[**]

Настоящее изобретение относится к идентификации новых вариантов полипептида и белка фактора роста фибробластов 21 (FGF21), которые обладают улучшенными фармацевтическими свойствами. Также описаны способы лечения FGF21-ассоциированных расстройств, включая метаболические расстройства.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к идентификации новых вариантов полипептида и белка фактора роста фибробластов 21 (FGF21), которые обладают улучшенными фармацевтическими свойствами. Также описаны способы лечения FGF21-ассоциированных расстройств, включая метаболические расстройства.

---

Евразийское (21) 201390739 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K14/50 (2006.01)
2013.09.30
(22) Дата подачи заявки 2011.11.17
(54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ FGF21-АССОЦИИРОВАННЫХ РАССТРОЙСТВ
(31) 61/415,476
(32) 2010.11.19
(33) US
(86) PCT/EP2011/070344
(87) WO 2012/066075 2012.05.24
(71) Заявитель:
НОВАРТИС АГ (CH); АйАрЭм ЭлЭлСи (BM)
(72) Изобретатель:
Беттхер Брайан Р., Каплан Шари Л., Дэниелс Дуглас С., Гайерстангер Бернхард Х., Хамамацу Норио, Лихт Стюарт, Лев Андреас, Уэлдон Стивен
Крейг (US)
(57) Настоящее изобретение относится к идентификации новых вариантов полипептида и белка фактора роста фибробластов 21 (FGF21), которые обладают улучшенными фармацевтическими свойствами. Также описаны способы лечения FGF21-ассоциированных расстройств, включая метаболические расстройства.
(74)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
2420-196258ЕА/026 СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ FGF21-АССОЦИИРОВАННЫХ РАССТРОЙСТВ
Описание
Область, к которой относится изобретения
Настоящее изобретение относится к новому полипептиду фактора роста фибробластов 21 (FGF21), который обладает улучшенными фармацевтическими свойствами. Также описаны способы лечения FGF21-ассоциированных расстройств, таких как ожирение, сахарный диабет типа 1 и типа 2, панкреатит, дислипидемия, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), инсулинорезистентность, гиперинсулинемия, непереносимость глюкозы, гипергликемия, метаболический синдром и другие метаболические расстройства, и способы снижения заболеваемости и смертности пациентов, находящихся в критическом состоянии.
Предпосылки создания изобретения
К семейству факторов роста фибробластов (FGF) принадлежит 22 генетически отличающихся гомологических лигандов, которые подразделяются на семь подсемейств. В настоящее время, в соответствии с данными, опубликованными в литературе, семейство FGF состоит по меньшей мере из двадцати трех членов, (FGF-1)-(FGF-23) (Reuss et al, Cell Tissue Res. 313: 139-157 (2003).
FGF-21 был выделен из мышиных эмбрионов и имеет наиболее близкое родство с факторами FGF-19 и FGF-23. Это подсемейство FGF регулирует различные физиологические процессы, которые не поддаются регуляции классическими FGF, а именно, энергетический баланс и гомеостаз желчных кислот, метаболизм глюкозы и липидов, и гомеостаз фосфата, а также витамина D. Кроме того, в отличие от классических FGF, факторы роста этого подсемейства действуют эндокринно (Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8). Сообщалось, что фактор роста фибробластов 21 (FGF21) экспрессируется преимущественно в печени (Nishimura et al, Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206, (2000); публикация патентной заявки WO01/36640; и публикация патентной заявки WO 01/18172), и что этот фактор используется для лечения ишемического заболевания сосудов; заболеваний, ассоциированных с заживлением ран; и заболеваний, ассоциированных с нарушением
функции легких, бронхов или альвеолярных клеток, а также для лечения других расстройств.
FGF21 был идентифицирован как сильный регулятор
метаболизма. Системное введение FGF21 грызунам и макакам-резус
с ожирением и диабетом, индуцированным кормом, или с врожденным
ожирением и диабетом, вызывало явно выраженные
антигипергликемические эффекты и явно выраженные эффекты
снижения уровней триглицеридов, а также приводило к снижению
массы тела (Coskun,T, et al. (2008) Endocrinology 149:6018-
6027; Kharitonenkov,A, et al. (2005) Journal of Clinical
Investigation 115: 1627-1635; Kharitonenkov,A, et al. (2007)
Endocrinology 148:774-781; Xu, J., et al. (2009) Diabetes
58:250-259). FGF21 представляет собой полипептид из 209
аминокислот, содержащий лидерную последовательность длиной в 2 8
аминокислот. Человеческий FGF21 имеет аминокислотную
последовательность, которая приблизительно на 7 9% идентична
аминокислотной последовательности мышиного FGF21 и
приблизительно на 8 0% идентична аминокислотной
последовательности крысиного FGF21.
Хотя FGF-21 активирует рецепторы FGF и молекулы последующей передачи сигнала, включая FRS2a и ERK, однако, прямого взаимодействия FGFR с FGF-21 не было детектировано. Кроме того, различные неадипоцитарные клетки не отвечают на FGF-21, даже, несмотря на то, что они экспрессируют множество изоформ FGFR. Все эти данные дают основание предположить, что передачу сигналов FGF-21 посредством FGFR должен опосредовать кофактор. Проведенные недавно исследования позволили идентифицировать [З-klotho, который в высокой степени экспрессируется в печени, в адипоцитах и в поджелудочной железе и является определяющим фактором клеточного ответа на FGF-21
(Kurosu, Н. et al. (2007) J. Biol. Chem. 282, 26687-95) . (3-klotho преимущественно связывается с FGFRlc и FGFR4. Комплекс |3-klotho-FGFR, но не один FGFR, связывается с FGF-21 in vitro
(Kharitonenkov, A. et al. (2008) J. Cell Physiol. 215, 1-7). Аналогичный механизм был идентифицирован в системе FGF-2 3
klotho-FGFR (Urakawa, I. et al. (2006) Nature 444, 770-4).
Биологическая активность FGF-21 была впервые
идентифицирована в анализе на поглощение глюкозы мышиными адипоцитами 3T3-L1 (Kharitonenkov, A. et al. (2005) J. Clin. Invest. 115, 1627-35). Впоследствии было показано, что FGF-21 индуцирует инсулиннезависимое поглощение глюкозы и экспрессию GLUT1. Также было показано, что FGF-21 снижает степень гипергликемии у грызунов с моделью диабета. Кроме того, было обнаружено, что трансгенные мыши, у которых наблюдается сверхэкспрессия FGF-21, являются резистентными к индуцированным кормом нарушениям метаболизма, то есть, у них наблюдались снижение массы тела и жировой массы и повышение чувствительности к инсулину (Badman, М.К. et al. (2007) Cell Metab. 5, 426-37). Введение FGF-21 страдающим диабетом приматам, не являющимся человеком, приводит к снижению уровней глюкозы, триглицеридов, инсулина и глюкагона в плазме натощак, и к значительному улучшению профилей липопротеина, включая приблизительно 8 0% увеличение уровня холестерина ЛВП (Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774-81) . Важно отметить, что гипогликемия не наблюдалась не на одной из стадий проведения этого исследования NHP. Кроме того, недавно проведенные исследования позволили идентифицировать FGF-21 как эндокринный гормон, играющий важную роль в регуляции адаптации организма в условиях голодания. Это позволило установить недостающее ранее звено в каскаде последующих реакций PPARa, с помощью которого печень вместе с остальным органами участвует в регуляции биологических процессов поддерживания энергетического баланса.
Объединенные наблюдения, указывающие на то, что FGF-21 регулирует патологические процессы в жировой ткани (липолиз), в печени (окисление жирных кислот и кетогенез) и в головном мозге (инертность головного мозга), подтвердили, что FGF-21 является главным эндокринным регулятором ответа организма в условиях голодания (Kharitonenkov, А. & Shanafelt, А.В. (2008) BioDrugs 22, 37-44). Однако проблема, связанная с непосредственным
использованием FGF-21 в качестве биотерапевтического средства, заключается в том, что оно имеет очень короткое время полужизни. У мышей время полужизни человеческого FGF21 составляет от 0,5 до 1 часа, и у собакоподобных обезьян оно составляет от 2 до 3 часов.
При получении белка FGF21, который может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения диабета типа 1 и типа 2, а также других состояний, ассоциированных с нарушением метаболизма, оказалось крайне желательным увеличение времени полужизни и повышение стабильности. Белки FGF21, имеющие увеличенное время полужизни и повышенную стабильность, можно вводить пациенту с меньшей частотой. Необходимость в разработке стабильного водного препарата, содержащего терапевтический белок FGF21, совершенно очевидна.
FGF21 может быть применен как стерильный фармацевтический препарат для многократного введения. Однако было установлено, что консерванты, то есть, м-крезол, оказывают негативное влияние на стабильность этого препарата в данных условиях. Настоящее изобретение позволяет в значительной степени предотвращать физическую нестабильность препарата благодаря использованию вариантов FGF21 согласно изобретению, которые являются более стабильными, менее чувствительными к протеолизу и к ферментативному расщеплению, и имеют меньшую тенденцию к образованию агрегатов и комплексов, чем FGF21 дикого типа, в условиях приготовления данного фармацевтического препарата.
Таким образом, варианты FGF21 согласно изобретению
позволяют получить стабильные фармакологические белковые
препараты, которые могут быть использованы для лечения FGF21-
ассоциированных расстройств, таких как ожирение, сахарный
диабет типа 2, сахарный диабет типа 1, панкреатит,
дислипидемия, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ),
инсулинорезистентность, гиперинсулинемия, непереносимость глюкозы, гипергликемия, метаболический синдром, гипертензия, сердечно-сосудистые заболевания, атеросклероз, заболевания периферических артерий, инсульт, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, заболевания почек, осложнения при
диабете, невропатия, гастропарез и другие метаболические расстройства, а также для снижения осложнений и смертности пациентов в критическом состоянии. Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к идентификации новых вариантов полипептида и белка фактора роста фибробластов 21
(FGF21), которые обладают улучшенными фармацевтическими
свойствами, например, они являются более стабильными, менее
чувствительными к протеолизу и к ферментативному расщеплению и
имеют меньшую тенденцию к образованию агрегатов и комплексов,
чем FGF21 дикого типа в условиях приготовления данного
фармацевтического препарата. Кроме того, описаны способы
лечения FGF21-ассоциированных расстройств, включая
метаболические расстройства.
Варианты белка FGF21 согласно изобретению могут быть введены путем инъекции один раз в неделю либо отдельно, либо в комбинации с антидиабетическими средствами для перорального введения, которые снижают уровень глюкозы в крови, массу тела и уровень липидов у пациентов с сахарным диабетом типа 1 и типа 2. В своем первом аспекте, настоящее изобретение относится к вариантам полипептида и белка фактора роста фибробластов 21
(FGF21), которыми являются, но не ограничиваются ими, одна или более последовательностей, представленных в таблице 1, и другие описанные в данном описании последовательности. Указанные варианты FGF21, представленные в таблице 1, содержат усеченные у N-конца зрелые белки FGF21 дикого типа, состоящие из 4 аминокислот (то есть, усеченные у N-конца варианты зрелой последовательности FGF21 из 4 остатков (SEQ ID N0:3)), и имеют различные сайт-специфические внутренние модификации. Варианты, представленные в таблице 1, пронумерованы в соответствии с о полноразмерной последовательностью белка FGF21 (исходной последовательностью NCBI под номером NP_06198 б.1) ; так например, остаток аспарагиновой кислоты в положении 1 варианта 1 (SEQ ID N0:5) соответствует остатку № 33 SEQ ID N0:1 (и остатку № 5 зрелой последовательности FGF21 (SEQ ID N0:3)).
Таблица
Список вариантов FGF21, аминокислотных последовательностей и аминокислотных замен по сравнению с последовательностью FGF21 дикого типа (SEQ ID N0:1)
Вариант
SEQ
N0:
Последовательность
Сайт-специфические модификации, введенные в известную последовательность SEQ ID NN 1 (полноразмерную
последовательность белка FGF21 (исходную последовательность NCBI под номером NP 061986.1))
DSSPLLQFGG IREDGTAGGA ILGVKTSRFL FRELVLEDGY HRDPAPRGPA PEPPDVGSSD
QVRQRYLYTD ADQSPESLLE CQGPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLSMVGPSQG
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGHKSP ALPEPPGILA RSPSYTS
Q56E, V69A, Q82E, R105G, L127V, Ы149Н, Q184E,
А208Т
DSSPLLQFGG IREDGTAGGA ILGVKTSRFL FRELVLEDGY HRDPAPRGPA PNPPDVGSSD
QVRQRYLYTD ADQSPESLLN CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLSMVGPSQG
DAQNTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGQKSP ALPEPPGILA RSPSYTS
Q56N, V69A, Q82N, R105K,L127V, N149Q, Q184N, A208T
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKASRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DDQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
A54D, D74H, T98A, R105K, D130N, K150R, P158S, R159Q, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVQTSRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSETHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DDQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNKSP ALPEPPGILA RSPSYAS
A54D, D74H, K97Q, R105K, D130N, A139T, P158S, R159Q, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKASRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q56E, D74H, T98A, R105K, D130N, K150R, P158S, R159Q, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVQTSRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSETHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNKSP
ALPEPPGILA RSPSYAS
Q56E, D74H, K97Q, R105K, D130N, A139T, P158S, R159Q, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKASRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSETHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DDQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNKSP ALPEPPGILA RSPSYAS
A54D, D74H, T98A, R105K, D130N, A139T, P158S, R159Q, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKASRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSETHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNKSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q56E, D74H, T98A, R105K, D130N, A139T, P158S, R159Q, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLENGY HRDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DDQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP
ALPEPPGILA RSPSYAS
A54D, D74H, Q82E, R105K, D130N, K150R, R159Q,
S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVQTSRFL FRELLLENGY HRDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DDQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
A54D, D74H, K97Q, R105K, D130N, K150R, R159Q, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKASRFL FRELLLENGY HRDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DDQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
A54D, D74H, T98A, R105K, D130N, K150R, R159Q, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLENGY HRDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q56E, D74H, Q82E, R105K, D130N, K150R, R159Q, S195A
14-
R154C,
L174P
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLENGY HCDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP APPEPPGILA RSPSYAS
Q56E, D74H, Q82E, R105K, D130N, K150R, R154C, R159Q, L174P, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVQTSRFL FRELLLENGY HRDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q56E, D74H, K97Q, R105K, D130N, K150R, R159Q, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKASRFL FRELLLENGY HRDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q56E, D74H, T98A, R105K, D130N, K150R, R159Q, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLENGY HRDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQQTESHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
A59S, D74H, Q82E, R105K, D130N, K150R, R159Q, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVQTSRFL FRELLLENGY HRDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQQTESHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
A59S, D74H, K97Q, R105K, D130N, K150R, R159Q, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKASRFL FRELLLENGY HRDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQQTESHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
A59S, D74H, T98A, R105K, D130N, K150R, R159Q, S195A
5 0
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVQTSRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DDQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
A54D, D74H, K97Q, R105K, D130N, K150R, P158S, R159Q, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVQTSRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q56E, D74H, K97Q, R105K, D130N, K150R, P158S, R159Q, S195A, G202A
DSSPLVQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSEAHSL RFLPLPGLPP PLSMVGPSQA
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNKSP ALPEPPGILA RSPSYAS
L38V, D74H, R105K, D130N, G141S, P158S, R159Q,
G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQETEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP APPEPPGILA RSPSYAS
Q56E, D74H, Q82E, R105K, D130N, K150R, P158S, R159Q, L174P, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGTLYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP APPEPPGILA RSPSYAS
D74H, Q82E, R105K, A109T, D130N, K150R, P158S, R159Q, L174P,S195A
DSSPLLQFGG IREDGTAGGA ILGVKTSRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP APPEPPGILA RSPSYAS
V69A, D74H, Q82E, R105K, D130N, K150R, P158S, R159Q, L174P, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKASRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQKPDGALYG NVYQSETHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNKSP APPEPPGILA RSPSYAS
D74H, T98A, R105K, D130N, A139T, P158S, R159Q, L174P, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKASRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQRPDGALYG NVYQSETHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP APPEPPGILA RSPSYAS
D74H, T98A, D130N, A139T, K150R, P158S, R159Q, L174P,S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLENGY HRDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLQ CQRPDGTLYG NVYQSETHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP APPEPPGILA RSPSYAS
D74H, A109T, D130N, A139T, K150R, P158S, R159Q, L174P,S195A, G202A
DSSPLLQFGG
QVRQRYLYTD
DACQTEAHLE
Q55C,
D74H, Q82E, D130N,
IREDGTVGGA
AHQSPESLLE
LKALKPGVIQ
G148C,
K15 0R, P158S,
ILGVKTSRFL
CQRPDGALYG
SLHFDPEACS
R159Q,
L174P,S19 5A
FRELLLENGY
NVYQSEAHGL
PLHLPCNRSP
HRDPASQGPA
RFLPLPGLPP
APPEPPGILA
PQPPDVGSSD
PLAMVGPSQG
RSPSYAS
DSSPLLQFGG
QVRQRYLYTD
DACQTEAHLE
Q55C,
D74H, Q82E, A109T,
IREDGTVGGA
AHQSPESLLE
LKALKPGVIQ
D130N,
G148C, K150R,
ILGVKTSRFL
CQRPDGTLYG
SLHFDPEACS
P158S,
L174P,S19 5A
FRELLLENGY
NVYQSEAHGL
PLHLPCNRSP
HRDPASRGPA
RFLPLPGLPP
APPEPPGILA
PQPPDVGSSD
PLAMVGPSQG
RSPSYAS
DSSPLLQFGG
QVRQRYLYTD
DACQTEAHLE
Q55C,
V69A, D74H, Q82E,
IREDGTAGGA
AHQSPESLLE
LKALKPGVIQ
D130N,
G148C, K150R,
ILGVKTSRFL
CQRPDGALYG
SLHFDPEACS
P158S,
L174P,S19 5A
FRELLLENGY
NVYQSEAHGL
PLHLPCNRSP
HRDPASRGPA
RFLPLPGLPP
APPEPPGILA
PQPPDVGSSD
PLAMVGPSQG
RSPSYAS
DSSPLLQFGG
QVRQRYLYTD
DACQTEAHLE
Q55C,
D74H, D130N, A139T,
IREDGTVGGA
AHQSPESLLQ
LKALKPGVIQ
G148C,
P158S, R15SQ,
ILGVKTSRFL
CQRPDGALYG
SLHFDPEACS
L174P,
S195A, G202A
FRELLLENGY
NVYQSETHGL
PLHLPCNKSP
HRDPASQGPA
RFLPLPGLPP
APPEPPGILA
PQPPDVGSSD
PLAMVGPSQA
RSPSYAS
DSSPLLQFGG
QVRQRYLYTD
DACQTEAHLE
Q55C,
D74H, D130N, A139T,
IREDGTVGGA
AHQSPESLLQ
LKALKPGVIQ
G148C,
K150R, P158S,
ILGVKTSRFL
CQRPDGALYG
SLHFDPEACS
L174P,
S195A, G202A
FRELLLENGY
NVYQSETHGL
PLHLPCNRSP
HRDPASRGPA
RFLPLPGLPP
APPEPPGILA
PQPPDVGSSD
PLAMVGPSQA
RSPSYAS
DSSPLLQFGG
QVRQRYLYTD
DACQTEAHLE
Q55C,
A109T, D130N, A139T,
IREDGTVGGA
ADQSPESLLQ
LKALKPGVIQ
G148C,
K150R, P158S,
ILGVKTSRFL
CQRPDGTLYG
SLHFDPEACS
L174P,
S195A, G202A
FRELLLENGY
NVYQSETHGL
PLHLPCNRSP
HRDPASRGPA
RFLPLPGLPP
APPEPPGILA
PQPPDVGSSD
PLAMVGPSQA
RSPSYAS
DSSPLLQFGG
QVRQRYLYTD
DAQETEAHLE
Q56E,
D74H, Q82E, R105K,
IREDGTVGGA
AHQSPESLLE
LKALKPGVIQ
D130E,
K150R, R159Q,
ILGVKTSRFL
CQKPDGALYG
SLHFDPEACS
S195A
FRELLLEEGY
NVYQSEAHGL
PLHLPGNRSP
HRDPAPQGPA
RFLPLPGLPP
ALPEPPGILA
PQPPDVGSSD
PLAMVGPSQG
RSPSYAS
DSSPLLQFGG
QVRQRYLYTD
DAQETEAHLE
Q56E,
D74H, Q82E, R105K,
IREDGTVGGA
AHQSPESLLE
LKALKPGVIQ
K150R,
R154C, R15SQ,
ILGVKTSRFL
CQKPDGALYG
SLHFDPEACS
S195A
FRELLLEDGY
NVYQSEAHGL
PLHLPGNRSP
HCDPAPQGPA
RFLPLPGLPP
ALPEPPGILA
PQPPDVGSSD
PLAMVGPSQG
RSPSYAS
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLEDGY HCDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
D74H, Q82E, R105K, K150R, R154C, R159Q, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLEDGY HCDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD ADQSPESLLE CQKPDGTLYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q82E, R105K, A109T, K150R, R154C, R159Q, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLEDGY HCDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
D74H, Q82E, R105K, K150R, R154C, P158S, R159Q, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLEDGY HCDPASQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD ADQSPESLLE CQKPDGTLYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q82E, R105K, A109T, K150R, R154C, P158S, R159Q, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLEDGY HCDPASRGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD ADQSPESLLE CQKPDGTLYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q82E, R105K, A109T, K150R, R154C, P158S, S195A,
G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLEDGY HCDPASRGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD ADQSPESLLE CQRPDGTLYG NVYQSETHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQA
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
Q82E, A109T, A139T, K150R, R154C, P158S, S195A, G202A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVKTSRFL FRELLLEEGY HCDPAPQGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD AHQSPESLLE CQKPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQQTEAHLE LKALKPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP ALPEPPGILA RSPSYAS
D74H, Q82E, R105K, D130E, K150R, R154C, R159Q,
S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVRTSRFL FRELLLEDGY HRDPAPRGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD ADQSPESLLQ CQRPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DAQQTEAHLE LRALRPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPGNRSP APPEPPGILA RSPSYAS
K84R, K87R, K97R, K150R, R154K, L174P, S195A
DSSPLLQFGG IREDGTVGGA ILGVRTSRFL FRELLLEDGY HRDPAPRGPA PQPPDVGSSD
QVRQRYLYTD ADQSPESLLQ CQRPDGALYG NVYQSEAHGL RFLPLPGLPP PLAMVGPSQG
DACQTEAHLE LRALRPGVIQ SLHFDPEACS PLHLPCNRSP APPEPPGILA RSPSYAS
Q55C, K84R, K87R, K97R, G148C, K150R, R154K, L174P, S195A
В других своих вариантах, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим варианты полипептида и белка согласно изобретению, к вектору, содержащему указанные полинуклеотиды, и к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор.
Настоящее изобретение также относится к способам получения указанных вариантов полипептида и белка, где указанные способы
включают модификацию белка FGF21 дикого типа, например, путем усечений белка FGF21 дикого типа и сайт-специфического введения аминокислот в представляющие интерес положения в белке FGF21 дикого типа. Указанные модификации приводят к улучшению биологических свойств вариантов согласно изобретению по сравнению со свойствами белка FGF21 дикого типа, а также, в некоторых случаях, они могут служить в качестве сайтов присоединения, например, меток и агентов, увеличивающих время полужизни белков, и в целях иммобилизации указанных вариантов на поверхности твердого носителя. Родственные варианты осуществления изобретения включают способы культивирования клеток, способных продуцировать указанные варианты полипептида и белка, а также векторы, содержащие ДНК, кодирующие указанные варианты.
В различных вариантах осуществления изобретения описанные в данном описании варианты полипептида и белка могут содержать: (а) амино-концевое усечение не более чем на 8 аминокислотных остатков, где указанный полипептид способен снижать уровень глюкозы в крови у млекопитающего; (Ь) карбокси-концевое усечение не более чем на 12 аминокислотных остатков, где указанный полипептид способен снижать уровень глюкозы в крови у млекопитающего; или (с) амино-концевое усечение не более чем на 8 аминокислотных остатков и карбокси-концевое усечение не более чем на 12 аминокислотных остатков, где указанный полипептид способен снижать уровень глюкозы в крови у млекопитающего.
В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные в данном описании варианты полипептида и белка могут быть ковалентно связаны с одним или более полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) или полисиаловая кислота, или в положениях сайт-специфических аминокислотных модификаций, введенных в FGF21 дикого типа, или в положениях аминокислот, обычно встречающихся в FGF21 дикого типа. В других вариантах осуществления изобретения полипептиды согласно изобретению могут быть присоединены к гетерологичной аминокислотной последовательности, необязательно, посредством линкера, такого как GS или GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N0:4). Гетерологичной
аминокислотной последовательностью могут быть константный домен IgG или его фрагмент (например, Fc-область), сывороточный альбумин человека (HSA) или альбумин-связывающие полипептиды. Такие описанные в данном описании гибридные полипептиды могут также образовывать мультимеры.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гибридная
гетерологичная аминокислотная последовательность (например,
HSA, Fc и т.п.) присоединена к амино-концу вариантов белка
согласно изобретению. В других вариантах осуществления
изобретения гибридная гетерологичная аминокислотная
последовательность (например, HSA, Fc и т.п.) присоединена к карбокси-концу вариантов белка согласно изобретению.
