[RU]

Изобретение предлагает композиции и способы, придающие пестицидную активность бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семенам. Последовательности, кодирующие токсины, можно использовать в составе конструкций ДНК или экспрессионных кассет для экспрессии в растениях и бактериях. Композиции также включают в себя трансформированные бактерии, растения, растительные клетки, ткани и семена. В частности, изобретение предлагает полинуклеотидные последовательности и кодируемые ими токсичные белки. Изобретение также предлагает антитела, способные специфически связываться с указанными аминокислотными последовательностями. В частности, изобретение охватывает полинуклеотидные последовательности, кодирующие гибридные белки, а также их биологически активные варианты и фрагменты, где гибридный белок содержит С-концевой фрагмент SEQ ID NO:43. Гибридный белок также может содержать N-концевой фрагмент SEQ ID NO:45. Изобретение также включает в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:47 и 1-14 или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:48 и 15-31, в том числе ее биологически активные варианты и фрагменты.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение предлагает композиции и способы, придающие пестицидную активность бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семенам. Последовательности, кодирующие токсины, можно использовать в составе конструкций ДНК или экспрессионных кассет для экспрессии в растениях и бактериях. Композиции также включают в себя трансформированные бактерии, растения, растительные клетки, ткани и семена. В частности, изобретение предлагает полинуклеотидные последовательности и кодируемые ими токсичные белки. Изобретение также предлагает антитела, способные специфически связываться с указанными аминокислотными последовательностями. В частности, изобретение охватывает полинуклеотидные последовательности, кодирующие гибридные белки, а также их биологически активные варианты и фрагменты, где гибридный белок содержит С-концевой фрагмент SEQ ID NO:43. Гибридный белок также может содержать N-концевой фрагмент SEQ ID NO:45. Изобретение также включает в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:47 и 1-14 или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:48 и 15-31, в том числе ее биологически активные варианты и фрагменты.

---

Евразийское (21) 201391444 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2014.06.30
(22) Дата подачи заявки
2012.04.04
(51) Int. Cl.
C12N15/82 (2006.01) C07K14/325 (2006.01) A01H 5/00 (2006.01)
(54) ВАРИАНТ ИНСЕКТИЦИДНОГО ГЕНА AXMI115 И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 61/471,848
(32) 2011.04.05
(33) US
(86) PCT/US2012/032086
(87) WO 2012/138703 2012.10.11
(71) Заявитель: АТЕНИКС КОРП. (US)
(72) Изобретатель:
Лехтинен Дуэйн, Дисэй Налини Манодж, Хайнрихс Фолькер (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение предлагает композиции и способы, придающие пестицидную активность бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семенам. Последовательности, кодирующие токсины, можно использовать в составе конструкций ДНК или экспрессионных кассет для экспрессии в растениях и бактериях. Композиции также включают в себя трансформированные бактерии, растения, растительные клетки, ткани и семена. В частности, изобретение предлагает поли-нуклеотидные последовательности и кодируемые ими токсичные белки. Изобретение также предлагает антитела, способные специфически связываться с указанными аминокислотными последовательностями. В частности, изобретение охватывает полинуклеотидные последовательности, кодирующие гибридные белки, а также их биологически активные варианты и фрагменты, где гибридный белок содержит С-концевой фрагмент SEQ ID I N0:43. Гибридный белок также может содержать | N-концевой фрагмент SEQ ID N0:45. Изобретение также включает в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID N0:47 и 1-14 или нуклеотид-ную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID N0:48 и 15-31, в том числе ее биологически активные варианты и фрагменты.
2420-510022ЕА/052 ВАРИАНТ ИНСЕКТИЦИДНОГО ГЕНА AXMI115 И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США № 61/471848, поданной 5 апреля 2011 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте.
Ссылка на список последовательностей, представленный в электронном виде
Официальная копия списка последовательностей представлена в электронном виде через EFS-Web как ASCII-отформатированный список последовательностей в виде файла под названием "2916693-093977-SEQLIST.txt", созданного 2 апреля 2012 года и имеющего размер 241 килобайт, который подается одновременно с настоящим описанием. Список последовательностей, содержащийся в данном ASCII-отформатированном документе, является частью описания и полностью включен в него в качестве ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Изобретение предлагает новые гены, которые кодируют пестицидные белки. Указанные белки и кодирующие их нуклеотидные последовательности можно использовать для получения пестицидных композиций и трансгенных растений, устойчивых к вредителям.
Уровень техники изобретения
Bacillus thuringiensis представляет собой грам-
положительную спорообразующую почвенную бактерию,
характеризующуюся способностью продуцировать кристаллические
включения, которые являются особо токсичными для некоторых
отрядов и видов насекомых и безвредными для растений и других
организмов, не являющихся мишенями. Поэтому композиции,
содержащие штаммы Bacillus thuringiensis или их инсектицидные
белки, можно использовать в качестве приемлемых для окружающей
среды инсектицидов для подавления насекомых-
сельскохозяйственных вредителей или насекомых, переносящих разные заболевания человека или животных.
Кристаллические (Cry) белки (дельта-эндотоксины) Bacillus
thuringiensis обладают высокой инсектицидной активностью, в основном по отношению к личинкам чешуекрылых, полужесткокрылых, двукрылых и жесткокрылых. Указанные белки также обладают активностью против отрядов вредителей Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga и Acari, а также отрядов других беспозвоночных, таких как Nemathelminthes, Platyhelminthes и Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.). Активность кристаллического белка не проявляется до проглатывания белка насекомым и его солюбилизации в средней кишке насекомого. Проглоченный протоксин гидролизуется под действием протеаз в пищеварительном тракте насекомого с образованием активной токсичной молекулы. (Hofte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Указанный токсин связывается с апикальными рецепторами щеточной каймы в средней кишке личинки-мишени и внедряется в апикальную мембрану, создавая ионные каналы или поры, приводящие к гибели личинки.
Помимо эндотоксинов В. thuringiensis также продуцирует секретируемые инсектицидные белки на протяжении вегетативной стадии роста, а именно, вегетативные инсектицидные белки (Vip). После открытия первого токсина Vip в В. thuringiensis были идентифицированы две основные группы токсинов Vip. Одна группа токсинов Vip состоит из бинарных токсинов, содержащих два компонента, Vipl и Vip2 (Warren (1997) In N. В. Carozzi and M. G. Koziel (ed.), Advances in insect control: the role of transgenic plants. Taylor & Francis, London, United Kingdom). Сочетание Vipl и Vip2 обладает высокой инсектицидной активностью в отношении сельскохозяйственно важного насекомого, западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera), но не проявляет никакой инсектицидной активности в отношении каких-либо насекомых чешуекрылые (Han et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6:932-936) . Другая группа состоит из токсинов Vip3, последовательности которых не обладают подобием по отношению к последовательностям Vipl или Vip2. Идентифицированный первым токсин Vip3, Vip3Aal, обладает высокой инсектицидной
активностью в отношении нескольких основных вредителей кукурузы и хлопка, относящихся к чешуекрылым, которые включают в себя совку травяную Spodoptera frugiperda и совку хлопковую Helicoverpa zea, но не проявляет активности в отношении мотылька кукурузного Ostrinia nubilalis, основного вредителя кукурузы (Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5389-5394). Удаление гена vip3Aal из штамма В. thuringiensis приводит к значительному уменьшению инсектицидной активности штамма В. thuringiensis, позволяя предположить, что Vip3 вносит вклад в общую токсичность штаммов В. thuringiensis (Donovan et al. (2001) J. Invertebr. Pathol. 78:45-51) . Также обнаружено, что Vip3Aal убивает насекомого посредством лизиса клеток средней кишки (Yu et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:532-536) в результате образования пор в клеточной мембране (Lee et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:4 64 8-4 657).
Интенсивное применение инсектицидов на основе В. thuringiensis уже привело к развитию устойчивости в полевых популяциях моли капустной, Plutella xylostella (Ferre and Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533). Наиболее распространенный механизм устойчивости включает в себя снижение связывания токсина со специфическим рецептором (рецепторами) средней кишки. Такой механизм также может приводить к развитию устойчивости к другим токсинам, имеющим этот же рецептор (Ferre and Van Rie (2002)).
Сущность изобретения
Изобретение предлагает композиции и способы, придающие пестицидную активность бактериям, растениям, растительным клеткам, тканям и семянам. Композиции включают в себя молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие последовательности пестицидных и инсектицидных полипептидов, векторы, содержащие указанные молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы. Композиции также включают в себя последовательности пестицидных полипептидов и антитела к указанным полипептидам. Нуклеотидные последовательности можно использовать в составе конструкций ДНК или экспрессионных кассет для трансформации организмов, включающих в себя микроорганизмы и растения, и
экспрессии в указанных организмах. Нуклеотидные или аминокислотные последовательности могут представлять собой синтетические последовательности, сконструированные для экспрессии в организме, включающем в себя, без ограничения, микроорганизм или растение. Композиции также могут включать в себя бактерии, растения, клетки, ткани и семена растений, содержащие нуклеотидную последовательность настоящего изобретения.
В частности, изобретение предлагает выделенные молекулы
нуклеиновых кислот, которые кодируют пестицидный белок. Кроме
того, изобретение охватывает аминокислотные последовательности,
соответствующие пестицидному белку. В частности, настоящее
изобретение предлагает выделенную или рекомбинантную молекулу
нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную
последовательность, кодирующую гибридный белок, а также ее биологически активные варианты и фрагменты, где гибридный белок содержит С-концевой фрагмент SEQ ID N0:43. В других воплощениях гибридный белок содержит N-концевой фрагмент SEQ ID N0:45. В конкретных воплощениях молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения (а также векторы, клетки-хозяева, растения и семена, содержащие указанную молекулу нуклеиновой кислоты) содержит нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID N0:47 и 1-14, или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID N0:48 и 15-31, в том числе ее биологически активные варианты и фрагменты. В объем настоящего изобретения также входят нуклеотидные последовательности, комплементарные нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, или способные гибридизоваться с последовательностью настоящего изобретения, а также комплементарные им последовательности. Выделенные или рекомбинантные гибридные белки, кодируемые молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, также входят в объем настоящего описания.
Изобретение предлагает способы получения полипептидов настоящего изобретения и применения указанных полипептидов для подавления или уничтожения вредителя отряда чешуекрылых,
полужесткокрылых, жесткокрылых, нематод или двукрылых. Изобретение также включает в себя способы и наборы, позволяющие детектировать нуклеиновые кислоты и полипептиды настоящего изобретения в образце.
Композиции и способы настоящего изобретения можно использовать для получения организмов с повышенной устойчивостью или толерантностью к вредителям. В сельском хозяйстве существует потребность в указанных организмах и содержащих их композициях. Композиции настоящего изобретения можно использовать для получения измененных или усовершенствованных белков, обладающих пестицидной активностью, или для детекции присутствия пестицидных белков или нуклеиновых кислот в продуктах или организмах.
Краткое описание рисунков
На фиг.1 показана диаграмма гибридных конструкций.
На фиг.2 показаны результаты биоанализа листового диска in vitro. pAG6585 содержит optAxmill5v01 (N=14), a pAG6141 содержит optAxmill5v02.01.01 (N=8).
Подробное описание
Настоящее изобретение относится к композициям и способам, позволяющим регулировать устойчивость или толерантность организмов, в частности растений или растительных клеток, к вредителям. Термин "устойчивость" означает, что вредитель (например насекомое) уничтожается при проглатывании или при другом контакте с полипептидами настоящего изобретения. Термин "толерантность" означает, что организм способен ухудшать или снижать двигательные, пищевые, репродуктивные или другие функции вредителя. Способы включают в себя трансформацию организмов нуклеотидной последовательностью, кодирующей пестицидный белок настоящего изобретения. В частности, нуклеотидные последовательности настоящего изобретения можно использовать для получения растений и микроорганизмов, обладающих пестицидной активностью. Таким образом, изобретение предлагает трансформированные бактерии, растения, клетки, ткани и семена растений. Композиции включают в себя пестицидные нуклеиновые кислоты и белки Bacillus или других видов.
Последовательности можно использовать для конструирования экспрессионных векторов с целью их последующего применения для трансформации представляющих интерес организмов, в качестве зондов для выделения других гомологичных (или частично гомологичных) генов, и для получения измененных пестицидных белков с помощью известных в данной области способов, таких как перестановка доменов или перестановка в ДНК, например, с использованием членов семейств токсинов Vipl, Vip2 или Vip3. Указанные белки можно использовать для подавления или уничтожения популяций вредителей отрядов чешуекрылых, полужесткокрылых, жесткокрылых, двукрылых и нематод, а также для получения композиций, обладающих пестицидной активностью.
Термин "пестицидный токсин" или "пестицидный белок"
относится к токсину, который обладает токсической активностью в
отношении одного или нескольких вредителей, включающих в себя,
без ограничения, членов отрядов Lepidoptera, Diptera и
Coleoptera или типа Nematoda, или к белку, гомологичному такому
токсину. Пестицидные белки были выделены из таких организмов,
как, например, Bacillus sp., Clostridium bifermentans и
Paenibacillus popilliae. Пестицидные белки включают в себя
аминокислотные последовательности, полученные с использованием
раскрытых здесь полноразмерных нуклеотидных
последовательностей, и аминокислотные последовательности, более короткие, чем полноразмерные последовательности, полученные либо путем использования альтернативного старт-кодона, находящегося ниже по ходу считывания, либо в результате процессинга, который приводит к образованию более короткого белка, обладающего пестицидной активностью. Процессинг может протекать в организме, в котором экспрессируется белок, или в организме вредителя после проглатывания белка.
Таким образом, настоящее изобретение предлагает новые выделенные или рекомбинантные нуклеотидные последовательности, которые придают пестицидную активность. Указанные нуклеотидные последовательности кодируют полипептиды, гомологичные известным токсинам. Изобретение также предлагает аминокислотные последовательности пестицидных белков. Белок, образующийся в
результате трансляции данного гена, позволяет клеткам подавлять или уничтожать вредителей, проглатывающих его.
Выделенные молекулы нуклеиновых кислот, их варианты и фрагменты
Один аспект настоящего изобретения относится к выделенным или рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие пестицидные белки и полипептиды, или их биологически активные фрагменты, а также к молекулам нуклеиновых кислот, достаточным для применения в качестве гибридизационных зондов для идентификации молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белки с участками, обладающими гомологией последовательностей. Кроме того, в объем настоящего изобретения также входят нуклеотидные последовательности, способные гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями настоящего изобретения в жестких условиях, как описано в данном документе. В настоящем описании термин "молекула нуклеиновой кислоты" включает в себя молекулы ДНК (например рекомбинантной ДНК, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например мРНК), а также аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, однако предпочтительно она представляет собой двухцепочечную ДНК.
Термин "выделенная" или "рекомбинантная" нуклеотидная последовательность (или ДНК) в данном описании относится к нуклеотидной последовательности (или ДНК), которая находится не в своей природной среде, а, например, in vitro или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине. В некоторых воплощениях выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота не содержит последовательности (предпочтительно последовательности, кодирующие белок), которые в природе фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательности, расположенные на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты), входящую в состав геномной ДНК организма, из которого получают нуклеиновую кислоту. В целях настоящего изобретения термин "выделенный", используемый в применении к молекулам нуклеиновых кислот, не включает в себя выделенные хромосомы. Например, в
разных воплощениях выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая дельта-эндотоксин, может содержать нуклеотидные последовательности размером менее чем примерно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 т.о., которые в природе фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получают нуклеиновую кислоту. В разных воплощениях белок дельта-эндотоксин, который практически не содержит клеточного вещества, включает в себя препараты белка, содержащие менее чем примерно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухой массе) отличного от дельта-эндотоксина белка (также называемого здесь "загрязняющий белок").
Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки
настоящего изобретения, включают в себя последовательность,
описанную в SEQ ID N0:47 и 1-14, а также ее варианты, фрагменты
и комплементарные ей последовательности. Термин
"комплементарная последовательность" относится к нуклеотидной
последовательности, комплементарной конкретной нуклеотидной
последовательности в степени, достаточной для того, чтобы она
могла гибридизоваться с указанной нуклеотидной
последовательностью с образование стабильного дуплекса. Аминокислотные последовательности, соответствующие пестицидным белкам, кодируемым указанным нуклеотидным последовательностям, описаны в SEQ ID N0:48 и 15-31.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые представляют собой фрагменты указанных нуклеотидных последовательностей, кодирующих пестицидные белки, также входят в объем настоящего изобретения. Под "фрагментом" подразумевается часть нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок. Фрагмент нуклеотидной последовательности может кодировать биологически активный фрагмент пестицидного белка, или он может представлять собой фрагмент, который можно использовать в качестве гибридизационного зонда или праймера ПЦР с помощью описанных ниже способов. Число смежных нуклеотидов, входящих в состав молекул нуклеиновых кислот, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, составляет, по меньшей мере, примерно 50,
100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200,
1300, 1350, 1400 и до числа нуклеотидов, присутствующих в
полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей
раскрытый здесь пестицидный белок, в зависимости от
предполагаемого применения. Под "смежными" нуклеотидами
подразумеваются нуклеотидные остатки, которые непосредственно
примыкают друг к другу. Фрагменты нуклеотидных
последовательностей настоящего изобретения кодируют белковые
фрагменты, которые сохраняют биологическую активность
пестицидного белка и, следовательно, сохраняют пестицидную
активность. Таким образом, изобретение также охватывает
биологически активные фрагменты раскрытых здесь полипептидов.
Под термином "сохраняет активность" подразумевается, что
активность фрагмента составляет, по меньшей мере, примерно 30%,
по меньшей мере, примерно 50%, по меньшей мере, примерно 7 0%,
80%, 90%, 95% или более от пестицидной активности пестицидного
белка. В разных воплощениях активность можно улучшить или
повысить по сравнению с активностью исходного пестицидного
белка (например, улучшить или повысить по сравнению с
активностью SEQ ID N0:43 или 45), как указано в данном
описании. В одном воплощении пестицидная активность направлена
на жесткокрылых. В другом воплощении пестицидная активность
направлена на чешуекрылых. В другом воплощении пестицидная
активность направлена на нематод. В другом воплощении
пестицидная активность направлена на двукрылых. В другом
воплощении пестицидная активность направлена на
полужесткокрылых. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. Смотрите, например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252: 199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США № 5743477, включенные в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте.
Фрагмент нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок, который кодирует биологически активный фрагмент белка настоящего изобретения, кодирует, по меньшей
мере, примерно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 и до полного числа смежных аминокислот, присутствующих в полноразмерном пестицидном белке настоящего изобретения. В некоторых воплощениях фрагмент получают в результате протеолитического расщепления. Например, фрагмент, полученный в результате протеолитического расщепления, может быть укорочен по N-концу или С-концу, по меньшей мере, примерно на 100 аминокислот, примерно на 12 0, примерно на 130, примерно на 14 0, примерно на 150 или примерно на 160 аминокислот по сравнению с SEQ ID N0:48 и 15-31. В некоторых воплощениях фрагменты, входящие в объем настоящего изобретения, получают в результате удаления С-концевого домена кристаллизации, например, путем протеолиза или путем вставки стоп-кодона в кодирующую последовательность. В других воплощениях гибридный белок содержит фрагмент С-концевого домена SEQ ID N0:43 и/или фрагмент N-концевого домена SEQ ID N0:45.
Предпочтительные пестицидные белки настоящего изобретения кодируются нуклеотидной последовательностью, в достаточной степени идентичной нуклеотидным последовательностям SEQ ID N0:47 и 1-14, или пестицидные белки в достаточной степени идентичны аминокислотным последовательностям, описанным в SEQ ID N0:48 и 15-31. В другом воплощении нуклеотидная последовательность кодирует гибридный белок, в котором N-концевой фрагмент в достаточной степени идентичен N-концевому фрагменту SEQ ID N0:45, или N-концевой фрагмент в достаточной степени идентичен N-концевому фрагменту SEQ ID N0:45, а С-концевой фрагмент в достаточной степени идентичен SEQ ID N0:43. Термин "в достаточной степени идентичен" означает, что аминокислотная или нуклеотидная последовательность, по меньшей мере, примерно на 60% или 65%, примерно на 7 0% или 7 5%, примерно на 8 0% или 8 5%, примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более процентов идентична исходной последовательности по результатам, полученным с помощью одной из описанных здесь программ выравнивания с использованием стандартных параметров. Специалисту в данной области известно, что указанные значения можно соответственным образом подгонять,
чтобы определить соответствующую идентичность белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, с учетом вырожденности кодонов, подобия аминокислот, расположения рамки считывания и т.п.
Чтобы определить процент идентичности двух аминокислотных
последовательностей или двух нуклеиновых кислот,
последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения.
Процент идентичности двух последовательностей является функцией
от числа идентичных положений в последовательностях (т.е.
процент идентичности = число идентичных положений/общее число
положений (например перекрывающихся положений)* 100) . В одном
воплощении две последовательности имеют одинаковую длину. В
другом воплощении процент идентичности рассчитывают на всем
протяжении исходной последовательности (т.е.
последовательности, раскрытой здесь как одна из SEQ ID NO: 131, 47 или 48) . Процент идентичности двух последовательностей можно определить с помощью методов, подобных описанным ниже, в присутствии или в отсутствие разрешенных пробелов. При расчете процента идентичности, как правило, считают точные совпадения. Пробел, т.е. положение, в котором при выравнивании в одной последовательности остаток присутствует, а в другой отсутствует, относят к положениям с неидентичными остатками.
Определение процента идентичности двух последовательностей
можно проводить с помощью математического алгоритма.
Неограничивающим примером математического алгоритма,
используемого для сравнения двух последовательностей является
алгоритм Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:2264, модифицированный в Karlin and Altschul (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Такой алгоритм используется
в программах BLASTN и BLASTX Altschul et al. (1990) J. Mol.
Biol. 215:403. Нуклеотидный поиск в BLAST можно проводить с
использованием программы BLASTN, сумма баллов равна 100, длина
слова равна 12, с определением нуклеотидных
последовательностей, гомологичных пестицид-подобным молекулам нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Белковый поиск в BLAST можно проводить с использованием программы BLASTX, сумма
баллов равна 50, длина слова равна 3, с определением аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам пестицидных белков настоящего изобретения. Для выравнивания с использованием пробелов, в целях сравнения можно использовать Gapped BLAST (в BLAST 2.0), как описано в Altschul et al.
(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Альтернативно PSI-Blast можно использовать для проведения итеративного поиска, который позволяет детектировать дистанционные взаимоотношения между молекулами. Смотрите Altschul et al. (1997), выше. При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast, в соответствующих программах (например BLASTX и BLASTN) можно использовать параметры по умолчанию. Выравнивание также можно проводить вручную путем осмотра.
Другим неограничивающим примером математического
алгоритма, используемого для сравнения последовательностей,
является алгоритм ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids
Res. 22:4673-4680). ClustalW позволяет сравнивать и выравнивать
аминокислотные последовательности и последовательности ДНК по
всей длине, и следовательно, с помощью данного алгоритма можно
получать данные о консервативности всей аминокислотной
последовательности. Алгоритм ClustalW используют в некоторых
коммерчески доступных пакетах программ для анализа
ДНК/аминокислот, таких как модуль ALIGNX пакета программ Вектор
NTI (Invitrogen Corporation, Carlsbad, СА) . После выравнивания
аминокислотных последовательностей с помощью ClustalW, можно
определить процент аминокислотной идентичности.
Неограничивающим примером программного обеспечения,
используемого для анализа выравниваний, проведенных с помощью ClustalW, является GENEDOC(tm). GENEDOC(tm) (Karl Nicholas) позволяет оценивать подобие аминокислотных последовательностей
(или последовательностей ДНК) и степень идентичности для нескольких белков. Другим неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN
(версия 2.0), которая является частью пакета программ GCG
Wisconsin Genetics, версия 10 (поставляемого Accelrys, Inc.,
9685 Scranton Rd. , San Diego, CA, USA) . При использовании
программы ALIGN для сравнения аминокислотных
последовательностей, можно использовать таблицу масс остатков РАМ120, штраф за удлинение пробела 12 и штраф за пробел 4.
Если не указано иначе, при определении идентичности или
подобия последовательностей с помощью GAP, версия 10, в которой
используется алгоритм Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol.
48(3) :443-453, используют следующие параметры: для определения
% идентичности и % подобия нуклеотидных последовательностей
используют вес пробела 50, вес длины 3 и матрицу замен
nwsgapdna.cmp; для определения % идентичности и % подобия
аминокислотных последовательностей используют вес пробела 8,
вес длины 2 и матрицу замен BLOSUM62. Также можно использовать
эквивалентные программы. Под "эквивалентной программой"
подразумевается любая программа для сравнения
последовательностей, которая для любых двух анализируемых последовательностей дает такое же число совпадений нуклеотидных остатков и такой же процент идентичности последовательностей, как соответствующее выравнивание, выполненное при помощи программы GAP, версия 10.
Изобретение также охватывает вариантные молекулы
нуклеиновых кислот. "Варианты" нуклеотидных
последовательностей, кодирующих пестицидные белки, включают в себя последовательности, которые кодируют раскрытые здесь пестицидные белки, но имеют консервативные отличия вследствие вырожденности генетического кода, а также последовательности, обладающие достаточной степенью идентичности по отношению к исходным последовательностям, как описано выше. Встречающиеся в природе аллельные варианты можно идентифицировать с помощью хорошо известных методов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методы гибридизации, описанные ниже. Вариантные нуклеотидные последовательности также включают в себя синтетические нуклеотидные последовательности, полученные, например, путем сайт-направленного мутагенеза, которые сохраняют способность
кодировать пестицидные белки, раскрытые в настоящем изобретении, как описано ниже. Вариантные белки, входящие в объем настоящего изобретения, являются биологически активными, то есть они сохраняют желательную биологическую активность нативного белка, то есть пестицидную активность. Термин "сохраняет активность" означает, что активность варианта составляет, по меньшей мере, примерно 30%, по меньшей мере, примерно 50%, по меньшей мере, примерно 7 0% или, по меньшей мере, примерно 80% от пестицидной активности нативного белка. В некоторых воплощениях активность улучшается или увеличивается по сравнению с исходным белком, как указано в данном описании. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. Смотрите, например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252: 199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США № 5743477, включенные в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте.
Опытным специалистам также известно, что изменения можно ввести путем введения в нуклеотидные последовательности настоящего изобретения мутаций, приводящих к изменениям аминокислотной последовательности кодируемых пестицидных белков, без изменения биологической активности белков. Таким образом, вариантные выделенные молекулы нуклеиновых кислот можно получить путем введения одной или нескольких мутаций, включающих в себя нуклеотидные замены, добавления и делеции, в соответствующую нуклеотидную последовательность, раскрытую в настоящем описании, что приводит к введению в кодируемый белок одной или нескольких замен, добавлений или делеций. Мутации можно ввести с помощью стандартных методов, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие вариантные нуклеотидные последовательности также входят в объем настоящего изобретения.
