[**]

Настоящее изобретение относится к методам предсказания эффективности противораковой иммунотерапии у пациента на основе новых биомаркеров. Настоящее изобретение относится также к определению прогноза исхода лечения на основе упомянутых биомаркеров. Настоящее изобретение относится также к панелям биомаркеров для применения в упомянутых выше методах.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к методам предсказания эффективности противораковой иммунотерапии у пациента на основе новых биомаркеров. Настоящее изобретение относится также к определению прогноза исхода лечения на основе упомянутых биомаркеров. Настоящее изобретение относится также к панелям биомаркеров для применения в упомянутых выше методах.

---

Евразийское (21) 201390762 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. G01N33/574 (2006.01)
2013.09.30 A61K39/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки
2011.11.22
(54) НОВЫЕ БИОМАРКЕРЫ ДЛЯ ПРЕДСКАЗАНИЯ ИСХОДА ПРОТИВОРАКОВОЙ ИММУНОТЕРАПИИ
(31) 61/416,981; 1021289.2; 61/423,652
(32) 2010.11.24; 2010.12.15; 2010.12.16
(33) US; GB; US
(86) PCT/EP2011/070661
(87) WO 2012/069462 2012.05.31
(71) Заявитель:
ИММАТИКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Вайншенк Тони, Сингх Харприт, Фриче Йенс, Мар Андреа (DE)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к методам предсказания эффективности противораковой иммунотерапии у пациента на основе новых биомаркеров. Настоящее изобретение относится также к определению прогноза исхода лечения на основе упомянутых биомаркеров. Настоящее изобретение относится также к панелям биомаркеров для применения в упомянутых выше методах.
2420-195654ЕА/032
НОВЫЕ БИОМАРКЕРЫ ДЛЯ ПРЕДСКАЗАНИЯ ИСХОДА ПРОТИВОРАКОВОЙ
ИММУНОТЕРАПИИ
Настоящее изобретение относится к методам предсказания эффективности противораковой иммунотерапии у пациента на основе новых биомаркеров. Настоящее изобретение относится также к определению прогноза исхода лечения на основе упомянутых биомаркеров. Настоящее изобретение относится также к панелям биомаркеров для применения в упомянутых выше методах.
Таким образом, данная заявка на изобретение заявляет приоритет на основании предварительных заявок на патент: GB1021289.6, поданной 15 декабря 2010 г.; US 61/416,981, поданной 24 ноября 2010 г. и US 61/423,652, поданной 16 декабря 2010 г. В данную заявку включен список последовательностей состоящий из 50 последовательностей. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитируемые источники включены в данное описание во всей полноте путем ссылки.
Уровень техники
Стимуляция иммунных ответов зависит от присутствия
антигенов, распознаваемых иммунной системой хозяина как
чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных и
опухолеспецифических антигенов повысило возможность
использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы управления обеими ветвями иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.
Конкретные элементы клеточного звена иммунитета способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрующих клеток или из периферической крови позволяет предположить, что такие клетки играют важную роль в природной иммунной защите от рака (Cheever и соавт., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690:101-112; Zeh HJ, Perry-Lalley D, Dudley ME, Rosenberg SA, Yang JC; J Immunol. 1999, 162 (2) : 989-94; High
avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumour efficacy.) . В частности, CD8-положительные Т-клетки (CD8+), которые распознают комплексы, образованные молекулами главного комплекса гистосовместимости
(МНС) I класса и пептидами, играют важную роль в этом ответе. Эти пептиды имеют обычно 8-10 аминокислотных остатков, образованных из цитозольных белков или дефектных рибосомных продуктов (DRIPS) (Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell JW, Bennink JR.,"Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes; Nature 2000; 404(6779) : 770-774) . Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA).
Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса могут быть обнаружены на большинстве клеток, имеющих ядро, и которые презентируют пептиды, образующиеся в результате протеолитического расщепления эндогенных белков, DRIPS и более крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться преимущественно на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК и впоследствии процессируются
(Cresswell P. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12:259-93). Комплексы из пептида и молекул МНС I класса распознаются CD8+ ЦТЛ, несущими подходящий Т-клеточный рецептор (ТКР), тогда как комплексы из пептида и молекул МНС II класса распознаются CD4+ хелперными Т-клетками, несущими подходящий ТКР. Хорошо известно, что ТКР, пептид и МНС встречаются в стехиометрическом соотношении 1:1:1.
Для того чтобы пептид вызывал клеточный иммунный ответ, он
должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от
аллеля молекулы МНС и аминокислотной последовательности
пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС I класса, как правило,
имеют 8, 9 или 10 аминокислотных остатков в длину и содержат
два консервативных остатка ("якоря") в своей
последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС. Таким образом, каждый аллель МНС имеет "связывающий мотив" определяющий, какие
пептиды могут специфически связываться со связывающей бороздкой (Rammensee Н. G., Bachmann J. and Stevanovic, S; МНС Ligands and Peptide Motifs, Chapman & Hall 1998). Чтобы вызвать иммунную реакцию, пептиды не только должны быть в состоянии связываться с конкретными молекулами МНС, но они также должны распознаваться Т-клетками, несущими специфические Т-клеточные рецепторы (ТКР). Другим предварительным условием эффективной иммунной реакции является отсутствие иммунологической толерантности к этому антигену.
Опухолеассоциированные антигены (ТАА), частью которых являются эпитопы, распознаваемые ЦТЛ, могут быть молекулами из всех классов белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые представлены в повышенном количестве в клетках соответствующей опухоли. Кроме того, антигены могут быть опухолеспецифическими, т.е. уникальными для опухолевых клеток, к примеру, в виде продуктов мутировавших генов или из альтернативных открытых рамок считывания (ОРС) или белкового сплайсинга (Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der Bruggen P, Boon T, Van den Eynde BJ. Science 2004 Apr 23; 304 (5670) : 587-90.) . Другой важный класс антигенов представлен тканеспецифическими антигенами, такими как раково-тестикулярный антиген (СТ), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани семенника.
Поэтому опухолеассоциированные антигены (ТАА) являются отправным пунктом для разработки противораковой вакцины. Методы идентификации и характеристики ТАА основаны, например, на использовании ЦТЛ, которые могут быть выделены у пациентов или здоровых субъектов, или же они основаны на генерировании различных профилей транскрипции или различном характере экспрессии пептидов опухолевыми и нормальными тканями (Lemmel С. , Weik S., Eberle U., Dengjel J., Kratt Т., Becker H. D., Rammensee H. G., Stevanovic S. Nat. Biotechnol. 2004 Apr.; 22(4):450-4, T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, 0. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, К. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. Cancer
Res. 62 (20):5818-5827, 2002).
Однако идентификация генов, гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных в опухолевых тканях или опухолевых клеточных линиях человека, не дает точной информации о том, является ли соответствующий антиген полезным в качестве мишени в иммунотерапии, основанной на Т-клетках. Это связано с тем, что лишь отдельные субпопуляции эпитопов этих антигенов а) презентируются и Ь) распознаются Т-клетками с соответствующими ТКР. Кроме того, необходимо, чтобы иммунологическая толерантность для данного конкретного эпитопа отсутствовала или была ничтожно малой. Поэтому важно выбрать лишь те пептиды из гиперэкспрессированных или селективно экспрессированных белков, которые презентируются в соединении с молекулами МНС и являются мишенями функциональных Т-клеток. Функциональная Т-клетка определяется как Т-клетка, которая при стимуляции конкретным антигеном может быть клонирована и способна выполнять эффекторные функции ("эффекторная Т-клетка").
Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении
эффекторными функциями ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете.
Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных
клеток типа THi, поддерживают эффекторные функции CD8+ ЦТЛ,
которые включают цитотоксические функции, направленные против
опухолевых клеток, экспонирующих комплексы
опухолеассоциированный пептид/МНС на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные эпитопы Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.
Так как оба вида ответов, зависящие от CD8 и от CD4, вносят свой вклад в противоопухолевый эффект сообща и синергически, то идентификация и характеристика ТАА, распознаваемых CD8+ ЦТЛ (лиганд: молекула МНС I класса + пептидный эпитоп), так и ТАА, распознаваемых CD4+ ЦТЛ (лиганд: молекула МНС II класса + пептидный эпитоп) являются важными при разработке эффективных противоопухолевых вакцин и эффективного
лечения, основанного на этих вакцинах.
В Европе почечно-клеточная карцинома (ПКК) занимает седьмое место среди наиболее распространенных злокачественных заболеваний у мужчин, среди которых ежегодно фиксируется 29 600 новых случаев (3,5% всех видов рака). Среди женщин ПКК занимает двенадцатое место, и ежегодно сообщается о 16 700 случаев (2,3% всех видов рака). ПКК - редкое заболевание в возрасте до 40 лет, после достижения этого возраста оно встречается в два раза чаще у мужчин, чем у женщин. Частота возникновения в зависимости от возраста стремительно растет от менее 2 случаев на 100 000/год среди пациентов младше 40 лет до 38 случаев на 100 000/год среди пациентов, возраст которых 65-69 лет. Впоследствии частота возникновения заболеваний достигает 4 6 случаев на 100 000/год среди тех, кто старше 75 лет.
В целом, при первом обследовании у 25-30% пациентов с ПКК имеются метастазы. В течение времени у трети пациентов с ПКК развивается метастатическая болезнь. Таким образом, у приблизительно 50-60% всех пациентов с ПКК, в конечном итоге, появляется метастатическая болезнь. Среди тех, у кого имеются метастазы, приблизительно у 75% встречаются метастазы в легких, у 3 6% поражены лимфатические узлы и/или мягкие ткани, у 2 0% -кости и у 18% - печень.
ПКК считается раковым заболеванием с наивысшей летальностью среди опухолей мочеполовой системы, при которых 5-летняя выживаемость составляет 65% по сравнению с 82% и 100% 5-летней выживаемостью в случае рака мочевого пузыря или предстательной железы, соответственно (данные США на 1972-2001 гг.). Средний показатель выживаемости по Европе в течение 5 лет (вплоть до 1999 г.) после постановки диагноза (1990-1994 гг.) "рак почки" составил около 58%, и многие авторы классифицировали ПКК как "рак с лишь умеренным прогнозом". В целом ПКК приводит к летальному исходу примерно в 8 0% случаев. Этот факт свидетельствует о высокой потребности медицины в эффективном и своевременно применяемом методе клинического наблюдения и методе лечения рецидивов.
Выживаемость находится в строгой зависимости от стадии, на
которой был поставлен диагноз: 5-летняя выживаемость составляет всего лишь 12% у пациентов, имеющих очаги поражения с отдаленными метастазами, но 8 0% в случае локализованной опухоли.
Колоректальная карцинома (КРР) занимает третье место по частоте встречаемости в мире. На долю рака толстой и прямой кишки приходится около 1 миллиона новых случаев ежегодно, и, в отличие от большинства других видов рака, данные для мужчин и женщин похожи (соотношение 1,2:1) . В Европе КРР находится на втором месте по частоте встречаемости и на втором месте по частоте вызываемых им летальных исходов как у мужчин, так и у женщин, ежегодно на его долю приходится прибл. 38 0 ООО новых случаев и около 200 ООО случаев смерти от этого заболевания. Необработанные данные по частоте заболеваемости в 2002 г. для мужчин и женщин дают результат 88,3 и 84,0 случая на 100 000 человек, соответственно; необработанные данные по смертности -34,8 и 35,2 случая на 100000 человек, соответственно. Эти данные отчетливо показывают, насколько крупную проблему представляет собой КРР как для отдельных людей, так и для общества в целом.
КРР - рак старшего поколения, поскольку средний возраст
при проявлении признаков заболевания у мужчин и женщин
составляет 69 и 75 лет, соответственно. Помимо факторов,
связанных с питанием и образом жизни (например, ожирение,
недостаток физической нагрузки, курение, регулярное
употребление алкоголя), другими факторами риска являются
семейная предрасположенность к возникновению КРР,
наследственные виды КРР (семейный аденоматозный полипоз [САП], аттенуированный САП [аттенуированный аденоматозный полипоз с геном предрасположенности АРС (Adenomatous Polyposis Coli)], наследственный неполипозный колоректальный рак [ННКРР], синдромы гамартомного полипоза) и воспалительные заболевания кишечника, такие как язвенный колит или болезнь Крона.
