[RU]

Изобретение относится к соединению формулы (III), где R ₁ представляет собой водород, гидрокси или галоген; R ₂ представляет собой водород или α-гидрокси; R ₃ представляет собой гидрокси, NH(CH ₂ ) _m SO ₃ H или NH(CH ₂ ) _n CO ₂ H; R ₅ представляет собой незамещенный или замещенный алкил или арил; R ₆ представляет собой водород; или R ₅ и R ₆ , взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером 3, 4, 5 или 6 атомов; R ₇ представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил или гидрокси; R ₈ представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил; R ₉ представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил; или R ₈ и R ₉ , взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонил; R ₁₀ представляет собой R ₃ или SO ₃ H; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и n является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; или его соли, гидрату или конъюгату глициновой или тауриновой аминокислоты. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (III), и к применению соединения для лечения различных болезней, включающих метаболическое заболевание, воспалительное заболевание, болезнь печени, аутоиммунное заболевание, болезнь сердца, болезнь почек, рак и болезнь желудочно-кишечного тракта.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к соединению формулы (III), где R ₁ представляет собой водород, гидрокси или галоген; R ₂ представляет собой водород или α-гидрокси; R ₃ представляет собой гидрокси, NH(CH ₂ ) _m SO ₃ H или NH(CH ₂ ) _n CO ₂ H; R ₅ представляет собой незамещенный или замещенный алкил или арил; R ₆ представляет собой водород; или R ₅ и R ₆ , взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером 3, 4, 5 или 6 атомов; R ₇ представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил или гидрокси; R ₈ представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил; R ₉ представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил; или R ₈ и R ₉ , взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонил; R ₁₀ представляет собой R ₃ или SO ₃ H; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и n является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; или его соли, гидрату или конъюгату глициновой или тауриновой аминокислоты. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (III), и к применению соединения для лечения различных болезней, включающих метаболическое заболевание, воспалительное заболевание, болезнь печени, аутоиммунное заболевание, болезнь сердца, болезнь почек, рак и болезнь желудочно-кишечного тракта.

---

2420-514488ЕА/026 МОДУЛЯТОРЫ TGR5 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
Описание
Родственная заявка
Настоящая заявка заявляет приоритет европейской заявки № 08169462.2, зарегистрированной 19 ноября 2008 года, содержание которой включено в настоящее изобретение.
Область изобретения
Изобретение относится к соединениям, которые модулируют TGR5, и к композициям, полезным для способов лечения и/или профилактики различных заболеваний.
Уровень изобретения
Рецептор TGR5 представляет собой связанный с G-белком рецептор, идентифицированный как рецептор клеточной поверхности, который восприимчив к желчным кислотам (ЖК) . У человеческого, бычьего, кроличьего, крысиного и мышиного TGR5 выявлена высокая консервативность первичной структуры TGR5 и его чувствительность к желчным кислотам, и в этой связи предполагается, что TGR5 имеет важные физиологические функции. Выявлено, что TGR5 широко распространен не только в лимфатических тканях, но также и в других тканях. Высокий уровень содержания мРНК TGR5 был обнаружен в плаценте, селезенке и моноцитах/макрофагах. Показано, что желчные кислоты индуцируют интернализацию слитого белка TGR5 от клеточной мембраны до цитоплазмы. Kawamata et al. 2003, J. Bio. Chem., 278, 9435. Выявлена идентичность TGR5 и hGPCR19, о чем опубликовано авторами Takeda et al. 2002, FEBS Lett. 520, 97101.
Существует связь TGR5 с внутриклеточным накоплением цАМФ, что широко проявляется в клетках разных типов. Активация мембранного рецептора TGR5 в макрофагах уменьшает продукцию провоспалительных цитокинов (Kawamata, Y. , et al. J. Biol. Chem. 2003, 278, 9435-9440), при этом стимуляция этого рецептора посредством ЖК в адипоцитах и миоцитах увеличивает потребление энергии (Watanabe, М. et al. Nature. 2006, 439, 484-489). Указанный эффект охватывает цАМФ-зависимую индукцию 2
типа йодотирониндейодиназы (D2), которая с помощью локального превращения Т4 в ТЗ вызывает повышение активности гормона щитовидной железы. Роль TGR5 в контроле энергетического обмена согласуется с тем, что у нокаутных по TGR5 самок мышей выявлено значительное накопление жира с увеличением веса при провокации высокожирной диетой, что указывает на уменьшение потребления энергии и возникновение ожирения при недостатке TGR5 (Maruyama, Т., et al. J. Endocrinol. 2006, 191, 197-205). Дополнительно, и в связи с вовлечением TGR5 в энергетический гомеостаз известно, что активация мембранного рецептора посредством желчных кислот способствует продукции глюкагон-подобного пептида 1 (GLP-1) в мышиных энтероэндокринных клеточных линиях (Katsuma, S., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 329, 386-390). Ha основании всех вышеупомянутых наблюдений утверждается, что TGR5 представляет собой привлекательную цель для лечения заболевания, например, ожирения, диабета и метаболического синдрома.
В дополнение к применению агонистов TGR5 для лечения и профилактики метаболических заболеваний, соединения, которые модулируют модуляторы TGR5, также полезны для лечения других заболеваний, например, болезней центральной нервной системы, а также воспалительных заболеваний (WO 01/77325 и W0 02/84286). Модуляторы TGR5 также обеспечивают способы регуляции гомеостаза желчных кислот и холестерина, абсорбции жирных кислот и переваривания углеводов и белков.
В литературе описано относительно мало примеров агонистов TGR5. В недавних публикациях отмечено, что 23-алкил-замещенные и б,2 3-алкил-дизамещенные производные хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК), такие как соединение ба-этил-23(S)-метил-хенодезоксихолевая кислота, показанная ниже, представляют собой мощные и селективные агонисты TGR5 (Pellicciari, R.; et al. J. Med. Chem. 2007, 50, 4265-4268).
В частности, метилирование (S-конфигурация) в С2з-положении
желчных кислот (ЖК) природного происхождения придает выраженную
селективность к TGR5 после активации FXR (фарнезоидных X-
рецепторов), тогда как ба-алкильное замещение увеличивает
потенциал обоих рецепторов. Некоторые примеры других агонистов
TGR5 включают в себя сложный бензиловый эфир 6-метил-2-оксо-4-
тиофен-2-ил-1,2,3,4-тетрагидро-пиримидин-5-карбоновой кислоты
(W0 004067008, Takeda Chemical Industries LTD, Япония, 2004) и
олеанолевая кислота (Sato, Н. et al. Biochem. and Biophys. Res.
Commun. 2007, 362, 793-798; Ito, F. Et al. WO 02004067008,
2 0 04) . Позднее первый синтез энантиомерической
хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК) и литохолевой кислоты (ЛХК) позволил подойти к изучению специфичности взаимодействия ЖК природного происхождения с TGR5 (Katona, В. W. Et al. J. Med. Chem. 2007, 50, 6048-6058).
Разработанные в последнее время агонисты TGR5 также впервые позволили дифференцировать с фармакологической точки зрения геномные эффекты, отличая их от негеномных эффектов ЖК, и также сделали возможными информативные исследования взаимоотношений структуры и действия, например, выявлено, что присутствие дополнительного связывающего кармана в TGR5 играет основную роль в определении селективности лиганда (См. Pellicciari, et al. Med. Chem. 2007, 50, 4265-4268). В этой связи наличие более мощных и селективных модуляторов TGR5 необходимо для дальнейшего определения дополнительных признаков, влияющих на активацию рецептора и определения параметров физиологического и фармакологического действия указанного рецептора, с целью лучшего понимания его отношения к профилактике и лечению заболевания.
Холевая кислота, представляющая собой первичную желчную кислоту у человека и многих видов животных, также известна как один из основных компонентов, наряду с билирубином Calculus Bovis, который высоко ценится в традиционной китайской медицине (Chen, X., Biochem. Pharmacol. 2002, 63, 533-541). Холевая кислота (ХК) отличается от хенодезоксихолевой кислоты (ХДХК) и ее производных, описанных выше, наличием в С-12 положении дополнительной альфа-гидроксильной группы, ориентированной на полярную сторону молекулы. Это "незначительное" структурное различие обусловливает заметно различающиеся физикохимические и биологические характеристики двух упомянутых желчных кислот. По сравнению с ХДХК, протонированная ХК обладает в 4 раза большей растворимостью и относительно меньшей детергентностью благодаря своему балансу гидрофобности/гидрофильности и полярности. Кроме того, ХК не имеет активности по отношению к рецептору FXR (ЕС50 > 10 0 мкМ), и при этом проявляет умеренное агонистическое действие к TGR5 (ЕС 50=13,6 мкМ). Еще более важное соображение, по предыдущим публикациям, состоит в том, что фармакологическое введение ХК в количестве 0,5% об/об мышам с ожирением, индуцированным диетой, является эффективным для профилактики и лечения метаболического синдрома (Katsuma, S., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 329, 386). В настоящем исследовании получены интересные результаты, связанные с эндокринными функциями желчных кислот, тем не менее, необходимость высокой дозы (0,5% об/об) ограничивает доказательство концепции в отношении терапевтической значимости TGR5 в контексте метаболических заболеваний, поскольку при указанной дозе нельзя исключать модуляцию других и неизвестных мишеней. Также
дополнительной проблемой был риск, связанный с тестированием высокой дозы ХК в клинических испытаниях, по причине продукции токсичного вторичного метаболита ЖК дезоксихолевой кислоты ДХК путем обширного и эффективного 7а-дегидроксилирования с помощью кишечных бактерий (Nagengast, F. М., Eur. J. Cancer, 1995, 31А, 1067).
Таким образом, существует потребность в разработке модуляторов TGR5 для лечения и/или профилактики различных заболеваний. В настоящем изобретении определены соединения, которые модулируют TGR5, а также способы применения указанных соединений для лечения или профилактики заболевания.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к модуляторам TGR5 и их применению для лечения и/или профилактики различных заболеваний. Изобретение рассматривает соединения, имеющие формулу А:
или их соль, сольват, гидрат или пролекарство. В формуле А переменные Ri# R2, R3, R4, R5, R6, R7, Re, R9 и Ri0 можно выбирать из соответствующих групп химических функциональных остатков, определение которых приведено ниже в подробном описании. Настоящее изобретение включает в себя композицию, содержащую соединение по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат или пролекарство, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель. Изобретение включает в себя соединения для использования в способе лечения или профилактики болезни у субъекта. Изобретение также включает в себя использование композиции или соединения по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата или пролекарства в изготовлении лекарства для лечения или
профилактики болезни у субъекта. В одном аспекте болезнь выбирают из метаболического заболевания, воспалительного заболевания, болезни печени, аутоиммунного заболевания, болезни сердца, болезни почек, рака и болезни желудочнокишечного тракта.
Вышеупомянутое описание достаточно широко формулирует наиболее важные признаки настоящего изобретения для понимания его дальнейшего подробного описания, с тем, чтобы лучше оценить вклад настоящего изобретения в данную область. Другие цели и признаки настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания, которое рассматривается вместе с примерами.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 представляет собой график, на котором показано влияние соединения Ih3e на прибавление веса у мышей, получающих обычный рацион и высокожирный корм.
Фигура 2 представляет собой ряд из девяти графиков ("А-I"), на которых показаны изменения профиля метаболизма у мышей, получавших высокожирный корм, леченных соединением Ih3e. Анализ плазмы мышей с индуцированным диетой ожирением, леченных соединением Ih3e. A-D относятся к ферментам печени. F-I относятся к липидам плазмы.
Фигура 3 представляет собой ряд графиков (А-В), на которых показаны результаты анализа плазмы на инсулин и пероральный тест на толерантность к глюкозе у мышей, получавших обычный рацион и высокожирный корм, леченных соединением Ih3e.
Фигура 4 представляет собой график, который показывает изменения содержания глюкозы у мышей, получавших обычный рацион, леченных соединением Ih3e.
Фигура 5 представляет собой ряд графиков (A-D), которые показывают высвобождение инсулина in vivo после тестовой еды у мышей, получавших обычный рацион и высокожирный корм, леченных соединением Ih3e.
Фигура 6 представляет собой ряд графиков (A-D), которые показывают потребление кислорода и продукцию С02, измеренные путем непрямой калориметрии у мышей, получавших обычный рацион
и высокожирный корм, леченных соединением Ih3e
Фигура 7 представляет собой три графика (А-С), которые показывают значение коэффициента дыхательного обмена (RER), вычисляемое путем непрямой калориметрии у мышей, получавших обычный рацион и высокожирный корм, леченных соединением Ih3e.
Фигура 8 представляет собой ряд графиков (А-В), которые показывают двигательную активность и поглощение корма и воды мышами, получавшими обычный рацион и высокожирный корм, леченных соединением Ih3e.
Фигура 9 представляет собой ряд графиков (А-С), которые показывают изменения веса органов у мышей, получавших обычный рацион и высокожирный корм, леченных соединением Ih3e.
Фигура 10 является графиком, отображающим поверхностное натяжение в зависимости от логарифма концентрации соединения Ih3e (мМ) в 0,15М NaCl.
Фигура 11 показывает схему эксперимента дуоденального вливания, проводимого с применением соединения Ih3e.
Фигура 12 показывает схему эксперимента феморального вливания, проводимого с применением соединения Ih3e.
Фигура 13 представляет график, отображающий скорости выделения в зависимости от времени, в экспериментах феморального и дуоденального вливания, проводимых с применением соединения Ih3e.
Фигура 14 представляет собой серию графиков (A-D), относящихся к соединению Ih3e и его метаболитам. Фигура 14А показывает соединение Ih3e и его основные метаболиты, определяемые в желчи путем масс-спектрометрии в эксперименте в/в вливания. Данные представлены как абсолютные значения областей. Фигура 14Ь представляет собой увеличенное изображение фигуры 14 А. Фигура 14С показывает соединение Ih3e и его основные метаболиты, определяемые в желчи путем масс-спектрометрии. Фигура 14 D представляет собой увеличенное изображение фигуры 14С.
Фигура 15 представляет собой график, который показывает стабильность соединения Ih3e (треугольник) и ХК (квадрат) в культуре человеческого кала.
Фигура 16 представляет собой гистограмму, показывающую дозозависимое высвобождение GLP-1 ex vivo, индуцированное соединением Ih3e.
Фигура 17А показывает графики корреляции экспрессии мРНК в печени у TGR5 и Cox-VTI в генетической эталонной популяции мышей BxD (п=41).
Фигура 17В представляет гистограмму, показывающую активность Сох в клетках STC-1, которые в течение 1 часа обрабатывали соединением Ih3e при определенной концентрации. За 15 минут до обработки добавляли носитель или ингибитор аденилатциклазы MDL-12330-A (MDL) (1 мкмоль) (п=3).
Фигура 17С представляет график потребления кислорода в клетках STC-1, измеряемого с помощью анализатора внеклеточного потока XF24 (Seahorse Bioscience) . Первая вертикальная пунктирная линия показывает добавление в культуральную среду носителя или MDL-1233 О-A (MDL), и вторая пунктирная линия указывает на обработку соединением Ih3e в дозе 1 мкмоль (п=10).
Фигура 17D представляет гистограмму, показывающую соотношение АТФ/АДФ в клетках STC-1, обработанных, как показано для фигуры В (п=3).
Фигура 17Е показывает графики корреляции экспрессии мРНК в печени для TGR5 и Kir6.2 в генетической эталонной популяции мышей BxD согласно методике, сходной с описанием для фигуры А.
Фигура 17F представляет собой гистограмму, которая показывает уровни экспрессии мРНК, измеряемой путем количественной ПЦР в реальном времени, для TGR5, Cox-IV и Kir6.2 в клетках STC-1, трансфицированных в течение 36 часов контролем или mTGR5 из короткой шпилечной РНК (shPHK). Уровень мРНК-мишени стандартизировали по уровню 36В4 мРНК (п=3). Данные представлены как среднее значение ±SE; непарный t-тест Стьюдента; *р <0,05.
Фигура 18А показывает графики корреляции экспрессии мРНК в печени для TGR5 и Cav2.2 в генетической эталонной популяции мышей BxD (п=41) по данным вебсайта GeneNetwork Университета Теннесси.
Фигуры 18В и 18С представляют собой графики, показывающие
внутриклеточное содержание кальция в клетках NCI-H716, трансфицированных пустым вектором, вектором экспрессии hTGR5, или hTGR5 siPHK в течение 36 часов, и обработанных соединением Ih3e в дозе 1 (В) или 10 мкмоль (С) . Стрелка показывает обработку соединением Ih3e (п=3).
Фигура 18D представляет собой график внутриклеточного содержания кальция в клетках NCI-H716, обработанных соединением Ih3e (обозначено стрелкой) в дозе 3 мкмоль в присутствии носителя или ингибитора аденилатциклазы MDL-1233О-A (MDL) (10 мкмоль). MDL или носитель добавляли за 15 минут до обработки соединением Ih3e (п=3).
Фигура 18Е представляет собой график, показывающий внутриклеточное содержание кальция в клетках NCI-H716, обработанных 1% глюкозой и затем соединения Ih3e в дозе 1 мкмоль (п=3).
Фигура 18F является гистограммой, показывающей высвобождение GLP-1 в клетках NCI-H716 после обработки 1% глюкозой, или соединением Ih3e в дозе в дозе 1 мкмоль, или комбинацией обоих агентов (п=3).
Фигура 18G представляет собой гистограмму, которая показывает высвобождение GLP-1 в клетках STC-1, трансфицированных в течение 36 часов контролем, вектором экспрессии mTGR5, или mTGR5 shPHK, и на которые затем воздействовали соединением Ih3e в течение 30 минут при определенной концентрации. В культуральную среду добавляли ингибитор DPP4 0,1% (Millipore) (п=3).
Фигура 18Н представляет гистограмму, показывающую эффект обработки соединением Ih3e в течение 30 минут на высвобождение GLP-1 в клетках STC-1, трансфицированных вектором экспрессии mTGR5 в присутствии носителя или ингибитора аденилатциклазы 2330-А MDL-1 (10 мкмоль). MDL или носитель добавляли за 15 минут до обработки соединением Ih3e. В культуральную среду добавляли ингибитор DPP4 0,1% (Millipore) (п=3). Данные представлены как среднее значение ±SE. Непарный t-тест Стьюдента; *р <0,05 обработка носителем по сравнению с соединение Ih3e; #р <0,05 обработка носителем по сравнению с
обработкой MDL-1 2330-А.
Фигура 19А представляет собой график, который показывает результаты перорального теста толерантности к глюкозе (ПТТГ) у самцов мышей TGR5-Tg, которые в течение 10 недель получали высокожирный (ВЖ) корм, и у подобранных по возрасту однопометных самцов, получавших обычный рацион (ОР) и ВЖ корм в течение того же периода. На момент начала кормления ВЖ пищей возраст всех мышей составлял 8 недель. Масса тела мышей TGR5-Тд и контрольных однопометников составляла 37,9±1,7 г и 37,0+1,8 г, соответственно (п=8; без статистической разницы). Соседняя гистограмма показывает среднюю область под кривой (AUC) (п=8).
Фигуры 19В и 19С показывают содержание инсулина в плазме (верхние графики) и GLP-1 (нижние графики) во время ПТТГ (19В), или перед тестовой пищевой провокации и после нее (19С) (п=8).
Фигура 19D показывает гистограмму высвобождения GLP-1 из подвздошных эксплантов, выделенных от самцов контрольных мышей и мышей TGR5-Tg, получавших в течение 18 недель ВЖ корм, на которые воздействовали в течение 1 часа определенными концентрациям ЛХК (п=4).
Фигура 19Е показывает ряд снимков, представляющих меченые иммунофлуоресцентным инсулином срезы поджелудочной железы от самцов мышей TGR5-Tg, получавших в течение 20 недель ВЖ корм, или от подобранных по возрасту самцов-однопометников, получавших ОР и ВЖ корм в течение того же периода.
Фигура 19F является гистограммой, показывающей профиль распределения панкреатических островков у самцов мышей TGR5-Tg и контрольных однопометников, получавших ОР и ВЖ корм, как описано для фигуры 19Е. Подсчет и измерение островков проводили с помощью программного обеспечения ImageJ analysis на четырех окрашенных ГЭ (гематоксилин+эозин) послойных панкреатических срезах, расположенных через каждые 150 мкМ (п=5).
Фигура 19G показывает гистограмму содержания инсулина в выделенных с помощью коллагеназы панкреатических островках у самцов мышей TGR5-Tg и контрольных однопометников, получавших ОР и ВЖ корм, как описано выше (Фигура 19Е).
Фигура 19Н представляет собой график, показывающий
результаты ПТТГ у самцов мышей TGR5"/_ и TGR5+/+, получавших в течение 8 недель ВЖ корм. На вставке показана среднюю область AUC. Масса тела самцов мышей TGR5~/_ и TGR5 +/+ во время анализа составляла 46,3+3,9 г и 51,9+2,0 г, соответственно (п=8; без статистической разницы).
Фигуры 191 и 19J представляют собой графики, показывающие содержание в плазме GLP-1 у получавших ОР мышей TGR5+/+ (фигура 191) и у мышей TGR5_/" (фигура 19J) после пероральной провокации глюкозой, которую проводили за 30 минут перед пероральным введением солевого раствора или соединения Ih3e (30 мг/кг) , единственного или в комбинации с ингибитором дипептидил-пептидазой-4 (DPP4i, 3 мг/кг) (п=б). Данные представлены как среднее значение ± SE. Непарный t-тест Стьюдента; #р <0,05, ВЖ-диета по сравнению с ВЖ-диетой у мышей, леченных соединением Ih3e; и #р <0,05, ВЖ-диета по сравнению с ОР у мышей за исключением (I) и (J), где ^обозначены показатели от мышей после введения солевого раствора или DPP4i по сравнению с мышами, леченными соединением Ih3e или Ih3e+DPP4i, и #показано введение мышам солевого раствора по сравнению с DPP4i.
Фигура 20А представляет собой график, который показывает результаты измерения содержания в плазме соединения Ih3e с помощью ВЭЖХ у самцов мышей C57BL6/J, получавших ОР, ВЖ корм и ВЖ корм на фоне лечения соединением Ih3e.
Фигура 20В представляет собой график, который показывает результат воздействия диеты с соединением Ih3e (30 мг/кг/в день), начатого после 14-недельного периода кормления ВЖ пищей, время начала воздействия обозначено стрелкой. Во время исследования наблюдали увеличение массы тела во всех группах (п=8).
Фигура 2 ОС представляет гистограмму, показывающую конституцию тела, которую оценивали с помощью qHMP (ядерно-магнитного резонанса) через 8 недель воздействия диеты (п=8).
Фигура 20D представляет гистограмму массы органов, выраженной как процент веса контрольных мышей, получавших ОР.
Фигура 20Е представляет собой гистограмму, которая показывает поглощение пищи (п=8).
¦ Фигура 20F представляет собой ряд гистограмм, показывающих спонтанную горизонтальную активность и расход энергии, которые оценивали с помощью измерения потребления кислорода (V02) и высвобождения углекислого газа (VC02) , указанные измерения проводили в течение 18 часов через 6 недель после начала воздействия диеты. Дыхательный коэффициент (ДК) вычисляли как отношение VC02/VO2. Гистограммы представляют среднее значение AUC. В отношении ДК гистограммы показывают среднее значение (п=8).
Фигура 2 0G является гистограммой, показывающей генную экспрессию в бурой жировой ткани (БЖТ) с помощью количественной ПЦР в реальном времени через 18 недель воздействия диеты. Содержание мРНК мишени было стандартизировано по уровню 36В4 мРНК (п=8).
Фигура 2 ОН представляет собой график, показывающий первичные коричневые адипоциты, выделенные у самцов мышей C57BL/6J, получавших ОР, которые культивировали в течение 12 часов с носителем или 3 мкмоль соединения Ih3e, затем измеряли потребление 02 с использованием анализатора внеклеточного потока XF24 (Seahorse Bioscience) (п=5). Пунктирные линии показывают добавление разобщающего агента FCCP в последовательных дозах 250 и 500 нМ.
Фигура 201 представляет собой ряд фотографий, которые отображают окрашивание криосрезов печени oil redO (ORO) (верхний ряд) и окрашивание парафиновых срезов печени Сириус красным (нижний ряд) в конце воздействия диеты. Фиброз обозначен стрелкой.
Фигура 20J представляет собой ряд гистограмм, которые показывают содержание липида I в образцах печени, выделенных способом по Folch (п=8) .
Фигура 2 0К и 2 0L представляет ряд гистограмм, которые показывают содержание в плазме печеночных ферментов (фигура 20 К) и липидов (фигура 20L) в конце воздействия диеты (п=8). Данные представлены как среднее значение +SE. Непарный t-тест Стьюдента; *р <0,05, получавшие ВЖ мыши по сравнению с получавшими ВЖ корм и леченными Ih3e мышами; и" #р <0,05,
получавшие ВЖ по сравнению с получавшими ОР мышами.
Фигура 21А показывает на графике результаты ПТТГ у самцов мышей C57BL6/J, получавших ОР и ВЖ корм с добавлением 30 мг/кг/вдень соединения Ih3e в течение 8 недель после начала ожирения, индуцированного употреблением ВЖ корма в течение 10 недель. На вставке показана средняя область AUC. Масса тела мышей, леченных носителем и рассматриваемым соединением Ih3e составляла 38,08+1,83 г и 32,26+0,95 г, соответственно (п=8; р <0,05) .
Фигура 21В представляет собой график, который показывает гликемию и инсулинемию натощак (4 часа голодания) у мышей с диет-индуцированным ожирением (ДИО) через 3 недели воздействия диеты с соединением Ih3e (верхняя схема). Содержание инсулина в плазме во время ПТТГ у мышей с диет-индуцированным ожирением (ДИО) (нижняя схема).
Фигура 21С представляет собой график, который показывает результат ПТТГ у 14-недельных самцов мышей db/db, получавших ОР и леченных соединением Ih3e в дозе 30 мг/кг/в день в течение 6 недель. На вставке показана средняя область AUC (п=8).
Фигура 21D представляет собой график, показывающий гликемию и инсулинемию натощак (4 часа) у мышей db/db через 6 недель лечения соединением Ih3e (верхняя схема). Содержание инсулина в плазме во время ПТТГ у мышей ДИО (нижняя схема).
Фигура 21Е представляет ряд из двух гистограмм, показывающих чувствительность к инсулину, оценениваемую по средней скорости вливания глюкозы в равновесном состоянии (эугликемия) в гиперинсулинемическом эугликемическом клэмп-тесте (10 mU инсулина/мин/кг) у мышей ДИО (после возникновения ожирения, индуцированного кормлением ВЖ пищей в течение 10 недель) через 10 недель воздействия диетой с соединением Ih3e (30 мг/кг/в день) (п=5). Продукцию глюкозы в печени и ее подавление инсулином, а также скорость исчезновения глюкозы оценивали в равновесном состоянии с использованием ЗН-глюкозы (п=5) .
Фигура 21F представляет собой ряд гистограмм, показывающих инсулин-стимулируемый захват глюкозы в обозначенных тканях,
который измеряли с помощью меченой 14С-2-дезоксиглюкозы (п=5).
Фигура 21G представляет ряд гистограмм, показывающих профиль экспрессии генов в печени, получаемый с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Содержание мРНК мишени стандартизировали по уровню 36В4 (п=8). Данные представлены как среднее значение + SE. Непарный t-тест Стьюдента; *р <0,05, получавшие ВЖ мыши по сравнению с мышами, которым давали ВЖ корм и вводили Ih3e; и #р <0,05, получавшие ВЖ по сравнению с получавшими ОР мышами.
Фигура 22А представляет ряд графиков, показывающих результаты исследования, в котором самцы мышей TGR5+/+ и TGR5_/~ получали ВЖ диету в течение 9 недель, и первый ПТТГ проводили после указанного периода. Затем к ВЖ корму добавляли соединение Ih3e в дозе 30 мг/кг/в день. Повторный ПТТГ проводили через 4 недели после начала лечения соединением Ih3e. Кривые показывают толерантность к глюкозе у мышей перед лечением, и после лечения в течение 4 недель соединением Ih3e у TGR5+/+ (график слева) и TGR5"/- (график справа). На вставке показана средняя область AUC. У мышей TGR5+/+ масса тела перед лечением соединением Ih3e и после лечения составляла 46,86+3,54 г и 43,50±3,47 г, соответственно (п=8; без статистической разницы). У мышей TGR5 масса тела перед лечением соединением Ih3e и после лечения составляла 54,34+2,23 г и 52,30+2,72 г, соответственно (п=8; без статистической разницы).
Фигура 22В представляет собой ряд графиков с показателями содержания инсулина в плазме, которые одновременно измеряли во время ПТТГ у мышей ДИО с TGR5+/+ (левый график) и TGR5_/" (правый график) перед лечением и после лечения в течение 4 недель соединением Ih3e. На вставке показана средняя область AUC (п=8). Данные представлены как среднее значение ± SE. Непарный t-тест Стьюдента; *р <0,05, носитель по сравнению с содинением Ih3e у 7 леченных мышей.
Фигура 23 является графиком, показывающим содержание соединения Ih3e и скорость желчеотделения Ii3e в тесте феморального вливания дозы 1 мкмоль/мин/кг в течение 1 часа, и скорость желчеотделения в феморальном тесте в ' качестве
контрольного вливания физиологического раствора с 3% бычьего сывороточного альбумина БСА в течение 1 часа.
Фигура 24 представляет график, который показывает уровень соединения Ih3e и выделения тауро-1пЗе в зависимости от времени в феморальном тесте при дозе 1 мкмоль/мин/кг в течение 1 часа.
Фигура 2 5 представляет график, показывающий уровень соединения Ih3e и выделения тауро-1пЗе в зависимости от времени в феморальном тесте при дозе 1 мкмоль/мин/кг в течение 1 часа.
Фигура 2 6 представляет график, показывающий уровень соединения Ih3e и его основных метаболитов, обнаруженных в образцах желчи, которые получали в тесте феморального вливания. Данные представлены как абсолютные значения области.
Фигура 27 представляет увеличенное изображение фигуры 26.
Описание изобретения
Подробности одного или больше вариантов осуществления изобретения сформулированы ниже в прилагаемом описании. При осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в изобретении, и в настоящем описании приведены указанные способы и материалы. Другие признаки, задачи и преимущества изобретения станут очевидными из настоящего описания. Формы единственного числв в настоящем описании также включают в себя формы множественного числа, если из контекста явно не следует иначе. Если не указано иначе, все технические и научные термины, приведенные в изобретении, имеют значения, аналогичные общепринятым значениям, которые понятны рядовым специалистам в области техники настоящего изобретения. В случае притиворечий настоящее описание их будет урегулировать.
Определения
Для удобства далее собраны конкретные термины, используемые в описании, примерах и в прилагаемой формуле изобретения.
Термин "лечение", используемый в изобретении, означает облегчение, уменьшение, снижение, устранение, модуляцию или улучшение, то есть, то, что вызывает регресс болезни или
патологического состояния.
Термин "профилактика", используемый в изобретении, означает полное или почти полное предотвращение состояния болезни или нарушения, его возникновения у пациента или субъекта, в особенности, если пациент или субъект предрасположен к такому состоянию или имеет риск возникновения болезни или патологического состояния. Профилактика также может включать в себя- ингибирование, то есть прекращение развития болезни или патологического состояния, и облегчение или улучшение, то есть вызывать регресс болезни или патологического состояния, например, если болезнь или патологическое состояние уже наступили.
Термин "6-Et,23(S)-МеСА" относится к соединению Ih3e, имеющему химическую структуру:
Альтернативно, соединение Ih3e может также называться 6а-этил- (23S) -метил-За, 7а, 12а-тригидрокси-5(Ь-холан-24-оевой кислотой.
Используемое в изобретении сокращение "ЖК" означает желчную кислоту и производные желчной кислоты. Желчные кислоты представляют собой стероидные карбоновые кислоты, происходящие из холестерина. Первичными желчными кислотами являются холевая и хенодезоксихолевая кислоты. В организме указанные кислоты сопрягаются с глицином или таурином перед их выделением в составе желчи.
Термин "алкил" включает в себя насыщенные алифатические группы, включающие в себя алкильные группы с прямой цепью (например, метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил, нонил, децил), алкильные группы с разветвленной цепью (например, изопропил, tert-бутил, изобутил), циклоалкильные (например, алициклические) группы (например, циклопропил,
циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил),
алкилзамещенные циклоалкильные группы и циклоалкилзамещенные алкильные группы. В конкретных вариантах осуществления прямая цепь или разветвленная цепь алкила в своей основной цепи имеет шесть или меньше атомов углерода, и упоминается как "низший алкил" (например, Ci-C6 для прямой цепи, что означает наличие 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомов углерода, С3-С6 для разветвленной цепи, что означает 3,' 4, 5 или б атомов углерода) . В некоторых примерах прямая цепь или разветвленная цепь алкила имеет в своей основной цепи четыре или меньше атомов углерода. Дополнительно, циклоалкилы в своей кольцевой структуре имеют 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода.
Термин "замещенный алкил" относится к алкильным
функциональных остаткам, имеющим заместитель, замещающий один
или больше атомов водорода по меньшей мере на одном или больше
углероде углеводородной основной цепи. Такие заместители могут
включать в себя, например, алкил, .алкенил, алкинил, галоген,
гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси,
алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат,
алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил,
алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил,
алкоксил, фосфат, фосфонат, фосфинат, циано, амино (включающий
в себя алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и
алкилариламино), ациламино (включающий в себя
алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический функциональный остаток.
Термин "арил" включает в себя группы с ароматичностью, включающие 5- и 6-членные "несопряженные" ароматические группы или ароматические группы с единственным кольцом, которые могут включать в себя от ноля до четырех гетероатомов, а также "сопряженные", или мультициклические, системы по меньшей мере с одним ароматическим кольцом. Примеры арильных групп включают в себя бензол, фенил, пиррол, фуран, тиофен, тиазол, йзотиазол,
имидазол, триазол, тетразол, пиразол, оксазол, изооксазол,
пиридин, пиразин, пиридазин и пиримидин, и тому подобные. Кроме
того, термин "арил" включает в себя мультициклические арильные
группы, например, трициклические, бициклические, например,
нафталин, бензоксазол, бензодиоксазол, бензотиазол,
бензоимидазол, бензотиофен, метилендиоксифенил, хинолин,
изохинолин, нафтиридин, индол, бензофуран, пурин, бензофуран,
деазапурин или индолизин. Указанные арильные группы, имеющие в
структуре кольца гетероатомы, также могут называться "арил-
гетероциклическими", "гетероциклическими",
"гетероароматическими" или "гетероарилами". Ароматическое
кольцо может быть замещенным по меньшей мере в одном кольцевом
положении такими заместителями, которые описаны выше, как,
например, галоген, гидроксил, алкокси, алкилкарбонилокси,
арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси,
карбоксилатом, алкилкарбонил, алкиламинокарбонил,
аралкиламинокарбонил, алкениламинокарбонил, алкилкарбонил,
арилкарбонил, аралкилкарбонил, алкенилкарбонил,
алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкилтиокарбонил, фосфат,
фосфонат, фосфинат, циано, амино (включающий в себя алкиламино,
диалкиламино, ариламино, диариламино, и алкилариламино),
ациламино (включающий в себя алкилкарбониламино,
арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино,
сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты,
алкилсульфинил, сульфонат, сульфамоил, сульфонамидо, нитро,
трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил, или
ароматическим или гетероароматическим функциональным остатком.
Арильные группы могут также быть слитыми или соединенными с
ациклическими или гетероциклическими кольцами, которые не
являются ароматическими, с тем, чтобы образовать
мультициклическую систему (например, тетралин,
метилендиоксифенил).
Если не указано другое число атомов углерода, термин "низший алкил" включает в себя алкильную группу, как определено выше, но имеющую в структуре основной цепи от одного до десяти, например, от одного до шести атомов углерода.
Термин "алкокси" или "алкоксил" включает в себя алкильные, алкенильные и алкинильные группы, ковалентно связанные с атомом кислорода. Примеры алкокси групп (или алкоксильных радикалов) включают в себя группы метокси, этокси, изопропилокси, пропокси, бутокси и пентокси.