Например, консервативные аминокислотные замены можно
осуществить по одному или нескольким вычисленным
неэссенциальным аминокислотным остаткам. "Неэссенциальный"
аминокислотный остаток представляет собой остаток
последовательности пестицидного белка дикого типа, который можно изменить, не оказывая влияния на биологическую активность, тогда как "эссенциальный" аминокислотный остаток необходим для проявления биологической активности. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену аминокислотного остатка другим остатком, содержащим подобную боковую цепь. В данной области известны семейства аминокислотных остатков, содержащих подобные боковые цепи. Указанные семейства включают в себя аминокислоты, содержащие основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Аминокислотные замены можно осуществить в неконсервативных участках, которые отвечают за функционирование белка. Как правило, такие замены не проводят по консервативным аминокислотным остаткам или по аминокислотным остаткам, присутствующим в консервативном мотиве, где такие остатки необходимы для проявления активности белка. Примеры остатков, которые являются консервативными и которые могут быть необходимыми для проявления активности белка, включают в себя, например, остатки, которые являются одинаковыми у всех белков, участвующих в выравнивании токсинов, подобных или родственных последовательностям настоящего изобретения (например, остатки, которые являются одинаковыми при выравнивании гомологичных белков). Примеры остатков, которые являются консервативными, но по которым можно проводить консервативные аминокислотные замены с сохранением активности, включают в себя, например, остатки, отличающиеся только консервативными заменами среди всех белков, участвующих в выравнивании токсинов, подобных или родственных последовательностям настоящего изобретения (например, остатки,
которые отличаются только консервативными заменами среди всех белков, участвующих в выравнивании гомологичных белков). Однако специалисту в данной области известно, что функциональные варианты могут содержать минорные консервативные или неконсервативные изменения в консервативных остатках.
Альтернативно вариантные нуклеотидные последовательности можно получить путем введения мутаций случайным образом по всей длине кодирующей последовательности или в ее части, например, путем насыщающего мутагенеза, после чего полученные мутанты можно подвергнуть скринингу на способность придавать пестицидную активность, чтобы идентифицировать мутанты, сохранившие активность. После проведения мутагенеза кодируемый белок можно экспрессировать рекомбинантными способами, а активность белка можно определить с помощью стандартных аналитических способов.
С помощью таких методов, как ПЦР, гибридизация и т.п.
можно идентифицировать соответствующие пестицидные
последовательности, в значительной степени идентичные последовательностям настоящего изобретения. Смотрите, например, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) and Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).
Метод гибридизации включает в себя применение полноразмерной пестицидной нуклеотидной последовательности, или ее части, для скрининга библиотек кДНК или геномных библиотек. Способы конструирования таких библиотек кДНК и геномных библиотек, широко известные в данной области, раскрыты в Sambrook and Russell, 2001, выше. Так называемые гибридизационные зонды могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и могут содержать в качестве метки детектируемую группу, такую как 32Р или любой другой детектируемый маркер, такой как другой радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Зонды для гибридизации можно получить путем мечения синтетических
олигонуклеотидов, в основе которых лежат раскрытые здесь нуклеотидные последовательности, кодирующие пестицидные белки. Кроме того, можно использовать вырожденные праймеры, сконструированные с учетом консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые могут входить в состав нуклеотидной последовательности или кодируемой ею аминокислотной последовательности. Как правило, зонд содержит участок нуклеотидной последовательности, который гибридизуется в жестких условиях, по меньшей мере, примерно с 12, по меньшей мере, примерно с 25, по меньшей мере, примерно с 50, 75, 100, 125, 150, 175 или 200 последовательными нуклеотидами нуклеотидной последовательности, кодирующей пестицидный белок настоящего изобретения, или ее фрагмента или варианта. Способы получения зондов для гибридизации широко известны в данной области и описаны в Sambrook and Russell, 2001, выше, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
Например, в качестве зонда, способного специфически гибридизоваться с соответствующими пестицидный белок-подобными последовательностями и матричными РНК, можно использовать раскрытую здесь полноразмерную пестицидную последовательность, или один или несколько ее фрагментов. Чтобы обеспечить специфическую гибридизацию в разных условиях, такие зонды содержат уникальные последовательности, длина которых составляет предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10 нуклеотидов или, по меньшей мере, примерно 2 0 нуклеотидов. Такие зонды можно использовать для амплификации соответствующих пестицидных последовательностей из выбранного организма методом ПЦР. Данный метод можно использовать для выделения других кодирующих последовательностей из желательного организма, а также в качестве диагностического средства для определения присутствия кодирующей последовательности в организме. Гибридизационные методы включают в себя гибридизационный скрининг высеянных на чашки библиотек ДНК (в виде бляшек или колоний; смотрите, например, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Таким образом, настоящее изобретение охватывает зонды для гибридизации, а также нуклеотидные последовательности, способные гибридизоваться с полноразмерной нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, или ее фрагментом
(например, содержащим, по меньшей мере, примерно 300 нуклеотидов, по меньшей мере, примерно 4 00, по меньшей мере, примерно 500, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 нуклеотидов, или число нуклеотидов, составляющее раскрытую здесь полноразмерную нуклеотидную последовательность). Гибридизацию таких последовательностей можно проводить в жестких условиях. Под "жесткими условиями" или "жесткими условиями гибридизации" подразумеваются условия, в которых зонд гибридизуется с последовательностью-мишенью в заметно большей степени, чем с другими последовательностями (например, в степени, по меньшей мере, в 2 раза превосходящей уровень фона). Жесткие условия являются последовательность-зависимыми и различаются в разных случаях. Варьируя жесткость условий гибридизации и/или промывания можно идентифицировать последовательности-мишени, которые на 100% комплементарны зонду
(гомологичное зондирование). Альтернативно, жесткость условий можно варьировать, допуская некоторые несовпадения в последовательностях, чтобы детектировать более низкую степень подобия (гетерологичное зондирование). Обычно длина зонда составляет менее чем примерно 1000 нуклеотидов, предпочтительно менее чем примерно 500 нуклеотидов.
Как правило, жесткие условия включают в себя концентрацию соли менее чем примерно 1,5 М иона Na, обычно концентрация иона Na (или другой соли) составляет от 0,01 до 1,0 М при рН от 7,0 до 8,3 и температуре, составляющей, по меньшей мере, примерно 30 °С для коротких зондов (например, содержащих от 10 до 50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, примерно 60°С для длинных зондов (например, содержащих более 50 нуклеотидов). Жестких условий можно достичь путем добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Типичные условия низкой жесткости включают в себя гибридизацию с использованием буферного раствора, содержащего от 30 до 35% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS
(додецилсульфат натрия), при 37°С, и промывание с использованием lx-2x SSC (20х SSC = 3,0 М NaCl/0,3 М тринатрия цитрат) при 50-55°С. Типичные условия средней жесткости включают в себя гибридизацию с использованием 40-45% формамида, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37°С, и промывание с использованием 0,5x-lx SSC при 55-бО°С. Типичные условия высокой жесткости включают в себя гибридизацию с использованием 50% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS при 37°С, и промывание с использованием 0,1х SSC при бО-б5°С. Буферы для промывания могут необязательно содержать примерно от 0,1% до 1% SDS. Продолжительность гибридизации, как правило, составляет менее чем примерно 2 4 часа, обычно от примерно 4 до примерно 12 часов.
Специфичность обычно зависит от условий промывания после
гибридизации, ключевыми факторами которых являются ионная сила
и температура раствора для конечного промывания. Для гибридов
ДНК-ДНК Тпл можно приблизительно определить из уравнения
Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284:
Тпл=81,5°C+16,6(log M)+0,41(%GC)-0,61(% форм.)-500/л; где M
обозначает молярность моновалентных катионов, %GC обозначает
процентное содержание нуклеотидов гуанозина и цитозина в ДНК, %
форм, обозначает процентное содержание формамида в растворе для
гибридизации, a L обозначает длину гибрида в парах оснований.
Тпл представляет собой температуру (при определенных значениях
ионной силы и рН), при которой 50% молекул комплементарной
последовательности-мишени гибридизуется с точно совпадающим
зондом. Тпл уменьшается примерно на 1°С для каждого 1%
несовпадений; следовательно, ТПЛ/ условия гибридизации и/или
промывания можно регулировать, чтобы обеспечить гибридизацию с
последовательностью, обладающей желательной степенью
идентичности. Например, если проводят поиск по
последовательностям с идентичностью больше 90%, Тпл можно уменьшить на 10°С. Как правило, для конкретной последовательности и комплементарной ей последовательности выбирают жесткие условия, включающие в себя снижение температуры примерно на 5°С по сравнению с термальной точкой плавления (Тпл) , при определенных значениях ионной силы и рН.
Однако очень жесткие условия могут включать в себя проведение гибридизации и/или промывания при температуре на 1, 2, 3 или 4°С ниже, чем термальная точка плавления (Тпл) ; умеренно жесткие условия могут включать в себя проведение гибридизации и/или промывания при температуре на б, 7, 8, 9 или 10°С ниже, чем термальная точка плавления (Тпл) ; условия низкой жесткости могут включать в себя проведение гибридизации и/или промывания при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 2 0°С ниже, чем термальная точка плавления (Тпл) . Для рядовых специалистов в данной области очевидно, что в описание уравнений, композиций, используемых для гибридизации и промывания, и желательной Тпл, включены вариации по жесткости растворов для гибридизации и/или промывания. Если желательная степень несовпадений приводит к снижению Тпл до значения менее чем 45°С (водный раствор), или 32°С (раствор формамида), предпочтительно увеличить концентрацию SSC так, чтобы можно было использовать более высокую температуру. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2
(Elsevier, New York); и Ausubel et al, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) . Смотрите Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Выделенные белки, а также их варианты и фрагменты Пестицидные белки также входят в объем настоящего изобретения. Термин "пестицидный белок" относится к белку, содержащему аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID N0:48 и 15-31. Кроме того, изобретение предлагает фрагменты, биологически активные участки и их варианты, которые можно использовать при осуществлении способов настоящего изобретения. Термин "выделенный белок" или "рекомбинантный белок" используют для обозначения белка, который находится не в своей природной среде, а, например, in vitro или в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине.
Термин "фрагменты" или "биологически активные фрагменты" относится к полипептидным фрагментам, содержащим аминокислотные последовательности, в достаточной степени идентичные аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID N0:48 и 15-31, и обладающие пестицидной активностью. Биологически активный фрагмент пестицидного белка может представлять собой полипептид, длина которого составляет, например, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 или более аминокислот. Такие биологически активные фрагменты можно получить с помощью рекомбинантных методов и подвергнуть анализу на пестицидную активность. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. Смотрите, например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США № 5743477, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте. В соответствии с настоящим описанием фрагмент содержит, по меньшей мере, 8 смежных аминокислот SEQ ID N0:48 и 15-31. Однако изобретение охватывает и другие фрагменты, например, любые фрагменты белка, длина которых превышает примерно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 или более аминокислот.
Термин "варианты" относится к белкам или полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 60%, 65%, примерно на 7 0%, 7 5%, примерно на 80%, 85%, примерно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31. Варианты также включают в себя полипептиды, кодируемые молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID N0:47 и 1-14, или с комплементарной ей последовательностью в жестких условиях. Варианты включают в себя полипептиды, которые отличаются по аминокислотной
последовательности вследствие мутагенеза. Вариантные белки, входящие в объем настоящего изобретения, являются биологически активными, то есть они продолжают проявлять желательную биологическую активность нативного белка, то есть сохраняют пестицидную активность. В некоторых воплощениях варианты обладают улучшенной активность по сравнению с нативным белком. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. Смотрите, например, Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252: 199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США № 5743477, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки во всей полноте.
Бактериальные гены, такие как гены axmi настоящего изобретения, очень часто содержат несколько метиониновых инициирующих кодонов в непосредственной близости к старт-кодону открытой рамки считывания. Зачастую инициация трансляции по одному или нескольким из указанных старт-кодонов приводит к образованию функционального белка. Указанные старт-кодоны могут включать в себя кодоны ATG. Однако бактерии, такие как Bacillus sp., также распознают кодон GTG как старт-кодон, а белки, которые инициируют трансляцию по кодонам GTG, содержат метионин в первом аминокислотном положении. В редких случаях трансляция в бактериальных системах может инициироваться по кодону TTG, хотя в данном событии TTG кодирует метионин. Кроме того, часто заранее определяют, какой из указанных кодонов используется бактерией в природе. Таким образом, следует понимать, что применение одного из дополнительных метиониновых кодонов также может привести к образованию пестицидных белков. Указанные пестицидные белки входят в объем настоящего изобретения и могут использоваться в способах настоящего изобретения. Следует понимать, что при экспрессии в растениях для соответствующей трансляции нужно изменить дополнительный старт-кодон на ATG.
В объем изобретения также входят антитела против полипептидов настоящего изобретения или их вариантов или фрагментов. Способы получения антител хорошо известны в данной области (смотрите, например, Harlow and Lane (1988) Antibodies:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; патент США № 4196265).
Измененные или усовершенствованные варианты Известно, что последовательности ДНК, кодирующие пестицидный белок, можно изменить с помощью разных методов, и что указанные изменения могут привести к получению последовательностей ДНК, кодирующих белки, аминокислотные последовательности которых отличаются от последовательностей пестицидного белка настоящего изобретения. Указанный белок можно изменить разными способами, включающими в себя аминокислотные замены и делеции, а также удаления и вставки одной или нескольких аминокислот в SEQ ID N0:48 и 15-31, например, они включают в себя примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно б, примерно 7, примерно 8, примерно 9, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 25, примерно 30, примерно 35, примерно 40, примерно 45, примерно 50, примерно 55, примерно 60, примерно 65, примерно 70, примерно 75, примерно 80, примерно 85, примерно 90, примерно 100, примерно 105, примерно 110, примерно 115, примерно 12 0, примерно 12 5, примерно 130, примерно 135, примерно 14 0, примерно 14 5, примерно 150, примерно 155 или более аминокислотных замен, делеций или вставок на С-концевом фрагменте или на N-концевом фрагменте, или на том и другом. Способы проведения таких манипуляций широко известны в данной области. Например, варианты аминокислотной последовательности пестицидного белка можно получить путем введения мутаций в ДНК. Введение мутаций можно проводить с использованием одного из нескольких видов мутагенеза и/или в результате направленной эволюции. В некоторых аспектах кодируемые изменения аминокислотной последовательности не влияют на функцию белка. Такие варианты обладают желательной пестицидной активностью. Однако следует понимать, что способность пестицидного белка придавать пестицидную активность можно улучшить путем применения таких методов с использованием композиций данного изобретения. Например, пестицидный белок можно экспрессировать в клетке-хозяине, которая характеризуется высокой частотой
пропуска оснований в процессе репликации ДНК, такой как XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). После размножения таких штаммов можно выделить ДНК (например, путем получения плазмидной ДНК, или путем амплификации методом ПЦР и клонирования полученного фрагмента ПЦР в векторе), культивировать мутантные пестицидные белки в немутагенном штамме, и идентифицировать мутантные гены, характеризующиеся пестицидной активностью, например, путем проведения анализа с целью тестирования пестицидной активности. Как правило, белок смешивают и используют в пищевых анализах. Смотрите, например, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такие анализы могут включать в себя приведение растений в контакт с одним или несколькими вредителями и определение способности растения выживать и/или вызывать гибель вредителей. Примеры мутаций, которые приводят к повышению токсичности, можно найти в Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.
Альтернативно, изменения можно внести в последовательность
многих белков по амино- или карбокси-концу, не оказывая
существенного влияния на активность. Такие изменения можно
осуществить путем введения вставок, делеций или замен с помощью
современных молекулярных методов, таких как ПЦР, в том числе
ПЦР-амплификации, которые позволяют изменить или удлинить
белок-кодирующую последовательность посредством включения
последовательностей, кодирующих аминокислоты, в
олигонуклеотиды, используемые в ПЦР-амплификации.
Альтернативно, добавленные белковые последовательности могут
содержать полноразмерные белок-кодирующие последовательности,
такие как традиционно используемые в данной области для
получения гибридных белков. Такие гибридные белки часто
используют для (1) повышения экспрессии представляющего интерес
белка, (2) введения связывающего домена, ферментативной
активности или эпитопа для облегчения очистки белка, детекции
белка или других экспериментальных применений, известных в
данной области; (3) специфической секреции или трансляции белка
во внутриклеточной органелле, такой как периплазматическое
пространство грам-отрицательной бактерии, или
эндоплазматический ретикулум эукариотических клеток, причем в последнем часто происходит гликозилирование белка.
Вариантные нуклеотидные и аминокислотные
последовательности настоящего изобретения также включают в себя последовательности, полученные в результате мутагенных и рекомбиногенных процедур, таких как перестановка в ДНК. Такая процедура с использованием одного или нескольких участков, кодирующих пестицидные белки, позволяет получать новые пестицидные белки, обладающие желательными свойствами. В данном способе библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов получают из популяции полинуклеотидов с родственными последовательностями, которые содержат участки последовательностей, обладающих значительной степенью идентичности последовательностей, и могут подвергаться гомологичной рекомбинации in vitro или in vivo. Например, с помощью данного способа можно переставлять мотивы последовательностей, кодирующие представляющие интерес домены, которые находятся в пестицидном гене настоящего изобретения и в других известных пестицидных генах, с получением нового гена, кодирующего белок с улучшенным целевым свойством, таким как расширенная инсектицидная активность. Стратегии проведения таких перестановок в ДНК известны в данной области. Смотрите, например, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1074710751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291; и патенты США №№ 5605793 и 5837458.
Другим механизмом получения измененных пестицидных белков является обмен или перестановка доменов. Обмен доменами среди пестицидных белков может приводить к получению гибридных или химерных токсинов с улучшенной пестицидной активностью или целевым спектром. Способы получения рекомбинантных белков и их тестирования на пестицидную активность хорошо известны в данной области (смотрите, например, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67: 5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol.
Chem. 266: 17954-17958; Schnepf et al. (1990 Biol. Chem. 265: 20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 2918-2925).
Таким образом, в разных воплощениях настоящего изобретения
описанные здесь нуклеотидные последовательности (а также
композиции, векторы, клетки-хозяева, растения и семена,
содержащие указанные нуклеотидные последовательности) содержат
фрагмент одного или нескольких токсинов и фрагмент одного или
нескольких других токсинов. В одном воплощении нуклеотидная
последовательность включает в себя нуклеотидную
последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент Axmi005 (описанный в SEQ ID N0:45) и С-концевой фрагмент Axmill5 (описанный в SEQ ID N0:43). В конкретных воплощениях N-концевой фрагмент Axmi0 05 содержит аминокислотные остатки Axmi0 05 примерно от 1 до 173, или примерно от 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 до 150, 155, 160, 165,
170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 250, 300, 325 или 350, а С-концевой фрагмент Axmill5 содержит аминокислотные остатки Axmill5 примерно от 174 до 8 03, или примерно от 17 0,
171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 250, 300, 325 или 350 до 600, 650, 700, 750, 760, 770, 780, 790, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802 или 803. Специалисту в данной области известно, что в каждую аминокислотную последовательность можно внести минорные изменения и делеции с сохранением (или улучшением) активности гибридного белка. В некоторых воплощениях нуклеотидные последовательности настоящего изобретения кодируют гибридный белок Axmi005/Axmill5, содержащий мутацию (по сравнению с соответствующим участком исходного белка Axmi005 или Axmill5) по одному или нескольким положениям, соответствующим аминокислотным положениям 584, 58 8 и 771 последоватлеьности SEQ ID N0:43 (смотрите, например, вариантные гибридные последовательности, описанные в SEQ ID N0:18-22) . В других воплощениях нуклеотидная последовательность настоящего изобретения описана в одной из SEQ ID N0:47 и 1-14,
170,
а аминокислотную последовательность описана в одной из SEQ ID N0:48 и 15-31.
В разных воплощениях гибрид Axmi0 05 с Axmill5 содержит аминокислотную последовательность, обладающую улучшенной или расширенной активностью по сравнению с активностью отдельно взятого Axmi005 или Axmill5. Под "улучшенной" активностью подразумевается увеличение смертности, по меньшей мере, одного вредителя, или увеличение степени снижения роста, питания или нормального физиологического развития по сравнению с нативным белком. Под "расширенной" активностью подразумевается активность в отношении вредителя, которую не проявляют Axmi005 и Axmill5. Например, гибрид, содержащий фрагмент Axmi0 05 и фрагмент Axmill5, может представлять собой один белок, обладающий профилем активности, который включает в себя активность как Axmi005, так и Axmill5. В некоторых воплощениях гибридный белок обладает улучшенной активностью в отношении отдельного вредителя по сравнению с одним из Axmi005 и Axmill5, или обоими указанными белками.
Векторы
Пестицидную последовательность настоящего изобретения можно вставить в экспрессионную кассету с целью экспрессии в представляющем интерес растении. Под "растительной экспрессионной кассетой" подразумевается конструкция ДНК, способная обеспечивать экспрессию белка из открытой рамки считывания в растительной клетке. Как правило, такая конструкция содержит промотор и кодирующую последовательность. Обычно такие конструкции также содержат 3'-нетранслируемый участок. Такие конструкции могут содержать "сигнальную последовательность" или "лидерную последовательность", чтобы обеспечить совместную трансляцию или после трансляционный транспорт пептида в определенные внутриклеточные структуры, такие как хлоропласт (или другая пластида), эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи.
Под "сигнальной последовательностью" подразумевается последовательность, которая заведомо или предположительно приводит к одновременному с трансляцией или посттрансляционному
транспорту пептида через клеточную мембрану. У эукариотов такой транспорт обычно включает в себя секрецию в аппарат Гольджи, что в некоторых случаях сопровождается гликозилированием. Инсектицидные токсины бактерий часто синтезируются в виде протоксинов, которые в результате протеолиза активируются в кишечнике вредителя-мишени (Chang (1987) Methods Enzymol. 153: 507-516). В некоторых воплощениях настоящего изобретения сигнальная последовательность находится в нативной последовательности или она может быть получена из последовательности настоящего изобретения. Под "лидерной последовательностью" подразумевается любая последовательность, которая после трансляции приводит к образованию аминокислотной последовательности, достаточной для инициации совместного с трансляцией транспорта пептидной цепи во внутриклеточную органеллу. Таким образом, данный термин включает в себя лидерные последовательности, определяющие транспорт и/или гликозилирование в результате поступления в эндоплазматический ретикулум, прохождение в вакуоли, пластиды, в том числе хлоропласты, митохондрии и т.п.
Под "вектором для трансформации растения" подразумевается
молекула ДНК, необходимая для эффективной трансформации
растительной клетки. Такая молекула может состоять из одной или
нескольких растительных экспрессионных кассет, и может быть
организована в несколько "векторных" молекул ДНК. Например, в
качестве векторов для трансформации растений можно использовать
бинарные векторы, состоящие из двух несмежных векторов ДНК,
которые кодируют все цис- и транс-действующие функции,
необходимые для трансформации растительных клеток (Hellens and
Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451) . Термин
"вектор" относится к нуклеотидной конструкции,
сконструированной так, чтобы можно было осуществлять перенос среди разных клеток-хозяев. Термин "экспрессионный вектор" относится к вектору, который может обеспечивать встраивание, интеграцию и экспрессию гетерологичных последовательностей ДНК или их фрагментов в чужеродной клетке. Кассета содержит 5'-и/или 3'-регуляторные последовательности, функционально
связанные с последовательностью настоящего изобретения. Под
термином "функционально связанный" подразумевается
функциональная связь между промотором и второй последовательностью, где промоторная последовательность инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Как правило, термин функционально связанный означает, что нуклеотидные последовательности, находящиеся в такой связи, являются смежными, кроме того, если нужно соединить два белок-кодирующих участка, они являются смежными и находятся в одной рамке считывания. Кассета может дополнительно содержать, по меньшей мере, один другой ген, предназначенный для совместной трансформации организма. Альтернативно, другой ген (гены) может присутствовать на другой экспрессионной кассете.
В разных воплощениях нуклеотидная последовательность
настоящего изобретения функционально связана с промотором,
например, с растительным промотором. Термин "промотор"
относится к нуклеотидной последовательности, способной
управлять транскрипцией нижележащей кодирующей
последовательности. Промоторы вместе с другими нуклеотидными
последовательностями, регулирующими транскрипцию и трансляцию
(также называемыми "регуляторные последовательности"),
необходимы для экспрессии представляющей интерес
последовательности ДНК.
Такая экспрессионная кассета содержит несколько участков рестрикции для вставки пестицидной последовательности таким образом, чтобы ее транскрипция находилась под управлением регуляторных участков.
Экспрессионная кассета содержит в 5'- 3' направлении транскрипции участок инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), последовательность ДНК настоящего изобретения и участок терминации транскрипции и трансляции (т.е. терминирующий участок), способные функционировать в растении. Промотор может быть нативным или гомологичным, или чужеродным или гетерологичным по отношению к растению-хозяину и/или к последовательности ДНК настоящего изобретения. Кроме того,
последовательность промотора может быть природной или, альтернативно, синтетической. Если промотор является "нативным" или "гомологичным" по отношению к растению-хозяину, подразумевается, что промотор, который вводят в растение, можно обнаружить в данном растении в его нативном состоянии. Если промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" по отношению к последовательности ДНК настоящего изобретения, подразумевается, что промотор не является нативным или в природе не находится в функциональной связи с последовательностью ДНК настоящего изобретения.
Терминирующий участок может быть нативным по отношению к участку инициации транскрипции, по отношению к представляющей интерес последовательности ДНК, находящейся с ним в функциональной связи, по отношению к растению-хозяину, или он может быть получен из другого источника (т.е. он может быть чужеродным или гетерологичным по отношению к промотору, представляющей интерес последовательности ДНК, растению-хозяину, или к любому сочетанию указанных элементов). Подходящие терминирующие участки, которые можно получить из Ti-плазмиды A. tumefaciens, включают в себя участки терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. Смотрите также Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; и Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.
Если это целесообразно, ген (гены) можно оптимизировать с целью увеличения экспрессии в трансформированной клетке-хозяине. То есть для повышения экспрессии гены можно синтезировать с использованием предпочтительных для клетки-хозяина кодонов, или их можно синтезировать с использованием предпочтительной для хозяина частотой использования кодонов. Как правило, содержание GC в гене можно увеличить. Описание предпочтительных для хозяина частот использования кодонов можно найти, например, в Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:
1-11. Способы синтеза предпочтительных для растения генов известны в данной области. Смотрите, например, патенты США №№ 5380831 и 5436391, U.S. Patent Publication No. 20090137409, and Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, включенные в настоящее описание в кчестве ссылки.