КРР в основном возникает как аденокарцинома слизистых оболочек прямой кишки, сигмовидной кишки, поперечной ободочной/нисходящей ободочной кишки и восходящей
ободочной/слепой кишки. Колоректальный рак на ранних стадиях может быть излечен с помощью первичной операции. Отдаленные метастазы, однако, распространяются в регионарные лимфатические узлы и печень, легкие и другие органы (такие как ЦНС). Вследствие неспецифических симптомов диагноз КРР часто ставится на относительно поздней стадии, и у прибл. 25% пациентов с КРР, когда они впервые обследуются у своего лечащего врача, уже имеется метастатическая болезнь (мКРР). В дополнение к этому, у 30% пациентов с впервые диагностированным локализованным резектабельным КРР впоследствии появляются рецидивы метастазов.
В патенте ЕР2105740 описывается, что некоторые белки,
включая аполипопротеин AI (АРОА1), регулируются
гиперэкспрессией с-тус у индивидов, страдающих раком или предрасположенных к раку. Таким образом, в ЕР2105740 описывается применение биомаркера АРОА1 для постановки диагноза, определения прогноза и/или мониторинга лечения ракового заболевания, в частности рака легких, но не для предсказания эффективности лечения, тем более не иммунотерапии.
В заявке WO2010/076322 описывается метод предсказания ответа и/или пользы от химиотерапии для пациента, страдающего раком, включающий (i) классификацию опухоли с определением по меньшей мере в два класса, (ii) выявление в опухолевом образце экспрессии по меньшей мере одного гена-маркера, являющегося свидетельством ответа на химиотерапию для опухоли в каждом соответствующем классе, (iii) и в зависимости от упомянутой экспрессии гена, предсказание упомянутого ответа и/или пользы, где одним геном-маркером является CXCL13. В заявке WO2010/076322 также не описывается предсказание эффективности лечения, тем более иммунотерапии.
Подобным образом, заявка WO2010/003773 описывает методы предсказания исхода ракового заболевания у пациента, страдающего раком, причем упомянутому пациенту предварительно был поставлен диагноз рака с поражением лимфатических узлов, и он прошел лечение методом цитотоксической химиотерапии; где одним геном-маркером является CXCL13. В заявке WO2010/003773 не описывается предсказание эффективности иммунотерапии.
Патент ЕР 1 777 523 А1 относится к определению прогноза исхода ракового заболевания у пациента, прогноз которого основан на определении количества одного или нескольких биологических маркеров, которые указывают на наличие или, в качестве альтернативы, на уровень адаптивного иммунного ответа у упомянутого пациента, направленного против ракового заболевания. В целом, раскрыто чрезвычайно большое количество маркеров. Кроме того, ЕР 1 777 523 А1 относится к определению прогноза (а не предсказания) исхода ракового заболевания у пациента на основе выявления и/или определения количества одного или нескольких биологических маркеров, которые указывают на присутствие или, в качестве альтернативы, на уровень адаптивного иммунного ответа у упомянутого пациента, направленного против ракового заболевания, в месте локализации опухоли.
Несмотря на прогресс в сферах диагностики и лечения многих
видов рака, описанных выше, таких как ПКК и КРР, до сих пор
существует необходимость биологических маркеров, которые могут
быть использованы для повышения качества диагностики, в
частности для предсказания, можно ли ожидать положительного
эффекта от иммунотерапии, в целях дальнейшего улучшения
выживаемости и возможности вносить коррективы в метод лечения
для нуждающихся в нем. Кроме того, маркеры должны также
позволить предсказывать исход упомянутого лечения рака. Поэтому
задачей настоящего изобретения является создание
соответствующих биологических маркеров и методов диагностики, прогноза течения заболевания и предсказания эффекта от лечения.
В первом аспекте настоящего изобретения данная задача
решена созданием метода предсказания эффективности
иммунотерапии у пациента, больного раком, включающего а)
определение уровня по меньшей мере одного маркера, выбираемого
из группы, состоящей из: апополипротеин Al (ApoAl), CCL17/TARC,
эозинофилы (абсолютное количество или %), моноциты (абсолютное
количество или %), CD95/Fas,
аспаратаминотрансфераза/сывороточная
глутаматоксалоацетаттрансаминаза (АсАТ/СГОТ), раковый антиген
19-9 (СА19-9) , лактатдегидрогеназа (ЛДГ), треонин,
иммуноглобулин Е (IgE) и матричная металлопротеиназа 3 (ММР-3), в образце, взятом у пациента, больного раком, в котором более высокий (или повышенный) уровень маркера в сравнении с медианными значениями данной популяции пациентов, больных раком, является свидетельством положительного влияния иммунотерапии на упомянутого пациента, или Ь) определение уровня по крайней мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из CXCL13/BCA-1, нейтрофилов (в %), интерлейкина б (ИЛ-б) и ацилкарнитинов с короткой цепью в образце, полученном от пациента, больного раком, в котором более низкий (или пониженный) уровень маркера по сравнению с медианными значениями (+/-10%) для данной популяции пациентов, больных раком, является свидетельством положительного влияния иммунотерапии на упомянутого пациента.
В данном варианте осуществления изобретение относится к единичным (также называемым "моновариантным" или "отдельным") маркерам для предсказания влияния, в частности, положительного влияния иммунотерапии на пациента, больного раком, как описывается в данном документе, такого как более продолжительная общая выживаемость, появление отдельного и/или нескольких ответов, индуцированных иммунотерапией, замедление роста опухоли, сокращение опухоли или более долгая выживаемость без прогрессирования.
В контексте настоящего изобретения термины "маркер", "биомаркер", "аналит" или "параметр" взаимозаменяемы и все относятся к маркеру(ам), которые анализируются в контексте метода(ов) в соответствии с настоящим изобретением.
В контексте настоящего изобретения термины "предсказание" или "предсказательный маркер" основаны на понятии маркеров в соответствии с настоящим изобретением, являющихся информативными для определения эффективности противораковой иммунотерапии, такой как, например, с использованием вакцин(ы), которая описана в данном документе.
CXCL13/BCA-1, ApoAl, нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, CD95/Fas, АсАТ/СГОТ, CCL17/TARC, ацилкарнитины с короткой цепью
и СА19-9 были идентифицированы как маркеры, обладающие предсказательной силой относительно выживаемости и, в некоторых случаях, ответов Т-клеток, при использовании одномерных анализов.
Предпочтительным является метод в соответствии с настоящим изобретением, в котором упомянутый маркер выбирается из ApoAl и/или CCL17/TARC. Уровни CCL17/TARC, находящиеся выше медианного значения соответствующей исследуемой популяции, и уровни ApoAl выше медианного значения, как было обозначено производителем соответствующего аналитического средства, (например, компанией Rules Based Medicine (RBM)), 0,288 мг/мл) являются положительными.
Предпочтительным является метод в соответствии с настоящим изобретением, в котором упомянутый маркер выбирается из CXCL13/BCA-1 и/или моноцитов. Тем не менее, комбинации маркеров также входят в объем настоящего изобретения, такие как, например, выбранные из ApoAl и CCL17/TARC; ApoAl и CXCL13/BCA-1; ApoAl, CXCL13/BCA-1 и моноцитов; ApoAl, CCL17/TARC, CXCL13/BCA-1 и моноцитов; CCL17/TARC и CXCL13/BCA-1; CCL17/TARC, CXCL13/BCA-1 и моноцитов; CCL17/TARC, ApoAl и моноцитов; CCL17/TARC, ApoAl и CXCL13/BCA-1; CCL17/TARC и моноцитов; CXCL13/BCA-1 и моноцитов; ApoAl и моноцитов. Все данные комбинации маркеров являются особенно предпочтительными.
Другие предпочтительные комбинации маркеров выбираются из CXCL13/BCA-1, нейтрофилов в %, ApoAl, эозинофиловв %, эозинофилов в абс. числах (абсолютное значение), моноцитов в %, FAS, TARC; ЛДГ, Thr, ИЛ-б, альбумина, IgE, ММР-3, СА19-9; моноцитов в абс. числах, АсАТ, билирубина, ацилкарнитинов (scAC); и ИЛ-33. Все данные комбинации маркеров также являются особенно предпочтительными.
ApoAl является основным белком липопротеина высокой плотности (ЛПВП) и может быть измерен вместо ЛПВП в рамках клинических анализов. В нормальных условиях ЛПВП обладает антиатеросклеротическими, антиоксидантными, антитромботическими и противовоспалительными свойствами. Однако в условиях хронического воспаления/окислительного стресса (например, при
хронических инфекциях, аутоиммунных заболеваниях,
метаболическом синдроме и раке), ЛПВП теряет эти свойства и приобретает провоспалительные свойства. В провоспалительном ЛПВП (piHDL) уровень ApoAl - отрицательного острофазного белка - снижается, а других белков, таких как сывороточный амилоид А
(SAA), - положительный острофазный белок - повышается. Таким образом, низкие уровни белка ApoAl указывают на хронические воспалительные или окислительные условия, и они могут, в свою очередь, способствовать возникновению таких состояний, которые, как известно, благоприятствуют развитию ракового заболевания. О пониженных уровнях ApoAl сообщалось для многих раковых заболеваний, и они также наблюдались у пациентов с ПКК в когорте исследования IMA901-202 (фазы II) . Примечательно, что родственный белок, АроА2, описывался как положительный прогностический маркер при метастатическом ПКК, и на мышиной модели было продемонстрировано функциональное участие ApoAl в подавлении прогрессирования рака (Su et al., 2010; Vermaat et al., 2010). В дополнение к тому, что они способствуют развитию ракового заболевания, реакции хронической и острой фазы и условия окислительного стресса, как известно, также неблагоприятно влияют на ответы адаптивной иммунной системы
(Haeryfar and Berczi, 2001; Muller et al., 2008; Vallejo et al., 2004) .
CCL17/TARC - хемокин, который первоначально был классифицирован как хемокин, привлекающий клетки ТН2, однако у него есть и другие клеточные мишени, такие как эффекторные клетки/Т-клетки памяти типов ТН1 и ТН2, в особенности те, что способны мигрировать в кожу, субпопуляцию CD8+ Т-клеток, Т-клетки памяти ТН17, NK- и NKT-клетки, дендритные клетки, и т.д. Исследования на мышах продемонстрировали, что внутриопухолевая экспрессия CCL17/TARC благоприятна для иммунологического отторжения. Уровни в сыворотке могут указывать на активность миелоидных дендритных клеток, макрофагов и моноцитов, которые являются основными источниками этого хемокина. Постоянная выработка CCL17 дендритными клетками, как было показано, является предпосылкой их уникальной функции по инициации
антиген-независимых ответов в Т-клетках. В отличие от таких заболеваний, как атопический дерматит и некоторых других аллергических или аутоиммунных заболеваний, при которых уровень CCL17/TARC патологически повышен и рассматривается как свидетельство увеличения активности ТН2, уровни CCL17/TARC у популяции пациентов исследования IMA901-202 находились в пределах нормы и соотносились с цитокинами типа ТН1, такими как ИЛ-12 и IFN-гамма.
В контексте настоящего изобретения уровни ApoAl и уровни CCL17/TARC, которые были выше медианных уровней, обнаруженных у пациентов с ПКК на поздних стадиях, рассматривались как благоприятные для успеха лечения. У пациентов, у которых по меньшей мере один фактор выше указанных пороговых значений (по статистике около 75%), по прогнозу должен наблюдаться лучший исход болезни после вакцинации противораковой вакциной IMA901 (Immatics Biotechnologies, г. Тюбинген, Германия), чем у пациентов, у которых оба фактора ниже пороговых значений. Пациенты, у которых оба фактора выше указанных пороговых значений (по статистике около 25%), по прогнозу должны получить наибольшую пользу от лечения. Нижняя граница нормы (НГН) для ApoAl зависит от метода анализа. При использовании мультиплексного анализа на основе технологии Luminex с микросферами (компании RBM) НГН составляет 0,288 мг/мл. При использовании других анализов НГН должна быть откорректирована как с помощью информации производителя, так и проведением параллельных экспериментов со сравнением результатов анализа с результатами, полученными общепринятым методом, или с помощью измерений статистически значимого количества образцов здоровых доноров. Медианные уровни CCL17/TARC и/или ApoAl в данной популяции пациентов зависят от популяции или метода количественного анализа.