Термин "эфир" включает в себя соединения или функциональные остатки, которые содержат атом кислорода, присоединенный к двум разным атомам углерода или гетероатомам. Например, указанный термин включает в себя "алкоксиалкил", который относится к алкильной, алкенильной или алкинильной группе, ковалентно связанной с атомом кислорода, который ковалентно связан с другой алкильной группой.
Термин "сложный эфир" включает в себя соединения и
функциональные остатки, содержащие атом углерода или
гетероатом, присоединенный к атому кислорода, который связан с
углеродом карбонильной группы. Термин "сложный эфир" включает в
себя алкоксикарбоксильные группы, такие как метоксикарбонил,
этоксикарбонил, пропоксикарбонил, бутоксикарбонил,
пентоксикарбонил и т.д. Определения алкильных, алкенильных или алкинильных групп приведены выше.
Термин "гидрокси" или "гидроксил" включает в себя группы с -ОН или -О".
Термин "галоген" включает в себя фтор, бром, хлор, иод и т.д. Термин "пергалогенированный" обычно относится к функциональному остатку, в котором все атомы водорода замещены атомами галогена.
Понятие "анионная группа", используемое в изобретении, относится к группе, имеющей отрицательный заряд при физиологическом уровне рН. Анионные группы включают в себя карбоксилат, сульфат, сульфонат, сульфинат, сульфамат, тетразолил, фосфат, фосфонат, фосфинат или фосфоротиоат или их функциональные эквиваленты. В понятие "функциональные эквиваленты" анионных групп включены биоизостеры, например, биоизостеры карбоксилатной группы. Термин "биоизостеры" охватывает и классические биоизостерические эквиваленты и неклассические биоизостерические эквиваленты. Классические и
неклассические биоизостеры известны в данной области техники (см., например, Silverman, R. В. , R. В. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Academic Press, Inc.: San Diego, Calif, 1992, pp.19-23). Другой анионной группой является карбоксилат.
Термин "нестабильная функциональная группа" относится к замещаемой структуре, которая содержит неустойчивое присоединение, например, функциональную группу или связь, которая восприимчива к гидролизу или расщеплению при физиологических условиях (например, водные растворы при нейтральном диапазоне уровня рН). Примеры нестабильных функциональных групп включают в себя ацетали и кетали.
Термины "кристаллические полиморфы" или "полиморфы" относятся к существованию более чем одной кристаллической формы для соединения, его соли или сольвата. Кристаллические полиморфы соединений аналогов желчной кислоты изготовляет путем кристаллизации при разных условиях.
Термин "R-EMCA" относится к соединению ба-этил-23(R)-метилхолевой кислоты, имеющей структуру:
но4' .
Она может иметь альтернативное название ба-этил-(23R)метил За, 7а, 12а тригидрокси-5-|3-холан-24-оевая кислота
Дополнительно, соединения настоящего изобретения, например, соли соединений, могут существовать или в гидратированной или в негидратированной (безводной) форме, или в виде сольватов с другими сольватными молекулами. Неограничивающие примеры гидратов включают в себя моногидраты, дигидраты и т.д. Неограничивающие примеры сольватов включают в себя этанольные сольваты, ацетоновые сольваты и т.д.
Термин "сольваты" означает сольвентные аддитивные формы, которые содержат или стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя. Некоторые соединения имеют тенденцию
захватывать фиксированное молярное соотношение сольватных молекул в твердое кристаллическое состояние, образуя таким путем сольват. Если растворителем является вода, образуемый сольват называют гидратом, когда растворителем является спирт, образуемый сольват называют алкоголятом. Гидраты образованы комбинацией одной или больше молекул воды с одним из веществ, в которых вода сохраняет свое молекулярное состояние как Н20, и такая комбинация обладает способностью образовать один или больше гидратов.
Необходимо отметить, что в структуру некоторых из соединений изобретения включены асимметричные атомы углерода. Соответственно, подразумевается, что изомеры, являющиеся результатом такой асимметрии (например, все энантиомеры и диастереомеры), включены в объем изобретения, если не указано иначе. Такие изомеры можно получать по существу в чистой форме с помощью классических способов разделения, и путем стериохимически контролируемого синтеза. Наименование энантиомеров (R- и S-конфигурации) осуществляют согласно системе, разработанной авторами R.S. Cahn, С. Ingold и V. Prelog.
Структуры и другие соединения, рассмотренные в настоящей заявке, дополнительно включают в себя все свои атроповые изомеры. Атроповые изомеры представляют собой тип стереоизомера, в котором атомы двух изомеров имеют отличающееся пространственное расположение. Существование атроповых изомеров обусловлено ограниченным вращением, вызванным затруднением вращения больших групп вокруг центральной связи. Такие атроповые изомеры обычно существуют в виде смеси, вместе с тем в результате последних разработок хроматографических методик стало возможным в отдельных случаях разделение смеси двух атроповых изомеров.
Понятия "стабильное соединение" и "стабильная структура" предназначается для определения соединения, которое является достаточно устойчивым, чтобы выдерживать выделение из реакционной смеси до полезной степени чистоты и приготовление рецептуры эффективного терапевтического агента.
Используемый в изобретении термин "аналог" относится к химическому соединению, обладающему структурным подобием с другим соединением, который при этом немного отличается по составу (например, заменой одного атома на атом другого элемента, или присутствием конкретной функциональной группы, или заменой одной функциональной группы на другую функциональную группу). Таким образом, аналог представляет собой соединение, которое сходно или сопоставимо по функции и внешнему виду с рассматриваемым соединением.
Согласно определению изобретения, термин "производное", например, в термине "производные желчной кислоты", относится к соединениям, которые имеют общую основную 4-членную кольцевую структуру, и замещения различными группами, описанными в изобретении.
Термин "биоизостер" относится к соединению, которое получено в результате обмена атома или группы атомов на другой, в общем подобный, атом или группу атомов. Биоизостерическая замена может иметь физикохимическую или топологическую основу. Примеры биоизостеров карбоксильной кислоты включают в себя ацилсульфонимиды, тетразолы, сульфонаты и фосфонаты. См. , например, Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176 (1996).
Термин "комбинированная терапия" (или "ко-терапия") включает в себя введение соединения по изобретению и, по меньшей мере, второго агента в качестве части конкретной схемы лечения, предназначенной для обеспечения полезного эффекта от совместного действия этих терапевтических агентов (то есть, соединения по изобретению и по меньшей мере второго агента). Полезный эффект комбинации включает в себя без ограничения фармакокинетическое или фармакодинамическое совместное действие, являющееся результатом комбинации терапевтических агентов. Введение указанных терапевтических агентов в комбинации обычно проводят в определенные периоды времени (обычно минуты, часы, дни или недели, в зависимости от выбранной комбинации). Термин "комбинированная терапия" может быть предназначен, но обычно нет, чтобы подразумевать введение двух или больше из указанных терапевтических агентов в качестве
части отдельных схем монотерапии, которые случайным и произвольным образом оказались в комбинациях настоящего изобретения. Термин "Комбинированная терапия" охватывает введение указанных терапевтических агентов последовательным образом, то есть, когда каждое терапевтическое вещество вводят в разное время, а также введение указанных терапевтических агентов, или по меньшей мере двух из терапевтических агентов, по существу одновременно. По существу одновременное введение можно осуществлять, например, путем введения субъекту единственной капсулы, в которой каждый из терапевтических агентов содержится в фиксированном соотношении, или путем многократного введения одиночных капсул для каждого из терапевтических агентов. Последовательное или по существу одновременное введение каждого терапевтического агента можно осуществлять любым подходящим путем, включающим в себя без ограничения пероральные пути, внутривенные пути, внутримышечные пути и прямую абсорбцию через ткани слизистых оболочек. Терапевтические агенты можно вводить одинаковыми путями или разными путями. Например, первый терапевтический агент выбранной комбинации можно вводить путем внутривенной инъекции, тогда как другие терапевтические агенты комбинации можно вводить перорально. Альтернативно, все терапевтические агенты можно вводить, например, перорально, или все терапевтические агенты можно вводить путем внутривенной инъекции. Последовательность, в которой вводят терапевтические агенты, не имеет строгого значения.
Термин "Комбинированная терапия" также охватывает введение описанных выше терапевтических агентов в дополнительной комбинации с другими биологически активными компонентами и нелекарственными способами лечения (например, в сочетании с хирургическим или механическим лечением). Если комбинированная терапия дополнительно содержит нелекарственное лечение, можно проводить нелекарственное лечение в любое подходящее время, с условием достижения полезного эффекта от совместного действия комбинации терапевтических агентов и нелекарственного лечения. Например, в соответствующих случаях, достижение "полезного
эффекта сохраняется при смещении во времени нелекарственного лечения и введения терапевтических агентов, возможно, на периоды в днях или даже неделях.
Термины "парентеральное введение" и "вводимый
парентерально", используемые в изобретении, относятся к
способам введения, отличным от энтерального и местного
введения, и обычно относятся к инъекции и включают в себя без
ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную,
интратекальную, внутрикапсульную, внутриорбитальную,
внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную,
чрезтрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставую,
подкапсульную, субарахноидальную, внутриспинальную и
внутригрудинную инъекцию и вливание.
Термин "легочный", используемый в изобретении, относится к любой части, ткани .или органу, основной функцией которого является газовый обмен с внешней средой, например, обмен 02/СО2 в организме пациента. Термин "легочный" обычно относится к тканям дыхательных путей. Таким образом, выражение "легочное введение" относится к введению описанных в изобретении рецептур в любую часть, ткань или орган, основной функцией которого является газовый обмен с внешней средой (например, рот, нос, зев, ротоглотка, гортаноглотка, гортань, трахея, киль, бронхи, бронхиолы, альвеолы). Для целей настоящего изобретения термин "легочный" также включает в себя ткань или полость, которая связана с дыхательными путями, в частности, пазухи.
Понятие "терапевтически эффективное количество" соединения изобретения, или комбинации соединений представляет собой количество (количественную величину или концентрацию) соединения или соединений. В одном варианте осуществления при введении субъекту, который нуждается в лечении, терапевтически эффективного количества соединения происходит немедленное улучшение вызванных болезнью симптомов или улучшение после введения соединения один или больше раз. Количество соединения, которое будет введено субъекту, зависит от конкретной патологии, способа введения, совместно вводимых соединений, если таковые имеются, и особенностей субъекта, таких ''как общее
состояние здоровья, наличие других заболеваний, возраст, пол, генотип, масса тела и переносимость лекарственных препаратов. Квалифицированный специалист сможет определить подходящие дозировки в зависимости от указанных и других факторов.
Понятие "профилактически эффективное количество" означает количество (количественную величину или концентрацию) соединения настоящего изобретения, или комбинации соединений, предназначенных ¦ для введения с целью профилактики или уменьшения заболевания, другими словами, количество, необходимое для обеспечения превентивного или профилактического эффекта. Количество соединения, которое будет введено субъекту, зависит от конкретной патологии, пути введения, совместно вводимых соединений, если таковые имеются, и особенностей субъекта, таких как общее состояние здоровья, наличие других заболеваний, возраст, пол, генотип, масса тела и переносимость лекарственных препаратов. Квалифицированный специалист сможет определить подходящие дозировки в зависимости от указанных и других факторов.
Понятие "уменьшение риска", используемое в изобретении,
означает снижение возможности или вероятности возникновения у
пациента заболевания центральной нервной системы,
воспалительного заболевания и/или метаболического заболевания, в особенности если пациент или субъект предрасположены к такому возникновению.
"Фармацевтически приемлемая соль" или "соль" соединения по изобретению представляет собой продукт соединения, который несет ионную связь, и обычно приготовляется путем реакции соединения или с кислотой или с основанием, подходящими для введения субъекту.
Используемый в изобретении термин "фармацевтически приемлемые соли" относятся к производным соединений по изобретению, в которых исходное соединение модифицировано путем получения его кислоты или основных солей. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают в себя без ограничения соли минеральных или органических кислот из остатков оснований, например, амины; щелочные или органические
соли кислотных остатков, например, карбоновые кислоты; и тому
подобное. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя
общепринятые нетоксичные соли исходного соединения или соли
четвертичного аммония, которые образованы, например, из
нетоксичных неорганических или органических кислот. Например,
такие общепринятые нетоксичные соли включают в себя без
ограничения соли, полученные из неорганических и органических
кислот, выбираемых из 2-ацетоксибензойной, 2-
гидроксиэтансульфоновой, уксусной, аскорбиновой,
бензолсульфоновой, бензойной, бикарбоновой, карбоновой,
лимонной, этилендиаминтетрауксусной, этандисульфоновой,
этансульфоновой, фумаровой, глюкогептоновой, глюконовой,
глутаминовой, гликолевой, гликольарсаниловой,
гексилрезорциновой, гидрабамовой, бромистоводородной,
хлористоводородной, йодистоводородной, гидроксималеиновой,
гидроксинафтойной, изотионовой, молочной, лактобионовой,
лаурилсульфоновой, малеиновой, яблочной, миндальной,
метансульфоновой, напсиловой, азотной, щавелевой, памовой, пантотеновой, фенилуксусной, фосфорной, полигалактуроновой, пропионовой, салициловой, стеариновой, субацетиловой, янтарной, сульфамовой, сульфаниловой, серной, дубильной, винной и толуолсульфоновой кислот.
Фармацевтически приемлемые соли настоящего изобретения можно синтезировать общепринятыми химическими способами из исходного соединения, которое содержит основной или кислый функциональный остаток. В общем, такие соли можно получать путем реакции свободных кислотных или основных форм указанных соединений со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе, или в смеси воды и органического растворителя; в общем, предпочтительными являются неводные среды, такие как эфир, этилацетат, этанол, изопропиловый спирт или ацетонитрил. Перечень подходящих солей опубликован в 18-ом издании Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA, p. 1445 (1990) .
Понятие "фармацевтически приемлемое" '" является
общепризнанным в данной области техники. В определенных вариантах осуществления термин включает в себя соединения, полимеры и другие материалы и/или лекарственные формы, которые, подходят в рамках по результатам тщательной клинической оценки для применения в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соизмеряемого с разумным соотношением пользы/риска.
Понятие "фармацевтически приемлемый носитель" общепризнано в данной области техники и включает в себя, например, фармацевтически приемлемые материалы, композиции или носители, такие как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующий в переносе или транспорте какой-либо рассматриваемой композиции от одного органа или части тела, в другой орган или часть тела. Каждый носитель должен быть "приемлемым" в плане совместимости с другими компонентами рассматриваемого соединения и не наносить вред пациенту. В определенных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель является неапирогенным. Некоторые примеры материалов, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают в себя: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлозу и ее производные, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетатцеллюлоза;
(4) порошок трагаканта; (5) солод; (б) желатин; (7) тальк; (8) эксципиенты, такие как масло какао и воски для суппозиториев;
(9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбитол, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновую кислоту; (16) апирогенную воду; (17) изотонический солевой раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спйрт; (20)
фосфатно-буферные растворы; и (21) другие нетоксичные совместимые субстанции, применяемые в фармацевтических рецептурах.
"Композиция" или "фармацевтически приемлемая композиция"
представляет собой рецептуру, содержащую соединение по
изобретению или его соль, сольват, гидрат или пролекарство. В
одном варианте осуществления фармацевтическая композиция не
расфасована или находится в монолитной лекарственной форме.
Монолитная лекарственная форма представляет собой какую-либо из
множества форм, включающих в себя, например, капсулы,
внутривенный (в/в) болюс, таблетки, одиночную помпу на
аэрозольном ингаляторе или флакон. Количество активного
компонента (например, рецептуры соединения по изобретения или
его солей) в монолитной дозе соединения является эффективным
количеством и варьирует в соответствии с конкретным применяемым
лечением. Специалисту в данной области техники будет очевидно,
что иногда необходимо осуществлять обычные изменения дозы в
зависимости от возраста и состояния пациента. Доза также будет
зависеть от пути введения. Рассматривается ряд путей введения,
включающих в себя пероральный, легочный, ректальный,
парентеральный, чрескожный, подкожный, внутривенный,
внутримышечный, внутрибрюшинный, внутриносовой и тому подобное. Лекарственные формы для местного или чрескожного введения соединения настоящего изобретения включают в себя порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляционные формы. В другом варианте осуществления в стерильных условиях действующее соединение смешивают с фармацевтически приемлемым носителем, и с любыми необходимыми консервантами, буферами или пропеллентами.
Термин "флэш-доза" относится к рецептурам соединения, которые представляют собой быстро диспергируемые лекарственные формы.
Термин "немедленное высвобождение" подразумевает высвобождение соединения из лекарственной формы за относительно короткий промежуток времени, обычно до 60 минут. Термин "модифицированное высвобождение" включает в себя отсроченное
высвобождение, продолжительное высвобождение и импульсное высвобождение. Термин "импульсное высвобождение" подразумевает высвобождение препарата из лекарственной формы сериями. Термин "длительное высвобождение" или "продолжительное высвобождение" обозначает непрерывное высвобождение соединения из лекарственной формы за длительный период.
Понятие "субъект" включает в себя млекопитающих, например, людей, домашних животных (например, собаки, кошки, птицы и т.п.), сельскохозяйственных животных (например, коровы, овцы, свиньи, лошади, домашняя птица и т.п.) и лабораторных животных
(например, крысы, мыши, морские свинки, птицы и т.п.). Обычно субъектом является человек.
Соединения настоящего изобретения также включают в себя пролекарства или физиологически эквивалентные производные. Термины "пролекарство" или "физиологически эквивалентное производное" включают в себя прекурсорную форму препарата, метаболическое превращение которой in vivo приводит к получению активного препарата. Изобретение дополнительно рассматривает применение пролекарств, которые in vivo превращаются в TGR5-модулирующие соединения, используемые в способах изобретения
(см., например, R. В. Silverman, 1992, "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", Academic Press, Chp. 88). Такие пролекарства можно применять для влияния на биораспределение (например, чтобы соединения, которые обычно не проходят через гематоэнцефалический барьер, получили возможность проходить через гематоэнцефалический барьер), или фармакокинетику соединения, модулирующего TGR5. Например, анионную группу, такую как карбоксилат, сульфат или сульфонат, можно этерифицировать, например, с помощью алкильной группы
(например, метильной группой) или фенильной группы, для
получения сложного эфира. При введении сложного эфира субъекту
происходит ферментативное или неферментативное,
восстановительное или гидролитическое расщепление сложного эфира для выявления анионной группы. Такой слоэжный эфир может быть циклическим, например, циклическим сульфатом или сульфоном, или два или больше анионных остатка могут быть
этерифицированы посредством связывающей группы. Анионную группу можно этерифицировать с функциональными остатками (например, ацилоксиметиловыми сложными эфирами), которые расщепляются для выявления промежуточного соединения, модулирующего TGR5, которое впоследствии разлагается для получения активного соединения, модулирующего TGR5. В одном варианте осуществления пролекарство представляет собой восстановленную форму карбоксилата, сульфата или сульфоната, например, спирт или тиол, который окисляется in vivo до соединения, модулирующего TGR5. Кроме того, анионная функциональная группа может быть этерифицирована до группы, которая in vivo активно переносится или селективно захватывается в органах-мишенях.
Используемый в настоящем изобретении термин
"аминокислотные конъюгаты" относится к конъгатам соединений по изобретению с любой подходящей аминокислотой. Примерами аминокислотных конъгатов являются таурин (NH(СН2) 2S03H) и глицин (NHCH2C02H) . Подходящие аминокислотные конъюгаты соединений, имеют дополнительное преимущество улучшенной целостности в желчи или жидкостях кишечника. Подходящие аминокислоты не ограничены таурином и глицином. Изобретение охватывает аминокислотные конъюгаты соединений по изобретению. Более конкретно, изобретение включает в себя аминокислотные конъюгаты соединения Ih3e. Еще более конкретно, изобретение включает в себя тауриновый и глициновый конъюгаты соединения Ih3e.
Термин "соединения по изобретению" относится к соединениям с формулами, описанными в изобретении.
Термин "TGR5 модулятор" означает любое соединение, которое взаимодействует с рецептором TGR5. Взаимодействие не ограничено действием соединения в качестве антагониста, агониста, частичного агониста или обратного агониста рецептора TGR5. В одном аспекте соединения настоящего изобретения действуют как антагонисты рецептора TGR5. В другом аспекте соединения настоящего изобретения действуют как агонисты рецептора TGR5. В другом аспекте соединения настоящего изобретения действуют как частичные агонисты рецептора TGR5. В другом аспекте соединения настоящего изобретения действуют как обратные ' агонисты
рецептора TGR5. Обычно профиль лиганда, эндогенного или
синтетического, отличается своей собственной эффективностью
'е', описанной впервые автором Furchgott в 1966 году. Это
понятие используют для выражения степени выработки варьирующих
биологических ответов у разных лигандов, которые задействуют
при этом одинаковое количество рецепторов. В общем, термин
"агонист" означает соединение, которое повышает активность
другой молекулы или рецепторного участка. По классическому
определению, агонист, который может быть ортостерическим,
аллостерическим, обратным или ко-агонистом, обладает свойством
связываться с рецептором, изменять состояние рецептора и в
результате производить биологическое действие. Следовательно,
агонизм определяют как свойство агониста или лиганда
производить биологическое действие. В отличие .от этого
"антагонист" является по существу агонистом с высокой
аффинностью к той же рецепторной макромолекуле, но с намного
меньшей или незначительной собственной эффективностью, и тем
самым стерически предотвращает биологические действия агониста.
В плане свойств, антагонизм может быть функциональным или
физиологическим, когда агонист непосредственно конкурирует за
рецепторный участок с вышеупомянутыми и противоположными
эффектами посредством отличающейся системы рецептор-мессенджер
в последнем случае. Более конкретно, агонист TGR5 представляет
собой рецепторный лиганд или соединение, которое связывается с
TGR5 и повышает по меньшей мере на 2 0% концентрацию
циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в клетках,
экспрессирующих рецептор. Напротив, антагонист TGR5
представляет собой соединение, которое антагонизирует или блокирует действие агониста, и таким образом вызывает снижение концентрации цАМФ.
Настоящее изобретение относится к соединениям, обладающим действием модуляции рецептора TGR5, и к их применению для лечения и/или профилактики различных болезней, включающих в себя метаболическое заболевание, воспалительное заболевание, болезнь печени, аутоиммунное заболевание, болезнь сердца, болезнь почек, рак и болезнь желудочнокишечногб тракта.
Дополнительно, настоящее изобретение относится к соединениями с описанными в нем формулами.
Соединения и композиции
В одном аспекте изобретение относится к соединению формулы
или к его соли, сольвату, гидрату или пролекарству, в котором: Ri представляет собой водород, гидрокси, замещенный или незамещенный алкил или галоген; R2 представляет собой водород или а-гидрокси; R3 представляет собой водород, гидрокси, NH(CH2)mS03H или NH (СН2) nC02H; R4 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил или галоген; R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил или арил; R6 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером в 3, 4, 5 или 6 атомов; R7 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил или гидрокси; R8 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил; R9 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, или взятые вместе R8 и R9 образуют карбонил; R10 является R3 или S03H; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5. В одном аспекте, если R5 является метилом, Ri является гидроксилом, и R3 представляет собой гидроксил или NHCH2CH2S03H, в этом случае R4 не является водородом.
В одном аспекте изобретения Rx представляет собой водород или гидрокси. Ri представляет собой гидрокси. Ri является водородом. R2 является а-гидрокси. Ri является гидрокси, и R2 является а-гидрокси. Rx представляет собой гидрокси, и R2 представляет собой Н. Ri является гидрокси, и R2 является Н. По
меньшей мере один из Ri или R2 представляет собой гидрокси. По меньшей мере один из Rx или R2 представляет собой водород. Rx и R2 являются одинаковыми. Каждый из Ri и R2 представляет собой а-гидрокси. Каждый из Ri и R2 представляет собой водород.
В другом аспекте изобретения R10 представляет собой R3. R3 представляет собой гидроксил, NH (СН2) mS03H, или NH (СН2) пС02Н. R3 является гидроксил'. R3 не является гидроксилом. R3 представляет собой NH (СН2) mS03H. R3 представляет собой NH (СН2) mS03H, и m равен 2. R3 представляет собой NH (СН2) пС02Н. R3 представляет собой NH(CH2)nC02H, и п равен 1.
В другом аспекте изобретения R4 представляет собой водород или незамещенный алкил. R4 является водородом. R4 является незамещенным алкилом. R4 является незамещенным алкилом. R4 представляет собой метил или этил. R4 представляет собой метил. R4 представляет собой этил. R3 и R4 являются одинаковыми. R3 и R4 различны. Каждый из R3 и R4 представляет собой водород. R3 является гидроксилом, и R4 является водородом. R3 представляет собой NH (СН2) mS03H, и R4 представляет собой водород. R3 представляет собой NH(СН2) mS03H, R4 является водородом, и m равен 2. R3 представляет собой NH (СН2) пС02Н, и R4 является водородом. R3 представляет собой NH(СН2) nC02H, R4 является водородом, и п равен 1. R3 представляет собой Н, и R4 представляет собой незамещенный алкил. R3 представляет собой ОН, и R4 является метилом. R3 представляет собой ОН, и R4 является этилом. R3 представляет собой ОН, и R4 является метилом.
В другом аспекте R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил. R5 находится в S-конфигурации. R5 находится в R-конфигурации. R5 представляет собой метил или этил. R5 представляет собой S-метил. R5 представляет собой R-метил. R5 представляет собой S-этил. R5 представляет собой R-этил. R5 является замещенным алкилом, замещенным фенилом. R5 представляет собой бензил. R5 представляет собой S-бензил. R5 представляет собой R-бензил. Rs является арилом. R5 является фенилом. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил,
в котором R5 находится в S-конфигурации, и R4 находится в альфа-конфигурации. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, и Ri является гидрокси. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, и R2 является водородом. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, Ri является гидрокси, и R2 является водородом.
В одном аспекте изобретения Ri( R2, R3 и R4 представляют собой водород. R2, R3 и R4 представляют собой водород. R2 и R3 являются водородом. По меньшей мере один из Ri, R2, R3 или R4 является водородом. По меньшей мере два из Ri, R2, R3 или R4 представляют собой водород. По меньшей мере три из Ri, R2, R3 или R4 представляют собой водород. По меньшей мере четыре из Ri, R2, R3 или R4 представляют собой водород.
В одном аспекте изобретения Ri; R2 и R4 представляют собой водород, и R3 является ОН. R2 и R4 представляют собой водород, и R3 является ОН. R2 представляет собой водород, и R3 является ОН. По меньшей мере один из Ri, R2 или R4 представляют собой водород, и R3 является ОН. По меньшей мере два из Ri, R2 или R4 представляют собой водород, и R3 является ОН. R1# R2 и R4 представляют собой водород, и R3 является ОН.
В другом аспекте изобретения, по меньшей мере одним из Ri или R7 является незамещенный алкил. По меньшей мере один из Ri или R7 представляет собой метил. По меньшей мере один из Ri или R7 представляет собой этил. По меньшей мере одним из R± или R7 является пропил. Ri является метилом. Ri является этилом. Rx является пропилом. R7 является метилом. R7 является этилом. R7 является пропилом. Оба из Ri и R7 представляют собой незамещенный алкил. Оба из Rx и R7 представляют собой метил. Оба из R± и R7 представляют собой этил. R7 является водородом. R7 является гидрокси. R± является водородом. Ri является гидроксилом. Одним из Ri или R7 является незамещенный алкил, и другим Ri или R7 является водород. Одним из Rx или R7 является незамещенный алкил, и другим R1 или R7 является гидрокси. По меньшей мере одним из Rx или R7 является незамещенный алкил, и R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил. По меньшей мере один из Rx или R7 представляет собой мётил, и R5
является метилом. R7 представляет собой гидрокси, и оба из Rx и R5 представляют собой незамещенный алкил. Rx является гидроксилом, и оба из R7 и R5 представляют собой незамещенный алкил. По меньшей мере одним из Rx или R7 является незамещенный алкил, и R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, дополнительно в котором R5 находится в S-конфигурации. По меньшей мере одним из Rx или R7 является незамещенный алкил, и R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, дополнительно в котором R5 находится в R-конфигурации.
В другом аспекте Rx представляет собой гидрокси, и R7 является метилом. Rx является метилом, и R7 является гидрокси. R6 представляет собой незамещенный алкил. R6 является метилом. R6 представляет собой этил. R6 представляет собой пропил. В другом аспекте R8 является водородом. R8 представляет собой незамещенный алкил. R8 является метилом. R8 является этилом. R8 представляет собой пропил. R2 представляет собой а-гидрокси, и R8 является незамещенным алкилом. В другом аспекте R8 и R9 образуют карбонил.
В одном аспекте Rxo представляет собой R3. R3 является гидроксилом. По меньшей мере одним из R8 или R9 является водород. Оба из R8 и R9 представляют собой водород. По меньшей мере одним из R8 или R9 является незамещенный алкил. По меньшей мере один из R8 или R9 представляет собой метил. По меньшей мере один из R8 или R9 представляет собой этил. В другом аспекте Rx0 представляет собой S03H.
В другом аспекте настоящего изобретения, если каждый из R2, R4 и R6 представляет собой водород, R3 является гидроксилом, и один из Rx и R7 представляет собой водород или гидроксил, в этом случае другие Rx или R7 не являются метилом. В другом аспекте, если R2 представляет собой а-ОН; R3 является гидроксилом; каждый из R4 и R6 представляет собой водород; и один из Rx и R7 представляет собой водород или гидроксил, тогда другие Rx или R7 не являются метилом. В другом аспекте в настоящее изобретение не включены следующие соединения: За,7а-дигидрокси-7[3-метил-5|3-холаноевая кислота, За, 7(Ь-дигидрокси-7а-метил - 5(3-холаноевая кислота, За -гидрокси- 7 е - метил - 5|3-холаноевая
кислота, За, 7(5, 12а-тригидрокси-7а-метил-5(5-холан-24-оевая
кислота; За, 7а, 12а-тригидрокси-7(5-метил-5(5-холан-24-оевая
кислота; и За, 12а-дигидрокси-7е-метил-5(5-холан-24-оевая
кислота.
В другом аспекте настоящего изобретения, если R3 представляет собой гидроксил и один из Ri и R7 является метилом и другие Ri и R7 представляют собой водород или гидроксил, в этом случае не все из R2, R4 и R6 представляют собой водород. В другом аспекте, если R2 представляет собой а-ОН, R3 является гидроксилом, и один из Ri и R7 является метилом, и другие Ri и R7 представляют собой водород или гидроксил, в этом случае не все из R4 и R6 представляют собой водород.
Согласно одному аспекту, настоящее изобретение относится к соединению формулы I:
или к его соли, сольвату, гидрату или пролекарству, в котором: Ri представляет собой водород, гидрокси, или галоген; R2 является водородом или а-гидрокси; R3 представляет собой гидрокси, NH (СН2) raS03H, или NH (СН2) пС02Н; R4 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или галоген; R5 представляют собой незамещенный или замещенный алкил, или арил; R6 является водородом, или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером в 3, 4, 5 или б атомов; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5, и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5. В одном аспекте, если R5 является метилом, R± является гидроксилом, и R3 представляет собой гидроксил или NHCH2CH2S03H, в этом случае R4 не является водородом.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к
соединениям, в которых Rx представляет собой водород или гидрокси. Ri является гидрокси. Ri является водородом. Rx является а-гидрокси. Rx является [3-гидрокси.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям, в которых Ri представляет собой галоген. Rx является фтором. Rx является а-фтором. Rx является [3-фтором. Стереохимия Ri в а- и (3- конфигурациях показана ниже:
Ri альфа (а-) конфигурация Ri бета ((3-) конфигурация
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям, в которых R2 представляет собой а-гидрокси. R2 является водородом. R1 представляет собой |3-гидрокси, и R2 представляет собой а-гидрокси. Ri представляет собой (3-гидрокси, и R2 является Н. R1 представляет собой а-гидрокси, и R2 является Н.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям, в которых по меньшей мере один из Ri или R2 является гидрокси. В другом аспекте, по меньшей мере одним из Ri или R2 является водородом. Rx и R2 одинаковы. Каждый из Ri и R2 представляет собой а-гидрокси. Каждый из Ri и R2 представляет собой водород.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям, в которых R3 представляет собой водород, гидроксил, NH(CH2)mS03H или NH (CH2)nC02H. R3 является гидроксилом. R3 не является гидроксилом. R3 представляет собой NH (СН2) mS03H. В другом аспекте R3 представляет собой NH (СН2) mS03H, и m равен 2. R3 представляет собой NH (СН2) пС02Н. В другом аспекте R3 представляет собой NH(СН2) пС02Н, и п равен 1.
В другом аспекте R4 представляет собой водород или алкил. R4 является водородом. R4 является низшим алкилом. R4 является низшим алкилом, и группа низшего алкила находится в альфа-конфигурации. R4 находится в альфа-конфигурации, что, означает
стереохимическую структуру R4, показанную ниже.
R4 альфа (а-) конфигурация
В другом аспекте R4 является галогеном. R4 является фтором. R4 является галогеном, и галоген находится в альфа-конфигурации. R4 представляет собой а-фтор.
В другом аспекте R4 представляет собой метил или этил. R4 является метилом. R4 является этилом. R4 представляет собой а-метил. R4 представляет собой а-этил. R3 и R4 одинаковы. R3 и R4 различны. Каждый из R3 и R4 представляет собой водород. R3 представляет собой NH(СН2) mS03H, и R4 является водородом. R3 является гидроксилом, и R4 является водородом. В другом аспекте R3 представляет собой NH(СН2) mS03H, R4 является водородом, и m равен 2. R3 представляет собой NH (СН2) пС02Н, и R4 является водородом. В другом аспекте R3 представляет собой NH(СН2) пС02Н, R4 является водородом, и п равен 1.
В другом аспекте R3 представляет собой ОН, и R4 является алкилом. R3 представляет собой ОН, и R4 является низшим алкилом. Низший алкил находится в альфа-конфигурации. R3 представляет собой ОН, и R4 является метилом. R3 представляет собой ОН, и R4 является этил. R3 представляет собой ОН, и R4 представляет собой а-метил. R3 представляет собой ОН, и R4 представляет собой а-этил.
В другом аспекте R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил. R5 представляет собой незамещенный или замещенный низший алкил. R5 находится в S-конфигурации. R5 находится в R-конфигурации. R5 представляет собой метил или этил. R5 представляет собой S-метил. R является метилом. R5 представляет собой S-этил. R является этилом. R5 представляет собой алкил, замещенный фенилом. R5 представляет собой низший алкил, замещенный фенилом. R5 является бензилом. R5 является S-бензилом. R5 является R-бензил.
В другом аспекте R5 представляет собой арил. R5 представляет собой фенил.
В другом аспекте каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил. Каждый из R4 и R5 представляет собой низший незамещенный алкил. Каждый из R4 и R5 представляет собой низший незамещенный алкил, и Rs находится в S-конфигурации. Каждый из R4 и R5 представляет собой низший незамещенный алкил, и R4 находится в альфа-конфигурации. В. другом аспекте R4 и R5 не являются водородом.
В другом аспекте каждый из R4 и R5 представляет собой низший незамещенный алкил, и Rx является а-гидрокси. Каждый из R4 и R5 представляет собой низший незамещенный алкил, и R2 является водородом. Каждый из R4 и R5 представляет собой низший незамещенный алкил, Rx является а-гидрокси, и R2 является водородом.
В другом аспекте, R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером в 3, 4, 5 или 6 атомов. R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют 3-членное кольцо. Ниже представлена стереохимия 3-членного кольца:
3-членное кольцо имеет следующую стереохимию:
R2 Г \f C0R3
В другом аспекте Ri, R2, R3 и R4 представляют собой водород. R2, R3 и R4 представляют собой водород. R2 и R3 представляют собой водород. В другом аспекте Ri, R2 и R4 представляет собой водород, и R3 является ОН. R2 и R4 представляет собой водород, и R3 является ОН. R2 является водородом, и R3 является ОН.
