EA201391382A1 20140930 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2014\PDF/201391382 Полный текст описания [**] EA201391382 20120323 Регистрационный номер и дата заявки US61/467,256 20110324 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2012/030223 Номер международной заявки (PCT) WO2012/129457 20120927 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [pdf] eaa21409 Номер бюллетеня [**] СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИБЛИОТЕКИ ЛИГАНДОВ Название документа [8] C40B 20/08, [8] C40B 40/10, [8] G01N 33/543, [8] C40B 30/04, [8] G01N 33/574, [8] C07K 7/06 Индексы МПК [US] Моола Муралидхар Редди, [US] Шилке Джессика Сведения об авторах [US] ОПКО ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ЭлЭлСи Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201391382a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение относится к способам диагностики и лечения с применением библиотеки лигандов. В частности, настоящее изобретение относится к применению библиотеки лигандов для диагностики или детектирования реакции, вызванной лекарственным средством, включая нежелательные реакции на лекарство, побочные эффекты, устойчивость к лекарству и терапевтическую эффективность. Настоящее изобретение также относится к идентификации биомаркеров, ассоциированных с вызванной лекарственным средством реакцией, и обеспечению персонализированного лечения.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к способам диагностики и лечения с применением библиотеки лигандов. В частности, настоящее изобретение относится к применению библиотеки лигандов для диагностики или детектирования реакции, вызванной лекарственным средством, включая нежелательные реакции на лекарство, побочные эффекты, устойчивость к лекарству и терапевтическую эффективность. Настоящее изобретение также относится к идентификации биомаркеров, ассоциированных с вызванной лекарственным средством реакцией, и обеспечению персонализированного лечения.


2420-199722ЕА/041
СПОСОБЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИБЛИОТЕКИ
ЛИГАНДОВ
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительным патентным заявкам США 61/467256, 61/491717 и 61/583881 от 24 марта 2011 г., 31 мая 2011 г. и 6 января 2012 г., полное описание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Настоящее изобретение относится к способам диагностики и лечения с применением библиотеки лигандов и активных соединений, являющихся их производными. В частности, настоящее изобретение относится к применению библиотеки лигандов для поиска лигандов, применяемых для определения профилей биомаркеров заболевания и для диагностики или детектирования реакции на лекарство, включая нежелательные реакции на лекарство, побочные эффекты, устойчивость к лекарству и терапевтическую эффективность. Настоящее изобретение также относится к идентификации биомаркеров, ассоциированных (связанных) с вызванной лекарственным средством реакцией, и обеспечению персонализированного лечения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Низкомолекулярные микроматрицы становятся все более важными
инструментами в комбинаторной химии. Указанные матрицы обычно получают, вначале синтезируя комбинаторную библиотеку на подходящей смоле в форме бусин, разделяя бусины в лунках микротитрационных планшетов с последующим высвобождением соединений из бусин. Полученный раствор затем автоматически наносят на химически модифицированное предметное стекло, ковалентно присоединяя молекулы библиотеки к его поверхности. В качестве альтернативы, существуют способы синтеза некоторых классов соединений in situ на поверхности матрицы. Наиболее частым применением низкомолекулярных микроматриц является их применение в качестве универсальной платформы для скрининга библиотек, обычно с целью выявления низкомолекулярных лигандов для исследуемого белка.
[0004] В заявке на патент США 2007/0003954 раскрыт способ получения профиля белков и антител с использованием микроматриц в низкомолекулярными
соединениями. В этой заявке раскрыты лиганды, связывающиеся с лиганд-связывающими молекулами, причем лиганды организованы в виде матриц синтетических молекул, используемых для скрининга на биомаркеры молекулярные отпечатки пальцев. Конкретные матрицы, описанные в этой заявке включают, например, маикроматрицу пептоидов, содержащую 7680 различных соединений, связанных с матрицей. В этом описании библиотеки на основе бусин используются в качестве исходного средства получения пептоидов, которые затем переносят в микроматрицы, содержащие адресуемые положении, для скрининга биологических жидкостей. Результатом скрининга является уникальный паттерн или "молекулярный отпечаток пальца" для любого конкретного белка в сложной биологической смеси. В заявке на патент США № 2010/0303805, которая полностью включена в настоящее описание путем ссылки, раскрыто несколько пептоидов и диагностические наборы, которые можно применять для скрининга биологических жидкостей на биомаркеры, связанные с заболеваниями центральной нервной системы. Конкретные мономеры, которые согласно этой заявке применяются для формирования матриц, также могут быть использованы в новом способе скрининга согласно настоящему изобретению, при условии увеличения библиотеке до значительно большего количества бусин/пептоидов или бусин/лигандов, например, от более чем 100 тысяч до 150 миллионов.
[0005] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что значительно более
крупные библиотеки на основе бусин (по сравнению с микроматричными системами скрининга на биомеркеры-антитела или системами скрининга клеток на основе бусин) в соответствующих условиях могут быть непосредственно использованы для скрининга сложных биологических образцов с целью обнаружения реакции на лекарственное средство, а также в качестве значительно более обширного пула лигандов, которые связываются с такими лиганд-связывающими молекулами. Такой значительно более обширный пул включает существенно повышенное число высокоаффинных лигандов, которые служат диагностическими средствами а также потенциальными терапевтическими средствами.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает библиотеку лигандов. В примере реализации настоящее изобретение обеспечивает крупную библиотеку случайных лигандов на основе бусин, в том числе библиотеку случайных пептоидных лигандов.
[0007] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики вызванной лекарственным средством реакции у субъекта, включающий: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного образца; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами в библиотеке; и установление, связаны ли указанные один или более маркеров с указанной вызванной лекарственным средством реакцией, что обеспечивает диагностику указанной вызванной лекарственным средством реакции у указанного субъекта. В одном примере реализации указанный ответ на лекарственное средство является неблагоприятной реакцией. В еще одном примере реализации указанный ответ на лекарственное средство является побочным эффектом. В еще одном примере реализации указанный ответ на лекарственное средство представляет собой устойчивость к указанному лекарству. В еще одном примере реализации указанный ответ на лекарственное средство представляет собой его терапевтическую эффективность, включая эффективность дозировки.
[0008] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ лечения заболевания у субъекта, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининга указанного образца с применением библиотеки лигандов; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами библиотеки; определение того, связаны ли указанные один или более маркеров с реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения указанного заболевания; введение указанного лекарственного средства указанному субъекту на основании определения связи между указанными одним или более маркерами и указанной реакцией, что обеспечивает лечение указанного заболевания у указанного субъекта.
[0009] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу определения риска нежелательной реакции на лекарственное средство у пациента, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининга указанного образца с применением библиотеки лигандов; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами библиотеки; и определение того, связаны ли указанные один или более маркеров с указанным риском, что обеспечивает определение указанного риска неблагоприятной реакции на указанное лекарственное средство у указанного субъекта.
[0010] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ определения профиля реакции на лекарственное средство для лечения заболевания для одного или более субъектов, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного образца ; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами библиотеки; и определение того, связаны ли указанные один или более маркеров с указанной реакцией на указанное лекарственное средство, что обеспечивает определение профиля указанной реакции на указанное лекарственное средство для лечения указанного заболевания у указанных одного или более субъектов.
[ООН] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации маркера, ассоциированного с реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения заболевания, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного биологического образца; определение характеристик связывания маркера в указанном образце с лигандом библиотеки; и определение, связан ли указанный маркер с указанной реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения указанного заболевания, тем самым выявляя указанный маркер, ассоциированный с указанной вызванной лекарственным средством реакцией для лечения указанного заболевания.
[0012] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации маркера, ассоциированного с реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения заболевания, причем указанный способ включает: взятие первого набора биологических образцов от одного или более субъектов, демонстрирующих указанную реакцию на указанное лекарственное средство для лечения указанного заболевания; взятие второго набора биологических образцов у одного или более субъектов, не демонстрирующих указанной реакции на указанное лекарственное средство для лечения указанного заболевания, скрининг библиотеки случайных лигандов против указанных первого и второго биологических образцов; определение различий в связывании одного или более маркеров с одним или несколькими лигандами библиотеки между указанными первым и вторым биологическими образцами; и идентификацию маркера, ассоциированного с указанной реакцией на указанное лекарственное средство для лечения указанного заболевания. В примере реализации маркер является аутоантителом, способным к связыванию с пептоидным лигандом.
[0013] Другие особенности и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из приведенного ниже подробного описания, примеров и фигур. Вместе с тем следует понимать, что хотя подробное описание и конкретные примеры демонстрируют предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, они приведены лишь в качестве иллюстрации, поскольку для специалиста в данной области техники на основании указанного подробного описания очевидна возможность различных изменений и модификаций в рамках настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0014] На Фигуре 1 показана основная химическая схема получения библиотеки бусин Tentagel (KN1B), использованной для скрининга образцов сыворотки пациентов с болезнью Альцгеймера. На Фигуре 1А показаны этапы получения, начиная с полистироловой бусины, несущей аминогруппу в качестве реагента (между бусиной и концевой аминогруппой может быть сформирован полиэтиленгликолевый или эквивалентный или альтернативный линкер). На Фигуре 1В показана начальная аминокислота на бусине - метионин, который в результате последующей реакции образует соединение, показанное на Фигуре В. На Фигуре 1С показаны субмономеры (мономерные амины и галоуксусные кислоты), использованные для формирования библиотеки олигомерных соединений.
[0015] На Фигуре 2 показана основная химическая схема получения библиотеки бусин Tentagel (JC3B), которую также использовали для скрининга образцов сыворотки пациентов с болезнью Альцгеймера. На Фигуре 1А показаны этапы получения, начиная с полистироловой бусины, несущей аминогруппу в качестве реагента (между бусиной и концевой аминогруппой может быть сформирован полиэтиленгликолевый или эквивалентный или альтернативный линкер). На Фигуре 1В показана начальная аминокислота на бусине - метионин, который в результате последующей реакции образует соединение, показанное на Фигуре В, на Фигуре 1С показаны субмономеры (мономерные амины и галоуксусные кислоты), использованные для формирования библиотеки олигомерных соединений. JC3B также использовали для скрининга сыворотки при раке поджелудочной железы.
[0016] На Фигуре 3 показана основная химическая схема получения библиотеки бусин Tentagel (JC4B), использованной для скрининга образцов сыворотки пациентов с болезнью Альцгеймера. На Фигуре 1А показаны этапы получения, начиная с полистироловой бусины, несущей аминогруппу в качестве реагента (между бусиной и концевой аминогруппой может быть сформирован полиэтиленгликолевый или
эквивалентный или альтернативный линкер). На Фигуре 1В показана начальная аминокислота на бусине - метионин, который в результате последующей реакции образует соединение, показанное на Фигуре В, на Фигуре 1С показаны субмономеры (мономерные амины и галоуксусные кислоты), использованные для формирования библиотеки олигомерных соединений.
[0017] На Фигуре 4 показана основная химическая схема получения библиотеки бусин Tentagel (JC5B), использованной для скрининга образцов сыворотки пациентов с болезнью Альцгеймера. На Фигуре 1А показаны этапы получения, начиная с полистироловой бусины, несущей аминогруппу в качестве реагента (между бусиной и концевой аминогруппой может быть сформирован полиэтиленгликолевый или эквивалентный или альтернативный линкер). На Фигуре 1В показана начальная аминокислота на бусине - метионин, который в результате последующей реакции образует соединение, показанное на Фигуре В. На Фигуре 1С показаны субмономеры (мономерные амины и галоуксусные кислоты), использованные для формирования библиотеки олигомерных соединений. Мономеры JC5B включали изобутиламин, 2-метоксиэтиламин, диаминобутан, фурфуриламин, циклогексиламин, R-метилбензиламин, пиперониламин и 4-(аминоэтил)бензолсульфонамид.
[0018] На Фигуре 5 показана основная химическая схема получения библиотеки бусин Tentagel (JC7B), использованной для скрининга образцов сыворотки. На Фигуре ЗА показаны этапы получения, начиная с полистироловой бусины, несущей аминогруппу в качестве реагента (между бусиной и концевой аминогруппой может быть сформирован полиэтиленгликолевый или эквивалентный или альтернативный линкер). На Фигуре 1В показана начальная аминокислота на бусине - метионин, который в результате последующей реакции образует соединение, показанное на Фигуре В. На Фигуре 1С показаны субмономеры (мономерные амины и галоуксусные кислоты), использованные для формирования библиотеки олигомерных соединений.
[0019] На Фигуре 6 показана схема процесса согласно настоящему изобретению для скрининга сложного биологического образца с использованием библиотеки пептоидных лигандов на основе бусин.
[0020] На Фигуре 7 показаны соединения Dynabead, проявляющие активность в нормальной контрольной (NC, ЗК) сыворотке после добавления QDot к библиотеки пептоидов (JOB), изготовленной для скрининга контрольных образцов сыворотки здоровых людей и образцов сыворотки пациентов с болезнью Альцгеймера. Активные
соединения удаляли, а остальные бусины, связанные с лигандом, использовали для скрининга заболевания.
[0021] На Фигуре 8 показан скрининг сыворотки крови образцов пациентов с болезнью Альцгеймера на основе бусин Tentagel после удаления соединений, проявляющих активность в NC. Указанные активные соединения показаны красным цветом и представляют собой вторичное антитело Qdot, связанное с биомаркером (антителом) сыворотки, ассоциированным с заболеванием, связанным с пептоидом, присоединенным к бусине через ПЭГ-линкер.
[0022] На Фигуре 9 показан тест на воспроизводимость с применением нормального контрольного образца (NC 030093) после промывки ДСН и добавления Qdot. Стрелка показывает пептоиды, связывавшиеся с NC и выбранные для секвенирования.
[0023] На Фигуре 10 показан тест на воспроизводимость с применением нормального контрольного образца (NC 050047) после промывки ДСН и добавления Qdot.
[0024] На Фигуре 11 показан тест на воспроизводимость с применением образца пациента после промывки ДСН и добавления Qdot.
[0025] На Фигуре 12 показаны пептоидные последовательности предполагаемых активных соединений ("попаданий" или "хитов"), выбранных при скрининге на болезнь Альцгеймера из библиотеки JC3B. С-конец находится на правой стороне листа, a N-конец находится на левой стороне.
[0026] На Фигуре 13 показаны химические структуры предпочтительных высокоаффинных активных соединений, полученных при скрининге болезни Альцгеймера с использованием библиотеки JC3B; показанные в этом примере структуры содержат остаток цистеина и были повторно синтезированы после определения структуры исходного активного соединения при предварительном скрининге. Библиотека JC3B содержала аналогичный пептоид, но содержавший на С-конце остаток метионина, а не остаток цистеина.
[0027] На Фигуре 14 показан конкурентный анализ с высокоаффинным лигандом (ADTGI) в растворе в сравнении с ADTG-1-ADTG-42 на микроматричном носителе. Указанный конкурентный анализ показывает, что ADTGI в растворе связывался с тем же антителом, которое связывалось с пептоидами ADTG-1, ADTG14, ADTG24, ADTG25, ADTG3I, ADTG35 и ADTG40 на микроматрице. Аналогичные эксперименты выполнили с каждым из пептоидов с целью поиска четырех наборов пептоидов, связанных с четырьмя различными аутоантителами при болезни Альцгеймера.
[0028] На Фигуре 15 показаны четыре группы различных пептоидов, связывающихся с различными аутоантителами при скрининге болезни Альцгеймера. В верхней части каждой группы на указанной Фигуре приведены связывающиеся агенты с более высоким сродством.
[0029] На Фигуре 16А показаны данные тестирования болезни Альцгеймера (слепое исследование) для пула больных с использованием пептоида PlaagI (JC3B-1), а на Фигуре 16В показаны данные тестирования (слепое исследование) того же пула пациентов с БА с использованием Plaag2 (JC3B-21). Каждый пептоид представлен на микроматрице.
[0030] На Фигуре 17А показаны данные тестирования болезни Альцгеймера (слепое исследование) для пула больных с использованием пептоида Plaag3 (JC3B-7), на Фигуре 17В показаны данные тестирования (слепое исследование) того же пула пациентов с Б А с использованием Plaag4 (ЗСЗВ-5). Каждый пептоид представлен на микроматрице.
[0031] На Фигуре 18А показаны данные тестирования болезни Альцгеймера (слепое исследование) для пула больных с использованием пептоида Plaag5 (JC3B-R8), на Фигуре 18В показаны данные тестирования (слепое исследование) того же пула пациентов с Б А с использованием Plaag6 (JC3B-R 12). Каждый пептоид представлен на микроматрице.
[0032] На Фигуре 19А показаны данные, полученные с использованием микроматриц для ADP2 в той же группе пациентов для тестов, выполненных с использованием Plaagl-6. На Фигуре 19В показано сравнение данных, полученных с использованием Plaag4 и того же набора пациентов. Указанные данные демонстрируют четкую корреляцию между результатами, достигнутыми с ранее выявленным ADP2 и вновь выявленным Plaag4 в одном и той же группе пациентов.
[0033] На Фигуре 20а показаны данные, полученные с использованием микроматриц для ADP3 в той же группе пациентов для тестов, выполненных с использованием Plaagl-6, на Фигуре 20В оказано сравнение данных, полученных с использованием Plaag2 и того же набора пациентов. Указанные данные демонстрируют четкую корреляцию между результатами, достигнутыми с ранее выявленным ADP3 и вновь выявленным Plaag2 в одном и той же группе пациентов.
[0034] На Фигуре 21 показана валидация Plaag5 (предполагаемое активное соединение 5 или JC3B-R8) на бусинах TentaGel при сравнении сыворотки пациентов с БА с пулом сыворотки здоровых контрольных субъектов при концентрации 40 мкг/мл.
[0035] На Фигуре 22А показаны пептоиды, связывавшиеся при скрининге рака поджелудочной железы с использованием Qdot 655 и библиотеки JC5B. На Фигурах 22В и С показано подтверждение активных соединений с использованием Qdot 655 (стрелки указывают на активные соединения).
[0036] На Фигуре 23 показана валидация пептоидных активных соединений для скрининга поджелудочной железы и сравнение добавления и детектирования сыворотки при заболевании с помощью Qdot 655 и добавления нормальной сыворотки.
[0037] На Фигуре 24 показана валидация активного соединения путем смешивания маркеров БА и РПЖ. Полученные данные показывают, что маркер РПЖ обнаруживали при отсутствии обнаруживаемого антитела на БА-пептоидных бусинах в сыворотке при раке поджелудочной железы (сыворотка 1).
[0038] На Фигуре 25 показаны последовательности соединений из библиотеки JC3B, подходящих для скрининга рака поджелудочной железы.
[0039] На Фигуре 26 показаны последовательности соединений из библиотеки JC5B, подходящих для скрининга рака поджелудочной железы.
[0040] На Фигуре 27 А, В и С показаны результаты скрининга СКВ (волчанки). А -нормальный контроль, а В и С - сыворотка при СКВ из двух различных групп 1 и 2. Стрелки указывают на активные соединения.
[0041] Фигура 28 показывает активные соединения для СКВ из библиотеки KN1B. С-конец находится на правой стороне листа.
[0042] На Фигуре 29 показана валидация попаданий для пептоида KN1B-20. Группу 1 составляют объединенные образцы сыворотки от субъектов с заболеванием с концентрацией приблизительно 0,374 мг/мл (картинка слева)(попадания показаны красной окраской бусин). Объединенные сыворотки субъектов без заболевания (картинка в центре) использованы в концентрации приблизительно 0,378 мг/мл, а на дальней правой картинке показан контроль без сыворотки.
[0043] На Фигуре 30 показано связывания/детектирование одного из активных пептоидных соеддинений СКВ (волчанки) с планшетами для твердофазного ИФА (ELISA) с использованием двух различных способов связывания при различных концентрациях пептоида с использованием флуоресцентной метки.
[0044] На Фигуре 31 показан конкурентный анализ с иммобилизованным на планшете KNlB-20-биотин-флюоресцеина и свободным KNlB-20-биотином в растворе в
различных концентрациях. Сигнал снижается по мере увеличения концентрации свободного KNlB-20-биотина начиная с эквимолярных концентраций свободного и связанного веществ.
[0045] На Фигуре 32 показан планшет для твердофазного ИФА, содержащий пептоид в различных концентрациях, изображение четко демонстрирует разницу между сывороткой больного субъекта (БА)(Р столбец 1) и сывороткой здорового контроля (ряд 3) [1:200 с удвоением в каждой лунке: 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3200, 1:6400, 1:12800]. Стрелки указывают на разведение 1:800 в IX буфере TBST. Концентрация пептоида в лунке составляет 10 мМ. На Фигуре 32 также показана валидация платформы на бусинах TentaGel по различению между сывороткой больного субъекта и контрольной сывороткой.
[0046] На Фигуре 33 показан планшет для твердофазного ИФА (ELISA) с 10 мМ ADP3 и различными разбавлениями сыворотки субъекта с Б А против контрольной сыворотки. Стрелка указывает на разбавление 1:800.
[0047] На Фигуре 34 показан планшет для твердофазного ИФА (ELISA) с 10 мМ SLE-KN1B-20 и различными разбавлениями сыворотки субъекта с Б А против контрольной сыворотки. Стрелка указывает на разбавление 1:800.
[0048] На Фигуре 35 показан график ИФА-анализа (ELISA) сыворотки Б А с использованием 10 мМ ADP3, приготовленного в буфере для связывания, при различных разведениях сыворотки. Разделение между сыворотками больных и здоровых субъектов происходило в диапазоне разбавления от 1:200 до приблизительно 1:10000. Начальные разбавления составляли 1:200 (Группа 1 - сыворотка БА при 0,394 мг/мл и сыворотка субъектов без заболевания при 0,386 мг/мл).
[0049] На Фигуре 36 показан график ИФА-анализа (ELISA) сыворотки СКВ с использованием 10 мМ KN1B-20, при, приготовленного в буфере для связывания, при различных разведениях сыворотки. Разделение между сыворотками больных и здоровых субъектов происходило в диапазоне разбавления от 1:200 до приблизительно 1:10,000. Начальные разбавления составляли 1:200 (Группа 1 - сыворотка СКВ при 0,375 мг/мл и сыворотка субъектов без заболевания при 0,396 мг/мл).
[0050] На Фигуре 37 показан график твердофазного ИФА (ИФА) сыворотки пациентов с СКВ с использованием 1,0 мМ KN1B-20 в ДМСО при различных разведениях сыворотки. Произошло разделение между сывороткой здоровых субъектов и пациентов в диапазоне разведений от 1:200 до приблизительно 1:10000. Исходное разведение
составляло 1:200 (группа 1, сыворотка пациентов с СКВ при 0,367 мг/мл и сыворотка здоровых субъектов при 0,322 мг/мл).
[0051] На Фигуре 38 показана валидация платформы FACS для бусин Tentagel.
[0052] На Фигуре 39 показана степень разделения между бусинами, несущими ацетильную группу и бусинами, несущими 2,5-динитрофенильную группу (DNP) при различных концентрациях сыворотки (от 100 мкг/мл до 1000 мкг/мл) и в ответ на лечение с применением меченых вторичных антител против DNP. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) разделения была наибольшей при более высоком разведении сыворотки 1000 мкг/мл.
[0053] Фигура 40 демонстрирует, что существует прямая конкуренция между этаноламин-DNP и связыванием DNP (на планшете) с анти-DNP антителом в концентрации 1000 мкг/мл сыворотки.
[0054] На Фигуре 41 показано, что ADP3 связывал антитело к антителу из объединенных сывороток здорового контроля и объединенных сывороток БА. Эти данные демонстрируют хорошее разделение при концентрациях сывороток в диапазоне от 20 до 140 мкг/мл с использованием двух различных вторичных антител (антитела козы к AT человека с Dylight 649 антитела козы к AT человека с Alexa 647).
[0055] На Фигуре 42 показано связанное с ADP3 аутоантитело из нормальной контрольной сыворотки и сыворотки пациентов с AD после вычитания фона в различных диапазонах концентрации сыворотки. Существует значительная степень разделения в большинстве диапазонов концентрации сыворотки от менее 20 мкг/мл до 1,20 мкг/мл или выше.
[0056] На Фигурах 43 и 44 приведены структуры повторно синтезированных активных пептоидных соединений при СКВ (волчанка).
[0057] На Фигуре 45 показано получение ADP3 на 10-мкм бусинах Tentagel и последующее расщепление под действием CNBr вместе с масс-спектрометрическим определением показанного лактона.