Предпочтительные методы определения количества маркеров и конкретно ApoAl и CCL17/TARC, выбираются из иммунологических методов, таких как ELISA, мультиплексный иммунохимический анализ на основе микросфер, чипов или планшетов, методы протеомики или масс-спектрометрии, анализы биологической
активности, электрофорез, иммунонефелометрия,
иммунотурбидиметрия, ферментативные методы анализа,
колориметрические или флуориметрические анализы, подлежащие оценке, например, с помощью фотометрии и методов, основанных на сортировке клеток с активированной флуоресценцией (FACS). Нейтрофилы, эозинофилы и моноциты могут быть определены с помощью сортировки FACS или других принятых в клинической практике гематологических методов. ApoAl тесно взаимосвязан с холестерином ЛПВП и, поэтому, может определяться всеми методами определения холестерина ЛПВП.
Кроме того, в качестве маркера был идентифицирован привлекающий В-клетки хемокин 1 (CXCL13/BCA-1). CXCL13/BCA-1, вероятно, необходим для организации скопления лимфоцитов в лимфоидных органах. Повышенные уровни для некоторых видов опухолей связаны с метастазами и неблагоприятным прогнозом и, вероятно, также с нарушением противоопухолевых иммунных ответов.
Эозинофилы, уровни которых в процентном соотношении и абсолютных числах были идентифицированы как маркер, учитывая противоречивые сообщения о их биологическом влиянии, могут выполнять несколько и причем противоположных функций при раке. Рекрутинг эозинофилов в место опухоли, по-видимому, является положительным явлением в нескольких случаях. Рекрутинг эозинофилов в место введения ГМ-КСФ был обнаружен в случае меланомы.
Моноциты, уровни которых в процентном соотношении и абсолютных числах были идентифицированы как маркер, рекрутируются в места воспаления или место введения ГМ-КСФ. Они способны дифференцироваться в макрофаги или дендритные клетки и могут выступать сами в функции АПК. Они могут заменять эмигрировавшие дендритные клетки ткани, такие как клетки Лангерганса. Напротив, моноцитоз описывали как негативный фактор при раковом заболевании и лечении ПКК введением ИЛ-2, предположительно, в связи с образованием активных форм кислорода (АФК) и ингибированием NK- и Т-клеток.
Растворимый CD95/Fas вырабатывается при альтернативном
сплайсинге и конкурирует со связанным с мембраной CD95 за связывание CD95L/FasL. Таким образом, он может предотвратить апоптоз Т-клетки, например, в месте локализации опухоли (контратака на опухоль). Он также может препятствовать неапоптотическим функциям сигнальных путей CD95, который способствуют подвижности и инвазивности раковых клеток. CD95 может также быть связан с эозинофилами, препятствуя их апоптозу. Напротив, CD95 может ингибировать CD95L-опосредованное уничтожение опухолевых клеток Т-клетками; в некоторых видах это коррелирует с высокой опухолевой нагрузкой и более неблагоприятным прогнозом.
Нейтрофилы являются известным отрицательным
прогностическим маркером при раке. В частности, высокое
соотношение нейтрофилов и лимфоцитов указывает на
неблагоприятный прогноз при нескольких видах рака. В этом
случае предполагается дополнительное неблагоприятное
прогностическое влияние на иммунотерапию ракового заболевания. Нейтрофилы могут препятствовать иммунным реакциям посредством ингибирования Т- и NK-клеточной активности.
Уровень ацилкарнитинов с короткой цепью повышен в случае снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ), что указывает на более сильное повреждение почек, которое может привести к снижению доступа кровяных клеток к опухоли (Wanner 1988). С другой стороны, уровень растворимых в кислотах ацилкарнитинов (свободных и с короткой цепью), как сообщалось, ниже у больных раком, чем в группе контроля (Sachean 1987).
СА19-9 является эпитопом на сиалированной структуре Льюиса А, углеводным антигеном муцинового типа, такого как MUC1. Его присутствие в сыворотке может коррелировать с экспрессией MUC1 в опухоли и, таким образом, с присутствием одного из антигенов вакцины. Напротив, сывороточные опухолевые маркеры обычно являются отрицательными прогностическими маркерами.
АсАТ/СГОТ - это фермент, задействованный в метаболизме аминокислот. Как и в случае ЛДГ, повышение его уровня в сыворотке является свидетельством увеличения клеточного оборота, что происходит в случае поражения печени и других
органов, в равной степени как и при раке. Полученные нами результаты подтверждают, что высокие уровни АсАТ/СГОТ и ЛДГ являются отрицательными прогностическими факторами при раке, однако, неожиданным образом, они также показали, что эти белки, по всей видимости, обладают положительной предсказательной силой для исхода иммунотерапии. Причина до сих пор непонятна. Можно предположить, что гибель клеток внутри опухоли, особенно в форме некроза, благоприятствует иммунным реакциям в месте локализации опухоли.
В другом своем аспекте метод в соответствии с настоящим изобретением также включает а) определение уровня по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из альбумина и прямого билирубина в упомянутом образце пациента, больного раком, где более высокий уровень в сравнении с медианными значениями (+/-10%) для данной популяции пациентов, больных раком, является свидетельством положительного влияния иммунотерапии на упомянутого пациента или Ь) определение уровня маркера интерлейкина-33 (ИЛ-33) в упомянутом образце пациента, больного раком, где более низкий уровень в сравнении с медианными значениями (+/-10%) для данной популяции пациентов, больных раком, является свидетельством положительного влияния иммунотерапии на упомянутого пациента.
В этом аспекте настоящего изобретения упомянутые маркеры применяются для дополнительной поддержки единичных маркеров, упоминавшихся ранее в первом аспекте настоящего изобретения. Таким образом, маркеры используются для создания набора или панели маркеров для "многовариантного" анализа в диагностических целях.
Особенно предпочтительным является метод в соответствии с настоящим изобретением, в котором упомянутый набор или панель маркеров для многовариантного анализа состоит из маркеров CXCL13/BCA-1, ApoAl, нейтрофилов, эозинофилов (в процентном соотношении и абсолютных числах), моноцитов (в процентном соотношении и абсолютных числах), CD95/FAS, АсАТ/СГОТ, CCL17/TARC, ЛДГ, Thr, ИЛ-б, ацилкарнитинов с короткой цепью, альбумина, билирубина, IgE, ИЛ-33, ММР-3 и СА19-9.
Согласно цели настоящего изобретения референсное значение уровня маркера является пороговым значением для каждого маркера, которое определяет, получит ли пациент пользу от иммунотерапии. В зависимости от того, является ли маркер отрицательным или положительным, более высокий или более низкий уровень у пациента в сравнении с референсным значением является признаком благоприятного исхода иммунной терапии. Референсное значение в одном варианте осуществления составляет +/-10% медианного значения концентрации, наблюдаемой в данной популяции пациентов, больных раком. Более предпочтительно, чтобы референсное значение, в зависимости от того, является ли оно отрицательным или положительным, соответствовало верхней или нижней квартили, верхней или нижней квинтили верхней или нижней децили данной популяции пациентов, больных раком. Наиболее предпочтительно, чтобы референсное значение отрицательного маркера, вплоть до которого пациенты, как считается, должны получить пользу от лечения, соответствовало 70-ой процентили, 80-ой процентили и, наиболее предпочтительно, 90-ой процентили. Для положительных маркеров наиболее предпочтительно, чтобы референсное значение, начиная с которого пациенты, как считается, должны получить пользу от лечения, соответствовало 30-ой процентили, 20-ой процентили и, наиболее предпочтительно, 10-ой процентили.
Другой важный аспект настоящего изобретения относится к методу в соответствии с настоящим изобретением, в котором упомянутая иммунотерапия включает вакцинацию противораковой вакциной, факультативно - совместно с адъювантом, таким как, например, ГМ-КСФ.
Иммунотерапия и соответствующие вакцины описываются в уровне техники; иммунотерапия больных раком направлена на специфическую активацию клеток иммунной системы, в особенности, т.н. цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ, также известных как "киллерные клетки", известных также как CD8+ Т-клетки), против опухолевых клеток, но не против здоровой ткани. Опухолевые клетки отличаются от здоровых клеток экспрессией опухолеассоциированных и опухолеспецифических белков. Молекулы
HLA презентируют наружу на клеточной поверхности части клеточного содержимого, таким образом, давая возможность ЦТЛ отличать здоровую клетку от опухолевой. Это происходит путем расщепления всех белков внутри клетки на короткие пептиды, которые присоединяются, затем, к молекулам HLA и презентируются на клеточной поверхности. Пептиды, представленные на опухолевых клетках, но которые не презентируются или в намного меньшей степени презентируются на здоровых клетках организма, называются опухолеассоциированными пептидами (TUMAP). Антигены, содержащие эпитопы, распознаваемые опухолеспецифическими Т-клетками, могут быть молекулами всех классов белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д..
Тем не менее, прайминга одного вида ЦТЛ обычно не достаточно для устранения всех опухолевых клеток. Опухоли обладают сильной мутагенностью и, таким образом, способны быстро реагировать на атаки ЦТЛ изменением своей белковой структуры во избежание узнавания ЦТЛ. Для противодействия механизмам уклонения опухоли от воздействия для вакцинации использовались различные специфические пептиды. Таким способом по опухоли могла быть произведена всеобщая одновременная атака несколькими клонами ЦТЛ. Так могут быть снижены шансы опухоли на уклонение от иммунного ответа. Эта гипотеза недавно получила подтверждение в клиническом исследовании по лечению пациентов с меланомой на поздней стадии. За всего лишь несколькими исключениями пациенты, имевшие по меньшей мере три различных Т-клеточных ответа, демонстрировали объективные клинические ответы или стабилизацию заболевания, а также увеличение выживаемости, в то время как подавляющему большинству пациентов, имевшему менее трех Т-клеточных ответов, был поставлен диагноз прогрессирования заболевания (Banchereau и соавт. 2001).
Предпочтительным препаратом/композицией, используемыми в контексте методов настоящего изобретения, является противораковая вакцина на основе пептидов. Другие предпочтительные препараты включают вакцины на основе ДНК или РНК, например, описываемые в работе Weide и соавт. (Weide В,
Garbe С, Rammensee HG, Pascolo S. Immunol. Lett. 2008 Jan 15;115(1):33-42. Epub 2 0 07 Oct 2 6) вакцины на основе дендритных клеток, вакцины с использованием лизатов клеток или клеточных линий первичных опухолей или отдельных компонентов опухолевых клеток, включая цельные белки или белки теплового шока. Медикамент может вводиться непосредственно пациенту, т.е. в пораженный орган или системно в/кг в/мг п/кг в/б, п/о и в/в или вноситься ex vivo в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться in vitro для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Антигены вакцины, например, пептиды могут быть, по существу, чистыми или комбинированными с иммуностимулирующим адъювантом (см. ниже) или использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например, липосомами. Пептиды могут быть также конъюгированы с подходящим носителем, таким как гемоцианин фиссуреллы (KLH) или маннан (см. WO 95/18145 и Longenecker и соавт. (1993)). Пептиды могут также быть мечеными или могут быть слитыми белками или гибридными молекулами. Пептиды, последовательности которых даны в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют CD4+ или CD8+ Т-клетки. Тем не менее, стимуляция ЦТЛ CD8+ более эффективна в присутствии поддержки, предоставляемой CD4+ хелперными Т-клетками. Таким образом, для эпитопов МНС I класса, которые стимулируют ЦТЛ CD8+, партнеры в слиянии или участки гибридной молекулы надлежащим образом предоставляют эпитопы, которые стимулируют CD4+ Т-клетки. Стимулирующие CD4+ эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, которые были идентифицированы в столбнячном токсине. В еще одном предпочтительном варианте осуществления пептид является слитым белком, в частности включающим N-терминальные аминокислоты HLA-DR антиген-ассоциированной инвариантной цепи (Ii). В одном варианте осуществления пептид по изобретению является усеченным белком человека или слитым белком белкового фрагмента и другого полипептидного участка при условии, что человеческий участок
включает одну или более аминокислотную последовательность настоящего изобретения.