В еще одном своем варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения пациента, страдающего одним или более FGF21-ассоциированными расстройствами, такими как ожирение, сахарный диабет типа 2, сахарный диабет типа 1, панкреатит, дислипидемия, неалкогольный стеатогапатит (НАСГ), инсулинорезистентность, гиперинсулинемия, непереносимость глюкозы, гипергликемия, метаболический синдром, гипертензия, сердечно-сосудистое заболевание, атеросклероз, заболевание периферических артерий, инсульт, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, заболевание почек, осложнения при диабете, невропатия, гастропарез и другие метаболические расстройства, где указанные способы включают введение указанному пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества одного или более вариантов человеческого полипептида и белка FGF21 согласно изобретению или фармацевтической композиции, содержащей указанные варианты.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим описанные в данном описании варианты полипептида и белка и фармацевтически приемлемую технологическую добавку. Такие фармацевтические композиции могут быть использованы в способе лечения метаболического расстройства, где указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции согласно
изобретению. Неограничивающими примерами метаболических расстройств, которые могут быть подвергнуты лечению, являются сахарный диабет типа 1 и типа 2, и ожирение.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг.1 представлен график, иллюстрирующий снижение
уровней триглицеридов в печени после 12-дневной обработки
ob/ob-мышей ПЭГилированным FGF21 дикого типа и вариантами FGF21
согласно изобретению. Образцы печени ( <50 мг) гомогенизировали
в смеси изопропанол:бутилированный гидрокситолуол (ВНТ или 2,6-
ди-трет-бутил-4-метилфеноле) в отношении 1000:5 с
использованием агента для лизиса ткани Qiagen (с одной 5 мм-сферой). После гомогенизации, образцы осторожно встряхивали в течение 4 5 минут при комнатной температуре, и затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Затем супернатанты собирали и анализировали на содержание триглицеридов с помощью набора для анализа триглицеридов Wako.
На фиг.2 представлен график, иллюстрирующий обработку плазмы, взятой у ob/ob-мышей, комплексами FGF21-WT-R154C-PEG и FGF21-V76-154C-PEG в течение 12 дней. FGF21-WT-R154C-PEG и FGF21-V76-154C-PEG вводили подкожно на 1-й, 4-й, 8-й и 11-й день после начала исследования, то есть, 0 ч.
На фиг.ЗА и ЗВ проиллюстрирована стабильность FGF21 дикого типа (панель А) и FGF21-V76-154C-PEG (панель В) в плазме ob/ob-мышей. Средняя pERK-активность плазмы ("фоновая активность") составляет 28% (в пределах от 12% до 49%) для образцов с FGF21 дикого типа, и 58% (в пределах от 46% до 75%) для образцов с FGF21-V7 6-154C-PEG.
Подробное описание настоящего изобретения
Главной проблемой при разработке белковых фармацевтических средств, таких как FGF21, включая варианты белка FGF21 согласно изобретению, является устранение их физической и химической нестабильности. Композиционное разнообразие и свойства белков определяют их специфические характеристики, такие как укладка,
конформационная стабильность и развертывание/денатурация. Такие характеристики должны быть учтены при стабилизации белков в условиях приготовления фармацевтических препаратов с использованием водных растворов белка (Wang, W., Int. J. of Pharmaceutics, 18, (1999)). Желаемым эффектом стабилизации представляющих интерес терапевтических белков, например, вариантов белка FGF21 согласно изобретению, является повышенная резистентность к протеолизу и к ферментативному расщеплению, и тем самым, повышение стабильности белка и снижение степени агрегации белка.
Более конкретно, при разработке фармацевтических белков, в исходные фармацевтические препараты, которые должны представлять собой стерильный препарат для многократного применения, необходимо включать противомикробные консерванты, такие как фенол, м-крезол, метилпарабен, резорцин и бензиловый спирт. К сожалению, эти соединения часто оказывают негативное влияние на стабильность белкового продукта, и, в частности, они индуцируют сборку и агрегацию белков (Маа et al. , Int. J. of Pharmaceutics 140: 155-168 (1996); Lam et al. , Pharm. Res. 14(6):725-729 (1997) ) .
Варианты полипептида и белка FGF21 согласно изобретению, представляющие собой модифицированные варианты полноразмерного полипептида FGF21 дикого типа, известны в данной области. Последовательность FGF21 дикого типа может служить в качестве эталонной последовательности (SEQ ID N0:1), например, если необходимо провести сравнение последовательности FGF21 дикого типа и последовательности вариантов белка. Последовательность FGF21 дикого типа имеет эталонную последовательность NCBI № NP_0 6198 6.1, и ее можно найти в выданных патентах, таких как, например, патент США 6716626В1, переуступленный корпорации Chiron Corporation.
Met
Asp
Ser
Asp
Glu
Thr
Gly
Phe
Glu
His
Ser
Gly
Leu
Trp
Val
Ser
Val
Leu
Ala
Gly 20
Leu
Leu
Leu
Gly
Ala 25
Cys
Gin
Ala
His
Pro 30
Pro
Asp
Ser
Ser 35
Pro
Leu
Leu
Gin
Phe 40
Gly
Gly
Gin
Val
Arg 45
Gin
Arg
Tyr
Leu
Tyr
Thr
Asp
Asp
Ala
Gin
Gin
Thr
Glu
Ala
His
Leu
Glu
Arg
Glu
Asp
Gly
Thr
Val
Gly
Gly
Ala
Ala
Asp
Gin
Ser
Pro
Glu
Ser
Leu
Leu
Gin
Leu
Lys
Ala
Leu
Lys
Pro
Gly
Val
Gin
Leu
Gly
Val
Lys
Thr
Ser
Arg
Phe
Leu
Cys
Gin
Arg
Pro
Asp
Gly
Ala
Leu
Tyr
Gly
100
105
110
Ser
Leu
His
Phe
Asp
Pro
Glu
Ala
Cys
Ser
Phe
Arg
Glu
Leu
Leu
Leu
115
120
125
Glu
Asp
Gly
Tyr
Asn
Val
Tyr
Gin
Ser
Glu
Ala
His
Gly
Leu
Pro
Leu
130
135
140
His
Leu
Pro
Gly
Asn
Lys
Ser
Pro
His
Arg
Asp
Pro
Ala
Pro
Arg
Gly
145
150
155
160
Pro
Ala
Arg
Phe
Leu
Pro
Leu
Pro
Gly
Leu
Pro
Pro
Ala
Leu
Pro
Glu
165
170
175
Pro
Pro
Gly
Leu
Ala
Pro
Gin
Pro
Pro
Asp
Val
Gly
Ser
Ser
Asp
180
185
190
Pro
Leu
Ser
Met
Val
Gly
Pro
Ser
Gin
Gly
Arg
Ser
Pro
Ser
Tyr
Ala
195
200
205
Соответствующая последовательность кДНК, кодирующая полноразмерный полипептид FGF21 (исходная последовательность NCBI № NM_019113.2), представлена ниже (SEQ ID N0:2).
1 atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt
61 cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc atccctgact ccagtcctct cctgcaattc
121 gggggccaag tccggcagcg gtacctctac acagatgatg cccagcagac agaagcccac
181 ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc
241 ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg
301 ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc
361 tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac
421 ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag tccccacacc gggaccctgc accccgagga
481 ccagctcgct tcctgccact accaggcctg ccccccgcac tcccggagcc acccggaatc
541 ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc
601 cagggccgaa gccccagcta cgcttcctga
В зрелой последовательности FGF21 отсутствует лидерная
последовательность, и эта последовательность может также
включать другие полипептидные модификации, такие как
модификации, введенные путем протеолитического процессинга у
амино-конца (с лидерной последовательностью или без нее) и/или
у карбокси-конца; модификации, введенные путем отщепления менее
крупного полипептида от более крупного предшественника;
модификации, введенные путем N-связанного и/или 0-связанного
гликозилирования, и другие посттрансляционные модификации,
известные специалистам в данной области. Репрезентативным
примером зрелой последовательности FGF21 является нижеследующая
последовательность (SEQ ID N0:3, которая представляет собой
последовательность в положениях аминокислот 29-209
полноразмерной последовательности белка FGF21 (исходная последовательность NCBI № NP 061986.1)):
Соответствующая последовательность кДНК, кодирующая зрелый полипептид FGF21 (SEQ ID N0:3), представлена ниже (SEQ ID
N0:47:
caccccatcc
ctgactccag
tcctctcctg
caattcgggg
gccaagtccg
gcagcggtac
ctctacacag
atgatgccca
gcagacagaa
gcccacctgg
agatcaggga
ggatgggacg
121
gtggggggcg
ctgctgacca
gagccccgaa
agtctcctgc
agctgaaagc
cttgaagccg
181
ggagttattc
aaatcttggg
agtcaagaca
tccaggttcc
tgtgccagcg
gccagatggg
240
gccctgtatg
gatcgctcca
ctttgaccct
gaggcctgca
gcttccggga
gctgcttctt
301
gaggacggat
acaatgttta
ccagtccgaa
gcccacggcc
tcccgctgca
cctgccaggg
360
aacaagtccc
cacaccggga
ccctgcaccc
cgaggaccag
ctcgcttcct
gccactacca
421
ggcctgcccc
ccgcactccc
ggagccaccc
ggaatcctgg
ccccccagcc
ccccgatgtg
481
ggctcctcgg
accctctgag
catggtggga
ccttcccagg
gccgaagccc
cagctacgct
541
tcctga
Специалистам в области экспрессии белков известно, что метионин или последовательность метионин-аргинин могут быть введены у N-конца в любых вариантах белка FGF21 для инициации экспрессии в Е. coli, и такое введение рассматривается в описании настоящего изобретения.
Термины "вариант белка FGF21", "вариант человеческого FGF21", "вариант полипептида или белка FGF21", "вариант", "мутант FGF21" или любые аналогичные термины определены в данном описании как термины, включающие человеческий FGF21, в котором природная аминокислотная последовательность FGF21 (то
есть, аминокислотная последовательность дикого типа) была
модифицирована, например, путем замены по меньшей мере одной
аминокислоты белка дикого типа другой аминокислотой и/или путем
удаления такой аминокислоты. Кроме того, такие варианты могут
включать N- и/или С-концевые усечения по сравнению с белком
FGF21 дикого типа. Вообще говоря, вариант обладает некоторыми
модифицированными свойствами, а также имеет измененную
структуру или функцию по сравнению с белком дикого типа. Так,
например, данный вариант может иметь повышенную или улучшенную
физическую стабильность в концентрированных растворах
(например, меньшую степень агрегации, опосредуемую гидрофобными
взаимодействиями), повышенную или улучшенную стабильность в
плазме при инкубации с плазмой крови, или повышенную или
улучшенную биологическую активность с сохранением
благоприятного профиля биологической активности.
Приемлемыми аминокислотными заменами и модификациями, которые определяют различия между вариантами полипептида и белка FGF21 согласно изобретению и FGF21 дикого типа, являются, но не ограничиваются ими, одна или более аминокислотных замен, включая замены неприродными аминокислотными аналогами, и усечения. Таким образом, вариантами белка FGF21 являются, но не ограничиваются ими, мутанты FGF21, полученные посредством сайт-направленного мутагенеза; усеченные полипептиды FGF21; мутанты FGF21, резистентные к протеолизу; мутанты FGF21 со сниженной степенью аграгации; комбинированные мутанты FGF21; и гибридые белки FGF21, описанные в настоящем описании.
Вариант может обладать более высокой совместимостью с фармацевтическими консервантами (например, с м-крезолом, фенолом, бензиловым спиртом), что позволяет получить фармацевтический препарат, содержащий консерванты, который сохраняет физико-химические свойства и биологическую активность белка во время хранения. В соответствии с этим, варианты, обладающие повышенной фармацевтической стабильностью, по сравнению с FGF21 дикого типа, имеют улучшенную физическую стабильность в концентрированных растворах в условиях приготовления физиологического препарата и фармацевтического
препарата с консервантами и сохраняют биологическую активность. В неограничивающем примере, варианты согласно изобретению могут иметь более высокую резистентность к протеолизу и к ферментативному расщеплению, повышенную стабильность и меньшую способность к образованию агрегатов, чем их аналоги дикого типа. Используемые в данном описании термины не являются взаимоисключающими или ограничивающими, и вполне возможно, что данный вариант обладает одним или более модифицированными свойствами по сравнению с белком дикого типа.
Настоящее изобретение также охватывает молекулу
нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант полипептида или белка
FGF21, или вариант, содержащий аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95% (альтернативно, на 96%, альтернативно, на 97%, альтернативно, на 98%, альтернативно, на 99%) идентична аминокислотной последовательности SEQ ID N0:3, но в которой специфические остатки, сообщающие варианту белка FGF21 желательные свойства, например, резистентность к протеолизу, увеличенное время полужизни или пониженную способность к агрегации и их комбинации, не были дополнительно модифицированы. Другими словами, за исключением остатков мутантной последовательности FGF21, которые были модифицированы для сообщения резистентности к протеолизу, снижения степени агрегации или других свойств, могут быть также модифицированы приблизительно 5% (альтернативно, 4%, альтернативно, 3%, альтернативно, 2%, альтернативно, 1%) остатков от всех других аминокислотных остатков в мутантной последовательности FGF21. Такие мутанты FGF21 обладают по меньшей мере одной активностью полипептида FGF21 дикого типа.
Настоящее изобретение также охватывает молекулу
нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную
последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 95% (альтернативно, на 96%, альтернативно, на 97%, альтернативно, на 98%, альтернативно, на 99%) идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID N0:47, но в которой, нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки, сообщающие
кодируемым вариантам белка FGF21 резистентность к протеолизу, снижение уровня агрегации или другие свойства, не были дополнительно модифицированы. Другими словами, за исключением нуклеотидов, кодирующих остатки мутантной последовательности FGF21, которые были модифицированы для сообщения резистентности к протеолизу, снижения степени агрегации или других свойств, могут быть также модифицированы приблизительно 5% (альтернативно, 4%, альтернативно, 3%, альтернативно, 2%, альтернативно 1%) остатков от всех других нуклеотидов в мутантной последовательности FGF21. Такие молекулы нуклеиновой кислоты кодируют мутантные полипептиды FGF21, обладающие по меньшей мере одной активностью полипептида FGF21 дикого типа.
В настоящем описании описаны способы получения указанных вариантов полипептида и белка FGF21 согласно изобретению, где указанные способы включают сайт-специфическую модификацию белка FGF21 дикого типа, например, посредством усечений белка FGF21 дикого типа и сайт-специфического введения аминокислот в представляющие интерес положения в белке FGF21 дикого типа. Указанные модификации приводят к улучшению биологических свойств вариантов согласно изобретению по сравнению со свойствами белка FGF21 дикого типа, а также, в некоторых случаях, они могут служить в качестве сайтов присоединения, например, меток и агентов, увеличивающих время полужизни белков, и в целях иммобилизации указанных вариантов на поверхности твердого носителя. Родственные варианты осуществления изобретения включают способы культивирования клеток, способных продуцировать указанные варианты полипептида и белка, а также векторы, содержащие ДНК, кодирующие указанные варианты.
В некоторых вариантах осуществления изобретения такие сайт-специфические модификации применяются для присоединения полиэтиленгликоля (ПЭГ) к белкам, полипептидам и/или к пептидам. В других вариантах осуществления изобретения такие сайт-специфические модификации применяются для присоединения конъюгатов "ПЭГ-холестерин" (включая мицеллы и липосомы) к белкам, полипептидам и/или к пептидам. В других вариантах
осуществления изобретения такие сайт-специфические модификации применяются для присоединения Сахаров (гликозилата) к белкам, полипептидам и/или к пептидам.
В других вариантах осуществления изобретения указанные сайт-специфические модификации применяются в целях присоединения для получения мультимеров FGF21 дикого типа и/или их вариантов, например, димеров (гомодимеров или гетеродимеров) или тримеров. Такие мультимерные молекулы FGF21 могут также иметь группы, такие как ПЭГ, сахара и/или конъюгаты "ПЭГ-холестерин", присоединенные к амино-концу или карбокси-концу, или связанные с амино-концом или карбокси-концом других белков, таких как Fc, HSA и т.п.
В других вариантах осуществления изобретения такие сайт-специфические модификации применяются для получения белков, полипептидов и/или пептидов, где положение сайт-специфического введения пирролизина или аналогов пирролизина определяет регулируемую ориентацию и присоединение таких белков, полипептидов и/или пептидов на поверхности твердого носителя или позволяет присоединять такие группы, как ПЭГ, сахара и/или конъюгаты "ПЭГ-холестерин".
В других вариантах осуществления изобретения такие сайт-специфические модификации применяются для сайт-специфического перекрестного связывания белков, полипептидов и/или пептидов, что приводит к образованию гетероолигомеров, включая, но, не ограничиваясь ими, гетеродимеры и гетеротримеры. В других вариантах осуществления изобретения такие сайт-специфические модификации применяются для сайт-специфического перекрестного связывания белков, полипептидов и/или пептидов с образованием конъюгатов "белок-белок", конъюгатов "белок-полипептид", конъюгатов "белок-пептид", конъюгатов "полипептид-полипептид", конъюгатов "полипептид-пептид" или конъюгатов "пептид-пептид".
Определения
В настоящем описании используются различные определения. Большинство терминов имеют общепринятые значения, известные специалистам в данной области. Термины, конкретно определяемые ниже или во всем описании настоящего изобретения, имеют
значения, которые, по существу, будут очевидны из контекста настоящего описания и обычно понятны специалистам в данной области.
Используемый в данном описании термин "FGF21" означает член семейства белков фактора роста фибробластов (FGF). Аминокислотная последовательность FGF21 (GenBank Accession No. NP 061986.1) представлена как SEQ ID N0:1, и ее соответствующая нуклеотидная последовательность представлена как SEQ ID N0:2
(исходная последовательность NCBI под номером NM 019113.2).
Используемый в данном описании термин "рецептор FGF21" означает рецептор для FGF21 (Kharitonenkov,A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215: 1-7; Kurosu,H, et al.
(2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Y, et al. (2007) PNAS 104:7432-7437) .
Термин "полипептид FGF21" означает природный полипептид, экспрессирующийся у человека. В настоящем описании термин "полипептид FGF21" может употребляться как синоним словосочетаний: любой полноразмерный полипептид FGF21, например, SEQ ID N0:1, который состоит из 209 аминокислотных остатков и кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID N0:2; любая зрелая форма полипептида, которая состоит из 181 аминокислотного остатка, и из которой были удалены 2 8 аминокислотных остатков у амино-конца полноразмерного полипептида FGF21 (то есть, эти аминокислотные остатки составляют сигнальный пептид), и ее варианты.
Термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты" означает молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая (1) отделена по меньшей мере приблизительно на 50 процентов от белков, липидов, углеводов или других веществ, с которыми она обычно ассоциируется в природе, в случае, если вся нуклеиновая кислота была выделена из клеточного источника; (2) не связана с полноразмерным полинуклеотидом или с его частью, с которыми "выделенная молекула нуклеиновой кислоты" ассоциируется в природе; (3) функционально присоединена к полинуклеотиду, с которым она не связана в природе; или (4) не встречается в природе как часть более крупной полинуклеотидной
последовательности. При этом, предпочтительно, чтобы выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, по существу, не содержала каких-либо других контаминирующих молекул нуклеиновой кислоты или других примесей, которые присутствуют в ее природном окружении, и которые оказывают негативное воздействие при ее использовании для продуцирования полипептидов, или при ее использовании в терапии, в диагностике, в целях профилактики или в исследовательских целях.
Используемый в данном описании термин "вектор" означает любую молекулу (например, нуклеиновую кислоту, плазмиду или вирус), используемую для переноса кодирующей информации в клетку-хозяина.
Термин "экспрессионный вектор" означает вектор, который является подходящим для трансформации клетки-хозяина и содержит последовательности нуклеиновой кислоты, которые направляют и/или регулируют экспрессию встроенных гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты. Указанная экспрессия включает, но не ограничивается ими, такие процессы, как транскрипция, трансляция и РНК-сплайсинг, если присутствуют интроны.
Используемый в данном описании термин "функционально
присоединенный" относится к расположению фланкирующих
последовательностей, где описанные фланкирующие
последовательности имеют конфигурацию или сборку, подходящую
для осуществления ими своей обычной функции. Таким образом,
фланкирующая последовательность, функционально присоединенная к
кодирующей последовательности, может осуществлять репликацию,
транскрипцию и/или трансляцию кодирующей последовательности.
Так например, кодирующая последовательность считается
функционально присоединенной к промотору, если этот промотор
обладает способностью регулировать транскрипцию кодирующей
последовательности. Фланкирующая последовательность
необязательно должна быть смежной с кодирующей
последовательностью, при условии, что она будет "правильно"
функционировать. Так например, между промоторной
последовательностью и кодирующей последовательностью могут
присутствовать промежуточные нетранслируемые, но уже
транскрибированные последовательности, и указанная промоторная
последовательность может рассматриваться как
последовательность, "функционально присоединенная" к кодирующей последовательности.
Используемый в данном описании термин "клетка-хозяин" означает клетку, которая была трансформирована или может быть трансформирована последовательностью нуклеиновой кислоты с последующей экспрессией выбранного представляющего интерес гена. Этот термин включает потомство родительской клетки, независимо от того, является или не является такое потомство идентичным по своей морфологии или генетической структуре родительской клетке, при условии, что в ней будет присутствовать выбранный ген.
Используемый в данном описании термин "аминокислота"
означает природные аминокислоты, и неприродные аминокислоты,
аминокислотные аналоги и аминокислотные миметики,
функционирующие аналогично природным аминокислотам, которые являются D- и L-стереоизомерами, если их структура, по своей природе, может иметь такие стереоизомерные формы. Аминокислоты обозначаются в данном описании либо своим традиционными названиями, либо общеизвестными трехбуквенными кодами или однобуквенными кодами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB.
Термин "природный", если он употребляется по отношению к биологическим соединениям, таким как молекулы нуклеиновой кислоты, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к веществам, которые существуют в природе и не были синтезированы человеком. Аналогичным образом, используемый в данном описании термин "неприродный" относится к веществу, которое не встречается в природе, или которое было структурно модифицировано или синтезировано человеком. Если речь идет о нуклеотидах, то термин "природный" относится к такими основаниям, как аденин (А) , цитозин (С), гуанин (G), тимин (Т) и урацил (U) . Если этот термин используется по отношению к
аминокислотам, то он относится к 2 0 стандартным аминокислотам
(таким как аланин (А) , цистеин (С), аспарагиновая кислота (D) , глутаминовая кислота (Е), фенилаланин (F), глицин (G), гистидин
(Н), изолейцин (I), лизин (К), лейцин (L), метионин (М) , аспарагин (N) , пролин (Р), глутамин (Q) , аргинин (R) , серии
(S) , треонин (Т) , валин (V) , триптофан (W) и тирозин (Y) ) , а также к таким аминокислотам, как селеноцистеин, пирролизин
(PYL) и пирролин-карбоксилизин (PCL).
Пирролизин (PYL) представляет собой аминокислоту, встречающуюся в природе в метиламинметилтрансферазах метаногенных архебактерий семейства Methanosarcina. Пирролизин представляет собой аналог лизина, ко-трансляционно включенный в кодоны UAG соответствующей мРНК с сохранением рамки считывания, и рассматривается как 22-я природная аминокислота.
Как описано по меньшей мере в патентной публикации РСТ WO2010/48582 (заявитель IRMA, LLC), попытки биологически синтезировать пирролизин (PYL) в Е. coli привели к образованию "деметилированного пирролизина", который называется в данном описании пирролин-карбоксилизином" или PCL. Используемая в данном описании аббревиатура означает либо PCL-A, либо PCL-B.
Используемые в данном описании термины "не встречающаяся в природе аминокислота" и "неприродная аминокислота" являются синонимами и означают аминокислотные структуры, которые не могут быть получены путем биосинтеза в любом организме с использованием немодифицированных или модифицированных генов, происходящих от любого организма, независимо от того, являются ли они одинаковыми или различными. Эти термины означают аминокислотный остаток, который не присутствует в природной последовательности белка FGF21 (дикого типа) или в последовательностях вариантов FGF21 согласно изобретению. Такими аминокислотами являются, но не ограничиваются ими, модифицированные аминокислоты и/или аминокислотные аналоги, которые не принадлежат ни к одной из 2 0 природных аминокислот, а именно, селеноцистеин, пирролизин (PYL) или пирролин-карбоксилизин (PCL) . Такие неприродные аминокислотные остатки могут быть введены путем замены природных аминокислот и/или
путем инсерции неприродных аминокислот в природную последовательность белка FGF21 (дикого типа) или в последовательности вариантов FGF21 согласно изобретению. Неприродный аминокислотный остаток может быть также включен так, чтобы он сообщал молекуле FGF21 нужные функциональные свойства, например, способность связываться с функциональной группой (например, ПЭГ).
Кроме того, очевидно, что для включения таких "неприродных аминокислот" в белок требуется присутствие модифицированной тРНК и модифицированной тРНК-синтетазы (RS) . Эти "выбранные" ортогональные пары тРНК/RS продуцируются способом отбора, разработанными Schultz и др., или путем неспецифического или направленного мутагенеза. Так, например, пирролин-карбоксилизин представляет собой "природную аминокислоту", которая продуцируется посредством биологического синтеза генов, перенесенных из одного организма в клетки-хозяева другого организма, и которая может быть включена в белки с использованием природных генов тРНК и тРНК-синтетазы, одновременно п-аминофенилаланин (см., Generation of a bacterium with а 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29; 125 (4) :935-9) представляет собой "неприродную аминокислоту", поскольку, хотя она и продуцируется посредством биосинтеза, но все же вводится в белки посредством "выбранной" ортогональной пары "тРНК/тРНК-синтетаза".
Модифицированными кодируемыми аминокислотами являются, но
не ограничиваются ими, гидроксипролин, у-карбоксиглутамат, 0-
фосфосерин, азетидинкарбоновая кислота, 2-аминоадипиновая
кислота, 3-аминоадипиновая кислота, бета-аланин,
аминопропионовая кислота, 2-аминомасляная кислота, 4-аминомасляная кислота, б-аминокапроевая кислота, 2-аминогептановая кислота, 2-аминоизомасляная кислота, 3-аминоизомасляная кислота, 2-аминопимелиновая кислота, трет-бутилглицин, 2, 4-диаминоизомасляная кислота, десмозин, 2,2'-диаминопимелиновая кислота, 2,3-диаминопропионовая кислота, N
этилглицин, N-метилглицин, N-этиласпарагин, гомопролин, гидроксилизин, алло-гидроксилизин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, N-метилаланин, N-метилглицин, N-метиоизолейцин, N-метилпентилглицин, N-метилвалин, нафталамин, норвалин, норлейцин, орнитин, пентилглицин, пипеколиновая кислота и тиопролин. Термин "аминокислота" также включает природные аминокислоты, которые у некоторых организмов являются метаболитами, но которые, для их включения в белки, необязательно должны кодироваться генетическим кодом. Такими аминокислотами являются, но не ограничиваются ими, орнитин, D-орнитин и D-аргинин.