[0058] На Фигуре 46 показано связанное с ADP3 аутоантитело из нормальной контрольной сыворотки и сыворотки пациентов с болезнью Альцгеймера при различных диапазонах концентрации. Бусины предварительно блокировали в течение 3 часов IX TBST, а затем обнаруживали с применением вторичного антитела козы против антител человека, меченого Alexa 647.
[0059] На Фигуре 47 показано связанное с ADP3 аутоантитело из нормальной контрольной сыворотки и сыворотки пациентов с болезнью Альцгеймера при различных диапазонах концентрации сыворотки, а также показаны значения DNP.
[0060] На Фигурах 48 и 49 показано связанное с ADP3 аутоантитело из нормальной контрольной сыворотки по сравнению с антителом из сыворотки пациентов с болезнью Альцгеймера с использованием предварительного блокирования, например, лизатом Е. coli и лизином.
[0061] На Фигуре 50 показана базовая схема приготовления и различения пептоидов, которые используются в микроматрицах в сравнении с пептоидами, которые размещали на планшетах для ИФА (ELISA). Схема получения отдельных пептоидов: отдельные бусины раздельно помещают в лунки микротитрационных планшетов и отщепляют пептоиды от бусин с получением концентрированного исходного раствора. Следует отметить, что в каждой лунке теперь находится единственный вид пептоида. Затем несколько тысяч пептоидов наносят на предметные стекла их химически модифицированного стекла таким образом, что они ковалентно связываются с поверхностью. Из одной синтетической библиотеки можно получить несколько тысяч стекол с высокой степенью воспроизводимость. ИФА получают аналогичным образом за тем исключением, что на поверхности нет цепи ПЭГ, но плотность пептоидов на планшете для ИФА может отличаться от их плотности на микроматрицах.
[0062] На Фигуре 51 показаны ИФА-тесты, которые позволяют четко отличить сыворотку здорового контроля от сыворотки больного пациента при разбавлении сыворотки 1:800 с использованием пероксидазы хрена (HRP), связанной со вторичным антителом, для детектирования комплекса ассоциированного с болезнью антитела с пептоидом. Добавляют бесцветный субстрат который меняет цвет (на синий) после реакции со связанным ферментом ПХ.
[0063] На Фигуре 52 показаны данные по титрованию, сравнивающие различные БА-пептоиды с помощью твердофазного ИФА при различных разведениях сыворотки пациентов (А) по сравнению с нормальной сывороткой (В). В нормальной сыворотке отсутствуют интенсивные сигналы, и имеет место четкое различие интенсивности всех БА-пептоидов по мере увеличения концентрации от 1:12800 до 1:200.
[0064] На Фигуре 53 приведена диаграмма, подтверждающая корреляцию между клиническим диагнозом для немаскированного набора образцов пациентов болезнью Альцгеймера с различными стадиями (или отсутствием) БА в сравнении с данными, полученными по тем же образцам сыворотки пациента (маскированным) в результате
скрининга против пептоида ADP3 для детектирования ассоциированных с болезнью антител. Приведенные результаты получены в слепом исследовании образцов плазмы из клиники Мауо в Джексонвилле (Jacksonville, США). UND = неопределенный. График получали с использованием единственной концентрации разведения сыворотки (1:800). Результат > 1 считали положительным, результат от 1 до 0,7 считали неопределенным, а результат ниже 0,7 считали отрицательным.
[0065] На Фигуре 54 приведена диаграмма, подтверждающая корреляцию между клиническим диагнозом для немаскированного набора образцов пациентов с болезнью Альцгеймера с различными стадиями (или отсутствием) БА в сравнении с данными, полученными по тем же образцам сыворотки пациента (маскированным) в результате скрининга против различных пептоидов БА (график представляет собой среднее значение результатов для 9 пептоидов) согласно настоящему изобретению для детектирования ассоциированных с болезнью антител. Приведенные результаты получены в слепом исследовании образцов плазмы из клиники Мауо в Джексонвилле (Jacksonville, США). UND = неопределенный. График получали с использованием единственной концентрации разведения сыворотки (1:800). Результат > 1 считали положительным, результат от 1 до 0,7 считали неопределенным, а результат ниже 0,7 считали отрицательным.
[0066] На Фигуре 55 приведена диаграмма, подтверждающая корреляцию между клиническим диагнозом для немаскированного набора образцов пациентов с болезнью Альцгеймера с различными стадиями (или отсутствием) БА в сравнении с данными, полученными по тем же образцам сыворотки пациента (маскированным) в результате скрининга против различных пептоидов БА согласно настоящему изобретению для детектирования ассоциированных с болезнью антител. Приведенные результаты получены в слепом исследовании образцов плазмы из клиники Мауо в Джексонвилле (Jacksonville, США). UND = неопределенный. График получали с использованием единственной концентрации разведения сыворотки (1:800). Результат > 1 считали положительным, результат от 1 до 0,7 считали неопределенным, а результат ниже 0,7 считали отрицательным. Эти данные также демонстрируют действие для других деменций, в случае когда в исследовании также участвовали маркированные образцы от пациентов с умеренными когнитивными нарушениями (МС1)/депрессией, и также маркированные образцы пациентов с деменцией с тельцами Леви. Эти данные демонстрируют, что по меньшей мере у трех пациентов с MCI в образцах плазмы были
определены антитела, связываемые селективными в отношении БА петоидами согласно настоящему изобретению, в количествах выше 1.
[0067] На Фигурах 56A-D представлены данные от подгруппы образцов от тех пациентов, у которых были несовпадения в результатах диагностических тестов на основе пептоидов Opko Health с использованием множества пептоидов БА и клиническим диагнозом после предоставления этой информации в демаскированном виде. На Фигуре 56А показаны данные для пептоида ADP3 и других в случае пациентов с клиническим диагнозом у которых, однако, результаты, полученные с пептоидом Plaag4 (Opko) были ниже 1,0 (UND в единственной точке; положительное титрование БА). Все другие пептоиды Opko были положительны по БА (т.е. выше 1.0). На Фигуре 56В показано, что все пептоиды Opko были положительны в отношении ассоциированных с болезнью антител у пациентов, которые в данный момент имели диагноз "здоров" (деменция отсутствует), что указывает на предболезнь А. Фигура 56С демонстрирует, что не один из пептоидов БА Opko не показал интенсивность выше 1 при каком-либо значении разбавления у пациента в клинически диагностированной БА, что указывает на то, что этот пациент страдает какой-то другой формой деменции. Фигура 56D демонстрирует, что у пациента с положительным клиническим диагнозом БА, несколько пептоидов БА Opko не дали положительных результатов по антителам, ассоциированным с болезнью, но два пептоида (Plaag6 и Plaag4) дали положительные результаты, т.е. UND в одной точке и UND даже после титрования.
[0068] На Фигуре 57 приведена кластерная диаграмма, полученная по предыдущим образцам Б А с использованием микроматрицы с нанесенным ADP3. Существует явная корреляция между образцами больных по сравнению со здоровым контролем в данных, полученных с использованием микроматрицы и данных, полученных с использованием платформа ИФА. На Фигуре 57 также показано, что пептоид ADP3 селективен в отношении антител, ассоциированных с болезнью Альцгеймера, но не для болезни Паркинсона и волчанки (СКВ).
[0069] На Фигуре 58 приведены обобщенные результаты иммуноферментного анализа (ELISA), в котором исследовали всего 106 образцов сыворотки.
[0070] На Фигуре 59 приведены химические структуры Plaag7-9.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0071] В приведенном ниже подробном описании приведены многочисленные конкретные детали в целях обеспечения полного понимания изобретения. Вместе с тем,
специалистам в данной области техники понятно, что настоящее изобретение можно осуществить без указанных конкретных деталей. В других случаях общеизвестные способы, процедуры и компоненты не описаны в подробностях, чтобы не затруднять понимание изобретения.
[0072] Настоящее изобретение включает библиотеку лигандов и варианты их применения. В частности, настоящее изобретение включает скрининг молекул, фармакопротеомику, диагностику, лечение и другие варианты применения случайной библиотеки.
[0073] В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает библиотеку лигандов для персонализированной медицины. Термин "персонализированная медицина" в настоящем документе может относиться к применению теста (или диагностического средства), для идентификации лекарственного средства (или терапевтического средства), которое с наибольшей вероятностью окажет благоприятное действие на пациентов, или для выявления пациентов, которые могут подвергаться риску неблагоприятного действия указанного терапевтического средства. Перед тем, как лекарство или диагностический продукт может поступить в продажу в США и большинстве других стран, оно проходит строгую проверку на безопасность и эффективность. В случае диагностического средства для персонализированной медицины это может потребовать тестирования ткани или жидкости из организма пациентов, получавших лекарство, для выяснения наличия взаимосвязи между реакцией на лечение и присутствием конкретного маркера. Соответственно, в одном варианте реализации настоящая заявка обеспечивает способ диагностики реакции на лекарственное средство для лечения заболевания у субъекта, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг указанного образца с использованием библиотеки лигандов; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или несколькими лигандами в библиотеке; и определение ассоциации указанного одного или более маркеров с указанной реакцией на указанное лекарственное средство, что обеспечивает диагностику указанной реакции на указанное лекарственное средство для лечения указанного заболевания у указанного субъекта. Примеры реакции включают неблагоприятную реакцию, побочный эффект, устойчивость к лекарству и терапевтическую эффективность, включая эффективность дозировки, но не ограничиваются ими.
[0074] Неблагоприятные реакции на лекарственного средства являются основной причиной низкого процента успеха программ разработки лекарственных средств (Управление США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) в конечном счете одобряет применение менее одного из четырех соединений, поступающих на клинические испытания на людях). Заболевания или токсические эффекты, вызванный лекарственным средством, создает для разработчиков лекарств ряд уникальных проблем, поскольку указанные реакции часто нельзя предсказать на основании доклинических исследований, они могут не обнаруживаться в ранних клинических испытаниях с участием небольшого количества субъектов. Когда такие эффекты обнаруживаются на более поздних стадиях клинической разработки, они часто приводят к прекращению программы разработки лекарственного препарата. Если лекарство одобряют, несмотря на некоторую токсичность, его клиническое применение часто сильно ограничивается возможностью возникновения нежелательных реакций даже в небольшой группе пациентов. Вероятность, что такое соединение становится терапевтическим средством первой линии, мала (только если нет конкурирующих продуктов). Клинические испытания, в которых применяют настоящее изобретение, могут обеспечить улучшенные прогнозы возможных токсических реакций в исследованиях с участием небольшого количества субъектов. Способы согласно настоящему изобретению предполагают быстрое получение прогноза вероятных токсических эффектов вмешательства в будущем. Соответственно, в еще одном варианте настоящее изобретение обеспечивает к способу определения риска нежелательной реакции на лекарственное средство у пациента, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининга указанного субъекта с применением библиотеки лигандов; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами библиотеки; и определение того, связаны ли указанные один или более маркеров с указанным риском, тем самым обнаруживая указанный риск неблагоприятной реакции на указанное лекарственное средство у указанного субъекта.
[0075] Настоящее изобретение основано, в частности, на неожиданно обнаруженном факте, что комбинацию биомаркеров, связывающих пептоид, можно применять для индивидуализации терапии для пациентов. С учетом высокой изменчивости реакции на лекарственное средство пациенту разных пациентов способы анализа согласно настоящему изобретению являются особенно предпочтительными, поскольку они используют комбинаторную стратегию, учитывающую различия в характеристиках связывания множественных молекулярных детерминант (например, биомаркеров,
связывающих пептоиды) для определения наличия высокой вероятности ответа заболевания у пациента на лечение конкретным лекарственным средством или комбинацией лекарств. Если пациента определяют как чувствительного, можно разработать режим дозирования для указанного пациента с целью достижения терапевтической эффективности без токсических побочных эффектов. Следовательно, пациенты, классифицируемые как чувствительные, могут получить все преимущества от лекарственной терапии, не испытывая побочных эффектов, связанных с такой терапией. Кроме того, пациенты, уже проходящие лечение лекарственным средством, могут испытывать уменьшение токсичных побочных эффектов без ущерба для терапевтической эффективности за счет регулировки последующей дозы препарата. Аналогично, можно осуществлять мониторинг пациентов, уже подвергающихся лечению лекарственным средством, с целью оценки развития устойчивости к лекарственному средству и необходимости назначения альтернативного терапевтического средства.
[0076] В результате способы согласно настоящему изобретению обеспечивают лечение заболевания у субъекта, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного субъекта; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами библиотеки; определение того, связаны ли указанные один или более маркеров с реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения указанного заболевания; введение указанного лекарственного средства указанному субъекту на основании определенной связи между указанными одним или более маркерами и указанной реакцией, что обеспечивает лечение указанного заболевания у указанного субъекта. В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает мониторинг лечения субъекта с применением лекарственного средства, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного субъекта; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами библиотеки; определение того, связаны ли указанные один или более маркеров с вызванной лекарственным средством реакцией для лечения указанного заболевания; введение указанного лекарственного средства указанному субъекту на основании определения связи между указанными одним или более маркерами и указанной реакцией, что обеспечивает мониторинг лечения указанного субъекта с применением указанного лекарственного средства.
[0077] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает библиотеку лигандов для решения задач фармакопротеомики и идентификации маркеров, ассоциированных с вызванной лекарственным средством реакцией. Соответственно, в одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации маркера, ассоциированного с вызванной лекарственным средством реакцией для лечения заболевания, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного биологического образца с; определение характеристик связывания маркера в указанном образце с лигандом в библиотеке; и определения того, связан ли указанный маркер с указанной реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения указанного заболевания, что обеспечивает идентификацию указанного маркера, ассоциированного с указанной вызванной лекарственным средством реакцией для лечения указанного заболевания. В примере реализации вызванная лекарственным средством реакция является реакцией пациента на медикамент, его дозировку, или неблагоприятной реакцией.
[0078] В одном варианте реализации одно или более предполагаемых активных соединений или предшественников биомаркеров идентифицируют с применением библиотеки лигандов согласно настоящему изобретению. Биологический образец можно получить от субъекта или множества субъектов (например, популяции или субпопуляции пациентов). В некоторых вариантах реализации первый набор биологических образцов может быть получен от множества субъектов, проявляющих реакцию (например, реакцию на лекарственное средство или на заболевание), а второй набор биологических образцов может быть получен от множества субъектов, не проявляющих реакции. С применением библиотеки лигандов можно выполнять скрининг первого и второго набора биологических образцов. Можно определить различия в характеристиках связывания одного или более маркеров с одним или более лигандами в библиотеке между первым и вторым наборами биологических образцов. На основании различий в характеристиках связывания можно идентифицировать предполагаемые активные соединения или предшественники биомаркеров. В некоторых вариантах реализации предполагаемые активные соединения или предшественники ("лиды") являются биомаркерами, распознающими аутоантитела к антигенам, ассоциированным с реакцией, например, реакцией пациента на лекарство, реакцией на заболевание и реакцией на определенную стадию заболевания.
[0079] В одном варианте реализации для идентификации предполагаемых активных соединений или предшественников биомаркеров можно применять крупную библиотеку случайных пептоидных лигандов на основе бусин, содержащую пептоидные лиганды в количестве от приблизительно 350000 до приблизительно 250 млн. Предполагаемые активные соединения или соединения-предшественники биомаркеров , выявленные при начальном скрининге с применением библиотеки случайных соединений можно затем применять при последующем скрининге образцов с целью выявления диагностических средств или диагностических средств-компаньонов, обсуждаемых в настоящем документе.
[0080] В некоторых вариантах реализации осуществляют валидацию предполагаемых активных соединений или предшественников при последующем скрининге. В одном варианте реализации при валидации в ходе последующего скрининга можно использовать ту же библиотеку лигандов, которую использовали при начальном скрининге. В еще одном варианте реализации при валидации в ходе последующего скрининга можно использовать другую библиотеку лигандов (отличающуюся от библиотеки, использованной при начальном скрининге.
[0081] В одном варианте реализации предполагаемые активные соединения или предшественники ассоциированные с первым признаком (например, реакцией на заболевание), выявляют при начальном скрининге, и предполагаемые активные соединения или предшественники применяют для скрининга образцов с целью определения их ассоциации со вторым признаком (например, вызванной лекарственным средством реакцией). В одном варианте реализации предполагаемые активные соединения или предшественники, ассоциированные с заболеванием, выявляют при начальном скрининге, и выявленные предполагаемые активные соединения или предшественники применяют для скрининга образцов с целью валидации и определения связи с определенной стадии указанного заболевания.
[0082] В некоторых вариантах реализации начальный скрининг для выявления предполагаемых активных соединений можно выполнить с применением устройства на основе бусин, применяя крупную библиотеку случайных лигандов, а последующий скрининг с целью выявления диагностических средств или диагностических средств-компаньонов можно выполнить с применением любой платформы, например, микроматрицы и библиотеки неслучайных или случайных лигандов.
[0083] В одном варианте реализации при последующем скрининге для выявления диагностических средств или диагностических средств-компаньонов первый скрининг
можно выполнить с применением первой библиотеки лигандов, а последующий скрининг - с применением второй библиотеки лигандов, причем указанная первая библиотека лигандов содержит первый набор лигандов, а вторая библиотека лигандов содержит второй набор лигандов. В одном примере первую библиотеку лигандов подвергают скринингу для идентификации маркеров, ассоциированных с заболеванием, а вторую библиотеку лигандов подвергают последующему скринингу для идентификации маркеров, ассоциированных с вызванной лекарственным средством реакцией.
[0084] В одном из примеров предполагаемые активные соединения или предшественники применяют при первом скрининге образцов пациента, отобранных до медикаментозного лечения, с целью определения их связи с заболеванием. После медикаментозного лечения можно взять образцы у пациентов, и в одном варианте реализации те же предполагаемые активные соединения, применявшиеся в группе с предварительной обработкой, можно использовать для идентификации пациентов, находящихся на определенных стадиях заболевания или реагирующих на изменения медикаментозного лечения. В еще одном варианте реализации для мониторинга побочных эффектов лекарственных средств или последствий лечения, вызванных введением лекарственного средства и возможно коррелирующих или связанных с профилем предварительной обработки, можно применять различные предполагаемые активные соединения. В некоторых вариантах реализации для поиска дополнительных биомаркеров, которые могут быть ассоциированы с медикаментозным лечением, можно применить другую библиотеку случайных соединений.
[0085] Термин "лекарственное средство" в настоящем описании может относиться к любому лекарственному средству, включая синтетическое неорганическое или органическое соединение, белок, пептид, полисахариды и другие сахара, липиды, нуклеотидные последовательности ДНК и РНК, антисмысловой олигонуклеотид, антитело, лиганд рецептора, фермент, пептид адгезии, антиген, гормон, фактор роста, рибозим и ретровирусный вектор, но не ограничиваясь ими.
[0086] Настоящее изобретение включает любое подходящее лекарственное средство, известное в данной области техники. Указанные лекарственного средства перечислены в The Merck Index; Physicians' Desk Reference, PDR Network, 2011 Edition edition (December 1, 2010), патенте США № 7932294 и патентных публикациях США 20060046967, 20110274695, 20110269722, 20110269709 и 20060205674, все из которых полностью включены в настоящий документ посредством ссылок.
[0087] В одном варианте реализации лекарство выбрано из одной или более из следующих категорий/групп: Антибиотики, седативные средства, снотворные средства, антидепрессанты, нейролептики, противоманиакальные средства, анальгетики, жаропонижающие средства, агенты для лечения мигрени, противосудорожные препараты, лекарственного средства для лечения паркинсонизма и двигательных расстройств, лекарственного средства для лечения деменции, противорвотные средства, лекарственного средства для лечения головокружения, стимуляторы и активаторы ЦНС, противоинфекционные глазные препараты, противовоспалительные средства, противоаллергические препараты, лекарственного средства для лечения глаукомы, препараты для лечения глазных заболеваний, препараты для лечения заболеваний уха, назальные препараты, ротоглоточные препараты, антиаритмические препараты, антигипертензивные средства, альфа/бета-блокаторы, блокаторы каналов, ингибиторы АХЭ, антагонисты рецепторов ангиотензина II, диуретики, лекарственного средства для лечения стенокардии, нитраты, блокаторы кальциевых каналов. Лекарственного средства для лечения сердечной недостаточности и шока, сосудорасширяющие, коагулянты, антикоагулянты, тромболитики, антиагреганты, стимуляторы дыхания, противокашлевые, отхаркивающие, муколитики, противоотечные средства, антигистаминные средства, противоастматические средства; противоязвенные, антисекреторные лекарственного средства, антагонисты рецептора H.sub.2, ингибиторы протонного насоса, аналоги простагландинов, антацидные, спазмолитики, лекарственного средства, изменяющие моторику кишечника, противодиарейные, препараты против перистальтики, антимикробные препараты, препараты, действующие на желчный пузырь, мочевые противомикробные средства, диуретики, мочевые анальгетики, спазмолитики, противодиарейные лекарственного средства, действующие на уретру и влагалище, лекарственного средства, действующие на матку, лекарственного средства для лечения гипертрофии предстательной железы, альфа-блокаторы, антиандрогены, лекарственного средства для лечения эректильной дисфункции, спермицидные средства, негормональные противозачаточные средства, смягчающие вещества, кератолитики, противомикробные средства для наружного применения, противогрибковые средства для наружного применения, противопаразитарные средства для наружного применения, стероиды для наружного применения, лекарственного средства для лечения вульгарных угрей для наружного применения, лекарственного средства для лечения псориаза, нарушений пигментации и противосеборейные средства, нестероидные противовоспалительные средства (Н11ВС), ингибиторы СОХ-2, противоартритные агенты, иммунодепрессанты, анальгетики для
наружного применения, миорелаксанты, нервно-мышечные лекарственного средства, пенициллиновые антибиотики, цефалоспориновые антибиотики, хинолон, фторхинолоновые антибиотики, макролидные антибиотики, хлорамфеникол, тетрациклиновые антибиотики, сульфаниламиды, средства против анаэробных микроорганизмов, метронидазол, противотуберкулезные лекарственного средства, антилепрозные лекарственного средства, противогрибковые средства, средства против простейших, антигельминтики, противоинфекционные лекарственного средства, лекарственного средства для лечения малярии, противовирусные средства, анаболики, стероиды, кортикостероиды, эстрогены, прогестагены и гормональные контрацептивы, средства против бесплодия, трофические гормоны и связанные с ними лекарственного средства, лекарственного средства для стимуляции и подавления активности щитовидной железы, противодиабетические и гипергликемические средства, витамины, аминокислоты, лекарственного средства для лечения ожирения, гиполипидемические лекарственного средства, производные фиброевой кислоты, статины, ингибиторы ГМГ-СоА-редуктазы, группа никотиновой кислоты, препараты для лечения подагры, препараты, влияющие на метаболизм костной ткани, бисфосфонаты, Противораковые препараты, алкилирующие агенты, цитотоксические антибиотики, антиметаболиты, цитарабин, флударабин, 5-фторурацил, меркаптопурин, тиогуанин, алкалоиды барвинка, этопозид, таксаны, ингибиторы топоизомеразы 1, цитотоксические иммунодепрессанты, иммуностимуляторы, цитопротекторы, амифостин, эстрогены, прогестагены, антагонисты гормонов, противоопухолевые препараты, противоаллергические средства, неседативные антигистаминные средства, цетиризин, дезлоратадин, терфенадин, фексофенадин, седативные гистаминные препараты, блокаторы рецепторов гистамина, местные анестетики, внутривенные анестетики, ингаляционные анестетики и миорелаксанты.
[0088] В еще одном варианте реализации лекарственное средство выбрано из одного или более лекарственных средств, перечисленных в Таблице 1 ниже.
PS псориаз, PsA псориатический артрит, CD болезнь Крона; UC неспецифический язвенный колит, AS анкилозирующий спондилит.