В другом аспекте, по меньшей мере однин из Ri; R2, R3 или
R4 представляет собой водород. В другом аспекте по меньшей мере два из Ri, R2, R3 или R4 представляют собой водород. В другом аспекте по меньшей мере три из Ri, R2/ R3 или R4 представляют собой водород. В другом аспекте Ri, R2, R3 и R4 являются водородом. В другом аспекте, по меньшей мере один из Ri, R2 или R4 представляет собой водород, и R3 является ОН. В другом аспекте по меньшей мере два из Ri, R2 или R4 представляют собой водород, и R3 является ОН. В другом аспекте Ri, R2 и R4 представляют собой водород, и R3 представляет собой ОН. В другом аспекте в настоящее изобретение не включены случаи, когда R5 представляет собой метил, R4 представляет собой водород, и R2 представляет собой Н или ОН.
В другом аспекте настоящего изобретения соединение выбирают из следующих соединений:
la, lb, Ic, Ig, Ih, Ii, Io, Ip, Iq, Ial, Ibl, Icl, Igl, Ihl, Iil, 111, Iml, Inl, Iol, Ipl, Iql, Ia2, Ib2, Ic2, Id2, Ie2,1С, Ig2, Ih2, Ii2,112, Im2, In2, Io2, Ip2, Iq2, Ia3, Ib3, Ic3, Id3, Ie3, Ю, Ig3, Ih3, Ii3,113, Im3, In3, Ia4, Ib4, Ic4, Id4, Ie4, If4, Ig4, Ih4, Ii4,114, Im4, In4, Ia5, Ib5, Ic5, Id5, Ie5, If5, Ig5, Ih5, Ii5,115, Im5, In5, Ib3e, Ic3e, Id3e, Ie3e, If3e,Ig3e, Ih3e, Ii3e,
I13e, Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Id4e, Ie4e, If4e, Ig4e, Ih4e, Ii4e, I14e, Im4e, In4e, Ia5e, Ib5e, Ic5e, Id5e, Ie5e, If5e, Ig5e, Ih5e, Ii5e, I15e, Im5e, Io5, Ip5, Iq5, and Ir5.
В другом аспекте настоящего изобретения соединение не выбирают из соединений Id, Ie, If, Idl, II, Im и In. В другом аспекте состав не выбирают из Iel и Ifl.
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, в котором Rx является водородом, гидрокси, или галогеном; R2
В другом аспекте в настоящее изобретение включена композиция или лекарство, содержащее соединение формулы I:
представляет собой водород или а-гидрокси; R3 представляет собой гидрокси, NH (СН2) raS03H или NH (СН2) nC02H; R4 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или галоген; R5 представляет собой незамещенный или замещенный низший алкил, или арил; R6 является водородом или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером 3, 4, 5 или 6 атомов; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5. В другом аспекте настоящее изобретение включает в себя композицию или лекарство, содержащее соединение формулы I, с условием, что, если R5 представляет собой метил, Rx является гидроксилом и R3 является гидрокси или NHCH2CH2S03H, в этом случае R4 не является водородом.
Другой аспект изобретения включает в себя соединение Формулы IA:
(IA)
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором: Ri представляет собой водород, гидрокси, замещенный или незамещенный алкил, или галоген; R2 представляет собой водород или а-гидрокси; R3 представляет собой гидрокси, водород, NH(CH2)mS03H или NH (СН2) nC02H; R4 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, или галоген; R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, или арил; R6 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером 3, 4, 5 или 6 атомов; R7 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, или гидрокси; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5. В одном аспекте, если R5 представляет собой метил, Ri является гидроксилом и R3
является гидрокси или NHCH2CH2S03H, в этом случае R4 не является водородом. В одном аспекте Rx представляет собой водород или гидрокси. Ri представляет собой гидрокси. Ri является водородом. Ri представляет собой гидрокси, и R2 представляет собой а-гидрокси. Ri является гидрокси, и R2 является Н. Ri представляет собой гидрокси, и R2 является Н. По меньшей мере один из Ri или R2 представляет собой гидрокси. По меньшей мере один из Ri или R2 представляет собой водород. Ri и R2 одинаковы. Ri является гидроксилом, и R2 представляет собой а-гидрокси. Каждый из Ri и R2 представляет собой водород.
В одном аспекте R3 представляет собой водород, гидрокси, NH(CH2)mS03H или NH (СН2) nC02H. R3 является гидрокси. R3 не является гидрокси. R3 представляет собой NH(СН2) mS03H. R3 представляет собой NH (СН2) mS03H, и m равен 2. R3 представляет собой NH (СН2) пС02Н. R3 представляет собой NH (СН2) пС02Н, и п равен 1.
В другом аспекте R4 является водородом или незамещенным алкилом. R4 является водородом. R4 представляет собой незамещенный алкил. R4 представляет собой незамещенный алкил. R4 представляет собой метил или этил. R4 является метилом. R4 является этилом. R3 и R4 одинаковы. R3 и R4 различны. Каждый из R3 и R4 представляет собой водород. R3 представляет собой ОН, и R4 является водородом.
В другом аспекте R3 представляет собой NH (СН2) mS03H, и R4 является водородом. R3 представляет собой NH(СН2) mS03H, R4 является водородом и m равен 2. R3 представляет собой NH (СН2) пС02Н, и R4 является водородом. R3 представляет собой NH (СН2) пС02Н, R4 является водородом, и п равен 1. R3 представляет собой ОН, и R4 является незамещенным алкилом. R3 представляет собой ОН, и R4 является незамещенным алкилом. R3 представляет собой ОН, и R4 является метилом. R3 представляет собой ОН, и R4 является этилом. R3 представляет собой ОН, и R4 является метилом.
В одном аспекте R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил. R5 находится в S-конфигурации. R5 находится в R-конфигурации. R5 представляет собой метил или 'этил. R5
представляет собой S-метил. R5 является R-метилом. R5 является S-этилом. R5 является R-этилом. R5 замещен фенилом. R5 представляет собой бензил. R5 представляет собой S-бензил. R5 является R-бензилом. В другом аспекте R5 является арилом. Например, R5 представляет собой фенил.
Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил. каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, дополнительно в котором R5 находится в S-конфигурации. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, и Ri является гидрокси. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, и R2 является водородом. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, Rx является гидрокси и R2 является водородом. В одном аспекте Ri, R2, R3 и R4 представляют собой водород. R2, R3 и R4 представляют собой водород. R2 и R3 являются водородом. По меньшей мере один из Rlt R2, R3 или R4 представляет собой водород. По меньшей мере два из Ri, R2, R3 или R4 представляют собой водород. По меньшей мере три из R1# R2, R3 или R4 представляют собой водород. Ri, R2, R3, и R4 являются водородом.
В одном аспекте Ri, R2 и R4 представляют собой водород, и R3 является ОН. R2 и R4 являются водородом, и R3 представляет собой ОН. R2 является водородом, и R3 представляет собой ОН. По меньшей мере один из Rlt R2 или R4 представляет собой водород, и R3 является ОН. По меньшей мере два из Ri, R2 или R4 представляют собой водород, и R3 представляет собой ОН. Все из Ri, R2 и R4 являются водородом, и R3 представляет собой ОН.
В другом аспекте по меньшей мере одним из Ri или R7 является незамещенный алкил. По меньшей мере одним из Rx или R7 является метил. По меньшей мере одним из R± или R7 является этил. По меньшей мере одним из Rx или R7 является пропил. Оба из Ri и R7 представляют собой незамещенные алкилы. Оба из Ri и R7 являются метилами. Оба из Ri и R7 являются этилами. Rx и R7 одинаковы. Ri и R7 различны. R7 представляет собой водород. R7 представляет собой гидрокси. Одним из Ri или R7 является незамещенный алкил и остальные Rx или R7 являются водородом.
Один из Ri или R7 представляет собой незамещенный алкил, и остальные Ri или R7 являются гидрокси. По меньшей мере одним из Rx или R7 является незамещенный алкил, и R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил. По меньшей мере один из Ri или R7 представляет собой метил, и R5 представляет собой метил.
Оба из Ri и R5 являются незамещенными алкилами, и R7 представляет собой гидрокси. Оба из R7 и R5 представляют собой незамещенные алкилы, и Rx является гидрокси. Ri или R7 представляют собой незамещенный алкил, и R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, дополнительно при этом R5 находится в S-конфигурации. Rx или R7 представляют собой незамещенный алкил, и R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, дополнительно при этом R5 находится в R-конфигурации.
В другом аспекте Rx является гидрокси, и R7 представляет собой метил. Rx является метилом, и R7 представляет собой гидрокси. R6 представляет собой незамещенный алкил. R6 является метилом. R6 является этилом. Каждый из R2 и Rg представляет собой водород. R2 и R6 представляют собой водород, и R5 является незамещенным алкилом. R2 и R6 являются водородом, R5 представляет собой незамещенный алкил, и по меньшей мере один из Rx или R7 является незамещенным алкилом.
В одном аспекте соединение выбирают из Соединений:
Ia6, Ib6, Ic6, Ig6, Ih6, Ii6,
Io6, Ip6, Iq6, Ia7, Ib7, Ic7, Ig7, Ih7, Ii7,117, Im7, In7, Io7, Ip7, Iq7, Ia8, Ib8, Ic8, Id8, Ie8, If8, Ig8, Ih8, Ii8,118, Im8, In8, Io8, Ip8, Iq8, Ia9, Ib9, Ic9, Id9, Ie9, И9, Ig9, Ih9, Ii9, 119, Im9, In9, IalO, 1Ы0, IclO, IdlO, IelO, IflO, IglO, IhlO, IilO, 1110, ImlO, InlO, Iall, Ibll, Icll, Idll,Iell, 1П1, Igll, Ihll, Iill, 1111, Imll, Inll, Ia9e, Ib9e, Ic9e, Id9e, Ie9e, If9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, I19e, Im9e, In9e, IalOe, IblOe, IclOe, IdlOe, IelOe, IflOe, IglOe, IhlOe, IilOe, IllOe, ImlOe, InlOe, Ialle, ТЫ U, Idle, Id lie. Telle, Iflle, Iglle, Ihlle, Iille, Illle, Imlle и Inlle
В другом аспекте настоящего изобретения, если каждый из R2, R4 и R6 является водородом, R3 является гидроксилом, и один из Rx и R7 представляет собой водород или гидроксил, в этом случае другой Rx или R7 не является метилом. В другом аспекте,
если R2 является а-ОН; R3 является гидроксилом; каждый из R4 и R6 является водородом; и один из Ri и R7 представляет собой водород или гидроксил, в этом случае другой Rx или R7 не является метилом. В другом аспекте в настоящее изобретение не включены следующие соединения: За, 7а-дигидрокси-7(3-метил-5(3-холаноевая кислота, За, 7(3-дигидрокси-7а-метил-5(3-холаноевая кислота, За-гидрокси-7г-метил-5|3-холаноевая кислота, За, 7(3, 12а-тригидрокси-7а-метил-5(3-холан-24-оевая кислота; За, 7а, 12а-тригидрокси-7[3-метил-5(3-холан-24-оевая кислота; и За, 12а-дигидрокси- 7 е -метил - 5(3-холан- 24 -оевая кислота .
В другом аспекте настоящего изобретения, если R3 является гидроксилом и один из Rx и R7 является метилом, и другие Ri и R7 представляют собой водород или гидроксил, в этом случае не все из R2, R4 и R6 являются водородом. В другом аспекте, если R2 представляет собой а-ОН, R3 является гидроксилом, и один из Ri и R7 является метилом и другие Ri и R7 представляют собой водород или гидроксил, в этом случае R4 и R6 не являются водородом.
Другой аспект изобретения включает в себя композицию или лекарство, содержащее соединение формулы IA:
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, в котором: Rx представляет собой водород, гидрокси, замещенный или незамещенный алкил или галоген; R2 представляет собой водород или а-гидрокси; R3 представляет собой гидрокси, NH(CH2)mS03H или NH (СН2) nC02H; R4 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, или галоген; R5 является незамещенным или замещенным алкилом, или арилом; R6 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они
присоединены, образуют кольцо размером в 3, 4, 5 или б атомов; R7 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, или гидрокси; и m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
В одном аспекте изобретения, если R5 является метилом, Ri является гидроксилом, и R3 представляет собой гидроксил или NHCH2CH2S03H, в этом случае R4 не является водородом.
В другом аспекте в настоящее изобретение включено соединение формулы II:
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором: Rx представляет собой водород, гидрокси, замещенный или незамещенный алкил, или галоген; R2 представляет собой водород или а-гидрокси; R4 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, или галоген; R5 является незамещенным или замещенным алкилом, или арилом; R6 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером в 3, 4, 5 или б атомов; R7 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, или гидрокси; и R8 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил. В одном аспекте, если R5 является метилом и R± является гидроксилом, в этом случае R4 не является водородом.
В одном аспекте R1 представляет собой водород или гидрокси. Rx является гидрокси. R± является водородом. Ri является (3-гидрокси. R2 является а-гидрокси. Ri является гидрокси и R2 является а-гидрокси. Ri является гидрокси, и R2 является Н. По меньшей мере один из Ri или R2 представляет собой гидрокси. По меньшей мере один из Ri или R2 является водородом. Rx и R2 одинаковы. Rx является гидроксилом, и R2 является а
гидрокси. Каждый из Rx и R2 представляет собой водород.
В другом аспекте R4 является водородом или незамещенным алкилом. R4 представляет собой водород. R4 представляет собой незамещенный алкил. R4 представляет собой незамещенный алкил. R4 является метилом или этилом. R4 является метилом. R4 является этилом.
В одном аспекте R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил. R5 находится в S-конфигурации. R5 находится в R-конфигурации. R5 представляет собой метил или этил. R5 является S-метилом. R5 является R-метилом. R5 представляет собой S-этил. R5 представляет собой R-этил. R5 замещен фенилом. R5 представляет собой бензил. R5 является S-бензилом. R5 является R-бензил. R5 представляет собой арил. R5 является фенилом. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, дополнительно при этом R5 находится в S - конфигурации. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, и Ri является гидрокси. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, и R2 является водородом. Каждый из R4 и R5 представляет собой незамещенный алкил, Rx является гидрокси, и R2 является водородом.
В одном аспекте Rx, R2 и R4 представляют собой водород. R2 и R4 представляют собой водород. R2 является водородом. По меньшей мере один из Rx, R2 или R4 является водородом. По меньшей мере два из Rx, R2 или R4 являются водородом. Все из Rx, R2 или R4 представляют собой водород.
В одном аспекте Rx или R7 являются незамещенными алкилами. Ri или R7 представляет собой метил. Rx или R7 представляет собой этил. Ri или R7 представляет собой пропил. Оба из Rx и R7 представляют собой незамещенные алкилы. R7 является водородом. R7 является гидрокси. Одним из Rx или R7 является незамещенный алкил и остальные Rx или R7 представляют собой водород. Одним из Rx или R7 является незамещенный алкил и остальные Rx или R7 представляют собой гидрокси. По меньшей мере одним из Rx или R7 является незамещенный алкил, и R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил. По меньшей мере бдин из Rx
или R7 представляет собой метил, и R5 представляет собой метил. R7 является гидрокси, и оба из Ri и R5 представляют собой незамещенные алкилы. Ri представляет собой гидрокси, и оба из R7 и R5 представляют собой незамещенные алкилы. По меньшей мере одним из Ri или R7 является незамещенный алкил, и R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, дополнительно при этом R5 находится в S-конфигурации. По меньшей мере одним из Rx или R7 является незамещенный алкил, и R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, дополнительно при этом R5 находится в R-конфигурации. R7 представляет собой гидрокси, и оба из Rx и R5 представляют собой незамещенные алкилы, дополнительно при этом R5 находится в S-конфигурации. R7 является гидрокси, и оба из Rx и R5 представляют собой незамещенные алкилы, дополнително при этом R5 находится в R-конфигурации. Rx является гидрокси, и оба из R7 и R5 представляют собой незамещенные алкилы, дополнительно при этом R5 находится в S-конфигурации. Rx является гидрокси, и оба из R7 и R5 представляют собой незамещенные алкилы, дополнительнот при этом R5 находится в R-конфигурации. Ri является гидрокси, и R7 является метилом. Rx является метилом, и R7 представляет собой гидрокси.
В другом аспекте R6 представляет собой незамещенный алкил. R6 является метилом. R6 является этилом. R8 представляет собой водород.
R8 представляет собой незамещенный алкил. R8 является метилом. R8 является этилом. R2 представляет собой а-гидрокси, и R8 представляет собой незамещенный алкил.
В другом аспекте изобретения соединение выбирают из Соединений:
Ial2, 1Ы2, Icl2, Igl2, Ihl2, Iil2, Iol2, Ipl2, Iql2, Ial3,1ЫЗ, Icl3, Igl3, Ihl3, ШЗ, 1113, Iml3, Inl3, Iol3, Ipl3, Iql3, Ial4,1Ы4, Icl4, Idl4, Iel4,H14, Igl4, Ihl4, Ш4,1114, Iml4, Inl4, Iol4, Ipl4, Iql4, Ial5,1Ы5, Icl5, Idl5, Iel5,1П5, Igl5,1Ы5, Iil5,1115, Iml5, Inl5, Ial6,1Ы6, Icl6, Idl6, Iel6,Ifl6, Igl6, Ihl6, Iil6,1116, Iml6, Inl6, Ial7, 1Ы7, Icl7, Idl7, Iel7, Ifl7, Igl7, Ihl7, Ш7,1117, Iml7, Inl7, Ial5e, Ibl5e, Icl5e, Idl5e, Iel5e, Ifl5e, Igl5e, Ihl5e, IilSe, U15e, Iml5e, Inl5e, Ial6e, Ibl6e, Icl6e, Idl6e, Iel6e, Ifl6e, Igl6e, Ihl6e, Iil6e, I116e, Iml6e, Inl6e, Ial7e, Ibl7e, Icl7e, Idl7e, Iel7e, Ifl7e, Igl7e, Ihl7e, Ш7е, Ш7е, 1ш17еи Inl7e.
В другом аспекте в изобретение включены композиция или лекарство, содержащее соединение формулы II:
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель, в котором: Rx представляет собой водород, гидрокси, замещенный или незамещенный алкил или галоген; R2 представляет собой водород или а-гидрокси; R4 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, или галоген; R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, или арил; R6 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером в 3, 4, 5 или 6 атомов; R7 представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, или гидрокси; и R8 представляет собой водород или замещенный или незамещенный алкил. В одном аспекте, если R5 является метилом, Rx является гидроксилом, и R3 представляет собой гидроксил или NHCH2CH2S03H, в этом случае R4 не является водородом.
В другом аспекте в изобретение включено соединение с формулой III:
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором Ri являются водородом, гидрокси, или галогеном; R2 представляет собой водород или а-гидрокси; R3 представляет собой гидрокси, NH (СН2) mS03H, или NH (СН2) nC02H; R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, или арил; R6 представляет собой водород, или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером 3, 4, 5 или б атомов; R7 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил или гидрокси; R8 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил; R9 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или R8 и R9, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонил; R10 представляет собой R3 или S03H; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
В другом аспекте в изобретение включено соединение с формулой IIIA:
или его соль, сольват, гидрат, или пролекарство, в котором Ri является водородом, гидрокси или галогеном; R3 представляет собой гидрокси, NH(CH2)mS03H или NH (СН2) пС02Н; R5 представляет
собой незамещенный или замещенный алкил, или арил; R6 представляет собой водород, или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером 3, 4, 5 или 6 атомов; R7 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил или гидрокси; R8 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил; R9 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или R8 и R9, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонил; Ri0 представляет собой R3 или S03H; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором Rx является гидроксилом. В другом аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R8 и R9, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонил, и Ri0 является R3. В одном аспекте R3 выбирают из гидрокси, NH (СН2) 2S03H, и NHCH2C02H. В одном аспекте R3 является гидрокси. В одном аспекте R3 представляет собой NH(СН2) 2S03H. В одном аспекте R3 представляет собой NHCH2C02H. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R6 является водородом. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 представляет собой незамещенный алкил. В одном аспекте R5 является метил. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 находится в S-конфигурации. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 находится в S-конфигурации, и R5 является метилом. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R7 является водородом.
В одном аспекте в изобретение включено соединение, выбираемое из Соединений Ig3e, Ih3e, Ii3e, Ig4e, Ih4e, Ii4e,
ноч> ''он
н -
^ (ШВ) или его соль, сольват, гидрат, или пролекарство, в котором R3 представляет собой гидрокси, NH(CH2)mS03H или NH (СН2) nC02H; R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, или арил; R8 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил; R9 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или R8 и R9, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонил; Rio представляет собой R3 или S03H; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 представляет собой незамещенный алкил. В одном аспекте R5 представляет собой метил. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 находится в S-конфигурации. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 находится в S-конфигурации, и R5 является метилом. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R8 и R9, взятые вместе с углеродом, к. которому они присоединены, образуют карбонил. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R10 представляет собой R3. В одном аспекте R3 выбирают из гидрокси, NH(CH2)2S03H и NHCH2C02H. В одном аспекте R3 является гидрокси. В одном аспекте R3 представляет собой NH (СН2) 2S03H. В одном аспекте R3 представляет собой NHCH2C02H.
В другом аспекте изобретение включает в себя соединение формулы II1С:
(IIIC)
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R3 является гидрокси, NH(CH2)mS03H или NH (СН2) nC02H; R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, или арил; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R3 выбирают из гидрокси, NH(CH2)2S03H и NHCH2C02H. В одном аспекте R3 представляет собой гидрокси. В одном аспекте R3 представляет собой NH (СН2) 2S03H. В одном аспекте R3 представляет собой NHCH2C02H. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 является незамещенным алкилом. В одном аспекте R5 является метилом. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 находится в S-конфигурации. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 находится в S-конфигурации, и R5 представляет собой метил.
В другом аспекте изобретение включает в себя соединение с формулой IV:
НО4'
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором: Ri представляет собой водород, гидрокси или галоген; R2 представляет собой водород или а-гидрокси; R3 представляет собой гидрокси, NH(CH2)mS03H или NH (СН2) nC02H; R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, или арил; R6 представляет собой водород, или R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером в 3, 4, 5 или 6 атомов; m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и п является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором Rx представляет собой гидрокси. В другом аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором Rx представляет собой альфа-гидрокси. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором Ri представляет собой бета-гидрокси. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором Rx представляет собой метил.
В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 представляет собой незамещенный алкил. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 представляет собой метил. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 находится в R-конфигурации. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R5 находится в S-конфигурации.
В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R6 является водородом. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R2 является водородом. В одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R2 представляет собой альфа гидрокси. В
одном аспекте изобретение включает в себя соединение или его соль, сольват, гидрат или пролекарство, в котором R3 представляет собой гидроксил.
В одном аспекте изобретение включает в себя соединение, выбираемое из Соединений:
Ib3e, Ic3e, ИЗе, Ie3e, If3e,Ig3e, Ih3e, Ше, ПЗе, Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Id4e, Ie4e, If4e, Ig4e, Ih4e, Ii4e, I14e, Im4e, In4e, Ia5e, Ib5e, Ic5e, Id5e, Ie5e, If5e, Ig5e, Ih5e, Ii5e, I15e, Im5e, In5e, Ia9e, Ib9e, Ic9e, Id9e, Ie9e, If9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, I19e, Im9e, In9e, IalOe, IMOe, IclOe, IdlOe, IelOe, IflOe, IglOe, IhlOe, IilOe, IllOe, ImlOe, InlOe, Ialle, Iblle, Idle, Idlle, Ielle, 1П1е, Iglle, Ihlle, Iille, Illle, Imlle, Inlle, Ial5e, Ibl5e, Icl5e, Idl5e, Iel5e, Ifl5e, Igl5e, IhlSe, Ш5е, I115e, Iml5e, InlSe, Ial6e, Ibl6e, Icl6e, Idl6e, Iel6e, 1П6е, Igl6e, Ihl6e, Iil6e, I116e, Iml6e, Inl6e, Ial7e, Ibl7e, Icl7e, Idl7e, Iel7e, Ifl7e, Igl7e, Ihl7e, Iil7e, Ш7е, Iml7e и Inl7e.
Настоящее изобретение включает в себя Соединение Ih3e:
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство. В одном аспекте изобретение включает тауриновый конъюгат Соединения
Ih3e:
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство. В одном аспекте изобретение включает в себя конъюгат глицина из Соединения Ih3e:
или его соль, сольват, гидрат или пролекарство.
В одном аспекте изобретение включает в себя Соединения 1ЬЗе, Ic3e, Id3e, Ie3e, If3e, Ig3e, Ih3e, Ii3e, I13e, Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Id4e, Ie4e, If4e, Ig4e, Ih4e, Ii4e, I14e, Im4e, In4e, Ia5e, 1Ь5е, Ic5e, Id5e, Ie5e, If5e, 1д5е, Ih5e, Ii5e, I15e, Im5e и In5e.
В одном аспекте изобретение включает в себя Соединения Ia9e, 1Ь9е, Ic9e, Id9e, Ie9e, If9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, I19e, Im9e, In9e, IalOe, IblOe, IclOe, IdlOe, IelOe, IflOe, IglOe, IhlOe, IilOe, IllOe, ImlOe, InlOe, Ialle, Iblle, Idle, Idlle, Ielle, Iflle, Iglle, Ihlle, Iille, Illle, Imlle и Inlle.
В одном аспекте изобретение включает в себя Соединения 1а15е, 1Ы5е, Icl5e, Idl5e, Iel5e, Ifl5e, Igl5e, Ihl5e, Iil5e, I115e, Iml5e, Inl5e, Ial6e, 1Ы6е, Icl6e, Idl6e, Iel6e, Ifl6e, Igl6e, Ihl6e, Iil6e, I116e, Iml6e, Inl6e, Ial7e, 1Ы7е, Icl7e, Idl7e, Iel7e, Ifl7e, Igl7e, Ihl7e, Iil7e, I117e, Iml7e и Inl7e.
В одном аспекте изобретение включает в себя соединение по изобретению, в котором соединение представляет собой фармацевтически приемлемую соль.
В одном аспекте изобретения включает в себя композицию, содержащую соединение по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат или пролекарство, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.
Настоящее изобретение также включает в себя радиомеченые соединения по изобретению. Радиомеченые соединения можно изготавливать с помощью общепринятых способов. Например, радиомеченые соединения изобретения можно изготавливать путем реакции соединения по изобретению с газообразным тритием в присутствии подходящего катализатора, с целью получения радиомеченых соединений, имеющих описанные в изобретении формулы. В одном варианте осуществления соединения по изобретению мечены тритием.
Применение и способы
Изобретение включает в себя использование соединения или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата или пролекарства для изготовления лекарства для лечения или
профилактики болезни у субъекта. Изобретение также включает в себя способ лечения или профилактики болезни у субъекта путем введения соединения по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, гидрата или пролекарства.
В одном аспекте изобретение включает в себя указанное применение или способ, при этом болезнь выбирают из метаболического заболевания, воспалительного заболевания, болезни печени, аутоиммунного заболевания, болезни сердца, болезни почек, рака и болезни желудочнокишечного тракта. В одном аспекте изобретение включает в себя метаболическое заболевание, выбираемое из ожирения, диабета, диажирения, метаболического синдрома, гипертонии, дислипидемии и резистентности к инсулину, включающей в себя пре-диабетическую резистентность к инсулину. В одном аспекте метаболическим заболеванием является ожирение. В другом аспекте метаболическим заболеванием является диабет. В одном аспекте диабет выбирают из преддиабетического состояния и диабета II типа. В одном аспекте метаболическим заболеванием является метаболический синдром. В одном аспекте метаболическим заболеванием является резистентность к инсулину. В одном аспекте метаболическое заболевание представляет собой дислипидемию. В одном аспекте метаболическим заболеванием является диажирение. Термин "диажирение" относится к состоянию, при котором субъект страдает диабетом и имеет излишний вес.
В одном аспекте изобретение включает в себя воспалительное заболевание, выбираемое из аллергии, остеоартрита (OA) , хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), аппендицита, бронхиальной астмы, панкреатита, аллергической сыпи и псориаза.
В одном аспекте изобретение включает в себя аутоиммунное заболевание, выбираемое из ревматоидного артрита, рассеянного склероза и диабета I типа.
В одном аспекте изобретение включает в себя болезнь желудочнокишечного тракта, выбираемую из воспалительной болезни кишечника (болезнь Крона, язвенный колит), синдрома короткой кишки (пострадиационный колит), микроскопический колит, синдром раздраженного кишечника (мальабсорбция) и чрезмерный рост
бактерий.
В одном аспекте изобретение включает в себя болезнь почек,
выбираемую из диабетической нефропатии, хронической почечной
недостаточности, гломерулярного нефрита, гипертензивного
нефросклероза, хронического гломерулонефрита, хронической
трансплантационной гломерулопатии, хронического
интерстициального нефрита и поликистозной болезни почек.
В одном аспекте изобретение включает в себя рак, выбираемый из колоректального рака, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, холангиокарциномы, рака почки, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы и инсулиномы.
В одном аспекте изобретение включает в себя болезнь печени, выбираемую из неалкогольного стеатогепатита, неалкогольной жировой болезни печени, хронического вирусного гепатита, алкогольной болезни печени, лекарственного гепатита, гемохроматоза, первичного билиарного цирроза, первичного склерозирующего холангита, портальной гипертензии, десатурации желчи, болезни Гоше, болезнь Вилсона, дефицита al-антитрипсина, полного парентерального питания (ППП), холелитиаза, ППП-ассоциированного холестаза и сепсиса.
В одном аспекте изобретение включает в сеюя аутоиммунное заболевание эритематоз.
В одном аспекте изобретение включает в себя болезнь сердца, выбираемую из застойной сердечной недостаточности, инфаркта миокарда, атеросклероза, стенокардии, артериосклероза и церебрально-васкулярного заболевания (кровоизлияние, инсульт, церебрально-васкулярный инфаркт).
В одном аспекте изобретение включает в себя применение или способ, в котором соединение по изобретению представляет собой агонист TGR5. В одном аспекте коэффициент селективности TGR5 ЕС50 к FXR ЕС50 составляет меньше 0,05.
В одном аспекте изобретение включает в себя применение или способ, в котором соединение или композицию вводят субъекту перорально, парентерально, внутривенно или местно. В одном аспекте субъектом является человек.
Один аспект изобретения включает в себя применение или способ, содержащий введение субъекту терапевтически эффективного количества соединения по изобретения. В одном аспекте изобретение включает в себя применение или способ, содержащий введение субъекту, который нуждается в таком введении. Настоящее изобретение включает в себя применение или способ, содержащий введение субъекту профилактически эффективного количества соединения по изобретению.
Соединения и композиции настоящего изобретения можно вводить разными путями, например, пероральным, подкожным, внутримышечным, внутривенным или внутрибрюшинным путем. Рассматриваемые пути введения фармацевтических композиций представляют собой пероральные, подкожные и внутривенные пути с ежедневными дозами от около 0,01 до около 5000 мг в день, предпочтительно от 5 до 500 мг в день лиганда FXR, которые рассчитаны для взрослого человека весом 7 0 кг. Подходящую дозу можно вводить как однократную ежедневную дозу или в виде разделенных доз с подходящими интервалами, например, две, три, четыре или больше части дозы в день.
Для изготовления фармацевтических композиций, содержащих
соединения по изобретению, используют инертные и
фармацевтически приемлемые носители. Фармацевтический носитель
может быть как твердым, так и жидким. Рецептуры твердых форм
включают в себя, например, порошки, таблетки, диспергируемые
гранулы, капсулы, саше и суппозитории. Твердый носитель может
представлять собой одну или больше субстанций, которые могут
также действовать как разбавители, ароматизаторы,
солюбилизаторы, лубриканты, суспендирующие агенты, связующие агенты или агенты, дезинтегрирующие таблетки; также могут быть инкапсулирующим материалом.
Носитель в порошках обычно является тонкоизмельченным твердым веществом, которое находится в смеси с тонкоизмельченным активным компонентом, например, соединением по изобретению. В таблетках активный компонент смешивают в подходящих пропорциях с носителем, имеющим необходимые связующие свойства, и прессуют с желательной формой и 'размером.
Для изготовления фармацевтических композиций в форме суппозиториев сначала расплавляют низкоплавкий воск, например, смесь глицеридов жирных кислот и масла какао, и диспергируют в нем активный компонент, например, путем взбалтывания. Затем расплавленную гомогенную смесь наливают в формы удобного размера и оставляют для охлаждения и отвердения.
Порошки и таблетки предпочтительно содержат активный компонент соединения по изобретению в диапазоне от около 5% до около 70% веса. Подходящие носители включают в себя, например, карбонат магния, стеарат магния, тальк, лактозу, сахар, пектин, декстрин, крахмал, трагакант, метилцеллюлозу, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, низкоплавкий воск, масло какао и тому подобное.
Фармацевтические композиции могут включать в себя рецептуру активного соединения с инкапсулирующим материалом в качестве носителя для получения капсулы, в которую помещают с помощью носителя соединение по изобретению (с носителями или без других носителей), таким образом, что носитель становится ассоциированным с соединением. Подобным образом в изобретение также могут быть включены саше. Таблетки, порошки, саше и капсулы можно применять как твердые лекарственные формы, подходящие для перорального введения.
Жидкие фармацевтические композиции включают в себя,
например, растворы, подходящие для перорального или
парентерального введения, суспензии и эмульсий, подходящие для
перорального введения. Примерами жидких соединений, подходящих
для парентерального введения, являются стерильные водные
растворы активных компонентов или стерильные растворы активного
компонента в растворителях, содержащих воду, буферный водный
раствор, солевой раствор, фосфатно-буферный раствор (ФБР),
этанол или пропиленгликоль. Композиции могут содержать
фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества,
необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как регуляторы уровня рН и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, увлажняющие агенты, детергенты и тому подобное.
Стерильные растворы можно приготовлять путем растворения активного компонента (например, соединения по изобретению) в желательной растворяющей системе, с последующим пропусканием полученного раствора через мембранный фильтр для его стерилизации, или, альтернативно, путем растворения в стерильных условиях стерильного соединения в заранее простерилизованном растворителе. Полученные водные растворы можно упаковывать для использования как есть, или лиофилизировать, при этом лиофилизированный препарат перед введением соединяют со стерильным водным носителем. Уровень рН указанных препаратов обычно будет в диапазоне от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9, и наиболее предпочтительно от 7 и 8.
Фармацевтические композиции, содержащие соединения по изобретения, можно вводить в целях профилактического и/или терапевтического лечения. Для терапевтических применений соединения вводят в количестве, достаточном для излечения, обратного развития болезни или по меньшей мере частичного замедления или прекращения симптомов болезни и ее осложнений. Количество, адекватное для излечения, обратного развития или по меньшей мере частичного замедления или прекращения симптомов болезни и ее осложнений определяют как "терапевтически эффективная доза". Для профилактических применений соединения вводят в количестве, достаточном для предотвращения симптома болезни и ее осложнений. Количество, адекватное для профилактики симтома болезни и ее осложнений, определяют как "профилактически эффективная доза".
Количество, эффективное для терапевтического применения, будет зависеть от степени тяжести болезни или нарушения, и веса и общего состояния здоровья пациента, но обычно для пациента весом 7 0 кг будет находиться в диапазоне от около 0,1 мг до 2 000 мг соединения в день, с более общепринятыми дозами для пациента весом 70 кг от около 5 мг до около 500 мг соединения в день.
Для профилактических применений фармацевтические соединения, содержащие соединения по изобретению, вводят пациенту, предрасположенному к развитию болезни или' имеющему
риск развития болезни, в количестве, достаточном для задержки развития или предотвращения возникновения симптомов болезни. Такое количество определяют как "профилактически эффективная доза." Точное количество соединения для указанного применения также зависит от состояния здоровья пациента и веса, но обычно для пациента весом 7 0 кг будет находиться в диапазоне от около 0,1 мг до 2000 мг соединения в день, с более общепринятыми дозами для пациента весом 70 кг от около 5 мг до около 500 мг соединения в день.
Выбор дозировок и путей введения соединений при однократных или многократных введениях может осуществлять лечащий врач. В любом случае, фармацевтические рецептуры должны обеспечивать количество соединения по изобретению, достаточное для эффективного лечения или профилактики болезни у пациента.
Изобретение также относится к комплектам для профилактики или лечения болезни согласно использованию и способу настоящего изобретения. В одном аспекте изобретение включает в себя комплект для лечения или профилактики болезни у субъекта, при этом комплект содержит соединение по изобретению или его соль, сольват, гидрат или пролекарство. Комплекты обычно включают в себя фармацевтическую композицию, которая содержит эффективное количество соединения по изобретению, а также информационный материал с инструкциями по отпуску фармацевтической композиции, включающими в себя описание типа пациентов для возможного лечения, схему (например, доза и частота введения) и путь введения, и тому подобное.
