[RU]

Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим фрагменты из токсина А и/или токсина В из Clostridium difficile , в частности, изобретение относится к белкам, содержащим первый фрагмент и второй фрагмент, где (1) первый фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина А; (2) второй фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина В; (3) первый фрагмент имеет первый проксимальный конец; (4) второй фрагмент имеет второй проксимальный конец; и где первый фрагмент и второй фрагмент примыкают друг к другу, и где полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А или токсин В или и тот и другой. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим фрагменты или варианты из SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:35.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим фрагменты из токсина А и/или токсина В из Clostridium difficile , в частности, изобретение относится к белкам, содержащим первый фрагмент и второй фрагмент, где (1) первый фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина А; (2) второй фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина В; (3) первый фрагмент имеет первый проксимальный конец; (4) второй фрагмент имеет второй проксимальный конец; и где первый фрагмент и второй фрагмент примыкают друг к другу, и где полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А или токсин В или и тот и другой. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим фрагменты или варианты из SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:35.

---

Евразийское (21) 201391548 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2014.06.30
(22) Дата подачи заявки 2012.05.25
(51) Int. Cl.
C12N15/62 (2006.01) C07K14/33 (2006.01) A61K39/08 (2006.01)
(54) ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ
(31) 61/490,707; 61/490,734; 61/490,716
(32) 2011.05.27
(33) US
(86) PCT/EP2012/059805
(87) WO 2012/163817 2012.12.06
(88) 2013.03.21
(71) Заявитель: ГЛАКСОСМИТКЛАЙН БАЙОЛОДЖИКАЛС С.А. (BE)
(72) Изобретатель: Кастадо Синди (BE)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим фрагменты из токсина А и/ или токсина В из Clostridium difFicileH частности, изобретение относится к белкам, содержащим первый фрагмент и второй фрагмент, где (1) первый фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина А; (2) второй фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина В; (3) первый фрагмент имеет первый проксимальный конец; (4) второй фрагмент имеет второй проксимальный конец; и где первый фрагмент и второй фрагмент примыкают друг к другу, и где полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А или токсин В или и тот и другой. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим фрагменты или варианты из SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, I SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, | SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 или SEQ ID NO:35.
РСТ/ЕР2012/059805 МПК: C12N 15/62 (2006.01) А61К 39/08 (2006.01)
С07К 14/33 (2006.01)
ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к антигенам из Clostridium difficile. В частности, изобретение относится к рекомбинантным белковым антигенам, содержащим фрагменты токсина А и/или токсина В. Кроме того, изобретение относится к иммуногенным композициям или вакцинам, содержащим эти антигены, и применению вакцин и иммуногенных композиций по изобретению в профилактике или терапии. Изобретение также относится к способам иммунизации с использованием композиций по изобретению и применению композиций по изобретению в изготовлении лекарственного средства.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
С. difficile представляет собой наиболее значительную причину внутрибольничных кишечных инфекций и является основной причиной псевдомембранозного колита у людей (Bartlett et al Am. J. Clin. Nutr. 11 suppl:2521-6 (1980)). Уровень общей ассоциированной смертности для лиц, инфицированных С. difficile, по подсчетам составил 5,99% в пределах 3 месяцев после постановки диагноза, с более высокой смертностью, ассоциированной с преклонным возрастом, составляющей 13,5% у пациентов старше 80 лет (Karas et al Journal of Infection 561:1-9 (2010)). Современное лечение инфекции С. difficile заключается во введении антибиотиков (метронидазола и ванкомицина), однако имеется свидетельство о наличие штаммов, устойчивых к этим антибиотикам (Shah et al., Expert Rev. Anti Infect. Ther. 8(5), 555-564 (2010)). Соответственно, существует необходимость в иммуногенных композициях, способных индуцировать антитела против С. difficile и/или защитный иммунный ответ против нее.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Энтеротоксичность С. difficile связана, прежде всего, с действием двух токсинов, токсина А и токсина В. Оба они являются сильнодействующими цитотоксинами (Lyerly et al Current Microbiology 21:29-32 (1990). С-концевые домены токсина А и токсина В содержат повторяющиеся звенья, например, С-концевой домен токсина А составлен из смежных повторяющихся звеньев
(Dove et al Infect. Immun. 58:480-499 (1990)), по этой причине С-концевой домен может упоминаться, как "повторяющийся домен". Эти повторяющиеся участки могут быть далее разделены на короткие повторы (SR) и длинные повторы (LR), как описано в Hoef a/(PNAS 102:18373-18378 (2005)).
Была определена структура фрагмента из 127-аа (аминокислот) из С-конца повторяющегося домена токсина А (Но et al PNAS 102:18373-18378 (2005)). Этот фрагмент формирует (З-соленоидподобную укладку, состоящую, преимущественно, из (З-тяжей с низкой долей а-спиралей.
Было показано, что фрагменты токсина А, в частности, фрагменты С-концевого домена, могут приводить к защитному иммунному ответу у хомяков (Lyerly et al Current Microbiology 21:29-32 (1990)), WO96/12802 и WO00/61762.
Как известно, конструирование слитых белков, которые правильно сворачиваются во время экспрессии, связано с трудностями. Полипептиды по настоящему изобретению представляют собой слитые белки, в которых сохраняется нативная (З-соленоидподобная структура и которые, как видно, обеспечивают иммунный ответ как против токсина А, так и токсина В у мышей.
В первом аспекте изобретения предложен полипептид, содержащий первый фрагмент и второй фрагмент, где
(1) первый фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина А;
(2) второй фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина В;
(3) первый фрагмент имеет первый проксимальный конец;
(4) второй фрагмент имеет второй проксимальный конец; и
полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют
токсин А или токсин В или и тот и другой.
Во втором аспекте изобретения предложен полипептид, содержащий:
(1) SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33 или SEQ ID N0:34 или SEQ ID N0:35;
(2) вариант, имеющий по меньшей мере 90%-ное, 95%-ное, 98%-ное, 99%-ное или 100%-ное сходство с SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ
(1)
ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33 или SEQ ID N0:34 или SEQ ID N0:35; или
(3) фрагмент из по меньшей мере 250, 280, 300, 350, 380, 400, 430, 450, 480, 500, 530, 550, 580 или 600 аминокислот из SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33 или SEQ ID N0:34 или SEQ ID N0:35.
В третьем аспекте изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий полипептид по изобретению.
В четвертом аспекте изобретения предложен вектор, содержащий полинуклеотид по изобретению, связанный с индуцибельным промотором.
В пятом аспекте изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая вектор по изобретению или полинуклеотид по изобретению.
В шестом аспекте изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая полипептид по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
В седьмом аспекте изобретения предложена вакцина, содержащая иммуногенную композицию по изобретению.
В восьмом аспекте изобретения предложено применение иммуногенной композиции по изобретению или вакцины по изобретению в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого С. difficile.
В девятом аспекте изобретения предложено применение иммуногенной композиции по изобретению или вакцины по изобретению в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения заболевания, вызываемого С. difficile.
В десятом аспекте изобретения предложен способ предупреждения или лечения заболевания, вызываемого С. difficile, включающий введение пациенту иммуногенной композиции по изобретению или вакцины по изобретению. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 - перечень последовательностей полипептидов по изобретению.
Фиг. 2 - графическое представление С-концевых доменов Тох А и Тох В с SR повторами, представленными в виде белых прямоугольников, и LR блоками, представленными в виде черных прямоугольников.
Фиг. 3 - графическое представление области соединения между третьим SR VIII Тох А и четвертым SR II Тох В, используемой в слитой конструкции 1.
Фиг. 4 - графическое представление области соединения между вторым SR VIII Тох А и третьим SR II Тох В, используемой в слитой конструкции 2.
Фиг. 5 - графическое представление области соединения между LR VII Тох А и LR II Тох В, используемой в слитой конструкции 3 (содержащей только часть LR VII Тох А и часть LR II Тох В).
Фиг. 6 - графическое представление области соединения между вторым SR VIII Тох А и третьим SR I Тох В, используемой в слитой конструкции 4.
Фиг. 7 - графическое представление области соединения, содержащей глициновый линкер, между последним остатком последовательности белка Тох А и началом четвертого SR II Тох В, используемого в слитой конструкции 5.
Фиг. 8 - графики, описывающие распределение слитых конструкций Тох А-Тох В С. difficile 1 -5, определенное скоростной седиментацией при аналитическом ультрацентрифугировании. Панель а) описывает распределение слитой конструкции 1, панель б) описывает распределение слитой конструкции 2, панель в) описывает распределение слитой конструкции 3, панель г) описывает распределение слитой конструкции 4, и панель д) описывает распределение слитой конструкции 5.
Фиг. 9 - график, описывающий спектр слитых конструкций 2, 3, 4 и 5 в дальней УФ области, измеренный с помощью кругового дихроизма. Спектр для слитой конструкции 2 представлен линией с точками в виде маленьких квадратов, спектр для слитой конструкции 3 представлен линией с точками в виде маленьких ромбов, для слитой конструкции 4 представлен линией с точками в виде кругов и для слитой конструкции 5 представлен линией с точками в виде крестов.
Фиг. 10 - график, описывающий спектр слитых конструкций 2, 3, 4 и 5 в ближней УФ области, измеренный с помощью кругового дихроизма. Спектр для слитой конструкции 2 представлен линией с точками в виде крестов, спектр для слитой конструкции 3 представлен линией с точками в виде кругов, спектр для слитой конструкции 4 представлен линией с точками в виде треугольников, и спектр для слитой конструкции 5 представлен линией с точками в виде маленьких ромбов.
Фиг. 11 - график, показывающий иммуногенность против Тох А у мышей,
иммунизированных фрагментом С-конца токсина А (аа 2387-2706), фрагментом С-конца токсина В (аа 1750-2360) или слитыми конструкциями 1, 2, 3, 4 или 5.
Фиг. 12 - график, показывающий ингибирование гемагглютинации у мышей, иммунизированных фрагментом С-конца токсина А (аа 2387-2706), фрагментом С-конца токсина В (аа 1750-2360) или слитыми конструкциями 1, 2, 3, 4 или 5.
Фиг. 13 - график, показывающий иммуногенность против Тох В у мышей, иммунизированных фрагментом С-конца токсина А (аа 2387-2706), фрагментом С-конца токсина В (аа 1750-2360) или слитыми конструкциями 1, 2, 3, 4 или 5.
Фиг. 14 - титры ингибирования цитотоксичности у мышей, иммунизированных фрагментом С-конца токсина А (аа 2387-2706), фрагментом С-конца токсина В (аа 1750-2360) или слитыми конструкциями 1, 2, 3, 4 или 5.
Фиг. 15 - графики, описывающие распределение слитых конструкций ТохА-ТохВ С. difficile F52New, F54Gly, F54New и F5ToxB, определенное скоростной седиментацией при аналитическом ультрацентрифугировании. Панель а) описывает распределение F52New, панель б) описывает распределение F54Gly, панель в) описывает распределение F54New, и панель г) описывает распределение F5ToxB.
Фиг. 16 - график, описывающий спектр слитых конструкций F52New, F54Gly, F54New и F5ToxB в дальней УФ области, измеренный с помощью кругового дихроизма. Спектр для F52New представлен линией с точками в виде двойных крестов, спектр для F54Gly представлен линией с точками в виде треугольников, для F54New представлен линией с точками в виде квадратов и для F5ToxB представлен линией с точками в виде крестов.
Фиг. 17 - график, описывающий спектр слитых конструкций F52New, F54Gly, F54New и F5ToxB в ближней УФ области, измеренный с помощью кругового дихроизма. Спектр для F52New представлен линией с точками в виде двойных крестов, спектр для F54Gly представлен линией с точками в виде треугольников, для F54New представлен линией с точками в виде квадратов и для F5ToxB представлен линией с точками в виде крестов.
Фиг. 18 - график, показывающий результаты анти-Тох А иммуноферментного анализа (ELISA) для мышей, иммунизированных слитыми конструкциями F2, F52New, F54Gly, G54New или F5ToxB.
Фиг. 19 - график, показывающий результаты анти-Тох В ELISA для
мышей, иммунизированных слитыми конструкциями F2, F52New, F54Gly, F54New или F5ToxB.
Фиг. 20 - график, показывающий ингибирование гемагглютинации у мышей, иммунизированных слитыми конструкциями F2, F52New, F54Gly, F54New или F5ToxB.
Фиг. 21 - график, показывающий титры цитотоксичности в клетках НТ29 из мышей, иммунизированных слитыми конструкциями F2, F52New, F54Gly, F54New или F5ToxB.
Фиг. 22 - график, показывающий титры цитотоксичности в клетках IMR90 из мышей, иммунизированных слитыми конструкциями F2, F52New, F54Gly, F54New или F5ToxB.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПОЛИПЕПТИДЫ
Изобретение относится к полипептиду, содержащему первый фрагмент и второй фрагмент, где
(1) первый фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина А;
(2) второй фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина В;
(3) первый фрагмент имеет первый проксимальный конец;
(4) второй фрагмент имеет второй проксимальный конец; и
где первый фрагмент и второй фрагмент примыкают друг к другу, и где полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А или токсин В или и тот и другой.
Термин полипептид относится к непрерывной последовательности аминокислот.
Термин "повторяющийся домен токсина А" относится к С-концевому домену белка токсина А из С. difficile, содержащему повторяющиеся последовательности. Этот домен относится к аминокислотам 1832-2710 токсина А из штамма VPI10463 (АТСС43255) и их эквивалентам в другом штамме, причем последовательность аминокислот 1832-2710 из штамма VPI10463 (АТСС43255) соответствует аминокислотам 1832-2710 из SEQ ID N0:1.
Термин "повторяющийся домен токсина В" относится к С-концевому
домену белка токсина В из С. difficile. Этот домен относится к аминокислотам 1834-2366 из штамма VPI10463 (АТСС43255) и их эквивалентам в другом штамме, причем последовательность аминокислот 1834-2366 из штамма VPI10463 (АТСС43255) соответствует аминокислотам 1834-2366 из SEQ ID N0:2.
Токсины А и В из С. difficile представляют собой консервативные белки, однако последовательность между штаммами отличается в небольшом количестве, кроме того, аминокислотная последовательность для токсинов А и В в различных штаммах может отличаться по числу аминокислот.
Таким образом, в изобретении термин "повторяющийся домен токсина А" и/или "повторяющийся домен токсина В" относится к последовательности, которая представляет собой вариант с 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной или 100%-ной идентичностью последовательности с аминокислотами 18322710 из SEQ ID N0:1 или вариант с 90%-ной, 95%-ной, 98%-ной, 99%-ной или 100%-ной идентичностью последовательности с аминокислотами 1834-2366 из SEQ ID N0:2. В одном воплощении "вариант" представляет собой полипептид, который отличается от референтных полипептидов консервативными аминокислотными заменами, в результате чего остаток заменен другим с теми же физико-химическими свойствами. Обычно такие замены происходят между Ala, Val, Leu и Не; между Ser и Thr; между кислотными остатками Asp и Glu; между Asn и Gin; и между основными остатками Lys и Агд; или ароматическими остатками Phe и Туг. В одном воплощении "фрагмент" представляет собой полипептид, который содержит непрерывный участок из по меньшей мере 250 аминокислот полипептида.
Кроме того, нумерация аминокислот может отличаться между С-концевыми доменами токсина А (или токсина В) из одного штамма и токсина А (или токсина В) из другого штамма. По этой причине термин "эквиваленты в другом штамме" относится к аминокислотам, которые соответствуют таковым в эталонном штамме (например С. difficile VPI10463), но которые обнаружены в токсине из другого штамма и которые могут, таким образом, быть пронумерованы иначе. Область "эквивалентных" аминокислот можно определить путем выравнивания последовательностей токсинов из разных штаммов. Представленные здесь номера аминокислот относятся к таковым штамма VPI10463.
Термин "фрагмент" полипептида или белка относится к непрерывному участку из по меньшей мере 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 или 600 аминокислот из этого полипептида или белка. Термин "первый фрагмент" относится к непрерывному участку из по меньшей мере 100, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 или 600 аминокислот повторяющегося домена токсина А. Термин "второй фрагмент" относится к непрерывному участку из по меньшей мере 100, 200, 230, 250, 280, 300, 350, 400, 450 или 500 аминокислот повторяющегося домена токсина В.
Термин "первый проксимальный конец" относится к концу первого фрагмента (фрагмента Тох А), который ковалентно связан со вторым фрагментом (фрагментом Тох В) или ковалентно связан с линкерной последовательностью между первым и вторым фрагментом и находится ближе ко второму фрагменту в первичной структуре. Термин "второй проксимальный конец" относится к концу второго фрагмента, который ковалентно связан с первым фрагментом (фрагментом Тох А) или ковалентно связан с линкерной последовательностью между первым и вторым фрагментом и находится ближе к первому фрагменту в первичной структуре.
Полипептид может быть частью более крупного белка, такого как белок-предшественник или слитый белок. Часто выгодно включать дополнительную аминокислотную последовательность, которая содержит последовательности, способствующие очистке, такие как множественные остатки гистидина или дополнительная последовательность для стабильности при рекомбинантном продуцировании. Кроме того, также рассматривается добавление экзогенного полипептида, или липидного хвоста, или полинуклеотидных последовательностей для увеличения иммуногенного потенциала конечной молекулы.
Фрагменты могут быть расположены так, чтобы N-конец первого фрагмента примыкал к С-концу второго фрагмента, альтернативно, С-конец первого фрагмента может примыкать к N-концу второго фрагмента, или С-конец первого фрагмента может примыкать к С-концу второго фрагмента, или N-конец первого фрагмента может примыкать к N-концу второго фрагмента.
Слово "примыкающие" означает разделенные меньше чем или ровно 20, 15, 10, 8, 5, 2, 1 или 0 аминокислотами в первичной структуре.
Полипептид по изобретению вызывает образование антител, которые
нейтрализуют токсин А или токсин В или и тот и другой. В одном воплощении полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А. В другом воплощении полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин В. В другом воплощении полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А и токсин В.
Можно измерить, вызывает ли полипептид образование антител против токсина, путем иммунизации мышей иммуногенной композицией, содержащей полипептид, сбора сыворотки и анализа титров против токсина в сыворотке с использованием ELISA. Сыворотку следует сравнивать с контрольным образцом, полученным от мышей, которые не были иммунизированы. Описание такой методики можно найти в примере 6. Полипептид по изобретению вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А, если сыворотка против полипептида дает измеряемую величину ELISA более чем на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% или 100% выше, чем контрольный образец.
В другом воплощении полипептид по изобретению вызывает защитный иммунный ответ у млекопитающего-хозяина против штаммов С. difficile. В одном воплощении млекопитающее-хозяин выбрано из группы, состоящей из мыши, кролика, морской свинки, примата, не являющегося человеком, обезьяны и человека. В одном воплощении млекопитающее-хозяин представляет собой мышь. В другом воплощении млекопитающее-хозяин представляет собой человека.
