(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к молчащим Fc-вариантам анти-CD40 антител и композициям и методам использования указанных антител для лечения патологических нарушений, таких как аутоиммунные и воспалительные нарушения, и/или для предотвращения или снижения риска отторжения трансплантата при трансплантации.
Евразийское (21) 201390725 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/28 (2006.01)
2013.09.30
(22) Дата подачи заявки 2011.11.14
(54) МОЛЧАЩИЕ FC-ВАРИАНТЫ АНТИ-€Б40 АНТИТЕЛ
(31) (32)
61/413,567 2010.11.15
(33) US
(86) PCT/EP2011/070058
(87) WO 2012/065950 2012.05.24
(71) Заявитель: НОВАРТИС АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Хойссер Кристоф, Раш Джеймс, Винсент Карен (CH)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к молчащим Fc-вариантам анти-ОБ40 антител и композициям и методам использования указанных антител для лечения патологических нарушений, таких как аутоиммунные и воспалительные нарушения, и/или для предотвращения или снижения риска отторжения трансплантата при трансплантации.
2420-195207ЕА/045 МОЛЧАЩИЕ FC-ВАРИАНТЫ AHTM-CD40 АНТИТЕЛ
Настоящее изобретение относится к молчащим вариантам константного фрагмента (Fc) анти-СБ40 антител и композициям и методам использования указанных антител для лечения патологических нарушений, таких как аутоиммунные и воспалительные нарушения, и/или для предотвращения или снижения риска отторжения трансплантата при трансплантации.
Несмотря на наличие различных иммуносупрессивных способов
лечения аутоиммунных заболеваний, остается большая
востребованность более эффективных и безопасных лекарственных средств в многочисленной части популяции пациентов. Например, несмотря на описанную в литературе эффективность терапии по снижению числа/ингибированию В-клеток, как, например, лечение ритуксимабом или белимумабом ревматоидного артрита, системной красной волчанки, синдрома Шегрена и рассеянного склероза, эти виды терапии эффективны только у части пациентов, а в случае ритуксимаба имеется сопутствующий риск развития прогрессирующей мультифокальной лейкоэнцефалопатии. Более того, многочисленные другие типы лейкоцитов зачастую вовлечены в патологию этих аутоиммунных заболеваний, такие как макрофаги, дендритные клетки и Т-клетки, следовательно, терапевтическое воздействие на дополнительные типы клеток или ключевые иммунологические каскады реакций, которые будут ингибировать их функцию, может оказаться эффективным. Принимая во внимание разнообразные, иммунологически значимые роли CD4 0-CD154 в активации и функции этих типов клеток, предполагают, что анти-СБ40 антитело окажет положительный терапевтический эффект у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, упомянутыми выше, помимо обеспечиваемого проводимыми в настоящее время методами терапевтического лечения. Более того, центральная роль взаимодействий CD40-CD154 в воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, таких как болезнь Крона и язвенный колит, и механистическая связь метаболического пути CD40 с патологией при более редких нарушениях, таких как аутоиммунный васкулит, вульгарная пузырчатка и ИТП, также подчеркивает
потенциал анти-СБ4 0 антител для применения.
Имеющиеся в наличие иммунодепрессанты, используемые после трансплантации паренхиматозных органов, обеспечивают отличную краткосрочную эффективность. Острое отторжение в течение вновь возникшего периода наблюдают у 5-20% реципиентов (в зависимости от органа, контингента пациентов и схемы лечения) и соотношение утраченных трансплантатов и острого отторжения в течение вновь возникшего периода ниже 5% для любых параметров. В настоящее время, ключевые проблемы в медицине связаны с переносимостью иммуносупрессии пациентом и жизнеспособностью трансплантата в течение долгого периода времени. После трансплантации почек 33% пациентов умирают и/или утрачивают трансплантат в течение 5 лет; средний возраст реципиентов трансплантата со смертельным исходом составляет 58 лет. Ингибиторы кальциневрина (CNI) остаются основой иммуносупрессивной терапии для подавляющего большинства пациентов, которым проведена трансплантация. Несмотря на то, что нефротоксичность и частота сердечнососудистых осложнений, ассоциированных с CNI, являются одними из факторов, способствующих хронической нефропатии при аллотрансплантации, а также наступлению смерти пациента с функционирующим трансплантатом, альтернативная первичная иммуносупрессия была неспособна заменить CNI. В целом, имеются возможности для усовершенствования долгосрочной иммуносупрессии трансплантата. Опосредованное В-клетками иммунологическое повреждение трансплантированных почек может обусловливать неудовлетворительные отдаленные последствия, и необходимость разработки новых средств воздействия на отторжение трансплантата, опосредуемое В-клетками, все в большей мере признается медицинской общественностью.
Chirl2.12 представляет собой полностью гуманизированное, не являющееся агонистом анти-СБ40 антитело (IgGl, каппа), которое блокирует опосредованную CD154 (также известное как лиганд CD40; CD40L) активацию лейкоцитов и может опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) лейкоцитов человека и В-клеточной лимфомы in vitro (смотрите WO2006/073443). WO2005/044306 также описывает анти-СБ40
антагонистические антитела, включая Chirl2.12, для
использования, в частности, в лечении аутоиммунных и воспалительных нарушений. Более того, Chirl2.12 эффективно в замедлении отторжения почечного аллотранслантата при назначении в виде монотерапии у Масаса fascicularis (яванского макака) [Li et al. (2008) Transplantation; 86 (1):10-15]. Однако, Chirl2.12 может также опосредовать обеднение фракции периферических В-клеток у не относящихся к человеку приматов (NHP).
По теоретическим оценкам анти-СБ4 0 mAb с молчащей ADCC-активностью обладают улучшенным профилем безопасности в сравнении с исходными анти-СБ4 0 антителами, и, в частности, могут быть более пригодными по неонкологическим показаниям для применения, таким как аутоиммунные заболевания и использование в условиях трансплантации.
Таким образом, настоящее изобретение представляет молчащие Fc-фрагменты анти-СБ4 0 моноклональных антител, которые сохраняют неагонистические, блокирующие CD4 0L свойства исходного анти-СБ40 антитела Chirl2.12.
В частности, изобретение представляет выделенное антитело или белок, включающие антиген-связывающий участок антитела, направленный против полипептида-мишени CD4 0 (SEQ ID N0:28), характеризуемые тем, что указанное антитело или белок
a) связывает полипептид CD4 0 с KD, равной 10 нМ или менее,
b) включает молчащий Fc-фрагмент IgG.
В одном варианте осуществления изобретения указанное антитело или белок ингибирует индуцированное CD4 0L проведение сигнала с IC50 величиной, равной 50 нг/мл или менее.
В другом варианте осуществления изобретения выделенное антитело или белок по данному изобретению не имеет или обладает низкой агонистической активностью в отношении проведения сигнала CD4 0.
В другом варианте осуществления изобретения антитело или белок по настоящему изобретению включает молчащий Fc-фрагмент IgG, выбранный из группы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18 или SEQ ID N0:19.
В другом варианте осуществления изобретения, выделенное антитело или белок по данному изобретению включает вариабельные участки тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL) , имеющие по меньшей мере 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности по последовательности в сравнении с VH Chirl2.12 (SEQ ID N0:9) и VL Chirl2.12 антитела (SEQ ID N0:10), соответственно.
Частными примерами антител по данному изобретению являются тАЫ, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:11 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID N0:12,
тАЬ2, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:13 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID N0:14, или
тАЬЗ, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:15 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID N0:16.
Выделенное антитело или белок по данному изобретению могут быть использованы в качестве лекарственного средства. В частности, они пригодны для использования в лечении аутоиммунных нарушений, воспалительных нарушений и/или для предотвращения или уменьшения риска отторжения трансплантата при трансплантации.
Выделенное антитело или белок по данному изобретению могут быть использованы, в частности, в лечении рассеянного склероза, системной красной волчанки, синдрома Шегрена, ревматоидного артрита, отторжения трансплантата и реакции "трансплантат против хозяина".
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим вышеперечисленные антитела или белки по данному изобретению, в сочетании, по меньшей мере, с фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем. Указанные фармацевтические композиции могут дополнительно включать другие активные ингредиенты.
Изобретение также относится к лиофилизату или жидкой лекарственной форме антитела или белка по данному изобретению.
Изобретение дополнительно относится к выделенной
нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело или белок по данному
изобретению, и соответствующему клонирующему или
экспрессионному вектору, включающему, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:22-27.
Изобретение также относится к клетке-хозяину, включающей один или несколько клонирующих или экспрессионных векторов согласно вышеприведенному определению.
Изобретение дополнительно представляет процесс
производства антитела или белка по изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина согласно вышеприведенному определению, очистку и извлечение указанного антитела или белка.
С целью лучшего понимания настоящего изобретения в первую очередь даны определения конкретным терминам. Дополнительные определения изложены на всем протяжении подробного описания.
Термин "иммунный ответ" относится к реакции, например, лимфоцитов, антиген-презентирующих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых вышеперечисленными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), что приводит к селективному повреждению, деструкции или элиминации из человеческого организма внедрившихся патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток, или, в случаях аутоиммунного или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей человека.
"Путь передачи сигнала" или "сигнальная активность"
относятся к биохимической причинно-следственной взаимосвязи,
как правило, инициируемой белок-белковым взаимодействием, таким
как связывание ростового фактора с рецептором, приводящее к
передаче сигнала от одной части клетки другой части клетки. В
основном, передача сигнала включает специфическое
фосфорилирование одного или нескольких остатков тирозина, серина или треонина в одном или нескольких белках в каскаде реакций, вызывая передачу сигнала. Предпоследние процессы обычно включают ядерные события, приводящие к изменению
экспрессии гена.
Термин "CD4 0" относится к CD4 0 человека, например, как определено в SEQ ID N0:28, если не описано иное.
Термин "антитело" в том смысле, в котором он здесь используется, включает полноразмерное антитело и любые антиген-связывающие фрагменты (т.е. "антиген-связывающая часть") или одноцепочечные варианты вышеперечисленного.
Встречающееся в природе "антитело" является
гликопротеином, включающим, по меньшей мере, две тяжелые (Н)
цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанных дисульфидными
связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области
тяжелой цепи (сокращенное название в настоящем документе VH) и
константная область тяжелой цепи. Константная область тяжелой
цепи состоит из трех доменов, CHI, СН2 и СНЗ. Каждая легкая
цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенное
название в настоящем документе VL) и константной области легкой
цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена,
CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на
области гипервариабельности, названные определяющими
комплементарность областями (CDR), вперемежку с областями, которые являются более консервативными и называются каркасными областями (FR) . Каждая область VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.
Термин "антиген-связывающий участок" антитела (или упрощенно "антигенный участок") в том смысле, в котором он здесь используется, относится к полноразмерному антителу или одному или нескольким его фрагментам, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например,
частью CD4 0). Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры фрагментов связывания, подходящих под термин "антиген-связывающий участок" антитела, включают фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CHI; фрагмент F(ab)2/ бивалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; фрагмент dAb
(Ward et al. , 1989 Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; и выделенную определяющую комплементарность область
(CDR) или любые химерные белки, включающие такие антиген-связывающие области.
Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены, используя рекомбинантные методы, синтетическим линкером, что позволяет им находиться в составе одноцепочечного белка, в котором области VL и VH соединены в пару с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный фрагмент Fv
(scFv); смотрите, например, Bird et al. , 1988 Science 242:423426; и Huston et al. , 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:58795883) . Такие одноцепочечные антитела также предназначены быть включенными в термин "антиген-связывающий участок" антитела. Эти фрагменты антитела получают, используя стандартные методики, известные специалистам в данной области техники, и проводят скрининг данных фрагментов на предмет практического применения таким же образом, как и интактные антитела.
Термин "область Fc IgG" в том смысле, в котором он здесь используется, применяется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая область Fc нативной последовательности и вариантные области Fc. Область Fc тяжелой цепи IgG человека, как правило, определяют как последовательность, включающую аминокислотные остатки, начиная с позиции С22 6 или Р230 до карбоксильного конца антитела IgG. Нумерация остатков в области Fc соответствует системе нумерации EU Index по Rabat. С-концевой лизин (остаток К447) области Fc
может быть удален, например, во время производства или очистки антитела. Соответственно, композиция антител по изобретению может включать популяции антител со всеми удаленными остатками К447, содержащие остатки К4 4 7 популяции антител, и популяции антител, имеющие смесь антител, содержащих и не содержащих остаток К447.
Термин "выделенное антитело" в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антителу, которое практически не содержит других антител, имеющих другую антигенную специфичность (например, выделенное антитело, которое специфически связывает CD4 0, практически не содержит антител, которые специфически связывают отличные от CD4 0 антигены). Выделенное антитело, которое специфически связывает CD4 0, может, однако, иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы CD4 0 из других (отличных от человека) видов. Более того, выделенное антитело может практически не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.
Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" в том смысле, в котором они здесь используются, относится к производству молекул антитела одномолекулярного состава. Композиция моноклонального антитела обладает единственной специфичностью связывания и аффинностью в отношении определенного эпитопа.
