последовательность указанных клеток-хозяев; 4) исключить последовательности, обусловливающие дестабилизацию, деградацию и терминацию РНК, или образовывать вторичную структуру типа "шпилька", усиленная экспрессия ротавирусного белка в экспрессионной системе указанных клеток-хозяев может достигаться с учетом распределения частоты использования кодонов у прокариот.
Степень идентичности двух сравниваемых аминокислотных последовательностей может быть установлена с помощью программы BLAST с матрицей попарных сравнений BLOSUM62 NCBI (Национального центра биотехнологической информации, Бетесда, шт. Мэриленд, США) с использованием стандартных параметров (см., например, алгоритмы BLAST или BLASTX на сервере NCBI, а так же работу Altschul et al.). В настоящем документе алгоритм или BLAST, или BLASTX и матрица BLOSUM62 обозначаются словом "blasts".
Термин "идентичность" применительно к последовательностям относится к числу положений с одинаковыми нуклеотидами или аминокислотами, деленному на число нуклеотидов или аминокислот в наиболее короткой из сравниваемых двух последовательностей. Выравнивание двух последовательностей определяют согласно алгоритму Уилбура-Липмана (Wilbur, Lipman), например, взяв размер окна 20
нуклеотидов, длину слова 4 нуклеотида и штраф за пробел 4. Компьютерный анализ и интерпретацию данных включая выравнивание можно осуществить, используя имеющиеся в продаже программы (например, Intelligenetics(tm) Suite, Intelligenetics Inc. CA). Когда говорят, что последовательности РНК сходны или имеют степень идентичности последовательностей, или гомологию с последовательностями ДНК, тимидин (Т) в последовательностях ДНК считается эквивалентным урацилу (U) в последовательностях РНК. Таким образом, последовательности РНК входят в объем данного изобретения; их можно вывести их последовательностей ДНК, полагая тимидин (Т) в последовательностях ДНК эквивалентным урацилу (U) в последовательностях РНК.
Идентичность или сходство двух аминокислотных последовательностей или идентичность двух нуклеотидных последовательностей можно определять, используя пакет программ Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Карлсбад, штат Калифорния, США).
В работах перечисленных ниже авторов предлагаются алгоритмы для сравнения и определения относительной идентичности или гомологии последовательностей; для определения процента гомологии или идентичности дополнительно к изложенному выше (или вместо него) можно использовать рекомендации, данные в работах этих авторов: Needleman SB and Wunsch CD; Smith TF and Waterman MS; Smith TF, Waterman MS and Sadler JR; Feng DF and Dolittle RF; Higgins DG and Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ; and, Devereux J, Haeberlie P and Smithies О. Опытный специалист в данной области техники может обойтись без ненужного экспериментирования, используя при определении процента гомологии также многие другие программы или работы.
Реакции гибридизации можно проводить в условиях различной степени строгости. Условия, увеличивающие строгость гибридизации, хорошо известны (см., например, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", второе издание (Sambrook et al., 1989).
Данное изобретение также охватывает ротавирусные полинуклеотиды, содержащиеся в векторных молекулах или экспрессионных векторах и функционально связанные с промоторными элементами и при необходимости с энхансерами.
Термин "вектор" в настоящем документе относится к рекомбинантным плазмидам (РНК или ДНК) или вирусам, содержащим гетерологичный полинуклеотид, который должен быть доставлен в клетку-мишень in vitro либо in vivo. Этот гетерологичный полинуклеотид может включать нуклеотидную последовательность, нужную для профилактики или лечения и при необходимости он может быть представлен экспрессионной кассетой. В контексте данного изобретения вектор не обязательно способен к репликации в конечной клетке-мишени или организме пациента. Термин
"вектор" включает клонирующие и вирусные векторы.
Термин "рекомбинантный" означает, что данный полинуклеотид является полностью или частично синтетическим и не встречается в природе или связан с другим полинуклеотидом в конструкции, не встречающейся в природе.
Термин "гетерологичный" означает, что данный полинуклеотид происходит из объекта, генетически отличного от того объекта, с которым проводится сравнение. Например, с помощью методов генетической инженерии полинуклеотид может быть включен в плазмиду или вектор, происходящий из другого источника, и тогда он является гетерологичным. Промотор, отделенный от своей природной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, отличной от той, природной, является гетерологичным промотором
Полинуклеотиды по данному изобретению могут содержать дополнительные последовательности, например, дополнительные кодирующие последовательности в пределах той же транскрипционной единицы; регуляторные элементы, например, промоторы; участки связывания с рибосомой; нетранслируемые области (5'-UTR, 3х-UTR); терминаторы транскрипции; сайты полиаденилирования; дополнительные транскрипционные единицы, регулируемые тем же или иным промотором; последовательности, обеспечивающие клонирование, экспрессию, гомологичную рекомбинацию и трансформацию клетки-хозяина; а также любые другие подобные элементы, если они желательны для воплощения данного изобретения.
В векторе по данному изобретению предпочтительно имеются элементы, нужные для экспрессии ротавирусного полипептида, антигена, эпитопа или иммуногенного агента. Как минимум вектор содержит кодон инициации трансляции (ATG), стоп-кодон и промотор, а при необходимости также последовательность polyA - в случае некоторых векторов, например, плазмид и ряда вирусных векторов (например, отличных от поксвирусов). Когда полинуклеотид по данному изобретению кодирует фрагмент полипептида, например, ротавирусного полипептида, в векторе предпочтительно инициаторный кодон ATG помещается на 5'-конце рамки считывания, а стоп-кодон - на ее 3'-конце. Могут присутствовать и другие элементы для регуляции экспрессии, например, энхансеры, стабилизирующие последовательности, интроны и сигнальные последовательности, нужные для секреции белка-продукта.
Данное изобретение относится также к препаратам, содержащим векторы (например, экспрессионные векторы), например, к терапевтическим композициям. Такие препараты могут включать один или более векторов, например, экспрессионных векторов, например, векторов для экспрессии in vivo, кодирующих и обеспечивающих экспрессию
одного или более ротавирусных полипептидов, антигенов, эпитопов или иммуногенньгх агентов. В одном из воплощений данного изобретения предлагаемый вектор содержит (и обеспечивает экспрессию) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий и/или обеспечивающий экспрессию ротавирусного гена, эпитопа или иммуногенного агента, в фармацевтически (для людей и животных) приемлемом носителе, эксципиенте или растворителе. Таким образом, по одному из воплощений данного изобретения другой вектор (векторы) в указанном препарате содержит (содержат) полинуклеотид, кодирующий и при соответствующих обстоятельствах экспрессирующих один или более других белков помимо ротавирусного полипептида, антигена, эпитопа или иммуногенного агента - например, гемагглютинин, белок капсида, нейраминидазу, нуклеопротеин, неструктурный белок, энтеротоксин - или их фрагменты; или указанный вектор состоит в основном или целиком из указанных элементов.
В другом воплощении данного изобретения предлагаемый вектор (векторы) в препарате содержит полинуклеотид (полинуклеотиды), кодирующий один или более белков или фрагментов ротавирусного полипептида, антигена, эпитопа или иммуногенного агента полинуклеотид; или указанный вектор состоит в основном либо целиком из указанных элементов. В другом воплощении данного изобретения предлагаемый препарат содержит один, два или более векторов, содержащих полинуклеотиды, кодирующие и обеспечивающие экспрессию, предпочтительно in vivo, ротавирусных полипептидов, антигенов, гибридных (слитых) белков или их эпитопов. Данное изобретение также направлено на смеси векторов, которые содержат полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие различные ротавирусные полипептиды, антигены, эпитопы, гибридные (слитые) белки или иммуногенные агенты, например, ротавирусные полипептиды, антигены, эпитопы или иммуногенные агенты различных видов живых организмов, включающих (но не ограничивающихся перечисленным здесь) людей, свиней, коров и другой крупный рогатый скот, собак, кошек и птиц.
В еще одном воплощении данного изобретения экспрессионный вектор является плазмидным, в частности, для экспрессии in vivo. В одном из конкретных примеров (не имеющем ограничительного характера) в качестве вектора для внедрения полинуклеотидной последовательности могут использоваться плазмиды pVR1020 или 1012 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al, 1996, см., например, патенты США №№ 5,846,946 и 6,451,769). Плазмида pVR1020 происходит из плазмиды pVR1012 и содержит человеческую сигнальную последовательность tPA. В одном из воплощений данного изобретения человеческая сигнальная последовательность tPA содержит аминокислоты с
М(1) по S(23) в последовательности, зарегистрированной в базе данных Genbank под номером HUMTPA14. В другом конкретном примере (не имеющем ограничительного характера) указанная плазмида, используемая как вектор для внедрения полинуклеотидной последовательности, может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид лошадиного инсулиноподобного фактора роста IGF1 с аминокислотного остатка М(24) до аминокислотного остатка А(48) в последовательности, зарегистрированной в базе данных Genbank под номером U28070. Дополнительная информация о ДНК-плазмидах, которую можно использовать для консультирования или осуществления на практике, имеется, например, в патентах США № 6852705; 6818628; 6586412; 6576243; 6558674; 6464984; 6451770; 6376473 и 6221362.
Термин "плазмида" в настоящем документе охватывает любые транскрипционные единицы ДНК, содержащие полинуклеотид по данному изобретению и элементы, необходимые для его экспрессии in vivo в клетке или клетках нужного организма-хозяина или мишени; в этой связи следует отметить, что сверхскрученные или несверхскрученные кольцевые, а также в линейной форме плазмиды входят в объем данного изобретения.
Каждая плазмида в дополнение к полинуклеотиду, кодирующему ротавирусный полипептид, антиген, эпитоп или иммуногенный агент, при необходимости содержит (или состоит в основном из указанных элементов) слитую с ним последовательность, кодирующую гетерологичный пептид, вариант, аналог или фрагмент, функционально связанную с промотором или регулируемую промотором, или зависимую от промотора. Вообще, предпочтительно использовать сильные промоторы, функциональные в эукариотических клетках. Таким сильным промотором может быть (не ограничиваясь перечисленным здесь) промотор предранних генов цитомегаловируса (CMV-IE) человеческого или мышиного происхождения или при необходимости иного происхождения, например, из морских свинок или крыс.