Ниже представлены некоторые примеры соединений по изобретению.
Следующие соединения 1а-1г5, указанные ниже, имеют по меньшей мере формулу I:
la: R,= сх-ОН, R2= Н, R3= ОН, R4= Н, R5= (S,R)Me, Rs=H lb: R!= a-OH, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (S)Me, Re=H Ic: R,= a-OH, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (Л)Ме, R6=H
Id: R,= p-OH, R2= H, R3= OH, RA= H, R5= (ЗДМе, R*=H
Ie: Ri= p-OH, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (S)Me, Re=H
If: R,= p-OH, R2= H, R3= OH, R4=H, R5= (Л)Ме, R$=H
Ig: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= OH, R^= H, Rs= (5,Л)Ме, R6=H
Ih: Ri= a-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= H, R5= (S)Me, Re=H
Ii: Ri= a-OH, R2= a-OH, R3= OH, R,= H, R5= (Л)Ме, Re=H
II: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= H, R5= (ЗДМе, R"=H
Im: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= H, R5= (S)Me, R"=H
In: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= H, R5= (Л)Ме, R*=H
Io: R,= H, R2= H, R3= OH, R,= H, Rs= (ЗДМе, R"=H
Ip: R,= H, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (S)Me, R6=H
Iq: R,= H, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (Л)Ме, R*=H
Ial: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R4= H, R5= (S,R)Mc, Re=H
Ibl: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R <= H, R5= (S)Me, R6=H
Icl: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (Л)Ме, Re=H
Idl: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (ЗДМе, Re=H
Iel: R|= p-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, Ri= H, R5= (S)Me, Re=H
1П: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,=H, R5= (Л)Ме, Re=H
Igl: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, Rr H, R5= (5,Л)Ме, Re=H
Ihl: Ri= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= H, R5= (S)Me, R6=H
Iil: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= H, R5= (Л)Ме, R6=H
111: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= H, R5= (S,*)Me, R^H
Iml: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, Ra= H, R5= (5)Me, Re=H
Inl: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= H, R5= (Л)Ме, R6=H
Iol: Ri= H, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (ЗДМе, R$=H
Ipl: Ri= H, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (S)Me, R6=H
Iql: R,= H, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R4= H, R5= (Л)Ме, R6=H
Ia2: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (S,R)Me, Rs=H
Ib2: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R"= H, R5= (S)Me, Re=H
Ic2: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, RA= H, R5= (Л)Ме, R6=H
Id2: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4- H, R5= (ЗДМе, R*=H
Ie2: R,= P-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (S)Me, Re=H
If2: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,=H, R5= (Д)Ме, Re=H
Ig2: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, Rr H, R5= (5,Л)Ме, ^=Н
Ih2: Ri= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (5)Ме, R^H
Ii2: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (R)Me, R"=H
112: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (S,R)Me, R <;=H
Im2: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (5)Me, Re=H
In2: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (Л)Ме, R*=H
Io2: R,= H, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (S,R)Me, R*=H
Ip2: R,= H, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (5)Me, Re=H
Iq2: R,= H, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (Л)Ме, R6=H
Ia3: R,= a-OH, R2= H, R3= OH, R,= a-Me, R5= (S,R)MQ, Re=H
Ib3: R,= a-OH, R2= H, R3= OH, R,= a-Me, R5= (S)Me, R6=H
Ic3: R,= a-OH, R2= H, R3= OH, Rr a-Me, R5= (Д)Ме, R6=H
Id3: Ri= p-OH, R2= H, R3= OH, R,= a-Me, R5= (ЗДМе, Re=H
Ie3: R,= p-OH, R2= H, R3= OH, R4= a-Me, R5= (5)Me, R^H
If3: Ri= p-OH, R2= H, R3= OH, Rt= a-Me, R5= (Л)Ме, Rfi=H
Ig3: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= a-Me, Rs= (S,i?)Me, Rfi=H
Ih3: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Me, R5= (5)Me, Re=H
Ii3: Ri= a-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= a-Me, R5= (i?)Me, R6=H
113: R,= P-OH, R2= a-OH, R3= OH, R"= a-Me, R5= (ЗДМе, ^=Н
Im3: Ri= p-OH, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Me, R5= (5)Me, Re=H
In3: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Me, R5= (7?)Me, R^H
Ia4: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, RA= a-Me, R5= (S,R)Me, Re=H
Ib4: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Me, R5= (S)Me, R6=H
Ic4: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, RA= a-Me, R5= (i?)Me, Re=H
Id4: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Me, R5= (ЗДМе, R <;=H
Ie4: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R"= a-Me, R5= (S)Me, R If4: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Me, R5= (tf)Me, R^H
Ig4: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= a-Me, R5= (5,/?)Me, Re=H
Ih4: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= a-Me, R5= (5}Me, Rs=H
Ii4: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= a-Me, R5= (Л)Ме, R6=H
114: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= a-Me, Rs= (ЗДМе, R6=H
Im4: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R"= a-Me, Rs= (S)Me, Re=H
In4: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Me, R5= (R)Mt, Re=H
Ia5: Ri= a-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= a-Me, R5= (S,R)Me, Re=H
Ib5: Ri= a-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= a-Me, R5= (S)Me, R6=H
Ic5: Ri= a-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= a-Me, Rs= (Л)Ме, Re=H
Id5: Ri= P-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R"= a-Me, R5= (ЗДМе, R6=H
IeS: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= a-Me, R5= (S)Me, R"=H
IfS: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R*= a-Me, R5= (Л)Ме, R6=H
Ig5: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R4= a-Me, R5= (ЗДМе, R6=H
Ih5: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R,= a-Me, R5= (S)Me, R6=H
Ii5: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, RA= a-Me, R5= (Л)Ме, Re=H
115: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R4= a-Me, R5= (S,R)Me, R Im5: Rt= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R"= a-Me, R5= (S)Me, R6=H
In5: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R"= a-Me, R5= (Л)Ме, Re=H
Ib3e: R,= a-OH, R2= H, R3= OH, R4= a-Et, R5= (5)Me, R6=H
Ic3e: Rj= a-OH, R2= H, R3= OH, R4= a-Et, R5= (Л)Ме, R6=H
Id3e: R,= p-OH, R2= H, R3= OH, R4= a-Et, R5= (?Л)Ме, Re=H
Ie3e: R,= p-OH, R2= H, R3= OH, R4= a-Et, R5= (S)Me, Re=H
IOe: Ri= p-OH, R2= H, R3= OH, R4= a-Et, R5= (Л)Ме, R6=H
Ig3e: Ri= a-OH, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Et, Rs= (S,R)M &, Re=H
Ib3e: Ri= a-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= a-Et, R5= (5)Me, R^H
Ii3e: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= a-Et, R5= (Л)Ме, Re=H
I13e: Ri= p-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= a-Et, R5= (S,R)Me, R6=H
Im3e: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= a-Et, R5= (5)Me, Re=H
In3e: R,= P-OH, R2= a-OH, R3= OH, R"= a-Et, R5= (Л)Ме, Re=H
Ia4e: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (S,R)Me, Re=H
Ib4e: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R4= a-Et, R5= (S)Me, Re=H
Ic4e: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (Л)Ме, R6=H
Id4e: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R4= a-Et, R5= (S,*)Me, R"=H
Ie4e. R,= P-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R4- a-Et, R5= (5)Me, R <;=H If4e: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (Л)Ме, R"=H Ig4e. R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= a-Et, R5= (ЗДМе, R6=H Ih4e: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, Rs= (5)Me, Re=H Ii4e: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (Л)Ме, R^H I14e: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R"= a-Et, R5= (S,R)Me, R^H Im4e: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (S")Me, Re=H In4e: R,= p-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (R)Mc, Rfi=H Ia5e: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= a-Et, R5= (5,Л)Ме, R^H Ib5e: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4- a-Et, R5= (5)Me, R^H Ic5e: R,= a-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= a-Et, R5= (i?)Me, R^=H Id5e: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= a-Et, R5= (ЗДМе, Re=H Ie5e: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R"= a-Et, R5= (S)Me, *6=Н IfSe: R,= p-OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= a-Et, R5= (Л)Ме, R <,=H Ig5e: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R,= a-Et, R5= (S,R)Me, Re=H Ih5e: R,= a-OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R"= a-Et, R5= (5)Me, R Следующие соединения In6-Inlle имеют по меньшей ме формулу IA:
1аб: R,= ОН, R2= Н, R3= ОН, R <= Н, R5= (ЗДМе, R^H, R7=Me
Ib6: Ri= ОН, R2= Н, R3= ОН, R4= Н, R5= (5)Ме, Re=H, R7= Me
Ic6: R,= OH, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (Л)Ме, R^H, R7= Me
Id6: R,= Me, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (ЗДМе, R^H, R7=OH
Ie6: R,= Me, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (5)Me, Re=H, R7=OH
If6: R,= Me R2= H, R3= OH, R,=H, R5= (Л)Ме, R6=H, R7=OH
Ig6: R,= OH, R2= a-OH, R3= OH, R,= H, R5= (5,/?)Me, R^H, R7= Me
№6: R,= OH, R2= a-OH, R3= OH, R,= H, R5= (S)Me, RrH, R7= Me
Ii6: R,= OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= H, R5= (Я)Ме, Re=H, R7= Me
116: Ri= Me, R2= a-OH, R3= OH, R4= H, R5= (S,R)Me, Re=H, R7=OH
Im6: R,= Me, R2= a-OH, R3= OH, R4= H, R5= (5)Me, R6=H, R7=OH
In6: R,= Me, R2= a-OH, R3= OH, R4= H, R5= (R)Mc, Rt=H, R7=OH
Io6: R,= H, R2= H, R3= OH, R <= H, R5= (ЗДМе, Re^H, R7= Me
Ip6: R,= H, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (S)Me, R <;=H, R7= Me
Iq6: Ri= H, R2= H, R3= OH, R4= H, R5= (tf)Me, Re=H, R7= Me
Ia7: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (S,R)Me, R6=H, R7= Me
Ib7: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (5)Me, R <;=H, R7= Me
Ic7: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R4= H, R5= (Д)Ме, R^H, R7= Me
Id7: Ri= Me, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (ЗДМе, Re=H, R7=OH
Ie7: R,= Me, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, Rr H, R5= (5)Me, R^H, R7=OH
If7: R,= Me, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,=H, R5= (R)Me, R <;=H, R7=OH
Ig7: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (S,R)Mc, R <5=H, R7= Me
Ih7: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, Rt= H, R5= (S)Me, R^H, R7= Me
Ii7: R2= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (Л)Ме, R*=H, R7= Me
117: R,= Me, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (S,R)Me, R Im7: R,= Me, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (5)Me, R6=H, R7=OH
In7: R,= Me, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R4= H, R5= (Л)Ме, R Io7: R,= H, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (S,R)Me, R Ip7: R,= H, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, RA= H, R5= (S)Me, R*=H, R7= Me
Iq7: R,= H, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= H, R5= (Л)Ме, Re=H, R7= Me
Ia8: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (S. Д)Ме, Re=H, R7= Me
Ib8: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (S)Me, R6=H, R7= Me
Ic8: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (Л)Ме, R6=H, R7- Me
Id8: R,= Me, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (ЗДМе, Кь=Я, R7=OH
Ie8: R,= Me, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (S)Me, R6=H, R7=OH
If8: R,= Me, R2= H, R3= NHCH2C02H, R^H, R5= (i?)Me, R"=H, R7=OH
Ig8: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (ЗДМе, R6=H, R7= Me
Ih8: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (5)Me, R6=H, R7= Me
И8: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me
118: R,= Me, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (S,R)Mc, R6=H, R7=OH
Im8: R,= Me, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (S)Me, R6=H, R7=OH
In8: R,= Me, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (Л)Ме, Re=H, R7=OH
Io8: R,= H, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (ЗДМе, Rfi=H, R7= Me
Ip8: R,= H, R2= H, R3= NHCH2C02H, R4= H, R5= (S)Me, R6=H, R7= Me
Iq8: R,= H, R2= H, R3= NHCH2C02H, R,= H, R5= (Л)Ме, Re=H, R7= Me
Ia9: R,= OH, R2= H, R3= OH, R4- a-Me, R5= (ЗДМе, Re=H, R7= Me
Ib9: R,= OH, R2= H, R3= OH, R,= a-Me, R5= (S)Me, R6=H, R7= Me
Ic9: R,= OH, R2= H, R3= OH, R,= a-Me, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me
Id9: R,= Me, R2= H, R3= OH, R4= a-Me, R5= (S,R)Me, R6=H, R7=OH
Ie9: R,= Me, R2= H, R3= OH, R4= a-Me, R5= (S)Me, RrH, R7=OH
If9: R,= Me, R2= H, R3= OH, R4= a-Me, R5= (Л)Ме, Re^H, R7=OH
Ig9: R,= OH, R2= a-OH, R3= OH, R4= a-Me, R5= (5,Л)Ме, R6=H, R7= Me
Ih9: R,= OH, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Me, R5= (S)Me, R*=H, R7= Me
Ii9: R,= OH, R2= a-OH, R3= OH, Rr a-Me, R5= (Л)Ме, R <;=H, R7= Me
119: R,= Me, R2= a-OH, R3= OH, R"= a-Me, R5= (S,R)Me, R6=H, R7=OH
Im9: Ri= Me, R2= a-OH, R3= OH, R4= a-Me, R5= (5)Me, R6=H, R7=OH
In9: R,= Me, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Me, R5= (Л)Ме, R"=H, R7=OH
IalO: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Me, R5= (ЗДМе, R6=H, R7= Me
1Ы0: Ri= OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Me, R5= (5)Me, R6=H, R7= Me IclO: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Me, Rs= (Д)Ме, R6=H, R7= Me IdlO: R|= Me, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Me, R5= (5,Л)Ме, R Ii9e: R,= OH, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Et, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me I19e: Ri= Me, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Et, R5= (S,R)Uc, R6=H, R7=OH Im9e: Ri= Me, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Et, R5= (S)Me, R6=H, R7=OH In9e: R,= Me, R2= a-OH, R3= OH, R,= a-Et, R5= (Л)Ме, Rfl=H, R7=OH IalOe: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R|= a-Et, R5= (5,Л)Ме, R6=H, R7= Me IblOe: Ri= OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, RA= a-Et, R5= (S)Me, Re=H, R7= Me IclOe: R,= OH, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (R)Mc, Rs=H, R7= Me IdlOe: R,= Me, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (S,R)Mc, R6=H, R7=OH IelOe: R,= Me, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (S)Me, R6=H, R7=OH IflOe: Ri= Me, R2= H, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, R5= (Л)Ме, Re=H, R7=OH IglOe: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2S03H, R,= a-Et, Rs= (5,Л)Ме, R Следующие указанные ниже соединения 1а12-1п17е имеют по меньшей мере формулу II:
Ial2: R,= ОН, R2= Н, R4= Н, R5= (?Л)Ме, R <;=H, R7= Me, Rg=H
1Ы2: R,= OH, R2= H, Rr H, R5= (S)Me, R <;=H, R7= Me, Rg=H Icl2: R,= OH, R2= H, R,= H, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me, R8=H Idl2: R,= Me, R2= H, R,= H, R5= (?Л)Ме, R6=H, R7=OH, R8=H Iel2: R,= Me, R2= H, R"= H, R5= (S)Me, R6=H, R7=OH, R8=H 1П2: R,= Me, R2= H, R,=H, R5= (Л)Ме, R6=H, R7=OH, R8=H Igl2: Ri= OH, R2= a-OH, R,= H, R5= (ЗДМе, R*=H, R7= Me, Rg=H Ihl2: Ri= OH, R2= a-OH, R,= H, R5= (S)Me, R6=H, R7= Me, R8=H Iil2: R,= OH, R2= a-OH, R,= H, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me, R8=H 1112: R,= Me, R2= a-OH, R"= H, Rs= (5,Л)Ме, R6=H, R7=OH, R8=H Iml2: R,= Me, R2= a-OH, R4= H, R5= (5)Me, R6=H, R7=OH, Rs=H Inl2: R,= Me, R2= a-OH, R4= H, R5= (/?)Me, R6=H, R7=OH, R8=H Iol2: R,= H, R2= H, R,= H, R5= (S,R)Me, R^H, R7= Me, Re=H Ipl2: R|= H, R2= H, R,= H, R5= (S)Me, R6=H, R7= Me, R8=H Iql2: R,= H, R2= H, R,= H, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me, R8=H Ial3: R,= OH, R2= H, Rr H, R5= (5,i?)Me, R^H, R7= Me, R8=H Ibl3: R,= OH, R2= H, Rr H, Rs= (S)Me, R <;=H, R7= Me, Rs=H Icl3: R,= OH, R2= H, R4= H, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me, R8=H Idl3: R,= Me, R2= H, R,= H, R5= (S,R)Me, R*=H, R7-OH, R8=H Iel3: R,= Me, R2= H, R,= H, R5= (S)Me, R <;=H, R7=OH, Rg=H 1ПЗ: R,= Me, R2= H, R,=H, R5= (Д)Ме, R6=H, R7=OH, R8=H Igl3: R,= OH, R2= a-OH, R4= H, R5= (S,R)Me, Кб=Я R7= Me, Rg=H Ihl3: R,= OH, R2= a-OH, R4= H, R5= (S)Me, R <;=H, R7= Me, R8=H lil3: R,= OH, R2= a-OH, R"= H, R5= (Л)Ме, Re=H, R7= Me, R8=H 1113: R,= Me, R2= a-OH, Ri= H, R5= (ЗДМе, R6=H, R7=OH, R8=H Iml3: R,= Me, R2= a-OH, R"= H, R5= (S)Me, R6=H, R7=OH, R8=H Inl3: R,= Me, R2= a-OH, R4= H, R5= (Л)Ме, R6=H, R7=OH, Rg=H ЫЗ: R,= H, R2= H, R,= H, R5= (S.R)Me, R6=H, R7= Me, Rg=H Ipl3: R,= H, R2= H, R,= H, R5= (S)Me, R6=H, R7= Me, R8=H Iql3: R,= H, R2= H, R,= H, R5= (tf)Me, R = H, R5= (S,R)Me, R6=H, R7= Me, R8=H Ibl4: R,= OH, R2= H, R,= H, R5= (5)Me, R <;=H, R7= Me, Rg=H Icl4: R,= OH, R2= H, Rt= H, R5= (Л)Ме, Re=H, R7= Me, R8=H
Idl4: R,= Me, R2= H, Ri= H, Rs= (5,Л)Ме, R = a-Me, R5= (S)Me, Re=H, R7=OH, R8=H Inl5: R,= Me, R2= a-OH, R"= a-Me, R5= (Л)Ме, R*=H, R7=OH, R8=H Ial6: Ri= OH, R2= H, R"= a-Me, R5= (ЗДМе, R6=H, R7= Me, R8=H 1Ы6: R,= OH, R2= H, R,= a-Me, R5= (5)Me, Re^H, R7= Me, R8=H Icl6: R,= OH, R2= H, R,= a-Me, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me, R8=H Idl6: Rj= Me, R2= H, R,= a-Me, R5= (S,R)Mt, R"=H, R7=OH, R8=H Iel6: R,= Me, R2= H, R,= a-Me, R5= (5)Me, R6=H, R7=OH, R8=H 1П6 R,= Me, R2= H, R,= a-Me, R5= (Л)Ме, R/> =H, R7=OH, R8=H Igl6:R,= OH, R2= a-OH, R,= a-Me, R5= (ЗДМе, R6=H, R7= Me, R8=H
Ihl6: Ri= OH, R2= a-OH, R4= a-Me, R5= (S)Me, R6=H, R7= Me, R"=H Iil6: R,= OH, R2= a-OH, R4= a-Me, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me, R"=H 1116: R)= Me, R2= a-OH, R,= a-Me, R5= (S,R)Mc, R6=H, R7=OH, R8=H Iml6: R,= Me, R2= a-OH, R"= a-Me, R5= (S)Me, R6=H, R7=OH, R8=H Inl6: R!= Me, R2= a-OH, R4= a-Me, R5= (Л)Ме, R6=H, R7=OH, R8=H Ial7: R,= OH, R2= H, R,= a-Me, R5= (ЗДМе, Re=H, R7= Me, R8=H 1Ы7: Ri= OH, R2= H, R,= a-Me, R5= (S)Me, R6=H, R7= Me, R8=H Icl7: R,= OH, R2= H, R,= a-Me, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me, R8=H Idl7: R,= Me, R2= H, R,= a-Me, R5= (S,R)Me, R Icl6e: R,= OH, R2= H, R,= a-Et, R5= (Л)Ме, R6=H, R7= Me, R8=H Idl6e: Ri= Me, R2= H, R,= a-Et, R5= (ЗДМе, R <;=H, R7=OH, R8=H Iel6e: R,= Me, R2= H, R,= a-Et, R5= (S)Me, R Все цитируемые в настоящем изобретении публикации и патентные документы включены в него путем ссылки, как если бы каждая такая публикация или документ были конкретно и отдельно указаны, как включенные в изобретение со ссылкой. Предполагается, что цитирование публикаций и патентных документов не является признанием отношения чего-либо из цитированного к предшествующему уровню техники, и не является каким-либо признанием относительно их содержания или даты. Изобретение описано посредством письменного описания, и специалистам в данной области техники будет очевидна возможность осуществления изобретения с помощью ряда вариантов
осуществления, и что предшествующее описание и нижеуказанные примеры приведены в иллюстативных целях и не ограничивают объем изложенной далее формулы изобретения.
ПРИМЕР 1: Синтез модуляторов TGR5
Соединения изобретения и родственные производные можно синтезировать способами, известными специалистам в данной области техники. Подобные способы синтеза указанных соединений описаны ниже. См. также патенты W0 02/072598, W0 2004/0007521, ЕР 1568706 и ЕР 135782. Если рассматриваются соединения, в которых Ri представляет собой водород, R2 и R3 представляют собой гидрокси, и R4 представляет собой группу низшего алкила, соединение формулы (I) можно получать согласно следующей схеме:
Схема 1
(i) 3,4-DHP, р-толуолсульфоновая кислота (ТСК), диоксан, комнатная температура (КТ) ; (ii) а) диизопропиламид лития LDA, CH3I, -78°С; b) НС1, СН3ОН, КТ; iii) NaOH, СН3ОН, кипячение с обратным холодильником.
Метилхенодеоксихоланоат (1) имел защиту в 3- и в 7-положениях после обработки 3,4-дигидро-2Н-пираном в диоксане в присутствии каталитического количества р-толуолсульфоновой кислоты (р-ТСК) , для получения За,7а-тетрагидропиранилокси аналогов (2). Реакция 2 с метилйодидом (или с подходящим алкилгалидом) при температуре -78°С с использованием в качестве основы диизопропиламида лития и тетрагидрофурана (ТГФ) в качестве растворителя, с последующей обработкой метанольной НС1
приводила к получению соответствующего соединения метил-23-метил-За, 7а-дигидрокси-5|3-холан-24-оат (3). Гидролиз 3 с использованием щелочи сложного метилового эфира и очистка флэш-хроматографией приводят к получению желаемой 23(S)-метил-За, 7а-дигидрокси-5(3-холан-24-оевой кислоты (lb) и 23 (R) -метил-За, 7а-дигидрокси-5р-холан-24-оевой кислоты (1с).
Получение 23(R)- и 23(S)-метил-За,7а-дигидрокси-5р-холан-24-оевой кислоты (lb, Ic)
a) Метил За, 7а-дитетрагидропиранилокси-5(3-холан-24-оат (2) К раствору метил-За, 7а-дигидрокси-5(3-холан-24-оата (1)
(2,0 г, 4,9 ммоль) в диоксане (6 мл) добавляли р-толуолсульфоновую кислоту (78 мг, 0,41 ммоль), 3,4-дигидро-2Н-пиран (20,1 мл, 0,098 моль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем добавляли Н20 (50 мл), смесь частично выпаривали в вакууме и экстрагировали EtOAc
(3x50 мл) . Объединенные органические фракции промывали солевым раствором (1x50 мл), высушивали (Na2S04) и выпаривали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле. Элюирование петролейным эфиром/этилацетатом 8 0/20 приводило к получению 2,5 г очищенного соединения 2 (выход 90%).
1Н-ЯМР (CDC13) 5: 0,64 (с, ЗН, СН3-18), 0,89 (с, ЗН, СН3-19), 0,92 (д, ЗН, СНз-21) , 3,31-3,67 (м, 4Н, -СН2ОСН-), 3,65 (с, ЗН, С02СН3), 3,67 (м, 1Н, СН-3), 3,88 (шир.с, 1Н, СН-7), 4,67
(шир.с, 1Н, -О-СН-О-), 4,73 (шир.с, 1Н, -О-СН-О-).
b) Метил 23(R,S)-метил-За,7а-дигидрокси-5р-холан-24-оат
(3)
N-бутил-литий (4,3 мл, 2,2 М раствор в гексане) добавляли по капле при -78°С к раствору диизопропиламина (1,4 мл, 10,1 ммоль) в безводном ТГФ (50 мл) . Систему сохраняли при -78°С в течение дополнительных 30 минут и затем к смеси по капле добавляли метил-За, 7а, 12а-тетрагидропиранилокси-5(3-холан-24-оат (2) (1,8 г, 3,2 ммоль), растворенный в безводном ТГФ (14 мл). Через 20 минут медленно добавляли метилйодид (1,4 мл, 22,0 ммоль), растворенный в безводном ТГФ (7 мл), и смесь оставляли для нагревания до комнатной температуры в течение ночи. Растворители удаляли в вакууме, подукисляли 10% НС1 и
экстрагировали EtOAc (5x50 мл), промывали 5% раствором Na2S203 (2x50 мл) , высушивали (над безводным Na2S04) , фильтровали и выпаривали в вакууме. Затем сырой остаток обрабатывали 2н раствором НС1 в МеОН (50 мл) в течение 12 часов. Остаток выпаривали в вакууме и поглощали EtOAc (100 мл), промывали влажным раствором NaHC03 (2x50 мл) , высушивали (Na2S04) и выпаривали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле. Элюирование петролейным эфиром/этилацетатом 70/30 приводило к получению 1,1 г (2,7 ммоль) очищенного соединения 3 (выход 84%). ХН-ЯМР (CDC13) 5: 0,62 (с, ЗН, СН3-18), 0,87 (с, ЗН, СНз-19), 0,92 (д, ЗН, СН3-21) , 2,38 (м, 1Н, СН-23), 3,273,40 (м, 1Н, СН-3), 3,55 (шир.с, 1Н, СН-7), 3,63 (с, ЗН, С02СН3) .
с) 23(R)-метил-За,7а-дигидрокси-5р-холан-24-оевая кислота (lb) и 23(S)-метил-За,7а-дигидрокси-5р-холан-24-оевая кислота (1с)
Метил-23-метил-За,7а-дигидрокси-5р-холан-24-оат 0,97 г (2,3 ммоль) растворяли в МеОН (25 мл) и добавляли 10% NaOH в МеОН (5,7 мл, 14,2 ммоль). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 16 часов. Смесь подкисляли Зн НС1 и экстрагировали EtOAc (3x20 мл). Объединенные органические фракции промывали солевым раствором (1x50 мл), высушивали (Na2S04) и выпаривали в вакууме. Остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле. Элюирование СНС13:МеОН (95/5) приводило к получению 1,5 г (65 %) 23(S)-метил-За,7а-дигидрокси-5р-холан-24-оевой кислоты и 330 мг 23 (R)-метил-За, 7а-дигидрокси-5|3-холан-24-оевой кислоты.
23 (S) -метил-За, 7а-дигидрокси-5(Ь-холан-24-оевая кислота (lb): т.пл.: 125-126°С, ^-ЯМР (CDC13+CD30D) 5: 0,44 (с, ЗН, СНз-18), 0,69 (с, ЗН, СНз-19), 0,73-0, 76 (д, ЗН СН3-21) , 0,930,97 (д, ЗН, -СН3), 2,36 (м, 1Н, СН-23), 3,15-3,38 (м, 1Н, СН-3), 3,62 (шир.с, 1Н, СН-7), 13С-ЯМР (CDC13 + CD30D) 6: 11,55, 18,43, 18,87, 20,49, 22,69, 28,15, 28,57, 30,14, 32,65, 34,43, 34,61, 34,94, 35,23, 37,06, 39,17, 39,60, 40,81, 41,40, 42,57, 46,54, 50,29, 56,63, 68,24, 71,62, 179,99.
23 {R) -метил-За, 7а-дигидрокси-5|3-холан-24-оевая '' кислота
(Ic) : т.пл.: 163-164°С, ^-ЯМР (CDC13+CD30D) 5: 0,43 (с, ЗН, СНз-18), 0,65 (с, ЗН, СНз-19), 0,65-0,69 (д, ЗН СН3-21) , 0,830,86 (д, ЗН, -СН3), 2,20 (м, 1Н, СН-23), 3,09-3,15 (м, 1Н, СН-3), 3,58 (шир.с, 1Н, СН-7), 13С-ЯМР (CDC13+CD30D) 5: 11,94, 16,40, 18,30, 20,93, 23,06, 23,89, 28,85, 30,52, 33,08, 34,16, 34,91, 35,38, 35,68, 37,14, 39,49, 39,64, 40,04, 40,17, 41,92, 43,05, 50,69, 57,10, 68,51, 72,01, 181,09.
ПРИМЕР 2: Получение 23 (S) - и 23 [R) -метил-ба-метил-За,7а-дигидрокси-5|3-холан-24-оевой кислоты (1ЬЗ, 1сЗ)
Получали следующие соединения путем алкилирования 6а-метил-За, 7а-дигидрокси-5(3-холан-24-оевой кислоты согласно методике из Примера 1.
23 (S) -метил-ба-метил-За, 7а-дигидрокси-5(3-холан-24-оевая кислота (1ЬЗ): т.пл.: 98-100°С, ^-ЯМР (CDC13) 5: 0,63 (с, ЗН, СН3- 18), 0,89 (с, ЗН, СН3- 19), 0,92-1,00 (м, 6Н, СН3-21 и СН3-6), 1,15-1,19 (д, ЗН, -СН3) , 2,45-2,73 (м, 1Н, СН-23), 3,313,52 (м, 1Н, СН-3), 3,58 (шир.с, 1Н, СН-7), 13С-ЯМР (CDC13) 5: 11,76, 15,72, 18,58, 18,88, 20,63, 23,11, 23,65, 28,19, 30,21, 30,47, 32,64, 33,79, 33,97, 34,61, 35,42, 35,66, 37,03, 39,60, 40,01, 40,71, 42,71, 47,35, 50,44, 56,60, 72,34, 72,87, 182,37.
23 (R) -метил-За, 7а-дигидрокси-5|3-холан-24-оевая кислота (1сЗ) : т.пл.: 89-90°С, hl-HMP (CDC13+CD30D) 5: 0,65 (с, ЗН, СНз-18), 0,88 (с, ЗН, СНз-19), 0,88-0,92 (м, ЗН, СН3-6), 0,95-0,99 (д, ЗН, СНз-21) , 1,08-1,14 (д, ЗН -СН3), 2,35 (м, 1Н, СН-23), 3,29-3,48 (м, 1Н, СН-3), 3,57 (шир.с, 1Н, СН-7), 13С-ЯМР (CDCI3+CD3OD) 5: 11,70, 15,66, 16,02, 18,00, 20,61, 23,09, 23,60, 28,51, 30,39, 32,61, 33,72, 33,92, 35,38, 35,65, 36,33, 39,57, 39,94, 42,77, 47,30, 50,39, 56,53, 72,22, 72,83, 180,50.
ПРИМЕР 3: Получение 23(R)- и 23(S)-метил-За,7а,12а-тригидрокси-5р-холан-24-оевой кислоты (Ih, Ii)
Получали следующие соединения путем алкилирования
За, 7а, 12а-тригидрокси-5(3-холан-24-оевой кислоты согласно
методике из Примера 1.
23 (S) -метил-За, 7а, 12а-тригидрокси-5(3-холан-24-оевая кислота (Ih): т.пл.: 237-239°С, ^-ЯМР (CDC13) 5: 0,63 (с, ЗН, СНз-18), 0,87 (с, ЗН, СНз-19), 0,96-0,98 (м, ЗН, СН3-21), 1,07
1,11 (Д, ЗН, -СН3) , 2,44-2, 73 (м, 1Н, СН-23), 3,35-3, 50 (м, 1Н, СН-3), 3,82 (шир.с, 1Н, СН-7) 3,95 (шир.с, 1Н, СН-12), 13С-ЯМР (ДМСО) 5: 12,72, 17,60, 19,24, 19,24, 23,00, 23,19, 26,59, 27,78, 28,88, 30,72, 34,77, 35,22, 35,66, 37,19, 41,84, 46,19, 47,27, 49,01, 66,69, 70,88, 71,45, 178,25.
23 (R) -метил-За, 7а, 12а-тригидрокси-5(3-холан-24-оевая кислота (Ii) : т.пл.: 221-223°С, ^-ЯМР (CDC13) 5: 0,63 (с, ЗН, СНз-18), 0,87 (с, ЗН, СНз-19), 0,96-0,98 (м, ЗН, СН3-21), 1,071,11 (д, ЗН, -СН3) , 2,44-2, 73 (м, 1Н, СН-23), 3,35-3,50 (м, 1Н, СН-3), 3,82 (шир.с, 1Н, СН-7) 3,95 (шир.с, 1Н, СН-12), 13С-ЯМР (ДМСО) 5: 12,76, 16,88, 17,31, 23,04, 23,24, 26,62, 28,12, 28,94, 30,81, 33,97, 34,80, 35,28, 35,71, 37,20, 41,85, 46,29, 47,44, 66,67, 70,86, 71,45, 178,77.
ПРИМЕР 4: Получение 23{R)- и 23(S)-метил-ба-метил-За, 7а, 12а-тригидрокси-5|3-холан-24-оевой кислоты (Ih3, ИЗ)
Получали следующие соединения путем алкилирования 6а-метил-За, 7а, 12а-тригидрокси-5|3-холан-24-оевой кислоты согласно методике из Примера 1.
23 (S) -метил-ба-метил-За, 7а, 12а-тригидрокси-5|3-холан-24-оевая кислота (Ih3): т. пл. : 131-134°С, ХН-ЯМР (CDC13+CD30D) 5: 0,65 (с, ЗН, СНз-18), 0,87 (с, ЗН, СНз-19), 0,97-1, 00 (м, ЗН, СНз-21) , 1,14-1,18 (д, ЗН, -СН3), 1,23 (м, 1Н, СН-6), 2,52 (м, 1Н, СН-23), 3,32-3, 50 (м, 1Н, СН-3), 3,55 (шир.с, 1Н, СН-7) 3,94 (шир.с, 1Н, СН-12), 13С-ЯМР (CDC13 + CD30D) 5: 12,43, 145,66, 17,62, 18,92, 22,70, 23,14, 26,21, 27,45, 28,01, 30,03, 33,44, 34,11, 34,42, 35,30, 36,71, 39,97, 40,45, 41,73, 46,45, 47,25, 72,13, 72,76, 73,01,180,53.
23 (R) -метил-ба-метил-За, 7а, 12а-тригидрокси-5(3-холан-24-оевая кислота (113): т.пл.: 109-110°С, ХН-ЯМР (CD3OD) 5: 0,72 (с, ЗН, СНз-18), 0,91 (с, ЗН, СНз-19), 1,07-1,11 (м, 6Н, -СН3 и СНз-21), 2,37-2,53 (м, 1Н, СН-23), 3,15-3,42 (м, 1Н, СН-3), 3,53 (шир.с, 1Н, СН-7) 3,97 (шир.с, 1Н, СН-12), 13С-ЯМР (CD3OD) 5: 11,61, 15,04, 15,32, 16,15, 22,04, 22,75, 26,27, 27,62, 28,18, 29,61, 32,91, 33,74, 34,31, 35,06, 35,18, 36,56, 39,70, 40,25, 41,68, 46,19, 46,31, 71,76, 71,77, 72,62, 180,11.
ПРИМЕР 5: Получение 23 (R) - и 23 (S) -метил-За-гидрокси-5(3
холан-24-оевой кислоты (Ip, Iq)
Получали следующие соединения путем алкилирования За-гидрокси-5(3-холан-24-оевой кислоты согласно методике из Примера 1.