Можно определить с использованием анализа контрольного заражения, вызывает ли полипептид защитный иммунный ответ у млекопитающего-хозяина против штаммов С. difficile. В таком анализе млекопитающее-хозяина вакцинируют полипептидом и подвергают воздействию С. difficile, время, которое млекопитающее-хозяин остается в живых после воздействия, сравнивают со временем, которое контрольное не иммунизированное полипептидом млекопитающее остается в живых. Полипептид вызывает защитный иммунный ответ, если млекопитающее, иммунизированное полипептидом, остается в живых по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, 80%, 90% или 100% дольше, чем контрольное млекопитающее, которое не было иммунизировано, после воздействия С. difficile.
Нативная структура С-концевых доменов из токсинов А и В состоит из
протяженной (З-соленоидподобной структуры. Эта структура состоит, в основном, из (З-складчатых структур с незначительным количеством а-спиральных структур, как показано в Но et al (PNAS 102:18373-18378 (2005)). Имеющиеся вторичные структуры можно определить с помощью кругового дихроизма. Например, при измерении формы и величины спектров КД (кругового дихроизма) в дальней УФ области (190-250 нм) и сравнении результатов с аналогичными для известных структур. Это может быть осуществлено с использованием оптической длины пути 0,01 см от 178 до 250 нм с разрешающей способностью и шириной полосы пропускания 1 нм на спектрополяриметре Jasco J-720, например, как видно в примере 5 ниже.
В одном воплощении первый фрагмент содержит меньше чем 25%, 23%, 20%, 18%, 15%, 10% или 7% альфа-спиральной вторичной структуры. В одном воплощении второй фрагмент содержит меньше чем 28%, 25%, 23%, 20%, 18%, 15%, 10% или 7% альфа-спиральной вторичной структуры. В другом воплощении как первый фрагмент, так и второй фрагмент содержат меньше чем 28%, 25%, 23%, 20%, 18%, 15%, 10% или 7% альфа-спиральной вторичной структуры.
В одном воплощении первый фрагмент содержит больше чем 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40% или 42% бета-складчатой структуры. В одном воплощении второй фрагмент содержит больше чем 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40%, или 42% бета-складчатой структуры. В другом воплощении как первый фрагмент, так и второй фрагмент содержат больше чем 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40% или 42% бета-складчатой структуры.
На Фиг. 2 представлена организация С-концевых доменов Тох А и Тох В. С-концевой домен токсина А составлен из 8 повторяющихся участков (обозначенных как повторяющийся участок I, повторяющийся участок II, повторяющийся участок III, повторяющийся участок IV, повторяющийся участок V, повторяющийся участок VI, повторяющийся участок VII и повторяющийся участок VIII), каждый из этих повторяющихся участков может быть дополнительно разделен на короткие повторы (SR), которые представлены в виде белых прямоугольников на Фиг. 2, и длинные повторы (LR), которые представлены в виде черных прямоугольников на Фиг. 2 (за исключением повторяющегося участка VIII Тох А, который не имеет длинного повтора). Каждый из длинных повторов имеет некоторое сходство структуры и
последовательности с другими длинными повторами. Аналогично, короткие повторы имеют некоторое сходство последовательности и структуры друг с другом. С-концевой домен токсина В составлен из 5 повторяющихся участков, подразделяемых на SR и LR. Каждый повторяющийся участок содержит один LR и от 2 до 5 SR (за исключением повторяющегося участка V Тох В, который не имеет длинного повтора). В контексте раскрытия фраза "повторяющийся участок" относится к одному из восьми повторяющихся участков Тох А (обозначенных I, II, III, IV, V, VI, VII и VIII) или одному из пяти повторяющихся участков Тох В (обозначенных I, II, III, IV или VI). Используемый здесь термин "первый повторяющийся участок" относится к повторяющемуся участку (или неполному повторяющемуся участку) из повторяющегося домена токсина А. Термин "второй повторяющийся участок" относится к повторяющемуся участку (или неполному повторяющемуся участку) из повторяющегося домена токсина В. В контексте раскрытия термин "длинный повтор" относится к одному из доменов LR, обозначенных в виде черных прямоугольников на Фиг. 2. В контексте раскрытия термин "короткий повтор" относится к одному из доменов SR, обозначенных в виде белых прямоугольников на Фиг. 2.
Таким образом, например, повторяющийся участок I Тох А содержит три SR и один LR, которые могут упоминаться как первый SRI Тох А, второй SRI Тох А, третий SRI Тох А и LRI Тох А, соответственно.
Считают, что первый проксимальный конец находится в пределах "повторяющегося участка", если первый фрагмент заканчивается аминокислотой, которая находится в пределах этого повторяющегося участка (т.е. первый проксимальный конец содержит только часть последовательности повторяющегося участка). Аналогично считают, что второй проксимальный конец находится в пределах "повторяющегося участка", если второй фрагмент заканчивается аминокислотой, которая находится в пределах этого повторяющегося участка. Например, первый проксимальный конец находится в пределах "повторяющегося участка I Тох А", если первый фрагмент заканчивается любой из аминокислот 1832-1924 (включительно) VPI10463 или ее эквивалентом в другом штамме. Первый проксимальный конец не находится в пределах участка короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор, если первый фрагмент заканчивается аминокислотой, которая не находится в пределах участка короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор.
Положения аминокислот каждого домена были определены для токсина А и токсина В из штамма VPI10463 (АТСС43255). К ним относятся следующие
Название
Начальное положение
Конечное положение
Тох A_l
SR1
1832
1852
SR2
1853
1873
SR3
1874
1893
1894
1924
ToxAJI
SR1
1925
1944
SR2
1945
1965
SR3
1966
1986
SR4
1987
2007
SR5
2008
2027
2028
2058
ToxAJII
SR1
2059
2078
SR2
2079
2099
SR3
2100
2120
SR4
2121
2141
SR5
2142
2161
2162
2192
Тох A_IV
SR1
2193
2212
SR2
2213
2233
SR3
2234
2253
SR4
2254
2275
2276
2306
Тох A_V
SR1
2307
2326
SR2
2327
2347
SR3
2348
2368
SR4
2369
2389
SR5
2390
2409
2410
2440
Тох A_VI
SR1
2441
2460
SR2
2461
2481
SR3
2482
2502
SR4
2503
2522
2523
2553
ToxA_VII
SR1
2554
2573
SR2
2574
2594
SR3
2595
2613
2614
2644
ToxA_VIII
SR1
2645
2664
SR2
2665
2686
SR3
2687
2710
Тох B_l
SR1
1834
1854
SR2
1855
1876
SR3
1877
1896
1897
1926
Тох В II
SR1
1927
1946
SR2
1947
1967
SR3
1968
1987
SR4
1988
2007
SR5
2008
2027
2028
2057
Тох В_Ш
SR1
2058
2078
SR2
2079
2099
SR3
2100
2119
SR4
2120
2139
SR5
2140
2159
2160
2189
Тох BJV
SR1
2190
2212
SR2
2213
2233
SR3
2234
2253
SR4
2254
2273
SR5
2274
2293
2294
2323
Тох B_V
SR1
2324
2343
В связи с этим термин "повторяющийся участок" может относиться к аминокислотам 1832-1924, 1925-2058, 2059-2192, 2193-2306, 2307-2440, 24412553, 2554-2644 или 2645-2710 токсина A (SEQ ID N0:1) или аминокислотам 1834-1926, 1927-2057, 2058-2189, 2190-2323 или 2324-2366 токсина В (SEQ ID N0:2) или их эквивалентам в другом штамме С. difficile.
В связи с этим термин "короткий повтор" может относиться к аминокислотам 1832-1852, 1853-1873, 1874-1893, 1925-1944 1945-1965, 19661986, 1987-2007, 2008-2027, 2059-2078, 2079-2099, 2100-2120, 2121-2141, 21422161, 2193-2212, 2213-2233, 2234-2253, 2254-2275, 2307-2326, 2327-2347, 23482368, 2369-2389, 2390-2409, 2441-2460, 2461-2481, 2482-2502, 2503-2522, 25542573, 2574-2594, 2595-2613, 2645-2664, 2665-2686 или 2687-2710 токсина А (SEQ ID N0:1) или аминокислотам 1834-1854, 1855-1876, 1877-1896, 1927-1946, 1947-1967, 1968-1987, 1988-2007, 2008-2027, 2058-2078, 2079-2099, 2100-2119, 2120-2139, 2140-2159, 2190-2212, 2213-2233, 2234-2253, 2254-2273, 2274-2293, 2324-2343 или 2344-2366 токсина В (SEQ ID N0:2) или их эквивалентам в другом штамме С. difficile.
Аналогично термин "длинный повтор" может относиться к аминокислотам 1894-1924, 2028-2058, 2162-2192, 2276-2306, 2410-2440, 2523-2553 или 26142644 токсина A (SEQ ID N0:1) или аминокислотам 1897-1926, 2028-2057, 21602189 или 2294-2323 токсина В (SEQ ID N0:2) или их эквивалентам в другом штамме С. difficile.
Аналогично термин "участок короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор" может относиться к аминокислотам 1874-1944, 2008-2078, 2142-2212, 2254-2326, 2390-2460, 2503-2573 или 2595-2664 токсина A (SEQ ID N0:1) или аминокислотам 1877-1946, 2008-2078, 2140-2212 или 2274-2343 токсина В (SEQ ID N0:2) или их эквивалентам в другом штамме С. difficile. Термин "не разрывает участок короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор" означает, что проксимальный конец находится в области, которая не разрывает структуру участка короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор, в целом, это означает, что проксимальный конец не находится в пределах длинного повтора и не находится в пределах коротких повторов, составляющих участок короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор, за исключением того, что
проксимальный конец может быть в области 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислот короткого повтора, которые наиболее удалены от длинного повтора согласно последовательности. В одном воплощении термин "не разрывает участок короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор" означает, что проксимальный конец не находится в пределах участка короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор.
В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора. В одном воплощении второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора. В одном воплощении первый проксимальный конец и второй проксимальный конец находятся в пределах короткого повтора. В одном воплощении первый проксимальный конец не разрывает участок короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор. В одном воплощении второй проксимальный конец не разрывает участок короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор. В одном воплощении первый проксимальный конец и второй проксимальный конец не разрывают участок короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор.
В одном воплощении первый проксимальный конец не находится в пределах аминокислот 1878-1940, 2146-2208, 2012-2074, 2258-2322, 2394-2456, 2507-2569, 2599-2660 или 2593-2660 токсина A (SEQ ID N0:1) или их эквивалентов в другом штамме С. difficile. Во втором воплощении второй проксимальный конец не находится в пределах аминокислот 1881-1942, 20122074, 2144-2208 или 2278-2339 токсина В (SEQ ID N0:2) или их эквивалентов в другом штамме С. difficile. В другом воплощении первый проксимальный конец не находится в пределах аминокислот 1878-1940, 2146-2208, 2012-2074, 22582322, 2394-2456, 2507-2569, 2599-2660 или 2593-2660 токсина A (SEQ ID N0:1) или их эквивалентов в другом штамме С. difficile, и второй проксимальный конец не находится в пределах аминокислот 1881-1942, 2012-2074, 2144-2208 или 2278-2339 токсина В (SEQ ID N0:2) или их эквивалентов в другом штамме С. difficile.
В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка V (аминокислоты 2307-2440 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), VI (аминокислоты 2441-2553 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), VII (аминокислоты 2554-2644 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме) или VIII (аминокислоты
2645-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме) токсина А. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VII (аминокислоты 2554-2644 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме) токсина А. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2645-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме) токсина А.
В одном воплощении второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 1834-1926 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме), II (аминокислоты 1927-2057 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) или III (аминокислоты 2058-2189 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В. В другом воплощении второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка II (аминокислоты 1927-2057 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В. В другом воплощении второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 1834-1926 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В.
В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2645-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме) токсина А и второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 18341926 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2645-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме) токсина А, и второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка II (аминокислоты 1927-2057 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VII (аминокислоты 2554-2644 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме) токсина А, и второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 1834-1926 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VII (аминокислоты 2554-2644 из SEQ ID N0:1 или их
эквиваленты в другом штамме) токсина А, и второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка II (аминокислоты 1927-2057 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VI (аминокислоты 2441-2553 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 1834-1926 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VI (аминокислоты 2441-2553 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка II (аминокислоты 1927-2057 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка V (аминокислоты 2307-2440 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 1834-1926 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка V (аминокислоты 2307-2440 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка II (аминокислоты 1927-2057 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме) токсина В.
В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2690-2710, или 2695-2710, или 2700-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквивалентов в другом штамме. В другом воплощении первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2670-2700, или 26752695, или 2680-2690 из SEQ ID N0:1 или их эквивалентов в другом штамме. В одном воплощении второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1860-1878 токсина В или их эквивалентов в другом штамме. В одном воплощении второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1950-1980, 1955-1975 или 1960-1970 из SEQ ID N0:2 или их эквивалентов в другом штамме. В другом воплощении второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1978-2008, 1983-2003 или 1988-1998
из SEQ ID N0:2 или их эквивалентов в другом штамме. В другом воплощении второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1860-1878, 1854-1876, 1857-1887, 1862-1882 или 1867-1877 из SEQ ID N0:2 или их эквивалентов в другом штамме.
В одном воплощении первый фрагмент состоит из полного повторяющегося домена токсина А (аминокислоты 1832-2710). В одном воплощении второй фрагмент состоит из полного повторяющегося домена токсина В (аминокислоты 1833-2366).
В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 4 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1988-2007 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1968-1987 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1947-1967 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1877-1896 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого
повтора 2 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1855-1876 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 1 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1834-1854 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2665-2686 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 4 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1988-2007 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2665-2686 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1968-1987 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2665-2686 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1947-1967 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2665-2686 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1877-1896 токсина В или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2665-2686 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1855-1876 из SEQ ID N0:2
или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2665-2686 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 1 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1834-1854 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VII токсина А (аминокислоты 2574-2594 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 4 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1988-2007 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VII токсина А (аминокислоты 2574-2594 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1668-1987 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VII токсина А (аминокислоты 2574-2594 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1947-1967 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VII токсина А (аминокислоты 2574-2594 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1855-1876 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VII токсина А (аминокислоты 2574-2594 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 1 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1834-1854 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении
первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2482-2502 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 4 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1988-2007 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2482-2502 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1968-1987 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2482-2502 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1947-1967 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2482-2502 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1855-1876 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2482-2502 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 1 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1834-1854 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2461-2481 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 4 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1988-2007 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2
повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2461-2481 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1968-1987 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2461-2481 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1947-1967 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2461-2481 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1855-1876 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме). В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VI токсина А (аминокислоты 2461-2481 из SEQ ID N0:1 или их эквиваленты в другом штамме), и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 1 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1834-1854 из SEQ ID N0:2 или их эквиваленты в другом штамме).
В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2690-2710, или 2695-2710, или 2700-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквивалентов в другом штамме, и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1950-1980, 1955-1975 или 1960-1970 из SEQ ID N0:2 или их эквивалентов в другом штамме. В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2690-2710, или 26952710, или 2700-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквивалентов в другом штамме, и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1978-2008, 1983-2003 или 1988-1998 из SEQ ID N0:2 или их эквивалентов в другом штамме. В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2690-2710, или 2695-2710, или 2700-2710 из SEQ ID N0:1 или их эквивалентов в другом штамме, и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1857-1887, 1862-1882 или 1867-1877 из SEQ
ID N0:2 или их эквивалентов в другом штамме. В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2670-2700, или 26752695, или 2680-2690 из SEQ ID N0:1 или их эквивалентов в другом штамме, и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1950-1980, 1955-1975 или 1960-1970 из SEQ ID N0:2 или их эквивалентов в другом штамме. В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2670-2700, или 2675-2695, или 2680-2690 из SEQ ID N0:1 или их эквивалентов в другом штамме, и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1978-2008, 1983-2003 или 1988-1998 из SEQ ID N0:2 или их эквивалентов в другом штамме. В одном воплощении первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2670-2700 или 26752695 или 2680-2690 из SEQ ID N0:1 или их эквивалентов в другом штамме, и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1857-1887, 1862-1882, 1860-1878 или 1867-1877 из SEQ ID N0:2 или их эквивалентов в другом штамме.
В одном воплощении первый фрагмент содержит по меньшей мере 100, 200, 300, 400 или 450 аминокислот. В одном воплощении второй фрагмент содержит по меньшей мере 100, 200, 300 или 400 аминокислот.
В одном воплощении полипептид дополнительно содержит линкер. Этот линкер может находиться между первым проксимальным концом и вторым проксимальным концом, альтернативно, линкер может соединять дистальные концы первого фрагмента и/или второго фрагмента с дополнительной последовательностью аминокислот.
Пептидная линкреная последовательность может быть использована для разделения первого фрагмента и второго фрагмента. Такая пептидная линкреная последовательность включается в слитый белок с использованием хорошо известных в данной области техники стандартных методов. Подходящие пептидные линкреные последовательности можно выбирать на основании следующих факторов: (1) их способность принимать гибкую протяженную конформацию; (2) их способность принимать вторичную структуру, которая может взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом фрагменте и/или втором фрагменте; и (3) отсутствие гидрофобных или заряженных остатков, которые могут взаимодействовать с функциональными эпитопами Тох А и/или Тох В. Пептидные линкерные последовательности могут
содержать остатки Gly, Asn и Ser. Другие близкие к нейтральным аминокислотам, такие как Thr и Ala, также можно использовать в линкерной последовательности. Аминокислотные последовательности, которые могут быть успешно использованы в качестве линкеров, включают раскрытые в Maratea et al., Gene 40:39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262 (1986); патент США № 4935233 и патент США № 4751180.
В одном воплощении линкер содержит 1-19, 1-15, 1-10, 1-5, 1-2, 5-20, 515, 5-15, 10-20 или 10-15 аминокислот. В одном воплощении линкер представляет собой глициновый линкер, линкер может содержать множественные (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 18 или 19) смежные остатки глицина, или, альтернативно, линкер может содержать несколько остатков глицина и несколько остатков других аминокислот, таких как аланин. В другом воплощении линкер содержит один остаток глицина.
В одном воплощении полипептид по изобретению представляет собой часть более крупного слитого белка. Слитые белки могут дополнительно содержать аминокислоты, кодирующие иммуногенный участок дополнительного белкового антигена. Например, слитый белок может дополнительно содержать иммуногенный участок белкового антигена, полученного или имеющего происхождение из бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. pneumoniae, Н. influenzae, N. meningitidis, Е. coli, М. cattarhalis, С. tentani, С. diphtheriae, В. pertussis, S. epidermidis, энтерококков, S. aureus и Pseudomonas aeruginosa. В этом случае линкер может находиться между первым фрагментом или вторым фрагментом и дополнительным иммуногенным участком белкового антигена.
