|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[**] Изобретение относится к отдельному вариабельному домену иммуноглобулина против TGF βRII. Соответственно, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGF βRII по изобретению имеет любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289 или 291, имеющую до 5 замен аминокислот, делеций или инсерций. Изобретение дополнительно относится к полипептиду и фармацевтической композиции для лечения заболевания, связанного с передачей сигнала TGF β, и, соответственно, заболевание выбрано из группы: фиброза ткани, такого как легочный фиброз, включая идиопатический легочный фиброз; фиброза печени, включая цирроз и фиброз при хроническом гепатите; ревматоидного артрита; глазных нарушений; фиброза кожи, включая келоид кожи; контрактуры Дюпюитрена; фиброза почек, такого как фиброз при нефритах и нефросклероз; заживления ран; снижения рубцевания и сосудистого состояния, такого как рестеноз.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к отдельному вариабельному домену иммуноглобулина против TGF βRII. Соответственно, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGF βRII по изобретению имеет любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289 или 291, имеющую до 5 замен аминокислот, делеций или инсерций. Изобретение дополнительно относится к полипептиду и фармацевтической композиции для лечения заболевания, связанного с передачей сигнала TGF β, и, соответственно, заболевание выбрано из группы: фиброза ткани, такого как легочный фиброз, включая идиопатический легочный фиброз; фиброза печени, включая цирроз и фиброз при хроническом гепатите; ревматоидного артрита; глазных нарушений; фиброза кожи, включая келоид кожи; контрактуры Дюпюитрена; фиброза почек, такого как фиброз при нефритах и нефросклероз; заживления ран; снижения рубцевания и сосудистого состояния, такого как рестеноз.
Евразийское (21) 201391012 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2014.01.30
(22) Дата подачи заявки
2012.01.04
(51) Int. Cl. C07K16/28 (2006.01)
(54) ЛИГАНДЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С РЕЦЕПТОРАМИ TGF-БЕТА ТИПА II
(31) 61/430,235
(32) 2011.01.06
(33) US
(86) PCT/EP2012/050061
(87) WO 2012/093125 2012.07.12
(71) Заявитель:
ГЛЭКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB)
(72) Изобретатель:
Битон Эндрю, Димеч Кэролайн, Эртл Питер Франц, Форд Сюзанна Карен, Макадам Рут (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение относится к отдельному вариабельному домену иммуноглобулина против TGFpRII. Соответственно, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению имеет любую аминокислотную последовательность из SEQ ID N0:1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289 или 291, имеющую до 5 замен аминокислот, делеций или инсерций. Изобретение дополнительно относится к полипептиду и фармацевтической композиции для лечения заболевания, связанного с передачей сигнала TGFp, и, соответственно, заболевание выбрано из группы: фиброза ткани, такого как легочный фиброз, включая идиопатический легочный фиброз; фиброза печени, включая цирроз и фиброз при хроническом гепатите; ревматоидного артрита; глазных нарушений; фиброза кожи, вклю- I чая келоид кожи; контрактуры Дюпюитрена; фиб- | роза почек, такого как фиброз при нефритах и неф-росклероз; заживления ран; снижения рубцевания и сосудистого состояния, такого как рестеноз.
2420-197504ЕА/011 ЛИГАНДЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С РЕЦЕПТОРАМИ TGF-БЕТА ТИПА II
Уровень техники
Трансформирующий фактор роста-р (TGF-бета; TGFp (TGF- (3) ) является сигнальной молекулой, опосредующей передачу сигнала в клетки посредством связывания с рецептором TGFp (TGFpR; TGFpR (TGF-pR)). Активность передачи сигнала TGFp регулирует дифференцировку и рост клеток, природа этого эффекта, т.е. функционирование в качестве промотора роста клеток, супрессора роста или индуктора других функций клеток, зависит от типа клеток (см. Roberts, et al. , Transforming growth factor-betas, Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, А.В., Springer-Verlag, Berlin, 1990, p. 419-472) .
TGFp продуцирует широкий спектр типов клеток, и родственные ему рецепторы экспрессируются в широком диапазоне органов и клеток (см., Shi and Massague, Cell, Volume 113, Issue 6, 13 June 2003, Pages 685-700; Biol. Signals., Vol. 5, p.232, 1996 and Pulmonary Fibrosis, Vol. 80 of Lung Biology in Health and Disease Series, ed. by Phan, et al., p.627, Dekker, New York, 1995). Были идентифицированы рецепторы TGFp, классифицируемые на три типа: TGFpRI (TGFpRI) (рецептор TGFp типа I (Franzen et al. , Cell, Vol. 75, No. 4, p. 681, 1993; инвентарный № в GenBank: L11695)); TGFPRII (TGFPRII) (рецептор TGFp типа II (Herbert et al. , Cell, Vol. 68, No. 4, p. 775, 1992; инвентарный № в GenBank: M85079) ) и TGF(3RIII (рецептор TGFp типа III (Lopez-Casillas, Cell, Vol. 67, No. 4, p. 785, 1991; инвентарный № в GenBank: L07594)). Показано, что TGFpRI и TGFpRII необходимы для передачи сигнала TGFp (Laiho et al. , J. Biol. Chem., Vol. 265, p. 18518, 1990 и Laiho et al., J. Biol. Chem., Vol. 266, p. 9108, 1991), в то же время считают, что TGFpRIII не является необходимым.
Передача сигнала TGFp опосредована его связыванием как с TGFpRI, так и с RII. Когда лиганд связывается с внеклеточным лиганд-связывающим доменом, то два рецептора объединяются, позволяя RII фосфорилировать RI и начиная каскад передачи
сигнала через фосфорилирование белков Smad (см. Shi и Massague, как указано выше).
У млекопитающих идентифицированы три изоформы TGFp: TGFpl, TGFp2 и TGFp3. Каждая изоформа является мультифункциональной и действует по механизму саморегулирующейся обратной связи для контроля биодоступности TGFp для процессов развития и поддержания гомеостаза ткани (как описано в ten Dijke and Arthur, Nature Reviews, Molecular Cell Biology, Vol. 8, Nov. 2007, p. 857-869). Уровни TGFp регулируются через экспрессию TGFp, а также посредством связывания с протеогликанами, т.е. внеклеточным матриксом (ЕСМ).
Нарушенная передача сигнала TGFp, например, избыточная передача сигнала TGFp и высокие уровни биодоступного TGFp, вовлечена в ряд патологий, включая фиброзы различных тканей, такие как легочный фиброз и цирроз, хронический гепатит, ревматоидный артрит, глазные нарушения, рестеноз сосудов, келоид кожи и начало нефросклероза.
Таким образом, существует необходимость получения соединений, блокирующих или прерывающих передачу сигнала TGFp конкретным образом, например, посредством связывания с рецептором TGFp типа II. Такие соединения можно использовать в терапевтических средствах.
Сущность изобретения
Изобретение относится к отдельному вариабельному домену иммуноглобулина против TGFpRII. Соответственно, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению является доменом, связывающимся с TGFpRII с равновесной константой диссоциации (KD) в диапазоне от 10 пМ до 50 нМ, необязательно, 10 пМ-10 нМ, необязательно, от 100 пМ до 10 нМ. В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII является доменом, связывающимся с TGFpRII с высокой аффинностью (высокой активностью) и имеющим равновесную константу диссоциации от 10 пМ до 500 пМ. В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII является доменом, связывающимся с TGFpRII с аффинностью (KD)
приблизительно 100 пМ. В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII является доменом, связывающимся с TGFpRII с аффинностью (KD) менее чем 100 пМ. В другом варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII является доменом, связывающимся с TGFpRII с умеренной аффинностью (низкой активностью) и имеющим равновесную константу диссоциации от 500 пМ до 50 нМ, предпочтительно, от 500 пМ до 10 нМ. В другом аспекте изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII. Соответственно, выделенный полипептид связывается с TGFpRII человека. В другом варианте осуществления выделенный полипептид также связывается с TGFpRII, полученным из различных видов, таких как мышь, собака или обезьяны, например, яванский макак (супо). Соответственно, выделенный полипептид связывается с TGFpRII мыши и человека. Такая перекрестная реактивность между TGFpRII людей и других видов позволяет использовать ту же конструкцию антитела в модели заболевания на животных, а также у людей.
В одном из аспектов изобретение относится к отдельному вариабельному домену иммуноглобулина против TGFpRII, имеющему любую аминокислотную последовательность из SEQ ID N0:1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 и 287, и имеющему до 5 изменений аминокислот, где каждое изменение аминокислоты является заменой аминокислоты, делецией или инсерцией, т.е. до 5 замен, делеций или инсерций аминокислот в любой комбинации. В конкретном варианте осуществления замены аминокислот являются консервативными заменами.
В варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII имеет аминокислотную последовательность SEQ ID N0:234 или 279, и содержит до 5 изменений аминокислот, где каждое изменение аминокислоты является заменой аминокислоты, делецией или инсерцией. В конкретном варианте осуществления изменения аминокислот находятся не в CDR3, более конкретно, не в CDR3 и CDR1, или
CDR3 и CDR2, более конкретно, не в какой-либо из CDR. В варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII состоит из любой из следующих последовательностей: SEQ ID N0:1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 и 287. В варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID N0:234 или 236.
Изобретение не включает в себя какую-либо из конкретных
последовательностей отдельного вариабельного домена
иммуноглобулина против TGFpRII, описываемой в W0 2011012609. Во избежание сомнений все без исключения последовательности, описываемые в WO 2011012609, можно исключать из настоящего изобретения. В частности, можно исключать DOM23h-271 (SEQ ID N0:4) и DOM-23h-439 (SEQ ID N0:10), описываемые в WO 2011012609. Можно исключать отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в настоящем описании в SEQ ID N0:199 или 201.
Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению может содержать один или несколько (например, 1, 2, 3, 4 или 5) С-концевых остатков аланина. Альтернативно, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII может содержать С-концевой пептид до 5 аминокислот в длину. В варианте осуществления С-концевой пептид содержит 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот.
Специалисту в данной области будет понятно, как получить
последовательность отдельного вариабельного домена, например, с
любой последовательностью из SEQ ID N0:1-38, 204, 206, 208,
214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275,
277, 279, 281, 283, 285 и 287, последовательности CDR которых
определяют в них с использованием различных способов,
представленных в настоящем описании, например,
последовательности CDR определяют с использованием способа Rabat (1987), Chothia (1989), АЬМ или контактных способов, или комбинации этих способов. Соответственно, последовательности
CDR определяют с использованием способа Rabat, представленного в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления последовательности CDR в каждой последовательности указаны в таблицах 1, 2, 9 и 13.
В одном из аспектов изобретения отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению идентичен на 90% или более 90% аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1-28.
В одном из аспектов изобретения отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:1-28, с 25 или менее изменениями аминокислот. В конкретном варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:1-28, с 20 или менее, 15 или менее, 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, б или менее, или 5 или менее изменениями аминокислот.
В одном из аспектов изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению, в частности, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 и 287, где указанный выделенный полипептид связывается с TGFpRII.
В одном из аспектов изобретение относится к выделенному полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 8 0% идентична по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы: SEQ ID N0:39-66, где указанный выделенный полипептид связывается с TGFpRII.
Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид по любому из аспектов изобретения может содержать любую из следующих аминокислот: R в положении 39, I в
положении 48, D в положении 53, N в положении 61, R в положении 61, К в положении 61, R в положении 64, F в положении 64, D в положении 64, Ев положении 64, Y в положении 64, Н в положении 102 или S в положении 103 отдельного вариабельного домена иммуноглобулина, положения указаны согласно общепринятой нумерации по Rabat. В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или полипептид содержит комбинацию этих аминокислот. В другом варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или полипептид содержит аминокислоты N в положении 61 и R в положении 64. В другом варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или полипептид содержит аминокислоты R или К в положении 61. В варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII содержит I в положении 4 8 в дополнение к любому из указанных выше остатков в положении 61 и/или 64. В этих вариантах осуществления нумерация аминокислот является такой, как в отдельном вариабельном домене иммуноглобулина, например, как в последовательностях SEQ ID N0:1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 и 287.
Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид по любому из аспектов изобретения может содержать одну из следующих комбинаций аминокислот, выбранных из группы: N в положении 61 и R в положении 64; R в положении 61 и Е в положении 64; R в положении 61 и М в положении 64; R в положении 61 и F в положении 64; R в положении 61 и Y в положении 64; и R в положении 61 и D в положении 64 отдельного вариабельного домена иммуноглобулина. В варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII содержит I в положении 4 8 в дополнение к любой из указанных выше комбинаций остатков в положениях 61 и 64.
В другом аспекте изобретение относится к лиганду или связывающему фрагменту, имеющему специфичность связывания для TGFpRII и ингибирующему связывание отдельного вариабельного домена иммуноглобулина против TGFpRII, содержащего
аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID N0:1-28, с TGFpRII.
В дополнительном аспекте изобретение относится к слитому
белку, содержащему отдельный вариабельный домен
иммуноглобулина, полипептид или лиганд по любому из аспектов изобретения.
В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, полипептид, лиганд или слитый белок по изобретению нейтрализует активность TGFp. Соответственно, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или полипептид по изобретению ингибирует связывание TGFp с TGFpRII. В другом варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или полипептид по изобретению ингибирует активность передачи сигнала TGFp через TGFpRII. В другом варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или полипептид по изобретению супрессирует активность TGFp, в частности, активность TGFp в отношении роста клеток и/или фиброгенную активность. Соответственно, TGFpRII является TGFpRII человека.
В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, полипептид, лиганд или слитый белок по изобретению лишен агонистической активности TGFpRII в концентрации 15 мкмоль (мкМ).
В другом аспекте изобретение относится к отдельному
вариабельному домену иммуноглобулина, полипептиду, лиганду или
слитому белку по любому из аспектов изобретения, дополнительно
содержащему фрагмент, повышающий время полужизни.
Соответственно, фрагмент, повышающий время полужизни, является остатком полиэтиленгликоля, сывороточным альбумином или его фрагментом, трансферриновым рецептором или его трансферрин-связывающей частью, или антителом или фрагментом антитела, содержащим участок связывания полипептида, повышающего время полужизни in vivo. В одном из вариантов осуществления фрагмент, повышающий время полужизни, является антителом или фрагментом антитела, содержащим участок связывания сывороточного альбумина или неонатального Fc-рецептора. В другом варианте осуществления
фрагмент, повышающий время полужизни, является dAb, антителом или фрагментом антитела.
В другом аспекте изобретение относится к выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, содержащий отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, полипептид, лиганд или слитый белок по любому из аспектов изобретения.
В одном из вариантов осуществления выделенная или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы любых из молекул нуклеиновой кислоты, имеющих последовательности SEQ ID N0:39-76, 203, 205, 207, 212, 233, 235, 237, 239, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, или состоит из нее.
В одном из аспектов изобретение относится к выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоте, где нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична нуклеотидной последовательности любой из молекул нуклеиновой кислоты, имеющих последовательности SEQ ID N0:39-66, и где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, содержащий отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, специфически связывающийся с TGFpRII.
В другом аспекте изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту по изобретению.
В дополнительном аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор по изобретению. В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения полипептида, содержащего отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, или полипептид, или лиганд, или слитый белок по изобретению, включающему поддержание клетки-хозяина по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты или вектора при условии, что получают полипептид, содержащий отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, полипептид, или лиганд, или слитый белок. Необязательно, способ дополнительно включает этап выделения полипептида и,
необязательно, получения варианта, например, мутантного варианта, имеющего улучшенную аффинность (Ко!) или ЕС50 для нейтрализации TGFp в стандартном анализе по сравнению с выделенным полипептидом. Подходящие анализы для определения активности TGFp, такие как анализ клеток с использованием сенсоров, представлены в настоящем описании, например, в разделе "Примеры".
В одном из аспектов изобретения отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, полипептид, или лиганд, или слитый белок по изобретению предназначен для применения в качестве лекарственного средства. Таким образом, изобретение относится к композиции, содержащей отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, полипептид, или лиганд, или слитый белок по изобретению, для применения в качестве лекарственного средства.
В одном из аспектов изобретение относится к применению отдельного вариабельного домена иммуноглобулина против TGFpRII, полипептида, или лиганда, или слитого белка по изобретению для получения лекарственного средства, в частности, для лечения заболевания, связанного с передачей сигнала TGFp.
Соответственно, отдельный вариабельный домен
иммуноглобулина против TGFpRII, полипептид, или лиганд, или слитый белок, или композиция по изобретению предназначены для лечения заболевания, связанного с передачей сигнала TGFp. Соответственно, заболевание является фиброзом ткани, таким как легочный фиброз, включая идиопатический легочный фиброз, фиброзом печени, включая цирроз и фиброз при хроническом гепатите, ревматоидным артритом, глазными нарушениями, или фиброзом кожи, включая келоид кожи, контрактурой Дюпюитрена, и фиброзом почек, таким как фиброз при нефритах и нефросклероз, или сосудистым состоянием, таким как рестеноз. Другие заболевания, связанные с передачей сигнала TGFp, включают сосудистые заболевания, такие как гипертония, преэклампсия, наследственная геморрагическая телеангиэктазия типа I (ННТ1), ННТ2, легочная артериальная гипертензия, аневризмы аорты, синдром Марфана, семейные формы аневризмы аорты, синдром
Лойеса-Дитца, синдром патологической извитости артерий (ATS). Другие заболевания, связанные с передачей сигнала TGFp, включают заболевания опорно-двигательного аппарата, такие как миодистрофия Дюшена и фиброз мышц. Дополнительные заболевания, связанные с передачей сигнала TGFp, включают злокачественные новообразования, такие как рак толстого кишечника, рак желудка и рак поджелудочной железы, а также глиому и NSCLC. Кроме того, изобретение относится к способам воздействия на злокачественное новообразование посредством модуляции передачи сигнала TGFp при ангиогенезе в опухоли. Другие заболевания или состояния включают те, которые относятся к рубцеванию ткани. Другие заболевания включают легочные заболевания, такие как COPD (хроническая обструктивная болезнь легких). Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, полипептид, или лиганд, или слитый белок или композицию по изобретению можно использовать в заживлении ран и/или профилактике или улучшении образования рубцов. В одном из аспектов изобретение относится к отдельному вариабельному домену против TGFpRII, лиганду или антагонисту, композиции или слитому белку для внутрикожной доставки. В одном из аспектов изобретение относится к отдельному вариабельному домену против TGFpRII, лиганду или антагонисту, или слитому белку для доставки в кожу пациента. В одном из аспектов изобретение относится к применению отдельного вариабельного домена против TGFpRII, лиганда, или антагониста, или слитого белка для получения лекарственного средства для внутрикожной доставки. В одном из аспектов изобретение относится к применению отдельного вариабельного домена против TGFpRII, или антагониста или слитого белка по изобретению для получения лекарственного средства для доставки в кожу пациента.
В одном из вариантов осуществления вариабельный домен является, по-существу, мономерным. В конкретном варианте осуществления вариабельный домен является на б5%-98% мономерным в растворе, что определяют с помощью SEC-MALLS. В другом варианте осуществления вариабельный домен является на б5%-100%, 70%-100%, 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100%
мономерным в растворе, что определяют с помощью SEC-MALLS.
В другом варианте осуществления вариабельный домен, лиганд, слитый белок или полипептид, представленный в настоящем описании, в частности, в фармацевтической композиции не содержит любую, или комбинацию, или все из следующих посттрансляционных модификаций: деамидирование, окисление или гликозилирование. В конкретном варианте осуществления вариабельный домен, лиганд, слитый белок или полипептид по изобретению не деамидирован.
Соответственно, композиция предназначена для терапии или профилактики опосредованного TGFp состояния у человека.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к dAb против TGFpRII для лечения фиброза кожи, в частности, келоидной болезни, или контрактуры Дюпюитрена. Соответственно, dAb против TGFpRII предоставляют в качестве, по-существу, мономерного dAb для внутрикожной доставки, предпочтительно, без любой метки (т.е. немеченым), такой как туе или другая метка для очистки.
В одном из аспектов композиция является фармацевтической композицией и дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения и/или профилактики опосредованного TGFp состояния у пациента-человека, включающему введение пациенту композиции, содержащей отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, полипептид или лиганд по изобретению.
В дополнительном аспекте изобретение относится к устройству для внутрикожной доставки, содержащему композицию по изобретению. Соответственно, такое устройство является микроиглой или набором микроигл.
В дополнительном аспекте изобретение относится к набору, содержащему отдельный вариабельный домен против TGFpRII или полипептид, представленный в настоящем описании, и устройство, такое как устройство для внутрикожной доставки, для введения указанного отдельного вариабельного домена или полипептида в кожу.
Подробное описание
Изобретение представлено со ссылкой на варианты осуществления таким образом, который позволяет четко и кратко изложить описание. Следует понимать, что варианты осуществления можно комбинировать или разделять различным образом без отклонения от сущности изобретения.
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают значением, общепринято понимаемым специалистами в этой области (например, в культивировании клеток, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, способах гибридизации и биохимии). Для молекулярных, генетических и биохимических способов (см., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel, et al. , Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc., которые включены в настоящее описание в качестве ссылки) и химических способов использовали стандартные техники.
Иммуноглобулин: Как используют в настоящем описании, термин "иммуноглобулин" относится к семейству полипептидов, сохраняющих свойство молекул антител сворачиваться как иммуноглобулины, содержащих два р-листа и, как правило, консервативную дисульфидную связь.
Домен: Как используют в настоящем описании, термин "домен" относится к структуре свернутого белка, сохраняющей свою третичную структуру независимо от остальной части белка. Как правило, домены отвечают за отдельные функциональные свойства белков, и во многих случаях их можно добавлять, удалять или переносить в другие белки без потери функции остальной части белка и/или домена. Отдельный вариабельный домен антитела или отдельный вариабельный домен иммуноглобулина означает домен свернутого полипептида, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антитела. Таким образом, он включает полные вариабельные домены антитела и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одну или несколько петель замещают последовательностями, не
характерными для вариабельных доменов антител, или укороченные, или содержащие N- или С-концевые удлинения вариабельные домены антитела, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, сохраняющих по меньшей мере частично активность и специфичность связывания полноразмерного домена.
Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина: Фраза "отдельный вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH/ Vl) ИЛИ связывающему домену, специфически связывающемуся с антигеном или эпитопом, независимо от отличающихся или других V-областей или доменов, т.е. являющемуся моновалентным. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может присутствовать в формате (например, гомо-или гетеро-мультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не являются необходимыми для связывания антигена с отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина (т.е. где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). Как используют в настоящем описании, термин "доменное антитело" или "dAb" означает "отдельный вариабельный домен иммуноглобулина". Как используют в настоящем описании термин "отдельный вариабельный домен антитела" означает то же, что и "отдельный вариабельный домен иммуноглобулина". В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина является вариабельным доменом антитела человека, но также включает отдельные вариабельные домены антител других видов, таких как VHH dAb грызунов (например, как описывают в W0 00/29004, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), усатой акулы-няньки и видов семейства Верблюдовых. VHH ВИДОВ семейства Верблюдовых представляют собой полипептиды отдельного вариабельного домена иммуноглобулина, получаемых из видов, включающих верблюда, ламу, альпака, дромадера и гуанако, в природе продуцирующих тяжелую цепь антитела без легких цепей. VHH МОЖНО гуманизировать.
Во всех аспектах изобретения отдельный вариабельный домен
иммуноглобулина независимо выбран из отдельных вариабельных доменов тяжелой цепи и легкой цепи антитела, например, VH, VL и VHH.
Как используют в настоящем описании, термин "антитело" относится к IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, или фрагменту (такому как Fab, F(ab')2/ Fv, Fv с дисульфидной связью, scFv, полиспецифическое антитело с закрытой конформацией, scFv с дисульфидной связью, диатело), полученному из любых видов, продуцирующих антитело в природе, или полученному технологией рекомбинантных ДНК, выделенному, например, из сыворотки, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий.
Формат антитела: В одном из вариантов осуществления
отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, полипептид или
лиганд по изобретению можно предоставлять в любом формате
антитела. Как используют в настоящем описании, "формат
антитела" относится к любой подходящей структуре полипептида, в
которую можно включать один или несколько вариабельных доменов
антитела таким образом, придавая специфичность связывания для
антигена на структуре. В этой области известно множество
подходящих форматов антител, таких как химерные антитела,
гуманизированные антитела, антитела человека, одноцепочечные
антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител,
легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей
и/или легких цепей антител, антигенсвязывающие фрагменты любых
из указанных выше (например, Fv-фрагмент (например,
одноцепочечный Fv (scFv), Fv с дисульфидной связью), Fab-
фрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2~Фрагмент), отдельный
вариабельный домен антитела (например, dAb, VH, VHH/ Vl) И модифицированные версии любых из указанных выше (например, модифицированные ковалентным присоединением полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера, или гуманизированные VHH) • В одном из вариантов осуществления альтернативные форматы антител включают альтернативные каркасы, в которых CDR любых молекул по изобретению можно пересаживать на подходящий белковый каркас или остов, такой как аффитело, каркас SpA, домен LDL рецептора класса А, авимер (см., например, публикации патентных заявок
США №№ 2005/0053973, 2 0 05/0089932, 2005/0164301) или домен EGF. Кроме того, лиганд может быть бивалентным (гетеробивалентным) или поливалентным (гетерополивалентным) , как представлено в настоящем описании. В других вариантах осуществления можно использовать "универсальный каркас", где "универсальный каркас" относится к отдельной последовательности каркаса антитела, соответствующей областям антитела, консервативным по последовательности, как определяют по Rabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services), или соответствующей репертуару иммуноглобулинов зародышевой линии человека или структуре, определяемой по Chothia и Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910917. Изобретение относится к применению отдельного каркаса или набора таких каркасов, которые, как обнаруживают, позволяют получать практически любую специфичность связывания исключительно посредством вариаций гипервариабельных областей.
В вариантах осуществления изобретения, представленных на всем протяжении этого описания предполагают, что вместо использования "dAb" против TGFpRII в пептиде или лиганде по изобретению специалист в этой области может использовать полипептид или домен, содержащий одну, или несколько или все 3 из CDR dAb по изобретению, связывающихся с TGFpRII (например, CDR, пересаженные на подходящий белковый каркас или остов, например аффитело, каркас SpA, домен рецептора LDL класса А или домен EGF) . Описание, в целом, необходимо интерпретировать как описание полипептидов, в которых вместо dAb используют такие домены. В связи с этим, см. WO2008096158, описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII является любым подходящим вариабельным доменом иммуноглобулина и, необязательно, вариабельным доменом человека или вариабельным доменом, содержащим каркасную область человека или полученным из нее (например, каркасные области DP4 7 или DPK9).
Антиген: Как используют в настоящем описании, термин "антиген" представляет собой молекулу, связываемую связывающим
доменом по настоящему изобретению. Как правило, антигены связываются лигандами-антителами и способны вызывать гуморальный ответ in vivo. Он может быть, например, полипептидом, белком, нуклеиновой кислотой или другой молекулой.
Эпитоп: "Эпитоп" является единицей структуры, обычно связываемой иммуноглобулиновой парой VH/VL. Эпитопы означают минимальный участок связывания для антитела и, таким образом, представляют собой мишень специфичности антитела. В случае однодоменного антитела эпитоп представляет собой единицу структуры, связываемую вариабельным доменом в отдельности.
Связывание: Как правило, специфическое связывание указывают посредством константы диссоциации (Ко!) 50 наномоль или менее, необязательно, 250 пикомоль или менее. Специфическое связывание антигенсвязывающего белка с антигеном или эпитопом можно определять с помощью соответствующего анализа, включая, например, анализ Скэтчарда и/или анализы конкурентного связывания, такие как радиоиммунологический анализ (RIA), ферментативные иммунологические анализы, такие как ELISA и конкурентные сэндвич-анализы, и различные их варианты.
Аффинность связывания: Аффинность связывания,
необязательно, определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и BIACORE(tm) (Karlsson et al. , 1991) с использованием системы BIACORE(tm) (Uppsala, Sweden). В системе BIACORE(tm) используют поверхностный плазмонный резонанс (SPR, Welford К. 1991, Opt. Quant. Elect. 23: 1; Morton and Myszka, 1998, Methods in Enzymology 295: 268) для контроля биомолекулярных взаимодействий в реальном времени и определения изменения резонансного угла падения света на поверхность тонкой пленки золота на стеклянной подложке в результате изменений показателя преломления поверхности на расстоянии до 300 нм. Общепринято, в анализе BIACORE(tm) получают константы скорости ассоциации, константы скорости диссоциации, равновесные константы диссоциации и константы равновесия. Аффинность связывания определяют с помощью оценки констант скорости ассоциации и диссоциации с использованием системы
поверхностного плазмонного резонанса BIACORE(tm) (BIACORE(tm), Inc.).
Биосенсорный чип активируют для ковалентного присоединения
мишени по инструкциям производителя (BIACORE(tm)). Затем мишень
разбавляют и инъецируют на чип для получения сигнала в
резонансных единицах иммобилизованного материала. Т.к. сигнал в
резонансных единицах (RU) пропорционален массе
иммобилизованного материала, он представляет собой диапазон плотностей иммобилизованного материала на матрице. Данные о диссоциации аппроксимируют для модели одного участка для получения k0ff +/- s.d. (стандартное отклонение измерений). Константу скорости реакции псевдопервого порядка (Kd) вычисляют для каждой кривой ассоциации и строят ее график как функции концентрации белка для получения kon +/- s.e. (стандартная ошибка аппроксимации). Равновесные константы диссоциации для связывания Kd вычисляют из измерений SPR как koff/kon.
В другом аспекте изобретение относится к отдельному вариабельному домену иммуноглобулина против TGFpRII, специфически связывающемуся с TGFpRII человека. В одном из вариантов осуществления вариабельный домен связывается с TGFpRII человека с равновесной константой диссоциации (KD) приблизительно 50 нМ, 4 0 нМ, 3 0 нМ, 2 0 нМ, 10 нМ или менее, необязательно, приблизительно 9, 8, 7, б или 5 нМ или менее, необязательно, приблизительно 4 нМ или менее, приблизительно 3 нМ или менее, или приблизительно 2 нМ или менее, или приблизительно 1 нМ или менее, необязательно, приблизительно 500 пМ или менее. Соответственно, если вариабельный домен имеет равновесную константу диссоциации в диапазоне приблизительно от 50 нМ до 500 пМ, он особенно подходит для местного введения в интересующую ткань, такую как легкое. В этом варианте осуществления такое связывающее средство с "умеренной аффинностью" в высокой концентрации можно считать эффективным терапевтическим средством. В другом варианте осуществления вариабельный домен связывается с TGFpRII человека с равновесной константой диссоциации (KD) приблизительно 500 пМ или менее, необязательно приблизительно 450 пМ, 400 пМ, 350 пМ, 300 пМ, 250 пМ, 200 пМ, 150 пМ, 100 пМ, 50 пМ или менее, необязательно,
приблизительно 4 0 пМ, 3 0 пМ, 2 0 пМ, 10 пМ или менее. Соответственно, если вариабельный домен имеет константу диссоциации в диапазоне от приблизительно 500 пМ до 10 пМ, он особенно подходит для системного введения таким образом, что количество в любой интересующей ткани является достаточным для проведения эффективной терапии. В этом варианте осуществления такое связывающее средство с "высокой аффинностью" в низкой концентрации можно представлять как эффективное терапевтическое средство.
В одном из вариантов осуществления отдельные вариабельные домены по настоящему изобретению демонстрируют перекрестную реактивность между TGFpRII человека и TGFpRII других видов, таким как TGFpRII мыши. В этом варианте осуществления вариабельные домены специфически связываются с TGFpRII человека и мыши. Это особенно полезно, т.к. разработка лекарственных средств, как правило, требует тестирования основных лекарственных средств-кандидатов в системах на основе мышей до тестирования лекарственных средств на людях. Получение лекарственного средства, которое может связываться с молекулами человека и мыши, позволяет тестировать результаты в этих системах и осуществлять наглядные сравнения данных с использованием того же лекарственного средства. Это позволяет избегать трудностей, связанных с необходимостью поиска лекарственного средства, действующего против TGFpRII мыши, и отделения лекарственного средства, действующего против TGFpRII человека, а также позволяет избегать необходимости сравнения результатов у людей и мышей с использованием неидентичных лекарственных средств. Также рассматривают перекрестную реактивность между другими видами, используемыми в моделях заболевания, такими как собака или обезьяна, такая как яванский макак.
Необязательно, аффинность связывания отдельного
вариабельного домена иммуноглобулина по меньшей мере для TGFpRII мыши и аффинность связывания для TGFpRII человека отличается не более чем в 10, 50 или 100 раз.
CDR: Отдельные вариабельные домены иммуноглобулина (dAb),
представленные в настоящем описании, содержат определяющие комплементарность области (CDR1, CDR2 и CDR3). Локализацию CDR и каркасных (FR) областей и систему нумерации определяли по Rabat et al. (Rabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)) . Аминокислотные последовательности CDR (CDR1, CDR2, CDR3) VH (CDRH1 и т.д.) и VL (CDRL1 и т.д.) (VK) dAb, представленных в настоящем описании, будут очевидны специалисту в этой области на основе хорошо известной системы нумерации аминокислот по Rabat и определения CDR. Согласно системе нумерации по Rabat наиболее общеупотребительный способ основывается на вариабельности последовательности, CDR-H3 тяжелой цепи имеет различную длину, инсерции нумеруют между остатком Н100 и Н101 с использованием букв до R (т.е. Н100, H100A...H100R, Н101) . Альтернативно, CDR можно определять с использованием системы Chothia (на основе локализации областей структурной петли) (Chothia et al. , (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883), no AbM (компромисс между системами нумерации по Rabat и по Chothia) или контактным способом (на основе кристаллических структур и предсказания остатков, контактирующих с антигеном) следующим образом. Подходящие способы определения CDR см. на http://www.bioinf.org.uk/abs/.
Когда пронумерован каждый остаток, можно использовать следующие определения CDR:
Rabat:
CDR HI:
31-
35/35A/35B
CDR H2:
50-
CDR НЗ:
95-
102
CDR LI:
24-
CDR L2:
50-
CDR L3:
89-
Chothia
CDR HI:
26-
CDR H2:
52-
Таким образом, специалист в этой области может делать выводы из указанной последовательности отдельного вариабельного домена, например, содержащего любую последовательность из SEQ ID N0:1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285 и 287, содержащую последовательности CDR, с использованием различных способов, приведенных в настоящем описании. Например, для указанной последовательности отдельного вариабельного домена, например, SEQ ID N0:1, специалист в этой области может определять содержащиеся в ней последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 с использованием любого из указанных выше способов определения CDR или их комбинации. При использовании
определения CDR по Rabat специалист в этой области может
определять, что последовательности CDR1, CDR2 и CDR 3 являются
последовательностями SEQ ID N0:77, 113 и 149, соответственно.
Соответственно, последовательности CDR определяют с
использованием способа по Rabat, представленного в настоящем
описании. В одном из вариантов осуществления последовательности
CDR в каждой последовательности являются последовательностями,
указанными в таблицах 1, 2, 9 и 13. В варианте осуществления
последовательность CDR1 является последовательностью CDR1,
выбранной из SEQ ID N0:77-112, 241, 244, 247 и 250. В варианте
осуществления последовательность CDR2 является
последовательностью CDR2, выбранной из SEQ ID N0:113-148, 242, 245, 248 и 251. В варианте осуществления последовательность CDR3 является последовательностью CDR3, выбранной из SEQ ID N0:149-184, 243, 246, 249 и 252.