23(5)-метил-За-гидрокси-5р-холан-24-оевая кислота (1р): т.пл.: 161-162°С, ХН-ЯМР (CDC13+CD30D) 6: 0,60 (с, ЗН, СН3-18), 0,88 (с, ЗН, СНз-19), 0,92-1,01 (м, ЗН, СН3-21) , 1,13-1,16 (д, ЗН, -СН3), 2,55 (м, 1Н, СН-23), 3,60 (м, 1Н, СН-3), 13С-ЯМР (CDC13+CD30D) 5: 11,97, 18,52, 18,87, 20,73, 23,30, 24,14, 26,34, 27,10, 28,15, 30,18, 34,48, 34,50, 35,23, 35,74, 36,06, 37,01, 40,13, 40,34, 40,74, 41,99, 42,68, 56,43, 56,75, 71,70, 181,42 .
23 (R) -метил-За-гидрокси-5(Ъ-холан-24-оевая кислота (Iq): т.пл.: 152-153°С, ^-ЯМР (CDC13+CD30D) 6: 0,63 (с, ЗН, СН3-18), 0,89 (с, ЗН, СНз-19), 0,94-1, 03 (м, ЗН, СН3-21), 2,45 (м, 1Н, СН-23), 3,59 (м, 1Н, СН-3), 13С-ЯМР (CD3OD) 5: 11,98, 15,97, 18,00, 20,75, 23,31, 24,14, 26,34, 27,11, 28,48, 30,26, 33,68, 34,50, 35,26, 35,77, 36,15, 36,46, 39,59, 40,13, 40,36, 42,01, 42,79, 56,45, 56,76, 71,71, 181,02.
Реактивы и условия: а) рТСК, МеОН, ультразвук, количеств., Ь) СН2(ОСН3)2, Р205, СНС13, 97%. с) LDA, Mel, -78°С- d) МеОН,
ПРИМЕР 6: Получение 23(S)-метил-За,7а,12а-тригидрокси-6а-зтил-5р-холан-24-оевой кислоты (Ih3e)
HCl, 45°C. e) MeOH, NaOH, 45°C, 41%. Полный выход: 39,7 %.
Синтез 23(S)-метил-За,7a,12а-тригидрокси-6а-этил-5р-холан-24-оата (2):
К раствору 1 (2,78 г, 6,37 ммоль) в МеОН (120 мл) добавляли рТСК (0,12 г, 0,63 ммоль), и смесь обрабатывали ультразвуком в течение 90 минут. Зетем смесь выпаривали при пониженном давлении, и полученный остаток разводили AcOEt (120 мл), промывали Н20 (3x100 мл), солевым раствором (100 мл), высушивали над безводным Na2S04, и выпаривали при пониженном давлении для получения соединения 2 (количественный выход), которое использовали для следующего этапа без дополнительной очистки.
гН-ЯМР (CDC13) 5 0,63 (ЗН, с, I8-CH3) , 0,84-0,88 (6Н, с, 19-СН3+СН3СН2) , 0,97 (ЗН, д, J=6, 62 Гц, 21-СН3), 3,30 (1Н, м, 3-СН) , 3,48 (ЗН, с, СООСНз) , 3,62 (1Н, м, 7-СН), 3,97 (1Н, м, 12-СН) .
Метил-За,7а,12а-тригидрокси-6а-этил-5р-24-оат (3):
К раствору 2 (2,50 г, 5,55 ммоль) в СНС13 (60 мл) и диметоксиметане (34,10 мл, 166,66 ммоль) порциями добавляли Р205 (14,18 г, 99,90 ммоль), и полученную суспензию механически смешивали в течение 4 5 минут. Затем смесь фильтровали и органический слой обрабатывали 10 % NaHC03 (50 мл) в течение 10 минут. Затем органический слой отделяли, и водный слой экстрагировали СНС13 (3x50 мл). Собранные органические слои промывали солевым раствором (100 мл), высушивали над безводным Na2S04, и выпаривали при пониженном давлении для получения соединения 3 (3,14 г, 97%), которое использовали в следующем этапе без дополнительной очистки. 1Н-ЯМР (CDC13) 5: 0,67 (ЗН, с, I8-CH3) , 0,88-1,04 (9Н, м, 19 - СН3 + СН3СН2 + 21 - СН3) , 3,30 (1Н, м, 3-СН) , 3,30-3,40 (7Н, м, 3-СН+2хСН30СН20) , 3,45 (ЗН, с, СН30СН20) , 3,50 (1Н, м, 7-СН), 3,66 (ЗН, с, СООСНз), 3,79 (1Н, м, 12-СН), 4,57-4,75 (6Н, м, ЗхСН30СН20).
23(S)-метил-За,7а,12а-тригидрокси-ба-этил-5р-холан-24-оевая кислота (Ih3e):
К раствору диизопропиламина (0,56 мл, 4,026 ммоль) в свежем дистиллированном ТГФ (15 мл), охлажденном до' -78°С, в
атмосфере N2 по капле добавляли i:LBuLi 2, 5н в гексане (1,53 мл, 3,840 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при -7 8°С в течение 30 минут, и затем по капле добавляли раствор 3 (350 мг, 0,60 1 ммоль), растворенный в свежедистиллированном ТГФ (7 мл). Полученный раствор перемешивали при -78 °С в течение 90 минут. Добавляли йодометан (0,56 мл, 9,015 ммоль), реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 60 минут и затем медленно подогревали до комнатной температуры в течение ночи. Затем смесь выпаривали при пониженном давлении, после чего полученный остаток разводили Н20 (30 мл) и экстрагировали AcOEt (3x30 мл). Собранные органические слои промывали солевым раствором (30 мл), высушивали над безводным Na2S04 и выпаривали при пониженном давлении. Затем остаток обрабатывали раствором 37% МеОН/НС1 (20 мл, 20:1 об/об) при 45°С в течение 8 часов. Смесь выпаривали при пониженном давлении, и полученный остаток разводили Н20 (3 0 мл) и экстрагировали AcOEt .(3x30 мл). Объединенные органические слои промывали солевым раствором (100 мл), высушивали над безводным Na2S04, и выпаривали при пониженном давлении. Полученный остаток обрабатывали 10% раствором NaOH в МеОН (15 мл) при 45°С в течение 24 часов. Затем смесь выпаривали при пониженном давлении, и полученный остаток разводили Н20 (20 мл) , промывали 1Рг20 (3x15 мл) , подкисляли Зн НС1, и, в завершении экстрагировали СНС13 (3x20 мл) . Органические слои промывали солевым раствором (100 мл), высушивали над безводным Na2S04 и выпаривали. Полученный остаток очищали хроматографией среднего давления (колонка: "RP-18 Lobar В", МеОН/Н20 от 5:5 до 6:4, 50 фунт/кв.дюйм) для получения соединения 4 (47 мг, 41 %). Т.пл.: 195-197°С.
XH-HMP (CDCI3 + CD3OD) 5: 0,63 (ЗН, с, I8-CH3), 0,84-0,88 (6Н, м, 19-СН3+СН3СН2) , 0,98 (ЗН, д, J=6,60 Гц, 21-СН3), 1,10 (ЗН, д, J=6,80 Гц, СН(СНз) СООН) , 2,61 (м, 1Н, СН (СН3) СООН) , 3,35 (1Н, м, 3-СН), 3,65 (1Н, м, 7-СН), 3,92 (1Н, м, 12-СН), 13С-ЯМР (CDC13+CD30D) 5: 11,51, 12,34, 17,52, 19,19, 22,09, 22,67, 23,11, 26,65, 27,40, 28,05, 29,83, 33,31, 34,56, 35,06, 35,40, 38,67, 39,90, 41,11, 41,39, 41,69, 45,10, 46,39, 47,32, 70,65, 71,79, 72,90, 182,07.
(i) ЭДА (этилдиазоацетат) , Rh2(OAc)4, СН2С12, комнатная температура; (ii) (a) NaOH, EtOH, кипячение с обратным холодильником, (Ь) ЖХСД (жидкостная хроматография среднего давления)
За,7а-дигидрокси-22,23-метилен-5р-холан-24-оевые кислоты (Io5, Ip5, Iq5 и 1г5).
Этилдиазоацетат (0, 478 г, 1,19 ммоль) в сухом СН2С12 (15 мл) медленно добавляли по капле к перемешиваемой суспензии За,7а-диацетокси-5-норхолан-22,23-ен (1) (0,6 г, 1,39 ммоль) в присутствии диродий (II) тетраацетата (9 мг, 0,02 ммоль) в сухом СН2С12 (15 мл) в атмосфере азота при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали и промывали Н20 (20 мл) , высушивали (Na2S04) и выпаривали в вакууме, и таким образом получали смесь четырех диастереоизомерных сложных эфиров 2. Сложные эфиры 2 последовательно растворяли в EtOH (15 мл) и обрабатывали Юн раствором NaOH (10 мл) с кипячением с обратным холодильником в течение 4 часов, охлаждали, вливали в холодную
Н20 (50 мл), подкисляли 2н НС1 и экстрагировали EtOAc (3x15 мл) . Органическую фазу промывали солевым раствором (10 мл), высушивали (Na2S04) и выпаривали в вакууме. Остаток очищали хроматографией на силикагеле. Элюирование СН2С12/МеОН 96/4 с 0,1% АсОН приводило к получению 0,087 г (выход 15%) (225,23^)-За,7а-дигидрокси-22,23-метилен-5р~холан-24-оевой кислоты (1о5) и 0,065 г (выход 11,5%) (22R,23R)-За,7а-дигидрокси-22,23-метилен-5|3-холан-24-оевой кислоты (Iq5). Элюирование СН2С12/МеОН 95,5/4,5 с 0,1% АсОН давало 0,18 г (выход 32%) (22S,23R)- За,7а-дигидрокси-22,23-метилен-5р-холан-24-оевой кислоты (1р5) и 0,15 г (выход 26,7%) (22R,23S)-За,7а-дигидрокси-22,23-метилен-5?-холан-24-оевой кислоты (1г5) в виде белых твердых веществ.
1о5. Т.пл.: 148-150°С [a]20D+5,16 (с 1, EtOH) , ХНЯМР (CD3OD и CDC13) 5: 0,67 (с, ЗН, 18-СН3) , 090 (с, ЗН, 19-СНЗ), 0,96 (д, J=6,68 Гц, ЗН, 21-СНз) , 3,40-3, 50 (м, 1Н, 3-СН), 3,85 (м, 1Н, 7-СН), 13С ЯМР (CDCI3) 5: 12,20, 16,80, 17,08, 20,80, 21,00, 23,15, 24,10, 28,30, 30,80, 31,30, 33,30, 34,80, 34,90, 35,40, 35,70, 39,80, 39,90, 41,80, 43,40, 50,55, 58,20, 68,90, 72,30, 177,00.
Iq5. Т.ПЛ.: > 230°С, [a]20D-38,19 (с 1,1, СН3С1/МеОН 1:1), ХН ЯМР (CD3OD и CDCI3) 5: 0,50 (с, ЗН, 18-СН3), 0,86 (с, ЗН, 19-СН3), 0,96 (д, J=6,40 Гц, ЗН, 21-СНз), 3,40-3, 60 (м, 1Н, 3-СН), 3,80 (м, 1Н, 7-СН), 13С ЯМР (CDCI3) 5: 12,00, 12,50, 20,90, 21,00, 21,10, 23,00, 23,80, 27,10, 30,50, 31,00, 32,10, 33,10, 34,80, 35,30, 35,60, 39,50, 39,70, 39,85, 41,80, 43,00, 50,40, 58,50, 68,60, 72,00, 176,90.
1р5. Т.пл.: 221-225°С, [a]20D-40,22 (cl, EtOH), ХН ЯМР
(CD3OD и CDCI3) 5: 0,56 (с, ЗН, 18-СН3), 0,86 (с, ЗН, 19-СН3) , 1,16 (д, J=6,60 Гц, ЗН, 21-СНз), 3,10-3,30 (м, 1Н, 3-СН), 3,85
(м, 1Н, 7-СН), 13С ЯМР (CDCI3) 5: 12,10, 18,30, 18,55, 20,00, 20,90, 23,10, 24,00, 28,20, 30,70, 31,70, 33,20, 34,80, 35,40, 35,70, 39,80, 40,10, 41,80, 43,15, 50,40, 57,80, 68,90, 72,20, 178,40,
1г5. Т.пл.: 136-140°С, [a] 20D +13,66 (с 1, EtOH), ХН ЯМР (CD3OD и CDCI3) 5: 0,56 (с, ЗН, 18-СН3), 0,86 (с, ЗН, 19-СН3) , 0,96 (д, J=6,66 Гц, ЗН, 21-СНз), 3,40-3,60 (м, 1Н, 3-СН), 3,80
(м, 1Н, 7-СН), 13С ЯМР (CDCI3) 5: 12,00, 13,50, 19,90, 20,90, 22,50, 23,10, 24,00, 28,00, 30,70, 31,60, 33,20, 34,90, 35,40, 35,65, 39,70, 39,73, 41,80, 43,10, 50,40, 58,00, 68,80, 72,20, 177,60 .
ПРИМЕР 8: Активность in vitro TGR5 и FXR
Потенциал и эффективность действия соединений изобретения на рецептор TGR5 оценивали с помощью тестов in vitro.
В таблице ' 1 указано, что соединения по изобретению представляют собой мощные и селективные модуляторы TGR5. Введение алкильной группы в положении С-23 желчной кислоты придает селективность рецептору TGR5 по сравнению с FXR. Это очевидно из наблюдаемых биологических результатов для FXR и TGR5, полученных с ХДХК, 6-МеХДХК и 6,23-диМе-ХДХК (смесь изомеров 23-i?,S) как указано в Таблице 1. 6,23-диМе-ХДХК является в 100 раз более мощной на рецепторе TGR5 по сравнению с рецептором FXR. Описание связывания рецептора TGR5 с использованием тестов in vitro см., например, в публикации Kawamata, J. Biol. Chem 2003, Vol. 278 No. 11, p. 9435-9440). Активность на FXR оценивали с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции FRET для рекрутинга пептида SRC-I в человеческий FXR с использованием бесклеточного фермент-связанного иммуносорбентного анализа ELiSA. См. Blanchard et al. WO 00/37077.
23 {R + S) МеХДХК
-Ме-ба-(13a)
"\-со2н
(R+S)
EC50: 15,62 мкмоль, эффективность
EC50: 0,11 мкмоль, эффективность
S^""OH
60%
123%
В таблицах 2 и 3 показаны дополнительные соединения, оцениваемые на активность TGR5. Активность люциферазы определяли в клетках СНО, устойчиво экспрессирующих hTGR5, или транзиторно котрансфицированных вектором экспрессии hTGR5 и цАМФ чувствительный элемент (CRE) - зависимым геном-репортером люциферазы. Некоторые из соединений дополнительно анализировали в тесте репортера люциферазы для оценки их способности активировать ядерный рецептор желчной кислоты FXR.
Таблица 2
Наименование
TGR5 ECso
Активность TGR5
225,235-CCDCA* (1о5)
а-ОН
1.33
22S,23X-CCDCA* (1р5)
а-ОН
^Јl^co2h
2.91
102
22i?523i?-CCDCA* (Iq5)
а-ОН
со2н
75.7
22/?,23S-CCDCA* (Ir5)
а-ОН
^Л-со2н
> 100
*Данные представляют средние значения по меньшей мере трех независимых анализов CRE-зависимого репортера люциферазы в TGR5-трансфицированных клетках СНО. Единицы для оценки ЕС50 указаны в мкмоль, единицы для оценки эффективности указаны в % от значения 10 мкмоль ЛХК.
Наименование
FXR
ЕС50 мкМ
Активность FXR
TGR5
ЕС50
мкМ
Активность TGR5
Соотношение
ЕС50 (TGR5/
FXR)
г X"/ °н
4.39
105
Г Т^у он
j^-^''ОН
> 51.9
75*
аДанные показывают средние значения по меньшей мере трех независимых экспериментов. Значение эффективности выражено как % активности от значения 10 мкмоль J1XK (TGR5) или 10 мкмоль баХДХК (FXR).
ьПлато уровня активации не достигнуто; максимальная тестированная концентрация составляла 125 мкмоль для lb и 100 мМ для Ii.
Данные в таблицах 2 и 3 можно определить с помощью способов, известных в данной области техники, например, согласно описанию ниже.
Яла змиды
Клоны MGC:40597 из Коллекции генов млекопитающих NIH (также именуемый pCMVSPORT6/hTGR5 или pTGR5) и pcDNA3.1(+) были получены из компании Invitrogen (Carlsbad, СА) . pCRE-Luc и pCMVp были получены из компании Clontech (Palo Alto, СА). рСМХ-hFXR и pCMX-mRXRa были предоставлены в дар д-ром David J. Mangelsdorf (Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center). pEcREx7-Luc были предоствлены в дар д-ром Richard A. Heyman (X-ceptor Therapeutics, СА).
Клеточная культура
Клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки NCI-H716, клетки НерЗВ и клетки C0S1 были получены из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA) . Культуральные среды для клеток, сыворотки и добавки поставлялись компаниями Invitrogen или Sigma-Aldrich. Все клетки СНО сохранялись в минимальной эссенциальной среде а (а-МЕМ) с добавлением 10%
(об/об) эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) и 100 мкмоль неосновных аминокислот (NEAA). Клетки NCI-H716 сохраняли в суспензии в среде RPMI-1640 с добавленем 10% ЭБС (v/v), 10 мМ HEPES и 1 мМ пирувата натрия. Клетки НерЗВ сохраняли в среде Игла с добавлением 10% ЭБС (об/об) и 100 мкмоль NEAA. Клетки COS1 сохраняли в модифицированной по Дульбекко среде Игла
(DMEM) с добавлением 10% ЭБС (об/об) . Во все культуральные среды для клеток добавляли 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата. Клетки выращивали при 37°С в атмосфере 5% С02, пассировали каждые 2-6 дней и для каждого эксперимента высевали заново.
Транзиторные трансфекции
Клетки СНО высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 3,5х104 клеток/на лунку, культивировали в течение 24 часов, и затем трансфицировали 150 нг человеческой (h) плазмидой экспрессии TGR5 (pCMVSPORT6/hTGRS) и 100 нг цАМФ-чувствительного элемента (CRE)-зависимой репортерной плазмиды люциферазы (pCRE-Luc) в каждой лунке с использованием реактива Липофектамин 2000 (Invitrogen) согласно инструкциям изготовителя. Через 6 часов инкубации клетки однократно промывали фосфатно-буферным раствором (ФБР) и заменяли среду на среду DMEM, содержащую 0,1% (вес/об) бычьего сывороточного альбумина (БСА). Через следующие 18 часов инкубации клетки обрабатывали в течение 5 часов каждым из соединений в разных концентрациях в новой DMEM, содержащей 0,1% (вес/об) БСА. После обработки клетки лизировали с помощью лизирующего буфера 50 мкл (25 мМ Трис-С1 (рН 7,6), 2 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотретиола (ДТТ) , 10% (об/об) глицерина и 1% (об/об) тритона Х-100) путем цикла замораживания-оттаивания и подвергали анализу с люциферазой,
как описано ниже.
Клетки C0S1 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 2,5х104 клеток/на лунку в среде DMEM с добавлением 10% (об/об) очищенной на активированном угле ЭБС, культивировали в течение 24 часов, и затем трансфицировали 25 нг плазмиды экспрессии hFXR (pCMX-hFXR), 25 нг плазмиды экспрессии мышиного (т) ретиноидного X рецептора a (RXRa) (pCMX-mRXRa) , 50 нг репортерной плазмиды (pEcREx7-Luc) и 50 нг pCMV(3 в качестве внутреннего контроля в каждой лунке с использованием реактива Липофектамин 2000 (Invitrogen). Через 24 часа клетки дважды промывали ФБР и обрабатывали каждым из соединений в разных концентрациях в свежей DMEM с добавлением 10% (об/об) очищенной на активированном угле ЭБС в течение 24 часов. После обработки клетки лизировали с помощью лизирующего буфера 50 мкл путем цикла замораживания-оттаивания и подвергали анализам и с люциферазой, и с (3-галактозидазой, как описано ниже. Стандартизированные значения люциферазы определяли как отношение активности люциферазы к активности (3-галактозидазы.
Анализы с люциферазой и с (З-галактозидазой
Для анализов с люциферазой смешивали 2 0 мкл клеточного лизата со 100 мкл люциферазного реакционного буфера [235 мкмоль люциферина, 265 мкмоль АТФ и 135 мкмоль коэнзима А (КоА)] и определяли люминесценцию на оборудовании CentroXS3 LB960
(Berthold Technologies, Bad Wildbad, Германия). Для анализа с р-галактозидазой 10 мкл клеточного лизата смешивали со 100 мкл буфера Z [60 мМ Na2HP04, 10 мМ КС1, 1 мМ MgS04, 50 мМ ¦ (3-меркаптоэтанола и 0,75 мг/мл о-нитрофенил-|3-Б-галактопиранозида
(ONPG) ] , и инкубировали при 37 °С в течение от 0,5 до 3 часов. Реакции прекращали путем добавления 50 мкл останавливающего буфера (1М Na2C03), и определяли оптическую плотность при 420 нм.
Создание клеток СНО, устойчиво экспрессирующих человеческий TGR5 (клетки CHO-TGR5)
Клетки СНО были трансфицированы 3,8 мкг плазмиды экспрессии hTGR5 (pCMVSPORT6/hTGR5), 3,8 мкг CRE-зависимой репортерной плазмиды люциферазы (pCRE-Luc) и 0,4 мкг плазмиды
экспрессии гена резистентности к неомицину [pcDNA3.1(+)] с использованием липофектамина 2000. Трансфектанты были отобраны с использованием 400 мкг/мл G418 сульфата, и одиночные клоны выращивали по отдельности в 96-луночных планшетах. Проводили скрининг клеточных линий СНО, экспрессирующих TGR5 путем обработки ЛХК с последующими люциферазными анализами. Анализ продукции цАМФ
Клетки NCI-H716 высевали в 96-луночные планшеты с нанесенным 0,75 мг/мл гелем Matrigel (BD Biosciences) согласно инструкциям изготовителя непосредственно перед использованием, с плотностью бхЮ4 клеток/на лунку в среде DMEM с добавлением 10% (об/об) ЭБС, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата, и культивировали в течение 24 часов, что приводило к адгезии клеток на дне планшета. Клетки CHO-TGR5 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 3,5х104 клеток/на лунку в среде а-МЕМ с добавлением 10% (об/об) ЭБС, 100 мкмоль NEAA, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг стрептомицина сульфата, и культивировали в течение 24 часов. Клетки дважды промывали ФБР, затем меняли среду на среду для цАМФ-анализа [DMEM, содержащую 0,1% (вес/об) БСА и 0,5 мМ З-изобутил-1-метилксантина (IBMX)]. После инкубации в течение 30 минут при 37°С клетки обрабатывали каждым соединением в течение 30 минут в новой среде для цАМФ-анализа. После обработки среду удаляли и определяли количество цАМФ с помощью комплекта для скрининга cAMP-Screen (Applied Biosystems, Foster City, СА) согласно инструкциям изготовителя.
Концентрации с 50% эффективности (ЕС50) и определение эффективности
Анализы проводили три раза или четыре раза для каждого условия. Значения ЕС50 определяли с помощью пробит-анализа. Эффективность в анализе с агонистом TGR5 определяли вычислением процента от значения для 10 мкмоль ЛХК, и в анализе с .агонистом FXR от значения 10 мкмоль 6a-Et-XflXK, соответственно. После вычитания среднего значения исходного состояния (при лечении носителем) эти значения использовали для определения ЕС50 и/или эффективности. Вычисление среднего ЕС50 и сравнение ЕС50 разных
соединений выполняли после логарифмического преобразования. Статистический анализ
Статистический анализ выполняли с помощью t-теста Стьюдента, и значения р <0,05 считали статистически значимыми.
Таблица ЗА
Анализ альфа-скрининга
FRET (цАМФ) NCI-H716
Анализ трансактивации
FRET (цАМФ) на клетках Нек.2 93 со
сверхэкспрессией TGR5
Соединение (рассматриваемое и стандартное)
hFXR
(ХДХК=1020 мкмоль)
ЕС50 (мкмоль)
hTGR5
(ЛХК=4 8 мкмоль)
ЕС50 (мкмоль)
hTGR5 (ЛХК=16 мкмоль) ЕС50 (мкмоль)
hTGR5 (ЛХК=0,35 мкмоль) ЕС50 (мкмоль)
lh3e
175
0,9
1,7
0 , 001
Данные в таблице ЗА были получены с помощью описанных ниже способов.
Анализ FRET (определение внутриклеточного содержания цАМФ).
Проводили анализ связывания рецептора путем измерения уровня циклического АМФ (цАМФ) с помощью анализа FRET. Человеческие клеточные линии кишечных клеток (NCI-H716) высевали в 96-луночные планшеты, покрытые непосредственно перед использованием 0,75 мг/мл гелем Matrigel (BD Biosciences) согласно инструкциям изготовителя,: с плотностью 12х103 клеток/на лунку в среде DMEM с добавлением 10% (об/об) ЭБС, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата, и культивировали в течение 24 часов, что приводило к адгезии клеток на дне планшета. Клетки дважды промывали ФБР, затем среду заменяли на среду для анализа цАМФ [OPTIMEM, содержащую 0,1% (вес/об) БСА и 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX)]. После инкубации в течение 60 минут при 37°С клетки в течение 1 часа при комнатной температуре обрабатывали возрастающими концентрациями соединения Ih3 с в стимулирующем буфере (5 мМ HEPES, 0,1% БСА в HBSS (сбалансированном солевом растворе Хенкса) с уровнем рН 7,4) который содержал конъюгированное с
хелатом европия - стрептадивином и ALEXA Фтор-647 антитело анти-цАМФ (PerkinElmer). Уровень внутриклеточного цАМФ определяли с помощью комплекта Lance (PerkinElmer). В качестве контрольного лиганда использовали литохолевую кислоту. Z' фактор использовали для подтверждения анализа. Для получения значения ЕС50 были построены нелинейные кривые регрессии без ограничений с использованием уравнения с четырьмя параметрами и программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Inc). Альфа-скрининговый анализ
Активность FXR оцененивали по методике альфа-скрининга в анализе рекрутинга коактиватора. Альфа-скрининг представляет собой химическое исследование, основанное на изучении гранул, которое используют для изучения биомолекулярных взаимодействий. Связывание молекул, зафиксированных на гранулах, приводит к передаче энергии от одной гранулы к другой, что в итоге производит люминесцентный сигнал. При взаимодействии партнеров химическая энергия передается от донорных на акцепторные гранулы и возникает сигнал. При стимуляции желчных кислот GST-FXR-LBD взаимодействует с пептидом Src-1. Для фиксации GST-слитого FXR-LBD использовали анти-СЗТ-покрытые акцепторные гранулы, тогда как биотинилированный SRC-1 пептид фиксировали донорными стрептадивиновыми гранулами. После облучения 680 нм происходил перенос химической энергии от донорных гранул к акцепторным гранулам через комплекс стрептадивин-донор/Src-l-6no(tm)H/GSTFXR-LBD/aHTH-GST-aK4enTop и возникал сигнал. Анализ проводили в белых малообъемных 384-луночных планшетах Optiplates (PerkinElmer) в конечном объеме 25 мкл, содержащем конечные концентрации 10 нМ очищенного GST-меченого белка FXR-LBD, 30 нМ биотинилированного пептида Src-1, 20 мкг/мл анти-GST акцепторных гранул и 10 мкг/мл стрептавидиновых донорных гранул (PerkinElmer). Тестовый буфер содержал 50 мМ Трис (уровень рН 7,4), 50 мМ КС1, 0,1% БСА и 1 мМ ДТТ. Устанавливали время возбуждения с помощью 1 мкл лигандов (солюбилизированных в 100%-ом ДМСО) в течение 30 минут при комнатной температуре. Поддерживали концентрацию ДМСО в каждой лунке с конечной концентрацией 4%. После добавления смеси обнаружения'' (донорные
и акцепторные гранулы) планшеты икубировали в темноте в течение 4 часов при комнатной температуре, затем данные считывали в анализаторе Envision microplate analyzer (PerkinElmer). Кривые доза-ответ получали трижды и для подтверждения анализа использовали фактор Z'. Для получения значения ЕС50 были построены нелинейные кривые регрессии без ограничений с использованием уравнения с четырьмя параметрами и программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Inc).
Клеточная культура, трансфекция и люциферазный анализ
Клетки HEPG2 и НЕК2 93Т культивировали в среде Е-МЕМ и DMEM
соответственно, и в обе среды добавляли 1%
пенициллин/стрептомицин, 1% L-глутамин и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (с высоким содержанием глюкозы) (Invitrogen, Carlsbad, СА) . Клетки выращивали при 37 °С в атмосфере 5% С02. Все трансфекции осуществляли с помощью трансфекционного реактива Fugene HD Trasfection (мкл) и ДНК (мкг) 5:2, соответственно (Roche). За двадцать четыре часа до трансфекции клетки НЕК293Т или HepG2 высевали на 96-луночные планшеты с плотностью 10000 или 15000 клеток/на лунку, соответственно. Осуществляли транзиторные трансфекции с использованием 100 нг векторного репортера pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] (Promega), 40 нг pGL4.74 (Renilla), в качестве внутреннего контроля эффективности трансфекции, и 10 нг плазмиды экспрессии pCMV-SPORT6-hTGR5. Коллекция генных клонов млекопитающих NIH MGC-.40597 (Invitrogen). Вектор pGEM добавляли для стандартизации количества трансфицированной ДНК в каждом анализе (2 мкг) . Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки в течение 18 часов стимулировались соединением Ih3e с возрастающей концентрацией. В контрольные культуры вводили только носитель (0,1% ДМСО). Затем клетки лизировали с добавлением 75 мкл люциферазного реактива Dual-Glo (Promega) к 75 мкл содержащих среду клеток/лунку. Активность люциферазы Renilla измеряли при добавлении объема реактива Dual-Glo Stop & Glo и оригинальной культуральной среды. Активность люциферазы выражали как отношение люциферазной единицы к единице люциферазы renilla. Каждая точка данных является средним
Предпочтительными являются соединения, имеющие группу
альфа-этила в С-б положении на кольце желчной кислоты. Более
конкретно, наиболее предпочтительны соединения, имеющие группу
альфа-этила в С-6 положении 23-метил-холевой кислоты. Как
показано в таблице ЗА выше, соединения, имеющие группу альфа-
этила в С-6 положении, являлись более мощными, чем
соответствующее С-6-альфа-метил-производное, что было
удивительным и неожиданным.
ПРИМЕР 9: Метаболическая активность олеанолевой кислоты и 6-зтил-23-метил-холевой кислоты (Ih3e) в мышиной модели индуцированного диетой ожирения
Цель исследования состояла в определении способности агониста TGR5 (олеанолевой (ОК) кислоты или 6-этил-23-метилхолевой кислоты (Ih3e) к коррекции in vivo развития ожирения и связанной резистентности к инсулину. Для проверки этого предположения OK/Ih3e вводили с кормом в течение 16 недель самцам мышей C57BL6J, которых в течение 10 недель перед исследованием подвергали кормлению высожирной пищей.
Протокол II
В предыдущем исследовании наблюдали действие ОК как селективного агониста TGR5, который не вызывал отвращение к пище. Вместе с тем, у животных, получавших ОК в дозе 100 мг/кг/день, были выявлены некоторые признаки токсичности, тогда как более низкие дозы переносились хорошо. Поэтому в этом исследовании ОК вводили в дозе 50 мг/кг/день.
В исследованиях in vitro выявлено, что Ih3e является мощным и селективным лигандом TGR5. Не предполагалось каких-либо проблем токсичности при введении 1пЗе в концентрациях в 50 раз меньше.
В этом исследовании 48 самцов мышей C57BL6J (в возрасте 5 недель) разделяли на две группы: 24 животных одной группы (группы 1, 2 и 3) получали обычный рацион, тогда как другие 24 мыши получали высожирную диету в течение 10 недель (группа 4, 5 и 6) . Затем животных исследовали в течение 16 недель. Пять групп из 10 животных имели следующие назначения: 1: обычный рацион
2: обычный рацион+ОК 50 мг/кг/день
3: обычный paui40H+6Et23MeCA (Ih3e) 30 мг/кг/день
4: высожирная пища
5: высожирная пища+ОК 5 0 мг/кг/день
6: высожирная nniiia + 6Et23IVIeCA (Ih3e) 30 мг/кг/день
На протяжении всего исследования массу тела и рацион
питания контролировали два раза в неделю.
Неделя 2: Конституцию тела анализировали для всех групп с
помощью двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (Dexascan).
Неделя 1: Сывороточное содержание трансаминаз, глюкозы, триглицеридов, холестерина, липопротеинов высокой плотности ЛВП-С, липопротеинов низкой плотности ЛНВ-С и инсулина измеряли во всех группах после периода голодания в течение 12 часов, затем мышам назначали диету, указанную выше (день 0).
Неделя 2: Сывороточное содержание трансаминаз, глюкозы, триглицеридов, холестерина, ЛВП-С, ЛНВ-С и инсулина измеряли во всех группах после периода голодания в течение 12 часов (день
Неделя 4: Определяли толерантность к глюкозе у всех животных с помощью внутрибрюшинного теста толерантности к глюкозе (IPGTT). Перед указанным исследованием животные голодали в течение 12 часов. Путем непрямой калориметрии измеряли ночное потребление энергии в группах 1, 4, 5 и 6 (обычный рацион, высокожирная диета и высокожирная диета с OK/6Et23MeXnXK (Ih3e).
Неделя 8: Во всех группах повторно анализировали конституцию веса тела с помощью декса-сканирования Dexascan. Сывороточное содержание трансаминаз, глюкозы, триглицеридов, холестерина, ЛВП-С, ЛНВ-С и инсулина измеряли во всех группах после периода голодания в течение 12 часов (день 56).
Неделя 9: В течение 30 часов изучали циркадную активность в группах 4, 5 и б (мыши, получавшие высожирную пищу).
Неделя 10: В группах 4, 5 и 6 измеряли кровяное давление и сердечный ритм.
Неделя 11: Измеряли ректальную температуру у всех животных при комнатной температуре в 10.00.
Циркадную активность определяли в группах 1, 2, 3 и 4.
Неделя 12: Определяли толерантность к глюкозе у всех животных с помощью внутрибрюшинного теста толерантности к глюкозе (IPGTT). Во время IPGTT также производили забор крови для анализа уровня инсулина. Перед указанным исследованием животные голодали в течение 12 часов. Во всех группах на протяжении 2 4 часов собирали фекалии для измерения содержания липидов в фекалиях.
Неделя 16: Всем животным проводили холодовый тест с измерением температуры тела животных, содержащихся при 4°С.
Через три дня животных умерщвляли. При забивании собирали кровь для анализа на: липиды плазмы (общий холестерин ОХ, триглицериды ТГ, ЛВП-С, свободные жирные кислоты СЖК); функции печени (АЛТ, ACT, щелочная фосфатаза, гамма-глутаминтрансфераза у-ГТ); глюкоза и инсулин; профили липопротеина в плазме у выбранных групп (эксклюзионная хроматография).
Осуществляли забор печени, тонкой кишки, жировых тканей
(белой жировой ткани БЖТ и коричневой жировой ткани КЖТ), поджелудочной железы, сердца и мышечной ткани, все взвешивали и сохраняли для дальнейших исследований, включающих в себя стандартный гистологический анализ (окрашивание гематоксилин-эозином ГЭ, окрашивание сукцинатдегидрогеназой, окрашивание oil-red-О и морфологический клеточный анализ); содержание липидов в ткани; электронную микроскопию КЖТ и мышц для изучения митохондрий; выделение РНК для исследования путем количественной RT-ПЦР экспрессии отдельных генов, вовлеченных в метаболизм и энергетический гомеостаз; экстракцию белка для исследования пост-трансляционных модификаций, таких как ацетилирование рассматриваемых белков (например, PGC-la).
Ill - Подробные методики
А. Методики и диеты животных
Содержание и работа с животными
Мышей содержали по группам (5 животных на клетку) в специальных беспатогенных условиях с режимом циклов света/темноты 12 часов:12 часов (с 7.00), при температуре (2022 °С) и регулируемой влажности в виварии, согласно инструкциям Европейского Экономического Сообщества. Животные имели свободный доступ к воде и пище.