В более общих чертах промотор может быть вирусного либо клеточного происхождения. Сильным вирусным промотором, отличным от CMV-IE, который можно использовать для осуществления данного изобретения, является промотор ранних/поздних генов вируса SV40 или промотор LTR вируса саркомы Рауса. Сильным клеточным промотором, который можно использовать для осуществления данного изобретения, является промотор какого-либо гена цитоскелета, например, промотор гена десмина (Kwissa et al., 2000) или промотор гена актина (Miyazaki et al., 1989).
Что касается сигнала полиаденилирования (polyA) для плазмид и вирусных векторов, отличных от поксвирусных, можно использовать сигнал полиаденилирования
гена гормона роста крупного рогатого скота (bGH) (см. патент США № 5122,458) или гена р-глобина кролика, или SV40.
Под клеткой-хозяином понимается прокариотическая либо эукариотическая клетка, которая генетически изменена или способна к генетическому изменению путем введения экзогенного полинуклеотида, например, рекомбинантной плазмиды или вектора. Применительно к генетически измененным клеткам данный термин относится как к клеткам, которые были изменены первыми, так и к их потомкам.
Способы применения и изделие
Данное изобретение включает следующие воплощения предлагаемого способа. В одном из воплощений раскрывается способ вакцинации животных, включающий введение животному композиции, содержащей вектор, в составе которого имеется нуклеотидная последовательность, кодирующая ротавирусный полипептид или его фрагмент, или его вариант, и фармацевтически (для людей и животных) приемлемый носитель, эксципиент или растворитель, в одном из вариантов этого воплощения способа по данному изобретению животным является свинья.
В одном из воплощений данного изобретения применяется такой режим вакцинации, когда проводят несколько иммунизаций разными вакцинными препаратами ("прайм-буст"); при этом делается по меньшей мере одно первичное введение и по меньшей мере одна повторная иммунизация с использованием по меньшей мере одного общего полипептида, антигена, эпитопа или иммуногенного агента. Обычно иммунологическая композиция или вакцина, используемая для первичного введения отличается от тех, что используются для повторной иммунизации. Однако следует отметить, что и для первичного введения и для повторной иммунизации можно использовать одну и ту же композицию. Такой режим введения вакцины называется "прайм-буст".
Режим прайм-буста включает по меньшей мере одно первичное введение и по меньшей мере одну повторную иммунизацию с использованием по меньшей мере одного общего полипептида и/или его вариантов, или его фрагментов. Вакцина, используемая для первичного введения, может отличаться от тех препаратов, которые используются для последующего усиления иммунного ответа. Первичное введение может происходить в один или более приемов. Повторное введение также может происходить в один или более приемов.
Объем дозы композиций по данному изобретению для видов-мишеней, являющихся млекопитающими, например, объем дозы для свиньи (как молодых особей, так и взрослых) в случае композиции на основе вирусного вектора, например, отличного
от поксвирусного, составляет, как правило, от около 0,1 до около 2,0 мл, от около 0,1 до около 1,0 мл и от около 0,5 до около 1,0 мл.
Эффективность вакцин можно оценивать через около 2-4 недели после последней иммунизации, подвергая животных, например, свиней, контакту с вирулентным штаммом ротавируса. При проверке эффективности вакцины для заражения животных используются как гомологичные, так и гетерологичные штаммы. Животное можно заражать путем внутримышечной или подкожной инъекции, путем использования аэрозольной формы, интраназально, интраокулярно, интратрахеально и/или перорально.
5 8 3 8
Инфицирующая доза вируса может составлять около 10 " EID50, TCID50 или 10 " геномных эквивалентов (по данным количественной полимеразной цепной реакции) в объеме, зависящем от пути введения. Например, если введение осуществляется воздушно-капельным путем, то суспензия вируса переводится в аэрозольную форму так, чтобы получились капли 1-100 мкм. Если введение осуществляется интраназально, интратрахеально или перорально, то объем инфицирующей дозы вируса составляет около 0,5 мл, 1-2 мл и 5-10 мл соответственно. На протяжении 14 суток после заражения животных ежедневно обследуют на предмет обнаружения клинических признаков, например, обезвоживания, поноса, неоформленного или водянистого стула, смерти и/или потери или отсутствия прироста массы тела, выделения вируса. Кроме того, группы особей можно умерщвлять и проводить патологоанатомическое исследование на предмет обнаружения поражения кишечника и атрофии кишечных ворсинок. У всех подопытных особей после заражения можно также брать мазки из прямой кишки и делать анализ кала с целью выделения или количественного определения, или выявления вируса. Присутствие или отсутствие вирусных антигенов в тканях кишечника или в экскрементах можно устанавливать с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR). До и после заражения у животных можно брать образцы крови и определять присутствие антител, специфичных к ротавирусам.
Композиции, включающие рекомбинантные антигенные полипептиды по данному изобретению, используемые для иммунизации в режиме прайм-буста, содержатся в фармацевтически или ветеринарно приемлемом носителе, разбавителе или ином вспомогательном веществе. Протоколы по данному изобретению защищают животных от ротавирусов и/или предотвращают прогрессирование заболевания у зараженных особей.
Предлагаемый препарат предпочтительно вводится с интервалом 1-6 недель. Предпочтительная продолжительность интервала между введениями составляет 3-5 недель, оптимально 4 недели. В одном из воплощений данного изобретения предусматривается ежегодное повторение иммунизации. На момент первого введения
возраст подопытных животных, например, свиней, может быть по меньшей мере 8 недель.
Специалистам в данной области техники следует учесть, что настоящее описание представляется в качестве примера и данное изобретение им не ограничивается. Базируясь на настоящем описании и на знаниях в данной области техники, опытный специалист может определить число введений, путь введения и дозы, нужные для каждого протокола иммунизации без излишнего экспериментирования.
По данному изобретению предполагается по меньшей мере одно введение животному достаточного количества терапевтической композиции, приготовленной по данному изобретению. Например, это достаточное количество может составлять от около 10 мкг до около 300 мкг белка. В одном из воплощений данного изобретения в достаточном количестве терапевтической композиции присутствует по 100 мкг каждого из трех различных белков ротавируса группы С. Подопытное животное может быть самцом, самкой, беременной самкой и новорожденным. Введение терапевтической композиции возможно различными путями, включая (но не ограничиваясь перечисленным здесь) внутримышечные (IM), интрадермальные (ID), интраперитонеальные (IP) или подкожные (SC) инъекции, или же интраназальное либо пероральное введение. Терапевтические композиции по данному изобретению можно также вводить с помощью безыгольного инъектора, например, Pulse Needle Free (производство Pulse Needlefree, Ленекса, шт. Канзас, США), Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (производство Merial, шт. Гавайи, США), Vetjet или Vitajet (производство Bioject, шт. ОЛрегон, США). Для введения плазмидных композиций можно также использовать другой подход -электропорацию (см., например, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; PCT Application No. WO99/01158). В другом воплощении данного изобретения предлагаемая терапевтическая композиция вводится в организм животного путем "бомбардировки" частицами золота или с помощью генной пушки. В предпочтительном воплощении данного изобретения подопытным животным является свинья, собака, хорек или тюлень.
Другое воплощение данного изобретения представляет собой набор для практического осуществления способа возбуждения и индуцирования иммунологической или защитной реакции у животных против ротавируса; оно включает ротавирусную субъединичную иммунологическую композицию или вакцину и инструкции для практического осуществления способа доставки указанного препарата в количестве, эффективном для возбуждения иммунного ответа у животного.
Другое воплощение данного изобретения представляет собой набор для практического осуществления способа индуцирования иммунологической или защитной
реакции у животных против ротавируса; оно включает композицию или вакцину, содержащую ротавирусный полипептид или антиген по данному изобретению и инструкции для практического осуществления способа доставки указанного препарата в количестве, эффективном для возбуждения иммунного ответа у животного.
В еще одном своем аспекте данное изобретения относится к набору для вакцинации в режиме прайм-буста, описанному выше в настоящем документе. Такой набор может содержать по меньшей мере две емкости: первая содержит вакцину или композицию для первичной вакцинации по данному изобретению, а вторая емкость содержит вакцину или композицию для повторной иммунизации с целью усиления иммунного ответа (бустер-иммунизации). Такой набор предпочтительно содержит дополнительную первую или вторую емкость для дополнительной первичной вакцинации или для дополнительной бустер-иммунизации.
Специалистам в данной области техники хорошо известны фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или разбавители, или иные вспомогательные вещества. Например, фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем или разбавителем, или эксципиентом может служить физиологический раствор (0,9%-ный раствор хлорида натрия) или фосфатный буферный раствор. Другие фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или разбавители, или иные вспомогательные вещества, которые и использовать при осуществлении способов по данному изобретению, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) поли-(Ь-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем или разбавителем, или эксципиентом может быть любое вещество или комбинация веществ, способствующая введению вектора (или белка, экспрессия которого обеспечивается вектором по данному изобретению in vitro); предпочтительно носитель или разбавитель, или иное вспомогательное вещество может способствовать трансфекции и/или улучшать сохранность вектора (или белка). Дозы и их объемы обсуждаются в настоящем документе в общем описании, из которого вместе с имеющимися знаниями и информацией специалист в данной области техники может их определить без излишнего экспериментирования.
Предпочтительные для плазмид катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония? (но подходят не только эти соединения), имеют следующую формулу:
СН3 I +
R, - О - СН2- СН-СН2 - N - R2-X I I OR1 СН3
где Ri представляет насьпценньгй или ненасыщенньгй неразветвленный алифатический радикал, содержащий 12-18 атомов углерода, R2 представляет другой алифатический радикал, содержащий 2-3 атома углерода, X представляет гидроксильную группу или аминогруппу, например, К-(2-гидроксиэтил)-К,К-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропан аммоний (DMRIE). В другом воплощении данного изобретения указанный катионный липид может быть связан с нейтральным липидом, например, диолеоил-фосфатидил-этаноламином (DOPE).