Вариант CDR или вариант связывающей единицы включает
аминокислотную последовательность, модифицированную по меньшей
мере на одну аминокислоту, где указанная модификация может быть
химическим или частичным изменением аминокислотной
последовательности (например, не более чем на 10 аминокислот) ,
где модификация позволяет получать вариант с сохранением
биологических характеристик немодифицированной
последовательности. Например, вариант является функциональным вариантом, специфически связывающимся с TGFpRII. Частичное изменение аминокислотной последовательности CDR может быть делецией или заменой от одной до нескольких аминокислот, или добавлением или инсерцией от одной до нескольких аминокислот или их комбинацией (например, не более чем на 10 аминокислот). Вариант CDR или вариант связывающей единицы может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или б замен аминокислот, инсерций или делеций в аминокислотной последовательности в любой комбинации. Вариант CDR или вариант связывающей единицы может содержать 1, 2 или 3 замены аминокислот, инсерций или делеций в аминокислотной последовательности в любой комбинации. Замены аминокислотных остатков могут быть консервативными заменами, например, заменой одной гидрофобной аминокислоты альтернативной гидрофобной
аминокислотой. Например, лейцин можно заменять валином или изолейцином.
TGFpRII: Как используют в настоящем описании, "TGFpRII"
(рецептор трансформирующего фактора роста бета типа II;
TGFpRII) относится к природным или эндогенным белкам TGFpRII
млекопитающего и белкам, имеющим аминокислотную
последовательность, являющуюся той же, что и у соответствующего природного или эндогенного белка TGFpRII млекопитающего (например, рекомбинантным белкам, синтетическим белкам (т.е. получаемым с использованием способов синтетической органической химии)). Таким образом, как определено в настоящем описании, термин включает зрелый белок TGFpRII, полиморфные или аллельные варианты и другие изоформы TGFpRII и модифицированные или немодифицированные формы указанного выше (например, липидированные, гликозилированные). Природный или эндогенный TGFpRII включает белки дикого типа, такие как зрелый TGFpRII, полиморфные или аллельные варианты, и другие изоформы и мутантные формы, существующие в природе у млекопитающих (например, людей, не являющихся человеком приматов). Такие белки можно выделять, например, из источника, в природе экспрессирующего TGFpRII. Эти белки и белки, имеющие ту же аминокислотную последовательность, что и соответствующий природный или эндогенный TGFpRII, обозначают по названию соответствующего млекопитающего. Например, если соответствующим млекопитающим является человек, белок обозначают как TGFpRII человека. TGFpRII человека описывают, например, в Lin, et al. , Cell. 1992, Vol. 68(4), p.775-785, и в GenBank под инвентарным номером М85079.
TGFpRII человека является трансмембранным рецептором, состоящим из 5 67 аминокислот с внеклеточным доменом из приблизительно 159 аминокислот, трансмембранным доменом и цитоплазматическим доменом, содержащим протеинкиназный домен для передачи сигнала.
Как используют в настоящем описании, "TGFpRII" также включает часть или фрагмент TGFpRII. В одном из вариантов осуществления такая часть или фрагмент включает внеклеточный
домен TGFpRII или его часть.
"Против TGFpRII" со ссылкой на отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, полипептид, лиганд, слитый белок и т.д. означает фрагмент, распознающий и связывающийся с TGFpRII. В одном из вариантов осуществления молекула "против TGFpRII" специфически распознает и/или специфически связывается с белком TGFpRII, и, соответственно, TGFpRII человека. В другом варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению также связывается с TGFpRII мыши
(инвентарный номер Genbank NM_029575; описываемый, например, в Massague et al., Cell, 69 (7), 1067-1070 (1992)).
"TGFP" включает изоформы, такие как TGFp1, TGFP2 и TGFP3. TGFP связывается с TGFPRII и в комплексе с TGFPRI инициирует передачу сигнала. Таким образом, активность TGFp и ингибирование или нейтрализацию активности TGFp можно определять с помощью любого анализа, в котором измеряют продукт передачи сигнала TGFp. Обзор по теме передачи сигнала TGFp представлен, например, в Itoh, et al. , Eur. J. Biochem 2000, Vol. 267, p.6954; Dennler, et al. , Journal of Leucocyte Biol. 2002, 71(5), p. 731-40. Таким образом, активность TGFp можно тестировать с помощью ряда различных анализов, известных специалисту в этой области. "Ингибирование" или "нейтрализация" означает, что в присутствие отдельного вариабельного домена иммуноглобулина по настоящему изобретению биологическую активность TGFp снижают полностью или частично относительно активности TGFp в отсутствие такого отдельного вариабельного домена иммуноглобулин.
В одном из вариантов осуществления ингибирование или нейтрализацию активности TGFp тестируют с помощью анализа высвобождения ИЛ-11. В этом варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина по изобретению тестируют на его способность ингибировать стимулированное TGFpl человека
(TGF-6eTal; TGF-pl) высвобождение ИЛ-11 из клеток, таких как клетки А549. TGFpl (TGF-pl) связывается непосредственно с TGFPRII (TGF-pRII) и индуцирует сборку комплекса TGFpRI/RII
(TGF-pRI/II). TGFPRI (TGF-pRI) фосфорилирован и способен
передавать сигнал через несколько путей, включая путь Smad 4. Активация пути Smad 4 приводит к высвобождению ИЛ-11. ИЛ-11 секретируется в супернатант клеток, и затем его измеряют с помощью колориметрического ELISA. В настоящем описании представлены подходящие анализы высвобождения ИЛ-11, такие как анализ с помощью набора Human ИЛ-11 Quantikine ELISA assay kit, поставляемый R &D systems (ref. D1100).
В другом варианте осуществления активность TGFp тестируют с помощью анализа на способность отдельного вариабельного домена иммуноглобулина по изобретению ингибировать индуцируемую TGFp экспрессию CAGA-люциферазы в клетках МСЗТЗ-Е1 в люциферазном анализе МСЗТЗ-Е1. В промоторе PAI-1 человека присутствуют три копии TGFp-чувствительных мотива, называемых CAGA box, и специфически связываются с белками Smad3 и 4. Клонирование многочисленных копий CAGA box в люциферазную репортерную конструкцию придает чувствительность к TGFp клеткам, трансфицированным с использованием репортерной системы. В одном из соответствующих анализов, представленных в настоящем описании, используют клетки МСЗТЗ-Е1 (остеобласты мыши), стабильно трансфицированные с использованием [CAGA] 12-люциферазной репортерной конструкции (Dennler, et al., (1998) EMBO J. 17, 3091-3100).
Другие подходящие анализы включают анализ клеток с использованием бета-лактамазы и SBE человека (INVITROGEN(r), анализ клеток с использованием сенсоров). Примеры соответствующих анализов представлены в настоящем описании.
Соответственно, отдельный вариабельный домен
иммуноглобулина, полипептид, лиганд или слитый белок по изобретению сам по себе не активирует передачу сигнала через рецептор TGFpRII. Таким образом, в одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, полипептид, лиганд или слитый белок по изобретению лишен агонистической активности при концентрации 10 мкМ. Агонистическую активность можно определять тестированием интересующего соединения с помощью анализа TGFpRII, как представлено в настоящем описании, в отсутствие TGFp. Если TGFp
отсутствует, агонистическую активность интересующего соединения будут определять посредством определения передачи сигнала через TGFpRII.
Гомология: Последовательности, схожие или гомологичные
(например, с идентичностью последовательности по меньшей мере
приблизительно 7 0%) последовательностям, представленным в
настоящем описании, также являются частью изобретения. В
некоторых вариантах осуществления идентичность
последовательности на уровне аминокислот может составлять приблизительно 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше. На уровне нуклеиновой кислоты идентичность последовательности может составлять приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше. Альтернативно, фактическая идентичность существует, когда сегменты нуклеиновой кислоты будут гибридизоваться с комплементарной цепью в избирательных условиях гибридизации (например, очень жестких условиях гибридизации). Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в лизатах клеток или в частично очищенной или, по-существу, чистой форме.
Как используют в настоящем описании, термины условия "пониженной жесткости", "средней жесткости", "высокой жесткости" или "очень высокой жесткости" означают условия гибридизации и промывания нуклеиновых кислот. Руководство по осуществлению реакций гибридизации можно найти в Current Protocols in Molecular biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В этом источнике описывают водные и неводные способы, и можно использовать любой. Конкретные условия гибридизации, приведенные в настоящем описании, являются следующими: (1) гибридизацию в условиях пониженной жесткости проводят в б-кратном хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при приблизительно 45°С с двумя последующими промывками 0,2-кратным SSC, 0,1% SDS, по меньшей мере при 50°С (для условий пониженной жесткости температуру промывок можно повышать до 55°С); (2) гибридизацию в условиях средней жесткости проводят в б-кратном
SSC при приблизительно 45°С с последующей одной или несколькими промывками в 0,2-кратном SSC, 0,1% SDS при 60°С; (3) гибридизацию в условиях высокой жесткости проводят в б-кратном SSC при приблизительно 45°С с последующей одной или несколькими промывками в 0,2-кратном SSC, 0,1% SDS при 65°С; и необязательно (4) условиями гибридизации очень высокой жесткости являются 0,5 М фосфат натрия, 7% SDS при 65°С с последующей одной или несколькими промывками в 0,2-кратном SSC, 1% SDS при 65°С. Условия с очень высокой жесткостью (4) являются предпочтительными условиями, и необходимо использовать их, если не указано иначе.
Вычисления "гомологии", или "идентичности
последовательности", или "схожести" между двумя
последовательностями (в настоящем описании термины используют
взаимозаменяемо) осуществляют следующим образом.
Последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения
(например, можно включать пропуски в одну или обе первую и вторую аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания, и в целях сравнения можно исключать негомологичные последовательности). В одном из вариантов осуществления длина референсной последовательности, выровненной в целях сравнения, составляет по меньшей мере приблизительно 30%, необязательно, по меньшей мере приблизительно 40%, необязательно, по меньшей мере приблизительно 50%, необязательно, по меньшей мере приблизительно 60%, и необязательно, по меньшей мере приблизительно 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% длины референсной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и в соответствующем положении во второй последовательности, то молекулы идентичны в этих положениях
(как используют в настоящем описании, "гомология" аминокислот или нуклеиновых кислот эквивалентна "идентичности" аминокислот
или нуклеиновых кислот) . Процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей, с учетом количества пропусков и длины каждого пропуска, который необходимо включать для оптимального выравнивания двух последовательностей.
Выравнивание и гомологию, схожесть или идентичность аминокислотных последовательностей и последовательностей нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем описании, необязательно, получают и определяют с использованием алгоритма BLAST 2 Sequences с использованием параметров по умолчанию
(Tatusova, Т. A. et al. , FEMS Microbiol Lett, 174: 187-188
(1999)) . Альтернативно, алгоритм BLAST (версии 2.0) используют для выравнивания последовательностей с использованием параметров, установленных на значения по умолчанию. BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool) представляет собой эвристический алгоритм поиска, используемый в программном обеспечении blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx; это программное обеспечение приписывает значимость их результатам с использованием статистических способов Karlin и Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6): 2264-8.
Лиганд: Как используют в настоящем описании, термин "лиганд" относится к соединению, содержащему по меньшей мере один пептид, полипептид или фрагмент белка, имеющий участок связывания со специфичностью связывания TGFpRII. Лиганд также можно обозначать как "связывающий фрагмент".
Лиганды или связывающие фрагменты по изобретению, необязательно, содержат вариабельные домены иммуноглобулина с разной специфичностью связывания и не содержат пары вариабельных доменов, совместно образующих участок связывания для соединения-мишени (т.е. не содержат вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, совместно образующих участок связывания для TGFpRII). Необязательно, каждый домен, имеющий участок связывания, обладающий специфичностью связывания для мишени, является отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина
(например, отдельным вариабельным доменом тяжелой цепи
иммуноглобулина (например, VH, VHH) г отдельным вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина (например, VL) ) , имеющим специфичность связывания для желаемой мишени (например, TGFpRII).
Таким образом, "лиганды" включают полипептиды, содержащие два или более отдельных вариабельных домена иммуноглобулина, где каждый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина связывается с разной мишенью. Лиганды также включают полипептиды, содержащие по меньшей мере два отдельных вариабельных домена иммуноглобулина или последовательности CDR отдельных вариабельных доменов, связывающих различные мишени в подходящем формате, таком как формат антитела (например, IgG-подобный формат, scFv, Fab, Fab', F(ab)'2), или подходящий белковый каркас или остов, такой как аффитело, каркас SpA, домен рецептора LDL класса А, домен EGF, авимер, и лиганды с двойной и полиспецифичностью, как представлено в настоящем описании.
Домен полипептида, имеющий участок связывания, обладающий
специфичностью связывания мишени (например, TGFpRII), также
может быть доменом белка, содержащим участок связывания
желаемой мишени, например, домен белка выбран из аффитела,
домена SpA, домена рецептора LDL класса А, авимера (см.,
например, публикации патентных заявок США №№ 2005/0053973,
2005/0089932, 2 0 05/0164301). При желании, "лиганд"
дополнительно может содержать один или несколько дополнительных фрагментов, каждый из которых независимо может быть пептидом, полипептидом или фрагментом белка или непептидным фрагментом (например, полиалкиленгликолем, липидом, углеводом). Например, лиганд дополнительно может содержать фрагмент, повышающий время полужизни, как представлено в настоящем описании (например, остаток полиалкиленгликоля, фрагмент, содержащий альбумин, фрагмент альбумина или вариант альбумина, фрагмент, содержащий трансферрин, фрагмент трансферрина или вариант трансферрина, фрагмент, связывающий альбумин, фрагмент, связывающий неонатальный Fc-рецептор).
Конкурирует: Как используют в настоящем описании, термин
"конкурирует" означает, что связывание первой мишени (например, TGFpRII) с соответствующим связывающим мишень доменом
(например, отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина) ингибируется в присутствие второго связывающего домена
(например, отдельного вариабельного домена иммуноглобулина), специфичного для указанной соответствующей мишени. Например, связывание можно ингибировать стерически, например, физическим блокированием связывающего домена или изменением структуры, или окружения связывающего домена, таким образом, что снижают его аффинность или авидность к мишени. Подробности осуществления экспериментов по конкурентному ELISA и конкурентному BIACORE(tm) для определения конкуренции между первым и вторым связывающими доменами см. в WO2006038027, полное описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки для представления точного описания для применения в настоящем изобретении. Изобретение включает антигенсвязывающие белки, конкретно, отдельные вариабельные домены, полипептиды, лиганды и слитые белки, конкурирующие с любым из отдельных вариабельных доменов SEQ ID N0:1-38. В конкретном варианте осуществления изобретение относится к связывающему TGFpRII белку, конкурирующему с любым из отдельных вариабельных доменов SEQ ID N0:1-38, а также имеющему KD для TGFpRII 50 нМ или менее. В конкретном варианте осуществления KD составляет 10 пМ-50 нМ. В конкретном варианте осуществления KD составляет 10 пМ-10 нМ. В конкретном варианте осуществления KD составляет 100 пМ-10 нМ. В конкретном варианте осуществления KD составляет приблизительно 100 пМ.
Передача сигнала TGFp: Соответственно, отдельный вариабельный домен, полипептид или лиганд по изобретению может нейтрализовывать передачу сигнала TGFp через TGFpRII. "Нейтрализация" означает, что нормальный эффект TGFp в отношении передачи сигнала блокируют таким образом, что наличие TGFp оказывает нейтральный эффект на передачу сигнала через TGFpRII. Подходящие способы измерения нейтрализующего эффекта включают анализы передачи сигнала TGFp, как представлено в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления нейтрализацию наблюдают как % ингибирования активности TGFp в
анализе передачи сигнала TGFp. В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен или полипептид связывается с внеклеточным доменом TGFpRII, таким образом, ингибируя/блокируя связывание TGFp с внеклеточным доменом TGFpRII. Соответственно, отдельный вариабельный домен или полипептид применим, если существует избыток биодоступного TGFp, и отдельный вариабельный домен или полипептид служит для ингибирования активности передачи сигнала биодоступного TGFp посредством ингибирования связывания TGFp с соответствующим ему рецептором TGFpRII.
Как используют в настоящем описании, термин "антагонист TGFpRII" или "антагонист против TGFpRII" и т.п. относится к средству (например, молекуле, соединению), которое связывается с TGFpRII и может ингибировать (т.е. одну или несколько) функцию TGFpRII. Например, антагонист TGFpRII может ингибировать связывание TGFp с TGFpRII и/или ингибировать передачу сигнала, опосредуемую TGFpRII. Таким образом, опосредуемые TGFp процессы и ответы клеток можно ингибировать с использованием антагониста TGFpRII.
В одном из вариантов осуществления лиганд (например,
отдельный вариабельный домен иммуноглобулина) , связывающийся с
TGFpRII, ингибирует связывание TGFp с рецептором TGFpRII с
концентрацией полумаксимального ингибирования (IC50),
составляющей < приблизительно 10 мкМ, < приблизительно 1 мкМ, < приблизительно 100 нМ, < приблизительно 50 нМ, < приблизительно 10 нМ, < приблизительно 5 нМ, < приблизительно 1 нМ, < приблизительно 500 пМ, < приблизительно 300 пМ, < приблизительно 100 пМ или < приблизительно 10 пМ. В конкретном варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению имеет IC50 15 мкМ или менее. IC50, необязательно, определяют с использованием анализа связывания рецептора TGFp in vitro или анализа клеток, такого как анализ, представленный в настоящем описании.
Также предполагают, что лиганд (например, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина), необязательно, ингибирует
индуцируемые TGFpRII функции в подходящем анализе in vitro с нейтрализующей дозой 50 (ND50) , составляющей < приблизительно 10 мкМ, < приблизительно 1 мкМ, < приблизительно 100 нМ, < приблизительно 50 нМ, < приблизительно 10 нМ, < приблизительно 5 нМ, < приблизительно 1 нМ, < приблизительно 500 пМ, < приблизительно 300 пМ, < приблизительно 100 пМ, < приблизительно 10 пМ, < приблизительно 1 пМ, < приблизительно 500 фМ, < приблизительно 300 фМ, < приблизительно 100 фМ, < приблизительно 10 фМ. В конкретном варианте осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению достигает более чем 40% нейтрализации TGF-p.
"Лиганд с двойной специфичностью": В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, полипептид или лиганд по изобретению может быть частью "лиганда с двойной специфичностью", который означает лиганд, содержащий первый участок связывания антигена или эпитопа (например, первый отдельный вариабельный домен иммуноглобулина) и второй участок связывания антигена или эпитопа (например, второй отдельный вариабельный домен иммуноглобулина), где участки связывания или вариабельные домены способны связываться с двумя антигенами (например, различными антигенами или двумя копиями одного антигена) или двумя эпитопами на одном антигене, которые в природе не связываются моноспецифическим иммуноглобулином. Например, два эпитопа могут находиться на одном антигене, но не являться одним и тем же эпитопом или в достаточной степени близкими для связывания моноспецифическим лигандом. В одном из вариантов осуществления лиганды с двойной специфичностью по изобретению состоят из участков связывания или вариабельных доменов, имеющих различные специфичности, и не содержат пары взаимокомплементарных вариабельных доменов (т.е. пары VH/VL) , имеющих одинаковую специфичность (т.е. не образуют единый участок связывания).
В одном из вариантов осуществления "лиганд с двойной специфичностью" может связываться с TGFpRII и с другой молекулой-мишенью. Например, другая молекула-мишень может быть
тканеспецифической молекулой-мишенью таким образом, что лиганд с двойной специфичностью по изобретению позволяет полипептиду или отдельному вариабельному домену иммуноглобулина против TGFpRII по изобретению иметь в качестве мишени интересующую ткань. Такие ткани включают легкое, печень и т.д.
Также изобретение относится к полиспецифичным мультимерам dAb. Они включают мультимер dAb, содержащий отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по любому из аспектов изобретения и один или несколько отдельных вариабельных доменов, каждый из которых связывается с разной мишенью (например, мишенью, иной чем TGFpRII). В варианте осуществления изобретение относится к биспецифичному мультимеру dAb, например, мультимеру dAb, содержащему один или несколько отдельных вариабельных доменов иммуноглобулина против TGFpRII по любому из аспектов изобретения и один или несколько dAb, связывающихся со второй, другой мишенью. В варианте осуществления изобретение относится к триспецифичному муль тимеру dAb.
Лиганды по изобретению (например, полипептиды, dAb и
антагонисты) можно получать в формате слитого белка,
содержащего первый отдельный вариабельный домен
иммуноглобулина, слитый непосредственно со вторым отдельным
вариабельным доменом иммуноглобулина. При желании такой формат
дополнительно может содержать фрагмент, повышающий время
полужизни. Например, лиганд может содержать первый отдельный
вариабельный домен иммуноглобулина, слитый непосредственно со
вторым отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина, слитым
непосредственно с отдельным вариабельным доменом
иммуноглобулина, связывающим сывороточный альбумин.
Как правило, ориентация полипептидных доменов, имеющих участок связывания со специфичностью связывания мишени, и содержание линкера в лиганде является вопросом дизайна. Однако, некоторые ориентации, с линкерами или без них, могут обеспечивать лучшие характеристики связывания, чем при других ориентациях. Все ориентации (например, о!АЫ-линкер-с1АЬ2; dAb2-линкер-dAbl) включены в изобретение, и лиганды, имеющие
ориентацию, обеспечивающую желаемые характеристики связывания, можно легко определять с помощью скрининга.
Полипептиды и dAb по изобретению, включая мономеры, димеры и тримеры dAb, можно соединять с Fc-областью антитела, содержащей один или оба домена СН2 и СНЗ и, необязательно, шарнирную область. Например, для получения таких полипептидов можно использовать векторы, кодирующие лиганды, соединенные в виде нуклеотидной последовательности с Fc-областью. В варианте осуществления изобретение относится к слитому белку dAb-Fc.
Кроме того, изобретение относится к димерам, тримерам и полимерам указанных выше мономеров dAb.
Мишень: Как используют в настоящем описании, фраза "мишень" относится к биологической молекуле (например, пептиду, полипептиду, белку, липиду, углеводу), с которой может связываться полипептидный домен, имеющий участок связывания. Например, мишень может являться внутриклеточной мишенью (например, внутриклеточным белком-мишенью), растворимой мишенью (например, секретируемой) или мишенью поверхности клетки (например, белком мембраны, рецепторным белком). В одном из вариантов осуществления мишень является TGFpRII. В другом варианте осуществления мишень является внеклеточным доменом TGFpRII.
Комплементарный: Как используют в настоящем описании, термин "комплементарный" относится к ситуации, когда два домена иммуноглобулина принадлежат к семействам структур, образующих соответствующие пары или группы, или их получают из таких семейств, и они сохраняют это свойство. Например, домен VH и домен VL антитела комплементарны; два домена VH не комплементарны, и два домена VL не комплементарны. Комплементарные домены можно обнаружить в других членах суперсемейства иммуноглобулинов, например, домены Va и Vp (или Y и 5) Т-клеточного рецептора. Домены, являющиеся искусственными, такими как домены на основе белковых каркасов, не связывающиеся с эпитопами, если их такими не сконструировали, являются некомплементарными. Аналогично, два домена на основе (например) домена иммуноглобулина и домена
фибронектина являются некомплементарными.
"Аффинность" и "авидность" являются терминами этой области техники, означающими силу связывающего взаимодействия. Что касается лигандов по изобретению, авидность относится к общей силе связывания между мишенями (например, первой мишенью и второй мишенью) на клетке и лигандом. Авидность представляет собой больше, чем сумму отдельных аффинностей отдельных мишеней.
Молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки-хозяева: Также изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим лиганды (отдельные вариабельные домены, слитые белки, полипептиды, лиганды с двойной специфичностью и полиспецифичные лиганды), представленные в настоящем описании.
Нуклеиновые кислоты, обозначаемые в настоящем описании как "выделенные", являются нуклеиновыми кислотами, отделенными от нуклеиновых кислот геномной ДНК или клеточной РНК источника их происхождения (например, в том виде, в котором они существуют в клетках или в смеси нуклеиновых кислот, таких как библиотека) , и включают нуклеиновые кислоты, получаемые способами, представленными в настоящем описании, или другими подходящими способами, включая, по существу, чистые нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты, получаемые химическим синтезом, комбинациями биологических и химических способов, и рекомбинантные нуклеиновые кислоты, являющиеся выделенными (см. например, Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471 2476 (1991); Lewis, A.P. и S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)).
Нуклеиновые кислоты, обозначаемые в настоящем описании как "рекомбинантные", являются нуклеиновыми кислотами, получаемыми способами рекомбинантной ДНК, включая, нуклеиновые кислоты, получаемые способами, основанными на способе искусственной рекомбинации, например, полимеразной цепной реакцией (ПНР) и/или клонированием в вектор с использованием рестрикционных ферментов.
В определенных вариантах осуществления выделенная и/или
рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную
последовательность, кодирующую отдельный вариабельный домен
иммуноглобулина, полипептид или лиганд, представленные в
настоящем описании, где указанный лиганд содержит
аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере
приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по
меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно
91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере
приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по
меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно
9 6%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере
приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%
идентичность аминокислотных последовательностей аминокислотной
последовательности dAb, связывающих TGFpRII, представленных в
настоящем описании, например, любые аминокислотные
последовательности из SEQ ID N0:1-38. Идентичность нуклеотидной последовательности можно определять на протяжении всей длины нуклеотидной последовательности, кодирующей выбранное dAb против TGFpRII. В варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 8 0% идентичной любой из SEQ ID N0:39-66. В варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты содержит любые последовательности нуклеиновой кислоты из SEQ ID N0:39-76 или состоит из них.
Варианты осуществления по изобретению также относятся к кодон-оптимизированным нуклеотидным последовательностям, кодирующим полипептиды и вариабельные домены, представленные в настоящем описании, например, оптимизированным для экспрессии в бактериальных клетках, клетках млекопитающего или дрожжевых клетках.
Также изобретение относится к вектору, содержащему рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению. В определенных вариантах осуществления вектор является вектором экспрессии, содержащим один или несколько контролирующих экспрессию элементов или последовательности, функционально связанные с рекомбинантной нуклеиновой кислотой по изобретению.
Также изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты или вектор по изобретению. Подходящие векторы (например, плазмиды, фагмиды), контролирующие экспрессию элементы, клетки-хозяева и способы получения рекомбинантных клеток-хозяев по изобретению хорошо известны в этой области, и их примеры представлены в настоящем описании ниже.
Подходящие векторы экспрессии могут содержать ряд
компонентов, например, участок начала репликации, ген
селективного маркера, один или несколько контролирующих
экспрессию элементов, таких как контролирующий транскрипцию
элемент (например, промотор, энхансер, терминатор), и/или один
или несколько трансляционных сигналов, сигнальных
последовательностей или лидерную последовательность и т.п.
Наличие контролирующих экспрессию элементов и сигнальной
последовательности, при наличии, можно обеспечивать с помощью
вектора или другого источника. Например, для регуляции
экспрессии можно использовать последовательности
транскрипционного и/или трансляционного контроля в клонированной нуклеиновой кислоте, кодирующей цепь антитела.
Можно предоставлять промотор для экспрессии в желаемой клетке-хозяине. Промоторы могут быть конститутивными или индуцибельными. Например, промотор может быть функционально связанным с нуклеиновой кислотой, кодирующей антитело, цепь антитела или его часть, таким образом, что он регулирует транскрипцию нуклеиновой кислоты. Доступно множество подходящих промоторов для прокариотических (например, lac-, tac-, ТЗ-, Т7-промоторы для Е. coli) и эукариотических (например, ранний или поздний промотор вируса обезьян 40, промотор из длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса, промотор цитомегаловируса, поздний промотор аденовируса) хозяев.
Кроме того, векторы экспрессии, как правило, содержат селективный маркер для отбора клеток-хозяев, несущих вектор, и, в случае реплицируемого вектора экспрессии, участок начала репликации. Гены, кодирующие продукты, придающие резистентность к антибиотикам или лекарственным средствам, являются
общепринятыми селективными маркерами, и их можно использовать в
прокариотических (например, ген лактамазы (резистентность к
ампициллину), ген Tet для устойчивости к тетрациклину) и
эукариотических клетках (например, гены устойчивости к
неомицину (G418 или генетицин), gpt (микофеноловой кислоте),
ампициллину или гигромицину). Маркерные гены
дигидрофолатредуктазы делают возможным отбор с использованием
метотрексата для множества хозяев. Гены, кодирующие продукт
гена ауксотрофных маркеров хозяина (например, LEU2, URA3, HIS3)
часто используют в качестве селективных маркеров у дрожжей.
Также включено использование вирусных (например,
бакуловирусных) или фаговых векторов, и векторов, способных встраиваться в геном клетки-хозяина, таких как ретровирусные векторы. Подходящие векторы экспрессии для экспрессии в клетках млекопитающих и прокариотических клетках (Е. coli), клетках насекомых (клетки S2 Drosophila Schnieder, Sf9) и дрожжей (Р. methanolica, P. pastoris, S. cerevisiae) хорошо известны в этой области.
Подходящие клетки-хозяева могут быть прокариотическими, включая бактериальные клетки, такие как Е. coli, В. subtilis и/или другие подходящие бактерии, эукариотическими клетками, такими как клетки грибов или дрожжей (например, Pichia pastoris, Aspergillus sp. , Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) или клетками других низших эукариот, и клетками высших эукариот, такими как клетки насекомых (например, клетки S2 Drosophila Schnieder, клетки насекомых Sf9 (WO 94/26087 (O'Connor)), млекопитающих
(например, клетки COS, такие как COS-1 (инвентарный № в АТСС CRL-1650) и COS-7 (инвентарный № в АТСС CRL-1651), СНО
(например, инвентарный № в АТСС CRL-9096, СНО DG44 (Urlaub, G. и Chasin, LA., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7): 4216-4220
(1980))), 293 (инвентарный № в АТСС CRL-1573), HeLa
(инвентарный № в АТСС CCL-2), CV1 (инвентарный № в АТСС CCL-70), WOP (Dailey, L, et al., J. Virol., 54:739-749 (1985), 3T3, 293T (Pear, W. S., et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:8392-8396 (1993)), клетки NS0, SP2/0, клетки HuT 78 и т.п.,
или растений (например, табака). (См., например, Ausubel, F.M.
et al., eds. Current Protocols in Molecular biology, Greene
Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993) . В
некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин является
выделенной клеткой-хозяином и не является частью
многоклеточного организма (например, растения или животного). В
определенных вариантах осуществления клетка-хозяин является не
принадлежащей человеку клеткой-хозяином. Также изобретение
относится к способу получения лиганда (например, лиганда с
двойной специфичностью, полиспецифичного лиганда) по
изобретению, включающему поддержание рекомбинантной клетки-
хозяина, содержащей рекомбинантную нуклеиновую кислоту по
изобретению в условиях, подходящих для экспрессии
рекомбинантной нуклеиновой кислоты, таким образом,
экспрессируется рекомбинантная нуклеиновая кислота и продуцируется лиганд. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает выделение лиганда.
Подробности описания, применимые к вариантам осуществления
настоящего изобретения, см. WO200708515 со строки 24 стр. 161
до строки 10 стр. 189. Таким образом, это описание включено в
настоящее описание в качестве ссылки, как если бы его в
точности включали в текст настоящего описания, и оно относится
к вариантам осуществления настоящего изобретения, и
предназначено для обеспечения определенной поддержки описания
для включенного в приведенную ниже формулу изобретения. Оно
включает описание, представленное в WO200708515 со строки 24
стр. 161 до строки 10 стр. 189, представляющее подробности
"Получения лигандов на основе иммуноглобулинов", "Систем
библиотек векторов", "Конструирования библиотек",
"Комбинирования отдельных вариабельных доменов", "Описания лигандов", "Структуры лигандов", "Остовов", "белковых каркасов", "Каркасов для применения в конструировании лигандов", "Диверсификации канонических последовательностей" и "Терапевтических и диагностических композиций и применения", а также определений "функционально связанного", "наивного", "профилактики", "супрессии", "лечения", "аллергического
заболевания", "Тп2-опосредовнного заболевания", "терапевтически эффективной дозы" и "эффективного".
Фраза "время полужизни" относится ко времени, необходимому для снижения концентрации отдельного вариабельного домена иммуноглобулина, полипептида или лиганда в сыворотке на 50% in vivo, например, по причине деградации лиганда, и/или выведения, или секвестрации лиганда природными механизмами. Лиганды по изобретению можно стабилизировать in vivo и повышать их время полужизни посредством связывания с молекулами, устойчивыми к деградации, и/или выведению, или секвестрации. Как правило, такие молекулы являются природными белками, которые сами по себе имеют длительное время полужизни in vivo. Время полужизни лиганда повышается, если его функциональная активность сохраняется in vivo в течение периода, более длительного, чем у аналогичного лиганда, не являющегося специфичным для молекулы, повышающей время полужизни. Таким образом, лиганд, специфичный для HSA и молекул-мишеней, сравнивают с тем же лигандом, где специфичность к HSA отсутствует, так, что он не связывается с HSA, но связывается с другой молекулой. Как правило, время полужизни повышают на 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или более. Возможны повышения времени полужизни в диапазоне от 2-кратного, 3-кратного, 4-кратного, 5-кратного, 10-кратного, 20-кратного, 30-кратного, 40-кратного, 50-кратного повышения или более. Альтернативно или дополнительно, возможны повышения времени полужизни в диапазоне до 30-кратного, 40-кратного, 50-кратного, 60-кратного, 70-кратного, 80-кратного, 90-кратного, 100-кратного, 150-кратного повышения.
Форматы: Повышенное время полужизни может быть полезным в применении иммуноглобулинов in vivo, особенно антител и, в особенности, фрагментов антител небольшого размера. Такие фрагменты (Fv, Fv с дисульфидной связью, Fab, scFv, dAb), как правило, быстро выводятся из организма. Можно адаптировать dAb, полипептиды или лиганды по изобретению для повышения времени полужизни in vivo и, таким образом, большего времени осуществления функциональной активности лиганда в организме.
Способы фармакокинетического анализа и определения времени
полужизни лиганда известны специалистам в данной области. Подробности можно найти в Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists и в Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996) . Также делают ссылку на "Pharmacokinetic", М Gibaldi & D Perron, опубликованную Marcel Dekker, 2-е дополненное издание (1982), в которой описывают фармакокинетические параметры, такие как время полужизни t альфа и t бета и площадь под кривой (AUC).
Время полужизни [ХМ альфа и ХМ бета) и AUC можно определять с помощью кривой концентрации лиганда в сыворотке относительно времени. Для моделирования кривой можно использовать, например, пакет аналитических программ WINNONLIN(tm) (доступный в Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA). В первую фазу (альфа-фазу) лиганд, главным образом, подвергается распределению в организме пациента с некоторой элиминацией. Вторая фаза (бета-фаза) является конечной фазой, когда лиганд распределяется, и концентрация в сыворотке снижается с выведением лиганда из организма пациента. Время полужизни t альфа является временем полужизни в первую фазу, и время полужизни t бета является временем полужизни во вторую фазу. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к лиганду или композиции, содержащей лиганд по изобретению, имеющий время полужизни ta в диапазоне от 15 минут или более. В одном из вариантов осуществления нижний предел диапазона составляет 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, б часов, 7 часов, 10 часов, 11 часов или 12 часов. Дополнительно или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению будут иметь время полужизни ta в диапазоне до 12 часов включительно. В одном из вариантов осуществления верхний предел диапазона составляет 11, 10, 9, 8, 7, б или 5 часов. Пример подходящего диапазона составляет от 1 до б часов, от 2 до 5 часов или от 3 до 4 часов.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к лиганду (полипептиду, dAb или антагонисту) или композиции, содержащей лиганд по изобретению, имеющий время полужизни tp в диапазоне от приблизительно 2,5 часов или более.