Термин "гуманизированное антитело" в том смысле, в котором
он здесь используется, включает антитела, которые содержат
минимальную последовательность, полученную из отличных от
человеческих последовательностей иммуноглобулинов. В
большинстве случаев, гуманизированные антитела представляют
собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в
которых остатки из гипервариабельной области (также известной
как определяющая комплементарность область или CDR) реципиента
заменены остатками из гипервариабельной области
иммуноглобулинов, отличных от человека видов (донорское антитело), таких как мышь, крыса, кролик или отличные от человека приматы, имеющие заданную специфичность, аффинность и
способность. Фраза "определяющая комплементарность область" относится к аминокислотным последовательностям, которые одновременно определяют аффинность и специфичность связывания области природного фрагмента Fv сайта связывания нативного иммуноглобулина. Смотрите, например, Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917: Rabat et al. (1991) US Dept. of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Фраза "константная область" относится к фрагменту молекулы антитела, который придает эффекторные функции. В предыдущей работе, направленной на производство неиммуногенных антител для использования в терапии человеческих заболеваний, мышиные константные области были заменены человеческими константными областями. Константные области гуманизированных антител субъекта были получены из иммуноглобулинов человека. Гуманизация может быть выполнена, руководствуясь методом Winter и соавторов (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327: Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536), путем замены крысиных и мутантных крысиных CDR или последовательностей CDR соответствующими последовательностями человеческого антитела. В некоторых случаях, остатки в каркасных областях одной или нескольких вариабельных областей человеческого иммуноглобулина замещают соответствующими остатками отличных от человеческих иммуноглобулинов (смотрите, например, патенты США №№ 5585089; 5693761; 5693762; и 6180370) . Более того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые нельзя обнаружить в реципиентном антителе или в донорском антителе. Гуманизированное антитело по изобретению также включает, по меньшей мере, участок константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, таковой человеческого иммуноглобулина и, в данном случае, молчащую область Fc IgG.
Антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими последовательностями (например, мутации, появившиеся в результате случайного или сайт-специфичного мутагенеза in vitro или в результате соматической мутации in vivo). В частности, термин
"гуманизированное антитело" включает антитела, которые содержат в своем составе молчащий вариант области Fc IgG.
Термин "гуманизированное моноклональное антитело" относится к антителам, обладающим единственной специфичностью связывания, которые имеют вариабельные области, в которых вариабельные области гуманизированы последовательностями, отличными от человеческих.
Термин "рекомбинантное антитело" в том смысле, в котором
он здесь используется, включает все человеческие или
гуманизированные антитела, которые синтезированы,
экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными
способами, как, например, антитела, выделенные из животного
(например, мыши), которое является трансгенным или
трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулинов человека,
гибридомы, созданной из них, антитела, выделенные из клетки-
хозяина, трансформированной с целью экспрессии человеческого
или гуманизированного антитела, например, из трансфектомы,
антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной
библиотеки человеческих антител, и антитела, синтезированные,
экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими
способами, которые включают сплайсинг всего или части гена
иммуноглобулина человека, последовательностей с другими
последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие или
гуманизированные антитела имеют вариабельные области, в которых
каркасная или CDR области могут быть получены из
последовательностей иммуноглобулинов человека эмбрионального
типа. В определенных вариантах осуществления изобретения,
однако, такие рекомбинантные человеческие или гуманизированные
антитела могут быть подвержены мутагенезу in vitro (или, когда
используется животное, трансгенное в отношении человеческих
последовательностей Ig, соматический мутагенез in vivo) и,
следовательно, аминокислотные последовательности областей VH и
VL рекомбинантных антител представляют собой
последовательности, которые, хотя и получены из человеческих последовательностей VH и VL эмбрионального типа и имеют к ним отношение, могут и не встречаться в природе in vivo среди
репертуара человеческих антител эмбрионального типа.
"Изотип" в том смысле, в котором он здесь используется,
относится к классу антител (например, IgM, IgE, IgG такие как
IgGl или IgG4), что обусловлено генами константной области
тяжелой цепи. Различные изотипы имеют различные эффекторные
функции. Например, изотипы дикого типа IgGl и IgG3 человека
опосредуют антитело-зависимую клеточно-опосредованную
цитоксическую (ADCC) активность.
Фразы "антитело, узнающее антиген" и "антитело, специфичное для антигена" и "антитело, направленное против антигена" используются взаимозаменяемо в настоящем документе вместе с термином "антитело, которое связывается специфически с антигеном".
В том смысле, в котором используется в настоящем документе антитело или белок, которые "специфически связываются с полипептидом CD4 0", предназначены для обозначения антитела или белка, которые связываются с человеческим полипептидом CD4 0 с KD, равной 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 1 нМ или менее.
Антитело, которое "перекрестно реагирует с антигеном, отличным от CD4 0", предназначено для обозначения антитела, которое связывается с этим антигеном с KD, равной 1 мкМ или менее, 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 1 нМ или менее. Антитело, которое "не реагирует перекрестно с определенным антигеном", предназначено для обозначения антитела, которое связывается с этим антигеном с KD, равной 100 нМ или более, или KD, равной 1 мкМ или более, или KD, равной 10 мкМ или более. В определенных вариантах осуществления изобретения такие антитела, которые не реагируют перекрестно с антигеном, демонстрируют практически не детектируемое связывание с этими белками в стандартных реакциях связывания.
Термин "Kassoc" или "Ка" в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения скорости ассоциации отдельно взятого взаимодействия антитело-антиген, тогда как термин "Kdis" или "Kd" в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения скорости диссоциации отдельно взятого взаимодействия антитело-антиген.
Термин "KD" в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения константы диссоциации, которую получают из отношения Kd к Ка (т.е. Kd/Ka) и выражают в виде молярной концентрации (М) . Значения KD для антител могут быть определены, используя методы, общепризнанные в данной области техники. Метод определения KD антитела заключается в использовании поверхностного плазмонного резонанса или в использовании биосенсорной системы, такой как система Biacore(r).
Термин "аффинность" в том смысле, в котором он здесь используется, относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в отдельно взятых иммунодоминантных сайтах. Внутри каждого иммунодоминантного сайта вариабельная область "плеча" антитела взаимодействует посредством слабых нековалентных связей с антигеном в многочисленных сайтах; чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность.
Термин "авидность" в том смысле, в котором он здесь используется, относится к информативному показателю общей стабильности или силы взаимодействия комплекса антитело-антиген. Она контролируется тремя основными факторами: аффинностью эпитопа антитела; валентностью как антигена, так и антитела; структурной конфигурацией взаимодействующих частей. В конечном счете эти факторы определяют специфичность антитела, то есть вероятность того, что определенное антитело связывается с определенным эпитопом антигена.
Термин "антагонист CD4 0" в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения антитела или белка, который ингибирует индуцированную CD4 0 сигнальную активность в присутствии CD4 0L в анализе клеток человека, таком как анализ CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС. Такой анализ описан более подробно в нижеприведенных примерах. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела или белки по изобретению ингибируют индуцированное CD4 0L проведение сигнала со значением IC50, равным 500 нг/мл или менее, предпочтительно, со значением IC50, равным 50 нг/мл или менее, например, со значением IC50, равным 20 нг/мл или менее, как было измерено в анализе CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС.
Антитело "без агонистической активности" в том смысле, в котором используется в настоящем документе, предназначено для обозначения антитела, которое значимо не увеличивает CD4 0-опосредованную сигнальную активность в отсутствие CD4 0L в клеточном анализе, таком как анализ CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС. Такой анализ описан более подробно в нижеприведенных примерах.
Термин "ADCC" или "антитело-зависимая клеточная цитотоксичность" в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антиклеточной активности. Активность ADCC может быть измерена анализом ADCC, как описано более подробно в нижеприведенных примерах.
Термин "молчащее" антитело в том смысле, в котором он используется в настоящем документе, относится к антителу, которое проявляет низкую активность ADCC или не проявляет вовсе, что измеряется анализом ADCC, как описано в примерах.
В одном варианте осуществления изобретения термин "отсутствующая или низкая активность ADCC" означает, что молчащее антитело проявляет активность ADCC, величина которой ниже 50% специфичного клеточного лизиса, например, ниже 10% специфичного клеточного лизиса, что измеряется анализом ADCC, как описано в примерах. Отсутствие активности ADCC означает, что молчащее антитело проявляет активность ADCC (специфичный клеточный лизис), величина которой ниже 1%. В конкретном варианте осуществления изобретения молчащее антитело по изобретению не проявляет какой-либо значимой активности ADCC, измеренной анализом ADCC, как описано в примерах.
Сниженные эффекторные функции могут быть получены введением мутации во фрагмент Fc антител и были описаны в данной области техники: LALA и N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 20 (6) :685-691) ; и D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181:6664-69; Strohl, W., supra). Примеры молчащих Fc IgGl антител включают так называемый мутант LALA, включающий мутацию L2 34A и L2 35A в аминокислотной последовательности Fc IgGl. Другой пример молчащего антитела IgGl включает мутацию D2 65A. Другое молчащее антитело IgGl
включает мутацию N2 97A, результатом которой являются агликозилированные/негликозилированные антитела.
Термин "селективный" для антитела или белка по изобретению в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антителу или белку, которые связываются с определенным полипептидом-мишенью, но не с близкородственным полипептидом.
Термин "высокая аффинность" для антитела в том смысле, в котором он здесь используется, относится к антителу, имеющему величину KD, равную 1 нМ или менее, для антигена-мишени. Термин "субъект" в том смысле, в котором он здесь используется, включает любого человека или отличного от человека животного.
Термин "отличное от человека животное" включает всех позвоночных, например, млекопитающих и не являющихся млекопитающими, такие как отличные от человека приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.д.
Термин "оптимизированный" в том смысле, в котором он здесь
используется, означает, что нуклеотидная последовательность
была изменена для кодирования аминокислотной
последовательности, используя кодоны, предпочтительные в продуцирующей клетке или организме, в основном, эукариотической клетке, например, клетке Pichia, клетке Trichoderma, клетке яичника китайского хомячка (СНО) или клетке человека. Оптимизированную нуклеотидную последовательность конструируют, чтобы полностью или как можно больше сохранить аминокислотную последовательность, изначально кодируемую исходной нуклеотидной последовательностью, которая также известна как "родительская" последовательность. Оптимизированная последовательность в настоящем документе была сконструирована, чтобы содержать кодоны, предпочтительные для клеток млекопитающих СНО, однако оптимизированная экспрессия этих последовательностей в других эукариотических клетках также предусмотрена в настоящем документе. Аминокислотные последовательности, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями, также называются оптимизированными.
Процент идентичности между двумя последовательностями в том смысле, в котором используется в настоящем документе,
является функцией числа идентичных позиций, являющихся общими
для данных последовательностей (т.е., % идентичности = #
идентичных позиций/общее количество # позиций 400), учитывая
количество несовпадений и длины каждого несовпадения, которые
должны быть введены для оптимального наложения двух
последовательностей. Сравнение последовательностей и
определение процента идентичности между двумя
последовательностями может быть выполнено, используя математический алгоритм, как описано ниже.
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен, использую алгоритм Е. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), используя таблицу веса остатков РАМ12 0, штраф длины разрыва 12 и штраф разрыва 4. Альтернативно, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен, используя алгоритм Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444453, 1970), который был включен в программу GAP в пакете программы GCG (доступно на сайте http://www.gcg.com), используя либо матрицу Blossom 62, либо матрицу РАМ250, и вес разрыва 16, 14, 12, 10, 8, б или 4 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или б.
Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями аминокислот может быть также определен, используя, например, алгоритмы, такие как программа BLASTN для последовательностей нуклеиновых кислот, используя по умолчанию длину слова (W) 11, ожидание (Е) 10, М=5, N=4 и сравнительный анализ обеих цепей.
Рекомбинантные антитела
Антитела по изобретению включают гуманизированные рекомбинантные антитела mAbl-тАЬЗ, выделенные и структурно охарактеризованные по их полноразмерным аминокислотным последовательностям тяжелой и легкой цепи, как описано ниже в таблице 1:
Соответствующие вариабельные области, аминокислотные последовательности VH и VL таких выделенных антител тАЫ-тАЬЗ по изобретению все происходят из одного и того же антитела Chirl2.12, ранее описанного, например, в WO2006/073443 и состоящего из аминокислотной последовательности VH SEQ ID N0:7 и аминокислотной последовательности VL SEQ ID N0:8.
Одно важное отличие антител по изобретению по сравнению с исходным Chirl2.12 состоит в том, что они имеют область Fc, состоящую из молчащей области Fc IgG, например, молчащая область Fc IgGl.
Модификация области Fc IgGl для получения тАЫ-тАЬЗ
В частности, в таблице 2 суммированы данные по модификации области Fc IgGl, выполненной для получения антител тАЫ-тАЬЗ, в сравнении с исходным антителом Chirl2.12.
Другие антитела по изобретению включают таковые, имеющие аминокислоты, которые были мутированы делецией, вставкой или заменой аминокислот, и, тем не менее, имеют, по меньшей мере, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности с областями VH и VL Chirl2.12, соответственно SEQ ID N0:7 и SEQ ID N0:8, и включающие молчащую область Fc IgG, например молчащую
область Fc IgGl.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело по изобретению представляет собой мутантный вариант любого из тАЫ-тАЬЗ, где указанное антитело мутантного варианта включает мутантную аминокислотную последовательность, где не более чем 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были мутированы делецией, вставкой или заменой аминокислот в областях VH и VL при сравнении с областями VH и VL Chirl2.12, соответственно SEQ ID N0:7 и SEQ ID N0:8 и сохраняя те же самые константные области как тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ.