[0089] В еще одном варианте реализации лекарство выбрано из одного или более из следующих: Абакавир, арипипразол, мышьяка триоксид, атомоксетин, аторвастатин, азатиоприн, боцепревир, брентуксимаб ведотин, бусульфан, капецитабин, карбамазепин, карисопродол, карведилол, целекоксиб, цетуксимаб (1), цетуксимаб (2), цевимелин, хлордиазепоксид и амитриптилин, хлорохин, циталопрам (1), циталопрам (2), клобазам, кломифен, кломипрамин, клопидогрель, клозапин, кодеин, кризотиниб, дапсон, дазатиниб, дезипрамин, дезлоратадин и псевдоэфедрин, декслансопразол (1), декслансопразол (2), декстрометорфан и хинидин, диазепам, доксепин, дроспиренон и этинилэстрадиол, эстрадиол, эрлотиниб, эзомепразол, фторурацил, флуоксетин,
флуоксетин и оланзапин, флурбипрофен, флувоксамин (1), флувоксамин (2), флувоксамин (3), фульвестрант, галантамин, гефитиниб (1), гефитиниб (2), илоперидон, иматиниб (1), иматиниб (2), иматиниб (3), иматиниб (4), имипрамин, индакатерол, иринотекан, изосорбид и гидралазин, лапатиниб, леналидомид, маравирок, меркаптопурин, метопролола, мивакурий, модафинил (1), модафинил (2), нефазодон, нелфинавир, нилотиниб (1), нилотиниб (2), нортриптилин, омепразол, панитумумаб (1), панитумумаб (2), пантопразол, пароксетин, пегинтерферон альфа 2Ь, перфеназин, фенитоин, пимозид, прасугрел, правастатин, пропафенон, пропранолол, протриптилин, хинидин, рабепразол, расбуриказа, рифампицин, изониазид, пиразинамид, рисперидон, фенилацетат натрия и бензоат натрия, фенилбутират натрия, тамоксифен, телапревир, тербинафина, тетрабеназин, тиогуанин, тиоридазин, тикагрелор, тимолол, тиотропия, толтеродин, тозитумомаб, трамадол и ацетаминофен, трастузумаб, третиноин, тримипрамин, вальпроевая кислота, вермурафениб, венлафаксин, вориконазол, варфарин (1) и варфарин (2).
[0090] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение включает диагностическое средство-компаньон для лекарственного средства, мишенью которого является известная мишень лекарственного средства. В еще одном варианте реализации настоящее изобретение включает диагностическое средство-компаньон для целевого лекарственного средства, которое проходит клинические испытания. Примеры целевых лекарственненных средств, которые проходят клинические испытания, включают бапинейзумаб, соланезумаб, иммуноглобулин для внутривенного введения (IVIg), латрепирдин (димебон), сцилло-инозит/ELND 005, метилтиониния хлорид (Rember), CERE-ПО, РВТ2, давенутид/АЬ-108, BMS-708163, PF-04494700/TTP488, тидеглусиб/КР-12 (Nypta), белимумаб, атацицепт, мапатумумаб, апомаб, дуланермин, оданакатиб, AMG-785, DG-041, ОС-000459, PLX-4032, LX-1031 и LX-1032, но не ограничиваются ими.
[0091] Профиль связывания одного или нескольких компонентов образца (например, биомаркеров) можно применять для прогнозирования, диагностики, оценки или лечения любого заболевания, известного в данной области техники. Термины "заболевание" или "состояние" широко известны в данной области техники и означают наличие признаков и/или симптомов у лица или пациента, которые в целом считаются аномальными. Заболевание или состояние можно диагностировать и классифицировать на основании патологических изменений. Признаки могут включать любой объективный признак заболевания, например, изменения, проявляющиеся при осмотре пациента, или
результаты диагностических тестов. Симптомы являются субъективными доказательствами заболевания или состояния пациента, т.е. восприятием пациентом аномального состояния, отличающегося от нормального функционирования, ощущения или внешнего вида, что может включать, без ограничения, физическую недееспособность, заболеваемость, боль и другие изменения по сравнению с нормальным состоянием, испытываемым субъектом. Различных заболевания или состояния включают заболевания или состояния, классифицированные в стандартных руководствах по медицине, включая, без ограничения, руководства по диетологии, аллопатической, гомеопатической и остеопатической медицине, но не ограничиваются ими. В некоторых аспектах настоящего изобретения заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из видов заболеваний, перечисленных в стандартной литературе, например, Harrison's Principles of Internal Medicine, 14.sup.th Edition (Fauci et al, Eds., McGraw Hill, 1997), или Robbins Pathologic Basis of Disease, 6.sup.th Edition (Cotran et al, Ed. W В Saunders Co., 1998), или Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders: DSM-IV, 4.sup.th Edition, (American Psychiatric Press, 1994) или других руководствах, полностью включенных в настоящий документ. Заболевания также перечислены в патентных публикациях США 2007/0003954 и 2011/0092384, полностью включенных в настоящий документ.
[0092] Примеры заболевания или состояния включают рак, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, инфекционные заболевания, нейродегенеративные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, бактериальные инфекции, вирусные инфекции, грибковые инфекции, прионные инфекции, физиологические состояния, состояния загрязнения или состояние здоровья в целом, но не ограничиваются ими.
[0093] В способах скрининга согласно настоящему изобретению с применением библиотеки случайных лигандов можно использовать характеристики связывания для дифференцирования различных форм заболевания или состояния, включая предболезненное состояние или тяжесть болезненного состояния. Например, указанные способы можно использовать для определения метастатического состояния рака или восприимчивости к агенту или болезненного состояния. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает способы и композиции для оценки лиганд-связывающих молекул, присутствующих при или ассоциированных с раком, например, не ограничиваясь ими, раком молочной железы, раком легких, раком простаты, раком шейки матки, раком головы и шеи, раком яичка, раком яичников, раком кожи, раком
головного мозга, раком поджелудочной железы, раком печени, раком желудка, раком толстой кишки, раком прямой кишки, раком пищевода, лимфомой и лейкозом.
[0094] В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает способы и композиции для оценки лиганд-связывающих молекул, присутствующих при аутоиммунных заболеваниях, например, не ограничиваясь ими, миастении гравис, хроническом активном гепатите, первичном билиарном циррозе, дилатационной кардиомиопатии, миокардите, аутоиммунном полиэндокринном синдроме I типа (APS-I), аутоиммунном гепатите, васкулитном муковисцидозе, приобретенном гипопаратиреозе, синдроме Гудпасчера, болезни Крона, ишемической болезни сердца, листовидной пузырчатке, вульгарной пузырчатке, синдроме Гийена-Барре, сахарном диабете 1 типа, синдроме скованного человека, энцефалите Расмуссена, аутоиммунном гастрите, болезни Аддисона, инсулиновом гипогликемическом синдроме (болезни Хирата), устойчивости к инсулину типа В, акантозе, системной красной волчанке (СКВ), пернициозной анемии, артрите Лайма, устойчивом к лечению, полинейропатии, рассеянном склерозе, демиелинизирующих заболеваниях, ревматизме, атопическом дерматите, аутоиммунном гипотиреозе, витилиго, офтальмопатии, связанной с щитовидной железой, аутоиммунном тиреоидите, аутоиммунном тиреоидите Хашимото, целиакии, недостаточности АКТГ, миозите, дерматомиозите, полимиозите, синдроме Шегрена, системной склеродермии, прогрессирующей системной склеродермии, очаговой склеродермии, первичном антифосфолипидном синдроме, буллезной пузырчатке, герпесе беременных, рубцующейся пузырчатке, хронической идиопатической крапивница, синдромы соединительной ткани, некротизирующий и серповидном гломерулонефрит (NCGN), системном васкулите, бусинематозе Вегенера, синдроме Черджа-Строса, полимиозите, синдроме Рейно, хроническом заболевании печени, висцеральном лейшманиозе, аутоиммунной недостаточности С1, мембранозном пролиферативном гломерулонефрите (MPGN), повышенном времени свертывания крови, аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуре, иммунодефиците, атеросклерозе, нейронопатии, паранеопластической пузырчатке, паранеопластическом синдроме скованного человека, паранеопластическом энцефаломиелите, подострой вегетативной невропатии, ретинопатии, ассоциированной с раком, паранеопластической опсоклонической-миоклонической атаксии, синдроме нижних мотонейронов, миастеническом синдроме Ламберта-Итона и паранеопластической дегенерации мозжечка.
[0123] В одном варианте реализации настоящее изобретение включает способы и композиции для оценки лиганд-связывающих молекул, присутствующих при инфекционных заболеваниях, например, не ограничиваясь ими, синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД), сибирской язве, бруцеллезе, мягком шанкре, хламидийной инфекции, холере, кокцидиоидомикозе, криптоспоридиозе, циклоспорин, дифтерии, эрлихиозе, арбовирусном энцефалите, энтерогеморрагической Escherichia coli (Е. coli), лямблиозе, гонорее, инфекции Haemophilus influenzae, болезни Хансена (лепре), хантавирусном легочном синдроме, гемолитическом уремическом синдроме, гепатите А, гепатите В, гепатите С, вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ), легионеллезе, листериозе, болезни Лайма, малярии, кори, менингококковой инфекции, инфекционном паротите, коклюше, чуме, паралитическом полиомиелите, пситтакозе (орнитозе), Ку-лихорадке, бешенстве, пятнистой лихорадке Скалистых гор, краснухе, синдроме врожденной краснухи, сальмонеллезе, тяжелом остром респираторном синдроме (ТОРС), шигеллезе, оспе, стрептококковых заболеваниях (инвазивные стрептококки группы А), стрептококковом синдроме токсического шока (STSS), Streptococcus pneumoniae, сифилисе, столбняке, синдроме токсического шока, трихинеллезе, туберкулезе, туляремии, брюшном тифе, ванкомицин-промежуточном/устойчивом Staphylococcus aureus, ветряной оспе, желтой лихорадке, варианте болезни Крейтцфельда-Якоба (vCJD), лихорадке денге, геморрагической лихорадке Эбола, эхинококкозе (альвеолярном эхинококкозе), инфекции вируса Хендра, оспе обезьян, гриппе H5N1 (птичьем гриппе), лихорадке Ласса, геморрагической лихорадке Марбург, вирусе Нипах, лихорадке о' ньонг-ньонг, лихорадке долины Рифт, венесуэльском конском энцефалите и вирусе Западного Нила.
[0095] Библиотеку лигандов согласно настоящему изобретению можно применять для скрининга любой стадии заболевания, например, ранней стадии заболевания или запущенной поздней стадии заболевания.
[0096] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение включает способы и композиции для оценки лиганд-связывающих молекул, присутствующих при нейродегенеративных заболеваний, например, не ограничиваясь ими, инсульте, гиповолемическом шоке, травматическом шоке, реперфузионном повреждении, рассеянном склерозе, деменции, связанной со СПИД; нейротоксических поражениях, болезни Альцгеймера, черепно-мозговой травме, респираторном заболевании у взрослых (РДСВ), острой спинальной травме, болезни Хантингтона и болезни Паркинсона.
[0097] Настоящее изобретение включает композиции, включающие библиотеки на основе частиц, несущих соединения, выбранные из пептоидов, пептидов, олигомеров, низкомолекулярных соединений и любых молекул природного или синтетического происхождения, которые можно поместить на систему носителя, например, бусину или небольшую частицу.
[0098] В соответствии с настоящим изобретением, предложены композиции, включающие пептоид(ы), связывающие антитела, являющиеся показателем реакции на лекарство, и способы детектирования антител в образце, содержащем антитела, включающие осуществление контакта антителосодержащего образца с носителем, к которому присоединен пептоид. Библиотеки лигандов могут включать соединения формулы 1, где R-группы на аминной боковой цепи или при альфа-атоме углерода независимо выбраны из группы, состоящей из атома водорода; алкила; аллила; метила; этила; n-пропила; изопропила; n-бутила; изобутила; n-бутиламина; фтор-бутила; трет-бутила; пентила; гексила; изопентила; арила; гетероарила; фуранила; индолила; тиофенила; тиазолила; имидазолила; изоксазолила; оксазолила; пиперонила; пиразолила; пирролила; пиразинила; пиридила; пиримидила; пиримидинила; пиринила; циннолинила; бензофуранила; бензотиенила; бензтриазолила; бензоксазолила; хинолина; изоксазолила; изохинолина циклоалкила; алкенила; циклоалкенила; фенила; пиридила; метоксиэтила; (Я)-метилбензила; Со-6 алкиларила; Со-6 алкилгетероарила; Со-6 алкила, замещенного группой, выбранной из ОН, SH, галогена, OR15, COOR15, NR15 (где R15 выбрана из группы, состоящей из Н или Ci-б, алкил или Ci-б алкинила) или R16 (где R16 выбрана из группы, состоящей из Н или Ci_6 алкинила); OCi_6 алкила; С2-6 алкенила; С2-6 алкинила; С2-6 алкенила; и С2-6 алкинила, включая одну или более химических групп, описанных в Таблицах 1 и 2 предварительной патентной заявки США 61/467,256, полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.
[0099] В одном варианте реализации библиотеки лигандов согласно настоящему изобретению могут включать соединение формулы 1 на носителе,
где Ri выбрана из электроноизбыточной боковой цепи Y аминокислоты;
a R2-R6 независимо выбраны из групп, состоящих из Н, -Ci-Сбалкила, -Ci-СбалкилБСНз; -Со-СбалкилСг-Сбалкенила, -Со-Сбалкил Сг-Сбалкинила, -Ci-Сб С ООН, -Ci-СбалкилОН, -СгСбалкилМО^Ь, -Сз-Свциклоалкила, -Ci-Сбалкиларила, -Ci-Сбалкилгетероарила -С1-СбалкилЖХО)С1-Сбалкила, -Ci-Сбалкилциклоамида, причем любая из арильных или гетероарильных групп может независимо содержать в качестве заместителей -ОН, CI, F, Br, -ОСН3, -S02NH2 или -0-СН2-0-.
[00100] Соединения библиотеки случайных лигандов (например, библиотек лигандов) для скрининга сложной биологический жидкости подробно описаны в предварительной патентной заявке США 61/467256 и 61/491717, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылок.
[00101] Большие библиотеки лигандов согласно настоящему изобретению можно применять непосредственно при анализе биологической жидкости в соответствующих экспериментальных условиях для выявления биомаркеров, без необходимости использовать меньшее количество опорных элементов (например, примерно 100000 или менее) или переноса таких пептоидов или лигандов на микроматрицу до скрининга биологической жидкости. Кроме того, библиотеки лигандов также можно применять для скрининга рецепторов клеток, которые имеют непосредственное отношение к определенному маркеру поверхности клеток. Настоящее изобретение, в отличие от ранее известных способов, допускает включение большего количества бусин/смол и, таким образом, более крупных библиотек при скрининге агентов, связывающихся с лигандом или скрининге клеточных рецепторов для непосредственного скрининга биологических образцов сложного состава (сложных биологических образцов).
[00102] Как описано ранее по отношению к системам микроматриц, практически любую молекулу или соединение можно использовать для создания библиотек случайных соединений на основе бусин или смол. Указанные "молекулы" или "соединения" могут включать природные продукты или искусственные соединения или молекулы синтетического происхождения. Источником таких молекул могут быть биологические системы, а также источники небиологического происхождения. Предпочтительные лиганды для целей начального скрининга с помощью крупных библиотек на основе бусин в условиях, описанных в настоящем изобретении, получают, в частности, из субмономеров, выбранных из любого известного мономерного амина и из любого
известного галогенида уксусной кислоты или галогенида замещенной уксусной кислоты. Например, в Таблице 1 предварительной патентной заявки США 61/467256, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки, представлен широкий спектр R-групп при монозамещенном амине.
[00103] В некоторых вариантах реализации мономеры и/или субмономеры выбраны из группы, состоящей из цистеина, глицина, метионина, аллиламина, этаноламина, изобутиламина, диаминобутана, метилбензиламина (рацемического или энантиомерного), пиперониламина, циклогексиламина, 3,4-диметоксифенетиламина, бензиламина, ]^-(2-аминоэтил)-ацетамида, Тч[-(3-аминопропил)-2-пирролидинона, 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонамида или фурфуриламина.
[00104] В качестве субмономеров также используют галогениды уксусной кислоты и/или галогениды замещенной R уксусной кислоты, где R выбрана из любой боковой цепи аминокислоты или из любой другой группы, включая указанные группы при монозамещенных аминах. В качестве альтернативы можно осуществлять взаимодействие комбинации любого амина и любого галогенида уксусной кислоты с образованием мономера, который затем подвергают взаимодействию с другим реакционноспособным мономером в растущей цепи пептоида с образованием олигомера согласно настоящему изобретению.
[00105] Комбинаторные библиотеки пептоидов можно получить следующим образом: Пептоиды, содержащие мономерный цистеин или метионин, присоединенный к носителю или линкеру на носителе или смоле или бусине, можно получить путем первоначального добавления блокированной аминокислоты к носителю или линкеру на носителе. После добавления указанной аминокислоты (или любой желательной аминокислоты, способной служить функциональной группой или использоваться для других целей в составе олигомера или диагностического средства, содержащего указанный олигомер) можно внести оставшиеся мономеры с использованием стандартных реактивов для пептидной химии или с использованием субмономеров бромуксусной кислоты (или а-замещенной бромуксусной кислоты или аналогичного реагента) и монозамещенного амина, причем указанный амин замещен R-группой. R-группа может быть выбрана из любого известного замещенного пептоида, в том числе пептоидов, описанных в, например, патентных публикациях США № 2010/0303805 или 2010/0303835 и/или в различных публикациях Zuckermann и Kodadek, полностью включенных в настоящий документ посредством ссылок. Предпочтительными аминами являются амины, выбранные из библиотек, упомянутых в настоящем документе, причем
определенные мономерные амины добавляют в каждую библиотеку для создания библиотек, содержащих 1-250 млн бусин или частиц смолы. Предпочтительный размер библиотеки колеблется от 1 млн до 50 млн бусин или частиц смолы, содержащих указанное разнообразие соединений.
[00106] Процесс изготовления каждого пептоида обычно включает (1) изготовление аминокислотного реагента на носителе (включая необязательный линкер на носителе), (2) взаимодействие аминокислоты на носителе с ацилгалогенидом, например, бромуксусной кислотой либо хлоруксусной кислотой с образованием галогенированного производного (3) взаимодействие указанного галогенированного производного с монозамещенным амином с образованием амида и (4) повторение этапов (2) и (3) с образованием пептоида. В составе крупных библиотек обычно получают метионинсодержащие пептоиды. Цистеинсодержащие пептоиды, как правило, получают при необходимости синтеза высокоаффинных пептоидов в больших количествах после первоначального скрининга крупных библиотек на основе бусин или частиц смолы. Если для первоначального скрининга сложной биологический жидкости, например, сыворотки, используют Большие библиотеки на основе бусин, то необходимость или потребность в длинном полиэтиленгликолевом линкере, который, как правило, необходим для скрининга с помощью микроматриц, отсутствует. Полиэтиленгликолевый линкер может присутствовать на бусине или частице смолы при условии, что он является коротким линкером, содержащим менее приблизительно 10 мономерных звеньев. В диагностических наборах, включающих бусины или бусины TentaGel размером менее приблизительно 50 мкм (например, 10 мкм), можно использовать как короткие линкеры ПЭГ (например, содержащие 2-10 мономеров ПЭГ), так и более длинные олигомеры ПЭГ.
[00107] При выполнении каждого этапа в процессе изготовления олигомера применяют растворители, например, ДМФ или ацетонитрил или дихлорметан. Трифторуксусную кислоту применяют для целей отщепления, а пиперидин или другое подходящее основание применяют в качестве основания в реакции между бромпроизводным и амином. При получении аминокислотного реагента применяют различные блокирующие группы. В предпочтительном варианте реализации диаминобутан применяют в качестве первого аминного субмономера в цепи, примыкающего к остатку цистеина на С-конце пептоида. На первом этапе указанного процесса выбранные бусины или частицы смолы (в количествах граммов или миллиграммов) подвергают набуханию в подходящем растворителе, например, ДМФ. Если бусины "блокированы"
защитной группой при реакционноспособном амине на указанной бусине, для деблокирования бусины неоднократно добавляют щелочной раствор, например, пиперидин, с последующей промывкой ДМФ. После деблокирования бусин или при первоначальном использовании таких бусин, как бусины TentaGel, их можно подвергать взаимодействию с подходящей аминокислотой, например, цистеином или метионином (блокированной Fmoc или другой подходящей защитной группой при атоме азота, блокированной Trt (трифенилметилом) при атоме серы и в молярных количествах, достаточных для взаимодействия с каждой бусиной) в подходящем растворителе, например, ДМФ. HBTU (гексафторфосфат тетраметилурония (связующий реагент) и 4-метилморфолин (основание) вместе с блокированной аминокислотой добавляют к раствору бусин в химическом стакане (или пробирке или колбе) и встряхивают при комнатной температуре с образованием Fmoc/Trt-блокированной аминокислоты на частицах смолы (или на линкере на частицах смолы). Затем бусины несколько раз промывают в растворителе, например, ДМФ. Затем Fmoc-группу деблокируют с помощью подходящего реагента, обеспечивая реакцию амина в составе аминокислоты с другим реагентом, например, другой блокированной аминокислотой или субмономером, например, бромуксусной кислотой, и активирующим агентом, например, DIG (3-изопропилкарбодиимидом) в подходящем растворителе при нагревании (СВЧ при перемешивании). Затем полученные бусины промывают несколько раз, а затем обрабатывают желательным мономерным амином (в некотором молярном избытке) в подходящем растворителе при нагревании. Полученные бусины промывают несколько раз, а затем повторно обрабатывают бромуксусной кислотой и выбранным амином, получая олигомер и библиотеку олигомеров. Пептоиды можно отщепить от бусин с помощью трифторуксусной кислоты. Альтернативный или другой подходящий процесс получения пептоидов, включающих предпочтительный вариант реализации, например, пептоидов, содержащих цистеин, примыкающий к мономеру, содержащему 1-ил-п-бутиламин, включает получение пептоида, содержащего две аминокислоты на С-конце, посредством процесса, дополнительно включающего добавление любого из мономеров, изготовленных в субмономерном процессе, причем вторая аминокислота представляет собой лизин. Указанное дополнительно включает выбор любого мономера или субмономера с целью изготовления а-замещенных субмономеров бромуксусной кислоты, причем заместители при атоме углерода могут быть выбраны из типичных боковых цепей аминокислот с образованием, после реакции с реагентами, а-замещенных пептоидов, причем R-группа находится при одном или обоих атомах углерода пептоидной цепи или при атоме азота пептоидной цепи.
Заместители при а-атоме углерода или азота могут представлять собой практически любой заместитель, как указано в настоящем документе.
[00108] Комбинаторные библиотеки низкомолекулярных соединений можно получить коммерческим путем или изготовить с помощью способов, известных в данной области техники. См., например, Bichler et al. 1995; Cho et al, 1999; LePiae et al., 2002; Ostergaard and Holm, 1997; Yang et al, 1999). Кроме того, источниками таких молекул и библиотек являются патент США № 6344334 и публикациях Gallop et al, (1994), Gordon et al, (1994); Thompson and Eilman (1996).
[00109] Комбинаторные библиотеки пептидов можно получить коммерческим путем или изготовить с помощью способов, известных в данной области техники. См., например, Stewart and Young (1984); Tarn et al. (1983); MerrifteM (1986); и Barany and Merritleld (1979), каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.
[00110] Комбинаторные библиотеки нуклеиновых кислот, включая РНК или ДНК, можно получить коммерческим путем или изготовить с помощью способов, известных в данной области техники. Комбинаторные библиотеки олигосахаридов можно получить коммерческим путем или изготовить с помощью способов, известных в данной области техники.
[00111] В каждом случае "лиганды" или случайные лиганды можно добавлять к смоле или бусинам носителя, формируя библиотеки для скрининга, которые можно применять в условиях, описанных в данном описании, для скрининга биомаркеров в сложной биологический жидкости. Предпочтительными лигандами являются пептоидные лиганды.
[00112] В дополнение к изготовлению и/или применению таких библиотек, может быть необходима или желательна оценка характеристик, очистка и/или синтез или повторный синтез любого из таких лигандов. Такие способы известны в данной области техники и включают весь спектр способов очистки, например, ВЭЖХ, с помощью хроматографических средств, или способы очистки с помощью химических средств; способы оценки характеристик, например, масс-спектрометрию или ЯМР, или комбинации любых из этих способов. Дополнительное описание таких способов приведено, например, в патентной публикации США 2007/0003954, включенной в настоящий документ посредством ссылки. В таких случаях любой из таких очищенных лигандов можно называть соединением или практически очищенным соединением.
[00113] В методике начального скрининга согласно настоящему изобретению бусины и/или частицы смолы применяют в качестве носителей, содержащих олигомер, функционально присоединенный к указанному носителю. В диагностических наборах или других наборах, содержащих "активные соединения " или "предполагаемые активные соединения", полученные в таком начальном скрининге, системы носителей могут быть расширены до практически любой системы носителей, включая микроматрицы или любую другую известную диагностическую платформу. В указанных случаях необходимо обеспечить, чтобы такие наборы или другие системы носителей, содержащие указанные предполагаемые активные соединения, также содержали или были приспособлены к детектору или способу, обеспечивающему обнаружение лигандов, включающему лиганд-связывающие молекулы, присоединенные к таким лигандам. Предпочтительные способы детектирования включают, например, твердофазный ИФА или другими способы, включающие применение меченых вторичных антител.