Питьевая вода
Химический состав воды из-под крана регулярно анализировали с целью проверки отсутствия потенциальных токсичных веществ в институте Institut d'Hydrologie, ULP, Страсбург. Питьевую воду обрабатывали НС1 и НС104, чтобы поддерживать уровень рН от 5 и 5,5 и концентрацияю хлорина от 5 до б промилле.
Диета
Стандартный рацион для грызунов получали из ОАР, и высокожирную пищу поставляла фирма Research Diet. Мышам давали или обычный рацион (16% белка, 3% жира, 5% волокна, 5% зола) или высокожирную пищу (20% белка, 20% углеводов, 60% жира). Олеанолевую кислоту и 6Et23MeXflXK (Ih3e) подмешивали и к порошкообразному обычному корму, и к высокожирной пище в следующих пропорциях: 0,5 г ОК/кг пищи для введения "в дозе 5 0
мг/кг/день и 0,08 г 6Et2 ЗМеСА (Ih3e)/ кг пищи для введения в дозе 10 мг/кг/день. Затем восстанавливали форму шариков. Контрольные группы получали шарики корма, поставляемые указанной компанией. Учитывая консистенцию высокожирного корма, воду в смесь с ОК совсем не добавляли. В случае обычного корма, который труднее восстанавливал форму, к порошку добавляли минимальное количество воды для воссоздания шариков, которые затем высушивали на воздухе. Новые порции корма приготовляли еженедельно.
Забор крови
Кровь собирали из ретроорбитальной пазухи с анестезией или из хвостовой вены. Анестезия
Для экспериментального декса-сканирования животным проводили анестезию смесью кетамина (200 мг/кг)/ксилазина (10 мг/кг), вводимой путем внутрибрюшинной инъекции.
Для венепункции животным проводили ингаляционную анестезию смесью изофлурана-02.
В. Биохимия
Анализы проводили на автоматизированной лабораторной рабочей станции Olympus AU-400 с использованием коммерческих реактивов (Olympus).
Анализ липидов и липопротеинов
Содержание в сыворотке триглицеридов, общего холестерина и ЛВН-холестерина определяли ферментным анализом. Сывороточное содержание холестерина определяли после преципитации апо-В-содержащих липопротеинов фосфорновольфрамовой кислотой/Мд (например, Roche Diagnostics, Mannheim, Германия). Уровень свободных жирных кислот определяли с помощью комплекта Wako (например, Neuss, Германия) согласно инструкциям изготовителя. Исследование метаболизма и эндокринного статуса Концентрацию глюкозы в крови измеряли высокоточным анализатором Precision Q.I.D (например, системой Medisense), используя электроды Medisense Precis (например, Abbot Laboratories, Medisense products, Бедфорд, США) . Этот способ подтверждали сравнением данных анализатора Precision' Q.I.D со
значениями классических измерений глюкозы. Способ Precision Q.I.D был выбран благодаря минимальному количеству требуемой крови и, следовательно, его можно применять для многократных измерений, например, в ходе IPGTT. Содержание инсулина в плазме (например, Mercodia, Uppsala, Швеция) определяли путем ELISA согласно инструкциям изготовителя.
С. Метаболическое исследование
Профили липопротеина
Профили липопротеина получали с помощью жидкостной экспресс-хроматографии белка, позволяющей разделение трех основных классов липопротеинов очень низкой плотности ЛПОНП, ЛНП и ЛВП.
Внутрибрюшинный тест толерантности к глюкозе (IPGTT) Пероральный тест толерантности к глюкозе
Тест IPGTT проводили у мышей, голодавших в течение ночи (12 часов). Мышам интраперитонеально (IPGTT) вводили раствор 20% глюкозы в стерильном солевом растворе (0,9% NaCl) в дозе 2 г глюкозы/кг массы тела. Кровь для контроля содержания глюкозы и инсулина забирали из хвостовой вены перед введением и через 15, 30, 45, 75, 90, 120, 150, 180 минут после введения раствора глюкозы. Область приращения глюкозной кривой рассчитывали как степень чувствительности к инсулину, при этом соответствующие уровни инсулина указывают на резервы секреции инсулина.
Потребление энергии
Потребление энергии оценивали путем непрямой калориметрии, измеряя потребление кислорода с помощью прибора Охутпах (например, Columbus Instruments, Columbus, ОН) в течение 12 часов. Эта система состоит из открытой цепи с входом и выходом воздуха из пластмассовых клеток (с одной мышью в клетке). Животные имели свободный доступ к корму и воде. Высокоточный датчик С02 и 02 измерял разницу концентрации 02 и С02 в обоих объемах воздуха, что давало количество кислорода, потребляемого за промежуток времени, при условии постоянного потока входящего в клетку воздуха. Полученные на приборе данные обрабатывали на соединенном с ним компьютере, анализировали и сохраняли в возможном для переноса файле Excel. Значения выражали в мл.кг"
1.час"1, общепринято называемое V02.
Определение содержания жира в организме с помощью декса-сканирования
Декса-сканирование выполняли на денситометре с ультравысоким разрешением серии PIXIMUS (0,18x0,18 мм пикселей, GE Medical Systems, Madison, WI, США). Минеральную плотность костной ткани (МПКТ, г/см2) и конституцию тела определяли с помощью программного обеспечения PIXIMUS (версия 1,4х, GE Medical Systems).
D. Неинвазивное измерение кровяного давления и пульса Система анализа кровяного давления Visitech ВР-2000
представляет собой автоматизированную компьютерную систему с хвостовой манжетой, которая ' используется для проведения многократных измерений одновременно у 4 бодрствующих мышей без вмешательства оператора. Мышей содержали в индивидуальных темных клетках на теплой платформе с зажатыми в манжете хвостами. Система измеряла кровяное давление посредством определения давления в манжете, которая пережимала кровоток в хвосте. Фотоэлектрический датчик определял пульс субъекта. Система дает результаты, показывающие их близкое соответствие значению внутриартериального давления, измеренного одновременно в каротидной артерии. Это позволяет получать воспроизводимые значения систолического кровяного давления и скорости сердечного ритма. Для этого требуется подготовка животных в системе в течение одной недели.
E. Циркадная активность
Спонтанную двигательную активность измеряли с помощью индивидуальных боксов, каждый из которых состоял из съемной клетки со скользким полом и был оборудован инфракрасными датчиками, позволяющими измерять двигательную активность передвижений и частоту испражнений. Боксы были связаны с компьютером с помощью электронного интерфейса (например, Imetronic, Pessac, Франция). Мышей тестировали в течение 32 часов, чтобы измерить привыкание к аппарату, а также ночную и дневную активность. Во время теста измеряли количество потребляемой воды, используя автоматизированный ликомётр.
Результаты исследования представлены в фигурах 1-9. Фигура 1 показывает влияние соединения Ih3e на прибавление веса у мышей, получавших обычный рацион и высокожирную пищу. Прибавление веса измеряли на протяжении 16 недель. У мышей, потреблявших высокожирную пищу на фоне лечения соединением Ih3e увеличение веса выявлено в меньшей степени, чем у мышей, получавших высокожирную пищу и леченных носителем. Фигура 2 показывает, что соединение Ih3e улучшает метаболический профиль у мышей, получавших высокожирную пищу. Результаты анализов плазмы крови и сердечного ритма у мышей с индуцированной диетой ожирением на фоне лечения соединением Ih3e, представлены в фигуре 2, и включают в себя уровни глюкозы крови, ферменты печени (лактатдегидрогеназа ЛДГ, ACT и АЛТ) и липиды плазмы (общий холестерин, ЛВП-холестерин, ЛНП-холестерин и триглицериды). У мышей, получавших высокожирную пищу на фоне лечения соединением Ih3e, выявлено более низкое содержание в крови глюкозы, ферментов печени и липидов в плазме, чем у мышей, получавших высокожирную пищу на фоне введения носителя. Скорость сердечного ритма мышей, получавших высокожирную пищу и соединение Ih3e, также была ниже по сравнению с сердечным ритмом у мышей, получавших высокожирную пищу на фоне введения носителя. Фигура 3 показывает, что соединение Ih3e улучшает толерантность к глюкозе у мышей, получавших высокожирную пищу. Уровни инсулина в плазме были повышенными через 10 недель у мышей с обычным рационом, и у мышей, получавших высокожирную пищу, которых лечили соединением Ih3e, по сравнению с мышами, которым вводили носитель, как показано в фигуре ЗА. Выявлено, что через 12 недель уровни глюкозы были ниже у мышей, получавших высокожирную пищу и леченных соединением Ih3e, как показано в фигуре ЗВ. Фигура 4 показывает результаты перорального теста толерантности к глюкозе (ПТТГ) в виде содержания глюкозы на протяжении 200 минут у мышей с обычным рационом, которым вводили соединение Ih3e. Фигура 5 (графики А-D) показывает высвобождение инсулина in vivo после тестового корма. Фигура 5А показывает уровень высвобождения инсулина в течение 30 мин. Фигура 5В показывает кратность увеличения
высвобождения инсулина по сравнению с исходным уровнем инсулина. Примерно на 12 минуте содержание инсулина достигало пикового повышения у мышей, получавших высокожирную пищу и леченных соединением Ih3e по сравнению с мышами, которым вводили носитель. Фигуры 5С и 5D показывают кратность увеличения высвобождения инсулина по сравнению с исходными уровнями инсулина.
Кратность увеличения у мышей, получавших высокожирную пищу и соединение Ih3e, была выше в точках времени 15 и 30 минут, как показано в фигуре 5D. Фигуры 6 (графики A-D) и 7 (графики А-С) показывают увеличение коэффициента дыхательного обмена (RER) у леченных соединением Ih3e мышей на фоне ВЖ диеты (высокожирной диеты), что можно объяснить связью с улучшенной у этих мышей чувствительностью к инсулину, который сохраняет способность к окислению глюкозы. Фигура 8 (графики А и В) показывает двигательную активность и потребление корма/воды у леченых мышей, получавших высокожирный и обычный рацион по сравнению с введением носителя. Выявлено небольшое увеличение потребления корма/воды у мышей, получавших высокожирную пищу на фоне лечения соединением Ih3e, по сравнению с мышами, которым вводили носитель. Фигура 9 (графики А-С) показывает изменения веса органов. Фигуры 9В и 9С показывают процент изменения массы тела, печени, почек, сердца, окружающей БЖТ, поверхностной БЖТ, подкожной БЖТ и КЖТ по сравнению с весом у мышей, получаших обычный рацион. Во всех органах мышей, получавших высокожирную пищу на фоне лечения соединением Ih3e, выявлено уменьшенное процентное изменение.
ПРИМЕР 10: Физико-химические свойства Растворимость в воде
Твердые ЖК (в протонированной форме для соединения Ih3e) суспендировали в 5 мл 0,1М НС1. После инкубации в течение 1 недели насыщенные растворы фильтровали на фильтре Millipore (0,22 мкпм) и измеряли концентрацию ЖК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ-ESI-MS/MS с использованием колонки С18 (внутр. диаметр 150 мм х2 мм, 4 мкмоль) и подвижные водные фазы, содержащие 15 мМ' уксусной
кислоты с уровнем рН 5 и ацетонитрил. Расход составлял 150 мкл/мин. Получение данных масс-спектрометрии осуществляли по схеме многократного контроля реакции с использованием отрицательного ионизированного источника ESI. Растворимость в воде выражали в мкмоль/литр.
Значение водной растворимости соединения Ih3e составляло 9 9 пМ, что превышало соответствующие значения для дигидрокси-ЖК и сопоставимо со значением для ХК (см. Таблица 4).
а Ws: водная растворимость, относится к ЖК как к протонированному типу, поэтому не проводили оценку для ТХДХК (тауро-ХДХК), и ТУДХК (тауроурсо-ХДК), обладающих высокой расторимостью (в.р.).
ь CMC: Критическая мицеллярная концентрация, определяемая в водном растворе 0,15 М NaCl.
с ПН-СМС: Поверхностное натяжение в CMC в 0,15М водном растворе NaCl.
d LogPA.: коэффициент распределения 1-октанол-вода исследуемых ионизированных видов желчных кислот. *: значения из литературных данных.
Присутствие в соединении Ih3e группы 23-метила не изменяет растворимость в воде. Обнаружено, что значение растворимости соединения Ih3e находится в диапазоне ЖК природного происхождения и ранее изученных синтетических аналогов. Дополнительно, учитывая относительно хорошее связывание
соединения Ih3e с альбумином, можно облегчать циркуляцию в крови соединения Ih3e, таким образом способствуя системному нацеливанию TGR5 в периферические ткани, например, в мышечную ткань и коричневую жировую ткань. Следующие примеры 9, 16 и 17 поддерживают эту гипотезу.
Критическая мицеллярная концентрация (CMC)
Детергентность, то есть тенденцию к образованию мицелл, оценивали для всех заряженных молекул, растворимых в воде, например, натриевой соли (на 2 единицы рКа). Критическую мицеллярную концентрацию (CMC) определяли измерением поверхностного натяжения (ПН), используя способ максимального давления в пузырьке, который дает значение поверхностного натяжения при незначительном влиянии потенциальных примесей, подобно статической методике. Использовали тензиометр Sensadyne 6000 (Chem-Dyne Research Corp., Milwaukee, WI), снабженный двумя стеклянными зондами диаметром 0,5 и 4,0 мм, связанными с источником азота. Частота пузырьков составляла 1 пузырек/в секунду в дистиллированной воде при 26°С (Р=2,7 атм) , калибровку проводили с бидистиллированной водой и метанолом. Поверхностное натяжение растворов натриевых солей ЖК в 0,15М NaCl измеряли в разных концентрациях в диапазоне от 0,13 до 50 мМ. Значения поверхностного натяжения откладывали от логарифма концентрации желчной соли; линии регрессии, соответствующие двум частям кривой (мономерная и мицеллярная фазы), вычисляли по методике наименьших квадратов, и пересечение линий принимали как значение CMC. По кривым ПН в зависимости от концентрации также вычисляли значение поверхностного натяжения в CMC (при равновесии мономерных и полимерных типов), что давало информацию о силе детергентности, которая связана с размером мицелл вместе со способностью уменьшения поверхностного натяжения.
Оценку CMC проводили путем измерения поверхностного натяжения в неравновесных условиях, то есть в условиях, когда примеси незначительно влияют на результаты поверхностного натяжения (фиг. 10).
Соединение Ih3e показывает низкое значение CMC,' при этом
умеренную детергентность и способность к уменьшению поверхностного натяжения, о чем свидетельствуют показатели поверхностного натяжения в CMC (низкая детергентность означает низкую токсичность для мембраны или клеток). Коэффициент распределения октанол/вода
Поскольку сульфат и сульфированные аналоги всегда являются ионизированными при всех значениях рН, коэффициент распределения октанол/вода измеряли для всех молекул в ионизированной форме, поэтому карбоксильные аналоги исследовали при высоком уровне рН. Коэффициент распределения 1-октанол/вода (log Р) оценивали путем общепринятой методики встряхиваемой колбы. Эксперименты выполняли с 0,1 мМ раствором желчной соли, забуференном 0,1 М фосфатным буфером с уровнем рН 8, для гарантии полной ионизации ЖК; значения log Р относятся к ЖК в ионизированной форме, а не к протонированным типам, и начальная концентрация каждой ЖК была ниже ее собственного значения CMC. Водный буфер заранее предварительно насыщался 1-октанолом, затем добавляли 5 мл 1-октанола, предварительно насыщенного водой, и образцы оставляли для уравновешивания в течение 2 недель при непрерывном встряхивании при комнатной температуре. После центрифугирования тщательно отделяли эти две фазы. Концентрацию ЖК в водной фазе измеряли с помощью ВЭЖХ-ESI-MS/MS с колонкой С18 (внутр. диаметр 150 мм х2 мм, 4 мкмоль) и с водой в качестве подвижной фазы, содержащей 15 мМ уксусной кислоты с рН 5 и ацетонитрил. Расход составлял 150 мкл/мин, температуру колонки поддерживали при 4 5°С. Получение данных масс-спектрометрии осуществляли по схеме многократного контроля реакции с использованием отрицательного ионизированного источника ESI.
Карбоксилированное соединение Ih3e с тремя гидроксильными группами в За,7а- и 12а- положениях показывает слегка более высокую липофильность 1,4 против 1,1 по сравнению с аналогом ХК природного происхождения, что обусловлено присутствием этила в 6-положении и метила в 23-положении.
Связывание альбумина
Степень связывания альбумина оценивали равновесным
диализом при фиксированном соотношении альбумин/ЖК. Растворяли ЖК в концентрации 100 мкмоль в 5% растворе бычьего сывороточного альбумина-соляного раствора (уровень рН 7,2) и оставляли для отстаивания в течение 24 часов при 25°С. Два миллилитра указанного раствора подвергали диализу в целлюлозных мешочках с молекулярно-массовым задержанием 12-14000 по сравнению с 25 мл соляного раствора. Систему уравновешивали мягким механическим встряхиванием в течение 72 часов при 25°С. Концентрации ЖК в диализном растворе (соответствующие свободной несвязанной фракции) и в исходном растворе определяли с помощью ВЭЖХ-ESI-MS/MS при тех же условиях, как в предшествующем анализе.
Процент связывания альбумина рассчитывали от начальной концентрации ЖК и от несвязанной концентрации в диализной фракции. Данные приведены в таблице 4.
Процент связывания альбумина у соединения Ih3e немного превышал процент у ХК, что обусловлено присутствием групп 23-метила и 6-этила.
ПРИМЕР 11: Метаболическая устойчивость in vitro в культуре человеческого кала
Устойчивость к кишечным бактериям.
Пример 11а: 7а-дегидроксилирование.
Гомогенизированные образцы свежего человеческого кала (500 мг) переносили в стерильные флаконы, в которые добавляли 5 мл стерилизованной среды из мясного фарша и глюкозы (Scott Lab., Fiskville, RI). Затем добавляли ЖК в конечной концентрации 0,05 мМ. Флаконы инкубировали при 37°С; затем после добавления ЖК в точки времени 0, 1, 2, 4, 8 и 24 часа реакцию останавливали посредством 150 мкл 30% КОН. Образцы центрифугировали при 3500 оборотов в минуту в течение 10 минут; выделение ЖК из супернатантов осуществляли С-18 твердофазной экстракцией, затем анализировали с помощью тонкослойной хроматографии ТСХ и ВЭЖХ-ES-MS/MS.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) с силикагелевыми пластинками толщиной 0,25 мм (Merck, Darmstat, Германия), служила первым скрининговым тестом. Растворяющая '' система,
используемая для разделения конъюгированных ЖК, состояла из
пропионовой кислоты/изоамилацетата/воды/м-пропанола (3:4: 1:2,
об/об/об/об/; растворитель I), и растворяющая, система для
разделения неконъюгированных ЖК представляла собой уксусную
кислоту/четырёххлористый углерод/изопропиловый
эфир/изоамилацетат/воду/Ы-пропанол/бензол (1:4:6:8:2:2, об/об/об/об/об/об; растворитель II). Разделенные ЖК обнаруживали с помощью 5% этанолового раствора фосфомолибденовой кислоты.
Соединение Ih3e обладало высокой устойчивостью при инкубации в культуре человеческого кала, и даже через 24 часа более 85% соединения восстанавливались немодифицированными. Напротив, рассматриваемый естественный аналог ХДХК показывал период полувыведения около одного часа, и через 8 часов инкубации он был почти полностью метаболизирован (7-дегидроксилирован) с образованием литохолевой кислоты.
После продолжительной инкубации. в соединении Ih3e фактически останавливалось 7 -дегидроксилирование и образование промежуточного 7-оксо-производного.
Пример lib:
Известно, что кишечные бактерии гидролизуют С2 4-амидную связь в тауриновых и глициновых конъюгатах ЖК и удаляют 7а-гидроксильную группу ХК, что приводит к образованию токсичных липофильных вторичных ЖК, например, деоксихолевой кислоты (ДХК) (Ridlon, J.M., et al., J. Lipid Res. 2006, 47, 241-259). Для определения чувствительности соединения Ih3e к 7-дегидроксилированию, обусловленному кишечной флорой, изучали его метаболическую устойчивость в бульонной культуре человеческого кала, как описано авторами Roda, A., et al., J. Lipid Res. 1994, 35, 2268-2279. Обнаружено, что соединение Ih3e невосприимчиво к указанному процессу и проявляет высокую устойчивость, то есть через 12 часов инкубации более 95% соединения остается немодифицированным. Для сравнения, более 50% ХК (холевой кислоты) подвергалось метаболизму через 1 час и в пределах 8 часов до 90% ХК (фигура 15). Вероятно, что повышенная устойчивость соединения Ih3e связана с
алкилированием в Сб-положении, что обеспечивает стерическое
препятствие для осуществления бактериального 7а-
дегидроксилирования.
Стабильность боковой цепи
Исходя из приведенных результатов, боковая цепь соединения Ih3e не подвергалась модификации посредством, ферментативной активности кишечных бактерий.
По этим данным предполагается, что присутствие группы этила в С-6 положении является стерическим препятствием и защищает 7-гидроксильную группу от окисления или удаления. Дополнительно, соединение Ih3e также является очень стабильным в отношении метаболизма боковой цепи. Не было обнаружено каких-либо минорных метаболитов с помощью ВЭЖХ-ES-MS/MS. Исходя из этих данных предполагается, что указанные аналоги устойчивы в содержимом нижних отделов кишечника в присутствии анаэробных бактерий.
ПРИМЕР 12: Секреция желчи и метаболизм соединения Ih3e у крыс с желчной фистулой после дуоденального (и/д) и феморального (в/в) введения
Пример 12А: Цели и обоснование
Структурные модификации желчных кислот могут влиять на их захват в печени, печеночный транспорт, секрецию и абсорбцию в кишечнике. Поэтому представление о секреции желчи для соединений и после в/в и после и/д введения, а также об их метаболизме, является ключевым пунктом для отбора соединений в дополнительные исследования.
Для оценки способа и эффективности кишечной абсорбции соединения Ih3e указанное соединение вводили двумя путями: внутривенным (феморальное вливание) и оральном (дуоденальное вливание) в одинаковых дозах, и оценивали уровень секреции желчи на модели крысы с желчной фистулой.
Отличия в области под кривой секреции желчи в зависимости от времени и от способов введения в/в и и/д обусловливают абсорбцию указанного соединения в кишечнике и дают информацию о его биодоступности. Кроме того, печеночный и кишечный метаболизм может иметь значительные различия, '¦ поэтому
определяли секрецию желчи для соединения Ih3e и его основных печеночных метаболитов. Желчегонный эффект
- Дуоденальное вливание
Крысиная модель с желчной фистулой была разработана Болонским университетом в лаборатории Lab facilities. Соединение Ih3e вводили группе крыс путем дуоденального вливания (и/д) в дозе 1 мкмоль/кг/мин (вливание в течение 1 часа) . Крысам создавали желчную фистулу для сбора образцов желчи в разное время перед вливанием, во время и после вливания. В эксперименте дуоденального вливания было 6 крыс (2 50110 г) . Образцы желчи собирали каждые 15 минут в течение четырех часов. Дополнительно, 3 контрольным крысам вводили соляной раствор при тех же условиях в отношении времени и сбора образцов (контрольные крысы с дуоденальным вливанием).
Дуоденальное вливание соединения Ih3e значительно увеличивало скорость желчеотделения, которое достигала максимального значения для ХК 120 мкл/мин/кг. Это явление начиналось во время вливания и продолжалось в течение по меньшей мере 3 часов.
Соединение Ih3e показывает мощный желчегонный эффект, который, как предполагают, связан с его структурой; метильная группа в положении С-23 частично предотвращает конъюгацию, и эта молекула может проходить холегепатический шунтовый путь. Для сравнения, дуоденальное вливание ХДХК незначительно увеличивает желчеотделение, которое не превышало 80 мкл/мин/кг.
- Внутривенное вливание
В эксперименте феморального вливания было 6 крыс. Фигура 12 показывает желчеотделение во время исследования. Феморальное вливание начинали через 7 5 минут после стабилизации состояния и продолжали в течение 60 минут. Образцы желчи собирали каждые 15 минут в течение четырех часов. Дополнительно, 3 крысам вводили 3% соляной раствор БСА при тех же условиях в отношении времени и сбора образцов (контрольные крысы с феморальным вливанием). В течение всего периода эксперимента во время в/в вливания 3% солевого носителя БСА (контроль, п=1) показатели желчеотделения
поддерживались в диапазоне от 4 0 до 8 0 мкл/мин/кг.
Вливание в/в соединения Ih3e значительно увеличивало скорость желчеотделения, и это явление начиналось через 15 минут от начала вливания и продолжалось в течение по меньшей мере двух часов. Желчегонный эффект был очень сходным с эффектом, достигнутым в эксперименте и/д вливания.
Секреция желчи
Анализировали образцы желчи, собранные в ходе в/в и и/д экспериментов для определения секреции желчи при использовании соединения Ih3e и его метаболитов.
Анализ ВЭЖХ-ES-MS/MS.
Чистый кристаллический порошок соединения Ih3e был получен из лаборатории R. Pellicciari laboratory of Perugia. Приготовляли стоковые растворы в метаноле 1 ммоль/л и рабочие растворы путем разведения соответствующих объемов первичного раствора. Метанол и ацетонитрил имели чистоту ВЭЖХ-сорта. Концентрация аммиака составляла 30%, концентрация уксусной кислоты была 99,8 %. Все реактивы были получены из фирмы Carlo Erba Reagents. Вода ВЭЖХ-сорта поставлялась Milli-Q system.
Получение образцов
Образцы крысиной желчи доводили до комнатной температуры, недолго перемешивали и разводили 15 мМ буфером ацетата аммония (уровень рН=5,0):ацетонитрил=70:30 (об/об) в соотношении 1:100 об/об (дуоденальные или инфузионные образцы желчи) и 1:100 или 1:200 об/об (образцы желчи при феморальном вливании). Конечный раствор переносили в пробирку для автосэмплера, и вносили 10 мкл в хроматографическую колонку.
Методика ВЭЖХ-ESI-MS/MS
Образцы крысиной желчи анализировали тандемной жидкостной
хроматографией с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-MS/MS) с
использованием источника электроспрея (ESI) с отрицательной ионизацией. Для жидкостной хроматографии использовали модуль разделения Waters Alliance 2695, соединенный с автосэмплером. Автосэмплер находился при 7°С. Разделение осуществляли на колонке Ci8 Synergi Hydro-RP (150x2,0 мм внутр.диам., размер частицы 4 мкмоль), с защитой предколонкой 4x2,0' мм i.d.
SecurityGuard ODS, оба прибора от компании Phenomenex. Анализируемое вещество элюировали с использованием 15 мМ буфера ацетата аммония (уровень рН=5,00) в качестве подвижной фазы А, и ацетонитрилом в качестве подвижной фазы В. Подвижную фазу В увеличивали от 30% до 64% за 10 минут, затем до 100% за 10 минут, и поддерживали постоянной в течение 10 мин. Расход составлял 150 мкл/мин, температуру в колонке поддерживали 45°С. Колоночный эффлюент вводили в источник ESI, связанный с тройным квадрупольным масс-спектрометром (Quattro-LC, Micromass), работающим в режиме получения данных Multiple Reaction Monitoring (MRM). В качестве газа распылителя применяли азот со скоростью потока 100 л/час, скорость потока азота в качестве газа десольватации составляла 930 л/час. Показатели температур блока источника ионов и десольватации устанавливали соответственно в 80 °С и 180°С. Капиллярное напряжение составляло 3,0 кВ. Для сбора и обработки данных применяли программное обеспечение MassLynx версия 4.0. Дополнительно, для идентификации метаболитов проводили исследования масс-спектрометрии как в режиме одиночной конфигурации MS или тандемной MS/MS.
Количественный анализ
Ежедневно строили калибровочную кривую с 5 точками и вводили дважды. Калибровочные образцы, приготовленные в подвижной фазе, получали в диапазоне концентрации от 0,1 до 20 мкмоль/л. Линейные параметры калибровочной кривой получали из построения площади пика аналита в зависимости от концентрации аналита, используя регрессионный анализ наименьших квадратов (вес = 1/х2) . Коэффициенты корреляции составляли > 0,981.
Также оценивали таурин-конъюгированные метаболиты соединения Ih3e. Оценивали корректирующие факторы для учета разных ответов свободных и таурин-конъюгированных типов в ES-MS/MS, и применяли их к значениям площадей, полученным из набора данных хроматограмм ВЭЖХ-MRM. Наконец, калибровочные кривые, полученные для свободных желчных кислот, использовали для оценки таурин-конъюгированных метаболитов.
Фармакокинетика (выделение с желчью) вводимых ''аналогов:
введение в/в по сравнению с и/д введением
Данные относятся к скорости выделения соединения, восстановленного в желчи как есть, после дуоденального и феморального вливания в дозе 1 мкмоль/кг/мин.
В таблице 5 представлены показатели концентрации и выделения для соединения Ih3e, полученные из образцов крысиной желчи, собранных во время дуоденального вливания (1 час, с диапазоном от 7 5 до 135 минут).
Таблица 5
Показатели концентрации и выделения соединения Ih3e, полученные во время дуоденального вливания (1 час, с
В таблице б представлены показатели концентрации и выделения для соединения Ih3e, полученные из образцов крысиной желчи, собранных во время феморального вливания (1 час, с диапазоном от 75 до 135 минут).
Таблица 6
Показатели концентрации и выделения соединения Ih3e, полученные во время феморального вливания (1 час, с диапазоном от 7 5 до 135 минут) из образцов крысиной желчи.
Показатели концентрации и выделения тауро-1ЬЗе, полученные во время дуоденального вливания (1 час, с диапазоном от 75 до 135 минут) из образцов крысиной желчи.
Время (мин)
Ih3e (п=4)
Концентрация (мкмоль/л)
Выделение мкмоль/кг/мин.
0 , 017
0, 001
120
0, 63
0, 051
150
0, 68
0, 053
180
0, 75
0, 091
210
0, 68
0, 063
240
0,60
0, 054
270
0, 64
0, 074
300
0 , 74
0, 053
Таблица 6В
Показатели концентрации и выделения тауро-1пЗе, полученные во время феморального вливания (1 час, с диапазоном от 75 до 135 минут) из образцов крысиной желчи.
Время (мин)
Ih3e (п=5)
Концентрация (мкмоль/л)
Выделение мкмоль/кг/мин.
0,29
0,0101
120
0,50
0, 044
150
0 , 43
0 , 043
180
0,51
0, 045
210
0, 33
0, 031
240
0 , 21
0, 019
270
0, 059
0,0039
Наблюдали эффективную секрецию желчи у соединения Ih3e после в/в введения, и относительно высокий процент восстанавления в желчи указанного соединения. Кинетический профиль показывает, что соединение эффективно захватывается печенью и частично выделяется с желчью как есть, и также, в меньшей степени, метаболизируется в более полярные соединения (фиг. 13, 14а и 14Ь). Без связи с какой-либо конкретной теорией предполагается, что присутствие метильной группы в положении С-23 препятствует процессу конъюгации с таурином и глицином, что отчасти является важным для эффективной секреции почти всех природных карбоксилированных ЖК; это является основополагающим для дигидрокси-ЖК и в меньшей степени для тригидрокси-ЖК. Степень . его восстановления в желчи также связана с вводимой дозой. После и/д введения восстановление в желчи было немного ниже, чем восстановление после в/в введения, что предполагает неэффективную абсорбцию соединения в кишечнике (фиг. 13, 14с и 14d) . Рассматривая физико-химические свойства, авторы предположили, что указанное соединение может абсорбироваться посредством пассивного механизма распределения (LogP=l,44), и активный механизм представляется не вовлеченным. Присутствие трех гидроксильных групп позволяет молекуле с одной стороны
эффективно захватываться печенью и частично выделяться в желчь. Это также препятствует абсорбции молекулы в кишечнике. Пример 12В
Результаты таблицы, представленной ниже, показывают наличие мощного желчегонного эффекта соединения Ih3e, при значительно более высокой максимальной скорости желчеотделения (SV0), чем скорость желчеотделения ХДХК и ХК.
Таблица
Параметры
секреции
липидов желчи
после в/в и и/д
вливания в
дозе 1 (мкмоль/мин)/веса тела после 1 часа
ЖКа
Соединение
SV0
% свободных
id(iv)
id(iv)
в/в(и/д)
конъюгатов в/в(и/д)
CD С А
57±7
0,7±0,2
3±1
96±8
(51±9)
(о,а±о,1)
(4±1)
(98±5)
64±6
1,0±0,4
12±2
90±4
(78±8)
(1,3±0,2)
(8±3)
(92±б)
Ih3e
112±12
0,5±0,2
94±б
10±5
(131±11)
(0,7±0,3)
(93±5)
(7±3)
Д-ЕМСА
81±8
0,4±0,2
68±8
32±7
(90±5)
(0,5±0,1)
(65±4)
(2б±6)
Солевой
46±4
0,4+0,1
раствор
(48±4)
(0,4±0,1)
аДанные отражают средние значения и стандартные отклонения шести независимых экспериментов. Применяемый для и/д введения носитель представлял собой соляной раствор. Применяемый для в/в введения носитель представлял собой 3% соляной раствор БСА с уровнем рН 7,2. SV0: максимальная скорость желчеотделения ((мкл/мин)/кг веса тела). Бжк: максимальная скорость секреции ЖК ((мкл/мин)/кг веса тела). % свободных: процент молекул, восстановленных в желчи как есть, от введенной дозы. % конъгатов: процент от введенной дозы, восстановленных как конъюгаты ЖК.
Таким образом, в таблице выше показаны ., следующие
результаты: соединение Ih3e является устойчивым к конъгации, то есть более 90% соединения после внутривенного или внутридуоденального вливания выделяется в желчь в его неконъюгированой форме. Напротив, ХДХК и ХК не могут секретироваться в желчь как есть, и для них необходим этап конъюгации. Таким образом, предполагается, что C23(S) метильная группа соединения Ih3e предотвращает активацию карбоксил-КоА и последующую конъюгацию, то есть облегчает холегепатический шунтовый путь с дуктулярной абсорбцией и создает мощный желчегонный эффект.
Для дополнительного изучения влияние конфигурации С23-метильной группы на амидирование боковых цепей и желчегонный эффект соединения проводили сходные исследования другого эпимера, а именно, 6а-этил-23(R)-метилхолевой кислоты (R-EMCA, см. в таблице выше). Определение максимальной скорости желчеотделения (SV0) показывает, что желчегонный эффект R-EMCA тем не менее превышает эффект ХК, хотя это значение ниже, чем у соединения Ih3e. Исходя из полученных данных предполагается, что ориентация С-23-метильной группы имеет значение для конъюгации карбоксильной группы, при этом метильный функциональный остаток плохо соответствует каталитическому карману конъюгирующего фермента в случае C23(S) эпимера. В целом, данные результаты показывают, что соединение Ih3e эффективно абсорбируется и подвергается энтерогепатическому обмену, несмотря на относительно небольшую конъюгацию в печени. Низкий уровень конъюгации может также позволить соединению Ih3e избежать выведения при .первом прохождении через печень и попасть в системный кровоток.
Печеночный метаболизм
Для предварительного скрининга проводили поиск возможных метаболитов на основе предполагаемых соединений согласно предшествующим экспериментам и данным и на основе структуры и физико-химических свойств соединения Ih3e.
Соединение Ih3e выделялось в основном как исходное (немодифицированное) соединение и подвергалось только небольшому метаболизму в печени. Основной метаболит представлял
собой тауриновый конъюгат, в "присутствии небольшого количества моноглюкоронида. Метаболизм был сходным в случае и в/в и и/д введения. Рассматривая восстановление в желчи, авторы предполагали идентификацию других метаболитов.
Присутствие ме'тильной группы в С-23 положении препятствует процессу конъюгации с таурином и глицином, что отчасти необходимо для эффективной секреции почти всех природных карбоксилированных ЖК; это является основополагающим для дигидрокси-ЖК и в меньшей степени для тригидрокси-ЖК, поскольку они являются почти полярными. Образование глюкоронидов возможно относится к изобретению, если их вводить в более высоких дозах.