Используемый в данном описании термин "аминокислотный
аналог" означает соединения, которые имеют такую же основную
химическую структуру, как и природная аминокислота, за
исключением того, что они имеют а-углерод, который связан с
водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой R.
Аминокислотные аналоги представляют собой природные и
неприродные аминокислоты, которые являются химически
блокированными, обратимо или необратимо, или которые имеют
химически модифицированные С-концевую карбоксигруппу, N-
концевую аминогруппу и/или функциональные группы боковой цепи.
Такими аналогами являются, но не ограничиваются ими, сульфоксид
метионина, метионинсульфон, S-(карбоксиметил)цистеин,
сульфоксид S-(карбоксиметил)цистеина, S-
(карбоксиметил)цистеинсульфон, бета-метиловый эфир
аспарагиновой кислоты, N-этилглицин, карбоксамид аланина, гомосерин, норлейцин и метионинметилсульфоний.
Используемый в данном описании термин "аминокислотные миметики" означает химические соединения, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислот, но функционируют аналогично природной аминокислоте.
Термин "биологически активный вариант FGF21" означает любой описанный в данном описании вариант полипептида FGF21, который обладает активностью полипептида FGF21 дикого типа,
например, способностью снижать уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, снижать массу тела и повышать толерантность к глюкозе, расход энергии или чувствительность к инсулину, независимо от типа или числа модификаций, вводимых в вариант полипептида FGF21. Варианты полипептида FGF21, обладающие пониженной FGF21-активностью по сравнению с полипептидом FGF21 дикого типа, могут все же рассматриваться в качестве биологически активных вариантов полипептида FGF21.
Термины "эффективное количество" и "терапевтически эффективное количество" относятся к количеству варианта белка FGF21, используемого для поддержания наблюдаемого уровня одной или нескольких биологических активностей полипептида FGF21 дикого типа, таких как способность снижать уровни глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови; снижать уровни триглицеридов или липидов в печени; снижать массу тела или повышать толерантность к глюкозе, расход энергии или чувствительность к инсулину. Так например, "терапевтически эффективное количество", вводимое пациенту, имеющему симптомы FGF21-ассоциированных расстройств, страдающему указанными расстройствами или имеющему предрасположенность к развитию FGF21-ассоциированных расстройств (таких как сахарный диабет типа 1 или 2, ожирение или метаболический синдром), представляет собой количество, которое индуцирует положительную динамику заболевания, улучшение состояния или ослабление симптомов заболевания; замедляет прогрессирование заболевания и физиологических состояний, ассоциированных с приведенными выше расстройствами; или повышает резистентность к развитию летальных форм указанных выше расстройств. В соответствии с настоящим изобретением, термины "индивидуум" или "пациент", предпочтительно, означают человека, но они могут также относиться и к животному, и более конкретно, к животному-компаньону (например, к собакам, кошкам и т.п.), к сельскохозяйственным животным (например, к коровам, овцам, свиньям, лошадям и т.п.) и к лабораторным животным (например, к крысам, мышам, морским свинкам и т.п.).
Используемый в данном описании термин "фармацевтически приемлемый носитель" или "физиологически приемлемый носитель" означает одну или более технологических добавок, подходящих для осуществления или улучшения доставки варианта белка FGF21.
Термин "антиген" означает молекулу или часть молекулы, которая способна связываться с антителом, и которая также может быть использована для продуцирования у животного антител, способных связываться с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов.
Термин "нативный Fc" означает молекулу или
последовательность, включающие последовательность не
связывающегося с антигеном фрагмента, образовавшегося в результате гидролиза целого антитела или полученного другими способами, независимо от того, присутствуют ли они в мономерной или в мультимерной форме, и такая молекула или последовательность может содержать шарнирную область. Природный источник нативного Fc иммуноглобулина предпочтительно происходит от человека, и такими иммуноглобулинами могут быть иммуноглобулины любых типов, хотя предпочтительными являются IgGl и IgG2. Нативные молекулы Fc состоят из мономерных полипептидов, которые могут быть присоединены к димерным или мультимерным формам посредством ковалентной связи (то есть, дисульфидных связей) и нековалентной связи. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Fc составляет от 1 до 4, в зависимости от класса (например, IgG, IgA и IgE) или подкласса (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl и IgGA2). Одним из примеров нативного Fc является связанный дисульфидной связью димер, образующийся в результате гидролиза IgG папаином (см., Ellison et al. , 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9) . Используемый в данном описании термин "нативный Fc" является общим понятием, включающим все мономерные, димерные и мультимерные формы. Термин "вариант Fc" означает молекулу или последовательность, которая является модифицированной молекулой Fc, но которая содержит сайт связывания с рецептором "спасения" FcRn (Fc-рецептором новорожденных). В Международных публикациях заявок
WO 97/34631 и WO 96/32478 описаны репрезентативные Fc-варианты, а также взаимодействие с рецептором "спасения", и эти публикации включены в настоящее описание посредством ссылки. Таким образом, термин "вариант Fc" может включать молекулу или последовательность, которые были гуманизированы путем введения человеческих остатков в нативный нечеловеческий Fc. Кроме того, нативный Fc содержит области, которые могут быть удалены, поскольку они имеют структурные признаки или биологическую активность, не требуемые для гибридных молекул мутантов FGF21 согласно изобретению. Таким образом, термин "вариант Fc" включает молекулу или последовательность, в которых отсутствуют один или более нативных Fc-сайтов или остатков, или в которых один или более нативных Fc-сайтов или остатков были модифицированы, и которые влияют на нижеследующие свойства или участвуют в их сообщении, где указанными свойствами являются:
(1) образование дисульфидных связей, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) N-концевая гетерогенность после экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование,
(5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с Fc-рецептором, отличающимся от рецептора "спасения", или (7) антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC). Fc-варианты более подробно описаны ниже.
Термин "Fc-домен" охватывает нативные Fc, варианты Fc и последовательности, определенные выше. Что касается вариантов Fc и нативных молекул Fc, то термин "Fc-домен" включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, независимо от того, получена ли эта форма путем гидролиза полноразмерного антитела или она была продуцирована другими способами. В некоторых вариантах настоящего изобретения Fc-домен может быть присоединен к FGF21 или к мутанту FGF21 (включая усеченную форму FGF21 или мутант FGF21) посредством, например, ковалентной связи между Fc-доменом и последовательностью FGF21. Такие гибридные белки могут образовывать мультимеры в результате сборки Fc-доменов, и эти гибридные белки и их мультимеры являются одним из аспектов настоящего изобретения.
Термин "полиэтиленгликоль" или "ПЭГ" означает
полиалкиленгликолевое соединение или его производное, полученное с использованием или без использования связывающих агентов, или полученное путем дериватизации связывающими или активирующими группами.
Термин "FGF21-ассоциированные расстройства" и аналогичные
используемые в данном описании термины включают, но не
ограничиваются ими, ожирение, сахарный диабет типа 1 и типа 2,
панкреатит, дислипидемию, неалкогольный стеатогапатит (НАСГ),
инсулинорезистентность, гиперисулинемию, непереносимость
глюкозы, гипергликемию, метаболический синдром, гипертензию, сердечно-сосудистое заболевание, атеросклероз, заболевание периферических артерий, инсульт, сердечную недостаточность, ишемическую болезнь сердца, заболевание почек, осложнения при диабете, невропатию, гастропарез и другие метаболические расстройства.
"Сахарный диабет типа 2" представляет собой состояние, характеризующееся избыточным продуцированием глюкозы, при котором, несмотря на доступность инсулина, уровни глюкозы в кровотоке остаются очень высокими, что обусловлено неадекватным клиренсом глюкозы.
"Сахарный диабет типа 1" представляет собой состояние, характеризующееся высокими уровнями глюкозы в крови, продуцируемыми при полном отсутствии инсулина. Это происходит в случае, когда иммунная система организма атакует инсулин-продуцирующие бета-клетки в поджелудочной железе и разрушает их. В этом случае, поджелудочная железа продуцирует незначительное количество инсулина или вообще не продуцирует инсулин.
"Панкреатит" представляет собой воспаление поджелудочной железы.
"Дислипидемия" представляет собой расстройство,
ассоциированное с нарушением метаболизма липопротеинов, включая избыточное продуцирование или дефицит липопротеинов. Дислипидемия может проявляться увеличением концентрации общего холестерина, холестерина липопротеина низкой плотности (ЛНП) и триглицеридов, и снижением концентрации холестерина
липопротеина высокой плотности (ЛВП) в крови.
"Неалкогольный стеатогепатит (НАСГ)" представляет собой заболевание печени, не ассоциированное с употреблением алкоголя, и характеризующееся жировым перерождением гепатоцитов, сопровождающимся внутридольчатым воспалением и фиброзом.
"Непереносимость глюкозы" или "пониженная толерантность к глюкозе" (IGT) представляет собой преддиабетическую стадию дисгликемии, которая ассоциируется с повышенным риском развития сердечно-сосудистой патологии. Преддиабетическое состояние препятствует эффективному транспорту глюкозы в клетки индивидуума и утилизации глюкозы как эффективного источника энергии, что приводит к повышению уровней глюкозы в крови и к развитию инсулинорезистентности на определенном уровне.
"Гипергликемия" определяется как избыточный уровень сахара (глюкозы) в крови.
"Гипогликемия", также называемая низким уровнем сахара в крови, имеет место в том случае, когда уровень глюкозы в крови снижается до слишком низкого уровня, который является недостаточным для вырабатывания энергии, необходимой для поддержания активности организма.
"Гиперинсулинемия" определяется как уровень инсулина в крови выше нормы.
"Инсулинорезистентность" определяется как состояние, при котором нормальное количество инсулина продуцирует субнормальный биологический ответ.
Термин "ожирение", если он относится к человеку, может быть определен как превышение массы тела на 2 0% по сравнению с идеальной массой тела для данного индивидуума (R. Н. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916).
"Метаболический синдром" может быть определен как совокупность по меньшей мере трех нижеследующих признаков: жир в области брюшины у большинства мужчин; размер талии 4 0 дюймов или выше; высокий уровень сахара в крови - по меньшей мере 110 миллиграммов на децилитр (мг/дл) после голодания; высокие уровни триглицеридов - по меньшей мере 150 мг/дл в кровотоке;
низкий уровень ЛВП - менее чем 4 0 мг/дл; и кровяное давление 13 0/85 мм рт. ст. или выше.
"Гипертензия" или высокое кровяное давление представляет
собой временное или продолжительное увеличение системного
артериального кровяного давления до уровня, при котором
существует вероятность развития сердечно-сосудистого
расстройства или других негативных последствий. Гипертензия условно определяется как состояние, при котором систолическое кровяное давление составляет выше 140 мм рт. ст. или диастолическое кровяное давление выше 90 мм рт. ст.
"Сердечно-сосудистые заболевания" представляют собой заболевания сердца или кровеносных сосудов.
"Заболевание периферических артерий" происходит в случае образования бляшек в артериях, которые подают кровь к голове, в органы и в конечности. Через определенный период времени бляшки могут сдавливать и сужать артерии, что будет приводить к ограничению поступления обогащенной кислородом крови в органы и в другие участки организма.
"Атеросклероз" означает сосудистое заболевание,
характеризующееся нерегулярным распределением отложения липидов во внутренней оболочке крупных и средних артерий, что приводит к сужению просветов между артериями и, в конечном счете, вызывает фиброз и кальцификацию. Такие поражения обычно являются очаговыми, и медленно и периодически прогрессирующими. Наиболее частые клинические проявления такого заболевания заключаются в ограниченном поступлении крови и варьируются в зависимости от распределения и тяжести поражения.
"Инсульт" представляет собой любое острое клиническое состояние, связанное с нарушением кровообращения в коре головного мозга, которое продолжается более чем 24 часа. Инсульт приводит к необратимому поражению головного мозга, и тип и тяжесть его симптомов зависят от локализации в ткани головного мозга и степени нарушения кровообращения в ткани головного мозга.
"Сердечная недостаточность", также называемая застойной сердечной недостаточностью, представляет собой состояние, при
котором сердце больше не может накачивать достаточное количество крови в различные органы организма.
"Ишемическая болезнь сердца", также называемая заболеванием коронарной артерии, представляет собой сужение небольших кровеносных сосудов, через которые в сердце подаются кровь и кислород.
"Болезнь почек" или нефропатия представляет собой любое почечное заболевание. Диабетическая нефропатия является основной причиной осложнений у людей с сахарным диабетом типа 1 или тина 2 и смертности от этого заболевания.
"Осложнения при диабете" представляют собой патологическое состояние, вызываемое высокими уровнями глюкозы в крови, при этом, нарушаются функции и других органов, таких как почки, нервы (невропатии), нижние конечности (язвы стоп и плохое кровообращение в них) и глаза (например, ретинопатии). При диабете также повышается риск заболеваний сердца, а также заболеваний костей и суставов. Другими хроническими осложнениями диабета являются заболевания кожи, проблемы с пищеварением, половая дисфункция и заболевания зубов и десен.
"Невропатии" представляют собой любые заболевания, поражающие черепные нервы или периферическую или вегетативную нервную систему.
"Гастропарез" представляет собой недостаточную
перистальтику желудка, которая приводит к замедлению опорожнения кишечника.
В соответствии с настоящим изобретением, термин "пациент в критическом состоянии" охватывает пациентов, у которых наблюдается, в основном, нестабильное состояние повышенного метаболизма. Такое нестабильное состояние повышенного метаболизма обусловлено изменением метаболизма субстратов, которое может приводить к относительной недостаточности некоторых питательных веществ. Вообще говоря, такое состояние характеризуется повышенным окислением, как жира, так и мышц.
Кроме того, пациентами в критическом состоянии, предпочтительно, являются пациенты, у которых наблюдаются синдром системного воспалительного ответа или респираторный
дистресс-синдром. Предотвращение осложнений означает уменьшение вероятности развития у пациента в критическом состоянии других заболеваний, состояний или симптомов или снижение тяжести других заболеваний, состояний или симптомов. Так например, предотвращение осложнений позволяет снизить вероятность развития бактериемии, сепсиса или осложнений, связанных с недостаточностью многих органов.
При употреблении единственного числа существительного подразумевается, что это существительное может означать объект и во множественном числе, если это не противоречит контексту описания. Так например, термин "антитело" включает смесь двух или более таких антител.
Используемый в данном описании термин "приблизительно" означает величину, составляющую ±2 0%, ±10% или ±5% от исходной величины.
Используемые в данном описании термины "полипептид" и "белок" являются синонимами и означают полимерную форму любой длины, состоящую из аминокислот, которыми могут быть кодируемые и некодируемые аминокислоты, химически или биохимически модифицированные или дериватизированные аминокислоты и полипептиды, имеющие модифицированные пептидные остовы. Этот термин охватывает гибридые белки, включая, но, не ограничиваясь ими, гибридые белки с гетерологичной аминокислотной последовательностью, гибриды с гетерологичными и гомологичными лидерными последовательностями, в которых присутствуют или отсутствуют N-концевые метиониновые остатки; иммунологически меченые белки; и т.п.
Используемые в данном описании термины "индивидуум", "субъект", "хозяин" и "пациент" является взаимозаменяемыми и относятся к любому индивидууму, который нуждается в установлении диагноза, в лечении или в терапии, и, в частности, к человеку. Другими субъектами могут быть крупный рогатый скот, собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади и т.п. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанным индивидуумом является человек.
Используемый в данном описании термин "образец" означает биологический материал, взятый у пациента. Образец, анализируемый в соответствии с настоящим изобретением, не ограничивается образцом какого-либо конкретного типа. Неограничивающими примерами образцов являются отдельные клетки, множество клеток, ткани, опухоли, биологические жидкости, биологические молекулы или супернатанты или экстракты любых вышеуказанных образцов. Примерами также являются ткани, взятые для биопсии, ткани, взятые во время резекции, пробы крови, пробы мочи, ткани лимфоузлов, лимфотическая жидкость, цереброспинальная жидкость, образцы слизистой и пробы фекалий. Используемый образец может варьироваться в зависимости от формата анализа, методов детектирования и природы анализируемых опухолей, тканей, клеток или экстрактов. Методы взятия образцов хорошо известны в данной области и могут быть легко адаптированы для получения образцов, пригодных для используемого метода исследования.
Используемый в данном описании термин "биологическая молекула" включает, но не ограничивается ими, полипептиды, нуклеиновые кислоты и сахариды.
Используемый в данном описании термин "модуляция" означает изменение качества или количества генов, белков или любых молекул, присутствующих внутри, за пределами или на поверхности клеток. Таким изменением может быть увеличение или снижение уровней экспрессии или количества молекул. Термин "модулирует" также относится к изменению качества или количества биологических функций/биологической активности, включая, но, не ограничиваясь ими, способность снижать уровни глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови; снижать уровни липидов или триглицеридов в печени; снижать массу тела и повышать толерантность к глюкозе, расход энергии или чувствительность к инсулину.
Используемый в данном описании термин "модулятор" означает композицию, которая модулирует одно или более физиологических или биохимических свойств, связанных с FGF21-ассоциированным расстройством, таким как сахарный диабет типа 1 или типа 2 или
метаболическое состояние, подобное ожирению. Такими свойствами являются, но не ограничиваются ими, способность снижать уровни глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови; снижать уровни липидов или триглицеридов в печени; снижать массу тела, повышать толерантность к глюкозе, расход энергии или чувствительность к инсулину.
"Генный продукт" представляет собой биополимерный продукт, который экспрессируется или продуцируется геном. Генным продуктом может быть, например, несплайсированная РНК, мРНК, вариант сплайсинга мРНК, полипептид, посттрансляционно модифицированный полипептид, вариант сплайсинга полипептида и т.п. В определение этого термина также входят биополимерные продукты, которые могут быть получены с использованием генного РНК-продукта в качестве матрицы (то есть, кДНК из РНК) . Генный продукт может быть получен ферментативным, рекомбинантным и химическим способом, или в клетке, для которой этот ген является нативным. В некоторых вариантах осуществления изобретения, если генным продуктом является белок, то он обладает биологической активностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, если генным продуктом является нуклеиновая кислота, то она может транслироваться в белковый генный продукт, обладающий биологической активностью.
Используемый в данном описании термин "модуляция FGF21-
активности" означает повышение или снижение FGF21-активности,
которое может быть обусловлено, например, взаимодействием
агента с полинуклеотидом или полипептидом FGF21, ингибированием
транскрипции и/или трансляции FGF21 (например, посредством
взаимодействия антисмысловой РНК или киРНК с геном FGF21 или с
транскриптом FGF21; посредством модуляции факторов
транскрипции, которые облегчают экспрессию FGF21) и т.п. Так например, термин "модуляция биологической активности" означает повышение или снижение биологической активности. FGF21-активность может быть определена любыми способами, включая, но, не ограничиваясь ими, оценку уровней глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови у индивидуума; оценку уровней полипептидов FGF21 или оценку уровней транскрипции
FGF21. Сравнение FGF21-активностей может быть также осуществлено, например, путем определения уровней биомаркеров, расположенных за FGF21, и оценку увеличения уровней передачи FGF21-сигнала. FGF21-активность может быть также измерена путем оценки клеточного сигнала; киназной активности; поглощения глюкозы адипоцитами; флуктуаций уровней инсулина, триглицеридов или холестерина в крови; изменений уровней липидов или триглицеридов в печени; взаимодействий между FGF21 и его рецептором; или фосфорилирования рецептора FGF21. В некоторых вариантах осуществления изобретения фосфорилированием рецептора FGF21 может быть фосфорилирование тирозина. В некоторых вариантах осуществления изобретения модуляция FGF21-активности может приводить к изменению FGF21-родственного фенотипа.
Используемый в данном описании термин "биомаркер, расположенный за FGF21, означает ген или генный продукт или оцениваемый признак гена или генного продукта. В некоторых вариантах осуществления изобретения ген или активность, которые представляют собой нижерасположенный маркер для FGF21, обнаруживают измененный уровень экспрессии, или указывают на присутствие в сосудистой ткани. В некоторых вариантах осуществления изобретения активность нижерасположенного маркера изменяется в присутствии модулятора FGF21. В некоторых вариантах осуществления изобретения нижерасположенный маркер обнаруживает измененные уровни экспрессии, если на FGF21 влияет модулятор FGF21 согласно изобретению. Маркерами, расположенными ниже FGF21, являются, но не ограничиваются ими, уровень поглощения глюкозы или 2-дезоксиглюкозы, уровни pERK и уровни других фосфорилированных или ацетилированных белков или НАД.
Используемый в данном описании термин "активация" означает повышение, индуцирование или стимуляцию активности или увеличение количества. Так например, в контексте настоящего изобретения, модуляторы FGF21 могут повышать активность рецептора FGF21. В одном из вариантов осуществления изобретения один или оба FGFR-lc или FGFR-4 могут активироваться в ответ на действие модулятора FGF21. Термин "активация" может также относиться к FGF21-родственной активности, такой как, например,
способность снижать уровни глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови; снижать уровни липидов или триглицеридов в печени; снижать массу тела и повышать толерантность к глюкозе, расход энергии или чувствительность к инсулину; индуцировать фосфорилирование рецептора FGF21; или увеличивать уровни маркера, расположенного за FGF21. Рецептором FGFR21 могут быть один или оба FGFR-lc или FGFR-4. Активация может составлять по меньшей мере 25%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 150%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 2 50%, по меньшей мере 4 0 0% или по меньшей мере 500% по сравнению с контролем.
Используемый в данном описании термин "N-конец" означает по меньшей мере первые 10 аминокислот белка.
Используемые в данном описании термины "N-концевой домен" и "N-концевая область" являются синонимами и означают фрагмент белка, который начинается с первой аминокислоты белка и заканчивается в любом положении аминокислоты в N-концевой части белка. Так, например, N-концевой домен FGF21 простирается от аминокислоты 1 последовательности SEQ ID N0:1 до любой аминокислоты приблизительно между положениями аминокислот 10 и 105 последовательности SEQ ID N0:1.
Используемый в данном описании термин "С-конец" означает по меньшей мере последние 10 аминокислот белка.
Используемые в данном описании термины "С-концевой домен" и "С-концевая область" являются синонимами и означают фрагмент белка, который начинается в любом положении аминокислоты в С-концевой части белка и заканчивается последней аминокислотой белка. Так, например, С-концевой домен FGF21 начинается в любом положении аминокислоты от положения 105 и приблизительно до положения 200 последовательности SEQ ID N0:1 и заканчивается в положении аминокислоты 2 09 последовательности SEQ ID N0:1.
Используемый в данном описании термин "домен" означает структурную часть биомолекулы, которая сообщает биомолекуле известную или предполагаемую функцию. Домены могут быть продолжением областей или их частей биомолекулы, либо они могут включать часть биомолекулы, которая отличается от конкретной
области, а также от всей биомолекулы или части этой области.
Используемый в данном описании термин "сигнальный домен" (также называемый "сигнальной последовательностью" или "сигнальным пептидом") означает пептидный домен, который расположен в непрерывном фрагменте аминокислотной последовательности в N-концевой области белка-предшественника (в большинстве случаев, мембраносвязанного или секретируемого белка) и участвует в посттрансляционном транспорте белка. Во многих случаях, сигнальный домен удаляется из полноразмерного белка под действием специализированных сигнальных пептидаз после завершения процесса отбора. Каждый сигнальный домен определяет конкретное назначение белка-предшественника в клетке. Сигнальный домен FGF21 представляет собой последовательность из аминокислот 1-28 SEQ ID N0:1.
Используемый в данном описании термин "домен, связывающийся с рецептором" означает любую часть или область белка, которая контактирует с мембраносвязанным белком рецептора, что приводит к индуцированию клеточного ответа, такого как передача сигнала.
Используемый в данном описании термин "домен, связывающийся с лигандом" означает любую часть или область белка, сохраняющую по меньшей мере одну качественно определяемую связывающую активность соответствующей нативной последовательности FGF21.
Термин "область" означает физически непрерывную часть первичной структуры биомолекулы. В случае белков, термин "область" определяется как непрерывная часть аминокислотной последовательности данного белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения "область" связана с функцией данной биомолекулы.
Используемый в данном описании термин "фрагмент" означает физически непрерывную часть первичной структуры биомолекулы. В случае белков, эта часть определяется как непрерывная часть аминокислотной последовательности данного белка и означает часть, состоящую по меньшей мере из 3-5 аминокислот, по меньшей мере из 8-10 аминокислот, по меньшей мере из 11-15 аминокислот,
по меньшей мере из 17-24 аминокислот, по меньшей мере из 25-30 аминокислот и по меньшей мере из 30-45 аминокислот. В случае олигонуклеотидов, эта часть определяется как непрерывная часть последовательности нуклеиновой кислоты этого олигонуклеотида и означает часть, состоящую по меньшей мере из 9-15 нуклеотидов, по меньшей мере из 18-30 нуклеотидов, по меньшей мере из 33-45 нуклеотидов, по меньшей мере из 48-72 нуклеотидов, по меньшей мере из 75-90 нуклеотидов и по меньшей мере из 90-130 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения части биомолекул обладают биологической активностью. В контексте настоящего изобретения, фрагменты полипептида FGF21 не включают всю последовательность полипептида FGF21, представленную в SEQ ID N0:1.
Полипептид с "нативной последовательностью" представляет собой полипептид, который имеет такую же аминокислотную последовательность, как и природный полипептид. Такие полипептиды с нативной последовательностью могут быть выделены из природного источника, либо они могут быть продуцированы рекомбинантными методами или методами синтеза. Таким образом, полипептид с нативной последовательностью может иметь аминокислотную последовательность природного человеческого полипептида, мышиного полипептида или полипептида, происходящего от млекопитающих любых других видов.