[00114] Носители могут быть изготовлены из любого подходящего материала. Материалы, применяемые для изготовления таких носителей, могут включать, например, стекло, пластик, керамические или полимерные смолы или бусины. Носители также могут включать такие материалы, как никель, латунь, сталь или другие металлы или смеси металлов. Носители также можно кондиционировать, присоединяя к ним линкеры и/или другие средства для связывания с или присоединения к или взаимодействия с лигандом или активной группой в составе лиганда. Такие группы также описаны в патентной публикации США № 2007/0003954. В настоящем изобретении количество частиц смолы или бусин, содержащих отдельные лиганды, связанные с ними или с линкером, а затем с указанным носителем, колеблется от более 100000 до приблизительно 150 миллионов (млн). Предпочтительное количество, применяемое в способах начального скрининга согласно настоящему изобретению, составляет от 1 млн до 2 млн лигандов/частиц смолы.
[00115] Смолы TentaGel(r) являются наиболее предпочтительными для методологии крупномасштабного скрининга лигандов согласно настоящему изобретению. Эти смолы являются привитыми сополимерами, состоящими из слабосшитой полистирольной матрицы, на которую привит полиэтиленгликоль (ПЭГ или FOB). Смолы TentaGel доступны для приобретения (Rapp Polymere GmbH). Поскольку ПЭГ являются полимером-"хамелеоном" с гидрофобными и гидрофильными свойствами, привитый сополимер демонстрирует модифицированные химические свойства. По
данным производителя, в принципе существуют два способа внедрения ПЭГ на модифицированную полистирольную матрицу. Простейшая процедура иммобилизации представляет собой присоединение ПЭГ через одну из его концевых гидроксильных групп к хлорметилированному полистиролу в соответствии с классической методологией синтеза простых эфиров или применение других бифункциональных ПЭГ для присоединения к твердому носителю. Производитель обнаружил, что посредством последовательного присоединения ПЭГ непосредственно к матриксу путем анионной привитой сополимеризации на функционализированном сшитом полистироле иммобилизовали цепи ПЭГ с молекулярной массой до 20 килоДальтон. Оказалось, что привитые сополимеры с цепями ПЭГ приблизительно 2000-3000 дальтон оптимальны по отношению к кинетической скорости, подвижности, набуханию и емкости смолы. Поскольку ни одна методика полимеризации не обеспечивает получения монодисперсного ПЭГ, содержащего более 10 этиленоксидных единиц, теоретически не существует способа внедрения монодисперсных цепей ПЭГ, содержащих более 10 этиленоксидных единиц, в смолу, или получения монодисперсного ПЭГ путем прямой полимеризации на полистирольном каркасе (монодисперсность определяется как ПЭГ без распределения по молекулярной массе). Указанные привитые сополимеры стабильны при давлении и могут применяться в периодических процессах, а также в условиях непрерывного потока. Указанный сополимер содержит приблизительно 50 - 70% ПЭГ (масс/масс). Свойства указанных полимеров в значительной степени определяются свойствами ПЭГ и преобладают над свойствами полистирольного матрикса.
[00116] Устройство химической библиотеки или пептидной библиотеки по принципу "одна бусина - одно соединение" важна для знания количества бусин, доступных при определенном количестве смолы, а также емкости одиночной бусины. В таблице 1 приведены некоторые размеры частиц и их сопоставление с соответствующей емкостью одиночной бусины. Расчеты основаны на типичной загрузке бусин TentaGel, которая находится в диапазоне 0,25 - 0,3 ммоль/г. Для аналитического исследования характеристик и секвенирования на бусине должно быть по меньшей мере 5 пмоль пептида, связанного со смолой. С целью оценки оптимального количества смолы для библиотеки, которое можно обработать экономически, следует учитывать размер бусин и емкость бусин. По отношению к однородности процесса диффузии и кинетической скорости, а также для анализа и количественной оценки одиночной бусины, все бусины, использованные авторами, демонстрировали очень узкое распределение по размеру.
[00117] Существует несколько типов смол TentaGel, демонстрирующих заданные свойства в зависимости от их применения:
Смолы TentaGel S:
[00118] ПЭГ-спейсер присоединен к полистирольной цепи через алкильную связь. Указанная связь устойчива к действию кислот или оснований. Указанный тип смолы представляет собой смолу стандартного типа, применяемую при синтезе пептидов, твердофазном органическом синтезе или комбинаторной химии.
Смолы TentaGel PAP:
[00119] ПЭГ присоединен к полистирольному каркасу через бензильную эфирную связь. Указанная бензильная эфирная связь чувствительна к агрессивным кислотам, например, 100% ТФУК или смесям ТФУК/FMSBr.
[00120] Указанные специально разработанные смолы применяют для процедур иммунизации или для синтеза ПЭГ-модифицированных производных (продуктов, присоединенных через ПЭГ); при воздействии агрессивных кислот ПЭГ-спейсер отщепляется вместе с синтезированным соединением от твердого носителя с получением ПЭГ-модифицированных растворимых соединений в условиях твердофазного синтеза (например, ПЭГ-модифицированных пептидов).
Смолы TentaGel N:
[00121] ПЭГ-спейсер присоединен к полистирольному каркасу через бензильную сложноэфирную связь. Указанные специально разработанные смолы применяют в химии олигонуклеотидов для синтеза олигонуклеотидов в небольших и крупных масштабах. По сравнению со стеклом с регулируемой плотностью емкость увеличивается в К раз.
[00122] Поскольку смолы TentaGel являются сополимерами, состоящими из полистирола и полиэтиленгликоля, следует принимать во внимание химические и физико-химические свойства обоих исходных полимеров.
[00123] ПЭГ сам по себе является гигроскопичным полимером. Как известно из литературы, сложные эфиры ПЭГ не очень стабильны и легко гидролизуются. В зависимости от условий хранения и времени хранения, ПЭГ сам по себе можно окислить по полиэфирной цепи с образованием перекоксидов или сложных эфиров. Затем обработка кислотой или основанием гидролизует образовавшиеся сложные эфиры ПЭГ, что приводит к небольшой "утечке ПЭГ". Указанную утечку моно зарегистрировать с помощью МС или ЯМР как ПЭГ и примеси в конечном продукте. Эти химические свойства присутствуют у всех ПЭГ и полимеров на основе ПЭГ.
TentaGel S:
"S" означает стандартную смолу, пригодную для широкого спектра вариантов применения, используемую в периодических и проточных системах.
TentaGel R:
Специально разработанная смола для синтеза в исследовательских целях. Смола демонстрирует повышенный объем при набухании, но менее устойчива к давлению. Хорошо подходит для синтеза крупных пептидов и проблемного синтеза.
TentaGel HL:
Этот вариант TentaGel с высокой загрузкой объединяет существенно повышенную емкость с достоинствами смол TentaGel
TentaGel MB:
Макробусины TentaGel выделяются необычно большим диаметром и высокой емкостью частиц, основанной на технологии TentaGel, и предназначены для синтеза на одиночной бусине и анализа одиночных бусин.
TentaGel N:
Смола этого типа предназначена для автоматического крупномасштабного синтеза олигонуклеотидов.
TentaGel J:
Смола этого типа разработана для полимерных иммуноконъюгатов.
TentaGel M:
Микросферическая форма частиц этой смолы TentaGel размером 10, 20, 30 мкм и ее монодисперсность обеспечивает применение в автоматических сортировщиках, для создания очень крупных библиотек, высокоскоростного синтеза и т.д.
TentaGel В:
Описывает бифункциональные смолы TentaGel, в которых реакционноспособные сайты на внешней поверхности бусин перпендикулярны реакционноспособным сайтам во внутреннем объеме бусин, а также гибридные смолы для последовательного отщепления.
[00124] В дополнение к бусинам TentaGel, для получения библиотек типа "один лиганд на бусину" можно применять другие смолы и/или частицы. Например, можно применять слабосшитые полистирольные смолы или полиамидные смолы. Группа, соединяющая подложку с бусиной смолы, может представлять собой неотъемлемую часть твердофазного синтеза. Линкер представляет собой специализированную блокирующую группу, в том смысле, что большую часть времени линкер связывает функциональную группу только для того, чтобы она появилась в конце синтеза. Линкер не должен быть подвержен действию реагентов, применяемых для модификации или
удлинения присоединенного соединения. И, наконец, этап отщепления должен протекать быстро и с хорошим выходом. Лучший линкер должен обеспечивать присоединение и отщепление с количественным выходом.
[00125] В некоторых аспектах, носитель может представлять собой бусину, планшет, тест-полоску, фильтр, мембрану, стержень или лунку. Обнаружение может включать РИА, ФИА, твердофазный ИФА, вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, FRET или поверхностный плазмонный резонанс.
Карбоксильные линкеры
[00126] Первая линкерная группа, использованная для синтеза пептидов, носит имя родоначальника твердофазного синтеза. Смола Меррифильда представляет собой сшитый полистирол, модифицированный хлорметильной группой. Карбонильная группа присоединена путем нуклеофильного замещения хлорида карбоксилатом цезия в ДМФ. Расщепление для регенерации карбоновой кислоты обычно осуществляют с помощью фтористого водорода.
[00127] Второй класс линкеров, применяемых для карбоновой кислоты, представляет собой линкер Ванга. Указанный линкер обычно присоединяют к сшитому полистиролу, TentaGel и полиакриламиду, получая смолу Ванга, разработанную для синтеза пептидных карбоновых кислот с использованием стратегии Fmoc-блокирования, и в связи с принципом использования активированного бензилового спирта продукт-карбоновую кислоту можно отщеплять с помощью ТФУК. Разработана более кислотолабильная форма смолы Ванга. Смола SASRIN обладает структурой, аналогичной линкеру Ванга, но с добавлением метоксигруппы для стабилизации иона карбония, образующегося при кислотном отщеплении.
Карбоксамидные линкеры
[00128] Линкер Ринка обычно предпочтителен для получения первичного карбоксамида при твердофазном синтезе; в настоящем изобретении этот линкер применяют при производстве или повторном синтезе активных соединений или предполагаемых активных соединений, полученных при первичном скрининге согласно изобретению. В таких случаях цистеин является первым мономером, взаимодействующим с линкером Ринка, а затем процесс включает либо добавлением следующего мономера для получения олигомера, либо последующего субмономерного реактива для получения олигомера. Повышенная чувствительность линкера Ринка к кислоте является следствием двух дополнительных электронодонорных метоксигрупп. При получении
первичного карбоксамида исходный материал присоединяют к линкеру в виде карбоновой кислоты и после синтеза отщепляют от смолы с помощью ТЭА.
f % ¦
ОМе
Амидный линкер Ринка
0 Me
V - н
R МИ,
ТФУК
NN \
О Ms
После применения смолы Ринка для получения карбоксамида следует катализируемое ТФУ кислотой отщепление.
Спиртовые линкеры
[00129] Гидроксильный линкер на основе тетрагидропиранильной (ТНР) блокирующей группы разработан Thompson and Ellmann. Все виды спиртов легко присоединяются к дигидропирану, и полученная ТНР-защитная группа устойчива к действию сильного основания, но легко расщепляется кислотой. Этот линкер присоединяют к смоле Меррифильда. Тритильная группа является хорошей кислотолабильной защитной группой для большого количества гетероатомов. Тритильную группу использовали для присоединения спиртов при синтезе библиотеки В-меркаптокетонов.
Карбаматный и аминный линкер
[00130] Карбаматный линкер использовали для синтеза комбинаторной библиотеки из 576 полиаминов, изготовленной при поиске ингибиторов трипаносомных паразитарных инфекций. Исследовали два линкера. Один из них был основан на гидроксиметилбензойной кислоте 1, а к другому была добавлена электронодонорная группа 2. Последний линкер обеспечивал отщепление с помощью ТФУК, в то время как первый мог расщепляться в агрессивной кислой среде.
[00131] Очень полезный линкер разработан недавно для получения третичного амина. (Третичные амины часто используют в молекулах лекарств.) Первичные и вторичные амины внедряют в линкер путем реакции Майкла. Амин можно алкилировать с получением иона четвертичного аммония, связанный со смолой. В умеренно щелочных условиях происходит элиминирование Хоффманна с получением третичных аминов высокой чистоты.
Бесследные линкеры
[00132] В некоторых случаях исходные материалы загружают на смолу в одной из форм, например, в виде карбоновой кислоты, а отщепляют в другой форме, например, карбоксамида. Это в особенности приемлемо, если для соединения-мишени требуется функция высвобождения. (Пептиды неизменно содержат карбоновую кислоту или карбоксамид). В то же время рост интереса к комбинаторным библиотекам низкомолекулярных соединений, не являющихся пептидами, выявил необходимость в линкерах нового типа. Указанные линкеры проявляют неспецифические функции после расщепления. Бесследные линкеры называются так потому, что анализ конечного соединения не обнаруживает следа присоединения к твердой фазе.
Образцы
[00133] Как обсуждалось ранее, биологические жидкости сложного состава, подготовленные для анализа в процессе согласно настоящему изобретению, включают или могут включать множество потенциальных биомаркеров, включая маркеры, экспрессирующиеся на клетках (неадгезивных клетках, в том числе Т-клетках или других иммунных эффекторных клетках), микроорганизмы, белки, пептиды, липиды, полисахариды, низкомолекулярные соединения, органические молекулы, неорганические молекулы, биологические молекулы, и в том числе любые обнаруживаемые или регистрируемые молекулы в такой среде сложного состава. В предпочтительном варианте реализации такие маркеры представляют собой антитела, и, в частности, являются антителами, синтезированными в результате заболевания или
состояния. В предпочтительном варианте реализации источником таких маркеров являются физиологические жидкости, например, сыворотка, плазма, слюна или другие жидкости или образцы, полученные от пациента или животного или организма. Каждый образец или ткань или биологический образец или образец, происходящий из окружающей среды, или полученный образец кондиционируют или обрабатывают или разбавляют, или иным способом подготавливают для начального скрининга либо любого последующего скрининга указанного образца с применением предполагаемых активных соединений или лигандов, обладающих сродством к таким биомаркерам. Образцы разводят в соответствии со способами, приведенными здесь, с целью обеспечить или допустить достаточное различие между фоновыми уровнями или шумом и сигналами, ассоциированными со связыванием лиганда с лиганд-связывающей молекулой.
[00134] Время и/или условия, необходимые для воздействия лигандов/носителей на такие образцы, зависят от конкретного образца и других факторов. Предпочтительные условия для процесса согласно настоящему изобретению дополнительно описаны в данном документе. Почти во всех случаях после воздействия биологической жидкости на крупную библиотеку лигандов и/или лиганды или наборы, полученные из такой библиотеки, применяют этапы промывки или элюирования и другие средства кондиционирования. Применяют водные растворы, в том числе буферные растворы, например, HEPES-буфер, Iris-буфер или физиологический раствор с фосфатным буфером. Системы носителя также можно обработать энергопоглощающими материалами для облегчения десорбции или ионизации "комплекса" с поверхности носителя. Кроме того, применяют химические средства для отсоединения или удаления комплексов "лиганд - лиганд-связывающая молекула" с носителя.
[00135] Способы детектирования комплексов "лиганд - лиганд-связывающая молекула" на носителе включают фотометрические и не фотометрические способы. Такие способы включают обеспечение того, что указанный процесс включает способ для детектирования и измерения поглощения, флуоресценции, показателя преломления, поляризации или светорассеяния. Сюда относятся прямые и/или косвенные средства для измерения таких параметров. Способы, использующие флуоресценцию, включают применение флуоресцентных маркеров в иммунологических способах, например, твердофазном ИФА или сэндвич-анализе. Способы, использующие показатель преломления, включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR), способы использования дифракционных решеток (например, сенсоры с однородным решеточным выводом, оптические сенсоры с опросом по длине волны (WIOS) и
дифракционные решетки с линейно меняющимся периодом), резонансное зеркало и интерферометрические методики. Способы, использующие поляризацию, включают эллипсометрию. Кроме того, можно использовать способы на основе светорассеяния. Другие средства для мечения и/или разделения и/или детектирования могут также включать магнитные средства. Можно применять магнитно-резонансную томографию, ионную спектрометрию в газовой фазе, МРТ.
[00136] Анализ полученных данных, как правило, включает количественную оценку сигнала, обусловленного обнаруженным биомаркером, по сравнению с контролем или эталоном. Указанные данные можно анализировать с помощью любого подходящего средства. Для сбора и анализа данных можно применять компьютеры и компьютерные программы. Бусины и/или другие носители можно кодировать с помощью компьютера в целях идентификации. Анализ данных включает анализ интенсивности сигнала в условиях данного анализа или способа детектирования. Лиганды, лиганд-связывающие молекулы или эталонные молекулы и/или молекулы для вторичного детектирования можно метить радиоактивной меткой или обнаруживаемой молекулой. Специалист в данной области техники может оценить различия и/или отличие между образцами биологической жидкости, содержащими биомаркеры, ассоциированные с заболеванием, и контрольными образцами или образцами от здорового пациента, которые не содержат таких маркеров. Специалист в данной области техники также может определить, в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, наличие ложноположительных или других активных соединений, которые являются или могут обнаруживаться в контрольных образцах для учета и/или удаления таких активных соединений, и специалист в данной области техники может, в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, продолжить процесс определения или поиска биомаркеров, ассоциированных с заболеванием, в образцах от пациентов с указанным заболеванием или состоянием. "Детектирование" таких активных соединений во всех случаях осуществляют с помощью средства для определения связывания лиганд-связывающей молекулы, например, биомаркера, ассоциированного с заболеванием, или другого маркера, с лигандами в библиотеке лигандов, например, описанной в настоящем документе.
[00137] Биомаркеры, ассоциированные с заболеваниями и/или состояниями, приведенными в настоящем документе, варьируют в зависимости от конкретной стадии заболевания и/или состояния конкретного пациента или животного или другого исследуемого организма. В большинстве случаев ожидается, что лиганды, являющиеся
предполагаемыми активными соединениями и соединениями, приведенными здесь, имитируют природный антиген, в первую очередь инициирующий иммунный ответ и/или образование антител или иммунных клеток. Настоящее изобретение и процесс скрининга, приведенные в настоящем документе, не требуют знания конкретного антигена или антитела, генерируемых в ответ на антиген. В то же время лиганды могут быть полезны сами по себе в качестве вакцин или лекарств-кандидатов в дополнение к применению при скрининге и в диагностических способах, приведенных в настоящем документе. Таким образом, настоящее изобретение включает соединения и фармацевтические композиции.
Скрининг пептоидов:
[00138] Для скрининга пептоидной комбинаторной библиотеки "одна бусина - одно соединение" (ОВОС) получают от десятков тысяч до миллионов бусин, несущих пептоиды, а затем смешивают их с биологическим образцом сложного состава. Начальный биологический образец сложного состава предпочтительно является контрольным образцом, а последующий биологический образец сложного состава, обработанный библиотекой лигандов после "удаления" из нее контрольных активных соединений, затем обрабатывают и/или подвергают скринингу с биологическим образцом сложного состава больного. Затем обнаруживают, идентифицируют и выделяют и/или оценивают характеристики лигандов/бусин, взаимодействующих по меньшей мере с одним биомаркером, ассоциированным с заболеванием. В предпочтительном варианте реализации применяют протокол скрининга Tentagel, включающий (1) получение бусин, (2) скрининг сложной биологический жидкости и (3) обнаружение активных соединений.
Скрининг пептидов:
[00139] Для скрининга пептидной комбинаторной библиотеки "одна бусина - одно соединение" (ОВОС) получают от десятков тысяч до миллионов бусин, несущих пептиды, а затем смешивают их со биологическим образцом сложного состава согласно процессам, описанным в настоящем документе. Затем идентифицируют и выделяют бусины, взаимодействующие с биомаркером, ассоциированным с заболеванием, для определения структуры соединения. Например, можно выполнить скрининг с помощью ОВОС-библиотеки пептидов с использованием стрептавидина (SA) в качестве белка-зонда, меченого красным флуоресцентным красителем, и с применением оборудования для проточной сортировки СОР AS BIO-BEAD для отделения флуоресцентных бусин от нефлуоресцентных. См. Manmi et a!., J. Comb. Chein,, 2009, 11 (1), pp 146-150. Красные
красители, которые можно применять, представляют собой АТТО 590 и Texas Red. После инкубирования библиотеки с конъюгатом SA-красный флуоресцентный краситель получают положительные бусины, обусловленные взаимодействием пептид-SA. Бусины анализируют времяпролётной масс-спектрометрией с ионизацией лазерной десорбцией и использованием матрицы (MALDI-TOF MS). Таким образом, пептидные библиотеки можно использовать аналогично описанному в настоящем документе способу с применением пептоидов, причем первоначальный контроль образцов биологической жидкости используют для удаления лиганд ов/бусин активных соединений из исходной библиотеки соединений, а затем используют оставшиеся члены библиотеки для скрининга любых активных соединений в образце сложной биологический жидкости, взятой у больного. Указанные активные соединения являются предполагаемыми активными соединениями, дальнейшую обработку которых осуществляют с применением любых диагностических наборов.
[00140] Аналогично, любой лиганд можно подвергать скринингу с применением бусин или носителей и процессов, описанных в настоящем документе Указанные лиганды включают, в дополнение к пептоидам или пептидам, нуклеиновые кислоты, олигомеры, полисахариды, низкомолекулярные соединения и/или любую их комбинацию, которую можно встроить в библиотеки и использовать использовали для скрининга сложной биологический жидкости в условиях, приведенных в настоящем документе.
Наборы и средства диагностики
[00141] Любое из соединений или композиций, описанных здесь, можно в дальнейшем применять в диагностических наборах в клинических или лабораторных условиях. Указанные наборы могут варьироваться от простых диагностических анализов, осуществляемых на месте, до сложных и многоканальных инструментов или зондов. Системы носителей и "упаковка", окружающая внутреннюю часть системы носитель/лиганд, могут быть выбраны из современных коммерческих наборов, предназначенных для включения предполагаемых активных соединений и/или повторно синтезированных активных соединений, установленных на таких подходящих платформах, либо их можно применять в диагностических наборах новой конструкции. Комплекты, как правило, снабжены всеми подходящими реагентами и инструкциями по применению наборов для скрининга и/или диагностики конкретного заболевания или состояния согласно назначению набора. Любой такой набор или способ включает, по меньшей мере одно предполагаемое активное соединение или лиганд, идентифицированный в соответствии со способом скрининга, приведенным в
настоящем документе. Указанный лиганд или множество лигандов можно выбрать из того же лиганда или смеси лигандов, которые включают соединения согласно настоящему изобретению. Указанные лиганды можно выбрать на основании их сродства к биомаркеру, ассоциированному с одним конкретным болезненным состоянием или группой или категорией заболеваний или состояний. Предпочтительными лигандами являются пептоидные лиганды. Наборы также могут содержать инструкции для врачей, диагностирующих конкретное заболевание или состояние, и специфические этикетки для определенного набора и болезненного состояния. Таким образом, настоящее изобретение включает комбинацию комплекта, включающего все необходимые компоненты, например, предполагаемые пептоиды или лиганды, обнаруженные при начальном скрининге с использованием любой из библиотек, описанных в настоящем документе и/или известных в соответствии с конкретными способами, приведенными здесь, и инструкций и этикеток. Кроме того, предполагается, что конкретные процессы, способы и материалы, описанные в настоящем документе, можно применять в клинических и лабораторных условиях под наблюдением квалифицированного оператора. Наборы и/или инструменты или оборудование включают лиганды, например, пептоиды, специфические для антител и/или клеток, ассоциированных с заболеванием. "Набор" может включать полный диагностический набор и/или набор для скрининга, либо "набор" может включать компоненты или суб-компоненты, содержащие или включающие диагностические пептоиды, антитела, обнаруженные и охарактеризованные посредством таких пептоидов, или нативные антигены, обнаруженные и очищенные и/или охарактеризованные в результате взаимодействия с аутоантителом. Такие антитела и очищенные антигены составляют часть настоящего изобретения.
[00142] В одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает набор для диагностики заболевания. В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает набор для лечения заболевания. Набор может включать библиотеку лигандов, реагенты для детектирования и скрининга биологического образца с помощью библиотеки лигандов, адъюванты для скрининга и вкладыш. Вкладыш может включать инструкции для выполнения этапов диагностики, инструкции для определения введения лекарственного средства и инструкции по введению лекарственного средства на основе определения. В некоторых вариантах реализации набор может включать вкладыш в упаковку, представляющий собой этикетку, утвержденную FDA или органом по одобрению лекарств в других странах.