Фигура 14А показывает соединение Ih3e и его основные метаболиты, определяемые в желчи путем масс-спектрометрии в эксперименте в/в вливания. Данные представлены как абсолютные значения областей (п=5). Фигура 14Ь представляет собой увеличенное изображение фигуры 14А. Фигура 14С показывает соединение Ih3e и его основные метаболиты, определяемые в желчи путем масс-спектрометрии. Фигура 14D представляет собой увеличенное изображение фигуры 14С.
В заключение: соединение Ih3e является умеренно гидрофильным и обладает умеренной детергентностью. Обнаружен его эффективный захват. Выделение с желчью также является эффективным, учитывая, что соединение секретируется в основном в немодифицированном виде и, до некоторых пределов конъюгируется с таурином. Кишечная абсорбция также эффективна, даже если она является неполной, и при вводимой дозе молекула не нуждается в обширном печеночном метаболизме для секреции в желчь.. Присутствие метильной группы в С-23-положении предотвращает обширную конъюгацию с таурином для выделения с желчью. Поэтому увеличивается время печеночного ответа у молекулы, которая проходит холегепатический шунтовый путь, отвечающий за ее мощный желчегонный эффект.
ПРИМЕР 13: Токсичность in vitro в клетках Нер62
Соединения изобретения оценивали на токсичность in vitro с помощью изучения клеток HepG2. Цитотоксичность клеток HepG2 определяли контролем уменьшения АТФ, и апоптоз клеток HepG2
определяли контролем активации каспазы-3. Результаты показаны в таблице 7.
Цитотоксичность
Жизнеспособность клеток измеряли с помощью Perkinelmer ATP-Lite 1 STEP. АТФ представляет собой маркер жизнеспособности клеток, поскольку присутствует во всех метаболически активных клетках, и при некрозе или апоптозе клеток наблюдается очень быстрое снижение его концентрации. Клетки HepG2 (lxlO4) высевали в 96-луночные планшеты и стимулировали 10-кратными разведениями от 1 нМ до 300 мкмоль соединения Ih3e в течение 4 часов при 37°С. Планшеты уравновешивали при КТ в течение 10 минут, затем к 100 мкл культуральной среды, содержащей клетки добавляли 100 мкл реактива ATP-Lite 1 STEP. Люминесценцию определяли устройством Victor Light (PerkinElemr). Тестовый сигнал вычленяли из фона. В качестве положительного контроля клеточной цитотоксичности применяли тамоксифен, а отрицательным контролем были необработанные клетки.
Апоптоз
Каспазы участвуют в молекулярном контроле апоптоза, и каспазную активность можно изучать с помощью субстрата каспазы-3 TruPoint, который позволяет проводить чувствительный, надежный и равномерный тест флюоресценции с временным разрешением. Человеческие клетки гепатоциты (HepG2) высевали (lxlO4) в 96-луночные планшеты со средой HepG2 без пирувата натрия. Клетки стимулировали в течение 4 часов при 37°С последовательными разведениями тестового соединения Ih3e от 1нМ до 300 мкмоль в трех исследованиях. В качестве положительного контроля апоптозных клеток применяли стауроспорин. Отрицательным контролем служили: 1. Нестимулированные клетки; 2. Среда единственная без клеток; 3. Клетки, инкубированные без каспазного субстрата. В клетки добавляли лизирующий буфер и каспазу-3 субстрат, затем через 1 час и через 24 часа после добавлени считывали данные флюоресценции с помощью ридера Envision.
Некроз
Клеточный некроз анализировали путем 'измерения
Токсичность in vitro в клетках HepG2
высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из некротических клеток в анализе изучения целостности гомогенных мембран, используя реактив CytoTox Promega ONE. Клетки HepG2 (lxlO4) высевали в 96-луночные планшеты. Через 18 часов инкубации производили замену среды на свежую среду без пирувата натрия и сыворотки, и добавляли соединение Ih3e при ответе на дозу от 0,1 мкмоль до 500 мкмоль. Тритон 1% использовали как контроль максимального высвобождения ЛДГ. Тамоксифен использовали как индуктор некроза. После высевания клетки вновь находились в инкубаторе в течение дополнительных 4 часов. Супернатант переносили в новую планшету, и в том же объеме в планшету добавляли реактив CytoTox Promega ONE. Через 1 час инкубации получали данные флюоресценции с помощью многофункционального планшетного ридера Envision с длиной волны возбуждения 560 нм и эмиссией 590 нм.
ПРИМЕР 14: Анализ селективности ядерных рецепторов (NR)
Селективность соединений по изобретению оценивали способами исследования, известными в данной обаласти техники. Более конкретно, применяли следующие способы исследований:
FXR и LXR: Рекрутинг коактиватора (альфа-скрининг);
TGR5: уровень цАМФ в человеческой клеточной линии клеток кишечника (NCI-H716);
PXR: анализ конкурентного связывания лигандов (анализ связывания)
CAR: Рекрутинг коактиватора (Lantha-скрининг); В таблице 8 представлены результаты указанных исследований.
TR-FRET анализ коактиватора
Lantha-скрининг (Invitrogen) применяли для изучения селективности ядерных рецепторов. В комплекте использовали меченое тербием анти-GST антитело, флюоресцеин-меченый коактиваторный пептид и NR-лиганд-связывающий домен, несущий метку глутатион-Б-трансферазы (GST) в формате гомогенного анализа смешивай-и-считывай. Исследование проводили в 384-луночной планшете с микролунками (PerkinElmer). В общей сложности 2 0 мкл исследуемой реакционной смеси включали в себя 5 нМ GST-меченых NR, 125 нМ корегуляторного пептида, 5 нМ ТВ-анти-СБТ-меченого антитела (тербий-анти-глутатион-S меченная трансфераза), 5 мМ ДТТ и соединения Ih3e в разных концентрациях в тестовом буфере, поставляемом компанией Invitrogen. Отрицательный контроль не содержал соединения Ih3e, но содержал все остальные содержавшиеся в лунках агонисты. Через 1 час инкубации в темноте проводили измерения TR-FRET в ридере Envision. Соотношения эмиссии 520/495 выстраивали в зависимости от разных концентраций лиганда. Данные анализировали с помощью GraphPad Prism, для получения значений ЕС50 использовали уравнение сигмоидальной кривой с переменным наклоном.
ПЗ =Г
s ч о га
S Рн I
Ен S Ю ы
Ш S ffl
Ен U Ен > > О Ен О ш
Ен > > U Ен О 01 S
Ен О В
О Ен О ш
Ен О В
> > и в о
в о
У, (О
CD S я в и в > > о в о
о о
о 2
и ы
2 2
m в о
Ен > > О Ен О
CD S
Ен О Ен > > О Ен О си
Ен > > О Ен О
S Ен О О X
S Ен X
ш S m в о в > >
в о
CD S ffl в о в
> > и в о
ю о
о в с
CD 3
CD а
х 3 X
а щ ч к
В U О X ш S Ен
i; ш ч
ч ш о о
о II
U Н н и
си со
о о и ы
2 И 2
2 2 2 ш
О Ен О о Ifl
О) Л
О Ш CN Л
S Ен О О I И S Ен
CD S
Ен О
Ен > > U Ен О
CD S О Ен О Ен > >
Ен О
Ш S И Ен О Ен > >
Ен О
Ш S
m в о
> > о
Ен О
О О X
m s
Ен Я СО
S Ен О О I И S Ен У,
S m в о в > > о в о о
1Л CN
CD S Я
в о в > > о в о
го о го си S Я
в и в
> > о в о
си S и в о в > , о в о ш S и в о в > > о в о о
X I
03 О) в (X ей
ч I га в о
X 14 X
CD S
CD X
s ч ш о и <и
ПРИМЕР 15: Стабильность соединений
Стабильность соединения Ih3e определяли известными в
данной области способами. Концентрация клеточной фракции
составляла 1 мг/мл на протяжении времени 0-15-30-60-120-240-
360-1440 минут. В качестве положительного контроля применяли
тестостерон (1000 нг/мл); 7-гидроксикумарин (1296 нг/мл);
бензойную кислоту (2440 нг/мл) на протяжении времени 0-10-20-
40-60-12 0 минут. Применяли анализ жидкостной
хроматографии/масс-спектрометрии LC/MS на колонке С18
посредством градиента полярности; .сбор данных осуществляли с
помощью селективного ионного мониторинга. Результаты показаны
ниже в таблице 9.
Фигура 16 показывает, что соединение Ih3e в значительной степени и дозозависимым образом вызывает высвобождение GLP-1 ех vivo. Фигура 16 показывает воздействие соединения Ih3e при его экспозиции в указанных концентрациях в течение 1 часа на высвобождение GLP-1 ex vivo на подвздошных эксплантах, выделенных у самцов мышей, которые получали в течение 18 недель TGR5-Tg с ВЖ-кормом (п=4). Данные представлены как среднее значение +SE: непарный t-тест Стьюдента, (*) Р <0,05, подвздошные экспланты, на которые воздействовали, соединением Ih3e по сравнению с воздействием носителя.
В экспериментах из примеров 17-21 применялись -.следующие
методики.
Химикаты и реактивы
Все биохимические реактивы приобретались в комании Sigma-Aldrich, если не указано иное. Ингибитор DPP4 (DPP4i) ситаглиптин был предоставлен в дар д-ром С. Ullmer (Hoffmann-La -Roche) .
Синтез соединения Ih3e проводили, как описано ранее (Macchiarulo et al., 2008; Pellicciari et al., 2007). Клеточная культура
Эксперименты in vitro проводили с клетками STC-1 или NCI-Н716, которые обрабатывали носителем (диметилсульфоксид) или соединением Ih3e. Агонистическую активность соединения Ih3e на TGR5 оценивали, как ранее описано авторами (Macchiarulo et al., 2008, J. Chem. Inf. Model. 48, 1792; Pellicciari et al., 2007, J. Med. Chem. 50, 4265-4268). Продукцию цАМФ осуществляли, как описано (Sato et al, 2008, J. Med. Chem. 51, 1831; Watanabe et al., 2006, Nature 439, 484). Активность Сох оценивали следующим окислением полностью восстановленного цитохрома С (Sigma) при 550 нм (Feige et al. , 2008b, Cell Metab. 8, 347). Соотношение АТФ/АДФ и высвобождение GLP-1 измеряли согласно инструкциям изготовителей (Biovision и Millipore, соответственно). Первичные коричневые адипоциты были подготовлены, как описано ранее (Watanabe et al. , 2006, Nature 439, 484), и подвздошные экспланты приготовляли согласно установленному способу (Cima et al., 2004, J. Exp. Med. 200, 1635-1646).
Количественное определение внутриклеточного кальция
Клетки NCI-H716 (40000 клеток) высевали в 96-луночные черные планшеты с нанесенным гелем Matrigel (BD Bioscience). Через семьдесят два часа после трансфекции клетки дважды промывали в тестовом буфере (HBSSlx, 20 мМ HEPES [уровень рН 7,4]) и оценивали на содержание внутриклеточного кальция с помощью Fluo-4 AM согласно протоколу изготовителя (Invitrogen).
Биохимия и гистохимия
Показатели плазмы и содержание липидов в печени и фекалиях измеряли согласно описанию (Mataki et al. , 2007, Mol. Cell Biol. 27, 8330-8339). Окрашивали гематоксилином и эозином (ГЭ),
Сириус красным и oil-red О, как. описано (Mark et al. , 2007,
Curr. Protoc. Mol. Biol, глава 29, раздел 29В, 24), и с помощью
камеры CCD на широкопольных микроскопах (Leica) получали
микрографии. В срезах поджелудочной железы измеряли островки и
производили подсчет на четырех послойных срезах с интервалами
150 мкм, окрашенных ГЭ, с использованием программного
обеспечения ImageJ (пять животных . в группе).
Иммунофлуоресцентное окрашивание инсулина осуществляли, как описано авторами (Fajas et al., 2004, J. Clin. Invest. 113, 1288). Дополнительно, островки поджелудочной железы выделяли посредством расщепления поджелудочной железы коллагеназой у мышей, получавших TGR5-Tg вместе с ВЖ-кормом согласно доступным онлайн методикам (например, см. JOVE (вебсайт Journal of Visualized Experiments)). Инсулин экстрагировали после инкубации 0/N при -20°С в кислом этаноле и измеряли с помощью ELISA на ФБР-разведенных образцах согласно инструкциям изготовителя (Mercodia). Высвобождение GLP-1 измеряли в условиях in vitro, ex vivo и in vivo согласно способам, известным в данной области техники.. Измерение потребления кислорода
Клеточное потребление кислорода измеряли в анализаторе Bioscience Seahorse XF24, с десятью биологическими повторами на условие (Feige et al., 2008b, Cell Metab. 8, 347).
Эксперименты с животными
Животные размещались и содержались согласно
стандартизированным процедурам (Argmann and Auwerx, 2006b). Во всех экспериментах задействовали подобранных по возрасту самцов мышей. Генетически сконструированные мышиные модели (GEMM), а именно, мыши TGR5-Tg и TGR5"/_, были созданы, как описано в дополнительных .данных. Диет-индуцированное ожирение (ДИО) у мышей GEMM или C57BL/6J (Charles River) . вызывали путем кормления 8-недельных мышей ВЖ кормом (60% кал/жир, D 124 92; Research Diets), в течение по меньшей мере 8 недель, как упомянуто в настоящем тексте и цифровых пояснениях. В экспериментах влияния диеты к корму подмешивали соединение Ih3e (Feige et al., 2008a, Curr. Protoc. Mol. Biol, глава 29, раздел
29В, 25) в дозе, достаточной для достижения in vivo дозы 30 мг/кг/день. Эксперименты по фенотипированию мышей проводили согласно протоколам EMPRESS (см., например, вебсайт Empress
(European Mouse Phenotyping Resource of Standardised Screening), цель указаннх экспериментов состояла в оценке потребления корма и воды, конституции тела (Argmann et al., 2006а, Curr. Protoc. Mol. Biol, глава 29, раздел 29A, 23), потребление энергии (Argmann et al. , 2006a, Curr. Protoc. Mol. Biol. глава 29, Единица 29A, 23), глюкозного и липидного гомеостаза (Argmann et al., 2006b, Curr. Protoc. Mol. Biol, глава 29, раздел 29A, 22); Heikkinen et al. , 2007, Curr. Protoc. Mol. глава 29, раздел 29В, 23; Mataki et al. , 2007, Mol. Cell Biol. 27, 8330), и биохимии плазмы (Argmann and Auwerx, 2006a, Curr. Protoc. Mol. Biol, глава 29, раздел 29A, 22) . Ткани и кровь собирали и обрабатывали для проведения анализов гистопатологии, химии крови и генной экспрессии согласно стандартизированным процедурам (Argmann and Auwerx, 2 0 06а; Feige et al., 2 0 08b; Mark et al., 2 007; Watanabe et al., 2006). Проводили гиперинсулинемический эугликемический клэмп-тест, как описано (Feige et al. , 2008b), с незначительными модификациями, включающими в себя изменения в исходном болюсе инсулина (30 мЕд/кг) и скорости вливания инсулина (10 мЕд/мин/кг). Уровень GLP-1 в плазме измеряли анализом ELISA
(Millipore) в образце крови, полученной ретроорбитальной пункцией.
Эксперименты с db/db мышами (Charles River) проводили на 14-недельных животных, получавших обычный рацион (ОР) без соединения Ih3e или с указанным соединением (30 мг/кг/день) в течение 6 недель (Feige et al., 2008а).
Определение профиля генной экспрессии
Профиль генной экспрессии определяли количественной ПЦР в
реальном времени (Feige et al., 2008b; Watanabe et al. , 2006).
Использовали ранее опубликованные праймерные
последовательности, кроме последовательностей, используемых для гена Kir6.2: R-5' AGATGCTAAACTTGGGCTTG (SEQ ID No 1), F-5' TAAAGTGCCCACACCACTC (SEQ ID No 2).
Статистика
Статистические исследования проводили с помощью непарного t-теста Стьюдента. Данные выражены как среднее значение ± SEM, и значения р меньше 0,05 считали статистически значимыми.
Пример 17. Экспрессия мРНК TGR5
В предшествующих исследованиях (Watanabe et al. , 2006, Nature, 439, 484-489) была установлена связь между желчными кислотами и потреблением энергии in vivo, таким образом, возникло предположение, что ' активация передачи сигналов TGR5 может более генерализованно влиять на митохондриальную активность. В поиске исходной поддержки указанной гипотезы анализировали экспрессию мРНК TGR5 посредством базы данных GeneNetwork по мРНК печени в эталонной генетической популяции BxD, по данным вебсайта GeneNetwork Университета Теннесси. Был достоверно выявлен широкий диапазон вариаций экспрессии мРНК TGR5 у разных мышиных линий BxD. Интересно, что экспрессия мРНК TGR5 в очень значительной степени коррелировала с экспрессией ряда генов, которые кодируют субъединицы комплексов, вовлеченных в окислительное фосфорилирование, таких как цитохром С оксидаза (Сох) (например, CoxVIla; фигура 17А) и АТФ синтаза (Atp6v0b, АТФ-аза Н+ транспортирующая субъединица V0 В; Atpaf2, АТФ-синтаза митохондриального F1 комплекса сборки, фактор 2; Atpl аЗ, АТФ-аза альфа-3-полипептида, транспортирующего Na+/K+; Atp6vl Ь2, АТФ-аза Н+ транспорта VI субъединицы В изоформы 2). С указанными наблюдениями согласуется то, что обработка клеток STC-1 соединением Ih3e приводила к цАМФ-зависимому увеличению активности Сох (фигура 17В) , что было связано с повышением клеточного потребления кислорода (фигура 17С) и увеличением соотношения АТФ/АМФ (фигура 17D). Полученный результат был подтвержден в человеческой линии энтероэндокринных клеток NCI-H716, у которых при обработке соединением Ih3e дозозависимым образом повышалась продукция АТФ. Интересно, что экспрессия TGR5 также строго коррелировала с экспрессией Kir6.2, компонентом АТФ-зависимого калиевого канала (КДТФ) (фигура 17Е) . Указанная корреляция дополнительно подтверждалась РНК-интерференцией TGR5 '"в клетках
STC-1, которые приводили к сопутствующему снижению экспрессии мРНК Cox-FV и Kir6.2 (фигура 17F).
Пример 18. Активация сигнального пути TGR5 повышает уровни внутриклеточного кальция и стимулирует высвобождение GLP-1 в энтероэндокринных L-клетках
Установлено, что ¦ в |3-клетках поджелудочной железы увеличение соотношения АТФ/АДФ, обусловленное ' метаболизмом глюкозы, закрывает каналы КДТФ, что приводит к деполяризации плазматической мембраны. Эта мембранная деполяризация, в свою очередь, раскрывает открываемые напряжением кальциевые каналы
(Cav) , вызывая поступление кальция. В результате наблюдается повышение уровня внутриклеточного кальция, которое затем запускает прямое взаимодействие между внеклеточными белками, расположенными в инсулин-содержащей мембране гранул, и белками, расположенными в плазматической мембране (Yang and Berggren, 2006, Endocr. Rev. 27, 621-676), что приводит к последующему высвобождению инсулина (Nichols, 2006, Nature, 440, 470-476). По результатам последних исследований подтверждается гипотеза, что каналы КАтф и Cav также играют основную роль в высвобождении GLP-1 из энтероэндокринных L клеток .(Reimann and Gribble, 2002, Diabetes 51, 2757-2763; Reimann et al. , 2008, Cell Metab. 8, 532-53 9). Примечательно, что в эталонной популяции BxD авторы также выявили корреляцию экспрессии TGR5 с экспрессией Cav2.2
(фигура 18А), которая ранее была описана для энтероэндокринных клеток (Reimann et al. , 2005, J. Phisiol. 563, 161-175), и которая участвует в кальций-стимулируемом высвобождении инсулина в панкреатических клетках 3 (Yang and Berggren, 2006, Endocr. Rev. 27, 621-676). Наряду с этим, соединение Ih3e значительно увеличивает поступление кальция в энтероэндокринные клетки NCI-H716 человеческой линии, и указанный эффект потенцировался посредством сверхэкспрессии TGR5 и, напротив, ослаблялся интерференцией РНК TGR5 (фигуры 18В и 18С), или добавлением ингибитора аденилатциклазы MDL-1 2330А (MDL)
(фигура 18D). Кроме того, присутствие глюкозы увеличивало TGR5-зависимое увеличение внутриклеточного кальция (фигура 18Е). Этот эффект коррелировал с увеличением высвобождения'; GLP-1 из
клеток NCI-H716 (фигура 18F) , которое ингибировалось MDL-12-3 3 OA.
TGR5-опосредованное высвобождение GLP-1, которое запускается соединением Ih3e, было дополнительно подтверждено в мышиных энтероэндокринных клетках STC-1, в которых было повышено влияние соединения Ih3e на высвобождение GLP-1 посредством сверхэкспрессии TGR5, при этом оно предотвращалось как интерференцией РНК (фигура 18G), так и посредством MDL-12-ЗЗОА, при особом значении роли цАМФ-зависимости TGR5-опосредованного высвобождения GLP-1 (фигура 18Н) . В совокупности указанные данные демонстрируют, что TGR5 регулирует ключевой путь регуляции высвобождения GLP-1 из энтероэндокринных L-клеток.
Пример 19. Сверхэкспрессия TGR5 модулирует in vivo секрецию GLP-1
Для дополнительной оценки метаболической роли усиления сигнального пути TGR5 авторы оценивали влияние трансгенной сверхэкспрессии TGR5 in vivo в контексте диет-индуцированного ожирения (ДИО) у мышей. Создавались TGR5-трансгенные мыши (TGR5-Tg) путем ооцитарной инъекции бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) RP23-278N1. С помощью количественной ПЦР в реальном времени показано наличие у мышей TGR5-Tg интегрированых шести копий RP23-27 8N1 1 клона ВАС, которые давали надежную экспрессию мРНК TGR5, ограниченную в большинстве тканей, обычно зкспрессирующих TGR5. Толерантность к глюкозе была заметно улучшена у мышей TGR5-Tg, которых провоцировали в течение 10 недель диетой с высоким содержанием жиров (ВЖ), по сравнению с контрольными однопометниками, получавшими ВЖ-корм (фигура 19А), при этом не выявлено какого-либо отличия у мышей, получавших обычный рацион (ОР) (данные не представлены). В отличие от ожиданий авторов, не выявлено каких-либо отличий в прибавлении веса тела у мышей дикого типа и мышей TGR5-Tg при ОР или ВЖ-диете, демонстрируя, что улучшение толерантности к глюкозе у мышей TGR5-Tg не может быть обусловлено смешанными эффектами потери веса. Отсутствие увеличения веса у мышей TGR5-Tg, вслед за увеличением
потребления энергии, объяснялось снижением двигательной активности. Поскольку нокаутные по рецептору GLP-1 мыши проявляют выраженную гиперактивность (Hansotia et al., 2007, J. Clin. Invest. 117, 143-152), авторы вводили агонист рецептора GLP-1 Ех4 мышам дикого типа, чтобы оценить возможность связи снижения двигательной активности у мышей TGR5-Tg с секрецией GLP-1. Двигательная активность мышей эффективно и дозозависимо снижалась посредством Ех4. Интересно, что при концентрации 1 нмоль/кг авторы отметили значительное уменьшение двигательной активности, тогда как мыши по прежнему получали нормальный корм.
Интересно, и согласно ожиданиям авторов, толерантность к глюкозе у мышей TGR5-Tg была связана с надежной секрецией GLP-1 и высвобождением инсулина в ответ на пероральную глюкозную нагрузку (фигура 19В). Значение повышенной секреции GLP-1 подчеркивается фактом, что измерения уровня GLP-1 в плазме проводили без предварительного перорального введения мышам ингибитора дипептидил-пептидазы-4 (DPP4). Такое повышенное высвобождение GLP-1 у мышей TGR5-Тд помогает объяснить уменьшенную двигательную активность этих мышей. Для дополнительного изучения влияния сверхэкспрессии TGR5 на секрецию GLP-1 получавшим ВЖ-диету мышам последовательно проводили провокацию тестовым кормом для стимуляции высвобождения ЖК из желчного пузыря. Интересно, что влияние сверхэкспрессии TGR5 на секрецию инсулина и GLP-1 было более явным после приема пищи, чем после простой провокации глюкозой (фигура 19С) . Можно предположить, что указанные эффекты обусловлены увеличением поступления ЖК, вызванного тестовым кормом, по сравнению с провокацией глюкозой. Согласно этой гипотезе, при обработке литохолевой кислотой (ЛХК) подвздошных эксплантов от мышей TGR5-Tg и контрольных мышей получено подтверждение, что ЖК обеспечивают превосходный сигнал индукции высвобождения GLP-1 в контексте высокой экспрессии TGR5 (фигура 19D) . Кроме того, эти данные соответствуют результатам, полученными в mTGR5-трансфицированных STC-1 клетках, в которых также увеличивалось высвобождение GLP-1 посредством'* повышения
экспрессии TGR5 (фигура 19G). Авторы предполагают, что в контексте подвздошных эксплантов дикого типа, быстрое расщепление GLP-1 ферментом DPP4 может замаскировать умеренное увеличение высвобождения GLP-1, которое запускает ЛХК.
В течение последнего десятилетия широко изучено влияние GLP-1 на функции поджелудочной железы, которое варьирует от эффектов повышения секреции инсулина до стимуляции выживания панкреатических островков и пролиферации (Drucker, 2006, Cell Metab. 3, 153-165). В этой связи, иммунофлуоресцентное окрашивание инсулина на срезах поджелудочной железы показало, что, в отличие от гипертрофических островков с низким содержанием инсулина, которые обнаруживаются у контрольных мышей, получавших ВЖ-корм, не выявлено гипертрофии островков у мышей TGR5-Tg, питавшихся ВЖ-кормом, и они более интенсивно окрашивались на инсулин (фигура 19Е). Исходя из полученных данных, подсчет и измерение панкреатических островков подтверждает, что экспрессия TGR5 приводит к поддержанию нормального профиля распределения островков (фигура 19F) , вероятно, по причине повышенного содержания в плазме GLP-1. Кроме того, содержание инсулина в выделенных панкреатических островках было значительно выше у мышей TGR5-Tg, получавших ВЖ-корм, чем у контрольных мышей (фигура 19G).
Для дополнительного установления роли сигнального пути TGR5 в поддержании гомеостаза глюкозы авторы оценивали толерантность к глюкозе зародышевой линии TGR5-дефицитных мышей (TGR5"/-), созданной путем выведения мышей, у которых аллель TGR5 была фланкирована трансгенным мышиным CMV-Cre. В прямой противоположности с тем, что наблюдалось у мышей TGR5-Tg, толерантность к глюкозе была снижена у TGR5-/" мышей, которым проводили провокацию ВЖ-диетой в течение 8 недель (фигура 19Н), при этом не наблюдалось каких-либо отличий у получавших ОР мышей (данные не представлены). Затем проверяли секрецию GLP-1 путем провокации мышей TGR5+/+ и TGR5"/" пероральной нагрузкой глюкозой через 30 минут после введения солевого раствора или соединения Ih3e единственного, или в комбинации с ингибитором DPP4 (DPP4i) ситаглиптином. Предварительное введение соединения
Ih3e умеренно увеличивает высвобождение GLP-1 после провокации глюкозой у мышей TGR5+/+ (фигура 191) . Вместе с тем, указанный эффект проявлялся более заметно при совместном введении DPP4i, что обусловлено его способностью пролонгировать полувыведение GLP-1 из плазмы (Drucker and Nauck, 2006, Lancet, 368, 16961705) (фигура 191). Напротив, влияние соединения Ih3e на содержание в плазме GLP-1 было снижено у мышей TGR5_/" (фигура 19J) . В совокупности эти данные подчеркивают решающую роль сигнального пути TGR5 в контроле высвобождения GLP-1, и дополнительно демонстрируют специфичность полусинтетического агониста соединения Ih3e in vivo.
Пример 20. Соединение Ih3e агонист TGR5 повышает потребление энергии и снижает стеатоз печени и ожирение при кормлении пищей с высоким содержанием жиров
Учитывая улучшение профиля содержания глюкозы и инсулина у мышей TGR5-Tg, авторы затем оценивали терапевтический потенциал соединения Ih3e, который смешивали с кормом в дозе 30 мг/кг/день (мкд) в интервенционном исследовании на мышах C57BL/6J, у которых индуцировали диажирение путем кормления ВЖ-кормом в течение 14 недель. Как предполагалось, ВЭЖХ профиль содержания в плазме ЖК подтверждал присутствие соединения Ih3e у мышей, леченных соединением единственным (фигура 20А) . Содержание в плазме соединения Ih3e находилось в диапазоне содержания в плазме ХК и 3-мурихолевой кислоты. Примечательно, что введение соединения Ih3e не влияло ни на композицию ЖК в плазме, ни на профиль экспрессии ферментов, вовлеченных в синтез ЖК, экспрессия которых регулируется в основном ядерными рецепторами. Полное отсутствие изменений в уровне экспрессии классических генов-мишеней FXR в печени, таких как холестерин 7а-гидроксилаза (CYP7A1) и насоса выведения солей желчных кислот (BSEP) (Thomas et al., 2008, Nat. Rev. Drug Discovery 7, 678-693), дополнительно подтверждает специфичность соединения Ih3e к TGR5.
Через 10 недель лечения соединением Ih3e наблюдалось значительное снижение нарастания веса, примерно на 15%, в сочетании с резким снижением общей массы у мышей, получавших
ВЖ-корм на фоне введения соединения Ih3e по сравнению с контрольными мышами, получавшими ВЖ-корм (фигуры 2 0В и 2ОС) . Увеличение печени и общей массы жира также было снижено у мышей, получавших ВЖ-корм на фоне введения соединения Ih3e
(фигура 20D). Как отмечено в предыдущем исследовании ХК авторов изобретения (Watanabe et al. , 2006, Nature, 439, 484-489), уменьшение массы КЖТ было связано с уменьшением белой жировой ткани (БЖТ) в межлопаточной области (фигура 20D, данные не представлены). Метаболические изменения между получавшими ВЖ-корм контрольными мышами и мышами, получавшими ВЖ-корм на фоне введения соединения Ih3e не были вызваны уменьшением потребления калорий (фигура 20Е) или потерей энергии с фекалиями, а скорее, являлись следствием повышения потребления энергии, что было показано измерением потребления 02 и продукции С02 при непрямой калориметрии (фигура 20F) . Во время периода темноты дыхательный коэффициент у получавших Ih3e мышей был значительно уменьшен, что согласуется с увеличением сжигания жира (фигура 20F). Профиль экспрессии генов БЖК подтверждал, что активация сигнального пути TGR5 запускает увеличение нескольких митохондриальных генов, вовлеченных в потребление энергии наряду с индукцией экспрессии гена дейодиназы 2 типа (фигура 20G). Активация митохондриальной дыхательной цепи посредством соединения Ih3e дополнительно подтверждалась с помощью измерения потребления 02 в первичных коричневых адипоцитах, выделенных у мышей C57BL/6J, которым в течение 12 часов вводили соединение 1пЗе. Дополнение разобщающего агента карбонилцианид-трифторметоксифенилгидразона
(FCCP) повышало основное потребление 02 при всех условиях, но значительно более заметным было в случаях введения соединения Ih3e (фигура 20). В дополнение к увеличению потребления энергии также улучшалась функция печени, о чем свидетельствует уменьшение стеатоза печени, которое оценивали окрашиванием oil red О (фигуры 201) и биохимическое количественное определение содержания липидов печени (фигура 20J). Кроме того, наблюдалось заметное уменьшение содержания в плазме ферментов печени по сравнению с контрольными мышами, получавшими ' ВЖ-корм,
коррелирующее с отсутствием фиброза печени в срезах печени у получавших Ih3e мышей при окрашивании Сириус красным (фигуры 201 и 20К). Улучшение функции печени также заключалось в значительном снижении уровня в плазме триглицеридов и неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК) у мышей, получавших ВЖ-корм на фоне введения соединения Ih3e (фигура 20L).
Пример 21. Соединение Ih3e агонист TGR5 улучшает чувствительность к инсулину у мышей с ожирением
Определяли способность соединения Ih3e улучшать гомеостаз
глюкозы. И у мышей с ДИО и у мышей db/db, моделей влияния
окружающей среды и генетической модели диажирения,
соответственно, лечение соединением Ih3e (30 мкд), подмешанным
к корму, значительно улучшало толерантность к глюкозе после
пероральной провокации глюкозой (фигуры 21А и 21С), наряду с
улучшением профиля секреции инсулина после стимуляции глюкозой
(фигуры 21В и 21D, нижний график). Указанный признак
согласуется с GLP-1-опосредованным улучшением функции
поджелудочной железы. Кроме того, уровни глюкозы натощак и
уровни инсулина были снижены и у мышей с ДИО и у мышей db/db,
которым вводили соединение Ih3e (фигуры 21В- и 21D, верхний
график). Для дополнительной оценки влияния соединения Ih3e на
гомеостаз глюкозы и чувствительности к инсулину, у мышей с ДИО
проводили гиперинсулинемический эугликемический клэмп-тест
глюкозы. Скорость вливания глюкозы, необходимая для поддержания
эугликемии у мышей с ДИО, которым вводили соединение Ih3e,
фактически была идентичной скорости вливания глюкозы у
контрольных мышей, получавших ОР (фигура 21Е), что согласуется
с улучшенной толерантностью к глюкозе. У инсулин-резистентных
мышей, получавших ВЖ-корм, выявляли повышение эндогенной
продукции глюкозы в печени наряду с уменьшением как скорости
утилизации глюкозы, так и подавления продукции глюкозы
инсулином, при этом введение соединения Ih3e мышам, получавшим
ВЖ-корм нормализовало указанные параметры до значений, которые
наблюдались у получавших ОР мышей (фигура 21Е). Измерение
инсулин-стимулируемого захвата 14С-дезоксиглюкозы в
гиперинсулинемическом эугликемическом клэмп-тесте' глюкозы
показывало, что улучшение гомеостаза глюкозы с помощью соединения Ih3e может быть обусловлено в основном снижением инсулин-резистентности в печени и мышечной ткани (фигура 21F) . Указанные эффекты согласуются с нормализацией экспрессии ключевых генов, вовлеченных в гомеостаз глюкозы в печени (фигура 21G).
Для изучения специфичности соединения Ih3e в отношении TGR5 in vivo сравнивали влияние лечения в течение 4 недель соединением Ih3e в дозе 30 мкд на толерантность к глюкозе у мышей TGR5' и TGR5, с предшествующим кормлением ВЖ-кормом в течение 9 недель. Даже за указанный короткий период времени соединение Ih3e значительно улучшало толерантность к глюкозе у мышей TGR5+/+, получавших ВЖ-корм (фигура 6А) , наряду с нормализацией секреции инсулина при пероральной провокации глюкозой (фигура 6В) . Эти эффекты были снижены у мышей TGR5"/_, что таким образом является дополнительным аргументом, подтверждающим специфичность соединения Ih3e к TGR5 (фигуры 22А и 22В).
Пример 22. Фармакокинетика и метаболизм соединений Ih3e и Ii3e у крыс с желчной фистулой после в/в введения
Различие между двумя чистыми диастереоизомерами Ih3e и
Ii3e состоит в разной ориентации метильной группы С-23, таким
образом, образуются 23S- и 23К-формы. Такая структурная
модификация способна частично изменить физико-химические
свойства, метаболизм и фармакокинетику двух соединений. С
введением в боковую цепь метильной группы С-23 с другой
ориентацией образуются два изомера, где карбоксильная группа
также имеет другую ориентацию, и два диастереоизомера могут
отличаться по реактивности в процессе амидирования или по
деконъюгации амидированной формы. Отличия в ориентации
карбоксильной группы также отвечает за разный
гидрофобный/гидрофильньный баланс двух молекул, что может обусловливать разные биологические свойства и метаболизм. Для прояснения этого вопроса два чистых изомера вводили путем феморального вливания (в/в) в желчную фистулу модели крысы в виде однократной дозы 1 мкмоль/мин/кг веса тела в 'течение 1
часа, и собирали образцы желчи в течение 3 часов. Также оценивали влияние на желчеотделение, на выделение с желчью исходного соединения и основного метаболита.