Полноразмерные нуклеотидные кодирующие последовательности легкой и тяжелой цепи тАЫ-тАЬЗ представлены в таблице 3 ниже.
Таблица 3
Полноразмерные кодирующие ДНК-последовательности тяжелой и
Другие нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела по изобретению, включают нуклеиновые кислоты, которые были мутированы нуклеотидной делецией, вставкой или заменой, и, тем не менее, имеют, по меньшей мере, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 10 0% идентичности кодирующим областям VH и VL Chirl2.12, как отображено в последовательностях, описанных, например, в SEQ ID N0:20 и SEQ ID N0:21, соответственно, и включая кодирующую последовательность молчащей области Fc IgG, например, молчащей области Fc IgGl.
В некоторых вариантах осуществления, изобретение включает альтернативные варианты нуклеиновых кислот, где не более чем 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов были изменены нуклеотидной делецией, вставкой или заменой в кодирующих областях VH и VL с кодирующими областями VH и VL, представленных в последовательностях,
описанных, например, в SEQ ID N0:20 и SEQ ID N0:21, соответственно, и сохраняя те же самые кодирующие последовательности константных областей как соответствующие кодирующие последовательности тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ. Гомологичные антитела
Помимо рекомбинантных антител по изобретению, тАЫ-тАЬЗ, изобретение также включает гомологичные антитела или белки, сохраняющие заданные функциональные свойства антител тАЫ-тАЬЗ.
В частности, указанные гомологичные антитела или белки по изобретению представляют собой антитела или белки, включающие антиген-связывающую часть антитела, направленного на целевой полипептид CD4 0 (SEQ ID N0:28), характеризуемое тем, что указанное антитело или белок
a) связывается с полипептидом CD4 0 с KD, равной 10 нМ или менее, и
b) включает молчащую область Fc IgG,
и где указанные гомологичные антитела или белки сохраняют заданные функциональные свойства исходных антител тАЫ-тАЬЗ.
Заданные функциональные свойства исходных антител тАЫ-тАЬЗ могут быть выбраны из одного или нескольких следующих свойств:
(i) специфически связывает CD4 0, например, величина KD равна 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, или 1 нМ или менее, измеряемая методом Biacore;
(ii) является антагонистом CD4 0, например, оно ингибирует индуцированное CD4 0L проведение сигнала, измеряемое анализом CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС;
(iii) проявляет низкую агонистическую активность или не проявляет вовсе, измеряемую анализом CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС;
(iv) перекрестно реагирует с полипептидом CD4 0 яванского макака;
(v) имеет низкую активность ADCC или вовсе ее не имеет; и
(vi) имеет подходящие свойства для разработки
лекарственного средства.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения
указанные гомологичные антитела или белки по изобретению включают молчащую область Fc IgGl, например, молчащую область Fc IgGl, выбранную из группы, состоящую из SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18 или SEQ ID N0:19.
В одном конкретном варианте осуществления, изобретение относится к антителу или белку, которые имеют нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, или аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи, или аминокислотные последовательности или нуклеотидные кодирующие последовательности всех б CDR, которые гомологичны соответствующим аминокислотным или нуклеотидным последовательностям антител тАЫ-тАЬЗ, описанных выше, в частности, в таблице 1, и указанное антитело или белок включает молчащую область Fc IgG, выбранную из группы, состоящую из области Fc тАЫ (SEQ ID N0:17), области Fc тАЬ2 (SEQ ID N0:18) и области Fc тАЬЗ (SEQ ID N0:19), где указанное гомологичное антитело или белок специфически связывается с CD4 0, и антитело или белок обладает следующими функциональными свойствами: является антагонистом CD40, обладает низкой агонистической активностью или не обладает ею вовсе, и имеет низкую активность ADCC или не имеет ее вовсе.
Например, изобретение относится к антителам или белкам, гомологичным тАЫ-тАЬЗ, включающим молчащую область Fc IgG, выбранную из группы, состоящую из области Fc тАЫ (SEQ ID N0:17), области Fc тАЬ2 (SEQ ID N0:18) и области Fc тАЬЗ (SEQ ID N0:19), и включающим последовательности вариабельной тяжелой цепи (VH) и вариабельной легкой цепи (VL) , где последовательности CDR имеют, по меньшей мере, 60, 70, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности соответствующим последовательностям CDR тАЫ-тАЬЗ, соответственно SEQ ID N0:1-6, где указанное гомологичное антитело или белок специфически связывается с CD4 0, и гомологичное антитело или белок обладает следующими функциональными свойствами: является антагонистом CD4 0, обладает низкой агонистической активностью или не обладает ею вовсе, и имеет низкую активность ADCC или не имеет ее вовсе.
В соответствующем конкретном варианте осуществления изобретения гомологичное антитело или белок
a) связывает CD4 0 с KD, равной 1 нМ или менее;
b) ингибирует индуцированное CD4 0L проведение сигнала с величиной IC50, равной 50 нг/мл или менее, измеренное в анализе CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС, описанном в примерах;
c) имеет низкую агонистическую активность или не имеет ее вовсе, измеренную в биоанализе, таком как анализ CD40L-опосредованной пролиферации РВМС, как описано в примерах; и
d) имеет низкую активность ADCC или не имеет ее вовсе.
Кроме того, изобретение относится к антителам или белкам,
гомологичным тАЫ-тАЬЗ, включающим молчащую область Fc IgG, выбранную из группы, состоящую из области Fc тАЫ (SEQ ID N0:17), области Fc тАЬ2 (SEQ ID N0:18) и области Fc тАЬЗ (SEQ ID N0:19), и включающим последовательности вариабельной тяжелой цепи (VH) и вариабельной легкой цепи (VL) , которые имеют, по меньшей мере, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности соответствующим последовательностям (VH) и (VL) тАЫ-тАЬЗ, соответственно SEQ ID N0:7 и SEQ ID N0:8, где указанное гомологичное антитело или белок специфически связывает CD4 0, и антитело или белок обладает следующими функциональными свойствами: является антагонистом CD40, обладает низкой агонистической активностью или не обладает ею вовсе, и имеет низкую активность ADCC или не имеет ее вовсе.
В соответствующем конкретном варианте осуществления изобретения указанное гомологичное антитело или белок
a) связывает CD4 0 с KD, равной 1 нМ или менее;
b) ингибирует индуцированное CD4 0L проведение сигнала с величиной IC50, равной 50 нг/мл или менее, измеренное в анализе CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС, описанном в примерах;
c) имеет низкую агонистическую активность или не имеет ее вовсе, измеренную в биоанализе, таком как анализ CD40L-опосредованной пролиферации РВМС, описанный в примерах; и
d) имеет низкую активность ADCC или не имеет ее вовсе.
В другом примере изобретение относится к антителам или белкам, гомологичным тАЫ-тАЬЗ, включающим молчащую область Fc
IgG, выбранную из группы, состоящую из области Fc тАЫ (SEQ ID N0:17), области Fc тАЬ2 (SEQ ID N0:18) и области Fc тАЬЗ (SEQ ID N0:19), и где: вариабельные тяжелые и легкие цепи кодируются нуклеотидной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 95% или на 100% идентична соответствующей кодирующей нуклеотидной последовательности вариабельным тяжелой и легкой цепям тАЫ-тАЬЗ, где указанное гомологичное антитело или белок специфически связывает CD4 0, и антитело или белок обладает следующими функциональными свойствами: является антагонистом CD4 0, обладает низкой агонистической активностью или не обладает ею вовсе, и имеет низкую активность ADCC или не имеет ее вовсе.
В соответствующем конкретном варианте осуществления изобретения указанное гомологичное антитело или белок
a) связывает CD4 0 с KD, равной 1 нМ или менее;
b) ингибирует индуцированное CD4 0L проведение сигнала с величиной IC50, равной 50 нг/мл или менее, измеренное в анализе CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС, описанном в примерах;
c) имеет низкую агонистическую активность или не имеет ее вовсе, измеренную в биоанализе, таком как анализ CD40L-опосредованной пролиферации РВМС, описанный в примерах; и
d) имеет низкую активность ADCC или не имеет ее вовсе.
Антитела с мутантными аминокислотными последовательностями
могут быть получены мутагенезом (например, сайт-направленным или ПЦР-опосредованным мутагенезом) молекул кодирующей нуклеиновой кислоты с последующим тестированием кодируемого измененного антитела на предмет сохраненной функции (т.е. изложенных выше функций), используя функциональные анализы, описанные в примерах ниже.
В определенных вариантах осуществления изобретения антитела или белки, гомологичные тАЫ-тАЬЗ, как описано выше, имеют консервативные модификации последовательности.
Термин "консервативные модификации последовательности" в том смысле, в котором он здесь используется, предназначен для обозначения аминокислотных замен, в которых аминокислотные
остатки замещены аминокислотными остатками, имеющими сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилалалин, метионин), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков внутри областей CDR антитела по изобретению могут быть замещены другими аминокислотными остатками из того же самого семейства боковых цепей, и измененное антитело может быть протестировано на предмет сохраненной функции, используя функциональные методы анализа, описанные в настоящем документе.
Модификации могут быть внесены в антитело по изобретению стандартными методами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела или белки по изобретению
Другой аспект изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела или белки по изобретению, как описано выше.
Примеры нуклеотидных последовательностей легкой и тяжелой
цепей любого из тАЫ-тАЬЗ могут быть получены из таблицы 3
(демонстрирующей полные нуклеотидные кодирующие
последовательности тяжелой и легкой цепей тАЫ-тАЬЗ).
Другие примеры нуклеотидных последовательностей легкой и
тяжелой цепей по изобретению представляют собой любую
последовательность, кодирующую аминокислотные
последовательности полноразмерной тяжелой и/или легкой цепей
тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, как описано в таблице 1.
Изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые получают из последних последовательностей, будучи оптимизированными для экспрессии белка в клетках млекопитающих, например, клеточных линиях СНО.
Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в клеточных лизатах, или могут быть нуклеиновыми кислотами в частично очищенном или практически чистом виде. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или "находится в практически чистом виде", когда очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, включая обработку щелочью/SDS, фракционирование в CsCl, колоночная хроматография, электрофорез в агарозном геле и другие хорошо известные в данной области техники методы. Смотрите, F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Нуклеиновая кислота по изобретению может быть, например, ДНК или РНК и может содержать или не содержать последовательности интронов. В варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК. Нуклеиновая кислота может находиться в составе вектора, таком как вектор фагового дисплея, или в рекомбинантном плазмидном векторе.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены, используя стандартные методы молекулярной биологии. Как только получают фрагменты ДНК, кодирующие, например, сегменты VH и VL, в дальнейшем можно проводить манипуляции с этими фрагментами ДНК стандартными технологиями рекомбинантной ДНК, например, для преобразования генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, гены фрагмента Fab или гена scFv. При этих манипуляциях, VL- или Ун-кодирующий фрагмент ДНК функционально связан с другой молекулой ДНК или с фрагментом, кодирующим константную область антитела тАЫ-тАЬЗ, включающую область Fc согласно SEQ ID N0:17-19.
Термин "функционально связанный" в том смысле, в котором он используется в этом контексте, означает, что два фрагмента
ДНК соединены функционально, например, таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются внутри рамки считывания, или таким образом, что белок экспрессируется под контролем заданного промотора.
Выделенная ДНК, кодирующая область VH, может быть преобразована в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания Ун-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CHI, СН2 и СНЗ). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области техники (смотрите, например, Rabat. Е. A., et al. , 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область тяжелой цепи может быть выбрана среди изотипов IgGl, включающих область Fc согласно SEQ ID N0:17-19.
Выделенная ДНК, кодирующая область VL, может быть преобразована в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген легкой цепи Fab) путем функционального связывания Уь-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константной области легкой цепи человека хорошо известны в данной области техники (смотрите, например, Rabat. Е. A., et al. , 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда.
Получение трансфектом, продуцирующих моноклональные
антитела
Антитела или белки по изобретению могут быть получены в трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, сочетание технологии рекомбинантной ДНК и методов генной трансфекции так, как это известно в данной области техники (например, Morrison,
S. (1985) Science 229:1202).
Например, для экспрессии антител, молекулы ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии или биохимии (например, химическим синтезом ДНК, ПЦР-амплификацией или клонированием кДНК, используя гибридому, которая экспрессирует представляющий интерес антитело) и молекулы ДНК могут быть вставлены в экспрессионные векторы так, что гены становятся функционально связанными с контролирующими транскрипцию и трансляцию последовательностями. В этой связи, термин "функционально связанный" означает, что ген антитела вставлен в вектор таким образом, что контролирующие транскрипцию и трансляцию последовательности внутри вектора выполняют заданные им функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и контролирующие экспрессию последовательности выбирают так, чтобы они были совместимы с используемой в целях экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, в большинстве случаев, оба гена вставлены в один и тот же экспрессионный вектор.
Гены антител вставляют в экспрессионный вектор стандартными методами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции во фрагменте гена антитела и векторе, или лигирование по тупым концам, если нет в наличии сайтов рестрикции). Вариабельные области легкой и тяжелой цепи антител, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для создания генов полноразмерного антитела путем их вставки в экспрессионные векторы, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи заданной последовательности, соответствующей указанным константным областям тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, так, что сегмент VH функционально связан с сегментом(ами) Сн внутри вектора и сегмент VL функционально связан с сегментом CL внутри вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает
секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид связан в рамке считывания с амино-концом цепи антитела. Сигнальный пептид может быть иммуноглобулиновым сигнальным пептидом или гетерологичным сигнальным пептидом (например, сигнальным пептидом из белков неиммуноглобулинового происхождения).