Термин "его иммуногенный участок" или "иммуногенный фрагмент" относится к фрагменту полипептида, содержащему эпитоп, который распознают цитотоксические Т-лимфоциты, хелперные Т-лимфоциты или В-клетки. Подходящим образом, иммуногенный участок будет содержать по меньшей мере 30%, подходящим образом по меньшей мере 50%, особенно по меньшей мере 75% и в частности по меньшей мере 90% (например 95% или 98%) аминокислот в контрольной последовательности. Иммуногенный участок, подходящим образом, будет содержать все эпитопные области контрольной последовательности.
В одном воплощении полипептид содержит иммуногенный фрагмент из SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID
N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 или SEQ ID N0:27. В одном воплощении полипептид содержит иммуногенный фрагмент из по меньшей мере 500, 550, 600, 650, 700, 750, 780, 800, 830, 850, 880, 900, 920 или 950 аминокислот из SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 или SEQ ID N0:27. В другом воплощении полипептид содержит вариант SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 или SEQ ID N0:27, в другом воплощении полипептид содержит вариант, имеющий по меньшей мере 80%-ную, 85%-ную, 90%-ную, 92%-ную, 95%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность последовательности с SEQ ID N0:3-SEQ ID N0:7.
В одном воплощении полипептид содержит больше чем 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825 или 850 аминокислот из токсина А. В одном воплощении полипептид содержит меньше чем 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625 или 600 аминокислот из токсина А. В одном воплощении полипептид содержит больше чем 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 или 525 аминокислот из токсина В. В одном воплощении полипептид содержит меньше чем 525, 500, 475 или 450 аминокислот из токсина В.
Термин "идентичность", известный в данной области техники, представляет собой соответствие между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, в зависимости от обстоятельств, как определено в результате сравнения последовательностей. В данной области техники "идентичность" также означает степень родства последовательностей между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями, в зависимости от обстоятельств, как определено посредством сопоставления цепей таких последовательностей. "Идентичность" можно легко рассчитать с помощью известных методов, включая, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis из SEQuence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; и Carillo, H., and
Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), но не ограничиваясь ими. Методы определения идентичности предназначены для получения наиболее высокого совпадения между тестируемыми последовательностями. Кроме того, методы определения идентичности кодифицированы в общедоступных компьютерных программах. Способы с использованием компьютерных программ для определения идентичности между двумя последовательностями включают программу Needle BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) и FASTA (Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)), но не ограничиваются ими. Семейство программ BLAST является общедоступным в NCBI и других источниках (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана также можно использовать для определения идентичности.
Параметры для сравнения полипептидной последовательности включают следующие:
алгоритм: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970);
матрица сравнения: BLOSSUM62 от Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 89:10915-10919(1992);
штраф за пропуск: 10;
штраф за продолжение пропуска: 0.5.
Полезная программа с этими параметрами является общедоступной, как "needle" программа из пакета EMBOSS (Rice P.et al, Trends in Genetics 2000 col.16(6):276-277). Вышеупомянутые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения пептидов (наряду с отсутствием штрафа за концевые пропуски).
Для того чтобы определить идентичность контрольной последовательности с SEQ ID N0:1, в одном воплощении идентичность последовательности рассчитывают по всей длине контрольной последовательности. В другом воплощении идентичность последовательности рассчитывают по всей длине последовательности в SEQ ID N0:1. Для того чтобы определить идентичность контрольной последовательности с SEQ ID N0:2, в одном воплощении идентичность последовательности рассчитывают по всей длине контрольной последовательности. В другом воплощении идентичность последовательности рассчитывают по всей длине
последовательности в SEQ ID N0:2.
В дополнительном аспекте изобретения предложен полипептид, содержащий (1) SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, или SEQ ID N0:34, или SEQ ID N0:35, (2) вариант, имеющий по меньшей мере 80%-ную, 85%-ную, 88%-ную, 90%-ную, 92%-ную, 95%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность с SEQ ID N0:10-19; или (3) фрагмент из по меньшей мере 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 или 600 аминокислот из SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, или SEQ ID N0:34, или SEQ ID N0:35. В другом воплощении полипептид содержит SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, или SEQ ID N0:34, или SEQ ID N0:35, (2) вариант, имеющий по меньшей мере 80%-ную, 85%-ную, 88%-ную, 90%-ную, 92%-ную, 95%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность с SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, или SEQ ID N0:34, или SEQ ID N0:35; или (3) фрагмент из по меньшей мере 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 или 600 аминокислот из SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, или SEQ ID N0:34, или SEQ ID N0:35. В другом воплощении полипептид содержит SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, или SEQ ID N0:34, или SEQ ID N0:35, (2) вариант, имеющий по меньшей мере 80%-ную, 85%-ную, 88%-ную, 90%-ную, 92%-ную,
95%-ную, 98%-ную, 99%-ную или 100%-ную идентичность с SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, или SEQ ID N0:34, или SEQ ID N0:35; или (3) фрагмент из по меньшей мере 100, 200, 230, 250, 300, 350, 380, 400, 450, 480, 500, 530, 550, 580 или 600 аминокислот из SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, или SEQ ID N0:34, или SEQ ID N0:35.
В одном воплощении полипептид содержит больше чем 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825 или 850 аминокислот из токсина А. В одном воплощении полипептид содержит меньше чем 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625 или 600 аминокислот из токсина А. В одном воплощении полипептид содержит больше чем 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 или 525 аминокислот из токсина В. В одном воплощении полипептид содержит меньше чем 525, 500, 475 или 450 аминокислот из токсина В.
В другом воплощении полипептид вызывают образование нейтрализующих антител, которые нейтрализуют токсин А или токсин В или и тот и другой. В другом воплощении полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А. В другом воплощении полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин В. В другом воплощении полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А и токсин В. Полипептид по изобретению вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А, если сыворотка против полипептида дает измеряемую величину ELISA более чем на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% или 100% выше, чем контрольный образец.
В другом воплощении полипептид по изобретению вызывает защитный иммунный ответ у млекопитающего-хозяина против штаммов С. difficile. В одном воплощении млекопитающее-хозяин выбрано из группы, состоящей из мыши, кролика, морской свинки, обезьяны, примата, не являющегося человеком, и человека. В одном воплощении млекопитающее-хозяин представляет собой мышь. В другом воплощении млекопитающее-хозяин представляет собой человека.
Можно определить с использованием анализа контрольного заражения, вызывает ли полипептид защитный иммунный ответ у млекопитающего-хозяина против штаммов С. difficile. В таком анализе млекопитающее-хозяин вакцинируют полипептидом и подвергают воздействию С. difficile, время, которое млекопитающее-хозяин остается в живых после воздействия, сравнивают со временем, которое контрольное не иммунизированное полипептидом млекопитающее остается в живых. Полипептид вызывает защитный иммунный ответ, если млекопитающее, иммунизированное полипептидом, остается в живых по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% или 100% дольше, чем контрольное млекопитающее, которое не было иммунизировано, после воздействия С. difficile. В одном воплощении полипептид по изобретению вызывает защитный иммунный ответ против штаммов С. difficile у млекопитающего, выбранного из группы, состоящей из мыши, морской свинки, обезьяны и человека. В одном воплощении млекопитающее представляет собой мышь, в другом воплощении млекопитающее представляет собой человека.
Нативная структура С-концевых (повторяющихся) доменов из токсинов А и В состоит из протяженной (З-соленоидподобной структуры. Эта структура состоит, в основном, из (З-складчатых структур с незначительным количеством а-спиральных структур, как показано в Но et al (PNAS 102:18373-18378 (2005)). Имеющиеся вторичные структуры можно определить с помощью кругового дихроизма. Например, при измерении формы и величины спектров КД в дальней УФ области (190-250 нм) и сравнении результатов с результатами для известных структур. Это может быть осуществлено с использованием оптической длины пути 0,01 см от 178 до 250 нм с разрешающей способностью и шириной полосы пропускания 1 нм на спектрополяриметре Jasco J-720, например, как видно в примере 5 ниже.
В одном воплощении полипептид содержит меньше чем 25%, 23%, 20%, 28%, 15%, 10% или 7% альфа-спиральной вторичной структуры. В другом воплощении полипептид содержит больше чем 20%, 25%, 28%, 30%, 33%, 35%, 38%, 40% или 42% бета-складчатой структуры.
ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ
Кроме того, в изобретении предложен полинуклеотид, кодирующий полипептид по изобретению. В контексте изобретения термин
"полинуклеотид(ы)", как правило, относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, которые могут быть немодифицированными РНК или ДНК или модифицированными РНК или ДНК, включая одно- и двухцепочечные области/формы.
Используемый здесь термин "полинуклеотид, кодирующий пептид" охватывает полинуклеотиды, которые включают последовательность, кодирующую пептид или полипептид по изобретению. Термин также охватывает полинуклеотиды, которые включают одну непрерывную область или прерывистые области, кодирующие пептид или полипептид (например полинуклеотиды, прерванные интегрированным фагом, интегрированной инсерционной последовательностью, интегрированной последовательностью вектора, интегрированной последовательностью транспозона или за счет редактирования РНК либо реорганизации геномной ДНК), вместе с дополнительными областями, которые также могут содержать кодирующие и/или некодирующие последовательности.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует много нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, как описано здесь. Некоторые из этих полинуклеотидов обладают минимальным сходством с нуклеотидной последовательностью любого нативного (т.е. встречающегося в природе) гена. Тем не менее, полинуклеотиды, отличающиеся ввиду различий в применении кодонов, специально предусмотрены настоящим изобретением, например, полинуклеотиды, оптимизированные для селекции кодонов у человека и/или примата и/или Е. coli.
Последовательности, кодирующие требуемый полипептид, можно синтезировать, полностью или частично, с использованием химических методов, хорошо известных в данной области техники (см. Caruthers, М. Н. et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 215-223 (1980), Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 225-232 (1980)). Альтернативно, белок сам по себе может быть получен с использованием химических методов для синтеза аминокислотной последовательности полипептида или его участка. Например, синтез пептида можно выполнять с использованием различных твердофазных методик (Roberge et al., Science 269:202-204 (1995)), а автоматизированный синтез может быть выполнен, например, с использованием пептидного синтезатора
ASI 431 A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).
Кроме того, полинуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут быть сконструированы с использованием широко известных в данной области техники методов для того, чтобы изменить последовательности, кодирующие полипептид, по множеству причин, включая, но не ограничиваясь этим, изменения, которые модифицируют клонирование, процессинг и/или экспрессию генного продукта. Например, для конструирования нуклеотидных последовательностей можно использовать перетасовку ДНК посредством случайной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР. Кроме того, сайт-направленный мутагенез может быть использован для вставки новых сайтов рестрикции, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтения кодонов, получения сплайс-вариантов или введения мутаций и т. Д.
ВЕКТОРЫ
В другом аспекте изобретения настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотид по изобретению, связанный с индуцибельным промотором, таким образом, что при индукции промотора экспрессируется полипептид, кодируемый полинуклеотидом.
Дополнительный аспект изобретения включает указанный вектор, где индуцибельный промотор активируется добавлением достаточного количества IPTG (изопропил-(3-0-1-тиогалактопиранозид), предпочтительно, к ростовой среде. Возможно, он находится в концентрации от 0,1 до 10 мМ, от 0.1 до 5 мМ, от 0,1 до 2,5 мМ, от 0,2 до 10 мМ, от 0,2 до 5 мМ, от 0,2 до 2,5 мМ, от 0,4 до 10 мМ, от 1 до 10 мМ, от 1 до 5 мМ, от 2,5 до 10 мМ, от 2,5 до 5 мМ, от 5 до 10 мМ. Альтернативно, промотор можно индуцировать изменением температуры или рН.
КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА
Для рекомбинантного получения полипептидов по изобретению клетки-хозяева могут быть генетически сконструированы для включения систем экспрессии или их частей или полинуклеотидов по изобретению. Введение полинуклеотида в клетку-хозяина может быть осуществлено методами, описанными во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) и Sambrook, et
al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), как, например, кальций-фосфатная трансфекция, ОЕАЕ(диэтиламиноэтил)-декстран-опосредованная трансфекция, трансвекция, микроинъекция, опосредованная катионным липидом трансфекция, электропорация, конъюгация, трансдукция, введение при соскабливании, баллистическое введение и инфекция.
Характерные примеры подходящих хозяев включают клетки грамотрицательных бактерий, такие как клетки Е. coli, Acinetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campylobacter, Cyanobacteria, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, Yersinia. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку Escherichia coli. Альтернативно, также могут быть использованы клетки грамположительных бактерий. Большое разнообразие систем экспрессии может быть использовано для получения полипептидов по изобретению. В одном воплощении вектор имеет происхождение из бактериальных плазмид. Как правило, при этом для экспрессии можно использовать любую систему или вектор, подходящие для поддержания, увеличения числа копий или экспрессии полинуклеотидов и/или для экспрессии полипептида в хозяине. Подходящую последовательность ДНК можно вставлять в систему экспрессии с помощью любой из множества хорошо известных и стандартных методик, таких как, например, изложенных в Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (выше).
ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ВАКЦИНЫ
Кроме того, предложена иммуногенная композиция, содержащая полипептид по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант. Выбор подходящего адъюванта, подлежащего смешиванию с бактериальными токсинами или конъюгатами, полученными с использованием способов по изобретению, входит в компетенцию специалиста в данной области техники. Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия, или фосфат алюминия, или алюминиевые квасцы, но также могут быть солями других металлов, таких как кальций, магний, железо или цинк, или могут быть нерастворимой суспензией ацилированного
тирозина, или ацилированными сахарами, катионно или анионно дериватизированными сахаридами или полифосфазенами.
В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит дополнительные антигены. В одном воплощении дополнительные антигены представляют собой антигены, имеющие происхождение из бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. pneumoniae, Н. influenzae, N. meningitidis, Е. coli, М. cattarhalis, возбудителей столбняка, дифтерии, коклюша, S. epidermidis, энтерококков, S. aureus и Pseudomonas aeruginosa. В другом воплощении иммуногенная композиция по изобретению может дополнительно содержать антигены из С. difficile, например белки S-слоя (WO01/73030).
Кроме того, предложена вакцина, содержащая иммуногенную композицию, причем эта вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый эксципиент.
Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, можно применять для защиты млекопитающего, восприимчивого к инфекции С. difficile, или лечения млекопитающего с инфекцией С. difficile путем введения указанной вакцины через системный путь или через слизистую. Эти введения могут включать инъекцию через внутримышечный, внутрибрюшинный, внутрикожные или подкожный пути; или введение через слизистую в ротовую полость/пищеварительный тракт, дыхательные, мочеполовые пути. Хотя вакцина по изобретению может быть введена в виде одной дозы, ее компоненты также могут быть введены совместно друг с другом в одно и то же время или в разное время (например, конъюгаты пневмококковых сахаридов можно вводить отдельно, в одно и то же время или через 1-2 недели после введения любого бактериального белкового компонента вакцины для координации иммунных ответов по отношению друг к другу). Помимо одного пути введения можно использовать 2 разных пути введения. Например, сахариды или сахаридные конъюгаты могут быть введены внутримышечно (IM) или внутрикожно (ID), а бактериальные белки могут быть введены интраназально (IN) или внутрикожно (ID). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводит IM для примирующих доз и IN для бустерных доз.
Содержание токсинов в вакцине, как правило, будет находиться в диапазоне 1-250 мкг, предпочтительно 5-50 мкг, наиболее типично в диапазоне 5-25 мкг. После первичной вакцинации субъекты могут получать одну или
несколько бустерных иммунизации с адекватным временным интервалом. Приготовление вакцин в целом описано в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляции в липосомы описана Fullerton, патент США 4235877.
В одном аспекте изобретения предложен вакцинный набор, включающий флакон, содержащий иммуногенную композицию по изобретению, возможно, в лиофилизированной форме, и дополнительно включающий флакон, содержащий адъювант, как описано здесь. Предполагается, что в этом аспекте изобретения адъювант будет использован для восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции.
Другой аспект изобретения представляет собой способ предупреждения или лечения инфекции С. difficile, включающий введение хозяину иммунозащитной дозы иммуногенной композиции или вакцины или набора по изобретению. В одном воплощении предложен способ предупреждения или лечения первичных и/или рецидивирующих эпизодов инфекции С. difficile, включающий введение хозяину иммунозащитной дозы иммуногенной композиции или вакцины или набора по изобретению.
Другой аспект изобретения представляет собой иммуногенную композицию по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого С. difficile. В одном воплощении предложена иммуногенная композиция по изобретению для применения в лечении или предупреждении первичных и/или рецидивирующих эпизодов заболевания, вызываемого С. difficile.
Другой аспект изобретения представляет собой применение иммуногенной композиции или вакцины или набора по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания, вызываемого С. difficile. В одном воплощении предложена иммуногенная композиция по изобретению для применения в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения первичных и/или рецидивирующих эпизодов заболевания, вызываемого С. difficile.
"Около" или "приблизительно" в контексте изобретения определяют как в пределах 10% больше или меньше данной величины.
Авторы изобретения подразумевают, что термины "содержащий", "содержат" и "содержит" могут в каждом случае быть заменены терминами
"состоящий из", "состоят из" и "состоит из", соответственно. Термин "содержит" означает "включает". Таким образом, если контекст не требует иного, слово "содержит" и его варианты, такие как "содержат" и "содержащий" следует понимать как включение указанных соединения или композиции (например нуклеиновой кислоты, полипептида, антигена) или стадии либо группы соединений или стадий, но не исключение каких-либо других соединений, композиции, стадий или их групп.
Воплощения, относящиеся к "вакцинным композициям" по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к "иммуногенным композициям" по изобретению, и наоборот.
Если иное не объяснено, все используемые здесь технические и научные термины имеют такое же значение, как традиционно понимает обычный специалист в данной области техники, к которой принадлежит данное описание. Определения традиционных терминов в области молекулярной биологии можно найти в Benjamin Lewin, Genes V, опубликованной Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованной Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-63202182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованной VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Термины в единственном числе включают множественное число, если в контексте явным образом не указано иное. Аналогично, слово "или" предназначено для включения "и", если в контексте явным образом не указано иное. Термин "множество" относится к двум или более. Кроме того, следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот, а также все значения молекулярного веса или молекулярной массы (ММ), приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предназначены для описания. Дополнительно, числовые пределы, приведенные в отношении концентраций или уровней вещества, такого как антиген (Ад), могут быть приблизительными.
Все ссылки или заявки на патент, цитируемые в описании, включены в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте.