[00143] Библиотеки лигандов согласно настоящему изобретению применяют для поиска и определения лигандов, связывающихся с биомаркерами, ассоциированными с заболеванием. Такие лиганды затем используют в наборах и/или способах, в целом описанных выше, для оценки, скрининга или диагностики болезненных состояний. Указанные диагностические способы обычно включают скрининг и поиск биомаркеров, ассоциированных с заболеванием, которые включают антитела и/или другие биологические маркеры. Как указано выше, эти антитела можно дополнительно идентифицировать и исследовать с использованием лигандов согласно настоящему изобретению на подходящих колонках для выделения или удаления таких антител из образцов крови. Указанные антитела можно, в свою очередь, использовать в качестве зондов для детектирования нативного антигена, связанного с таким антителом. Таким образом, настоящее изобретение включает как антитела, так и очищенные антигены, связанные с такими антителами, и обнаруженные, выделенные и охарактеризованные с применением способов согласно настоящему изобретению.
[00144] Наборы и/или другие средства для скрининга и/или диагностики болезненных состояний следует, в первую очередь, оценивать по образцам, взятым у пациентов. Указанные образцы, взятые у пациента, могут происходить от нормальных контрольных образцов или образцов от пациента, где у указанный пациент болен или у которого подозревают указанное заболевание или состояние. У пациента могут быть другие симптомы, связанные с заболеванием, кроме "присутствия" биомаркера, ассоциированного с заболеванием. Пациент может находиться на ранней стадии заболевания, может вообще не страдать заболеванием или состоянием, или может находиться на поздней стадии конкретного заболевания. В любом клиническом контексте и в рамках соответствующих руководств контрольные образцы, образцы от пациента и клинические образцы можно представить в соответствии со слепым принципом, а затем оценить с помощью соединений согласно настоящему изобретению. Данные, полученные в результате скрининга, можно анализировать после раскрытия с целью поиска статистически значимых результатов или корреляций с известными или базовыми данными о любом конкретном пациенте или группе пациентов. Настоящее изобретение включает способ скрининга на присутствие заболевания или состояния, включающий в себя (1) скрининг биологического образца от пациента с применением по меньшей мере одного соединения согласно настоящему изобретению: (2) скрининг контрольного биологического образца при тех же условиях с применением по меньшей мере одного соединения, и (3) сравнение контрольных данных здорового субъекта с данными для пациента с целью определения наличия или отсутствия биомаркера,
ассоциированного с заболеванием. Группу пациентов и образцов от пациентов, которые больны или у которых подозревают заболевание X, можно подвергнуть скринингу с применением набора или диагностического зонда, содержащего по меньшей мере одно соединение согласно настоящему изобретению, а данные, полученные по каждому пациенту, можно использовать в зависимости от конкретного случая с целью подтверждения или валидации болезненного состояния или отсутствия такового. Такие данные, полученные согласно настоящему изобретению, можно использовать в сочетании с полной известной информацией о конкретном пациенте с целью оценки состояния пациента, а также обеспечения указаний для врача, назначающего лечение. "Информацию", полученную в результате любого такого скрининга, можно использовать при клинических испытаниях для оценки отдельных пациентов, получающих медикаментозное лечение. Таким образом, настоящее изобретение включает способ оценки хода клинических испытаний, включающий применение скрининга, выполненного в соответствии со способами, описанными в настоящем документе. В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к способу скрининга или диагностики раннего болезненного состояния, включающему использование скрининга или соединения, приведенного в настоящем документе, для детектирования биомаркера, ассоциированного с заболеванием. Настоящее изобретение особенно полезно в контексте раннего вмешательства в ход заболевания, причем обнаружение таких биомаркеров, как ожидается, станет возможным задолго до агрессивного прогрессирования заболевания. В еще одном контексте ожидается, что раннее вмешательство в ход сердечно-сосудистого заболевания и/или метаболического заболевания, а также неврологического заболевания спасет жизни и предотвратит или сможет использоваться для предотвращения дальнейшего развития таких заболеваний без раннего медицинского вмешательства или лечения.
[00145] Настоящее изобретение также включает способы повышения разрешения или эффективности различий между контрольным или стандартным раствором и биологической жидкостью сложного состава, содержащей биомаркер, ассоциированный с заболеванием. Например, способы включают в себя предварительную подготовку или предобработку или предварительное блокирование системы/сыворотки буферами и/или кондиционирующими агентами, например, лизатом Е. coli и/или лизином.
[00146] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение обеспечивает способ лечения субъекта, предположительно страдающего от заболевания, включающий (а)
обеспечение контакта образца, содержащего антитело, от указанного субъекта с одним или более носителями, присоединяющими к нему пептоид, включающий пептоид формул, приведенных в настоящем документе (Ь) обнаружение антител, связанных с указанными пептоидами, и (с), формирование решения по лечению на основании результатов шага (Ь). Способ может дополнительно включать получение указанного образца от субъекта. Способ может также дополнительно включать постановку диагноза заболевания для субъекта, от которого получен указанный образец, если уровень антитела, связывающегося с пептоидом, больше, чем уровень антитела, наблюдаемый для контрольных здоровых пациентов. Способ может также дополнительно включать формирование решения по лечению для указанного субъекта. Образец можно приводить в контакт более чем с одним пептоидом формул, приведенных в настоящем документе. Образец можно приводить в контакт с многоканальной платформой для целей диагностики множественных болезненных состояний. Носитель может представлять собой бусину, планшет, тест-полоску, фильтр, мембрану, стержень или лунку. Образец может представлять собой кровь, сыворотку, слюну или ЦСЖ. Обнаружение может включать РИА, ФИА, твердофазный ИФА, вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, FRET или поверхностный плазмонный резонанс.
[00147] Еще один вариант реализации направлен на композицию антител, выделенных из биологической жидкости, являющихся показателем заболевания; в некоторых вариантах реализации указанные антитела выделены путем контакта образца, содержащего такие антитела, с пептоидной композицией, специфически связывающейся с антителами, являющимися показателем заболевания или ассоциированными с заболеванием. Антитела можно удалить, выделить или очистить от других компонентов, не являющихся антителами, и не-D специфических компонентов. Затем антитела можно промыть и/или отделить от агентов, захватывающих пептоиды.
[00148] В некоторых вариантах реализации матрицу с пептоидами, изготовленную из пептоидов, обнаруженных с применением способа, описанного здесь, гибридизуют с биологическим образцом, включающим добавку бактериального лизата, например, лизата Е. coli. Биологический образец включает контрольный образец и образец, содержащий маркер расстройства центральной нервной системы. Например, стекла микроматриц покрывают камерой для гибридизации и уравновешивают 1XTBST (50 мМ Трис, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20) в течение приблизительно 15 минут. Затем стекла блокируют бактериальным лизатом при концентрации по меньшей мере
не превышающей, или приблизительно равной 0,5, 1, 1,5, 2 мг/мл лизата. Лизат удаляют, а предметные стекла инкубируют приблизительно с миллилитром биологического образца (содержащим приблизительную концентрацию белка 5, 10, 15, 20 или 25 дг/мл, включая все диапазоны и значения между ними) в бактериальном лизате при осторожном встряхивании. Затем микроматрицы промывают 1XTBST и гибридизуют с меченым антителом против IgG (например, при разведении 1:400). Затем стекла промывают соответствующим буфером. Стекла высушивают с использованием центрифуги (например, 5-мин центрифугирование при 1500 об/мин) и сканируют на сканере микроматриц, например, с использованием 635-нм лазера при 100% мощности и усилении трубки фотоумножителя 600 или 650. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу снижения фонового шума антисывороток в диагностическом тесте, включающему обработку контрольного образца плазмы и образца от больного лизатом E.coli и обеспечение контакта указанных образцов с матрицей пептоидов или лигандов. Считается, что этот процесс можно использовать для обработки носителя любой матрицы, используемой для детектирования и различения антител в сыворотках в контексте сравнения контрольного образца и образца от больного.
[00149] Предполагается, что любой способ или композицию, описанные в настоящем документе, можно осуществить по отношению к любому другому способу или композиции, описанным в настоящем документе.
[00150] Использование форм единственного числа в сочетании с термином "включающий" в формуле изобретения и/или описании может означать "один", но также согласуется со значением "один или более", "по меньшей мере, один" и "один или более одного".
[00151] Предполагается, что любые варианты реализации, рассмотренные в данном описании, можно осуществить по отношению к любому способу или композиции согласно настоящему изобретению, и наоборот. Кроме того, композиции и наборы согласно настоящему изобретению можно применять для осуществления способов согласно настоящему изобретению.
[00152] В данной заявке термин "приблизительно" используется для указания того, что значение включает изменения, обусловленные внутренней ошибкой устройства, способа, используемого для определения указанного значения, или изменчивость, существующую среди подопытных субъектов.
[00153] Понятно, что любое из предполагаемых активных соединений или пептоидов, обнаруженных в ходе процесса, приведенного в настоящем документе, также может являться терапевтическим лекарственным средством или вакциной-кандидатом. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу для детектирования лекарств-кандидатов или вакцин, включающему использование скрининга в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.
[00154] Следующие примеры приведены с целью более полной иллюстрации предпочтительных вариантов реализации изобретения. В то же время, их не следует рассматривать в качестве ограничений для рамок изобретения.
ПРИМЕРЫ ПРИМЕР 1: Получение библиотеки
Протокол синтеза пептоидов (цистеин-пептоидов или метионин-пептоидов)
[00155] В следующем примере продемонстрировано получение библиотек пептоидов согласно настоящему изобретению. Материалы, используемые в примере, включали химические колбы или стаканы, пластиковые пробирки, 10-15 3-мл шприцов с иглами. Латексные перчатки, 10-15 15-мл полипропиленовых пробирок и микропипетки с наконечниками, устойчивыми к действию растворителей (1000 мкл), стеклянные пипетки и бусины из смолы. Использованные химические вещества и/или реагенты включали ТчГ^-диметилформамид, бромуксусную кислоту (ВМА), безводный диметилформамид, пиперидин, ацетонитрил, 3-диизопропилкарбодиимид (DIC), трифторуксусную кислоту, 5(6)-карбоксифлуоресцеин, дихлорметан (ДХМ) и 4-метилморфолин (NMM). При изготовлении каждой библиотеки также применяли различные амины, а также HBTU (гексафторфосфат тетраметилурония) и триэтилсилан.
Получение пептоидов
[00156] Концентрацию каждого амина, используемого в процессе, вычисляли с использованием следующей формулы: V-FW/d/1000x2Mx5 мл
Процедура:
Этап 1
[00157] Набухание бусин смолы.
(а) 250 мг бусин смолы помещали в чистую сухую реакционную колбу и добавляли к бусинам 5 мл водного ДМФ, и оставляли набухать в течение часа или менее. Затем бусины несколько раз (2 или 3 раза) промывали ДМФ в вакууме.
Этап 2
[00158] Этапы (b), (с) и (d) пропускали с использованием "неблокированных бусин (например, Tema~Gel).
[00159] 20% раствор пиперидина (основание) с использованием безводного ДМФ качестве растворителя использовали в следующем процессе:
[00160] Следующий способ, включающий этапы (Ь), (с) и (d), осуществляли 2 раза использованием "блокированных бусин".
(b) К блокированным бусинам добавляли 2,5 мл 20% раствора пиперидина;
(c) После добавления пиперидина реакционную колбу помещали на качалку/инкубатор в течение 20 минут при 200 об/мин и 25° С.
(d) Реакционную колбу промывали 8-10 раз 5 мл водного ДМФ.
[00161] Кроме того, получали следующие растворы:
468 мг Fmoc-Cys(Trt)-OH в безводном ДМФ (объем 2 мл) (раствор А).
161,6 MrNMM в 2 мл безводного ДМФ
303,2 мг HBTU добавляли во флакон с NMM (раствор
Добавление HBTU/HMM и Fmoc-Cys
[00162] 1 мл раствора А и раствора 8 добавляли к бусинам - (HBTU/NMM) и Fmoc-Cy (Trt)-OH) и встряхивали в течение 1 часа.
[00163] Бусины промывали в ДМФ 5-10 раз.
[00164] К бусинам добавляли оставшийся 1 мл раствора растворов А и В, встряхивали течение 1 часа и затем снова промывали в ДМФ 5-10 раз.
[00165] Кроме того, получали следующие растворы:
20% пиперидин (в безводном ДМФ)
2М бромуксусную кислоту
50%D1C/A. ДМФ
М раствор каждого амина
[00166] Следующие этапы (а), (Ь) и (с) выполняли 2 раза, добавляли 2,5 мл 20% раствора пиперидина; (Ь) реакционную колбу встряхивали при 200 об/мин и 25 ° С, а затем (с) промывали бусины ДМФ от 8 до 10 раз.
[00167] Получали 10 мл раствора 2 М бромуксусной кислоты.
[00168] Также получали 10 мл раствора 50% 3,2 DIC/безводного ДМФ (об/об).
[00169] Для каждого амина и каждой библиотеки получали 2 М растворы аминов.
[00170] Для синтеза пептоида каждый раз при добавлении амина к цепи пептоида использовали 1 мл 2 М рабочего раствора.
Этап 3
1 мл бромуксусной кислоты добавляли в реакционный сосуд;
(Ь) затем добавляли 1 мл 50% раствора DIC/ДМФ, и полученный раствор подвергали (с) действию СВЧ в течение 15 секунд при 10% мощности.
[00171] Этап (с) проводили два раза, вращая колбу из стороны в сторону между этапами СВЧ-обработки.
[00172] После каждого этапа СВЧ-обработки выпадал белый осадок. Затем бусины промывали ДМФ 8-10 раз.
Этап 4
[00173] Один мл первого амина в последовательности добавляли в реакционную колбу, содержащую бромированный интермедиат предыдущего этапа и встряхивали сосуд для равномерного распределения амина по бусинам. Затем инициировали реакцию с помощью 2-кратной обработки СВЧ в течение 15 секунд при 10% мощности. Затем прореагировавшие бусины промывали водным ДМФ 8-10 раз.
[00174] Этапы 3 и 4 повторяли до добавления всех аминов, получая целевые пептоиды. Этап 5
[00175] Затем промывали бусины дихлорметаном (ДХМ) 3 раза и позволяли им высохнуть.
Этап 6
[00176] Затем отщепляли пептоиды от бусин с помощью 95% раствора ТФУК (5 мл). Затем отделяли пептоиды от бусин, промытых растворителем (CH3CN и вода) для удаления остаточных пептоидов. Для удаления остаточной ТФУК использовали газообразный аргон. Затем пептоиды при необходимости лиофилизировали, исследовали и очищали.
[00177] Вышеуказанные условия реакции можно изменить в соответствии с необходимостью, в зависимости от необходимых количеств конкретной композиции бусин.
[00178] На Фигурах 1-5 в целом продемонстрировано получение библиотеки согласно настоящему изобретению для заболевания, например, диагностики БА, диагностики рака поджелудочной железы и волчанки. В целом, бусины, несущие аминогруппу, присоединяют к аминокислотному остатку путем осуществления ряда этапов, применяя стандартные реагенты в области химии пептидов, взаимодействующие с активированной карбонильной группой, несущей галогенидную группу, которая затем взаимодействовала с мономерным амином, несущим группу R. Этапы цикла 2 и 3 повторяли, как показано на Фигурах, получая большие библиотеки пептоидов, содержащие от 1 млн до 2 млн различных лигандов. Библиотека для начального скрининга, полученная на смоле или бусинах Tentagel, обычно содержала аминокислоту метионин в качестве первого мономера в цепи. Автор настоящего изобретения использовал такую аминокислоту для облегчения отщепления от бусин или смолы в отсутствие расщепляемого линкера. Для получения цистеинсодержащих пептоидов с линкерами, не нуждающихся или не требующих использования метионина в качестве первой аминокислоты, использовали смолу Ринка. Цистеинсодержащие пептоиды обычно повторно синтезировали после детектирования предполагаемых активных соединений при начальном скрининге. Сульфогруппа цистеина обеспечивала реакцию пептоидной цепи с, например, другой реакционноспособной группой на носителе диагностической платформы. Повторно синтезированные пептоиды также содержали 1 -ил-п-бутиламиногруппу в качестве первой боковой цепи после амина аминокислоты. Считается, что эта группа необходима для экспонирования пептоида и солюбилизации пептоида в водных растворах.
ПРИМЕР 2: Общая методология скрининга
[00179] 160-мкм бусины Tentagel с присоединенными выбранными пептоидами оставляли набухать в течение ночи в ДМФ. Затем бусины десять раз промывали водой
Millipore в реакционном сосуде при энергичном встряхивании. Каждый раз добавляли свежую воду Millipore, а при 10-й промывке бусины оставляли на ночь при встряхивании (150-200 об/мин). На следующий день бусины аналогичным образом промывали IX TBST и оставляли при встряхивании (150-200 об/мин) по меньшей мере на 3 часа.
[00180] Затем бусины равномерно распределяли по 15-мл коническим пробиркам из расчета приблизительно 0,5 грамма на пробирку в 1 X TBST. TBST удаляли, и в каждую пробирку добавляли 4 мл разбавленной нормальной сыворотки человека. Рабочую сыворотку в IX TBST распределяли нано-раскапыванием, получая желательную концентрацию 20 мкг/мл. Пробирки, содержащие сыворотку и бусины, затем оставляли перемешиваться на ночь при 4 градусах Цельсия в темноте. Затем сыворотку удаляли из пробирок пипеткой и заменяли 4 мл 1 X TBST. Затем пробирки медленно переворачивали для повторного суспендирования бусин, а затем оставляли осаждаться. TBST дважды удаляли и вновь добавляли, т.е. в общей сложности осуществляли три промывки с использованием TBST.
[00181] Затем получали раствор вторичного антитела путем изготовления раствора 5 мкл антитела козы против IgG человека Qdot 655 в 1 мл 1 X TBST. После удаления последнего добавленного TBST от бусин добавляли 4 мл раствора Qdot и оставляли бусины перемешиваться на 2 часа при четырех градусах Цельсия в темноте. Затем бусинам позволяли осесть и удаляли раствор Qdot. Затем бусины трижды промывали 4 мл 1 X TBST. Затем бусины переносили в чистую чашку Петри и рассматривали под УФ-микроскопом с фильтром DAP I. Удаляли все бусины, окрашенные красным.
[00182] После завершения первого скрининга бусины вновь переносили в 15-мл конические пробирки и перемешивали при четырех градусах Цельсия по меньшей мере в течение четырех часов, до добавления следующего образца сыворотки. Затем к бусинам добавляли сыворотку от больных аналогично добавлению нормальной сыворотки, за исключением того, что сыворотку разбавляли StartingBlock PBS, а не IX TBST. Однако исходный рабочий раствор разбавляли IX TBST для получения необходимой концентрации с помощью нанокапельницы. Добавление сыворотки и вторичного антитела осуществляли аналогично тому, как это делали при нормальной сыворотке.
[00183] После удаления "активных соединений", характерных для заболевания, их объединяли в 1,5-мл пробирке Эппендорфа и нагревали при 95 градусах Цельсия в течение 25-30 минут в 1% ДСН. Затем ДСН удаляли из пробирки и заменяли водой
Millipore. Затем бусины перемешивали в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Затем воду заменяли свежей водой и перемешивали бусины в течение еще 15 минут. Затем воду удаляли, заменяли 50/50 раствором ацетонитрил/вода и оставляли перемешиваться в течение еще 15 минут. Затем бусины распределяли по отдельным лункам в 96-луночного планшета и оставляли сушиться.
[00184] Получали раствор 20-30 мг бромистого цианогена, 500 мкл ацетонитрила, 400 мкл ледяной уксусной кислоты и 100 мкл воды Millipore, и 20 мкл указанного раствора добавляли в каждую лунку, содержавшую бусины с активными соединениями. Планшет закрывали и оставляли на 16 часов при встряхивании (100 об/мин). Затем снимали крышку и выпаривали раствор для отщепления из лунок. Затем активные соединенияпо каплям переносили на планшет для МС секвенировали с помощью анализатора 4800 MALDI/TOF/FOF.
[00185] На Фигуре 6 приведена общая схема методологии скрининга, описанная в настоящем документе.
ПРИМЕР 3: Диагностика реакции на лекарственное средство для лечения
заболевания
[00186] 500 мг 160-мкм бусин Tentagel (библиотеку JC3B) добавляли в 15-мл коническую пробирку. В указанную пробирку добавляли 5 мл ДМФ и оставляли бусины набухать в течение ночи. На следующий день ДМФ удаляли из пробирки пипеткой и заменяли 5 мл 1 X TBST. Пробирку переворачивали для перемешивания, а затем позволяли бусинам осесть на дно и удаляли 1 X TBST. 5 мл 1 X TBST добавляли и удаляли еще пять раз.
[00187] Образцы нормальной сыворотки получали путем добавления в пробирку 4 мл ФБР StartingBlock и 7 мкл каждого из четырех отдельных образцов после обработки лекарственным средством. Указанную сыворотку добавляли к промытым бусинам, и оставляли бусины и сыворотку перемешиваться в течение ночи при четырех градусах Цельсия в темноте. На следующее утро бусины снимали с устройства для перемешивания и позволяли осесть, а затем удаляли сыворотку из пробирки. В пробирку добавляли 4 мл IX TBST и переворачивали пробирку для перемешивания. Затем TBST удаляли из пробирки пипеткой, заменяли на 4 мл свежего ГХ TBST и снова удаляли.
[00188] Затем получали раствор бусин DYNA, добавляя 50 мкл перемешанных бусин DYNA с антителами козы против IgG человека в 4 мл IX TBST. Затем указанную смесь добавляли к промытым бусинам. Затем бусины оставляли перемешиваться на два часа при четырех градусах Цельсия в темноте.
[00189] Скрининг бусин DYNA выполняли без промывки бусин. Пробирку помещали в магнитный держатель и заполняли до краев 1 X TBST. Магнит и пробирку медленно взбалтывали в течение двух минут и позволяли бусинам осесть в магнитный держатель. TBST и свободные бусины, осевшие на дно, тщательно удаляли, не касаясь бусин с активными соединениями, прикрепленных к боковым стенкам за счет магнита, и заменяли свежим 1 X TBST. Указанный процесс повторяли два-три раза, пока не становились видны бусины, присоединенные к боковым стенкам пробирки. Затем бусины с активными соединениями объединяли в одной пробирке.
[00190] Оставшиеся бусины, не содержавшие активных соединений, распределяли по 15мл пробиркам, переворачивали и подвергали быстрому импульсному центрифугированию. Супернатант удаляли и заменяли свежим IX TBST. Указанный процесс повторяли 6-8 раз, пока видимые бусины DYNA не исчезали из раствора бусин/TBST. Бусины с активными соединениями промывали аналогичным образом.
[00191] Бусины вновь объединяли в 15-мл пробирке, добавляли к бусинам нормальную сыворотку аналогично предыдущему описанию и оставляли оседать в течение ночи при 4 градусах Цельсия в темноте. Кроме того, 3 мл каждого из четырех нормальных образцов добавляли к 1 мл StartingBlock PBS, и полученный раствор добавляли к бусинам DYNA и бусинам с "активными соединениями" в пробирке. На следующий день бусины промывали аналогично промывке для нормальной сыворотки.
[00192] 20 мкл антитела козы против IgG человека, конъюгированного с квантовой точкой 655, разбавляли в 4 мл IX TBST (20 мкл Qdot в 1 мл IX TBST на пробирку с "активными соединениями") и добавляли к бусинам. Растворперемешивали в течение двух часов при четырех градусах Цельсия в темноте. Пробирки, содержавшие и не содержавшие активных соединений, четырежды промывали IX TBST и выполняли скрининг ярко-красных бусин под УФ-микроскопом. Остальные бусины перемешивали в 4 мл IX TBST в течение 1 часа и добавляли образец сыворотки больного или после обработки лекарственным средством аналогично образцу нормальной сыворотки. Магнитный скрининг и добавление Qdot выполняли аналогично описанному выше. Затем активные соединения секвенировали на масс-спектрометре MALDI-TOF7TOF.