В одном воплощении пестицидный белок направляется в хлоропласт для экспрессии. В данном способе, если пестицидный белок не вставляется непосредственно в хлоропласт, экспрессионная кассета дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую транзитный пептид, обеспечивающий направление пестицидного белка в хлоропласты. Такие транзитные пептиды известны в данной области. Смотрите, например, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; и Shah et al. (1986) Science 233: 478-481.
Пестицидный ген, направляемый в хлоропласт, можно оптимизировать по экспрессии в хлоропластах с учетом различий в использовании кодонов ядром растения и его органеллами. В данном случае представляющие интерес нуклеиновые кислоты можно синтезировать с использованием хлоропласт-предпочтительных кодонов. Смотрите, например, патент США № 5380831, включенный в настоящее описание в качестве ссылки.
Трансформация растений
Способы настоящего изобретения включают в себя введение нуклеотидной конструкции в растение. Под "введением" подразумевается такое предоставление растению нуклеотидной конструкции, что конструкция получает доступ ко внутреннему пространству клетки растения. Способы настоящего изобретения, независимо от того, какой конкретно способ используется для введения нуклеотидной конструкции в растение, обеспечивают нуклеотидной конструкции доступ к внутреннему пространству, по меньшей мере, одной клетки растения. Способы введения нуклеотидных конструкций в растения известны в данной области и включают в себя, без ограничения, способы стабильной
трансформации, способы транзиторной трансформации и вирус-опосредованные способы.
Термин "растение" включает в себя целые растения, органы растений (например, листья, стебли, корни и др.), семена, растительные клетки, ростки, зародыши, а также их потомство. Растительные клетки могут быть дифференцированными или недифференцированными (например, каллюс, клетки суспензионной культуры, протопласты, клетки листьев, клетки корней, клетки флоэмы, пыльца).
Термины "трансгенные растения" или "трансформированные
растения", или "стабильно трансформированные" растения, или
клетки, или ткани относятся к растениям, которые содержат
экзогенные нуклеотидные последовательности или фрагменты ДНК,
внедренные или интегрированные в клетку растения. Указанные
нуклеотидные последовательности включают в себя экзогенные или
не присутствующие в нетрансформированной растительной клетке
последовательности, а также последовательности, которые могут
быть эндогенными, то есть которые могут присутствовать в
нетрансформированной растительной клетке. Термин
"гетерологичные", как правило, относится к нуклеотидным последовательностям, которые не являются эндогенными по отношению к клетке или части нативного генома, в котором они присутствуют, и были добавлены в клетку путем инфекции, трансфекции, микроинъекции, электропорации, микропроекции и т.п.
Трансгенные растения настоящего изобретения экспрессируют одну или несколько раскрытых здесь последовательностей новых токсинов. В разных воплощениях трансгенное растение дополнительно содержит один или несколько других генов, отвечающих за устойчивость к насекомым (например, Cryl, включающий в себя членов семейств CrylA, CrylB, CrylC, CrylD, CrylE и CrylF; Cry2, включающий в себя членов семейства Сгу2А; Сгу9, включающий в себя членов семейств Сгу9А, Сгу9В, Сгу9С, Cry9D, Сгу9Е и Cry9F; и др. ) . Специалисту в данной области следует понимать, что трансгенное растение может содержать любой ген, отвечающий за представляющий интерес агрономический
признак.
Трансформацию растительных клеток можно проводить с помощью одного из нескольких методов, известных в данной области. Пестицидный ген настоящего изобретения можно модифицировать с достижением или повышением экспрессии в растительных клетках. Как правило, конструкция, которая экспрессирует такой белок, содержит промотор, управляющий транскрипцией гена, а также 3'-нетранслируемый участок, обеспечивающий терминацию транскрипции и полиаденилирование. Схема построения таких конструкций хорошо известна в данной области. В некоторых случаях полезно сконструировать ген так, чтобы обеспечить секрецию образующегося пептида, или, в других случаях, направление указанного пептида в растительную клетку. Например, ген можно сконструировать так, чтобы он содержал сигнальный пептид, обеспечивающий транспортировку пептида в эндоплазматический ретикулум. Предпочтительно растительную экспрессионную кассету конструируют так, чтобы она содержала интрон, в этом случае для экспрессии требуется процессинг мРНК с удалением интрона.
Как правило, упомянутую "растительную экспрессионную кассету" вставляют в "вектор для трансформации растений". Указанный вектор для трансформации растений может состоять из одного или нескольких векторов ДНК, необходимых для достижения трансформации растения. Например, обычной практикой в данной области является применение векторов для трансформации растений, которые состоят из нескольких смежных сегментов ДНК. Указанные векторы в данной области часто называют "бинарные векторы". Бинарные векторы, а также векторы, содержащие хелперные плазмиды, чаще всего используют для трансформации, опосредуемой Agrobacterium, где размер и сложность сегментов ДНК, необходимых для достижения эффективной трансформации, является очень большим, и предпочтительно распределять функции на разные молекулы ДНК. Бинарные векторы обычно содержат плазмидный вектор, который включает в себя цис-действующие последовательности, необходимые для переноса Т-ДНК (такие как левый бордюр и правый бордюр), селектируемый маркер,
сконструированный для экспрессии в растительной клетке, и "представляющий интерес ген" (ген, сконструированный для экспрессии в растительной клетке, из которой желательно получить трансгенные растения). На указанном плазмидном векторе также присутствуют последовательности, необходимые для репликации бактерий. Цис-действующие последовательности располагают таким образом, чтобы обеспечить эффективный перенос в растительные клетки и экспрессию в них. Например, ген селектируемого маркера и пестицидный ген располагают между левым и правым бордюрами. Второй плазмидный вектор обычно содержит транс-действующие факторы, которые опосредуют перенос Т-ДНК из Agrobacterium в растительные клетки. Указанная плазмида зачастую содержит вирулентные элементы (гены Vir) , которые обеспечивают инфицирование растительных клеток Agrobacterium, перенос ДНК путем расщепления по бордюрным последовательностям и vir-опосредованный перенос ДНК, как известно в данной области (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 44 6-451). Некоторые типы штаммов Agrobacterium (например LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105 и др.) можно использовать для трансформации растений. Второй плазмидный вектор не является необходимым для трансформации растений с помощью других способов, таких как микропроекция, микроинъекция, электропорация, применение полиэтиленгликоля и др.
Как правило, способы трансформации растений включают в себя перенос гетерологичных ДНК в растительные клетки-мишени (такие как клетки незрелых или зрелых зародышей, суспензионных культур, недифференцированного каллюса, протопласты и др.) с последующей соответствующей селекцией с применением максимального порогового уровня (в зависимости от гена селектируемого маркера) , чтобы отделить трансформированные растительные клетки от массы нетрансформированных клеток. Эксплантаты обычно переносят в свежую порцию той же среды и культивируют рутинным способом. Трансформированным клеткам дают дифференцироваться с образованием побегов после помещения на среду для регенерации, содержащую максимальный пороговый
уровень селективного средства. Затем побеги переносят на
селективный субстрат для выращивания растений, чтобы получить
укоренившийся побег или саженец. Трансгенный саженец выращивают
до зрелого растения и получают фертильные семена (например,
Hiei et al. (1994) Plant Journal 6: 271-282; Ishida et al.
(1996) Nature Biotechnology 14: 745-750). Эксплантаты обычно
переносят в свежую порцию той же среды и культивируют рутинным
способом. Общее описание методов и способов получения
трансгенных растений можно найти в Ayres and Park (1994)
Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239 и Bommineni and
Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120. Поскольку трансформированное
вещество содержит много клеток, в любой части подвергнутых
воздействию каллюса, ткани или группы клеток присутствуют как
трансформированные, так и нетрансформированные клетки.
Трансформированные растительные культуры получают путем
уничтожения нетрансформированных клеток и оставления
трансформированных клеток для пролиферации. Зачастую
возможность удаления нетрансформированных клеток является
ограничительным фактором для быстрого извлечения
трансформированных растительных клеток и успешного получения трансгенных растений.
Методы трансформации и методы введения нуклеотидных последовательностей в растения могут варьировать в зависимости от типа предназначенных для трансформации растений или растительных клеток, где тип включает в себя однодольные или двудольные. Получение трансгенных растений можно проводить с помощь одного из нескольких способов, включающих в себя, без ограничения, микроинъекцию, электропорацию, прямой перенос гена, введение гетерологичных ДНК в растительные клетки с использованием Agrobacterium (Agrobacterium-опосредованная трансформация), бомбардировку растительных клеток частицами, содержащими на поверхности гетерологичные чужеродные молекулы ДНК, баллистическое ускорение частиц, трансформацию с использованием аэрозольного луча (опубликованная заявка США № 20010026941; патент США № 4945050; международная публикация № WO 91/00915; опубликованная заявка США № 2002015066),
трансформацию с применением Led, а также разные другие методы переноса ДНК, не опосредуемые частицами.
Способы трансформации хлоропластов известны в данной области. Смотрите, например, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. Способ основан на доставке с помощью генной пушки ДНК, содержащей селектируемый маркер, и направлении ДНК в плазмидный геном посредством гомологичной рекомбинации. Кроме того, можно использовать пластидную трансформацию путем трансактивации полученного с использованием молчащей пластиды трансгена с помощью тканеспецифической экспрессии кодируемой в ядре и пластида-направленной РНК-полимеразы. Такой способ описан в McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305.
После интеграции гетерологичной чужеродной ДНК в
растительные клетки можно провести в среде соответствующую
селекцию с максимальным пороговым уровнем, которая позволяет
уничтожить нетрансформированные клетки и отделить с последующей
пролиферацией предположительно трансформированные клетки,
которые выжили после проведения указанной селекционной
обработки, путем регулярного переноса в свежую среду. Путем
непрерывных пассажей и обработки соответствующим средством
селекции можно идентифицировать клетки, трансформированные
плазмидным вектором и обеспечить их пролиферацию. Затем с
помощью молекулярных и биохимических методов можно подтвердить
присутствие интегрированного представляющего интерес
гетерологичного гена в геноме трансгенного растения.
Трансформированные клетки можно выращивать традиционными способами с получением растений. Смотрите, например, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. После выращивания указанные растения можно опылить либо таким же трансформированным штаммом, либо другими штаммами, и идентифицировать полученный гибрид, обладающий конститутивной экспрессией желательной фенотипической характеристики. Можно вырастить два или более поколений, чтобы удостовериться, что
экспрессия желательной фенотипической характеристики стабильно поддерживается и наследуется, после чего собирают семена и подтверждают наличие экспрессии желательной фенотипической характеристики. Таким образом, настоящее изобретение предлагает трансформированное семя (также называемое "трансгенное семя"), содержащее нуклеотидную конструкцию настоящего изобретения, например, экспрессионную кассету настоящего изобретения, стабильно внедренную в геном.
После введения гетерологичной чужеродной ДНК в
растительные клетки, трансформацию или интеграцию
гетерологичного гена в геном растения подтверждают разными способами, такими как анализы нуклеиновых кислот, белков и метаболитов, ассоциированных с интегрированным геном.
Анализ методом ПЦР представляет собой быстрый способ скрининга трансформированных клеток, тканей или побегов на присутствие внедренного гена на ранней стадии перед пересаживанием в почву (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . ПЦР проводят с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных к представляющему интерес гену, к фону вектора Agrobacterium и др.
Трансформацию растения можно подтвердить путем анализа геномной ДНК методом саузерн-блоттинга (Sambrook and Russell, 2 001, выше). В большинстве случаев общую ДНК экстрагируют из трансформанта, расщепляют соответствующими рестрикционными ферментами, фракционируют в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозную или найлоновую мембрану. Затем мембрану или "блот" зондируют с помощью стандартных методов, например, фрагментом целевой ДНК, меченным радиоактивным изотопом 32Р, чтобы подтвердить интеграцию введенного гена в геном растения (Sambrook and Russell, 2 001, выше).
Для проведения анализа методом нозерн-блоттинга РНК выделяют из конкретных тканей или трансформантов, фракционируют в формальдегид-содержащем агарозном геле и помещают на найлоновый фильтр в соответствии со стандартными процедурами,
Анализ трансформации растений
широко используемыми в данной области (Sambrook and Russell, 2 001, выше). Экспрессию РНК, кодируемой пестицидным геном, тестируют путем гибридизации фильтра с радиоактивным зондом, полученным из пестицидного гена, с помощью способов, известных в данной области (Sambrook and Russell, 2001, выше).
Присутствие в трансгенных растениях белка, кодируемого пестицидным геном, можно подтвердить с помощью стандартных процедур вестерн-блоттинга, биохимических анализов и т.п. (Sambrook and Russell, 2001, выше), используя антитела, которые связываются с одним или несколькими эпитопами пестицидного белка.
В другом аспекте настоящего изобретения можно получить
трансгенные растения, которые экспрессируют пестицидный белок,
обладающий пестицидной активностью. Для получения трансгенных
растений можно использовать описанные выше иллюстративные
способы, однако способ получения трансгенных растительных
клеток не является критичным для данного изобретения. Известные
или описанные в данной области способы, такие как
Agrobacterium-опосредованная трансформация, биолистическая
трансформация и способы, в которых не применяются частицы,
экспериментатор может использовать по своему усмотрению.
Растения, экспрессирующие пестицидный белок, можно получить с
помощью традиционных способов, описанных в данной области,
например путем трансформации каллюса, селекции
трансормированного каллюса и регенерации фертильных растений из полученного трансгенного каллюса. В таком способе в качестве селектируемого маркера можно использовать любой ген при условии, что его экспрессия в растительных клетках позволит идентифицировать или выбрать трансформированные клетки.
Для растительных клеток разработан ряд маркеров, таких как гены устойчивости к хлорамфениколу, аминогликозиду G418, гигромицину и т.п. В качестве селектируемых маркеров также можно использовать гены, кодирующие продукт, участвующий в метаболизме хлоропластов. Например, гены, отвечающие за устойчивость к растительным гербицидам, таким как глифосат,
Пестицидная активность в растениях
бромоксинил или имидазолинон, могут найти конкретное применение. Такие гены описаны Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 2 63: 6310-6314 (ген нитрилазы, обеспечивающий устойчивость к бромоксинилу) ; и Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 2188 (ген устойчивости к имидазолинону AHAS) . Кроме того, раскрытые здесь гены можно использовать в качестве маркеров для анализа трансформации бактериальных или растительных клеток. Способы определения присутствия трансгена в растении, органе растения (например, в листьях, стеблях, корнях и др.), семени, растительной клетке, побеге, зародыше, или в их потомстве, известны в данной области. В одном воплощении присутствие трансгена детектируют путем тестирования пестицидной активности.
Фертильные растения, экспрессирующие пестицидный белок, можно тестировать на пестицидную активность, после чего растения, характеризующиеся оптимальной активностью, выбирают для последующей селекции. В данной области существуют методы анализа пестицидной активности. Как правило, белок смешивают и используют в пищевых анализах. Смотрите, например, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293.
Настоящее изобретение можно использовать для трансформации растений любых видов, относящихся, без ограничения, к однодольным и двудольным. Примеры представляющих интерес растений включают в себя, без ограничения, кукурузу (маис), сорго, пшеницу, подсолнечник, томат, крестоцветные, перцы, картофель, хлопок, рис, соевые бобы, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак, ячмень и масличный рапс, Brassica sp., люцерну, рожь, просо, сафлор, арахис, батат, маниоку, кофе, кокос, ананас, цитрусовые деревья, какао, чай, банан, авокадо, фиговое дерево, гуаву, манго, оливковые деревья, папайю, кешью, макадамию, миндаль, овес, овощи, декоративные растения и хвойные деревья.
Овощи включают в себя, без ограничения, томаты, латук, зеленую фасоль, лимскую фасоль, горох и членов рода Curcumis, таких как огурец, канталупа и мускусная дыня. Декоративные растения включают в себя, без ограничения, азалию, гортензию,
гибискус, розы, тюльпан, нарцисс желтый, петунию, гвоздику, пуансеттию и хризантему. Предпочтительно, растения настоящего изобретения относятся к сельскохозяйственным культурам (таким как маис, сорго, пшеница, подсолнечник, томат, крестоцветные, перцы, картофель, хлопок, рис, соевые бобы, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, ячмень, масличный рапс и др.). Применение для пестицидного контроля
Общие способы применения штаммов, содержащих нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, или ее вариант, для подавления вредителей или для получения рекомбинантными методами других организмов, используемых в качестве пестицидных средств, известны в данной области. Смотрите, например, патент США № 5039523 и ЕР 0480762А2.
Штаммы Bacillus, содержащие нуклеотидную
последовательность настоящего изобретения или ее вариант, или микроорганизмы, которые в результате генетического изменения содержат пестицидный ген настоящего изобретения и белок, можно использовать для защиты сельскохозяйственных культур и продуктов от вредителей. В одном аспекте настоящего изобретения целые, т.е. не лизированные, клетки токсин (пестицид)-продуцирующего организма обрабатывают реагентами, продлевающими активность токсина, продуцируемого клетками, после чего клетки вносят в среду обитания целевого вредителя (вредителей).
Альтернативно, пестицид продуцируется в результате введения пестицидного гена в клетку-хозяина. Экспрессия пестицидного гена приводит, непосредственно или косвенно, к внутриклеточной продукции и поддержанию пестицида. В одном аспекте настоящего изобретения указанные клетки обрабатывают в условиях, продлевающих активность токсина, продуцируемого клетками, после чего клетки вносят в среду обитания целевого вредителя (вредителей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Указанные естественным образом инкапсулированные пестициды можно затем использовать для получения композиции в соответствии с традиционными методами для внесения в среду обитания целевого вредителя, такую как почва, вода и листва растений. Смотрите, например, ЕРА 0192319,
а также ссылки, упоминающиеся в указанном документе. Альтернативно клетки, экспрессирующие ген настоящего изобретения, можно использовать для получения композиции, подходящей для применения в качестве пестицида.
Активные ингредиенты настоящего изобретения обычно
используют в виде композиций, которые можно наносить на
посевную площадь или растения, подлежащие обработке,
одновременно или поочередно с другими средствами. Указанные
средства могут включать в себя удобрения, гербициды, средства,
защищающие от переохлаждения, поверхностно-активные вещества,
детергенты, пестицидные мыла, масла для обработки растений,
полимеры и/или композиции с замедленным высвобождением или
композиции, содержащие биоразлагаемый носитель, которые
обеспечивают длительное высвобождение средства на целевой
площади после однократного нанесения композиции. Они также
могут включать в себя селективные гербициды, химические
инсектициды, противовирусные средства, бактерицидные средства,
противоамебные средства, пестициды, фунгициды, бактерицидные
средства, нематоциды, моллюскоциды или смеси нескольких из
указанных препаратов, при необходимости вместе с другими
сельскохозяйственно приемлемыми носителями, поверхностно-
активными веществами или вспомогательными средствами,
облегчающими нанесение, традиционно используемыми для получения
композиций. Подходящие носители и адъюванты могут быть твердыми
или жидкими и могут включать в себя вещества, традиционно
используемые для получения композиций, такие как природные или
регенерированные минеральные вещества, растворители,
диспергирующие средства, увлажняющие средства, средства, придающие клейкость, связующие средства или удобрения. Подобным образом, композиции можно использовать для получения пищевых "приманок" или "ловушек" для вредителей, которые способствуют потреблению или проглатыванию целевым вредителем пестицидной композиции.
Способы применения активного ингредиента настоящего изобретения или агрохимической композиции настоящего изобретения, которая содержит, по меньшей мере, один из
пестицидных белков, продуцируемых бактериальными штаммами настоящего изобретения, включают в себя нанесение на листья, покрытие семян и нанесение на почву. Число и частота нанесений зависит от интенсивности заражения соответствующим вредителем.
Композицию можно получить в виде порошка, пылевидного
препарата, шариков, гранул, спрея, эмульсии, коллоидного
вещества, раствора и т.п., с помощью традиционных способов,
таких как сушка, лиофилизация, гомогенизация, экстракция,
фильтрация, центрифугирование, седиментация или
концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид. Во всех таких композициях, которые содержат, по меньшей мере, один такой пестицидный полипептид, полипептид может присутствовать в концентрации, составляющей от примерно 1% до примерно 99% по массе.
С помощью способов настоящего изобретения можно уничтожать или уменьшать численность чешуекрылых, полужесткокрылых, двукрылых или жесткокрылых вредителей в конкретном районе, или указанные способы можно профилактически применять к району окружающей среды для предотвращения заражения чувствительным вредителем. Предпочтительно вредитель проглатывает пестицидно эффективное количество полипептида, или контактирует с ним. Под "пестицидно эффективным количеством" подразумевается количество пестицида, способное вызвать гибель, по меньшей мере, одного вредителя, или в заметной степени уменьшить рост вредителя, потребление пищи вредителем или нормальное физиологическое развитие вредителя. Данное количество варьирует в зависимости от таких факторов, как, например, конкретные целевые вредители, подлежащие подавлению, конкретная окружающая среда, местонахождение, растение, сельскохозяйственная культура или земледельческий участок, подлежащие обработке, условия окружающей среды, а также способ и частота нанесения пестицидно эффективной полипептидной композиции, ее концентрация, стабильность и количество. Композиции также могут варьировать в зависимости от климатических условий, экологических факторов, частоты нанесения и/или степени заражения вредителем.
Описанные пестицидные композиции можно получить путем
смешивания бактериальной клетки, суспензии кристаллов и/или спор, или выделенного белкового компонента с желательным сельскохозяйственным носителем. Перед введением композиции можно поместить в подходящую среду, включающую в себя лиофилизированные, высушенные из замороженного состояния, обезвоженные или водные носители, среды или подходящие разбавители, такие как физиологический раствор или другой буфер. Полученные композиции могут находиться в виде пылевидного или гранулированного вещества, суспензии в масле (растительном или минеральном), воде или масляно/водных эмульсиях, в виде смачиваемого порошка, или в виде сочетания с любыми другими веществами-носителями, подходящими для применения в сельском хозяйстве. Подходящие для применения в сельском хозяйстве носители, которые могут быть твердыми или жидкими, хорошо известны в данной области. Термин "сельскохозяйственно приемлемый носитель" охватывает все вспомогательные средства, инертные компоненты, диспергирующие средства, поверхностно-активные средства, средства, придающие клейкость, связующие средства и др., традиционно используемые для получения пестицидных композиций; они хорошо известны специалистам в области пестицидных композиций. Композиции можно смешивать с одним или несколькими твердыми или жидкими вспомогательными средствами с помощью разных способов, включающих в себя, например, гомогенное смешивание, перемешивание и/или размалывание пестицидных композиций с подходящими адъювантами, с использованием традиционных методов получения композиций. Подходящие композиции и способы их применения описаны в патенте США № 6468523, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.
Термин "вредитель" включает в себя, без ограничения, насекомых, грибков, бактерий, нематод, клещей, зудней и т.п. Вредители-насекомые включают в себя членов отрядов Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., в особенности Coleoptera, Lepidoptera и Diptera.
Отряд Coleoptera включает в себя подотряды Adephaga и Polyphaga. Подотряд Adephaga включает в себя надсемейства Caraboidea и Gyrinoidea, тогда как подотряд Polyphaga включает в себя надсемейства Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea и Curculionoidea. Надсемейство Caraboidea включает в себя семейства Cicindelidae, Carabidae и Dytiscidae. Надсемейство Gyrinoidea включает в себя семейство Gyrinidae. Надсемейство Hydrophiloidea включает в себя семейство Hydrophilidae. Надсемейство Staphylinoidea включает в себя семейства Silphidae и Staphylinidae. Надсемейство Cantharoidea включает в себя семейства Cantharidae и Lampyridae. Надсемейство Cleroidea включает в себя семейства Cleridae и Dermestidae. Надсемейство Elateroidea включает в себя семейства Elateridae и Buprestidae. Надсемейство Cucujoidea включает в себя семейство Coccinellidae. Надсемейство Meloidea включает в себя семейство Meloidae. Надсемейство Tenebrionoidea включает в себя семейство Tenebrionidae. Надсемейство Scarabaeoidea включает в себя семейства Passalidae и Scarabaeidae. Надсемейство Cerambycoidea включает в себя семейство Cerambycidae. Надсемейство Chrysomeloidea включает в себя семейство Chrysomelidae. Надсемейство Curculionoidea включает в себя семейства Curculionidae и Scolytidae.
Отряд Diptera включает в себя подотряды Nematocera, Brachycera и Cyclorrhapha. Подотряд Nematocera включает в себя семейства Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae и Cecidomyiidae. Подотряд Brachycera включает в себя семейства Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae и Dolichopodidae. Подотряд Cyclorrhapha включает в себя группы Aschiza и Aschiza. Группа Aschiza включает в себя семейства Phoridae, Syrphidae и Conopidae. Группа Aschiza включает в себя разделы Acalyptratae и Calyptratae. Раздел Acalyptratae включает в себя семейства Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae и Drosophilidae. Раздел
Calyptratae включает в себя семейства Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae и Sarcophagidae.
Отряд Lepidoptera включает в себя семейства Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae и Tineidae.