Помимо генов цепей антитела, рекомбинантные экспрессионные
векторы по изобретению несут регуляторные последовательности,
которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-
хозяине. Термин "регуляторная последовательность" предусмотрен
для включения промоторов, энхансеров и других элементов
контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования),
которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей
антитела. Такие регуляторные последовательности описаны,
например, в Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in
Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990).
Специалистам в данной области техники ясно, что дизайн
экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных
последовательностей, может зависеть от таких факторов, как
выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, уровень
экспрессии целевого белка, и т.д. Регуляторные
последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающих включает вирусные элементы, которые контролируют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, как, например, промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV), вируса обезьяны 40 (SV40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP) и вируса полиомы. Альтернативно, могут быть использованы регуляторные последовательности невирусного происхождения, такие как промотор убиквитина или Р-глобиновый промотор. Более того, регуляторные элементы, состоящие из последовательностей из различных источников, такие как промоторная система SRa, которая содержит последовательности из раннего промотора SV4 0 и длинного терминального повтора вируса типа 1 Т-клеточной лейкемии человека (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol.
8:466-472).
Помимо генов цепей антител и регуляторных последовательностей, рекомбинантные экспрессионные векторы по изобретению могут содержать дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точка начала репликации) и селектируемые маркерные гены. Селектируемый маркерный ген облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор
(смотрите, например, патент США №№ 4399216, 4634665 и 5179017, автором всех патентов является Axel et al.). Например, как правило, селектируемый маркерный ген придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен вектор. Селектируемые маркерные гены включают ген дигидрофолатредуктазы
(DHFR) (для использования в dhfr- клетках-хозяевах с метотрексатной селекцией/амплификацией) и ген пео (для селекции G418) .
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей, клетку-хозяина
трансфецируют экспрессионным(ыми) вектором(ами),
кодирующим(ими) тяжелые и легкие цепи, стандартными методами.
Различные формы термина "трансфекция" предназначены для
включения большого разнообразия методов, обычно используемых
для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или
эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорации,
кальций-фосфатной преципитации, DEAE-декстрановой трансфекции и
т.п. Теоретически возможно экспрессировать антитела по
изобретению либо в прокариотической, либо в эукариотической
клетке-хозяине. Экспрессия антител в эукариотических клетках,
например, клетках-хозяевах млекопитающих, дрожжах или
мицелиальных грибах, обсуждается, поскольку такие
эукариотические клетки и, в частности, клетки млекопитающих чаще, чем прокариотические клетки, осуществляют сборку и секрецию правильно уложенного и иммунологически активного антитела.
В одном частном варианте осуществления изобретения, вектор клонирования или экспрессии по изобретению включает либо, по
меньшей мере, одну из нижеприведенных кодирующих последовательностей (а) -(с) , функционально связанных с подходящими промоторными последовательностями:
(a) SEQ ID N0:22 и SEQ ID N0:23, кодирующие, соответственно, полноразмерные тяжелые и легкие цепи тАЫ;
(b) SEQ ID N0:24 и SEQ ID N0:25, кодирующие, соответственно, полноразмерные тяжелые и легкие цепи тАЬ2; или
(c) SEQ ID N0:26 и SEQ ID N0:27, кодирующие, соответственно, полноразмерные тяжелые и легкие цепи тАЬЗ.
Клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению, включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) (включая dhfr- клетки СНО, описанные Urlab и Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с DH FR селектируемым маркером, например, как описано в R. J. Kaufman и P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601621), СН0К1 dhfr+ клеточные линии, NS0 клетки миеломы, клетки COS и клетки SP2. В частности, для использования с NS0 клетками миеломы, другой экспрессионной системой является система экспрессии гена GS, представленная в публикациях РСТ W0 87/04462, W0 89/01036 и ЕР 0338841.
При введении рекомбинантных экспрессионных векторов, кодирующих гены антител, в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются культивируемыми клетками-хозяевами в течение периода времени, достаточного для обеспечения возможности экспрессии антитела в клетках-хозяевах или секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть извлечены из культуральной среды, используя стандартные методы очистки белка (смотрите, например, Abhinav et al. 2007, Journal of Chromatography 848: 28-37).
В одном частном варианте осуществления изобретения клетка-
хозяин по изобретению является клеткой-хозяином,
трансфецированной экспрессионным вектором, имеющим кодирующие
последовательности, выбранные из группы, состоящей из (а)-(с),
пригодные для экспрессии тАЫ-тАЬЗ, соответственно,
функционально связанные с пригодными последовательностями
промотора:
SEQ
NO:
: 22
SEQ
NO:
: 2 3;
SEQ
NO:
: 24
SEQ
NO:
: 2 5; и
SEQ
NO:
: 26
SEQ
NO:
:27.
Последние из упомянутых клеток-хозяев затем могут дополнительно культивироваться в пригодных условиях для экспрессии и продукции антитела по изобретению, выбранного из группы, состоящей из тАЫ-тАЬЗ, соответственно.
Биспецифические молекулы
В другом аспекте настоящее изобретение представляет
биспецифические или мультиспецифические молекулы, включающие
антитело анти-СО4 0 или белок по изобретению. Антитело или белок
по изобретению могут образовать производное или быть
присоединенными к другой функциональной молекуле, например,
другому пептиду или белку (например, другому антителу или
лиганду для рецептора), для образования биспецифической
молекулы, которая связывается, по меньшей мере, с двумя
различными сайтами связывания или молекулами-мишенями. Антитело
по изобретению может фактически быть производными или быть
связанным с более чем одной другой функциональной молекулой для
образования мультиспецифических молекул, которые связываются с
более, чем двумя различными сайтами связывания и/или
молекулами-мишенями; такие мультиспецифичные молекулы также
попадают под термин "биспецифическая молекула" в том смысле, в
котором он используется в настоящем документе. Для создания
биспецифической молекулы по изобретению, антитело или белок по
изобретению могут быть функционально связаны (например,
химическим присоединением, генетическим сцеплением,
нековалентной связью или иным способом) с одной или несколькими другими связывающими молекулами, такими как другим антителом, фрагментом антитела, пептидом или миметиком связывания, таким образом, чтобы в результате получить биспецифическую молекулу.
В этой связи настоящее изобретение включает биспецифическую молекулу, включающую, по меньшей мере, одну специфическую молекулу связывания для CD4 0, например, одну антиген-связывающую часть любого из тАЫ-тАЬЗ, и вторую специфическую молекулу связывания для второго эпитопа мишени.
Например, второй эпитоп мишени представляет собой другой эпитоп CD4 0, отличный от первого эпитопа мишени. Другим примером является биспецифическая молекула, включающая, по меньшей мере, одну первую специфическую молекулу связывания CD4 0, например, одну антиген-связывающую часть любого из тАЫ-тАЬЗ, и вторую специфическую молекулу связывания для эпитопа внутри CD4 0.
Кроме того, в случае изобретения, в котором биспецифическая молекула является мультиспецифичной, молекула может дополнительно включать третью специфическую молекулу связывания в дополнение к первому и второму эпитопу мишени.
Биспецифические молекулы настоящего изобретения могут быть
получены путем объединения составных частей специфических
молекул связывания, используя методы, известные в данной
области техники. Например, каждая специфическая молекула
связывания биспецифической молекулы может быть получена
отдельно и затем объединена друг с другом. Когда специфические
молекулы связывания являются белками или пептидами,
разнообразные объединяющие или перекрестно-связывающие агенты
могут быть использованы для ковалентного соединения. Примеры
перекрестно-реагирующих агентов включают белок А, карбодиимид,
N-сукцинимидил-З-ацетилтиоацетат (SATA), 5,5'-дитиобис(2-
нитробензойная кислота) (DTNB), о-фенилендималеимид (oPDM), N-
сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и
сульфосукцинимидил 4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-
карбоксилат (сульфо-SMCC) (смотрите, например, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. , 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие методы включают те, что описаны в Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), и Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139:2367-2375). Конъюгирующими агентами являются SATA и сульфо-SMCC, имеющиеся в наличие в Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Когда специфическими молекулами связывания являются антитела, они могут быть конъюгированы посредством связывания сульфгидрильных групп С-концевых шарнирных областей двух тяжелых цепей. В частном варианте осуществления изобретения,
шарнирную область модифицируют с целью содержания нечетного числа сульфгидрильных групп, например одной, до конъюгирования.
Альтернативно, обе специфических молекул связывания могут быть кодированы в одном и том же векторе, их экспрессия и сборка может происходить в одной и той же клетке-хозяине. Этот метод особенно удобен в том случае, когда биспецифическая молекула представляет собой mAbxmAb, mAbxFab, Fab*F(ab')2 или лиганд х химерный белок Fab. Биспецифическая молекула по изобретению может быть одноцепочечной молекулой, включающей одно одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечной биспецифической молекулой, включающей две детерминанты связывания. Биспецифические молекулы могут включать, по меньшей мере, две одноцепочечные молекулы. Методы получения биспецифических молекул описаны, например, в патенте США № 5260203; патенте США № 5455030; патенте США № 4881175; патенте США № 5132405; патенте США № 5091513; патенте США № 5476786; патенте США № 5013653; патенте США № 5258498 и патенте США № 5482858.
Связывание биспецифических молекул с их специфическими мишенями может быть подтверждено, например, иммуносорбентным ферментным анализом (ELISA), радиоиммунологическим анализом (REA), методом с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS), биоанализом (например, ингибированием роста) или анализом Вестерн-блот. Каждый из этих анализов, в основном, определяет наличие представляющих особый интерес комплексов белок-антитело путем использования меченого реагента (например, антитела), специфичного к исследуемому комплексу.
Мультивалентные антитела
В другом аспекте настоящее изобретение представляет мультивалентные антитела, включающие, по меньшей мере, две идентичные или отличные друг от друга антиген-связывающие части антител по изобретению, связывающиеся с CD4 0, например, выбранные из антиген-связывающих частей любого из тАЫ-тАЬЗ. В одном варианте осуществления изобретения мультивалентные антитела обладают, по меньшей мере, двумя, тремя или четырьмя
антиген-связывающими частями антител. Антиген-связывающие части могут быть связаны друг с другом посредством белкового сцепления или ковалентной или нековалентной связи. Альтернативно, методы соединения были описаны для биспецифических молекул. Четырехвалентные соединения могут быть получены, например, антителом, перекрестно связывающим антитела по изобретению, которое связывается с константными областями антител по изобретению, например, областью Fc или шарнирной областью.
Методы терапии, используя антагонистические анти-СР4 0 антитела по изобретению
Методы изобретения направлены на использование анти-СБ4 0 антител или белков по изобретению для лечения субъектов (например, пациентов), имеющих аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где заболевание и/или воспаление опосредовано CD4 0L-опосредованным проведением сигнала CD4 0 в клетках, экспрессирующих антиген CD4 0.
Методы определения экспрессии CD4 0 в клетках хорошо известны в данной области техники и включают, помимо прочего, метод ПЦР, иммуногистохимию, проточную цитометрию, Вестерн-блот, ELISA и др.
Методы по изобретению особенно пригодны для лечения воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний, где вовлечена CD4OL-опосредованная стимуляция CD4 0.
Воспалительные заболевания характеризуются воспалением и деструкцией ткани или сочетанием этих двух процессов. "Воспалительное заболевание" включает любой воспалительный иммуно-опосредованный процесс, где инициирующий фактор или мишень иммунного ответа включает чужой(ие) антиген(ы), включая, например, аллоантигены, ксеноантигены, вирусные антигены, бактериальные антигены, неизвестные антигены или аллергены.
Более того, в контексте настоящего изобретения, термин "воспалительное(ые) заболевание(я)" включает "аутоиммунное(ые) заболевание(я)". Под термином "аутоиммунная реакция", в том
смысле, в котором он используется в настоящем документе, в основном, понимают воспалительные иммуно-опосредованные процессы, вовлекая "собственные" антигены. При аутоиммунных заболеваниях собственный(ые) антиген(ы) запускает иммунные ответы хозяина.
Кроме того, настоящее изобретение включает лечение воспаления, связанного с отторжением тканевого трансплантата. "Отторжение трансплантата" или "отторжение пересаженного лоскута ткани" относится к любому характерному для хозяина иммунному ответу против трансплантата, включая, помимо прочего, HLA-антигены, антигены группы крови и т.п.
Изобретение также может быть использовано для лечения реакции трансплантат против хозяина таким же образом, как при трансплантации костного мозга, например. При такой реакции трансплантат против хозяина костный мозг донора включает лимфоциты и клетки, которые дифференцируются в лимфоциты. Лимфоциты донора распознают антигены реципиента как чужие и осуществляют воспалительный иммунный ответ. В связи с этим, "патологический процесс трансплантат против хозяина" в том смысле, в котором используется в настоящем документе, или "реакция трансплантат против хозяина" относится к любому Т-клеточно-опосредованному иммунному ответу, в котором лимфоциты донора реагируют на антигены хозяина.