ПРИМЕР 4: Данные микроматрицы по одному измерению
[00193] Микроматрицы изготовили, как описано в патентной публикации США № 2010/0303805, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Стекла микроматриц накрывали камерой для гибридизации и уравновешивали IXTBST (50 мМ Iris, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин-20) в течение 15 минут. Затем стекла блокировали 1 мл блокирующего буфера в течение 1 часа при 4°С. Блокирующий буфер удаляли и инкубировали стекла с 1 мл сыворотки (20 мг/мл) в течение 16 часов при 4°С и аккуратном встряхивании. В альтернативном способе стекла блокировали 1 мл лизата Е. coli (1,5 мг/мл) в течение 1 часа при 4 °С. Лизат Е. coli удаляли и инкубировали стекла с 1 мл сыворотки (15 мг/мл) в лизате Е. coli (1,5 мг/мл) в течение 18 часов при 4 °С и аккуратном встряхивании. Затем микроматрицы трижды промывали IX TBST и гибридизовали с антителом против IgG, меченным А1еха-647 (5 мг/мл), в течение 2 часов на орбитальном шейкере при 4°С. Камеры кассеты снимали со стекол микроматриц и промывали IX TBST (3 х 15 мин), а затем 0,1Х TBST (1 х 10). Затем стекла высушивали на центрифуге (5 мин при 1500 об/мин) и сканировали на сканере для микроматриц (Gene Pix Autoloader 4200), используя 635-нм лазер при 100%мощности и усиление трубки фотоумножителя 600 или 650. Все отсканированные изображения анализировали с помощью программного обеспечения Gene Fix Pro 6.0 и Genespring.
ПРИМЕР 5: Протокол твердофазного ИФА
[00194] 96-луночные малеимид-активированные планшеты получили из Thermo Scientific, трижды промывали с использованием 400 мкл/лунку буфера для промывки (0,1 М фосфата натрия, 0,15 М хлорида натрия, 0,05% Твин-20, рН 7,2), с помощью устройства для промывки планшетов от Beckman Coulter. Исследуемый пептоид разбавляли до 10 мМ в PBS-буфере для связывания (0,1 М фосфата натрия, 0,15 М хлорида натрия, 10 мМ ЭДТА, рН 7,2), и 200 мкл раствора пептоида добавляли в соответствующие лунки. Затем планшет оставляли для инкубирования в темноте на два часа при комнатной температуре и встряхивании (500 об/мин). Затем раствор пептоида удаляли из лунок с помощью устройства для промывки планшетов и вновь трижды промывали 400 мкл/лунку буфера для промывки. L-цистеин НС1: Н20 (Thermo Scientific) разбавляли буфером для связывания до 10 мкг/мл и добавляли по 200 мкл на лунку. Затем планшет инкубировали в течение одного часа в темноте при комнатной температуре и встряхивании при 500 об/мин и трижды промывали. 200 мкл блокирующего буфера StartingBlock(tm) (PBS) (Thermo Scientific) добавляли в лунки и
инкубировали планшет в течение одного часа при 4° Цельсия в темноте при встряхивании (500 об/мин). Планшет трижды промывали с помощью устройства для промывки планшетов и получали образцы сыворотки путем серийного разведения в буфере для связывания, начиная от 1:200. Концентрации 1:200 рабочих образцов получали путем нанораскапывания (Thermo Scientific), обеспечивая их сходство. Каждый разбавленный образец встряхивали на вортексе до получения следующего разведения. 200 мкл соответствующего разведения сыворотки (больных и здоровых субъектов), а также буфер для связывания без сыворотки в качестве контроля, добавляли в лунки планшета. Сыворотку оставляли для инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре в темноте при встряхивании (500 об/мин). Планшет повторно промывали и добавляли в соответствующие лунки 200 мкл 1:30000 разведения антитела козы, меченого ПХ, против IgG человека (Millipore) в буфере для связывания и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут при встряхивании (500 об/мин) в темноте. Планшет трижды промывали, в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина) и оставляли для развития окраски на 30 минут на лабораторном столе в темноте. Для остановки реакции добавляли 100 мкл 2 М стоп-раствора серной кислоты и считывали поглощение в лунках при 450 нм с помощью планшетного считывающего устройства.
[00195] Таким образом, в каждом конкретном случае и в отношении каждого варианта лечения с помощью лекарственного средства можно применять процесс согласно настоящему изобретению для быстрого детектирования биомаркеров, ассоциированных с вызванной лекарственным средством реакцией (например, неблагоприятной реакцией, устойчивостью к лекарству и эффективности терапевтической дозы), и лигандов, связывающихся с такими маркерами. Указанный крупный пул лигандов затем можно использовать в различных диагностических или терапевтических целях. Диагностические платформы включают микроматрицы, средства на основе бусин и системы для твердофазного ИФА. Условия, использованные выше, составляют важный аспект изобретения. Указанные условия включают диапазоны разбавления сыворотки, а также концентрацию конкретного пептоида на бусине или в лунке, и способы детектирования. Количество бусин, содержащих пептоид, может варьироваться в зависимости от конкретного диагностического набора или набора для скрининга. Указанные количества также могут варьироваться в зависимости от применения бусин/лигандов согласно протоколу начального скрининга и способу, приведенному в настоящем документе, и/или их применения в составе диагностического набора, основанного на обнаружении высокоаффинного лиганда.
[00196] Специалист в данной области техники должен поймет, что в вышеописанные варианты реализации можно внести изменения без отхода от расширенной сущности изобретения. Таким образом, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными вариантам реализации; подразумевается, что оно охватывает модификации, входящие в объем изобретения, определенный прилагаемой формулой изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ диагностики вызванной лекарственным средством реакции у субъекта, включающий: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного образца; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами в библиотеке; и определение того, связаны ли указанные один или более маркеров с указанной вызванной лекарственным средством реакцией, что обеспечивает диагностику указанной вызванной лекарственным средством реакцией у указанного субъекта.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная реакция является побочным эффектом указанного лекарственного средства, нежелательной реакцией на указанное лекарственное средство, устойчивостью к указанному лекарственному средству или эффективностью терапевтической дозы указанного лекарственного средства.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное лекарственное средство представляет собой по меньшей мере одно из лекарственных средств, перечисленных в Таблице 1.
4. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап определения, является ли субъект чувствительным или нечувствительным к лечению или терапии с применением указанного лекарственного средства.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная вызванная лекарственным средством реакция связана с заболеванием или стадией указанного заболевания.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой рак, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание, инфекционное заболевание, нейродегенеративное заболевание или сердечно-сосудистое заболевание.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что рак представляет собой рак молочной железы, рак легких, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак головы и шеи, рак яичка, рак яичников, рак кожи, рак головного мозга, рак поджелудочной железы, рак печени, рак желудка, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак пищевода,
лимфому или лейкоз, причем лиганды, распознающие маркеры, уникальны для этих болезненных состояний.
8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой волчанку, миастению гравис, рассеянный склероз, нарколепсию, ревматоидный артрит, нефрит, болезнь Шагаса, склеродермию или болезнь Шегрена.
9. Способ по п. 6, отличающийся тем, что инфекционное заболевание является следствием вирусной, бактериальной или грибковой инфекции.
10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера, деменцию или болезнь Крейцфельда-Якоба.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная библиотека лигандов содержит множество лигандов, выявленных ранее в начальном скрининге или заранее выбранных на основании известной способности к взаимодействию с указанными лиганд-связывающими маркерами.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная библиотека лигандов представляет собой библиотеку пептоидов.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека содержит соединение формулы I,
причем Ri выбран из богатой электронами боковой цепи Y аминокислоты; R2 выбран из Н;
и R3-R6 независимо выбраны из групп, состоящих из Н, -Ci-Сбалкила, -Ci-СбалкилБСНз; -Со-СбалкилСг-Сбалкенила, -Со-Сбалкил Сг-Сбалкинила, -Ci-Сб СООН, -Ci-СбалкилОН, -Ci-C6anKrorN(R)2, -Сз-Свциклоалкила, -Ci-Сбалкиларила, -Ci-Сбалкилгетероарила, -С1-СбалкилЖХО)С1-Сбалкила, -Ci-Сбалкилциклоамида, причем любая из арильных или гетероарильных групп может независимо содержать в качестве
заместителей -ОН, CI, F, Br, -ОСН3, -S02NH2 или -0-СН2-0-.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека содержит соединение формулы I,
причем указанные соединения получают способом, включающим применение реагентов, выбранных из группы, состоящей из
(A) фурфуриламина; 3,4-диметоксиэтаноламина; бензиламина; N-(2-аминоэтил)ацетамида; Тч[-(3-аминопропил)-2-пирролидинона; этаноламина; глицина; диаминобутана; аллиламина; пиперониламина; метилбензиламина; изобутиламина; 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонамида или циклогексиламина; или
(B) метоксиэтиламина; пиперониламина; циклогексиламина; диаминобутана;
метилбензиламина; изобутиламина; фурфуриламина или 4-(2-
аминоэтил)бензолсульфонамида; или
(C) фурфуриламина; этаноламина; глицина; диаминобутана; аллиламина;
пиперониламина; метилбензиламина; изобутиламина или 4-(2-
аминоэтил)бензолсульфонамида; или
(D) фурфуриламина; ТЧ-(2-аминоэтил)ацетамида; Тч[-(3-аминоэтил)-2-пирролидинона; этаноламина; глицина; диаминобутана; аллиламина; пиперониламина; метилбензиламина; изобутиламина; 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонамида; или
(E) цистеина, глицина, аллиламина, этаноламина, изобутиламина, метилбензиламина, пиперониламина, метионина, циклогексиламина, 3,4-диметоксифенетиламина, бензиламина, 1Ч-(2-аминоэтил)ацетамида, Тч[-(3-аминопропил)-2-пирролидона, 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонамида и фурфуриламина; и
при этом
Ri выбран из группы, состоящей из -(С1-Сб)8СНз; R2 выбран из Н;
R3 и R5 независимо выбраны из групп, состоящих из Н, -Ci-Сбалкила, -Ci-СбалкилБСНз; -Со-СбалкилС2-Сбалкенила, -Со-Сбалкил С2-Сбалкинила, -Ci-Сб СООН, -Ci-СбалкилОН, -Ci-C6ajrK^N(R)2, -Сз-Свциклоалкила, -Ci-Сбалкиларила, -Ci-
Сбалкилгетероарила, -С1-СбалкилЖХО)С1-Сбалкила, -Ci-Сбалкилциклоамида, причем любая из арильных или гетероарильных групп может независимо содержать в качестве заместителей -ОН, CI, F, Br, -ОСН3, -S02NH2 или -0-СН2-0-;
R4 выбрана из группы, состоящей из фурфурила или -(СгСбалкш^М^Яв, Ябвыбрана из группы, состоящей из Н, 1-ил-аллила, 1-ил-2-гидроксиэтила, изобутила, 1-ил-п-бути л амина, метилбензила, пиперонила, циклогексила, 1-ил-2-(3,4-диметоксифенил)этила, бензила, 1-ил-2-(ацетамид)этила, 1-ил-3-2-пирролидинона, 1-ил-2-(4-бензолсульфонамид)этила и фурфурила, и п составляет от 3 до 11.
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека содержит соединение формулы 1а,
причем указанное соединение выбрано из группы, состоящей из соединения формулы 1а, причем
(a) R9 представляет собой n-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; Ri2 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, HRI6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(b) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Ri2 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1-ил-2,2-диметилэтил (изобутил); R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(c) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; Ri2 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(d) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; Ri2 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет
(a)
собой циклогексил; R45 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(e) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(f) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изопропил; Rn представляет собой изопропил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(g) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(h) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Ri3 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(i) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой
метилбензил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-
бутиламин; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой
циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и R16
представляет собой циклогексил;
(j) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой метилбензил; Ri 1 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(k) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой изобутил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой пиперонил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(1) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(m) R9 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2
метоксиэтил; Rb представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой фурфурил, и Ri6 представляет собой фурфурил;
(n) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой фурфурил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой фурфурил;
(о) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой пиперонил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(р) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1 -ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой изобутил;
(q) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и R16 представляет собой метилбензил;
(г) R9 представляет собой метилбензил; Rio представляет собой метилбензил; R11 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(s) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(t) R9 представляет собой метилбензил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой изобутил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(u) R9 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(v) R9 представляет собой изобутил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой
метилбензил; R43 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R44 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(w) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой изобутил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(х) R9 представляет собой фурфурил; Rio представляет собой фурфурил; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(у) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой пиперонил; Rn представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(z) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(аа) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(bb) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(сс) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой циклогексил; R12 представляет собой пиперонил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил;
(dd) R9 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R14 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(ее) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-п
бутиламин; R43 представляет собой пиперонил; R44 представляет собой изобутил; R45 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ff) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(gg) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(hh) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ii) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой фурфурил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой фурфурил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой изобутил;
(kk) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(11) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(mm) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(nn) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(00) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой метилбензил; Ri 1 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой пиперонил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(рр) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метиламин; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(qq) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой фурфурил; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой изобутил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(гт) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(ss) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой циклогексил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
и их фармацевтически приемлемые соли.
причем указанное соединение выбрано из группы, состоящей из соединения формулы II, причем
16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека содержит соединение формулы:
(a) R9 представляет собой n-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, hRi6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(b) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1-ил-2,2-диметилэтил (изобутил); R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(c) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(d) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(e) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(f) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изопропил; R12 представляет собой изопропил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(g) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(h) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Ri3 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(i) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой
метилбензил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-
бутиламин; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой
циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и R16
представляет собой циклогексил;
(]) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой метилбензил; Ri 1 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(k) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой изобутил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой пиперонил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(1) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(m) R9 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой фурфурил, и Ri6 представляет собой фурфурил;
(n) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой фурфурил; R13 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой фурфурил;
(о) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой пиперонил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(р) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1 -ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой изобутил;
(q) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(г) R9 представляет собой метилбензил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(s) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(t) R9 представляет собой метилбензил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой изобутил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(u) R9 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(v) R9 представляет собой изобутил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(w) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой изобутил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(х) R9 представляет собой фурфурил; Rio представляет собой фурфурил; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(у) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой пиперонил; Rn представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(z) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(аа) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(bb) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(сс) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой циклогексил; R12 представляет собой пиперонил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил;
(dd) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R14 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(ее) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ff) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(gg) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(hh) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ii) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой фурфурил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой фурфурил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14
представляет собой метилбензил; R45 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой изобутил;
(kk) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(11) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(mm) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(nn) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(00) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой метилбензил; Ri 1 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой пиперонил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(рр) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метиламин; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(qq) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой фурфурил; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой изобутил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(гт) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(ss) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой циклогексил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
и их фармацевтически приемлемые соли.
17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная библиотека лигандов представляет собой библиотеку лигандов на основе бусин, включающую множество бусин, содержащих лиганды, связанные с указанными бусинами.
18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный скрининг осуществляют с применением матрицы.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица представляет собой микроматрицу, предметное стекло, планшет, чип или набор бусин.
20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица включает твердый носитель, имеющий поверхность; множество лигандов, связанных с указанным носителем, причем каждый из указанных лигандов включает якорный сегмент, стабильно связанный с поверхностью носителя, пептоидный сегмент и линкерный сегмент, связывающий якорный и пептоидный сегменты и находящийся между ними.
21. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица включает от приблизительно 1000 до 100000 различных лигандов.
22. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица включает от приблизительно 2000 до 50000 различных лигандов.
23. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица включает от приблизительно 4000 до 25000 различных лигандов.
24. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица включает от приблизительно 6000 до 15000 различных лигандов.
25. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица включает от приблизительно 7000 до 12500 различных лигандов.
19.
26. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица включает от приблизительно 8000 до 10000 различных лигандов.
27. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица включает лиганд-связывающую молекулу, поперечносшитую с указанной матрицей.
28. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап определения включает флуоресцентное детектирование связывающих молекул.
29. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная матрица включает флуоресцентно меченные лиганды.
30. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный скрининг включает начальный скрининг с применением первой библиотеки лигандов и последующий скрининг с применением второй библиотеки лигандов.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанный начальный скрининг осуществляют в первом образце, взятом до введения указанного лекарственного средства указанному субъекту, и указанный последующий скрининг выполняют во втором образце, взято после введения указанного лекарственного средства указанному субъекту.
32. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанную первую библиотеку лигандов подвергают скринингу на первую реакцию, и указанную вторую библиотеку лигандов подвергают скринингу на вторую реакцию.
33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что указанная первая реакция ассоциирована с указанным заболеванием, а указанная вторая реакция ассоциирована с указанной вызванной лекарственным средством реакцией.
34. Способ по п. 32, отличающийся тем, что указанная первая реакция ассоциирована с указанным заболеванием, и указанная вторая реакция ассоциирована со стадией указанного заболевания.
19.
35. Способ по п. 30, отличающийся тем, что указанная первая библиотека лигандов содержит первый набор лигандов, и указанная вторая библиотека лигандов содержит второй набор лигандов.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанный первый набор лигандов отличается от указанного второго набора лигандов.
37. Способ по п. 35, отличающийся тем, что один или более лигандов из указанного первого набора совпадает с одним или более лигандов из указанного второго набора.
38. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный биологический образец представляет собой ткань, клетку, мочу, сыворотку, цельную кровь, спинномозговую жидкость, мокроту, слюну или сперму.
39. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный субъект является человеком или животным.
40. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные этапы диагностики осуществляют в соответствии с инструкциями на вкладыше в упаковке.
41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что указанный вкладыш в упаковке включает инструкции по осуществлению указанных этапов диагностики, инструкции по определению введения лекарственного средства, и инструкции по введению указанного лекарственного средства на основании определения.
42. Способ по п. 40, отличающийся тем, что указанный вкладыш в упаковке представляет собой вкладыш в наборе, включающем указанную библиотеку и компоненты для осуществления указанных этапов диагностики.
43. Способ лечения заболевания у субъекта, включающий:
взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного образца ; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами в библиотеке;
определение того, связаны ли указанные один или более маркеры с реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения указанного заболевания;
введение указанного лекарственного средства указанному субъекту на основании определения того, связаны ли указанные один или более маркеров с реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения указанного заболевания, что обеспечивает лечение указанного заболевания у указанного субъекта.
44. Способ лечения заболевания у пациента, включающий:
взятие биологического образца у указанного пациента; скрининг указанного образца с применением библиотеки, включающей по меньшей мере один лиганд, с определением профиля связывания лиганда;
введение лекарственного средства указанному пациенту на основании результатов указанного профиля связывания лиганда у указанного пациента, причем указанный по меньшей мере один лиганд обладает сродством к одному или более антител, ассоциированных с указанным заболеванием.
45. Способ мониторинга лечения субъекта с применением лекарственного средства, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного субъекта; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами библиотеки; определение того, связаны ли указанные один или более маркеров с реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения указанного заболевания; введение указанного лекарственного средства указанному субъекту на основании определения связи между указанными одним или более маркерами и указанной реакцией, что обеспечивает мониторинг лечения указанного субъекта с применением указанного лекарственного средства.
46. Способ определения риска нежелательной реакции на лекарственное средство у пациента, включающий:
взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного образца ; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или несколькими лигандами в библиотеке; и
определения, связаны ли указанные один или более маркеров с указанным риском, что обеспечивает определение указанного риска нежелательной реакции на указанное лекарственное средство у указанного субъекта.
47. Способ получения профиля реакции на лекарственное
средство для лечения заболевания для одного или нескольких субъектов, включающий:
взятие биологического образца у указанного субъекта;
скрининг библиотеки лигандов против указанного субъекта;
определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или несколькими лигандами в библиотеке; и
определения, связаны ли указанные один или более маркеров с указанной реакцией на указанное лекарственное средство, что обеспечивает получения профиля указанной реакции на указанное лекарственное средство для лечения указанного заболевания у указанных одного или более субъектов.
48. Способ диагностики вызванной лекарственным средством реакции у субъекта, включающий: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки пептоидов против указанного образца; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами в библиотеке, причем по меньшей мере один из указанных одного или более маркеров является аутоантителом, способным к связыванию с пептоидным лигандом; и установление того, связаны ли указанные один или более маркеров с указанной вызванной лекарственным средством реакцией, что обеспечивает диагностику указанной вызванной лекарственным средством реакции у указанного субъекта.
49. Способ прогнозирования реакции субъекта на лекарственное средство для лечения заболевания у субъекта, включающий: взятие биологического образца у указанного субъекта; скрининг библиотеки лигандов против указанного образца; определение характеристик связывания одного или более маркеров в указанном образце с одним или более лигандами в библиотеке; и установление того, связаны ли указанные один или более маркеров с указанной вызванной лекарственным средством реакцией, что обеспечивает указанное прогнозирование указанной реакции на лекарственное средство для лечения указанного заболевания у указанного субъекта.
48.
50. Набор для диагностики заболевания по п. 1, включающий: библиотеку лигандов, реагенты для детектирования для скрининга указанной библиотеки лигандов против биологического образца, вспомогательные материалы для указанного скрининга, и вкладыш в упаковку, причем указанный вкладыш включает инструкции по осуществлению указанных этапов диагностики, инструкции по определению введения лекарственного средства и инструкции по введению указанного лекарственного средства на основании определения.
51. Набор для лечения заболевания по п. 43, включающий: библиотеку лигандов, реагенты для детектирования для скрининга указанной библиотеки лигандов против биологического образца, вспомогательные материалы для указанного скрининга, и вкладыш в упаковку, причем указанный вкладыш включает инструкции по осуществлению указанных этапов диагностики, инструкции по определению введения лекарственного средства и инструкции по введению указанного лекарственного средства на основании определения.
52. Способ идентификации маркера, ассоциированного с реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения заболевания, причем указанный способ включает: взятие биологического образца у субъекта; скрининг указанного биологического образца с применением библиотеки лигандов; определение характеристик связывания маркера в указанном образце с лигандом в библиотеке; и определения, связан ли указанный маркер с указанной реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения указанного заболевания, что обеспечивает идентификацию указанного маркера, ассоциированного с указанной вызванной лекарственным средством реакцией для лечения указанного заболевания.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанная библиотека включает от приблизительно 350000 до приблизительно 150 млн лигандов.
54. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанная библиотека лигандов представляет собой библиотеку случайных лигандов.
55. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанная библиотека лигандов представляет собой библиотеку неслучайных лигандов.
53.
56. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанная библиотека лигандов представляет собой библиотеку пептоидов.
57. Способ по п. 52, отличающийся тем, что по меньшей мере один лиганд в указанной библиотеке лигандов обладает сродством к аутоантителу к антигену, ассоциированному с указанной реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения указанного заболевания.
58. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный маркер является аутоантителом, способным к связыванию с пептоидным лигандом.
59. Способ по п. 52, отличающийся тем, что библиотека лигандов представляет собой библиотеку лигандов на основе бусин, включающую множество бусин, содержащих лиганды, связанные с указанными бусинами.
60. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный скрининг осуществляют с применением матрицы.
61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что указанная матрица представляет собой микроматрицу, предметное стекло микроскопа, планшет, чип или набор бусин.
62. Способ по п. 60, отличающийся тем, что указанная матрица включает твердый носитель, обладающий поверхностью; множество лигандов, связанных с указанным носителем, причем каждый из указанных лигандов включает якорный сегмент, стабильно связанный с поверхностью носителя, пептоидный сегмент и линкерный сегмент, связывающий якорный и пептоидный сегменты и находящийся между ними.
причем Ri выбран из богатой электронами боковой цепи Y аминокислоты; R2 выбран из Н;
и R3-R6 независимо выбраны из групп, состоящих из Н, -Ci-Сбалкила, -Ci-СбалкилБСНз; -Со-СбалкилСг-Сбалкенила, -Со-Сбалкил Сг-Сбалкинила, -Ci-Сб СООН, -Ci-СбалкилОН, -Ci-C6ajiK^N(R)2, -Сз-Свциклоалкила, -Ci-Сбалкиларила, -Ci-Сбалкилгетероарила, -С1-СбалкилЖХО)С1-Сбалкила, -Ci-Сбалкилциклоамида, причем любая из арильных или гетероарильных групп может независимо содержать в качестве заместителей -ОН, CI, F, Br, -ОСН3, -S02NH2 или -0-СН2-0-.