Насекомые настоящего изобретения, являющиеся вредителями основных сельскохозяйственных культур, включают в себя: маис: Ostrinia nubilalis, мотылек кукурузный; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Helicoverpa zea, совка хлопковая; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Diatraea grandiosella, огневка кукурузная юго-западная; Elasmopalpus lignosellus, малый кукурузный точильщик; Diatraea saccharalis, огневка сахарного тростника; Diabrotica virgifera, западный кукурузный жук; Diabrotica longicornis barberi, блошка длинноусая; Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка 11-точечная Говарда; Melanotus spp., проволочники; Cyclocephala borealis, северный скрытый майский жук (личинка майского хруща); Cyclocephala immaculata, южный скрытый майский жук (личинка майского хруща); Popillia japonica, хрущик японский; Chaetocnema pulicaria, блошка стеблевая хлебная; Sphenophorus maidis, долгоносик кукурузный; Rhopalosiphum maidis, тля кукурузная; Anuraphis maidiradicis, тля кукурузная корневая; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Melanoplus femurrubrum, кобылка красноногая; Melanoplus sanguinipes, кобылка мексиканская; Hylemya platura, личинка мухи ростковой; Agromyza parvicornis, кукурузная минирующая мушка; Anaphothrips obscrurus, трипе злаковый; Solenopsis milesta, муравей-вор; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ; сорго: Chilo partellus, сорговый точильщик; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Helicoverpa zea, совка хлопковая; Elasmopalpus lignosellus, малый кукурузный точильщик; Feltia subterranea, зернистая совка; Phyllophaga crinita, личинка майского хруща; Eleodes, Conoderus, and Aeolus spp., проволочники; Oulema melanopus, пьявица красногрудая; Chaetocnema pulicaria, блошка
стеблевая хлебная; Sphenophorus maidis, долгоносик кукурузный;
Rhopalosiphum maidis; тля кукурузная; Sipha flava, тля желтая
сахарного тростника; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-
черепашка пшеничный североамериканский; Contarinia sorghicola,
галлица сортовая; Tetranychus cinnabarinus, красный паутинный
клещ; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ;
пшеница: Pseudaletia unipunctata, совка; Spodoptera frugiperda,
совка травяная; Elasmopalpus lignosellus, малый кукурузный
точильщик; Agrotis orthogonia, западная совка; Elasmopalpus
lignosellus, малый кукурузный точильщик; Oulema melanopus,
пьявица красногрудая; Hypera punctata, долгоносик листовой
клеверный; Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка 11-
точечная Говарда; русская пшеничная тля; Schizaphis graminum,
злаковая тля; Macrosiphum avenae, тля листовая; Melanoplus
femurrubrum, кобылка красноногая; Melanoplus differ entialis,
кобылка отличительная; Melanoplus sanguinipes, кобылка
мексиканская; Mayetiola destructor, гессенская мушка;
Sitodiplosis mosellana, комарик пшеничный; Meromyza americana,
личинка американской меромизы; Hylemya coarctata, муха озимая;
Frankliniella fusca, табачный трипе; Cephus cinctus, пилильщик
хлебный американский; Aceria tulipae, луковичный клещ
тюльпанов; подсолнечник: Suleima helianthana, почковая
листовертка подсолнечника; Homoeosoma electellum, огневка
подсолнечниковая; zygogramma exclamationis, совка
подсолнечниковая; Bothyrus gibbosus, жук морковный; Neolasioptera murtfeldtiana, подсолнечниковая галлица; Хлопок: Heliothis virescens, хлопковая совка; Helicoverpa zea, коробочный червь; Spodoptera exigua, совка малая; Pectinophora gossypiella, розовый коробочный червь; Anthonomus grandis, долгоносик хлопковый; Aphis gossypii, тля хлопковая; Pseudatomoscelis seriatus, марокканская кобылка; Trialeurodes abutilonea, полосатокрылая белокрылка; Lygus lineolaris, клоп травяной; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differ entialis, кобылка отличительная; Thrips tabaci, трипе луковый; Franklinkiella fusca, трипе табачный; Tetranychus cinnabarinus, красный паутинный клещ; Tetranychus
urticae, обыкновенный паутинный клещ; рис: Diatraea
saccharalis, огневка сахарного тростника; Spodoptera
frugiperda, совка травяная; Helicoverpa zea, совка хлопковая;
Colaspis brunnea, grape colaspis; Lissorhoptrus oryzophilus,
долгоносик рисовый водяной; Sitophilus oryzae, долгоносик
рисовый; Nephotettix nigropictus, рисовая цикадка; Blissus
leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный
североамериканский; Acrosternum hilare, щитник; соевые бобы: Pseudoplusia includens, соевая пяденица; Anticarsia gemmatalis, ложногусеница бархатных бобов; Plathypena scabra, зеленый вредитель клевера; Ostrinia nubilalis, мотылек кукурузный; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Spodoptera exigua, совка малая; Heliothis virescens, хлопковая совка; Helicoverpa zea, коробочный червь; Epilachna varivestis, мексиканская зерновка бобовая; Myzus persicae, тля персиковая зеленая; Empoasca fabae, цикадка картофельная; Acrosternum hilare, щитник; Melanoplus femurrubrum, кобылка красноногая; Melanoplus differ entialis, кобылка отличительная; Hylemya platura, личинка мухи ростковой; Sericothrips variabilis, соевые трипсы; Thrips tabaci, луковые трипсы; Tetranychus turkestani, клещик паутинный атлантический; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ; ячмень: Ostrinia nubilalis, мотылек кукурузный; Agrotis ipsilon, совка-ипсилон; Schizaphis graminum, злаковая тля; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшеничный североамериканский; Acrosternum hilare, щитник; Euschistus servus, коричневый щитник; Delia platura, личинка мухи ростковой; Mayetiola destructor, гессенская мушка; Petrobia latens, коричневый пшеничный клещ; рапс: Brevicoryne brassicae, капустная тля; Phyllotreta cruciferae, картофельные жуки; Mamestra configurata, гусеница Bertha; Plutella xylostella, моль капустная; Delia ssp., корневые личинки.
Нематоды включают в себя паразитические нематоды, такие как нематоды, образующие корневые наросты, и цистообразующие нематоды, а также нематоды-вредители, такие как Heterodera spp., Meloidogyne spp. и Globodera spp.; в особенности цистообразующие нематоды, которые включают в себя, без
ограничения, Heterodera glycines (соевые цистообразующие нематоды); Heterodera schachtii (свекловичные цистообразующие нематоды); Heterodera avenae (злаковые цистообразующие нематоды); а также Globodera rostochiensis и Globodera pallida (картофельные цистообразующие нематоды). Нематоды-вредители включают в себя Pratylenchus spp.
Способы повышения урожая растений
Изобретение предлагает способы повышения урожая растений.
Указанные способы включают в себя получение растений или
растительных клеток, экспрессирующих раскрытый здесь
полинуклеотид, кодирующий последовательность пестицидного
полипептида, и выращивание растения или его семени на поле,
зараженном (или подверженном заражению) вредителем, против
которого направлена пестицидная активность указанного
полипептида. В некоторых воплощениях полипептид обладает
пестицидной активностью в отношении чешуекрылых, жесткокрылых,
двукрылых, полужесткокрылых или нематод, а указанное поле
заражено вредителем, относящимся к чешуекрылым,
полужесткокрылым, жесткокрылым, двукрылым или нематодам. В настоящем описании термин "урожай" растения относится к качеству и/или количеству биомассы, продуцируемой растением. Под термином "биомасса" подразумевается любой измеряемый растительный продукт. Повышение продукции биомассы означает улучшение урожая измеряемого растительного продукта. Повышение урожая растения имеет несколько коммерческих применений. Например, увеличение биомассы листьев растения может соответствовать увеличению урожая листовых овощей, предназначенных для потребления человеком ли животными. Кроме того, увеличение биомассы листьев можно использовать для повышения продукции получаемых из растения фармацевтических или промышленных продуктов. Увеличение урожайности может включать в себя любое статистически значимое увеличение, которое составляет, без ограничения, например, по меньшей мере 1%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 100% или больше по сравнению
с растением, не экспрессирующим пестицидную последовательность. В конкретных способах урожай растения увеличивается в результате повышения устойчивости растения, экспрессирующего раскрытый здесь пестицидный белок, к вредителю. Экспрессия пестицидного белка приводит к снижению способности вредителя к заражению или поглощению пищи.
Растения также можно обрабатывать химическими
композициями, содержащими один или несколько гербицидов,
инсектицидов или фунгицидов. Типичные химические композиции
содержат: гербициды для защити фруктов/овощей: Атразин,
Бромацил, Диурон, Глифосат, Линурон, Метрибузин, Симазин,
Трифлуралин, Флуазифоп, Глифосинат, Галосульфурон Гована,
Паракват, Пропизамид, Сетоксидим, Бутафенацил, Галосульфурон,
Индазифлам; инсектициды для защиты фруктов/овощей: Алдикарб,
Bacillus thuriengiensis, Карбарил, Карбофуран, Хлорпирифос,
Циперметрин, Дельтаметрин, Абамектин, Цифлутрин/бета-цифлутрин,
Эсфенвалерат, Лямбда-цигалотрин, Ацеквиноцил, Бифеназат,
Метоксифенозид, Новалурон, Хромафенозид, Тиаклоприд,
Динотефуран, Флуакрипирим, Спиродиклофен, Гамма-цигалотрин,
Спиромесифен, Спиносад, Ринахипир, Циазипир, Трифлумурон,
Спиротетрамат, Имидаклоприд, Флубендиамид, Тиодикарб,
Метафлумизон, Сульфоксафлор, Цифлуметофен, Цитанопирафен,
Клотианидин, Тиаметоксам, Спиноторам, Тиодикарб, Флоникамид,
Метиокарб, Эмамектин-бензоат, Индоксакарб, Фенамифос,
Пирипроксифен, Фенбутатин-оксид; фунгициды для защиты
фруктов/овощей: Аметоктрадин, Азоксистробин, Бентиаваликарб,
Боскалид, Каптан, Карбендазим, Хлорталонил, Медь, Циазофамид,
Цифлуфенамид, Цимоксанил, Ципроконазол, Ципродинил,
Дифеноконазол, Диметоморф, Дитианон, Фенамидон, Фенгексамид,
Флуазинам, Флудиоксонил, Флуопиколид, Флуопирам,
Флуоксастробин, Флуксапироксад, Фолпет, Фосетил, Ипродион,
Ипроваликарб, Изопиразам, Кресоксим-метил, Манкозеб,
Мандипропамид, Металаксил/мефеноксам, Метирам, Метрафенон,
Миклобутанил, Пенконазол, Пентиопирад, Пикоксистробин,
Пропамокарб, Пропиконазол, Пропинеб, Проквиназид,
Протиоконазол, Пираклостробин, Пириметанил, Квиноксифен,
Сироксамин, Сульфур, Тебуконазол, Тиофанат-метил,
Трифлоксистробин; гербициды для защиты зерновых: 2,4-D,
Амидосульфурон, Бромоксинил, Карфентразон-Е, Хлортолурон,
Хлорсульфурон, Клодинафоп-Р, Клопиралид, Дикамба, Диклофоп-М,
Дифлуфеницан, Феноксапроп, Флорасулам, Флукарбазон-NA,
Флуфенацет, Флупиросульфурон-М, Флуроксипир, Флуртамон,
Глифосат, Иодосульфурон, Иоксинил, Изопротурон, МЦПА,
Мезосульфурон, Метсульфурон, Пендиметалин, Пиноксаден,
Пропоксикарбазон, Просульфокарб, Пироксулам, Сульфосульфурон,
Тифенсульфурон, Тралкоксидим, Триасульфурон, Трибенурон,
Трифлуралин, Тритосульфурон; фунгициды для защиты зерновых:
Азоксистробин, Биксафен, Боскалид, Карбендазим, Хлорталонил,
Цифлуфенамид, Ципроконазол, Ципродинил, Димоксистробин,
Эпоксиконазол, Фенпропидин, Фенпропиморф, Флуопирам,
Флуоксастробин, Флуквинконазол, Флуксапироксад, Изопиразам,
Кресоксим-метил, Метконазол, Метрафенон, Пентиопирад,
Пикоксистробин, Прокслораз, Пропиконазол, Проквиназид,
Протиоконазол, Пираклостробин, Квиноксифен, Спироксамин,
Тебуконазол, Тиофанат-метил, Трифлоксистробин; инсектициды для
защиты зерновых: Диметоат, Лямбда-цихалтрин, Дельтаметрин,
алфа-Циперметрин, р-цифлутрин, Бифентрин, Имидаклоприд,
Клотианидин, Тиаметоксам, Тиаклоприд, Ацетамиприд, Динетофуран,
Клорфирифос, Пиримикарб, Метиокарб, Сульфоксафлор; гербициды
для защиты маиса: Атразин, Алахлор, Бромоксинил, Ацетохлор,
Дицамба, Клопиралид, (S-)Диметенамид, Глуфосинат, Глифосат,
Изоксафлутол, (S-)Метолахлор, Месотрион, Никосульфурон,
Примисульфурон, Римсульфурон, Сулкотрион, Форамсульфурон,
Топрамезон, Темботрион, Сафлуфенацил, Тиенкарбазон, Флуфенацет,
Пироксасульфон; инсектициды для защиты маиса: Карбофуран,
Хлорпирифос, Бифентрин, Фипронил, Имидаклоприд, Лямбда-
Цигалотрин, Тефлутрин, Тербуфос, Тиаметоксам, Клотианидин,
Спиромесифен, Флубендиамид, Трифлумурон, Ринаксипир,
Дельтаметрин, Тиодикарб, р-Цифлутрин, Циперметрин, Бифентрин, Луфенурон, Тебупиримфос, Этипрол, Циазипир, Тиаклоприд, Ацетамиприд, Динетофуран, Авермецтин; фунгициды для защиты маиса: Азоксистробин, Биксафен, Боскалид, Ципроконазол,
Димоксистробин, Эпоксиконазол, Фенитропан, Флуопирам,
Флуоксастробин, Флуксапироксад, Изопиразам, Метконазол,
Пентиопирад, Пикоксистробин, Пропиконазол, Протиоконазол,
Пираклостробин, Тебуконазол, Трифлоксистробин; гербициды для
защиты риса: Бутахлор, Пропанил, Азимсульфурон, Бенсульфурон,
Цигалофоп, Даимурон, Фентразамид, Имазосульфурон, Мефенацет,
Оксацикломефон, Пиразосульфурон, Пирибутикарб, Квинклорак,
Тиобенкарб, Инданофан, Флуфенацет, Фентразамид, Галосульфурон,
Оксазикломефон, Бензобициклон, Пирифталид, Пеноксулам,
Биспирибак, Оксадиаргил, Этоксисульфурон, Претилахлор,
Месотрион, Тефурилтрион, Оксадиазон, Феноксапроп,
Пиримисульфан; инсектициды для защиты риса: Диазинон,
Фенобукарб, Бенфуракарб, Бупрофезин, Динотефуран, Фипронил,
Имидаклоприд, Изопрокарб, Тиаклоприд, Хромафенозид,
Клотианидин, Этипрол, Флубендиамид, Ринаксипир, Дельтаметрин,
Ацетамиприд, Тиаметоксам, Циазипир, Спиносад, Спиноторам,
Эмамецтин-Бензоат, Циперметрин, Хлорпирифос, Этофенпрокс,
Карбофуран, Бенфуракарб, Сульфоксафлор; фунгициды для защиты
риса: Азоксистробин, Карбендазим, Карпропамид, Диклоцимет,
Дифеноконазол, Эдифенфос, Феримзон, Гентамицин, Гексаконазол,
Гимексазол, Ипробенфос (ИБП), Изопротиолан, Изотианил,
Касугамицин, Манкозеб, Метоминостробин, Орисастробин,
Пенцикурон, Пробеназол, Пропиконазол, Пропинеб, Пироквилон,
Тебуконазол, Тиофанат-метил, Тиадинил, Трициклазол,
Трифлоксистробин, Валидамицин; гербициды для защиты хлопка:
Диурон, Флуометурон, MSMA, Оксифлуорфен, Прометрин,
Трифлуралин, Карфентразон, Клетодим, Флуазифоп-бутил, Глифосат,
Норфлуразон, Пендиметалин, Пиритиобак натрия,
Трифлоксисульфурон, Тепралоксидим, Глуфосинат, Флумиоксазин,
Тидиазурон; инсектициды для защиты хлопка: Ацефат, Алдикарб,
Хлорпирифос, Циперметрин, Дельтаметрин, Абамецтин, Ацетамиприд,
Эмамектина бензоат, Имидаклоприд, Индоксакарб, Лямбда-
Цигалотрин, Спиносад, Тиодикарб, Гамма-Цигалотрин,
Спиромецифен, Пиридалил, Флоникамид, Флубендиамид, Трифлумурон, Ринаксипир, Бета-Цифлутрин, Спиротетрамат, Клотианидин, Тиаметоксам, Тиаклоприд, Динетофуран, Флубендиамид, Циазипир,
Спиносад, Спиноторам, гамма-Цигалотрин, 4-[ [ (б-Хлорпиридин-3-
ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Х)-он, Тиодикарб,
Авермецтин, Флоницамид, Пиридалил, Спиромесифен, Сульфоксафлор;
фунгициды для защиты хлопка: Азоксистробин, Биксафен, Боскалид,
Карбендазим, Хлорталонил, Медь, Ципроконазол, Дифеноконазол,
Димоксистробин, Эпоксиконазол, Фенамидон, Флуазинам, Флуопирам,
Флуоксастробин, Флуксапироксад, Ипродион, Изопиразам,
Изотианил, Манцозеб, Манеб, Метоминостробин, Пентиопирад,
Пикоксистробин, Пропинеб, Протиоконазол, Пираклостробин,
Квинтозен, Тебуконазол, Тетраконазол, Тиофанат-метил,
Трифлоксистробин; гербициды для защиты соевых бобов: Алахлор,
Бентазон, Трифлуралин, Хлоримурон-этил, Клорансулам-метил,
Феноксапроп, Фомесафен, Флуазифоп, Глифосат, Имазамокс,
Имазаквин, Имазетапир, (С-)Метолахлор, Метрибузин,
Пендиметалин, Тепралоксидим, Глуфосинат; инсектициды для защиты
соевых бобов: Лямбда-цигалотрин, Метомил, Имидаклоприд,
Клотианидин, Тиаметоксам, Тиаклоприд, Ацетамиприд, Динетофуран,
Флубендиамид, Ринаксипир, Циазипир, Спиносад, Спиноторам,
Эмамецтин-бензоат, Фипронил, Этипрол, Дельтаметрин, р-
Цифлутрин, гамма- и лямбда-Цигалотрин, 4-[ [ ( б-Хлорпиридин-3-
ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Х)-он, Спиротетрамат,
Спинодиклофен, Трифлумурон, Флоницамид, Тиодикарб, бета-
Цифлутрин; фунгициды для защиты соевых бобов: Азоксистробин,
Биксафен, Боскалид, Карбендазим, Хлорталонил, Медь,
Ципроконазол, Дифеноконазол, Димоксистробин, Эпоксиконазол,
Флуазинам, Флуопирам, Флуоксастробин, Флутриафол,
Флуксапироксад, Изопиразам, Ипродион, Изотианил, Манкозеб,
Манеб, Метконазол, Метоминостробин, Миклобутанил, Пентиопирад,
Пикоксистробин, Пропиконазол, Пропинеб, Протиоконазол,
Пираклостробин, Тебуконазол, Тетраконазол, Тиофанат-метил, Трифлоксистробин; гербициды для защиты сахарной свеклы: Хлоридазон, Десмедифам, Этофумесат, Фенмедифам, Триаллат, Клопиралид, Флуазифоп, Ленацил, Метамитрон, Квинмерак, Циклоксидим, Трифлусульфурон, Тепралоксидим, Квизалофоп; инсектициды для защиты сахарной свеклы: Имидаклоприд, Клотианидин, Тиаметоксам, Тиаклоприд, Ацетамиприд, Динетофуран,
Дельтаметрин, р-Цифлутрин, гамма/лямбда-Цигалотрин, 4-[[(6-
Хлорпиридин-З-ил)метил](2,2-дифторэтил)амино]фуран-2(5Х)-он,
Тефлутрин, Ринаксипир, Циаксипир, Фипронил, Карбофуран;
гербициды для защиты канолы: Клопиралид, Диклофоп, Флуазифоп,
Глуфосинат, Глифосат, Метазахлор, Трифлуралин этаметсульфурон,
Квинмерак, Квизалофоп, Цлетодим, Тепралоксидим; фунгициды для
защиты канолы: Азоксистробин, Биксафен, Боскалид, Карбендазим,
Ципроконазол, Дифеноконазол, Димоксистробин, Эпоксиконазол,
Флуазинам, Флуопирам, Флуоксастробин, Флусилазол,
Флуксапироксад, Ипродион, Изопиразам, Мепикват-хлорид,
Метконазол, Метоминостробин, Паклобутразол, Пентиопирад,
Пикоксистробин, Прохлораз, Протиоконазол, Пираклостробин,
Тебуконазол, Тиофанате-метил, Трифлоксистробин, Винклозолин;
инсектициды для защиты канолы: Карбофуран, Тиаклоприд,
Дельтаметрин, Имидаклоприд, Клотианидин, Тиаметоксам,
Ацетамиприд, Динетофуран, р-Цифлутрин, гамма- и лямбда-Цигалотрин, тау-Флувалериат, Этипрол, Спиносад, Спиноторам, Флубендиамид, Ринаксипир, Циазипир, 4-[[(б-Хлорпиридин-3-ил)метил](2,2-дифлуоретил)амино]фуран-2(5Х)-он.
Нижеследующие примеры предлагаются для иллюстрации, но не для ограничения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение и тестирование гибридных белков Axmill5
Axmill5 описан в патентной публикации США 20100004176 (аминокислотная последовательность приведена здесь как SEQ ID N0:43). Указанный ген на 70% гомологичен последовательности Vip3Aa. Оптимизированную по кодонам версию Axmill5 (в данном документе ее также называют Axmill5v01 и описывают как SEQ ID N0:42) клонируют и экспрессируют, используя вектор экспрессии Е coli. Биоанализ in vitro демонстрирует, что полученный белок обладает пестицидной активностью в отношении разных насекомых-вредителей, таких как мотылек кукурузный (ЕСВ), совка хлопковая (CEW), совка травяная (FAW) и совка-ипсилон (BCW).
Axmi0 05 также описан в патентной публикации США
20100004176. Указанный ген на 94% гомологичен
последовательности Vip3Aa. Оптимизированную по кодонам версию Axmi005 (optAxmi005, описанную здесь как SEQ ID N0:44) клонируют и экспрессируют, используя вектор экспрессии Е coli. Биоанализ in vitro демонстрирует, что полученный белок обладает пестицидной активностью в отношении разных насекомых-вредителей, таких как Helicoverpa zea (Hz), Heliothis virescens
(Hv), FAW, BCW, огневка сахарного тростника (SCB) и ложногусеница бархатных бобов (VBC).
Относительная активность Axmill5 является низкой в отношении Hz и FAW по сравнению с Axmi0 05. Кроме того, как отмечено выше, Axmi005 не обладает активностью в отношении ЕСВ. Чтобы идентифицировать домены, отвечающие за характерную специфичность и активность двух белков, получают конструкции, обеспечивающие экспрессию гибридов optAxmi005 и кодон-оптимизированной версии Axmill5 (optAxmill5v01), как описано ниже и показано на фиг.1. Белок экспрессируют в Е. coli и тестируют против ЕСВ, Hz, FAW и BCW с помощью биоанализа in vitro. Белок, экспрессированный с использованием рАХб307
(Axmill5v02.01, описанный здесь как SEQ ID N0:1) обладает повышенной активностью по сравнению с белком, экспрессированным с использованием рАХ5477 (Axmill5v01, описанный здесь как SEQ ID N0:42), в отношении всех четырех участвующих в тестировании вредителей.
Ген, экспрессированный в pAX6307 (Axmill5v02.01) , помещают в растительный вектор экспрессии pAG6141, в котором экспрессия белка находится под управлением промотора убихитина сахарного тростника.
Образцы листьев трансгенных растений, экспрессирующих Axmill5v01 и Axmill5v02.01, тестируют с помощью лабораторного биоанализа с использованием насекомых против ЕСВ, Hz, FAW и BCW и с помощью полевого анализа против ЕСВ, Hz и FAW. Результаты показывают, что усовершенствованный ген Axmill5v02.01 обладает более высокой эффективностью в отношении всех участвующих в тестировании вредителей.
Описание конструкций
Аминокислотные последовательности, полученные путем
компьютерного моделирования трансляции последовательностей ДНК Vip3Aa, Axmi005, Axmill5v01, Axmil63 и Axmil84, выравнивают, чтобы идентифицировать консервативные аминокислоты во всех гомологах (Axmil63 и Axmil84 описаны в патентной публикации США 20100004176).
Праймеры ПЦР конструируют для трех консервативных участков Axmi005 и Axmill5v01, используя последовательность optAxmi005, присутствующую в рАХ54 7 8 (который содержит кодон-оптимизированную версию Axmi005, описанную в SEQ ID N0:44), и последовательность optAxmill5, присутствующую в рАХ54 7 7 (который содержит кодон-оптимизированную версию Axmill5). Три гибридных гена получают методом ПЦР с перекрыванием (смотрите фиг.1).
Конструкции гибридного гена
ДНК гибридных генов, полученных с помощью указанных реакций ПЦР, клонируют в векторе экспрессии Е. coli pRSflB. Полученные векторы экспрессии показаны в таблице 1. Белок экспрессируют с помощью известных методов и экстракт Е. coli тестируют, используя биоанализ in vitro.
Биоанализ in vitro
Неочищенные экстракты Е. coli после экспрессии векторов анализируют против Hz, ЕСВ, FAW и BCW. Результаты показаны в таблице 2 (замедление роста) и в таблице 3 (смертность).
* Система оценки:
Процент смертности
0 = эффект не наблюдается
1 = легкое неравномерное замедление роста
2 = умеренное неравномерное замедление роста
3 = равномерное замедление роста от умеренного до тяжелого
4 = смертность ( <100%) с равномерным замедлением роста
5 = полная смертность
рАХ5477 (Axmill5v01)
Белок, экспрессированный из вектора рАХб307 (гибрид А) и отличающийся шестью аминокислотами, обозначают Axmill5v02.01. Аминокислотная последовательность данного гибридного белка описанаю в SEQ ID N0:15.
Векторы, обеспечивающие экспрессию Axmill5v01 (рАХ547б) и Axmill5v02.01 (pAX6307) в Е coli, содержат N-концевые маркеры бх His. Два белка очищают, используя никель-связывающие свойства маркера бх His. Разные концентрации очищенного белка анализируют с помощью биоанализа in vitro против ЕСВ, FAW, BCW и совки малой (BAW). Результаты показывают, что во всех случаях Axmill5v02.01 обладает повышенной активностью по сравнению с Axmill5v01 (таблицы 4 и 5).
Таблица 4
Оценка замедления роста
Axmill5v01
0, 01
Axmill5v02
75%
50%
Axmill5v02
25%
50%
Axmill5v02
25%
Axmill5v02
0,1
Axmill5v02
0, 01
Дисковый биоанализ листьев растений
Axmill5v01 (SEQ ID N0:42) и Axmi 115v02 . 01 (SEQ ID N0:1) клонируют в растительных векторах экспрессии pAG6585 и pAG6141, соответственно, и получают трансгенные растения маиса. Берут образцы для анализа методом ПЦР и вестерн-блоттинга, а также для дискового биоанализа листьев in vitro против Hz, ЕСВ, FAW и BCW. Оценка результатов биоанализа включает в себя отсутствие повреждений, низкую степень повреждений (1 - несколько дыр), умеренную степень повреждений и тяжелую степень повреждений. Неповрежденные и слабоповрежденные растения рассматривают как положительный результат, а умеренно- или сильноповрежденные растения рассматривают как отрицательный результат.
Вещество листьев растений, положительных по результатам
ПЦР и вестерн-блоттинга, подвергают дисковому биоанализу in
vitro. На фиг.2А для каждой конструкции показан процент ПЦР-
положительных растений, которые по результатам биоанализа имеют
оценку неповрежденные, слабоповрежденные, умеренноповрежденные
или сильноповрежденные. Результаты вестерн-блоттинга
демонстрируют, что уровень экспрессии белка в растениях, экспрессирующих optAxmill5v02.01, как правило, выше, чем в растениях, экспрессирующих Axmill5v01.