Используемые в данном описании термины "гомологичная
нуклеотидная последовательность" или "гомологичная
аминокислотная последовательность" или их варианты означают
последовательности, имеющие по меньшей мере определенный
процент гомологии на нуклеотидном уровне или на аминокислотном
уровне, и эти термины являются синонимами термина "идентичная
последовательность". Гомологичными нуклеотидными
последовательностями являются последовательности, кодирующие изоформы белков. Такие изоформы могут экспрессироваться в различных тканях одного и того же организма в результате, например, альтернативного сплайсинга РНК. Альтернативно, изоформы могут кодироваться различными генами. Гомологичными нуклеотидными последовательностями являются нуклеотидные
последовательности, кодирующие белок, происходящий от видов, не
являющихся человеком, включая млекопитающих, но, не
ограничиваясь ими. Гомологичными нуклеотидными
последовательностями могут быть также, но не ограничиваются ими, природные аллельные варианты и нуклеотидные последовательности с мутациями, определенные в настоящем описании. Гомологичными аминокислотными последовательностями являются аминокислотные последовательности, которые содержат консервативные аминокислотные замены, и полипептиды, которые обладают такой же связывающей способностью и/или активностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность являются гомологичными, если они имеют идентичность по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная или аминокислотная последовательность является гомологичными, если они имеют 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 или 50-60 нуклеотидных/аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах осуществления изобретения гомологичные аминокислотные последовательности имеют не более чем 5, или не более чем 3 консервативных аминокислотных замены.
Процент гомологии или идентичности может быть определен, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI) с параметрами по умолчанию, которые используются в алгоритме Smith & Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489). В некоторых вариантах осуществления изобретения гомология между зондом и мишенью составляет приблизительно 75%-85%. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеиновые кислоты имеют нуклеотиды, которые по меньшей мере приблизительно на 95%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% и приблизительно на 100% гомологичны последовательности SEQ ID N0:2 или ее части.
Гомология может быть также определена на полипептидном уровне. В некоторых вариантах осуществления изобретения
полипептиды приблизительно на 95%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% и приблизительно на 100% гомологичны последовательности SEQ ID N0:1 или ее части. Степень или процент идентичности варианта FGF21 согласно изобретению ("последовательности согласно изобретению", например, варианта 1 или SEQ ID N0:5) и другой аминокислотной последовательности ("чужеродной последовательности", например, SEQ ID N0:1, где L17 4 заменена на Р174) вычисляют как число точных соответствий при выравнивании двух последовательностей, деленное на длину "последовательности согласно изобретению" или "чужеродной последовательности", в зависимости от того, которая из них короче. Полученный результат выражают как процент идентичности. Так например, вариант 1 (SEQ ID N0:5) на 94,9% идентичен FGF21 дикого типа с заменой L174 на Р174 (SEQ ID N0:1 с заменой L174 на Р174). У этих двух последовательностей, общая длина которых составляет 177 аминокислот, идентичными являются 168 аминокислот. Таким образом, процент идентичности составляет (168/177)х100=94,9%.
Используемый в данном описании термин "смешивание" означает способ комбинирования одного или более соединений, одной или более клеток, одной или более молекул и т.п., взятых вместе в одном и том же контейнере. Это может быть осуществлено, например, в тест-пробирке, в чашке Петри или в любом контейнере, в котором могут быть смешаны одно или несколько соединений, одна или более клеток или одна или более молекул.
Используемый в данном описании термин "по существу, очищенный" относится к соединению (например, либо к полинуклеотиду, либо к полипептиду, либо к антителу), которое было отделено от его природного окружения и которое по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 75% и по меньшей мере на 90% не содержит других компонентов, с которыми это соединение ассоциируется в природе.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает носитель, используемый для введения терапевтического средства,
такого как антитела или полипептид, гены и другие терапевтические средства. Этот термин означает любой фармацевтический носитель, который сам по себе не индуцирует образование антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, получающего указанную композицию, и который, при его введении, не будет продуцировать излишней токсичности. Подходящими носителями могут быть крупные и медленно подвергающиеся метаболизму макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалисту в данной области. Фармацевтически приемлемыми носителями в терапевтических композициях могут быть жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. В таких носителях могут также присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-буферирующие вещества и т.п.
Природные дисульфидные связи, образуемые цистеиновыми остатками, обычно повышают термодинамическую стабильность белков. Убедительные примеры повышения термодинамической стабильности, измеряемой по увеличению температуры плавления, демонстрируют множество мутантов фермента лизоцима Т4, связанных дисульфидными связями (Matsumura, et al, PNAS 86:6562-6566 (1989)), и барназы (Johnson et al. , J. Mol. Biol. 268: 198-208 (1997)). Одним из аспектов настоящего изобретения является повышение физической стабильности FGF21 в присутствии консерванта, которое достигается за счет дисульфидных связей, присутствующих в этих вариантах, где указанные дисульфидные связи ограничивают гибкость FGF21 дикого типа и доступ консервантов в гидрофобную коровую область белка.
Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к вариантам человеческого FGF21 или к его биологически активному пептиду, обладающим повышенной фармацевтической стабильностью, достигаемой за счет введения дополнительных дисульфидных связей, например, путем включения или замены цистеиновых остатков в белке FGF21 дикого типа или в вариантах полипептида
и белка FGF21 согласно изобретению. Специалисту в данной области известно, что нативные цистеины, цистеин 103 и цистеин 121 могут быть использованы в качестве локусов для введения новой дисульфидной связи, которая может сообщать улучшенные свойства, помимо предполагаемых свойств, описанных в данном описании вариантов.
Такими вариантами являются FGF-21 с заменой двух или более из нижеследующих остатков цистеином, а именно, таких остатков, как: глутамин 4 6, аргинин 47, тирозин 48, лейцин 4 9, тирозин 50, треонин 51, аспартат 52, аспартат 53, аланин 54, глутамин 55, глутамин 56, треонин 57, глутамат 58, аланин 59, гистидин 60, лейцин 61, глутамат 62, изолейцин 63, валин 69, глицин 70, глицин 71, аланин 72, аланин 73, лейцин 144, гистидин 145, лейцин 14 6, пролин 147, глицин 14 8, аспарагин 14 9, лизин 150, серии 151, пролин 152, гистидин 153, аргинин 154, аспартат 155, пролин 156, аланин 157, пролин 158, аргинин 159, глицин 160, пролин 161, аланин 162, аргинин 163, фенилаланин 164, где нумерация аминокислот дана в соответствии с полноразмерной аминокислотной последовательностью hFGF21 из 209 аминокислот, представленной SEQ ID N0:1.
Кроме того, помимо природного Cysl03-Cysl21, были получены варианты человеческого FGF21 или его биологически активного пептида, содержащие введенные в него дисульфидные связи, и ими являются следующие варианты: Gln46Cys-Ala59Cys, Gln46Cys-His60Cys, Gln46Cys-Leu61Cys, Gln46Cys-Glu62Cys, Gln46Cys-Ile63Cys, Arg47Cys-Ala59Cys, Arg47Cys-His60Cys, Arg47Cys-Leu61Cys, Arg47Cys-Glu62Cys, Arg47Cys-Ile63Cys, Tyr48Cys-Ala59Cys, Tyr48Cys-His60Cys, Tyr48Cys-Leu61Cys, Tyr48Cys-Glu62Cys, Tyr48Cys-Ile63Cys, Leu49Cys-Ala59Cys, Leu49Cys-His60Cys, Leu49Cys-Leu61Cys, Leu49Cys-Glu62Cys, Leu49Cys-Ile63Cys, Tyr50Cys-Ala59Cys, Tyr50Cys-His60Cys, Tyr50Cys-Lue61Cys, Tyr50Cys-Glu62Cys, Tyr50Cys-Ile63Cys, Leul44Cys-Glyl60Cys, Leul44Cys-Prol61Cys, Leul44Cys-Alal62Cys, Leul44Cys-Argl63Cys, Leul44Cys-Phel64Cys, Hisl45Cys-Glyl60Cys, Hisl45Cys-Prol61Cys, Hisl45Cys-Alal62Cys, Hisl45Cys-Argl63Cys, Hisl45Cys-Phel64Cys, Leul46Cys-Glyl60Cys, Leul46Cys-Prol61Cys, Leul46Cys-
Alal62Cys,
Glyl60Cys,
Argl63Cys,
Prol61Cys,
Phel64Cys,
Gly71Cys,
Val69Cys,
Ala72Cys,
Gly70Cys,
Ala73Cys,
Gly71Cys,
Val69Cys,
Ala72Cys,
Glyl48Cys,
Glyl48Cys,
Glyl48Cys,
Glyl48Cys,
Asnl49Cys,
Asnl49Cys,
Asnl49Cys,
Asnl49Cys,
Lysl50Cys,
Lysl50Cys,
Lysl50Cys,
Lysl50Cys,
Serl51Cys,
Serl51Cys,
Serl51Cys,
Serl51Cys,
Prol52Cys,
Prol52Cys,
Prol52Cys,
Prol52Cys,
Hisl53Cys,
Hisl53Cys,
Hisl53Cys,
Leul4 6Cys-Argl63Cys, Prol4 7Cys-Prol61Cys, Prol4 7Cys-Phel-4Cys, Glyl4 8Cys-Alal62Cys, Thr57Cys-Val69Cys, Thr57Cys-Ala72Cys, Glu58Cys-Glu7 0Cys, Glu58Cys-Ala7 3Cys, Ala59Cys-Gly71Cys, His60Cys-Val69Cys, His60Cys-Ala72Cys, Leu61Cys-Gly70Cys, Leu61Cys-Ala7 3Cys, Leu4 9Cys-Glyl4 8Cys, Asp52Cys-Glyl4 8Cys, Gln55Cys-Glyl4 8Cys, Glu58Cys-Glyl4 8Cys, Leu4 9Cys-Asnl4 9Cys, Asp52Cys-Asnl4 9Cys, Gln55Cys-Asnl4 9Cys, Glu58Cys-Asnl4 9Cys, Leu4 9Cys-Lysl50Cys, Asp52Cys-Lysl50Cys, Gln55Cys-Lysl50Cys, Glu58Cys-Lysl50Cys, Leu4 9Cys-Serl51Cys, Asp52Cys-Serl51Cys, Gln55Cys-Serl51Cys, Glu58Cys-Serl51Cys, Leu4 9Cys-Prol52Cys, Asp52Cys-Prol52Cys, Gln55Cys-Prol52Cys, Glu58Cys-Prol52Cys, Leu4 9Cys-Hisl53Cys, Asp52Cys-Hisl53Cys, Gln55Cys-Hisl53Cys,
Leul46Cys-Phel64Cys, Prol47Cys-
Prol47Cys-Alal62Cys, Prol47Cys-
Glyl48Cys-Glyl60Cys, Glyl48Cys-
Glyl48Cys-Argl63Cys, Glyl48Cys-
Thr57Cys-Gly70Cys, Thr57Cys-
Thr57Cys-Ala73Cys, Glu58Cys-
Glu58Cys-G71Cys, Glu58Cys-
Ala59Cys-Val69Cys, Ala59Cys-
Ala59Cys-Ala72Cys, Ala59Cys-
His60Cys-Gly70Cys, His60Cys-
His60Cys-Ala73Cys, Leu61Cys-
Leu61Cys-Gly71Cys, Leu61Cys-
Arg47Cys-Glyl48Cys, Tyr48Cys-
Tyr50Cys-Glyl48Cys, Thr51Cys-
Asp53Cys-Glyl48Cys, Ala54Cys-
Gln56Cys-Glyl48Cys, Thr57Cys-
Arg47Cys-Asnl49Cys, Tyr48Cys-
Tyr50Cys-Asnl49Cys, Thr51Cys-
Asp53Cys-Asnl49Cys, Ala54Cys-
Gln56Cys-Asnl49Cys, Thr57Cys-
Arg47Cys-Lysl50Cys, Tyr48Cys-
Tyr50Cys-Lysl50Cys, Thr51Cys-
Asp53Cys-Lysl50Cys, Ala54Cys-
Gln56Cys-Lysl 50Cys, Thr57Cys-
Arg47Cys-Serl51Cys, Tyr48Cys-
Tyr50Cys-Serl51Cys, Thr51Cys-
Asp53Cys-Serl51 Cys, ala54Cys-
Gln56Cys-Serl51Cys, Thr57Cys-
Arg47Cys-Prol52Cys, Tyr48Cys-
Tyr50Cys-Prol 52Cys, Thr51Cys-
Asp53Cys-Prol52Cys, Ala54Cys-
Gln56Cys-Prol52Cys, Thr57Cys-
Arg47Cys-Hisl53Cys, Tyr48Cys-
Tyr50Cys-Hisl53Cys, Thr51Cys-
Asp53Cys-Hisl53Cys, Ala54Cys-
Gln56Cys-Hisl53Cys, Thr57Cys-
Hisl 53Cys,
Glu58Cys
-Hisl53Cys,
Arg47Cys-
¦Argl 54Cys,
Tyr48Cys-
Argl54Cys,
Leu49Cys-
-Argl54Cys,
Tyr50Cys-
-Argl54Cys,
Thr51Cys-
Argl54Cys,
Asp52Cys-
-Argl54Cys,
Asp53Cys-
-Argl54Cys,
Ala54Cys-
Argl54Cys,
Gln55Cys-
-Argl54Cys,
Gln56Cys-
-Argl54Cys,
Thr57Cys-
Argl54Cys,
Glu58Cys-
-Argl54Cys,
Arg47Cys-
-Aspl55Cys,
Tyr48Cys-
Aspl55Cys,
Leu49Cys-Aspl 55Cys,
Tyr50Cys-
¦Aspl 55Cys,
Thr51Cys-
Aspl55Cys,
Asp52Cys-
-Aspl55Cys,
Asp53Cys-
-Aspl55Cys,
Ala54Cys-
Aspl55Cys,
Gln55Cys-
-Aspl55Cys,
Gln56Cys-
-Aspl55Cys,
Thr57Cys-
Aspl55Cys,
Glu58Cys-
-Aspl55Cys,
Arg47Cys-
-Prol56Cys,
Tyr48Cys-
Prol56Cys,
Leu49Cys-
-Prol56Cys,
Tyr50Cys-
-Prol56Cys,
Thr51Cys-
Prol56Cys,
Asp52Cys-
-Prol56Cys,
Asp53Cys-
-Prol56Cys,
Ala54Cys-
Prol56Cys,
Gln55Cys-
-Prol56Cys,
Gln56Cys-
-Prol56Cys,
Thr57Cys-
Prol 56Cys,
Glu58Cys
-Prol56Cys,
Arg47Cys-
¦Alal 57Cys,
Tyr48Cys-
Alal57Cys,
Leu49Cys-
-Alal57Cys,
Tyr50Cys-
-Alal57Cys,
Thr51Cys-
Alal57Cys,
Asp52Cys-
-Alal57Cys,
Asp53Cys-
-Alal57Cys,
Ala54Cys-
Alal57Cys,
Gln55Cys-
-Alal57Cys,
Gln56Cys-
-Alal57Cys,
Thr57Cys-
Alal57Cys,
Glu58Cys-
-Alal57Cys,
Arg47Cys-
-Prol58Cys,
Tyr48Cys-
Prol58Cys,
Leu49Cys-
-Prol58Cys,
Tyr50Cys-
-Prol58Cys,
Thr51Cys-
Prol58Cys,
Asp52Cys-
-Prol58Cys,
Asp53Cys-
-Prol58Cys,
Ala54Cys-
Prol58Cys,
Gln55Cys-
-Prol58Cys,
Gln56Cys-
-Prol58Cys,
Thr57Cys-
Prol 58Cys,
Glu58Cys-Prol58Cys,
Arg47Cys
;-Argl59Cys,
Tyr48Cys-
Argl59Cys,
Leu49Cys-
-Argl59Cys,
Tyr50Cys-
-Argl59Cys,
Thr51Cys-
Argl59Cys,
Asp52Cys-
-Argl59Cys,
Asp53Cys-
-Argl59Cys,
Ala54Cys-
Argl59Cys,
Gln55Cys-
-Argl59Cys,
Gln56Cys-
-Argl59Cys,
Thr57Cys-
Argl59Cys,
Glu58Cys
-Argl59Cys,
Arg47Cys-G160Cys,
Tyr48Cys-
G160Cys,
Leu49Cys-(
G160Cys,
Tyr50Cys-Glyl60Cys,
Thr51Cys-
Glyl60Cys,
Asp52Cys-
-Glyl60Cys,
Asp53Cys-
-Glyl60Cys,
Ala54Cys-
Glyl60Cys,
Gln55Cys-
-Glyl60Cys,
Gln56Cys-
-Glyl60Cys,
Thr57Cys-
Glyl60Cys,
Glu58Cys-
-Glyl60Cys,
Arg47Cys-
-Prol61Cys,
Tyr48Cys-
Prol61Cys,
Leu49Cys-
-Prol61Cys,
Tyr50Cys-
-Prol61Cys,
Thr51Cys-
Prol61Cys,
Asp52Cys-
-Prol61Cys,
Asp53Cys-
-Prol61Cys,
Ala54Cys-
Prol61Cys,
Gln55Cys-
-Prol61Cys,
Gln56Cys-
-Prol61Cys,
Thr57Cys-
Prol61Cys,
Glu58Cys-
-Prol61Cys,
Arg47Cys-
-Alal62Cys,
Tyr48Cys-
Alal62Cys,
Leu49Cys-
-Alal62Cys,
Tyr50Cys-
-Alal62Cys,
Thr51Cys-
Alal62Cys,
Asp52Cys-
-Alal62Cys,
Asp53Cys-
-Alal62Cys,
Ala54Cys-
Alal62Cys,
Gln55Cys-
-Alal62Cys,
Gln56Cys-
-Alal62Cys,
Thr57Cys-
Alal62Cys,
Glu58Cys-
-Alal62Cys,
Arg47Cys-
-Argl63Cys,
Tyr48Cys-
Argl63Cys,
Leu49Cys-
-Argl63Cys,
Tyr50Cys-
-Argl63Cys,
Thr51Cys-
Argl63Cys,
Asp52Cys-
-Argl63Cys,
Asp53Cys-
-Argl63Cys,
Ala54Cys-
Argl63Cys,
Gln55Cys-
-Argl63Cys,
Gln56Cys-
-Argl63Cys,
Thr57Cys-
Argl63Cys,
Glu58Cys-Argl63Cys.
В своем третьем
аспекте настоящее изобретение
относится к
вариантам человеческого FGF21 или к их биологически активному пептиду, имеющим замену любой заряженной и/или полярной, но незаряженной, аминокислоты в любых положениях аминокислот, указанных в первом варианте настоящего изобретения, вместе с заменой цистеином в двух или более положениях аминокислот, указанных во втором варианте настоящего изобретения.
Хорошо известно, что главной проблемой при разработке белковых фармацевтических средств является устранение физической и химической нестабильности белков. Это особенно очевидно, если белковая фармацевтическая композиция предназначена для многократного применения в виде препарата для инъекций, который должен быть приготовлен в виде стабильного концентрированного раствора с консервантами для сохранения благоприятного профиля его биологической активности. Подробная биофизическая характеризация FGF21 дикого типа показала, что концентрированный раствор белка (> 5 мг/мл), при его помещении в условия стресса, такие как высокая температура или низкий рН, подвергается быстрой сборке и агрегации (то есть, он имеет плохую физическую стабильность и обладает нежелательными биофармацевтическими свойствами). Обработка концентрированного раствора белка FGF21 фармацевтическими консервантами (например, м-крезолом) также оказывает негативное влияние на физическую стабильность.
Поэтому, в одном из своих вариантов осуществления настоящее изобретение относится к повышению физической стабильности концентрированных растворов и к сохранению их химической стабильности и биологической активности в физиологического условиях и в условиях приготовления препарата с консервантами. Следует отметить, что сборка и агрегация могут быть следствием гидрофобных взаимодействий, поскольку
концентрация, температура и ионная сила данного белка оказывают значительное влияние на физическую стабильность. По большей части, мишенями являются неконсервативные, предположительно, поверхностные аминокислотные остатки. Было проанализировано локальное окружение этих остатков, и было обнаружено, что их структура не имеет существенного значения при выборе остатков для мутагенеза. Одним из способов инициации специфических замен является дальнейшее снижение pi белка путем введения остатков глутаминовой кислоты ("сканирование глутаминовой кислоты"). Была высказана гипотеза, что введение заряженных аминокислотных замен будет приводить к ингибированию агрегации, опосредуемой гидрофобными взаимодействиями, за счет отталкивания зарядов, и, возможно, будет улучшать их совместимость с консервантами. Кроме того, специалистам в данной области также известно, что при достаточной степени мутагенеза, pi будет смещаться в сторону основного рН в результате введения положительно заряженного остатка с последующими уменьшением или без уменьшения отрицательного заряда, где указанное уменьшение отрицательного заряда достигается за счет отталкивания зарядов.
Хотя варианты осуществления настоящего изобретения относятся к физической и химической стабильности, как в физиологических условиях, так и в условиях приготовления фармацевтических композиций с консервантами, однако, важным фактором, который необходимо принять во внимание, является сохранение в вариантах согласно изобретению такой же биологической активности, как и в FGF21 дикого типа. Поэтому, биологическая активность вариантов согласно изобретению определяется способностью этих вариантов влиять на поглощение глюкозы, измеряемое в клеточном in vitro анализе на поглощение 2-D0G адипоцитами 3T3-L1 (пример 3) и/или снижение уровней глюкозы в плазме, а также уровней триглицеридов в плазме, как было измерено в in vivo анализе на ob/ob-мышах (пример 5).
Варианты FGF21, вводимые в соответствии с настоящим
изобретением, могут быть получены и/или выделены любыми
известными способами. Наиболее предпочтительным способом
получения указанного варианта является технология
рекомбинантных ДНК, хорошо известная специалистам в данной области. Такие технологии описаны в публикации Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.), которая включена в настоящее описание посредством ссылки.
Кроме того, предпочтительными вариантами изобретения являются биологически активный пептид, происходящий от описанного в данном описании варианта. Такой пептид содержит по меньшей мере одну из описанных в данном описании замен и обладает биологической активностью. Указанный пептид может быть получен любыми способами, известными специалистам в данной области, и примерами таких способов являются, но не ограничиваются ими, ферментативный гидролиз, химический синтез или технология рекомбинантных ДНК.
В данной области известно, что фрагменты пептидов некоторых факторов роста фибробластов являются биологически активными. См., например, Baird et al, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2324-2328 (1988), и J. Cell. Phys. Suppl. 5: 101-106 (1987). Поэтому, отбор фрагментов или вариантов пептидов осуществляют на основе критериев, известных в данной области. Так например, известно, что дипептидилпептидаза IV (DPP-IV) представляет собой сериновую протеазу, участвующую в инактивации нейропептидов, эндокринных пептидов и цитокинов (Damme et al. Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)). N-конец FGF21 (HisProIlePro) содержит два дипептида, которые могут быть субстратами для DPP-IV, в результате чего они могут образовывать фрагмент FGF21, усеченный у N-конца на 4 аминокислоты. Неожиданно было обнаружено, что фрагмент FGF21 дикого типа сохраняет биологическую активность (таблица 2), и поэтому, варианты согласно изобретению, усеченные у N-конца на 4 аминокислоты, являются вариантами настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также охватывает полинуклеотиды, кодирующие вышеописанные варианты, которые могут присутствовать в форме РНК или в форме ДНК, где указанная ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной. Кодирующие последовательности, которые кодируют варианты согласно изобретению, могут варьироваться из
за избыточности или вырожденности генетического кода.
Полинуклеотидами, которые кодируют варианты согласно изобретению, могут быть следующие полинуклеотиды: только кодирующая последовательность для данного варианта; кодирующая последовательность для данного варианта и дополнительная кодирующая последовательность, такая как последовательность, кодирующая функциональный полипептид; или лидерная или секреторная последовательность или последовательность пробелка; кодирующая последовательность для данного варианта и некодирующая последовательность, такая как интроны или некодирующая последовательность, расположенная у 5'- и/или 3'-конца кодирующей последовательности этого варианта. Таким образом, термин "полинуклеотид, кодирующий вариант" охватывает полинуклеотид, который может включать не только кодирующую последовательность для данного варианта, но также и полинуклеотид, включающий дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.
Настоящее изобретение также относится к вариантам описанных полинуклеотидов, которые кодируют фрагменты, аналоги и производные полипептида, имеющего указанные замены. Вариантом полинуклеотида могут быть природный аллельный вариант человеческой последовательности FGF21, неприродный вариант или усеченный вариант, описанные выше. Таким образом, настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, кодирующие описанные выше варианты, а также варианты таких полинуклеотидов, которые кодируют фрагмент, производное или аналог описанного варианта. Такими нуклеотидными вариантами являются варианты с делециями, варианты с заменами, усеченные варианты и варианты с добавлениями или инсерциями, при условии, что в них присутствует по меньшей мере одна из указанных аминокислотных замен согласно первому или второму вариантам изобретения.
Полинуклеотиды согласно изобретению экспрессируются в хозяевах после того, как эти последовательности были функционально присоединены к последовательности регуляции экспрессии (то есть, присоединены в положении, обеспечивающем их функционирование). Эти экспрессионные векторы обычно
реплицируются в организмах-хозяевах либо как эписомы, либо как
непрерывная часть хромосомной ДНК хозяина. Обычно,
экспрессионные векторы содержат маркеры отбора, например,
тетрациклин, неомицин или дигидрофолат-редуктазу, что позволяет
детектировать клетки, трансформированные нужными
последовательностями ДНК. Вариант FGF21 может экспрессироваться в клетках млекопитающих, насекомых, дрожжей, бактерий или в других клетках под контролем соответствующих промоторов. Бесклеточные системы трансляции могут быть также применены для продуцирования таких белков с использованием РНК, продуцируемых конструкциями ДНК согласно изобретению.
Е. coli представляет собой прокариотическую клетку-хозяина, которая может быть использована, в частности, для клонирования полинуклеотидов согласно изобретению. Другими микробными хозяевами, подходящими для их применения в данных целях, являются Bacillus subtilus, Salmonella typhimurium и различные виды Serratia, Pseudomonas, Streptococcus и Staphylococcus, хотя могут быть также выбраны и другие хозяева. В этих прокариотических хозяевах могут также присутствовать экспрессионные векторы, обычно содержащие последовательности регуляции экспрессии, которые являются совместимыми с клеткой-хозяином (например, ориджин репликации). Кроме того, может присутствовать любой из хорошо известных промоторов, таких как промоторная система лактозы, промоторная система триптофана (trp), промоторная система бета-лактамазы или промоторная система фагов лямбда или Т7. Промоторы обычно содержат последовательность регуляции экспрессии и необязательно операторную последовательность, последовательности сайтов связывания с рибосомой и т.п., для инициации и терминации транскрипции и трансляции.