Антагонистические анти-СР4 0 антитела или белки, описанные
в настоящем документе, например тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, могут быть
использованы в соответствии с методами изобретения для лечения
аутоиммунных и/или воспалительных нарушений, включая, помимо
прочего, системную красную волчанку (SLE), дискоидную волчанку,
волчаночный нефрит, саркоидоз, воспалительный артрит, включая
болезнь Стилла, ревматоидный артрит, псориатический артрит,
синдром Рейтера, анкилозирующий спондилоартрит и подагрический
артрит, отторжение трансплантата органа или ткани, сверхострое,
острое или хроническое отторжение и/или реакцию трансплантат
против хозяина, рассеянный склероз, синдром
гипериммуноглобулинемии Е, узелковый полиартериит, первичный биллиарный цирроз, воспалительную болезнь кишечника, болезнь
Крона, целиакию (глютенчувствительную энтеропатию), первичный
синдром Шегрена (pSS), аутоиммунный гепатит, пернициозную
анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, псориаз,
склеродермию, миастению гравис, аутоиммунную
тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунный тиреоидит, базедову
болезнь, тиреоидит Хашимото, болезнь иммунных комплексов,
хроническую усталость, синдром иммунной дисфункции (CFIDS),
полимиозит и дерматомиозит, криоглобулинемию, тромболизис,
кардиомиопатия, вульгарную пузырчатку, легочный
интерстициальный фиброз, сахарный диабет типа 1 и типа 2,
гиперчувствительность замедленного типа 1, 2, 3 и 4 типов,
аллергию или аллергические нарушения,
нежелательные/непредусмотренные иммунные ответы на
терапевтические белки (смотрите, например, патентную заявку США № US 2002/0119151 и Koren et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349-60), астму, синдром Чарга-Стросса
(аллергический гранулематоз), атопический дерматит,
аллергический и ирритативный контактный дерматит, крапивницу, IgE-опосредованную аллергию, атеросклероз, ANCA-ассоциированные васкулиты, васкулит, идиопатические воспалительные миопатии, гемолитическая болезнь, болезнь Альцгеймера, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию и т.п.
Ранее было показано, что генетическая абляция или фармакологическое ингибирование сигнального пути CD40-CD154 оказывают терапевтический положительный эффект либо в клинических, либо доклинических моделях SLE, pSS, ITP, MS, болезни Крона, вульгарной пузырчатки, аутоиммунного васкулита и RA (Law CL, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009;647:8-36); медицинская потребность которых детально описана ниже.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению пригодны для лечения: (i) системной красной волчанки (волчаночного нефрита), предпочтительно для обеспечения эффективной стероид-сберегающей терапии для индукции и поддержания ремиссии и для предотвращения терминальной стадии почечной недостаточности;
(ii) первичного синдрома Шегрена, предпочтительно в
предотвращении деструкции слюнных и слезных желез, и индукции и поддержании ремиссии экстрагландулярных проявлений; (iii) аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры, предпочтительно для лечения пациентов, трудно поддающихся стандартной терапии; (iv) ANCA-ассоциированных васкулитов, предпочтительно индуцируя и поддерживая ремиссию у пациентов, трудно поддающихся терапии кортикостероидами и стероидами в умеренных дозах; (v) вульгарной пузырчатки, предпочтительно для индукции и поддержания ремиссии у пациентов, трудно поддающихся терапии кортикостероидами и стероидами в умеренных дозах; (vi) рассеянного склероза, предпочтительно для обеспечения более эффективного лечения с целью предотвращения рецидивов и прогрессирования нетрудоспособности, и для достижения нормального состояния здоровья; и (vii) болезни Крона, предпочтительно для обеспечения более эффективной терапии для поддержания ремиссии, и для лечения пациентов, трудно поддающихся терапии анти-TNF.
В некоторых других вариантах осуществления изобретения, анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению пригодны для лечения воспалительных заболеваний легких, включая, помимо прочего, отторжение легочного трансплантата, астму, саркоидоз, эмфизему, муковисцидоз, идиопатический фиброз легких, хронический бронхит, аллергический ринит и аллергические заболевания легких, такие как аллергический альвеолит, эозинофильная пневмония, облитерирующий бронхиолит вследствие трансплантации костного мозга и/или легкого или других причин, атеросклероз/флебосклероз вследствие тканевой трансплантации, а также фиброз легких в результате коллагеновых, сосудистых и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, склеродермия и красная волчанка.
"Лечение" в настоящем документе означает применение или назначение анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, субъекту, или применение или назначение фармацевтической композиции, включающей указанное анти-СБ4 0 антитело или белок по изобретению, в отношении выделенной ткани или клеточной линии
из субъекта, где субъект имеет аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, симптом, ассоциированный с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где целью является исцеление, заживление, облегчение состояния, ослабление симптомов, внесение изменений, лечение, улучшение, нормализация и воздействие на аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, любые ассоциированные симптомы аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, или на предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.
Под термином "лечение" также подразумевают применение или
назначение фармацевтической композиции, включающей анти-СБ4 0
антитела или белок по изобретению, например, антитело тАЫ,
тАЬ2 или тАЬЗ, субъекту, или применение или назначение
фармацевтической композиции, включающей указанное анти-СБ4 0
антитело или белок по изобретению, в отношении выделенной ткани
или клеточной линии из субъекта, где субъект имеет аутоиммунное
заболевание и/или воспалительное заболевание, симптом,
ассоциированный с аутоиммунным заболеванием и/или
воспалительным заболеванием, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где целью является исцеление, заживление, облегчение состояния, ослабление симптомов, внесение изменений, лечение, улучшение, нормализация и воздействие на аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, любые ассоциированные симптомы аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, или на предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.
Под "противовоспалительной активностью" подразумевают уменьшение или предотвращение воспаления. Терапия, по меньшей мере, одним анти-СБ4 0 антителом или белком по изобретению вызывает физиологический ответ, который благотворно влияет на лечение аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где в заболевание вовлечены клетки,
экспрессирующие CD4О-антиген. Следует признать, что методы по изобретению могут быть пригодны для предотвращения фенотипических изменений клеток, таких как пролиферация, активация и т.п.
В соответствии с методами по настоящему изобретению, по меньшей мере, одно анти-СБ40 антитело или белок по изобретению, как определено выше в настоящем документе, используется для стимуляции положительного терапевтического ответа в отношении лечения или предотвращения аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.
Под "положительным терапевтическим ответом" в отношении аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания подразумевают улучшение течения заболевания в связи с противовоспалительной активностью этих антител или белков, и/или улучшение симптомов, ассоциированных с данным заболеванием. То есть можно наблюдать антипролиферативный эффект, предотвращение дальнейшей пролиферации CD40-экспрессирующих клеток, уменьшение воспалительного ответа, включая, помимо прочего, сниженную секрецию цитокинов воспаления, молекул адгезии, протеаз, иммуноглобулинов (в примерах, где CD4О-экспрессирующей клеткой является В клетка), сочетание вышеперечисленного и тому подобное, повышенную продукцию противовоспалительных белков, уменьшение числа аутореактивных клеток, увеличение иммунной толерантности, ингибирование выживаемости аутореактивных клеток, и/или ослабление одного или нескольких симптомов, опосредованных стимуляцией CD4О-экспрессирующих клеток. Такие положительные терапевтические ответы не лимитированы способом применения и могут включать назначение донору, донорской ткани (как, например, перфузия органа), хозяину или сочетание вышеперечисленного и т.п.
Оценку клинического ответа можно получить, используя методы скрининга, такие как сканирование с помощью магнитной резонансной томографии (MRI), рентгенография, сканирование с помощью компьютерной томографии (СТ), проточная цитометрия или анализ с использованием клеточного сортера с возбуждением
флуоресценции (FACS), гистология, макропатологическое
исследование, биохимический анализ крови, включая, помимо прочего, изменения, детектируемые ELISA, RIA, хроматографией и т.п. Помимо этих положительных терапевтических ответов, у субъекта, которому проводят терапию антагонистическим анти-СБ4 0 антителом или белком по изобретению, можно наблюдать положительное воздействие на симптомы, связанные с заболеванием.
Под "терапевтически эффективной дозой или количеством" или "эффективным количеством" подразумевают количество анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению, которое при применении вызывает положительный терапевтическое ответ в отношении лечения субъекта с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, терапевтически эффективная доза анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, находится в диапазоне от 0,01 до 40 мг/кг, от 3 до 20 мг/кг или от 7 до 12 мг/кг. Следует признать, что метод лечения может включать единственное назначение терапевтически эффективной дозы или многократные назначения терапевтически эффективной дозы антагонистического анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению.
Дополнительным вариантом осуществления изобретения
является использование анти-СБ4 0 антител или белков по
изобретению для диагностического мониторирования уровней белка
в ткани как часть процедуры клинических испытаний, например,
определение эффективности определенной схемы лекарственной
терапии. Определение может быть облегчено соединением антитела
с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ
включают различные ферменты, простетические группы,
флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы,
биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры
пригодных ферментов включают пероксидазу хрена,
алкалинфосфатазу, Р-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры пригодных комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры пригодных
флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентного материала включают люциферазу, люциферин и экворин; примеры пригодных радиоактивных материалов включают
125 т 131т 35с т/гттт, Зтт
I, I, S или Н.
Анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению, например,
тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ могут быть использованы в сочетании с любой
известной терапией аутоиммунных и воспалительных заболеваний,
включая любое вещество или комбинацию веществ, которые заведомо
являются пригодными, или которые уже были использованы или в
данный момент используются, для лечения аутоиммунных и
воспалительных заболеваний. Такие терапевтические воздействия и
терапевтические вещества включают, помимо прочего,
хирургическую операцию или оперативное вмешательство (например,
спленэктомию, лимфаденэктомию, тиреоидэктомию, плазмаферез,
лейкофорез, трансплантацию клеток, ткани или органа, желудочно-
кишечные манипуляции, перфузию органа и т.п.), лучевую терапию,
терапию такую, как стероидная терапия и нестероидная терапия,
гормонотерапия, цитокинотерапия, терапия с дерматологическими
веществами (например, местнодействующими средствами,
используемыми для лечения кожных патологий, таких как аллергия, контактный дерматит и псориаз), иммуносупрессивная терапия, и другие способы противовоспалительной терапии моноклональными антителами и т.п. Таким образом, антагонистические анти-СБ4 0 антитела или белки, описанные в настоящем документе, назначают в сочетании, по меньшей мере, с одним другим видом терапии, включая, помимо прочего, хирургическую операцию, перфузию органа, лучевую терапию, стероидную терапию, нестероидную терапию, антибиотикотерапию, противогрибковую терапию, гормонотерапию, цитокинотерапию, терапию с дерматологическими веществами (например, местнодействующие средства, используемые для лечения кожных патологий, таких как аллергия, контактный дерматит и псориаз), иммуносупрессивная терапия, другие способы терапии с применением противовоспалительных моноклональных
антител, их сочетания и т.п.
Таким образом, в случае, когда комбинированная терапия
включает назначение анти-СБ4 0 антитела или белка по
изобретению, такого как тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, в сочетании с
назначением другого терапевтического средства, как со
стероидами в качестве одного из примеров, методы по изобретению
заключаются в совместном применении лекарственных средств,
используя отдельные композиции или единственную
фармацевтическую композицию, и в последовательном применении в любом порядке. В случае, когда методы по настоящему изобретению включают комбинированные терапевтические схемы, эти лекарственные средства могут быть применены одновременно, т.е. анти-СБ4 0 антитела или белок по изобретению применяют параллельно или в пределах одних и тех же временных рамок как и другое лекарственное средство (т.е. лекарственные средства применяют параллельно, но анти-СБ4 0 антитело или белок по изобретению не применяют точно в одно и то же время, как и другое лекарственное средство) . Альтернативно, анти-СБ40 антитело по настоящему изобретению или белок по изобретению может также быть применен до или после другой терапии. Последовательное применение различных лекарственных средств может быть выполнено независимо от того, отвечает ли лечащийся субъект на первый курс терапии, чтобы уменьшить вероятность появления ремиссии или рецидива заболевания.
В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-СБ4 0
антитела или белки по изобретению, например, тАЫ, тАЬ2 или
тАЬЗ антитело, назначают в сочетании с иммунодепрессантами или
противовоспалительными средствами, где антитело или белок и
терапевтическое(ие) средство(а) могут применяться
последовательно, в любом порядке, или одновременно (т.е. параллельно или в пределах одних и тех же временных рамок). Примеры пригодных иммунодепрессантов, которые можно применять в сочетании с антагонистическими анти-СБ4 0 антителами или белками по изобретению, например, антителом тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, включают, помимо прочего, метотрексат, циклофосфамид, мизорибин, хлорамбуцил, циклоспорин, такой как, например,
аэрозольный циклоспорин (смотрите, публикацию патентной заявки США № US 2002/0006901), такролимус (FK506; ProGrafrM), мофетила микофенолат и азатиоприн (б-меркаптопурин) , сиролимус
(рапамицин), деоксиспергуалин, лефлуномид и его
малононитриламидные аналоги; иммуносупрессивные белки, включая, например, гибридные белки анти-СТЪА4 антитела и Ig, гибридные белки стимулирующих В-лимфоциты антител (например, LYMPHOSTAT-ВТМ) и Ig (BlyS-Ig), анти-СБ80 антитела и этанерцепт (Enbrel
(RTM)), а также антитела против Т-клеток, такие как анти-СБЗ
(ОКТЗ), анти-СБ4 и т.п. Примеры пригодных противовоспалительных веществ включают, помимо прочего, кортикостероиды, такие как, например, клобетазол, галобетазол, гидрокортизон, триамцинолон, бетаметазон, флуоцинолон, флуоцинонид, преднизон, преднизолон, метилпреднизолон; нестероидные противовоспалительные средства
(NSAID), такие как, например, сульфасалазин, лекарственные средства, содержащие мезаламин (именуемые 5-ASA вещества), целекоксиб, диклофенак, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, ибупрофен, кетопрофен, меклофамат, мелоксикам, набуметон, напроксен, оксапрозин, пироксикам, рофекоксиб, салицилаты, сулиндак и толметин; ингибиторы фосфодиэстеразы-4, противовоспалительные антитела, такие как адалимумаб (HUMERA
(RTM), антагонист TNF-a) и инфликсимаб (Ремикейд, антагонист TNF-a) и т.п. Также включены иммуномодуляторы текущего или потенциального использования при лечении аутоиммунного заболевания, такие как талидомид или его аналоги, такие как леналидомид.