В одном из вариантов осуществления нижний предел диапазона составляет приблизительно 3 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно б часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов или приблизительно 12 часов. Дополнительно или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеет время полужизни tp в диапазоне до 21 дня включительно. В одном из вариантов осуществления верхний предел диапазона составляет приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 2 дня, приблизительно 3 дня, приблизительно 5 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 15 дней или приблизительно 2 0 дней. В одном из вариантов осуществления лиганд или композиция по изобретению будут иметь время полужизни tp в диапазоне от приблизительно 12 до приблизительно 60 часов. В дополнительном варианте осуществления оно будет находиться в диапазоне от приблизительно 12 до приблизительно 4 8 часов. В еще одном дополнительном варианте осуществления оно будет находиться в диапазоне от приблизительно 12 до приблизительно 2 6 часов.
Дополнительно или альтернативно указанным выше критериям, настоящее изобретение относится к лиганду или композиции, содержащей лиганд по изобретению, имеющий значение AUC (площадь под кривой) в диапазоне от приблизительно 1 мг-мин/мл или более. В одном из вариантов осуществления нижний предел диапазона составляет приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 100, приблизительно 2 00 или приблизительно 300 мг-мин/мл. Дополнительно или альтернативно, лиганд или композиция по изобретению имеет AUC в диапазоне до приблизительно 600 мг-мин/мл. В одном из вариантов осуществления верхний предел диапазона составляет приблизительно 500, приблизительно 400, приблизительно 300, приблизительно 200, приблизительно 150, приблизительно 100, приблизительно 75 или приблизительно 50 мг-мин/мл. В одном из вариантов осуществления лиганд по изобретению будет иметь AUC в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из следующего: от
приблизительно 15 до приблизительно 150 мг-мин/мл, от приблизительно 15 до приблизительно 100 мг-мин/мл, от приблизительно 15 до приблизительно 7 5 мг-мин/мл, и от приблизительно 15 до приблизительно 50 мг-мин/мл.
Полипептиды и dAb по изобретению и содержащие их антагонисты можно получать в формате, имеющем больший гидродинамический размер, например, прикреплением группы PEG, сывороточного альбумина, трансферрина, трансферринового рецептора или по меньшей мере его трансферрин-связывающей части, Fc-области антитела, или посредством конъюгации с доменом антитела. Например, полипептиды, dAb и антагонисты получают в формате большего антигенсвязывающего фрагмента антитела или в виде антитела (например, получают в формате Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv).
Как используют в настоящем описании, "гидродинамический
размер" относится к кажущемуся размеру молекулы (например,
молекулы белка, лиганда), основанному на диффузии молекулы в
водном растворе. Диффузию или движение белка в растворе можно
анализировать для получения кажущегося размера белка, где
размер указывают с помощью "радиуса Стокса" или
"гидродинамического радиуса" белковой частицы.
"Гидродинамический размер" белка зависит от массы и формы (конформации), таким образом, что два белка, имеющих одинаковую молекулярную массу, могут иметь разные гидродинамические размеры на основании общей конформации белка.
Гидродинамический размер лигандов (например, мономеров и мультимеров dAb) по изобретению можно определять с использованием способов, хорошо известных в этой области. Например, для определения гидродинамического размера лиганда можно использовать хроматографию с гель-фильтрацией. Подходящие матрицы для гель-фильтрации для определения гидродинамических размеров лигандов, такие как, матрицы из агарозы с поперечными сшивками, хорошо известны и легкодоступны.
Размер формата лиганда (например, размер PEG-фрагмента, прикрепленного к мономеру dAb) можно варьировать в зависимости от желаемого применения. Например, если лиганд должен покидать
кровоток и проникать в периферические ткани, желательно сохранять гидродинамический размер лиганда низким для облегчения экстравазации из кровотока. Альтернативно, если желательно сохранять лиганд в системном кровотоке в течение более длительного периода времени, размер лиганда можно повышать, например, получая формат Ig-подобного белка.
Повышение времени полужизни посредством воздействия на антиген или эпитоп, повышающий время полужизни in vivo: Гидродинамический размер лиганда и его время полужизни в сыворотке также можно повышать конъюгацией или соединением связывающего TGFpRII полипептида, dAb или лиганда по изобретению со связывающим доменом (например, антителом или фрагментом антитела), связывающим антиген или эпитоп, повышающий время полужизни in vivo, как представлено в настоящем описании. Например, связывающее TGFpRII средство (например, полипептид) можно конъюгировать или соединять с антителом или фрагментом антитела против сывороточного альбумина или против неонатального Fc-рецептора, например, dAb, Fab, Fab' или scFv против SA или против неонатального Fc-рецептора, или с аффителом против SA, или аффителом против неонатального Fc-рецептора или авимером против SA, или связывающим доменом против SA, содержащим каркас, выбранный из, в качестве неограничивающих примеров, группы, состоящей из CTLA-4, липокалина, SpA, аффитела, авимера, GroEI и фибронектина (см. описание этих связывающих доменов в WO2008096158, эти домены и их последовательности включены в настоящее описание в качестве ссылки, и образуют часть настоящего изобретения). Конъюгация относится к композиции, содержащей полипептид, dAb или антагонист по изобретению, соединенный (ковалентно или нековалентно) со связывающим доменом, таким как связывающий домен, связывающий сывороточный альбумин.
Как правило, полипептид, повышающий время полужизни в сыворотке in vivo, является полипептидом, существующим в природе in vivo и устойчивым к деградации или удалению эндогенными механизмами, удаляющими нежелательный материал из
организма (например, человека). Например, полипептид, повышающий время полужизни в сыворотке in vivo, можно выбирать из белков внеклеточного матрикса, белков, обнаруживаемых в крови, белков, обнаруживаемых в гематоэнцефалитическом барьере или в нервной ткани, белков, локализующихся в почках, печени, легком, сердце, коже или костях, белков стресса, белков, специфичных для определенных заболеваний, или белков, участвующих в транспорте Fc-фрагмента. Подходящие полипептиды описывают, например, в WO2008/096158.
Такой подход также можно использовать для направленной доставки отдельного вариабельного домена, полипептида или лиганда по изобретению в интересующую ткань. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к направленной доставке высокоаффинного отдельного вариабельного домена по изобретению.
Связывающие сывороточный альбумин dAb: В одном из вариантов осуществления изобретение относится к полипептиду или антагонисту (например, лиганду с двойной специфичностью, содержащему dAb против TGFpRII (первое dAb) ) , связывающееся с TGFpRII, и второе dAb, связывающееся с сывороточным альбумином (SA) . Подробности о лигандах с двойной специфичностью можно найти в WO03002609, WO04003019, WO2008096158 и WO04058821.
В конкретных вариантах осуществления лигандов и антагонистов dAb связывается с сывороточным альбумином человека и конкурирует за связывание с альбумином с dAb, выбранными из группы, состоящей из любой из последовательностей dAb, описываемых в WO2004003019 (эти последовательности и соответствующие им последовательности нуклеиновых кислот включены в настоящее описание в качестве ссылки и образуют часть настоящего изобретения), любой из последовательностей dAb, описываемых в WO2007080392 (эти последовательности и соответствующие им последовательности нуклеиновых кислот включены в настоящее описание в качестве ссылки и образуют часть настоящего изобретения), любой из последовательностей dAb, описываемых в WO2008096158 (эти последовательности и соответствующие им последовательности нуклеиновых кислот
включены в настоящее описание в качестве ссылки и образуют часть настоящего изобретения).
В определенных вариантах осуществления dAb связывается с
сывороточным альбумином человека и содержит аминокислотную
последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 8 0%,
или по меньшей мере приблизительно 8 5%, или по меньшей мере
приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 95%, или
по меньшей мере приблизительно 9 6%, или по меньшей мере
приблизительно 97%, или по меньшей мере приблизительно 98%, или
по меньшей мере приблизительно 99% идентичность аминокислотных
последовательностей с аминокислотной последовательностью dAb,
описываемой в любом из WO2004003019, WO2007080392 или
W02008096158. Например, dAb, связывающее сывороточный альбумин
человека, может содержать аминокислотную последовательность,
имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере
приблизительно 95%, или по меньшей мере приблизительно 9 6%, или
по меньшей мере приблизительно 97%, или по меньшей мере
приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%
идентичность аминокислотных последовательностей с
аминокислотной последовательностью любого из этих dAb. В определенных вариантах осуществления dAb связывается с сывороточным альбумином человека и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 8 0%, или по меньшей мере приблизительно 8 5%, или по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 95%, или по меньшей мере приблизительно 9 6%, или по меньшей мере приблизительно 97%, или по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность аминокислотных последовательностей с аминокислотной последовательностью любого из этих dAb.
В более конкретных вариантах осуществления dAb является VK dAb, связывающим сывороточный альбумин человека. В более конкретных вариантах осуществления dAb является VH dAb, связывающим сывороточный альбумин человека.
Подходящие VHH ВИДОВ семейства Верблюдовых, связывающие сывороточный альбумин, включают описываемые в WO2004041862
(Ablynx N.V.) и в WO2007080392 (эти последовательности VHH И соответствующие им последовательности нуклеиновых кислот включены в настоящее описание в качестве ссылки и образуют часть настоящего изобретения). В определенных вариантах осуществления VHH ВИДОВ семейства Верблюдовых связывается с сывороточным альбумином человека и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 8 0%, или по меньшей мере приблизительно 8 5%, или по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 95%, или по меньшей мере приблизительно 9 6%, или по меньшей мере приблизительно 97%, или по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность аминокислотных последовательностей с последовательностями, описываемыми в WO2007080392, или любой из SEQ ID N0:518-534, эти номера последовательностей соответствуют цитируемым в WO2007080392 или WO2004041862.
В альтернативном варианте осуществления антагонист или лиганд содержит связывающий фрагмент, специфичный для TGFpRII (например, TGFpRII человека), где фрагмент содержит неиммуноглобулиновые последовательности, описываемые в WO2008096158, описание этих связывающих фрагментов, способы их получения и отбора (например, из различных библиотек), и их последовательности включены в настоящее описание в качестве ссылки как часть настоящего изобретения).
Конъюгация с фрагментом, повышающим время полужизни (например, альбумином): В одном из вариантов осуществления (один или несколько) фрагмент, повышающий время полужизни (например, альбумин, трансферрин и его фрагменты и аналоги), конъюгируют или соединяют со связывающим TGFpRII полипептидом, dAb или антагонистом по изобретению. Примеры подходящего альбумина, фрагментов альбумина или вариантов альбумина для применения в связывающем TGFpRII формате описывают в WO2005077042, описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки и образует часть настоящего изобретения.
Дополнительные примеры подходящего альбумина, фрагментов и аналогов для применения в связывающем TGFpRII формате описывают
в WO 0307 6567, описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки и образует часть настоящего изобретения.
Если (один или несколько) фрагмент, повышающий время полужизни (например, альбумин, трансферрин и их фрагменты и аналоги), используют для формата связывающих TGFpRII полипептидов, dAb и антагонистов по изобретению, их можно конъюгировать с использованием любого подходящего способа, такого как прямое слияние со связывающим TGFpRII фрагментом
(например, dAb против TGFpRII), например, с использованием единой нуклеотидной конструкции, кодирующей слитый белок, где слитый белок кодируется единой полипептидной цепью с фрагментом, повышающим время полужизни, локализованным на N-или С-конце связывающего TGFpRII фрагмента. Альтернативно, конъюгацию можно осуществлять с использованием пептидного линкера между фрагментами, например, пептидного линкера, описываемого в WO03076567 или WO2004003019 (эти описания линкеров включены в настоящее описание в качестве ссылки, представляя примеры для применения в настоящем изобретении).
Конъюгация с PEG: В других вариантах осуществления фрагмент, повышающий время полужизни, является фрагментом полиэтиленгликоля. В одном из вариантов осуществления антагонист содержит отдельный вариабельный домен по изобретению
(необязательно, состоит из него), соединенный с остатком полиэтиленгликоля (необязательно, где указанный остаток имеет размер от приблизительно 2 0 до приблизительно 50 кДа, необязательно, линейный или разветвленный PEG размером приблизительно 40 кДа). См. больше подробностей пегилирования dAb и связывающих фрагментов в WO04081026. В одном из вариантов осуществления антагонист состоит из мономера dAb, соединенного с PEG, где мономер dAb является отдельным вариабельным доменом по изобретению.
В другом варианте осуществления отдельный вариабельный домен, лиганд или полипептид по изобретению можно соединять с фрагментом токсина или токсином.
Устойчивость к протеазе: Отдельные вариабельные домены, полипептиды или лиганды по изобретению можно модифицировать для
улучшения их устойчивости к деградации протеазами. Как используют в настоящем описании, пептид или полипептид
(например, доменное антитело (dAb)), "устойчивый к деградации протеазами", по-существу, не подвергается деградации протеазами при инкубации с протеазами в условиях, подходящих для активности протеаз. Полипептид (например, dAb), по-существу, не подвергается деградации, если не более чем приблизительно 25%, не более чем приблизительно 2 0%, не более чем приблизительно 15%, не более чем приблизительно 14%, не более чем приблизительно 13%, не более чем приблизительно 12%, не более чем приблизительно 11%, не более чем приблизительно 10%, не более чем приблизительно 9%, не более чем приблизительно 8%, не более чем приблизительно 7%, не более чем приблизительно б%, не более чем приблизительно 5%, не более чем приблизительно 4%, не более чем приблизительно 3%, не более чем приблизительно 2%, не более чем приблизительно 1% подвергается деградации протеазами или, по-существу, никакая часть белка не подвергается деградации протеазами после инкубации с протеазой в течение приблизительно одного часа при температуре, подходящей для активности протеаз. Например, при температуре 37 или 50°С. Деградацию белков можно оценивать с использованием любого подходящего способа, например, электрофореза в ПААГ в присутствие SDS или функционального анализа (например, связывания лиганда), как представлено в настоящем описании.
Способы получения dAb с повышенной устойчивостью к протеазам описывают, например, в W02008149143. В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен, полипептид или лиганд по изобретению устойчив к деградации лейкозимом и/или трипсином. Полипептиды, отдельные вариабельные домены иммуноглобулин и лиганды по изобретению могут быть устойчивыми к одному или нескольким из следующего: сериновой протеазе, цистеиновой протеазе, аспартатным протеазам, тиоловым протеазам, матричной металлопротеиназе, карбоксипептидазам
(например, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсину, химотрипсину, пепсину, папаину, эластазе, лейкозиму, панкреатину, тромбину, плазмину, катепсинам (например,
катепсину G) , протеиназам (например, протеиназе 1, протеиназе 2, протеиназе 3), термолизину, химозину, энтеропептидазе, каспазе (например, каспазе 1, каспазе 2, каспазе 4, каспазе 5, каспазе 9, каспазе 12, каспазе 13), кальпаину, фикаину, клострипаину, актинидаину, бромелаину и сепаразе. В конкретных вариантах осуществления протеаза является трипсином, эластазой или лейкозимом. Также протеазу можно предоставлять с использованием биологического экстракта, биологического гомогената или биологического препарата. Полипептиды, отдельные вариабельные домены иммуноглобулина и лиганды, представленные в настоящем описании, можно подвергать отбору в присутствии протеаз легкого, таким образом, что указанные полипептиды, отдельные вариабельные домены иммуноглобулина и лиганды являются устойчивыми к указанным протеазам легкого. В одном из вариантов осуществления протеаза является протеазой, обнаруживаемой в мокроте, слизи (например, желудочной слизи, назальной слизи, бронхиальной слизи), бронхоальвеолярном лаваже, гомогенате легкого, экстракте легкого, экстракте поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюне. В одном из вариантов осуществления протеаза является протеазой, обнаруживаемой в глазу и/или слезах. Примеры таких протеаз, обнаруживаемых в глазу, включают каспазы, кальпаины, матричные металлопротеиназы, дезинтегрин, металлопротеиназы (например, ADAM - дезинтегрин и металлопротеиназа) и ADAM с тромбоспондиновыми мотивами, протеасомы, тканевый активатор плазминогена, секретазы, катепсин В и D, цистатин С, сериновую протеазу PRSS1, компоненты убиквитин-протеасомного пути (UPP). В одном из вариантов осуществления протеаза является небактериальной протеазой. В варианте осуществления протеаза является протеазой животного, например, млекопитающего, например, человека. В варианте осуществления протеаза является протеазой ЖКТ или протеазой легочной ткани, например, протеазой ЖКТ или протеазой легочной ткани, обнаруживаемыми у людей. Такие протеазы, указанные в настоящем описании, также можно использовать в способах, описываемых, например, в WO2008149143, включая подвергание репертуара библиотеки воздействию протеазы.
Стабильность: В одном из аспектов изобретения полипептиды, отдельные вариабельные домены, dAb, лиганды, композиции или составы по изобретению являются, по-существу, стабильными после инкубации (при концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл) при температуре от 37 до 50°С в течение 14 дней в буфере Бриттона-Робинсона или буфере PBS. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида, антагониста или вариабельного домена и т.д. остается неагрегированным после такой инкубации при температуре 37°С. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остается мономерным после такой инкубации при температуре 37°С.
В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается неагрегированным после такой инкубации при температуре 50°С. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остается мономерным после такой инкубации при 50°С. В одном из вариантов осуществления не наблюдают агрегацию полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов после любой из таких инкубаций. В одном из вариантов осуществления pi полипептида или вариабельного домена остается неизменным или, по-существу, неизменным после инкубации при температуре 37°С при концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона. В одном из аспектов изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или составы по изобретению являются, по-существу, стабильными после инкубации (при концентрации полипептида или вариабельного домена 100 мг/мл) при температуре 4°С в течение 7 дней в буфере Бриттона-Робинсона или PBS при рН 7-7,5 (например, при рН 7 или рН 7,5). В одном из вариантов
осуществления по меньшей мере 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается неагрегированным после такой инкубации. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остается мономерным после такой инкубации. В одном из вариантов осуществления не наблюдают агрегацию полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов после любой из таких инкубаций.
В одном из аспектов изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или составы по изобретению являются, по-существу, стабильными после небулизации (например, при концентрации полипептида или вариабельного домена 4 0 мг/мл), например, при комнатной температуре, 20°С или 37°С, в течение 1 часа, например, компрессорным небулайзером, например, в емкости Pari LC+. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95, 5, 96, 96, 5, 97, 97, 5, 98, 98, 5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остается неагрегированным после такой небулизации. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остается мономерным после такой небулизации. В одном из вариантов осуществления не наблюдают агрегацию полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов после любой из таких небулизаций.
Мономерная форма: В одном из вариантов осуществления dAb по настоящему изобретению определяют как, предпочтительно, мономерное. Соответственно, изобретение относится к (по-существу) чистому мономеру. В одном из вариантов осуществления dAb является по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% чистым или 100% чистым мономером. Для определения того, являются ли dAb в растворе мономерными, или образуют олигомеры более высокого порядка, их можно анализировать с помощью SEC-MALLS. SEC-MALLS (эксклюзионная хроматография с детектированием рассеяния лазерного излучения с кратными
углами) является неинвазивным способом характеризации макромолекул в растворе, известным любому специалисту в этой области. В кратком изложении, белки (при концентрации 1 мг/мл в буфере PBS в модификации Дульбекко) разделяют по их гидродинамическим свойствам с помощью эксклюзионной хроматографии (колонка: TSK3000; S200) . После разделения свойство белка рассеивать свет измеряют с использованием детектора рассеяния лазерного излучения с кратными углами (MALLS). Интенсивность рассеянного света в то время, когда белок проходит через детектор, измеряют как функцию угла. Это измерение вместе с концентрацией белка, определяемой с использованием детектора показателя преломления (RI), позволяет вычислять молярную массу с использованием соответствующего уравнения (неотъемлемая часть аналитического программного обеспечения Astra v.5.3.4.12).
Терапевтическое применение: Изобретение относится к способу лечения, супрессии или профилактики заболевания, связанного с передачей сигнала TGFp. В одном из вариантов осуществления такое заболевание может быть вызвано нарушенной передачей сигнала TGFp, гиперэкспрессией TGFp или высокими уровнями биодоступного TGFp, или они могут участвовать в его развитии. Заболевания, связанные с передачей сигнала TGFp, включают заболевания, относящиеся к фиброзам различных тканей, таким как легочный фиброз, включая идиопатический легочный фиброз (IPF) и другие интерстициальные заболевания легких, такие как острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), фиброз печени, включая цирроз и фиброз при хроническом гепатите, ревматоидный артрит, глазные нарушения, сосудистые состояния, такие как рестеноз, фиброз кожи, включая келоид кожи и рубцевание после заживления ран, и контрактуру Дюпюитрена, и состояния почек, такие как фиброз при нефритах, фиброз почек и нефросклероз, или сосудистое состояние, такое как рестеноз. Другие заболевания, связанные с передачей сигнала TGFp, включают сосудистые заболевания, такие как гипертония, преэклампсия, наследственная геморрагическая телеангиэктазия типа I (ННТ1), ННТ2, легочная артериальная гипертензия,
аневризмы аорты, синдром Марфана, семейные формы аневризмы
аорты, синдром Лойеса-Дитца, синдром патологической извитости
артерий (ATS). Другие заболевания, связанные с передачей
сигнала TGFp, включают заболевания опорно-двигательного
аппарата, такие как миодистрофия Дюшена и фиброз мышц.
Дополнительные заболевания, связанные с передачей сигнала TGFp,
включают злокачественное новообразование, такое как рак
толстого кишечника, рак желудка и рак поджелудочной железы, а
также глиому и NSCLC. Кроме того, изобретение относится к
способам воздействия на злокачественное новообразование,
например, посредством модуляции передачи сигнала TGFp при
ангиогенезе в опухоли или посредством воздействия на строму
опухоли. Другие заболевания или состояния включают относящиеся
к рубцеванию ткани. Другие заболевания включают заболевания
легких, такие как COPD (хроническая обструктивная болезнь
легких), заболевания печени, такие как печеночная
недостаточность (например, в результате вирусного гепатита,
алкогольной интоксикации, ожирения, аутоиммунных,
метаболических, обструктивных заболеваний), заболевания почек,
включая почечную недостаточность (например, в результате
диабета, гипертензии), гипертрофическую кардиомиопатию,
отторжение трансплантата (легкого/печени/почки), и
гипертрофическое и келоидное рубцевание.
"Фиброз" является результатом избыточного накопления компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген, вызывающего избыточный рост, рубцевание и/или склерозирование тканей.
"Фиброз кожи": фиброз кожи включает множество нарушений у человека, имеющих различную этиологию, но с общей дисрегуляцией метаболизма соединительной ткани, в частности, дермальных фибробластов. Конкретные примеры фиброза кожи включают келоидную болезнь, гипертрофические рубцы (HS) и склеродермии. Келоидная болезнь и гипертрофические рубцы, хотя и не являются подгруппами одного состояния, оба возникают в результате рубцевания после заживления ран, при этом келоиды разрастаются вне исходного участка раны, в то время как гипертрофический
рубец находится в пределах исходной раны. Однако, термин "склеродермия" используют для описания фиброза кожи при системном склерозе, являющемся системным состоянием, приводящим к фиброзу многих органов. В варианте осуществления вариабельный домен, лиганд, слитый белок или полипептид, как представлено в настоящем описании, используют для профилактики или лечения келоидной болезни, гипертрофических рубцов или склеродермии.
"Келоиды" являются фиброзными наростами в участках
повреждения кожи, образующимися в результате аномального
процесса заживления ран у генетически предрасположенных
индивидуумов и, в отличие от нормальных рубцов, не
регрессируют. Преимущественно наблюдаемая у пациентов с темной
пигментации кожи, "келоидная болезнь" является
доброкачественной кожной фибропролиферативной опухолью, уникальной у людей тем, что никогда не становится злокачественной.
"Контрактура Дюпюитрена" является ограниченным
образованием рубцовой ткани под кожей ладони. Рубцовая ткань накапливается в ткани (фасции), в норме покрывающей сухожилия, тянущие пальцы для сжатия. С прогрессированием контрактуры Дюпюитрена все большая часть фасции становится утолщенной и укороченной, что приводит к сгибательной контрактуре руки, при которой пальцы сгибаются по направлению к ладони, и их нельзя полностью разгибать (выпрямлять), что в крайних случаях приводит к невозможности использования руки.
Рубцевание происходит после хирургического вмешательства, повреждения или травмы тканей или органов организма. Оно является следствием механизмов репарации, при которых внеклеточный матрикс продуцируется для замещения отсутствующей нормальной ткани. Кожа представляет собой наиболее часто повреждаемую ткань, что приводит к ее рубцеванию, которое может приводить к неблагоприятным последствиям, включая: утрату функции, контрактуру и эстетически неприятные последствия, которые могут оказывать психологические эффекты на пациента. Рубцы можно определять как "макроскопическое нарушение нормальной структуры и функции архитектуры кожи, являющееся
конечным результатом заживления ран" (Fergusson et al., 1996) . В настоящее время не существует терапевтических средств для эффективной профилактики или улучшения рубцевания.
Наблюдали участие TGFp в легочном фиброзе (Wynn et al., J. Pathology 2008, 214, p.199-210; Sime et al. J. Clinical Immunology 1997, Vol.100, p. 768-776). В результате неизвестного повреждения легких наблюдают сдвиг в сторону повышенной продукции Тп2-цитокинов и сниженной продукции Thl-цитокинов. Гиперэкспрессия TGFp стимулирует ангиогенез, активацию фибробластов, накопление ЕСМ и фиброгенез. Использование моделей на животных (например, гиперэкспрессии TGFp, КО SMAD3, ингибирования передачи сигнала через TGFpR) показало, что TGFp является ключевым медиатором в развитии легочного фиброза.
"Идиопатический легочный фиброз (IPF)" является хроническим и прогрессирующим заболеванием, приводящим к аномальному и избыточному накоплению фиброзной ткани в легочном интерстиции в отсутствие известной причины. В США частота заболевания составляет приблизительно 10-20 случаев на 100000 людей в год. Распространенность резко повышается с возрастом, достигая 175 случаев на 100000 людей старше 75 лет, с началом, как правило, в возрасте от 50 до 70 лет. Коэффициент выживаемости за пять лет составляет 2 0% со средней выживаемостью 2,8 лет. Симптомы включают сухой кашель и прогрессирующую дыхательную недостаточность, аномальные данные рентгенограммы грудной клетки или HRCT и сниженные легочные объемы. Существующие в настоящее время способы лечения включают кортикостероиды (преднизон), иммуносупрессоры (циклофосфамид) или трансплантацию, хотя ни один из доступных в настоящее время способов терапии не обладает доказанной эффективностью. В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен или полипептид по настоящему изобретению относится к лечению IPF.
Соответственно, удачное лечение идиопатического легочного фиброза (IPF) будет демонстрировать что-либо из снижения пролиферации легочных фибробластов, повышения апоптоза легочных фибробластов, снижения избыточного синтеза и накопления
внеклеточного матрикса, повышения расщепления и ремоделирования внеклеточного матрикса или будет демонстрировать некоторую защиту от непрерывного повреждения ткани и восстановление нормальной гистологической картины.
Соответственно, удачное лечение будет замедлять прогрессирование заболевания.
Эффективность лечения IPF можно демонстрировать на модели индуцированного блеомицином легочного фиброза. В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен иммуноглобулина по настоящему изобретению перекрестно реагирует с TGFpRII мыши таким образом, что его эффективность можно тестировать на модели мыши.
TGFp является важной молекулой передачи сигнала в клетке для модуляции поведения клетки в тканях глаза. Гиперактивация TGFp участвует в патогенезе фиброзных заболеваний в ткани глаза, которые могут быть связанными с заживлением ран и приводить к нарушению зрения и гомеостаза ткани глаза (обзор см., например, в Saika, Laboratory Investigation (2006), 86, 106-115) .
Таким образом, в одном из вариантов осуществления заболевания, связанные с передачей сигнала TGFp, включают глазные нарушения, такие как фиброзные заболевания ткани глаза. Фиброзное заболевание глаза может иметь место в роговице, конъюнктиве, хрусталике или сетчатке. Глазные нарушения включают пролиферативную витреоретинопатию (PVR), нарушение после отслоения сетчатки и фиброз сетчатки, диабетическую ретинопатию, глаукому, такую как открытоугольную глаукому, закрытоугольную, врожденную глаукому и псевдоэксфолиативный синдром, реакции заживления ран в хрусталике, например, после химического или термического ожога, или синдром Стивенса-Джонсона, и осложнения после хирургического вмешательства по поводу катаракты. TGFp также играет роль в развитии катаракты (Wormstone et al., Exp Eye Res; 83 1238-1245, 2006). Ряд глазных нарушений происходит в результате фиброза после хирургического вмешательства. Кроме того, считают, что гиперактивность TGFp2 (трансформирующего фактора роста р2)
вызывает рубцевание в глазу и возле него после фильтрующей хирургической операции при глаукоме. TGFp2 является преобладающей изоформой, участвующей в патологическом рубцевании ткани глаза, включая роговицу, сетчатку, конъюнктиву и трабекулярную сеть. Рубцевание или фиброз трабекулярной сети может приводить к окклюзии пути нормального оттока жидкости, приводящей к повышению внутриглазного давлению и риску развития глаукомы. В доклинических моделях глаукомы показано, что TGFp 2 является патологическим фактором. Уровни TGFp2 повышаются у пациентов с глаукомой, обработка клеток huTM TGFp-2 in vitro приводит к фенотипическим изменениям и положительной регуляции модулирующих ЕСМ белков (ММР-2, PAI-I) (Lutjen-Drecol (2005), Experimental Eye Research, Vol. 81, Issue 1, pages 1-4; Liton (2005), Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 337, issue 4, p.1229-1236; Fuchshofer et al (2003), Experimental Eye Research, Vol. 77, issue 6, p. 757-765; Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) conference poster #1631 2009) . Кроме того, гиперэкспрессия TGFp в глазу приводит к глаукомо-подобной патологии у мышей (постер на конференции ARVO № 5108 2009), и показано, что доставка TGFp-2 с использованием AAV ингибирует утрату ганглиозных клеток сетчатки на модели глаукомы крысы (постер на конференции ARVO № 5510 2009). Недавно показано, что индукция оксидативного стресса в культивируемых астроцитах головки зрительного нерва человека повышает секрецию TGFp2 (Yu et al (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50: 1707-1717). Все это свидетельствует о том, что снижение уровней TGFp2 может минимизировать характерные изменения головки зрительного нерва, наблюдаемые при глаукоме. Однако, также известно, что TGFp играет иммуносупрессорную роль и тем самым в некоторых аспектах может являться протективным, таким образом, снижение повышенных уровней TGFp2 чаще, чем полный нокдаун, может быть предпочтительным для лечения хронических состояний глаза, таких как глаукома. Таким образом, заболевания, которые можно лечить с использованием dAb и композиций и т.д. по изобретению, включают рубцевание после фильтрующей хирургической операции
при глаукоме.
Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к способу лечения, супрессии или профилактики заболевания, связанного с передачей сигнала TGFp и, в частности, нарушенной передачей сигнала TGFp, включающему введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективной дозы или количества полипептида, слитого белка, отдельного вариабельного домена, антагониста или композиции по изобретению.
В другом аспекте изобретение относится к отдельному вариабельному домену иммуноглобулина, полипептиду, лиганду или слитому белку по изобретению для применения в качестве лекарственного средства. Подходящее лекарственное средство может содержать отдельный вариабельный домен иммуноглобулина и т.д. по изобретению в формате, представленном в настоящем описании.
Соответственно, лекарственное средство является
фармацевтической композицией. В дополнительном аспекте
изобретение относится к композиции (например, фармацевтической
композиции), содержащей полипептид, отдельный вариабельный
домен, лиганд, композицию или антагониста по изобретению, и
физиологически или фармацевтически приемлемый носитель,
разбавитель или эксципиент. В одном из вариантов осуществления
композиция содержит средство для доставки. В конкретных
вариантах осуществления полипептид, слитый белок, отдельный
вариабельный домен, антагониста или композицию вводят с помощью
легочной доставки, такой как ингаляция (например,
внутрибронхиальная, интраназальная или пероральная ингаляция,
интраназальное введение, например, с помощью капель), или с
помощью системной доставки (например, парентерального,
внутривенного, внутримышечного, интраперитонеального,
интраартериального, интратекального, внутрисуставного,
подкожного, вагинального или ректального введения). В другом варианте осуществления полипептид, отдельный вариабельный домен, лиганд или слитый белок, или композиции по изобретению вводят в глаз, например, с помощью местного введения в виде глазных капель, системы частиц полимера, геля или импланта, или
с помощью внутриглазной инъекции, например, в стекловидное тело. Доставку можно направлять в конкретные области глаза, такие как поверхность глаза, или слезные протоки, или слезные железы, или в переднюю или заднюю камеры глаза, или стекловидное тело). Она также может быть полезной, если отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, композицию и т.д. доставляют в глаз вместе со средством, повышающим проникающую способность в ткани глаза, например, капратом натрия, или с усилителем вязкости, например, гидроксипропилметилцеллюлозой (НРМС). В дополнительных вариантах осуществления полипептид, слитый белок, отдельный вариабельный домен, антагонист или композицию вводят в кожу с помощью местной доставки на поверхность кожи и/или доставки в области в коже, например, внутрикожной доставки.
Хоть и являясь наиболее доступным для доставки органом организма, внешний барьер кожи, роговой слой (SC), действует как скорость-лимитирующий барьер для доставки лекарственного средства. Общепринято, для преодоления SC необходима внутрикожная инъекция, позволяющая доставлять лекарственное средство в места приложения действия в более глубоких слоях кожи. Однако доставку можно осуществлять с помощью других подходов для трансдермальной доставки. Для облегчения доставки можно использовать способы получения составов, включая: добавление химических усилителей для изменения структуры липидов SC, добавление пептидов, облегчающих трансфолликулярный транспорт, и инкапсулирование в частицы, включая липосомы, ниосомы, этосомы и трансферсомы, которые, как считают, способствуют местной флюидизации липидов и образованию депо для длительного эффекта. Ионтофорез, включая подачу на кожу небольшого электрического потенциала, используют для локализованной доставки лекарственного средства. Ионтофорез позволяет доставлять заряженные и нейтральные молекулы посредством миграции в электрическом поле и электроосмоса, соответственно. Можно использовать микроиглы для создания каналов микронного размера в коже для преодоления SC, позволяя белкам проходить через эти каналы в нижние слои эпидермиса.
Микроиглы ориентировочно можно классифицировать на твердые и полые микроиглы. Твердые микроиглы можно использовать для пробивания SC перед введением лекарственного средства покрытые, делающие возможной доставку, т.к. лекарственное средство высвобождается из игл, или растворимые, делающие возможной высвобождение лекарственного средства, т.к. иглы растворяются in situ. Полые микроиглы делают возможной инфузию жидкого состава лекарственного средства. Электропорация, в отличие от ионтофореза, требует более высокого вольтажа > 50 В для изменения проницаемости кожи для повышения проникающей способности лекарственного средства. Способы термической и радиочастотной абляции позволяют разрушать SC посредством локализованного нагревания и абляции SC. При термической абляции этот результат возникает после использования высокой температуры в течение короткого периода времени, в то время как радиочастотная абляция включает использование радиочастот для вибрации микроэлектродов на коже, что приводит к локализованному нагреванию. Разрушение SC также можно осуществлять посредством лазерной шлифовки, использования ультразвуковых волн низкой частоты (сонофореза) и компрессорных распылителей, в которых используют высокую скорость для продвижения лекарственного средства через SC.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания с использованием полипептида, отдельного вариабельного домена, композиции, лиганда или антагониста по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления заболевание является фиброзом ткани, таким как келоидная болезнь или контрактура Дюпюитрена.