Следующие примеры представлены для того, чтобы данное изобретение можно было лучше понять. Эти примеры приведены лишь в качестве
иллюстрации и не должны быть истолкованы как ограничивающие каким-либо образом объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: разработка пяти слитых конструкций ТохА-ТохВ С. difficile
Были сконструированы слитые белки, содержащие фрагменты С-концевых повторяющихся доменов Тох А и Тох В. Эти слитые конструкции содержали фрагмент С-концевого повторяющегося домена Тох А и фрагмент С-концевого повторяющегося домена Тох В и область соединения между С-терминальным концом фрагмента Тох А и N-терминальным концом фрагмента Тох В. Были разработаны две стратегии, согласно первой стратегии слитая конструкция была разработана таким образом, чтобы длинная соленоидная структура сохранялась у области соединения между двумя фрагментами. Согласно второй стратегии два фрагмента слитых конструкций разделены линкером, чтобы сделать возможным независимый правильный фолдинг.
С-концевая часть Тох А и В состоит из повторяющихся последовательностей: коротких повторов (SR) и длинных повторов (LR) (PNAS 2005 vol 102: 18373-18378).
Частично известна трехмерная структура С-концевого домена Тох А (PNAS 2005 Greco et al., vol 102: 18373-18378; Nature Structural & Molecular biology 2006 vol 13(5): 460-461; коды в PDB: 2F6E, 2G7C and 2QJ6).
Авторы изобретения предсказали, что существуют два вида существенных взаимодействий между остатками С-концевой части Тох А и Тох В. Первое взаимодействие происходит между остатками, содержащимися в LR и предшествующем ему SR, и является важным для сохранения соленоидподобной структуры. Второй тип взаимодействия происходит между остатками, содержащимися в LR и последующем SR, и это взаимодействие опосредует углевод-связывающую функцию токсина.
Был определен новый "структурно-функциональный" повтор SR-LR-SR. Структура этого повтора сохранялась интактной в разработанных слитых конструкциях.
На Фиг. 2 представлены С-концевые домены Тох А и Тох В и определенный блок "SR-LR-SR".
Положения коротких (SR) и длинных повторов (LR) Тох А и Тох В
представлены в таблице 1.
Список блоков "SR-LR-SR", содержащихся в С-концевом домене Тох А и Тох В, представлен в таблице 2.
Наконец, число SR между двумя LR будет сохраняться в разработанных слитых конструкциях для поддержания длинной соленоидподобной структуры.
Перед разработкой областей соединения для слитых конструкций были определены две рабочие гипотезы: первая гипотеза - чем короче слитые конструкции, тем выше вероятность стабильной повышенной экспрессии слитых конструкций; вторая гипотеза, в соответствии с концепцией блоков "SR-LR-SR", начальное положение должно быть выбрано для того, чтобы сделать возможным правильный фолдинг первого SR этого ранее определенного блока SR-LR-SR. Таким образом, слитые конструкции начинаются с начала SR, который предшествует блоку SR-LR-SR. С помощью этих двух гипотез проанализировали три начальных положения: остаток 2370, 2234 и 2121 из Тох А.
Было исключено начальное положение 2370. Начальное положение 2234 также было исключено, так как один из остатков, вовлеченных в существенные для структурной стабильности белка взаимодействия, не сохраняется. Таким образом, было решено, что все разработанные слитые конструкции будут начинаться с остатка 2121 из Тох А.
Все слитые конструкции будут заканчиваться последним остатком Тох В.
Четыре слитые конструкции (F1-4) были разработаны так, чтобы сохранить всю слитую конструкцию в длинной соленоидподобной структуре между двумя фрагментами слитой конструкции.
Слитые конструкции 1 (F1) и 2 (F2) были разработаны с использованием той же гипотезы. Все белковые последовательности SR Тох А и Тох В сравнивали с использованием программного обеспечения множественного выравнивания (ClustalW - Thompson JD et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 46734680). Наиболее сходными последовательностями были третий SR VIII из Тох А и третий SR II из Тох В и третий SR III из Тох В. Для того чтобы сделать выбор между этими двумя SR из Тох В, было осуществлено моделирование структурной гомологии (с использованием интерфейса SwissModel - Arnold К et al. (2006) Bioinformatics, 22, 195-201) на С-концевой части Тох В с использованием известной трехмерной структуры неполного С-концевого домена Тох А (код в PDB: 2QJ6). Используя третий SR VIII из Тох А, лучшее структурное наложение (выполняли с использованием SwissPDBViewer - Guex N et al. (1997), Electrophoresis 18, 2714-2723) получили с третьим SR II из Тох В. Таким образом, были сконструированы две области соединения: первая находится между третьим SR VIII из Тох А и четвертым SR II из Тох В (F1), а вторая находится между вторым SR VIII из Тох А и третьим SR II из Тох В (F2). Эти области соединения представлены на Фиг. 3 и 4, соответственно.
Для разработки слитой конструкции 3 (F3), общее структурное наложение было выполнено между известной структурой неполного С-концевого домена Тох А и предсказанной структурой С-концевого домена Тох В (с использованием программных обеспечений SwissModel и SwissPDBViewer). Лучшее наложение было обнаружено между LR VII из Тох А и LR II из Тох В. Таким образом, было решено создать область соединения в этом подобном LR. Соединение было выполнено в первую очередь в области, где последовательность является консервативной между Тох А и Тох В, после этого для сохранения в части Тох А слитой конструкции остатки во взаимодействии с предшествующим SR и, наконец, для сохранения в части Тох В остатки во взаимодействии со следующим SR. Эта область соединения показана на Фиг. 5.
Для разработки слитой конструкции 4 (F4) С-концевой домен Тох В
делили на 4 фрагмента и на них выполняли более точное моделирование гомологии (SwissModel). Разбиение было выполнено для того, чтобы сохранить блоки "SR-LR-SR" интактными (каждый домен заканчивается в конце SR, который следует за LR). Было сделано структурное наложение между предсказанными структурами этих фрагментов и известной трехмерной структурой Тох А, и лучшее структурное наложение было получено для третьего SR из Тох В (SR I) и последнего SR из Тох А (третий SR VIII). Таким образом, соединение было сделано между вторым SR VIII из Тох А и третьим SRI из Тох В. Эта конструкция представлена на Фиг. 6.
Последняя слитая конструкция (F5) была разработана для того, чтобы сделать возможным независимый правильный фолдинг двух фрагментов слитой конструкции. Линкер был добавлен между последним остатком белковой последовательности Тох А и началом четвертого SR II из Тох В (всегда принимая во внимание важность интактного блока "SR-LR-SR"). Только один экзогенный остаток (глицин) был добавлен в качестве линкера и расположен между двумя имеющимися глицинами. Таким образом, линкер также может быть описан как состоящий из 3 глицинов, окруженных известным (для Тох А) и предсказанным (для Тох В) бета-тяжем. Эта последняя конструкция показана на Фиг. 7.
Пример 2: Клонирование, экспрессия и очистка слитых белков
Экспрессия плазмиды и рекомбинантного штамма
Гены, кодирующие слитые белки неполных С-концевых доменов Тох А и Тох В (SEQ ID N0:3, 4, 5, 6 и 7) и His-метку, клонировали в экспрессирующий вектор pET24b(+) (Novagen) с использованием сайтов рестрикции Ndel/Xhol с помощью стандартных процедур. Конечная конструкция была создана посредством трансформации штамма Е. coli BLR (DE3) рекомбинантным экспрессирующим вектором согласно стандартному методу с клетками, обработанными СаСЬ (Hanahan D. "Plasmid transformation by Simanis." В Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135).
Штамм-хозяин
BLR(DE3). BLR представляет собой гесА-производное BL21. Штаммы, имеющие обозначение (DE3), являются лизогенными в отношении профага А, который содержит IPTG-индуцибельную Т7 РНК-полимеразу. A-DE3 лизогены предназначены для экспрессии белка с помощью векторов рЕТ. Этот штамм
также является дефектным по протеазам Ion и отрТ.
Генотип: штамм Е. coli BLR::DE3, F" ompT hsdSB^B rnB") 9al dcm (DE3) A(srl-recA)306::Tn70 (TetR)
Экспрессия рекомбинантных белков
Трансформант Е. coli отбирали с чашки с агаровой средой и использовали для инокуляции 200 мл бульона LBT ± 1% (масс/об.) глюкозы + канамицин (50 мкг/мл) для получения O.D. (оптической плотности) при 600 нм от 0,1 до 0,2. Культуры инкубировали в течение ночи при 37°С, при 250 об/мин.
Эту ночную культуру разводили 1:20 в 500 мл среды LBT, содержащей канамицин (50 мкг/мл), и выращивали при 37°С при скорости перемешивания 250 об/мин до тех пор, пока O.D. при 620 нм не достигала 0,5/0,6.
При O.D. при 600 нм около 0,6 культуру охлаждали перед индукцией экспрессии рекомбинантного белка путем добавления 1 мМ изопропил-p-D-l-тиогалактопиранозида (IPTG; EMD Chemicals Inc., номер по каталогу: 5815) и инкубировали в течение ночи при 23°С при 250 об/мин.
После индукции в течение ночи (около 16 часов) O.D.600 нм оценивали после индукции, и культуру центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 минут, и осадок отдельно замораживали при -20°С.
Очистка
Бактериальный осадок ресуспендировали в 20 мМ бициновом буфере (рН 8,0), содержащем 500 мМ NaCI и смесь протеазного ингибитора (Complete, Roche). Бактерии лизировали с использованием системы Френч-пресса с давлением 20000 фунтов на кв. дюйм (примерно 137,9 МПа). Растворимые (супернатант) и нерастворимые (осадок) компоненты разделяли центрифугированием, например при 20000д в течение 30 мин при 4°С.
б-г-Нэ-меченный белок очищали в нативных условиях с помощью IMAC (афинная хроматография с использованием иммобилизованных металлов). Растворимые компоненты загружали на колонку GE (например 15 мл) (загруженную Ni), предварительно уравновешенную тем же буфером, который использовали для ресуспендирования бактерий. После загрузки на колонку, колонку промывали тем же самым буфером. Элюирование проводили с использованием 20 мМ бицинового буфера (рН 8,0), содержащего 500 мМ NaCI и имидазол в различных концентрациях (5-600 мМ). После анализа геля более
чистые фракции отбирали, концентрировали, и загружали для гель-хроматографии для дополнительной стадии очистки.
Фракции, содержащие слитые белки, были выбраны на основе чистоты с помощью SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и подвергнуты диализу против бицинового буфера (20 мМ Бицин, 150 мМ NaCI, с или без 5 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 8,0), концентрацию белка определяли с использованием DC Protein Assay от BioRad. Белки, таким образом, объединяли, стерилизовали фильтрованием через 0,22 мкм фильтр, хранили при -80°С.
Альтернативно, IMAC-очистке предшествовала стадия DEAE-очистки с использованием 2 мМ бицинового буфера (рН 8,0) для загрузки и промывки, и элюировали с использованием градиента с тем же самым буфером, но с добавлением 1М NaCI.
Пример 3 - Клонирование, экспрессия и очистка отдельных фрагментов Тох А и Тох В С. difficile
Экспрессия плазмиды и рекомбинантного штамма
Гены, кодирующие фрагменты белка Тох А и Тох В (SEQ ID N0:8 и SEQ ID N0:9) и His-метку, клонировали в экспрессирующий вектор рЕТ24Ь(+) (Novagen) с использованием сайтов рестрикции Ndel/Xhol с помощью стандартных процедур. Конечная конструкция была создана посредством трансформации штамма Е. coli BLR (DE3) рекомбинантным экспрессирующим вектором согласно стандартному методу с клетками, обработанными СаСЬ (Hanahan D. "Plasmid transformation by Simanis." В Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.).
Штамм-хозяин
BLR(DE3). BLR представляет собой гесА-производное BL21. Штаммы, имеющие обозначение (DE3), являются лизогенными в отношении профага А, который содержит IPTG-индуцибельную Т7 РНК-полимеразу. A-DE3 лизогены предназначены для экспрессии белка с помощью векторов рЕТ. Этот штамм также является дефектным по протеазам Ion и отрТ.
Генотип: штамм Е. coli BLR::DE3, F" ompT hsdSB^B rnB") 9al dcm (DE3) A(srl-recA)306::Tn70 (TetR)
Экспрессия рекомбинантных белков
Трансформант Е coli отбирали с чашки с агаровой средой и
использовали для инокуляции 200 мл бульона LBT ± 1% (масс/об.) глюкозы + канамицин (50 мкг/мл) для получения O.D.6OOHM ОТ 0,1 до 0,2. Культуры инкубировали в течение ночи при 37°С при 250 об/мин.
Эту ночную культуру разводили 1:20 в 500 мл среды LBT, содержащей канамицин (50 мкг/мл), и выращивали при 37°С при скорости перемешивания 250 об/мин до тех пор, пока O.D.620HM не достигала 0,5/0,6.
При O.D.600 нм около 0,6 культуру охлаждали перед индукцией экспрессии рекомбинантного белка посредством добавления 1 мМ изопропил-p-D-l-тиогалактопиранозида (IPTG; EMD Chemicals Inc., номер по каталогу: 5815) и инкубировали в течение ночи при 23°С, при 250 об/мин.
После индукции в течение ночи (около 16 часов) O.D. при 600 нм оценивали после индукции, и культуру центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15 минут, и осадок отдельно замораживали при -20°С.
Очистка:
Бактериальный осадок ресуспендировали в 20 мМ бициновом буфере (рН 8,0), содержащем 500 мМ NaCI и дополненном смесью протеазного ингибитора (Complete без ЭДТА, Roche cat 11873580001) и бензоназы (Roche cat 1.01695.0001). Бактерии лизировали с использованием системы Френч-пресса с давлением 2 X 20000 фунтов на кв. дюйм. Растворимые (супернатант) и нерастворимые (осадок) компоненты разделяли центрифугированием при 34000д или 48000д в течение 25-30 мин при 4°С. Супернатант собирали и фильтровали через 0,22 мкм фильтр.
б-г-Нэ-меченный белок очищали при нативных условиях с помощью IMAC. Растворимые компоненты загружали на колонку GE (например, 15 мл) (загруженную Ni), предварительно уравновешенную тем же буфером, который использовали для ресуспендирования бактерий. После загрузки колонку промывали тем же буфером.
Для Тох А
Элюирование проводили с использованием 20 мМ бицинового буфера (рН 8,0), содержащего 500 мМ NaCI и имидазол в различных концентрациях (5100 мМ). После анализа геля более чистые фракции отбирали, концентрировали, и их загружали для гель-хроматографии (SUPERDEX(tm) 75) для дополнительной стадии очистки в том же буфере без имидазола.
Для Тох В
Вторую промывку выполняли 20 мМ бициновым буфером (рН 8,0), содержащим 500 мМ NaCI и 0,5% дезоксихолата, или тем же буфером с 150 мМ NaCI. Элюирование проводили с использованием 20 мМ бицинового буфера (рН 8,0), содержащего 500 мМ NaCI и имидазол в различных концентрациях (10500 мМ). После анализа геля более чистые фракции отбирали, дополняли 5 мМ ЭДТА и загружали для гель-хроматографии (SUPERDEX(tm) 200) для дополнительной стадии очистки в том же буфере с 5 мМ ЭДТА.
Фракции, содержащие фрагменты Тох А или Тох В, были выбраны на основе чистоты с помощью SDS-PAGE и подвергнуты диализу против бицинового буфера (20 мМ Бицин, 150 мМ NaCI, рН 8,0), концентрацию белка определяли с использованием RCDC Protein Assay от BioRad. Белки, таким образом, объединяли, стерилизовали фильтрованием через 0,22 мкм фильтр, хранили при -80°С.
Пример 4 - Оценка молекулярной массы пяти слитых конструкций Тох А-Тох В С. difficile
Аналитическое ультрацентрифугирование использовали для определения гомогенности и распределения по размеру в растворе различных частиц в образце белка посредством измерения скорости, с которой молекулы движутся в ответ на центробежную силу. Это основано на вычислении коэффициентов седиментации различных частиц, получаемых в эксперименте скоростной седиментации, которые зависят от их молекулярной формы и массы.
1. Образцы белка центрифугировали в аналитической ультрацентрифуге Beckman-Coulter Р ROTE ОМЕ LAB(tm) XL-1 при 42000 об/мин после установления температуры ротора AN-60Ti 15°С.
а) Слитый белок F1, 500 мкг/мл, 20 мМ Бицина, 150 мМ NaCI, рН 8,0;
б) слитый белок F2, 500мкг/мл, 20 мМ Бицина, 150 мМ NaCI, рН 8,0;
в) слитый белок F3, 500мкг/мл, 20 мМ Бицина, 150 мМ NaCI, рН 8,0;
г) слитый белок F4, 500мкг/мл, 20 мМ Бицина, 150 мМ NaCI, рН 8,0;
д) слитый белок F5, 500мкг/мл, 20 мМ Бицина, 150 мМ NaCI, рН 8,0.
2. Для сбора данных записывали 160 изображений при 280 нм каждые 5
минут.
3. Анализ данных выполняли с использованием программы SEDFIT для
определения распределения C(S). Определение парциального удельного
объема белков проводили с помощью программного обеспечения SEDNTERP
на основании их аминокислотной последовательности. SEDNTERP был также
использован для определения вязкости и плотности буфера.
4. Молекулярную массу различных частиц определяли из графика
распределения C(S) (концентрация в зависимости от коэффициента
седиментации), учитывая, что это лучше представляет исходные данные, чем
распределение С(М) (концентрация в зависимости от молекулярной массы) для
характеристики распределения по размерам в смеси.
На Фиг. 8 описано распределение слитых конструкций Тох А-Тох В, определенное скоростной седиментацией при аналитическом ультрацентрифугировании.
Молекулярная масса основных частиц, определенных из распределения C(S) всех пяти слитых белков Тох А-Тох В соответствует их мономерной форме. Все наилучшие фрикционные отношения, определенные для пяти слитых конструкций, находятся в диапазоне от 2 до 2,2. Это может указывать на то, что белки присутствуют в растворе в удлиненной форме, которая соответствовала бы структуре белка.
Пример 5 - оценка вторичной и третичной структур слитых конструкций Тох А-Тох В С. difficile с помощью кругового дихроизма и флуоресцентной спектроскопии
Круговой дихроизм используют для определения вторичной структуры в композиции белка путем измерения разности в поглощении левостороннего поляризованного света по сравнению с правосторонним поляризованным светом, которая обусловлена структурной ассиметрией. Форма и величина спектров КД в области дальнего УФ (190-250 нм) отличаются, если белок демонстрирует бета-складчатую, альфа-спиральную или случайную клубковую структуру. Относительное содержание каждого типа вторичной структуры в данном образце белка может быть рассчитано путем сравнения с эталонными спектрами.
Третичную структуру образца белка можно оценить путем определения иммобилизации ароматических аминокислот. Наблюдение сигнала КД в
области ближнего УФ (250-50 нм) может быть связано с поляризацией остатков фенилаланина, тирозина и триптофана и является хорошим показателем того, что белок укладывается в четко определенную структуру. Был использован следующий протокол.