Отторжение трансплантата и реакция трансплантат против хозяина могут быть сверхострыми (гуморальными), острыми (Т-клеточноопосредованными) или хроническими (неизвестной этиологии) или их комбинацией. Таким образом, анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению, например антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, используются в некоторых вариантах осуществления изобретения, чтобы предотвратить и/или избежать отторжение и/или симптомы, ассоциированные со сверхострым, острым и/или хроническим отторжением трансплантата любой ткани, включая, помимо прочего, печень, почки, поджелудочную железу,
островковые клетки поджелудочной железы, тонкий кишечник,
легкое, сердце, роговицу, кожу, кровяные сосуды, кость,
гетерологичный или аутологичный костный мозг и т.п. Ткани
трансплантата могут быть получены из любого донора и
трансплантированы в любого реципиента-хозяина, и,
соответственно, процедура трансплантации может включать
трансплантацию животной ткани людям (например,
ксенотрансплантаты), трансплантацию ткани от одного человека другому человеку (например, аллотрансплантаты) и/или трансплантацию ткани из одной части тела человека в другую
(например, аутотрансплантаты).
Лечение антителами или белками по изобретению может также уменьшать осложнения трансплантации, такие как лихорадка, анорексия, гемодинамические нарушения, лейкопения, инфильтрацию белыми клетками крови трансплантированного органа/ткани, а также оппортунистические инфекции.
В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, могут быть использованы по отдельности или в сочетании с иммунодепрессантами для лечения и/или предотвращения отторжения трансплантата, такого как сверхострое, острое и/или хроническое отторжение, и/или реакции трансплантат против хозяина.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения, где анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению используются для лечения отторжения трансплантата, антитела, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, могут быть использованы в сочетании с пригодными иммунодепрессантами, включая, помимо прочего, метотрексат; циклофосфамид; мизорибин; хлорамбуцил; циклоспорин, такой как, например, аэрозольный циклоспорин
(смотрите, публикацию патентной заявки США № US20020006901), такролимус (FK50 6; ProGrafm), мофетила микофенолат и азатиоприн
(б-меркаптопурин), сиролимус (рапамицин), деоксиспергуалин, лефлуномид и его малононитриламидные аналоги; иммуномодуляторы, включая, например, талидомид и его аналоги; и иммуносупрессивные белки, включая, например, гибридные белки
анти-CTLA антител и Ig, гибридные белки стимулирующих В-лимфоциты антител (например, LYMPHOSTAT-BTM) и Ig (BlyS-Ig), анти-СБ80 антитела и этанерцепт (Enbrel (RTM)), а также антитела против Т-клеток, такие как анти-СБЗ (ОКТЗ), анти-СБ4 и т.п.
В связи с этим, специально предусмотрено, что композиции и методы по изобретению используются в сочетании с другими лекарственными средствами для дальнейшего улучшения симптомов и исходов у реципиентов трансплантата, как, например, у тех, которые получают трансплантаты легких или почек, например. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, используются для лечения отторжения трансплантата (такого, как, например, сверхострого, острого и/или хронического отторжения или реакция трансплантат против хозяина у реципиентов трансплантата легких или почек) по отдельности или в сочетании с циклоспорином, назначаемым парентерально и/или непарентерально, включая, например, циклоспорин перорального применения, инъецируемый циклоспорин, аэрозольный (например, ингаляционный) циклоспорин, и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения, где, по меньшей мере, составляющей терапии является аэрозольный циклоспорин, циклоспорин поступает в легкие реципиента ингаляцией циклоспорина в виде аэрозольного спрея, используя, например, находящееся под давлением приспособление для доставки препарата или аэрозольный аппарат. Циклоспорин могут назначать в виде сухого порошка или влажной лекарственной формы. Циклоспорин могут назначать в субтерапевтической дозе.
В некоторых других вариантах осуществления изобретения, анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, могут быть использованы по отдельности или в сочетании с иммунодепрессантами для лечения и/или предотвращения ревматоидного артрита. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, где анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, используются для лечения ревматоидного артрита,
указанные антитела или белки могут быть использованы в сочетании с пригодными иммунодепрессантами, включая, помимо прочего, метотрексат, циклофосфамид, мизорибин, хлорамбуцил, циклоспорин, такролимус (FK506; PROGRAFTM), мофетила микофенолат и азатиоприн (б-меркаптопурин), сиролимус
(рапамицин), деоксиспергуалин, лефлуномид и его
малононитриламидные аналоги; иммуномодуляторы, включая,
например, талидомид и его аналоги; и иммуносупрессивные белки,
включая, например, гибридные белки анти-CTLA антител и Ig,
гибридные белки стимулирующих В-лимфоциты антител (например,
LYMPHOSTAT-BTM) и Ig (BlyS-Ig), анти-СБ20 антитела (например,
RITUXAN (д) ) ; полностью человеческое антитело HuMax-CD2 0, R-
1594, IMMU-106, TRU-015, АМЕ-133, тозитумомаб/1-131,
тозитумомаб (Bexxar (D) , ибритумомаб титуксетан (Zevalin
(RTM) ) ; анти-СБ80 антитела, и этанерцепт (ENBREL), а также антитела против Т-клеток, такие как анти-СРЗ (ОКТЗ), анти-СБ4 и т.п. Как обсуждалось выше, эффективность лечения может быть оценена, используя любые способы, и включает, помимо прочего, эффективность, измеряемую клиническими ответами, определяемыми критериями Американской коллегии ревматологии или любыми другими критериями. Смотрите, например, Felson et al. (1995) Arthritis. Rheum. 38: 727-35 and van Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum. 39:34-40.
В еще других вариантах осуществления изобретения анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, могут быть использованы по отдельности или в сочетании с иммунодепрессантами для лечения и/или предотвращения рассеянного склероза. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, где анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, используются для лечения рассеянного склероза, антитела могут использоваться в сочетании с пригодными иммунодепрессантами, включая, помимо прочего, метотрексат, циклофосфамид, мизорибин, хлорамбуцил, циклоспорин, такролимус (FK506; PROGRAFTM), мофетила микофенолат и азатиоприн (б-меркаптопурин), сиролимус
(рапамицин), деоксиспергуалин, лефлуномид и его
малононитриламидные аналоги; и иммуносупрессивные белки, включая, например, гибридные белки анти-CTLA антител и Ig, гибридные белки стимулирующих В-лимфоциты антител (например, LYMPHOSTAT-BTM) и Ig (BlyS-Ig), анти-СБ20 антитела (например, RITUXAN (D) ; полностью человеческое антитело HuMax-CD20, R-1594, IMMIJ-106, TRU-015, АМЕ-133, тозитумомаб/1-131, тозитумомаб (Bexxar (RTM)), ибритумомаб титуксетан (Zevalin (RTM)); анти-СБ80 антитела, и этанерцепт (ENBREL), а также антитела против Т-клеток, такие как анти-СБЗ (ОКТЗ), анти-СБ4, вещества, вовлеченные в модуляцию рецептора S1P, включая, например, финголимод; и т.п.
Фармацевтические композиции и способы применения
Анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению применяют в концентрации, которая является терапевтически эффективной для предотвращения или лечения аутоиммунных заболеваний и/или воспалительных заболеваний и/или для предотвращения или снижения рисков, ассоциированных с отторжением трансплантата при трансплантации.
Для достижения этой цели антитела могут быть изготовлены, используя ряд приемлемых вспомогательных веществ, известных в данной области техники. Как правило, антитела или белки назначают в виде инъекций, например, либо внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно. Методы выполнения этого назначения известны среднему специалисту в данной области техники. Также представляется возможным получить композиции, которые могут быть применены местно или перорально, или которые могут обладать способностью проникать через мембраны слизистой.
Внутривенное применение осуществляют предпочтительно инфузией в течение периода от приблизительно 1 до приблизительно 10 часов, более предпочтительно в течение периода от приблизительно 1 до приблизительно 8 часов, еще более предпочтительно в течение периода от приблизительно 2 до приблизительно 7 часов, еще более предпочтительно в течение периода от приблизительно 4 до приблизительно б часов, в зависимости от применения анти-СБ4 0 антитела или белка. Начальная инфузия фармацевтической композиции может быть
назначена в течение периода от приблизительно 4 до приблизительно б часов с последующими инфузиями, проводимыми быстрее. Последующие инфузии могут быть назначены в течение периода от приблизительно 1 до приблизительно б часов, включая, например, от приблизительно 1 до приблизительно 4 часов, от приблизительно 1 до приблизительно 3 часов или от приблизительно 1 до приблизительно 2 часов.
Фармацевтическая композиция по изобретению создается, чтобы быть совместимой с предусмотренным способом применения. Примеры возможных способов применения включают парентеральный
(например, внутривенный (IV), внутримышечный (IM),
внутрикожный, подкожный (SC) или инфузионный), пероральный или легочный (например, ингаляционный), назальный, трансдермальный
(местный), трансмукозальный и ректальный способ применения. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения могут включать следующие компоненты: стериальный разбавитель, такой как вода для инъекции, солевой раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные вещества, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты и вещества для корректировки тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Величина рН может быть скорректирована кислотами или основаниями, такими как соляная кислота или гидроксид натрия. Парентеральное средство может быть заключено в ампулы, одноразовые шприцы, или флаконы для многократного приема, сделанные из стекла или пластика.
Анти-СБ4 0 антитела или белки по изобретению обычно обеспечивают стандартным способом фармацевтически приемлемым буфером, например, стерильным солевым раствором, стерильная буферная вода, пропиленгликоль, комбинации вышеупомянутого, и др. Методы приготовления парентерально применяемых веществ описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) . Смотрите также,
например, WO 98/56418, который описывает стабилизированные
фармацевтические композиции антител, пригодные для
использования в методах по настоящему изобретению.
Количество, по меньшей мере, одного антагонистического анти-СБ4 0 антитела или белков по изобретению, подлежащих применению, легко определяется любым средним специалистом в данной области техники. Факторы, влияющие на способ применения и соответствующее количество, по меньшей мере, одного антагонистического анти-СБ40 антитела или белка, включают, помимо прочего, определенное заболевание, подлежащее терапевтическому воздействию, тяжесть заболевания, история заболевания, и возраст, рост, вес, состояние здоровья, состояние по данным физикального обследования индивидуума, проходящего терапевтическое лечение. Аналогичным образом, количество антагонистического анти-СБ4 0 антитела или белка, подлежащего применению, будет зависеть от способа применения и вводят ли субъекту единичную дозу или многократные дозы этого вещества. Как правило, более высокое дозирование анти-СБ40 антитела или белка является предпочтительным с увеличением веса пациента, проходящего терапевтическое лечение. Доза анти-СБ40 антитела или белка, подлежащего применению, находится в диапазоне от приблизительно 0,003 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, предпочтительно в диапазоне от 0,01 мг/кг до приблизительно 4 0 мг/кг.
Таким образом, например, доза может составлять 0,01, 0,03, 0, 1, 0, 3, 0, 5, 1, 1, 5, 2, 2, 5, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 4 5 или 50 мг/кг.
В другом варианте осуществления изобретения метод включает назначение многократных доз антагонистического анти-СБ4 0 антитела или его фрагмента. Метод может включать назначение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или более терапевтически эффективных доз фармацевтической композиции, включающей антагонистическое анти-СБ4 0 антитело или его фрагмент. Частота и продолжительность применения многократных доз фармацевтических композиций, включающих анти-СБ4 0 антитело или белок, может быть легко определено любым специалистом в
данной области техники. Более того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством антитела или белка может включать однократное лекарственное воздействие или, предпочтительно, может включать серию лекарственных воздействий. В предпочтительном примере, субъекта лечат антагонистическим анти-СБ4 0 антителом или белком по изобретению в диапазоне от приблизительно 0,1 до 2 0 мг/кг массы тела, один раз в неделю в течение от приблизительно 1 до 10 недель, предпочтительно от приблизительно 2 до 8 недель, более предпочтительно от приблизительно 3 до 7 недель, и даже более предпочтительно в течение приблизительно 4, 5 или б недель. Лечение можно проводить ежегодно для предотвращения рецидива или при указании на рецидив. Также принимается во внимание то, что эффективное дозирование антитела или его антиген-связывающего фрагмента, используемого для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в ходе определенного терапевтического лечения. Изменения в дозировании могут проистекать и становится очевидными из результатов диагностических анализов, как описано в настоящем документе.
Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения, схема дозирования включает первое применение терапевтически эффективной дозы, по меньшей мере, одного анти-СБ40 антитела или белка по изобретению на 1, 7, 14 и 21 дни лечебного периода. В другом варианте осуществления изобретения схема дозирования включает первое применение терапевтически эффективной дозы, по меньшей мере, одного анти-СБ40 антитела или белка по изобретению на 1, 2, 3, 4, 5, би7 дни недели в лечебном периоде. Дополнительные варианты осуществления изобретения включают схему дозирования, имеющую первое применение терапевтически эффективной дозы, по меньшей мере, одного анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению на 1, 3, 5 и 7 дни недели в лечебном периоде; схему дозирования, включающую первое назначение терапевтически эффективной дозы, по меньшей мере, одного анти-СБ40 антитела или белка по изобретению на 1 и 3 дни недели в лечебном периоде; и предпочтительную схему дозирования, включающую первое применение терапевтически
эффективной дозы, по меньшей мере, одного анти-СБ40 антитела или белка по изобретению в 1 день недели лечебного периода. Лечебный период может включать 1, 2, 3 недели, месяц, 3, б месяцев или год. Лечебные периоды могут следовать друг за другом или отделены друг от друга днем, неделей, 2 неделями, месяцем, 3, б месяцами или годом с режимом дозирования от 0,003 до 50 мг/кг, от 0,01 до 40 мг/кг, от 0,01 до 30 мг/кг, от 0,1 до 30 мг/кг, от 0,5 до 30 мг/кг, от 1 до 30 мг/кг, от 3 до 30 мг/кг, от 3 до 25 мг/кг, от 3 до 20 мг/кг, от 5 до 15 мг/кг или от 7 до 12 мг/кг. Таким образом, например, доза любого антагонистического анти-СБ4 0 антитела или его антиген-связывающего фрагмента, например, анти-СБ4 0 моноклонального антитела или белка по изобретению, может составлять 0,003, 0, 01, 0, 03, 0, 1, 0, 3, 0, 5, 1, 1, 5, 2, 2, 5, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мг/кг или другие такие дозы, находящихся в пределах диапазона от 0, 003 до 50 мг/кг. Одна и та же терапевтически эффективная доза анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению может быть назначена на всем протяжении каждой недели дозирования антитела.
Альтернативно, различные терапевтически эффективные дозы антагонистического анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению могут быть использованы в течение лечебного периода.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, начальная терапевтически эффективная доза антагонистического анти-СБ40 антитела или его антиген-связывающего фрагмента, как определено где-либо еще в настоящем документе, может находиться в более низком диапазоне дозирования (т.е. от 0,003 до 20 мг/кг) с последующими дозами, находящимися в пределах более высокого диапазона дозирования (т.е. от 20 до 50 мг/кг).
В альтернативных вариантах осуществления изобретения начальная терапевтически эффективная доза антагонистического анти-СБ4 0 антитела или его антиген-связывающего фрагмента, как определено где-либо еще в настоящем документе, может находиться в верхнем диапазоне дозирования (т.е. от 20 до 50 мг/кг) с последующими дозами, находящимися в пределах более низкого диапазона дозирования (т.е. от 0,003 до 20 мг/кг). Таким
образом, в одном варианте осуществления изобретения, начальная терапевтически эффективная доза антагонистического анти-СБ40 антитела или его антиген-связывающего фрагмента составляет от 20 до 35 мг/кг, включая приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 25 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг и приблизительно 35 мг/кг, и последующие терапевтически эффективные дозы антагонистического анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению составляют от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, включая приблизительно 5, 8, 10, 12 мг/кг и приблизительно 15 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, анти-СБ4 0 терапия начинается с назначения "нагрузочной дозы" антитела или белка по изобретению субъекту, нуждающемуся в анти-СБ4 0 терапии. Под "нагрузочной дозой" подразумевают начальную дозу анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению, которых назначают субъекту, где назначаемая доза антитела или белка по изобретению находится в пределах более высокого диапазона дозирования (т.е. от приблизительно 20 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг). "Нагрузочная доза" может быть назначена в виде однократного применения, например, однократной инфузии, где антитело или его антиген-связывающий фрагмент назначается IV, или в виде многократных применений, например, многократных инфузий, где антитело или его антиген-связывающий фрагмент назначается IV до тех пор, пока полная "нагрузочная доза" не будет введена в пределах приблизительно 24-часового периода. Вслед за назначением "нагрузочной дозы" субъекту затем вводят одну или несколько дополнительных терапевтически эффективных доз анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению. Последовательные терапевтически эффективные дозы могут быть назначены, например, в соответствии с еженедельной схемой дозирования, или один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, или один раз каждые четыре недели. В таких вариантах осуществления изобретения, последовательные терапевтически эффективные дозы, как правило, находятся в пределах более низкого диапазона дозирования (т.е. от 0,003 до 2 0 мг/кг).
Альтернативно, в некоторых вариантах осуществления
изобретения, вслед за "нагрузочной дозой" назначают последовательные терапевтически эффективные дозы анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению в соответствии со "схемой поддержания нужного состояния", где терапевтически эффективную дозу антитела или белка по изобретению назначают один раз в месяц, один раз каждые б недель, один раз каждые два месяца, один раз каждые 10 недель, один раз каждые три месяца, один раз каждые 14 недель, один раз каждые четыре месяца, один раз каждые 18 недель, один раз каждые пять месяцев, один раз каждые 22 недели, один раз каждые шесть месяцев, один раз каждые 7 месяцев, один раз каждые 8 месяцев, один раз каждые 9 месяцев, один раз каждые 10 месяцев, один раз каждые 11 месяцев, или один раз каждые 12 месяцев. В таких вариантах осуществления изобретения терапевтически эффективные дозы анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению находятся в пределах более низкого диапазона дозирования (т.е. от 0,003 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг), в частности, когда последовательные дозы назначают с более частыми интервалами, например, один раз каждые две недели до одного раза каждый месяц, или в пределах более высокого диапазона дозирования (т.е. от 20 до 50 мг/кг), в частности, когда последовательные дозы назначают с менее частыми интервалами, например, где последовательные дозы назначают с интервалом от одного месяца до 12 месяцев.
Любая фармацевтическая композиция, включающая анти-СБ4 0 антитело или белок по изобретению, обладающие заданными функциональными свойствами, описанными в настоящем документе, в качестве терапевтически активного компонента может быть использована в методах по изобретению. Следовательно, жидкие, лиофилизированные или высушенные распылением композиции, включающие одно или несколько анти-СБ4 0 антител или белков по изобретению, например, антитела тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, могут быть приготовлены в виде водного или неводного раствора или суспензии для последовательного назначения субъекту в соответствии с методами по изобретению.
Каждая из этих композиций включает, по меньшей мере, одно из анти-СБ4 0 антител или один из белков по настоящему
изобретению в качестве терапевтически или профилактически активного компонента.
Под "терапевтически или профилактически активным компонентом" подразумевают анти-СБ4 0 антитело или белок по изобретению, специфически включенные в композицию для достижения желаемого терапевтического или профилактического ответа в отношении лечения, предотвращения возникновения или диагностики заболевания или патологического состояния у субъекта, когда фармацевтическую композицию назначают данному субъекту. Предпочтительно, фармацевтические композиции включают стабилизирующие вещества, объемообразующие вещества или оба вещества для минимизации проблем, связанных с потерей стабильности и биологической активности белка во время приготовления и хранения.
Инертные вещества могут быть добавлены к фармацевтическим
композициям, включающим анти-СБ4 0 антитело или белок по
изобретению. Эти инертные вещества могут включать, помимо
прочего, масла, полимеры, витамины, углеводы, аминокислоты,
соли, буферы, альбумин, сурфактанты или объемообразующие
вещества. Предпочтительно, углеводы включают сахар или сахарные
спирты, такие как моно-, ди- или полисахариды, или
водорастворимые глюканы. Сахариды или глюканы могут включать
фруктозу, глюкозу, маннозу, сорбозу, ксилозу, мальтозу,
сахарозу, декстран, пуллулан, декстрин, а- и р-циклодекстрин,
растворимый крахмал, гидроксиэтиловый крахмал и
карбоксиметилцеллюлозу или смеси вышеперечисленного.
"Сахарный спирт" - это углеводород С4-С8, имеющий гидроксильную группу, и включает галактитол, инозитол, маннитол, ксилитол, сорбитол, глицерол и арабит. Эти сахара или сахарные спирты могут быть использованы индивидуально или комбинированно. Концентрация сахара или сахарного спирта может находиться в пределах от 1,0% до 7% вес/объем, более предпочтительно от 2,0% до б% вес/объем. Например, аминокислоты включают левовращающие (L) формы карнитина, аргинина и бетаина; однако, другие аминокислоты могут быть добавлены. Предпочтительные полимеры включают поливинилпирролидон (PVP) со
средним молекулярным весом от 2000 до 3000, или полиэтиленгликоль (PEG) со средним молекулярным весом от 3000 до 5000. Сурфактанты, которые могут быть добавлены к композиции, представлены в ЕР №№ 270799 и 268110.
Кроме того, антитела могут быть химически модифицированы ковалентной конъюгацией с полимером для увеличения их времени жизни в циркулирующей крови, например. Предпочтительные полимеры и методы их прикрепления к пептидам представлены в патенте США №№ 4766106; 4179337; 4495285; и 4609546. Предпочтительные полимеры являются полиоксиэтилированными полиолами и полиэтиленгликолями (PEG). PEG растворим в воде при комнатной температуре и имеет основную формулу: R(0-СН2-СН2) пО-R, где R может быть водородом или защитной группой, такой как алкильная или алканольная группа. Предпочтительно, защитная группа имеет от 1 до 8 углеродов, более предпочтительно, когда она является метильной. Символ п является положительным целым числом, предпочтительно, от 1 до 1000, более предпочтительно от 2 до 500. PEG имеет предпочтительный средний молекулярный вес от 1000 до 40000, более предпочтительно от 2000 до 20000, наиболее предпочтительно от 3000 до 12000. Предпочтительно, PEG имеет, по меньшей мере, одну гидроксигруппу, которая более предпочтительно является концевой гидроксигруппой. Она является именно той гидроксигруппой, которая предпочтительно активируется для взаимодействия со свободной аминогруппой на ингибиторе. Однако, следует понимать, что тип и количество реактивных групп может варьировать для достижения ковалентно конъюгированного соединения PEG/антитело по настоящему изобретению.
Водорастворимые полиоксиэтилированные полиолы также пригодны в настоящем изобретении.
Они включают полиоксиэтилированный сорбитол,
полиоксиэтилированную глюкозу, полиоксиэтилированный глицерол (POG) и т.п. Предпочтительным является POG. Одна причина состоит в том, что глицероловый скелет полиоксиэтилированного глицерола является таким же, какой встречается в природе, например, у животных и людей в моно-, ди-, триглицеридах.
Следовательно, это разветвление не обязательно будет рассматриваться как чужеродное вещество в организме. POG имеет предпочтительный молекулярный вес в том же диапазоне, что и PEG. Структура POG показана в Knauf et al. (1988, J. Bio. Chem. 263: 15064-15070) и обсуждение конъюгатов POG/IL-2 можно найти в патенте США № 4766106.
Другой системой доставки лекарственного средства для повышения его времени жизни в циркулирующей крови является липосома.
Методы приготовления липосомных систем доставки обсуждаются в Gabizon et al. (1982) Cancer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129; и Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplays. Eng. 9: 4 67. Другие системы доставки лекарственного средства известны в данной области техники и описаны, например, в Poznansky et al. (1980) Drug Delivery Systems (R. L. Juliano, ed., Oxford, N. Y.) pp. 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277.
Инертное вещество, подлежащее включению в фармацевтическую композицию, должно обеспечить стабильность антагонистического анти-СР4 0 антитела или белка по изобретению. То есть, анти-СО4 0 антитело или белок по изобретению должен сохранять свою физическую и/или химическую стабильность и обладать заданными функциональными свойствами, т.е. одним или несколькими заданными функциональными свойствами, определенными выше в настоящем документе.
Методы мониторинга стабильности белка хорошо известны в
данной области техники. Смотрите, например, Jones (1993) Adv.
Drug Delivery Rev. 10: 29-90; Lee, ed. (1991) Peptide and
Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New
York); и анализ стабильности рассмотрены в настоящем документе
ниже. Как правило, стабильность белка измеряется при выбранной
температуре в определенный период времени. В предпочтительных
вариантах осуществления изобретения, стабильная
фармацевтическая композиция антитела обеспечивает стабильность антагонистического анти-СО4 0 антитела или белка по изобретению в условиях хранения при комнатной температуре (приблизительно
25°С) в течение, по меньшей мере, 1 месяца, по меньшей мере, 3 месяцев или, по меньшей мере, б месяцев, и/или стабильна приблизительно при 2-8°С в течение, по меньшей мере, б месяцев, по меньшей мере, 9 месяцев, по меньшей мере, 12 месяцев, по меньшей мере, 18 месяцев, по меньшей мере, 24 месяцев.