В одном из аспектов изобретение относится к полипептиду, отдельному вариабельному домену, лиганду, композиции или антагонисту для терапии и/или профилактики заболевания или состояния, связанного с передачей сигнала TGFp у человека. В другом аспекте изобретение относится к применению полипептида, отдельного вариабельного домена, композиции или антагониста для получения лекарственного средства для терапии или профилактики заболевания или состояния, связанного с передачей сигнала TGFp
у человека. В другом аспекте изобретение относится к способу лечения и/или профилактики заболевания или состояния, связанного с передачей сигнала TGFp у пациента-человека, включающему введение полипептида, отдельного вариабельного домена, композиции или антагониста пациенту. Изобретение также относится к способам терапии, включающим введение терапевтически эффективного количества лиганда по изобретению (например, антагониста или отдельного вариабельного домена) нуждающемуся в этом индивидууму.
В других вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения идиопатического легочного фиброза, включающему введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества лиганда по изобретению (например, антагониста или отдельного вариабельного домена).
Изобретение также относится к устройству для доставки лекарственного средства, содержащему композицию (например, фармацевтическую композицию) по изобретению. В некоторых вариантах осуществления устройство для доставки лекарственного средства содержит множество терапевтически эффективных доз лиганда.
В других вариантах осуществления устройство для доставки лекарственного средства выбрано из группы, состоящей из устройства для парентеральной доставки, устройства для внутривенной доставки, устройства для внутримышечной доставки, устройства для интраперитонеальной доставки, устройства для трансдермальной или внутрикожной доставки, устройства для легочной доставки, устройства для интраартериальной доставки, устройства для интратекальной доставки, устройства для внутрисуставной доставки, устройства для подкожной доставки, устройства для интраназальной доставки, устройства для офтальмологической доставки, устройства для вагинальной доставки, устройства для ректальной доставки, шприца, устройства для трансдермальной доставки, устройства для внутрикожной доставки, капсулы, таблетки, небулайзера, ингалятора, аэрозольного ингалятора, порошкового ингалятора, дозирующего ингалятора и катетера. В варианте осуществления
устройство для доставки лекарственного средства является устройством для трансдермальной или внутрикожной доставки.
Соответственно, изобретение относится к устройству для легочной доставки, содержащему полипептид, отдельный вариабельный домен, композицию или антагонист по изобретению. Устройство может являться ингалятором или устройством для интраназального введения. Соответственно, устройство для легочной доставки делает возможной доставку терапевтически эффективной дозы лиганда и т.д. по изобретению.
В другом варианте осуществления изобретение относится к устройству для офтальмологической доставки, содержащему полипептид, отдельный вариабельный домен, композицию или антагонист по изобретению. Соответственно, устройство для глазной доставки делает возможной доставку терапевтически эффективной дозы лиганда и т.д. по изобретению.
Как используют в настоящем описании, термин "доза" относится к количеству лиганда, вводимого индивидууму полностью одновременно (однократной дозе), или за два или более введения за определенный интервал времени. Например, доза может относится к количеству лиганда (например, лиганда, содержащего отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, связывающийся с TGFpRII), вводимому индивидууму в течение одних суток (24 часа) (суточная доза), двух дней, одной недели, двух недель, трех недель или одного или нескольких месяцев (например, посредством однократного введения или за два или более введений). Интервал между дозами может являться любым желаемым количеством времени. В конкретном варианте осуществления отдельный вариабельный домен или полипептид по изобретению вводят в кожу посредством инъекции, в частности, посредством внутрикожной доставки, еженедельно или раз в две недели или каждые 7-10 дней, например, каждые 7, 8, 9 или 10 дней.
В одном из вариантов осуществления отдельный вариабельный домен по изобретению предоставляют в виде мономера dAb, необязательно, немодифицированного (например, без пегилирования или повышения времени полужизни) или соединенного с PEG, необязательно, в виде порошкообразного состава, необязательно,
для доставки пациенту посредством ингаляции (например, легочной доставки), необязательно, для лечения и/или профилактики состояния легких (например, идиопатического легочного фиброза).
Лиганды по изобретению обладают несколькими
преимуществами. Например, как представлено в настоящем описании, лиганд можно адаптировать так, чтобы он имел желаемое время полужизни in vivo в сыворотке. Доменные антитела гораздо меньше, чем общепринятые антитела, и их можно вводить для достижения лучшего проникновения в ткани, чем в случае общепринятых антител. Таким образом, dAb и лиганды, содержащие dAb, обладают преимуществами по сравнению с общепринятыми антителами при введении для лечения заболевания, такого как заболевание, опосредуемое передачей сигнала TGFp. В частности, легочная доставка dAb по настоящему изобретению для лечения идиопатического легочного фиброза делает возможной конкретную местную доставку ингибитора передачи сигнала TGFp. Предпочтительно, немодифицированный мономер dAb, специфически связывающий и ингибирующий TGFpRII, является достаточно небольшим для абсорбции в легких посредством легочной доставки.
Примеры из W02007085815 включены в настоящее описание в качестве ссылки для описания подробностей соответствующих анализов, модификации и экспериментов, которые в равной степени можно применять к лигандам по настоящему изобретению.
Все публикации, включая, в качестве неограничивающих примеров, патенты и патентные заявки, цитируемые в этом описании, включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Далее изобретение описывают в следующих примерах исключительно в иллюстративных целях.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Отбор dAb, связывающихся с TGFpRII Отбор dAb, связывающихся с TGFpRII мыши
Отбор наивных клонов: использовали наивные фаговые библиотеки 4G и 6G, фаговые библиотеки, представляющие отдельные вариабельные домены антитела, экспрессируемые с использованием лидерной последовательности GAS1 (см.
WO2005093074) в случае 4G и дополнительно с предварительным отбором способом нагревания/охлаждения в случае 6G (см. WO041017 90). Лучшие DOM2 3 выделяли пэннингом совокупностей библиотек VH и VK (идентифицированных как 4G Н11-19 и 6G VH2-4 (VH dAb) и 4G к1, 4G к2 и 6G к (VK dAb) ) с использованием рекомбинантного химерного белка TGF-pRII/Fc мыши и человека. Эти химерные белки получали с помощью экспрессии последовательности ДНК, кодирующей остатки аминокислот 24-159 внеклеточного домена рецептора TGF-p типа II человека (Lin, et al., 1992, Cell 68:775-785), подвергнутого слиянию с Fc-областью IgGl человека в линии эмбриональных клеток почки человека HEK-F.
Рекомбинантные химерные белки TGF-pRII/Fc мыши и человека биотинилировали с использованием реагента EZ-LINK(tm) Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Rockford, USA) (Henderikx, et al. , 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display: Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press). Фаговые библиотеки объединяли в шесть групп: 4G к1 и к2, 6G к, 4G Hll-13, 4G Н14-16, 4G Н17-19 и 6G VH2-4. Объединяли по lxlO11 фагов на библиотеку.
Фаги блокировали в 2% порошковом молоке MARVEL(tm) в фосфатно-солевом буфере (MPBS) с добавлением 10 мкМ Fc-фрагмента IgG человека (нативный Fc-фрагмент IgG, полученный из IgG плазмы человека с миеломой, Calbiochem, California, US, кат. № 4 01104) в течение одного часа. 200 нМ биотинилированного TGF-pRII/Fc мыши инкубировали со смесью блокированного фага и Fc-фрагмента в течение 1 часа при комнатной температуре и затем фиксировали на стрептавидиновых DYNAbeads(tm) (Dynal, UK) в течение пяти минут. Бусы промывали семь раз 1 мл фосфатно-солевого буфера/0,1% TWEEN(tm) (PBST) с последующим промыванием 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Биотинилированный фаг, соединенный с TGF-pRII/Fc мыши, элюировали в 500 мкл 1 мг/мл трипсина в PBS в течение 10 минут и затем использовали для инфицирования 1,75 мл Escherichia coli TGI в фазе логарифмического роста в течение 3 0 минут. Клетки помещали на чашки с агаровой средой 2 х TYE (триптон, дрожжевой экстракт),
дополненной 15 мкг/мл тетрациклина. Для последующих раундов отбора клетки соскребали с чашек и использовали для инокуляции 50 мл культур в 2 х TY (триптон, дрожжевой экстракт) + 15 мкг/мл тетрациклина, выращенных в течение ночи при 37°С для амплификации фага.
Амплифицированный фаг выделяли посредством
центрифугирования ночной культуры в течение 10 минут при 4566 д. 4 0 мл супернатанта, содержащего амплифицированный фаг, добавляли в 10 мл PEG/NaCl (20% об./масс. PEG 8000 + 2, 5 М NaCl) и инкубировали на льду в течение 45-60 минут. Образцы центрифугировали в течение 3 0 минут при 4566 g для пеллетирования осажденного фага. Супернатант удаляли и фаговый осадок ресуспендировали в 2 мл 15% об./об. глицерина/PBS. Образец фага переносили в пробирки Eppendorf по 2 мл и центрифугировали в течение 10 минут при g для удаления любого оставшегося детрита бактериальных клеток. Фага использовали в качестве исходного фага для второго раунда отбора. Второй раунд отбора осуществляли, как описано для первого раунда, за исключением добавления приблизительно 1х1010 фагов и использования в отборе 200 нМ TGF-pRII/Fc человека или 20 нМ TGF-pRII/Fc мыши.
Продукты второго раунда клонировали из вектора fd-фага, pDOM4 в pDOMlO. Вектор pDOM4 является производным вектора fd-фага, в котором последовательность сигнального пептида в гене III заменяют сигнальным пептидом заякоренного в гликолипиды поверхностного белка дрожжей (GAS). Он также содержит метку с-тус между лидерной последовательностью и геном III, сдвигающую ген III обратно в рамку считывания. Эта лидерная последовательность хорошо функционирует в векторах для фагового дисплея, а также в других прокариотических векторах экспрессии, и ее можно использовать универсально. pDOMlO является плазмидным вектором, сконструированным для экспрессии растворимых dAb. Он основан на векторе pUC119 с экспрессией под контролем промотора LacZ. Экспрессию dAb в супернатант обеспечивали слиянием гена dAb с универсальным сигнальным пептидом GAS (см. WO2005093074) на N-конце. Кроме того, на С
конец dAb помещали FLAG-метку.
Субклонирование генов dAb осуществляли посредством
выделения ДНК pD0M4 из клеток, инфицированных селектированным
dAb-представляющим fd-фагом, с использованием набора QIAPREP(tm)
Spin MINIPREP(tm) по инструкциям производителя (кат. № 27104,
Qiagen). ДНК амплифицировали с помощью ПЦР с использованием
биотинилированных олигонуклеотидов DOM57 (5'
TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3' (SEQ ID N0:197) и DOM6 (5'-
CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3' (SEQ ID N0:198)), рестрицировали с
использованием эндонуклеаз рестрикции Sail и NotI и лигировали
с pDOMlO, рестрицированным Sail и NotI. Клетки Е. coli НВ2151
трансформировали продуктами лигирования посредством
электропорации и помещали на планшеты с TYE (триптоном с дрожжевым экстрактом), дополненным 100 мкг/мл карбенициллина
(TYE-carb). Снимали отдельные клоны и экспрессировали в среде для автоиндукции Overnight Express (системе высокоуровневой экспрессии белка, Novagen), дополненной 100 мкг/мл карбенициллина, в 9б-луночных планшетах, выращивали при встряхивании при температуре 30°С или 37°С. Затем эти планшеты для экспрессии центрифугировали при 18 00 g в течение 10 минут. Клоны dAb, связывающиеся с TGF-pRII/Fc мыши и/или человека, идентифицировали скринингом с помощью ELISA и BIACORE(tm) (GE HEALTHCARE(tm)) или скринингом с помощью анализа связывания MSD
(Meso Scale Discovery). В случае ELISA 9б-луночные планшеты для иммунологических анализов Maxisorp(tm) (Nunc, Denmark) покрывали TGF-pRII/Fc человека или мыши в течение ночи при 4°С. Лунки промывали три раза PBST и затем блокировали 1% TWEEN(tm) в PBS
(1%TPBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. Снимали блокирование, добавляли 1:1 смесь 1% TPBS и супернатанта dAb и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшет промывали три раза PBST, добавляли детекторное антитело
(моноклональное антитело против-FLAG М2 с пероксидазой, Sigma-Aldrich, UK) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. В планшеты добавляли колориметрический субстрат
(раствор SUREBLUE(tm) 1-Component ТМВ MicroWell Peroxidase, KPL, Maryland, USA) и измеряли оптическую плотность (OD) при 450 нМ,
где OD450 пропорциональна количеству связанного детекторного антитела. В случае BIACORE(tm) супернатанты разбавляли 1:1 в буфере HBS-EP и подвергали скринингу с использованием BIACORE(tm) на связывание биотинилированного TGF-pRII/Fc человека и мыши
(чип SA, покрытый 1500 Ru биотинилированного hRII-Fc и 1550 Ru биотинилированного mRII-Fc по инструкциям производителя)
(BIACORE(tm), GE HEALTHCARE(tm)). Образцы анализировали с помощью BIACORE(tm) при скорости потока 50 мкл/мин. Отбор и скрининг наивных клонов Отбор dAb, связывающих TGFpRII человека
Отбор наивных клонов осуществляли, как описано для TGFpRII мыши, но с использованием 150 и 15 нМ биотинилированного TGFpRII/Fc человека в раунде один и два, соответственно. Третий раунд осуществляли с использованием того же способа, что и для раунда два, но с 1,5 нМ биотинилированного TGFpRII/Fc человека.
Продукты третьего раунда клонировали из вектора fd-фага, pDOM4 в pDOMlO. Субклонирование генов dAb осуществляли посредством выделения ДНК pDOM4 из клеток, инфицированных селектированным dAb-представляющим fd-фагом с использованием набора QIAPREP(tm) Spin MIDIPREP(tm) по инструкциям производителя (кат. № 27104, Qiagen). Плазмидную ДНК рестрицировали эндонуклеазами рестрикции Sail и NotI и вставку гена dAb лигировали с pDOMlO, рестрицированным эндонуклеазами рестрикции Sail, NotI и Pstl. Клетки Е. coli НВ2151 трансформировали продуктами лигирования с помощью электропорации и помещали на планшеты с TYE (триптоном и дрожжевым экстрактом), дополненным 100 мкг/мл карбенициллина (TYE-carb). Снимали отдельные клоны и экспрессировали в 9б-луночных планшетах при 2 50 об./мин., 30°С в течение 72 часов в 1 мл/лунку среды для автоиндукции Overnight Express (Novagen), дополненной 100 мкг/мл карбенициллина. Затем эти планшеты центрифугировали при 18 00 g в течение 10 минут. Супернатанты с растворимым dAb подвергали скринингу на связывание антигена в анализе связывания TGFpRII MSD, комбинированном с анализом концентрации посредством определения поляризации флуоресценции. Количество связывающих TGFpRII человека средств являлось высоким, и было слишком много
клонов для дальнейшего исследования. В связи с этим, секвенировали подгруппу клонов и далее исследовали клоны с уникальными последовательностями.
Анализ связывания TGFBRII MSD
Этот анализ использовали для определения активности связывания dAb против TGFpRII. Антигеном TGFpRII-Fc покрывали планшет для MSD, который затем блокировали для предотвращения неспецифического связывания. Добавляли серийно разведенные супернатанты, содержащие растворимые dAb с меткой FLAG. После инкубации планшет промывали, и только dAb, специфически связавшиеся с TGFBRII-Fc, оставались связавшимися с планшетом. Связавшиеся dAb определяли с использованием рутенилированного антитела против метки FLAG и буфера для считывания MSD. Если концентрацию dAb в разведениях супернатанта определяли с использованием анализа концентрации с определением поляризации флуоресценции, то затем строили кривые связывания и концентраций.
0,5 мкл на лунку 60 мкг/мл TGFpRII-Fc человека, 60 мкг/мл TGFpRII-Fc мыши или 60 мкг/мл Fc IgGl человека (R &D systems, кат. № 110-HG) наносили на 384-луночные планшеты MSD с высокой связывающей способностью (Meso Scale Discovery). Планшеты сушили воздухом при комнатной температуре в течение минимум четырех часов и не более чем в течение ночи. Планшеты блокировали 50 мкл на лунку 5% MARVEL(tm) в забуференном Трисом физиологическом растворе (TBS) + 0,1 % TWEEN(tm) 2 0 в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Блокирующий реагент удаляли из лунок встряхиванием планшетов. Серию разведений супернатантов с dAb 1:3 получали в среде 2 х TY. Экспрессировали dAb в векторе экспрессии pDOMlO таким образом, что белок dAb экспрессировался как слитый с FLAG белок. Блокирующий реагент удаляли и переносили 10 мкл на лунку разведенных супернатантов с dAb в блокированные планшеты для MSD. Супернатанты с dAb подвергали скринингу с построением 4-точечных кривых или 11-точечных кривых. В дополнение к разведенным супернатантам с dAb в каждый планшет включали два контроля, один контроль низкого уровня (нормализованный по 0%
связыванию) без специфичности связывания TGFpRII и один контроль высокого уровня (нормализованный по 10 0% связывания) с высокой специфичностью связывания TGFpRII, данные не приведены.
Планшеты инкубировали с супернатантами с dAb и контрольными образцами в течение одного часа при комнатной температуре и затем промывали три раза 50 мкл на лунку TBS + 0,1% TWEEN(tm). В планшеты добавляли 15 мкл/лунку рутенилированного антитела против FLAG и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Антитело против FLAG
(моноклональное антитело против FLAG М2, Sigma, UK, кат. № F3165) конъюгировали с эфиром рутений(II)трис-бипиридина и N-гидроксисукцинимида по инструкциям производителя (Meso Scale Discovery, кат. № R91BN-1). Рутенилированное антитело против FLAG добавляли во все лунки за исключением контрольных лунок с антителом мыши против Fc IgGl человека. Вместо этого добавляли 15 мкл/лунку метки MSD против мыши (Meso Scale Discovery, кат. № R31AC-1). Метку MSD против мыши разводили в 2% MARVEL(tm) в TBS + 0,1% TWEEN(tm) 20 до конечной концентрации 750 нг/мл. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение одного часа и промывали три раза 50 мкл на лунку TBS + 0,1% TWEEN(tm). В каждую лунку добавляли 35 мкл 1-кратного буфера для считывания MSD
(Meso Scale Discovery) и планшеты анализировали с помощью спектрофотометра MSD Sector 6000 (Meso Scale Discovery).
Данные анализировали с использованием ХС50 Activity Base. Все данные нормировали по среднему для лунок с контролями низкого и высокого уровней на каждом планшете, где контроль низкого уровня нормировали по 0% связыванию и контроль высокого уровня нормировали по 10 0% связыванию. К нормированным данным применяли построение 4-параметрической кривой и строили кривые концентрации и связывания с использованием концентраций dAb, вычисленных с использованием анализа концентрации dAb с использованием поляризации флуоресценции при анализе супернатантов.
Используемое 4-параметрическое уравнение являлось следующим:
(а - d)
у = ъ + d
i + (c)
где a является минимумом, b является коэффициентом Хилла, с является ХС50, и d является максимумом.
Анализ концентрации dAb с определением поляризации флуоресценции при анализе супернатантов
Этот анализ позволяет определять концентрацию растворимых меченых FLAG dAb, экспрессирующихся в супернатантах. Флуоресцентно меченый пептид FLAG смешивали с антителом против FLAG. Флуоресцентные молекулы возбуждали поляризованным светом с длиной волны 531 нМ и испускаемый поляризованный свет считывали при длине волны 595 нМ. Добавление меченого FLAG dAb приводило к вытеснению флуоресцентного пептида из антитела против FLAG, что в свою очередь приводило к снижению поляризации сигнала эмиссии. Получали стандартную кривую с известными концентрациями очищенного меченого FLAG VH контрольного dAb и использовали для обратного вычисления концентраций растворимых dAb в супернатантах. Данные о концентрации комбинировали с данными об активности связывания, что позволяло строить кривые связывания и концентрации для супернатантов с dAb.
Получали серийные разведения 1:2 супернатантов с dAb в среде 2 х TY (1:2, 1:4, 1:8 и 1:16) с последующим разведением в фосфатно-солевом буфере (PBS) 1:10. Разведенные супернатанты переносили на черный 384-луночный планшет. Строили стандартную кривую по серийным разведениям очищенного VH контрольного dAb 1:1,7 в 10% об./об. среды 2 х TY в PBS. Наибольшая концентрация dAb составляла 10 мкМ, а всего получали 16 разведений. 5 мкл каждого разведения переносили на 384-луночный планшет. Получали смесь 5 нМ пептида FLAG, меченого СуЗЬ на С-конце, 100 мМ моноклонального антитела против FLAG М2 (Sigma, кат. № F3165), 0,4 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 2 мМ буфера CHAPs. 5 мкл смеси переносили в лунки, содержащие разведенные dAb (лунки с супернатантами и для построения стандартной кривой). Планшет центрифугировали при 1000 об./мин. (216 д) в
течение 1 минуты и затем инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Планшеты анализировали с использованием спектрофотометра ENVISION(tm) (Perkin Elmer), оборудованного следующими фильтрами:
Фильтр возбуждения: BODIPY TMR FP 531 Эмиссионный фильтр 1: BODIPY TMR FP Р pol 595 Эмиссионный фильтр 2: BODIPY TMR FP P pol 595 Зеркало: BODIPY TMR FP Dual Enh
Строили стандартную кривую и использовали ее для обратного вычисления концентраций растворимых dAb в супернатантах.
dAb, связывающие TGF-pRII/Fc мыши и человека, идентифицированные с помощью анализов связывания ELISA, BIACORE(tm) и MSD, экспрессировали в среде для автоиндукции Overnight Express (ONEX(tm), Novagen) при 30 °C в течение периода от 4 8 до 72 часов. Культуры центрифугировали (4600 об./мин. в течение 3 0 минут) и супернатанты инкубировали с бусами STREAMLINE(tm) с протеином A (Amersham Biosciences, GE HEALTHCARE(tm), UK. Связывающая способность: 5 мг dAb на мл бус) в течение ночи при 4°С или при комнатной температуре в течение по меньшей мере одного часа. Бусы упаковывали в колонку для хроматографии и промывали 1-кратным или 2-кратным PBS, а затем 10 или 100 мМ Трис-HCl с рН 7,4 (Sigma, UK). Связавшиеся dAb элюировали 0,1 М глицин-HCl с рН 2,0 и нейтрализовывали 1М Трис с рН 8,0. Измеряли OD dAb при 2 80 нм и определяли концентрации белка с использованием коэффициента экстинкции, вычисленного по композициям аминокислот dAb.
Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты лучших наивных dAb против TGFRII человека и против TGFRII мыши указаны ниже.
Аминокислотная последовательность Dom23h 802 (SEQ ID N0:1) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEGTMWWVRQAPGKGLEWVSAILAAGSNTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKKRQERDGFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты Dom23h 802 (SEQ ID N0:39)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTGAGGGGACGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG
AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTTTGGCTGCTGGTTCTAATACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAAGAGGCAGGAGCGGGATGGG TTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность Dom23h 803 (SEQ ID N0:2) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAGRMWWVRQAPGKGLEWVSAINRDGTRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHDDGHGNFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты Dom23h 803 (SEQ ID N0:40)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGTGCTGGGCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCGATTAATCGGGATGGTACTAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGTGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATGATGATGGTCATGGTAAT TTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-813 (SEQ ID N0:3) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTDDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIQPDGHTTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEQDVKGSSSFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-813 (SEQ ID N0:41)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGATGATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTCAGCCTGATGGTCATACGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGAACAGGATGTTAAGGGGTCGTCT TCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-815 (SEQ ID N0:4) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAEDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIDPQGQHTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQSTGSATSDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-815 (SEQ ID N0:42)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCGGAGGATCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTGATCCTCAGGGTCAGCATACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGTCTACTGGGTCTGCTACG
TCTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-828 (SEQ ID N0:5) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMSYRMWWVRQAPGKGLEWVSAISPSGSDTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQWEYSRTHKGVFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-828 (SEQ ID N0:43)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTATGAGTTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTTCTCCGAGTGGTAGTGATACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGTGGTGGAGTATTCGCGT ACTCATAAGGGTGTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-830 (SEQ ID N0:6) EVQLLESGGGLVQPGGFLRLSCAASGFTFEGYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIDSLGDRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQGLTHQSPSTFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-830 (SEQ ID N0:44)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTTCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGGGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTGATTCTCTGGGTGATCGTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGTCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGGGCTTACGCATCAGTCT CCGAGTACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-831 (SEQ ID N0:7) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEAYKMTWVRQAPGKGLEWVSYITPSGGQTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYGSSFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-831 (SEQ ID N0:45)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGGCGTATAAGATGACGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTGGAGTGGGTCTCATATATTACGCCGTCTGGTGGTCAGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATATGGTTCGAGTTTTGACTAC TGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-840 (SEQ ID N0:8) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGDGRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEGAGSDTYYADS
VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQASRNSPFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-840 (SEQ ID N0:46)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGGATGGTCGTATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTGAGGGGGCGGGTTCGGATACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGTCGCGGAATTCGCCG TTTGACTACTGGGGTCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-842 (SEQ ID N0:9) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDSEMAWARQAPGKGLEWVSLIRRNGNATYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVTKDRSVLFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-842 (SEQ ID N0:47)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATGATAGTGAGATGGCGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCACTTATTCGGCGTAATGGTAATGCTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTACGAAGGATCGTTCTGTG CTTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-843 (SEQ ID N0:10)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDQDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIESGGHRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQNESGRSGFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-843 (SEQ ID N0:48)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATCAGGATCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTGAGAGTGGTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGAATGAGTCGGGGCGTTCG GGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-850 (SEQ ID N0:11)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDAARMWWARQAPGKGLEWVSAIADIGNTTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQSGSEDHFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-850 (SEQ ID N0:49)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATGCGGCTAGGATGTGGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGG AAG G G T С TAGAG T G G G T С T СAG С GAT T G С G GATAT T G G TAATAC TACATAC TAC G СAGAC T С С GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGTCTGGTTCGGAGGATCAT TTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-854 (SEQ ID N0:12)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFAQDRMWWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDLHGTSSLFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-854 (SEQ ID N0:50)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGCTCAGGATCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGATTTGCATGGTACTAGT TCTTTGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-855 (SEQ ID N0:13)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENTSMGWVRQAPGKGLEWVSRIDPKGSHTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQRELGKSHFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-855 (SEQ ID N0:51)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAATACGAGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAG G G T С TAGAG T G G G T С T СAC G TAT T GAT С С TAAG G G TAG T СATACATAC TAC G СAGAC T С С GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAATACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGCGTGAGTTGGGTAAGTCG CATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-865 (SEQ ID N0:14)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSYEMTWVRQAPGKGLEWVSKIDPSGRFTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRTDLQLFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-8 65 (SEQ ID NO:52)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTCGTAGTTATGAGATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAAAGATTGATCCTTCGGGTCGTTTTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGTCGGACGGATCTTCAGCTT TTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-866 (SEQ ID N0:15)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMRWARQAPGKGLEWVSYITPKGDHTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAESLHNERVKHFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-8 66 (SEQ ID NO:53)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTCGAATTATTGGATGCGGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGG AAG G G T С TAGAG T G G G T С T СATATAT TAC T С С TAAG G G T GAT СATACATAC TAC G СAGAC T С С GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGGAATCGCTTCATAATGAGCGTGTT AAGCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-874 (SEQ ID N0:16)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYRMWWVRQAPGKGLEWVSVIDSTGSATYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQQAGSAMGEFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-874 (SEQ ID NO:54)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACTAGTTATCGTATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGTTATTGATTCTACTGGTTCGGCTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGCAGGCTGGGAGTGCGATG GGGGAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-883 (SEQ ID N0:17)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFVNYRMWWVRQAPGKGLEWVSAISGSGDKTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGLS FDYWGQGTLVTVS S
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-883 (SEQ ID NO:55)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGTTAATTATCGTATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGATAAGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACATGGGCTGTCGTTTGACTAC TGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-903 (SEQ ID N0:18)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNDMRMWWVRQAPGKGLEWVSVINADGNRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGLPFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-903 (SEQ ID N0:56)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAATGATATGAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAG G G T С TAGAG T G G G T С T СAG T GAT TAAT G С T GAT G G TAATAG GACATAC TAC G СAGAC T С С GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATGGGCTGCCTTTTGACTAC TGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23m-4 (SEQ ID N0:19) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTTYGMGWVRQAPGKGLEWVSWIEKTGNKTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAGRHIKVRSRDFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23m-4 (SEQ ID NO:57)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGACTTATGGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAG G G T С TAGAG T G G G T С T CAT G GAT T GAGAAGAC G G G TAATAAGACATAC TAC G СAGAC T С С GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGCGGGGAGGCATATTAAGGTG CGTTCGAGGGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23m-29 (SEQ ID N0:20) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFKRYSMGWVRQAPGKGLEWVSVINDLGSLTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGNISMVRPGSWFDYWGQGTLVTVS S
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23m-29 (SEQ ID N0:58)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAAGAGGTATTCTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGTTATTAATGATCTGGGTAGTTTGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGGAATATTAGTATGGTGAGG CCGGGGAGTTGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23m-32 (SEQ ID N0:21) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFFEYPMGWVRQAPGKGLEWVSVISGDGQRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSHTGTVRHLETFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23m-32 (SEQ ID N0:59)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTTTGAGTATCCTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGTTATTAGTGGGGATGGTCAGCGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGTCATACGGGGACTGTGAGG CATCTGGAGACGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23m-62 (SEQ ID N0:22) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQESMYWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGTRIKQGFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23m-62 (SEQ ID N0:60)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGTCAGGAGAGTATGTATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGTGGTACGCGGATTAAGCAG GGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23m-71 (SEQ ID N0:23) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMDYRMYWVRQAPGKGLEWVSGIDPTGLRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKIKWGEMGSYKTFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23m-71 (SEQ ID N0:61)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTATGGATTATAGGATGTATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGGGATTGATCCTACTGGTTTGCGGACATACTACGCAGACTCC
GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATTAAGTGGGGGGAGATGGGG AGTTATAAGACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23m-72 (SEQ ID N0:24) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMDYDMSWVRQAPGKGLEWVSMIREDGGKTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKARVPYRRGHRDNFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23m-72 (SEQ ID NO:62)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTATGGATTATGATATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAATGATTCGTGAGGATGGTGGTAAGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGCGAGGGTGCCTTATCGGCGT GGGCATAGGGATAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23m-81 (SEQ ID N0:25) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEPVIMGWVRQAPGKGLEWVSAIEARGGGTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGRHLSQDFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23m-81 (SEQ ID NO:63)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCTTCCGGATTCACCTTTGAGCCGGTTATTATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTGAGGCGCGGGGTGGGGGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCTGGGCGGCATCTTAGTCAG GATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23m-99 (SEQ ID N0:26) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDRYRMMWVRQAPGKGLEWVSTIDPAGMLTY YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRLASRSHFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23m-99 (SEQ ID NO:64)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATCGGTATCGTATGATGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAACGATTGATCCTGCTGGTATGCTTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAGGCTGGCTTCGCGGAGTCAT TTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23m-101 (SEQ ID N0:27)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYDMAWVRQAPGKGLEWVSRIRSDGVRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRAKNGWFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23m-101 (SEQ ID NO:65)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGCGCAGCCTCCGGATTCACCTTTTCTGAGTATGATATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTTGAGTGGGTCTCACGGATTCGTTCTGATGGTGTTAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGATCGTGCTAAGAATGGTTGG TTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-352 (SEQ ID N0:28)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDKYKMAWVRQAPGKGLEWVSLIFPNGVPTYYANS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYSGQGRDFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-352 (SEQ ID N0:66)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATAAGTATAAGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTGGAGTGGGTCTCACTTATTTTTCCGAATGGTGTTCCTACATACTACGCAAACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATATAGTGGTCAGGGGCGGGAT TTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Последовательности CDR dAb против TGF|3RII человека
CDR этих лучших наивных dAb против TGFRII человека и против TGFRII мыши, определенные по Rabat, представлены в таблицах 1 и 2 ниже, соответственно.
Термическую стабильность dAb определяли с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Диализировали dAb в течение ночи в PBS до конечной концентрации 1 мг/мл. Буфер для диализа использовали в качестве референса для всех образцов. Измерения DSC осуществляли с использованием микрокалориметра с капиллярными ячейками GE HEALTHCARE(tm)-MICROCAL(tm)VP-DSC при скорости нагревания 180°С/час. Типичный
диапазон сканирования составлял от 20-90°С и для референсного буфера, и для образца белка. Каждый раз осуществляли повторное сканирование для оценки степени рефолдинга белка в этих экспериментальных условиях. После каждого сканирования образца белка капиллярную ячейку очищали раствором 5% DECON(tm) (Fisher-Scientific) в воде с последующим сканированием с PBS. Полученные данные измерений анализировали с использованием программного обеспечения Origin 7.0. Данные DSC, полученные при сканировании референсного буфера, вычитали из данных сканирования образца белка. Точную молярную концентрация в образце белка включали в анализ данных для получения значений температуры плавления (Тт), энтальпии (АН) и Вант-Гоффа (AHv). Данные аппроксимировали для недвухстадийной модели (N2M). Лучшей аппроксимации достигали с 1 или 2 переходами. Значения Тт, полученные для dAb, представленных в этом описании, находились в диапазоне от 52,1°С до 73,3°С. Значения Тт и процентная доля рефолдинга представлены в таблице 3.
Пример 3. SEC-MALLS (эксклюзионная хроматография с детектированием рассеяния лазерного излучения с кратными углами) - наивные клоны
Для определения того, являются ли dAb мономерными, или образуют в растворе олигомеры более высокого порядка, их анализировали с помощью SEC-MALLS (эксклюзионной хроматографии с детектированием рассеяния лазерного излучения с кратными углами). Систему для ВЭЖХ серии Agilent 1100 с автосемплером и УФ-детектором (контролируемым с помощью программного обеспечения Empower) подключали к Wyatt Mini Dawn Treos
(детектору рассеяния лазерного излучения (LS)) и Wyatt Optilab rEX DRI (детектору дифференциального показателя преломления
(RI)) . Детекторы подключали в следующем порядке -UV-LS-RI. Инструменты RI и LS работали при длине волны 658 нм; УФ-сигналы считывали при 280 нм и 220 нм. Доменные антитела (инъекция 100 микролитров при концентрации 1 мг/мл в PBS) разделяли по их гидродинамическим свойствам с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки GE HEALTHCARE(tm) 10/300
Superdex 75. Подвижной фазой являлся PBS с 10% этанолом. Интенсивность рассеянного излучения при прохождении белка через детектор измеряли как функцию угла. Это измерение, учитываемое вместе с концентрацией белка, определяемой с использованием детектора RI, делает возможным вычисление молярной массы с использованием соответствующих уравнений (неотъемлемой части аналитического программного обеспечения Astra v.5.3.4.14). Все dAb, представленные в настоящем описании, имели содержание мономеров в диапазоне б5%-98%. Данные представлены в таблице 4.