Специалистам в области экспрессии белков известно, что метионин или последовательность метионин-аргинин могут быть введены у N-конца зрелой последовательности (SEQ ID N0:3) для инициации экспрессии в Е. coli, и такое введение рассматривается в описании настоящего изобретения. Таким образом, если не указано иное, то варианты согласно
изобретению, экспрессируемые в Е. coli, имеют метиониновую последовательность, введенную у N-конца.
Для экспрессии могут быть использованы и другие микроорганизмы, такие как дрожжи или грибы. Примерами предпочтительных дрожжевых хозяев являются Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Pichia angusta, содержащие подходящие векторы, которые имеют последовательности регуляции экспрессии, такие как промоторы, включая промоторы 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, а также, если это необходимо, ориджин репликации, последовательности терминации и т.п. Примерами грибов-хозяев являются Aspergillus niger, Trichoderma reesei; и Schizophyllum commune, хотя могут быть также выбраны и другие хозяева.
Для экспрессии и продуцирования полипептидов согласно изобретению может быть также использована клеточная культура тканей млекопитающих. Фактически, предпочтительными являются эукариотические клетки, поскольку уже был разработан ряд подходящих клеточных линий-хозяев, способных секретировать интактные варианты, и такими клеточными линиями являются клеточные линии СНО, различные клеточные линии COS, клетки NSO, клеточные линии яичника сирийского хомячка, клетки HeLa или клеточные линии почек человеческого эмбриона (то есть, НЕК2 93, НЕК2 93EBNA) .
Экспрессионными векторами для этих клеток могут быть
последовательности регуляции экспрессии, такие как ориджин
репликации, промотор, энхансер и сайты, необходимые для
процессинга, такие как сайты связывания с рибосомой, сайты РНК-
сплайсинга, сайты полиаденилирования и последовательности
терминации транскрипции. Предпочтительными последовательностями
регуляции экспрессии являются промоторы, происходящие от SV4 0,
аденовируса, вируса бычьей папилломы, цитомегаловируса, вируса
саркомы Рауса и т.п. Предпочтительными сайтами
полиаденилирования являются последовательности, происходящие от SV4 0 и бычьего гормона роста.
Векторы, содержащие представляющие интерес
полинуклеотидные последовательности (например, варианты FGF21 и последовательности регуляции экспрессии), могут быть перенесены в клетки-хозяева хорошо известными методами, которые могут варьироваться в зависимости от типа клетки-хозяина. Так например, для прокариотических клеток обычно используется система трансфекции хлоридом кальция, и для других клеток-хозяев может быть проведена обработка фосфатом кальция или электропорация.
При этом, могут быть применены различные методы очистки белков, и такие методы известны в данной области и описаны, например, в публикации Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) and Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). Выбор стадии(й) очистки зависит, например, от способа продуцирования вариантов FGF21.
Композиции, содержащие вариант FGF21, должны быть
приготовлены и дозированы в соответствии со
стандартизированными международными требованиями
фармацевтической практики; с учетом состояния здоровья пациента, области доставки композиции, содержащей вариант FGF21, способа введения, схемы введения и других факторов, известных практическому врачу. Таким образом, "терапевтически эффективное количество" варианта FGF21, используемого в целях настоящего изобретения, определяют исходя из приведенного выше обсуждения.
Фармацевтические композиции вариантов FGF21 согласно
изобретению могут быть введены любыми способами, позволяющими
достичь нужной цели, а именно, для лечения сахарного диабета
типа 1 и типа 2, ожирения и метаболического синдрома, или для
лечения пациентов в критическом состоянии. Используемый в
данном описании термин "парентеральное" введение относится к
способам введения, которые включают внутривенные,
внутримышечные, внутрибрюшинные, интрастернальные, подкожные и внутрисуставные инъекции и вливания. Вводимая доза зависит от возраста, состояния здоровья и массы тела реципиента, типа сопутствующего лечения, если оно проводится, а также от частоты введения и от конкретно желаемого эффекта. Композициями,
входящими в объем настоящего изобретения, являются все композиции, в которых вариант FGF21 присутствует в количестве, подходящем для достижения терапевтического эффекта, необходимом для лечения сахарного диабета типа 1 или типа 2, ожирения или метаболического синдрома. Хотя количество, необходимое для каждого конкретного пациента, может варьироваться, однако, определение оптимальных интервалов эффективных количеств всех компонентов может быть осуществлено самим врачом-клиницистом.
Варианты FGF21 согласно изобретению могут быть получены в соответствии с известными способами получения фармацевтически приемлемых композиций. Предпочтительным препаратом является стабильный лиофилизованный продукт, который разводят соответствующим разбавителем или водным раствором с высокой частотой и необязательно фармацевтически приемлемыми носителями, консервантами, эксципиентами или стабилизоторами [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)]. Варианты согласно изобретению могут быть объединены с фармацевтически приемлемым буфером, при этом, рН может быть скорректирован для достижения приемлемой стабильности и для достижения приемлемой рН-среды для введения.
В одном из вариантов осуществления изобретения для парентерального введения, варианты FGF21, как правило, приготавливают в виде единичной лекарственной формы для инъекций (раствора, суспензии или эмульсии) путем смешивания одного или более вариантов, имеющих желательную чистоту, с фармацевтически приемлемым носителем, то есть, носителем, который является нетоксичным для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и который является совместимым с другими ингредиентами в данной композиции. При этом, могут быть, предпочтительно, добавлены один или более фармацевтически приемлемых противомикробных средств. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми противомикробными средствами являются фенол, м-крезол и бензиловый спирт.
Могут быть также добавлены, но необязательно, одна или более фармацевтически приемлемых солей для коррекции ионной силы или тоничности. Для дополнительной коррекции изотоничности
препарата могут быть добавлены один или более эксципиентов. Примерами эксципиентов для коррекции изотоничности являются глицерин, хлорид натрия и маннит.
Специалист в данной области может легко оптимизировать
фармацевтически эффективные дозы и схемы введения
терапевтических композиций, содержащих вариант FGF21, в
соответствии со стандартизированными международными
требованиями фармацевтической практики и с учетом состояния здоровья пациента. Конкретные интервалы доз для вариантов FGF21 согласно изобретению составляют приблизительно от 0,01 мг в день до 1000 мг в день (или приблизительно от 0,05 мг в неделю до 5000 мг в неделю, один раз в неделю) для взрослых. Предпочтительно, интервалы доз составляют приблизительно от 0,1 мг в день до 100 мг в день (или приблизительно от 0,5 мг в неделю до 500 мг в неделю, один раз в неделю), и более предпочтительно, приблизительно от 1,0 мг в день до 10 мг в день (или приблизительно от 5 мг в неделю до 50 мг в неделю, один раз в неделю). Наиболее предпочтительная доза составляет приблизительно 1-5 мг/день (или приблизительно от 5 мг в неделю до 25 мг в неделю, один раз в неделю) . Соответствующая доза вводимого варианта FGF21 будет снижать уровни глюкозы в крови и повышать расход энергии благодаря более быстрой и эффективной утилизации глюкозы, и поэтому эта доза может быть использована для лечения сахарного диабета типа 1 и типа 2, ожирения и метаболического синдрома.
Кроме того, поскольку гипергликемия и
инсулинорезистентность обычно наблюдаются у пациентов в критическом состоянии, которым вводят искусственное питание, то в некоторых отделениях интенсивной терапии, для лечения пациентов с очень высоким содержанием сахара в крови вводят инсулин. Действительно, в недавно проводимых исследованиях задокументировано введение экзогенного инсулина для поддержания содержания глюкозы в крови на уровне, не превышающем 110 мг на децилитр, и для снижения риска ухудшения состояния пациента и летального исхода у пациентов в критическом состоянии, находящихся в хирургическом отделении интенсивной терапии,
независимо от наличия диабета в анамнезе (Van den Berghe, et al. N. Engl. J. Med., 345(19): 1359, (2001)). Таким образом, варианты FGF21 согласно изобретению являются исключительно подходящими для восстановления метаболической стабильности у метаболически нестабильных пациентов в критическом состоянии. Варианты FGF21 являются уникальными в том смысле, что они стимулируют поглощение глюкозы и усиливают чувствительность к инсулину, но не индуцируют гипогликемию.
В другом аспекте настоящего изобретения рассматриваются варианты FGF21, используемые в качестве лекарственного средства для лечения сахарного диабета типа 1 и типа 2, ожирения и метаболического синдрома, или для лечения указанных заболеваний у пациента в критическом состоянии.
Настоящее изобретение будет более очевидным из его подробного описания и из нижеследующих примеров, которые приводятся только в целях иллюстрации и не рассматриваются как ограничение объема изобретения.
Настоящее изобретение может быть осуществлено, если не указано иное, в соответствии со стандартными способами, применяемыми в химии, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, и известными специалистам в данной области. Такие способы подробно описаны в литературе. См., например, руководства Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); и Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); и Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989).
Сайт-специфические мутанты FGF21
Термины "сайт-специфический мутант FGF21" или "мутант
FGF21 с заменой" означают мутантный полипептид FGF21, имеющий
аминокислотную последовательность, отличающуюся от
аминокислотной последовательности природного полипептида FGF21, например, SEQ ID N0:1, и его варианты. Сайт-специфические мутанты FGF21 могут быть получены путем введения аминокислотных
замен, либо консервативных, либо неконсервативных, и с использованием природных или неприродных аминокислот, вводимых в конкретные положения полипептида FGF21.
"Консервативная аминокислотная замена" может включать
замену нативного аминокислотного остатка (то есть, остатка,
присутствующего в данном положении полипептидной
последовательности FGF21 дикого типа) ненативным остатком (то
есть, остатком, который не присутствует в данном положении
полипептидной последовательности FGF21 дикого типа), где
указанная замена будет оказывать незначительное влияние или
вообще не будет оказывать влияния на полярность или заряд
аминокислотного остатка в данном положении. Консервативные
аминокислотные замены также охватывают неприродные
аминокислотные остатки, которые обычно вводят не с помощью
синтеза в биологических системах, а посредством химического
пептидного синтеза. Такими полипептидами являются
пептидомиметики и другие обращенные или инвертированные формы аминокислотных молекул.
Природные остатки могут быть подразделены на несколько классов исходя из общих свойств их боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, lie;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: Asn, Gin, His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Туг, Phe; и
(7) селеноцистеин, пирролизин (PYL) и пирролин-
карбоксилизин (PCL).
Консервативные замены могут включать замену одного остатка, принадлежащего к одному из этих классов, другими остатками, принадлежащими к этому классу. Неконсервативные замены могут включать замену остатка, принадлежащего к одному из этих классов, остатком, принадлежащим к другому классу.
Желательные аминокислотные замены (независимо от того, являются ли они консервативными или неконсервативными) могут быть определены самим специалистом в данной области, если такие
замены необходимы.
Усеченные полипептиды FGF21
Один из вариантов настоящего изобретения относится к усеченным формам зрелого полипептида FGF21 (SEQ ID N0:3). Этот вариант настоящего изобретения был разработан в результате попыток получить усеченные полипептиды FGF21, способные продуцировать активность, аналогичную активности неусеченных форм зрелого полипептида FGF21, и, в некоторых случаях, более высокую активность.
Используемый в данном описании термин "усеченный полипептид FGF21" означает полипептид FGF21, в котором аминокислотные остатки были удалены у амино-конца (или у N-конца) полипептида FGF21; у карбокси-конца (или у С-конца) полипептида FGF21; или у амино-конца и у карбокси-конца полипептида FGF21. Различные описанные в данном описании усечения были получены, как описано в настоящем описании.
Активность усеченных по N-концу полипептидов FGF21 и усеченных по С-концу полипептидов FGF21 может быть оценена с помощью in vitro анализа на фосфо-ERK. Конкретное подробное описание in vitro анализов, которые могут быть проведены для оценки активности усеченных полипептидов FGF21, приведены в примерах.
Активность усеченных полипептидов FGF21 согласно изобретению может быть также оценена с помощью in vivo анализа на ob/ob-мышах. В общих чертах, для оценки активности усеченного полипептида FGF21 in vivo, этот усеченный полипептид FGF21 может быть введен тестируемому животному внутрибрюшинно. После необходимого периода инкубации (например, в течение одного часа или более) может быть взята проба крови с последующим измерением уровней глюкозы в крови.
а. N-концевые усечения
В некоторых вариантах осуществления изобретения N-концевые усечения означают удаление 1, 2, 3, 4, 5, б, 7 или 8 аминокислотных остатков у N-конца зрелого полипептида FGF21. Усеченные полипептиды FGF21, имеющие N-концевые усечения в менее чем 9 аминокислотных остатков, сохраняют способность
зрелого полипептида FGF21 снижать уровень глюкозы в крови у индивидуума. В соответствии со своими конкретными вариантами, настоящее изобретение включает усеченные формы зрелого полипептида FGF21 или вариантов белка FGF21, имеющие N-концевые усечения в 1, 2, 3, 4, 5, б, 7 или 8 аминокислотных остатков.
b. С-концевые усечения
В некоторых вариантах осуществления изобретения С-концевые усечения означают удаление 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков у С-конца зрелого полипептида FGF21. Усеченные полипептиды FGF21, имеющие С-концевые усечения в менее чем 13 аминокислотных остатков обладают эффективностью, которая составляет по меньшей мере 50% от эффективности FGF21 дикого типа в in vitro анализе с использованием ELK-люциферазы (Yie J. et al. FEBS Letts 583: 19-24 (2009)), что указывает на то, что эти мутанты FGF21 сохраняют способность зрелого полипептида FGF21 снижать уровень глюкозы в крови у индивидуума. В соответствии с конкретными вариантами осуществления, настоящее изобретение включает усеченные формы зрелого полипептида FGF21 или вариантов белка FGF21, имеющие С-концевые усечения в 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков.
c. N-концевые усечения и С-концевые усечения
В некоторых вариантах осуществления изобретения усеченные полипептиды FGF21 могут иметь комбинацию N-концевых и С-концевых усечений. Усеченные полипептиды FGF21, имеющие комбинацию N-концевых и С-концевых усечений, сохраняют активность соответствующих усеченных полипептидов FGF21, имеющих либо N-концевые, либо С-концевые усечения. Другими словами, усеченные полипептиды FGF21, имеющие N-концевые усечения в менее чем 9 аминокислотных остатков, и С-концевые усечения в менее чем 13 аминокислотных остатков, обладают активностью в снижении уровня глюкозы в крови, аналогичной активности усеченных полипептидов FGF21, имеющих N-концевые усечения в менее чем 9 аминокислотных остатков или С-концевые усечения в менее чем 13 аминокислотных остатков, или обладают более высокой активностью. В соответствии с конкретными
вариантами осуществления, настоящее изобретение включает усеченные формы зрелого полипептида FGF21 или вариантов белка FGF21, имеющие N-концевые усечения в 1, 2, 3, 4, 5, б, 7 или 8 аминокислотных остатков, и С-концевые усечения в 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислотных остатков.
Как и во всех вариантах FGF21 согласно изобретению, усеченные полипептиды FGF21 могут содержать, но необязательно, амино-концевой метиониновый остаток, который может быть введен посредством сайт-направленного мутагенеза или в результате экспрессии в бактериях.
Усеченные полипептиды FGF21 согласно изобретению могут быть получены, как описано ниже в примерах. Специалист в данной области, знакомый со стандартными методами молекулярной биологии, может, исходя из описания настоящего изобретения, легко получить и использовать усеченные полипептиды FGF21 согласно изобретению. Для этого могут быть применены стандартные методы рекомбинантных ДНК, олигонуклеотидного синтеза, культивирования тканей и трансформации (например, электропорации, липофекции). См., например, руководство Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, см. выше, которое в любых целях включены в настоящее описание посредством ссылки. Ферментативные реакции и методы очистки могут быть осуществлены в соответствии с рекомендациями производителей, и в общих чертах описаны в литературе или в настоящем описании. Если не указано конкретно иное, то в настоящем изобретении используются хорошо известные и широко применяемые номенклатура, лабораторные методики и методы аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии. Химический синтез, химические анализы, получение фармацевтических препаратов, составление композиций, доставка и лечение пациентов могут быть осуществлены стандартными методами.
Усеченные полипептиды FGF21 согласно изобретению также могут быть присоединены к другой молекуле, которая может сообщать усеченному полипептиду FGF21 дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления изобретения усеченный
полипептид FGF21 может быть присоединен к константному домену IgG или к его фрагменту (например, к Fc-области), к альбумину человеческой сыворотки (HSA) или к альбумин-связывающим полипептидам. Такое присоединение может быть осуществлено известными методами молекулярной биологии и/или в соответствии с указанными в данном описании руководствами. Преимущества таких гибридных полипептидов, а также способы получения таких гибридных полипептидов более подробно обсуждаются ниже. Гибридные белки FGF21
Используемый в данном описании термин "гибридный полипептид FGF21" или "гибридный белок FGF21" означает гибрид, полученный путем присоединения одного или нескольких аминокислотных остатков (таких как гетерологичный белок или пептид) к N-концу или С-концу любого описанного в данном описании варианта белка FGF21.
Гетерологичными пептидами и полипептидами являются, но не ограничиваются ими, эпитоп, позволяющий детектировать и/или выделять вариант белка FGF21; трансмембранный рецепторный белок или его часть, такой как внеклеточный домен или трансмембранный и внутриклеточный домен; лиганд или его часть, которые связываются с трансмембранным рецепторным белком; фермент или его часть, которые являются каталитически активными; полипептид или пептид, который стимулирует олигомеризацию, такой как домен "лейциновая молния"; полипептид или пептид, который повышает стабильность, такой как константная область иммуноглобулина; функциональное или нефункциональное антитело или его тяжелая или легкая цепь; и полипептид, который обладает активностью, например, терапевтической активностью, отличающейся от активности вариантов белка FGF21 согласно изобретению. Настоящее изобретение также охватывает мутанты FGF21, присоединенные к альбумину человеческой сыворотки (HSA).
Гибридые белки FGF21 могут быть получены путем присоединения гетерологичных последовательностей к N-концу или к С-концу варианта белка FGF21. Как описано в настоящем описании, гетерологичной последовательностью может быть аминокислотная последовательность или полимер, не содержащий
аминокислот. Гетерологичные последовательности могут быть непосредственно присоединены к варианту белка FGF21, либо они могут быть присоединены к данному белку посредством линкерной или адаптерной молекулы. Линкерной или адаптерной молекулой может быть один или несколько аминокислотных остатков (или -меров), например, 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8 или 9 остатков (или -меров), предпочтительно, от 10 до 50 аминокислотных остатков (или -меров), например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 остатков (или -меров) , и более предпочтительно, от 15 до 35 аминокислотных остатков (или -меров). Линкерная или адаптерная молекула также может быть сконструирована вместе с сайтом отщепления для рестриктирующей ДНК-эндонуклеазы или для протеазы в целях отделения гибридных молекул.
а. Fc-гибриды
В одном из вариантов осуществления изобретения вариант белка FGF21 присоединен к одному или нескольким доменам Fc-области человеческого IgG. Антитела содержат две функционально независимых части, то есть, вариабельный домен, известный как "Fab", который связывается с антигеном, и константный домен, известный как "Fc", который участвует в эффекторных функциях, таких как активация комплемента, и атакуется фагоцитами. Fc имеет длительное время полужизни в сыворотке, и Fab имеет короткое время полужизни в сыворотке (Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31). При присоединении к терапевтическому белку, Fc-домен может увеличивать время полужизни в сыворотке или сообщать такие функции, как связывание с Fc-рецептором, связывание с белком А, фиксация комплемента и, вероятно, даже перенос через плаценту (Capon et al, 1989).
Фармакокинетический анализ in vivo, проведенный на мышах, показал, что человеческий FGF21 имеет короткое время полужизни, составляющее приблизительно от 0,5 до 1 часа, что обусловлено быстрым клиренсом и быстрым разложением in vivo. Поэтому, для увеличения времени полужизни FGF21, последовательность Fc была присоединена к N- или С-концу полипептида FGF21. Однако присоединение Fc-области к FGF21 дикого типа и, в частности,
присоединение Fc-области к N-концу FGF21 дикого типа, не приводило к увеличению времени полужизни, как и предполагалось, и поэтому были проведены исследования протеолитического расщепления FGF21 in vivo и были идентифицированы мутанты FGF21, которые являются резистентными к такому расщеплению.
В описании настоящего изобретения FC-FGF21 означает гибридный белок, в котором последовательность Fc присоединена к N-концу FGF21. Аналогичным образом, в описании настоящего изобретения FGF21-FC означает гибридный белок, в котором последовательность Fc присоединена к С-концу FGF21.
Полученный гибридный белок FGF21 может быть очищен, например, на аффинной колонке с белком А. Было обнаружено, что пептиды и белки, присоединенные к Fc-области, имеют, в основном, более продолжительное время полужизни in vivo, чем их несвязанный аналог. Кроме того, присоединение к Fc-области стимулирует димеризацию/мультимеризацию гибридного полипептида. Fc-областью может быть природная Fc-область, либо Fc-область, которая была модифицирована в целях улучшения некоторых свойств, таких как терапевтическое качество, время полужизни в кровотоке или пониженная агрегация.
Подходящие модификации белковых терапевтических средств, полученные путем их присоединения к "Гс"-домену антитела, подробно обсуждаются в публикации международной заявки № W0 00/024782, которая во всей своей полноте включена в настоящее описание посредством ссылки. В этом документе описано присоединение к "носителю", такому как полиэтиленгликоль (ПЭГ), декстран или Fc-область.
Ь. Линкеры гибридных белков
Для получения гибридных белков согласно изобретению может быть использован, но необязательно, линкер. Химическая структура линкера, если он используется, не имеет существенного значения, поскольку он служит, главным образом, в качестве спейсера. Линкер может состоять из аминокислот, связанных пептидными связями. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер состоит из 1-20 аминокислот, связанных пептидными связями, где аминокислоты выбраны из 2 0 природных
аминокислот. В различных вариантах осуществления изобретения указанные 1-20 аминокислот выбраны из таких аминокислот, как глицин, серии, аланин, пролин, аспарагин, глутамин и лизин. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер состоит из множества аминокислот, которые не являются стерически затрудненными, таких как глицин и аланин. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкерами являются полиглицины, полиаланины, комбинации глицина и аланина (такие как поли(61у-А1а) ) или комбинации глицина и серина (такие как поли(61у-Ser)). Хотя было обнаружено, что линкер, состоящий из 15 аминокислотных остатков, функционирует достаточно эффективно в отношении гибридных белков FGF21, однако, в настоящем изобретении рассматриваются и другие линкеры, имеющие любую длину или любой состав.
Описанные в данном описании линкеры приведены в качестве примера, и в настоящем изобретении рассматриваются гораздо более длинные линкеры, включающие другие остатки. В настоящем изобретении также рассматриваются непептидные линкеры. Так например, могут быть также использованы алкильные линкеры. Такие алкильные линкеры также могут быть заменены любыми стерически незатрудненными группами, включая, но, не ограничиваясь ими, низший алкил (например, С1-С6), низший ацил, галоген (например, CI, Br), CN, NH2 или фенил. Репрезентативным непептидным линкером является полиэтиленгликолевый линкер, который имеет молекулярную массу 100-5000 кД, например, 10 0-50 0 кД.
Химически модифицированные мутанты FGF21
Химически модифицированные формы вариантов белка FGF21, описанные в настоящем описании, включая описанные в данном описании усеченные формы FGF21, могут быть получены специалистом в данной области, исходя из настоящего описания. Такие химически модифицированные мутанты FGF21 были модифицированы так, чтобы химически модифицированный мутант FGF2 отличался от немодифицированного мутанта FGF21 либо по типу, либо по локализации молекул, которые по своей природе связаны с мутантом FGF21. Химически модифицированными мутантами
FGF21 могут быть молекулы, полученные путем делеции одной или более химических групп, являющихся связанными по своей природе.
В одном из вариантов осуществления изобретения варианты белка FGF21 согласно изобретению могут быть модифицированы посредством ковалентного связывания одного или более полимеров. Так например, выбранным полимером обычно является водорастворимый полимер, то есть, полимер, который, при присоединении к нему белка, не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. Подходящие полимеры также охватывают и смесь полимеров. Для терапевтического применения конечного препарата, предпочтительно, чтобы полимер был фармацевтически приемлемым. В этот аспект изобретения также входят не растворимые в воде полимеры, конъюгированные с вариантами белка FGF21 согласно изобретению.
Каждый из репрезентативных полимеров может иметь любую молекулярную массу, и каждый из них может быть разветвленным или неразветвленным. Каждый полимер обычно имеет среднюю молекулярную массу, составляющую приблизительно от 2 кДа до 100 кДа (термин "приблизительно" означает, что в препаратах водорастворимого полимера некоторые молекулы имеют более высокую или более низкую молекулярную массу по сравнению с исходной молекулярной массой). Средняя молекулярная масса каждого полимера, предпочтительно, составляет приблизительно от 5 кДа до 50 кДа, более предпочтительно, приблизительно от 12 кДа до 40 кДа, и наиболее предпочтительно, приблизительно от 20 кДа до 35 кДа.
Подходящими водорастворимыми полимерами или их смесями
являются, но не ограничиваются ими, N-связанные или О-связанные
углеводы, сахара, фосфаты, полиэтиленгликоль (ПЭГ) (включая
формы ПЭГ, которые были использованы для дериватизации белков,
включая моно-(С1-С10)-, алкокси- или
арилоксиполиэтиленгликоль), монометоксиполиэтиленгликоль,
декстран (такой как низкомолекулярный декстран размером, например, приблизительно б кД) , целлюлоза или другие полимеры на основе углеводов, поли(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые гомополимеры, сополимеры полипропиленоксида
и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например,
глицерин) и поливиниловый спирт. В настоящем изобретении также
рассматриваются бифункциональные перекрестно-связывающие
молекулы, которые могут быть использованы для получения ковалентно связанных мультимеров варианта белка FGF21. В настоящем изобретении также рассматриваются мутанты FGF21, ковалентно связанные с полисиаловой кислотой.