Из этих катионньгх липидов предпочтителен DMRIE (см. публикацию WO96/34109), предпочтительно связанный с нейтральным липидом, предпочтительно DOPE (см. Behr, 1994), с образованием DMRIE-DOPE.
При наличии DOPE молярное отношение DMRIE:DOPE предпочтительно составляет от (около 95: около 5) до (около 5: около 95), более предпочтительно (около 1: около 1), например, 1:1.
В другом воплощении данного изобретения фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем или разбавителем, или эксципиентом может служить эмульсия типа "вода в масле". Примеры подходящих эмульсий типа "вода в масле" включают вакцинные эмульсии на масляной основе, стабильные и жидкие при 4°С, которые содержат 6-50% (объем/объем) водной фазы, содержащей антиген (предпочтительно 1225% (объем/объем)); и 50-94% (объем/объем) масляной фазы, содержащей полностью или частично не метаболизируемое масло (например, минеральное масло - скажем, вазелиновое) и/или метаболизируемое масло (например, растительное масло или жирные кислоты, эфиры многоатомных спиртов или этилового спирта); 0,2-20% (частей на объем) поверхностно-активного агента, предпочтительно 3-8% (частей на объем), причем последний полностью или частично представляет собой смесь либо эфиры полиглицерина (указанные эфиры полиглицерина предпочтительно являются полиглицерол-(поли)рицинолеатами), либо этоксилированное касторовое масло, либо гидрогенизированное полиоксиэтиленом касторовое масло. Примеры поверхностно-активных веществ, которые можно использовать в эмульсии типа "вода в масле" включают этоксилированные эфиры ангидросорбита (например, полиоксиэтилен(20)-сорбитан-моноолеат, или TWEEN 80(r) производства AppliChem, Inc., Чешир, штат Коннектикут, США) и эфиры ангидросорбита (например, сорбитан-моноолеат, или SPAN
80(r) производства Sigma Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США). В отношении эмульсий типа "вода в масле" см. также патент США № 6919084. В некоторых воплощениях данного изобретения водная фаза, включающая антиген, содержит солевой раствор, включающий один или более забуферивающих агентов. Примером подходящего в этом смысле буферного раствора является фосфатный буфер с хлоридом натрия (PBS). В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения эмульсия типа "вода в масле" может быть тройной эмульсией вода/масло/вода (см. патент США № 6358500). Примеры других подходящих эмульсий описаны в патенте США № 7371395.
Иммунологические композиции и вакцины по данному изобретению могут содержать один или более адъювантов (или состоять в основном из них). Подходящими для практического осуществления данного изобретения адъювантами являются: (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, малеиновый ангидрид и полимеры с алкенильными группами; (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), например, олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие один или более неметилированных элементов CpG (см. Klinman et al., 1996; W098/16247); (3) эмульсии типа "масло в воде", например, эмульсия SPT, описанная на стр. 147 работы "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach)), M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, и эмульсия MF59, описанная на стр. 183 той же работы; (4) катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония, например, диметилдиоктадециламмоний (DDA); (5) цитокины; (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия; (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любой из цитируемых в настоящем документе работ и включаемые в данную заявку путем отсылки, или (9) любые комбинации или смеси указанных агентов.
Эмульсия типа "масло в воде" (3), которая особенно подходит для вирусных векторов, может быть приготовлена на основе: легкого вазелинового масла (по Европейской фармакопее); изопреноидного масла, например, сквалена; масла, полученного в результате олигомеризации алкенов, например, изобутена или децена; эфиров кислот или спиртов с неразветвленной алкильной группой, например, растительных масел, этилолеата, пропиленгликоля, ди(каприлат/капрата), глицерол-три(каприлат/капрата) и пропиленгликольолеата, или эфиров разветвленных жирных спиртов или кислот, особенно эфиров изостеариновой кислоты.
Для образования эмульсии масло используется в сочетании с эмульгирующими агентами. Эмульгирующими агентами могут быть неионные поверхностно-активные вещества, например, эфиры ангидросорбита (сорбитана), маннита (например, безводный маннитолеат), глицерина, полиглицерина или пропиленгликоля, с одной стороны, и олеиновой, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислот, с другой
стороны, причем указанные эфиры при необходимости этоксилированы, или блок-сополимеры полиоксипропилена и полиоксиэтилена, например, плюроники (например, L121).
Из числа адъювантньгх полимеров типа (1) предпочтительны полимеры поперечно-сшитой акриловой или метакриловой кислоты, особенно поперечно-сшитые полиалкениловыми эфирами Сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны под названием "карбомеры" (Европейская фармакопея, Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). Специалист в данной области техники может также обратиться к патенту США № 2909462, в котором предлагаются такие акриловые полимеры, поперечно-сшитые полигидроксильным соединением с по меньшей мере тремя гидроксильными группами, предпочтительно, чтобы было не более восьми таких групп, причем атомы водорода по меньшей мере трех гидроксильньгх групп замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, содержащими по меньшей мере два атома углерода. Предпочтительны такие радикалы, которые содержат 2-4 атома углерода, например, винилы, аллилы и другие ненасыщенные по этилену группы, ненасыщенные радикалы могут также содержать другие заместители, например, метил. Особенно подходят продукты, имеющиеся в продаже под названием "карбопол" (BF Goodrich, Огайо, США), в которых поперечные сшивки образованы аллилсахарозой или алилпентаэритритолом. В их числе упомянем карбополы 974Р, 934Р и 971 Р.
Что касается сополимеров малеинового ангидрида и алкенильных производных, то предпочтителен ЕМА (Monsanto), который является неразветвленным или поперечно-сшитым сополимером этилена и малеинового ангидрида, например, с поперечными сшивками дивинилового эфира. Сошлемся также на работу J. Fields et al., 1960.
Со структурной точки зрения в полимерах акриловой или метакриловой кислот и ЕМА основной единицей является предпочтительно следующая:
с-С- сн2Л- с -С сн2 V
| \ х | У
соон соон
где
Рч и R2, которые могут быть одинаковыми или же различными, представляют Н или СНЗ
х = 0 или 1, предпочтительно х = 1 у = 1 или 2, причем х + у = 2.
В случае ЕМА х = 0иу = 2,ав случае карбомеров х = у = 1.
Эти полимеры растворимы в воде или в физиологическом солевом растворе (20 г/л NaCl), и можно довести рН такого раствора до 7,3-7,4, например, с помощью едкого натра (NaOH); в результате получится адъювантный раствор, в который можно включить экспрессионный вектор (векторы). Концентрация полимера в конечной иммунологической или вакцинной композиции может варьировать от около 0,01% до около 1,5% (масса/объем), от около 0,05% до около 1% (масса/объем) и от около 0,1%" до около 0,4% (масса/объем).
Цитокин или цитокины (5) в иммунологической или вакцинной композиции могут присутствовать в форме белка или же экспрессироваться в организме-хозяине вместе с иммуногеном или иммуногенами или их эпитопом (эпитопами). Последний вариант предпочтителен: цитокин (цитокины) экспрессируются тем же вектором, что и иммуноген (иммуногены) или эпитоп (эпитопы), либо отдельным вектором.
Данное изобретение включает получение таких комбинированных композиций; например, путем смешивания активных компонентов, предпочтительно вместе с адьювантом, носителем, цитокином и/или разбавителем.
Цитокины, которые можно использовать по данному изобретению, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов/макрофагов (GM-CSF), интерферон a (IFNa), интерферон р (IFNP), интерферон у, (IFNy), интерлейкин-1а (IL-la), интерлейкин-ip (IL-ip), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), фактор некроза опухолей a (TNFa), фактор некроза опухолей Р (TNFP) и трансформирующий фактор роста Р (TGFP). Ясно, что эти цитокины можно вводить пациенту вместе и/или последовательно с иммунологической или вакцинной композицией по данному изобретению. Так, например, вакцина по данному изобретению может также содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, которая экспрессируется in vivo с образованием подходящего цитокина, например, цитокина, подходящего для данного организма-хозяина, который подлежит вакцинации или в котором должна быть вызвана иммунологическая реакция (например, собачий цитокин в случае препаратов, которые предназначены для введения собакам).
Далее данное изобретение описывается с помощью следующих примеров, не имеющих ограничительного характера.
Примеры
Краткое изложение. Вирусные вакцины обычно получают из цельных вирусных частиц, выделенных из образцов тканей зараженных животных путем его адаптации и размножения в куриных эмбрионах или in vitro в культуре клеток. Свиные ротавирусы группы С печально известны тем, что их трудно выделить обычными вирусологическими методами и притом в процессе адаптации к куриным эмбрионам или к росту культуры клеток происходит, как правило, нарушение антигенных структур, а в результате не достигается оптимальная продукция вакцины из выделенных цельных вирусных частиц. Поэтому был сконструирован экспрессионный вектор (pNPL2, SEQ ID N0:15) для того, чтобы обеспечить продукцию вакцины, содержащей рекомбинантные белки VP4, VP6 и/или NSP4 свиного ротавируса группы С. Генетический материал ротавируса был получен с помощью полимеразной цепной реакции из клинического материала, предоставленного ветеринарами. В вектор pNPL2 добавили (способом, описанным в настоящем документе, и изображенным на фиг. 7) ген, кодирующий полипептиды/ субъединицы VP4 (18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40), VP6 (42, 44, 46, 48 или 50) или NSP4 (52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 или 72), в результате чего образовались векторы pNPL2-RotaC, каждый из которых кодировал и обеспечивал экспрессию в бактериальной клетке-хозяине участка NSP4, VP4 или же VP6. Эти векторы размножали в клетках Е. coli SE1, в которых конститутивно экспрессируется белковый токсин ccdB, который убивает клетки, не содержащие вектор. Клетки выращивали и инактивировали, затем собирали экспрессировавшиеся рекомбинантные белки ротавируса и объединяли с адъювантом для использования в качестве неживой субъединичной белковой аутогенной вакцины. Вакцинные композиции по данному изобретению вызывали у свиней защитный иммунитет против ротавируса.