DOM2 3m-81
He определено
DOM2 3m-99
DOM23m-101
77,4
DOM2 3m-352
*Эти dAb анализировали с использованием тех же настроек SEC-MALLS, что описаны выше, за исключением использования системы Shimadzu LC-2 0AD Prominence для ВЭЖХ. Эти dAb также анализировали на колонке Superdex7 5, но буфером подвижной фазы являлся PBS.
Молекулы, приведенные в таблицах 3 и 4, выбирали на основе состояния в растворе (склонность к мономерному состоянию) и термической стабильности. Все молекулы демонстрировали > 65% склонность к мономеризации и сохраняли третичную структуру после нагревания по меньшей мере до 52°С.
Пример 4. Анализы ингибирования TGFpRII (наивные клоны)
Люциферазный анализ МСЗТЗ-Е1 - способ ml:
В люциферазном анализе МСЗТЗ-Е1 измеряют способность dAb ингибировать индуцируемую TGFp экспрессию CAGA-люциферазы в клетках МСЗТЗ-Е1. Три копии TGFp-чувствительного мотива, называемого CAGA box, присутствуют в промоторе PAI-1 человека и специфически связываются с белками Smad3 и 4. Клонирование многочисленных копий CAGA box в люциферазную репортерную конструкцию придает клеткам, трансфицированным с использованием репортерной системы, чувствительность к TGFp. В этом анализе использовали клетки МСЗТЗ-Е1 (остеобласты мыши), стабильно трансфицированные с использованием [CAGA] 12-люциферазной репортерной конструкции (Dennler, et al. (1998) EMBO J. 17, 3091-3100).
Растворимые dAb тестировали на их способность блокировать передачу сигнала TGFpl через путь Smad3/4.
Протокол, используемый для получения данных,
представленный как способ ml в таблице 5, являлся следующим. В кратком изложении, 2,5> <104 клеток МСЗТЗ-Е1 на лунку в среде для анализа (среда RPMI (Gibco, Invitrogen Ltd, Paisley, UK) , 10% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка и 1%
пенициллин/стрептомицин) добавляли в культуру ткани в 9 6-луночном планшете (Nunc), а затем добавляли dAb и TGFpl
(конечная концентрация 1 нг/мл) и инкубировали в течение шести часов при 37°С, 5% С02. Перед тестированием dAb диализировали в PBS. В лунки добавляли люциферазный реагент BRIGHTGLOW(tm)
(Promega, UK) и инкубировали при комнатной температуре в течение двух минут, позволяя клеткам лизироваться и получая люминесценцию, измеряемую с помощью люминометра.
Модифицированный люциферазный анализ МСЗТЗ-Е1 - способ т2. Клетки МСЗТЗ-Е1 добавляли в 9б-луночные планшеты (Nunc 13610) при концентрации 1,25> <104 клеток на лунку в "питательную среду для чашек Петри" (MEM-Альфа + рибонуклеозиды + дезоксирибонуклеозиды (Invitrogen 22571), 5% очищенной на активированном угле FCS (Perbio Sciences UK Ltd; SH30068.03), 1/100 пирувата натрия (Invitrogen 11360), 250 мкг/мл генетицина 50 мг/мл (Invitrogen, 10131027) и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% С02. Среды для клеток заменяли "средами для анализа" (DMEM (Invitrogen 31966021,) 25 мМ Hepes (Invitrogen)) и очищенные dAb в PBS в 4-кратной конечной концентрации для анализа титровали в "среду для анализа" и добавляли в планшеты для культивирования, а затем добавляли TGF-pl (R &D, 240В) при 4-кратном ЕС80. Планшеты инкубировали в течение шести часов при 37°С, 5% С02. В лунки добавляли люциферазный реагент STEADYLITE(tm) (PerkinElmer 6016987), инкубировали при комнатной температуре в течение 3 0 минут и полученную люминесценцию измеряли на спектрофотометре для чтения планшетов ENVISION(tm).
При анализе каждое dAb титровали в двух повторениях и определяли максимальный % ингибирования (п=2). Анализ осуществляли множество раз для получения среднего значения и диапазона максимального % ингибирования, приведенных в таблице 5. Анализ удовлетворял параметрам QC; низкомолекулярное соединение для внутреннего пользования демонстрировало диапазон IC50 от 100 до 900 нМ в случае анализов с использованием
Анализ осуществляли множество раз для получения среднего значения и диапазона максимального % ингибирования, приведенных в таблице 5. Этот способ модифицировали, и он описан ниже.
принадлежащих мыши клонов. Также, робастные Z-факторы составляли более 0,4, и ECso TGF-p находилась в пределах б-кратной концентрации, добавляемой при анализе. Анализ высвобождения ИЛ-11 из А54 9- hi
В анализе высвобождения интерлейкина-11 (ИЛ-11) из А54 9 измеряют способность dAb ингибировать стимулированное TGFpl человека высвобождение ИЛ-11 из клеток А549. TGFpl связывается непосредственно с TGFpRII и индуцирует сборку комплекса TGFpRI/II. TGFpRI фосфорилируется и способен передавать сигнал через несколько путей, включая путь Smad4. Активация пути Smad4 приводит к высвобождению ИЛ-11. ИЛ-11 секретировался в супернатант клеток, и затем его измеряли с помощью колориметрической ELISA.
Растворимые dAb тестировали на их способность блокировать передачу сигнала TGFpl через путь Smad4. В кратком изложении, 1х105 клеток А549 на лунку в "среде для анализа" (среда DMEM с высоким содержанием глюкозы (Gibco(tm), Invitrogen Ltd, Paisley, UK) , 10% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка (РАА, Austria), 10 мМ HEPES (Sigma, UK) и 1 % пенициллин/стрептомицин
(РАА, Austria)) добавляли в 9б-луночный планшет для культивирования ткани (Nunc), затем добавляли dAb и TGFpl
(конечная концентрация 3 нг/мл) (R &D Systems, Abingdon, UK) и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% С02. Перед анализом dAb диализировали в PBS. Концентрацию высвобождающегося в супернатант ИЛ-11 измеряли с использованием набора DUOSET(tm) для ИЛ-11 человека (R &D systems, Abingdon, UK) по инструкциям производителя.
Анализ высвобождения ИЛ-11 из А54 9 приведен в таблицах 5 и б как способ анализа hi. Анализ осуществляли множество раз для получения среднего значения и диапазона максимального % ингибирования, приведенных в таблице 5. Анализ удовлетворял параметрам QC; низкомолекулярное соединение для внутреннего пользования демонстрировало диапазон IC50 от 50 до 500 нМ для анализов с использованием принадлежащих человеку клонов.
Анализ клеток НЕК 293Т с SBE-bla с использованием сенсоров
- h2:
Члены семейства молекул передачи сигнала Smad являются компонентами внутриклеточного пути, передающего сигналы TGFp с поверхности клетки в ядро. TGFpl связывается непосредственно с TGFPRII и индуцирует сборку комплекса TGFpRI/II. Затем TGFPRI фосфорилирует Smad2 и Smad3, и впоследствии они образуют гетеромерный комплекс с другим членом семейства Smad, Smad4. Эти комплексы переносятся в ядро, где они связываются с ДНК и регулируют транскрипцию генов.
Клетки НЕК 2 93Т с SBE-bla для анализа с использованием сенсоров содержат бета-лактамазный репортерный ген под контролем Smad-связывающего элемента (SBE), стабильно встроенный в клетки НЕК 2 93Т (Invitrogen, UK) . Клетки чувствительны к TGFpl, и их можно использовать для определения агонистов/антагонистов пути передачи сигнала Smad2/3.
Растворимые dAb тестировали на их способность блокировать передачу сигнала TGFpl через этот путь, следуя представленному ниже способу, основанному на оптимизированном способе от Invitrogen, UK, (клеточная линия К1108).
Анализ осуществляли непосредственно на замороженных клетках, выращенных по меньшей мере при 4 пассажах в средах для выращивания (DMEM с высоким содержанием глюкозы, Invitrogen 21068028, 10% диализированная U.S. FBS (Invitrogen 26400-044), 0,1 мМ (1/100) заменимые аминокислоты (Invitrogen 11140-050), 25 мМ (1/40) буфер HEPES (Sigma Н0887), 1 мМ (1/100) пируват натрия (Invitrogen 11360-070), 1% GLUTAMAX(tm) (200 мМ Invitrogen 35050038), 5 мкг/мл бластицидина (Invitrogen R21001)) и замороженных для внутреннего пользования (при 4 * 107/мл). Клетки помещали в концентрации 2 0000 клеток на лунку в планшеты для клеточных культур (Costar 3712) в питательных средах для чашек Петри (как указано выше, с 1% FCS и без бластицидина) . После инкубации клеток в течение ночи очищенные dAb разводили в "средах для анализа" (DMEM (Invitrogen 31966021,) 25 мМ Hepes (Invitrogen) и добавляли в клетки для анализа при 4-кратной конечной концентрации. После 1 часа инкубации при 37 °С добавляли TGFp (R &D Systems; 240В) при 4-кратной ECso и инкубировали в течение следующих 5 часов. Субстрат LIVEBLAZER(tm)
(Invitrogen K1030) получали по инструкциям производителя и добавляли при 8-кратном объеме. Планшеты инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 16 часов и анализировали на спектрофотометре для чтения планшетов ENVISION(tm) по протоколу Invitrogen.
Анализ НЕК с SBE-Ыа CELLSENSOR(tm) представлен в таблицах 5 и б как способ п2. При анализе каждое dAb титровали в двух повторениях и определяли IC50 и максимальный % ингибирования (п=2) . В связи с трудностями получения сплошных кривых в анализе с использованием принадлежащих мыши клонов в таблице 5 приведены только % ингибирования. Анализ осуществляли множество раз для получения среднего значения и диапазона значений, приведенных в таблицах 5 и б. Арифметическое среднее IC50 вычисляли с использованием PIC50 (-log IC50) , и диапазона, вычисленного сложением и вычитанием логарифмического стандартного отклонения из среднего pICso, и затем преобразовывали обратно в IC50. Анализ удовлетворял параметрам QC; низкомолекулярное соединение для внутреннего пользования демонстрировало диапазон IC50 от 50 до 500 нМ для анализов с использованием принадлежащих человеку клонов. Также, робастные Z-факторы составляли более 0,4, и ЕС8о TGFp находилось в пределах б-кратной концентрации, добавляемой при анализе. Результаты представлены в таблицах 5 и б.
Таблица 5
Данные функционального анализа клеток для специфичных принадлежащих мыши клонов и VH контрольных dAb.
Анализ клеток мыши ЗТЗ
Анализ высвобождения ИЛ-11 (hi) или анализ НЕК с SBE-bla CELLSENSOR(tm) (h2)
Максимальный % ингибирования
Максимальный % ингибирования
Способ анализа
Среднее
Диапазон
Способ анализа
Среднее
Диапазон
DOM23m-04
73,3
8,4
68,8-83
70,7
6,4
67-78
DOM23m-04
69,0
DOM23m-29
54,2
5,2
50,5-57,9
DOM23m-32
39,7
4,0
36,9-42,5
DOM23m-62
78,6
79,0
DOM23m-71
44,9
9,3
38,3-51,4
-2,0
DOM23m-72
17,5
24,7
0-34,9
1,7
DOM23m-81
30,3
11,5
21-47
DOM23m-99
46,5
28,0
26,7-93,5
DOM23m-101
48,0
22,0-74,1
59,8
27,0
17-81
DOM23h-352
48,0
23,9
16,8-78,9
46,7
36,5
5,7-86
VHDUM-2
21,4
13,2
21-33,9
46,0
29,6
17-84
VHDUM-2
22,5
22,5
Таблица б
Данные функционального анализа специфических принадлежащих
что они демонстрировали более чем 4 0% нейтрализацию TGFp в нескольких анализах. Единственным исключением из этого являлся DOM23m-72. Также клоны демонстрировали хорошие кривые нейтрализации (данные не приведены). Принадлежащие человеку
клоны подвергали отбору на основе того, что средние IC50 составляли менее 15 мкМ.
Мутагенез с внесением ошибок осуществляли для улучшения аффинности dAb, определенных как активные dAb с подходящими биофизическими характеристиками (описываемыми выше).
Конструирование фаговой библиотеки: Библиотеки DOM23h-843,
DOM23h-850, DOM23h-854, DOM23h-855, DOM23h-865, DOM23h-866,
DOM23h-874, DOM23h-883, DOM23h-439 и DOM23h-903 с внесением
ошибок получали с использованием набора для случайного
мутагенеза GENEMORPH(tm) II (Stratagene, кат. № 200550). Гены-
мишени dAb амплифицировали с помощью ПЦР с использованием ДНК-
полимеразы Taq и олигонуклеотидов DOM008 (5'-
AG С G GATААСAAT Т Т СACACAG GA- 3' (SEQ ID N0:185)) и DOM009 (5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (SEQ ID N0:186)) с последующей повторной амплификацией разведенного продукта ПЦР с олигонуклеотидами DOM172 (5' -TTGCAGGCGTGGCAACAGCG-3' (SEQ ID N0:187)) и DOM173 (5'-CACGACGTTGTAAAACGACGGCC-3' (SEQ ID N0:188)) и ДНК-полимеразой MUTAZYME(tm) II по инструкциям производителя. Этот продукт ПЦР далее амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы Taq и олигонуклеотидами DOM172 и DOM17 3 для повышения выхода ДНК-продукта. Продукт ПЦР рестрицировали с использованием эндонуклеаз рестрикции Sail и NotI. Нерестрицированный продукт и рестрицированные концы удаляли из расщепленного продукта с использованием стрептавидиновых бус (Dynal Biotech, UK) . Для отбора против TGFpRII человека с внесением ошибок рестрицированный продукт лигировали в фаговый вектор pD0M4, рестрицированный эндонуклеазами рестрикции Sail и NotI и использовали для трансформации клеток Е. coli TBI. Трансформированные клетки помещали на агар 2 х TY, дополненный 15 мкг/мл тетрациклина, получая размеры библиотеки > 1> <107 трансформантов.
Отбор специфичных dAb против TGFpRII человека с внесением ошибок: Осуществляли три раунда отбора с использованием библиотек DOM23h-843, DOM23h-850, DOM23h-854, DOM23h-855,
Пример 5. Созревание аффинности наивных клонов с внесением ошибок (из примера 1)
DOM23h-865, DOM23h-866, DOM23h-874, DOM23h-883, DOM23h-903 и
DOM23h-439. Первый раунд осуществляли с использованием 1 нМ
биотинилированного TGFpRII/Fc человека (N13241-57). Для второго
и третьего раундов использовали два различных способа, способ 1
с использованием димерной формы антигена TGFpRII/Fc и способ
два с использованием растворимой мономерной формы TGFpRII.
Способ 1: Второй раунд осуществляли с 1 нМ биотинилированным
TGFpRII/Fc человека и его конкурентом, 1 мкМ
небиотинилированного TGFpRII/Fc человека. Третий раунд осуществляли с использованием 100 пМ биотинилированного TGFpRII/Fc человека и 1 мкМ небиотинилированного TGFpRII/Fc человека (N12717-4). Способ 2: Второй раунд осуществляли с использованием 1 нМ биотинилированного TGFpRII человека и его конкурента, 1 мкМ небиотинилированного TGFpRII человека. Третий раунд осуществляли с использованием 100 пМ биотинилированного TGFpRII человека и его конкурента 1 мкМ небиотинилированного TGFPRII человека.
Продукты второго и третьего раунда отбора субклонировали в
вектор pDOM13, как описано выше. Снимали отдельные клоны и
экспрессировали их в 9б-луночных планшетах при 850 об./мин.,
37°С в течение 24 часов, 90% влажности в 0,5 мл/лунку среды для
автоиндукции Overnight Express, дополненных 100 мкг/мл
карбенициллина. Затем планшеты центрифугировали при 18 00 g в
течение 10 минут. Супернатанты разводили 1/5 или 1/2 в буфере
HBS-EP и подвергали скринингу с использованием BIACORE(tm) на
связывание с биотинилированным TGFpRII/Fc человека (чип SA,
покрытый 100 0 Ru биотинилированного hRII-Fc по инструкциям
производителя) (BIACORE(tm), GE HEALTHCARE(tm)). Образцы
анализировали с использованием BIACORE(tm) при скорости потока 50 мкл/мин. Клоны, связывающиеся с большим количеством резонансных единиц (RU) или с улучшенной скоростью обратной реакции по сравнению с родительским клоном, экспрессировали в 50 мл среды для автоиндукции Overnight Express при 30 °С в течение периода от 48 до 72 часов и центрифугировали при 4600 об. /мин. в течение 3 0 минут. Супернатанты инкубировали в течение ночи при 4°С с бусами STREAMLINE(tm)-npoTenH А. Затем бусы упаковывали в
проточные колонки, промывали 5 объемами колонки 2-кратного PBS, затем одним объемом слоя 10 мМ Трис-HCl с рН 7,4, и связавшиеся dAb элюировали в 0,1 М глицин-HCl с рН 2,0 и нейтрализовывали 1 М трис-HCl с рН 8,0. Измеряли OD dAb при 280 нм и определяли концентрации белка с использованием коэффициентов экстинкции, вычисленных по композициям аминокислот dAb.
Анализ in vitro улучшенного отбора по обратной скорости с внесением ошибок: Очищенные dAb подвергали тем же тестам, что и в случае отбора наивных клонов, а именно анализу клеток НЕК 293Т с SBE-bla с использованием сенсоров Biacore (h2), DSC и SEC-MALLS. Примеры улучшенных клонов в настоящем описании приведены в таблице 6А. Значения IC50 представляют собой среднее для количества экспериментов "п".
*Количество экспериментов для вычисления средних IC50 приведено в скобках
Аффинно зрелые последовательности
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-855-21 (SEQ ID N0:203)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTC TCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGAATACGAGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCT С СAG G GAAG G G T С TAGAG T G G G T С T СAC G TAT T GAT С С TAAG G G TAG T СATACATAC TAC ACAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAATACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGCGT GAGTTGGGTAAGTCGTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-855-21 (SEQ ID N0:204)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFENTSMGWVRQAPGKGLEWVSRIDPKGSHTYY TDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQRELGKSYFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-843-13 (SEQ
ID N0:205)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTC TCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATCAGGATCGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCC CCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATTGAGAGTGGTGGTCATAGGACATACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAATCAGAAT AAGTCGGGGCGTTCGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-843-13 (SEQ ID N0:206)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDQDRMWWVRQAPGKGLEWVSAIESGGHRTY
YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCANQNKSGRSGFDYWGQGTLVTVS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-439-20 (SEQ ID N0:207)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCATGCGGCTGGGGTTTCG GGTACTTATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-20 (SEQ ID N0:208)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRHAAGVSGTYFDYWGQGTLVTVSS Пример 6. Аффинное созревание линии DOM23h-271-7 Аминокислотная последовательность DOM23h-271 (SEQ ID N0:199)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271 (SEQ ID N0:200)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGTGG
ACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-7 (SEQ ID N0:201)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-7 (SEQ ID N0:202)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGTGG ACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Доменное антитело DOM23h-271(SEQ ID N0:199) выделяли из фаговых библиотек на предыдущих этапах отбора и выделяли вариант DOM23h-271-7 (SEQ ID N0:201) после созревания аффинности с внесением ошибок, как описано в W0 2011/012609. DOM23h-271-7 (SEQ ID N0:201) выбирали для дальнейшего созревания аффинности на основе его кинетики связывания, последовательности и биофизических характеристик. Созревание аффинности осуществляли с помощью мутагенеза с использованием вырожденных праймеров для повторной диверсификации CDR, и лучшие из них идентифицировали с использованием ДНК-дисплея или фагового дисплея. Конструировали два типа библиотек для повторной диверсификации CDR и обозначали их как триплетная библиотека и библиотека, содержащая примесь библиотеки. Для получения триплетных библиотек конструировали олигонуклеотидные праймеры, покрывающие каждую CDR, и в каждом праймере кодоны для трех аминокислот заменяли кодонами NNS таким образом, что диверсифицировали три положения. Использовали многочисленные олигонуклеотиды для покрытия всех целевых аминокислот в каждой CDR: 2 для CDR1, 3 для CDR2 и б для CDR3. Комплементарные олигонуклеотидные праймеры использовали для амплификации фрагмента последовательности, содержащего каждую мутантную CDR, а также перекрывающегося фрагмента последовательности, покрывающего остальную часть кодирующей последовательности dAb.
Эти фрагменты смешивали и собирали с помощью ПЦР с достройкой перекрывающихся участков для получения полноразмерной кодирующей последовательности dAb. Этот продукт амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров DOM172 (SEQ ID N0:187) и DOM173 (SEQ ID N0:188), рестрицировали с использованием Sail и NotI и лигировали в аналогично рестрицированный pD0M4 (описано выше) для отбора с помощью фагового дисплея или р1Е2А2 (описываемый в WO2006018650) для отбора с помощью ДНК-дисплея. Аналогичным способом конструировали библиотеки, содержащие примесь, по-существу, как описано в WO2006018650. Для покрытия всех мутаций в каждой CDR использовали единственный вырожденный олигонуклеотидный праймер. В каждом праймере аминокислоты для диверсификации определяли с использованием вырожденных кодонов для определения разных аминокислот. Пять аминокислот диверсифицировали в CDR1, 7 в CDR2 и 13 в CDR3. В праймерах использовали следующее вырожденное кодирование: "а" = 91% А + 3% Т + 3% G + 3% С; "д" = 91% G + 3% Т + 3% С + 3% А; "с" = 91% С + 3% Т + 3% G + 3% A; "t" = 91% Т + 3% А + 3% G + 3% С; "S" = 50% G и 50% С. Заглавными буквами указывают 100% определенного нуклеотида. Использовали праймеры: 271-7Rldeg CDR1
(GCAGCCTCCGGATTCACCTTTacSgaStatagSATGtgSTGGGTCCGCCAGGCTCCG GGG) (SEQ ID N0:189); 271-7R2deg CDR2
(GGGTCTCGAGTGGGTCTCAgcSATTgaSccSatSggSaaScgSACATACTACGCAGA CTCCGTG) (SEQ ID N0:190); 271-7R3deg CDR3:
(GCGGTATATTACTGTGCGAAAcaSatSccSggScgSaaStgSacSgcSaaStcScgS ttSGACTACTGGGGTCAGGG) (SEQ ID N0:191).
Вырожденные праймеры библиотеки использовали тем же способом, что и триплетные праймеры. Каждую диверсифицированную CDR амплифицировали раздельно и затем комбинировали с фрагментом родительской последовательности с использованием ПЦР с достройкой перекрывающихся участков. Фрагменты субклонировали в pD0M4 и р1Е2А2 с использованием Sail и NotI.
ДНК-дисплей
Отбор осуществляли с использованием компартментализации in
vitro в эмульсиях и ДНК-дисплея с использованием ДНК-
связывающего белка scArc, по-существу, как описано в
WO2006018650. В кратком изложении, антиген TGF(3RII-FC
биотинилировали с использованием биотина в молярном отношении
5:1 и набора EZ-LINK(tm) Sulpho-NHS-LC-Biotin (Thermo #21327).
Фрагмент ДНК, содержащий операторные последовательности Arc и
экспрессирующую кассету, содержащую диверсифицированную
библиотеку dAb, амплифицировали с помощью ПЦР из вектора р1Е2А2
с использованием фланкирующих праймеров. Продукт выделяли из
eGel (Invitrogen) и разводили до 1,7 или 0,85 нМ в 1 мг/мл BSA.
Для отбора улучшенных связывающих средств библиотеки,
содержащие примесь, и триплетные библиотеки обрабатывали
раздельно в немного различающихся условиях. Триплетные
библиотеки CDR комбинировали для получения объединенных
библиотек CDR 1, 2 или 3. Использовали десять раундов отбора
для каждого типа библиотек. При обоих способах после 2 циклов
отбора диверсифицированные CDR амплифицировали и
рекомбинировали с помощью ПЦР с достройкой перекрывающихся участков для получения 4-ой библиотеки с мутациями во всех 3 CDR.
В случае библиотек, содержащих примесь, 5x108 копий ДНК смешивали с 50 мкл смеси для трансляции in vitro EXPRESSWAY(tm)
(Invitrogen). Каждая реакция включала 10,0 мкл экстракта SLYD(tm); 10,0 мкл 2,5-кратного реакционного буфера; 12,5 мкл 2-кратного загрузочного буфера; 1,0 мкл метионина (75 мМ) ; 1,25 мкл смеси аминокислот (50 мМ) ; 15 мкл ЩО; 0,5 мкл полимеразы Т7; 0,25 мкл mAb против НА 3F10 (Roche, кат. № 1 867 423) ; и 1,5 мкл глутатиона (100 мМ) (Sigma). Все это добавляли к 800 мкл гидрофобной фазы (4,5% SPAN(tm)-80, (Fluka) + 0,5% Triton Х-100
(Sigma) в минеральном белом легком масле (Sigma)) в 4 мл стеклянном сосуде (CHROMACOL(tm) 4SV Р837) и перемешивали при 2000 об./мин. в течение 4-5 минут. Сосуды запаивали и инкубировали в течение 3 часов при 30°С. Все последующие этапы проводили при комнатной температуре. Для экстракции комплексов ДНК-белок в сосуд добавляли 200 мкл буфера С+ (10 мМ Трис, 0,1 М КС1, 0,05%
TWEEN(tm)-20, 5 мМ MgCl2, 1% BSA, рН 7,4) и 500 мкл гексана,
смешивали, переносили в микропробирку и центрифугировали при
13000 g в течение 1 минуты. Удаляли органическую фазу и
повторно экстрагировали водную фазу с использованием 800 мкл
гексана еще 3-5 раз до тех пор, пока поверхность раздела не
станет почти четкой. В первых 5 раундов отбора
биотинилированный TGFpRII-Fc предварительно связывали со
стрептавидиновыми DYNAbeads(tm) (Invitrogen) и добавляли к
экстрагированным комплексам для получения концентрации
антигена, равной 40, 40, 10, 5и5 нМ антигена (раунды 1, 2, 3,
4 и 5, соответственно). Для раундов отбора 1-3 использовали
бусы Т1, а для раундов 4 и 5 - С1. После 30 минут инкубации
бусы промывали буфером С+ 3-5 раза. Затем оставшиеся комплексы
ДНК, связавшиеся с бусами, выделяли с помощью ПЦР с
фланкирующими праймерами. Раунды отбора 6-10 обозначали как
отбор "растворимых dAb", где биотинилированный TGFpRII-FC
добавляли непосредственно к комплексам после экстракции для
получения концентрации 5, 5, 4, 5 и 5 нМ (раунды б, 7, 8, 9 и
10, соответственно) и инкубировали в течение 30 минут, позволяя
осуществляться связыванию. Затем добавляли небиотинилированный
TGFpRII-FC в качестве конкурента до концентрации 74, 750, 400,
250 и 250 нМ (раунды б, 7, 8, 9 и 10, соответственно) и
инкубировали в течение 15, 15, 30, 30 и 30 минут (раунды б, 7,
8, 9 и 10, соответственно) . В раунды 9 и 10 включали
двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий операторную
последовательность ARC, в концентрации 50 нМ в буфере С+, используемом в экстракции гексаном, для снижения перекрестных реакций между любыми не образовавшими комплексы ДНК и избытка белка, высвобождающегося из эмульсии. После периода конкуренции добавляли 10 мкл стрептавидиновых DYNAbeads(tm) С1. После 10 минут бусы 5 раз промывали буфером С+ и выделяли связавшиеся комплексы с помощью ПЦР с фланкирующими праймерами, как описано выше. Продукт ПЦР очищали с использованием eGel и использовали для следующего цикла отбора. После 10-го отбора выделенный продукт подвергали рестрикции ферментами Sail и NotI и клонировали в аналогично рестрицированный pDOM13 для
экспрессии.
Триплетные библиотеки подвергали отбору аналогичным способом, за исключением того, что использовали 1> <109 копий ДНК в первом раунде отбора, а затем 5хЮ8. Кроме того, время инкубации для экспрессии белка в эмульсии снижали до 2 часов. Растворимый биотинилированный TGFpRII-Fc использовали во всех десяти раундах отбора в концентрации 25, 10, 5, 5, 5, 5, 2,5, 2,5, 2,5, 2,5, 2,5, 2,5 нМ, соответственно. Биотинилированную мишень инкубировали с экстрагированными комплексами в течение 3 0 минут. В раундах отбора 5-10 добавляли конкурентный небиотинилированный TGFpRII-Fc до конечной концентрации 2 50 нМ за 15, 30, 60, 60, 75 и 90 минут, соответственно, до добавления стрептавидиновых DYNAbeads(tm) С1. В раунде 5 конкуренция проходила при комнатной температуре, но с раунда б температуру конкуренции повышали до 30°С. Операторный олигонуклеотид-имитацию Arc включали в раунды отбора 1-4 для снижения перекрестного образования комплексов дефектной ДНК.
После отбора кодирующие dAb вставки вырезали из экспрессирующих кассет ДНК-дисплея с использованием Sail и NotI и клонировали в бактериальный вектор экспрессии pDOM13. Последовательности dAb секвенировали, и экспрессировали их в среде ТВ ONEX(tm), а супернатанты подвергали скринингу с помощью BIACORE(tm) для идентификации клонов с улучшенными скоростями обратной реакции по сравнению с родительскими dAb. Клоны с улучшенными скоростями обратной реакции экспрессировали, очищали и оценивали на аффинность с помощью BIACORE(tm) и на активность в клеточном анализе с использованием сенсоров. Не выбирали клоны, имеющие плохие кинетические профили, содержащие нежелательные последовательности или имеющие очень низкий выход. Выбирали три интересующие клона. Клоны DOM23h-271-21
(SEQ ID N0:29) и DOM23h-271-22 (SEQ ID N0:30) выделяли при отборе из библиотеки, содержащей примесь. Клон DOM23h-271-27
(SEQ ID N0:31) выделяли при отборе из триплетной библиотеки. Аффинность выбранных клонов к TGFpRII-Fc человека представлена в таблице 7.
Фаговый дисплей:
Триплетные библиотеки или библиотеки, содержащие примесь, для раздельных совокупностей CDR1, CDR2 и CDR3 подвергали раундам фагового отбора, как описано выше, с использованием антигена биотинилированного TGFpRII/Fc человека в течение 4 раундов в концентрациях 10 нМ, 1 нМ, 100 пМ и 2 0 пМ, соответственно, или двух раундов отбора с использованием 20 пМ, а затем 2пМ антигена. Вставки, прошедшие отбор с использованием фагового дисплея, клонировали в вектор экспрессии pDOMlO и для дальнейшего исследования выбирали супернатанты с dAb со скоростями обратной реакции, лучшими, чем у родительских dAb. Доменные антитела экспрессировали и очищали по их аффинности и биологической активности против антигена TGFpRII/Fc человека, тестируемой с помощью BIACORE(tm) Т100 и клеточного анализа с использованием сенсоров, описываемого выше (данные не приведены). Аффинность выбранных клонов к TGFpRII-Fc человека представлена в таблице 8.
Таблица 8
Образец
Ka (M-l.c-1)
Kd (с-1)
KD (М)
271-101
3,73Е+06
0,02014
5,40Е-09
271-102
9,35Е+06
0,01531
1,64Е-09
271-105а*
3,29Е+06
0,00747
2,27Е-09
Определяли последовательность выбранных клонов с улучшенной активностью, и полные последовательности и последовательности CDR представлены ниже.
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-21 (SEQ ID N0:29)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGRKWTAKFRWDYWGQGTLVIVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-21 (SEQ ID NO:67)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACCGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCGGGCCGGAAGTGG ACGGCCAAGTTCCGCTGGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCATCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-22 (SEQ ID N0:30)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGQKWMAKSRFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-22 (SEQ ID N0:68)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC
AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCCGGCCAGAAGTGG ATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-27 (SEQ ID N0:31)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGQKTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVIVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-27 (SEQ ID N0:69)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCAGAAGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGTGG ACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCATCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-101 (SEQ ID NO:32)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANGRKDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-101 (SEQ ID N0:70)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGTGG ACTGCTAATGGTCGTAAGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-102 (SEQ ID N0:33)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKWTANSRFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-102 (SEQ ID N0:71)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC
AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGA7AACAGATTCCGGGGCGTAAGTGG ACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-105 (SEQ ID N0:34)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTY
YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGQRWTGNSRFDYWGQGTL
VTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-105 (SEQ ID N0:72)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCAGCGGTGG ACTGGTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-106 (SEQ ID N0:35)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQFPGRKWTANSRSDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-106 (SEQ ID N0:73)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGTTTCCGGGGCGTAAGTGG ACTGCTAATTCGCGGTCTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-114 (SEQ ID N0:36)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQIPGRKGTANSRFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-114 (SEQ ID N0:74)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCAGACTCC
GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATTCCGGGGCGTAAGGGA ACTGCTAATTCGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Таблица 9
Последовательности CDR 271 аффинно зрелых клонов с улучшенной
активностью
CDR1 (Rabat 2 635)
CDR2 (Rabat 5 065)
CDR3 (Rabat 95102)
DOM23h-271-21
GFTFTEYRMW (SEQ ID NO:105)
AIEPIGNRTYYADSVRG (SEQ ID N0:141)
QMPGRRWTARFRWDY (SEQ ID NO:177)
DOM23h-271-22
GFTFTEYRMW (SEQ ID NO:106)
AIEPIGNRTYYADSVRG (SEQ ID N0:142)
QMPGQRWMARSRFDY (SEQ ID NO:178)
DOM23h-271-27
GFTFTEYRMW (SEQ ID NO:107)
AIEPIGQRTYYADSVRG (SEQ ID N0:143)
QIPGRRWTANSRFDY (SEQ ID NO:179)
DOM23h-271-101
GFTFTEYRMW (SEQ ID NO:108)
AIEPIGNRTYYADSVRG (SEQ ID N0:144)
QIPGRRWTANGRRDY (SEQ ID N0:180)
DOM23h-271-102
GSTFTEYRMW (SEQ ID NO:109)
AIEPIGHRTYYADSVRG (SEQ ID N0:145)
QIPGRRWTANSRFDY (SEQ ID N0:181)
DOM23h-271-105
GFTFTEYRMW (SEQ ID NO:110)
AIEPIGNRTYYADSVRG (SEQ ID N0:146)
QIPGQRWTGNSRFDY (SEQ ID NO:182)
DOM23h-271-106
GFTFTEYRMW (SEQ ID N0:111)
AIEPIGNRTYYADSVRG (SEQ ID N0:147)
QFPGRRWTANSRSDY (SEQ ID NO:183)
DOM23h-271-114
GFTFTEYRMW (SEQ ID N0:112)
AIEPIGNRTYYADSVRG (SEQ ID N0:148)
QIPGRRGTANSRFDY (SEQ ID NO:184)
N.B CDR2 и CDR3 определяли no Rabat. CDR1 определяли с помощью комбинации способов Rabat и Chothia.