1. Спектры в дальней области УФ измеряют с использованием оптической длины пути 0,01 см от 178 до 250 нм с разрешающей способностью и шириной полосы пропускания 1 нм на спектрополяриметре Jasco J-720. Температуру ячейки поддерживают при 23°С термостатированным с помощью элементов Пельтье блоком ячеек RTE-111. Во время измерения поддерживают скорость потока азота 10 л/мин.
2. Спектры в ближней области УФ измеряют с использованием оптической длины пути 0,01 см от 250 до 300 нм с разрешающей способностью и шириной полосы пропускания 1 нм на Jasco J-720 спектрополяриметре. Температуру ячейки поддерживают при 23°С термостатированным с помощью элементов Пельтье блоком ячеек RTE-111. Во время измерения поддерживают скорость потока азота 10 л/мин.
Изучение спектров в дальней области УФ (Фиг. 9) для всех пяти слитых белков Тох А-Тох В свидетельствует о незначительном содержании альфа-спиральных структур и высоком содержании бета-складчатых структур. Кроме того, все белки демонстрировали максимум при 230 нм, что является необычным для растворимых глобулярных белков. Эта особенность хорошо охарактеризована в литературе и связана с небольшой группой белков, известных отсутствием альфа-спирали и высоким содержанием бета-складчатой структуры и ароматических аминокислот (Zsila, Analytical Biochemistry,391(2009) 154-156). Эти особенности согласуются со структурой, предполагаемой для слитых белков Тох А-Тох В. Сравнивали кристаллические структуры 13 белков, демонстрирующих характеристические спектры КД с положительным сигналом при 230 нм (Protein Data Bank). Среднее содержание вторичной структуры этих белков составляет 42%±9% бета-складок и 7%±6% альфа-спиралей. Это убедительно показывает, что спектральная сигнатура слитых белков Тох А-Тох В соответствует белку, содержащему в большом количестве бета-складчки и в небольшом количестве альфа-спирали.
Изучение формы спектров в ближней области УФ (Фиг. 10) для всех пяти слитых белков указывает на то, что по меньшей мере некоторые из
ароматических аминокислот иммобилизованы, что является ярким свидетельством компактной и специфической третичной структуры. Кроме того, обработка белка денатурирующей концентрацией мочевины вызывала исчезновение сигнала в ближней области УФ, что является дополнительным свидетельством того, что этот характеристический спектр обусловлен фолдингом белка.
Пример 6 - Иммунизация мышей фрагментами Тох А или Тох В и слитыми конструкциями Тох А-Тох В
Мыши Balb/C были иммунизированы конструкциями, описанными в примерах 2 и 3.
Иммунизация мышей
Группы из 15 мышей-самок Balb/c иммунизировали IM на 0-е, 14-е и 28-е сутки 3 мкг или 10 мкг отдельных фрагментов Тох А и Тох В (см. пример 2), а также слитыми белками Тох А-Тох В (см. пример 3) с адъювантом AS03B. Контрольную группу из 10 мышей вакцинировали одним AS03B.
ELISA-титры против Тох А и против Тох В определяли в индивидуальных сыворотках, собранных на 42-е сутки (post III (после трех иммунизаций)).
Титры ингибирования гемагглютинации определяли в объединенной Post III сыворотке.
ELISA-ответ против Тох А и против Тох В: протокол
Образцами фрагментов Тох А или Тох В в концентрации 1 мкг/мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) покрывали микротитрационные планшеты высокого связывания (Nunc MAXISORP(tm)) в течение ночи при 4° С. Планшеты блокировали 1% PBS-BSA (бычий сывороточный альбумин) в течение 30 мин при комнатной температуре при перемешивании. Мышиные антисыворотки предварительно разводили в соотношении 1/500 в 0,2% PBS-BSA с 0,05% TWEEN(tm) и затем дополнительно приготавливали двукратные разведения в микропланшетах и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин при перемешивании. После промывки связавшиеся мышиные антитела детектировали с использованием конъюгированного с пероксидазой козьего IgG против мышиных антител affiniPure (H+L) от Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115-035-003) в разведении 1:5000 в 0,2% PBS-BSA с 0,05% Tween. Детектируемые антитела инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре при
перемешивании. Для развития окраски использовали 4 мг О-фенилендиамина (OPD) + 5 мкл Н2О2 на 10 мл 0,1 М цитратного буфера с рН 4,5 в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали 50 мкл HCI и оптическую плотность (OD) определяли при 490 нм относительно 620 нм.
Уровень антител против Тох А или против Тох В, присутствующих в образцах сыворотки, выражали в виде средних точек титрования. GMT (средние геометрические титры) рассчитывали для 15 образцов в каждой группе обработки (10 для контрольной группы).
Анализ ингибирования гемагглютинации: протокол
Серийные двукратные разведения образцов мышиной объединенной антисыворотки (25 мкл) выполняли в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в 96-луночных микропланшетах с U-образным дном.
Затем добавляли 25 мкл нативного токсина А (0,2 мкг/лунка) и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут.
После инкубации 50 мкл очищенных кроличьих эритроцитов, разбавленных до 2%, добавляли в каждую лунку. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 2 часов.
Планшеты анализировали визуально, при этом гемагглютинация была представлена в виде диффузных красных клеток в лунке, а ингибирование гемагглютинации наблюдали в виде красной точки, образованной в лунке.
Титры ингибирования определяли в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, ингибирующего гемагглютинацию.
Анализ цитотоксичности
Фибробластные клетки IMR90 культивировали при 37°С с 5% СО2, в ЕМЕМ (минимальная среда Игла) + 10% фетальной бычьей сыворотки + 1% глутамина + 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин-амфотерицин) и высевали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей при плотности 5x104 клеток/лунка.
Через 24 ч клеточную среду удаляли из лунок.
Серийное двукратное разведение мышиной объединенной антисыворотки (50 мкл) производили в клеточной среде.
Затем добавляли 50 мкл нативного токсина В (0,5 нг/мл) и планшеты инкубировали при 37°С с 5% СО2 в течение 24 часов.
Через 24 часа анализировали клетки и определяли долю округлившихся клеток.
Титры ингибирования определяли в виде обратной величины наибольшего разведения сыворотки, ингибирующего 50% клеточного округления.
Результаты
Результаты Elisa с использованием антител Тох А описаны на Фиг. 11. Антитела против Тох А были индуцированы после иммунизации одним Тох А, а также каждой из 5 слитых конструкций.
Функциональные свойства этих антител тестировали в анализе гемагглютинации. Этот анализ можно использовать только для оценки Тох А, так как в случае Тох В не наблюдали гемагглютинации.
Титры ингибирования гемагглютинации описаны на Фиг. 12. Ингибирование гемагглютинации наблюдали в сыворотке против фрагмента Тох А или сыворотке, направленной против каждой из слитых конструкций Тох А-Тох В.
Также выполняли ELISA с использованием антител против Тох В; результаты представлены на Фиг. 13. Антитела против Тох В были индуцированы после иммунизации одним фрагментом Тох В, а также слитыми конструкциями F2, F3 и F4.
Титры ингибирования цитотоксичности описаны на Фиг. 14. Титры ингибирования, полученные с использованием образцов сыворотки из мышей, иммунизированных фрагментом Тох В или слитыми конструкциями Тох А-Тох В, были выше, чем полученные с использованием контрольных образцов сыворотки.
Пример 7 - Конструирование, клонирование, экспрессия и очистка 4 дополнительных слитых белков
Четыре дополнительных слитых белка были разработаны с использованием принципов конструирования, описанных в примере 1, они были названы F54Gly (SEQ ID N0:21), F54New (SEQ ID N0:23), F5ToxB (SEQ ID N0:25) и F52New (SEQ ID N0:27).
Эти слитые белки экспрессировали согласно процедуре, описанной в примере 2.
Пример 8 - Оценка молекулярной массы слитых конструкций Тох А-
Тох В С. difficile, описанных в SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 и SEQ ID N0:27
Молекулярную массу слитых конструкций, описанных в SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 и SEQ ID N0:27, определяли, как описано в примере 4.
На Фиг. 15 описано распределение этих четырех дополнительных слитых белков, определенное скоростной седиментации при аналитическом ультрацентрифугировании.
Молекулярная масса основных частиц, определенных из распределения C(S) всех четырех слитых белков, описанных в SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 и SEQ ID N0:27, соответствует их мономерной форме, и все белки демонстрируют седиментационные свойства, подобные слитым конструкциям F1-F5.
Пример 9 - оценка вторичной и третичной структур слитых конструкций Тох А-Тох В С. difficile, описанных в SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 и SEQ ID N0:27
Вторичную и третичную структуры слитых конструкций, описанных в SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 и SEQ ID N0:27, оценивали в соответствии со способом, описанным в примере 5. КД в дальней УФ области для этих слитых белков можно найти на Фиг. 16, а спектры в ближней УФ области для этих слитых конструкций можно найти на Фиг. 17.
Анализ спектров КД в ближней и дальней УФ области белков, описанных в SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 и SEQ ID N0:27, показывает, что все четыре имеют такую же высокую бета-складчатую структуру, что и слитые конструкции F1-F5. Кроме того, изучение спектров в ближней УФ области не показало существенных различий в положении ароматических аминокислот в третичной структуре по сравнению со слитыми конструкциями F1-F5.
Пример 10 - Иммунизация мышей слитыми конструкциями Тох А-
Тох В
Мыши Balb/c были иммунизированы четырьмя слитыми белковыми конструкциями F54Gly (SEQ ID N0:21), F54New (SEQ ID N0:23), F5ToxB (SEQ ID N0:25) и F52New (SEQ ID N0:27), как описано в примере 6.
ELISA выполняли с использованием ELISA-ответа против Тох А и против
Тох В: протокол описан в примере 6, за исключением того, что в данном случае микропланшеты высокого связывания покрывали образцами фрагментов Тох А или Тох В в забуференном фосфатом физиологическом растворе в концентрации 2 мкг/мл. Анализ ингибирования гемагглютинации выполняли, как описано в примере 6. Анализ цитотоксичности Тох В выполняли, как описано в примере 6. Дополнительный анализ цитотоксичности Тох А выполняли, как описано ниже.
Анализ цитотоксичности Тох А
Клетки НТ29 культивировали при 37°С с 5% С02 в DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) + 10% фетальной бычьей сыворотки + 1% глутамина + 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин-амфотерицин) и высевали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей при плотности 5x104 клеток/лунка.
Через 24 ч клеточную среду удаляли из лунок.
Серийное двукратное разведение мышиной объединенной антисыворотки (50 мкл) производили в клеточной среде.
Затем добавляли 50 мкл нативного токсина В (0,15 нг/мл) и планшеты инкубировали при 37°С с 5% СОг в течение 48 часов.
Через 24 часа анализировали клетки и определяли долю округлившихся клеток.
Результаты анти-Тох A ELISA, анти-Тох В Elisa, ингибирования гемагглютинации и анализы цитотоксичности описаны на Фиг. 18, 19, 20, 21 и 22, соответственно.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полипептид, содержащий первый фрагмент и второй фрагмент, где
(1) первый фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина А;
(2) второй фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина В;
(3) первый фрагмент имеет первый проксимальный конец;
(4) второй фрагмент имеет второй проксимальный конец; и
где первый фрагмент и второй фрагмент примыкают друг к другу, и где полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют токсин А или токсин В или и тот и другой.
2. Полипептид по п. 1, вызывающий защитный иммунный ответ у млекопитающего-хозяина против штаммов С. difficile.
3. Полипептид по любому из пп. 1-2, где первый фрагмент и/или второй фрагмент содержат меньше чем 25%, 20%, 18% или 15% альфа-спиральной структуры.
4. Полипептид по любому из пп. 1-3, где первый фрагмент и/или второй фрагмент содержат больше чем 25%, 30%, 35%, 38% или 40% бета-складчатой структуры.
5. Полипептид по любому из пп. 1-4, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора.
6. Полипептид по любому из пп. 1-5, где второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора.
7. Полипептид по любому из пп. 1-6, где первый проксимальный конец не разрывает участок короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор.
8. Полипептид по любому из пп. 1-7, где второй проксимальный конец не разрывает участок короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор.
9. Полипептид по любому из пп. 1-8, где первый проксимальный конец и второй проксимальный конец не разрывают участки короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор.
10. Полипептид по любому из пп. 1-9, где первый проксимальный конец
не находится в пределах аминокислот 1878-1940, 2012-2074, 2146-2208, 2258-
2322, 2394-2456, 2507-2569 или 2598-2660 токсина А.
11. Полипептид по любому из пп. 1-10, где второй проксимальный конец не находится в пределах аминокислот 1881-1942, 2012-2074, 2144-2208 или 2278-2339 токсина В.
12. Полипептид по любому из пп. 1-11, где первый фрагмент содержит по меньшей мере 100, 250, 400 или 450 аминокислот.
13. Полипептид по любому из пп. 1-12, где второй фрагмент содержит по меньшей мере 100, 200, 300 или 400 аминокислот.
14. Полипептид по любому из пп. 1-13, где первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2645-2710) токсина А.
15. Полипептид по любому из пп. 1-14, где первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2700-2710 или 2680-2690 токсина А.
16. Полипептид по любому из пп. 1-15, где второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 1834-1926) токсина В.
17. Полипептид по любому из пп. 1-16, где второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1860-1878, 1854-1876.
18. Полипептид по любому из пп. 1-15, где второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка II (аминокислоты 1927-2057) токсина В.
19. Полипептид по любому из пп. 1-15 или 18, где второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1960-1970, 1988-1998 или 1867-1877 токсина В.
20. Полипептид по любому из пп. 1-13 или 16-19, где первый фрагмент состоит из полного повторяющегося домена токсина А (аминокислоты 18322710).
21. Полипептид по любому из пп. 1-15 или 20, где второй фрагмент состоит из полного повторяющегося домена токсина В (аминокислоты 18332366).
22. Полипептид по любому из пп. 14, 15, 16 или 17, где первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2645-2710) токсина А и где второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 1834-1926) токсина В.
11.
23. Полипептид по любому из пп. 14, 15, 18 или 19, где первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2645-2710) токсина А и где второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка II (аминокислоты 1927-2057) токсина В.
24. Полипептид по любому из пп. 14, 15, 18 или 19, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710) и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 4 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1988-2007).
25. Полипептид по любому из пп. 14, 15, 18 или 19, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2665-2686) токсина А и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1968-1987).
26. Полипептид по любому из пп. 14, 15, 16 или 17, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2665-2686) и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка I токсина В (1877-1896).
27. Полипептид по любому из пп. 1-13, 14, 15, 16, 17 или 22, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2645-2686) и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 1 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1834-1854).
28. Полипептид по любому из пп. 14, 15, 18 или 19, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710) и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 4 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1988-2007).
29. Полипептид по п. 23, где первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2700-2710 токсина А и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1960-1970 токсина В.
30. Полипептид по п. 23, где первый проксимальный конец находится в
пределах аминокислот 2680-2690 токсина А и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1960-1970 токсина В.
31. Полипептид по п. 23, где первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2700-2710 токсина А и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1988-1998 токсина В.
32. Полипептид по п. 23, где первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2680-2690 и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1860-1878.
33. Полипептид по любому из пп. 1-32, дополнительно содержащий линкер.
34. Полипептид по п. 33, где линкер содержит 1-19 аминокислот.
35. Полипептид по любому из пп. 33-34, где линкер представляет собой глициновый линкер.
36. Полипептид по любому из пп. 33-35, где линкер находится между проксимальным концом первого фрагмента и проксимальным концом второго фрагмента.
37. Полипептид по любому из пп. 1-36, представляющий собой часть более крупного слитого белка.
38. Полипептид по любому из пп. 1-37, содержащий иммуногенный фрагмент из SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 или SEQ ID N0:27.
39. Полипептид по любому из пп. 1-38, содержащий иммуногенный фрагмент из по меньшей мере 500, 600, 700, 750, 800, 850 или 900 аминокислот из SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 или SEQ ID N0:27.
40. Полипептид по любому из пп. 1-39, содержащий вариант из SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 или SEQ ID N0:27.
41. Полипептид по любому из пп. 1-40, содержащий больше чем 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825 или 850 аминокислот из токсина А.
42. Полипептид по любому из пп. 1-41, содержащий меньше чем 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625 или 600 аминокислот из токсина А.
43. Полипептид по любому из пп. 1-42, содержащий больше чем 350, 375,
31.
400, 425, 450, 475, 500 или 525 аминокислот из токсина В.
44. Полипептид по любому из пп. 1-43, содержащий меньше чем 525, 500, 475 или 450 аминокислот из токсина В.
45. Полипептид, содержащий:
(1) SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33 или SEQ ID N0:34 или SEQ ID N0:35;
(2) вариант, имеющий по меньшей мере 90%-ное, 95%-ное, 98%-ное, 99%-ное или 100%-ное сходство с SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33 или SEQ ID N0:34 или SEQ ID N0:35; или
(3) фрагмент из по меньшей мере 250, 280, 300, 350, 380, 400, 430, 450, 480, 500, 530, 550, 580 или 600 аминокислот из SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33 или SEQ ID N0:34 или SEQ ID N0:35.
46. Полипептид по n. 45, содержащий больше чем 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825 или 850 аминокислот из токсина А.
47. Полипептид по п. 45 или 46, содержащий меньше чем 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625 или 600 аминокислот из токсина А.
48. Полипептид по любому из пп. 45-47, содержащий больше чем 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 или 525 аминокислот из токсина В.
49. Полипептид по любому из пп. 45-48, содержащий меньше чем 525, 500, 475 или 450 аминокислот из токсина В.
50. Полипептид по любому из пп. 45-49, вызывающий образование антител, которые нейтрализуют токсин А или токсин В или и тот и другой.
51. Полипептид по любому из пп. 45-50, вызывающий защитный иммунный ответ у млекопитающего-хозяина против штаммов С. difficile.
52. Полипептид по любому из пп. 45-51, содержащий меньше чем 25%, 20%, 18% или 15% альфа-спиральной структуры.
46.
53. Полипептид по любому из пп. 45-52, содержащий больше чем 25%, 30%, 35%, 38% или 40% бета-складчатой структуры.
54. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-53.
55. Вектор, содержащий полинуклеотид по п. 54, связанный с индуцибельным промотором.
56. Вектор по п. 47, где индуцибельный промотор активируется добавлением достаточного количества IPTG (изопропил-p-D-l-тиогалактопиранозид).
57. Клетка-хозяин, содержащая вектор по пп. 54 или 55 или полинуклеотид по п. 46.
58. Клетка-хозяин по п. 57, представляющая собой грамотрицательную бактерию.
59. Клетка-хозяин по п. 57, представляющая собой Е. coli.
60. Иммуногенная композиция, содержащая полипептид по любому из пп. 1-45 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
61. Иммуногенная композиция по п. 60, дополнительно содержащая адъювант.
62. Иммуногенная композиция по любому из пп. 60-61, дополнительно содержащая дополнительные антигены.