Получают другие трансгенные растения, экспрессирующие Axmill5v02.01. Вещество листьев растений, положительных по результатам ПЦР и вестерн-блоттинга, подвергают дисковому биоанализу in vitro против Hz, ЕСВ, FAW и BCW. Результаты приведены на фиг.2Ь.
Полевые испытания растений
Растения, экспрессирующие гены, показанные в таблице б, выращивают на опытном участке Polk County, IA. Отрицательные
сегрегаты идентифицируют и удаляют путем применения 1* глифосата (20 унций (567 г)/А Buccaneer 5, Tenkoz, Inc.), когда растения находятся на стадии развития листьев V3-V4. Нагрузку насекомыми обеспечивают путем заражения ЕСВ, Hz и FAW вручную.
Заражения ЕСВ имитируют природную встречаемость первого и второго поколений. Всего примерно 34 0 личинок ЕСВ наносят либо на пучки листьев (первое поколение, ЕСВ1), либо в пазухи листьев (второе поколение, ЕСВ2) каждого растения. ЕСВ1 оценивают по шкале Гутри, включающей в себя оценки 1-9. ЕСВ2 используют для измерения общей длины стеблевого канала в см.
Двадцать личинок Hz наносят на верхушки колосков каждого растения. В природе также существует умеренное заражение Hz, которое доплниет указанные ручные заражения. Повреждение колосков измеряют в кв. см.
Примерно 60 личинок FAW наносят на пучки листьев. Повреждение измеряют по модифицированной оценочной шкале Дэвиса, включающей в себя оценки 1-9, как описано ниже.
Результаты указанных полевых испытаний приведены в таблице
Результаты полевых испытаний
FAW - Описание модифицированной оценочной шкалы Дэвиса, включающей в себя оценки 1-9.
1. Видимые повреждения отсутствуют или присутствуют только крошечные отверстия на завитых листьях.
2. Присутствуют крошечные отверстия и небольшие круглые повреждения на завитых листьях.
3. Небольшие круглые повреждения и несколько мелких
удлиненных (прямоугольной формы) повреждений длиной до 1,3 см (1/2 дюйма) присутствуют на завитых и скрученных листьях.
4. Несколько удлиненных повреждений размером от маленьких до средних, составляющих в длину от 1,3 до 2,5 см (от 1/2 до 1 дюйма), присутствуют на нескольких завитых и скрученных листьях.
5. Несколько крупных удлиненных повреждений длиной более 2,5 см (1 дюйм) присутствуют на нескольких завитых и скрученных листьях и/или несколько отверстий правильной или неправильной формы (съедена базальная мембрана) выедены в завитых и скрученных листьях.
6. Несколько крупных удлиненных повреждений присутствуют на нескольких завитых и скрученных листьях и/или несколько крупных отверстий правильной или неправильной формы выедены в завитых/скрученных листьях.
7. Большое число удлиненных повреждений всех размеров присутствует на нескольких завитых и скрученных листьях плюс несколько крупных отверстий правильной или неправильной формы выедены в завитых и скрученных листьях.
8. Большое число удлиненных повреждений всех размеров присутствует на большей части завитых и скрученных листьев плюс много отверстий размером от среднего до крупного правильной или неправильной формы выедены в завитых и скрученных листьях.
9. Завитые и скрученные листья почти полностью разрушены.
Davis, F. М., S. S. Ng, and W.P. Williams. 1992. Visual
rating scales for screening whorl-stage corn for resistance to fall armyworm. Miss. Agric. Forestry Exp. Stn. Tech. Bull. 186.
ECB - Описание оценочной шкалы Гутри, включающей в себя оценки 1-9.
1. Отсутствие видимого повреждения листа.
2. Немного червоточин на небольшом количестве листьев.
3. Червоточины присутствуют на нескольких листьях.
4. Несколько листьев с червоточинами и продолговатыми повреждениями.
5. Несколько листьев с продолговатыми повреждениями.
6. Несколько листьев с продолговатыми повреждениями длиной
примерно 2,5 см.
7. Длинные повреждения, присутствующие примерно на
половине листьев.
8. Длинные повреждения, присутствующие примерно на двух
третях листьев.
9. Длинные повреждения на большей части листьев.
Guthrie, W. D. , F. F. Dicke, and С. R. Neiswander. 1960.
Leaf and sheath feeding resistance to the European corn borer in eight inbred lines of dent corn. Ohio. Agric. Exp. Sta. Res. Bull. 860.
Пример 2. Направленное развитие Axmill5v02
Метод направленного развития используют для улучшения
профиля эффективности и активности Axmill5 против ЕСВ, Hz, FAW,
BCW и VBC. Чтобы идентифицировать Axmill5, участвующий в
обеспечении токсичности против насекомых, получают ряд
вариантов последовательностей Axmill5/Axmi0 05 путем
перестановок в С-концевой части Axmill5. Определяют двадцать один блок различающихся последовательностей Axmill5 и Axmi005 (смотрите патентную публикацию США № 20100004176, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки во всей полноте), после чего указанные блоки последовательности Axmill5 заменяют соответствующими блоками последовательности Axmi005. Биоанализы гибридных белков показывают, что замены блоков 2, 3, 10 и 18 связаны с повышением токсичности в отношении насекомых.
Получают библиотеки точечных мутаций для конкретных положений в блоках 2, 3, 10 и 18. Указанные библиотеки точечных мутаций анализируют против ЕСВ, Hz, FAW, BCW и VBC с 1,5* охватом и 4 повторами. Повторные анализы проводят с 4 повторами и затем масштабируют до 16 повторов. Следующие точечные мутации соответствуют улучшенной активности против одного или нескольких вредителей:
Указанные варианты содержат мутации в С-концевой области. Чтобы отследить улучшения, синергические с Axmill5v02 (рАХ6307), С-концевую часть нескольких из вышеуказанных мутантов клонируют в Axmill5v02 (рАХ6307). Проводят анализы с масштабированием и идентифицируют варианты, обладающие
Активность точечных мутантов Axmill5
улучшенной активностью по сравнению с Axmill5v02.
Активность мутантов Axmill5v02
Ген
ECB
FAW
VBC
BCW
Замедление роста
% смертности
Замедление роста
% смертности
Замедление роста
% смертности
Замедление роста
% смертности
Замедление роста
% смертности
axmi-115 v02
3,50
14,84
3,75
45,31
4,00
72,27
4,00
16,67
2,08
4,17
115B2L11H6 (v02)-evo27
3,67
13,02
3,67
52,08
4,00
84,38
4,00
35,16
1,50
0,00
115B18L12B10(v02)-evo28
3,33
15,63
3,67
26,56
4,00
60,94
4,00
1,56
2,25
0,00
115B2L11H7 (v02)
3,33
10,94
3,67
33,33
4,00
56,77
4,00
3,91
2,00
0,00
115B18L12A10(v02)
3,33
16,15
3,67
27,08
4,00
60,94
4,00
0,78
2,13
0,00
115B2L11F9 (v02)-evo29
3,67
6,88
3,67
54,17
4,00
86,98
4,00
34,38
1,38
3,13
Вариант Axmill5 B2L11H6 (v02) обладает улучшенной
активностью против Н. zea, VBC, FAW. Его обозначают
Axmill5v02(evo27). Нуклеотидная последовательность
Axmill5v02(evo2 7) описана в SEQ ID N0:4, а кодируемая ею аминокислотная последовательность описана в SEQ ID N0:18.
Вариант Axmill5 B18L12B10 (v02) обладает улучшенной активностью против ЕСВ. Его обозначают Axmill5v02(evo28). Нуклеотидная последовательность Axmill5v02(evo28) описана в SEQ ID N0:5, а кодируемая ею аминокислотная последовательность описана в SEQ ID N0:19.
Вариант Axmill5 B2L11F9 (v02) обладает улучшенной
активностью против H.zea, VBC, FAW. Его обозначают
Axmill5v02(evo29). Нуклеотидная последовательность
Axmill5v02(evo29) описана в SEQ ID N0:6, а кодируемая ею аминокислотная последовательность описана в SEQ ID N0:20.
В С-концевой участок последовательности Axmill5v02 вводят и другие мутации. Идентифицируют три варианта с улучшенной активностью по сравнению с Axmill5v02 (таблица 9) . Определяют значения LC50 и ЕС50 для двух из указанных С-концевых мутантов (таблица 10).
Axmill5v02(EV031) обуславливает более высокую смертность у FAW, пяденицы соевых бобов (SBL) и VBC, чем Axmill5v02. Нуклеотидная последовательность Axmill5v02(evo31) описана в SEQ ID N0:7, а аминокислотная последовательность описана в SEQ ID N0:21.
Axmill5v02(EV032) обуславливает более высокую смертность у ЕСВ и Н. Zea, чем Axmill5v02. Нуклеотидная последовательность Axmill5v02(evo32) описана в SEQ ID N0:8, а аминокислотная последовательность описана в SEQ ID N0:22.
Axmill5v02(EV03 8) обуславливает более высокую смертность у BCW, чем Axmill5v02. Нуклеотидная последовательность Axmill5v02(evo38) описана в SEQ ID N0:47, а аминокислотная последовательность описана в SEQ ID N0:48.
Активность С-концевых мутантов Axmill5v02
Ген
ECB
FAW
VBC
BCW
Замедление роста
смертности
Замедление роста
смертности
Замедление роста
смертности
Замедление роста
смертности
Замедление роста
смертности
Axmill5v02
3,3
11,5
4,0
16,5
4,0
80,2
4,0
13,8
2,8
1,1
Axmill5v02(evo31)
3,4
28,6
4,0
20,7
4,0
81,4
4,0
14,3
2,4
0,0
Axmill5v02(evo32)
3,4
30,0
4,0
18,2
4,0
94,4
4,0
35,0
3,0
0,0
Axmill5v02(evo38)
0,2
0,0
4,0
15,7
4,0
87,1
4,0
10,5
3,6
6,6
LC50 и ЕС50 С-концевых мутантов
Ген
ECB
FAW
VBC
SBL
BCW
LC50
EC50
LC50
ЕС50
LC50
LC50
LC50
ЕС50
LC50
Axmill5v02
20 мкг/мл
мкг/мл
6,3 мкг/мл
1,3 мкг/мл
400
нг/мл
280 нг/мл
339 мкг/мл
14,3 мкг/мл
7,6 мкг/мл
Axmill5v02 (evo31)
мкг/мл
4,5 мкг/мл
2,4 мкг/мл
240 нг/мл
120
нг/мл
нг/мл
185 мкг/мл
12 мкг/мл
27,3 мкг/мл
Axmill5v02 (evo32)
12,3 мкг/мл
4,3 мкг/мл
6 мкг/мл
400
нг/мл
520 нг/мл
520 нг/мл
42,5 мкг/мл
13,3 мкг/мл
16,6
мкг/мл
SBL = Пяденица соевых бобов
Пример 3. Дополнительные анализы пестицидной активности
Нуклеотидные последовательности настоящего изобретения можно тестировать на способность продуцировать пестицидные белки. Способность пестицидного белка действовать на вредителя как пестицид часто анализируют с помощью ряда способов. Один хорошо известный в данной области способ включает в себя проведение пищевого анализа. В таком пищевом анализе вредителя подвергают либо воздействию образца, содержащего соединения, подлежащие тестированию, либо воздействию контрольного образца. Обычно такой анализ проводят путем помещения тестируемого вещества или подходящего разведения такого вещества на материал, проглатываемый вредителем, такой как искусственная питательная среда. Тестируемое вещество может представлять собой жидкое вещество, твердое вещество или взвесь. Подлежащее тестированию вещество можно поместить на поверхность и затем оставить сохнуть. Альтернативно, тестируемое вещество можно смешать с жидкой искусственной питательной средой и затем распылить в аналитической камере. Аналитическая камера может представлять собой, например, чашку, блюдо или лунку титрационного микропланшета.
В анализах с использованием сосущих вредителей (таких как тли) тестируемое вещество можно отделить от насекомого перегородкой, в идеале используют перегородку, которую могут проткнуть сосущие части рта сосущего насекомого, чтобы обеспечить проглатывание тестируемого вещества. Обычно тестируемое вещество смешивают со средством, стимулирующим потребление пищи, таким как сахароза, чтобы обеспечить проглатывание тестируемого соединения.
Другие типы анализов могут включать в себя микроинъекцию тестируемого вещества в рот или кишку вредителя, а также получение трансгенных растений с последующим тестированием способности вредителя кормиться на трансгенном растении. Тестирование растений может включать в себя заключение обычно потребляемых частей растений, например, в маленькие клетки, присоединенные к листьям, или заключение целых растений в клетки, содержащие насекомых.
В данной области также известны другие способы и подходы к анализам, в которых используются вредители, они описаны, например, в Robertson and Preisler, eds. (1992) Pesticide bioassays with arthropods, CRC, Boca Raton, FL. Альтернативно, такие анализы часто описываются в журналах Arthropod Management Tests и Journal of Economic Entomology, или обсуждаются членами Энтомологического общества Америки (ESA).
В некоторых воплощениях участки ДНК, кодирующие токсичные участки раскрытых здесь пестицидных белков, клонируют в векторе pMAL-C4x, обеспечивающем экспрессию в Е. Coli, после гена malE, кодирующего белок, связывающий мальтозу (МВР). Указанное объединение в одной рамке считывания приводит к экспрессии в Е. coli гибридных белков MBP-Axmi.
Для проведения экспрессии в Е. coli BL21*DE3 трансформируют отдельными плазмидами. Отдельные колонии инокулируют в LB, содержащий карбенициллин и глюкозу, и выращивают в течение ночи при 37°С. На следующий день в свежую среду вносят 1% культивируемой в течение ночи культуры и выращивают при 37°С до достижения логарифмической фазы роста. Затем культуры индуцируют 0,3 мМ IPTG в течение ночи при 20°С. Каждый клеточный осадок суспендируют в 2 0 мМ буфере Tris-HCl, рН 7,4 плюс 2 00 мМ NaCl, плюс 1 мМ DTT, плюс ингибиторы протеаз, и обрабатывают ультразвуком. Экспрессию гибридных белков можно подтвердить методом SDS-PAGE.
Затем все не содержащие клеток экстракты пропускают через амилозную колонку, присоединенную к системе жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC), где происходит афинная очистка гибридных белков MBP-axmi. Связанные гибридные белки элюируют со смолы 10 мМ раствором мальтозы. Затем очищенные гибридные белки расщепляют либо фактором Ха, либо трипсином, чтобы удалить амино-концевой маркер МВР из белка Axmi. Расщепление и растворимость белков можно определить методом SDS-PAGE
Пример 4. Конструирование синтетических
последовательностей
В одном аспекте настоящего изобретения получают
синтетические последовательности axmi. Указанные синтетические последовательности содержат измененные последовательности ДНК по сравнению с исходной последовательностью axmi и кодируют белок, коллинеарный исходному белку AXMI, которому он соответствует, но утративший С-концевой "кристаллический домен", присутствующий во многих дельта-эндотоксинах.
В другом аспекте настоящего изобретения модифицированные
версии синтетических генов конструируют так, чтобы направить
полученный пептид в органеллу растения, такую как
эндоплазматический ретикулум или апопласт. Пептидные
последовательности, которые заведомо обеспечивают направление
гибридных белков в растительные органеллы, известны в данной
области. Например, в даной области известно, что N-концевой
участок гена кислой фосфатазы белого люпина Lupinus albus
(Genebank ID GI: 14276838; Miller et al. (2001) Plant
Physiology 127: 594-606) обеспечивает направление
гетерологичных белков в эндоплазматический ретикулум. Если полученный гибридный белок также содержит последовательность удерживания в эндоплазматическом ретикулуме, содержащую пептид N-конец-лизин-аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота-лейцин (т.е. мотив "KDEL" (SEQ ID N0:46)) на С-конце, гибридный белок направляется в эндоплазматический ретикулум. Если гибридный белок не содержит последовательность, обеспечивающую направление в эндоплазматический ретикулум, на С-конце, этот белок будет направляться в эндоплазматический ретикулум, но затем он будет удаляться в апопласт.
Пример 5. Трансформация клеток маиса описанными здесь генами пестицидных белков
Початки кукурузы предпочтительно собирают через 8-12 дней после опыления. Из початков выделяют зародыши, причем для трансформаци предпочтительно используют зародыши размером 0,81,5 мм. Зародыши помещают щитком вверх на подходящую инкубационную среду, такую как среда DN62A5S (3,98 г/л солей N6; 1 мл/л (ЮООх разведение исходного раствора) витаминов N6; 800 мг/л L-аспарагина; 100 мг/л миоинозитола; 1,4 г/л L-пролина; 100 мг/л казаминовых кислот; 50 г/л сахарозы; 1 мл/л
(1 мг/мл исходного ратсвора) 2,4-D). Однако можно использовать известные в данной области среду и соли, отличные от DN62A5S. Зародыши инкубируют в течение ночи при 25°С в темноте. Однако инкубация зародышей в течение ночи не является необходимой как таковая.
Полученные эксплантаты переносят на планшеты с отверстиями (30-40 на планшет), затем на осмотическую среду в течение
примерно 30-45 минут, и затем на планшет для облучения (смотрите, например, публикацию РСТ № WO/0138514 и патент США №
5240842) .
Конструкции ДНК, сконструированные для переноса генов настоящего изобретения в растительные клетки, внедряют в ткань растения с помощью аэрозольного лазерного ускорителя, по существу в условиях, описанных в публикации РСТ № WO/0138514. После облучения зародыши инкубируют в течение примерно 3 0 мин на осмотической среде, затем помещают в среду для инкубации и инкубируют в течение ночи при 25°С в темноте. Чтобы избежать излишнего повреждения облученных эксплантатов, их инкубируют в течение, по меньшей мере, 24 часов перед переносом в среду для регенерации. Затем зародыши распределяют на периодической среде для регенерации в течение примерно 5 дней, при 25°С, в темноте, после чего переносят в среду для селекции. Эксплантаты инкубируют в среде для селекции до восьми недель, в зависимости от типа и характеристик конкретного используемого способа селекции. По окончанию периода селекции полученный каллюс переносят на среду для созревания зародышей, где его держат до визульного подтверждения образования зрелых соматических зародышей. Затем полученные зрелые соматические зародыши помещают в условия слабой освещенности и инициируют процесс регенерации с помощью звестных в данной области способов. Полученные побеги оставляют укореняться на среде для укоренения, после чего полученные растения переносят в горшки для рассады и выращивают трансгенные растения.
Материалы Среда DN62A5S
Компоненты
На литр
Источник
Основная солевая смесь Chu's № 6 (№ продукта С 416)
3,98 г/л
Phytotechnology Labs
Витаминный раствор Chu's № б (№ продукта С 14 9)
1 мл/л (1000-кратное разведение исходного раствора)
Phytotechnology Labs
L-Аспарагин
8 00 мг/мл
Phytotechnology Labs
Миоинозитол
100 мг/мл
Sigma
L-Пролин
1,4 г/л
Phytotechnology Labs
Казаминовые кислоты
100 мг/мл
Fisher Scientific
Сахароза
50 г/л
Phytotechnology Labs
2,4-D (№ продукта D-7299)
1 мл/л (1 мг/мл исходного раствора)
Sigma
рН раствора доводят до 5,8 используя 1 н. КОН/1 н. КС1, добавляют гелрит (Sigma) в концентрации до 3 г/л и затем среду автоклавируют. После охлаждения до 50°С добавляют 2 мл/л исходного раствора нитрата серебра с концентрацией 5 мг/мл (Phytotechnology Labs).
Пример 6. Трансформация растительных клеток генами настоящего изобретения методом Agrobacterium-опосредованной трансформации
Початки предпочтительно собирают через 8-12 дней после опыления. Из початков выделяют зародыши, причем для трансформаци предпочтительно используют зародыши размером 0,81,5 мм. Зародыши помещают щитком вверх на подходящую инкубационную среду и инкубируют в течение ночи при 25°С в темноте. Однако инкубация зародышей в течение ночи не является необходимой как таковая. Зародыши приводят в контакт со штаммом Agrobacterium, содержащим векторы, подходящие для Ti-плазмида-опосредованного переноса в течение примерно 5-10 мин, после чего их помещают на чашки, содержащие среду для совместного
культивирования, где держат в течение примерно 3 дней (25°С в темноте). После совместного культивирования эксплантаты переносят на периодическую среду для регенерации и держат в ней в течение примерно пяти дней (при 25°С в темноте). Эксплантаты инкубируют в среде для селекции до восьми недель, в зависимости от типа и характеристик конкретного используемого способа селекции. По окончанию периода селекции полученный каллюс переносят на среду для созревания зародышей, где его держат до визульного подтверждения образования зрелых соматических зародышей. Затем полученные зрелые соматические зародыши помещают в условия слабой освещенности и инициируют процесс регенерации с помощью звестных в данной области способов.
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, свидетельствуют об уровне специалистов в области, к которой принадлежит нстоящее изобретение. Все публикации и патентные заявки включены в данный документ в качестве ссылки в такой степени, как если бы для каждой отдельной публикации или патентной заявки было бы специально и отдельно указано, что она включена в данный документ в качестве ссылки.