Пример 1. Конструирование вектора для аутогенного образования или промышленного производства ротавирусных субъединичных вакцин
Конструирование экспрессионных векторов pNPLl и 2
Экспрессионный вектор pNPL2 (SEQ ID N0:15) был получен из вектора pStabyl.2 (SEQ ID N0:1) (Delphi Genetics, pStabyl.2 руководство пользователя, 2011) путем делеции гена устойчивости к ампициллину и вставки гена глутатион S-трансферазы (GST), чтобы способствовать процессингу "ниже" (в направлении 3') расположенных последовательностей в процессе образования белка-продукта. Этот вектор не содержит и не обеспечивает экспрессию никаких известных признаков вирулентности для млекопитающих, а кроме того в процессе его конструирования были удалены все гены устойчивости к антибиотикам. Вектор pNPL2 размножали в клетках SE1 Е. coli, ; вместе
они составляют систему продукции хозяин/вектор штамма В Е. coli (pStaby).
Рестрикционная карта pStabyl.2 представлена на фиг. 1; указано, что данный вектор содержит промотор Т7 для обеспечения экспрессии гена, кодирующего рекомбинантный белок. Эта плазмида содержит также ген ccdA, который кодирует нестабильный белок-антидот, подавляющий экспрессию стабильного белка ccdB, инактивирующего гиразу, который токсичен для клеток бактерий семейства Enterobacteriaceae. Белок ccdB кодируется геном ccdB, который имеется в хромосоме клеток SE1 Е. coli (в плазмиде pStabyl.2 ген ccdB отсутствует). После трансформации благодаря наличию гена ccdA в указанной плазмиде успешно трансформированные клетки жизнеспособны, тогда как в клетках SE1, не несущих плазмиду, образуется токсин, а антидота к нему в них нет, и они, таким образом, не жизнеспособны.
Присутствовавший в векторе pStabyl.2 ген устойчивости к ампициллину не желателен при получении субъединичных ротавирусных вакцин, поэтому он был удален при помощи обратной полимеразной цепной реакции (фиг.2). В таблице 1 представлен перечень праймеров, использовавшихся во всех описанных в настоящем документе способах Конечный продукт ПЦР фосфорилировали и сшивали его концы с образованием кольцевой формы pNPLl (SEQ ID N0:14). Затем к pNPLl добавляли последовательность, кодирующую глутатион-8-трансферазу (GST), для увеличения размеров экспрессирующегося белка и для облегчения процессинга в сторону 37инлайн-анализа. Последовательность GST амплифицировали путем ПЦР, используя pGEX4T.l (GE Life Sciences) с праймерами #650 (SEQ ID N0:2) и #651 (SEQ ID N0:3); затем ампликон (SEQ ID N0:16) расщепляли и клонировали в векторе Ndel-BamHI-линеаризованный pNPLl, в результате получали pNPL2 (фиг. 2-4). Вектор pNPL2 расщепляли рестриктазами BamHI и Hindlll, так что в агарозном геле видно две полосы (5682 п.н. и 25 п.н.).
Конструирование экспрессионного вектора pNPL3
ПЦР проводили с праймерами KSN772 (SEQ ID N0:77) и KSN773 (SEQ ID N0:78), используя pNPLl в качестве матрицы. Продукт ПЦР фосфорилировали и сшивали концы, так что получалась кольцевая форма pNPL3, содержащая гексагистидиновую метку (тэг). Гены NSP4, VP4, VP6 или VP7 можно клонировать в векторе pNPL3, расщепленном рестриктазами BamHI и Hindlll, методом In-Fusion (с рекомбиназой), используя продукты ПЦР, образовавшиеся с использованием праймеров, представленных SEQ ID N0:79-89. Вектор pNPL3 сходен с pNPL2, за тем исключением, что в pNPL3 нет последовательности, кодирующей глутатион-8-трансферазу (GST), вместо которой имеется последовательность, кодирующая гистидиновую метку (тэг), благодаря чему образуются гибридные (слитые) пептиды с гистидиновой меткой (тэгом) на N-конце.
Пример 2. Получение аутогенных ротавирусных субъединичных вакцин Выделяли ротавирусные РНК, проводя очистку непосредственно клинических образцов, взятых у зараженных свиней, и использовали их для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RTPCR); при этом брали праймеры, специфичные для генов, кодирующих VP4 (праймеры SEQ ID N0:10, 11), VP6 (праймеры SEQ ID N0:12, 13) и NSP4 (праймеры SEQ ID N0:8, 9). Каждая пара праймеров была такой, чтобы связываться с высококонсервативными участками на каждом из концов гена-мишени (фиг. 5), что обеспечивало амплификацию генов ротавирусов группы С из многих разных изолятов вируса. Если эти гены невозможно амплифицировать, используя праймеры, специфичные для генов ротавирусов группы С, представленные SEQ ID N0:8, 9, 10, 11, 12 и 13, то специалист в данной области техники, применяя известные методы, сумеет подобрать и использовать другие праймеры. Например, можно использовать дегенерированные праймеры, при этом критические положения праймера (например, 3'-концевой нуклеотид) можно варьировать, чтобы нивелировать отклонения матрицы от консервативных последовательностей. Праймеры с последовательностями, представленными SEQ ID N0: 73, 74, 5 и 76, можно использовать, чтобы амплифицировать и клонировать последовательности VP4 в векторах pNPLl и/или pNPL2. Последовательности SEQ ID NO:73 и 74 можно использовать, чтобы амплифицировать последовательность VP4 и клонировать ее векторе ТОРО. Затем можно использовать SEQ ID N0:75 и 76, чтобы включить последовательность VP4 в вектор pNPL2 для последующего получения субъединичной вакцины.
У каждого праймера на 5'-конце имелась последовательность из 15 нуклеотидов, обеспечивающая встраивание в вектор pNPL2 в ходе последующей реакции по методу 1п-Fusion. Выделение и амплификация генов ротавирусов природного происхождения для получения донорной ДНК, предназначенной для использования в экспрессионной системе показаны на фиг. 4, 5 и 6. Когда в трансформированных клетках SE1 присутствует как ген ccdA (в векторе), так и ген ccdB (в клеточном геноме), клеточная культура жизнеспособна и стабильна и в ней экспрессируется ротавирусный ген. Не трансформированные клетки или клетки, подвергнутые удалению плазмид, нежизнеспособны. Внедрение гена характеризовали и проверяли путем секвенирования. Экспрессию белка проверяли путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS PAGE) (фиг. 8); этот метод позволяет определить приблизительную молекулярную массу, а именно 36 кДа (NSP4), 52 кДа (VP4), и 68 кДа (VP6). Такой подход предположительно применим к любому природному ротавирусному штамму, имеющему достаточную степень гомологии с праймерами клонирования в консервативных участках.
Для проведения эксперимента в большем масштабе отдельные колонии или множество одинаковых колоний переносили в среду LB (объем 10 мл - 200 ООО мл). Когда оптическая плотность при 600 нм достигала 0,4-1,0, прибавляли изопропил-P-D-тиогалактопиранозид (IPTG, Sigma Aldrich, каталожный номер 15502 или эквивалентный продукт) до конечной концентрации 1 мМ. Культуры инкубировали еще 2-6 часов. Клетки можно культивировать в ферментере при следующих условиях:
a. Температура культуры поддерживается 36° ± 3°С.
b. Фильтрованный воздух подается под давлением с постоянной скоростью 0,1-300
л/мин.
c. рН культуры поддерживается 7,4 ± 0.3.
d. Когда оптическая плотность при 600 нм достигает 0,4-1,0, прибавляют IPTG до конечной концентрации 1 мМ. Культуры инкубируют еще 2-6 часов.
Процедура сбора продукта. Путем центрифугирования или фильтрации отделяли отработанную культуральную среду от клеток Е. coli, и клетки концентрировали путем фильтрования, используя фильтр с порами 0,1-0,45 мкм. Концентрированные клетки подвергали лизису под действием реагента для экстракции белков B-PER (производство Thermo Scientific, каталожный номер 78248 или эквивалентный продукт), затем перемешивали или встряхивали раствор в течение 0,5-2 часов. Лизированные клетки концентрировали путем центрифугирования при 5000-10000 g в течение 15-30 минут или путем фильтрации, используя фильтр с порами 0,1-0,45 микрон; супернатант/фильтрат отбрасывали. Полученный осадок/концентрат ресуспендировали в буферном растворе для промывания (20 мМ Tris-HCL, 2 мМ EDTA, 0,1% Triton Х-100, рН доводят до 7,5-8,5) путем перемешивания или встряхивания в течение 0,1-0,5 часов. Полученную суспензию концентрировали путем центрифугирования при 5000-10000 g в течение 15-30 минут или путем фильтрации, используя фильтр с порами 0,1-0,45 микрон. Полученный осадок/концентрат ресуспендировали в буферном растворе для промывания (20 мМ Tris-HCL, 2 мМ EDTA, рН доводят до 7,5-8,5) путем перемешивания или встряхивания в течение 0,1-0,5 часов. Полученную суспензию концентрировали путем центрифугирования при 5000-10000 g в течение 15-30 минут или путем фильтрации, используя фильтр с порами 0,1-0,4 микрон. Концентрат суспендировали в растворе (8 М) мочевины (производства Sigma-Aldrich, каталожный номер U6504 или эквивалентный продукт) и перемешивали или встряхивали в течение 0,5-2 часов. Конечную суспензию разбавляли стерильным раствором PBS.
Вакцинные композиции
Собранные ротавирусные субъединицы объединяли с эмульсией TPJGEN ("масло в
воде") и консервирующими агентами (гентамицин в концентрации <30,0 мкг/мл и амфотерицин В в концентрации <2,50 мкг/мл или полимиксин В в концентрации <30 мкг/мл). К этой смеси прибавляли а) гель гидроксида алюминия (ALHYDROGEL(r) "85", производства Brenntag Biosector, каталожный номер EMS 2485-2 или REHYDRAGEL HP А, производства Reheis, каталожный номер 203130070600, REHYDRAGEL LV, производства Reheis, каталожный номер 203120070602 или эквивалентные продукты), что обеспечивало от около 0,1 до около 0,5% AI2O3 в конечном продукте. Или же в состав композиции включали адъювант Quil А в соотношении 0,5-2,5%" инактивированной жидкости с адьювантом "масло в воде". На долю адъювантов приходится от около 10% до около 50% конечного продукта.