63. Иммуногенная композиция по п. 62, где дополнительные антигены представляют собой антигены, имеющие происхождение из бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. pneumoniae, Н. influenzae, N. meningitidis, Е. coli, М. cattarhalis, возбудителей столбняка, дифтерии, коклюша, S. epidermidis, энтерококков и S. aureus.
64. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по любому из пп. 60-63.
65. Применение иммуногенной композиции по любому из пп. 60-63 или вакцины по п. 64 в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого С. difficile.
66. Иммуногенная композиция по любому из пп. 60-63 или вакцина по п. 64 для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого С. difficile.
67. Применение иммуногенной композиции по любому из пп. 60-63 или вакцины по п. 64 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения
46.
или лечения заболевания, вызываемого С. difficile.
Способ предупреждения или лечения заболевания, вызываемого С. difficile, включающий введение пациенту иммуногенной композиции по пп. 60-63 или вакцины по п. 64.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ с изменениями, внесенными в соответствии со статьей 34(2)(Ь) РСТ
1. Полипептид, содержащий первый фрагмент и второй фрагмент, где
(1) первый фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина А;
(2) второй фрагмент представляет собой фрагмент повторяющегося домена токсина В;
(3) первый фрагмент имеет первый проксимальный конец;
(4) второй фрагмент имеет второй проксимальный конец; и
где первый фрагмент и второй фрагмент разделены меньше чем или ровно 5 аминокислотами в первичной структуре, где полипептид вызывает образование антител, которые нейтрализуют как токсин А, так и токсин В, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора, второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора и первый проксимальный конец и второй проксимальный конец не разрывают участки короткий повтор-длинный повтор-короткий повтор.
2. Полипептид по п. 1, вызывающий защитный иммунный ответ у млекопитающего-хозяина против штаммов С. difficile.
3. Полипептид по любому из пп. 1-2, где первый фрагмент и/или второй фрагмент содержат меньше чем 25%, 20%, 18% или 15% альфа-спиральной структуры.
4. Полипептид по любому из пп. 1-3, где первый фрагмент и/или второй фрагмент содержат больше чем 25%, 30%, 35%, 38% или 40% бета-складчатой структуры.
5. Полипептид по любому из пп. 1-4, где первый проксимальный конец не находится в пределах аминокислот 1878-1940, 2012-2074, 2146-2208, 22582322, 2394-2456, 2507-2569 или 2598-2660 токсина А.
6. Полипептид по любому из пп. 1-5, где второй проксимальный конец не находится в пределах аминокислот 1881-1942, 2012-2074, 2144-2208 или 22782339 токсина В.
7. Полипептид по любому из пп. 1-6, где первый фрагмент содержит по меньшей мере 100, 250, 400 или 450 аминокислот.
8. Полипептид по любому из пп. 1-7, где второй фрагмент содержит по
меньшей мере 100, 200, 300 или 400 аминокислот.
9. Полипептид по любому из пп. 1-6, где первый проксимальный конец
находится в пределах повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2645-2710)
токсина А.
10. Полипептид по любому из пп. 1-9, где первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2700-2710 или 2680-2690 токсина А.
11. Полипептид по любому из пп. 1-10, где второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 1834-1926) токсина В.
12. Полипептид по любому из пп. 1-11, где второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1860-1878, 1854-1876.
13. Полипептид по любому из пп. 1-10, где второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка II (аминокислоты 1927-2057) токсина В.
14. Полипептид по любому из пп. 1-10 или 13, где второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1960-1970, 1988-1998 или 1867-1877 токсина В.
15. Полипептид по любому из пп. 9, 10, 11 или 12, где первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2645-2710) токсина А и где второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка I (аминокислоты 1834-1926) токсина В.
16. Полипептид по любому из пп. 9, 10, 13 или 14, где первый проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2645-2710) токсина А и где второй проксимальный конец находится в пределах повторяющегося участка II (аминокислоты 1927-2057) токсина В.
17. Полипептид по любому из пп. 9, 10, 13 или 14, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710) и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 4 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1988-2007).
18. Полипептид по любому из пп. 9, 10, 13 или 14, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2
10.
3 Формула изобретения с изменениями, внесенными в соответствии со статьей 34(2)(Ь) РСТ
повторяющегося участка VIII (аминокислоты 2665-2686) токсина А и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1968-1987).
19. Полипептид по любому из пп. 9, 10, 11 или 12, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 2 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2665-2686) и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка I токсина В (1877-1896).
20. Полипептид по любому из пп. 1-8, 9, 10, 11, 12 или 15, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2645-2686) и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 1 повторяющегося участка I токсина В (аминокислоты 1834-1854).
21. Полипептид по любому из пп. 9, 10, 13 или 14, где первый проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 3 повторяющегося участка VIII токсина А (аминокислоты 2687-2710) и второй проксимальный конец находится в пределах короткого повтора 4 повторяющегося участка II токсина В (аминокислоты 1988-2007).
22. Полипептид по п. 16, где первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2700-2710 токсина А и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1960-1970 токсина В.
23. Полипептид по п. 16, где первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2680-2690 токсина А и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1960-1970 токсина В.
24. Полипептид по п. 16, где первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2700-2710 токсина А и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1988-1998 токсина В.
25. Полипептид по п. 16, где первый проксимальный конец находится в пределах аминокислот 2680-2690 и второй проксимальный конец находится в пределах аминокислот 1860-1878.
26. Полипептид по любому из пп. 1-25, представляющий собой часть более крупного слитого белка.
27. Полипептид по любому из пп. 1-26, содержащий иммуногенный фрагмент из SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID
19.
N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 или SEQ ID N0:27.
28. Полипептид по любому из пп. 1-27, содержащий иммуногенный фрагмент из по меньшей мере 500, 600, 700, 750, 800, 850 или 900 аминокислот из SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:25 или SEQ ID N0:27.
29. Полипептид по любому из пп. 1-28, содержащий больше чем 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825 или 850 аминокислот из токсина А.
30. Полипептид по любому из пп. 1-29, содержащий меньше чем 850, 825, 800, 775, 750, 725, 700, 675, 650, 625 или 600 аминокислот из токсина А.
31. Полипептид по любому из пп. 1-30, содержащий больше чем 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 или 525 аминокислот из токсина В.
32. Полипептид по любому из пп. 1-31, содержащий меньше чем 525, 500, 475 или 450 аминокислот из токсина В.
33. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-32.
34. Вектор, содержащий полинуклеотид по п. 33, связанный с индуцибельным промотором.
35. Иммуногенная композиция, содержащая полипептид по любому из пп. 1-32 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
36. Иммуногенная композиция по п. 35, дополнительно содержащая адъювант.
37. Иммуногенная композиция по любому из пп. 35-36, дополнительно содержащая дополнительные антигены.
38. Иммуногенная композиция по п. 37, где дополнительные антигены представляют собой антигены, имеющие происхождение из бактерии, выбранной из группы, состоящей из S. pneumoniae, Н. influenzae, N. meningitidis, Е. coli, М. cattarhalis, возбудителей столбняка, дифтерии, коклюша, S. epidermidis, энтерококков и S. aureus.
39. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по любому из пп. 35-38.
40. Применение иммуногенной композиции по любому из пп. 35-38 или вакцины по п. 39 в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого С. difficile.
41. Иммуногенная композиция по любому из пп. 35-38 или вакцина по
п. 39 для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого С. difficile.
42. Применение иммуногенной композиции по любому из пп. 35-38 или вакцины по п. 39 в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения заболевания, вызываемого С. difficile.
SEQ ID N0:1 - последовательность токсина А
MSLISKEELIKLAYSIRPRENEYKTILTNLDEYNKLTTNNNENKYLQLKKLNESIDVFMN KYKTSSRNRALSNLKKDILKEVILIKNSNTSPVEKNLHFVWIGGEVSDIALEYIKQWADI NAEYNIKLWYDSEAFLWTLKKAIVESSTTEALQLLEEEIQNPQFDNMKFYKKRMEFIYD RQKRFINYYKSQINKPTVPTIDDIIKSHLVSEYNRDETVLESYRTNSLRKINSNHGIDIR ANSLFTEQELLNIYSQELLNRGNLAAASDIVRLLALKNFGGVYLDVDMLPGIHSDLFKTI SRPSSIGLDRWEMIKLEAIMKYKKYINNYTSENFDKLDQQLKDNFKLIIESKSEKSEIFS KLENLNVSDLEIKIAFALGSVINQALISKQGSYLTNLVIEQVKNRYQFLNQHLNPAIESD NNFTDTTKIFHDSLFNSATAENSMFLTKIAPYLQVGFMPEARSTISLSGPGAYASAYYDF INLQENTIEKTLKASDLIEFKFPENNLSQLTEQEINSLWSFDQASAKYQFEKYVRDYTGG SLSEDNGVDFNKNTALDKNYLLNNKIPSNNVEEAGSKNYVHYIIQLQGDDISYEATCNLF SKNPKNSIIIQRNMNESAKSYFLSDDGESILELNKYRIPERLKNKEKVKVTFIGHGKDEF NTSEFARLSVDSLSNEISSFLDTIKLDISPKNVEWLLGCNMFSYDFNVEETYPGKLLLS IMDKITSTLPDWKNSITIGANQYEVRINSEGRKELLAHSGKWINKEEAIMSDLSSKEYI FFDSIDNKLKAKSKNIPGLASISEDIKTLLLDASVSPDTKFILNNLKLNIESSIGDYIYY EKLEPVKNIIHNSIDDLIDEFNLLENVSDELYELKKLNNLDEKYLISFEDISKNNSTYSV RFINKSNGESVYVETEKEIFSKYSEHITKEISTIKNSIITDWGNLLDNIQLDHTSQWT LNAAFFIQSLIDYSSNKDVLNDLSTSVKVQLYAQLFSTGLNTIYDSIQLWLISNAWDT INVLPTITEGIPIVSTILDGINLGAAIKELLDEHDPLLKKELEAKVGVLAINMSLSIAAT VASIVGIGAEVTIFLLPIAGISAGIPSLWNELILHDKATSVWYFNHLSESKKYGPLKT EDDKILVPIDDLVISEIDFNNNSIKLGTCNILAMEGGSGHTVTGNIDHFFSSPSISSHIP SLSIYSAIGIETENLDFSKKIMMLPNAPSRVFWWETGAVPGLRSLENDGTRLLDSIRDLY PGKFYWRFYAFFDYAITTLKPVYEDTNIKIKLDKDTRNFIMPTITTNEIRNKLSYSFDGA GGTYSLLLSSYPISTNINLSKDDLWIFNIDNEVREISIENGTIKKGKLIKDVLSKIDINK NKLIIGNQTIDFSGDIDNKDRYIFLTCELDDKISLIIEINLVAKSYSLLLSGDKNYLISN LSNTIEKINTLGLDSKNIAYNYTDESNNKYFGAISKTSQKSIIHYKKDSKNILEFYNDST LEFNSKDFIAEDINVFMKDDINTITGKYYVDNNTDKSIDFSISLVSKNQVKWGLYLNES VYSSYLDFVKNSDGHHNTSNFMNLFLDNISFWKLFGFENINFVIDKYFTLVGKTNLGYVE FICDNNKNIDIYFGEWKTSSSKSTIFSGNGRNVWEPIYNPDTGEDISTSLDFSYEPLYG IDRYINKVLIAPDLYTSLININTNYYSNEYYPEIIVLNPNTFHKKVNINLDSSSFEYKWS TEGSDFILVRYLEESNKKILQKIRIKGILSNTQSFNKMSIDFKDIKKLSLGYIMSNFKSF NSENELDRDHLGFKIIDNKTYYYDEDSKLVKGLININNSLFYFDPIEFNLVTGWQTINGK KYYFDINTGAALTSYKIINGKHFYFNNDGVMQLGVFKGPDGFEYFAPANTQNNNIEGQAI VYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGWRIINNEKYYFNPNNAIAAVGLQVIDNNKYYFNPD TAIISKGWQTWGSRYYFDTDTAIAFNGYKTIDGKHFYFDSDCWKIGVFSTSNGFEYFA PANTYNNNIEGQAIVYQSKFLTLNGKKYYFDNNSKAVTGLQTIDSKKYYFNTNTAEAATG WQTIDGKKYYFNTNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQ IGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNK KYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVFKG PNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNL NTAEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFY FNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVT GLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIM QIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDG NRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAI RYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGV DGVKAPGIYG
SEQ ID N0:2 - последовательность токсина В
MSLWRKQLEKMANVRFRTQEDEYVAILDALEEYHNMSENTWEKYLKLKDINSLTDIYI DTYKKSGRNKALKKFKEYLVTEVLELKNNNLTPVEKNLHFVWIGGQINDTAINYINQWKD WSDYNWVFYDSNAFLINTLKKTWESAINDTLESFRENLNDPRFDYNKFFRKRMEIIY DKQKNFINYYKAQREENPELIIDDIVKTYLSNEYSKEIDELNTYIEESLNKITQNSGNDV RNFEEFKNGESFNLYEQELVERWNLAAASDILRISALKEIGGMYLDVDMLPGIQPDLFES IEKPSSVTVDFWEMTKLEAIMKYKEYIPEYTSEHFDMLDEEVQSSFESVLASKSDKSEIF SSLGDMEASPLEVKIAFNSKGIINQGLISVKDSYCSNLIVKQIENRYKILNNSLNPAISE
DNDFNTTTNTFIDSIMAEANADNGRFMMELGKYLRVGFFPDVKTTINLSGPEAYAAAYQD LLMFKEGSMNIHLIEADLRNFEISKTNISQSTEQEMASLWSFDDARAKAQFEEYKRNYFE GSLGEDDNLDFSQNIWDKEYLLEKISSLARSSERGYIHYIVQLQGDKISYEAACNLFAK TPYDSVLFQKNIEDSEIAYYYNPGDGEIQEIDKYKIPSIISDRPKIKLTFIGHGKDEFNT DIFAGFDVDSLSTEIEAAIDLAKEDISPKSIEINLLGCNMFSYSINVEETYPGKLLLKVK DKISELMPSISQDSIIVSANQYEVRINSEGRRELLDHSGEWINKEESIIKDISSKEYISF NPKENKITVKSKNLPELSTLLQEIRNNSNSSDIELEEKVMLTECEINVISNIDTQIVEER IEEAKNLTSDSINYIKDEFKLIESISDALCDLKQQNELEDSHFISFEDISETDEGFSIRF INKETGESIFVETEKTIFSEYANHITEEISKIKGTIFDTWGKLVKKWLDTTHEWTLN AAFFIQSLIEYNSSKESLSNLSVAMKVQVYAQLFSTGLNTITDAAKWELVSTALDETID LLPTLSEGLPIIATIIDGVSLGAAIKELSETSDPLLRQEIEAKIGIMAWLTTATTAIIT SSLGIASGFSILLVPLAGISAGIPSLWNELVLRDKATKWDYFKHVSLVETEGVFTLLD DKIMMPQDDLVISEIDFNNNSIVLGKCEIWRMEGGSGHTVTDDIDHFFSAPSITYREPHL SIYDVLEVQKEELDLSKDLMVLPNAPNRVFAWETGWTPGLRSLENDGTKLLDRIRDNYEG EFYWRYFAFIADALITTLKPRYEDTNIRINLDSNTRSFIVPIITTEYIREKLSYSFYGSG GTYALSLSQYNMGINIELSESDVWIIDVDNWRDVTIESDKIKKGDLIEGILSTLSIEEN KIILNSHEINFSGEWGSNGFVSLTFSILEGINAIIEVDLLSKSYKLLISGELKILMLNS NHIQQKIDYIGFNSELQKNIPYSFVDSEGKENGFINGSTKEGLFVSELPDWLISKVYMD DSKPSFGYYSNNLKDVKVITKDNWILTGYYLKDDIKISLSLTLQDEKTIKLNSVHLDES GVAEILKFMNRKGNTNTSDSLMSFLESMNIKSIFWFLQSNIKFILDANFIISGTTSIGQ FEFICDENDNIQPYFIKFNTLETNYTLYVGNRQNMIVEPNYDLDDSGDISSTVINFSQKY LYGIDSCWKWISPNIYTDEINITPVYETNNTYPEVIVLDANYINEKINWINDLSIRY VWSNDGNDFILMSTSEENKVSQVKIRFWVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFT PSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKFYINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPWNLITGFVTVG DDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEG EAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFN SDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFA HHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIG LSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIG VFDTSDGYKYFAPANTWDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESD KYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIED KMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYI AATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID N0:3 - последовательность слитой конструкции 1
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGFVSINDNKHYFD DSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTA WGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFY IDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTWDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFN PETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPD GFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID N0:4 - последовательность слитой конструкции 2
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE
AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFD DSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTA WGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFY IDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTWDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFN PETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPD GFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID N0:5 - последовательность слитой конструкции 3
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAHHNEDLGNEEGEEISYSG ILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSD SGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIE TGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMF YFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPD TAQLVISE
SEQ ID N0:6 - последовательность слитой конструкции 4