Для использования вакцина может также включать один или
более адъювантов. Предпочтительными адъювантами являются
имиквимод, резимиквимод, ГМ-КСФ, циклофосфамид, сунитиниб,
бевацизумаб, интерферон-альфа, CpG олигонуклеотиды и их
производные, поли-(I:С) и ее производные, РНК, силденафил и
составы из твердых микрочастиц с PLG или виросомы. Как
упоминалось, медикамент используется для парентерального
введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное,
или орального введения. Для этого пептиды и факультативно
другие молекулы растворяют или суспендируют в фармацевтически
приемлемом, предпочтительно водном носителе. Помимо того,
композиция может содержать вспомогательные вещества, такие как
буферы, связующие агенты, баластные вещества, разбавители,
ароматизаторы, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть
также введены вместе с иммуностимулирующими агентами, такими
как цитокины. Обширный список вспомогательных веществ, которые
могут быть использованы в такой композиции, может быть взят,
например, из работы A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical
Excipients", 3. Ed., 2000, изд. "American Pharmaceutical
Association and pharmaceutical press". Композиция может
применяться для предупреждения, профилактики и/или лечения раковых заболеваний, таких как, например ПКК и КРР. Образцы комбинаций пептидов для вакцин для использования в контексте настоящего изобретения представлены в следующих таблицах 1А -1D и имеют названия IMA901, IMA910, IMA941 и IMA950,
соответственно.
IMA901 (например, применение при ПКК)
АРО-001
Аполипопротеин LI
ALADGVQKV
CCN-001
Циклин Dl
LLGATCMFV
GUC-001
GUCY1A3
SVFAGWGV
K67-001
KIAA0367
ALFDGDPHL
MET-001
протоонкоген c-met
YVDPVITSI
MUC-001
MUC1
STAPPVHNV
RGS-001
RGS 5
LAALPHSCL
Таблица IB
IMA910 (например, применение при раке толстой кишки)
SEQ ID No:
Сокр.
Последовательность
С20-001
ALSNLEVTL
NOX-001
ILAPVILYI
ODC-001
ILDQKINEV
PCN-001
KLMDLDVEQL
TGFBI-001
ALFVRLLALA
ТОР-001
KIFDEILVNA
TGFBI-004
TPPIDAHTRNLLRNH
СЕА-0 0 6
SPQYSWRINGIPQQHT
CCN-001
LLGATCMFV
MUC-001
STAPPVHNV
ММР-001
SQDDIKGIQKLYGKRS
СЕА-0 04
YLSGANLNL
МЕТ-001
YVDPVITSI
Таблица 1С
IMA941 (например, применение при раке желудка)
SEQ ID NO
Ид. № пептида
Последовательность
CDC2-001
LYQILQGIVF
ASPM-002
SYNPLWLRI
UCHL5-001
NYLPFIMEL
МЕТ-006
SYIDVLPEF
PROM1-001
SYIIDPLNL
UQCRB-001
YYNAAGFNKL
1МА990а (например, применение при раке предстательной железы)
Поэтому в другом предпочтительном варианте метода в соответствии с настоящим изобретением упомянутая противораковая вакцина выбирается из противораковой вакцины, включающей по меньшей мере один иммуногенный пептид, выбранный из группы с SEQ ID No. 1 по 37, например, включающей SEQ ID No. 1 по 10; SEQ ID No. 11 по 19 и 1, 5, 8, и 9; SEQ ID No. 20 по 29, и SEQ ID No. 30 no 37.
В другом варианте метода в соответствии с настоящим изобретением упомянутый пациент получает лечение или прошел предварительное лечение. Виды такого предварительного лечения могут включать, например, лечебную хирургическую операцию, лучевую терапию и/или химиотерапию. Предпочтительным предварительным лечением является терапия на основе противоракового препарата, выбираемого из цитокинов и ингибиторов тирозинкиназ (ИТК), таких как сорафениб и сунитиниб, и циклофосфамида. В этом варианте упомянутый метод лечения ракового заболевания может быть выбран из методов, которые описаны выше, предпочтительным является иммунотерапия, предпочтительно включающая применение противораковой вакцины, факультативно - совместно с ГМ-КСФ.
Раковыми заболеваниями, подлежащими лечению, могут быть все виды раковых заболеваний, которые чувствительны к иммунотерапии, и они предпочтительно выбираются из почечно-клеточной карциномы (ПКК), колоректального рака (КРР), рака желудка (РЖ), меланомы, немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), глиобластомы и, в целом, аденокарциномы любого вида.
Образцы, которые анализируются в контексте настоящего изобретения, могут быть выбраны из цельной крови, периферической крови или ее фракций, сыворотки, лейкоцитарной пленки, опухолевой ткани, лимфатической жидкости, мочи, костного мозга, плазмы с ЭДТА, гепаринизированной плазмы, цитратной плазмы, гепаринизированной цельной крови и замороженной гепаринизированной цельной крови. Выбор образца для анализа зависит также от маркера(ов), который(ые) должны быть проанализированы, и специалист данной области будет в
состоянии выбрать в соответствии с этим подходящий образец.
В предпочтительном варианте осуществления метод в
соответствии с настоящим изобретением может также включать
определение прогноза эффективности противораковой иммунотерапии
у пациента, где упомянутый пациент, предпочтительно, получил
предварительное лечение циклофосфамидом (как описывается выше).
В контексте настоящего изобретения в основе терминов "прогноз"
или "прогностический маркер" лежит понятие маркеров,
упоминаемых в данном документе, которые являются информативными
относительно эффективности, исходя из обычных или стандартных
химиотерапевтических методов лечения рака, таких как, например,
с применением таксола, соединений платины и других известных
веществ, используемых в химиотерапии ракового(ых)
заболевания(й). Прогнозируемая эффективность может быть выбрана из общей выживаемости, возникновения отдельного и/или нескольких Т-клеточных ответов на иммунотерапию, замедления опухолевого роста или выживаемости без прогрессирования. Таким образом, маркеры настоящего изобретения могут быть использованы в "смешанных" сценариях - в предсказательных или прогностических целях.
В другом аспекте настоящего изобретения метод в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включает мониторинг эффективности упомянутого метода лечения ракового заболевания у пациента, включающий повторение этапа определения а) и/или Ь) и, факультативно - с) и/или d) , как раскрыто в данном документе, не менее одного раза. Обычно мониторинг проводится во время лечения через регулярные интервалы времени, например, еженедельно, два раз в неделю или же ежемесячно.
Предпочтительным является метод в соответствии с настоящим изобретением, в котором упомянутая процедура определения включает по меньшей мере один метод, выбранный из методов иммунохимического анализа, иммунохимического анализа с использованием микросфер, мультиплексного иммунохимического анализа, метода ELISA, методов на основе микрочипов, эпигенетических методов, анализа экспрессии, клеточной сортировки FACS, масс-спектрометрии, методов клинической
гематологии и других рутинных клинических методов, таких как
электрофорез, имунонефелометрия, иммунотурбидиметрия,
ферментативные методы анализа, колориметрические или флуориметрические методы. Все эти методы хорошо известны специалисту данной области и описаны в литературе.
Еще один предпочтительный аспект настоящего изобретения относится к диагностическому набору, включающему материалы для осуществления метода в соответствии с настоящим изобретением, как это описано в настоящем документе, в одном или в отдельных контейнерах, предпочтительно включающих (i) по меньшей мере одно маркер-специфическое антитело, специфичное к ApoAl, CCL17/TARC, Fas, АсАТ/СГОТ, СА19-9, ЛДГ, IgE, матричной металлопротеиназе 3 (ММР-3), CXCL13/BCA-1, нейтрофилам, интерлейкину-б (ИЛ-б), интерлейкину-33 (ИЛ-33), альбумину и билирубину, факультативно - вместе с (ii) инструкциями по проведению упомянутого метода.
Кроме того, набор может также включать один или более (iii) буферов, (iv) разбавителей, (v) фильтров, (vi) игл или (vii) шприцев. Контейнер является, предпочтительно, бутылью, флаконом, шприцем или пробиркой; и он может быть контейнером многоразового применения. Контейнер может быть изготовлен из разных материалов, таких как стекло или пластмасса. Предпочтительно, если набор и/или контейнер содержит(ат) инструкции по применению контейнера или связанные с ним инструкции, которые дают указания по восстановлению и/или применению. Например, на этикетке может быть указано, что лиофилизированный состав должен быть восстановлен до конкретных концентраций антител, которые подходят для указанных выше методов, таких как ELISA.
Еще один предпочтительный аспект настоящего изобретения
относится к усовершенствованному методу лечения рака у
пациента, больного раком и нуждающегося в лечении, включающему
а) осуществление метода в соответствии с настоящим
изобретением, как указано выше, и Ь) введение пациенту,
больному раком, подходящего противоракового
иммунотерапевтического средства, исходя из результатов,
полученных на этапе а) , и с) факультативно - повторение этапов а) и Ь) .
В данных терапевтических аспектах настоящего изобретения методы в соответствии с настоящим изобретением применяются в целях обеспечения усовершенствованных способов лечения в рамках терапии, в частности иммунотерапии, раковых заболеваний. Методы в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают дополнительной и заблаговременной предсказательной или предсказательной и прогностической информацией относительно необходимости и эффективности иммунологического лечения рака и, таким образом, позволяют принимать более обоснованные решения о дальнейшем лечении упомянутого ракового заболевания. Таким образом, предпочтительным является метод в соответствии с описанным выше, который дополнительно включает мониторинг эффективности упомянутого противоракового лечения для пациента, включающий повторение упомянутого этапа определения не менее одного раза.
Как описывается выше, предпочтительные лекарственные препараты или препараты для предварительного лечения в дополнение к иммунотерапевтическим вакцинам, описанным выше, выбираются из противоракового препарата, выбираемого из цитокинов, сорафениба, сунитиниба, циклофосфамида и ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) . Видами рака, подлежащими лечению, могут быть все виды рака, которые чувствительны к иммунотерапии, и которые предпочтительно выбираются из почечно-клеточной карциномы (ПКК), колоректального рака (КРР), рака желудка (РЖ), меланомы, немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), глиобластомы и аденокарциномы.
Следует понимать, что признаки изобретения, раскрываемые и описываемые здесь, могут быть использованы не только в соответствующей комбинации, описанной выше, но также по отдельности, не выходя за объем патентных притязаний настоящего изобретения.
Ниже изобретение будет описано более подробно посредством примеров и ссылок на список последовательностей. Следующие
примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не направлены на ограничение изобретения. На Фигурах:
На Фигуре 1 показана оценка влияния уровней (A) ApoAl, (В) CXCL13/BCA-1, (С) моноцитов и (D) CCL17/TARC на общую выживаемость всех пациентов и подгрупп по методу Каплан-Мейера. Для каждого параметра на верхнем рисунке показана выживаемость всех пациентов с высоким (красные линии) и низким (зеленые линии) уровнем параметра. На нижнем рисунке представлен анализ в подгруппах (+CY в сравнении с -CY) для пациентов с высокими уровнями параметра (красные и синие линии), и для пациентов с низкими уровнями параметра (зеленые и желтые линии).
На Фигуре 2А показано распределение значений уровня единичных биомаркеров ApoAl, CXCL13/BCA-1, моноцитов и CCL17/TARC, показанных на рисунке, подгруппы -CY (серый) и +CY (черный), свидетельствующее об отсутствии Т-клеточного ответа (по), ответе на отдельный пептид (1) или ответе на комплекс пептидов (> 1) • На планках погрешностей представлена среднеквадратическая погрешность среднего значения. На Фигуре 2В другим способом показано распределение показателей уровня множественного биомаркера у пациентов подгрупп -CY (серый) и +CY (черный), с информацией об отсутствии Т-клеточного ответа (по), ответе на отдельный пептид (1) или ответе на комплекс пептидов (> 1). Точки соответствуют отдельным значениям, линиями представлено среднее значение.
На Фигуре 3 показана оценка влияния уровня комбинации из ApoAl и CCL17/TARC на общую выживаемость всех пациентов и подгрупп по методу Каплан-Мейера. На А), было определено, что биомаркер-положительная популяция должна состоять из пациентов по меньшей мере с одним из двух параметров в положительном диапазоне (балл = 1 или 2), тогда как у биомаркер-отрицательных пациентов ни один параметр не находился в положительном диапазоне (балл = 0) . На В), было определено, что биомаркер-положительная популяция должна состоять только из тех пациентов, у которых оба параметра находятся в положительном диапазоне (балл = 2), тогда как пациенты, хотя бы один параметр
которых находился в отрицательном диапазоне (балл = 0 или 1), рассматривались как биомаркер-отрицательные. На верхних фигурах показана выживаемость всех биомаркер-положительных пациентов
(зеленые линии) относительно всех биомаркер-отрицательных пациентов (красные линии). На нижних фигурах представлен анализ в подгруппах (+CY относительно -CY) для биомаркер-положительных пациентов (зеленые в сравнении с желтыми линиями) и биомаркер-отрицательных пациентов (красные в сравнении с синими линиями).