Желчеотделение. Желчегонный эффект
Способы
Это исследование осуществляли путем феморального вливания (в/в) двух соединений; 6 крысам (с массой тела 267+12 г) вводили каждый диастереоизомер в дозе 1 мкмоль/мин/кг. Феморальное вливание начинали через 7 5 минут после стабилизации состояния и продолжали в течение 60 минут. Образцы желчи собирали каждые 15 минут в течение 2 часов. Дополнительно, 3 крысам вводили 3% соляной раствор БСА при тех же условиях в отношении времени и сбора образцов (контрольные крысы с феморальным вливанием). Результаты
Показатели желчеотделения во время в/в вливания 3% солевого носителя БСА (контроль, п=1) поддерживались в диапазоне от 40 до 80 мкл/мин/кг в течение всего периода эксперимента. Вливание в/в соединения Ih3e значительно увеличивало скорость желчеотделения, и это явление начиналось через 15 минут от начала вливания и продолжалось в течение по меньшей мере двух часов. Вливание в/в соединения ИЗе также увеличивало скорость желчеотделения, но указанный эффект был значительно ниже, чем эффект, наблюдаемый с изомером соединения Ih3e (фигура 23) .
Фармакокинетика (выделение с желчью) вводимых изомеров при в/в вливании
Анализировали образцы желчи, собранные в ходе в/в экспериментов для определения выделения с желчью вводимых изомеров и их основных метаболитов, восстанавливаемых в желчи.
Ма териалы
Чистый кристаллический порошок каждого соединения получали из лаборатории R. Pellicciari laboratory Университета Perugia. Приготовляли стоковые растворы в метаноле 1 ммоль/л и рабочие растворы путем разведения соответствующих объемов первичного раствора. Метанол и ацетонитрил имели чистоту ВЭЖХ-сорта.
Концентрация аммиака составляла 30%, концентрация уксусной кислоты была 99,8 %. Все реактивы были получены из фирмы Carlo Erba Reagents. Вода ВЭЖХ-сорта поставлялась Milli-Q system. Получение образцов
Образцы крысиной желчи доводили до комнатной температуры, недолго перемешивали и разводили в соотношении 1:100 или 1:200 об/об 15 мМ буфером ацетата аммония (уровень рН=5,0):ацетонитрил=70:30 (об/об). Конечный раствор переносили в пробирку для автосзмплера, и вносили 10 мкл в хроматографическую колонку. Когда образцы получали в линейном диапазоне, их разбавляли и повторно анализировали.
Методика ВЭЖХ-ESI-MS/MS
Образцы крысиной желчи анализировали тандемной жидкостной хроматографией с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-MS/MS) с использованием источника электроспрея (ESI) с отрицательной ионизацией. Для жидкостной хроматографии использовали модуль разделения. Waters Alliance 2695, соединенный с автосэмплером. Автосэмплер находился при 7°С. Разделение осуществляли на колонке Ci8 Synergi Hydro-RP (150x2,0 мм внутр.диам., размер частицы 4 мкмоль), с защитой предколонкой 4x2,0 мм i.d. SecurityGuard ODS, оба прибора от компании Phenomenex. Анализируемое вещество элюировали с использованием 15 мМ буфера ацетата аммония (уровень рН=5,00) в качестве подвижной фазы А, и ацетонитрилом в качестве подвижной фазы В. Подвижную фазу В увеличивали от 30% до 64% за 10 минут, затем до 100% за 10 минут, и поддерживали постоянной в течение 10 мин. Расход составлял 150 мкл/мин, температуру в колонке поддерживали 45°С. Колоночный эффлюент вводили в источник ESI, связанный с тройным квадрупольным масс-спектрометром (Quattro-LC, Micromass), работающим в режиме получения данных Multiple Reaction Monitoring (MRM). В качестве газа распылителя применяли азот со скоростью потока 100 л/час, скорость потока азота в качестве газа десольватации составляла 930.л/час. Показатели температур блока источника ионов и десольватации устанавливали соответственно в 80 °С и 180°С. Капиллярное напряжение составляло 3, 0 кВ. Для сбора и обработки данных ' применяли
программное обеспечение MassLynx версия 4.0. Дополнительно, для идентификации метаболитов проводили исследования масс-спектрометрии как в режиме одиночной конфигурации MS или тандемной MS/MS.
Количественный анализ
Ежедневно строили калибровочную кривую с 5 точками и вводили дважды. Калибровочные образцы, приготовленные в подвижной фазе, получали в диапазоне концентрации от 0,1 до 20 мкмоль/л. Линейные параметры калибровочной кривой получали из построения площади пика аналита в зависимости от концентрации аналита, используя регрессионный анализ наименьших квадратов
(вес = 1/х2) . Коэффициенты корреляции составляли > 0,994. Также оценивали таурин-конъюгированные метаболиты соединений Ih3e и Ii3e, даже в отсутствие у авторов эталонов. Оценивали корректирующие факторы для учета разных ответов свободных и таурин-конъюгированных типов в ES-MS/MS, и применяли их к значениям площадей, полученным из набора данных хроматограмм ВЭЖХ-MRM. Наконец, калибровочные кривые, полученные для свободных желчных кислот, использовали для оценки таурин-конъюгированных метаболитов.
Результаты - выделение с желчью соединения Ih3e Выделение с желчью соединения Ih3e после в/в введения было эффективным, и относительно высокий процент от вводимой дозы соединения восстанавливался в желчи. Кинетический профиль показывает, что соединение Ih3e эффективно захватывается в печени и выделяется с желчью, в основном в немодифицированном виде, и также, в меньшей степени, в виде конъюгата с таурином
(фиг. 24); в следовых количествах в желчи были обнаружены другие минорные метаболиты, включающие в себя глюкорониды
(фигуры 2 6 и 21).
Присутствие метильной группы в положении С-23 препятствует физиологическому процессу конъюгации с таурином и глицином, который является важным для эффективной секреции почти всех карбоксил.ированных ЖК природного происхождения; это крайне важно для дигидрокси-ЖК и в меньшей степени для тригидрокси-ЖК. Степень их восстановления в желчи также связана с' вводимой
дозой, как это выявлено для холевой кислоты (Roda A. et al. Hepatology. 8,1571-6,1988).
Рассматривая физико-химические свойства, авторы
предположили, что указанное соединение может абсорбироваться посредством пассивного механизма распределения (LogP=l,44), и активный механизм представляется не вовлеченным. Присутствие трех гидроксильных групп позволяет молекуле с одной стороны эффективно захватываться печенью и частично выделяться в желчь. Группа 6-этила также предотвращает 7-дегидроксилирование посредством кишечных бактерий, как указано в предыдущем сообщении.
Результаты. Выделение с желчью соединения Ii3e
Выделение с желчью после в/в вливания соединения Ii3e показано в фигуре 25. Кинетический профиль демонстрирует, что указанное соединение метаболизируется в печени более экстенсивно, чем соединение Ih3e. Исходное соединение также выделялось с желчью как есть, и в меньшей степени в виде конъгата с таурином. В отношении диастереоизомера соединения Ih3e процент его конъюгации был выше, при этом максимальная скорость секреции неконъюгированной формы была ниже. Предполагается, что С-23(R) изомер имеет более подходящую для процесса амидирования геометрию боковой цепи и ориентацию по сравнению с изомером (S) , процент выделения которого в виде неконъюгированной формы был более высоким. Конъюгация с таурином способствует улучшению восстановления соединения ИЗе в желчи, которое составляет около 70-80% вводимой дозы. В следовых количествах в желчи были обнаружены другие минорные метаболиты, включающие в себя глюкорониды (фиг. 28-29).
Метаболизм в печени
Способы
Используя данные, полученные в предыдущих экспериментах, а также структурные и физико-химические свойства изученных аналогов, проводили предварительный скрининг для поиска возможных метаболитов.
Соединение Ih3e
Эта молекула выделялась в основном в виде '' исходного
(немодифицированного) соединения и только незначительно метаболизировалась в печени. Основной метаболит представлял собой таурин-конъгированные виды, и было обнаружено очень низкое содержание моноглюкоронидных видов (фиг. 26-27).
Присутствие метильной группы в положении С-23 препятствует физиологическому процессу конъюгации с таурином и' глицином, который является важным для эффективной секреции почти всех карбоксилированных ЖК природного происхождения; это имеет основное значение для дигидрокси-ЖК и в меньшей степени для тригидрокси-ЖК, так как они являются уже весьма полярными. Может быть применимым образование глюкоронидов при их введении в более высоких дозах.
Соединение 1±3е
Эта молекула выделялась в основном в виде исходного (немодифицированного) соединения и также метаболизировалась в печени с образованием таурин-конъгированного вида, и на очень низком уровне, моноглюкоронидного вида (фиг. 27-29).
Присутствие метильной группы в положении С-23 является препятствием для процесса конъюгации с таурином и глицином, который является важным- для эффективной секреции почти всех карбоксилированных ЖК природного происхождения; это имеет основное значение для дигидрокси-ЖК и в меньшей степени для тригидрокси-ЖК, так как они являются уже весьма полярными. Может быть применимым образование глюкоронидов при их введении в более высоких дозах.
Соединение ИЗе выделяется с желчью в виде конъюгированной с таурином формы в более высокой степени, чем диастереоизомер соединения Ih3e, 20-30% по сравнению с 5-10%, и это обусловлено отличием геометрии боковой цепи и немного более высокой липофильностью соединения Ii3e.
Соединение Ih3e является умеренно липофильным и обладает умеренной детергентностью. Обнаружен его эффективный захват. Выделение с желчью также является эффективным, учитывая, что соединение секретируется в основном в немодифицированном виде и, до некоторых пределов в виде конъюгата с таурином. Кишечная абсорбция происходит посредством пассивного механизма, как у
неконъюгированных ЖК природного происхождения, и его кинетика сходна с кинетикой холевой кислоты и слегка ниже, чем кинетика дигидрокси-желчных кислот (Aldini R. et al. Steroids 61, 590-7, 1996) .
Соединение Ih3e не нуждается в обширном печеночном метаболизме для секреции в желчь в вводимой дозе. Присутствие метильной группы в С-23-положении предотвращает обширную конъюгацию с таурином, и молекула может эффективно выделяться немодифицированной. Увеличенное время нахождения молекулы в печени обусловлено дуктулярной абсорбцией, поскольку указанная молекула проходит холегепатический шунтовый путь, который отвечает за ее мощный желчегонный эффект.
Соединение Ii3e представляет собой диастереоизомер соединения Ih3e. Соединение ИЗе отличается немного более низкой гидрофильностью в результате отличий в геометрии боковой цепи. Поэтому С-2 3 карбоксильная группа имеет другую ориентацию и это обусловливает отличие гидрофильно-гидрофобного баланса молекулы. Вследствие более высокой липофильности этой молекуле необходима более выраженная конъюгация с таурином по сравнению с соединением Ih3e. Предполагается, что геометрия боковой цепи указанного соединения приводит к продукции ЖК с более низкой специфичностью субстрата к ферменту, отвечающему за конъюгацию, медиатором которой является процесс активации КоА. Конечный результат состоит в том, что соединение Ii3e выделяется с желчью с более высоким процентом конъюгатов, чем соединение Ih3e.
Другие варианты осуществления
Описание изобретения изложено вместе с его подробным описанием, и вышеупомянутое описание предназначено для его иллюстрации и не ограничивает объем изобретения, определяемый объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем формулы изобретения, изложенной ниже. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что можно делать различные изменения в форме и деталях изобретения, не отступая от объема изобретения, который охватывается прилагаемой формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> intercept Pharmaceuticals, inc.
Pellicciari, Roberto
<12 0> Модуляторы TGR5 и способы их применения
<130> 35147-501002WO
<140> PCT/US09/65188
<141> 2009-11-19
<150> ЕР 08169462.2
<151> 2008-11-19
<160> 2
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Химически синтезированный праймер
<400> 1
agatgctaaa cttgggcttg
<210> 2
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Химически синтезированный праймер
<400> 2
taaagtgccc acaccactc
или его соль, гидрат, или конъюгат глициновой или тауриновой аминокислоты, в котором
Ri представляет собой водород, гидрокси или галоген;
R2 представляет собой водород или а-гидрокси;
R3 представляет собой гидрокси, NH (СН2) mS03H или NH (СН2) пС02Н ;
R5 представляет собой незамещенный или замещенный алкил, или арил;
R6 представляет собой водород; или
R5 и R6, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют кольцо размером 3, 4, 5 или 6 атомов;
R7 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил, или гидрокси;
R8 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил;
R9 представляет собой водород, незамещенный или замещенный алкил; или
R8 и R9, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонил;
R10 представляет собой R3 или S03H;
m является целым числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5; и
п является целым-числом 0, 1, 2, 3, 4 или 5.
2. Соединение по п.1, в котором R8 и R9, взятые вместе с углеродом, к которому они присоединены, образуют карбонил.
3. Соединение по п. 2, в котором R10 является R3, и R3 выбирают из гидроксила, NH(CH2)2S03H и NHCH2C02H.
4. Соединение по п.1, где соединение выбирают из следующих соединений:
2.
Ib3e, Ic3e, Id3e, Ie3e,
I13e,Ig3e, Ih3e, Ii3e, I13e, Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Id4e, Ie4e, If4e, Ig4e, Ih4e, Ii4e, II4e, Im4e, In4e, Ia5e, Ib5e, Ic5e, Id5e, Ie5e, If5e, Ig5e, Ih5e, Ii5e, I15e, Im5e, In5e, Ia9e, Ib9e, Ic9e, Id9e, Ie9e, H9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, I19e, Im9e, In9e, IalOe, IblOe, IclOe, IdlOe, IelOe, IflOe, IglOe, IhlOe, IilOe, IUOe, ImlOe, InlOe, Ialle, Iblle, Idle, Idlle, Ielle, mie, Iglle, Ihlle, Iille, Illle, Imlle, Inlle, IalSe, Ibl5e, Icl5e, IdlSe, Iel5e, 1П5е, Igl5e, IhlSe, Iil5e, I115e, Iml5e, Inl5e, Ial6e, Ibl6e, Icl6e, Idl6e, Iel6e, Шбе, Igl6e, Ihl6e, Iil6e, I116e, Iml6e, Inl6e, Ial7e, Ibl7e, Icl7e, Idl7e, Iel7e, Ifl7e, Igl7e, Ihl7e, Iil7e, II17e, Iml7e и Inl7e.
5. Фармацевтически приемлемая композиция, содержащая соединение по любому из п.п.1-4 или его соль, гидрат или конъюгат глициновой или тауриновой аминокислоты, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.
6. Применение соединения в способе лечения или профилактики болезни у субъекта, включающий.введение соединения по любому из п.п.1-4 или его соли, гидрата или конъюгата глициновой или тауриновой аминокислоты, где болезнь выбирают из метаболического заболевания, воспалительного заболевания, болезни печени, аутоиммунного заболевания, болезни сердца, болезни почек, рака и болезни желудочнокишечного тракта.
По доверенности
vЈ5
03 Q.
X CO
m о
m s i
CD X
CN 5
О Ш Ш ^ С О 5 C^ ri ю (i) N
с; ш c[ ш
I LU
(J) VL/31 oaa
А Ш Обычный рацион + носитель С В Щ Обычный рацион + 6Et,(23)-MeCA D
ВЖ-диета + носитель ВЖ-диета + 6Et,(23)-MeCA
Фиг. 2
ГЛЮКОЗА КРОВИ
лдг
ACT
АЛТ
140120100-
ш 604020-
ABC
Фиг. 2D
I T 0
CD О
650 600 5S0~ 500 450^ 400
BCD
ЛНП-ХОЛЕСТЕРИН
ТРИГЛИЦЕРИДЫ
КОНТРОЛЬ ИНСУЛИНА В ПЛАЗМЕ
НЕДЕЛЯ О
НЕДЕЛЯ 2
НЕДЕЛЯ 10
б-;
31 21
И 0 х
ш А
.iL.
С D
> . о
X 7-
б-5,
4^ 321-
А В С D
> О X
541 32" 1-0J
А В С D
А I ОР
В 0 ОР + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e С Ш ВЖ-ДИЕТА
D ? ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. ЗА
ПЕРОРАЛЬНЫЙ ТЕСТ ТОЛЕРАНТНОСТИ К ГЛЮКОЗЕ
НЕДЕЛЯ 12
400350-
зоо-
^ 250-
со 200^ О
loot
50 0
150$
AUC
/.¦'///.
//,¦¦//,
:УШ
УУУ'УУ-
УШУУ
'¦¦'///У/
iliiijjij
в с
А Ш ОР
В Ш ВЖ-ДИЕТА
С Ш ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. ЗВ
А-А- ОР
B-tSr- ОР + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e С-М- ВЖ-ДИЕТА
D-H~ ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
10 20 ВРЕМЯ (мин)
А-А(tm) ОР
В-А- ОР + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e С-Ш- ВЖ-ДИЕТА
D-S- ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
То" 20 30
ВРЕМЯ (мин)
А Ш OP
В Pi OP +- Соединение ih3e С В ВЖ-диета
ВЖ-диета + Соединение ih3e
А 1 ОР
В Ш ОР + Соединение !h3e С Я ВЖ-диета
D ВЖ-диета + Соединение Sh3e
мин
С D
30 мин
А I ОР СИ ВЖ-ДИЕТА
В Ш ОР + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e D 0 ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. 6
<
о го
CN О
А Ю
ЗРМ 7РМ СВЕТ
ТЕМНОТА
7AM 9АМ СВЕТ
Фиг. 6А
¦z. < ш
о та т
см О
2 ш
ю О
1400 1200-1 1000 800600400
VCOi
т A Т Т
ЗРМ 7РМ СВЕТ
ТЕМНОТА
7AM 9AM СВЕТ
Фиг. 6В
VCO-
160001400012000(tm) и 10000- < 8000
6000400020000-
А В С
ФАЗА ТЕМНОТЫ
X CD
§ ю о
ja с; Ф
3 ш з *
ф гг
05 О
Д-А- ОР
0.8- В ОР + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e 0.75
0.70.650.60.55
0.5
ЗРМ 7РМ СВЕТ
ТЕМНОТА
Фиг. 7А
ЗАМ 9АМ СВЕТ
А т OP
В Ш ОР + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e С Ш ВЖ-ДИЕТА
D ЕЗ ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
RER
BCD
ФАЗА ТЕМНОТЫ
КОНЕЦ ФАЗЫ ТЕМНОТЫ (2.00 - 7.00 УТРА)
А В С D
СВЕТОВАЯ ФАЗА (15.00-7.00 УТРА)
Фиг. 7С
СВЕТ
ТЕМНОТА
Фиг. 8А
ПОТРЕБЛЕНИЕ ПИЩИ ПОТРЕБЛЕНИЕ ВОДЫ (19.00-7.00) (19.00-7.00)
А-а- ОР
В-А- СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
С-"- ВЖ-ДИЕТА
D~n- СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
А Ц OP СИ ВЖ-ДИЕТА
В Ц) ОР + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e D ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. 9
О X
со <
> xg х -X > х ш ш
со х
О О
ш ш ZT со
О о
801 70-|
60 -j 50-1
40-]
зо-j
201
o-f
X О)
т о g
в в
900
800
700
600
500Н
400
300
200
100
° CD CD CD CD
ОКРУЖАЮЩАЯ ПОВЁРХН. ПОДКОЖН. КЖТ
БЖТ БЖТ БЖТ
Фиг. 9С
15 ~45 75 ~105 135 165 195 225
255 285 315 345
ВРЕМЯ (мин)
Фиг. 11
n = 5 (1 мкмоль/мин/кг)
0.5-
0.4-
c; о
0.3-
it;
0.2-
0.1-
Ьг:
0.0-
- <з- |h3e, n = 5 (1 мкмоль/мин/кг) "в- ТАУРО-1 Ih3e n = 5
^ д",-Л---?--1 |
45 75 105 135 165 195 225 255 285 315 345
ВРЕМЯ (мин)
Фиг. 13
-о- ТАУРО - Ih3e -о- ГЛЮКОРОНИД - Ih3e Ih3e
105 1з1Г 165 195 225 ~ 255 285 315 345
-ж-ЭПИМЕРтЗе
•5Е+06
¦p--U~-"(tm)"|"(tm)'')'l-> f.:-U ) ' !¦> ; 1 f 1 1 1
75 105 135 165 195 225 255 285 315 345 ВРЕМЯ (мин)
4.0Е+06-
ДУОДЕНАЛЬНАЯ ИНФУЗИЯ
¦о- ТАУРО - Ih3e
-о- ГЛЮКОРОНИД - Ih3e
-6- Ih3e
3.0Е+06-
g 2.0Е+06-1 .ОЕ+Об'
0.0Е+00
15 45 75 105 135 165 195 225 255 285 315 345
ВРЕМЯ (мин)
3 CO
О С
_. <,.... ТАУРО - Ih3e -о- ГЛЮКОРОНИД -1h3e Ih3e
-ж- ЭПИМЕР Ih3e
9.0E+05
6.0Е+05Ч
3.0E+05
0.0Е+00- ' 1 ' y.Hfr-^--g-ч-4 Г-Г? Г-О г-^-"--|--Lf- W г
15 45 75 105 135 165 195 225 255 285 315 345
ВРЕМЯ (мин)
Фиг. 14D
10 ~U 14 ВРЕМЯ (час)
16 18 20 22 24
X LU
700i
ja m
600-
500-
p-1
400-
300-
200-
100-
CO.
Ш .p
s3 Ш
? НОСИТЕЛЬ Ш lh3e 1 мкМ 0lh3e1O мкМ ЙШЗеЮОмкМ ЦЦЬЗеЮООмкМ
о О
О О ш
rz о
СО JD I
ш со О
0> >
Коэфф. корреляции Пирсона
-0.21 г-0.73, р = 7.2 10"9
JQ СО <
О О
х ^ О ш
I- 5 ZT
о о
m х
<
1.5
? ОмкМ Ш 1 мкМ
т змкм
0.5
1.0
НОСИТЕЛЬ MDL
Фиг. 17В
J 170
(c) 10 Р 8
< ш
ш 3 О
? 0 мкМ Ш 3 мкМ Я ЗОмкМ
О 2 О z О
о ь-со
со ф
1.5-
1.0-
? КОНТРОЛЬ Ш mTGR5 shPHK
0.5
о. ш ci О О 0J
TGR5 CoxlV Kir6.2
Фиг. 17F
см. КОЭФФ. КОРРЕЛЯЦИИ ПИРСОНА г = 0.68, р = 3.3.10
? 0.5-)
о_ -0.5-1 1 > ' 1 1 1
> -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ TGR5
Фиг. 18А
со о
ГС S ZT
LU ZT
о ш
Q. О
<
X XI с; Ш V-
О X
I-О
108642-0^
> MOCK vhTGR5 AS'IRNA HTGR5
ih3e 1 мкМ
40 80 120
ВРЕМЯ (сек)
160
¦MOCK *hTGR5 ASjRNAhTGR5
% уСОЕДИНЕНИЕ Ih3e + Носитель д|ЬЗЕ + MDL
IX X
ш =г о
ш о_ О > с;
е <
X _0
t=. ш
О О
о 8642-
ih3e 3 мкМ
,1.4
30 60 90 ВРЕМЯ (сек)
Фиг. 18D
120
со о
X ш хг о ш а. О >
и: < х
ш б-
ih3e 1 мкМ
о КОНТРОЛЬ
? 1% ГЛЮКОЗА
* 1% ГЛЮКОЗА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
о о
•ч 1 г-
0 -таШ-//-С5С!р--,-//-
40 60 140 160 180 260 280 ВРЕМЯ (сек)
Фиг. 18Е
? НОСИТЕЛЬ О Соединение Ih3e
l 1 ГЛЮКОЗА 3 ГЛЮКОЗА + Ih3e
_1 О ш s: x ш
LQ О
m о
X Ш
m О
20016012080400
0_ _J
x -5
LU ?
о s
LD О m О J3
m 250т 200150100-1 I 50-
дан
._:c_.
-ii-
[JJ НОСИТЕЛЬ
Ш MDL
СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
10 30 мкМ
30-
20-
10-
АО.
щ ж
о ю
ВРЕМЯ (мин)
7006005004003002001000-
ЛХК (мкМ) | 0 --J
[""] Дикий тип Ш TGR5-Tg
т т щ
II fell
1 10 102 103
Фиг. 19D
со О
m О
о О
со I-о
ш см
О со
О о. I-О О 70 60 50 40 30J 20 10 0
? ДИКИЙ ТИП ОР Н ДИКИЙ ТИП ВЖ |§ ДИКИЙ ТИП TGRS-ТдВЖ
# *
Ј"ir
5-10
.X,
1-5
10-80
> 80
с; Ф ю
с; > . О X б
5 4 3 210
РАЗМЕР ОСТРОВКА (1-Ю3 мм2}
Фиг. 19F
Фиг. 19G
0- i -л 1
О 10 30
ВРЕМЯ (мин)
~ СОЛЕВОЙ РАСТВОР ih3e -Чк~ DPP4i -ф- Ih3e + DPP4I
Фиг. 191
<
о; ш
s l-
5" <
х о
со ш
О ОО
тощий
ВЕС
? ОР Ш ВЖ-ДИЕТА
I ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. 20С
о. О
< О ш со
800
- 600
- 400
700
ш ш
'ПЕЧЕНЬ окруж.ПОДКОЖН. КЖТ БЖТ БЖТ
? ОР Ш ВЖ-ДИЕТА Ш ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. 20D
ET з
X 3
LX 2
Ш го
S -5
X го
? ОР Ш ВЖ-ДИЕТА S
15129630
ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. 20F
2.21.84
ш 1.4-
| 1.0-
ш 0.6-1
0.2-1 0
1 I
-О С
х |
LU Е
LQ Ш О. Н О 7000
6000i
5000
4000
3000
2000
1000
ВРЕМЯ (мин)
Фиг. 20Н
-о s
X X 0- ID
s => - 5
LU _
LQ ^
CO ^ О
ass
LU X л -ГШ с;
f= LU 5
Ее ?
it
,=1
:::::
? OP
И ВЖ-ДИЕТА
Ш ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. 20J
ш с
X X
1200-^ 1000Ч 800
600400 200 0
I-О <
1601401006020-0J
Фиг. 20К
Р $ ш
2.5 2.01.51.0: 0.5-
ш! х ~-
ш 2
СТО
о <
о ^
1.00.80.60.40.2-
ВРЕМЯ (мин)
-te-OP^k-ВЖ-ДИЕТА -Ш- ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. 21А
# * # *
- &-ОР- &ГВЖ-ДИЕТА -Щ- ВЖ-ДИЕТА + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
1500-
1300-
<
1100-
900^
с i_
700s
1 оо:
<
со О
8.5 т 7.56.5:
3.0-] 2.5^
1.5?--^
1.0
х_2.5
5^15
х^0.5 s 0J
~-т~ 15
db/db
ВРЕМЯ (мин) db/db + СОЕДИНЕНИЕ Ih3e
Фиг. 21D
о J5 О ? о. О
°Е s
< t
X 5 X w
ш ст;
X > СО d О 0_ С
140
100
60-I
20 0
# *
(X X
ш СС ш со
а. О
150i
# *
120
90-
i §
-Х-. [?
60-
ПЕЧЕНЬ
БЖТ
мышцы
Фиг. 21F
- ш
Pdk4 G6pase Рерск Gck
Фиг. 21G
_ 4.5-1
_ 120'
< 80-
й 40-
I3-5"
< 0J
1 2.5-о 1.5^
S " ----Л
Л- ^
с , ,
ВРЕМЯ (мин) Д TGR5+/+, ВЖ
A TGR5+/+, ВЖ + Соединение Ih3e
ВРЕМЯ (мин)
? TGR5-/-, ВЖ Ш TGR5-/-, ВЖ + соединение Ih3e
Фиг. 22В
ВРЕМЯ (мин)
ВРЕМЯ (мин)
Фиг. 23
5.00Е+06-4.00Е+06-
1 3.00Е4-06-
ФЕМОРАЛЬНАЯ ИНФУЗИЯ
СОЕДИНЕНИЕ Ih3e (rR = 17 мин) -¦л- ТАУРО-ИпЗе (tR = 12,4 мин) -о- ГЛУКОРОН - Ih3e (tR = 8,4 мин) -*- ГЛЮКУРОН - Ih3e (tR = 4,7 мин)
О С
2.00Е+06 1.00Е+06-
О.ООЕ-гОО
-д- -д-
60 90 120 150 180 ВРЕМЯ (мин)
210 240 270
1.00Е+05-
ФЕМОРАЛЬНАЯ ИНФУЗИЯ
СОЕДИНЕНИЕ Ih3e (rR = 17 мин) -д.- ТАУРО-тЗе (tR = 12,4 мин) --*> - ГЛУКУРОН - Ih3e (tR = 8,4 мин) -*- ГЛЮКУРОН - Ih3e (tR = 4,7 мин)
5.00Е+04-
О.ООЕ+00-
ОТЧЕТ О ПАТЕНТНОМ ПОИСКЕ
(статья 15(3) ЕАГЖ и правило 42 Патентной инструкции к ЕАПК)
Номер евразийской заявки: 201400258
Датаподачи: 19 ноября 2009 (19.11.2009) | Дата испрашиваемого приоритета: 19 ноября 2008 (19.11.2008)
Название изобретения: Модуляторы TGR5 и способы их применения
Заявитель:
ИНТЕРСЕПТ ФАРМАСЫОТИКАЛЗ, ИНК.
| | Некоторые пункты формулы не подлежат поиску (см. раздел 1 дополнительного листа)
О Единство изобретения не соблюдено (см. раздел II дополнительного листа)
А. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРЕДМЕТА ИЗОБРЕТЕНИЯ:
Согласно международной патентной классификации (МПК)
C07J9/00 (2006.01) C07J31/00 (2006.01) C07J41/00 (2006.01) А61К31/575 (2006.01) А6IP 1/16 (2006.01)
Б. ОБЛАСТЬ ПОИСКА:
Минимум просмотренной документации (система классификации и индексы МПК)
C07J 9/00, 31/00, 41/00, А61К 31/575, А61Р 1/16
Другая проверенная документация в той мере, в какой она включена в область поиска:
В. ДОКУМЕНТЫ, СЧИТАЮЩИЕСЯ РЕЛЕВАНТНЫМИ
Категория
Ссылки на документы с указанием, где это возможно, релевантных частей
Относится к пункту №
А А А
SATO Hiroyuki et al. Novel Potent and Selective Bile Acid Derivatives as TGR5 Agonists: Biological Screening, Structure-Activity Relationships, and Molecular Modeling Studies. Journal of Medicinal Chemistry, 2008, 51 (6), pp. 1831-1841, (реферат) [он-лайн] CAS (STN), 148:441185, RN 951694-85-2
US 4892868 A (GIPHARMEX S.P.A.) 09.01.1990 ^
WO 2008/091540 A2 (INTERCEPT PHARMACEUTICALS, INC. et al.) 31.07.2008
EP 0186023 A2 (LEHNER A.G.) 02.07.1986
1-6
1-6 1-6
1-6
юследующие документы указаны в продолжении графы В данные о патентах-аналогах указаны в приложении
* Особые категории ссылочных документов: А" документ, определяющий общий уровень техники
Е" более ранний документ, но опубликованный на дату
подачи евразийской заявки или после нее "О" документ, относящийся к устному раскрытию, экспонированию и т.д.
"Р" документ, опубликованный до даты подачи евразийской
заявки, но после даты испрашиваемого приоритета "D" документ, приведенный в евразийской заявке
ИТ" более поздний документ, опубликованный после даты приоритета и приведенный для понимания изобретения
"X" документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмету
поиска, порочащий новизну или изобретательский уровень,
взятый в отдельности "Y" документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмету
поиска, порочащий изобретательский уровень в сочетании с
другими документами той же категории
" &" документ, являющийся патентом-аналогом
"L" документ, приведенный в других целях
Дата действительного завершения патентного поиска:
30 октября 2014(30.10.2014)
Наименование и адрес Международного поискового органа Федеральный институт промышленной собственности
РФ, 123995,Москва, Г-59, ГСП-5,Бережковская наб., 30-1. Факс: 243-3337, телетайп: 114818 ПОДАЧА
Уполномоченное лицо :
(IV)
(IV)
(IV)
14) .
121
121
121
121
121
123
124
124
142
142
2/48
1/48
Фиг. 2В
2/48
1/48
Фиг. 2В
2/48
1/48
Фиг. 2В
2/48
1/48
Фиг. 2В
2/48
1/48
Фиг. 2В
2/48
3/48
Фиг. 2В
2/48
3/48
Фиг. 2В
4/48
5/48
Фиг. 2Н
4/48
5/48
Фиг. 2Н
4/48
5/48
Фиг. 2Н
6/48
5/48
Фиг. 2Н
7/48
7/48
7/48
7/48
7/48
7/48
7/48
7/48
8/48
8/48
10/48
9/48
Фиг. 5В
10/48
9/48
Фиг. 5В
10/48
9/48
Фиг. 5В
10/48
9/48
Фиг. 5В
10/48
11/48
Фиг. 5В
10/48
11/48
Фиг. 5В
10/48
11/48
Фиг. 5В
12/48
13/48
Фиг. 6D
12/48
13/48
Фиг. 6D
12/48
13/48
Фиг. 6D
12/48
13/48
Фиг. 6D
12/48
13/48
Фиг. 6D
12/48
13/48
Фиг. 6D
12/48
13/48
Фиг. 6D
12/48
13/48
Фиг. 6D
12/48
13/48
Фиг. 6D
12/48
13/48
Фиг. 6D
14/48
13/48
Фиг. 6D
14/48
13/48
Фиг. 6D
14/48
13/48
Фиг. 6D
15/48
15/48
15/48
15/48
15/48
15/48
15/48
15/48
16/48
16/48
Фиг. 8В
Фиг. 8В
16/48
16/48
Фиг. 8В
Фиг. 8В
16/48
16/48
Фиг. 8В
Фиг. 8В
17/48
17/48
Фиг. 9В
Фиг. 9В
17/48
17/48
Фиг. 9В
Фиг. 9В
17/48
17/48
Фиг. 9В
Фиг. 9В
18/48
18/48
19/48
19/48
20/48
20/48
20/48
20/48
20/48
20/48
21/48
21/48
Фиг. 14А
Фиг. 14А
21/48
21/48
Фиг. 14А
Фиг. 14А
22/48
22/48
Фиг. 14С
Фиг. 14С
23/48
23/48
Фиг. 15
Фиг. 15
23/48
23/48
Фиг. 15
Фиг. 15
24/48
24/48
26/48
25/48
Фиг. 17D
26/48
25/48
Фиг. 17D
26/48
25/48
Фиг. 17D
26/48
25/48
Фиг. 17D
26/48
27/48
Фиг. 17D
28/48
28/48
Фиг. 18В
Фиг. 18В
28/48
28/48
Фиг. 18В
Фиг. 18В
2.9/48
2.9/48
2.9/48
2.9/48
30/48
30/48
Фиг. 18F
Фиг. 18F
30/48
30/48
Фиг. 18F
Фиг. 18F
31/48
31/48
Фиг. 18Н
Фиг. 18Н
31/48
31/48
Фиг. 18Н
Фиг. 18Н
31/48
31/48
Фиг. 18Н
Фиг. 18Н
32/48
33/48
Фиг. 19С
32/48
33/48
Фиг. 19С
34/48
33/48
Фиг. 19С
34/48
33/48
Фиг. 19С
36/48
35/48
Фиг. 19J
36/48
35/48
Фиг. 19J
36/48
37/48
Фиг. 19J
38/48
38/48
Фиг. 20Е
Фиг. 20Е
38/48
38/48
Фиг. 20Е
Фиг. 20Е
39/48
39/48
39/48
39/48
40/48
40/48
40/48
40/48
41/48
41/48
Фиг. 20L
Фиг. 20L
41/48
41/48
Фиг. 20L
Фиг. 20L
41/48
41/48
Фиг. 20L
Фиг. 20L
42/48
42/48
Фиг. 21В
Фиг. 21В
43/48
43/48
ФИГ. 21Е
ФИГ. 21Е
43/48
43/48
ФИГ. 21Е
ФИГ. 21Е
43/48
43/48
ФИГ. 21Е
ФИГ. 21Е
44/48
44/48
44/48
44/48
44/48
44/48
45/48
45/48
45/48
45/48
45/48
45/48
46/48
47/48
Фиг. 26
46/48
47/48
Фиг. 26
46/48
47/48
Фиг. 26
46/48
47/48
Фиг. 26
46/48
47/48
Фиг. 26
48/48
47/48
Фиг. 26
48/48
47/48
Фиг. 26