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFA PANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGV MQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGI LNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDS GIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIET GWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFY FGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDT AQLVISE
SEQ ID N0:7 - последовательность слитой конструкции 5
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGGGFVSINDN
KHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFD DSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNID DNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTWDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESD KYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGV FNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID N0:8 - последовательность отдельного фрагмента токсина А
MASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVT GLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFA PANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGL PQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAA GGLFEIDGVIYFFGVDGVKAP
SEQ ID N0:9 - последовательность отдельного фрагмента токсина В
MILMSTSEENKVSQVKIRFVNVFKDKTLANKLSFNFSDKQDVPVSEIILSFTPSYYEDGLIGYDLGLVSLYNEKF YINNFGMMVSGLIYINDSLYYFKPPVNNLITGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGV FSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIG DYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGN EEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVT INDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDV YYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQF GYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVII DGEEYYFDPDTA
SEQ ID N0:10 - последовательность фрагмента токсина А из слитой конструкции 1
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAP
SEQ ID N0:11 - последовательность фрагмента токсина А из слитой конструкции 2
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAG
SEQ ID N0:12 - последовательность фрагмента токсина А из слитой конструкции 3
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEY
SEQ ID N0:13 - последовательность фрагмента токсина А из слитой конструкции 4
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAG
SEQ ID N0:14 - последовательность фрагмента токсина А из слитой конструкции 5
MGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEF LTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANN ESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAE AATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFE YFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFN TNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNS KAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQN RFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYG
SEQ ID N0:15 - последовательность фрагмента токсина В из слитой конструкции 1
GFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNF NNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGII ESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTWDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWI YDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGE DGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQL VISE
SEQ ID N0:16 - последовательность фрагмента токсина В из слитой конструкции 2
GLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHH NEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIM QVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLV RVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNE NGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAA TGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID N0:17 - последовательность фрагмента токсина В из слитой конструкции 3
FAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFND DGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTWDNIYGQAVEY SGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNY YFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDE YIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID N0:18 - последовательность фрагмента токсина В из слитой конструкции 4
GETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKEL DGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQ IGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGL SLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANT VNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIM RTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWL DLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID N0:19 - последовательность фрагмента токсина В из слитой конструкции 5
GFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNF NNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGII ESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWI YDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGE DGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQL VISE
SEQ ID N0:20 - нуклеотидная последовательность F54Gly
ATGGCAACCGGTTGGCAGACCATCGATGGCAAAAAATATTATTTTAATACCAACACCGCAATTGCAAGCACCGGCTATACCATTATCAACGGCA AACACTTTTATTTTAACACCGACGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTTAAAGGTCCGAACGGCTTTGAATACTTTGCACCGGCAAATACCGATGC CAATAATATTGAAGGCCAGGCCATTCTGTATCAGAATGAATTTCTGACCCTGAACGGCAAAAAATACTACTTTGGCAGCGATAGCAAAGCAGTT ACCGGTTGGCGCATCATCAACAATAAGAAATATTACTTCAACCCGAATAATGCAATTGCAGCAATTCATCTGTGCACCATTAACAACGACAAAT ATTATTTCAGCTATGACGGTATTCTGCAGAATGGCTACATTACCATCGAACGCAACAACTTTTATTTCGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGT GACCGGTGTTTTCAAAGGCCCTAATGGTTTTGAGTATTTCGCTCCGGCAAACACCCATAATAACAACATTGAAGGTCAGGCGATCGTTTATCAG AACAAATTCCTGACGCTGAATGGTAAGAAATACTATTTCGATAATGACAGCAAAGCCGTGACCGGCTGGCAGACAATTGACGGGAAGAAATATT ACTTTAATCTGAATACCGCAGAAGCAGCAACCGGTTGGCAAACGATCGACGGTAAAAAGTACTACTTCAACCTGAACACAGCCGAAGCAGCCAC AGGATGGCAGACTATTGATGGAAAAAAATACTATTTCAACACCAACACCTTTATTGCATCTACCGGTTATACCAGCATTAACGGTAAACATTTC TACTTCAACACCGATGGTATCATGCAGATCGGCGTTTTCAAAGGTCCAAATGGTTTCGAATACTTTGCCCCTGCCAATACAGATGCAAATAACA TCGAGGGTCAGGCAATCCTGTACCAAAACAAATTTCTGACCCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGGTAGCGATTCTAAAGCCGTTACCGGTCT GCGTACCATTGATGGTAAAAAATACTACTTTAATACGAATACAGCCGTTGCGGTTACAGGCTGGCAGACCATTAACGGGAAAAAATACTATTTT AACACAAATACCAGCATTGCCTCAACGGGTTATACCATTATTTCGGGTAAACACTTCTACTTTAATACCGATGGTATTATGCAAATCGGAGTCT TTAAAGGACCTGATGGGTTCGAATATTTTGCGCCTGCGAACACTGATGCGAACAATATCGAAGGACAGGCAATCCGCTATCAGAATCGCTTTCT GTATCTGCACGACAACATCTATTATTTTGGCAACAATTCAAAAGCAGCCACCGGCTGGGTTACAATTGATGGCAACCGCTACTATTTCGAACCG AATACCGCAATGGGTGCAAATGGCTACAAAACCATCGATAATAAAAATTTCTATTTTCGCAACGGTCTGCCGCAGATCGGGGTATTTAAAGGTA GCAACGGCTTCGAATACTTCGCTCCAGCGAATACGGACGCGAACAATATTGAGGGTCAAGCGATTCGTTATCAAAACCGTTTTCTGCATCTGCT GGGCAAAATCTACTACTTTGGCAATAACAGTAAAGCAGTTACTGGATGGCAGACAATCAATGGTAAAGTGTACTATTTTATGCCGGATACCGCC ATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGCGTGATCTATTTTTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCACCGGGAATATACGGTGGTACCG GCTTTGTGACCGTGGGTGATGATAAATACTATTTCAATCCGATTAACGGTGGTGCAGCGAGCATTGGCGAAACCATCATCGATGACAAAAACTA TTATTTCAACCAGAGCGGTGTGCTGCAGACCGGTGTGTTTAGCACCGAAGATGGCTTTAAATATTTTGCGCCAGCGAACACCCTGGATGAAAAC CTGGAAGGCGAAGCGATTGATTTTACCGGCAAACTGATCATCGATGAAAACATCTATTACTTCGATGATAACTATCGTGGTGCGGTGGAATGGA AAGAACTGGATGGCGAAATGCATTATTTTTCTCCGGAAACCGGTAAAGCGTTTAAAGGCCTGAACCAGATCGGCGATTACAAATACTACTTCAA CAGCGATGGCGTGATGCAGAAAGGCTTTGTGAGCATCAACGATAACAAACACTATTTCGATGATAGCGGTGTGATGAAAGTGGGCTATACCGAA ATTGATGGCAAACATTTCTACTTCGCGGAAAACGGCGAAATGCAGATTGGCGTGTTCAATACCGAAGATGGTTTCAAATACTTCGCGCACCATA ACGAAGATCTGGGTAACGAAGAAGGCGAAGAAATTAGCTATAGCGGCATCCTGAACTTCAACAACAAAATCTACTACTTTGATGATAGCTTTAC CGCGGTGGTGGGCTGGAAAGATCTGGAAGATGGCAGCAAATATTATTTCGATGAAGATACCGCGGAAGCGTATATTGGCCTGAGCCTGATTAAC
GATGGCCAGTACTATTTTAACGATGATGGCATTATGCAGGTGGGTTTCGTGACCATTAATGATAAAGTGTTCTATTTCAGCGATAGCGGCATTA TTGAAAGCGGCGTGCAGAACATTGATGATAACTACTTCTACATCGATGATAACGGCATTGTGCAGATCGGCGTTTTTGATACCAGCGATGGCTA CAAATATTTCGCACCGGCCAATACCGTGAACGATAACATTTATGGCCAGGCGGTGGAATATAGCGGTCTGGTGCGTGTGGGCGAAGATGTGTAT TATTTCGGCGAAACCTATACCATCGAAACCGGCTGGATTTATGATATGGAAAACGAAAGCGATAAATATTACTTTAATCCGGAAACGAAAAAAG CGTGCAAAGGCATTAACCTGATCGATGATATCAAATACTATTTTGATGAAAAAGGCATTATGCGTACCGGTCTGATTAGCTTCGAAAACAACAA CTATTACTTCAACGAAAACGGTGAAATGCAGTTCGGCTACATCAACATCGAAGATAAAATGTTCTACTTCGGCGAAGATGGTGTTATGCAGATT GGTGTTTTTAACACCCCGGATGGCTTCAAATACTTTGCCCATCAGAATACCCTGGATGAAAATTTCGAAGGTGAAAGCATTAACTATACCGGCT GGCTGGATCTGGATGAAAAACGCTACTACTTCACCGATGAATACATTGCGGCGACCGGCAGCGTGATTATTGATGGCGAAGAATACTACTTCGA TCCGGATACCGCGCAGCTGGTGATTAGCGAACATCATCATCATCACCAT
SEQ ID N0:21 - аминокислотная последовательность F54Gly
MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLN
GKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVF
KGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYY
FNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILY
QNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDG
IMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKT
IDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMP
DTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYGGTGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFS
TEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFN
SDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGIL
NFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESG
VQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESD
KYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPD
GFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISEHHHHHH
SEQ ID NO: 22 - нуклеотидная последовательность F54New
ATGGCAACCGGTTGGCAGACCATCGATGGCAAAAAATATTATTTTAATACCAACACCGCAATTGCAAGCACCGGCTATACCATTATCAACGGCA AACACTTTTATTTTAACACCGACGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTTAAAGGTCCGAACGGCTTTGAATACTTTGCACCGGCAAATACCGATGC CAATAATATTGAAGGCCAGGCCATTCTGTATCAGAATGAATTTCTGACCCTGAACGGCAAAAAATACTACTTTGGCAGCGATAGCAAAGCAGTT ACCGGTTGGCGCATCATCAACAATAAGAAATATTACTTCAACCCGAATAATGCAATTGCAGCAATTCATCTGTGCACCATTAACAACGACAAAT ATTATTTCAGCTATGACGGTATTCTGCAGAATGGCTACATTACCATCGAACGCAACAACTTTTATTTCGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGT GACCGGTGTTTTCAAAGGCCCTAATGGTTTTGAGTATTTCGCTCCGGCAAACACCCATAATAACAACATTGAAGGTCAGGCGATCGTTTATCAG AACAAATTCCTGACGCTGAATGGTAAGAAATACTATTTCGATAATGACAGCAAAGCCGTGACCGGCTGGCAGACAATTGACGGGAAGAAATATT ACTTTAATCTGAATACCGCAGAAGCAGCAACCGGTTGGCAAACGATCGACGGTAAAAAGTACTACTTCAACCTGAACACAGCCGAAGCAGCCAC AGGATGGCAGACTATTGATGGAAAAAAATACTATTTCAACACCAACACCTTTATTGCATCTACCGGTTATACCAGCATTAACGGTAAACATTTC TACTTCAACACCGATGGTATCATGCAGATCGGCGTTTTCAAAGGTCCAAATGGTTTCGAATACTTTGCCCCTGCCAATACAGATGCAAATAACA TCGAGGGTCAGGCAATCCTGTACCAAAACAAATTTCTGACCCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGGTAGCGATTCTAAAGCCGTTACCGGTCT GCGTACCATTGATGGTAAAAAATACTACTTTAATACGAATACAGCCGTTGCGGTTACAGGCTGGCAGACCATTAACGGGAAAAAATACTATTTT AACACAAATACCAGCATTGCCTCAACGGGTTATACCATTATTTCGGGTAAACACTTCTACTTTAATACCGATGGTATTATGCAAATCGGAGTCT TTAAAGGACCTGATGGGTTCGAATATTTTGCGCCTGCGAACACTGATGCGAACAATATCGAAGGACAGGCAATCCGCTATCAGAATCGCTTTCT GTATCTGCACGACAACATCTATTATTTTGGCAACAATTCAAAAGCAGCCACCGGCTGGGTTACAATTGATGGCAACCGCTACTATTTCGAACCG AATACCGCAATGGGTGCAAATGGCTACAAAACCATCGATAATAAAAATTTCTATTTTCGCAACGGTCTGCCGCAGATCGGGGTATTTAAAGGTA GCAACGGCTTCGAATACTTCGCTCCAGCGAATACGGACGCGAACAATATTGAGGGTCAAGCGATTCGTTATCAAAACCGTTTTCTGCATCTGCT GGGCAAAATCTACTACTTTGGCAATAACAGTAAAGCAGTTACTGGATGGCAGACAATCAATGGTAAAGTGTACTATTTTATGCCGGATACCGCC ATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGCGTGATCTATTTTTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCAGTTACCGGCTTTGTGACCGTGG GTGATGATAAATACTATTTCAATCCGATTAACGGTGGTGCAGCGAGCATTGGCGAAACCATCATCGATGACAAAAACTATTATTTCAACCAGAG CGGTGTGCTGCAGACCGGTGTGTTTAGCACCGAAGATGGCTTTAAATATTTTGCGCCAGCGAACACCCTGGATGAAAACCTGGAAGGCGAAGCG ATTGATTTTACCGGCAAACTGATCATCGATGAAAACATCTATTACTTCGATGATAACTATCGTGGTGCGGTGGAATGGAAAGAACTGGATGGCG AAATGCATTATTTTTCTCCGGAAACCGGTAAAGCGTTTAAAGGCCTGAACCAGATCGGCGATTACAAATACTACTTCAACAGCGATGGCGTGAT GCAGAAAGGCTTTGTGAGCATCAACGATAACAAACACTATTTCGATGATAGCGGTGTGATGAAAGTGGGCTATACCGAAATTGATGGCAAACAT
TTCTACTTCGCGGAAAACGGCGAAATGCAGATTGGCGTGTTCAATACCGAAGATGGTTTCAAATACTTCGCGCACCATAACGAAGATCTGGGTA ACGAAGAAGGCGAAGAAATTAGCTATAGCGGCATCCTGAACTTCAACAACAAAATCTACTACTTTGATGATAGCTTTACCGCGGTGGTGGGCTG GAAAGATCTGGAAGATGGCAGCAAATATTATTTCGATGAAGATACCGCGGAAGCGTATATTGGCCTGAGCCTGATTAACGATGGCCAGTACTAT TTTAACGATGATGGCATTATGCAGGTGGGTTTCGTGACCATTAATGATAAAGTGTTCTATTTCAGCGATAGCGGCATTATTGAAAGCGGCGTGC AGAACATTGATGATAACTACTTCTACATCGATGATAACGGCATTGTGCAGATCGGCGTTTTTGATACCAGCGATGGCTACAAATATTTCGCACC GGCCAATACCGTGAACGATAACATTTATGGCCAGGCGGTGGAATATAGCGGTCTGGTGCGTGTGGGCGAAGATGTGTATTATTTCGGCGAAACC TATACCATCGAAACCGGCTGGATTTATGATATGGAAAACGAAAGCGATAAATATTACTTTAATCCGGAAACGAAAAAAGCGTGCAAAGGCATTA ACCTGATCGATGATATCAAATACTATTTTGATGAAAAAGGCATTATGCGTACCGGTCTGATTAGCTTCGAAAACAACAACTATTACTTCAACGA AAACGGTGAAATGCAGTTCGGCTACATCAACATCGAAGATAAAATGTTCTACTTCGGCGAAGATGGTGTTATGCAGATTGGTGTTTTTAACACC CCGGATGGCTTCAAATACTTTGCCCATCAGAATACCCTGGATGAAAATTTCGAAGGTGAAAGCATTAACTATACCGGCTGGCTGGATCTGGATG AAAAACGCTACTACTTCACCGATGAATACATTGCGGCGACCGGCAGCGTGATTATTGATGGCGAAGAATACTACTTCGATCCGGATACCGCGCA GC Т GGT GAT TAGC GAAC AT САТСАТСАТСАССАТ
SEQ ID NO: 23 - аминокислотная последовательность F54New
MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQN
EFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESK
MVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTI
DGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIE
GQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHF
YFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQHRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGHRYYFEPNTAMG
ANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGK
VYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAVTGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVF
STEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYF
NSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGI
LNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIES
GVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENES
DKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTP
DGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISEHHHHHH
SEQ ID NO: 24 - нуклеотидная последовательность F5ToxB
ATGGCAACCGGTTGGCAGACCATCGATGGCAAAAAATATTATTTTAATACCAACACCGCAATTGCAAGCACCGGCTATACCATTATCAACGGCA AACACTTTTATTTTAACACCGACGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTTAAAGGTCCGAACGGCTTTGAATACTTTGCACCGGCAAATACCGATGC CAATAATATTGAAGGCCAGGCCATTCTGTATCAGAATGAATTTCTGACCCTGAACGGCAAAAAATACTACTTTGGCAGCGATAGCAAAGCAGTT ACCGGTTGGCGCATCATCAACAATAAGAAATATTACTTCAACCCGAATAATGCAATTGCAGCAATTCATCTGTGCACCATTAACAACGACAAAT ATTATTTCAGCTATGACGGTATTCTGCAGAATGGCTACATTACCATCGAACGCAACAACTTTTATTTCGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGT GACCGGTGTTTTCAAAGGCCCTAATGGTTTTGAGTATTTCGCTCCGGCAAACACCCATAATAACAACATTGAAGGTCAGGCGATCGTTTATCAG AACAAATTCCTGACGCTGAATGGTAAGAAATACTATTTCGATAATGACAGCAAAGCCGTGACCGGCTGGCAGACAATTGACGGGAAGAAATATT ACT TTAATCTGAATACCGCAGAAGCAGCAACCGGTTGGCAAAC GAT CGACGGTAAAAAGTAC TACT TCAACCTGAACACAGCCGAAGCAGCCAC AGGATGGCAGACTATTGATGGAAAAAAATACTATTTCAACACCAACACCTTTATTGCATCTACCGGTTATACCAGCATTAACGGTAAACATTTC TACTTCAACACCGATGGTATCATGCAGATCGGCGTTTTCAAAGGTCCAAATGGTTTCGAATACTTTGCCCCTGCCAATACAGATGCAAATAACA TCGAGGGTCAGGCAATCCTGTACCAAAACAAATTTCTGACCCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGGTAGCGATTCTAAAGCCGTTACCGGTCT GCGTACCATTGATGGTAAAAAATACTACTTTAATACGAATACAGCCGTTGCGGTTACAGGCTGGCAGACCATTAACGGGAAAAAATACTATTTT AACACAAATACCAGCATTGCCTCAACGGGTTATACCATTATTTCGGGTAAACACTTCTACTTTAATACCGATGGTATTATGCAAATCGGAGTCT TTAAAGGACCTGATGGGTTCGAATATTTTGCGCCTGCGAACACTGATGCGAACAATATCGAAGGACAGGCAATCCGCTATCAGAATCGCTTTCT GTATCTGCACGACAACATCTATTATTTTGGCAACAATTCAAAAGCAGCCACCGGCTGGGTTACAATTGATGGCAACCGCTACTATTTCGAACCG AATACCGCAATGGGTGCAAATGGCTACAAAACCATCGATAATAAAAATTTCTATTTTCGCAACGGTCTGCCGCAGATCGGGGTATTTAAAGGTA GCAACGGCTTCGAATACTTCGCTCCAGCGAATACGGACGCGAACAATATTGAGGGTCAAGCGATTCGTTATCAAAACCGTTTTCTGCATCTGCT GGGCAAAATCTAC TACT TTGGCAATAACAGTAAAGCAGT TACT GGATGGCAGACAATCAATGGTAAAGTGTAC TAT TT TAT GCCGGATACCGCC ATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGCGTGATCTATTTTTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCAGTGAGCGGTCTGATTTATATTA ACGATAGCCTGTATTACTTTAAACCACCGGTGAATAACCTGATTACCGGCTTTGTGACCGTGGGTGATGATAAATACTATTTCAATCCGATTAA CGGTGGTGCAGCGAGCATTGGCGAAACCATCATCGATGACAAAAACTATTATTTCAACCAGAGCGGTGTGCTGCAGACCGGTGTGTTTAGCACC