На Фигуре 4А показано среднее значение уровня маркера, состоящего из комбинации ApoAl и CCL17/TARC, у пациентов подгрупп -CY (серый) и +CY (черный), которое свидетельствует либо об отсутствии Т-клеточного ответа (по), либо об ответе на отдельный пептид (1) или об ответе на комплекс пептидов (> 1) . На планках погрешностей представлена среднеквадратическая погрешность среднего значения. На Фигуре 4В другим способом показано распределение показателей уровня двойного биомаркера у пациентов подгрупп -CY (серый) и +CY (черный), с информацией об отсутствии Т-клеточного ответа (по), ответе на отдельный пептид
(1) или ответе на комплекс пептидов (> 1) . Точки соответствуют отдельным значениям, линиями представлено среднее значение.
На Фигуре 5 показана оценка влияния уровня множественного маркера на общую выживаемость по методу Каплан-Мейера. На верхнем рисунке показана выживаемость всех пациентов с высоким
(красные линии) и низким (зеленые линии) уровнем параметра. На нижнем рисунке представлен анализ в подгруппах (+CY в сравнении с -CY) для пациентов с высокими уровнями параметра (красные и синие линии), и для пациентов с низкими уровнями параметра
(зеленые и желтые линии). Значение 0,019076043 было принято за пороговое значение, разделяя пациентов с высоким и низким содержанием биомаркера.
На Фигуре 6А показано среднее значение уровня множественного биомаркера у пациентов подгрупп -CY (серый) и +CY (черный), которое свидетельствует либо об отсутствии Т-клеточного ответа (по), оибо об ответе на отдельный пептид (1) или об ответе на комплекс пептидов (> 1) . На планках погрешностей представлена среднеквадратическая погрешность
среднего значения. На Фигуре 6В другим способом показано распределение показателей уровня множественного биомаркера у пациентов подгрупп -CY (серый) и +CY (черный), с информацией об отсутствии Т-клеточного ответа (по), ответе на отдельный пептид (1) или ответе на комплекс пептидов (> 1) . Точки соответствуют отдельным значениям, линиями представлено среднее значение.
Последовательностями SEQ ID No. 1 по 50 представлены аминокислотные последовательности пептидов, приведенных выше в таблицах 1А по 1Е.
Биомаркер-положительная группа, подгруппа +CY относительно -CY
0,36 (0,061)
0,35 (0,051)
0,29 (0,014)
0,22 (0,017)
Биомаркер-отрицательная группа, подгруппа +CY относительно -CY
0, 84 (0,696)
1, 07 (0,876)
1,31 (0,538)
0, 85 (0,715)
Взаимодействие
0,43 (0,24)
0,3271 (0,13)
0,22 (0,03)
0,26 (0,094)
Параметр благоприятен, если значения высокие/низкие
высокие
низкие
высокие
высокие
пороговое значение
0, 264 мг/мл (МЕДИАНА)
64,21 пг/мл (МЕДИАНА)
7,7% (МЕДИАНА)
161,99 пг/мл (МЕДИАНА)
В Таблице 2 показаны значения отношения рисков (ОР) и логрангового критерия р (модель пропорциональных рисков Кокса) для предсказания общей выживаемости с помощью единичных биомаркеров у всех пациентов и подгрупп +/-CY, ОР и логрангового критерия р для оценки эффективности предварительного лечения циклофосфамидом среди биомаркер-положительных и биомаркер-отрицательных пациентов и эффекта взаимодействия уровней биомаркеров и предварительного лечения циклофосфамидом.
В Таблице 3 показаны р-значения, вычисленные с помощью одномерного статистического анализа (t-критерий Уэлча) для предсказания вероятности Т-клеточных ответов и Т-клеточных ответов на комплекс пептидов по выбранным параметрам для всех пациентов и подгрупп +/-CY.
В Таблице 4 показаны значения отношения рисков (ОР) и логрангового критерия р для предсказания общей выживаемости с помощью множественных биомаркеров у всех пациентов и подгрупп +/-CY, ОР и логрангового критерия р для оценки эффективности предварительного лечения циклофосфамидом среди биомаркер-положительных и биомаркер-отрицательных пациентов и эффекта взаимодействия уровней биомаркеров и предварительного лечения циклофосфамидом.
Примеры
1. Введение
IMA901 - это вакцина, основанная на пептидах, разработанная для индуцирования специфических Т-клеточных
реакций, направленных против комплексов пептид-МНС, обнаруженных на клетках ПКК. В исследовании IMA901-202 (фазы II) использовался одномерный и многомерный анализ для выявления параметров, которые по отдельности или в комбинации служат предсказательными биомаркерами успеха в отношении индукции иммунного ответа и продления общей выживаемости пациентов с метастатической ПКК, получавших лечение вакциной IMA901.
В этих целях было проанализировано около 450 параметров (параметры, связанные с пациентом или опухолью, в равной степени как и концентрации аналитов, измеренные в сыворотке или моче, и клеточные параметры) с использованием образцов популяции пациентов исследования IMA901-202 (фазы II), взятых до лечения. Чтобы снизить затраты на измерения в будущих исследованиях, параметры, для измерения которых требуется обработка мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), в многомерный анализ, для которого подбирался набор из нескольких параметров, включены не были. Параметры анализировали на наличие их взаимосвязи с общей выживаемостью и Т-клеточными ответами.
Поскольку лечение вакциной IMA901 оказало гораздо большее влияние на общую выживаемость после предварительного лечения циклофосфамидом, и поскольку только в подгруппе пациентов +CY наличие иммунных ответов ассоциировалось с улучшением общей выживаемости, подгруппу пациентов +CY рассматривали в качестве группы исследования и результаты сравнивали с группой -CY, использовавшейся в качестве контроля. Таким образом, были выбраны параметры, которые показывали взаимодействие с предварительным лечением циклофосфамидом и/или которые предсказывали общую выживаемость в подгруппе +CY лучше, чем в группе -CY. Тем самым, исключался выбор чисто прогностических маркеров, которые по определению показывали бы взаимосвязь с общей выживаемостью в обеих подгруппах.
2. Сравнение пациентов, принимающих участие в исследовании, с совместимыми по возрасту здоровыми донорами
Для сравнения уровней до лечения с уровнем здоровых доноров были выбраны только пациенты, подлежащие лечению (ITT),
младше 70 лет, чтобы достичь соответствия по возрасту самым старшим здоровым донорам группы контроля. Получившиеся группы пациентов (N=52) и здоровых доноров (N=22) были перегруппированы для соответствия возраста, пола и ЦМВ (цитомегаловирус)-сероположительности.
3. Материалы и Методы
Сбор образцов
Все образцы были собраны до какого-либо терапевтического вмешательства в рамках исследования, либо за три дня до вакцинации и непосредственно до введения циклофосфамида в группе +CY, либо непосредственно перед вакцинацией. Образцы сыворотки были взяты с помощью пробирок VACUTAINER с разделительным гелем для получения сыворотки (Becton Dickinson, 5 мл), которые переворачивали и инкубировали не менее 30 минут. Пробирки центрифугировали в течение 15 минут при ускорении не менее 1200 д, и сыворотку (прибл. 2 мл) переносили в криопробирки NUNC (3,6 мл). Криопробирки немедленно помещали на хранение при < -20°С до проведения измерений. Кровь с ЭДТА для анализа гематологических параметров собирали в пробирки VACUTAINER с ЭДТА на 3 мл, которые не центрифугировали и хранили при комнатной температуре до проведения анализа. Пробу мочи брали незадолго до вакцинации. Для анализа с помощью тест-полоски использовали только свежую мочу. Цитратная плазма для анализа коагуляции была получена приблизительно за две недели до вакцинации. Образцы брали с помощью пробирок с цитратом VACUTAINER и центрифугировали в течение 3 0 минут при ускорении не менее 1200 g при комнатной температуре. Супернатант плазмы переносили в микропробирки.
Измерения
Методы измерения уровня биомаркеров включали ELISA, мультиплексный иммунохимический анализ, эпигенетические методы, масс-спектрометрию, клеточную сортировку FACS, рутинные методы клинической гематологии, клинические химические анализы, анализы мочи и другие методы. Параметры, которые были выбраны в итоге, измеряли с помощью мультиплексного анализа на наборах компании RBM (ApoAl, CD95/FAS, ИЛ-б, IgE, ММР-3, СА19-9),
Millipore (CXCL13/BCA-1, CCL17/TARC), ИЛ-33) и методом масс-спектрометрии на диагностикумах компании Biocrates (треонин, ацилкарнитин с короткой цепью). Другие параметры были предоставлены лабораторией центра и были измерены с помощью рутинных гематологических методов (нейтрофилы, эозинофилы, моноциты) и клинических химических анализов (АсАТ/СГОТ, ЛДГ, альбумин, билирубин).
Оценка Т-клеточных ответов
Поскольку анализ проводился не только для установления взаимосвязи между биомаркерами и общей выживаемостью, но и биомаркерами и возникновением одиночных или нескольких Т-клеточных ответов, измеряли специфические Т-клеточные ответы несколько раз до и после вакцинации методом ELISPOT и тетрамерным окрашиванием соответствующих комплексов пептидов с молекулами МНС.
Одномерный статистический анализ:
Оценку взаимосвязи параметров с Т-клеточными ответами проводили с помощью метода с t-критерием Уэлча. Параметры, обладающие предсказательной силой для Т-клеточных ответов у всех пациентов и/или внутри подгруппы +CY с р < 0,05, принимали за значимые.
Взаимодействие параметров с предварительным лечением CY оценивали с помощью модели пропорциональных рисков Кокса. Кандидаты, у которых р-значение для параметров взаимодействия составляло < 0,05 при любом пороговом значении, которые не находились в самых крайних участках кривой распределения (т.е. выбор или отмена выбора > ~5% пациентов), рассматривались как представляющие интерес.
Более того, чтобы исключить параметры со значимым взаимодействием в связи с обратной взаимосвязью предварительного лечения циклофосфамидом с общей выживаемостью в группе исследования с неблагоприятными значениями биомаркеров, использовали дополнительный критерий значимой взаимосвязи (р < 0,05) с общей выживаемостью в биомаркер-положительной группе. Значимая (р < 0,05) взаимосвязь с общей выживаемостью в группе +CY, но не в группе -CY, рассматривалась
как дополнительный признак того, что параметр обладает предсказательным, а не прогностическим качеством.
Дополнительные критерии для выбора параметров были
основаны на их биологических свойствах и на сохранении ими
картины взаимодействия с предварительным лечением
циклофосфамидом и взаимосвязи с общей выживаемостью в подгруппе исследования +CY, но не в подгруппе пациентов -CY, которые получали предварительное лечение ИТК или цитокинами.
Были подсчитаны корреляции между параметрами. Параметры с высокой степенью корреляции с другими параметрами в оставшемся наборе данных (скорректированное р-значение < 0,005), были исключены.
После выбора отдельных параметров при использовании этих этапов были проведены испытания того, показывают ли эти параметры, и в каких комбинациях, наилучшие результаты относительно предсказания общей выживаемости и Т-клеточных ответов; была также проанализирована стабильность в подгруппах пациентов, указанных выше.
Многомерный статистический анализ:
Множественные биомаркеры были определены с помощью модели пропорциональных рисков Кокса, свойства и дополнения к ним описываются ниже.