Пример 3. Иммунизация свиней аутогенными ротавирусными субъединичными
вакцинами
Краткое изложение. В исследовании эффективности вакцины взяли 48 самок свиней с хронической инфекцией ротавирусом С и сходным числом родов в прошлом. Из них 26 особей получали вместо вакцины плацебо (контроль), а 22 особи получали ротавирусную субъединичную вакцину, содержащую смесь VP4, VP6, NSP4 и эмульсию/дополнительные адъюванты. Состав вакцины был таков, что в каждой дозе вакцины содержалось около 100 мкг каждого из указанных белков (суммарно 300 мкг белка) и 10%" Trigen. Вакцину вводили внутримышечно за 6 и 3 недели до опороса. До вакцинации и опороса у животных брали сыворотку крови, также брали сыворотку крови у поросят через 7 суток после опороса.
Результаты. Среди поросят, родившихся от непривитых самок смертность составляла 21%", а в потомстве привитых свиней - 14% (то есть на 33%" меньше). Заболеваемость среди детенышей привитых особей также была значительно ниже, чем непривитьгх. Кроме того, у поросят вакцинированных самок по сравнению с контрольными был значительно (р <0,05) более высокий титр антител (фиг.9).
Пример 4. Эффективность новой вакцины на основе ротавирусов группы С в снижении частоты поноса и улучшении состояния у подсосных поросят
Краткое изложение. Для оценки эффективности новой ротавирусной (ротавирусы группы С) вакцины было отобрано стадо из 3600 свиней с поросятами до отъема от вскармливания молоком. Стадо состояло из самок PIC L03, которые скрещивались с самцами линии 02. Животные получали корм, состав которого соответствовал установленным пищевым потребностям (NRC, 1998) или несколько превышал их. Свиноматок и подсвинок случайным образом распределяли на две группы: контрольную (CON) и получавшую вакцину (Rota С RS VACC), с учетом даты спаривания и сходства
физических показателей. Животные вакцинируемой группы получали 2 мл вакцины внутримышечно за 3 недели; за 3 и 5 недель или же за 3, 5 и 8 недель до опороса. В первые сутки после рождения всех поросят подсаживали к другим свиноматкам (перекрестное вскармливание). Ежедневно начиная с дня опороса и по 5-й день жизни характеризовали случаи поноса у поросят по балловой системе: 0 - отсутствие поноса, 1 -мало случаев, 2 - понос отмечается у 50% детенышей, 3 - понос отмечается более чем у 50% детенышей. Регистрировали число поросят, умерших из-за поноса. Не отмечалось разницы в частоте поноса или в связанной с ним смертности между потомством самок, получавших вакцину за 3 недели до опороса и за 3, 5 и 8 недель до опороса. А между контрольной группой и группой, получавшей вакцину за 3 и 5 недель до опороса, была заметная разница: во втором случае показатели были меньше (0,56 против 0,41; Р < 0,05). Кроме того, в потомстве самок, вакцинированных за 3 и 5 недель до опороса, доля детенышей с поносом снижалась от 1-го дня жизни к 5-му. Можно заключить, что новая ротавирусная (ротавирусы группы С) вакцина не влияла на частоту случаев поноса и смерти из-за поноса у детенышей свиноматок, получавших вакцину один или три раза. Однако при вакцинации за 3 и 5 недель до опороса частота поноса у поросят снижалась.
Воздействие. Свиноматок и подсвинок случайным образом распределяли на четыре группы: контрольную (CON) и три получавших вакцины (Newport) (VACC 1-3), с учетом даты спаривания и сходства физических показателей. В состав вакцины входило по 100 мкг каждого из следующих полипептидов: VP4 (SEQ ID N0:42), VP6 (SEQ ID N0:52) и NSP4 (SEQ ID N0:18), происходивших из изолята 1 ротавирусов. Эти белковые субъединицы объединяли с 10% TPJGEN (состоявшего приблизительно из 1,6% полиоксиэтилен-сорбитан-моноолеата, 10% геля гидроксида алюминия, 38% воды/физиологического раствора, 45% очищенного минерального масла и 5% сорбитан-моноолеата) в объеме 2 мл. В группе VACC 1 животные получали 2 мл вакцинного препарата внутримышечно за 3 недели до опороса; в группе VACC 2 - 2 мл вакцинного препарата внутримышечно за 5 недель до опороса и еще раз за 3 недели до опороса; в группе VACC 3 - 2 мл вакцинного препарата внутримышечно за 7, 5 и 3 недели до опороса. В первые сутки после рождения всех поросят подсаживали к другим свиноматкам (перекрестное вскармливание).
Сбор данных. Частоту поноса по балловой системе определяли ежедневно с первого по пятый день жизни. Персоналу, собиравшему данные, изначальное распределение животных по группам не было известно. Регистрировали число поросят, умерших из-за поноса, в день смерти и включали эти данные в оценку смертности/заболеваемости.
Анализ данных. Показатели смертности/заболеваемости и результаты оценки поноса по балловой системе анализировали с помощью обобщенной линейной модели (GLM). Учитывались также размещение и сходство животных.
Результаты. В потомстве свиней, получавших две дозы вакцины до опороса, по сравнению с соответствующей контрольной группой смертность и заболеваемость поросят были меньше, хотя и не значительно. В потомстве свиней, получавших одну либо три дозы вакцины, разницы не отмечалось. В случае двукратной вакцинации балловый показатель поноса существенно отличался только в первый день после опороса. Никаких других различий в результатах оценки поноса ни в другие моменты времени, ни между тремя схемами вакцинации не наблюдалось. Интересно, что в этом исследовании эффект вакцины проявлялся при двукратной вакцинации, а при введении одной или трех доз -нет.
Пример 5. Получение тройной слитой вакцины на основе ротавирусов группы С Краткое изложение. Как говорилось выше, субъединичную вакцину Rota С получали путем клонирования трех разных генов (NSP4, VP4 и VP6) в трех разных векторах и выращивания трех разных культур Е. coli. Для упрощения процедуры все три гена включали в один плазмидный вектор (тандемно, в одной рамке считывания) что позволяло использовать одну серию культур Е. coli. Эту конструкцию получали путем клонирования генов Rota С (изолят 12-1260-5) в векторе pNPL2 (тэг GST в рамке считывания на N-конце). Три слитых гена (без тэга GST) имели последовательность, представленную SEQ ID N0:94. Кодируемый ею полипротеин имеет последовательность, представленную SEQ ID NO:95.
Материалы и методы. РНК выделяли из клинических образцов, используя набор Qiagen для выделения вирусной РНК согласно инструкции производителя. Концентрацию и чистоту РНК проверяли, определяя поглощение при 260 и 280 нм с помощью спектрофотометра для микрообъемов Nanodrop. РНК считалась достаточно чистой, если отношение поглощения 260/280 составляло по меньшей мере 1,7. а концентрация РНК была по меньшей мере 50 нг/мкл. Ротавирусные гены амплифицировали (праймеры представлены в таблице 5) и продукты ПЦР очищали, используя набор для очистки продуктов ПЦР Qiagen. Размеры продуктов ПЦР подтверждали путем гель-электрофореза (NSP4 - 300 п.н., VP4 - 750 п.н., VP6 - 1200 п.н.); концентрацию определяли с помощью
Nanodrop.
Клонирование продуктов ПЦР в векторе pNPL2. Все три продукта клонировали в векторе одновременно. Реакцию проводили, как описано ниже, инкубировали 15 минут при температуре 50°С, после чего держали при 4°С. Для трансформации компетентных клеток CYS21 Е. coli (Cat # GE-STCB-22) брали около 5 мкл продуктов реакции согласно
рекомендациям производителя (Delphi Genetics). Рекомбинантные клетки Е. coli, содержащие плазмиду, культивировали в среде LB. Последовательность плазмидной ДНК определяли, используя праймеры, указанные в таблице 5 наряду с праймерами к промотору Т7 и терминатору Т7 (стандартные свободные праймеры). Последовательности выравнивали, чтобы получилась большая открытая рамка считывания и проверяли точность; открытая рамка считывания содержала все три гена с тэгом GST (GST-NSP4-VP4-VP6; около 2,9 т.п.н.).
Анализ экспрессии полипротеина NSP4-VP4-VP6. Экспрессию белка индуцировали в клетках штамма SE1 Е. coli путем добавления IPTG по стандартным протоколам. Культуральную жидкость подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле, чтобы убедиться в экспрессии слитого белка (фиг. 12). Слитый белок присутствовал во фракции, растворимой в мочевине, но не во фракции, растворимой в B-PER (электрофорез в полиакриламидном геле; данные не показаны). Растворимый в мочевине слитый белок разбавляли водой в соотношении 1:20 и 1:40, и разгоняли в полиакриламидном геле для последующего вестерн-блоттинга. В качестве зонда использовали моноклональные антитела против GST (Genscript Cat А00866) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл, следуя стандартному протоколу (фиг. 13).
Приведенное в настоящем документе подробное описание предпочтительных воплощений данного изобретения следует принимать к сведению с учетом того, что изложенное выше не ограничивает данное изобретение приведенными в этом описании конкретными деталями, поскольку возможно много очевидных вариантов, не отклоняющихся от сущности и объема изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Иммунологическая композиция, содержащая:
a) один или более полипептидов, выбираемых из ротавирусных полипептидов или их фрагментов; и
b) фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители, разбавители или иные эксципиенты.
2. Композиция по пункту 1, дополнительно содержащая адъювант.
3. Композиция по пункту 2, в которой адъювант представляет собой эмульсию типа "масло в воде".
4. Композиция по пункту 2 или 3, в которой адьювантом является TPJGEN, или ULTRAGEN, или PRIMAVANT, TS6, или LR4.
5. Композиция по любому из пунктов 1-3, в которой полипептид имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности, представленной SEQ ID N0:17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 или 71.
6. Композиция по любому из пунктов 1-3 или 5, дополнительно содержащая по меньшей мере один дополнительный антиген, ассоциированный с патогенным агентом, отличным от ротавирусов.