GAAGATGGCTTTAAATATTTTGCGCCAGCGAACACCCTGGATGAAAACCTGGAAGGCGAAGCGATTGATTTTACCGGCAAACTGATCATCGATG AAAACATCTATTACTTCGATGATAACTATCGTGGTGCGGTGGAATGGAAAGAACTGGATGGCGAAATGCATTATTTTTCTCCGGAAACCGGTAA AGCGTTTAAAGGCCTGAACCAGATCGGCGATTACAAATACTACTTCAACAGCGATGGCGTGATGCAGAAAGGCTTTGTGAGCATCAACGATAAC AAACACTATTTCGATGATAGCGGTGTGATGAAAGTGGGCTATACCGAAATTGATGGCAAACATTTCTACTTCGCGGAAAACGGCGAAATGCAGA TTGGCGTGTTCAATACCGAAGATGGTTTCAAATACTTCGCGCACCATAACGAAGATCTGGGTAACGAAGAAGGCGAAGAAATTAGCTATAGCGG CATCCTGAACTTCAACAACAAAATCTACTACTTTGATGATAGCTTTACCGCGGTGGTGGGCTGGAAAGATCTGGAAGATGGCAGCAAATATTAT TTCGATGAAGATACCGCGGAAGCGTATATTGGCCTGAGCCTGATTAACGATGGCCAGTACTATTTTAACGATGATGGCATTATGCAGGTGGGTT TCGTGACCAT ТААТ GATAAAGTGTTCTATTTCAGCGATAGCGGCAT TAT TGAAAGCGGCGTGCAGAACATT GAT GATAACTACT TCTACATCGA TGATAACGGCATTGTGCAGATCGGCGTTTTTGATACCAGCGATGGCTACAAATATTTCGCACCGGCCAATACCGTGAACGATAACATTTATGGC CAGGCGGTGGAATATAGCGGTCTGGTGCGTGTGGGCGAAGATGTGTATTATTTCGGCGAAACCTATACCATCGAAACCGGCTGGATTTATGATA TGGAAAACGAAAGCGATAAATATTACTTTAATCCGGAAACGAAAAAAGCGTGCAAAGGCATTAACCTGATCGATGATATCAAATACTATTTTGA TGAAAAAGGCAT TAT GCGTACCGGTCT GAT TAGCTTCGAAAACAACAACTAT TACT TCAACGAAAACGGTGAAATGCAGTTCGGCTACATCAAC ATCGAAGATAAAATGTTCTACTTCGGCGAAGATGGTGTTATGCAGATTGGTGTTTTTAACACCCCGGATGGCTTCAAATACTTTGCCCATCAGA ATACCCTGGATGAAAATTTCGAAGGTGAAAGCATTAACTATACCGGCTGGCTGGATCTGGATGAAAAACGCTACTACTTCACCGATGAATACAT TGCGGCGACCGGCAGCGTGATTATTGATGGCGAAGAATACTACTTCGATCCGGATACCGCGCAGCTGGTGATTAGCGAACATCATCATCATCAC CAT
SEQ ID NO: 25 - аминокислотная последовательность F5ToxB
MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQN
EFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESK
MVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTI
DGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIE
GQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHF
YFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMG
ANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGK
VYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAVSGLIYINDSLYYFKPPVNNLITGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGE
TIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYF
SPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKY
FAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQ
VGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDV
YYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINI
EDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPD
TAQLVISEHHHHHH
SEQ ID NO: 26 - нуклеотидная последовательность F52New
ATGGCAACCGGTTGGCAGACCATCGATGGCAAAAAATATTATTTTAATACCAACACCGCAATTGCAAGCACCGGCTATACCATTATCAACGGCA AACACTTTTATTTTAACACCGACGGCATTATGCAGATTGGTGTGTTTAAAGGTCCGAACGGCTTTGAATACTTTGCACCGGCAAATACCGATGC CAATAATATTGAAGGCCAGGCCATTCTGTATCAGAATGAATTTCTGACCCTGAACGGCAAAAAATACTACTTTGGCAGCGATAGCAAAGCAGTT ACCGGTTGGCGCATCATCAACAATAAGAAATATTACTTCAACCCGAATAATGCAATTGCAGCAATTCATCTGTGCACCATTAACAACGACAAAT ATTATTTCAGCTATGACGGTATTCTGCAGAATGGCTACATTACCATCGAACGCAACAACTTTTATTTCGATGCCAACAACGAAAGCAAAATGGT GACCGGTGTTTTCAAAGGCCCTAATGGTTTTGAGTATTTCGCTCCGGCAAACACCCATAATAACAACATTGAAGGTCAGGCGATCGTTTATCAG AACAAATTCCTGACGCTGAATGGTAAGAAATACTATTTCGATAATGACAGCAAAGCCGTGACCGGCTGGCAGACAATTGACGGGAAGAAATATT ACTTTAATCTGAATACCGCAGAAGCAGCAACCGGTTGGCAAACGATCGACGGTAAAAAGTACTACTTCAACCTGAACACAGCCGAAGCAGCCAC AGGATGGCAGACTATTGATGGAAAAAAATACTATTTCAACACCAACACCTTTATTGCATCTACCGGTTATACCAGCATTAACGGTAAACATTTC TACTTCAACACCGATGGTATCATGCAGATCGGCGTTTTCAAAGGTCCAAATGGTTTCGAATACTTTGCCCCTGCCAATACAGATGCAAATAACA TCGAGGGTCAGGCAATCCTGTACCAAAACAAATTTCTGACCCTGAATGGGAAAAAATATTACTTTGGTAGCGATTCTAAAGCCGTTACCGGTCT GCGTACCATTGATGGTAAAAAATACTACTTTAATACGAATACAGCCGTTGCGGTTACAGGCTGGCAGACCATTAACGGGAAAAAATACTATTTT AACACAAATACCAGCATTGCCTCAACGGGTTATACCATTATTTCGGGTAAACACTTCTACTTTAATACCGATGGTATTATGCAAATCGGAGTCT TTAAAGGACCTGATGGGTTCGAATATTTTGCGCCTGCGAACACTGATGCGAACAATATCGAAGGACAGGCAATCCGCTATCAGAATCGCTTTCT GTATCTGCACGACAACATCTATTATTTTGGCAACAATTCAAAAGCAGCCACCGGCTGGGTTACAATTGATGGCAACCGCTACTATTTCGAACCG
AATACCGCAATGGGTGCAAATGGCTACAAAACCATCGATAATAAAAATTTCTATTTTCGCAACGGTCTGCCGCAGATCGGGGTATTTAAAGGTA GCAACGGCTTCGAATACTTCGCTCCAGCGAATACGGACGCGAACAATATTGAGGGTCAAGCGATTCGTTATCAAAACCGTTTTCTGCATCTGCT GGGCAAAATCTACTACTTTGGCAATAACAGTAAAGCAGTTACTGGATGGCAGACAATCAATGGTAAAGTGTACTATTTTATGCCGGATACCGCC ATGGCAGCAGCCGGTGGTCTGTTTGAAATTGATGGCGTGATCTATTTTTTTGGTGTGGATGGTGTTAAAGCAGTGAAAGGCCTGAACCAGATCG GCGATTACAAATACTACTTCAACAGCGATGGCGTGATGCAGAAAGGCTTTGTGAGCATCAACGATAACAAACACTATTTCGATGATAGCGGTGT GATGAAAGTGGGCTATACCGAAATTGATGGCAAACATTTCTACTTCGCGGAAAACGGCGAAATGCAGATTGGCGTGTTCAATACCGAAGATGGT TTCAAATACTTCGCGCACCATAACGAAGATCTGGGTAACGAAGAAGGCGAAGAAATTAGCTATAGCGGCATCCTGAACTTCAACAACAAAATCT ACTACTTTGATGATAGCTTTACCGCGGTGGTGGGCTGGAAAGATCTGGAAGATGGCAGCAAATATTATTTCGATGAAGATACCGCGGAAGCGTA TATTGGCCTGAGCCTGATTAACGATGGCCAGTACTATTTTAACGATGATGGCATTATGCAGGTGGGTTTCGTGACCATTAATGATAAAGTGTTC TATTTCAGCGATAGCGGCATTATTGAAAGCGGCGTGCAGAACATTGATGATAACTACTTCTACATCGATGATAACGGCATTGTGCAGATCGGCG TTTTTGATACCAGCGATGGCTACAAATATTTCGCACCGGCCAATACCGTGAACGATAACATTTATGGCCAGGCGGTGGAATATAGCGGTCTGGT GCGTGTGGGCGAAGATGTGTATTATTTCGGCGAAACCTATACCATCGAAACCGGCTGGATTTATGATATGGAAAACGAAAGCGATAAATATTAC TTTAATCCGGAAACGAAAAAAGCGTGCAAAGGCATTAACCTGATCGATGATATCAAATACTATTTTGATGAAAAAGGCATTATGCGTACCGGTC TGATTAGCTTCGAAAACAACAACTATTACTTCAACGAAAACGGTGAAATGCAGTTCGGCTACATCAACATCGAAGATAAAATGTTCTACTTCGG CGAAGATGGTGTTATGCAGATTGGTGTTTTTAACACCCCGGATGGCTTCAAATACTTTGCCCATCAGAATACCCTGGATGAAAATTTCGAAGGT GAAAGCATTAACTATACCGGCTGGCTGGATCTGGATGAAAAACGCTACTACTTCACCGATGAATACATTGCGGCGACCGGCAGCGTGATTATTG ATGGCGAAGAATACTACTTCGATCCGGATACCGCGCAGCTGGTGATTAGCGAACATCATCATCATCACCAT
SEQ ID NO: 27 - аминокислотная последовательность F52New
MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQNEFLTLN
GKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDANNESKMVTGVF
KGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYY
FNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILY
QNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYYFNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDG
IMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGNNSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKT
IDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMP
DTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAVKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFY
FAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAY
IGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVN
DNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISF
ENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDE
YIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISEHHHHHH
SEQ ID NO: 28 - последовательность фрагмента токсина А из F54Gly
MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQN EFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDA NNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNT AEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNG FEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYY FNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGN NSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRY QNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAPGIYG
SEQ ID NO: 29 - последовательность фрагмента токсина А из F54New
MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQN EFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDA NNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNT AEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNG FEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYY
FNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGN NSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRY QNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAV
SEQ ID N0:30 - последовательность фрагмента токсина А из F5ToxB
MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQN EFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDA NNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNT AEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNG FEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYY FNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGN NSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRY QNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAV
SEQ ID N0:31 - последовательность фрагмента токсина А из F52New
MATGWQTIDGKKYYFNTNTAIASTGYTIINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNGFEYFAPANTDANNIEGQAILYQN EFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGWRIINNKKYYFNPNNAIAAIHLCTINNDKYYFSYDGILQNGYITIERNNFYFDA NNESKMVTGVFKGPNGFEYFAPANTHNNNIEGQAIVYQNKFLTLNGKKYYFDNDSKAVTGWQTIDGKKYYFNLNT AEAATGWQTIDGKKYYFNLNTAEAATGWQTIDGKKYYFNTNTFIASTGYTSINGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPNG FEYFAPANTDANNIEGQAILYQNKFLTLNGKKYYFGSDSKAVTGLRTIDGKKYYFNTNTAVAVTGWQTINGKKYY FNTNTSIASTGYTIISGKHFYFNTDGIMQIGVFKGPDGFEYFAPANTDANNIEGQAIRYQNRFLYLHDNIYYFGN NSKAATGWVTIDGNRYYFEPNTAMGANGYKTIDNKNFYFRNGLPQIGVFKGSNGFEYFAPANTDANNIEGQAIRY QNRFLHLLGKIYYFGNNSKAVTGWQTINGKVYYFMPDTAMAAAGGLFEIDGVIYFFGVDGVKAV
SEQ ID NO: 32 - последовательность фрагмента токсина В из F54Gly
TGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGK LIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSG VMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWG WKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDD NGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTWDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPET KKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFK YFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID NO: 33 - последовательность фрагмента токсина В из F54New
TGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKYFAPANTLDENLEGEAIDFTGK LIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSG VMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAWG WKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGIIESGVQNIDDNYFYIDD NGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKYYFNPET KKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFK YFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
SEQ ID NO: 34 - последовательность фрагмента токсина В из F5ToxB
SGLIYINDSLYYFKPPVNNLITGFVTVGDDKYYFNPINGGAASIGETIIDDKNYYFNQSGVLQTGVFSTEDGFKY FAPANTLDENLEGEAIDFTGKLIIDENIYYFDDNYRGAVEWKELDGEMHYFSPETGKAFKGLNQIGDYKYYFNSD GVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNEEGEEISYS GILNFNNKIYYFDDSFTAWGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFS DSGIIESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTI ETGWIYDMENESDKYYFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKM
FYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQNTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDP DTAQLVISE
SEQ ID NO: 35 - последовательность фрагмента токсина В из F52New
KGLNQIGDYKYYFNSDGVMQKGFVSINDNKHYFDDSGVMKVGYTEIDGKHFYFAENGEMQIGVFNTEDGFKYFAHHNEDLGNE EGEEISYSGILNFNNKIYYFDDSFTAVVGWKDLEDGSKYYFDEDTAEAYIGLSLINDGQYYFNDDGIMQVGFVTINDKVFYFSDSGI IESGVQNIDDNYFYIDDNGIVQIGVFDTSDGYKYFAPANTVNDNIYGQAVEYSGLVRVGEDVYYFGETYTIETGWIYDMENESDKY YFNPETKKACKGINLIDDIKYYFDEKGIMRTGLISFENNNYYFNENGEMQFGYINIEDKMFYFGEDGVMQIGVFNTPDGFKYFAHQ NTLDENFEGESINYTGWLDLDEKRYYFTDEYIAATGSVIIDGEEYYFDPDTAQLVISE
| SR Щ LR
С-концевой домен Тох А
н inn inn mi mil 1111 in m
! II 111 IV V VI VII VIII С-концевой домен Тох В
и mil inn urn
I 11 111
блок "SR-LR-SR":
С-концевой домен Тох А
С-концевой домен Тох В
С-концевой домен Тох А
С-концевой домен Тох В
С-концевой домен Тох А
С-концевой домен Тох В
Flvar Lot P1010J jan 2010
F2 var Lot BMP87 dec 2010
F3 var lot ВМР88 (20Apr2012)
F4 var lot BMP89 (20Apr2012)
lot BMP90(20Apr2012)
КД в ближнем УФ слитых конструкций Тох А-Тох В
20100*-73: Иммучиэп'ди* мышей С ксцом Тох Д. О-кс-'цг.-м Тех В С difficile и слитыми бс-.чкп ми ?'с покол^яиг-" г-рел.%т:1ппонн:/ми в л SC." В
сы:;орогки Post III
10000 1000
1:00
9? у i-J61 37: r-;o l27?
1. 1111E1. 11111
2,5 CO
.2706) 2360;
Post II!
i:0!:';0:;73 Имм> ; <;и пя'я М'.щ.'.ч' •". ..олцс/ Г ¦¦ пи-..|р.ч1 чопк.чми 2 M.:f::);i.- = ;;i> !. пг)п;ц: галопными =j Л503:! Ah.i;ih::
HHiiir-iviiiuiMMKii riV. <.i;r.'!K-.lHH.l-.|i'ii iV; re .(.," riii fK:f;.l"u-w ,-j-ih ги.ч.мчцо"
ТсмА Тохб Fl 'J J wfl 23S7- 1/50-
fillfiaiiiil' vv
2387- J75C
3-00673" Иммунизация мышеи С-концом Тох А. С-концом Тох В С difficile и слитыми белками 2'° поколения, представленными в AS03B
Анти-Tov В ELISA: концентрация (мкг/мл) з образцах
сыворотки Post III
154
145,-. If-'.Б
8 у
¦ ч4
201ОСС^"" л H:/M/i:ii:-:-j:j;i;i :,':.;!С IIOML'.M Т .-X А С .¦v'UOM Гох ;> С. (iiffici'r) и спитыми белками 2!- покорения.
л;?ел; a; ;ечs!mi,мб AS;;2В
320 ^1/
40 SO 'О"
¦ч -ч "J 1 1 п -1 -я я т) ч я Я
., . ... , ^
о -> .J J о
~i J -"г ^ <Г ^ ^ c[ cЈ q; 51 ci
S SisiSbiiist; 2 й: as -2
ooooooon rortrocoir)^
V> A 7-!x3 ,:1 r2 ::3 e4 rS Tixa -ixS ci c2 сз "4 C5
i.tH- l.bO- /187- ¦ /pO-
ФИГ. 15
F52 new !otBMP154 (03oct2011)
n m I t
F54 Gly Lot BMP155 (23Sep2011)
F54NewLotBMP156 (23Scp2011) i
\
FSToxB LotBMP157(21scp2011)
ФИГ. 16
л*.---.-г .-.--j.. V..-II ¦ г ..г. ¦ -.v. С 'е .-г;-.:,7таэпенными з AS03B Ачти- ;о> В i Lib*. ытр-:1 и/кг/уп! Г UbA д;;я индивидуальных образцов
Анализ ингибирования цитотоксичности из клетках IMR90 (для ТохВ'г титры ингибирования для объединенных образцов сыворотки Post III
10000
iiOff
(19)
(19)
(19)
Формула изобретения с изменениями, внесенными в соответствии со статьей 34(2)(b) РСТ
Формула изобретения с изменениями, внесенными в соответствии со статьей 34(2)(b) РСТ
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ
2 Формула изобретения с изменениями, внесенными в соответствии со статьей 34(2)(Ь) РСТ
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ
5 Формула изобретения с изменениями, внесенными в соответствии со статьей 34(2)(Ь) РСТ
5 Формула изобретения с изменениями, внесенными в соответствии со статьей 34(2)(Ь) РСТ
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ
ФИГ. 1
Иммуногенная композиция
ФИГ. 1
Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
ФИГ. 2
Иммуногенная композиция
ФИГ. 2
Иммуногенная композиция
ФИГ. 3
Иммуногенная композиция
ФИГ. 3
Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
ФИГ. 5
Иммуногенная композиция
ФИГ. 5
Иммуногенная композиция
ФИГ. 6
Иммуногенная композиция
ФИГ. 6
Иммуногенная композиция
ФИГ. 7
Иммуногенная композиция
ФИГ. 7
Иммуногенная композиция
19 Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
19 Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
21 Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
ФИГ. 9
Иммуногенная композиция
ФИГ. 9
Иммуногенная композиция
ФИГ. 10
23 Иммуногенная композиция
ФИГ. 10
23 Иммуногенная композиция
ФИГ. 11
24 Иммуногенная композиция
ФИГ. 11
24 Иммуногенная композиция
ФИГ. 12
Иммуногенная композиция
ФИГ. 12
Иммуногенная композиция
ФИГ. 12
Иммуногенная композиция
ФИГ. 12
Иммуногенная композиция
ФИГ. 14
27 Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
ФИГ. 14
27 Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
ФИГ. 14
27 Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
ФИГ. 14
27 Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
ФИГ. 14
27 Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
ФИГ. 17
Иммуногенная композиция
ФИГ. 17
Иммуногенная композиция
ФИГ. 18
Иммуногенная композиция
ФИГ. 18
Иммуногенная композиция
ФИГ. 19
33 Иммуногенная композиция
ФИГ. 19
33 Иммуногенная композиция
34 Иммуногенная композиция
34 Иммуногенная композиция
ФИГ. 21
Иммуногенная композиция
ФИГ. 21
Иммуногенная композиция
ФИГ. 22
5b Иммуногенная композиция
ФИГ. 22
5b Иммуногенная композиция