В некоторых вариантах настоящего изобретения мутант FGF21
был ковалентно или химически модифицирован так, чтобы он
содержал один или более водорастворимых полимеров, включая, но,
не ограничиваясь ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ),
полиоксиэтиленгликоль или пропиленгликоль. См., например,
патенты США 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 и
4179337. В некоторых вариантах настоящего изобретения мутант
FGF21 содержит один или более полимеров, включая, но, не
ограничиваясь ими, монометоксиполиэтиленгликоль, декстран,
целлюлозу, полимер на основе других углеводов, поли(N-
винилпирролидон)полиэтиленгликоль, пропиленгликолевые
гомополимеры, сополимеры полипропиленоксида и этиленоксида,
полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин),
поливиниловый спирт или смеси таких полимеров.
В некоторых вариантах осуществления изобретения мутант FGF21 ковалентно модифицирован субъединицами ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров связаны в одном или более конкретных положениях (например, у N-конца) мутанта FGF21. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров неспецифически связаны с одной или более боковыми цепями мутанта FGF21. В некоторых вариантах осуществления изобретения ПЭГ используется для улучшения терапевтического свойства мутанта FGF21. Некоторые из указанных методов обсуждаются, например, в патенте США 613342 6, который в любых целях включен в настоящее описание посредством ссылки.
В вариантах осуществления изобретения, в которых полимером является ПЭГ, группа ПЭГ может иметь любую стандартную молекулярную массу, и такая группа может быть прямой или
разветвленной. Средняя молекулярная масса группы ПЭГ,
предпочтительно, составляет в пределах приблизительно от 2 кДа
до 100 кДа, и более предпочтительно, приблизительно от 5 кДа до
50 кДа, например, 10, 20, 30, 40 или 50 кДа. Группы ПЭГ обычно
присоединяют к мутанту FGF21 путем ацилирования или
восстановительного алкилирования посредством
реакционноспособной группы на молекуле ПЭГ (например, альдегидной группы, аминогруппы, тиольной группы или сложноэфирной группы) реакционноспособной группы на мутанте FGF21 (например, альдегидной группы, аминогруппы или сложноэфирной группы).
Разветвленные ПЭГ-производные, также известные как
производные ПЭГ, имеющие "Y-образную" форму, содержат две
прямых метокси-ПЭГ-цепи, связанных с центральной коровой
областью. Стерически затрудненная структура таких ПЭГ-
производных, имеющих "Y-образную" форму, облегчает
присоединение модифицированных молекул в одном положении. Так
например, существует три вида ПЭГ-производных, имеющих "Y-
образную" форму, а именно, производное Y-NHS-40K (используемое
для ПЭГилирования амина); производное Y-MAL-40K (используемое
для ПЭГилирования тиола); и производное Y-ALD-4 0K (например, Y-
AALD-4 0K и Y-PALD-4 0K)(используемое для ПЭГилирования у N-
конца). Для ПЭГилирования амина, NHS-эфир, имеющий "Y-образную"
форму, подвергают взаимодействию с аминогруппой лизина(ов) или
с N-концевым амином в биологически активных молекулах с
получением стабильной(ых) амидной(ых) связи(ей). Этот NHS-эфир
связывается с нацеливающими молекулами при рН 7-8. Для
ПЭГилирования тиола, малеимид, имеющий "Y-образную" форму,
подвергают взаимодействию с тиольными группами в биологически
активных молекулах с получением стабильной 3-
тиосукцинимидилэфирной связи. Данный малеимид связывается с нацеливающими молекулами при рН 5,0-6,5, в присутствии других функциональных групп. Для N-концевого ПЭГилирования, альдегид, имеющий "Y-образную" форму, предпочтительно, подвергают взаимодействию с N-концевым амином в биологически активных молекулах с получением стабильной аминной связи в присутствии
восстановителя, такого как цианоборогидрид натрия. Данный альдегид связывается с N-концевым амином нацеливающих молекул при рН 5-8. Реагенты для разветвленного ПЭГилирования доступны, например, от JenKem Technology.
ПЭГилирование полипептида, включая мутанты FGF21 согласно
изобретению, может быть, в частности, осуществлено путем
проведения любых реакций ПЭГилирования, известных в данной
области. Такие реакции описаны, например, в нижеследующих
работах: Francis et al., 1992, Focus on Growth Factors 3: 4-10;
в Европейских патентах 0154316 и 0401384; и в патенте США
4179337. Так например, ПЭГилирование может быть осуществлено
путем проведения реакции ацилирования или реакции алкилирования
с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля (или с
аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером), как
описано в настоящем описании. Для проведения реакций
ацилирования, выбранный полимер должен иметь одну
реакционноспособную сложноэфирную группу. Для проведения
восстановительного алкилирования, выбранный полимер должен
иметь одну реакционноспособную альдегидную группу.
Реакционноспособным альдегидом является, например,
пропиональдегид полиэтиленгликоля, который является стабильным в воде, или его моно-С1-С10-алкокси- или арилокси-производные (см., например, патент США 5252714).
В некоторых вариантах осуществления изобретения подходящей стратегией присоединения группы ПЭГ к полипептиду является объединение пептида и группы ПЭГ посредством образования сопряженной связи в растворе, где каждая из этих групп имеет специальные функциональные группы, которые взаимодействуют друг с другом. Пептиды могут быть легко получены стандартным методом твердофазного синтеза. Такие пептиды "предварительно активируют" соответствующей функциональной группой в конкретном сайте. Затем эти предшественники подвергают очистке и полной характеризации, и затем взаимодействию с группой ПЭГ. Присоединение пептида к ПЭГ обычно происходит в водной фазе, и его мониторинг может быть легко осуществлен с помощью аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой. ПЭГилированные пептиды
могут быть легко очищены с помощью препаративной ВЭЖХ и охарактеризованы с помощью аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и масс-спектрометрии методом лазерной десорбции.
Другими типами водорастворимых полимеров, которые могут
быть использованы для модификации белков, являются
полисахаридные полимеры. Поэтому, в одном из своих вариантов
осуществления настоящее изобретение относится к мутантам FGF21
согласно изобретению, присоединенным к полисахаридному
полимеру. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры,
состоящие из отдельных субъединиц глюкозы, связанных
преимущественно альфа-1-б-связями. Сам декстран поставляется в
различных молекулярных массах, но обычно его молекулярные массы
составляют приблизительно от 1 кД до 7 0 кД. Декстран
представляет собой подходящий водорастворимый полимер, который
может быть использован в виде отдельно взятого носителя или в
виде комбинации с другим носителем (например, Fc) . См.,
например, публикацию Международной заявки No. WO 96/11953. В
литературе сообщалось об использовании декстрана,
конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами. См., например, публикацию Европейского патента 0315456, которая включена в настоящее описание посредством ссылки. Настоящее изобретение также охватывает использование декстрана, имеющего молекулярную массу приблизительно от 1 кД до 2 0 кД.
Как правило, химическая модификация может быть
осуществлена в любых условиях, подходящих для проведения
взаимодействия белка с активированной полимерной молекулой.
Способы получения химически модифицированных полипептидов
обычно включают стадии: (а) взаимодействия полипептида с
активированной полимерной молекулой (такой как
реакционноспособный сложный эфир или альдегидное производное полимерной молекулы) в условиях, при которых вариант белка FGF21 может присоединяться к одной или более полимерным молекулам, и (Ь) получения продуктов реакции. Оптимальные условия проведения реакции могут быть определены с учетом известных параметров и желаемого результата. Так, например, чем
выше отношение "полимерные молекулы:белок", тем выше процент присоединенной полимерной молекулы. В одном из вариантов настоящего изобретения химически модифицированные мутанты FGF21 могут иметь одну полимерную молекулу у амино-конца (см., например, патент США 5234784) .
В другом варианте настоящего изобретения варианты белка
FGF21 могут быть химически связаны с биотином. Затем
биотин/варианты белка FGF21 подвергают связыванию с авидином, в
результате чего получают четырехвалентную смесь
авидина/биотина/вариантов белка FGF21. Варианты белка FGF21 могут быть также ковалентно связаны с динитрофенолом (DNP) или с тринитрофенолом (TNP), и полученные конъюгаты осаждают анти-DNP- или анти-TNP-IgM с образованием декамерных конъюгатов с валентностью 10.
Обычно, условия, которые могут быть скорректированы или изменены путем введения химически модифицированных мутантов FGF21 согласно изобретению, описаны в настоящем описании для вариантов белка FGF21. Однако химически модифицированные мутанты FGF21, описанные в настоящем описании, могут обладать дополнительными активностями, такими как повышенная или пониженная биологическая активность, или другими свойствами, такими как более длительное или более короткое время полужизни по сравнению со временем полужизни немодифицированных мутантов FGF21.
Терапевтические композиции мутантов FGF21 и их введение
Терапевтические композиции, содержащие мутанты FGF21,
входят в объем настоящего изобретения и конкретно
рассматриваются с точки зрения идентификации
последовательностей нескольких мутантов FGF21, обладающих улучшенными свойствами. Такие фармацевтические композиции, содержащие мутанты FGF21, могут включать терапевтически эффективное количество варианта белка FGF21 в смеси с фармацевтически или физиологически приемлемой технологической добавкой, выбранной в соответствии с подходящим способом введения.
Приемлемые средства для составления композиций,
предпочтительно, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях.
Фармацевтическая композиция может содержать средства для составления композиций для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмомолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости диссоциации или высвобождения, адсорбции или пенетрации композиции. Подходящими средствами для составления композиций являются, но не ограничиваются ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные средства, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфат натрия или бисульфит натрия), буферы (такие как борат, бикарбонат, трис-HCl, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты), агенты, придающие объем
(такие как маннит или глицин), хелатообразующие агенты (такие
как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) ) ,
комплексообразующие агенты (такие как кофеин,
поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-
бета-циклодекстрин), наполнители, моносахариды, дисахариды и
другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины),
белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или
иммуноглобулины), красители, отдушки и разбавители,
эмульгирующие агенты, гидрофильные полимеры (такие как
поливинилпирролидон), низкомолекулярные полипептиды,
солеобразующие противоионы (такие как натрий), консерванты
(такие как бензалконийхлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимерозал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), спирты ряда Сахаров (такие как маннит или сорбит), суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества или смачивающие агенты (такие как плюроники, ПЭГ, сложные эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 2 0 или полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин или тилоксапал), агенты, повышающие стабильность (такие как сахароза или сорбит), агенты, придающие тоничность (такие как
галогениды щелочных металлов, и предпочтительно, хлорид натрия или калия, или маннит или сорбит), носители для доставки, разбавители, эксципиенты и/или фармацевтические адъюванты (см., например, руководство Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) и его последующие издания, которые в любых целях включены в настоящее описание посредством ссылки).
Оптимальный состав фармацевтической композиции может быть определен специалистом в данной области в зависимости, например, от предполагаемого способа введения, формы доставки и желаемой дозы (см., например, руководство Remington's Pharmaceutical Sciences, см. выше). Состав такой композиции может влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость in vivo клиренса варианта белка FGF21.
В основном, наполнитель или носитель в фармацевтической композиции может быть, по своей природе, водным или безводным. Так например, подходящими наполнителями или носителями для инъекций могут быть вода, физиологический раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, в которую могут быть добавлены и другие вещества, обычно используемые в композициях для парентерального введения. Дополнительными примерами носителей являются нейтрально забуференные физиологические растворы или физиологические растворы, смешанные с сывороточным альбумином. Другие примеры фармацевтических композиций содержат трис-буфер, имеющий рН приблизительно 7,0-8,5, или ацетатный буфер, имеющий рН приблизительно 4,0-5,5, и такие композиции могут также включать сорбит или его подходящий заменитель. В одном из вариантов осуществления изобретения композиции варианта белка FGF21 могут быть получены для последующего хранения путем смешивания выбранной композиции, имеющей нужную степень чистоты, с необязательными средствами для составления композиций (Remington's Pharmaceutical Sciences, см. выше), которые могут присутствовать в форме лиофилизованного осадка или водного раствора. Кроме того, продукт варианта белка FGF21 может быть приготовлен в виде лиофилизата с использованием
соответствующих эксципиентов, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции варианта белка FGF21 могут быть выбраны для парентерального введения. Альтернативно, такие композиции могут быть выбраны для введения путем ингаляции или для доставки через желудочно-кишечный тракт, например, путем перорального введения. Получение таких фармацевтически приемлемых композиций входит в объем настоящего изобретения.
Средства для составления композиций должны присутствовать в концентрациях, которые являются приемлемыми для данного участка введения. Так например, буферы используют в композициях для поддержания физиологического рН или слегка более низкого рН, обычно рН в пределах приблизительно от 5 до 8.
Для парентерального введения, терапевтические композиции,
используемые в настоящем изобретении, могут быть в форме
апирогенного парентерально приемлемого водного раствора,
содержащего нужный вариант белка FGF21 в фармацевтически
приемлемом носителе. Особенно предпочтительным носителем для
парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная
вода, в которой вариант белка FGF21 приготовлен в виде
стерильного изотонического раствора с соответствующими
консервантами. Другой препарат может включать композицию нужной
молекулы с таким агентом, как инъецируемые микросферы,
биологически разлагаемые частицы, полимерные соединения (такие
как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), сферы или
липосомы, которые обеспечивают регулируемое или
пролонгированное высвобождение продукта, который может быть доставлен посредством депо-инъекции. Может быть также использована гиалуроновая кислота, которая может увеличивать время пребывания лекарственного средства в кровотоке. Другими подходящими средствами для введения нужной молекулы являются имплантируемые приспособления для доставки лекарственных средств.
В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция может быть приготовлена для ингаляции. Так например, вариант белка FGF21 может быть приготовлен в виде сухого порошка для ингаляции. Растворы
варианта белка FGF21 для ингаляции могут быть также приготовлены с использованием пропеллента для аэрозольной доставки. В еще одном варианте изобретения растворы могут быть приготовлены в виде спрея. Введение в легкие подробно описано в публикации Международной заявки No. WO 94/20069, в которой рассматривается доставка химически модифицированных белков в легкие.
Также рассматривается пероральное введение некоторых препаратов. В одном из вариантов осуществления изобретения варианты белка FGF21, которые вводят таким способом, могут быть приготовлены в отсутствии или в присутствии носителей, которые обычно используются для получения твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. Так, например, капсула может быть предназначена для высвобождения активной части препарата в таком участке желудочно-кишечного тракта, в котором биологическая доступность является максимальной, и преждевременное (до поступления в кровоток) разложение является минимальным. Для облегчения адсорбции варианта белка FGF21 могут быть введены дополнительные агенты. При этом, могут быть также использованы разбавители, отдушки, воски с низкой температурой плавления, растительные масла, лубриканты, суспендирующие агенты, агенты для дезинтеграции таблеток и связующие агенты.
Другая фармацевтическая композиция может включать эффективное количество вариантов белка FGF21 в смеси с нетоксичными эксципиентами, подходящими для получения таблеток. Растворы могут быть приготовлены в виде единичной лекарственной формы путем растворения таблеток в стерильной воде или в другом подходящем разбавителе. Подходящими эксципиентами являются, но не ограничиваются ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция, или связующие агенты, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь, или лубриканты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Специалистам в данной области известны и другие фармацевтические композиции варианта белка FGF21, включая
композиции, содержащие варианты белка FGF21, в виде препаратов
с пролонгированной или регулируемой доставкой лекарственного
средства. Способы получения ряда других препаратов с
пролонгированной или регулируемой доставкой лекарственного
средства, таких как липосомы, биологически разлагаемые
микрочастицы или пористые сферы и депо-инъекции, также известны
специалистам в данной области (см., например, публикацию
Международной заявки No. WO 93/15722, в которой описано
регулируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для
доставки фармацевтических композиций, и публикации Wischke &
Schwendeman, 2008, Int. J. Pharm. 364: 298-327, и Freiberg &
Zhu, 2004, Int. J. Pharm. 282: 1-18, в которых обсуждается
получение и применение препаратов в виде
микросфер/микрочастиц).
Дополнительными примерами препаратов с пролонгированным высвобождением являются полупроницаемые полимерные матрицы в виде сформованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Матрицами с пролонгированным высвобождением могут быть полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США 3773919 и Европейский патент 0058481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ъ-глутамата (Sidman et al. , 1983, Biopolymers 22: 547-56), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Langer et al, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 и Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Langer et al. , см. выше) или поли-D-3-гидроксимасляная кислота (Европейский патент 0133988). Композициями с пролонгированным высвобождением могут быть также липосомы, которые могут быть получены любыми способами, известными в данной области. См., например, Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-92; и Европейские патенты 0036676, 0088046 и 0143949.
Фармацевтическая композиция варианта белка FGF21, используемая для введения in vivo, должна быть стерильной. Это может быть достигнуто путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Если композиция является лиофилизованной, то стерилизация, проводимая этим методом, может быть осуществлена до или после лиофилизации и разведения. Композиция
для парентерального введения может храниться в лиофилизованной форме или в форме раствора. Кроме того, композиции для парентерального введения обычно помещают в контейнер, имеющий стерильное входное устройство, например, в пакет или в сосуд, предназначенный для хранения раствора для внутривенного введения и имеющий пробку, протыкаемую иглой для подкожных инъекций.
Фармацевтическую композицию, после ее приготовления, можно хранить в стерильных сосудах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизованного порошка. Такие препараты могут храниться либо в форме, готовой для применения, либо в форме (например, лиофилизованной), которую необходимо разводить перед введением.
В своем конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к наборам для приготовления разовой единичной дозы. Каждый из этих наборов может включать первый контейнер, содержащий осушенный белок, и второй контейнер, содержащий водный препарат. В объем настоящего изобретения также входят наборы, содержащие однокамерные и многокамерные предварительно заполняемые шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).
Эффективное количество фармацевтической композиции варианта белка FGF21, применяемой в терапии, зависит, например, от цели и методов терапии. Специалистам в данной области известно, что соответствующие уровни доз, применяемых для лечения, могут варьироваться частично в зависимости от типа доставляемой молекулы; заболевания, при котором показано использование варианта белка FGF21; способа введения, телосложения (массы тела, площади поверхности тела или размера органа) и индивидуальных особенностей (возраста и общего состояния здоровья) пациента. В соответствии с этим, врач-клиницист может подобрать дозу и изменить способ введения для достижения оптимального терапевтического эффекта. Конкретная доза может составлять в пределах приблизительно от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от приведенных выше факторов. В другом варианте осуществления изобретения доза
может составлять в пределах от 0,1 мкг/кг и приблизительно до 100 мкг/кг; или от 1 мкг/кг и приблизительно до 100 мкг/кг; или от 5 мкг /кг, 10 мкг /кг, 15 мкг /кг, 20 мкг/кг, 25 мкг/кг, 30 мкг/кг, 35 мкг/кг, 40 мкг/кг, 45 мкг/кг, 50 мкг/кг, 55 мкг/кг, 60 мкг/кг, 65 мкг/кг, 70 мкг/кг, 75 мкг/кг и приблизительно до 100 мг/кг. В другом варианте осуществления изобретения доза может составлять 50 мкг/кг, 100 мкг/кг, 150 мкг/кг, 200 мкг/кг, 250 мкг/кг, 300 мкг/кг, 350 мкг/кг, 400 мкг/кг, 450 мкг/кг, 500 мкг/кг, 550 мкг/кг, 600 мкг/кг, 650 мкг/кг, 700 мкг/кг, 750 мкг/кг, 800 мкг/кг, 850 мкг/кг, 900 мкг/кг, 950 мкг/кг, 100 мкг/кг, 200 мкг/кг, 300 мкг/кг, 400 мкг/кг, 500 мкг/кг, 600 мкг/кг, 700 мкг/кг, 800 мкг/кг, 900 мкг/кг, 1000 мкг/кг, 2000 мкг/кг, 3000 мкг/кг, 4000 мкг/кг, 5000 мкг/кг, 6000 мкг/кг, 7 000 мкг/кг, 8 000 мкг/кг, 90 0 0 мкг/кг или 10 мг/кг.
Частота введения дозы зависит от фармакокинетических параметров варианта белка FGF21 в используемом препарате. Обычно, врач-клиницист может вводить композицию в соответствующей дозе до тех пор, пока не будет достигнут желаемый эффект. Поэтому, данная композиция может быть введена в виде разовой дозы, в виде двух или более доз (которые могут содержать, а могут и не содержать одинаковые количества нужной молекулы) в течение определенного периода времени, или в виде непрерывного вливания с помощью устройства для имплантации или катетера. Дальнейшее уточнение соответствующей дозы может быть рутинно осуществлено средним специалистом в данной области и обычно входит в его обязанности. Соответствующие дозы могут быть определены с использованием данных о соответствующей зависимости "доза-ответ".
Пути введения фармацевтической композиции могут
соответствовать известным способам, например, пероральному,
путем внутривенной, внутрибрюшинной, интрацеребральной (в
паренхиму), интрацеребровентрикулярной, внутримышечной,
внутриглазной или внутриартериальной инъекции, инъекции в воротную вену или путем введения в область поражения; введения с помощью систем пролонгированного высвобождения (которые могут быть также введены путем инъекции); или введения с помощью
устройства для имплантации. Если это необходимо, то композиции могут быть введены путем инъекции ударной дозы или непрерывного вливания, либо с помощью устройства для имплантации.
Альтернативно или дополнительно, указанная композиция может быть введена местно путем имплантации мембраны, губки или другого соответствующего материала, на которых может абсорбироваться или в которых может быть инкапсулирована нужная молекула. В случае использования устройства для имплантации, такое устройство может быть имплантировано в любую подходящую ткань или в любой подходящий орган, и доставка нужной молекулы может быть осуществлена посредством диффузии, с использованием болюса с пролонгированным высвобождением, или путем непрерывного введения.
Терапевтическое применение мутантов полипептида FGF21
Варианты белка FGF21 могут быть использованы для лечения,
диагностики, ослабления симптомов или предупреждения ряда
заболеваний, расстройств или состояний, включая, но, не
ограничиваясь ими, метаболические расстройства. В одном из
вариантов осуществления изобретения, метаболическим
расстройством, подвергаемым лечению, является диабет, например,
сахарный диабет типа 2. В другом варианте изобретения указанным
метаболическим расстройством является ожирение. Другие варианты
осуществления включают метаболические состояния или
расстройства, такие как сахарный диабет типа 1, панкреатит,
дислипидемия, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ),
инсулинорезистентность, гиперинсулинемия, непереносимость глюкозы, гипергликемия, метаболический синдром, гипертензия, сердечно-сосудистое заболевание, атеросклероз, заболевание периферических артерий, инсульт, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, заболевание почек, осложнения при диабете, невропатия, гастропарез и другие метаболические расстройства.
Как описано в настоящем описании, расстройство или состояние, такое как сахарный диабет типа 1 или типа 2, или ожирение, могут быть подвергнуты лечению путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, варианта белка FGF21, описанного
в настоящем описании, в терапевтически эффективной дозе. Такое введение может быть осуществлено, как описано в настоящем описании, например, путем внутривенной (i.v.) инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутримышечной инъекции или перорально в форме таблетки или жидкого препарата. В большинстве случаев, желаемая доза может быть определена врачом-клиницистом, как описано в настоящем описании, и такая доза может представлять собой терапевтически эффективную дозу мутантного полипептида FGF21. Следует отметить, что терапевтически эффективная доза мутантного полипептида FGF21 зависит, inter alia, от схемы введения и единичной дозы вводимого антигена, где молекулу нуклеиновой кислоты или полипептида вводят в комбинации с другими терапевтическими средствами, а также от иммунного статуса и состояния здоровья реципиента. Используемый в данном описании термин "терапевтически эффективная доза" означает количество мутантного полипептида FGF21, которое продуцирует биологический или терапевтический ответ в тканевой системе животного или человека, и такая доза может быть определена исследователем, практическим врачом или другим врачом-клиницистом и введена в целях ослабления симптомов заболевания или расстройства, подвергаемого лечению.
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим один или более описанных в данном описании вариантов или мутантов FGF21, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции могут быть получены в виде инъекций, жидких растворов или суспензий и твердых форм, подходящих для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. В определение фармацевтически приемлемого носителя также входят липосомы. В фармацевтической композиции могут также присутствовать фармацевтически приемлемые соли, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты,
бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых эксципиентов приведено в руководстве Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkins.
Гибридые белки и пептидные соединения, происходящие от
FGF21
В другом варианте осуществления изобретения варианты FGF21 согласно изобретению могут быть получены в виде гибридного белка или пептидного соединения, происходящего от аминокислотных последовательностей вариантов FGF21. Такие гибридые белки и пептидные соединения могут быть получены стандартными способами, известными в данной области. Так например, пептидные соединения могут быть получены путем химического синтеза, проводимого стандартными методами пептидного синтеза, и затем они могут быть введены в клетки различными способами, известными специалистам в области введения пептидов в клетки (например, в липосомы и т.п.).
Время полужизни in vivo гибридного белка или пептидных соединений согласно изобретению может быть увеличено посредством пептидных модификаций, таких как добавление сайтов N-связанного гликозилирования в варианты FGF21, или конъюгирование вариантов FGF21 с полиэтиленгликолем (ПЭГ) (ПЭГилирование), например, посредством моно-ПЭГилирования по лизину или моно-ПЭГилирования по цистеину. Было подтверждено, что такие методы позволяют увеличивать время полужизни терапевтических белковых лекарственных средств. Как и ожидалось, ПЭГилирование вариантов FGF21 согласно изобретению может давать аналогичные фармацевтические преимущества.