Общий способ определения кинетики связывания - Т100 Анализ BIACORE(tm) осуществляли с использованием фиксирующей поверхности чипа СМ4. В качестве фиксирующего средства использовали IgG против человека и присоединяли его к биосенсорному чипу СМ4 с помощью присоединения первичных аминогрупп. Молекулу антигена, слитую с Fc человека, фиксировали на этой иммобилизованной поверхности на уровне от 2 50 до 300 резонансных единиц и определенные концентрации доменных антител, разведенных в подвижном буфере, пропускали через эту фиксирующую поверхность. Инъекцию буфера на
поверхность с фиксированным антигеном использовали для двойного сопоставления. После каждой инъекции доменного антитела фиксирующую поверхность восстанавливали с использованием раствора 3 М хлорида магния; восстановлением удаляли фиксированный антиген, но не влияли значительно на способность поверхности фиксировать антиген в следующем цикле. Все запуски осуществляли при 25°С с использованием буфера HBS-EP в качестве подвижного буфера. Данные получали с использованием BIACORE(tm) Т100 и аппроксимировали к модели связывания 1:1, включенной в программное обеспечение. Когда при наиболее высокой концентрации наблюдали неспецифическое связывание, кривую связывания при этой концентрации удаляли из анализа. Дальнейшая диверсификация CDR3
Производные DOM23h-271-7 с наибольшей аффинностью содержали метионин в положениях 96 и 10 0В. Эти положения вместе с положениями 99, 100D, 100Е и 100G диверсифицировали с использованием мутагенеза NNK для определения того, где можно делать замены. Библиотеку NNK конструировали, как описано выше, с использованием праймера PEP-2 6-F для внесения различий в выбранных положениях в каркас DOM23h-271-22 или DOM23h-271-102. DOM23h-271-102 содержит мутации в положениях 27 и 55, придающие ему улучшенную аффинность по сравнению с DOM23h-271-7.
PEP-26-F (SEQ ID N0:209) GCGGTATATTACTGTGCGAAACAGNNSCCCGGCNNSAAGTGGNNSGCCNNSNNSCGCNNSGAC TACTGGGGTCAGGGAACC
Конструировали библиотеки ДНК-дисплея и подвергали их отбору с помощью биотинилированного hTGFpRII-Fc, как описано выше, с использованием концентраций 5 нМ; 0,5 нМ; 0,1 нМ; 0,1 нМ; 0,1 нМ; и 0,1 нМ в последующих раундах. В раундах отбора 46 добавляли конкурентный небиотинилированный TGFpRII-Fc до конечной концентрации 100 нМ за 60, 90 и 90 минут, соответственно, до добавления стрептавидиновых DYNAbeads(tm) С1. После отбора вставки dAb амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров PelB NcoVh и РЕР011, рестрицировали с помощью Ncol и EcoRI и клонировали в бактериальный вектор экспрессии рСЮ.
PelB NcoVh (SEQ ID N0:210)
GCCCAGCCGGCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGG PEP011 (SEQ ID N0:211)
GAATTCGCGGCCGCCTATTAGCTCGAGACGGTGACCAGGG
Клонированные продукты экспрессировали и подвергали скринингу с помощью Biacore. Клоны со скоростями обратной реакции, аналогичными или лучше, чем у DOM23h-271-22, секвенировали, очищали и оценивали на аффинность с помощью BIACORE(tm) и на активность с помощью клеточного анализа с использованием сенсоров. Не выбирали клоны, имеющие плохие кинетические профили, содержащие нежелательные мотивы или имеющие очень плохой выход. Для дальнейшего созревания аффинности выбирали DOM23h-271-50.
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM-271-50 (SEQ ID N0:212)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGG CTCGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM-271-50 (SEQ ID N0:213 и дублирующая запись SEQ ID N0:214)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWLARGRLDYWGQGTLVTVSS
Пример 7. Встраивание мутаций в последовательности dAb против TGFpRII (линии DOM23h-271) в положениях 61 и 64
Ранее двойные мутации D61N и K64R встраивали в различные линии dAb против TGFpRII и демонстрировали их улучшенную активность (WO2011/012609). Эти мутации встраивали в dAb против TGFpRII линии DOM2 3h-2 71 для наблюдения того, можно ли достигать аналогичного улучшения активности. Исследовали альтернативные мутации в этом положении для определения того, можно ли достигать дополнительного улучшения активности.
Мутации встраивали в остов DOM23h-271 (SEQ ID N0:199) с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с достройкой
перекрывающихся участков (Но, et al. , Gene 1989 77(1)); для
получения двух фрагментов ДНК, имеющих перекрывающиеся или
комплементарные концы, использовали комплементарные
олигонуклеотидные праймеры. Эти фрагменты объединяли с помощью
последующей полимеразной циклической сборки, в которой отжигали
перекрывающиеся концы, позволяя перекрывающемуся 3'-участку
каждой цепи служить в качестве праймера для достройки в
направлении 3' комплементарной цепи и получая слитый продукт,
который далее амплифицировали с помощью ПЦР. Конкретные
изменения нуклеотидной последовательности осуществляли
внесением изменений нуклеотидов в перекрывающиеся
олигонуклеотидные праймеры. Фрагменты гена-мишени dAb амплифицировали с помощью двух отдельных ПЦР с использованием полимеразы SUPERTAQ(tm) (НТ Biotechnology). Выбирали DOM23h-271, т.к. он имел низкую аффинность к TGFpRII, таким образом, что улучшения аффинности можно четко измерять с использованием BIACORE(tm). Мутации в положениях 61 и 64 кодировали с использованием вырожденного олигонуклеотида для мутагенеза обоих положений в комбинации, намереваясь использовать отбор по аффинности для обогащения мутантов с улучшенной аффинностью связывания. Т.к. известно, что мутация NR доминирует, то избегали наличия этой мутации в библиотеке, используя ограниченный кодон NNG в положении 61. Этот кодон кодирует 13 аминокислот, но не включает аминокислоты F, Y, С, Н, I, N или D. Свободный Cys не является предпочтительным в dAb, и аспарагин также является нежелательным в этом положении, таким образом, исключали только 5 комбинаций желаемых аминокислот. В положении 64 кодон NNK использовали для получения всего диапазона возможных аминокислот.
Парами олигонуклеотидов, используемыми для внесения
мутаций, являлись РЕ008 (фланкирует 5'-конец гена dAb: 5'-
TTGCAGGCGTGGCAACAGCGTCGACAGAGGTGCAGCTGTTGGAG-3') (SEQ ID
N0:192) с 271-6164 R (5'-GCGTAGTATGTACGATTACCAATCGG-3') (SEQ ID N0:193) и мутантный 271-6164 deg-F (мутантные остатки подчеркнуты: 5'-GGTAATCGTACATACTACGCANNGTCCGTGNNKGGCCGGTTCACCATCTCCCGC-3') (SEQ
ID N0:194) с AS1309 (фланкирует 3'-конец гена dAb: 5'-
TGTGTGTGTGTGGCGGCCGCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGACCCCA-3') (SEQ
ID N0:195). Два фрагмента продукта ПЦР соединяли с помощью
полимеразной циклической сборки с использованием ДНК-полимеразы
SUPERTAQ(tm) без добавления праймеров. Затем продукт слияния
амплифицировали добавлением фланкирующих праймеров РЕ0 0 8 и
AS1309 в реакцию ПЦР. Мутантное dAb рестрицировали
эндонуклеазами рестрикции Sail и NotI, лигировали в аналогично
рестрицированный вектор экспрессии pD0M13 и трансформировали
клетки E.Coli НВ2151 с его использованием. Мутацию D61N, K64R
также вносили в DOM2 3h-2 71 тем же способом, но заменяя праймер
271-6164 NR-F (5'-
GGTAATCGTACATACTACGCAAACTCCGTGCGCGGCCGGTTCACCATCTCCCGC-3') (SEQ ID N0:196) на 271-6164 deg-F. Мутантные dAb определяли секвенированием. Идентифицировали 12 9 клонов с новыми комбинациями мутаций в положениях 61 и 64, хотя 11 несли дополнительные мутации в результате ошибок ПЦР. Они представлены в таблице 11. N. В. Клоны с повышенной аффинностью подчеркнуты. Клоны с дополнительными мутациями указаны звездочкой.
Для определения эффекта мутаций выбранные клоны экспрессировали в ТВ 0NEX(tm) в 9б-луночных планшетах в течение 72 часов при 30 °С или 2 4 часов при 37 °С. Супернатанты очищали посредством центрифугирования и фильтровали через фильтр 0,22 мкм до определения скорости обратной реакции с помощью BIACORE(tm).
Анализ BIACORE(tm) А100 осуществляли с использованием фиксирующей поверхности на чипе СМ5. В качестве фиксирующего средства использовали IgG против человека и соединяли с биосенсорным чипом СМ5 присоединением по первичной аминогруппе. Молекулу антигена, слитую с Fc человека, фиксировали на этой иммобилизованной поверхности на уровне от 2 00 до 300 резонансных единиц и супернатанты или очищенные доменные антитела пропускали через эту фиксирующую поверхность. Инъекцию сред или буфера на поверхность с фиксированным антигеном использовали для двойного сопоставления. На каждую проточную
кювету наносили точку протеина А для подтверждения наличия доменного антитела в каждом инъецируемом образце. После каждой инъекции доменного антитела поверхность восстанавливали с использованием раствора 3 М хлорида магния; восстановлением удаляли фиксированный антиген, но не влияли значительно на способность поверхности фиксировать антиген в следующем цикле. Все запуски осуществляли при 25°С с использованием буфера HBS-ЕР в качестве подвижного буфера. Данные получали с использованием BIACORE(tm) А100 и анализировали с использованием встроенного программного обеспечения. Данные о кинетике от очищенных образцов аппроксимировали к модели связывания 1:1, в то время как скорости обратной реакции для супернатантов анализировали с использованием модели диссоциации 1:1 и/или с использованием уровня связывания и уровня стабильности каждого образца по сравнению с родительской молекулой.
Из тестируемых клонов 4 6 идентифицировали как клоны с улучшенной скоростью обратной реакции по сравнению с родительским dAb DOM23h-271, как представлено в таблице 11. Обнаруживали, что мутации D61R и D61K повышали связывания независимо от мутаций в положении 64. Ряд комбинаций проявляли лучшие свойства, чем исходные мутации D61N, K64R и они включали RE, RM, RF и RY.
Выбранные мутанты с улучшенной скоростью обратной реакции очищали и подвергали полному кинетическому анализу BIACORE(tm) А10 0 для определения их аффинности (Таблица 10) . Термическую стабильность мутантов также определяли получением профилей плавления в присутствие SYPRO(tm) Orange (Invitrogen). В кратком изложении, очищенные dAb разводили до 50 и 100 мкг/мл в разведении SYPRO(tm) Orange 1:500 в PBS и получали кривую плавления при 30-90°С с помощью прибора для ПЦР Mini OPTICON(tm) (BioRad). Tm основного положительного перехода определяли в каждой концентрации и использовали для вычисления приблизительного значения Тт при 1 мг/мл, как показатель температуры плавления для сравнения (Таблица 10).
Выбирали мутации D61R, K64D и D61R, K64F, т.к. они демонстрировали хорошее улучшение аффинности для сниженного
эффекта в отношении Тт. Эти мутации переносили в аффинно зрелое производное DOM23h-271 DOM23h-271-22 (SEQ ID N0:30) для получения dAb DOM23h-271-39 (SEQ ID N0:37) и DOM23h-271-40 (SEQ ID N0:38). Обнаруживали, что эти мутации вызывают повышение аффинности по результатам BIACORE(tm), включая перекрестную реактивность с TGFpRII-Fc мыши, и повышенную активность при клеточном анализе с использованием сенсоров. Однако также обнаруживали, что мутации снижают Тт, измеряемую с помощью DSC, и повышают агрегацию dAb в PBS, измеряемую с помощью SEC-MALLS. Эти анализы осуществляли, как описано выше, за исключением того, что буфер для SEC-MALLS представлял собой 0,4 М NaCl, 0,1 М фосфат натрия и 10% изопропанол с рН7. Эти результаты представлены в таблице 12 (представлены средние значения для анализа клеток человека с использованием сенсоров и ЗТЗ люциферазный анализ мыши).
Последовательности dAb, указанные в этом примере, представлены ниже:
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-39 (SEQ ID N0:37)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYARS VDGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGQKWMAKSRFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-39 (SEQ ID N0:75)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCACGCTCC GTGGACGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCCGGCCAGAAGTGG ATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-40 (SEQ ID N0:38)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGNRTYYARS VFGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQMPGQKWMAKSRFDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-40 (SEQ ID N0:76)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC
61, и Y является положением 64.
TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTAATCGTACATACTACGCACGCTCC GTGTTCGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGATGCCCGGCCAGAAGTGG ATGGCCAAGTCCCGCTTCGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Клоны с улучшенной скоростью обратной реакции подчеркнуты. Клоны с дополнительными мутациями указаны звездочкой.
Пример 8. Созревание аффинности посредством диверсификации CDR линии DOM23h-439-20, D0M2Зп-843-13, D0M23h-855-21 и DOM23h-271-50
Доменные антитела DOM23h-855-21(SEQ ID N0:204) и DOM23h-843-13 (SEQ ID N0:206) выделяли из продуктов созревания аффинности с внесением ошибок, осуществляемого в отношении наивных клонов DOM23h-855 (SEQ ID N0:13) и DOM23h-843 (SEQ ID N0:10), соответственно, как показано в примере 5. Доменное антитело DOM2 3h-4 3 9 выделяли из фаговых библиотек на предыдущих этапах отбора, описываемых в W0 2011/012609, и затем выделяли вариант DOM23h-439-20 (SEQ ID N0:208) посредством созревания аффинности с внесением ошибок, как описано в примере 5. Доменное антитело DOM23h-271-50 (SEQ ID N0:214) получали с помощью повторной диверсификации CDR3 CDR-специфичного аффинно зрелого варианта DOM23h-271-22 (SEQ ID N0:30), как описано в примере 6. Все из DOM23h-855-21, DOM23h-843-13, DOM23h-439-20 и DOM23h-271-50 выбирали для дальнейшего созревания аффинности на основе их кинетики связывания, активности в анализе клеток НЕК 293Т с SBE-bla с использованием сенсоров, последовательности и биофизических свойств. Созревание аффинности осуществляли с помощью мутагенеза с использованием вырожденных праймеров для повторной диверсификации CDR, и лучшие dAb идентифицировали с использованием фагового дисплея. Вариабельность вносили в CDR посредством конструирования библиотек, содержащих примесь, или NNK библиотек.
Осуществляли аффинное созревание DOM23h-271-50 с
использованием NNK библиотек (насыщающий мутагенез) ,
олигонуклеотидные праймеры конструировали для покрытия каждой
CDR и в каждом праймере кодоны для 5 аминокислот заменяли
кодонами NNK таким образом, что одновременно диверсифицировали
5 положений. Одиночные или множественные олигонуклеотиды
использовали для покрытия всех целевых аминокислот в каждой
CDR; 1 для CDR1, 2 для CDR2 и 3 для CDR3. CDR-специфичное
созревание аффинности осуществляли с использованием
полимеразной цепной реакции (ПЦР); комплементарные
олигонуклеотидные праймеры использовали для амплификации
фрагмента последовательности, содержащего каждую мутантную CDR,
а также перекрывающегося фрагмента последовательности,
покрывающего остальную кодирующую последовательность dAb. Эти
фрагменты смешивали и собирали с помощью ПЦР с достройкой
перекрывающихся участков для получения полноразмерной
кодирующей последовательности dAb. Этот продукт амплифицировали
с помощью ПЦР с использованием праймеров PelB NcoVh (SEQ ID
N0:210) и PEP044 (5'-
GGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGCATAATAAGAATTCA-3' (SEQ ID
N0:215), рестрицировали с помощью Ncol и NotI и лигировали в рестрицированный NotI и Ncol гибридный вектор pDOM4-gene3-pelB. Гибридный вектор pDOM4-gene3-pelB является модифицированной версией описываемого выше вектора pD0M4, но модифицированного для замены лидерной последовательности GAS сигнальным пептидом pelB (пектатлиазы В).
Доменные антитела DOM2 3h-8 55-21, DOM2 3h-8 4 3-13 и DOM2 3h-439-20 подвергали аффинному созреванию с использованием библиотек, содержащих примесь. Библиотеки, содержащие примесь, конструировали, по-существу, как описано выше и в WO2006018650. Единственный вырожденный олигонуклеотидный праймер использовали для покрытия всех мутаций в каждой CDR. В каждом праймере аминокислоты, подлежащие диверсификации, определяли с использованием вырожденных кодонов для кодирования множественных аминокислот. Использовали следующие вырожденные кодоны: "а" = 85% А + 5% Т + 5% G + 5% С; "д" = 85% G + 5% Т + 5% С + 5% А; "с" = 85% С + 5% Т + 5% G + 5% A; "t" = 85% Т + 5% А + 5% G + 5% С; "S" = 50% G и 50% С. Заглавными буквами указывают 100% конкретного нуклеотида. В случае содержащей примесь библиотеки DOM23h-439-20 диверсифицировали пять аминокислот в CDR1, б в CDR2 и 11 в CDR3 для включения фенилаланина в положении 100. В случае содержащей примесь библиотеки DOM2 3h-8 55-21 диверсифицировали пять аминокислот в CDR1, 7 в CDR2 и 8 в CDR3. В случае содержащей примесь библиотеки DOM2 3h-8 4 3-13 диверсифицировали пять аминокислот в CDR1, б в CDR2 и 8 в CDR3, положение 94 перед CDR3 также диверсифицировали встраиванием кодона VRK. Для каждого из dAb
конструировали 4 библиотеки, содержащие примесь, одну для диверсификации CDR1, одну для диверсификации CDR2, одну для диверсификации CDR3 и четвертую для диверсификации всех CDR. Вырожденные праймеры библиотеки использовали тем же способом, что и праймеры для триплетных библиотек. Каждую диверсифицированную CDR амплифицировали раздельно и затем объединяли с фрагментом родительской последовательности с использованием ПЦР с достройкой перекрывающихся участков, полноразмерный продукт амплифицировали с использованием праймеров PelB NcoVh (SEQ ID N0:210) и DOM173 (SEQ ID N0:188). Фрагменты субклонировали в гибридный вектор pDOM4-gene3-pelB с использованием Ncol и NotI.
Последовательности вырожденных праймеров:
CDRH1 23h-439-20 (SEQ ID N0:216)
5' -
GCAGCCTCCGGATTCACCTTTggSacSgagcagATGtggTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG-3' CDRH2 23h-439-20 (SEQ ID N0:217) 5' -
AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCAcgSATTgattcSccSGGTggScgSACATACTACGCAGACTCC GTG-3'
CDRH3 23h-439-20 (SEQ ID N0:218) 5' -
GCGGTATATTACTGTGCGAAAcgScatgcSgcSggSgtStcSggSacStaYtttGACTACTGG GGTCAGGGAACC-3'
CDRH1 23h-843-13 (SEQ ID N0:219)
5' -
GCAGCCTCCGGATTCACCTTTgatcaggatcgSATGtggTGGGTCCGCCAGGCCCCAGGG-3' CDRH2 23h-843-13 (SEQ ID N0:220) 5' -
AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAgcSATTgagtcSggSGGTcatcgSACATACTACGCAGACTCC GTG-3'
CDRH3 23h-843-13 (SEQ ID N0:221) 5' -
ACCGCGGTATATTACTGTGCGVRKcagaataagtcSggScgStcSggSTTTGACTACTGGGGT CAGGGA-3'
CDRH1 23h-855-21 (SEQ ID N0:222)
GCAGCCTCCGGATTCACCTTTgagaatacStcSATGggSTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG-3' CDRH2 23h-855-21 (SEQ ID N0:223) 5' -
AAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAcgSATTgatccSaagGGTtcScatACATACTACacSGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACC-3'
CDRH3 23h-855-21 (SEQ ID N0:224)
5' -
GCGGTATATTACTGTGCGAAAcagcgSgagctSggSaagtcStaYTTTGACTACTGGGGTCAG GGA-3'
Hl-271-43 R (SEQ ID N0:225) 5' -
GCAGCCTCCGGATTCACCTTTNNKNNKNNKNNKATGNNKTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAG GGTCTC-3'
H2pl-271-43 F (SEQ ID N0:226)
5' -
CCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCANNKATTNNKNNKNNKGGTNNKCGTAC ATAC TAC G СAGAC T С С G-3'
H2p2-271-43 F (SEQ ID N0:227)
5' -
CCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGNNKNNKNNKNNKNNKAC ATAC TAC G СAGAC T С С G-3'
H3pl-271-43 F (SEQ ID N0:228)
5' -
ACCGCGGTATATTACTGTGCGAAANNKNNKNNKNNKNNKAAGTGGATGGCCGTGGGCCGCTTG GACTACTGGGGTCAGGG-3'
H3p2-271-43 F (SEQ ID N0:229)
5' -
AC CGCGGTATAT TAC T G T G С GAAACAGAAG С С CNNKNNKNNKNNKNNKG С CGTGGGCCGCTTG GACTACTGGGGTCAGGG-3'
H3p3-271-43 F (SEQ ID N0:230)
5' -
AC CGCGGTATAT TAC T G T G С GAAACAGAAG С С С G G С СAGAAG T G GNNKNNKNNKNNKNNK T T G GACTACTGGGGTCAGGG-3' Фаговый дисплей:
Библиотеки NNK или библиотеки, содержащие примесь, для
отдельных совокупностей CDR1, CDR2, CDR3 и комбинированных
совокупностей CDR1, 2 и 3 подвергали по меньшей мере б раундам
отбора с использованием 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ и 0,1
нМ (раунды 1, 2, 3, 4, 5 и б, соответственно)
биотинилированного мономерного антигена TGFpRII человека, как
описано в примере 1, со следующим изменением на этапе
блокирования: исключали Fc-фрагмент IgG человека, который ранее
добавляли в примере 1, а этап блокирования осуществляли в
течение минимум 2 0 минут. В раунды отбора 4 и б включали
конкуренцию посредством инкубации с 100 нМ небиотинилированного
антигена в течение 3 0 мин (раунды 4 и б) после этапа инкубации
с меченым антигеном. В случае DOM23h-439-20 (CDR1, CDR3 и
комбинированных совокупностей) и DOM23h-855-21 (CDR3)
осуществляли семь раундов отбора с использованием 0,1 нМ
биотинилированного мономерного антигена TGFpRII человека и 100
нМ конкурента в течение 12 0 мин или 2 0 пМ биотинилированного
мономерного антигена TGFpRII человека и 100 нМ конкурента в
течение 30 мин. Фаг амплифицировали между раундами отбора
посредством центрифугирования ночной культуры инфицированных
фагом клеток TG1 в течение 30 минут при 4000 д. Добавляли 40 мл
супернатанта, содержащего амплифицированный фаг, к 10 мл
PEG/NaCl (20% об./масс. PEG 8000 + 2, 5 М NaCl) и инкубировали
на льду в течение 60 минут. Образцы центрифугировали в течение
4 0 минут при 4 000 g для пеллетирования осажденного фага.
Супернатант сливали и осадок фага ресуспендировали в 1 мл 15%
об./об. глицерина/PBS. Образец фага переносили в пробирки
Eppendorf 2 мл и центрифугировали в течение 10 минут для
удаления любых оставшихся продуктов распада бактериальных
клеток. Гены Vh диверсифицированного доменного антитела после
отбора фага амплифицировали с помощью ПЦР с использованием
праймеров PEPOllVHStopNotIR (5'-
CCCTGGTCACCGTCTCGAGCTAATAGGCGGCCGCGAATTC-3' (SEQ ID N0:231) и Ncol VH F (5'-TATCGTCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3' (SEQ ID N0:232), рестрицировали с использованием эндонуклеаз рестрикции Ncol и NotI и лигировали в вектор рСЮ, также рестрицированный с использованием Ncol и NotI. рСЮ является плазмидным вектором
на основе вектора pUC119 с экспрессией под контролем усиленного промотора LacZ, сконструированного для экспрессии растворимых dAb. Экспрессию dAb в супернатант делают возможной посредством слияния гена dAb с сигнальным пептидом pelB на N-конце. Химически компетентные клетки Е. coli НВ2151 трансформировали с использованием продуктов лигирования и помещали на планшеты с питательным агаром, дополненным 100 мкг/мл карбенициллина. Снимали отдельные клоны и экспрессировали в среде для автоиндукции Overnight Express (система высокоуровневой экспрессии белка, Novagen), дополненной 100 мкг/мл карбенициллина, в 9б-луночных планшетах и выращивали со встряхиванием при 250 об./мин. в течение бб часов при 30°С или 24 часов при 37°С. Затем планшеты для экспрессии центрифугировали при 350 0 g в течение 15 минут и фильтровали супернатанты с использованием плоского фильтра 0,45 мкм
(Millipore). Супернатанты, содержащие доменные антитела, подвергали скринингу с помощью BIACORE(tm) В4000 с использованием TGFpRII человека и TGFpRII/Fc человека для определения скорости обратной реакции (Kd) (данные не приведены). Биотинилированные антигены фиксировали на чипе SA по инструкциям производителя, анализ осуществляли при 25°С с использованием буфера HBS-EP. Образцы анализировали с помощью BIACORE(tm) при скорости потока 3 0 мкл/мин. Восстановление чипа осуществляли с использованием глицина при низком рН. Данные (не представлены) анализировали на скорость обратной реакции, аппроксимируя фазу диссоциации к модели диссоциации 1:1, включенной в программное обеспечение, супернатанты также анализировали на связывание протеина А для оценки уровней экспрессии. Для дальнейшего исследования выбирали доменные антитела с улучшенными скоростями обратной реакции по сравнению с родительскими dAb. Улучшенные клоны экспрессировали в среде для автоиндукции Overnight Express
(ONEX(tm), Novagen), дополненной 100 мкг/мл карбенициллина и пеногасителем (Sigma) при 30°С в течение периода времени от 48 до 72 часов со встряхиванием при 2 50 об./мин. Культуры центрифугировали (4200 об./мин. в течение 40 минут) и супернатанты инкубировали с бусами STREAMLINE(tm) с протеином А
(Amersham Biosciences, GE HEALTHCARE(tm), UK. Связывающая способность: 5 мг dAb на мл бус) при 4°С или при комнатной температуре в течение по меньшей мере одного часа. Бусы упаковывали в колонку для хроматографии и промывали PBS, затем 10 мМ Трис-HCl с рН 7,4 (Sigma, UK). Связавшиеся dAb элюировали с использованием 0,1 М глицина-HCl с рН 2,0 и нейтрализовывали с использованием 1М Трис-HCl с рН 8,0. Измеряли OD dAb при 280 нм и определяли концентрации белка с использованием коэффициентов экстинкции, вычисляемых по композиции аминокислот dAb. Аффинно зрелые доменные антитела тестировали с помощью BIACORE(tm) Т200 (данные для двух предпочтительных dAb представлены в примере 9) и анализа клеток НЕК 2 93Т с SBE-bla с использованием сенсоров (данные для двух предпочтительных dAb представлены в примере 11) для определения их аффинности и активности. Биофизические свойства, включая термическую стабильность и состояние в растворе определяли с использованием дифференциальной сканирующей колориметрии (DSC) и эксклюзионной хроматографии с детектированием рассеяния лазерного излучения с кратными углами (SEC-MALLS) (данные для двух предпочтительных dAb представлены в примере 10).
Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты аффинно зрелых DOM23h-439-20 и DOM23h-271-50 dAb против TGFpRII человека
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-439-25 (SEQ ID N0:233)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCC GGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-25 (SEQ ID N0:234)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-123 (SEQ
ID N0:235)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGG GCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-123 (SEQ ID N0:236)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-439-35 (SEQ ID N0:237)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTC TCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACCGATCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCT CCAGGGAAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGCATTGATTCCCCCGGTGGGCGGACATACTAC GCAAACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCAG CCGGCGGGGGTGTCGGGGAAGTACGTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTC TCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-35 (SEQ ID N0:238)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTDQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRQPAGVSGKYVDYWGQGTLVTVSS
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-129 (SEQ ID N0:239)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTC TCCTGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCT CCGGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTAC GCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCG CCCAATCAGAGGTATGTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTC ACCGTCTCGAGC
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-129 (SEQ ID N0:240)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADS
VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPNQRYVARGRLDYWGQGTLVTVSS
CDR этих аффинно зрелых dAb против TGFpRII человека, определяемые по Rabat, представлены в таблице 13.
Последовательности CDR аффинно зрелых dAb против TGFRII человека
Дополнительная модификация нуклеотидной последовательности DOM23h-439-25 и DOM23h-271-123
Как описано в примере 7, мутации D61N и K64R вносили в аффинно зрелые dAb DOM23h-439-25, DOM23h-271-123 и DOM23h-271-12 9 в комбинации или раздельно. Внесение мутации V4 8I в dAb DOM23h-439-25 и DOM23h-271-123 также тестировали для определения того, может ли она улучшать активность. Спонтанную мутацию в положении 4 8 по Rabat наблюдали в ряде улучшенных dAb линии DOM23h-439 после обоих тестовых созреваний и CDR-специфичного созревания аффинности. В DOM23h-439-25, DOM23h-271-123 и DOM23h-271-129 и все варианты этих dAb с указанными выше мутациями также добавляли аланин на С-конец области Vh непосредственно после остатка 113 по Rabat. Мутации вносили в каркасы DOM23h-439-25 (SEQ ID N0:234), DOM23h-271-123 (SEQ ID N0:236) и DOM23h-271-129 (SEQ ID N0:240) посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с достройкой перекрывающихся участков, по-существу, как описано в примере 7. Конкретные мутации в нуклеотидную последовательность вносили встраиванием изменений нуклеотидов в перекрывающиеся олигонуклеотидные праймеры, инсерцию аланина в конец области Vh осуществляли с использованием 3'-олигонуклеотида, сконструированного для
встраивания остатка аланина после положения 113 по Rabat.
Для внесения мутаций использовали следующие
олигонуклеотиды (мутантные остатки подчеркнуты):
439 481 SDM F (SEQ ID N0:253)
5'-GGGTCTAGAGTTTATTTCACGTATTGATTCGCC-3'
439 61N SDM F (SEQ ID N0:254)
5'-GGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGG-3'
439 64R SDM F (SEQ ID N0:255)
5'-CGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3'
439 61N 64R SDM F (SEQ ID N0:256)
5'-GGGAGGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3'
271 61N SDM F (SEQ ID N0:257)
5'-GGACATACTACGCAAACTCCGTGAAGGGCCGG-3'
271 64R SDM F (SEQ ID N0:258)
5'-CGCAGACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3'
271 61N 64R SDM F (SEQ ID N0:259)
5'-GGACATACTACGCAAACTCCGTGCGTGGCCGGTTCACC-3'
567 +A rev (фланкирует 3'-конец гена Vh dAb)(SEQ ID N0:260)
5'-CCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGTAATAAGCGGCCGCAGATTA-3'
21-23 Fwd (фланкирует 5'-конец гена Vh dAb)(SEQ ID N0:261)
5'-ATAAGGCCATGGCGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3'
Для определения эффекта мутаций dAb экспрессировали в ТВ ONEX(tm), дополненной 100 мкг/мл карбенициллина и пеногасителем (Sigma) при 30°С в течение 72 часов со встряхиванием при 250 об./мин. Культуры центрифугировали (4200 об./мин. в течение 40 минут) и аффинно очищали dAb с использованием бус STREAMLINE(tm) с протеином A (Amersham Biosciences, GE HEALTHCARE(tm), UK) , как указано вше. Аффинность и активность вариантов доменных антител определяли с помощью BIACORE(tm) Т200 (данные для предпочтительных dAb представлены в примере 9) и анализа клеток НЕК 293Т с SBE-bla с использованием сенсоров (данные для предпочтительных dAb представлены в примере 11).
Аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты dAb DOM23h-439-25 (SEQ ID N0:234) и DOM23h-271-123 (SEQ ID N0:236) против TGF(3RII человека,
модифицированных для включения С-концевого аланина и мутаций D61N, K64R или V48I, представлены ниже:
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM2 3h-4 3 9-4 0 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин) (SEQ ID N0:262) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCC GGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-40 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин) (SEQ ID N0:263)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-439-41 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин + 481) (SEQ ID N0:264) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTTTATTTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCC GGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-41 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин + 481) (SEQ ID N0:265)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFISRIDSPGGRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-439-42 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин + 61N) (SEQ ID N0:266) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCC GGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-439-43 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин + 64R) (SEQ ID N0:268) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAGACTCC GTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCC GGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-43 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин + 64R) (SEQ ID N0:269)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYADS VRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-439-44
(DOM23h-439-25 + С-концевой аланин + 61N64R) (SEQ ID N0:270) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTTTGTCTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCC GTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCC GGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-44 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин + 61N64R) (SEQ ID N0:271) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFVSRIDSPGGRTYYANS VRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-130
(DOM23h-271-123 + С-концевой аланин) (SEQ ID N0:272) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGG GCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-131 (DOM23h-271-123 + С-концевой аланин + 61N) (SEQ ID N0:274) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGG GCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-131 (DOM23h-271-123 + С-концевой аланин + 61N) (SEQ ID N0:275)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-132 (DOM23h-271-123 + С-концевой аланин + 64R) (SEQ ID N0:276) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCC GTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGG GCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-132 (DOM23h-271-123 + С-концевой аланин + 64R) (SEQ ID N0:277)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADS VRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-133 (DOM23h-271-123+ С-концевой аланин + 61N64R) (SEQ ID N0:278) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCC GTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGG GCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC GCG
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANS VRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-134 (DOM23h-271-123+ С-концевой аланин + 481) (SEQ ID N0:280) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAG G G T С T С GAG T G GAT T T СAG С GAT T GAG С С GAT T G G T СATAG GACATAC TAC G СAGAC T С С GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCGGCGAGAAGTGG GCGAGGCGGTGGGATTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-134 (DOM23h-271-123+ С-концевой аланин + 481) (SEQ ID N0:281)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWISAIEPIGHRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPGEKWARRWDLDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-135 (DOM23h-271-129 + С-концевой аланин) (SEQ ID N0:282) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAGACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCAATCAGAGGTAT GTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-135 (DOM23h-271-129 + С-концевой аланин) (SEQ ID N0:283)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPNQRYVARGRLDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-136 (DOM23h-271-129 + С-концевой аланин + 61N) (SEQ ID N0:284) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCAATCAGAGGTAT GTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPNQRYVARGRLDYWGQGTLVTVSSA Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-271-137
(DOM23h-271-129 + С-концевой аланин + 61N64R) (SEQ ID N0:286) GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATCCACCTTTACGGAGTATAGGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGG AAGGGTCTCGAGTGGGTCTCAGCGATTGAGCCGATTGGTCATAGGACATACTACGCAAACTCC GTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACAGGCGCCCAATCAGAGGTAT GTTGCCCGGGGCCGCTTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-137 (DOM23h-271-129 + С-концевой аланин + 61N64R) (SEQ ID N0:287) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFTEYRMWWVRQAPGKGLEWVSAIEPIGHRTYYANS VRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQAPNQRYVARGRLDYWGQGTLVTVSSA Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-439-47
(DOM23h-439-42 + 481) (SEQ ID N0:288)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTTTATTTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCC GTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCC GGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-47 (DOM23h-439-42 + 481) (SEQ ID N0:289)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFISRIDSPGGRTYYANS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Последовательность нуклеиновой кислоты DOM23h-439-48 (DOM23h-439-44 + 481) (SEQ ID N0:290)
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCC TGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGGGACGGAGCAGATGTGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG AAGGGTCTAGAGTTTATTTCACGTATTGATTCGCCTGGTGGGAGGACATACTACGCAAACTCC GTGCGTGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACGGCGACCCACGGGGGTGTCC GGGACGTTTTATGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCG
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGTEQMWWVRQAPGKGLEFISRIDSPGGRTYYANS VRGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRPTGVSGTFYDYWGQGTLVTVSSA
Пример 9. Кинетический анализ Biacore аффинно зрелых доменных антител
IgG против человека иммобилизовывали на чипе Biacore СМ4 с помощью присоединения по первичной аминогруппе по инструкциям производителя. На этой поверхности фиксировали TGFpRII/Fc человека, TGFpRII/Fc яванского макака или Fc-фрагмент человека. Доменные антитела пропускали через эти два фиксированных рецептора при 3 концентрациях 100, 10 и 1 нМ (dAb DOM23h-439) или 100, 25 и 6,25 нМ (dAb DOM23h-271). В случае Fc-фрагмента человека для подтверждения специфичности связывания внеклеточного домена TGFpRII использовали только концентрацию 100 нМ каждого dAb. Инъекцию буфера на поверхность с фиксированным антигеном использовали для двойного сопоставления. После каждой инъекции доменного антитела фиксированную поверхность восстанавливали с использованием раствора 3 М хлорида магния; с помощью восстановления удаляли фиксированный антиген, но это не влияло значительно на способность поверхности фиксировать антиген в следующем цикле. Все запуски осуществляли при 25°С с использованием буфера HBS-ЕР в качестве подвижного буфера. Данные получали с использованием BIACORE(tm) Т200 и аппроксимировали к модели связывания 1:1, включенной в программное обеспечение. В таблице 14 представлены данные о кинетике связывания тестируемых dAb. В различных экспериментах исследовали dAb DOM2 3h-2 71 и линию DOM2Зп-4 39.