64. Способ по п. 52, отличающийся тем, что библиотека содержит соединение формулы I,
причем указанные соединения получают способом, включающим применение реагентов, выбранных из группы, состоящей из
(A) фурфуриламина; 3,4-диметоксиэтаноламина; бензиламина; N-(2-аминоэтил)ацетамида; Тч[-(3-аминопропил)-2-пирролидинона; этаноламина; глицина; диаминобутана; аллиламина; пиперониламина; метилбензиламина; изобутиламина; 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонамида или циклогексиламина; или
(B) метоксиэтиламина; пиперониламина; циклогексиламина; диаминобутана;
метилбензиламина; изобутиламина; фурфуриламина или 4-(2-
аминоэтил)бензолсульфонамида; или
(C) фурфуриламина; этаноламина; глицина; диаминобутана; аллиламина;
пиперониламина; метилбензиламина; изобутиламина или 4-(2-
аминоэтил)бензолсульфонамида; или
(D) фурфуриламина; ТЧ-(2-аминоэтил)ацетамида; Тч[-(3-аминоэтил)-2-пирролидинона; этаноламина; глицина; диаминобутана; аллиламина; пиперониламина; метилбензиламина; изобутиламина; 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонамида; или
(E) цистеина, глицина, аллиламина, этаноламина, изобутиламина, метилбензиламина, пиперониламина, метионина, циклогексиламина, 3,4-диметоксифенетиламина, бензиламина, 1Ч-(2-аминоэтил)ацетамида, Тч[-(3-аминопропил)-
(A)
2-пирролидона, 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонамида и фурфуриламина; и причем
Ri выбран из группы, состоящей из -(С1-Сб)8СНз; R2 выбран из Н;
R3 и R5 независимо выбраны из групп, состоящих из Н, -Ci-Сбалкила, -Ci-СбалкилБСНз; -Со-СбалкилСг-Сбалкенила, -Со-Сбалкил Сг-Сбалкинила, -Ci-Сб СООН, -Q-СбалкилОН, -Ci-C6ajiK^N(R)2, -Сз-Сациклоалкила, -Ci-Сбалкиларила, -Ci-Сбалкилгетероарила, -С1-СбалкилгЧС(0)С1-Сбалкила, -Ci-Сбалкилциклоамида, причем любая из арильных или гетероарильных групп может независимо содержать в качестве заместителей -ОН, CI, F, Br, -ОСН3, -S02NH2 или -0-СН2-0-;
R4 выбрана из группы, состоящей из фурфурила или -(С1-Сбалкил)№^^8,
R6Bbi6paHa из группы, состоящей из Н, 1-ил-аллила, 1-ил-2-гидроксиэтила, изобутила, 1-ил-п-бути л амина, метилбензила, пиперонила, циклогексила, 1-ил-2-(3,4-диметоксифенил)этила, бензила, 1-ил-2-(ацетамид)этила, 1-ил-3-2-пирролидинона, 1-ил-2-(4-бензолсульфонамид)этила или фурфурила, а
п составляет от 3 до 11.
65. Способ по п. 52, отличающийся тем, что библиотека содержит соединение формулы 1а,
причем указанное соединение выбрано из группы, состоящей из соединения формулы 1а, причем
(tt) R9 представляет собой n-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, nRi6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(uu) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1-ил-2,2-диметилэтил (изобутил); R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(vv) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(ww) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(хх) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Ri3 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(уу) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изопропил; R12 представляет собой изопропил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(zz) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(ааа) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(bbb) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и R16 представляет собой циклогексил;
(ссс) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой метилбензил; Ri 1 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ddd) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой изобутил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой пиперонил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(eee) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(fff) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R10 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R11 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой фурфурил, и R16 представляет собой фурфурил;
(ggg) R9 представляет собой циклогексил; R10 представляет собой циклогексил; R11 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой фурфурил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и R16 представляет собой фурфурил;
(hhh) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R10 представляет собой пиперонил; R11 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и R16 представляет собой метилбензил;
(iii) R9 представляет собой циклогексил; R10 представляет собой циклогексил; R11 представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и R16 представляет собой изобутил;
(jjj) R9 представляет собой пиперонил; R10 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R11 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и R16 представляет собой метилбензил;
(kkk) R9 представляет собой метилбензил; R10 представляет собой метилбензил; R11 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(111) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(mmm) R9 представляет собой метилбензил; Rio представляет собой 1-ил-2-
(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой изобутил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(nnn) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(000) R9 представляет собой изобутил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(ррр) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой изобутил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(qqq) R9 представляет собой фурфурил; Rio представляет собой фурфурил; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(rrr) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой пиперонил; Rn представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(sss) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ttt) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(uuu) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(vvv) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой циклогексил; R12 представляет собой пиперонил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил;
(www)R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R14 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(ххх) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(УУУ) ^9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(zzz) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(аааа) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(bbbb) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой фурфурил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой фурфурил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(сссс) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой изобутил;
(dddd) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(ееее) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой
метилбензил; R44 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R45 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ffff) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(gggg) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(hhhh) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой метилбензил; Ri 1 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой пиперонил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(iiii) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метиламин; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(jjjj) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой фурфурил; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой изобутил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(kkkk) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(1111) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой циклогексил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
и их фармацевтически приемлемые соли.
66. Способ по п. 52, отличающийся тем, что библиотека содержит соединение формулы:
причем указанное соединение выбрано из группы, состоящей из соединения формулы II, причем
(tt) R9 представляет собой n-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, nRi6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(uu) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1-ил-2,2-диметилэтил (изобутил); R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(vv) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(ww) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(хх) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(уу) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изопропил; R12 представляет собой изопропил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(zz) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(ааа) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2
метоксиэтил; Ri3 представляет собой циклогексил; R44 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(bbb) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и R16 представляет собой циклогексил;
(ссс) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой метилбензил; Ri 1 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ddd) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой изобутил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой пиперонил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(еее) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой циклогексил; R13 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(fff) R9 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой фурфурил, и Ri6 представляет собой фурфурил;
(ggg) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой фурфурил; R13 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой фурфурил;
(hhh) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой пиперонил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(iii) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1 -ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой изобутил;
(jjj) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R12 представляет собой 1-ил-2
(4(бензолсульфонамид)этил; RB представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(ккк) R9 представляет собой метилбензил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; RB представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(111) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; RB представляет собой метилбензил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(mmm) R9 представляет собой метилбензил; Rio представляет собой 1-ил-2-
(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; RB представляет собой изобутил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(nnn) R9 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой изобутил; RB представляет собой циклогексил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(000) R9 представляет собой изобутил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; RB представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; RB представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(ррр) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой изобутил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; RB представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(qqq) R9 представляет собой фурфурил; Rio представляет собой фурфурил; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой циклогексил; RB представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(rrr) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой пиперонил; Rn представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; RB представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(sss) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; RB представляет собой метилбензил; R14 представляет
собой циклогексил; R45 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ttt) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(uuu) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой изобутил; R13 представляет собой циклогексил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой пиперонил;
(vvv) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой циклогексил; R12 представляет собой пиперонил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил;
(www)R9 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R13 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R14 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой изобутил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(ххх) R9 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой пиперонил; R14 представляет собой изобутил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(УУУ) ^9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой метилбензил; R13 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(zzz) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R13 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(аааа) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R13 представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(bbbb) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой фурфурил; Rn представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; RB представляет собой фурфурил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(сссс) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой метилбензил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; RB представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил, и Ri6 представляет собой изобутил;
(dddd) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; RB представляет собой метилбензил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(ееее) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; RB представляет собой метилбензил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой 1-ил-п-бутиламин;
(ffff) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rn представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; R12 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; RB представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(gggg) R9 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой пиперонил; R12 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; RB представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой циклогексил;
(hhhh) R9 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил; Rio представляет собой метилбензил; Ri 1 представляет собой метилбензил; R12 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; RB представляет собой метилбензил; R14 представляет собой пиперонил; R15 представляет собой 1-ил-п-бутиламин, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(iiii) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метиламин; RB представляет собой пиперонил; R14 представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R15 представляет собой пиперонил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил;
(jjjj) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой фурфурил; R12 представляет собой 1 -ил-2-метоксиэтил; RB
представляет собой изобутил; R44 представляет собой циклогексил; R45 представляет собой метилбензил, и Ri6 представляет собой метилбензил;
(kkkk) R9 представляет собой пиперонил; Rio представляет собой 1-ил-п-бутиламин; Rn представляет собой изобутил; R12 представляет собой изобутил; RB представляет собой 1-ил-2-метоксиэтил; R14 представляет собой циклогексил; R15 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил, и Ri6 представляет собой 1-ил-2-(4(бензолсульфонамид)этил;
(1111) R9 представляет собой циклогексил; Rio представляет собой циклогексил; Rn представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R12 представляет собой метилбензил; RB представляет собой 1-ил-п-бутиламин; R14 представляет собой метилбензил; R15 представляет собой циклогексил, и Ri6 представляет собой пиперонил;
и их фармацевтически приемлемые соли.
67. Способ по п. 59, отличающийся тем, что указанная библиотека на основе бусин включает лиганд-связывающую молекулу, поперечно сшитую с бусинами.
68. Способ по п. 52, отличающийся тем, что этап определения включает флуоресцентное детектирование связывающих молекул.
69. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанная библиотека содержит флуоресцентно меченные лиганды.
70. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный биологический образец получен на ранней стадии указанного заболевания.
71. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный биологический образец получен на поздней стадии указанного заболевания.
72. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает идентификацию маркера, ассоциированного со стадией указанного заболевания.
73. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой рак, аутоиммунное заболевание, воспалительное заболевание, инфекционное заболевание, нейродегенеративное заболевание или сердечно-сосудистое заболевание.
74. Способ по п. 73, отличающийся тем, что рак представляет собой рак молочной железы, рак легких, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак головы и шеи, рака яичка, рак яичников, рак кожи, рака головного мозга, рак поджелудочной железы, рак печени, рак желудка, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак пищевода, лимфому или лейкоз.
75. Способ по п. 73, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой волчанку, миастению гравис, рассеянный склероз, нарколепсию, ревматоидный артрит, нефрит, болезнь Шагаса, склеродермию или болезнь Шегрена.
76. Способ по п. 73, отличающийся тем, что инфекционное заболевани представляет собой результат вирусной, бактериальной или грибковой инфекции.
77. Способ по п. 73, отличающийся тем, что нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера, деменцию или болезнь Крейцфельда-Якоба.
78. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанная реакция является побочным эффектом указанного лекарственного средства, нежелательной реакцией на указанное лекарственное средство, устойчивостью к указанному лекарственному средству или эффективностью терапевтической дозы указанного лекарственного средства.
79. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает идентификацию маркера, ассоциированного с популяцией или субпопуляцией пациентов.
80. Способ по п. 52, отличающийся тем, что по меньшей мере один лиганд обладает сродством к аутоантителу к антигену, ассоциированному со стадией указанного заболевания в популяции или субпопуляции пациентов.
81. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанное лекарственное средство представляет собой по меньшей мере одно из лекарств, перечисленных в Таблице 1.
82. Способ по п. 52, отличающийся тем, что различия в связывании позволяют отличить субъекта, чувствительного от субъекта, нечувствительного к лечению или терапии с применением указанного лекарственного средства.
83. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный скрининг включает начальный скрининг с применением первой библиотеки лигандов и последующий скрининг с применением второй библиотеки лигандов.
84. Способ по п. 83, отличающийся тем, что первая библиотека лигандов представляет собой библиотеку случайных лигандов, и вторая библиотека лигандов представляет собой библиотеку случайных или неслучайных лигандов.
85. Способ по п. 83, отличающийся тем, что указанная вторая библиотека лигандов содержит множество лигандов, выявленных в указанном начальном скрининге или заранее выбранных на основании известной способности к взаимодействию с указанными лиганд-связывающими маркерами.
86. Способ по п. 83, отличающийся тем, что указанная первая библиотека лигандов содержит первый набор лигандов, и указанная вторая библиотека лигандов содержит второй набор лигандов.
87. Способ по п. 86, отличающийся тем, что указанный первый набор лигандов отличается от указанного второго набора лигандов.
88. Способ по п. 86, отличающийся тем, что один или более лигандов из указанного первого набора совпадает с одним или более лигандов из указанного второго набора.
89. Способ по п. 83, отличающийся тем, что указанный начальный скрининг осуществляют в первом образце, взятом до введения указанного лекарственного средства указанному субъекту, и указанный последующий скрининг выполняют во втором образце, взятом после введения указанного лекарственного средства указанному субъекту.
86.
90. Способ по п. 83, отличающийся тем, что указанную первую библиотеку лигандов подвергают скринингу для идентификации одного или более биомаркеров, ассоциированных с первой реакцией, и указанную вторую библиотеку лигандов подвергают скринингу для идентификации одного или более биомаркеров, ассоциированных со второй реакцией.
91. Способ по п. 83, отличающийся тем, что указанную первую библиотеку лигандов подвергают скринингу для идентификации одного или более биомаркеров, ассоциированных с реакцией, и указанную вторую библиотеку лигандов подвергают скринингу для валидации определения связи указанных одного или более биомаркеров с указанной реакцией.
92. Способ по п. 83, отличающийся тем, что указанную первую библиотеку лигандов подвергают скринингу для идентификации одного или более биомаркеров, ассоциированных с указанным заболеванием, и указанную вторую библиотеку лигандов подвергают скринингу для идентификации одного или более биомаркеров, ассоциированных со стадией указанного заболевания.
93. Способ по п. 83, отличающийся тем, что указанную первую библиотеку лигандов подвергают скринингу для идентификации одного или более биомаркеров, ассоциированных с указанным заболеванием, и указанную вторую библиотеку лигандов подвергают скринингу для идентификации одного или более биомаркеров, ассоциированных с указанной вызванной лекарственным средством реакцией.
94. Способ по п. 83, отличающийся тем, что указанную первую библиотеку лигандов подвергают скринингу для идентификации одного или более биомаркеров, ассоциированных с указанным заболеванием и/или с указанной вызванной лекарственным средством реакцией, и указанную вторую библиотеку лигандов подвергают скринингу для валидации определения связи указанных одного или более биомаркеров с указанным заболеванием и/или с указанной вызванной лекарственным средством реакцией.
95. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный биологический образец представляет собой ткань, клетку, мочу, сыворотку, цельную кровь, спинномозговую жидкость, мокроту, слюну или сперму.
86.
96. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный субъект является человеком или животным.
97. Маркер, ассоциированный с реакцией, вызванной лекарственным средством для лечения заболевания, причем указанный маркер идентифицирован способом по п. 52.
По доверенности
1/65
199722
Структурная схема скрининга с применением TentaGel
Обеспечивают набухание гранул в
DMF, промывают TBST, оставляют
набухать на один час
Добавляют NC-сыворотку в 1 X TBST, перемешивать в течение ночи
Выполняют скрининг Dynabead
Промывают библиотеку центрифугированием
Промывают "активные соединения" Dynabead центрифугированием
Добавляют NC-сыворотку в 1 X TBST на ночь, затем добавляют Qdots
Добавляют NC-сыворотку в 1 X TBST на ночь, затем добавляют Qdots
Сохраняют активные соединения N Qdot из библиотеки
Промывают библиотеку (смешивание), добавляют D-сыворотку в StartingBlock на ночь
Сохраняют активные соединения N Dynabead
Сохраняют активные соединения N Dynabead Qdot
Выполняют скрининг Dynabead
Промывают библиотеку центрифугированием 1
Промывают активные соединения Dynabead центрифугированием
Добавляют D-сыворотку в SB, затем добавляют Qdots
Добавляют D-сыворотку в SB, затем добавляют Qdots
Собрать активные соединения D Qdot
Сохранить библиотеку
Сохраняют активные соединения D Dyna
Сохраняют активные соединения D Dynabead Qdot
ФИГУРА б
Активные соединения NC Dynabead библиотеки JC38 после добавления Qdot
Скрининг библиотеки TentaGel с применением сыворотки больных
ФИГУРА 8
Выбранные активные соединения
й Я
> > ю о я я
я !=Г > > ю о я я
я !=Г я я
я я о
я я
с ю я > > ю о я я
ю я ю о я
я о
л ¦е-
я я
я я о
я я
S Я
Я S
ч о
и 3
со S н 5Й
Я Я
о. 3
S н и о Я 4
> > ю о я я
> > ю о я я
я я
я я о
я я
ю я
я я
я я о
я я
ю я
ю о
S S к
я !=Г
> > ю о я я
> > ю о я я
я я
я я о
я я
я о
¦е-
я !=Г
я я
!=Г
> > ¦е-
ю я
ю я
S S S
я !=Г
я я
я я о
я я
> > ю о я я
> > ю о я я
> > ю о я я
я о
¦ел
я я
я я о
я я
> > ю о я я
я я
ю я
я я о
я я
я о
¦е-
> > ю о я я
я о
¦е-
ю о > > ю о я я
ю о
ю о
я 1=Г > > ю о я я
> > ю о я я
ю я
> > ю о я я
ю о
ю я
я о
¦е-
я я
я я о
я я
я !=Г
я я
я я о
я я
с я я
я я о
я я
> > ю о я я
<
<
о ю я я 1=Г я !=Г ю я я 1=Г ю о > > ю о я я
> > ю о я я
> > ю о я я
> > ю о я я
ю о > > ю о я я
> > ю о я я
я о
¦е-
я я
я !=Г ю я
я я
я я о
я я
с я
я о
¦е-
я я
я 1=Г ю о
> > ю о я я
ю я я
я о
¦е-
я я
ю я
я я
> > - &
я о
¦е-
я я
> > - &
ю я > > ю о я я
я я
н > > ю о ю я
ю я я я
я я о
я я
> > ю о я я
я я
я я о
я я
с ю я я
я о
я я
я 1=Г я я
я я о
я я
я я
я я о
я я
с я !=Г я
я о
¦е-
я я
я 1=Г > > ю о я я
я я
с я
ев Я О
¦е> > ю о я я
Я" > > ю о я я
> > ю о я я
Я" > > ю о я я
> > ю о я я
я о
я о
> > ю о я я
> > ю о я я
я о
я я
я !=Г
я я
я я
я я ч 0) о
и 3 я со я н ы
3 я я
я н
U О
Я Л
о > > ю о я я
ю я
ю о
п я
я о
ю я
¦е-
ю я
я Я
я я
н > > ю о
я о
¦е-
> > ю о я я
я я
н > > ю о
S я
я Я
> > ю о я я
> > ю о я я
> > ю о я я
я о
> > ю о я я
ю я
о я
я я
я я о
я я
> > ю о я я
я о
¦е-
> > ю о я я
я о
> > ю о я я
¦е-
> > ю о я я
я я
я я о
я я
я о
я я
н > > ю о
п я
я о
я я
н > > ю о
я Я я
я Я я
S S S
4 ч §
5 5 я
я я
S S S
я о
¦е-
> > ю о я я
я о
¦е-
> > ю о я я
> > ю о я я
я о
п я
я о
¦е-
¦е-
> > ю о я я
ю я
¦е-
> > ю о я я
> > ю о я я
> > ю о я я
я о
¦е-
ю я
ю я
> > ю о я я
> > ю о я я
ю я
> > л
ю 4
о > .
x о
я ч
S °
я g
ю я
ю я
Ч W
ю я
ю я
> > ю о я я
я о
¦е-
S S S
ю я
ю я
ю я
S S S
я о
¦е-
я о
> > ю о я я
я о
¦е> > ю о я я
я я
я я о
я я
я о
¦е-
> > ю о я я
ю я
ю я
> > ю о я я
ю я
> > ю о я я
> > ю о я я
я я
я я
> > ю о я я
> > ю о я я
> > ю о я я
я я
ю о
> > - &
я я
н > > ю о
я я
н > > ю о
S S s
я я
я я о
я я
я о
ю я
> > ю о я я
ю я
> > ю о я я
ю я
<
> > ю о я я
я ¦ея я
я я
5 F(tm)
о я
8 ю о я я
о я
ю я > > ю о я я
о я
ю о ю я > > ю о я я
о я
> > ю о я я
ю я я
я о
я я
NH2 0=S=0
Химические структуры выбранных предполагаемых активных соединений
О Л о но
г Г
О ^04
NH2 NH2 JC38-1
NH2
о о ^ о s
NH2
о I о Jo Jo Jo Цн
NH2
JC3B-7
JC3B-3
NH2
О N о
!,, О
NH2 /О
NH2
• " * И J Q
0 HQ о ^SH
о Ч о
0 AO
N-^^N-^NX^YNY^S'OH
NH2
0=S"0 NH2
JC3B-R12
ФИГУРА 13B
г; оо о
о о |^
О Ю
О ^1о
00 о см
я я
ю я
ч ч
се Я Ч
о я я
се я о
¦е-
ю я
н > > ю о я !=Г
ю о
я !=Г
се я о
¦е-
ю я
ю о
К К S
п я
се я о
¦е-
(Т) О W W
я !=Г
> > ю о я я
се я Ч
> > ю о я я
се я Ч
> > ю о я я
се я Ч я
се я о
¦е-
ю я я !=Г
я !=Г
ю я
ю я
се Я
я о
я я
с я я
н > > ю о
ю я я
се я о
¦е-
ю я я я
я я о
Сч>
я я
ю я
ю я я я
н > > ю о я я
я я о
Сч>
я я
ю я я я
я я о
Сч>
я я
Я" я !=Г п я
се я о
Сч>
Сч)
Сч>
Сч)
Сч)
Сч)
я !=Г
я я я я
я я
ю я
> > ю о я я
се я Ч
я я я я
я я
я я о
Сч>
я я
се я о
¦е-
я я
н > > ю о
ю я
я я
> > ю о я я
се я Ч
я я
н > > ю о
я я
н > > ю о
ю я
& & &
о я я
се я Ч
о я я
се я Ч
я я
н > > ю о
я я
о я я
се я Ч
се Я
я о
Сч>
я я
с я я я я
ч-Ч
я о
¦е-
се я о
¦е-
я я
я я о
Сч>
я я
с ю о
> > ю о я я
се я
> > ю о я я
се я
я !=Г я я
я я о
Сч>
я я
се я о
¦е-
ю о
ю о
w К К
> > ю о я я
се я Ч
се я о
ю о
ч1ч ч^
я !=Г
я я
я я о
Сч>
я я
с > > ю о я я
се я Ч я
се я о
¦е-
се я о
¦е-
> > ю о я я
се я Ч я
се я о
¦е-
> > ю о я я
се я Ч ю о
> > ю о я я
се я Ч я !=Г я я
я я о
Сч>
я я
с я я
я я о
Сч>
я я
с я я
я я о
Сч>
я я
с > > ю о я я
се я Ч
ю я
S S S
> > ю о я я
се я Ч ю о ю о я я я я
г-Ч
ю я
ю о
S К m
се я о
¦ея я
я я
я я
я я
я я
я я о
Сч>
я я
с я я
> > ю о я я
се я Ч я !=Г ю о
о я я
се я Ч > > ю о я я
се я Ч
> > ю о я я
се я Ч
о я я
ю я
ю о
S S m
се я о
¦е-
ю я
S S w Й
я 1=Г
> > ю о я я ю я > > ю о я я
се я Ч
я я
я я о
я я
с > >
ю о я я
се я Ч
я я
я я о
я я
ю я
ю о
> > ю о я я
се я Ч
m S S
я я я я
ч-Ч
ю о я я
се я Ч
я !=Г
я 1=Г ю я
ю я
<
о я я
се я Ч
я я
я я я
о я се
я я
я я о
я я
с я я
ч-Ч
я я
> > ю о я я
> > ю о > > ю о я я
се я Ч > > ю о я я
се я Ч я я
> > ю о
я я я я
ч-Ч
> > ю о я я
се я
о я я
се я Ч я я
я я о
Сч>
я я
с я
се я о
¦ею я я
се я о
¦ея я
я я о
Сч>
я я
я я
ю я
> > ю о
К S m
ю о я я
се я Ч
п я
се я о
¦е-
я я
> > ю о
п я
се я о
¦е-
я я
ю я
е> > ю о
ЧчЧ^^Ч-Ч ^ U J" Г
я я
я я о
я я
с я 1=Г я я я я
ч-Ч
> > ю о я я
се я
се я о
¦е-
> > ю о я я
се я Ч я
се я о
¦е-
ю о я я
се я Ч > > ю о я я
се я Ч ю о ю я
ТЕСТ БА MayolOO :
Мауо97 :
Мауо94 Мауо91 : May о 88 :, Мауо85 May о 82 Мауо79 Мауо76 Мауо73 Мауо70 Мауо67 Мауо64 Мауоб! Мауо58 IVIayoSS MayoS2 Мауо49 Мауо46 $* Мауо43 : Мауо40 Мауо37 Мауо34 МауоЗ! : Мауо28 :
Мауо25 : Мауо22 : Мауо19 : Мауо 16 Мауо 13 МауоЮ :
Мауо7
Мауо4
Мауо!