Хотя вышеприведенное изобретение описано с некоторыми подробностями, приведенными для иллюстрации и примера с целью улучшения понимания, очевидно, что можно внести определенные изменения и модификаци в пределах объема приложенной формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Desai, Nalini
Heinrichs, Volker Lehtinen, Duane
<120> ВАРИАНТ ИНСЕКТИЦИДНОГО ГЕНА AXMI115 И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
<130> (TBD)
<150> 61/471848 <151> 2011-04-05
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2415
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
aagctgaagc
agaactacca
ggtggacaac
cagagcttga
gcgagatcgt
ctacctggac
atcgacaagc
tcttctgccc
ggagaactca
gagcagaagt
actacaccaa
gaacctcacc
ttccctgatg
gatatgtcat
caccaagatc
accttcgaga
agaagctgaa
caacctcatc
tacgaggcca
ccgccaactt
ctatgatcca
tcaacaggag
acatcgacct
caacaagaag
caagtggaga
gcaccttccc
tcaaacagac
tacatcacca
tggacattgg
agatgatgat
ggcatctaca
tgccgctcgg
cgtcatctca
gaaaccttct
tgacgcccat
caacagcttc
ggcctggagg
tggacgccaa
gagcaagacc
ttgacgctca
agtgcaagag
ctacctcagg
gagtacctgc
tggagagtga
tttgaagaac
aaggagacag
ggctgatcgc
gccgccaaat
gtgttcatca
gcaatgtggt
gaagaactgg
gacatcgagg
aggattcatt
ggagccatgg
gtggccaaca
acaagaatgc
ttatgtggac
aacaccggcg
gcattgaaag
aagcaaggcg
ctcttcaccc
aaggagatgg
agagttcagc
cagttcatcg
gcgacaagct
aaagcccaac
accgactaca
tcatccagta
caccgtcaag
ggcaagccgg
ccatctacct
caagaacaag
agcaccggct
acatcaccta
cgaggacacc
aatggaaatt
ctgaggagtt
ccaaacaatt
gctgtgaagt
tcacctcaga
aacagatttg
agccagaccc
acctggtgtt
caagagccaa
aatggatatg
aagcatgggg
agacaacttc
atcatcctgg
aggccaagct
cttcgagaca
ccagaaagcc
cggagctcat
caagttcaat
gattgggaga
ggttcggcac
cacctacatc
accggcaatg
agctgaggat
tgatcattca
agaggaggct
acttccgcca
aagcctcaac
atcgacagct
acagcaccta
cgacctcagc
ttcagcttca
gcggcctctg
ggccaaggtg
attgtgaaga
acagccgcgg
cgtggtgctc
ttcgagaagg
tgaagaacaa
tggaagcagc
tatgaggaca
tctcagagag
cttcaccacc
gccagcaaca
aggatggctt
cttcatcgag
ctcaccgccg
agaggacaag
cagcaccttc
cacagcttca
gagacatcag
catcaaggag
aagattgaat
agtaa
1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2415
<210> 2 <211> 2397 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 2
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcaacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa agcagctgca agagatctcc gacaagctgg acatcatcaa tgtcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccggcctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagtttg aggagctcac cttcgccacc gagacaacat tgaaggtgaa gaaggacagc 600
tcgccggcgg acatcctgga tgagctcacc gagctaacag agctggccaa gagcgtcacc 660
aagaatgatg ttgatggctt cgagttctac ctcaacacct tccatgatgt gatggtgggc 720
aacaacctct tcggccgctc ggcgctcaag acggcgtcgg agctgatcgc caaggagaat 780
gtcaagacaa gtggatcaga ggtgggcaat gtctacaact tcctcatcgt gctgacggcg 840
ctgcaagcca aggccttcct caccttgaca acctgccgca agttgctggg cctctccgac 900
atcgactaca cctccatcat gaatgagcac ctcaacaatg agaagaatga gttcagagac 960
aacatcctgc cggcgctgag caacaagttc agcaacccaa gctacgccaa gaccatcggc 1020
tcagacaact acgccaaggt gatcctggag agcgagcctg gctacgcgct ggtgggcttc 1080
gagatcatca atgatccaat tcctgttctc aaggcctaca aggccaagct gaagcagaac 1140
taccaggtgg acaaccagag cttgagcgag atcgtctacc tggacatcga caagctcttc 1200
tgcccggaga actcagagca gaagtactac accaagaacc tcaccttccc tgatggatat 1260
gtcatcacca agatcacctt cgagaagaag ctgaacaacc tcatctacga ggccaccgcc 1320
aacttctatg atccatcaac aggagacatc gacctcaaca agaagcaagt ggagagcacc 1380
ttccctcaaa cagactacat caccatggac attggagatg atgatggcat ctacatgccg 1440
ctcggcgtca tctcagaaac cttcttgacg cccatcaaca gcttcggcct ggaggtggac 1500
gccaagagca agaccttgac gctcaagtgc aagagctacc tcagggagta cctgctggag 1560
agtgatttga agaacaagga gacagggctg atcgcgccgc caaatgtgtt catcagcaat 1620
gtggtgaaga actgggacat cgaggaggat tcattggagc catgggtggc caacaacaag 1680
aatgcttatg tggacaacac cggcggcatt gaaagaagca aggcgctctt cacccaagga 1740
gatggagagt tcagccagtt catcggcgac aagctaaagc ccaacaccga ctacatcatc 1800
cagtacaccg tcaagggcaa gccggccatc tacctcaaga acaagagcac cggctacatc 1860
acctacgagg acaccaatgg aaattctgag gagttccaaa caattgctgt gaagttcacc 1920
tcagaaacag atttgagcca gacccacctg gtgttcaaga gccaaaatgg atatgaagca 1980
tggggagaca acttcatcat cctggaggcc aagctcttcg agacaccaga aagcccggag 2040
ctcatcaagt tcaatgattg ggagaggttc ggcaccacct acatcaccgg caatgagctg 2100
aggattgatc attcaagagg aggctacttc cgccaaagcc tcaacatcga cagctacagc 2160
acctacgacc tcagcttcag cttcagcggc ctctgggcca aggtgattgt gaagaacagc 2220
cgcggcgtgg tgctcttcga gaaggtgaag aacaatggaa gcagctatga ggacatctca 2280
gagagcttca ccaccgccag caacaaggat ggcttcttca tcgagctcac cgccgagagg 2340
acaagcagca ccttccacag cttcagagac atcagcatca aggagaagat tgaataa 2397
<210> 3 <211> 2421 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 3
atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatgaaca tgaacaacac caagctcaat 60
gcaagggcgc tgccgagctt catcgactac ttcaatggca tctatggctt cgccaccggc 120
atcaaggaca tcatgaacat gatcttcaag accgacaccg gcggcaacct caccttggat 180
gagatcctca agaaccagca gctgctgaat gagatctcag gcaagctgga cggcgtcaat 240
ggaagcctca acgacctcat tgctcaaggc aacctcaaca ccgagctgag caaggagatc 300
ctcaagattg caaatgagca gaaccaggtg ctgaatgatg tcaacaacaa gctggacgcc 360
atcaacacca tgctgcacat ctacctgcca aagatcacct caatgctctc tgatgtgatg 420
aagcagaact acgcgctgag cctccagatt gagtacctct caaagcagct gcaagagatc 480
tccgacaagc tggacatcat caatgtcaat gtgctcatca acagcacctt gacagagatc 540
acgccggcct accagaggat caagtatgtc aatgagaagt ttgaggagct caccttcgcc 600
accgagacaa cattgaaggt gaagaaggac agctcgccgg cggacatcct ggatgagctc 660
accgagctaa cagagctggc caagagcgtc accaagaatg atgttgatgg cttcgagttc 720
tacctcaaca ccttccatga tgtgatggtg ggcaacaacc tcttcggccg ctcggcgctc 780
aagacggcgt cggagctgat cgccaaggag aatgtcaaga caagtggatc agaggtgggc 840
aatgtctaca acttcctcat cgtgctgacg gcgctgcaag ccaaggcctt cctcaccttg 900
acaacctgcc gcaagttgct gggcctcgcc gacatcgact acacctccat catgaatgag 960
cacctcaaca aggagaagga ggagttccgc gtcaacatcc tgccaacatt gagcaacacc 1020
ttcagcaacc ccaactacgc caaggtgaag ggctcagatg aagatgccaa gatgattgtg 1080
gaggccaagc ctggccatgc tctggtgggc ttcgagatga gcaacgacag catcaccgtg 1140
ctgaaggtct acgaggccaa gctgaagcag aactaccagg tggacaagga cagcttgtct 1200
gaggtgatct acggcgacat ggacaagctg ctatgtccag atcaaagcga gcagatctac 1260
tacaccaaca acatcgtctt tccaaatgaa tatgtcatca ccaagatcga cttcaccaag 1320
aagatgaaaa cattgagata tgaggtgacg gccaacagct acgacagcag caccggcgag 1380
atcgacctca acaagaagaa ggtggagagc tcagaagctg agtacaggac gctctccgcc 1440
aaggatgatg gcgtctacat gccgctcggc gtcatctcag aaaccttctt gacgcccatc 1500
aatggcttcg gcctccaagc tgatgagaac agcaggctca tcaccttgac ctgcaagagc 1560
tacctcaggg agctgctgct ggccaccgac ctcagcaaca aggagacaaa gctcatcgtg 1620
ccgccatcag gcttcatcag caacatcgtg gagaatggca acctggaagg agagaacctg 1680
gagccatgga tagccaacaa caagaatgct tatgttgatc acaccggcgg cgtcaatgga 1740
acaagggcgc tctatgttca caaggatgga ggcttcagcc agttcatcgg cgacaagctg 1800
aagcccaaga cagaatatgt catccagtac accgtcaagg gcaagccggc catctacctc 1860
aagaacaaga gcaccggcta catcacctac gaggacacca atggaaattc tgaggagttc 1920
caaacaattg ctgtgaagtt cacctcagaa acagatttga gccagaccca cctggtgttc 1980
aagagccaaa atggatatga agcatgggga gacaacttca tcatcctgga ggccaagctc 2040
ttcgagacac cagaaagccc ggagctcatc aagttcaatg attgggagag gttcggcacc 2100
acctacatca ccggcaatga gctgaggatt gatcattcaa gaggaggcta cttccgccaa 2160
agcctcaaca tcgacagcta cagcacctac gacctcagct tcagcttcag cggcctctgg 2220
gccaaggtga ttgtgaagaa cagccgcggc gtggtgctct tcgagaaggt gaagaacaat 2280
ggaagcagct atgaggacat ctcagagagc ttcaccaccg ccagcaacaa ggatggcttc 2340
ttcatcgagc tcaccgccga gaggacaagc agcaccttcc acagcttcag agacatcagc 2400
atcaaggaga agattgaata a 2421
<210> 4
<211> 2412
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 4
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcaacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa agcagctgca agagatctcc gacaagctgg acatcatcaa tgtcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccggcctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600
ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660
gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720
gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780
atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840
atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900
ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020
gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcaccc aaggagatgg aaagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860
agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920
gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980
aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040
ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100
accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160
atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220
attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 2280
tatgaggaca tctcagagag cttcaccacc gccagcaaca aggatggctt cttcatcgag 2340
ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400
aagattgaat aa 2412
<210> 5 <211> 2412 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 5
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcaacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa agcagctgca agagatctcc gacaagctgg acatcatcaa tgtcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccggcctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600
ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660
gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720
gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780
atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840
atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900
ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020
gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcaccc aaggagatgg agagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860
agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920
gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980
aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040
ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100
accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160
atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220
attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 2280
tatgaggaca tctcagagag cttcaccacc atgagcaaca aggatggctt cttcatcgag 2340
ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400
aagattgaat aa 2412
<210> 6 <211> 2412 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 6
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcaacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa agcagctgca agagatctcc gacaagctgg acatcatcaa tgtcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccggcctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600
ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660
gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720
gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780
atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840
atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900
ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020
gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcaccg taggagatgg agagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860
agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920
gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980
aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040
ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100
accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160
atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220
attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 2280
tatgaggaca tctcagagag cttcaccacc gccagcaaca aggatggctt cttcatcgag 2340
ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400
aagattgaat aa 2412
<210> 7
<211> 2409
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 7
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcaacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa agcagctgca agagatctcc gacaagctgg acatcatcaa tgtcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccggcctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600
ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660
gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720
gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780
atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840
atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900
ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020
gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcaccc aaggagatgg agagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860
agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920
gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980
aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040
ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100
accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160
atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220
attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 2280
tatgaggaca tctcagagga cttcaccacc aatggcttta aggatggctt ctatatcgag 2340
ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400
aagattgaa 2409
<210> 8
<211> 2409
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 8
atgaacatga
acaacaccaa
gctcaatgca
agggcgctgc
cgagcttcat
cgactacttc
aatggcatct
atggcttcgc
caccggcatc
aaggacatca
tgaacatgat
cttcaagacc
gacaccggcg
gcaacctcac
cttggatgag
atcctcaaga
accagcagct
gctgaatgag
atctcaggca
agctggacgg
cgtcaatgga
agcctcaacg
acctcattgc
tcaaggcaac
ctcaacaccg
agctgagcaa
ggagatcctc
aagattgcaa
atgagcagaa
ccaggtgctg
aatgatgtca
acaacaagct
ggacgccatc
aacaccatgc
tgcacatcta
cctgccaaag
atcacctcaa
tgctctctga
tgtgatgaag
cagaactacg
cgctgagcct
ccagattgag
tacctctcaa
agcagctgca
agagatctcc
gacaagctgg
acatcatcaa
tgtcaatgtg
ctcatcaaca
gcaccttgac
agagatcacg
ccggcctacc
agaggatcaa
gtatgtcaat
gagaagttcg
acaagctcac
cttcgccacc
gagagcaccc
tccgcgccaa
gcaaggcatc
ttcaatgaag
attcatttga
caacaacacc
ttggagaact
tgacagacct
cgccgagctg
gccaagagca
tcaccaagaa
tgatgtggac
agcttcgagt
tctacctcca
caccttccat
gatgtgctca
tcggcaacaa
cctctttgga
agaagcgcgc
tcaagacggc
atcagagctc
atcaccaagg
atgagatcaa
gacaagcggc
agcgagatcg
gcaaggtcta
cagcttcctc
atcgtgctga
catcattgca
agccaaggcc
ttcctcacct
tgacaacctg
ccgcaagttg
ctgggcctct
ccgacatcga
ctacacctcc
atcatgaatg
agcacctcaa
caatgagaag
aatgagttca
gagacaacat
cctgccggcg
ctgagcaaca
agttcagcaa
cccaagctac
gccaagacca
tcggctcaga
caactacgcc
aaggtgatcc
tggagagcga
gcctggctac
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcaccc aaggagatgg agagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860
agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920
gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980
aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040
ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100
accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160
atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220
attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 2280
tatgaggaca tctcagagca cttcaccacc tggggctata aggatggctt ctttatcgag 2340
ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400
aagattgaa 2409
<210> 9
<211> 2412
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 9
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tcaacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa ggcagctgca agagatctcc gacaagctgg atgtcatcaa cctcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccaagctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600
ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660
gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720
gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780
atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840
atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900
ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020
gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcgtcc aaggagatgg agagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860
agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920
gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980
aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040
ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100
accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160
atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220
attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 2280
tatgaggaca tctcagagag cttcaccacc gccagcaaca aggatggctt cttcatcgag 2340
ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400
aagattgaat aa 2412
<210> 10
<211> 2412
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320
tacgaggcca
ccgccaactt
ctatgatcca
tcaacaggag
acatcgacct
caacaagaag
caagtggaga
gcaccttccc
tcaaacagac
tacatcacca
tggacattgg
agatgatgat
ggcatctaca
tgccgctcgg
cgtcatctca
gaaaccttct
tgacgcccat
caacagcttc
ggcctggagg
tggacgccaa
gagcaagacc
ttgacgctca
agtgcaagag
ctacctcagg
gagtacctgc
tggagagtga
tttgaagaac
aaggagacag
ggctgatcgc
gccgccaaat
gtgttcatca
gcaatgtggt
gaagaactgg
gacatcgagg
aggattcatt
ggagccatgg
gtggccaaca
acaagaatgc
ttatgtggac
aacaccggcg
gcattgaaag
aagcaaggcg
ctcttcaccc
ttggagatgg
agagttcagc
cagttcatcg
gcgacaagct
aaagcccaac
accgactaca
tcatccagta
caccgtcaag
ggcaagccgg
ccatctacct
caagaacaag
agcaccggct
acatcaccta
cgaggacacc
aatggaaatt
ctgaggagtt
ccaaacaatt
gctgtgaagt
tcacctcaga
aacagatttg
agccagaccc
acctggtgtt
caagagccaa
aatggatatg
aagcatgggg
agacaacttc
atcatcctgg
aggccaagct
cttcgagaca
ccagaaagcc
cggagctcat
caagttcaat
gattgggaga
ggttcggcac
cacctacatc
accggcaatg
agctgaggat
tgatcattca
agaggaggct
acttccgcca
aagcctcaac
atcgacagct
acagcaccta
cgacctcagc
ttcagcttca
gcggcctctg
ggccaaggtg
attgtgaaga
acagccgcgg
cgtggtgctc
ttcgagaagg
tgaagaacaa
tggaagcagc
tatgaggaca
tctcagagag
cttcaccacc
gccagcaaca
aggatggctt
cttcatcgag
ctcaccgccg
agaggacaag
cagcaccttc
cacagcttca
gagacatcag
catcaaggag
aagattgaat
1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2412
<210> 11 <211> 2412 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 11
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tcaacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa ggcagctgca agagatctcc gacaagctgg atgtcatcaa cctcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccaagctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600
ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660
gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720
gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780
atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840
atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900
ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020
gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcacca aaggagatgg agagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860
agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920
gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980
aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040
ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100
accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160
atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220
attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 2280
tatgaggaca tctcagagag cttcaccacc gccagcaaca aggatggctt cttcatcgag 2340
ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400
aagattgaat aa 2412
<210> 12
<211> 2412
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 12
atgaacatga
acaacaccaa
gctcaatgca
agggcgctgc
cgagcttcat
cgactacttc
aatggcatct
atggcttcgc
caccggcatc
aaggacatca
tgaacatgat
cttcaagacc
gacaccggcg
gcgacctcac
cttggatgag
atcctcaaga
accagcagct
gctgaatgag
atctcaggca
agctggacgg
cgtcaatgga
agcctcaacg
acctcattgc
tcaaggcaac
ctcaacaccg
agctgagcaa
ggagatcctc
aagattgcaa
atgagcagaa
ccaggtgctg
aatgatgtca
acaacaagct
ggacgccatc
aacaccatgc
tcaacatcta
cctgccaaag
atcacctcaa
tgctctctga
tgtgatgaag
cagaactacg
cgctgagcct
ccagattgag
tacctctcaa
ggcagctgca
agagatctcc
gacaagctgg
atgtcatcaa
cctcaatgtg
ctcatcaaca
gcaccttgac
agagatcacg
ccaagctacc
agaggatcaa
gtatgtcaat
gagaagttcg
acaagctcac
cttcgccacc
gagagcaccc
tccgcgccaa
gcaaggcatc
ttcaatgaag
attcatttga
caacaacacc
ttggagaact
tgacagacct
cgccgagctg
gccaagagca
tcaccaagaa
tgatgtggac
agcttcgagt
tctacctcca
caccttccat
gatgtgctca
tcggcaacaa
cctctttgga
agaagcgcgc
tcaagacggc
atcagagctc
atcaccaagg
atgagatcaa
gacaagcggc
agcgagatcg
gcaaggtcta
cagcttcctc
atcgtgctga
catcattgca
agccaaggcc
ttcctcacct
tgacaacctg
ccgcaagttg
ctgggcctct
ccgacatcga
ctacacctcc
atcatgaatg
agcacctcaa
caatgagaag
aatgagttca
gagacaacat
cctgccggcg
ctgagcaaca
agttcagcaa
cccaagctac
gccaagacca
tcggctcaga
caactacgcc
aaggtgatcc
tggagagcga
gcctggctac
gcgctggtgg
gcttcgagat
catcaatgat
ccaattcctg
ttctcaaggc
ctacaaggcc
aagctgaagc
agaactacca
ggtggacaac
cagagcttga
gcgagatcgt
ctacctggac
atcgacaagc
tcttctgccc
ggagaactca
gagcagaagt
actacaccaa
gaacctcacc
ttccctgatg
gatatgtcat
caccaagatc
accttcgaga
agaagctgaa
caacctcatc
tacgaggcca
ccgccaactt
ctatgatcca
tcaacaggag
acatcgacct
caacaagaag
caagtggaga
gcaccttccc
tcaaacagac
tacatcacca
tggacattgg
agatgatgat
ggcatctaca
tgccgctcgg
cgtcatctca
gaaaccttct
tgacgcccat
caacagcttc
ggcctggagg
tggacgccaa
gagcaagacc
ttgacgctca
agtgcaagag
ctacctcagg
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcaccc aaagtgatgg agagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860
agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920
gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980
aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040
ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100
accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160
atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220
attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 2280
tatgaggaca tctcagagag cttcaccacc gccagcaaca aggatggctt cttcatcgag 2340
ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400
aagattgaat aa 2412
<210> 13 <211> 2412 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 13
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tcaacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa ggcagctgca agagatctcc gacaagctgg atgtcatcaa cctcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccaagctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600
ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660
gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720
gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780
atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840
atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900
ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020
gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcaccc aaggagatgg agttttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca tcatccagta caccgtcaag ggcaagccgg ccatctacct caagaacaag 1860
agcaccggct acatcaccta cgaggacacc aatggaaatt ctgaggagtt ccaaacaatt 1920
gctgtgaagt tcacctcaga aacagatttg agccagaccc acctggtgtt caagagccaa 1980
aatggatatg aagcatgggg agacaacttc atcatcctgg aggccaagct cttcgagaca 2040
ccagaaagcc cggagctcat caagttcaat gattgggaga ggttcggcac cacctacatc 2100
accggcaatg agctgaggat tgatcattca agaggaggct acttccgcca aagcctcaac 2160
atcgacagct acagcaccta cgacctcagc ttcagcttca gcggcctctg ggccaaggtg 2220
attgtgaaga acagccgcgg cgtggtgctc ttcgagaagg tgaagaacaa tggaagcagc 2280
tatgaggaca tctcagagag cttcaccacc gccagcaaca aggatggctt cttcatcgag 2340
ctcaccgccg agaggacaag cagcaccttc cacagcttca gagacatcag catcaaggag 2400
aagattgaat aa 2412
<210> 14
<211> 2412
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115 <400> 14
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tcaacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa ggcagctgca agagatctcc gacaagctgg atgtcatcaa cctcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccaagctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600
ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660
gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720
gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780
atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840
atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900
ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020
gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca acaagaatgc ttatgtggac aacaccggcg gcattgaaag aagcaaggcg 1740
ctcttcaccc aaggagatgg agagttcagc cagttcatcg gcgacaagct aaagcccaac 1800
accgactaca
tcatccagta
caccgtcaag
ggcaagccgg
ccatctacct
caagaacaag
1860
agcaccggct
acatcaccta
cgaggacacc
aatggaaatt
ctgaggagtt
ccaaacaatt
1920
gctgtgaagt
tcacctcaga
aacagatttg
agccagaccc
acctggtgtt
caagagccaa
1980
aatggatatg
aagcatgggg
agacaacttc
atcatcctgg
aggccaagct
cttcgagaca
2040
ccagaaagcc
cggagctcat
caagttcaat
gattgggaga
ggttcggcac
cacctacatc
2100
accggcaatg
agctgaggat
tgatcattca
agaggaggct
acttccgcca
aagcctcaac
2160
atcgacagct
acagcaccta
cgacctcagc
ttcagcttca
gcggcctctg
ggccaaggtg
2220
attgtgaaga
acagccgcgg
cgtggtgctc
ttcgagaagg
tgaagaacaa
tggaagcagc
2280
tatgaggaca
tctcagagag
cttcaccacc
tgcagcaaca
aggatggctt
cttcatcgag
2340
ctcaccgccg
agaggacaag
cagcaccttc
cacagcttca
gagacatcag
catcaaggag
2400
aagattgaat
2412
<210> 15
<211> 803
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 15
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 16 <211> 798
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 16
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
lie Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys Asn Glu Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser Asn Pro Ser Tyr Ala
325 330 335
Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val Ile Leu Glu Ser Glu
340 345 350
Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile Asn Asp Pro Ile Pro
355 360 365
Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Lys Leu Phe
385 390 395 400
Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr Lys Asn Leu Thr Phe
405 410 415
Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe Glu Lys Lys Leu Asn
420 425 430
Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Pro Ser Thr Gly
435 440 445
Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser Thr Phe Pro Gln Thr
450 455 460
Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp Gly Ile Tyr Met Pro
465 470 475 480
Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Ser Phe Gly
485 490 495
Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr Leu Lys Cys Lys Ser
500 505 510
Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asn Lys Glu Thr
515 520 525
Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser Asn Val Val Lys Asn
530 535 540
Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp Val Ala Asn Asn Lys
545 550 555 560
Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu Arg Ser Lys Ala Leu
565 570 575
Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu
580 585 590
Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro
595 600 605
Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr Ile Thr Tyr Glu Asp
610 615 620
Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile Ala Val Lys Phe Thr
625 630 635 640
Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val Phe Lys Ser Gln Asn
645 650 655
Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ala Lys Leu
660 665 670
Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys Phe Asn Asp Trp Glu
675 680 685
Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu Leu Arg Ile Asp His
690 695 700
Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn Ile Asp Ser Tyr Ser
705 710 715 720
Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Trp Ala Lys Val Ile
725 730 735
Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu Lys Val Lys Asn Asn
740 745 750
Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe Thr Thr Ala Ser Asn
755 760 765
Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu Arg Thr Ser Ser Thr
770 775 780
Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu Lys Ile Glu
785 790 795
<210> 17
<211> 795
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 17
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Lys Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn Leu
530 535 540
Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Ile Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Arg Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr
595 600 605
Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly
610 615 620
Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr
625 630 635 640
Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr
660 665 670
Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly
675 680 685
Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly
690 695 700
Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp
705 710 715 720
Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn
725 730 735
Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser
740 745 750
Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly
755 760 765
Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser
770 775 780
Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu Lys Ile Glu
785 790 795
<210> 18 <211> 803
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 18
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Lys Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 19
<211> 803
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 19
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Met Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 20 <211> 803
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 20
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Val Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 21
<211> 803
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 21
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
lie Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Asp Phe
755 760 765
Thr Thr Asn Gly Phe Lys Asp Gly Phe Tyr Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 22
<211> 803
Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 22
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu His Phe
755 760 765
Thr Thr Trp Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 23
<211> 803
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 23
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Val Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 24 <211> 803
Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 24
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Lys Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 25
<211> 803
<212>
Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 25