Кроме того, ПЭГилирование может быть осуществлено в любой части полипептида согласно изобретению путем введения неприродной аминокислоты. Некоторые неприродные аминокислоты могут быть введены методом, описанным в публикациях Deiters et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783, 2003; Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang et al. , Science 292:498-500, 2001; Zhang et al., Science 303:371-373, 2004, или в патенте США 7083970. Кратко, некоторые из этих экспрессионных
систем включают сайт-направленный мутагенез для введения "нонсенс"-кодона, такого как "амбер"-кодон TAG, в открытую рамку считывания, кодирующую полипептид согласно изобретению. Затем такие экспрессионные векторы вводят хозяину, в котором может использоваться тРНК, специфичная к введенному нонсенс-кодону и связывающаяся с выбранной неприродной аминокислотой. Конкретными неприродными аминокислотами, которые являются предпочтительными для конъюгирования молекул с полипептидами согласно изобретению, являются аминокислоты с ацетиленовыми и азидными боковыми цепями. Варианты FGF21, содержащие эти новые аминокислоты, могут быть затем ПЭГилированы в этих выбранных сайтах белка.
Примеры
Пример 1: Получение и ПЭГилирование вариантов белков FGF21 Экспрессионные конструкции для вариантов FGF21: Варианты FGF21 клонировали в модифицированный экспрессионный вектор рЕТЗОа Е. coli, описанный Achmuller et al. (2007) (Nature Methods 4: 1037-1043), с получением гибридых белков с сохранением рамки считывания и с гексагистидиновой меткой, за которой следует Npro-EDDIE-MeTKa у N-конца FGF21 (а.к.33-209).
Экспрессия и очистка вариантов FGF21: Экспрессионную плазмиду pET30a-His-Npro-EDDIE-FGF21 переносили в компентентные клетки Е. coli BL21 Star (DE3) (Invitrogen) . Культивирование моноколоний свежетрансформированных клеток в течение ночи осуществляли в 50 мл бульона Terrific (ТВ), содержащего 50 мкг/мл канамицина, при 37°С. Прекультуру переносили в 1 л среды ТВ с канамицином и культивировали в колбах с перегородками при 37°С при встряхивании при 250 об/мин. После культивирования в течение б часов, экспрессию FGF21 индуцировали путем добавления IPTG в конечной концентрации 1 мМ, и эти культуры выращивали в течение ночи при 37°С. Затем клетки собирали и ресуспендировали в 50 мл охлажденного льдом буфера для лизиса; 50 мМ трис-НС1, рН 8, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, с последующим лизированием на микрофлюидизаторе(tm).
Тельца включения (ТВ) осаждали центрифугированием при
ЗООООхд в течение 1 часа при 4°С. ТВ промывали 50 мМ трис-НС1, рН 8, 150 мМ NaCl, и затем растворяли в 30 мл буфера для растворения; 10 мМ трис-HCl, рН 8, 100 мМ NaH2P04, 6М GnHCl. Растворенные ТВ осветляли путем центрифугирования при ЗООООхд в
течение 1 часа при 25°С. Раствор ТВ загружали на высокоразрешающую 5 мл-колонку со смолой Ni-NTA (GE Healthcare), уравновешенную буфером для растворения. Белки, связанные со смолой, элюировались при снижении рН до 4,5. Элюат кондиционировали регулированием рН и добавлением дитиотреитола (DTT) в концентрации 2 0 мМ. Кондиционированный элюат медленно разводили в 1 л буфера для рефолдинга; 50 мМ трис-HCl, рН 8, 0,5М аргинина, 20 мМ DTT, с последующим инкубированием в течение 2 дней при 4°С. Разведенный образец концентрировали, и затем буфер заменяли на 2 0 мМ трис-HCl, рН 9 с использованием ультрафильтрации. Концентрированный образец загружали на 10 мл-колонку с Q-сефарозой - смолой Fast Flow (GE Healthcare), уравновешенную 2 0 мМ трис-HCl (рН 9).
После промывки смолы уравновешивающим буфером, белки, связанные со смолой, элюировали 20 мМ трис-HCl, рН 9, 500 мМ NaCl. Для удаления отщепленного Н1э-^го-гибридного фрагмента и любого неотщепленного гибридного белка от белка FGF21, подвергнутого рефолдингу, элюат загружали на высокоразрешающую 5 мл-колонку со смолой Ni-NTA, уравновешенную 2 0 мМ трис, рН 8,0, 50 мМ имидазола, и проточную фракцию, содержащую FGF21, собирали. Для снижения уровней эндотоксина, фракцию FGF21 обрабатывали смолой EndoTrap HD (Hyglos), уравновешенной 10 мМ триса, рН 8, 50 мМ имидазола, 500 мМ NaCl, 1 мМ СаС1г- Образец с низким уровнем эндотиоксина диализировали против PBS, с последующей стерилизацией на 0,22 мкм-фильтре. Очищенный белок FGF21 быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -8 0°С. Концентрацию белка определяли по оптической плотности на 280 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции для FGF21, который составлял 93 62 М_1-см-1. Чистоту и целостность белка определяли с использованием ВЭЖХ, электрофореза в ДСН-ПААГ и жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии.
ПЭГилирование вариантов FGF21 по цистеину: Варианты hsFGF21 (R154C) имеют тенденцию к димеризации благодаря введенному цистеину, поэтому, перед ПЭГилированием, раствор белка (обычно 5 мг/мл в трис-буфере) подвергали слабому восстановлению 5 мМ меркаптоэтиламина в течение 3 0 минут на льду, с последующим обессоливанием в 20 мМ триса, рН 7. Затем свежий восстановленный белок (обычно 3 мг/мл) сразу ПЭГилировали 1,5 эквивалента разветвленного малеимидо-ПЭГ-реагента размером 40 кДа (NOF, номер по каталогу # GL2-400MA серии Sunbright) в течение 3 часов на льду. И наконец, ПЭГилированный белок очищали анионообменной хроматографией (MonoQ) с общим выходом приблизительно 25%.
N-концевое ПЭГилирование вариантов FGF21: Конечная концентрация варианта FGF21 и разветвленного ПЭГ-реагента размером 40 кДа (NOF, номер по каталогу # GL2-400AL3 серии Sunbright, молярное отношение к FGF21 равно 3:1) составляла 3-4 мг/мл и 9-12 мг/мл, соответственно. Буфер представляет собой 50 мМ ацетата натрия, рН 6,0, 25 мМ хлорида натрия и 40 мМ цианоборогидрида натрия. Реакционные смеси осторожно взбалтывали при 4°С в течение 4 4 часов, и проводили мониторинг реакции преобразования через определенные промежутки времени. Через 20 часов, преобразование приблизительно составляло 50%, и через 44 часа - 70%. Пример 2: Получение дисульфидных вариантов человеческого FGF21
Библиотека для клонирования: Вектор pGAPZalphaA (Invitrogen, Carlsbad, СА) модифицировали путем добавления экспрессионного кластера р-лактамазы в уникальный BamHI-сайт вектора. Экспрессионный кластер р-лактамазы получали, как описано Hribar, et al. (2008) BioTechniques 44:477-84. кДНК человеческого FGF21, кодирующую аминокислоты 33-209, клонировали в модифицированный вектор pGAPZalphaA за промотором глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAP) в одной рамке считывания с N-концевыми последовательностями, включая секреторную сигнальную последовательность фактора скрещивания альфа, аффинную метку для очистки, состоящую из шести
гистидинов, и последовательность распознавания протеазы вируса табачной гравировки (TEV). Получали библиотеку конструкций hFGF21, которая содержала каждую из конструкций, имеющих Cysl03 и Cysl21, которые присутствовали в последовательности дикого типа, а также две аминокислоты дикого типа, которые были заменены цистеинами. Данную библиотеку создавали путем генерирования кодирующей области для ПЦР-фрагментов hFGF21 из аминокислот 33-209 вместе с праймерами, которые кодировали цистеин вместо аминокислоты дикого типа. ПЦР-фрагменты конструировали так, чтобы они имели шестнадцать общих пар оснований с идентичными последовательностями, либо конструировали линеаризованный модифицированный вектор pGAPZalphaA путем присоединения с использованием фермента 1п-Fusion (Takara Bio Со USA) . Последовательность каждой конструкции подтверждали перед ее использованием для получения дрожжевых штаммов.
Продуцирование дрожжевых штаммов: Дрожжевой штамм SMD1168H Pichia pastoris (Invitrogen) модифицировали путем разрыва гена YPS1, как описано Yao et al (2009) J. Biotechnol. Jan 15; 139(2): 131-6. Модифицированный штамм (SMD1 168H дельта YPS1) обладал резистентностью к 300 мкг/мл бластицидина. Приблизительно 5-10 мкг плазмидной ДНК с подтвержденной последовательностью гидролизовали ферментом Avr II и смешивали с клетками SMD1 168Н дельта YPS1, которые получали согласно руководству Invitrogen для pGAPZa-A. Клетки смешивали с линеаризованной плазмидой в 0,2 см-кювете (Bio-Rad, Hercules, СА). Кювету с клетками и линеаризованной плазмидой инкубировали на льду в течение 5 минут. На кювету подавали импульсы с использованием импульсного генератора Gene Pulser-II (Bio-Rad) с напряжением, установленным на 1,5 кВ, и емкостью, установленной на 25 мкФ, и с регулятором импульсов, установленным на 4 00 Ом.
Сразу после подачи импульсов, в кювету добавляли 1 мл охлажденного льдом 1М сорбита, и содержимое кюветы переносили в стерильную 15 мл-пробирку. Пробирку инкубировали при 3 0°С в
течение 2 часов без встряхивания. Клетки, подвергнутые электропорации, высевали на планшеты с YPDS (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% декстроза, 1М сорбит и 2% агар), содержащие 100 мкг/мл зеоцина (zeo). Затем планшеты инкубировали в течение 3-10 дней при 30°С до образования колоний. Затем объединяли 2 4 колонии от каждой конструкции, и эти колонии использовали для инокуляции 1 мл среды для культивирования YPD, содержащей 100 мкг/мл зеоцина, в 96-луночном планшете с глубокими лунками. Планшет инкубировали в течение ночи при 30°С в шейкере (Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR) при 900 об/мин. 10 мкл-аликвоту каждой культуры удаляли и разводили в 990 мкл PBS (рН 7,4) в 9б-луночном планшете с глубокими лунками.
Для колориметрической оценки р-лактамазной активности, 50 мкл культуры, разведенной 1:100, переносили в 9б-луночный микротитрационный планшет. Нитроцефин (1 мг; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) растворяли в 100 мкл ДМСО и разводили в 1,9 мл PBS с получением рабочего раствора в концентрации 1 мМ. Затем в каждую лунку добавляли рабочий раствор нитроцефина (50 мкл) до конечной концентрации 500 мкМ. После добавления нитроцефина, планшет инкубировали при комнатной температуре (к.т.) в темноте в течение 5 минут. Оптическую плотность на 4 92 нм измеряли на микротитрационном планшет-ридере Spectramax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) для определения р-лактамазной активности. Затем получали глицериновые маточные растворы для двух штаммов с наивысшей р-лактамазной активностью для каждой
конструкции, и маточные растворы хранили при -8 0°С.
Экспрессия и очистка дисульфидных вариантов hFGF21 в малом масштабе: Глицериновые маточные растворы дисульфидного варианта hFGF21 от двух штаммов с наивысшей удельной р-лактамазной активностью для каждой конструкции использовали для инокуляции 1 мл забуференной глюкозной среды различного состава (содержащей 1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 100 мМ фосфата калия, рН 6,0, 1,34% YNB, 4x10-5% биотина, 2% глюкозы и 2% казаминокислот) в 9б-луночных планшетах с глубокими лунками.
Культуры выращивали при 3 0°С при встряхивании при 90 0 об/мин.
(Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR) приблизительно в течение 48 часов до тех пор, пока рост клеток не достигал своего насыщения. Аликвоту насыщенной культуры (25 мкл) использовали для инокуляции 5 мл забуференной глюкозной среды различного состава в 24-луночных планшетах с глубокими лунками. Планшеты инкубировали в течение ночи при 3 0°С в шейкере (Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR) при 350 об/мин. Приблизительно через 24 часа, планшеты центрифугировали при 2500хд в течение 15 минут. Затем среду отсасывали из осажденных клеток и добавляли в центрифужное фильтрующее устройство Amicon ultra-15
(Millipore, Billerica, MA) , снабженное мембраной с отсечкой молекулярной массы 10 кДа. В среду, содержащуюся в концентраторе, добавляли 10 мл PBS, рН 7,4, содержащего 10 мМ имидазола и IX коктейля ингибиторов протеазы Halt, не содержащего EDTA (Thermo, Rockford, IL) , до общего объема 15 мл.
Фильтрующее устройство центрифугировали при 4000 об/мин. в центрифуге Sorvall Legend RT Plus (Thermo) в течение 30 минут. Проточную жидкость, выходящую с концентратора, отбрасывали, и в концентрированную среду добавляли приблизительно 13 мл PBS, рН 7,4. Фильтрующее устройство снова центрифугировали при 4000 об/мин. в течение 3 0 минут. Концентрированный образец для буферного обмена загружали в центрифужную колонку, содержащую никель-нитрилотриуксусную кислоту (Ni-NTA) (Qiagen, Valencia, СА). Колонку центрифугировали при 270хд (1600 об/мин.) в центрифуге Sorvall Legend Micro 21R (Thermo) в течение 5 минут, и затем два раза промывали 600 мкл PBS, рН 7,4, содержащего 10 мМ имидазола. б-Н1э-меченные варианты hFGF21 элюировали 200 мкл PBS, рН 7,4, содержащего 300 мМ имидазола.
Экспрессия и очистка дисульфидных вариантов hFGF21 в среднем масштабе: Глицериновые маточные растворы дисульфидного варианта hFGF21 от штаммов, экспрессирующих дисульфидные варианты hFGF21 с наивысшей активностью, как было обнаружено при тестировании в клеточном анализе на pERK в двух
концентрациях (10 и 100 нМ) , использовали для инокуляции 5 мл забуференной глюкозной среды различного состава (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 100 мМ фосфата калия, рН 6,0, 1,34% YNB, 4x10-5% биотина, 2% глюкозы, и 2% казаминокислот), содержащей 100 мкг/мл зеоцина, в стерильной 50 мл-пробирке. Культуры выращивали при 3 0°С при встряхивании 2 50 об/мин в течение приблизительно 4 8 часов до тех пор, пока рост клеток не достигал своего насыщения. Аликвоты насыщенной культуры (50 мкл) использовали для инокуляции 100 мл забуференной глюкозной среды различного состава в 250 мл-колбе Ultra Yield (Thomson Instrument Co, Oceanside, CA) . Колбы инкубировали в течение ночи при 3 0°С в шейкере при 300 об/мин. Приблизительно через 2 4 часа, клетки центрифугировали при 2500хд в течение 15 минут. Среду (80 мл) отсасывали из осажденных клеток и добавляли в центрифужное фильтрующее устройство Centricon-70 (Millipore, Billerica, MA) , снабженное мембраной с отсечкой молекулярной массы 10 кДа. Фильтрующее устройство центрифугировали при 4 000 об/мин на центрифуге Sorvall Legend RT Plus (Thermo) в течение 30 минут. Оставшуюся осветленную среду (приблизительно 20 мл) добавляли в центрифужный фильтр Centricon-7 0, и общий объем в фильтре повышали до 80 мл путем добавления PBS, рН 7,4, содержащего 10 мМ имидазола и IX коктейля ингибиторов протеазы Halt, не содержащего EDTA. Фильтрующее устройство снова центрифугировали при 4 000 об/мин. в течение 3 0 минут. Объем концентрированной среды в фильтрующем устройстве повышали до 8 0 мл путем добавления PBS, рН 7,4, содержащего 10 мМ имидазола. Фильтрующее устройство снова центрифугировали при 4000 об/мин. в течение 3 0 минут.
Концентрированный образец для буферного обмена загружали на 1 мл-колонку His-Gravitrap (GE Lifesciences, Piscataway, NJ) , которая была предварительно уравновешена PBS, рН 7,4, содержащим 10 мМ имидазола. Колонку промывали 10 мл PBS, рН 7,4, содержащим 20 мМ имидазола. 6Н1Э-меченные варианты hFGF21 элюировали 2,5 мл PBS, рН 7,4, содержащего 300 мМ имидазола. 2,5 мл элюирующего буфера наносили на 10-миллилитровую
обессоливающую колонку PD-10, которая была предварительно уравновешена 25 мл PBS, рН 7,4, содержащего 10 мМ имидазола. бШБ-меченные дисульфидные варианты элюировали с обессоливающей колонки 3,5 миллилитрами PBS, рН 7,4, содержащего 10 мМ имидазола.
бШБ-метку удаляли из обессоленных и аффинно-очищенных дисульфидных вариантов hFGF21 путем добавления протеазы ProTEV (250 единиц; Promega, Madison, WI) и инкубации образца при комнатной температуре в течение 2 часов и в течение ночи при 4°С. Дисульфидные варианты hFGF21 с отщепленной меткой загружали на 1 мл-колонку His-Gravitrap, которая была предварительно уравновешена PBS, рН 7,4, содержащим 10 мМ имидазола. Проточную жидкость, содержащую дисульфидные варианты hFGF21 с отщепленной меткой, собирали. Колонку His-Gravitrap промывали 5 мл PBS, рН 7,4, содержащим 10 мМ имидазола. Проточную жидкость собирали с колонки и добавляли в проточную жидкость, полученную после реакции отщепления метки. Объединенные образцы проточной жидкости (приблизительно 8,5 мл) концентрировали приблизительно до 1 мл на центрифужном фильтре Amicon Ultra-15, снабженном мембраной с отсечкой молекулярной массы 10 кДа. Концентрированные дисульфидные варианты hFGF21 замораживали при -80°С, и хранили до проведения клеточного анализа на pERK.
Пример 3: Измерение уровня поглощения 2-деЗоксиглюкоЗы (2-DOG)
Совсем недавно было обнаружено, что FGF21 стимулирует поглощение глюкозы мышиными адипоцитами 3T3-L1 в присутствии и в отсутствии инсулина, и приводит к снижению уровней глюкозы, триглицеридов и глюкагона в крови у ob/ob- и db/db-мышей и у 8-недельных крыс ZDF после потребления корма и натощак, в зависимости от дозы, и поэтому был сделан вывод, что FGF21 может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения диабета и ожирения (см., например, публикацию патентной заявки WO03/011213 и Kharitonenkov et al, (2005) Jour, of Clinical Invest. 115: 1627-1635). Кроме того, было также обнаружено, что FGF21 стимулирует фосфорилирование тирозина
FGFR-1 и FGFR-2 в адипоцитах 3T3-L1.
Фибробласты 3T3-L1 закупали у АТСС (Catalog # CL173). Клетки культивировали до конфлюэнтности в 150 см-чашках Петри и выдерживали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (Invitrogen # 11995065), в которую было добавлено 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина, в течение еще 4 дней. Затем клетки дифференцировали в вышеуказанной среде, в которую было добавлено 4 мкг/мл инсулина (Sigma Catalog # 15500), 115 мкг/мл IBMX (Sigma Catalog # 15879) и 0,0975 мкг/мл дексаметазона (Sigma Catalog # D1756), в течение 3 дней, и затем среду для дифференцировки заменяли полной средой DMEM. Через день после замены среды, один планшет с дифференцированными адипоцитами 3T3-L1 засевали на четыре 96-луночных планшета.
После этого, адипоциты обрабатывали FGF21-WT (дикого типа) и вариантами FGF21 (см. список вариантов в таблице 2 ; конкретная используемая концентрация составляла 30 пМ-100 нМ) в течение ночи в полной среде. Адипоциты, обработанные образцами FGF21, хранили в бессывороточной среде при 50 мкл на лунку в буфере KRH (0,75% NaCl; 0,038% КС1; 0,0196% СаС12; 0,032% MgS04; 0,025М Hepes, рН 7,5; 0,5% BSA; 2 мМ пирувата натрия) в течение 2 часов. В контрольные лунки в течение 15 минут добавляли 1 мкл (конечная концентрация 5 мкг/мл) цитохалазина В. [3HJ-2-DOG (20,6 мКи/ммоль, 1 мКи/мл) разводили 1:20 в 5,1 мМ холодной 2-DOG, и 1 мкл разведенной 2-DOG на лунку добавляли в клетки и инкубировали в течение 5 минут. Клетки три раза промывали 100 мкл/лунка буфера KRH. Затем в клетки добавляли 4 0 мкл/лунка 1% ДСН, и клетки встряхивали по меньшей мере в течение 10 минут. После этого, добавляли 2 00 мкл/лунка сцинтилляционной жидкости, и затем планшеты встряхивали в течение ночи и считывали на микропланшет-ридере бета. Величины, полученные для лунок во всех столбцах/рядах, которые были обработаны цитохалазином В, усредняли и вычитали из всех других величин. Данные анализировали с помощью компьютерной программы GraphPad prism, и полученные результаты систематизированы в таблице 2.
Пример 4: pERK в клеточном вестерн-анализе (ICW)
Клетки НЕК2 93, стабильно трансфицированные человеческим |3-klotho, культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, включающей 10% FBS, 1% PS и 600 нг/мл G418, и высевали в 9б-луночные планшеты, покрытые поли-О-лизином (BD bioscience, 356640), при плотности 30000 клеток на лунку, и затем оставляли на ночь. Клетки выдерживали в течение 4 часов в бессывороточной среде DMEM, которая имела высокое содержание глюкозы и включала 0,5% BSA и 10 мМ HEPES. FGF21 дикого типа и варианты FGF21 (см. список вариантов в таблице 3) разводили различными концентрациями (конкретная используемая концентрация составляла 100 пМ-300 нМ) в бессывороточной среде. Эти клетки стимулировали белком FGF21 в течение 10 минут. После FGF21-стимуляции, среду отсасывали из лунок, и клетки один раз промывали 100 мкл холодного PBS, затем фиксировали 100 мкл 4% формальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре и затем инкубировали еще 10 минут со 100 мкл охлажденного льдом метанола.
После фиксации, клетки четыре раза промывали 0,3% тритона Х-100 в PBS, каждый раз в течение 5 минут. К клеткам с
проницаемой мембраной в течение 1,5 часа и при комнатной температуре добавляли 150 мкл блокирующего буфера Odyssey. Антитело против фосфо-ERK (pERK) разводили до концентрации 0,17 мкг/мл (разведение в отношении 1:200 или в указанном отношении), и антитело против всех ERK (tERK) разводили до концентрации 2,2 мкг/мл (разведение в отношении 1:200 или в указанном отношении) в блокирующем буфере Odyssey. В каждую лунку, за исключением лунок в одном столбце, которые были обработаны только "вторым" антителом, добавляли 50 мкл буфера для нормализации на фоновый уровень. Планшет закрывали мокрым бумажным полотенцем и крышкой для предупреждения испарения, и затем инкубировали при 4°С в течение ночи.
Затем, "первое" антитело отсасывали, и клетки четыре раза промывали 0,3% твином 20 в PBS, каждый раз в течение 5 минут. В процессе промывки получали реакционную смесь "вторых" антител в блокирующем буфере Odyssey, содержащем разведенное в отношении 1:1000 (или в указанном отношении) козье антимышиное антитело alexa 680 и разведенное в отношении 1:1000 (или в указанном отношении) козье антикроличье антитело IRDye800. После завершения промывки, в каждую лунку добавляли 4 0 мкл указанной реакционной смеси. Планшеты закрывали черной крышкой для зашиты "второго" антитела от действия света, и планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа на шейкере. И наконец, клетки снова четыре раза промывали 0,3% твином 20 в PBS, каждый раз в течение 5 минут, после чего сканировали на ИК-визуализирующей системе LI-COR Bioscience Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE) в каналах на 700 нм (красный) и на 800 нм (зеленый). Антитело alexa 680 окрашивало tERK с флуоресценцией в дальней инфракрасной области (длина волны излучения 668 нм) , и антитело IRDye800 окрашивало pERK с флуоресценцией в зеленом диапазоне спектра (длина волны излучения 800 нм). Для вычитания флуоресцентного фона, величины, полученные для лунок во всех столбцах/рядах, которые были обработаны только вторым антителом, усредняли и вычитали из всех других величин, полученных для данного планшета. Для
нормализации количества pERK, присутствующего в каждом образце, величины для pERK в каждой лунке делили на величины, полученные для tERK. Данные анализировали с помощью компьютерной программы GraphPad prism, и полученные результаты систематизированы в таблице 3.
дикого типа, вычисленное для молекул с типом присоединения "голова к голове" в одном и том же эксперименте
Пример 5: In vivo анализы FGF21 и вариантов FGF21 -фармакодинамика и обработка плазмы
ob/ob-Мышами являются мыши с моделью диабета типа 2. У этих мышей отсутствует функциональный лептин и наблюдается гипергликемия, инсулинорезистентность, гиперфагия, печеночный стеатоз и ожирение. Самцов ob/ob-мышей (10-13-недельные) использовали для оценки влияния: (1) FGF21 дикого типа, (2) вариантов FGF21, (3) ПЭГилированного FGF21 дикого типа и (4) ПЭГилированных вариантов FGF21 на уровни глюкозы в крови.
FGF21 дикого типа, вариант FGF21 или PBS-носитель ежедневно вводили подкожно (s.c.) в дозе 1 мг/кг и 4 мг/кг один раз в день в течение 5 дней. В первый день исследования измеряли уровень глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены, и массу тела, и затем мышей распределяли по различным группам (п=8 на группу) по среднему уровню глюкозы в крови и по массе тела. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром (OneTouch) на дни 1, 3 и 5 до введения дозы и через 2 и 4 часа после введения дозы. Результаты данных исследований систематизированы в таблице 4.
Мышам подкожно (s.c.) вводили ПЭГилированый FGF21 дикого типа в количестве 1 мг/кг, ПЭГилированные варианты FGF21 в количестве 0,3, 1 или 3 мг/кг, или PBS-носитель в количестве 4 мл/кг 2 раза в неделю в течение 2 недель. В первый день исследования измеряли уровень глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены, и массу тела, и затем мышей распределяли по различным группам (п=8 на группу) по среднему уровню глюкозы в крови и по массе тела. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром (OneTouch) на дни 1, 4, 8 и 11 до введения дозы и через 4 часа после введения дозы. Дополнительные измерения уровней глюкозы в крови проводили через 2 4 часа после введения
каждой дозы на дни 2, 5, 9 и 12. Уровни инсулина в плазме измеряли за 1 день до введения дозы и на день 12, через 24 часа после введения последней дозы. Уровни триглицеридов в плазме измеряли за 1 день до введения дозы и на день 5, через 24 часа после введения второй дозы. Результаты данных исследований систематизированы в таблице 5.