7. Композиция по пункту 6, в которой по меньшей мере один дополнительный антиген способен вызывать у свиней иммунный ответ, направленный против М. hyo, PCV2, PRRSV, S1Y или другого патогенного агента, способного заражать свиней или вызывать у них заболевание или подверженность заболеванию.
8. Способ получения аутогенной композиции по любому из пунктов 1-3, 5 или 7, включающий следующие этапы:
(a) забор биологического образца у животного, зараженного или с подозрением на инфекцию ротавирусами одного или более типов;
(b) если инфекционный статус индивида неизвестен, определение зараженности животного ротавирусами;
(c) выделение РНК у животного, зараженного ротавирусами одного или более
типов;
(d) проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и праймерами, комплементарными по меньшей мере одному гену ротавирусов группы С;
(e) встраивание продукта ПЦР, полученного на этапе (d), в подходящий экспрессионный вектор;
(d)
(f) введение вектора, полученного на этапе (е), в экспрессионную систему подходящего организма-хозяина;
(g) выделение ротавирусных полипептидов; и
(h) добавление каких-либо дополнительных вакцинных компонентов и получение таким образом вакцинной композиции.
9. Способ по пункту 8, в котором дополнительные компоненты выбирают из
адъювантов, носителей, разбавителей и антигенов, ассоциированных с патогенными
агентами, отличными от ротавирусов.
10. Способ по пункту 9, в котором дополнительным компонентом является TPJGEN или ULTRAGEN.
11. Способ по пункту 9, в котором дополнительным компонентом является антиген или антигены, способные вызывать у свиней иммунный ответ, направленный против М. hyo, PCV2, PRRSV, SIV или других патогенных агентов, способных заражать свиней и вызывать у них заболевание и/или подверженность заболеванию.
12. Способ вакцинации животных, включающий по меньшей мере одно введение композиции или вектора по любому из пунктов 1-7.
13. Способ по пункту 12, в котором животное является свиньей.
14. Способ по пункту 13, в котором свинья является свиноматкой, которой осталось от около 3 до около 6 недель до опороса.
15. Способ по пункту 12, в котором среди рождающихся у указанных самок поросят понижены смертность и/или заболеваемость по сравнению с потомством невакцинированных свиноматок.
10.
Xhot (5771) Aval (5771) Not! (57БЗ) Eagi (57БЗ)
ИЫШ (575Б) Sail (5750) Sad (5747)
EcoR) (5737) (5731) /Vte/ (5698) Ndel (5693)
"Yte7^653) Bj/tf (5587)
Staby Пр
pStabyl.2 5932 Пар нуклеотидов
Фиг. 1
pStabyl.2 Вектор
Удаление гена устойчивости к ампицил ли ну путем обратной полимеразной цепной реакции с ^использованием праймеров 644 и 645
KSN644
Продукт полимеразной цепной реакции фосфорилируется и аутолигируется с образованием модифицирование го вектора Лбез гена устойчивости к ампициллину
pNPLl
Фиг. 2
Амплификация (полимеразная цепная
l'i 1;И 1S ii И i 5 pNPU реакция) гена глутатион-Б-трансферазы
•iL~мсГ"1"/^ С использованием праймеров 650 и 651
- | - - -.^.^ аад ,-
Uri Т7 Hii
Расщепление ферментами Nide I и BamH I
Расщепление продукта полимеразной цепной реакции ' ферментами Nide I и BamH I
Лигирование расщепленного продукта полимеразной^ цепной реакции и вектора pNPLl
pNPL2 (Основной биологический агент)
NdcH \ [BamHI
-| ^eEBESE$"^
Ori Т7 GST His
ccdA
Фиг. 3
pNPL2 (Основной биологический агент)
I-fl'iwn'Miffliyli^- ccdA шюиф-
Ori T7 GST / His
Сайт встраивания ротавирусного гена в основной биологический агент
ATCTGGTTCCGCGTGGAJCCGAATTCGAGC TCCGTCGACA4GC7TGCGGCCGCAC
BamH I Hind III
Фиг. 4
Сегмент ротавирусной двухцепочечной РНК
Консервативный участок
Вариабельный участок
_ I
Консервативный участок
Прямой и обратный праймеры для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией к консервативным участкам
Прямой праймер
->
Обратный праймер
Консервативный участок
Вариабельный участок
Консервативный участок
ПЬЖмёразная'"цШная~ реакция с обратной -тра нскри пцией-
ВзтН!
Hind 111
Двухцепочечная ДНК
Продукт полимеразной цепной реакции, содержащий ротавирусные гены
Фиг. 5
"6 5 3
Сегмент двухцепочечной ротавирусной РНК
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
||я"1йаа81Двухиепочечная ДНК N S Р 4
Сегмент двухцепочечной ротавирусной РНК
I Полимеразная цепная реакция I с обратной транскрипцией
¦1вухиепочечная Днкч^-'К^ьш№""^|>
Фиг. 6
pNPL2 Основной биологический агент
- i ¦ ?1 i'!. L V;,
Ротавирусные гены NSP4 или VP4 или VP6 продукты полимеразной цепной реакции
Расщепление вектора pNPL2 ферментами BamH I и Hind III
Реакция In-Fusion
ccdA,
Ori T7 Ротавирусный ген His
Фиг. 7
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(151)
SEQ
(148)
SEQ
(148)
SEQ
(148)
SEQ
(148)
SEQ
(148)
SEQ
(148)
SEQ
(148)
SEQ
(148)
SEQ
(148)
SEQ
(151)
SEQ
(148)
1 50 ATCACCTCAAAAACTGTGATTGOT^
ATCACCTCAAAGACTGTGATTAGTAAGTTCAAGACTGAAAATGACATTAG
ATCACCTCAAAGACTGTGATTAGTAAGTTCAAGACTGAAAATGACATTAG
ATCACCTCAAAGACTGTG^
ATCACCTCAAAGACTGTGATTAGTAAGTT
Afc^bcTCAAAGACTGTGATTAGTAAGTTC
ATCACCTCGAAGACTGTGATTAGTAAGTTCAAGACTGAAAATGACATTAG
ATCACCT"CAAAGA6TGTGATTAGT^
ATCACCTCAAAGACTGTGATTAGTAAGTT
ATCACCTCAAAGACTGTGATTAG
ATCACCTCAAAAACTCTGATTGGTAAATT
ATCACCTCJAAAAACTGTGATTGGTAAATTCAAGACTGAAAATGACATTAG si 100 TCATЈAG^AATGACGACAT^ CGACCAtf|^
CCACCASAACAACGA^^
CCACCAGMCAACGATATC
CCACCAGAACAACGATM
ССЙССА^лЙ
CCAQCAG^CAACGATATC CCAcbAG^CAACGA^^
CCACCAGAACAACGATATС
CCAC'GAGAACAACG^TA^
TCATSAG"^
ССАССАбЖСА &^^
101 """""* " " *150
TGCGTGAAATGAGAGTTCAT ACTGCATTATTTAATAGTATACATAAA
TGpGTGAAATGAGAGJTTCAT ACTGI^TMra^^TAGTA^C^TA^
ТЙССТ|АААТЙА &ЖТ№А| ACT^ATTX^^A^MfA^^pLAA
TGCGT^A^TS^G^TTCAT-AC^^ATfAJJraM'^l'ктШШША
TGCGT^h^TbAd^^fdK'I АСТССАТТА^ЙТ^А^А^Т^ТА^^ТААА
TGCGTGSAATGAGASTTCAT ACTGCST^TTTMTAG^piCATA^