В качестве ковариант в генерализованной линейной модели рассматривались все параметры, хотя они были линейно преобразованы в нулевое среднее значение и единичное стандартное отклонение ("стандартизированные" параметры) во избежание излишнего влияния на параметры, которые были представлены небольшими числами выборки. Чтобы снизить стоимость измерений для набора, включены были только те параметры, которые не требовали выделения РВМС. Так как соответствующая модель максимального правдоподобия при неполном отклике была недоопределена, т.е. число параметров превышало число пациентов; модель была дополнена априорным Гауссовским распределением, которое ограничивает относительное влияние каждого параметра в оптимальном биомаркере. Оптимизация по методу оценки максимальной апостериорной гипотезы (MAP), как
известно, улучшает предсказательную силу результатов ("регуляризация"), полученных с помощью метода максимального правдоподобия. Модель была дополнена априорным распределением Лапласа, при котором для оптимизации используется лишь одно подмножество рассматриваемых параметров. Таким способом количество параметров, включенных в биомаркер, было ограничено до 2 0.
Другим желательным свойством было также, чтобы множественный биомаркер не был предсказательным для группы -CY, или же, чтобы он был менее предсказательным для этих пациентов по сравнению с группой +CY. В целях выполнения этой задачи итеративные предсказательные модели были оптимизированы для группы -CY, и полученные в результате направления были спроецированы из пространства параметров, пока не остались только по существу не предсказанные направления. Сам биомаркер был затем определен на оставшемся подпространстве параметров для группы +CY. Чтобы оценить предсказательную точность биомаркера, для всего процесса оптимизации применялся метод проверки с исключением объектов анализа по одному. Таким способом рассчитывали предсказания для всех пациентов, объединяли и сравнивали с известными сроками выживаемости.
Результаты: Одномерный анализ
Выбор параметров
59 из около 450 проверенных параметров статистически значимо предсказывали появление Т-клеточных ответов, как для всех пациентов, так и/или для группы пациентов +CY. 118 параметров показали значимое взаимодействие с предварительным лечением циклофосфамидом на основе их оптимальных пороговых значений. Учитывая упомянутые выше критерии для предсказания Т-клеточного ответа, взаимодействие с предварительным лечением циклофосфамидом, лучшую взаимосвязь с общей выживаемостью в группе +CY, чем в группе -CY, отсутствие статистической неопределимости в отношении других параметров и наличие целесообразного биологического обоснования, в качестве предпочтительных кандидатов единичных биомаркеров были идентифицированы четыре параметра (ApoAl, CXCL13/BCA-1,
моноциты и CCL17/TARC).
Определение пороговых значений
Для каждого из четырех параметров, выявленных, как было описано выше, задавали определенное пороговое значение, по которому пациентов подразделяли в две группы (положительная или отрицательная в отношении биомаркера), которые обнаруживали достоверно различный исход лечения IMA901. Выбор пороговых значений был необходим, поскольку параметры, хотя они связаны с общей выживаемостью и Т-клеточными ответами скорее в непрерывной, чем дискретной форме, должны использоваться для принятия решений о лечении, ограничивающихся ответами да/нет. По этой причине подходящие пороговые значения должны а) включать достаточное количество пациентов и Ь) быть объективными.
В случае ApoAl, уровень которого был патологически низким у более чем 50% пациентов исследования IMA901-202, в качестве порогового значения была выбрана нижняя граница нормы, установленная для здоровых доноров в соответствии с указанием изготовителя диагностикума (компания RBM, 0,288 мг/мл), идентифицируя пациентов с уровнями ApoAl в пределах нормы как биомаркер-положительную группу. Данное пороговое значение было близко к медианному значению для пациентов исследования IMA901-202 (0,264 мг/мл). Таким образом, это пороговое значение является максимально объективным и связано с биологическим обоснованием для ApoAl. В качестве альтернативы для ApoAl использовали также медианное значение. Другие параметры у пациентов исследования IMA901-202 находились, в основном, в пределах нормы. Для таких параметров в качестве пороговых значений выбирали медианное значение популяции исследования, так как оно также является объективным и включает достаточное количество пациентов (50%).
Предсказание общей выживаемости и Т-клеточных ответов отдельными единичными биомаркерами
Анализ пропорциональных рисков Кокса показал, что все четыре параметра, выбранные с помощью одномерного анализа, значимо предсказывают общую выживаемость у всех пациентов и в
подгруппе пациентов, прошедших предварительное лечение циклофосфамидом, но не в подгруппе, которая не получала предварительного лечения циклофосфамидом (Таблица 2, Фигура1). В биомаркер-положительных группах, которые были определены с помощью соответствующего порогового значения биомаркера, предварительное лечение циклофосфамидом оказало значимое положительное влияние (р < 0,05) на общую выживаемость (CCL17/TARC, моноциты) или тенденцию (р < 0,1) в сторону положительного влияния на общую выживаемость (ApoAl, CXCL13/BCA-1). Анализ взаимодействия показал, что влияние предварительного лечения циклофосфамидом был достоверно различным (р < 0,05) на пациентов, классифицированных как положительные и отрицательные относительно уровня моноцитов в их организме. CCL17/TARC показал тенденцию для взаимодействия с предварительным лечением циклофосфамидом. ApoAl и CXCL13/BCA-1 не показали статистической значимости при установленных пороговых значениях.
Примечательно, что в подгруппе +CY наилучшее отношение рисков (ОР) может быть получено, если классифицировать пациентов по их уровням CCL17/TARC (Таблица 2, ОР=0,18, р=0,003). Напротив, CCL17/TARC-пoлoжитeльныe пациенты получали наибольшую пользу от предварительного лечения циклофосфамидом (Таблица 2, ОР=0,22, р=0,017).
CCL17/TARC также обладает исключительными свойствами, если принять во внимание тот факт, что 75% CCL17/TARC-пoлoжитeльныx пациентов, получивших предварительное лечение циклофосфамидом, были еще живы в конце исследования (Фигура 1D).
Картина, наблюдаемая в отношении предсказания общей выживаемости, оставалась стабильной для субпопуляций пациентов, проходивших лечение ИТК или цитокинами (данные не приводятся).
В отношении предсказания Т-клеточного ответа, наилучшие результаты были получены с CCL17/TARC и ApoAl, которые оба предсказывали со статистической значимостью пациентов с ответной реакцией среди всех пациентов и в обеих подгруппах, +CY и -CY, и предсказывали пациентов с ответной реакцией на комплекс пептидов среди всех пациентов. Напротив, CXCL13/BCA-1
и моноциты обладали слабой предсказательной силой для ответов (ТаблицаЗ).
5. Результаты: Многомерный анализ
Выбор параметров
Для всей популяции пациентов был вычислен набор биомаркеров, состоящий из 2 0 параметров, предсказывающий общую выживаемость после лечения вакциной IMA901 в подгруппе пациентов +CY лучше, чем в группе -CY. Параметры этого набора представлены в Таблице 4. Они включают цитокины, хемокины и другие белки, поддающиеся измерению в сыворотке, клеточные параметры, поддающиеся измерению стандартными гематологическими методами, метаболомические параметры, поддающиеся измерению с помощью масс-спектрометрии. Помимо оптимизации для всех пациентов (тренировочная версия), набор биомаркеров вычисляли с помощью метода перекрестной проверки с исключением по одному образцу (испытательная версия). Последний из этих анализов является более релевантным, так как он подтверждает устойчивость оценки результатов во время последующего наблюдения. Данные, полученные в этих экспериментах, отражают результаты испытаний.
Таблица 5
Вес
Ранг
Название параметра
-47,3867
CXCL13/BCA-1
38,38821
ApoAl
-38,1861
Нейтрофилы (%)
34,36199
Эозинофилы (%)
34,10915
Моноциты (%)
33,89069
CD95/FAS
32,72272
АсАТ/СГОТ
32,01683
CCL17/TARC
31,7325
ЛДГ
31,47377
Thr
-31,3839
ИЛ-6
-31,2785
Ацилкарнитины с короткой
30,83843
Альбумин
30,78772
Эозинофилы (абс.)
29,57142
Моноциты (абс.)
28,89882
Билирубин (прямой
28,63935
IgE
-27,8701
ИЛ-33
27.72058
ММР-3
27,204
СА19-9
В Таблице 5 показаны параметры, включенные в множественный биомаркер из 2 0 параметров, и вес и ранг, характеризующие их относительную важность в наборе.
Значение уровня биомаркера для каждого пациента является линейной комбинацией значений, измеренных для 2 0 включенных параметров. Постоянные множители этой формулы были выбраны таким образом, что медианное значение распределения биомаркера было близко к нулю. Значения уровней биомаркеров, вычисленные этим способом, имели приблизительно нормальное распределение в популяции пациентов исследования IMA901-202, и они были равномерно распределены между пациентами подгрупп +CY и -CY.
Предсказание общей выживаемости и Т-клеточных ответов с помощью набора множественных маркеров
Чтобы продемонстрировать предсказательную силу биомаркера, проводили анализ выживаемости путем подразделения пациентов на две группы в соответствии с измеренным значением биомаркера. Медианное значение плотности распределения уровня биомаркера по всей популяции пациентов было принято за пороговое значение, что включает 50% пациентов с уровнями, находящимися выше данного порогового значения, в биомаркер-положительную группу. В подгруппе пациентов +CY биомаркер-положительные пациенты получили высоко значимую пользу от вакцинации, тогда как биомаркер не показал никакой эффективности в группе -CY. Наоборот, в биомаркер-положительной группе предварительное лечение циклофосфамидом привело к значительно более высокой общей выживаемости, тогда как его влияние не было значимым или даже (по тенденции) противоположным в биомаркер-отрицательной группе (Таблица 4; Фигура 5). Соответственно, наблюдалось
высоко значимое взаимодействие между множественным маркером и предварительным лечением циклофосфамидом.
Хотя биомаркер не оптимизировали для предсказания иммунных ответов, авторы изобретения проверили, имело ли распределение значений уровня биомаркера также взаимосвязь с наличием или отсутствием Т-клеточных ответов. Действительно, существовала тенденция в сторону более высоких уровней биомаркера в группах, имевших иммунные ответы и ответы на комплекс пептидов, в частности, в подгруппе пациентов +CY (Фигура 6).
Предсказание общей выживаемости и Т-клеточных ответов с помощью комбинации параметров
Отдельные параметры могут комбинироваться таким образом, что пациентам могут быть присвоены баллы по шкале на основе биомаркеров в зависимости от значений всех параметров, включенных в комбинацию. В случае комбинации двух параметров каждый параметр мог быть либо положительным, либо отрицательным в соответствии с его пороговым значением, и пациенты могли получить два балла по шкале на основе биомаркеров (оба параметра положительные) , один балл (один положительный параметр) или ноль баллов (ни одного положительного параметра) в отношении комбинации маркеров.
При комбинации нескольких параметров расчет количества баллов по шкале на основе биомаркеров может быть полезным по нескольким причинам. Во-первых, это ведет в повышению устойчивости оценки результатов, поскольку а) в некоторой степени преодолевается проблема фиксированных пороговых значений вместо непрерывной взаимосвязи параметров и исхода лечения, Ь) снижается влияние выбросов результатов измерений и с) большее число параметров позволяет проникнуть в сущность большего числа биологических процессов, которые могут быть релевантными в вопросах противоракового иммунитета. Во-вторых, модель с присвоением баллов позволяет внести больше гибкости при выборе пациента: тогда как отдельный параметр с медианным значением в качестве объективного порогового значения неизбежно позволяет выбрать для лечения лишь 50% пациентов, бальная оценка на основе двух параметров (с пороговым значением
отдельных параметров в соответствии с медианным значением распределения) разделяет пациентов на три группы. Если исключаются только пациенты без положительных маркеров (т.е. балл по шкале на основе биомаркеров равен нулю), то около 75% пациентов будут включены в группу лечения. Однако, если в этой группе не достигается желательный уровень значимости, то пациенты с нулем баллов и одним баллом могут быть исключены, чтобы в группе остались около 25% пациентов с двумя баллами по шкале на основе биомаркеров.
По этим причинам были проведены эксперименты, чтобы проверить, дает ли использование комбинации отдельных параметров, определенных выше, лучшие результаты относительно предсказания общей выживаемости и Т-клеточных ответов. Кроме того, измерялась стабильность эффекта для субпопуляций пациентов, указанных выше. Несколько комбинаций маркеров превзошли по своим характеристикам использование отдельных параметров в этом отношении, лучшей из которых оказалась комбинация из ApoAl и CCL17/TARC (Фигура 3, Фигура 4).
6. Уровень маркера:
Исследование IMA901-202
Диапазон (медиана)
25,5-623 (162)
Среднее +/- ст. откл.