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Leu Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 26 <211> 803
<212>
Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115 <400> 26
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Lys Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 27
Белок
<211> 803
<212>
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 27
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Val Gly Asp Gly Lys Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 28
<211> 803
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 28
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
lie Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 3б0 3б5
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 4б0
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
4б5 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Ser Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
Белок
<210> 29 <211> 803
^ О 1 О ^ T-i
<212>
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115 <400> 29
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Val Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
lie Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 30
<211> 803
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 30
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
He Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Cys Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 31
<211> 803
Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта AXMI115
<400> 31
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
He Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370 375 380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Met Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<210> 32 <211> 2445
<212> ДНК <213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 32
atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatgaaca tgaacaacac caagctcaat 60
gcaagggcgc tgccgagctt catcgactac ttcaatggca tctatggctt cgccaccggc 120
atcaaggaca tcatgaacat gatcttcaag accgacaccg gcggcaacct caccttggat 180
gagatcctca agaaccagca gctgctgaat gagatctcag gcaagctgga cggcgtcaat 240
ggaagcctca acgacctcat tgctcaaggc aacctcaaca ccgagctgag caaggagatc 300
ctcaagattg caaatgagca gaaccaggtg ctgaatgatg tcaacaacaa gctggacgcc 360
atcaacacca tgctgcacat ctacctgcca aagatcacct caatgctctc tgatgtgatg 420
aagcagaact acgcgctgag cctccagatt gagtacctct caaagcagct gcaagagatc 480
tccgacaagc tggacatcat caatgtcaat gtgctcatca acagcacctt gacagagatc 540
acgccggcct accagaggat caagtatgtc aatgagaagt tcgacaagct caccttcgcc 600
accgagagca ccctccgcgc caagcaaggc atcttcaatg aagattcatt tgacaacaac 660
accttggaga acttgacaga cctcgccgag ctggccaaga gcatcaccaa gaatgatgtg 720
gacagcttcg agttctacct ccacaccttc catgatgtgc tcatcggcaa caacctcttt 780
ggaagaagcg cgctcaagac ggcatcagag ctcatcacca aggatgagat caagacaagc 840
ggcagcgaga tcggcaaggt ctacagcttc ctcatcgtgc tgacatcatt gcaagccaag 900
gccttcctca ccttgacaac ctgccgcaag ttgctgggcc tctccgacat cgactacacc 960
tccatcatga atgagcacct caacaatgag aagaatgagt tcagagacaa catcctgccg 1020
gcgctgagca acaagttcag caacccaagc tacgccaaga ccatcggctc agacaactac 1080
gccaaggtga tcctggagag cgagcctggc tacgcgctgg tgggcttcga gatcatcaat 1140
gatccaattc ctgttctcaa ggcctacaag gccaagctga agcagaacta ccaggtggac 1200
aaccagagct tgagcgagat cgtctacctg gacatcgaca agctcttctg cccggagaac 1260
tcagagcaga agtactacac caagaacctc accttccctg atggatatgt catcaccaag 1320
atcaccttcg agaagaagct gaacaacctc atctacgagg ccaccgccaa cttctatgat 1380
ccatcaacag gagacatcga cctcaacaag aagcaagtgg agagcacctt ccctcaaaca 1440
gactacatca ccatggacat tggagatgat gatggcatct acatgccgct cggcgtcatc 1500
tcagaaacct tcttgacgcc catcaacagc ttcggcctgg aggtggacgc caagagcaag 1560
accttgacgc tcaagtgcaa gagctacctc agggagtacc tgctggagag tgatttgaag 1620
aacaaggaga cagggctgat cgcgccgcca aatgtgttca tcagcaatgt ggtgaagaac 1680
tgggacatcg aggaggattc attggagcca tgggtggcca acaacaagaa tgcttatgtg 1740
gacaacaccg gcggcattga aagaagcaag gcgctcttca cccaaggaga tggagagttc 1800
agccagttca tcggcgacaa gctaaagccc aacaccgact acatcatcca gtacaccgtc 1860
aagggcaagc cggccatcta cctcaagaac aagagcaccg gctacatcac ctacgaggac 1920
accaatggaa attctgagga gttccaaaca attgctgtga agttcacctc agaaacagat 1980
ttgagccaga cccacctggt gttcaagagc caaaatggat atgaagcatg gggagacaac 2040
ttcatcatcc tggaggccaa gctcttcgag acaccagaaa gcccggagct catcaagttc 2100
aatgattggg agaggttcgg caccacctac atcaccggca atgagctgag gattgatcat 2160
tcaagaggag gctacttccg ccaaagcctc aacatcgaca gctacagcac ctacgacctc 2220
agcttcagct tcagcggcct ctgggccaag gtgattgtga agaacagccg cggcgtggtg 2280
ctcttcgaga aggtgaagaa caatggaagc agctatgagg acatctcaga gagcttcacc 2340
accgccagca acaaggatgg cttcttcatc gagctcaccg ccgagaggac aagcagcacc 2400
ttccacagct tcagagacat cagcatcaag gagaagattg aataa 2445
<210> 33 <211> 2430 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 33
atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatgaaca tgaacaacac caagctcaat 60
gcaagggcgc tgccgagctt catcgactac ttcaatggca tctatggctt cgccaccggc 120
atcaaggaca tcatgaacat gatcttcaag accgacaccg gcggcaacct caccttggat 180
gagatcctca agaaccagca gctgctgaat gagatctcag gcaagctgga cggcgtcaat 240
ggaagcctca acgacctcat tgctcaaggc aacctcaaca ccgagctgag caaggagatc 300
ctcaagattg caaatgagca gaaccaggtg ctgaatgatg tcaacaacaa gctggacgcc 360
atcaacacca tgctgcacat ctacctgcca aagatcacct caatgctctc tgatgtgatg 420
aagcagaact acgcgctgag cctccagatt gagtacctct caaagcagct gcaagagatc 480
tccgacaagc tggacatcat caatgtcaat gtgctcatca acagcacctt gacagagatc 540
acgccggcct accagaggat caagtatgtc aatgagaagt ttgaggagct caccttcgcc 600
accgagacaa cattgaaggt gaagaaggac agctcgccgg cggacatcct ggatgagctc 660
accgagctaa cagagctggc caagagcgtc accaagaatg atgttgatgg cttcgagttc 720
tacctcaaca ccttccatga tgtgatggtg ggcaacaacc tcttcggccg ctcggcgctc 780
aagacggcgt cggagctgat cgccaaggag aatgtcaaga caagtggatc agaggtgggc 840
aatgtctaca acttcctcat cgtgctgacg gcgctgcaag ccaaggcctt cctcaccttg 900
acaacctgcc gcaagttgct gggcctctcc gacatcgact acacctccat catgaatgag 960
cacctcaaca atgagaagaa tgagttcaga gacaacatcc tgccggcgct gagcaacaag 1020
ttcagcaacc caagctacgc caagaccatc ggctcagaca actacgccaa ggtgatcctg 1080
gagagcgagc ctggctacgc gctggtgggc ttcgagatca tcaatgatcc aattcctgtt 1140
ctcaaggcct acaaggccaa gctgaagcag aactaccagg tggacaacca gagcttgagc 1200
gagatcgtct acctggacat cgacaagctc ttctgcccgg agaactcaga gcagaagtac 1260
tacaccaaga acctcacctt ccctgatgga tatgtcatca ccaagatcac cttcgagaag 1320
aagctgaaca acctcatcta cgaggccacc gccaacttct atgatccatc aacaggagac 1380
atcgacctca acaagaagca agtggagagc accttccctc aaacagacta catcaccatg 1440
gacattggag atgatgatgg catctacatg ccgctcggcg tcatctcaga aaccttcttg 1500
acgcccatca acagcttcgg cctggaggtg gacgccaaga gcaagacctt gacgctcaag 1560
tgcaagagct acctcaggga gtacctgctg gagagtgatt tgaagaacaa ggagacaggg 1620
ctgatcgcgc cgccaaatgt gttcatcagc aatgtggtga agaactggga catcgaggag 1680
gattcattgg agccatgggt ggccaacaac aagaatgctt atgtggacaa caccggcggc 1740
attgaaagaa gcaaggcgct cttcacccaa ggagatggag agttcagcca gttcatcggc 1800
gacaagctaa agcccaacac cgactacatc atccagtaca ccgtcaaggg caagccggcc 1860
atctacctca agaacaagag caccggctac atcacctacg aggacaccaa tggaaattct 1920
gaggagttcc aaacaattgc tgtgaagttc acctcagaaa cagatttgag ccagacccac 1980
ctggtgttca agagccaaaa tggatatgaa gcatggggag acaacttcat catcctggag 2040
gccaagctct tcgagacacc agaaagcccg gagctcatca agttcaatga ttgggagagg 2100
ttcggcacca cctacatcac cggcaatgag ctgaggattg atcattcaag aggaggctac 2160
ttccgccaaa gcctcaacat cgacagctac agcacctacg acctcagctt cagcttcagc 2220
ggcctctggg ccaaggtgat tgtgaagaac agccgcggcg tggtgctctt cgagaaggtg 2280
aagaacaatg gaagcagcta tgaggacatc tcagagagct tcaccaccgc cagcaacaag 2340
gatggcttct tcatcgagct caccgccgag aggacaagca gcaccttcca cagcttcaga 2400
gacatcagca tcaaggagaa gattgaataa 2430
<210> 34 <211> 2454
<212> ДНК <213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115 <400> 34
atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatggcac atcaccacca ccatcacgga 60
tccaccatga acatgaacaa caccaagctc aatgcaaggg cgctgccgag cttcatcgac 120
tacttcaatg gcatctatgg cttcgccacc ggcatcaagg acatcatgaa catgatcttc 180
aagaccgaca ccggcggcaa cctcaccttg gatgagatcc tcaagaacca gcagctgctg 240
aatgagatct caggcaagct ggacggcgtc aatggaagcc tcaacgacct cattgctcaa 300
ggcaacctca acaccgagct gagcaaggag atcctcaaga ttgcaaatga gcagaaccag 360
gtgctgaatg atgtcaacaa caagctggac gccatcaaca ccatgctgca catctacctg 420
ccaaagatca cctcaatgct ctctgatgtg atgaagcaga actacgcgct gagcctccag 480
attgagtacc tctcaaagca gctgcaagag atctccgaca agctggacat catcaatgtc 540
aatgtgctca tcaacagcac cttgacagag atcacgccgg cctaccagag gatcaagtat 600
gtcaatgaga agtttgagga gctcaccttc gccaccgaga caacattgaa ggtgaagaag 660
gacagctcgc cggcggacat cctggatgag ctcaccgagc taacagagct ggccaagagc 720
gtcaccaaga atgatgttga tggcttcgag ttctacctca acaccttcca tgatgtgatg 780
gtgggcaaca acctcttcgg ccgctcggcg ctcaagacgg cgtcggagct gatcgccaag 840
gagaatgtca agacaagtgg atcagaggtg ggcaatgtct acaacttcct catcgtgctg 900
acggcgctgc aagccaaggc cttcctcacc ttgacaacct gccgcaagtt gctgggcctc 960
gccgacatcg actacacctc catcatgaat gagcacctca acaaggagaa ggaggagttc 1020
cgcgtcaaca tcctgccaac attgagcaac accttcagca accccaacta cgccaaggtg 1080
aagggctcag atgaagatgc caagatgatt gtggaggcca agcctggcca tgctctggtg 1140
ggcttcgaga tgagcaacga cagcatcacc gtgctgaagg tctacgaggc caagctgaag 1200
cagaactacc aggtggacaa ggacagcttg tctgaggtga tctacggcga catggacaag 1260
ctgctatgtc cagatcaaag cgagcagatc tactacacca acaacatcgt ctttccaaat 1320
gaatatgtca tcaccaagat cgacttcacc aagaagatga aaacattgag atatgaggtg 1380
acggccaaca gctacgacag cagcaccggc gagatcgacc tcaacaagaa gaaggtggag 1440
agctcagaag ctgagtacag gacgctctcc gccaaggatg atggcgtcta catgccgctc 1500
ggcgtcatct cagaaacctt cttgacgccc atcaatggct tcggcctcca agctgatgag 1560
aacagcaggc tcatcacctt gacctgcaag agctacctca gggagctgct gctggccacc 1620
gacctcagca acaaggagac aaagctcatc gtgccgccat caggcttcat cagcaacatc 1680
gtggagaatg gcaacctgga aggagagaac ctggagccat ggatagccaa caacaagaat 1740
gcttatgttg atcacaccgg cggcgtcaat ggaacaaggg cgctctatgt tcacaaggat 1800
ggaggcttca gccagttcat cggcgacaag ctgaagccca agacagaata tgtcatccag 1860
tacaccgtca agggcaagcc ggccatctac ctcaagaaca agagcaccgg ctacatcacc 1920
tacgaggaca ccaatggaaa ttctgaggag ttccaaacaa ttgctgtgaa gttcacctca 1980
gaaacagatt tgagccagac ccacctggtg ttcaagagcc aaaatggata tgaagcatgg 2040
ggagacaact tcatcatcct ggaggccaag ctcttcgaga caccagaaag cccggagctc 2100
atcaagttca atgattggga gaggttcggc accacctaca tcaccggcaa tgagctgagg 2160
attgatcatt caagaggagg ctacttccgc caaagcctca acatcgacag ctacagcacc 2220
tacgacctca gcttcagctt cagcggcctc tgggccaagg tgattgtgaa gaacagccgc 2280
ggcgtggtgc tcttcgagaa ggtgaagaac aatggaagca gctatgagga catctcagag 2340
agcttcacca ccgccagcaa caaggatggc ttcttcatcg agctcaccgc cgagaggaca 2400
agcagcacct tccacagctt cagagacatc agcatcaagg agaagattga ataa 2454
<210> 35
<211> 2442 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 35
atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatgaaca tgaacaacac caagctcaat 60
gcaagggcgc tgccgagctt catcgactac ttcaatggca tctatggctt cgccaccggc 120
atcaaggaca tcatgaacat gatcttcaag accgacaccg gcggcaacct caccttggat 180
gagatcctca agaaccagca gctgctgaat gagatctcag gcaagctgga cggcgtcaat 240
ggaagcctca acgacctcat tgctcaaggc aacctcaaca ccgagctgag caaggagatc 300
ctcaagattg caaatgagca gaaccaggtg ctgaatgatg tcaacaacaa gctggacgcc 360
atcaacacca tgctgcacat ctacctgcca aagatcacct caatgctctc tgatgtgatg 420
aagcagaact acgcgctgag cctccagatt gagtacctct caaagcagct gcaagagatc 480
tccgacaagc tggacatcat caatgtcaat gtgctcatca acagcacctt gacagagatc 540
acgccggcct accagaggat caagtatgtc aatgagaagt tcgacaagct caccttcgcc 600
accgagagca ccctccgcgc caagcaaggc atcttcaatg aagattcatt tgacaacaac 660
accttggaga acttgacaga cctcgccgag ctggccaaga gcatcaccaa gaatgatgtg 720
gacagcttcg agttctacct ccacaccttc catgatgtgc tcatcggcaa caacctcttt 780
ggaagaagcg cgctcaagac ggcatcagag ctcatcacca aggatgagat caagacaagc 840
ggcagcgaga tcggcaaggt ctacagcttc ctcatcgtgc tgacatcatt gcaagccaag 900
gccttcctca
ccttgacaac
ctgccgcaag
ttgctgggcc
tctccgacat
cgactacacc
tccatcatga
atgagcacct
caacaatgag
aagaatgagt
tcagagacaa
catcctgccg
gcgctgagca
acaagttcag
caacccaagc
tacgccaaga
ccatcggctc
agacaactac
gccaaggtga
tcctggagag
cgagcctggc
tacgcgctgg
tgggcttcga
gatcatcaat
gatccaattc
ctgttctcaa
ggcctacaag
gccaagctga
agcagaacta
ccaggtggac
aaccagagct
tgagcgagat
cgtctacctg
gacatcgaca
agctcttctg
cccggagaac
tcagagcaga
agtactacac
caagaacctc
accttccctg
atggatatgt
catcaccaag
atcaccttcg
agaagaagct
gaacaacctc
atctacgagg
ccaccgccaa
cttctatgat
ccatcaacag
gagacatcga
cctcaacaag
aagcaagtgg
agagcacctt
ccctcaaaca
gactacatca
ccatggacat
tggagatgat
gatggcatct
acatgccgct
cggcgtcatc
tcagaaacct
tcttgacgcc
catcaacagc
ttcggcctgg
aggtggacgc
caagagcaag
accttgacgc
tcaagtgcaa
gagctacctc
agggagtacc
tgctggagag
tgatttgaag
aacaaggaga
cagggctgat
cgcgccgcca
aatgtgttca
tcagcaatgt
ggtgaagaac
tgggacatcg
aggaggattc
attggagcca
tgggtggcca
acaacaagaa
tgcttatgtg
gacaacaccg
gcggcattga
aagaagcaag
gcgctcttca
cccaaggaga
tggagagttc
agccagttca
tcggcgacaa
gctaaagccc
aacaccgact
acatcatcca
gtacaccgtc
aagggcaagc
cggccatcta
cctcaagaac
aagagcaccg
gctacatcac
ctacgaggac
accaatggaa
attctgagga
gttccaaaca
attgctgtga
agttcacctc
agaaacagat
ttgagccaga
cccacctggt
gttcaagagc
caaaatggat
atgaagcatg
gggagacaac
ttcatcatcc
tggaggccaa
gctcttcgag
acaccagaaa
gcccggagct
catcaagttc
aatgattggg
agaggttcgg
caccacctac
atcaccggca
atgagctgag
gattgatcat
tcaagaggag
gctacttccg
ccaaagcctc
aacatcgaca
gctacagcac
ctacgacctc
agcttcagct
tcagcggcct
ctgggccaag
gtgattgtga
agaacagccg
cggcgtggtg
ctcttcgaga
aggtgaagaa
caatggaagc
agctatgagg
acatctcaga
ggacttcacc
accaatggct
ttaaggatgg
cttctatatc
gagctcaccg
ccgagaggac
aagcagcacc
ttccacagct
tcagagacat
cagcatcaag
gagaagattg
1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680
1740
1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2442
<210> 36
<211> 2442
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 36
atggcacatc accaccacca tcacggatcc accatgaaca tgaacaacac caagctcaat 60
gcaagggcgc tgccgagctt catcgactac ttcaatggca tctatggctt cgccaccggc 120
atcaaggaca tcatgaacat gatcttcaag accgacaccg gcggcaacct caccttggat 180
gagatcctca agaaccagca gctgctgaat gagatctcag gcaagctgga cggcgtcaat 240
ggaagcctca acgacctcat tgctcaaggc aacctcaaca ccgagctgag caaggagatc 300
ctcaagattg caaatgagca gaaccaggtg ctgaatgatg tcaacaacaa gctggacgcc 360
atcaacacca tgctgcacat ctacctgcca aagatcacct caatgctctc tgatgtgatg 420
aagcagaact acgcgctgag cctccagatt gagtacctct caaagcagct gcaagagatc 480
tccgacaagc tggacatcat caatgtcaat gtgctcatca acagcacctt gacagagatc 540
acgccggcct accagaggat caagtatgtc aatgagaagt tcgacaagct caccttcgcc 600
accgagagca ccctccgcgc caagcaaggc atcttcaatg aagattcatt tgacaacaac 660
accttggaga acttgacaga cctcgccgag ctggccaaga gcatcaccaa gaatgatgtg 720
gacagcttcg agttctacct ccacaccttc catgatgtgc tcatcggcaa caacctcttt 780
ggaagaagcg cgctcaagac ggcatcagag ctcatcacca aggatgagat caagacaagc 840
ggcagcgaga tcggcaaggt ctacagcttc ctcatcgtgc tgacatcatt gcaagccaag 900
gccttcctca ccttgacaac ctgccgcaag ttgctgggcc tctccgacat cgactacacc 960
tccatcatga atgagcacct caacaatgag aagaatgagt tcagagacaa catcctgccg 1020
gcgctgagca acaagttcag caacccaagc tacgccaaga ccatcggctc agacaactac 1080
gccaaggtga tcctggagag cgagcctggc tacgcgctgg tgggcttcga gatcatcaat 1140
gatccaattc ctgttctcaa ggcctacaag gccaagctga agcagaacta ccaggtggac 1200
aaccagagct tgagcgagat cgtctacctg gacatcgaca agctcttctg cccggagaac 1260
tcagagcaga agtactacac caagaacctc accttccctg atggatatgt catcaccaag 1320
atcaccttcg agaagaagct gaacaacctc atctacgagg ccaccgccaa cttctatgat 1380
ccatcaacag gagacatcga cctcaacaag aagcaagtgg agagcacctt ccctcaaaca 1440
gactacatca ccatggacat tggagatgat gatggcatct acatgccgct cggcgtcatc 1500
tcagaaacct tcttgacgcc catcaacagc ttcggcctgg aggtggacgc caagagcaag 1560
accttgacgc tcaagtgcaa gagctacctc agggagtacc tgctggagag tgatttgaag 1620
aacaaggaga cagggctgat cgcgccgcca aatgtgttca tcagcaatgt ggtgaagaac 1680
tgggacatcg aggaggattc attggagcca tgggtggcca acaacaagaa tgcttatgtg 1740
gacaacaccg gcggcattga aagaagcaag gcgctcttca cccaaggaga tggagagttc 1800
agccagttca tcggcgacaa gctaaagccc aacaccgact acatcatcca gtacaccgtc 1860
aagggcaagc cggccatcta cctcaagaac aagagcaccg gctacatcac ctacgaggac 1920
accaatggaa attctgagga gttccaaaca attgctgtga agttcacctc agaaacagat 1980
ttgagccaga
cccacctggt
gttcaagagc
caaaatggat
atgaagcatg
gggagacaac
ttcatcatcc
tggaggccaa
gctcttcgag
acaccagaaa
gcccggagct
catcaagttc
aatgattggg
agaggttcgg
caccacctac
atcaccggca
atgagctgag
gattgatcat
tcaagaggag
gctacttccg
ccaaagcctc
aacatcgaca
gctacagcac
ctacgacctc
agcttcagct
tcagcggcct
ctgggccaag
gtgattgtga
agaacagccg
cggcgtggtg
ctcttcgaga
aggtgaagaa
caatggaagc
agctatgagg
acatctcaga
gcacttcacc
acctggggct
ataaggatgg
cttctttatc
gagctcaccg
ccgagaggac
aagcagcacc
ttccacagct
tcagagacat
cagcatcaag
gagaagattg
2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2442
<210> 37
<211> 814
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 37
Met Ala His His His His His His Gly Ser Thr Met Asn Met Asn Asn
1 5 10 15
Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn
20 25 30
Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile
35 40 45
Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys
50 55 60
Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn
65 70 75 80
Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu
85 90 95
Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn
100 105 110
Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr
115 120 125
Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr
130 135 140
Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile
145 150 155 160
Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu
180 185 190
Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser Thr Leu Arg Ala Lys
195 200 205
Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn Asn Thr Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile Thr Lys Asn Asp Val
225 230 235 240
Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His Asp Val Leu Ile Gly
245 250 255
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
260 265 270
Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu Ile Gly Lys Val Tyr
275 280 285
Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
290 295 300
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ile Asp Tyr Thr
305 310 315 320
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys Asn Glu Phe Arg Asp
325 330 335
Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser Asn Pro Ser Tyr Ala
340 345 350
Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val Ile Leu Glu Ser Glu
355 360 365
Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile Asn Asp Pro Ile Pro
370 375 380
Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
385 390 395 400
Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Lys Leu Phe
405 410 415
Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr Lys Asn Leu Thr Phe
420 425 430
Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe Glu Lys Lys Leu Asn
435 440 445
Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Pro Ser Thr Gly
450 455 460
Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser Thr Phe Pro Gln Thr
465 470 475 480
Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp Gly Ile Tyr Met Pro
485 490 495
Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Ser Phe Gly
500 505 510
Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr Leu Lys Cys Lys Ser
515 520 525
Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asn Lys Glu Thr
530 535 540
Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser Asn Val Val Lys Asn
545 550 555 560
Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp Val Ala Asn Asn Lys
565 570 575
Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu Arg Ser Lys Ala Leu
580 585 590
Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu
595 600 605
Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro
610 615 620
Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr Ile Thr Tyr Glu Asp
625 630 635 640
Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile Ala Val Lys Phe Thr
645 650 655
Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val Phe Lys Ser Gln Asn
660 665 670
Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ala Lys Leu
675 680 685
Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys Phe Asn Asp Trp Glu
690 695 700
Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu Leu Arg Ile Asp His
705 710 715 720
Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn Ile Asp Ser Tyr Ser
725 730 735
Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Trp Ala Lys Val Ile
740 745 750
Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu Lys Val Lys Asn Asn
755 760 765
Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe Thr Thr Ala Ser Asn
770 775 780
Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu Arg Thr Ser Ser Thr
785 790 795 800
Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu Lys Ile Glu
805 810
<210> 38
<211> 809
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 38
Met Ala His His His His His His Gly Ser Thr Met Asn Met Asn Asn
1 5 10 15
Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn
20 25 30
Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile
35 40 45
Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys
50 55 60
Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn
65 70 75 80
Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu
85 90 95
Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn
100 105 110
Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr
115 120 125
Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr
130 135 140
Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile
145 150 155 160
Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu
180 185 190
Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr Thr Leu Lys Val Lys
195 200 205
Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr
210 215 220
Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe
225 230 235 240
Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly
245 250 255
Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val
260 265 270
Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val
275 280 285
Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg
290 295 300
Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu
305 310 315 320
His Leu Asn Asn Glu Lys Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala
325 330 335
Leu Ser Asn Lys Phe Ser Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser
340 345 350
Asp Asn Tyr Ala Lys Val Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu
355 360 365
Val Gly Phe Glu Ile Ile Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr
370 375 380
Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser
385 390 395 400
Glu Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser
405 410 415
Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val
420 425 430
Ile Thr Lys Ile Thr Phe Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu
435 440 445
Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn
450 455 460
Lys Lys Gln Val Glu Ser Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met
465 470 475 480
Asp Ile Gly Asp Asp Asp Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser
485 490 495
Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala
500 505 510
Lys Ser Lys Thr Leu Thr Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr
515 520 525
Leu Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro
530 535 540
Pro Asn Val Phe Ile Ser Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu
545 550 555 560
Asp Ser Leu Glu Pro Trp Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp
565 570 575
Asn Thr Gly Gly Ile Glu Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp
580 585 590
Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp
595 600 605
Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys
610 615 620
Asn Lys Ser Thr Gly Tyr Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser
625 630 635 640
Glu Glu Phe Gln Thr Ile Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu
645 650 655
Ser Gln Thr His Leu Val Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp
660 665 670
Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu
675 680 685
Ser Pro Glu Leu Ile Lys Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr
690 695 700
Tyr Ile Thr Gly Asn Glu Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr
705 710 715 720
Phe Arg Gln Ser Leu Asn Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser
725 730 735
Phe Ser Phe Ser Gly Leu Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg
740 745 750
Gly Val Val Leu Phe Glu Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu
755 760 765
Asp Ile Ser Glu Ser Phe Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe
770 775 780
Ile Glu Leu Thr Ala Glu Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg
785 790 795 800
Asp Ile Ser Ile Lys Glu Lys Ile Glu
805
<210> 39
<211> 806
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 39
Met Ala His His His His His His Gly Ser Thr Met Asn Met Asn Asn
1 5 10 15
Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn
20 25 30
Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile
35 40 45
Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys
50 55 60
Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn
65 70 75 80
Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu
85 90 95
Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn
100 105 110
Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr
115 120 125
Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr
130 135 140
Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile
145 150 155 160
Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu
180 185 190
Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr Thr Leu Lys Val Lys
195 200 205
Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr
210 215 220
Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe
225 230 235 240
Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly
245 250 255
Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile Ala Lys Glu Asn Val
260 265 270
Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val
275 280 285
Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg
290 295 300
Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu
305 310 315 320
His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr
325 330 335
Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser
340 345 350
Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu
355 360 365
Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr
370 375 380
Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser
385 390 395 400
Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu Cys Pro Asp Gln Ser
405 410 415
Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val
420 425 430
Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu
435 440 445
Val Thr Ala Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn
450 455 460
Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala
465 470 475 480
Lys Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe
485 490 495
Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala Asp Glu Asn Ser Arg
500 505 510
Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala
515 520 525
Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly
530 535 540
Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn Leu Glu Gly Glu Asn Leu
545 550 555 560
Glu Pro Trp Ile Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp His Thr Gly
565 570 575
Gly Val Asn Gly Thr Arg Ala Leu Tyr Val His Lys Asp Gly Gly Phe
580 585 590
Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys Thr Glu Tyr Val Ile
595 600 605
Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser
610 615 620
Thr Gly Tyr Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe
625 630 635 640
Gln Thr Ile Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr
645 650 655
His Leu Val Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn
660 665 670
Phe Ile Ile Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu
675 680 685
Leu Ile Lys Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr
690 695 700
Gly Asn Glu Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln
705 710 715 720
Ser Leu Asn Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe
725 730 735
Ser Gly Leu Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val
740 745 750
Leu Phe Glu Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser
755 760 765
Glu Ser Phe Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu
770 775 780
Thr Ala Glu Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser
785 790 795 800
Ile Lys Glu Lys Ile Glu
805
<210> 40
<211> 814
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 40
Met Ala His His His His His His Gly Ser Thr Met Asn Met Asn Asn
1 5 10 15
Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn
20 25 30
Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile
35 40 45
Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys
50 55 60
Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn
65 70 75 80
Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu
85 90 95
Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn
100 105 110
Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr
115 120 125
Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr
130 135 140
Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile
145 150 155 160
Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu
180 185 190
Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser Thr Leu Arg Ala Lys
195 200 205
Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn Asn Thr Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile Thr Lys Asn Asp Val
225 230 235 240
Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His Asp Val Leu Ile Gly
245 250 255
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
260 265 270
Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu Ile Gly Lys Val Tyr
275 280 285
Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
290 295 300
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ile Asp Tyr Thr
305 310 315 320
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys Asn Glu Phe Arg Asp
325 330 335
Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser Asn Pro Ser Tyr Ala
340 345 350
Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val Ile Leu Glu Ser Glu
355 360 365
Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile Asn Asp Pro Ile Pro