TGC^TGi^TdAG^T,fcAT ACTGCATT^^TJ^AJ,^^^^^^^A
TGCGT^AAAJfe^AGTT^AT ^TGCAT^T^^AJ/fi^ST^^FAAA
TGCGTGXAXTG^A^TTCAT-ACTGCATXАТЙМТА'^Й^САГААА TGCGTG^
TGC§TGXA^T^A^MTT^AT-ACTCCATT^TTAA'TЙ <ЗТАТ!АСЙТААА
151 ^ ' " "200
GAT|^TATGGAGTGGA*GAATGAGTGAA
GATAATATGGAATGGAGAATGAGTGAATCAATTCG^
GA^^TATGbAGTGGjiGAATGA
GATAjfTATGGAGjfGGAGAATGAGTGAATCAATTCGCAGAG
GATAATATGGAGTGGAGAATGAGTGAATCAATTCGC^GAGAAAAGAAACG
GATAATATGGAGTGG^^
GATAATAYGGAGTGGAGAATGAGTGAATCGATTCGCXGAG GATAATATG^GTGGAGAATGIV3TG
Фиг. 9A (1/3)
SEQ
(201)
SEQ
(198)
SEQ
(198)
SEQ
(198)
SEQ
(198)
SEQ
(198)
SEQ
(198)
SEQ
(198)
SEQ
(198)
SEQ
(198)
SEQ
(201)
SEQ
(198)
SEQ
(251)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(251)
SEQ
(248)
2 01 '""** 250
TGA &ATGA!AATC^
TGS^|GAAATЈ^^ ТЙ &АА|6А^
TG|S^ TGЈS^
TGJ^TGAAATC)^
^^^^T^^^^^cc^G^L^^yc^^A'gi^caAite TG!BS^
TGldp^^
251 " * "~ " " " 297
ATCTA^TATATCTGGTACGTCTG^
ATJ3T||^
ATGTA)^
ATЈT|^5G"Ґ^^^
ATGTAAA^ GTA^G^^^
ATGTAAATGTATGTGATACGTCTGGAT.TAGAGACGGAGGTTTGTCTA
Фиг. 9A (2/3)
1 8/20 50
ITSKTVI S &KTJ2OT
DNMEWRM^
ЬЖЩ^1^'1Ме1Ш
ifSKTVlGKFCT
NSP4
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
последовательности
SEQ 18
SEQ 20
SEQ22
100
100
SEQ 24
100
SEQ 26
SEQ 28
100
100
100
SEQ 30
100
100
SEQ 32
100
SEQ 34
SEQ 36
SEQ 38
SEQ 40
Фиг. 9А (3/3)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(101)
SEQ
(151)
SEQ
(151)
SEQ
(151)
SEQ
(151)
SEQ
(151)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(251)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(248)
SEQ
(301)
SEQ
(298)
SEQ
(298)
SEQ
(298)
SEQ
(298)
SEQ
(351)
SEQ
(348)
SEQ
(348)
SEQ
(348)
SEQ
(348)
SEQ
(396)
SEQ
(398)
SEQ
(398)
SEQ
(398)
SEQ
(398)
1 50
AGGGCGTCCTCACTTTATCATCAATTAATT;TCT
AGGGCGT^CCTCA^
AGJ3GCGTCGTCA
AGbGCGYC^^
51 """ "* ' * ' 100
TGGGAAYGAGATCTTAAAAGATTTACAAACGACT &
TGGAAATGATATTSTACTGGATCAGCAAACAAATAACACAACTGTTGACT
101 """* ' 150
ATGTAGATGCTGgGS^^ А*АТЩАТАТАГ||А^ ATATAGATA1 Al
ATGTAGATGTGGGAAATTATTC
151 J2 0 0
GdAGCTGl^GCTACCTT
GGAGGAGG5^TGAGTTT BGAGCAGGAATGACTTTTAAG^
gdAJSCAGGj^
25f * 250
AjSCGCACAC^AAAT^
AC^CCAATS5AGG|T GA^ AS^^TTTg^TA^tTTGACl^jGgGASTG
ACSCAKT^GGGT |A^^GATTTSAAT &| T?GACMA| GgGAgTG
Ag§CASTkcAGGjf fA^AT^ &TTT^ATl^TTGAC^^TGeGAATG
ACJTAKCASAGGT GA^TA^TCTGAGTAA'TC^CACAScfGeGAlTG
251 "~ * " 300
AGTI^GTTGCTGTTTCCAAAACC^
GATGGAfATgAfA^GAG^GgCGACAATTkCCAAACGGTTAT|AMA^ 301 350 jSGAC^TCA^CATATGATA^
G^ACCAGAAAGTTATGj^
G"GACCAGAAAGTTATGAcSGTGTATAcbl^icA
351 400
GAAGGCTJ^TACT
ТААА^СА|?УЙА5ТС
ТАААрСАЖтаЙта
TA^^CAMMCAGJMJTACA^
401 _ 450
-TGATAATCAGGTGAATGTAAATGCCGATT^
CTGAAAACACTGTAACAGTACAAC
CTGAAAACACTCTAA^AGTACA^ATGA^
CTGAGMTACT^AACATTACAGTATGACTGATF^A &TAC^A^f TTTCAAT
Фиг. 9B (1/3)
SEQ
(445)
SEQ
(448)
SEQ
(448)
SEQ
(448)
SEQ
(448)
SEQ
(495)
SEQ
(498)
SEQ
(498)
SEQ
(498)
SEQ
(498)
SEQ
(545)
SEQ
(545)
SEQ
(545)
SEQ
(545)
SEQ
(545)
SEQ
(595)
SEQ
(595)
SEQ
(595)
SEQ
(595)
SEQ
(595)
SEQ
(645)
SEQ
(639)
SEQ
(639)
SEQ
(639)
SEQ
(639)
SEQ
(695)
SEQ
(689)
SEQ
(689)
SEQ
(689)
SEQ
(689)
VP4
последовательности
SEQ 41
SEQ 43
SEQ 45
SEQ 47
SEQ 49
SEQ 41
SEQ 43
SEQ 45
SEQ 47
SEQ 49
Фиг. 9B (2/3)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(1)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(51)
SEQ
(101)
SEQ
(100)
SEQ
(100)
SEQ
(100)
SEQ
(100)
SEQ
(149)
SEQ
(150)
SEQ
(150)
SEQ
(150)
SEQ
(150)
SEQ
(199)
SEQ
(199)
SEQ
(199)
SEQ
(199)
SEQ
(199)
RASSLYHQLISQOTYSTGNEILKDLQTTKTTVDrvpAGNYT RASJLYQQMJT^^
RASSLYQQLISQNYYSTGITOILLDQQTN^ ^SSLYQdLiSQNYYSTG^
51 " 100
GjpATFESVFSAAEl|pPHTNRVIEWKijLLNSDQ
GAGMTFKSAFNAEEITGPNTG-DIDLNKLTNANGWILYDKPTDTKRLLKL GAGMTjjKS AFNAEEITGPNTG - Dto
GA^MTgT§AFNi^ - D &LNij"LTNANGWlLYDlc|TDTKRLЈKL
GA|M| |K§AFNSEEMTGf NTG-DiDLS^TTANGWlbYEICPTITKREiTKL
101 ' * ~ ~ " 150
GjPQTYpSTLAAC|LWYЈI^TiyTSEHYS|LS - -DNQVNWADjSL\bFWN 6PESWSWAAF§l5x^j^
GPES YrfgwMFi^YGiO^I'iVVTS IYYSS VQNSEkTv^QHtfSI^FFN
GPDVYDSVYAAFELWYGKANTVVTSIYYASAQNSENTVTLQYDSL^ 151 200 AGGTT FD KQ I^^FAWDMG*GIli IKP S S QQ PRLD, I YMANM^J^SpNFNWEE VGY^GLTiCQI^KS'Nj^NMGGILVRPTADG-RVfi
VGYTGLTKQjVKlNJ^G^iEVRlTTDG - RVglCf^JpD|slpifrawMS VGYTGLTKQI^KFNWNMGGILVRPTTDG - RVSlcMfcS^^^^FNWES VGYTGLTKQIWFNWDMGGILVRPTADG - RVDICJ^}iroFSSDNFlWEK 201 ' -.^
WKRSFPRS--NIimYTEXYLANVpPpjpLKIL^ WKRSFPRS- - Nli^YTEYYLlpJV^
gKRSFPRS - -NI^YTEYYLANVpbtYNQLKILNQLTAKNVE Ip^KAIК iTRSFPRS,--Nf^YAEYYLAWDfPYSQLKAЈNXLTXXNIEIR^
VP4
последовательности
SEQ 42
SEQ 44
SEQ 46
SEQ 48
SEQ 50
SEQ 42
SEQ 44
SEQ 46
SEQ 48
SEQ 50
Фиг. 9B (3/3)
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(51
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(101
SEQ
(151
SEQ
(151
SEQ
(151
SEQ
(151
SEQ
(151
SEQ
(151
SEQ
(151
SEQ
(151
SEQ
(151
SEQ
(151
SEQ
(151)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
SEQ
(201)
GACGTGCTGTTTTCAATTGCG^ GATGTGCTOTTCTC GATGTG^TGTTC^ GATgjGCf^
GATbj^CJTG^ GA^Sf GfcTG#CTC
GATGTSCT'GCTCT
GAT'dTGCT^
SATISJGCTGTTCT^
51 " 100
TGTAGTTCGTA'CITOT
TGTAGTTGGTACTATTTATACAAATGTAGAAGATAJAATCpAACAGACTA
TGTAGTT^T^CTM
TGTAGTTl^fifiЈ^^
TGTAGTji(r)|l^^
TG'TXGTTMT^^
TGfAGTTC^TACT TGTAGTTGGTK^
TGTHBT^^ TGTAGTTCGTA^TA^
I6I ' "*"*" " " ' " > > "-•-'- • -I50
ATGMCTGATTAGAACTTTGAATGG
ATGAATTGA^TAGAACTTT^
ATG^TTGAT3^G^^
AfGMTTAATj|^^
AT(gj &TTG^
^TTGAATGGC^ ATJS^TJGAJJ^
ATG^TҐA &1?TЈ^ AT§AATTAATTA|A^
151 ' " 200
GGAACACAG^TjS^
VCTjieffl^GCT^GGTAG GGA^CACJSA^C'IJCAGAAM
GGAACACAACCTJ^GAAAG^ GGGACAt^AdCTj^G GGAACACAACCT|^GAASGAATGGAAT^ GGAA'cACAAbCT^GAi^bAATGGAATT
201 " """ "250
GAC^TC^Ai^^
AACACTTTTGAATT^AGATGA(tm)
AACACTCFTGAATTTAGATC AACACTTTTGAATITXG
AA <^C|TfTG^T^
AACSSITTTGII^
AA^CTTTlGAJOTirJiG^ AAC &TT^G^^ А^^СТТ;ГТС|^ AACAfcTTTTGAATrffAGATG^^
251 300
TCGATTATTJ?GGCC?CAT^ TCGATTAJYTGG^ TT'GAC'TATTTTC^ тсдлттаттаф5с?