174 +/- 118
Участники
исследования
IMA901-202
Диапазон (медиана)
47-86, 9 (67, 3) %; 2,18-10,39 (4,44) х 10Л9/л
Среднее +/- ст. откл.
68,05 +/-8,2 %; 4,88 +/-1,86 х
10л9/л
6.4 Уровни эозинофилов в процентах и абсолютных значениях
Состояние
Источник
Эозинофилы; Диапазон или среднее +/- ст. откл.
Здоровые лица группы контроля
LKF Kiel
Laboratory,
Германия
0-7 %; 0,04-0,6 х 10л9/л
(Simon and Simon, 2007)
0-0,4 х 10л9/л
Заболевание
(Moroni и соавт., 2 000), ПКК
0,15 +/-0,1 х 10л9/л
Участники
исследования
IMA901-202
Диапазон (медиана)
0,2-6,5 (2) %; 0, 02-0, 55 (0, 12) х 10л9/л
Среднее +/- ст. откл.
2,35 +/-1,62 % 0,16 +/-0,13 х 10л9/л
6.10 Сывороточные уровни треонина Thr мин./макс: 21-157 мкМ
Thr среди./станд. откл.: 84,5 +/- 24,1 мкМ МЕДИАННОЕ 82 мкМ
6.11 Сывороточные уровни альбумина
Нормальные показатели в сыворотке крови и отклонения при патологических состояниях:
Лабораторные показатели: альбумин 35-50 г/л (3,5-5 г/дл) параметр СРЕДНЕЕ Ед. изм. Ст. откл. МИН. МАКС. МЕДИАННОЕ альбумин
крови 39,95 г/л 4,39 26 48 41
6.12 Уровни прямого билирубина Лабораторные показатели: 0-5,1 мкМ
Уровни, измеренные в сыворотке в исследовании IMA-901: мин./макс: 0,5-4,4 мкМ (21 различное значение) СРЕДН./СТ. ОТКЛ.: 2,0 - 0,8 9 мкМ МЕДИАННОЕ 1,7 мкМ
6.13 Уровни ММР-3
Уровни в исследовании IMA-901:
мин./макс: 1,85-41,2 нг/мл (лишь 3 были выше 17; 58 дискретных значений)
СРЕДН./СТ. ОТКЛ.: 8,5 +/- 6,0 нг/мл МЕДИАННОЕ 6,7 нг/мл
Нормальные уровни в сыворотке: Диапазон согласно данным производителя: 0,2-2,17 нг/мл
6.14 Уровни СА19-9
Широкий параметр СРЕДН.
Раковый антиген
диапазон значений (производитель )
52 Раковый 15,63
СТ.
ОТКЛ.
Ед/мл 2 9,73 О
167
МАКС. МЕД Подсчет
5,94 45
19-9
6.15 Уровни IgE
параметр СРЕДНЕЕ Ед. изм. СТ. ОТКЛ. МИН.
IgE 104,09 нг/мл 261,00 0
Производитель (RBM): нормальный уровень нг/мл IgE
6.16 Уровни ИЛ-6
параметр СРЕДНЕЕ Ед. изм. СТ. ОТКЛ. МИН.
ИЛ-6 16,32 пг/мл 67,65 0
Производитель (RBM): нормальный уровень пг/мл ИЛ-б
6.17 Уровни ИЛ-33
Ед. Ст.
параметр СРЕДНЕЕ изм. откл. МИН.
ИЛ-33 166,95 пг/мл 293,28 55,0672
МАКС. МЕДИАННОЕ
1362 22,5
- вплоть до 606
МАКС. МЕДИАННОЕ
532 2,86 - вплоть до 42,6
МАКС. МЕДИАННОЕ 1867 75,73
нормальные уровни не определены
Список цитируемой литературы
Donskov F, Hokland М, Marcussen N, Torp Madsen HH, von der MH (2006) . Monocytes and neutrophils as 'bad guys' for the outcome of interleukin-2 with and without histamine in metastatic renal cell carcinoma--results from a randomised phase II trial. Br. J Cancer 94, 218-226.
Echigo T, Hasegawa M, Shimada Y, Inaoki M, Takehara K, Sato S (2006). Both Thl and Th2 chemokines are elevated in sera of patients with autoimmune blistering diseases. Arch. Dermatol. Res 298, 38-45.
Fujii H, Shimada Y, Hasegawa M, Takehara K, Sato S (2004). Serum levels of a Thl chemoattractant IP-10 and Th2 chemoattractants, TARC and MDC, are elevated in patients with systemic sclerosis. J Dermatol. Sci. 35, 43-51.
Haeryfar SM, Berczi I (2001) . The thymus and the acute phase response. Cell Mol. Biol. (Noisy, -le-grand) 47, 145-156.
Leung TF, Ma КС, Hon KL, Lam CW, Wan H, Li CY, Chan IH (2003). Serum concentration of macrophage-derived chemokine may be a useful inflammatory marker for assessing severity of atopic dermatitis in infants and young children. Pediatr. Allergy Immunol. 14, 296-301.
Moroni M, Porta C, De AM, Quaglini S, Cattabiani MA, Buzio С (2000) . Eosinophils and C4 predict clinical failure of combination immunotherapy with very low dose subcutaneous interleukin-2 and interferon in renal cell carcinoma patients. Haematologica 85, 298-303.
Muller AJ, Sharma MD, Chandler PR, Duhadaway JB, Everhart ME, Johnson BA, III, Kahler DJ, Pihkala J, Soler AP, Munn DH, Prendergast GC, Mellor AL (2008). Chronic inflammation that facilitates tumor progression creates local immune suppression by inducing indoleamine 2,3 dioxygenase. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 17073-17078.
Panse J, Friedrichs K, Marx A, Hildebrandt Y, Luetkens T, Barrels K, Horn C, Stahl T, Cao Y, Milde-Langosch K, Niendorf A, Kroger N, Wenzel S, Leuwer R, Bokemeyer C, Hegewisch-Becker
S, Atanackovic D (2008) . Chemokine CXCL13 is overexpressed in the tumour tissue and in the peripheral blood of breast cancer patients. Br. J Cancer 99, 930-938.
Rashid F, Waraich N, Bhatti I, Saha S, Khan RN, Ahmed J, Leeder PC, Larvin M, Iftikhar SY (2010) . A pre-operative elevated neutrophil: lymphocyte ratio does not predict survival from oesophageal cancer resection. World J Surg Oncol 8, 1.
Riesen, WF (2008) . Fettstoffwechsel, Referenzbereich. In Labor und Diagnose, L.Thomas, ed. (Frankfurt/Main: TH-Books Verlagsgesellschaft mbH), p. 236.
Saeki H, Tamaki К (2006). Thymus and activation regulated chemokine (TARC)/CCL17 and skin diseases. J Dermatol. Sci. 43, 75-84.
Sansonno D, Tucci FA, Troiani L, Lauletta G, Montrone M, Conteduca V, Sansonno L, Dammacco F (2008) . Increased serum levels of the chemokine CXCL13 and up-regulation of its gene expression are distinctive features of HCV-related cryoglobulinemia and correlate with active cutaneous vasculitis. Blood 112, 1620-1627.
Sasaki A, Iwashita Y, Shibata K, Matsumoto T, Ohta M, Kitano S (2006). Prognostic value of preoperative peripheral blood monocyte count in patients with hepatocellular carcinoma. Surgery 139, 755-764.
Sekiya T, Yamada H, Yamaguchi M, Yamamoto K, Ishii A, Yoshie 0, Sano Y, Morita A, Matsushima K, Hirai К (2002). Increased levels of a TH2-type CC chemokine thymus and activation-regulated chemokine (TARC) in serum and induced sputum of asthmatics. Allergy 57, 173-177.
Shimada Y, Takehara K, Sato S (2004) . Both Th2 and Thl chemokines (TARC/CCL17, MDC/CCL22, and Mig/CXCL9) are elevated in sera from patients with atopic dermatitis. J Dermatol. Sci. 34, 201-208.
Simon D, Simon HU (2007). Eosinophilic disorders. J Allergy Clin Immunol 119, 1291-1300.
Su F, Kozak KR, Imaizumi S, Gao F, Amneus MW, Grijalva V, Ng C, Wagner A, Hough G, Farias-Eisner G, Anantharamaiah GM,
Van Lenten BJ, Navab M, Fogelman AM, Redely ST, Farias-Eisner R (2010). Apolipoprotein A-I (apoA-I) and apoA-I mimetic peptides inhibit tumor development in a mouse model of ovarian cancer. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A.
Sugawara N, Yamashita T, Ote Y, Miura M, Terada N, Kurosawa M (2002) . TARC in allergic disease. Allergy 57, 180181.
Vallejo AN, Weyand CM, Goronzy JJ (2004). T-cell senescence: a culprit of immune abnormalities in chronic inflammation and persistent infection. Trends Mol. Med 10, 119124 .
Vermaat JS, van dT, I, Mehra N, Sleijfer S, Haanen JB, Roodhart JM, Engwegen JY, Korse CM, Langenberg MH, Kruit W, Groenewegen G, Giles RH, Schellens JH, Beijnen JH, Voest EE (2010) . Two-protein signature of novel serological markers apolipoprotein-A2 and serum amyloid alpha predicts prognosis in patients with metastatic renal cell cancer and improves the currently used prognostic survival models. Ann Oncol 21, 14721481.
Wanner, C, P. Schollmeyer, and W. H. Horl. 1988. Serum carnitine levels and carnitine esters of patients after kidney transplantation: role of immunosuppression. Metabolism 37:263267 .
Longenecker, В. M., M. Reddish, R. Koganty, and G. D. MacLean. 1993. Immune responses of mice and human breast cancer patients following immunization with synthetic sialyl-Tn conjugated to KLH plus detox adjuvant. Ann N.Y.Acad.Sci. 690:276-291.
Sachan, D. S. and W. L. Dodson. 1987. The serum carnitine status of cancer patients. J Am Coll.Nutr. 6:145-150.