370 375 380
Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
385 390 395 400
Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Lys Leu Phe
405 410 415
Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr Lys Asn Leu Thr Phe
420 425 430
Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe Glu Lys Lys Leu Asn
435 440 445
Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Pro Ser Thr Gly
450 455 460
Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser Thr Phe Pro Gln Thr
465 470 475 480
Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp Gly Ile Tyr Met Pro
485 490 495
Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Ser Phe Gly
500 505 510
Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr Leu Lys Cys Lys Ser
515 520 525
Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asn Lys Glu Thr
530 535 540
Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser Asn Val Val Lys Asn
545 550 555 560
Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp Val Ala Asn Asn Lys
565 570 575
Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu Arg Ser Lys Ala Leu
580 585 590
Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu
595 600 605
Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro
610 615 620
Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr Ile Thr Tyr Glu Asp
625 630 635 640
Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile Ala Val Lys Phe Thr
645 650 655
Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val Phe Lys Ser Gln Asn
660 665 670
Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ala Lys Leu
675 680 685
Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys Phe Asn Asp Trp Glu
690 695 700
Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu Leu Arg Ile Asp His
705 710 715 720
Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn Ile Asp Ser Tyr Ser
725 730 735
Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Trp Ala Lys Val Ile
740 745 750
Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu Lys Val Lys Asn Asn
755 760 765
Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Asp Phe Thr Thr Asn Gly Phe
770 775 780
Lys Asp Gly Phe Tyr Ile Glu Leu Thr Ala Glu Arg Thr Ser Ser Thr
785 790 795 800
Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu Lys Ile Glu
805 810
<210> 41
Белок
<211> 814
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 41
Met Ala His His His His His His Gly Ser Thr Met Asn Met Asn Asn
1 5 10 15
Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn
20 25 30
Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile
35 40 45
Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys
50 55 60
Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn
65 70 75 80
Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu
85 90 95
Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln Asn Gln Val Leu Asn
100 105 110
Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu His Ile Tyr
115 120 125
Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val Met Lys Gln Asn Tyr
130 135 140
Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gln Leu Gln Glu Ile
145 150 155 160
Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu
180 185 190
Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser Thr Leu Arg Ala Lys
195 200 205
Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn Asn Thr Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile Thr Lys Asn Asp Val
225 230 235 240
Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His Asp Val Leu Ile Gly
245 250 255
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
260 265 270
Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu Ile Gly Lys Val Tyr
275 280 285
Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
290 295 300
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser Asp Ile Asp Tyr Thr
305 310 315 320
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys Asn Glu Phe Arg Asp
325 330 335
Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser Asn Pro Ser Tyr Ala
340 345 350
Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val Ile Leu Glu Ser Glu
355 360 365
Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile Asn Asp Pro Ile Pro
370 375 380
Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
385 390 395 400
Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp Ile Asp Lys Leu Phe
405 410 415
Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr Lys Asn Leu Thr Phe
420 425 430
Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe Glu Lys Lys Leu Asn
435 440 445
Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Pro Ser Thr Gly
450 455 460
Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser Thr Phe Pro Gln Thr
465 470 475 480
Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp Gly Ile Tyr Met Pro
485 490 495
Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Ser Phe Gly
500 505 510
Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr Leu Lys Cys Lys Ser
515 520 525
Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu Lys Asn Lys Glu Thr
530 535 540
Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser Asn Val Val Lys Asn
545 550 555 560
Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp Val Ala Asn Asn Lys
565 570 575
Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu Arg Ser Lys Ala Leu
580 585 590
Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu
595 600 605
Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro
610 615 620
Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr Ile Thr Tyr Glu Asp
625 630 635 640
Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile Ala Val Lys Phe Thr
645 650 655
Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val Phe Lys Ser Gln Asn
660 665 670
Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ala Lys Leu
675 680 685
Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys Phe Asn Asp Trp Glu
690 695 700
Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu Leu Arg Ile Asp His
705 710 715 720
Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn Ile Asp Ser Tyr Ser
725 730 735
Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu Trp Ala Lys Val Ile
740 745 750
Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu Lys Val Lys Asn Asn
755 760 765
Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu His Phe Thr Thr Trp Gly Tyr
770 775 780
Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu Arg Thr Ser Ser Thr
785 790 795 800
Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu Lys Ile Glu 805 810
<210> 42 <211> 2412
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Оптимизированная последовательность Axmi115
<400> 42
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcgacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tcaacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa ggcagctgca agagatctcc gacaagctgg atgtcatcaa cctcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccaagctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagttcg acaagctcac cttcgccacc gagagcaccc tccgcgccaa gcaaggcatc 600
ttcaatgaag attcatttga caacaacacc ttggagaact tgacagacct cgccgagctg 660
gccaagagca tcaccaagaa tgatgtggac agcttcgagt tctacctcca caccttccat 720
gatgtgctca tcggcaacaa cctctttgga agaagcgcgc tcaagacggc atcagagctc 780
atcaccaagg atgagatcaa gacaagcggc agcgagatcg gcaaggtcta cagcttcctc 840
atcgtgctga catcattgca agccaaggcc ttcctcacct tgacaacctg ccgcaagttg 900
ctgggcctct ccgacatcga ctacacctcc atcatgaatg agcacctcaa caatgagaag 960
aatgagttca gagacaacat cctgccggcg ctgagcaaca agttcagcaa cccaagctac 1020
gccaagacca tcggctcaga caactacgcc aaggtgatcc tggagagcga gcctggctac 1080
gcgctggtgg gcttcgagat catcaatgat ccaattcctg ttctcaaggc ctacaaggcc 1140
aagctgaagc agaactacca ggtggacaac cagagcttga gcgagatcgt ctacctggac 1200
atcgacaagc tcttctgccc ggagaactca gagcagaagt actacaccaa gaacctcacc 1260
ttccctgatg gatatgtcat caccaagatc accttcgaga agaagctgaa caacctcatc 1320
tacgaggcca ccgccaactt ctatgatcca tcaacaggag acatcgacct caacaagaag 1380
caagtggaga gcaccttccc tcaaacagac tacatcacca tggacattgg agatgatgat 1440
ggcatctaca tgccgctcgg cgtcatctca gaaaccttct tgacgcccat caacagcttc 1500
ggcctggagg tggacgccaa gagcaagacc ttgacgctca agtgcaagag ctacctcagg 1560
gagtacctgc tggagagtga tttgaagaac aaggagacag ggctgatcgc gccgccaaat 1620
gtgttcatca gcaatgtggt gaagaactgg gacatcgagg aggattcatt ggagccatgg 1680
gtggccaaca
acaagaatgc
ttatgtggac
aacaccggcg
gcattgaaag
aagcaaggcg
1740
ctcttcaccc
aaggagatgg
agagttcagc
cagttcatcg
gcgacaagct
aaagcccaac
1800
accgactaca
tcatccagta
caccgtcaag
ggcaagccgg
ccatctacct
caagaacaag
1860
agcaccggct
acatcaccta
cgaggacacc
aatggaaatt
ctgaggagtt
ccaaacaatt
1920
gctgtgaagt
tcacctcaga
aacagatttg
agccagaccc
acctggtgtt
caagagccaa
1980
aatggatatg
aagcatgggg
agacaacttc
atcatcctgg
aggccaagct
cttcgagaca
2040
ccagaaagcc
cggagctcat
caagttcaat
gattgggaga
ggttcggcac
cacctacatc
2100
accggcaatg
agctgaggat
tgatcattca
agaggaggct
acttccgcca
aagcctcaac
2160
atcgacagct
acagcaccta
cgacctcagc
ttcagcttca
gcggcctctg
ggccaaggtg
2220
attgtgaaga
acagccgcgg
cgtggtgctc
ttcgagaagg
tgaagaacaa
tggaagcagc
2280
tatgaggaca
tctcagagag
cttcaccacc
gccagcaaca
aggatggctt
cttcatcgag
2340
ctcaccgccg
agaggacaag
cagcaccttc
cacagcttca
gagacatcag
catcaaggag
2400
aagattgaat
2412
<210> 43
<211> 803
<212> Белок
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 43
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Asn Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115
120
125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Arg
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Val Ile Asn Leu Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ser Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Asp Lys Leu Thr Phe Ala Thr Glu Ser
180 185 190
Thr Leu Arg Ala Lys Gln Gly Ile Phe Asn Glu Asp Ser Phe Asp Asn
195 200 205
Asn Thr Leu Glu Asn Leu Thr Asp Leu Ala Glu Leu Ala Lys Ser Ile
210 215 220
Thr Lys Asn Asp Val Asp Ser Phe Glu Phe Tyr Leu His Thr Phe His
225 230 235 240
Asp Val Leu Ile Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
245 250 255
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Thr Ser Gly Ser Glu
260 265 270
Ile Gly Lys Val Tyr Ser Phe Leu Ile Val Leu Thr Ser Leu Gln Ala
275 280 285
Lys Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ser
290 295 300
Asp Ile Asp Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Asn Glu Lys
305 310 315 320
Asn Glu Phe Arg Asp Asn Ile Leu Pro Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ser
325 330 335
Asn Pro Ser Tyr Ala Lys Thr Ile Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Lys Val
340 345 350
Ile Leu Glu Ser Glu Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Ile Ile
355 360 365
Asn Asp Pro Ile Pro Val Leu Lys Ala Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln
370
375
380
Asn Tyr Gln Val Asp Asn Gln Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Leu Asp
385 390 395 400
Ile Asp Lys Leu Phe Cys Pro Glu Asn Ser Glu Gln Lys Tyr Tyr Thr
405 410 415
Lys Asn Leu Thr Phe Pro Asp Gly Tyr Val Ile Thr Lys Ile Thr Phe
420 425 430
Glu Lys Lys Leu Asn Asn Leu Ile Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr
435 440 445
Asp Pro Ser Thr Gly Asp Ile Asp Leu Asn Lys Lys Gln Val Glu Ser
450 455 460
Thr Phe Pro Gln Thr Asp Tyr Ile Thr Met Asp Ile Gly Asp Asp Asp
465 470 475 480
Gly Ile Tyr Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro
485 490 495
Ile Asn Ser Phe Gly Leu Glu Val Asp Ala Lys Ser Lys Thr Leu Thr
500 505 510
Leu Lys Cys Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Ser Asp Leu
515 520 525
Lys Asn Lys Glu Thr Gly Leu Ile Ala Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser
530 535 540
Asn Val Val Lys Asn Trp Asp Ile Glu Glu Asp Ser Leu Glu Pro Trp
545 550 555 560
Val Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp Asn Thr Gly Gly Ile Glu
565 570 575
Arg Ser Lys Ala Leu Phe Thr Gln Gly Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe
580 585 590
Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Asn Thr Asp Tyr Ile Ile Gln Tyr Thr
595 600 605
Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Ser Thr Gly Tyr
610 615 620
Ile Thr Tyr Glu Asp Thr Asn Gly Asn Ser Glu Glu Phe Gln Thr Ile
625 630 635 640
Ala Val Lys Phe Thr Ser Glu Thr Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Val
645 650 655
Phe Lys Ser Gln Asn Gly Tyr Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile
660 665 670
Leu Glu Ala Lys Leu Phe Glu Thr Pro Glu Ser Pro Glu Leu Ile Lys
675 680 685
Phe Asn Asp Trp Glu Arg Phe Gly Thr Thr Tyr Ile Thr Gly Asn Glu
690 695 700
Leu Arg Ile Asp His Ser Arg Gly Gly Tyr Phe Arg Gln Ser Leu Asn
705 710 715 720
Ile Asp Ser Tyr Ser Thr Tyr Asp Leu Ser Phe Ser Phe Ser Gly Leu
725 730 735
Trp Ala Lys Val Ile Val Lys Asn Ser Arg Gly Val Val Leu Phe Glu
740 745 750
Lys Val Lys Asn Asn Gly Ser Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Glu Ser Phe
755 760 765
Thr Thr Ala Ser Asn Lys Asp Gly Phe Phe Ile Glu Leu Thr Ala Glu
770 775 780
Arg Thr Ser Ser Thr Phe His Ser Phe Arg Asp Ile Ser Ile Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Glu
<213> Искусственная
<220>
<223> Оптимизированная последовательность Axmi005
<400> 44
atgaacatga acaacaccaa gctcaatgca agggcgctgc cgagcttcat cgactacttc 60
aatggcatct atggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120
gacaccggcg gcaacctcac cttggatgag atcctcaaga accagcagct gctgaatgag 180
atctcaggca agctggacgg cgtcaatgga agcctcaacg acctcattgc tcaaggcaac 240
ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagattgcaa atgagcagaa ccaggtgctg 300
aatgatgtca acaacaagct ggacgccatc aacaccatgc tgcacatcta cctgccaaag 360
atcacctcaa tgctctctga tgtgatgaag cagaactacg cgctgagcct ccagattgag 420
tacctctcaa agcagctgca agagatctcc gacaagctgg acatcatcaa tgtcaatgtg 480
ctcatcaaca gcaccttgac agagatcacg ccggcctacc agaggatcaa gtatgtcaat 540
gagaagtttg aggagctcac cttcgccacc gagacaacat tgaaggtgaa gaaggacagc 600
tcgccggcgg acatcctgga tgagctcacc gagctaacag agctggccaa gagcgtcacc 660
aagaatgatg ttgatggctt cgagttctac ctcaacacct tccatgatgt gatggtgggc 720
aacaacctct tcggccgctc ggcgctcaag acggcgtcgg agctgatcgc caaggagaat 780
gtcaagacaa gtggatcaga ggtgggcaat gtctacaact tcctcatcgt gctgacggcg 840
ctgcaagcca aggccttcct caccttgaca acctgccgca agttgctggg cctcgccgac 900
atcgactaca cctccatcat gaatgagcac ctcaacaagg agaaggagga gttccgcgtc 960
aacatcctgc caacattgag caacaccttc agcaacccca actacgccaa ggtgaagggc 1020
tcagatgaag atgccaagat gattgtggag gccaagcctg gccatgctct ggtgggcttc 1080
gagatgagca acgacagcat caccgtgctg aaggtctacg aggccaagct gaagcagaac 1140
taccaggtgg acaaggacag cttgtctgag gtgatctacg gcgacatgga caagctgcta 1200
tgtccagatc aaagcgagca gatctactac accaacaaca tcgtctttcc aaatgaatat 1260
gtcatcacca agatcgactt caccaagaag atgaaaacat tgagatatga ggtgacggcc 1320
aacagctacg acagcagcac cggcgagatc gacctcaaca agaagaaggt ggagagctca 1380
gaagctgagt acaggacgct ctccgccaag gatgatggcg tctacatgcc gctcggcgtc 1440
atctcagaaa ccttcttgac gcccatcaat ggcttcggcc tccaagctga tgagaacagc 1500
aggctcatca ccttgacctg caagagctac ctcagggagc tgctgctggc caccgacctc 1560
agcaacaagg agacaaagct catcgtgccg ccatcaggct tcatcagcaa catcgtggag 1620
aatggcaacc tggaaggaga gaacctggag ccatggatag ccaacaacaa gaatgcttat 1680
gttgatcaca ccggcggcgt caatggaaca agggcgctct atgttcacaa ggatggaggc 1740
ttcagccagt tcatcggcga caagctgaag cccaagacag aatatgtcat ccagtacacc 1800
gtcaagggca agccatcaat ccacctcaag aatgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860
gacaccaaca acaacctgga ggactaccag accatcacca agaggttcac caccggcacc 1920
gacctcaagg gcgtctacct catcttgaag agccaaaatg gagatgaagc atggggagac 1980
aacttcacca tcctggagat ctcgccatca gagaagctgc tctcgccgga gctcatcaat 2040
gtcaacaact ggatcagaac tggaagcacc cacatcagcg gcaacacctt gacgctctac 2100
caaggaggag gaggcaacct caagcagaac ctccagcttg acagcttctc cacctacagg 2160
gtgaacttct ccgtcaccgg cgacgccaat gtgaggatca gaaattcaag ggaggtgctc 2220
ttcgagaaga gatacatgag cggcgccaag gatgtttctg agatcttcac caccaagctg 2280
ggcaaggaca acttctacat cgagctgagc caaggcaaca acctctatgg agggccgctg 2340
gtgaagttca atgatgtgag catcaag 2367
<210> 45
<211> 789
<212> Белок
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 45
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Lys Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn Leu
530 535 540
Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Ile Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Arg Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asn Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Thr Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Val Asn Asn Trp Ile Arg Thr Gly
675 680 685
Ser Thr His Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Asn Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Asn Phe Ser Val Thr Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu Ile Phe Thr Thr Lys Leu Gly Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Leu Val Lys Phe Asn
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys
785
<210> 46
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность варианта Axmi115
<400> 46
Lys Asp Glu Leu
<210> 47
<211> 2367
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Axmi115v02(evo38)
gagaagttcg aggagctcac cttcgccacc gagacaaccc tcaaggtcaa gaaagattca 600
tctcccgccg acatcttgga tgagttgaca gagctcaccg agctggccaa gagcgtcacc 660
aagaatgatg tggacggctt cgagttctac ctcaacacct tccatgatgt gatggtcggc 720
aacaacctct ttggaagaag cgcgctcaag acggcatcag agctcatcgc caaggagaat 780
gtcaagacaa gcggcagcga ggtcggcaat gtctacaact tcctcatcgt gctgacagca 840
ttgcaagcca aggccttcct caccttgaca acctgccgca agttgctggg cctcgccgac 900
atcgactaca cctccatcat gaatgagcac ctcaacaagg agaaggagga gttcagagtc 960
aacatcctgc cgacgctgag caacacgttc agcaacccaa actacgccaa ggtcaagggc 1020
tcagacgaag acgccaagat gatcgtggag gccaagcctg gccacgcgct ggtgggcttc 1080
gagatgagca atgattcaat tactgttctc aaggtctacg aggccaagct gaagcagaac 1140
taccaggtgg acaaggacag cttgagcgag gtgatctacg gggacatgga caagctcctc 1200
tgcccggatc aatcagagca gatctactac accaacaaca tcgtcttccc taatgaatat 1260
gtcatcacca agatcgactt cacgaagaag atgaaaaccc tcagatacga ggtcaccgcc 1320
aacagctatg attcatcaac aggagagatc gacctcaaca agaagaaagt ggagagctct 1380
gaagcagagt acaggaccct gtccgctaag gatgatggcg tctacatgcc gctcggcgtc 1440
atctcagaaa ccttcttgac gcccatcaac ggcttcggcc tgcaagcgga cgagaacagc 1500
aggctcatca cgctcacgtg caagagctac ctcagggagc tcctgctggc gaccgatttg 1560
agcaacaagg agacaaagct gatcgtgccg ccaagtgggt tcatcagcaa tatcgtggag 1620
aacgggaacc tcgaggggga gaacttggag ccatggatag ccaacaacaa gaatgcttat 1680
gtggaccaca ccggcggcgt taatggaacc agggcgctct acgtccacaa agatggaggg 1740
ttcagccagt tcatcggcga caagctaaag cccaagaccg aatacgtcat ccagtacacc 1800
gtcaagggca agccgtccat ccacctcaag aacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860
gacaccaata acaatcttga ggactaccaa acaattacta agaggttcac cacaggaaca 1920
gatttgagcc agacccacct gatcttgaag agccaaaatg gagatgaagc atggggagac 1980
aacttcacca tcctggagat ctcgccctcc gagaaactac taagcccgga gctcatcaat 2040
gtcaataatt ggatcaggac cggcagcacc cacatcagcg gcaatacgct gacgctttat 2100
caaggaggag gaggcaacct caagcaaaac ctccagctcg acagcttcag cacctaccgc 2160
gtcaacttca gcgtcaccgg cgacgccaat gtgaggatca ggaacagccg cgaagtgctc 2220
ttcgagaaga ggtacatgag tggagctaag gacgtctcag agatcttcac caccaaactc 2280
ggcaaggata acttctacat cgagctctcc caggggaata acctctatgg cggccccctc 2340
gtcaagttca atgacgtcag catcaag 2367
<210> 48
<211> 789
<212> Белок
<213> Искусственная
<220>
<223> Axmi115v02(evo38)
<400> 48
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln
85 90 95
Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
210 215 220
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
245 250 255
Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Lys Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
He Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn Leu
530 535 540
Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Ile Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Arg Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asn Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Ser Gln Thr His Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Thr Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Val Asn Asn Trp Ile Arg Thr Gly
675 680 685
Ser Thr His Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Gly
690 695 700
Gly Asn Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Asn Phe Ser Val Thr Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu Ile Phe Thr Thr Lys Leu Gly Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Leu Val Lys Phe Asn
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys
785
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует гибридный полипептид, обладающий пестицидной активностью, где гибридный полипептид содержит С-концевой фрагмент SEQ ID N0:43.
2. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где С-концевой фрагмент соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до примерно 803 SEQ ID N0:43 или ее варианту или фрагменту.
3. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.1 или
2, где гибридный полипептид содержит N-концевой фрагмент SEQ ID
N0:45.
4. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-3, где N-концевой фрагмент соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до примерно 803 SEQ ID N0:43 или ее варианту или фрагменту.
5. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, 2, 3 или 4, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, включающей в себя:
a) нуклеотидную последовательность, описанную в одной из
SEQ ID N0:47 и 1-14;
b) нуклеотидную последовательность, которая кодирует
полипептид, содержащий одну из аминокислотных
последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31;
c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31, где пестицидная активность гибридного полипептида улучшена или повышена по сравнению с пестицидной активностью SEQ ID N0:43 или 45.
6. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, 2,
3, 4 или 5, где указанная нуклеотидная последовательность
представляет собой синтетическую последовательность,
сконструированную для экспрессии в растении.
7. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, 2,
3, 4, 5 или б, где указанная нуклеотидная последовательность
функционально связана с промотором, способным управлять экспрессией указанной нуклеотидной последовательности в растительной клетке.
8. Вектор, содержащий рекомбинантную молекулу нуклеиновой
кислоты по любому из пп.1-7.
9. Вектор по п. 8, дополнительно содержащий молекулу
нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный полипептид.
10. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантную
нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-7 или вектор по п. 8 или
11. Клетка-хозяин по п.10, которая представляет собой бактериальную клетку-хозяина.
12. Клетка-хозяин по п.10, которая представляет собой растительную клетку.
13. Трансгенное растение, содержащее клетку-хозяина по
п. 12 .
14. Трансгенное растение по п.13, где указанное растение выбрано из группы, включающей в себя кукурузу, сорго, пшеницу, капусту, подсолнечник, томат, крестоцветные, перцы, картофель, хлопок, рис, соевые бобы, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак, ячмень и масличные культуры.
15. Трансгенное семя, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7 или вектор по п.8 или 9.
16. Рекомбинантный полипептид, обладающий пестицидной активностью, где полипептид содержит С-концевой фрагмент SEQ ID N0:43.
17. Рекомбинантный полипептид по п.16, где С-концевой фрагмент соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до примерно 803 SEQ ID N0:43, или его вариант или фрагмент.
18. Рекомбинантный полипептид по п. 16 или 17, где полипептид содержит N-концевой фрагмент SEQ ID N0:45.
19. Рекомбинантный полипептид по любому из пп.16-18, где N-концевой фрагмент соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до примерно 803 SEQ ID N0:43 или ее варианту или фрагменту.
20. Рекомбинантный полипептид по п.16, 17, 18 или 19, где
указанный полипептид содержит аминокислотную
последовательность, выбранную из группы, включающей в себя:
а) одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31;
с) аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31, где пестицидная активность полипептида улучшена или повышена по сравнению с пестицидной активностью SEQ ID N0:43 или 45.
21. Полипептид по любому из пп.16-2 0, дополнительно содержащий гетерологичные аминокислотные последовательности.
22. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1б-
21.
23. Композиция по п.22, где указанная композиция выбрана из группы, включающей в себя порошок, пылевидный препарат, шарики, гранулы, спрей, эмульсию, коллоидное вещество и раствор.
24. Композиция по п.22, где указанную композицию получают путем сушки, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, осаждения или концентрирования культуры бактериальных клеток.
25. Композиция по п.22, содержащая от примерно 1% до примерно 99% по массе указанного полипептида.
26. Способ подавления популяции вредителя, относящегося, например, к чешуекрылым, полужесткокрылым, жесткокрылым, нематодам или двукрылым, включающий в себя приведение указанной популяции в контакт с пестицидно-эффективным количеством полипептида по любому из пп.16-22 или композиции по п.23, 2 4 или 2 5.
27. Способ уничтожения вредителя, относящегося, например, к чешуекрылым, полужесткокрылым, жесткокрылым, нематодам или двукрылым, включающий в себя приведение указанного вредителя в контакт с пестицидно-эффективным количеством или скармливание указанному вредителю пестицидно-эффективного количества полипептида по любому из пп.16-22 или композиции по п.23, 2 4 или 2 5.
23.
28. Способ получения полипептида, обладающего пестицидной активностью, который включает в себя культивирование клетки-хозяина по п. 10 в условиях, обеспечивающих экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид.
29. Растение, которое содержит стабильно внедренную в его геном конструкцию ДНК, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, включающую в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридный полипептид с пестицидной активностью, где гибридный полипептид содержит С-концевой фрагмент SEQ ID N0:43.
30. Растение по п.29, где С-концевой фрагмент
соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до
примерно 803 SEQ ID N0:43 или ее варианту или фрагменту.
31. Растение по п. 2 9 или 30, где гибридный полипептид содержит N-концевой фрагмент SEQ ID N0:45.
32. Растение по любому из пп.29-31, где N-концевой фрагмент соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до примерно 803 SEQ ID N0:43 или ее варианту или фрагменту.
33. Растение по любому из пп.2 9-32, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, включающей в себя:
a) одну из нуклеотидных последовательностей, описанных в
SEQ ID N0:47 и 1-14;
b) нуклеотидную последовательность, которая кодирует
полипептид, содержащий одну из аминокислотных
последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31;
c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31, где пестицидная активность гибридного полипептида улучшена или повышена по сравнению с пестицидной активностью SEQ ID N0:43 или 45.
34. Растение по любому из пп.29-33, где указанное растение представляет собой растительную клетку.
35. Способ защиты растения от вредителя, включающий в себя экспрессию в растении или его клетке молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая
34.
кодирует гибридный полипептид с пестицидной активностью, где гибридный полипептид содержит С-концевой фрагмент SEQ ID N0:43.
36. Способ по п.35, где С-концевой фрагмент соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до примерно 8 03 SEQ ID N0:43 или ее варианту или фрагменту.
37. Способ по п.35 или 3 6, где гибридный полипептид содержит N-концевой фрагмент SEQ ID N0:45.
38. Способ по любому из пп.35-37, где N-концевой фрагмент соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до примерно 803 SEQ ID N0:43 или ее варианту или фрагменту.
39. Способ по любому из пп.35-38, где указанная
нуклеотидная последовательность выбрана из группы, включающей в
себя:
a) одну из нуклеотидных последовательностей, описанных в
SEQ ID N0:47 и 1-14;
b) нуклеотидную последовательность, которая кодирует
полипептид, содержащий одну из аминокислотных
последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31;
c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31, где пестицидная активность гибридного полипептида улучшена или повышена по сравнению с пестицидной активностью SEQ ID N0:43 или 45.
40. Способ по любому из пп.35-39, где указанное растение продуцирует пестицидный полипептид, обладающий пестицидной активностью в отношении вредителя, относящегося, например, к чешуекрылым, полужесткокрылым, жесткокрылым, нематодам или двукрылым.
41. Способ повышения выхода в растении, включающий в себя выращивание в полевых условиях растения или его семени, содержащих стабильно внедренную в геном конструкцию ДНК, несущую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует гибридный полипептид с пестицидной активностью, где гибридный полипептид содержит С-концевой фрагмент SEQ ID N0:43.
40.
42. Способ по п.41, где С-концевой фрагмент соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до примерно 8 03 SEQ ID N0:43 или ее варианту или фрагменту.
43. Способ по п.41 или 42, где гибридный полипептид содержит N-концевой фрагмент SEQ ID N0:45.
44. Способ по любому из пп.41-43, где N-концевой фрагмент соответствует аминокислотным положениям от примерно 174 до примерно 803 SEQ ID N0:43 или ее варианту или фрагменту.
45. Способ по любому из пп.41-44, где указанная
нуклеотидная последовательность выбрана из группы, включающей в
себя:
a) одну из нуклеотидных последовательностей, описанных в
SEQ ID N0:47 и 1-14;
b) нуклеотидную последовательность, которая кодирует
полипептид, содержащий одну из аминокислотных
последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31;
c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 95% идентичную одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID N0:48 и 15-31, где пестицидная активность гибридного полипептида улучшена или повышена по сравнению с пестицидной активностью SEQ ID N0:43 или 45.
По доверенности
Axmi005 - pAX5478 Продукт рАХбЗОЭ
Продукт рАХ6308
Axmi115-pAX5477
ФИГ. 1
(19)
(19)
(19)
Таблица 2
Таблица 8
Таблица 8
Таблица 9
Таблица 9
Таблица 10
Таблица 10
960
102
102
104
104
104
104
105
105
105
105
106
106
109
109
112
112
113
113
1/2
1/2
2/2
2/2