Вариант У7б-154С-ПЭГ обнаруживал превосходный профиль метаболизма in vivo, как видно из таблицы 5. У7б-154С-ПЭГ также обладал превосходными свойствами в отношении снижения уровня триглицеридов в печени (изменение уровней триглицеридов в
печени составляло ~25%, что значительно отличалось от уровня, наблюдаемого для контрольной группы, которой вводили носитель; фиг.1) по сравнению с FGF21-WT-R154C-n3r (изменение уровней триглицеридов в печени составляло ~7%, что существенно не отличалось от уровня, наблюдаемого для контрольной группы, которой вводили носитель; фиг.1) . В том же самом исследовании, при введении дозы 1 мг/кг (WT-R154C-n3r, эксп. 3), уровни обоих соединений в плазме (фиг.2) были эквивалентными, при этом, другие конечные показатели эффективности (общая глюкоза по AUC, уровень инсулина в плазме, увеличение массы тела и уровни триглицеридов в плазме) существенно не отличались.
Пример 6: Анализ на стабильность в плазме, проводимый с использованием FGF21 дикого типа и ПЭГилированных вариантов
FGF21
Для оценки стабильности FGF21 дикого типа (FGF21-WT) в плазме и стабильности ПЭГилированных вариантов FGF21 в плазме проводили анализ на их стабильность в плазме. В 90 мкл и 2 64,5 мкл плазмы ob/ob-мышей (90% плазмы и 88% плазмы) добавляли десять (10) мкл FGF21-WT (4,84 мг/мл) и 35,5 мкл FGF21-V76-154С-ПЭГ (2,12 мг/мл). Каждую пробу брали в 5 аликвотах и инкубировали в течение 1 часа, 4 часов, 24 часов, 48 часов и 72 часов. Обработанные пробы плазмы хранили при 4°С до тех пор, пока не были взяты пробы во все периоды времени. Девять (9) мкл плазмы, обработанной FGF21 дикого типа, и 27 мкл плазмы, обработанной вариантом FGF21-V76-154C-n3r, добавляли в 750 мкл среды (300 нМ FGF21-WT с 1,2% плазмой и 450 нМ FGF21-V76-154C-ПЭГ с 3,6% плазмой) и 8 раз серийно разводили 1:3 в среде. Клетки НЕК2 93, стабильно трансфицированные человеческим |3-klotho, обрабатывали белками в течение 10 минут, и затем подвергали ICW-анализу на pERK согласно стандартным протоколам. Необработанный FGF21 дикого типа, вариант FGF21-V76-154C-PEG и 1,2% и 3,6% мышиной плазмы также использовали в качестве контроля. Результаты этих экспериментов графически представлены на фиг.ЗА и ЗВ.
FGF21 дикого типа, при его инкубации с мышиной плазмой при
37°С, терял активность в течение короткого периода времени (1-4 часа), и V76-154С-ПЭГ, при его инкубации с мышиной плазмой при 37°С, полностью сохранял свою активность в течение по меньшей мере 72 часов.
Хотя настоящее изобретение описано со ссылками на конкретные варианты его осуществления, однако, для специалиста в данной области очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения, и его элементы могут быть заменены эквивалентами, не отходя от истинного существа и объема изобретения. Кроме того, многие модификации могут быть введены в зависимости от конкретной ситуации, конкретного материала, состава композиции, способа, стадии или стадий данного способа, и такие модификации не должны отходить от целей, существа и объема изобретения. При этом, предусматривается, что все эти модификации входят в объем настоящего изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Boettcher, Brian R. Loew, Andreas
<12 0> СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ FGF21-АССОЦИИРОВАННЫХ РАССТРОЙСТВ
<130> РАТ054412 <160> 49
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 209 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 1
Met Asp Ser Asp Glu Thr Gly Phe Glu His Ser Gly Leu Trp Val Ser
15 10 15
Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Cys Gin Ala His Pro lie Pro
20 25 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
35 40 45
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu lie Arg
50 55 60
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu
65 70 75 80
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val lie Gin lie Leu Gly Val
85 90 95
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
100 105 110
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
130 135 140
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
145 150 155 160
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
165 170 175
Pro Pro Gly lie Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
180 185 190
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
195 200 205
Ser
<210> 2
<211> 630
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggactcgg acgagaccgg gttcgagcac tcaggactgt gggtttctgt gctggctggt 60
cttctgctgg gagcctgcca ggcacacccc atccctgact ccagtcctct cctgcaattc 120
gggggccaag tccggcagcg gtacctctac acagatgatg cccagcagac agaagcccac 180
ctggagatca gggaggatgg gacggtgggg ggcgctgctg accagagccc cgaaagtctc 240
ctgcagctga aagccttgaa gccgggagtt attcaaatct tgggagtcaa gacatccagg 300
ttcctgtgcc agcggccaga tggggccctg tatggatcgc tccactttga ccctgaggcc 360
tgcagcttcc gggagctgct tcttgaggac ggatacaatg tttaccagtc cgaagcccac 420
ggcctcccgc tgcacctgcc agggaacaag tccccacacc gggaccctgc accccgagga 480
ccagctcgct tcctgccact accaggcctg ccccccgcac tcccggagcc acccggaatc 540
ctggcccccc agccccccga tgtgggctcc tcggaccctc tgagcatggt gggaccttcc 600
cagggccgaa gccccagcta cgcttcctga 630
<210> 3 <211> 181 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 4 <211> 15 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкер <400> 4
ggggsggggs ggggs 15
<210> 5 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe
1 5 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu 20
Glu Asp Gly Thr Ala Gly Gly Ala
35 40 Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro 50 55
Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
10 15 Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg 25 30 Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu 45
Gly Val He Gin He Leu Gly Val 60
Lys Thr 65
Ser Leu
Glu Asp
His Leu
Pro Ala 130 Pro Pro 145
Pro Leu Ser
Phe Asp 85
Tyr Asn 100
Gly His
Pro 115 Arg
Gly
Ser
Ser Arg Phe His Gly
Phe Leu
He Leu
Met Val 165
Leu Cys Gin 70
Pro Glu Ala
Val Tyr Gin
Lys Ser Pro 120
Pro Leu Pro 135
Ala Pro Glu 150
Gly Pro Ser
Gly
Cys
Ser 105 His
Gly
Pro
Gin
Pro
Ser
Glu
Arg
Leu
Pro
Gly 170
Asp
Phe
Ala
Asp
Pro
Asp 155 Arg
Gly Ala
Arg Glu
His Gly
Pro Ala 125 Pro Ala 140
Val Gly
Tyr
Val
Pro
Arg
Pro
Ser
Tyr 175
Gly
Leu
Leu
Gly
Glu
Asp 160 Thr
<210> 6 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 6
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Asn Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Ala Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Asn Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Val Leu
85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Gin Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Asn Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Thr
165 170 175
Ser
<210> 7 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 7
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 Lys Ala 65
Ser Leu
Glu Asn
His Leu
Pro Ala 130 Pro Pro 145
Pro Leu Ser
Phe Asp 85
Tyr Asn 100
Gly Asn
Pro 115 Arg
Gly
Ala
Ser Arg Phe His Gly
Phe Leu
He Leu
Met Val 165
Leu Cys Gin 70
Pro Glu Ala
Val Tyr Gin
Arg Ser Pro 120
Pro Leu Pro 135
Ala Pro Gin 150
Gly Pro Ser
Lys Pro
Cys Ser 90
Ser Glu 105
His Arg
Gly Leu
Pro Pro
Gin Ala 170
Asp
Phe
Ala
Asp
Pro
Asp 155 Arg 60 Gly
Arg
His
Pro
Pro 140 Val
Ser
Ala
Glu
Gly
Ala 125 Ala
Gly
Pro
Leu Tyr Gly 80
Leu Leu Leu 95
Leu Pro Leu 110
Ser Gin Gly
Leu Pro Glu
Ser Ser Asp 160
Ser Tyr Ala 175
<210> 8 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 8
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Gin Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 9 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 9
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe
1 5 Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu 20
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala 35 40
Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
10 15 Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg 25 30 Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 10 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 10
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Gin Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 11 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin
15 10 Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gin Gin Thr Glu Ala
20 25 Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin
Val Arg Gin Arg Tyr 15
His Leu Glu He Arg 30
Ser Pro Glu Ser Leu
Leu Gin
50 Lys Ala 65
Ser Leu
Glu Asn
His Leu
Pro Ala 130 Pro Pro 145
Pro Leu Ser
35 Leu
Ser
His
Gly
Pro 115 Arg
Gly
Ala
Lys Ala
Arg Phe
Phe Asp 85
Tyr Asn 100
Gly Asn
Phe Leu
He Leu
Met Val 165
Leu Lys Pro 55
Leu Cys Gin 70
Pro Glu Ala
Val Tyr Gin
Lys Ser Pro 120
Pro Leu Pro 135
Ala Pro Gin 150
Gly Pro Ser
Gly
Lys
Cys
Ser 105 His
Gly
Pro
Gin
Val
Pro
Ser
Glu
Arg
Leu
Pro
Ala 170
Asp
Phe
Thr
Asp
Pro
Asp 155 Arg
Gin
Gly
Arg
His
Pro
Pro 140 Val
Ser 45 He
Ala
Glu
Gly
Ala 125 Ala
Gly
Pro
Leu Gly Val
Leu Tyr Gly 80
Leu Leu Leu 95
Leu Pro Leu 110
Ser Gin Gly
Leu Pro Glu
Ser Ser Asp 160
Ser Tyr Ala 175
<210> 12 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 12
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 13 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 13
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 14 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 14
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Gin Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 15 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 15
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
Glu Asp
Leu Gin
50 Lys Ala 65
Ser Leu
Glu Asn
His Leu
Pro Ala 130 Pro Pro 145
Pro Leu Ser
Gly Thr Val 35
Leu Lys Ala
Ser Arg Phe
His Phe Asp 85
Gly Tyr Asn 100
Pro Gly Asn 115
Arg Phe Leu
Gly He Leu
Ala Met Val 165
Gly Gly Ala 40
Leu Lys Pro 55
Leu Cys Gin 70
Pro Glu Ala
Val Tyr Gin
Arg Ser Pro 120
Pro Leu Pro 135
Ala Pro Gin 150
Gly Pro Ser 25
Ala His Gin
Gly Val He
Lys Pro Asp 75
Cys Ser Phe 90
Ser Glu Ala 105
His Arg Asp
Gly Leu Pro
Pro Pro Asp 155
Gin Gly Arg 170
Ser Pro Glu 45
Gin He Leu 60
Gly Ala Leu
Arg Glu Leu
His Gly Leu 110
Pro Ala Pro 125
Pro Ala Leu 140
Val Gly Ser Ser Pro Ser
Ser Leu
Gly Val
Tyr Gly 80
Leu Leu 95
Pro Leu
Gin Gly
Pro Glu
Ser Asp 160 Tyr Ala 175
<210> 16 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 16
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 17 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Туг
Glu Asp
Leu Glu
50 Lys Thr 65
Ser Leu
Glu Asn
His Leu
Pro Ala 130 Pro Pro 145
Pro Leu Ser
Thr
Gly
Leu
Ser
His
Gly
Pro 115 Arg
Gly
Ala
Asp Asp 20
Thr Val
Lys Ala
Arg Phe
Phe Asp 85
Tyr Asn 100
Gly Asn
Phe Leu
He Leu
Met Val 165
Ala Gin Glu
Gly Gly Ala 40
Leu Lys Pro 55
Leu Cys Gin 70
Pro Glu Ala
Val Tyr Gin
Arg Ser Pro 120
Pro Leu Pro 135
Ala Pro Gin 150
Gly Pro Ser
Thr Glu 25
Ala His
Gly Val
Lys Pro
Cys Ser 90
Ser Glu 105
His Cys
Gly Leu
Pro Pro
Gin Gly 170
Ala His
Gin Ser
He Gin 60
Asp Gly 75
Phe Arg
Ala His
Asp Pro
Pro Pro 140 Asp Val 155
Arg Ser
Leu Glu
30 Pro Glu 45
He Leu
Ala Leu
Glu Leu
Gly Leu 110 Ala Pro 125
Ala Pro Gly Ser Pro Ser
He Arg
Ser Leu
Gly Val
Tyr Gly 80
Leu Leu 95
Pro Leu
Gin Gly
Pro Glu
Ser Asp 160 Tyr Ala 175
<210> 18 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 18
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Gin Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 19 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 19
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
Leu Туг
Glu Asp
Leu Gin
50 Lys Ala 65
Ser Leu
Glu Asn
His Leu
Pro Ala 130 Pro Pro 145
Pro Leu Ser
Thr
Gly
Leu
Ser
His
Gly
Pro 115 Arg
Gly
Ala
Asp
Thr
Lys
Arg
Phe
Tyr 100 Gly
Phe
Met 5
Asp
Val
Ala
Phe
Asp
Asn
Asn
Leu
Leu
Val 165
Ala Gin Glu
Gly Gly Ala 40
Leu Lys Pro 55
Leu Cys Gin 70
Pro Glu Ala
Val Tyr Gin
Arg Ser Pro 120
Pro Leu Pro 135
Ala Pro Gin 150
Gly Pro Ser 10
Thr Glu Ala 25
Ala His Gin
Gly Val He
Lys Pro Asp 75
Cys Ser Phe 90
Ser Glu Ala 105
His Arg Asp
Gly Leu Pro
Pro Pro Asp 155
Gin Gly Arg 170
His Leu Glu 30
Ser Pro Glu 45
Gin He Leu 60
Gly Ala Leu
Arg Glu Leu
His Gly Leu 110
Pro Ala Pro 125
Pro Ala Leu 140
Val Gly Ser Ser Pro Ser
15 He
Ser
Gly
Tyr
Leu
Pro
Gin
Pro
Ser
Tyr 175
Arg
Leu
Val
Gly
Leu
Leu
Gly
Glu
Asp 160 Ala
<210> 20 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 20
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ser His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 21 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Asp Ser 1
Leu Tyr
Glu Asp
Leu Gin
50 Gin Thr 65
Ser Leu
Glu Asn
His Leu
Pro Ala 130 Pro Pro 145
Pro Leu Ser
Ser
Thr
Gly
Leu
Ser
His
Gly
Pro 115 Arg
Gly
Ala
Pro
Asp
Thr
Lys
Arg
Phe
Tyr 100 Gly
Phe
Met
Leu 5
Asp
Val
Ala
Phe
Asp
Asn
Asn
Leu
Leu
Val 165
Leu Gin Phe
Ala Gin Gin
Gly Gly Ala 40
Leu Lys Pro 55
Leu Cys Gin 70
Pro Glu Ala
Val Tyr Gin
Arg Ser Pro 120
Pro Leu Pro 135
Ala Pro Gin 150
Gly Pro Ser
Gly
Thr
Ala
Gly
Lys
Cys
Ser 105 His
Gly
Pro
Gin
Gly Gin 10
Glu Ser
His Gin
Val He
Pro Asp
75 Ser Phe 90
Glu Ala
Arg Asp
Leu Pro
Pro Asp 155 Gly Arg 170
Val Arg
His Leu
Ser Pro
45 Gin He 60
Gly Ala
Arg Glu
His Gly
Pro Ala 125 Pro Ala 140
Val Gly Ser Pro
Gin Arg Tyr 15
Glu He Arg 30
Glu Ser Leu
Leu Gly Val
Leu Tyr Gly 80
Leu Leu Leu 95
Leu Pro Leu 110
Pro Gin Gly
Leu Pro Glu
Ser Ser Asp 160
Ser Tyr Ala 175
<210> 22 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 22
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ser His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 23 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Asp Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Gin Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 24 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 24
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Gin Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 25 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Asp Ser Ser Pro Leu Val Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Ser Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 26 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 26
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 27 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 27
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 28 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 28
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Ala Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 29 <211> 177
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 29
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 30 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 30
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Ala Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 31
<211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 31
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 32 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 32
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
<210> 33 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 33
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 34 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 34
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Ala Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
<210> 35 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 35
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Cys Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 36 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 36
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
<210> 37 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 37
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Cys Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Gin Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asn Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Cys Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Pro Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 38 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 38
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Glu Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
<210> 39 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 39
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Glu Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 40 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 40
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 41 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 41
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 42 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 42
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 43
<211> 177
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Ser Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 44 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 44
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 45 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 45
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Arg Pro Asp Gly Thr Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Thr His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Ser Arg Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Ala Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 46 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 46
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
15 10 15
Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gin Gin Thr Glu Ala His Leu Glu He Arg
20 25 30
Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala His Gin Ser Pro Glu Ser Leu
35 40 45
Leu Glu Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val He Gin He Leu Gly Val
50 55 60
Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gin Lys Pro Asp Gly Ala Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu
85 90 95
Glu Glu Gly Tyr Asn Val Tyr Gin Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu
100 105 110
His Leu Pro Gly Asn Arg Ser Pro His Cys Asp Pro Ala Pro Gin Gly
115 120 125
Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu
130 135 140
Pro Pro Gly He Leu Ala Pro Gin Pro Pro Asp Val Gly Ser Ser Asp
145 150 155 160
Pro Leu Ala Met Val Gly Pro Ser Gin Gly Arg Ser Pro Ser Tyr Ala
165 170 175
Ser
<210> 47
<211> 546
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 47
caccccatcc
ctctacacag
gtggggggcg
ggagttattc
gccctgtatg
gaggacggat
aacaagtccc
ggcctgcccc
ggctcctcgg
tcctga
ctgactccag atgatgccca ctgctgacca aaatcttggg gatcgctcca acaatgttta cacaccggga ccgcactccc accctctgag tcctctcctg gcagacagaa gagccccgaa agtcaagaca ctttgaccct ccagtccgaa ccctgcaccc ggagccaccc catggtggga caattcgggg gcccacctgg agtctcctgc tccaggttcc gaggcctgca gcccacggcc cgaggaccag ggaatcctgg ccttcccagg gccaagtccg agatcaggga agctgaaagc tgtgccagcg gcttccggga tcccgctgca ctcgcttcct ccccccagcc gccgaagccc gcagcggtac 60 ggatgggacg 120 cttgaagccg 180 gccagatggg 240 gctgcttctt 300 cctgccaggg 360 gccactacca 420 ccccgatgtg 480 cagctacgct 540 546
<210> 48 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Asp Ser Ser Pro Leu
1 5 Leu Tyr Thr Asp Asp 20
Glu Asp Gly Thr Val 35
Leu Gin Leu Arg Ala 50
Arg Thr Ser Arg Phe 65
Ser Leu His Phe Asp 85
Glu Asp Gly Tyr Asn 100
His Leu Pro Gly Asn 115
Pro Ala Arg Phe Leu 130
Pro Pro Gly He Leu 145
Pro Leu Ala Met Val 165
Ser
Leu Gin Phe
Ala Gin Gin
Gly Gly Ala 40
Leu Arg Pro 55
Leu Cys Gin 70
Pro Glu Ala
Val Tyr Gin
Arg Ser Pro 120
Pro Leu Pro 135
Ala Pro Gin 150
Gly Pro Ser
Gly Gly Gin 10
Thr Glu Ala 25
Ala Asp Gin
Gly Val He
Arg Pro Asp 75
Cys Ser Phe 90
Ser Glu Ala 105
His Lys Asp
Gly Leu Pro
Pro Pro Asp 155
Gin Gly Arg 170
Val Arg
His Leu
Ser Pro
45 Gin He 60
Gly Ala
Arg Glu
His Gly
Pro Ala 125 Pro Ala 140
Val Gly Ser Pro
Gin Arg Tyr 15
Glu He Arg 30
Glu Ser Leu
Leu Gly Val
Leu Tyr Gly 80
Leu Leu Leu 95
Leu Pro Leu 110
Pro Arg Gly
Pro Pro Glu
Ser Ser Asp 160
Ser Tyr Ala 175
<210> 49 <211> 177 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gin Phe Gly Gly Gin Val Arg Gin Arg Tyr
Leu
Glu
Leu
Arg
Ser
Glu
His
Pro
Pro 145 Pro
Ser
Tyr Thr Asp 20
Asp Gly Thr 35
Gin Leu Arg 50
Thr Ser Arg
Leu His Phe
Asp Gly Tyr 100
Leu Pro Cys 115
Ala Arg Phe 130
Pro Gly He Leu Ala Met
Phe Leu 70
Asp Pro 85
Asn Val
Asn Arg
Leu Pro
Leu Ala 150 Val Gly 165
Gly Ala 40
Arg Pro 55
Cys Gin
Ser Pro 120 Leu Pro 135
Pro Gin
Glu Ala Tyr Gin
Gly Pro Pro Ser Gin
Glu Ala
Asp Gin
Val He
Pro Asp
75 Ser Phe 90
Glu Ala
Lys Asp
Leu Pro
Pro Asp 155 Gly Arg 170
His Leu
Ser Pro
45 Gin He 60
Gly Ala
Arg Glu
His Gly
Pro Ala 125 Pro Ala 140
Val Gly Ser Pro
Glu He Arg 30
Glu Ser Leu
Leu Gly Val
Leu Tyr Gly 80
Leu Leu Leu 95
Leu Pro Leu 110
Pro Arg Gly
Pro Pro Glu
Ser Ser Asp 160
Ser Tyr Ala 175
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Вариант полипептида, имеющий последовательность,
выбранную из группы последовательностей, представленных в
таблице 1.
2. Вариант по п.1, где указанный вариант дополнительно включает одну или более следующих модификаций: (а) амино-концевое усечение не более чем на 8 аминокислотных остатков; и (Ь) карбокси-концевое усечение не более чем на 12 аминокислотных остатков.
3. Вариант по п.1, где указанный вариант ковалентно связан с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или полисиаловой кислотой.
4. Вариант по п.З, где указанный вариант дополнительно содержит разветвленную группу ПЭГ размером в 4 0 кДа, ковалентно связанную с цистеином указанного варианта.
5. Вариант по п.1, где указанный вариант присоединен к гетерологичной аминокислотной последовательности, состоящей из одного из следующего: константного домена IgG или его фрагмента, сывороточного альбумина человека (HSA) и альбумин-связывающих полипептидов.
6. Вариант по п. 5, где указанная гетерологичная аминокислотная последовательность присоединена к амино-концу указанного варианта.
7. Вариант по п. 5, где указанная гетерологичная аминокислотная последовательность присоединена к карбокси-концу указанного варианта.
8. Мультимер, состоящий по меньшей мере из одного варианта по п.1.
9. Мультимер по п.8, где указанным мультимером является гомодимер.
10. Вариант полипептида или белка, содержащий вариант 7 6 (V76) .
11. Вариант по п.10, где указанный вариант ПЭГилирован в положении цистеина 154.
12. Вариант по п.11, где указанный вариант дополнительно включает разветвленную группу ПЭГ размером 4 0 кДа в положении 154 .
10.
13. Фармацевтическая композиция, содержащая вариант, выбранный из группы, состоящей из последовательностей, представленных в таблице 1.
14. Фармацевтическая композиция по п.13, дополнительно содержащая вариант 7 6 {VI6), ПЭГилированный в положении цистеинового остатка 154.
15. Способ лечения пациента, включающий введение
указанному пациенту терапевтически эффективного количества
варианта полипептида или белка фактора роста фибробластов 21
(FGF21), где указанный пациент страдает одним или более FGF21-
ассоциированными расстройствами.
16. Способ по п.15, где указанные FGF21-ассоциированные
расстройства состоят из одного или более из следующего:
ожирения, сахарного диабета типа 2 и типа 1, панкреатита,
дислипидемии, неалкогольного стеатогепатита (НАСГ),
инсулинорезистентности, гиперинсулинемии, непереносимости
глюкозы, гипергликемии, метаболического синдрома и другие
метаболических расстройств.
17. Способ по п.16, где указанное FGF21-ассоциированное расстройство состоит из сахарного диабета типа 1.
18. Способ по п.16, где указанное FGF21-ассоциированное расстройство состоит из сахарного диабета типа 2.
19. Способ лечения пациента, включающий введение указанному пациенту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество варианта полипептида или белка фактора роста фибробластов 21 (FGF21), где указанный пациент страдает одним или более FGF21-ассоциированными расстройствами.
20. Способ лечения пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества варианта полипептида или белка фактора роста фибробластов 21 (FGF21), где указанный пациент страдает одним или более FGF21-ассоциированными расстройствами, и где указанный вариант включает вариант 7 6 {VI6), ПЭГилированный в положении цистеинового остатка 154.
21. Способ по п.20, где указанные FGF21-ассоциированные
расстройства состоят из одного или более из следующего:
ожирения, сахарного диабета типа 2 и типа 1, панкреатита,
дислипидемии, неалкогольного стеатогепатита (НАСГ),
инсулинорезистентности, гиперинсулинемии, непереносимости глюкозы, гипергликемии, метаболического синдрома и других метаболических расстройств.
22. Способ по п.21, где указанное FGF21-ассоциированное расстройство состоит из сахарного диабета типа 1.
23. Способ по п.21, где указанное FGF21-ассоциированное расстройство состоит из сахарного диабета типа 2.
24. Способ снижения одного или более из гипергликемии, гиперинсулинемии, уровня липидов в печени и увеличения массы тела у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества варианта полипептида или белка фактора роста фибробластов 21 (FGF21).
25. Способ по п.24, где указанный вариант дополнительно включает вариант 7 6 {VI6), ПЭГилированный в положении цистеинового остатка 154.
По доверенности
1/3
196258
Уровень триглицеридов в печени
250 п
* Р < 0,05 по сравнению с носителем, как было опеределено с помощью одностороннего ANOVA
200-
3. 150-
X О)
5 100-
50-
Носитель
J J J <Э ^ J
\* # о* Л^Г ^
,Q> \' пу N • <У К' 'Ъ'
<^
^ ////
^' ^ ^ ^
¦" -i "¦ .я- , Фиг. 1
Фиг. 2
1 час 4 часа 24 часа48 часов 72 часа FGF21 дикого типа (3,7 нМ)
Фиг. ЗА
1 час 4 часа 24 часа48 часов 72 часа FGF21-V76-154C-n3r(11,1 нМ)
Фиг. ЗВ
Ser
Ser
2/3
2/3
3/3
3/3