Banchereau, J., A. K. Palucka, M. Dhodapkar, S. Burkeholder, N. Taquet, A. Rolland, S. Taquet, S. Coquery, K. M. Wittkowski, N. Bhardwaj, L. Pineiro, R. Steinman, and J. Fay. 2001a. Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+) progenitor-derived dendritic cell vaccine. Cancer Res. 61:6451-6458.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> immatics biotechnologies GmbH
<120> Новые биомаркеры для предсказания исхода противораковой иммунотерапии
<130> I32047PCT
<150> US 61/416,981 <151> 2010-11-24
<150> GB 1021289.2 <151> 2010-12-15
<150> US 61/423,652 <151> 2010-12-16
<160> 50
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ser Gin Asp Asp lie Lys Gly lie Gin Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser
15 10 15
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Val Met Ala Gly Asp lie Tyr Ser Val 1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ser Val Ala Ser Thr lie Thr Gly Val 1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
Ala Leu Ala Asp Gly Val Gin Lys Val 1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val 1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Ser Val Phe Ala Gly Val Val Gly Val 1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 7
Ala Leu Phe Asp Gly Asp Pro His Leu 1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 8
Tyr Val Asp Pro Val lie Thr Ser lie 1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 9
Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val 1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 10
Leu Ala Ala Leu Pro His Ser Cys Leu 1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 11
Ala Leu Ser Asn Leu Glu Val Thr Leu 1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 12
lie Leu Ala Pro Val lie Leu Tyr lie 1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 13
lie Leu Asp Gin Lys lie Asn Glu Val 1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 14
Lys Leu Met Asp Leu Asp Val Glu Gin Leu 15 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
Ala Leu 1
Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala
5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 16
Lys lie Phe Asp Glu lie Leu Val Asn Ala 15 10
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 17
Thr Pro Pro lie Asp Ala His Thr Arg Asn Leu Leu Arg Asn His
15 10 15
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 18
Ser Pro Gin Tyr Ser Trp Arg lie Asn Gly lie Pro Gin Gin His Thr
15 10 15
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 19
Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu 1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 20
Leu Tyr Gin lie Leu Gin Gly lie Val Phe
<210> <211>
21 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 21
Ser Tyr Asn Pro Leu Trp Leu Arg lie 1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 22
Asn Tyr Leu Pro Phe lie Met Glu Leu 1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 23
Ser Tyr lie Asp Val Leu Pro Glu Phe 1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 24
Ser Tyr lie lie Asp Pro Leu Asn Leu 1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 25
Tyr Tyr Asn Ala Ala Gly Phe Asn Lys Leu 15 10
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 26
Asn Tyr Leu Leu Tyr Val Ser Asn Phe
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 27
Ala Туг Leu Val Туг Thr Asp Arg Leu 1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 28
His Tyr Lys Pro Thr Pro Leu Tyr Phe 1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 29
Val Trp Ser Asp Val Thr Pro Leu Thr Phe 15 10
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 30
Thr Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala 1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 31
Leu Thr Phe Gly Asp Val Val Ala Val 1 5
<210> 32 <211> 9 <212> PRT
<213>
Homo
Sapiens
<400>
Asn Leu Asp 1
Thr Leu Met Thr Tyr Val 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 33
Ala Met Thr Gin Leu Leu Ala Gly Val 1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 34
Gly Leu Trp His His Gin Thr Glu Val 1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 35
Lys lie Gin Glu lie Leu Thr Gin Val 1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Home Sapiens
<400> 36
Ala Leu Trp Ala Trp Pro Ser Glu Leu 1 5
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 37
Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val lie Thr Ser lie Ser Pro Lys Tyr
15 10 15
Gly
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 38
Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gin Cys Val 15 10
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 39
Lys Leu Gin Cys Val Asp Leu His Val 1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 40
Val lie Ser Asn Asp Val Cys Ala Gin Val 15 10
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 41
Ala Leu Gin Pro Gly Thr Ala Leu Leu 1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 42
Ala lie Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu 1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 43
Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val 1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 44
Ala Leu Phe Asp lie Glu Ser Lys Val 1 5
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 45
Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 15 10
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 46
Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gin Pro Phe Leu 15 10
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 47
Gly Leu Met Lys Tyr lie Gly Glu Val 1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
Cys Leu Ala Ala Gly lie Thr Tyr Val 1 5
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 49
Asn Tyr Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu
15 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 50
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn
15 10 15
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Метод предсказания эффективности иммунотерапии у пациента, больного раком, включающий
a) определение уровня по меньшей мере одного маркера,
выбранного из группы, состоящей из аполипопротеина Al (ApoAl),
CCL17/TARC, эозинофилов, моноцитов, CD95/Fas,
аспаратаминотрансферазы/сывороточной
глутаматоксалоацетаттрансаминазы (АсАТ/СГОТ), ракового антигена
19-9 (СА19-9), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), треонина,
иммуноглобулина Е (IgE) и матричной металлопротеиназы 3 (ММР-3), в образце, взятом у пациента, больного раком, в котором повышение уровня или более высокий уровень в сравнении с медианными значениями данной популяции пациентов, больных раком, является свидетельством положительного влияния иммунотерапии на упомянутого пациента, и/или
b) определение уровня по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из привлекающего В-клетки хемокина (CXCL13/BCA-1), нейтрофилов, интерлейкина-б (ИЛ-б) и ацилкарнитинов с короткой цепью в образце, полученном от пациента, больного раком, в котором снижение уровня или более низкий уровень по сравнению с медианными значениями для данной популяции пациентов, больных раком, является свидетельством положительного влияния иммунотерапии на упомянутого пациента.
2. Метод в соответствии с п. 1, где упомянутый маркер выбран из ApoAl и/или CCL17/TARC; CXCL13/BCA-1, нейтрофилов в %, ApoAl, эозинофилов в %, эозинофилов в абс. числах, моноцитов в %, FAS, TARC; ЛДГ, Thr, ИЛ-б, альбумина, IgE, ММР-3, СА19-9; моноцитов в абс. числах, АсАТ, билирубина, ацилкарнитинов (scAC) и ИЛ-33.
3. Метод в соответствии с п. 1 или п.2, включающий также
c) определение по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из альбумина и прямого билирубина, в упомянутом образце, полученном от пациента, больного раком, в котором повышение уровня или более высокий уровень по сравнению с медианными значениями данной популяции пациентов, больных
c)
раком, является свидетельством положительного влияния иммунотерапии на упомянутого пациента, и/или
d) определение уровня маркера интерлейкина-33 (ИЛ-33) в упомянутом образце, полученном от пациента, больного раком, в котором снижение уровня или более низкий уровень по сравнению с медианными значениями данной популяции пациентов, больных раком, является свидетельством положительного влияния иммунотерапии на упомянутого пациента.
4. Метод в соответствии с любым из пп. 1-3, где упомянутая иммунотерапия включает вакцинацию противораковой вакциной, факультативно - совместно с адъювантом, предпочтительно - ГМ-КСФ.
5. Метод в соответствии с любым из пп. 1-4, где упомянутый пациент получает лечение или ранее получал лечение с помощью методов, включающих хирургическую операцию, лучевую терапию и/или химиотерапию, и предпочтительно, где упомянутый пациент получает лечение или ранее получал лечение противораковым препаратом, выбранным из цитокинов и ингибиторов тирозинкиназ (ИТК), таких как сорафениб и сунитиниб, и циклофосфамида.
6. Метод в соответствии с любым из пп. 1-5, где упомянутое раковое заболевание выбрано из почечно-клеточной карциномы (ПКК), колоректального рака (КРР), рака желудка (РЖ), меланомы, немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), глиобластомы и аденокарцином любого вида.
7. Метод в соответствии с любым из пп. 1-6, где упомянутый образец выбран из цельной крови, периферической крови или ее фракций, сыворотки, лейкоцитарной пленки, опухолевой ткани, лимфатической жидкости, мочи, костного мозга, плазмы с ЭДТА, гепаринизированной плазмы, цитратной плазмы, гепаринизированной цельной крови и их замороженных образцов, таких как замороженная гепаринизированная цельная кровь.
8. Метод в соответствии с любым из пп. 1-7, дополнительно
включающий прогнозирование эффективности упомянутой
иммунотерапии у пациента.
4.
9. Метод в соответствии с любым из пп. 1-8, где упомянутая
эффективность выбрана из общей выживаемости, возникновения
отдельного и/или нескольких Т-клеточных ответов на
иммунотерапию, замедления опухолевого роста, сокращения опухоли
или выживаемости без прогрессирования.
10. Метод в соответствии с любым из пп. 1-9, дополнительно включающий мониторинг эффективности упомянутого метода лечения ракового заболевания для пациента, включающий повторение упомянутого этапа определения не менее одного раза.
11. Метод в соответствии с любым из пп. 1-10, где
упомянутое определение включает по меньшей мере один метод,
выбранный из методов иммунохимического анализа,
иммунохимического анализа на основе микросфер, мультиплексного
анализа, метода ELISA, анализа на основе микрочипов,
эпигенетических методов, анализа экспрессии, клеточной
сортировки FACS, стандартных гематологических методов,
протеомики и масс-спектрометрии.
12. Метод в соответствии с любым из пп. 4-11, где упомянутая противораковая вакцина выбрана из противораковой вакцины, включающей по меньшей мере один иммуногенный пептид, выбранный из группы последовательностей SEQ ID No. 1 по 37, например, включающий последовательности SEQ ID No. 1 по 10; SEQ ID No. 11 по 19 и 1, 5, 8 и 9; SEQ ID No. 20 по 29 и SEQ ID No. 30 no 37.
13. Диагностический набор, включающий материалы для
осуществления метода в соответствии с любым из пп. 1-12, в
одном или в отдельных контейнерах, предпочтительно включающий
по меньшей мере одно маркер-специфичное антитело, факультативно
- вместе с инструкциями по проведению упомянутого метода.
14. Усовершенствованный метод лечения ракового заболевания
у пациента, нуждающегося в лечении, включающий
a) проведение метода в соответствии с одним из пп. 1-3 и
5-11 и
b) использование результатов для принятия решений о
лечении, в частности о проведении подходящей противораковой
иммунотерапии у упомянутого пациента, основываясь на
результатах, полученных на этапе а), и
с) факультативно - повторение этапов а) и Ь). 15. Метод в соответствии с п. 14, где упомянутое раковое заболевание выбрано из почечно-клеточной карциномы (ПКК), колоректального рака (КРР), рака желудка (РЖ), меланомы, немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), глиобластомы и аденокарцином любого вида.
По доверенности
Аполипопротеин А1 выс. (28) низк. (33) g
?. А 1 r~- < -,fl' ts ! -?
? I-
Я X
ш га
2 э-ш о
я с 3 ю О
1ЖИ
ент
к я
Время (дни)
Время (дни)
Л" I-
5 Lieu
Я х ш я
2 э-ш о
я с
ю О
Время (дни)
Время (дни)
100(
СО СЛ CD СЛ
High = высокий; low = низкий
Фигура 1 (продолж.)
МОНОЦИТЫ h-sh ;1>
1; R ¦
? I-
5 3 5 Lieu
я X m (б
1 1
X а)
2 з ш о
я с 3 ю О
к се
о С
Время (дни)
ЦП 1
Время (дни)
'л (lu.v 1 Liji - , (nub >
кс -
? I-
5 3 5 Li-CU
(б х m (б
2 з ш о
(б с
ю О
- т^-
-~t-T-
-H-
lui'iu
время (дни)
время (дни)
ApoAl
"q 0.4'
" 0.3
0.2
0.1
О 0.0
> -О > -о > -о > -о > -о + > -о +
Предварительное лечение / количество ответов
ВСА-1
> -О > -О > -о > -о > -о + > -о +
Предварительное лечение / количество ответов
Моноциты
о т-
- >
> - О
т- О
Л С
Фигура 2 (продолж.) G
CCL17
350-Ш-
Предварительное лечение / количество ответов
CCL17
"С I]
О О
650-1 600550500450400350300250200150100500-1
о с
О > -О л
> -О
О С
О > -О + л
> -О +
Score = баллы
1ЖИ1
ент
к (б
Score = 1 or 2 (44)
Score = 0(17)
Score = 2(15)
Score = Oor 1 (46)
? I-
5 LI-CU
(б X m (б
2 з ш о
(б =
ю О
+ CY, score=1 or 2 (22)
-UY, score=1 or ^(^J
-CY, score=0(9) + CY, score=0 (S)
+ CY, score=2 (7) -CY, score=2(S)
i: Y, score=
or 1 (23) - +CY, score
r' Oor 1(23)
Время (дни)
Время (дни)
ApoA1-TARC
ш о
<и
га 2
о s
0) Ц га
о с
Ц га Ш
2.0"
1.5-
1.0-
0.5-
0.0-
о с
> -О > -О > -о о с
> -О + > -о
> -о
si E
3 ю О
20 0 4;jO
Время (дни)
ъии
3CQ
High = высокий; low = низкий
1.5л
" LOSE.
го о.
0.0-
5 -0.5л н
о -1.0-
=Г -1.5
о с
О > -
о > -о
го ю
го о.
-1-
о о
X X
-2-
-3J
о с
> -о > ¦ о > -о о с
> -о
> -о
> -о
Предварительное лечение / количество ответов
<400> 4
<400> 4
<400> 15
<400> 15
<400> 15
<400> 15
<400> 48
<400> 48
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
Фигура 1
3/9
Фигура 2 А
3/9
Фигура 2 А
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
3/9
Фигура 2 А
3/9
Фигура 2 А
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
3/9
Фигура 2 А
3/9
Фигура 2 А
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
3/9
Фигура 2 А
3/9
Фигура 2 А
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
3/9
Фигура 2 А
3/9
Фигура 2 А
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
3/9
Фигура 2 А
3/9
Фигура 2 А
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
4/9
4/9
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
4/9
4/9
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
4/9
4/9
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
4/9
4/9
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
5/9
5/9
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
5/9
5/9
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
5/9
5/9
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
Фигура 3 А
Фигура 3 А
Фигура 3 А
Фигура 3 А
7/9
Фигура 4 А
7/9
Фигура 4 А
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
7/9
Фигура 4 А
7/9
Фигура 4 А
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
7/9
Фигура 4 А
7/9
Фигура 4 А
Предварительное лечение / количество ответов
Предварительное лечение / количество ответов
8/9
Фигура 5 А
8/9
Фигура 5 А
8/9
Фигура 5 А
8/9
Фигура 5 А
8/9
Фигура 5 А
8/9
Фигура 5 А
8/9
Фигура 5 А
8/9
Фигура 5 А
8/9
Фигура 5 А
8/9
Фигура 5 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А
9/9
Фигура 6 А