P1aag1
ТЕСТ БА
Мауо 100
Мауо97
Мауо94 IVIayoSi MayoSS Мауо85 Мауо82 Мау(c)79 Мауо76 Мауо73 Мауо70 Мауоб? Мауо64 Мауо61 IVIayoSS MayoSS
Мауо52 3
Мауо49 Мауо46 Мауо43 Мауо40 МауоЗ? Мауо34
Мауо28 Мауо25 Мауо22 Мзуо19 МауоХб Мауо13 Мауо 10 Мауо7 Мауо4 Mayol
ТЕСТ БА
MayolOQ
Мауо97 Мауо94 Мауо91 MayoSS MayoSS Мауо82 Мауо79 Мауо76 Мауо73 Мауо70 Мауо67 Мауо64 Мауоб! MayoSS MayoSS Мауо52 Мауо49 Мауо46 May о43 Мауо40 Мауо37 Мауо34 МауоЗ! Мауо28 Мауо25 Мауо22 Мауо 19 Мауо 16 Мауо 13 Мауо 10 Мауо7 Мауо4 Мауо!
ТЕСТ БА MayolOO ;
Мауо97 Мауо94 : Мауо91 : MayoSS : MayoSS Мауо82 Мауо79 Мауо76 Мауо73 Мауо70 Мауоб? Мауо64 Мауоб! MayoSS MayoSS MayoS2 Мауо49 Мауо4б Мауо43 Мауо40 МауоЗ? Мауо34 МауоЗ! Мауо28 Mayo2S Мауо22 Мауо 19 Мауо!б Мауо13 Мауо 10
Мауо?
Мауо4
Mayol
ТЕСТ БА MayolOO
¦ ________
¦ ________
¦ ¦
:====
ш
" ^^_^(tm)_
Мауо97 Мауо94 Мауо9! MayoSS MayoSS MayoS2 Мауо79 Мауо76 Мауо73 Мауо70 Мауо67 Мауо64 Мауоб! MayoSS MayoSS Мауо52 Мауо49 Мауо46 Мауо43 Мауо40 Мауо37 : Мауо34 МауоЗ! Мауо28 Мауо25 Мауо22 Мауо19 Мауо!6 Мауо!3 МауоЮ
IVlSyO? 9 ^uuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuw
Мауо4 Мауо!
ТЕСТ БА
MayolGO Мауо97 Mayо94 : Мауо91 MayoSS : MayoSS : Мауо82 Мауо79 ; Мауо7б Мауо73 :
Мауо70 :
Мауо67 : Мауоб4 Мауоб! MayoSS MayoSS Мауо52 :
Мауо49 I
Мауо4б " Мауо43 : Мауо40 Мауо37 Мауо34 МауоЗ! Мауо28 : Мауо25 :
Мауо22 :
Мауо19 Мауо1б Мауо13 : Мауо 10 Мауо7 : Мауо4 Мауо!
ТЕСТ БА
МауоЮО Мауо97 Мауо94 Мауо9! MayoSS MayoSS MayoS2 Мауо79 Мауо76 Мауо73 Мауо70 Мауоб7 Мауо64 Мауоб1 MayoSS MayoSS Мауо52 Мауо49 Мауо4б Мауо43 Мауо40 Мауо37 Мауо34 МауоЗ! Mayo2S Мауо25 Мауо22 Мауо!9 Мауо 16 Мауо 13 МауоЮ Мауо7 Мауо4 Mayol
ADP2
20 40 60
Интенсивность{Х103)
ТЕСТ БА
МауоЮО
Мауо97 Мауо94
Мауо91 . MayoSS ; MayoSS Мауо82 : Мауо79 Мауо76 I Мауо73 Мауо70 : Мауоб? Мауоб4 Мауоб! MayoSS MayoSS Мауо52 Мауо49 Мауо46 Мауо43 Мауо40 МауоЗ? Мауо34 МауоЗ! Мауо28 Mayo2S Мауо22 Мауо!9 Мауо!б MayolS MayolO
Мауо7
Мауо4
Мауо!
ТЕСТ БА
МауоЮО Мауо97 Мауо94 Мауо91 IVIayoSS MayoSS MayoS2 Мауо79 Мауо76 Мауо73 Мауо70 Мауо67 Мауо64 : Мауоб! IVIayoSS IVIayoSS Мауо52 Мауо49 Мауо46 Мауо43 Мауо40 МауоЗ? Мауо34 МауоЗ! Мауо28 Мауо25 Мауо22 Мауо 19 Мауо 16 Мауо 13 Мауо 10 : Мауо7 Мауо4 : Mayol
ADP3
ТЕСТ БА
МауоЮО Мауо97 Мауо94 Мауо91 MayoSS MayoSS Мауо82 Мауо79 Мауо76 Мауо73 Мауо70 Мауо67 Мауо64 Мауоб!
* mwwwwwwHiw
MayOSS ; шшшшшшшшшшшшшшшшшшшшшт
MayoSS Мауо52 Мауо49
Мауо46 ?~*
Мауо43
Мауо40
Мауо37
Мауо34
МауоЗ!
Mayo2S
Мауо 25
Мауо22
Мауо!9
"г.
Мауо16 : -
Мауо!3 *^ МауоЮ
Мауо7 -Н
Мауо4
Мауо!
Валидация на гранулах TentaGel
140 мкм
D 30144 40мкг/мл NC 6 объединенных мкг/мл
Примечание: валидацию на гранулах TentaGel
можно использовать в качестве колориметрического теста для анализа на месте
ФИГУРА 21
Активные соединения JC5B
- Повторное подтверждение активных соединений с помощью Qdot 655
- Активные соединения Qdot 655 после добавления сыворотки от больных
- Обнаружены с помощью ФИГУРА 22 Qdot 655
Валидация активных соединений
Маркер PC . Обнаружены с помощью Qdot 655 - Обнаружены с помощью Qdot 655
Валидация активных соединений перемешиванием
Ю Я
> > Ю О Я Я
> > Ю О Я Я
> > Ю О Я Я
Я Я
Я Ю О
_я_
Я Я
Ю Я
> > Ю О Я Я
> > Ю О Я Я
> > Ю О Я Я
Я Я
Ю Я Ю О
О Я Я
Ч Ю Я
О Я Я
Ч > > Ю О Я Я
Ю О
> > Ю О Я Я
Я Я

U I
зЯ Я
и 3 я
CQ Я Н
5й ее
Я Н "_>
о Я Л
Ч о, н
со о
,-i
СХ!
X X X О X
S ей
х а н > . ю о
X X S ей К et
CD И
<
> > ю О Я Я
2 св
Я Я
2 св
> > ю О
> > ю О Я Я
2 св
Я Я
2 св
Я Я О
Я Я
> > ю О Я Я
2 св
Я Я
2 св
Я Я Я
2 св
Я Я О
Я Я
Я Я
2 св
О Я
Скрининг библиотеки при СКВ
А. Нормальная В. Сыворотка при СКВ - С. Сыворотка при СКВ -
контрольная сыворотка Группа 1 Группа 2
ФИГУРА 27
я я
!=r
> > ю о я я
2 СВ
я _Ё__
!=г
> > ю о я я
2 СВ
я _Ё__
> > ю о я я
2 СВ
> > ю о я я
2 СВ
> > ю о я я
2 СВ
!=г
> > ю о я я
2 СВ
> > ю о я я
2 СВ
я !=Г
> > ю о я я
2 СВ
_А_
> > ю о я я
2 СВ
я я
2 СВ
_ <_.
я __Э1
2 СВ
я о
¦е-
2 СВ
я о
¦е-
> > ю о я я
2 СВ
я я
2 СВ
я я
ю я
я о я я
я я я я
ч-Ч
2 СВ
я о
> > ю о я я
2 СВ
> > ю о я я
2 СВ
2 я Ч 2
я я
2 СВ
> > ю о я я
2 СВ
ю я
я 14
> > ю о я я
2 СВ
2 СВ
я о
¦е-
> > ю о я я
2 СВ
я я
2 СВ
я я о
я я
> > ю о я я
2 СВ
ю я
ю я
> > ю о я я
2 СВ
я я
_Е_
я я
2 СВ
> > ю о
я я
2 СВ
ю я
> > ю о я я
2 СВ
я я
2 СВ
ю я я
2 СВ
я о
¦е-
я я
2 СВ
ю я
> > ю о я я
2 СВ
я я
2 СВ
ю я
я я
_Е_
> > ю о я я
2 СВ
> > ю о я я
2 СВ
ю о
я я
2 СВ
я я
2 СВ
я я о
я я
_Е_
> > ю о я я
2 СВ
2 СВ
я о
¦е-
я я
2 СВ
ю я
> > ю о я я
2 СВ
ччЙч.
я я
2 СВ
ю я
я 14
> > ю о я я
2 СВ
ю я
я я
2 СВ
я я о
я я
> > ю о я я
2 СВ
я я
2 СВ
я я о
я я
> > ю о я я
2 СВ
ю я
> > ю о я я
2 СВ
ю я я я
2 СВ
я !=Г
> > ю о я я
2 СВ
Валидация активных соединений для пептоида KN1B-20
Объединенная сыворотка группы 1 (-0,374 мг/мл)
Объединенная Без контрольной сыворотки
сыворотка от здоровых субъектов (-0,378 мг/мл)
ФИГУРА 29
Твердофазный ИФА
Связывание KNIB-20-биотин-флуоресцеина с планшетами для твердофазного ИФА
Пептоид-КЫ1В-20
Пептоид-KN1B-20
Флуоресцеин Флуоресцеин
494 возбуждение/520 излучение
1400, 1200 1000 800600 4002000-
мМ KNIB-20-биотин-флуоресцеина
Конкурентный анализ
. 1 мМ KNIB-20-биотин-флуоресцеина по сравнению с 0, 1,5, 10 и 50 мМ KNIB-20-биотина 494 возбуждение/ 520 излучение
600.00
500.00
400,00
300,00
200.00
100.00
0.00
-00
1.00 5.00 10.00
мМ KNIB-20-биотина
50.00
ФИГУРА 31
Валидация пептоидов на платформах TentaGel и
твердофазном ИФА
D 30144 40:мкг/мл NC 6 объединенных 40 мкг/мл
ФИГУРА 32
Твердофазный ИФА с ЮмМ ADP3
АО АО ОС ОС Р Р D D
ФИГУРА 33 Твердофазный ИФА с ЮмМ SLE-KN1B-20
SLE SLE (1С (1С
1 в
D Е
Твердофазный ИФА сыворотки при БА с 10 мМ ADP3 (в буфере для связывания)
Начальные разведения (1:200)
Группа 1, сыворотка при БА, -0,394 мг/мл
Сыворотка от здоровых субъектов, -0,386 мг/мл
ФИГУРА 35
Твердофазный ИФА сыворотки при СКВ с 10 мМ KN1B-20 (в буфере для связывания)
К-Группа 1, сыворотка при СКВ Сыворотка от здоровых субъектов
Начальные разведения (1:200) Группа 1, сыворотка при СКВ, -0,375 мг/мл Сыворотка от здоровых субъектов, -0,396 мг/мл
Твердофазный ИФА сыворотки при СКВ с 10 мМ KN1B-20
(в ДМСО)
г о
^1-
Разведение сыворотки
Начальные разведения (1:200) Группа 1, сыворотка при СКВ, -0,367 мг/мл Сыворотка от здоровых субъектов, -0,322 мг/мл
_Ф Группа 1, сыворотка при СКВ
Сыворотка от здоровых "- субъектов
FACS-платформа для валидации активных соединений
гранул TentaGel
10-мкм гранулы TentaGel после анализа
лазер
Новая капля
Электронное поле >
(r)
Положительные гранулы
Отрицательные гранулы
Пустая капля
Отходы
Модельное исследование: связывание 2,5-динитрофенильной группы (ДНФ) с антителом против ДНФ
Средняя интенсивность флуоресценции (MFI)
30000
25000
Гранулы-ДНФ
20000
15000
10000
5000
Гранулы-ацетильная группа
~т -I
200
400
600
800
100
1200
[Сыворотка] (мкг/мл)
Гранулы-ацетильная группа
Подтверждение основано на нингидриновом тесте и изменении цвета гранулы
Этаноламин-ДНФ конкурирует за связывание ДНФ с антителом против ДНФ
ALEXA 647-А
MFI
14000
12000 4
Нормальная сыворотка: мкг/мл, 1 ч
1000
10000 8000 6000 4000 2000 О
Вторичное антитело против -антитела человека, DyLight 649 (Abeam), 1/100, 10 мкг/мл (конечная концентрация)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
[Свободный этаноламин-ДНФ] (мкг/мл)
ADP3 связывал аутоантитело из пула нормальной контрольной сыворотки (NC) и пула сыворотки при болезни Альцгеймера (БА)
Вторичное антитело: козы против [Сыворотка] (мкг/мл) антител человека, Dylight 649
45000 40000
asooo
MFI
30000 25000 20000 15000 10000 5000 О
О 20 40 60 Вторичное антитело: козы против антител человека, Alexa 647
18000 16000 14000 12000 10000
MFIsooo
6000 4000 2000 О
-2000
Dylight 649
[Сыворотка] (мкг/мл)
Alexa 647
MFI
О 20 40 60 80 100 120 140
[Сыворотка] (мкг/мл) ф|/|рурд 42
KN1B-14 0=S=0
NH2
NH2 NH2
ADP3 связывал аутоантитело из нормальной контрольной сыворотки и сыворотки при болезни Альцгеймера
ф Серия 1 NC (нормальный контроль)
MFI И Серия 2 БА (болезнь Альцгеймера)
35000
30000 25000 20000 15000 10000 5000
40 60 ВО
[Сыворотка] (мкг/мл)
100
120
Предварительное блокирование гранул в течение 3 ч 1XTBST+ антитело козы против антител человека, Alexa 647
коротка] (мкг/мл) 0 3 75 7 5 15 30 юо
NC 8956 9732 11195 9992 11516 25772
БА 6023 7841 9896 13928 15713 31489
20000 18000
ADP3 связывал аутоантитело из нормальной контрольной сыворотки и сыворотки при болезни Альцгеймера
0 20 40 60 80 100 120
[Сыворотка] (мкг/мл)
Блокирующий буфер + антитело козы против антител человека, Alexa 647
ADP3 связывал аутоантитело из нормальной контрольной сыворотки (NC) и сыворотки при болезни Альцгеймера (БА)
MFI
14000
0 "I 1 1 1 ! } 1 1
0 10 20 30 40 50 60 70
[Сыворотка] (мкг/мл)
1. Предварительное блокирование лизатом Е. coli + 0,5% лизином в течение 3 ч
2. Блокирующий буфер + антитело козы против антител человека, Alexa 647
ADP3 связывал аутоантитело из нормальной контрольной сыворотки (NC) и сыворотки при болезни Альцгеймера (БА)
MFI
20000 1
[Сыворотка] (мкг/мл)
1. Предварительное блокирование лизатом Е. coli + 1% лизином в течение 3 ч
2. Блокирующий буфер + антитело козы против антител человека, Alexa 647
Данные по титрованию - соответствие между клинической диагностикой и тестом Opko
Интенсивность 4i
ADP3
Р1аад2
Р1аадЗ
Р1аад4
Р1аад5
Р1аад6
Валидация ADP3 на платформе твердофазного ИФА
Интенсивность
^ = Клинически здоров = Клинически - БА = Клинически - БА = Клинически здоров = Клинически - БА (деменция) = Клинически здоров
= Можно определить при использовании большего количества пептоидов
ФИГУРА 53
Валидация пептоидов (P1aag1-9) в качестве селективных маркеров болезни Альцгеймера на платформе твердофазного ИФА
Интенсивность
^ ='Клинически здоров (2} ~ Клинически - БА <^> = Клинически - БА
[] = Клинически здоров
О = Клинически - БА (деменция)
А =Клинически здоров
о &
Производительность при других видах деменции
Интенсивность
0#^* ф.о^меРенные когнитивные нарушения
Умеренные когнитивные нарушения
Умеренные когнитивные Q нарушения/депрессия Q ф
Расхождение между клинической диагностикой и тестом Opko
Интенсивность
32.5
-¦-ADP3
Р1аад2 Р1аадЗ Р1аад4 Р1аад5 Р1аад6 NC
Клинически болен
Opko: состояние, предшествующее БА, даже по одной точке
ФИГУРА 56А
Интенсивность 3i
ADP3
Р1аад2
Р1аадЗ
Р1аад4
Р1аад5
Р1аад6
Клинически здоров (не страдает деменцией) . KCD
Opko: состояние, предшествующее БА, даже ФИ1 У г A ODD по одной точке
Интенсивность З-i
ADP3 Р1аад2 Р1аадЗ Р1аад4 Р1аад5 Р1аад6
1 g
• •
• •
Разбавление сыворотки
Клинически - БА (деменция)
Opko: Не БА, должно быть, другой вид
деменции
ФИГУРА 56С
Интенсивность
,,_ =г о
О СО 00
г; со см
о ^
Разбавление сыворотки
ADP3 Р1аад2 Р1аадЗ Р1аад4 Р1аад5 Р1аад6 -*(tm) NC
Клинически - БА (деменция)
Opko: UND по одной точке. UND даже после
титрования.
Интенсивность
lilt.
Напоминание: сыворотка + микроматрица ADP3
i Ш *'
4 ****
БА NC m ФИГУРА 57
СКВ
Сводная информация по твердофазному ИФА Общее количество исследованных образцов плазмы = 106
Клинич. диагноз Диагноз авт. изобр-я Различия
49 пациентов с БА 42 7 (14%)
57 здор. субъектов 47 10(17%)
ФИГУРА 58
NH2 0=S=0
о ^ Y о -у о т о н °
NH2
ФИГУРА 59В
NH*
Р1аад8
NH2 NH2 NH2
Р1аад9
2/65
2/65
6/65
6/65
6/65
6/65
6/65
6/65
6/65
6/65
6/65
6/65
8/65
8/65
9/65
9/65
11/65
11/65
11/65
11/65
11/65
11/65
11/65
11/65
12/65
12/65
12/65
12/65
13/65
13/65
13/65
13/65
13/65
13/65
14/65
14/65
14/65
14/65
14/65
14/65
14/65
14/65
14/65
14/65
15/65
15/65
15/65
15/65
16/65
16/65
16/65
16/65
16/65
16/65
17/65
17/65
17/65
17/65
17/65
17/65
17/65
17/65
18/65
18/65
О 20 40 60
ФИГУРА 16А ИНТЕНСИВНОСТЬ(Х1°3)
О 20 40 60
ФИГУРА 16А ИНТЕНСИВНОСТЬ(Х1°3)
19/65
Р1аад2
19/65
Р1аад2
О 20 40 60
ФИГУРА 16В Интенсивность (Х103)
О 20 40 60
ФИГУРА 16В Интенсивность (Х103)
20/65
Р1аадЗ
20/65
Р1аадЗ
О 20 40 60
ФИГУРА 17А ИнтенсивностЦХЮ3)
О 20 40 60
ФИГУРА 17А ИнтенсивностЦХЮ3)
21/65
Р1аад4
21/65
Р1аад4
0 20 40 60
ФИГУРА 17В Интенсивность{Х103)
0 20 40 60
ФИГУРА 17В Интенсивность{Х103)
22/65
Р1аад5
22/65
Р1аад5
О 20 40 60
ФИГУРА 18А Интенсивность^!(c)3)
О 20 40 60
ФИГУРА 18А Интенсивность^!(c)3)
22/65
Р1аад5
22/65
Р1аад5
О 20 40 60
ФИГУРА 18А Интенсивность^!(c)3)
О 20 40 60
ФИГУРА 18А Интенсивность^!(c)3)
23/65
Р1аад6
23/65
Р1аад6
0 20 40 60
ФИГУРА 18В Интенсивность(Х103)
0 20 40 60
ФИГУРА 18В Интенсивность(Х103)
23/65
Р1аад6
23/65
Р1аад6
0 20 40 60
ФИГУРА 18В Интенсивность(Х103)
0 20 40 60
ФИГУРА 18В Интенсивность(Х103)
24/65
24/65
ФИГУРА 19
ФИГУРА 19
24/65
24/65
ФИГУРА 19
ФИГУРА 19
25/65
25/65
О 20 40 60
ФИГУРА 19В Интенсивность(Х103)
О 20 40 60
ФИГУРА 19В Интенсивность(Х103)
26/65
26/65
0 20 40 60
ФИГУРА 20А Интенсивность(Х103}
0 20 40 60
ФИГУРА 20А Интенсивность(Х103}
27/65
Р1аад2
27/65
Р1аад2
О 20 40 60
ФИГУРА 20В Интенсивностью3}
О 20 40 60
ФИГУРА 20В Интенсивностью3}
27/65
Р1аад2
27/65
Р1аад2
О 20 40 60
ФИГУРА 20В Интенсивностью3}
О 20 40 60
ФИГУРА 20В Интенсивностью3}
28/65
28/65
28/65
28/65
28/65
28/65
28/65
28/65
29/65
29/65
30/65
30/65
31/65
31/65
31/65
31/65
32/65
32/65
33/65
33/65
33/65
33/65
35/65
34/65
ФИГУРА 30
35/65
34/65
ФИГУРА 30
35/65
34/65
ФИГУРА 30
35/65
34/65
ФИГУРА 30
35/65
36/65
ФИГУРА 30
35/65
36/65
ФИГУРА 30
37/65
38/65
ФИГУРА 34
37/65
38/65
ФИГУРА 34
39/65
38/65
ФИГУРА 34
40/65
40/65
ФИГУРА 36
ФИГУРА 36
41/65
41/65
ФИГУРА 37
ФИГУРА 37
41/65
41/65
ФИГУРА 37
ФИГУРА 37
42/65
42/65
ФИГУРА 38
ФИГУРА 38
42/65
42/65
ФИГУРА 38
ФИГУРА 38
42/65
42/65
ФИГУРА 38
ФИГУРА 38
42/65
42/65
ФИГУРА 38
ФИГУРА 38
42/65
42/65
ФИГУРА 38
ФИГУРА 38
42/65
42/65
ФИГУРА 38
ФИГУРА 38
43/65
43/65
ФИГУРА 39
ФИГУРА 39
43/65
43/65
ФИГУРА 39
ФИГУРА 39
43/65
43/65
ФИГУРА 39
ФИГУРА 39
43/65
43/65
ФИГУРА 39
ФИГУРА 39
43/65
43/65
ФИГУРА 39
ФИГУРА 39
43/65
43/65
ФИГУРА 39
ФИГУРА 39
43/65
43/65
ФИГУРА 39
ФИГУРА 39
43/65
43/65
ФИГУРА 39
ФИГУРА 39
44/65
44/65
ФИГУРА 40
ФИГУРА 40
44/65
44/65
ФИГУРА 40
ФИГУРА 40
44/65
44/65
ФИГУРА 40
ФИГУРА 40
45/65
45/65
140
ФИГУРА 41А
140
ФИГУРА 41А
45/65
45/65
140
ФИГУРА 41А
140
ФИГУРА 41А
45/65
45/65
140
ФИГУРА 41А
140
ФИГУРА 41А
46/65
46/65
47/65
47/65
47/65
47/65
47/65
47/65
48/65
48/65
ФИГУРА 43A
ФИГУРА 43A
49/65
49/65
ФИГУРА 43 В
ФИГУРА 43 В
50/65
50/65
ФИГУРА 44
ФИГУРА 44
51/65
51/65
52/65
52/65
ФИГУРА 46
ФИГУРА 46
52/65
52/65
ФИГУРА 46
ФИГУРА 46
52/65
52/65
ФИГУРА 46
ФИГУРА 46
53/65
53/65
ФИГУРА 47
ФИГУРА 47
54/65
54/65
ФИГУРА 48
ФИГУРА 48
55/65
55/65
ФИГУРА 49
ФИГУРА 49
57/65
58/65
ФИГУРА 52В
59/65
58/65
ФИГУРА 52В
59/65
58/65
ФИГУРА 52В
60/65
60/65
ФИГУРА 54
ФИГУРА 54
60/65
60/65
ФИГУРА 54
ФИГУРА 54
61/65
61/65
ФИГУРА 55
ФИГУРА 55
61/65
61/65
ФИГУРА 55
ФИГУРА 55
63/65
62/65
ФИГУРА 56D
63/65
62/65
ФИГУРА 56D
63/65
62/65
ФИГУРА 56D
63/65
62/65
ФИГУРА 56D
63/65
62/65
ФИГУРА 56D
63/65
62/65
ФИГУРА 56D
63/65
64/65
ФИГУРА 56D
63/65
64/65
ФИГУРА 56D
63/65
64/65
ФИГУРА 56D
63/65
64/65
ФИГУРА 56D
63/65
64/65
ФИГУРА 56D
63/65
64/65
ФИГУРА 56D
65/65
65/65
ФИГУРА 59С
ФИГУРА 59С
65/65
65/65
ФИГУРА 59С
ФИГУРА 59С
65/65
65/65
ФИГУРА 59С
ФИГУРА 59С