TCGATTATTTGGCCTCATTTATA^ TCGATTAfTTGGCCjTCAT^ TCGATyA^TTGGCGTCATTTA^^ TCGATTXfTTGGCCfcATT^
301 350
AGAGAAGCGTCAAGAAAT^
AGAllAAG(!GTC/AAlli^
AGAGAG|fcG]rC^ri^^ AGi
AGAGAAGCGTCAAGij^ra^
^TgAATfcT^CTGCA^TTATAGC
AGAGAAGCGTC^ip!^
351 " ' ' ""400
GCTGTCATCAT|^
GT*ATCT||rJkG^
GTTAT'CTjdAGjS^
GC1TGT6C?C1T^^A№TAAASS,I^TAATT1
GTTATCTTCAGCAAAATTTAAGACTA^
GTTATCTH _ _
GTҐA|GT5CAG <3^^
GTTATCTT'CAGr^S^^ GTTAjtTj^G^^
PTTAICT^I^GC^^^
GTTAfcTTS^
401 - -• - - ~ ~~ ~* ' "' 4S0
СААТТААА^ТТЩАСТ
С*ТАт]гААД^
C^TTAAGAATTGGAGTG^
CCATTA^GAATTGtlAGTGGT'CAGJCAAGAtiGTpAA^
CC^TAAG|ATVGGAGT^
CCATTAAGAATTpGj^
CCATTAAGAATTG^GTGCTC^
451 * '" " * 50 0
TACЈGAAATC^^^
ТАТХАЭЖ?^^
TACAGAAATCCGA^GA|TATTCGA^
TATAAAA^TCCAA^^
TATAA^AATCCAAT^^
ТАТАААА1УССА?Т§РТС^
TAT|AAAATCCA|^^
TATAAAAA^CC^TTiSGTGTTTGAGTA^
TCGAYfSTTTGAbCT
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(501)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(551)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(601)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(651)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
SEQ
(701)
^"ыа-ШШ^шш^т!^ few-
15/2 о:
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(751
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(801
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(851
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(901
SEQ
(951
SEQ
(951
SEQ
(951
SEQ
(951
SEQ
(951
SEQ
(951
SEQ
(951
SEQ
(951
SEQ
(951
SEQ
(951
SEQ
(951
751 800
GTG'CAAGTI^GAATGGAA^ GTGCAGAT!|ATG15\TC GTGC^GATJ &TGAATB^ GTAP^GTAA'TG^TGGAACTTTTACTATTG^
GTACAbATAATSAAfGGA^
GTACAGATAATGAAfGGAACATTTACTAT
GTGC^GAfAATG^^
GTGgAGAT^TjI^il^^
GTACAAA;B &T3^
G^|^GA;J| &^
SfA^GATA^
801 850 GTTjglTjpi^
GTTAGTIFGATTTGA &AG^^ ATTXGWGATAҐGATTAG
GTjMgffGAW
GTjSGjIj^
GTjJSjJ^fT^
GT^gTfg^^
851 900
ATACJGTACAGAM
ATASGTACAGAAT^XfiAA^
MGAEAA
ATACG№C7VGAATWCAATTGA ATACGTACAGAATTA'G^TTGACATGATTAGACGA
Шй.1кИ Iteti ЙКЗДЮ e4"i""l"lteM"K*l ПНШМнШа кинем" "Х> М.1М"ЖКСЛ* Ш &ШШ! &Ш &.*Ж1ЯЯЯЛЬ11*№№. *1Л> *?Г1^тгмш^Мш> ИЖЖ=
^AgGT^C^^^^TA^ATT^CA|; <^TA^ffi^GЈJ\A^C^^^A6AG A^AgGTAC3^A^C^^TT^CAJGATT^^^^^iGgC^^^^A5AG ^TA^^C^^^T^S^TG^CA^^yT^^g^gir^GbcgT^gGSAG АТА^вЙСА^^
901*" " ' " * '"" 950
TAC^TTCAGAGAACATJCCASP^GGTGGTC STATG-T.
CATACCAAGCTpG
TATj
^CgJTgAGAGAAC^JCp^CACAAGGfGGTCCTTA'
SITSTAT
TAT§TAgW$G^
ҐATJ35A5?^
TAT^TGAAAC^CTGTTTCCACAGGGTGGCCCA.^^ TATGTTPAAAGACTGTTTCE^CAGGGT
951 1000 ATACATGTTGAGGGfCAGTGTATTAGATGGGACAACGGAftT^
ATATAfGATAAGTCfTAGTATATTGGATGJ3CACAACAGAATCAGJCATGT
ATACATGTTGACAG
ATATA^AfAkCTg^
АТАТАТ^ТААСтёэт
ATATATGAiAAGTGTTAGTATAT^
IrnVTATC^TAACTCTT^^
ATATATjj^TAACTCJTT^^
АТАТАГСАТААбТСТ^
ATATA?GATAkcTC^TA^TAfATTGGAT6CCAC
1001 1050
GCGATTCACACTCTGTGGATTATTCAATTGTTGCAAACGTTAGAAGAGAC
GTGATTGACATTGAGTAGATTATTGAATCGTCGCAAATGTCA
GTGATTCACATTCAGTAGATTATTCAATCGTCGCAAATGTCAGAAGAGAC
GCGATTGAGACTCTGTAGACTAT'TCAATTGTTO
GTGATICЈCATTG^
GTGAJTCACATTCAGTAGATTATTCAATCGTC
GT*GATTC1|CATT &AGTAG
GTGATTCAC^TT^GTAbATTATTCAAlcGT
GTGATTCj^TjrCA^^
GTS &WCAC^
GTGACTCAciAT^^
TJ^GJ?A7^C3^
TcSdcAT^pcl^G^^ TCAGCT^GCCAGCTGGAA^
1101 1150
GACATJTAT^CCAAtja^
GATA^TATj5CAA(|ra
GATAҐTAT1^ вАскттмгг^^
GATMJTA^CCAA'C^ACJ^TGVTJGC GATATTATCC^^
вАТХтТЙТ^^^
GATATTAT^CAA <^
GATATTAtfCfi^
1151 " " "'"ll82
TACTAGTTCCCT
TGTTAG3^ESTfefefGAA^GAATQGTGA &
105l"~ _ 1100
SEQ 51
SEQ 53
SEQ 55
SEQ 57
SEQ 59
SEQ 61
SEQ 63
SEQ 65
SEQ 67
SEQ 69
SEQ 71
SEQ 51
SEQ 53
100
100
100
SEQ 55
100
100
SEQ 57
SEQ 59
SEQ 61
SEQ 63
100
SEQ 65
SEQ 67
SEQ 69
100
SEQ 71
GtQ^Q,KEV^^jpgg> Tj5H^(r)^X5LQ^MI i ijfr LAS F I ЕАУСРРЕ iy
бтОРдКЕЖ!ЩЕ^
GTQPSKEj &WQLPQLGf TLLNLppNYVQATRS I IDYLTS^EAVCTDEIV ОТ0^^^§(^Ы^^Щ?п^1Г^^Ы8 I IDYEASF IEAVCDDEIV
GTQ'PQKE^FQ'I^ GIC^K^
GTQ?QKk^'FQLPQL7^
GTQP'QKEfeEQLP^LGT^LLNLDpNWQATRS IIDYLAS FIEAVCDDEIV
101 _ ' 150
REASRNCTJQ^
b^sJfKgtf^^
151"~ _ 200
YROT$IpҐYMSTl^
YKNJ
YKNPjfVFEYI^ YKMPJWF]^^
YKNPiWFEV^jJlLQRANA
YKlbwfE?^^
YKSfpMVFlS^Rlji^^
YKN$iwFiSi^^
201 * ~ " _ 250
PNN^QRFljmGRLKRPTSNALMKIEAGAQNi
PNGfQRFIYNGRpKRPISNVLMjCIFAGA
PWTQRFIY]^
PNNTJ^%IYNGRLKRP IgNVLlS5EA§AQNI S S PTVLPPPTMQT^'T/WЈEI|P
~ " " ~ "* "" "" ** ?DPASQfT^lFNl
100
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(251)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(301)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
SEQ
(351)
251 300
^QIMNGTFTJ^
VQlj^TFTIEF
yQvMBTETIE^
VQIMtfGTfTIEljY^^
vQij^TfTiijI^^
yQIMrfGTFT.^ VQI^GTETIEF^
VQ IMt^ffTlJFYN^QLVpLl"R)^yvfm^m\^iTlDmRPA^fQ ^QltoGT~FTIEFYNl^QLTOLi
'301"" "* " " • 350
YyQRTFPQ^CTPYQAAYMLTLSVLDA
YVQ^T^PCg|^ YVQtfLfiQGG^
Y^RLFJ!QGGPYQH§A^ YVQ^LfPQl^
ууо|1ь|Р5 <| &^
3 51 ' ~ 3 94
SAMPAGJYFQ2GF'PJЈEQTL
SAM^AGTVFQ^GF_PWE32 SAMP> |1^Q^^
SAMPAGT^FQPGFP^^^^ SAMPXGTV^Q'PVFPWE'QILSOT
SMP7jGTVFQJPg_FP^
SA^PXGIV^^
SAMPAGWFQrel^
SAMPAGTVFQPGF'PWE^
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ
SEQ 52
SEQ 54
100
100
100
100
100
100
SEQ 56
100
100
100
100
100
100
SEQ 58
SEQ 60
100
100
100
100
100
SEQ 62
SEQ 64
100
100
100
SEQ 66
100
100
SEQ 68
100
100
SEQ 70
100
SEQ 72
Фиг. 9C (7/7)
3.5 3 2.5
1.5
щ Ш
He вакцинированные Поросята ВТ свиноматки не
вакцинированные
вакцинации
После
Поросята ВТ вакцинации вакцинированные свиноматки
Фиг. 10
VP4
VP6
2.5 2
1.5 1
0.5 0
2.5
2 1.5
111..:
0.5 -.0
Свиноматки Свиноматки Не вакциниро- Поросята ВТ, Поросята ВТ, Свиноматки Свиноматки
до вакцинации после ванные без вакцинация до вакцинации после
вакцинации свиноматки вакцинации
Поросята ВТ,
без вакцинации
1 -.1
.2...
Поросята 6Т, вакцинац 1я
NSP4
3.5 3
2.5 2
1.5 1
0.5 0
Ш01
Не вакцинированные
г •j -, ¦ -
Поросята ВТ, без
шш. Wmm
..",..Щк?§?Щ
Поросята ВТ, вакцинация
вакцинации
свиноматки
вакцинации
Фиг. И
Фмг. 72
L1234 L1234
1/20
1/20
1/20
1/20
1/20
1/20
1/20
1/20
1/20
1/20
2/20
2/20
2/20
2/20
2/20
2/20
3/20
3/20
3/20
3/20
3/20
3/20
4/20
4/20
4/20
4/20
5/20
5/20
5/20
5/20
6/20
6/20
9/20
9/20
9/20
9/20
9/20
9/20
1 11/20
1 11/20
1 11/20
1 11/20
12/20
12/20
Фиг. 9C(l/7)
Фиг. 9C(l/7)
13/20
13/20
Фиг. 9C (2/7)
Фиг. 9C (2/7)
501
14/20
501
14/20
Фиг. 9C (3/7)
Фиг. 9C (3/7)
Фиг. 9C (4/7)
Фиг. 9C (4/7)
Фиг. 9C (4/7)
Фиг. 9C (4/7)
Фиг. 9C (5/7)
Фиг. 9C (5/7)
Фиг. 9C (5/7)
Фиг. 9C (5/7)
17/20
17/20
Фиг. 9C (6/7)
Фиг. 9C (6/7)
18/20
18/20
18/20
18/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
19/20
20/20
20/20