DOM23h-271-130
2,51E+06
3,09E-04
1.23E-10
2,61E+06
3,24E-04
1.24E-10
DOM23h-271-131
6.26E+06
1.36E-04
2Д7Е-11
6,81E+06
1.44E-04
2Д2Е-11
DOM23h-271-132
1.22E+07
2.22E-04
1.82E-11
1.29E+07
2,38E-04
1.85E-11
DOM23h-271-133
8,47E+06
7.70E-05
9,09E-12
8,84E+06
8,71E-05
9,85E-12
DOM23h-439-25
7J7E+06
6,34E-04
8Д7Е-11
8,99E+06
2,73E-03
3,04E-10
DOM23h-439-35
2Д6Е+07
2.22E-04
9,83E-12
2,32E+07
6,75E-04
2.91E-11
DOM23h-439-40
1.34E+07
1.39E-03
1.04E-10
9,34E+06
3,42E-03
3,66E-10
DOM23h-439-41
1.81E+07
1.87E-04
1.04E-11
1.57E+07
5,22E-04
3.33E-11
DOM23h-439-42
4,09E+07
1.31E-04
3,20E-12
3J2E+07
4Д0Е-04
1Д0Е-11
DOM23h-439-43
8,83E+06
3J3E-04
4.23E-11
8,04E+06
1.20E-03
1.49E-10
DOM23h-439-44
2,39E+07
6,91E-05
2,89E-12
2Д7Е+07
1.47E-04
6J7E-12
Пример 10. Биофизическая оценка аффинно зрелых dAb
Термическую стабильность dAb определяли с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Диализировали dAb в течение ночи в буфер PBS и доводили до конечной концентрации 1 мг/мл. Буфер для диализа использовали в качестве референса для всех образцов. DSC осуществляли с использованием микрокалориметра VP-DSC с капиллярной кюветой (GE HEALTHCARE/Microcal) при скорости нагревания 180°С/час. Типичный диапазон сканирования составлял 20-90°С и для референсного буфера, и для образца белка. После каждой пары референсного буфера и образца капиллярную кювету очищали раствором 5% Decon (Fisher-Scientific) в воде, а затем PBS. Полученные данные измерений анализировали с использованием программного обеспечения Origin 7.0. Данные DSC, полученные от
референсного буфера, вычитали из данных для образца. Точную молярную концентрацию образца включали в анализ данных для получения значений температуры плавления (Тт), энтальпии (АН) и энтальпии Вант-Гоффа (AHv). Данные аппроксимировали к недвухстадийной модели. Лучшую аппроксимацию и значения зависимостей получали при 1 или 2 переходах. Также определяли температуру начала разворачивания интегрированием термограммы каждого образца от нуля. Затем это значение определяли как температуру, при которой 4 процента образца являлись несвернутыми.
Анализ состояния раствора с помощью эксклюзионной хроматографии с детектированием рассеяния лазерного излучения с кратными углами (SEC-MALLS)
Для определения того, являются ли dAb мономерными, или образуют в растворе олигомеры более высокого порядка, их анализировали с помощью SEC-MALLS (эксклюзионной хроматографии с детектированием рассеяния лазерного излучения с кратными углами). Систему для ВЭЖХ серии Agilent 1100 с автосемплером и УФ-детектором (контролируемым программным обеспечением Empower)
соединяли с Wyatt Mini Dawn Treos (детектором рассеяния лазерного излучения (LS)) и Wyatt Optilab rEX DRI (детектором дифференциального показателя преломления (RI)). Детекторы соединяли в следующем порядке -UV-LS-RI. Инструменты RI и LS использовали при длине волны 658 нм; УФ-сигнал анализировали при 280 нм и 22 0 нм. Доменные антитела (инъекция 50 микролитров в концентрации 1 мг/мл в PBS) разделяли по их гидродинамическим свойствам с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием колонки TSK2000. Подвижной фазой являлись 0,2 М NaCl, 0,1 М NaPC> 4, 15% n-пропанол. Интенсивность рассеянного излучения при пропускании белка через детектор измеряли как функцию угла. Это измерение, учитываемое вместе с концентрацией белка, определяемой с использованием детектора RI, делает возможным вычисление молярной массы с использованием соответствующих уравнений (неотъемлемая часть аналитического программного обеспечения Astra v.5.3.4.14). Состояние раствора как процентная доля мономера представлена в таблице 15.
Пример 11. Ингибирование TGFpRII аффинно зрелыми dAb в анализе клеток НЕК 293Т с SBE-bla с использованием сенсоров
Анализ осуществляли точно, как описано в примере 4, анализ
п2 .
Анализ осуществляли множество раз для получения среднего значения и диапазона значений, представленных в таблице 16. Арифметическое среднее IC50 вычисляли с использованием log IC50, а диапазон вычисляли сложением и вычитанием логарифмического стандартного отклонения от среднего IC50, и затем преобразованием обратно в IC50. Анализ удовлетворял параметрам QC; робастные Z-факторы составляли более 0,4, и ECso TGF-p находилась в пределах б-кратной концентрации, добавляемой при анализе. Результаты представлены в таблице 16.
Таблица соответствия последовательностей
SEQ NO
Номер
DOM
Описание
DOM2 3h-8
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-8
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-8
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-8
аминокислотная
последовательность
наивный клон
DOM2 3h-
828
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
830
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
831
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
840
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
842
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
843
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
850
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
854
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
855
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
865
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
866
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
874
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
883
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3h-
903
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3m-
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3m-
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3m-
аминокислотная наивный клон
последовательность
DOM2 3m-62
аминокислотная последовательность -наивный клон
DOM2 3m-71
аминокислотная последовательность -наивный клон
DOM2 3m-72
аминокислотная последовательность -наивный клон
DOM2 3m-81
аминокислотная последовательность -наивный клон
DOM2 3m-99
аминокислотная последовательность -наивный клон
DOM23m-101
аминокислотная последовательность -наивный клон
DOM2 3m-352
аминокислотная последовательность -наивный клон
DOM23h-271-21
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый
DOM23h-271-22
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый
DOM23h-271-27
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый
DOM23h-271-101
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый
DOM23h-271-102
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый
DOM23h-271-105
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый
DOM23h-271-106
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый
DOM23h-271-114
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый
DOM23h-271-39
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый с мутацией D61R K64D
DOM23h-271-40
аминокислотная последовательность -аффинно зрелый с мутацией D61R K64F
DOM2 3h-8 02
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3h-8 03
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-813
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-815
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3h-82 8
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-830
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-831
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-84 0
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3h-8 42
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-843
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3h-8 50
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3h-8 54
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3h-8 55
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3h-8 65
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-8 66
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-874
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-8 83
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3h-903
последовательность нуклеиновой
кислоты - наивный клон
DOM2 3m-4
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3m-2 9
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3m-32
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3m-62
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3m-71
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3m-72
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3m-81
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3m-99
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23m-101
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM2 3m-352
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
DOM23h-271-21
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый
DOM23h-271-22
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый
DOM23h-271-27
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый
DOM23h-271-101
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый
DOM23h-271-102
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый
DOM23h-271-105
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый
DOM23h-271-106
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый
DOM23h-271-114
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый
DOM23h-271-39
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый с мутацией D61R K64D
DOM23h-271-40
последовательность нуклеиновой кислоты - аффинно зрелый с мутацией D61R K64F
DOM2 3h-8 02
CDR1
113
CDR2
149
CDR3
DOM2 3h-8 03
CDR1
114
CDR2
150
CDR3
DOM23h-813
CDR1
115
CDR2
151
CDR3
DOM23h-815
CDR1
116
CDR2
152
CDR3
DOM2 3h-82 8
CDR1
117
CDR2
153
CDR3
DOM23h-830
CDR1
118
CDR2
154
CDR3
DOM23h-831
CDR1
119
CDR2
155
CDR3
DOM23h-84 0
CDR1
120
CDR2
156
CDR3
DOM2 3h-8 42
CDR1
121
CDR2
157
CDR3
DOM23h-843
CDR1
122
CDR2
158
CDR3
DOM2 3h-8 50
CDR1
123
CDR2
159
CDR3
DOM2 3h-8 54
CDR1
124
CDR2
160
CDR3
DOM2 3h-8 55
CDR1
125
CDR2
161
CDR3
DOM2 3h-8 65
CDR1
126
CDR2
162
CDR3
DOM23h-8 66
CDR1
127
CDR2
163
CDR3
DOM23h-874
CDR1
128
CDR2
164
CDR3
DOM23h-8 83
CDR1
129
CDR2
165
CDR3
DOM2 3h-903
CDR1
130
CDR2
166
CDR3
DOM2 3m-4
CDR1
131
CDR2
167
CDR3
DOM2 3m-2 9
CDR1
132
CDR2
168
CDR3
DOM2 3m-32
CDR1
133
CDR2
169
CDR3
DOM2 3m-62
CDR1
134
CDR2
170
CDR3
DOM2 3m-71
CDR1
135
CDR2
171
CDR3
100
DOM2 3m-72
CDR1
136
CDR2
172
CDR3
101
DOM2 3m-81
CDR1
137
CDR2
173
CDR3
102
DOM2 3m-99
CDR1
138
CDR2
174
CDR3
103
DOM23m-101
CDR1
139
CDR2
175
CDR3
104
DOM2 3m-352
CDR1
140
CDR2
176
CDR3
105
DOM23h-271-21
CDR1
141
CDR2
177
CDR3
106
DOM23h-271-22
CDR1
142
CDR2
178
CDR3
107
DOM23h-271-27
CDR1
143
CDR2
179
CDR3
108
DOM23h-271-101
CDR1
144
CDR2
180
CDR3
109
DOM23h-271-102
CDR1
145
CDR2
181
CDR3
110
DOM23h-271-105
CDR1
146
CDR2
182
CDR3
111
DOM23h-271-106
CDR1
147
CDR2
183
CDR3
112
DOM23h-271-114
CDR1
148
CDR2
184
CDR3
185
DOM0 0 8
Праймер
186
DOM0 0 9
Праймер
187
DOM172
Праймер
188
DOM17 3
Праймер
189
271-7Rldeg CDR1
Праймер
190
271-7R2deg CDR2
Праймер
191
271-7R3deg CDR3
Праймер
192
PE008
Праймер
193
271-6164 R
Праймер
194
271-6164 deg-F
Праймер
195
AS 13 0 9
Праймер
196
271-6164 NR-F
Праймер
197
DOM57
Праймер
198
DOM 6
Праймер
199
DOM2 3h-2 71
аминокислотная последовательность -наивный клон
200
DOM2 3h-2 71
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
201
DOM23h-271-7
аминокислотная последовательность -наивный клон
202
DOM23h-271-7
последовательность нуклеиновой кислоты - наивный клон
203
DOM23h-855-21
последовательность нуклеиновой кислоты - тестовый зрелый клон
204
DOM23h-855-21
аминокислотная последовательность -тестовый зрелый клон
205
DOM23h-843-13
последовательность нуклеиновой кислоты - тестовый зрелый клон
206
DOM23h-843-13
аминокислотная последовательность -тестовый зрелый клон
207
DOM23h-439-20
последовательность нуклеиновой кислоты - тестовый зрелый клон
208
DOM23h-439-20
аминокислотная последовательность -тестовый зрелый клон
209
PEP-26-F
Праймер
210
PelB NcoVh
Праймер
211
PEP011
Праймер
212
DOM-271-50
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
213
DOM-271-50
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
214
DOM-271-50
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон (*Дубликат приведенного выше 213*)
215
PEP044
Праймер
216
23h-439-20
Праймер
CDRH1
217
23h-439-20 CDRH2
Праймер
218
23h-439-20 CDRH3
Праймер
219
23h-843-13 CDRH1
Праймер
220
23h-843-13 CDRH2
Праймер
221
23h-843-13 CDRH3
Праймер
222
23h-855-21 CDRH1
Праймер
223
23h-855-21 CDRH2
Праймер
224
23h-855-21 CDRH3
Праймер
225
Hl-271-43 R
Праймер
226
H2pl-271-43F
Праймер
227
H2p2-271-43 F
Праймер
228
H3pl-271-43 F
Праймер
229
H3p2-271-43 F
Праймер
230
H3p3-271-43 F
Праймер
231
PEPOllVHStopNo tIR
Праймер
232
Ncol VH F
Праймер
233
DOM23h-439-25
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
234
DOM23h-439-25
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
235
DOM23h-271-123
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
236
DOM23h-271-123
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
237
DOM23h-439-35
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
238
DOM23h-439-35
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
239
DOM23h-271-129
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
240
DOM23h-271-129
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
241
DOM23h-271-123
CDR1
242
DOM23h-271-123
CDR2
243
DOM23h-271-123
CDR3
244
DOM23h-271-129
CDR1
245
DOM23h-271-129
CDR2
246
DOM23h-271-129
CDR3
247
DOM23h-439-25
CDR1
248
DOM23h-439-25
CDR2
249
DOM23h-439-25
CDR3
250
DOM23h-439-35
CDR1
251
DOM23h-439-35
CDR2
252
DOM23h-439-35
CDR3
253
439 481 SDM F
Праймер
254
439 61N SDM F
Праймер
255
439 64R SDM F
Праймер
256
439 61N 64R SDM F
Праймер
257
271 61N SDM F
Праймер
258
271 64R SDM F
Праймер
259
271 61N 64R
Праймер
SDM F
260
567 +A rev
Праймер
261
21-23 Fwd
Праймер
262
DOM23h-439-40
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
263
DOM23h-439-40
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
264
DOM23h-439-41
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
265
DOM23h-439-41
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
266
DOM23h-439-42
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
267
DOM23h-439-42
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
268
DOM23h-439-43
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
269
DOM23h-439-43
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
270
DOM23h-439-44
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
271
DOM23h-439-44
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
272
DOM23h-271-130
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно
зрелый клон
273
DOM23h-271-130
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
274
DOM23h-271-131
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
275
DOM23h-271-131
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
276
DOM23h-271-132
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
277
DOM23h-271-132
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
278
DOM23h-271-133
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
279
DOM23h-271-133
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
280
DOM23h-271-134
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
281
DOM23h-271-134
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
282
DOM23h-271-135
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
283
DOM23h-271-135
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
284
DOM23h-271-136
последовательность нуклеиновой
кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
285
DOM23h-271-136
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
286
DOM23h-271-137
последовательность нуклеиновой кислоты - CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
287
DOM23h-271-137
аминокислотная последовательность -CDR-ориентированный аффинно зрелый клон
288
DOM23h-439-47
последовательность нуклеиновой кислоты - DOM2 3h-4 3 9-42 + 481
289
DOM23h-439-47
аминокислотная последовательность DOM23h-439-42 + 481
290
DOM23h-439-48
последовательность нуклеиновой кислоты - DOM2 3h-4 3 9-4 4 + 481
291
DOM23h-439-48
аминокислотная последовательность DOM23h-439-44 + 481
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> BEATON, Andrew
DIMECH, Caroline ERTL, Peter F. FORD, Susannah
MCADAM, Ruth
<120> ЛИГАНДЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С РЕЦЕПТОРАМИ TGF-БЕТА ТИПА II
<130> PB64388 <150> 61/430,235
<151> 2011-01-06
<160> 291
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400>
l Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
5 10 u Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ile Leu Ala Ala Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 110
115
<210> 2 <211> 119 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Gly
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Arg Asp Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Asp Asp Gly His Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 3 <211> 120 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Asp Asp
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gln Pro Asp Gly His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Glu Gln Asp Val Lys Gly Ser Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 5 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<210> 6 <211> 122 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Phe Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Gly Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Gly Leu Thr His Gln Ser Pro Ser Thr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 7 <211> 116 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 7 Glu Val Gln
Ser Leu Arg Leu 20
Lys Met Thr Trp 35
Ser Tyr Ile Thr
Lys Gly Arg Phe 65
Leu Gln Met Asn
100
Ser
Ala Lys Tyr
Thr Val Ser
115
Gly Gly 15
Ala Tyr Trp Val Ser Val
Leu Tyr 80
Tyr Cys 95
Leu Val
<210> 8 <211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Pro Gly Gly 15
Gly Leu
45 Tyr Ala 60
Gly Asp Gly 30
Glu Trp Val
Thr Leu Tyr
Tyr Tyr Cys 95
Gly Gln Gly 110
Asp Ser Val
Lys Asn
Ala Val Tyr Trp
<210> 9 <211> 120 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Ser
20 25 30
Glu Met Ala Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Arg Arg Asn Gly Asn Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
105
110
Ala Lys Val Thr Lys Asp Arg Ser Val Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Leu
Val
Gln
Pro
Gly
Gln
Gly
Leu
20 Trp
5 Ser
Cys
Ala
Ala
Ser
Pro
Phe
Thr
Phe
Asp
Glu
Asp
Val
Arg
Gln
Ala 40
His
Gly
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Trp
Val
Glu
Ser
Gly
Gly 55
Arg
Thr
Tyr
Tyr 60
Asp
Ser
Val
Phe
Thr
Ile 70
Leu
Ser
Arg
Asp
Asn
Ser
Thr
Lys
Asn
Thr
Leu
Tyr
Cys
Asn
Ser 85 Glu
Arg
Ala
Glu
Asp 90 Gly
Ala
Val
Tyr
Tyr
Gly
Asn 100 Val
Ser
Gly
Arg
Ser 105
Phe
Asp
Tyr
Trp 110
Gln
Thr
Val
Ser
Ser
ion
<210> 11 <211> 119 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 11 Glu Val Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Ser
Leu
Arg
Leu
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Arg
Met
Trp
Ile
Trp
Ala
Arg
Gln
Ala
Asn
Pro
Ser
Ala
Gly
Ala
Asp
Ile
Gly
Ser
Thr
Lys
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Arg
Asp
Leu
Gln
Met
Asn
Ser
Gly
Leu
Arg
Ala
Glu
Ala
Lys
Gln
Ser 100 Thr
Ser
Glu
Asp
His 105
Thr
Leu
Val 115
Val
Ser
Ser
10 15
Gly Phe Thr Phe Asp Ala Ala
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
TiU^ 7\^.-^ г-Птт-^- m ^--^ гЧ т T ^1-^ г-'Тт
110
<210> 12
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<210> 13 <211> 120 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu
Val
Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Ser
Leu
Arg
Leu
5 Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Ser
Met
Gly
Ile
Trp
Val
Arg
Gln
Ala
Ser
Pro
Gly
Ser
Arg
Gly
Asp
Pro
Lys
Gly
Ser
His
Thr
Lys
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Arg
Asp
Asn
Leu
Gln
Met
Asn
Ser
Glu
Leu
Arg
Ala
Glu
Asp
His
Ala
Lys
Gln
Arg 100 Val
Leu
Gly
Lys
Ser 105
Gly
Thr
Leu
115
Thr
Val
Ser
Ser 120
Phe Thr Phe Glu Asn Thr 30
Lys Gly Leu Glu Trp Val 45
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 110
<210> 14 <211> 119 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser
Leu
Arg
Leu
Trp
Ser
Cys
Glu
Met
Thr
Ile
Val
Arg
Ser
Lys
50 Gly
Gln
Asp
Pro
Ser
Lys
Leu
Arg Met
Phe Asn
Thr Ser
85 Thr
Ile
70 Leu
Ala
Lys
Gly
Arg 100 Thr
Asp
Thr
Leu
Val 115
Val
Ser
10 15 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
25 30 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 45 Gly Arg Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 60
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95 Leu Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 110
<210> 15 <211> 121 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Arg Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Thr Pro Lys Gly Asp His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Leu
Gln
Met
Asn
Ser 85
His
Leu
Arg
Ala
Glu
Ala
Glu
Ser
Leu
100
Asn
Glu
Arg
Val 105
Gln
Gly
Thr 115
Leu
Val
Thr
Val
Ser 120
Ser
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95 Lys His Phe Asp Tyr Trp Gly 110
<210> 16 <211> 121 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 16
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Asp Ser Thr Gly Ser Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
110
Ala Lys Gln Gln Ala Gly Ser Ala Met Gly Glu Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105
120
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 1 С 1 О п
115
<210> 17
<211> 116 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu
Val
Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Ser
Leu
Arg
Leu
5 Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Arg
Met
Trp 35
Ile
Trp
Val
Arg
Gln
Ala
40 Asp
Pro
Gly
Ser
Ala
Gly
Ser
Gly
Ser
Gly
Ser
Lys
Thr
Lys
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Arg
Asp
Asn
Leu
Gln
Met
Asn
Ser 85
Leu
Leu
Arg
Ala
Glu
Asp
Trp
Ala
Lys
His
Gly 100
Ser
Phe
Asp
Tyr 105
Thr
Val
Ser 115
Ser
Phe Thr Phe Val Asn Tyr 30
Lys Gly Leu Glu Trp Val 45
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 95
Gly Gln Gly Thr Leu Val 110
<210> 18 <211> 116 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Trp Ile Glu Lys Thr Gly Asn Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Gly Arg His Ile Lys Val Arg Ser Arg Asp Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 20 <211> 123 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 20
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Asn Asp Leu Gly Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Asn Ile Ser Met Val Arg Pro Gly Ser Trp Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 21 <211> 123 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Phe Glu Tyr
20 25 30
<210> 22 <211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Gln Glu
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ser Gly Thr Arg Ile Lys Gln Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
<210> 23 <211> 123 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Asp Tyr
20 25 30
Arg Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Pro Thr Gly Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ile Lys Trp Gly Glu Met Gly Ser Tyr Lys Thr Phe Asp Tyr
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 24 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 24
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Met Ile Arg Glu Asp Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Arg Val Pro Tyr Arg Arg Gly His Arg Asp Asn Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 25 <211> 120 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 25
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Pro Val
20 25 30
Ile Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Ala Arg Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Gly Arg His Leu Ser Gln Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 26 <211> 119 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu
Val
Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Ser
Leu
Arg
Leu
Ser
Cys
Ala
Arg
Met
Met 35
Ile
Trp
Val
Arg
Gln
Ser
Thr
Gly
Asp
Pro
Ala
Gly 55
Lys
Leu
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Leu
Ser
Gln
Met
Asn
Ser 85
Arg
Ala
Lys
Arg
Leu
100 Thr
Ala
Ser
Arg
Thr
Leu
Val 115
Val
Ser
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Leu
Val
Gln
Pro
Gly
Arg
Gly
Ala
Ser
Pro
Phe
Thr
Phe
Asp
Glu
Tyr
Ala
Met
Gly
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Trp
Val
Leu
Thr
Tyr
Tyr 60
Asp
Ser
Val
Arg
Asp
Asn
Ser
Thr
Lys
Asn
Thr
Leu
Tyr
Cys
Ala
Glu
Asp
Phe
Ala
Val
Tyr
Tyr
Gln
Ser
His
105
Asp
Tyr
Trp
Gly 110
Gly
<210> 27 <211> 119
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Gly
Gly
Gly
Gly
Leu
Val
Gln
Pro
Gly
Glu
Gly
Ala
Ser
Pro
Phe
Thr
Phe
Ser
Glu
Tyr
Ala
Val
Gly
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Trp
Val
Arg
Thr
Tyr
Tyr 60
Lys
Asp
Ser
Val
Arg
Asp
Asn
Ser
Thr
Asn
Thr
Leu
Tyr
Cys
Ala
Glu
Asp
Phe
Ala
Val
Tyr
Tyr
Gln
Gly
Trp 105
Asp
Tyr
Trp
Gly 110
Gly
<400> 27
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser 1 5
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln 35
Ser Arg Ile Arg Ser Asp Gly
50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 65 70 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 85
Ala Lys Asp Arg Ala Lys Asn
100
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 28 <211> 119 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Lys Tyr
20 25 30
Lys Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Phe Pro Asn Gly Val Pro Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Ser Gly Gln Gly Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
115
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 1 rz
<210> 29 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Val
Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly 10 Gly
Leu
Val
Gln
Pro
Leu
Arg
Leu
20 Trp
5 Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25 Pro
Phe
Thr
Phe
Thr 30 Glu
Met
Trp
Ile
Val
Arg
Gln
Ala
Asn
Gly
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Ala
Gly
Glu
Pro
Ile
Gly
Ser
Arg
Thr
Tyr
Tyr 60
Lys
Asp
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Leu
Arg
Asp
Asn
Ser 75 Thr
Asn
Thr
Gln
Met
Asn
Ser 85 Pro
Arg
Ala
Glu
Asp 90 Thr
Ala
Val
Tyr
Lys
Gln
Met 100 Gln
Gly
Arg
Lys
Trp 105 Ile
Ala
Lys
Phe
Arg 110
Trp
Gly 115
Gly
Thr
Leu
Val 120
Val
Ser
Ser
<210> 30 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Met Pro Gly Gln Lys Trp Met Ala Lys Ser Arg Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 31 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 31
Glu Val Gln
Leu
Leu
Ser
Leu
Arg
Leu
20 Trp
Ser
Arg
Met
Trp 35
Ile
Val
Ser
Ala
Gly
Glu
Pro
Lys 65
Arg
Phe
Thr
Leu
Gln
Met
Asn
Ser
Ala
Lys
Gln
Ile 100 Gln
Pro
Tyr
Trp
Gly 115
Gly
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Cys
Ala
Ala
Ser
Pro
Arg
Gln
Ala
Gln
Gly
Ile
Gly
Ser
Lys
Thr
Ile
Arg
Asp
Asn
Leu
Arg
Ala
Glu
Asp
Thr
Gly
Arg
Lys
Trp 105 Ile
Thr
Leu
Val 120
Val
Leu
Val
Gln
Pro
Gly
Glu
Gly
Phe
Thr
Phe
Thr
Glu
Tyr
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Trp
Val
Tyr
Tyr 60
Lys
Ala
Asp
Ser
Val
Ser
Thr
Asn Val
Thr Tyr
Leu
Tyr
Phe
Tyr
Cys
Ala
Asn
Ser
Arg 110
Asp
Ser
Ser
<210> 32 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu Val Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Ser
Leu
Arg
Leu
5 Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Arg
Met
Trp
Ile
Trp
Val
Arg
Gln
Ala
Asn
Pro
Gly
Ser
Ala
Gly
Glu
Pro
Ile
Gly
Ser
Arg
Thr
Lys
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Arg
Asp
Asn
75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Gly Arg Lys Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 33 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 34 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 34
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ile Pro Gly Gln Arg Trp Thr Gly Asn Ser Arg Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 35 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
1 5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25 Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr
50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70
Leu
Val
Gln
Pro
Gly
Glu
Gly
Phe
Thr
Phe
Thr
Glu
Tyr
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Trp
Val
Tyr
Tyr 60
Asp
Ser
Val
Ser 75
Lys
Asn
Thr
Leu
Tyr 80
105
nfU
115
120
<210> 36 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu Val Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Ser
Leu
Arg
Leu
5 Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Arg
Met
Trp
Ile
Trp
Val
Arg
Gln
Ala
Asn
Pro
Gly
Ser
Ala
Gly
Glu
Pro
Ile
Gly
Ser
Arg
Thr
Lys
Arg
Phe
Thr
Ile
Arg
Asp
Asn
75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ile Pro Gly Arg Lys Gly Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 37 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 37 Glu Val
Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Ser
Leu
Arg
Leu
20 Trp
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser
Pro
Arg
Met
Trp
Ile
Val
Arg
Gln
Ala
Asn
Ser
Ala
Gly
Glu
Pro
Ile
Gly
Ser
Arg
Asp 65
Leu
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Leu
Arg
Asp
Gln
Met
Asn
Ser 85
Arg
Ala
Glu
Ala
Lys
Gln
Met 100 Gln
Pro
Gly
Gln
Lys
Trp 105 Thr
Tyr
Trp
Gly 115
Gly
Thr
Leu
Val 120
10 15 Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr 30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Thr Tyr Tyr Ala Arg Ser Val 60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Met Ala Lys Ser Arg Phe Asp 110
<211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu Val Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Ser
Leu
Arg
Leu
5 Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Arg
Met
Trp
Ile
Trp
Val
Arg
Gln
Ala
40 Asn
Pro
Gly
Ser
Ala 50
Gly
Glu
Pro
Ile
Gly
Ser
Arg
Thr
Phe 65
Arg
Phe
Thr
Ile
Arg
Asp
Asn
75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Met Pro Gly Gln Lys Trp Met Ala Lys Ser Arg Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 39 <211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 39
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt gaggggacga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attttggctg ctggttctaa tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaagagg 300 caggagcggg atgggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357
<210> 40 <211> 357 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 40
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt gctgggcgga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attaatcggg atggtactag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacatgat 300 gatggtcatg gtaattttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357
<210> 41 <211> 360 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 41
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gatgatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attcagcctg atggtcatac gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaacaggat 300
gttaaggggt cgtcttcgtt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<210> 42 <211> 357 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 42
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg gaggatcgga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attgatcctc agggtcagca tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagtct 300
actgggtctg ctacgtctga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357
<210> 43 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 43
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg agttatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct atttctccga gtggtagtga tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacaggtg 300
gtggagtatt cgcgtactca taagggtgtg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<210> 44 <211> 366 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 44
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtt cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gggtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attgattctc tgggtgatcg tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagggg 300
cttacgcatc agtctccgag tacttttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcgagc 366
<210> 45 <211> 348 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 45
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggagggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gcgtataaga tgacgtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctggagtg ggtctcatat attacgccgt ctggtggtca gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatggt 300
tcgagttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348
<210> 46 <211> 357 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 46
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg gatggtcgta tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attgaggggg cgggttcgga tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300
tcgcggaatt cgccgtttga ctactggggt caggggaccc tggtcaccgt ctcgagc 357
<210> 47 <211> 360 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 47
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat gatagtgaga tggcgtgggc ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcactt attcggcgta atggtaatgc tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagttacg 300
aaggatcgtt ctgtgctttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<210> 48 <211> 360 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 48
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat caggatcgga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attgagagtg gtggtcatag gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagaat 300
gagtcggggc gttcgggttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<212> ДНК
<213> Artifificla Sequence
<400> 49
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat gcggctagga tgtggtgggc ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attgcggata ttggtaatac tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagtct 300
ggttcggagg atcattttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357
<210> 50 <211> 363 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 50
gaggtgcagc tgttggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct caggatcgga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacaggat 300 ttgcatggta ctagttcttt gtttgactac tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360 agc 363
<210> 51 <211> 360 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 51
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aatacgagta tgggttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgt attgatccta agggtagtca tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa tacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagcgt 300
gagttgggta agtcgcattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<210> 52 <211> 357 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 52
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgt agttatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaaag attgatcctt cgggtcgttt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaggtcgg 300 acggatcttc agctttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты <400> 53
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg aattattgga tgcggtgggc ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatat attactccta agggtgatca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaatcgctt 300 cataatgagc gtgttaagca ttttgactac tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360 agc 363
<210> 54 <211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 54
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttact agttatcgta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtt attgattcta ctggttcggc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagcag 300 gctgggagtg cgatggggga gtttgactac tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360 agc 363
<210> 55 <211> 348 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 55
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt aattatcgta tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtgataa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacatggg 300 ctgtcgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348
<210> 56 <211> 348 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 56
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat gatatgagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtg attaatgctg atggtaatag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagatggg 300 ctgccttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348
<210> 57
ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 57
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg acttatggta tgggttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attgagaaga cgggtaataa gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagcgggg 300
aggcatatta aggtgcgttc gagggatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360
gtctcgagc 369
<210> 58 <211> 369 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 58
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag aggtattcta tgggttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtt attaatgatc tgggtagttt gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagggaat 300
attagtatgg tgaggccggg gagttggttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360
gtctcgagc 369
<210> 59 <211> 369 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 59
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttttt gagtatccta tgggttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtt attagtgggg atggtcagcg gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagtcat 300
acggggactg tgaggcatct ggagacgttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360
gtctcgagc 369
<210> 60 <211> 360 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 60
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt caggagagta tgtattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagtggt 300
acgcggatta agcagggttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<210> 61 <211> 369 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 61
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gattatagga tgtattgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggg attgatccta ctggtttgcg gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaattaag 300
tggggggaga tggggagtta taagactttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360
gtctcgagc 369
<210> 62 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 62
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gattatgata tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatg attcgtgagg atggtggtaa gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagcgagg 300
gtgccttatc ggcgtgggca tagggataat tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<210> 63 <211> 360 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 63
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cttccggatt cacctttgag ccggttatta tggggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attgaggcgc ggggtggggg gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggg 300
cggcatctta gtcaggattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<210> 64 <211> 357 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 64
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat cggtatcgta tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attgatcctg ctggtatgct tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaggctg 300 gcttcgcgga gtcattttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357
<210> 65
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 65
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgcgcag cctccggatt caccttttct gagtatgata tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtcttgagtg ggtctcacgg attcgttctg atggtgttag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcgt 300 gctaagaatg gttggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357
<210> 66 <211> 357 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 66
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat aagtataaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcactt atttttccga atggtgttcc tacatactac 180 gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatagt 300 ggtcaggggc gggattttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357
<210> 67 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 67
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacc gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatg 300 ccgggccgga agtggacggc caagttccgc tgggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 atcgtctcga gc 372
<210> 68 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatg 300 cccggccaga agtggatggc caagtcccgc ttcgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372
<210> 69
<211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 69
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcagaa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatt 300 ccggggcgta agtggactgc taattcgcgg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 atcgtctcga gc 372
<210> 70 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 70
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatt 300
ccggggcgta agtggactgc taatggtcgt aaggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<210> 71 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 71
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatt 300
ccggggcgta agtggactgc taattcgcgg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<210> 72 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты <400> 72
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatt 300 ccggggcagc ggtggactgg taattcgcgg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372
<210> 73 <211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 73
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagttt 300
ccggggcgta agtggactgc taattcgcgg tctgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<210> 74 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 74
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatt 300 ccggggcgta agggaactgc taattcgcgg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372
<210> 75 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 75
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180
gcacgctccg tggacggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatg 300
cccggccaga agtggatggc caagtcccgc ttcgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 76
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180
gcacgctccg tgttcggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatg 300
cccggccaga agtggatggc caagtcccgc ttcgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<210> <211> <212> 77 6
БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 77
Ser Glu Gly Thr Met Trp 1 5
<210> 78 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 78
Ser Ala Gly Arg Met Trp 1 5
<210> 79
<211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 79
Thr Asp Asp Arg Met Trp
1 5
<210> 80 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Ala Glu Asp Arg Met Trp 1 5
<210> 81 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 81
Met Ser Tyr Arg Met Trp 1 5
<210> 82 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 82
Glu Gly Tyr Arg Met Trp 1 5
<210> 83 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 83
Glu Ala Tyr Lys Met Thr 1 5
<210> 84 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 84
Gly Asp Gly Arg Met Trp 1 5
<210> 85 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 85
Asp Asp Ser Glu Met Ala 1 5
<210> 86 <211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 86
Asp Gln Asp Arg Met Trp 1 5
<210> 87 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 87
Asp Ala Ala Arg Met Trp 1 5
<210> 88 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 88
Ala Gln Asp Arg Met Trp 1 5
<210> 89 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 89
Glu Asn Thr Ser Met Gly 1 5
<210> 90 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 90
Arg Ser Tyr Glu Met Thr
1 5
<210> 91 <211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 91
Ser Asn Tyr Trp Met Arg 1 5
<210> 92 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 92
Thr Ser Tyr Arg Met Trp 1 5
<210> 93 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 93
Val Asn Tyr Arg Met Trp
1 5
<210> 94 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 94
Asn Asp Met Arg Met Trp 1 5
<210> 95 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 95
Thr Thr Tyr Gly Met Gly 1 5
<210> 96 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 96
Lys Arg Tyr Ser Met Gly 1 5
<210> 97
<211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 97
Phe Glu Tyr Pro Met Gly 1 5
<210> 98 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 98
Gly Gln Glu Ser Met Tyr 1 5
<210> 99 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 99
Met Asp Tyr Arg Met Tyr 1 5
<210> 100 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 100
Met Asp Tyr Asp Met Ser 1 5
<210> 101
<211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 101
Glu Pro Val Ile Met Gly
1 5
<210> 102 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 102
Asp Arg Tyr Arg Met Met 1 5
<210> 103 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 103
Ser Glu Tyr Asp Met Ala 1 5
<210> 104 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 104
Asp Lys Tyr Lys Met Ala 1 5
<210> 105 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 105
Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<210> 106 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 106
Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<210> 107 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 107
Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<210> 108
<211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 108
Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<210> 109 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 109
Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 110
Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<210> 111 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 111
Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<210> 112 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 112
Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<210> 113
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 113
Ala Ile Leu Ala Ala Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 114 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 114
Ala Ile Asn Arg Asp Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 115
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 115
Ala Ile Gln Pro Asp Gly His Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 116
<211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 116
Ala Ile Asp Pro Gln Gly Gln His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 117 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 117
Ala Ile Ser Pro Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 118 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 118
Ala Ile Asp Ser Leu Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность <400> 119
Tyr Ile Thr Pro Ser Gly Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 120
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 120
Ala Ile Glu Gly Ala Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 121 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 121
Leu Ile Arg Arg Asn Gly Asn Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 122 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 122
Ala Ile Glu Ser Gly Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 123 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 123
Ala Ile Ala Asp Ile Gly Asn Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 124 <211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 124
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 125 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 125
Arg Ile Asp Pro Lys Gly Ser His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 126 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 126
Lys Ile Asp Pro Ser Gly Arg Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 127 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 127
Tyr Ile Thr Pro Lys Gly Asp His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 128 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 128
Val Ile Asp Ser Thr Gly Ser Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 129 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 129
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 130 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 130
Val Ile Asn Ala Asp Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 131 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 131
Trp Ile Glu Lys Thr Gly Asn Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 132 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 132
Val Ile Asn Asp Leu Gly Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 133 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 133
Val Ile Ser Gly Asp Gly Gln Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 134 <211> 18 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 134
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 135 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 135
Gly Ile Asp Pro Thr Gly Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность <400> 136
Met Ile Arg Glu Asp Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 137 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 137
Ala Ile Glu Ala Arg Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 138 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 138
Thr Ile Asp Pro Ala Gly Met Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 139 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 139
Arg Ile Arg Ser Asp Gly Val Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 140 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 140
Leu Ile Phe Pro Asn Gly Val Pro Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 141 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 141
Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 142 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 142
Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 143 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 143
Ala Ile Glu Pro Ile Gly Gln Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 144 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 144
Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 145 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 145
Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 146 <211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 146
Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 147 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 147
Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 148 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 148
Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 149
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 149
Lys Arg Gln Glu Arg Asp Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 150 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 150
His Asp Asp Gly His Gly Asn Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 151 <211> 12 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 151
Glu Gln Asp Val Lys Gly Ser Ser Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 152 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 152
Gln Ser Thr Gly Ser Ala Thr Ser Asp Tyr
1 5 10
<210> 153 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 153
Gln Val Val Glu Tyr Ser Arg Thr His Lys Gly Val Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 154 <211> 13 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 154
Gln Gly Leu Thr His Gln Ser Pro Ser Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 155
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 155
Tyr Gly Ser Ser Phe Asp Tyr 1 5
<210> 156
<211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 156
Gln Ala Ser Arg Asn Ser Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 157 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 157
Val Thr Lys Asp Arg Ser Val Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 158
<211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 158
Gln Asn Glu Ser Gly Arg Ser Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 159
<211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 159
Gln Ser Gly Ser Glu Asp His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 160 <211> 12 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 160
Gln Asp Leu His Gly Thr Ser Ser Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 161 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 161
Gln Arg Glu Leu Gly Lys Ser His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 162 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 162
Gly Arg Thr Asp Leu Gln Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 163 <211> 12 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 163
Ser Leu His Asn Glu Arg Val Lys His Phe Asp Tyr
<210> 164 <211> 12 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 164
Gln Gln Ala Gly Ser Ala Met Gly Glu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 165 <211> 7 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 165
His Gly Leu Ser Phe Asp Tyr 1 5
<210> 166 <211> 7 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 166
Asp Gly Leu Pro Phe Asp Tyr 1 5
<210> 167 <211> 14 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 167
Ala Gly Arg His Ile Lys Val Arg Ser Arg Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 168 <211> 14 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Gly Asn Ile Ser Met Val Arg Pro Gly Ser Trp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 169 <211> 14 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 169
Ser His Thr Gly Thr Val Arg His Leu Glu Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 170 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 170
Ser Gly Thr Arg Ile Lys Gln Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 171 <211> 14 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 171
Ile Lys Trp Gly Glu Met Gly Ser Tyr Lys Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 172 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 172
Ala Arg Val Pro Tyr Arg Arg Gly His Arg Asp Asn Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 173 <211> 11 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 173
Pro Gly Arg His Leu Ser Gln Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 174 <211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 174
Arg Leu Ala Ser Arg Ser His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 175 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 175
Asp Arg Ala Lys Asn Gly Trp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 176 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 176
Tyr Ser Gly Gln Gly Arg Asp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 177 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 177
Gln Met Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Lys Phe Arg Trp Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 178 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 178
Gln Met Pro Gly Gln Lys Trp Met Ala Lys Ser Arg Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 179 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 179
Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 180 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 180
Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Gly Arg Lys Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 181 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 181
Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 182 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 182
Gln Ile Pro Gly Gln Arg Trp Thr Gly Asn Ser Arg Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 183 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 183
Gln Phe Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Ser Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 184 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 184
Gln Ile Pro Gly Arg Lys Gly Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 185 <211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 185
agcggataac aatttcacac agga 24 <210> 186
<211> 24 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 186
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210> 187 <211> 20 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 187
ttgcaggcgt ggcaacagcg 20
<210> 188 <211> 23 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 188
cacgacgttg taaaacgacg gcc
<210> 189 <211> 60 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 189
gcagcctccg gattcacctt tacsgastat agsatgtgst gggtccgcca ggctccgggg 60
<210> 190 <211> 64 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 190
gggtctcgag tgggtctcag csattgascc satsggsaas cgsacatact acgcagactc 60 cgtg 64
<210> 191 <211> 77 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 191
gcggtatatt actgtgcgaa acasatsccs ggscgsaast gsacsgcsaa stcscgstts 60 gactactggg gtcaggg 77
<210> 192 <211> 44 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 192
ttgcaggcgt ggcaacagcg tcgacagagg tgcagctgtt ggag 44
<210> 193 <211> 26 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 193
gcgtagtatg tacgattacc aatcgg 26
<210> 194 <211> 54 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<221> misc feature
<222> 22, 23, 31, 32
<223> n = A,T,C или G
<400> 194
ggtaatcgta catactacgc anngtccgtg nnkggccggt tcaccatctc ccgc 54
<210> 195 <211> 53 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 195
tgtgtgtgtg tggcggccgc gctcgagacg gtgaccaggg ttccctgacc cca 53
<210> 196 <211> 54 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 196
ggtaatcgta catactacgc aaactccgtg cgcggccggt tcaccatctc ccgc 54 <210> 197
<211> 20 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 197
ttgcaggcgt ggcaacagcg 20
<210> 198 <211> 23 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 198
cacgacgttg taaaacgacg gcc 23
<210> 199 <211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 199
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 200 <211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 200
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatt 300 ccggggcgta agtggactgc taattcgcgg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372
<210> 201 <211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 201
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ile Pro Gly Arg Lys Trp Thr Ala Asn Ser Arg Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 202
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtaatcg tacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacagatt 300
ccggggcgta agtggactgc taattcgcgg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gc 372
<210> 203 <211> 360 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 203
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aatacgagta tgggttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgt attgatccta agggtagtca tacatactac 180
acagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa tacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagcgt 300
gagttgggta agtcgtattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<210> 204 <211> 120 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 204
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asn Thr
20 25 30
Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asp Pro Lys Gly Ser His Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Arg Glu Leu Gly Lys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 205 <211> 360 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты <400> 205
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat caggatcgga tgtggtgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attgagagtg gtggtcatag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaatcagaat 300 aagtcggggc gttcgggttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360
<210> 206 <211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 206
Glu Val Gln
Leu
Leu
Ser
Leu
Arg
Leu
20 Trp
Ser
Arg
Met
Trp
Ile
Val
Ser
Ala
Gly
Glu
Ser
Lys
Arg
Phe
Thr
Leu
Gln
Met
Asn
Ser 85
Ala
Asn
Gln
Asn 100 Val
Lys
Gly
Thr
Leu
115
Thr
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Pro
Arg
Gln
Ala 40
His
Gly
Gly
Gly
Ser
Arg
Thr
Ile
Arg
Asp
Asn
Leu
Arg
Ala
Glu
Asp 90
Gly
Ser
Gly
Arg
Ser 105
Val
Ser
Ser 120
Leu
Val
Gln
Pro
Gly
Gln
Gly
Phe
Thr
Phe
Asp
Glu
Asp
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Trp
Val
Tyr
Tyr 60
Lys
Ala
Asp
Ser
Val
Ser
Thr
Asn Val
Thr Tyr
Leu
Tyr
Gly
Tyr
Cys
Phe
Asp
Tyr
Trp 110
Gln
<210> 207 <211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 207
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtt tgtctcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcat 300
gcggctgggg tttcgggtac ttattttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcgagc 366
<210> 208 <211> 122 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
Glu
Val
Gln
Leu
Leu
Ser
Leu
Arg
Leu
Trp
Ser
Gln
Met
Trp
Ile
Val
Ser
Arg 50
Gly
Asp
Ser
Lys 65
Arg
Phe
Thr
Leu
Gln
Met
Asn
Ser
Ala
Ala
Lys
Arg
His
100 Thr
Gly
Gln
Gly 115
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Gly
Gly
Cys
Ala
Ala
Ser
Pro
Arg
Gln
Ala
Gly
Gly
Pro
Gly
Ser
Arg
Thr
Ile
Arg
Asp
Asn
Leu
Arg
Ala
Glu
Asp 90
Gly
Ala
Gly
Val
Ser 105 Ser
Val
Thr
Val 120
Ser
Leu
Val
Gln
Pro
Gly
Thr
Gly
Phe
Thr
Phe
Gly
Glu
Glu
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Phe
Val
Tyr
Tyr 60
Lys
Ala
Asp
Ser
Val
Ser
Thr
Asn Val
Thr Tyr
Leu
Tyr 95
Tyr
Cys
Thr
Tyr
Phe
Asp 110
Tyr
Trp
<210> 209
<211> 81 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<221> misc_feature
<222> 25, 26, 34, 35, 43, 44, 49, 50, 52, 53, 58, 59
<223> n = A,T,C или G <400> 209
gcggtatatt actgtgcgaa acagnnsccc ggcnnsaagt ggnnsgccnn snnscgcnns 60 gactactggg gtcagggaac c 81
<210> 210 <211> 42 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 210
gcccagccgg ccatggcgga ggtgcagctg ttggagtctg gg 42
<210> 211 <211> 40 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 211
gaattcgcgg ccgcctatta gctcgagacg gtgaccaggg 40
<210> 212 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 212
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300 cccggcgaga agtggctcgc ccggggccgc ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372
<210> 213 <211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<210> 214 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 214
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ala Pro Gly Glu Lys Trp Leu Ala Arg Gly Arg Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 215 <211> 46 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 215
ggaaccctgg tcaccgtctc gagcgcggcc gcataataag aattca 46
<210> 216 <211> 60 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 216
gcagcctccg gattcacctt tggsacsgag cagatgtggt gggtccgcca ggctccaggg 60
<210> 217
<211> 66 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 217
aagggtctag agtttgtctc acgsattgat tcsccsggtg gscgsacata ctacgcagac 60 tccgtg 66
<210> 218 <211> 75 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 218
gcggtatatt actgtgcgaa acgscatgcs gcsggsgtst csggsacsta ytttgactac 60 tggggtcagg gaacc 75
<210> 219
<211> 60 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Nucliec acid sequence
<400> 219
gcagcctccg gattcacctt tgatcaggat cgsatgtggt gggtccgcca ggccccaggg 60
<210> 220 <211> 66 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты <400> 220
aagggtctag agtgggtctc agcsattgag tcsggsggtc atcgsacata ctacgcagac 60 tccgtg 66
<210> 221 <211> 69 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 221
accgcggtat attactgtgc gvrkcagaat aagtcsggsc gstcsggstt tgactactgg 60 ggtcaggga 69
<210> 222 <211> 60 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 222
gcagcctccg gattcacctt tgagaatacs tcsatgggst gggtccgcca ggctccaggg 60
<210> 223
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 223
aagggtctag agtgggtctc acgsattgat ccsaagggtt cscatacata ctacacsgac 60 tccgtgaagg gccggttcac c 81
<210> 224 <211> 66 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 224
gcggtatatt actgtgcgaa acagcgsgag ctsggsaagt cstaytttga ctactggggt 60 caggga 66
<210> 225 <211> 69 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<221> misc feature
<222> 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 37, 38 <223> n = A,T,C или G
<400> 225
gcagcctccg gattcacctt tnnknnknnk nnkatgnnkt gggtccgcca ggctccgggg 60 aagggtctc 69
<210> 226 <211> 80 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<221> misc_feature
<222> 38, 39, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 56, 57 <223> n = A,T,C или G
<400> 226
ccgccaggct ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcannk attnnknnkn nkggtnnkcg 60 tacatactac gcagactccg 80
<210> 227 <211> 80 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<221> misc_feature
<222> 47, 48, 50, 51, 53, 54, 56, 57, 59, 60 <223> n = A,T,C или G
<400> 227
ccgccaggct ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagnnkn nknnknnknn 60 kacatactac gcagactccg 80
<210> 228 <211> 80 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<221> misc_feature
<222> 25, 26, 28, 29, 31, 32, 34, 35, 37, 38 <223> n = A,T,C или G
<400> 228
accgcggtat attactgtgc gaaannknnk nnknnknnka agtggatggc cgtgggccgc 60 ttggactact ggggtcaggg 80
<210> 229 <211> 80 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<221> misc_feature
<222> 34, 35, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 46, 47
<223> n = A,T,C или G
<400> 229
accgcggtat attactgtgc gaaacagaag cccnnknnkn nknnknnkgc cgtgggccgc 60 ttggactact ggggtcaggg 80
<210> 230 <211> 80
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<221> misc_feature
<222> 46, 47, 49, 50, 52, 53, 55, 56, 58, 59 <223> n = A,T,C или G
<400> 230
accgcggtat attactgtgc gaaacagaag cccggccaga agtggnnknn knnknnknnk 60 ttggactact ggggtcaggg 80
<210> 231 <211> 40 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 231
ccctggtcac cgtctcgagc taataggcgg ccgcgaattc 40
<210> 232 <211> 37 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 232
tatcgtccat ggcggaggtg cagctgttgg agtctgg 37
<210> 233 <211> 366 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 233
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtt tgtctcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300 cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366
<210> 234 <211> 122
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Leu
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Trp
Val
Arg
Gln
Ala
Gly
Pro
Asp
Ser
Pro
Gly 55
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Leu
Ser
Arg
Asp
Asn
Ser 85
Arg
Ala
Glu
Arg 100 Thr
Pro Leu
Thr Val
Gly Thr
Val Val
ion
Ser 105 Ser
<400> 234
Glu Val Gl
1 5 10 15
Gly Phe Thr Phe Gly Thi
Gly Lys Gly Leu Glu Phe
35 40 45
Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr 711 -
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65 70 75 80
Leu Gn" Met As" Ser Leu Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
90 95 Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 235 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 235
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300 cccggcgaga agtgggcgag gcggtgggat ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372
<210> 236 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 236
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
110
Ala Lys Gln Ala Pro Gly Glu Lys Trp Ala Arg Arg Trp Asp Leu Asp
100 105 110
120
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 1 rz ion
115
<210> 237 <211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты <400> 237
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg accgatcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtt tgtctcacgc attgattccc ccggtgggcg gacatactac 180
gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcag 300
ccggcggggg tgtcggggaa gtacgttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcgagc 366
<210> 238 <211> 122 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Leu
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Trp
Val
Arg
Gln
Ala 40 Gly
Pro
Asp
Ser
Pro
Gly 55
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Ser
Arg
Asp
Asn
Ser
Pro
Leu
Leu
Arg
Ala
Glu
Gln 100 Thr
Ala Val
Gly Thr
Val Val
ion
Ser 105 Ser
<400> 238
n Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
5 10 g Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
r~ < "1 .
35 40 45
Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65 70 75 80
Leu Met Ser Leu A- Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
90 95 Gly Lys Tyr Val Asp Tyr 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 239 <211> 372 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300 cccaatcaga ggtatgttgc ccggggccgc ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372
<210> 240 <211> 124 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 240
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ala Pro Asn Gln Arg Tyr Val Ala Arg Gly Arg Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 241 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 241
Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<210> 242 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 242
Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Аминокислотная последовательность <400> 243
Gln Ala Pro Gly Glu Lys Trp Ala Arg Arg Trp Asp Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 244 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 244
Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Arg Met Trp
1 5 10
<210> 245
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 245
Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 246 <211> 15 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 246
Gln Ala Pro Asn Gln Arg Tyr Val Ala Arg Gly Arg Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 247 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 247
Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu Gln Met Trp
1 5 10
<210> 248 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 248
Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 249
<211> 13 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 249
Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 250 <211> 10 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 250
Gly Phe Thr Phe Gly Thr Asp Gln Met Trp
1 5 10
<210> 251 <211> 17 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 251
Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 252 <211> 13 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 252
Arg Gln Pro Ala Gly Val Ser Gly Lys Tyr Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 253 <211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 253
gggtctagag tttatttcac gtattgattc gcc 33
<210> 254 <211> 3б <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 254
gggaggacat actacgcaaa ctccgtgaag ggccgg 3б
<210> 255 <211> 28 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 255
cgcagactcc gtgcgtggcc ggttcacc 28
<210> 25б <211> 42 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 25б
gggaggacat actacgcaaa ctccgtgcgt ggccggttca cc 42
<210> 257 <211> 32 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 257
ggacatacta cgcaaactcc gtgaagggcc gg 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты <400> 258
cgcagactcc gtgcgtggcc ggttcacc 28 <210> 259
<211> 38 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 259
ggacatacta cgcaaactcc gtgcgtggcc ggttcacc 38
<210> 260 <211> 43 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 260
ccctggtcac cgtctcgagc gcgtaataag cggccgcaga tta 43
<210> 261 <211> 36 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 261
ataaggccat ggcggaggtg cagctgttgg agtctg 36
<210> 262 <211> 369 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 262
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtt tgtctcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300
cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcgagcgcg 369
<210> 263 <211> 123
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Leu
Val
Gln
Pro
Gly
Thr
Gly
Phe
Thr
Phe
Gly
Glu
Glu
Lys
Gly
Leu
45 Ala
Phe
Val
Tyr
Tyr 60
Asp
Ser
Val
Ser
Thr
Lys Ala
Asn Val
Thr Tyr
Leu
Tyr 95
Tyr 80
Cys
Thr
Phe
Tyr
Asp 110
Tyr
Trp
<400> 263
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
1 5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
20 25 Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr
50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 85 90 Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly
100 105 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120
<210> 264 <211> 369 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 264
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtt tatttcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300
cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcgagcgcg 369
<210> 265 <211> 123 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Leu
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Trp
Val
Arg
Gln
Ala
Gly
Pro
Asp
Ser
Pro
Gly 55
Arg
Phe
Thr
Ile
Leu
Ser
Arg
Asp
Asn
Ser 85
Arg
Ala
Glu
Arg 100 Thr
Pro Leu
Thr Val
Gly Thr
Val Val
ion
Ser 105 Ser
<400> 265 Glu Val Gl
1 5 10 15
Gly Phe Thr Phe Gly Thr 30
Gly Lys Gly Leu Glu Phe
35 40 45
Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95 Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
<210> 266
<211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты <400> 266
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtt tgtctcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180
gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300
cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcgagcgcg 369
<210> 267 <211> 123
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Val
Gln
Pro
Gly 15 Thr
Gly
Thr
Phe
Gly
Glu
Glu
Gly
Leu
45 Ala
Phe
Val
Tyr 60
Asn
Ser
Val
Lys
Asn
Thr
Leu
Tyr
Cys
Ala
Val
Tyr
Tyr 95
Phe
Tyr
Asp 110
Tyr
Trp
<400> 267 Glu Val G 1
<210> 268 <211> 369 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 268
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtt tgtctcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180
gcagactccg tgcgtggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300
cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcgagcgcg 369
<211> 123 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность <400> 269
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu
20 25 30
Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120
<210> 270 <211> 369 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 270
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gtctagagtt tgtctcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180
gcaaactccg tgcgtggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300
cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcgagcgcg 369
<210> 271 <211> 123 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr
Leu Glu
Ala Asn
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
115
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
1 1 rz ion
120
<210> 272 <211> 375 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 272
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300
cccggcgaga agtgggcgag gcggtgggat ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gcgcg 375
<210> 273 <211> 125 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<210> 274 <211> 375 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 274
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180
gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300
cccggcgaga agtgggcgag gcggtgggat ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gcgcg 375
<210> 275 <211> 125
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность <400> 275
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ala Pro Gly Glu Lys Trp Ala Arg Arg Trp Asp Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 276 <211> 375
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 276
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180
gcagactccg tgcgtggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300
cccggcgaga agtgggcgag gcggtgggat ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gcgcg 375
<210> 277 <211> 125 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 277
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
110
Ala Lys Gln Ala Pro Gly Glu Lys Trp Ala Arg Arg Trp Asp Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 278 <211> 375 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 278
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120
ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180
gcaaactccg tgcgtggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300
cccggcgaga agtgggcgag gcggtgggat ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360
accgtctcga gcgcg 375
<210> 279 <211> 125 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 279
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ala Pro Gly Glu Lys Trp Ala Arg Arg Trp Asp Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 280 <211> 375 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 280
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60
tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg gatttcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300 cccggcgaga agtgggcgag gcggtgggat ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gcgcg 375
<210> 281 <211> 125
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu 1
Ser
Val
Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Leu
Arg
Leu
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Arg
Met
Trp
Ile
Trp
Val
Arg
Gln
Ala 40
His
Pro
Ser
Ala
Gly
Glu
Pro
Ile
Gly
Ser
Arg
Lys
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Arg
Asp
Leu
Gln
Met
Asn
Ser
Pro
Leu
Arg
Ala
Glu
Ala
Lys
Gln
Ala 100 Gln
Gly
Glu
Lys
Trp 105 Thr
Tyr
Trp
Gly 115
Gly
Thr
Leu
Val 120
10 15 Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr 30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 45
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95
Ala Arg Arg Trp Asp Leu Asp
110
Val Ser Ser Ala 125
<210> 282 <211> 375
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 282
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300 cccaatcaga ggtatgttgc ccggggccgc ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gcgcg 375
<210> 283 <211> 125 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 283
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
T T -Г ,
100 105
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 284 <211> 375 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 284
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180 gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300 cccaatcaga ggtatgttgc ccggggccgc ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gcgcg 375
<210> 285 <211> 125 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 285
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Arg Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Glu Pro Ile Gly His Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ala Pro Asn Gln Arg Tyr Val Ala Arg Gly Arg Leu Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
<210> 286 <211> 375 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты <400> 286
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatc cacctttacg gagtatagga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctcgagtg ggtctcagcg attgagccga ttggtcatag gacatactac 180 gcaaactccg tgcgtggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacaggcg 300 cccaatcaga ggtatgttgc ccggggccgc ttggactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gcgcg 375
<210> 287 <211> 125 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu 1
Ser
Val
Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Leu
Arg
Leu
20 Trp
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser
Pro
Arg
Met
Trp 35
Ile
Val
Arg
Gln
Ala
His
Ser
Ala
Gly
Glu
Pro
Ile
Gly
Ser
Arg
Arg 65
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Arg
Asp
Leu
Gln
Met
Asn
Ser 85
Leu
Arg
Ala
Glu
Ala
Lys
Gln
Ala 100 Gln
Pro
Asn
Gln
Arg
Tyr 105 Thr
Tyr
Trp
Gly 115
Gly
Thr
Leu
Val 120
10 15
Gly Ser Thr Phe Thr Glu Tyr
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Val Ala Arg Gly Arg Leu Asp 110
Val Ser Ser Ala 125
<210> 288 <211> 369 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 288
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtt tatttcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180 gcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300 cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagcgcg 369
<210> 289 <211> 123 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
1 5 10
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
20 25 Gln Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
35 40 Ser Arg Ile Asp Ser Pro Gly Gly Arg Thr Tyr
50 55
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
85 90 Ala Lys Arg Arg Pro Thr Gly Val Ser Gly Thr
100 105 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120
Val
Gln
Pro
Gly
Thr
Gly
Thr
Phe
Gly
Glu
Glu
Gly
Leu 45
Ala
Phe
Ile
Tyr
Lys
Asn
Ser
Val
Asn
Thr
Leu
Tyr 80
Ala
Val
Tyr
Tyr 95
Cys
Phe
Tyr
Asp 110
Tyr
Trp
<210> 290 <211> 369
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 290
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acggagcaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtt tatttcacgt attgattcgc ctggtgggag gacatactac 180 gcaaactccg tgcgtggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggcga 300 cccacggggg tgtccgggac gttttatgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagcgcg 369
<210> 291 <211> 123
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
Glu 1
Ser
Val
Gln
Leu
Leu
Glu
Ser
Gly
Gly
Leu
Arg
Leu
20 Trp
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser
Pro
Gln
Met
Trp
Ile
Val
Arg
Gln
Ala
Gly
Ser
Arg
Gly
Asp
Ser
Pro
Gly
Ser
Arg
Arg 65
Leu
Arg
Phe
Thr
Ile
70 Leu
Arg
Asp
Gln
Met
Asn
Ser 85
Arg
Ala
Glu
Ala
Lys
Arg
Arg 100 Thr
Pro
Thr
Gly
Val
Ser 105 Ser
Gly
Gln
Gly 115
Leu
Val
Thr
Val 120
10 15 Gly Phe Thr Phe Gly Thr Glu 30
Gly Lys Gly Leu Glu Phe Ile 45
Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val 60
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95 Gly Thr Phe Tyr Asp Tyr Trp 110
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, содержащий любую аминокислотную последовательность из SEQ ID N0:1-38, 204, 206, 208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289 и 2 91, имеющую до 5 замен аминокислот, делеций или инсерций в любой комбинации.
2. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по п. 1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:234 или 236, имеющую до 5 замен аминокислот, делеций или инсерций в любой комбинации.
3. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по п. 1 или п. 2, где указанные замены аминокислот, делеций или инсерций не находятся в CDR3.
4. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по п. 1, 2 или 3, где указанные замены аминокислот, делеций или инсерций не находятся в какой-либо из CDR.
5. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против
TGFpRII, содержащий аминокислотную последовательность,
выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:1-38, 204, 206,
208, 214, 234, 236, 238, 240, 263, 265, 267, 269, 271, 273,
275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289 и 291.
6. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по п. 5, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:234 или 236.
7. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по любому из предшествующих пунктов, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII дополнительно содержит С-концевой остаток аланина.
8. Выделенный полипептид, содержащий отдельный
вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по любому из
предшествующих пунктов, где указанный выделенный полипептид
связывается с TGFpRII.
9. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против
TGFpRII по любому из пп.1-7 или полипептид по п. 8,
дополнительно содержащий по меньшей мере одну из следующих
аминокислот, выбранных из группы: R в положении 39, I в положении 48, D в положении 53, N в положении 61, R в положении 61, К в положении 61, R в положении 64, F в положении 64, D в положении 64, Ев положении 64, М в положении 64, Y в положении 64, Н в положении 102 или S в положении 103 отдельного вариабельного домена иммуноглобулина, где указанные положения соответствуют нумерации по Rabat.
10. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид по п. 9, содержащий R или К в положении 61.
11. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по любому из пп.1-7 или полипептид по п. 8, дополнительно содержащий одну из следующих комбинаций аминокислот, выбранных из группы: N в положении 61 и R в положении 64; R в положении 61 и Е в положении 64; R в положении 61 и М в положении 64; R в положении 61 и F в положении 64; R в положении 61 и Y в положении 64; и R в положении 61 и D в положении 64 отдельного вариабельного домена иммуноглобулина.
12. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид по п. 9, 10 или 11, содержащий остаток изолейцина в положении 48.
13. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид по любому из пп.1-12, где указанный отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид связывается с TGFpRII человека.
14. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид по п. 13, где указанный отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид также связывается с TGFpRII мыши и/или TGFpRII яванского макака.
15. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или полипептид по любому из пп.1-14, где указанный отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или полипептид нейтрализует активность TGFp.
16. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или
полипептид по любому из пп.1-15, где указанный отдельный вариабельный домен иммуноглобулина или полипептид ингибирует связывание TGFp с TGFpRII.
17. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид по любому из пп. 1-16.
18. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 16, содержащая по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную из группы: SEQ ID N0:39-76, 203, 205, 207, 212, 233, 235, 237, 239, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290.
19. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 17 или п. 18.
20. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор по любому из пп. 17-19.
21. Способ получения полипептида, содержащего отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по любому из пп. 1-16, включающий поддержание клетки-хозяина по п. 2 0 в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты или вектора, таким образом, что получают полипептид, содержащий отдельный вариабельный домен иммуноглобулина.
22. Применение отдельного вариабельного домена
иммуноглобулина против TGFpRII или полипептида по любому из пп.
1-16 в качестве лекарственного средства.
23. Фармацевтическая композиция, содержащая отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид по любому из пп. 1-16.
24. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, или полипептид по п. 22, или фармацевтическая композиция по п. 23 для лечения заболевания, связанного с передачей сигнала TGFp.
25. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII, полипептид или фармацевтическая композиция по п. 24, где заболевание, связанное с передачей сигнала TGFp, выбрано из группы: фиброза ткани, такого как легочный фиброз, включая идиопатический легочный фиброз; фиброза печени, включая цирроз
23.
и фиброз при хроническом гепатите; ревматоидного артрита; глазных нарушений; фиброза кожи, включая келоид кожи, и контрактуры Дюпюитрена; фиброза почек, такого как фиброз при нефритах и нефросклероз, заживления ран; и сосудистого состояния, такого как рестеноз.
26. Применение отдельного вариабельного домена
иммуноглобулина против TGFpRII, полипептида или
фармацевтической композиции по п. 22, для лечения фиброза ткани
или для применения в заживлении ран и/или снижении рубцевания.
27. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII по п. 22, 24 или 25, где заболевание является келоидной болезнью или контрактуры Дюпюитрена.
28. Применение отдельного вариабельного домена против TGFpRII или полипептида по любому из пп. 1-16 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с передачей сигнала TGFp.
29. Способ лечения и/или профилактики опосредуемого TGFp состояния у пациента-человека, включающий этап: введения композиции, содержащей отдельный вариабельный домен иммуноглобулина против TGFpRII или полипептид по любому из пп. 1-16, пациенту-человеку.
30. Набор, содержащий отдельный вариабельный домен против TGFpRII или полипептид по любому из пп. 1-16 и устройство для нанесения указанного отдельного вариабельного домена или полипептида на кожу.
31. Набор по п. 30, где устройство является устройством для внутрикожной доставки.
По доверенности
(19)
(19)
(19)
119
5' -
118
121
121
126
126
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-42 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин + 61N) (SEQ ID N0:267)
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-42 (DOM23h-439-25 + С-концевой аланин + 61N) (SEQ ID N0:267)
127
127
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-130 (DOM23h-271-123 + С-концевой аланин) (SEQ ID N0:273)
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-130 (DOM23h-271-123 + С-концевой аланин) (SEQ ID N0:273)
128
128
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-133 (DOM23h-271-123+ С-концевой аланин + 61N64R) (SEQ ID N0:279)
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-133 (DOM23h-271-123+ С-концевой аланин + 61N64R) (SEQ ID N0:279)
129
129
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-136 (DOM23h-271-129 + С-концевой аланин + 61N) (SEQ ID N0:285)
Аминокислотная последовательность DOM23h-271-136 (DOM23h-271-129 + С-концевой аланин + 61N) (SEQ ID N0:285)
130
130
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-48 (DOM23h-439-44 + 481) (SEQ ID N0:291)
Аминокислотная последовательность DOM23h-439-48 (DOM23h-439-44 + 481) (SEQ ID N0:291)
131
131
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
115
<210> 19 <211> 123 <212> БЕЛОК
<210> 19 <211> 123 <212> БЕЛОК
<400> 33
<400> 33
100
100
100
100
100
100
<211> 357
<211> 357
<210> 53 <211> 363 <212> ДНК
<210> 53 <211> 363 <212> ДНК
<400> 68
<400> 68
<210> 76
<210> 76
<400> 80
<400> 80
<400> 80
<400> 80
<400> 80
<400> 80
<223> Аминокислотная последовательность
<223> Аминокислотная последовательность
<223> Аминокислотная последовательность
<223> Аминокислотная последовательность
<220>
<220>
<210> 110 <211> 10 <212> БЕЛОК
<210> 110 <211> 10 <212> БЕЛОК
<211> 17
<211> 17
<220>
<220>
<210> 136 <211> 18 <212> БЕЛОК
<210> 136 <211> 18 <212> БЕЛОК
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 168
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 168
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 168
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 168
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<220>
<220>
<220>
<220>
<210> 202 <211> 372 <212> ДНК
<210> 202 <211> 372 <212> ДНК
<220>
<220>
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 208
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
<400> 208
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<220>
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 239
<220>
<223> Последовательность нуклеиновой кислоты
<400> 239
<210> 243
<210> 243
<220>
<220>
<210> 258 <211> 28
<210> 258 <211> 28
115
115
115
115
<210> 269
<210> 269
<220>
<220>
<220>
<220>
<400> 289
<400> 289
150
150
|