Считается, что белок, такой как антитело, входящий в состав фармацевтической композиции, сохраняет свою физическую стабильность в данный момент времени, если у него не обнаруживают никаких видимых признаков (т.е. изменение цвета или потеря прозрачности) или измеряемых признаков (например, используя гель-фильтрацию (SEC) или рассеивание УФ-излучения) преципитации, агрегации и/или денатурации в этой фармацевтической композиции. Что касается химической стабильности, считается, что белок, такой как антитело, входящий в состав фармацевтической композиции, сохраняет свою химическую стабильность в данный момент времени, если измерения химической стабильности указывают на то, что данный белок (т.е. антитело) сохраняет представляющую интерес биологическую активность в данной фармацевтической композиции. Методы мониторинга изменений химической стабильности хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, помимо прочего, методы определения химически измененных форм белка, таких, которые являются результатом усечения, используя, например, SDS-PAGE, SEC и/или времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы; и деградацию, связанную с изменениями молекулярного заряда (например, связанными с дезамидированием), используя, например, ион-обменную хроматографию. Смотрите, например, методы, рассмотренные ниже в настоящем документе.
Считается, что анти-СБ40 антитело или белок по изобретению в составе фармацевтической композиции сохраняет желаемую биологическую активность в данный момент времени, если желаемая биологическая активность в этот момент времени находится в пределах приблизительно 30%, предпочтительно в пределах приблизительно 2 0% желаемой биологической активности, проявляемой в момент создания фармацевтической композиции, как
определяемой подходящим методом анализа желаемой биологической активности. Методы измерения желаемой биологической активности антагонистических анти-СБ4 0 антител или белков, рассмотренных в настоящем документе, могут быть выполнены, как описано в примерах в настоящем документе. Смотрите также методы анализа, описанные в Schutze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr Transplant. 2: 615; Evans et al. (2000) J : Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman et al. (1996) Curr Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan et al. (1991) CurrentProtocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79: 439-444; and U. S. Patent Nos. 5674492 and 5847082.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, анти-СБ4 0 антитело, например, выбранное среди рекомбинантных антител тАЫ-тАЬЗ, входит в состав жидкой фармацевтической композиции. Анти-СБ4 0 антитело или белок по изобретению могут быть приготовлены, используя любой метод, известный в данной области техники, включая методы, описанные выше в настоящем документе. В одном варианте осуществления изобретения, анти-СБ40 антитело, например, выбранное среди тАЫ-тАЬЗ антител, продуцируется с использованием рекомбинантных ДНК-технологий в клеточной линии СНО.
После приготовления и очистки анти-СБ4 0 антитела оно может входить в состав жидкой фармацевтической композиции в форме, изложенной выше в данном документе. В случае, когда антагонистическое анти-СБ4 0 антитело подлежит хранению до создания композиции, оно может быть заморожено, например, при -20°С, и затем оттаяно при комнатной температуре для дальнейшего составления рецептуры.
Жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ антитела. Количество антитела, находящееся в композиции, учитывает способ применения и желаемый объем дозы.
Таким образом, жидкая фармацевтическая композиция включает
анти-СБ40 антитело, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ антитело, в концентрации в диапазоне от 0,1 до 300, 0 мг/мл, от 1,0 до 200 мг/мл, от 5,0 до 100,0 мг/мл, от 7,5 до 50 мг/мл или от 15,0 до 2 5,0 мг/мл.
Жидкая фармацевтическая композиция включает анти-СБ4 0 антитело, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ антитело и буфер, который поддерживает значение рН композиции в диапазоне от рН 5,0 до рН 7,0.
Любой пригодный буфер, который поддерживает значение рН жидкой композиции анти-СБ4 0 антитела в диапазоне от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, может быть использован в композиции при условии, что физикохимическая стабильность и желаемая биологическая активность антитела сохраняются, как указано выше в настоящем документе. Пригодные буферы включают, помимо прочего, общепринятые кислоты и их соли, где противоион может быть, например, натрием, калием, аммонием, кальцием или магнием. Примеры общепринятых кислот и их солей, которые могут быть использованы для забуферивания фармацевтической жидкой композиции, включают, помимо прочего, янтарную кислоту или сукцинат, гистидин или гидрохлорид гистидина, лимонную кислоту или цитрат, уксусную кислоту или ацетат, винную кислоту или тартрат, фосфорную кислоту или фосфат, глюконовую кислоту или глюконат, глутаминовую кислоту или глутамат, аспарагиновую кислоту или аспартат, малеиновую кислоту или малеат, оксиянтарную кислоту или малат. Концентрация буфера в составе композиции может быть в диапазоне от 1 до 50 мМ, включая приблизительно 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мМ или другие такие значения в пределах диапазона от 1 до 50 мМ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СБ4 0 антитела, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ антитела, и сукцинатный буфер или цитратный буфер или гистидиновый буфер или гистидингидрохлоридный буфер в концентрации, которая поддерживает значение рН композиции в диапазоне рН от приблизительно 5,0 до 7,0. Под "сукцинатный
буфер" или "цитратный буфер" подразумевают буфер, включающий соль янтарной кислоты или соль лимонной кислоты, соответственно. Под "гистидиновым буфером" подразумевают буфер, включающий соль аминокислоты гистидин.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, буфер является гистидиновым буфером, например, буфером гистидина гидрохлорида. Как указано выше, концентрация гистидинового буфера в составе композиции может находиться в диапазоне от 1 до 50 мМ, включая приблизительно 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мМ или другие такие значения в пределах диапазона от 1 до 50 мМ.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения противоионом сукцината или цитрата является катион натрия, и следовательно буфер является сукцинатом натрия или цитратом натрия, соответственно. Однако любой катион потенциально является эффективным. Другие возможные катионы сукцината или цитрата включают, помимо прочего, калий, аммоний, кальций и магний. Как указано выше, концентрации сукцинатного или цитратного буфера в составе композиции могут находиться в диапазоне от 1 до 50 мМ, включая приблизительно 1, 2, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 мМ или другие такие значения в пределах диапазона от 1 до 50 мМ.
В другом варианте осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция включает антагонист анти-СБ4 0 антитела, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ антитела, в концентрации от 0,1 до 300,0 мг/мл, от 1,0 до 200 мг/мл, от 5,0 до 100,0 мг/мл, от 7,5 до 50 мг/мл или от 15,0 до 25,0 мг/мл, и гистидиновый или сукцинатный или цитратный буфер, например, буфер сукцината натрия или цитрата натрия или гистидина гидрохлорида в концентрации от 1 до 50 мМ, от 5 до 4 0 мМ, от 10 до 35 мМ, предпочтительно приблизительно 30 мМ.
В случаях, когда желательно, чтобы жидкая фармацевтическая композиция была примерно изотонической, жидкая фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ антитела, и буфер для поддержания значения рН
композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, может дополнительно включать количество изотонизирующего вещества, достаточного для превращения композиции в примерно изотоническую. Под термином "примерно изотонический" подразумевают, что водная композиция имеет осмолярность в диапазоне от 240 до 800 ммоль/кг, от приблизительно 240 ммоль/кг до приблизительно 600 ммоль/кг, более предпочтительно от 240 ммоль/кг до приблизительно 440 ммоль/кг, более предпочтительно от приблизительно 2 60 ммоль/кг до приблизительно 320 ммоль/кг, еще более предпочтительно от приблизительно 27 0 до приблизительно 310 ммоль/кг.
Методы определения изотоничности раствора хорошо известны специалистам в данной области техники. Смотрите, например, Setnikar et al. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628. Специалисты в данной области техники знакомы с целым рядом фармацевтически приемлемых растворов, пригодных для обеспечения изотоничности в фармацевтических композициях. Изотонирующее вещество может быть любым реагентом, способным регулировать осмотическое давление жидкой фармацевтической композиции по настоящему изобретению до получения значения, примерно равного таковому жидкости организма. Желательно использовать физиологически приемлемое изотонирующее вещество.
Таким образом, жидкая фармацевтическая композиция,
включающая терапевтически эффективное количество
антагонистического анти-СБ4 0 антитела, например, антитела тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, и буфер для поддержания значения рН композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, может дополнительно включать компоненты, которые могут быть использованы для обеспечения изотоничности, например, хлорид натрия; аминокислоты, такие как аланин, валин и глицин; сахара и сахарные спирты (полиолы), включая, помимо прочего, глюкозу, декстрозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, маннитол, трегалозу, глицерол, сорбитол и ксилитол; уксусную кислоту, другие органические кислоты и их соли, и относительно незначительные количества цитратов или фосфатов. Специалист среднего звена знает дополнительные вещества, которые пригодны
для обеспечения оптимальной тоничности жидкой композиции.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция, включающая терапевтически эффективное количество анти-СБ40 антитела, например, антитела тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, и буфер для поддержания значения рН композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, дополнительно включает хлорид натрия в качестве изотонизирующего вещества.
Концентрация хлорида натрия в композиции зависит от вклада других компонентов в тоничность. В некоторых вариантах осуществления изобретения, концентрация хлорида натрия составляет от 50 до 300 мМ. В одном таком варианте осуществления изобретения, концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 150 мМ. В других таких вариантах осуществления изобретения, концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 150 мМ, буфером является буфер сукцината натрия или цитрата натрия в концентрации от 5 до 15 мМ, жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению, например, антитела тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, и композиция имеет значение рН от 5,0 до 7,0.
В других вариантах осуществления изобретения жидкая фармацевтическая композиция включает анти-СБ4 0 антитело или белок по изобретению, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, в концентрации в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл или от 5,0 до 25,0 мг/мл, приблизительно 150 мМ хлорида натрия, и приблизительно 10, 20, 30, 40 или 50 мМ сукцината натрия или цитрата натрия, со значением рН, равным приблизительно 5,5.
Деградация белка вследствие замораживания/оттаивания или механической деформации во время обработки жидкой фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть ингибированы включением сурфактантов в композицию для снижения поверхностного натяжения на границе раздела раствора/воздуха. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СБ4 0
антитела или белка по изобретению, например антитела тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, буфер для поддержания значения рН композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, и дополнительно включает сурфактант. В других вариантах осуществления изобретения, жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению, например, антитела тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, буфер для поддержания значения рН композиции в пределах диапазона от приблизительно рН 5,0 до приблизительно рН 7,0, изотонизирующее вещество, такое как хлорид натрия в концентрации от приблизительно 50 мМ до приблизительно 300 мМ, и дополнительно включает сурфактант.
Общепринятыми применяемыми сурфактантами являются неионные сурфактанты, включая эфиры полиоксиэтиленсорбитола, такие как полисорбат 8 0 (Tween 80) и полисорбат 2 0 (Tween 2 0); эфиры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, такие как Pluronic F68; полиоксиэтиленовые спирты, такие как Brij 35; симетикон; полиэтиленгликоль, такой как PEG400; лизофосфатидилхолин; и полиоксиэтилен-п-т-октилфенол, такой как Triton Х-100.
Классическая стабилизация фармацевтических средств сурфактантами или эмульсификаторами описана, например, в Levine et al. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45 (3) : 160-165, включенная в настоящий документ в качестве ссылки. Предпочтительным сурфактантом, применяемым на практике по настоящему изобретению, является полисорбат 80. Там, где включен сурфактант, он обычно добавляется в количестве от 0,001% до 1,0% (вес/объем).
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, жидкая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество анти-СБ4 0 антитела или белка по изобретению, например, белка тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, буфером является буфер сукцината натрия или цитрата натрия или гистидина или гистидина гидрохлорида в концентрации от 1 до 50 мМ, от 3 до 40 мМ или от 5 до 35 мМ, или от 7,5 до 30 мМ; композиция имеет значение рН от 5,0 до 7,0; и данная композиция дополнительно включает сурфактант, например, полисорбат 80, в
количестве от 0,001% до 1,0% или от 0,001% до 0,5%. Такие композиции могут в некоторых случаях включать изотонизирующее вещество, такое как хлорид натрия в концентрации от 50 до 300 мМ, от 50 до 200 мМ или от 50 до 150 мМ.
В других вариантах осуществления изобретения, жидкая фармацевтическая композиция включает анти-СБ4 0 антитело или белок по изобретению, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, в концентрации от 0,1 до 200,0 мг/мл или от 1 до 100,0 мг/мл, или от 2 до 50,0 мг/мл, или от 5,0 до 25,0 мг/мл, включая приблизительно 20,0 мг/мл; от 50 до 200 мМ хлорида натрия, включая приблизительно 150 мМ хлорида натрия; сукцината натрия или цитрата натрия от 5 до 2 0 мМ, включая приблизительно 10 мМ сукцината натрия или цитрата натрия; хлорида натрия в концентрации от 50 до 200 мМ, включая приблизительно 150 мМ; гистидин или хлорид гистидина от 5 до 50 мМ, включая приблизительно 3 0 мМ гистидина или хлорида гистидина; и в некоторых случаях сурфактант, например, полисорбат 80, в количестве от 0,001% до 1,0%, включая от 0,001% до 0,5%; где жидкая фармацевтическая композиция имеет значение рН, равное от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0.
Жидкая фармацевтическая композиция может практически не содержать каких-либо консервантов и других носителей, вспомогательных веществ или стабилизаторов, указанных выше в настоящем документе. Альтернативно, композиция может включать один или несколько консервантов, например, антибактериальных веществ, фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы, описанные выше в настоящем документе, при условии, что они не оказывают неблагоприятного воздействия на физикохимическую стабильность антагонистического анти-СБ4 0 антитела или антиген-связывающего фрагмента вышеуказанного. Примеры приемлемых носителей, вспомогательных веществ и стабилизаторов включают, помимо прочего, дополнительные буферные вещества, вспомогательные растворители, сурфактанты, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, металлокомплексы (например, Zn-белковые комплексы), и биоразлагаемые полимеры,
такие как полиэфиры. Детальное обсуждение композиции и выбор фармацевтически приемлемых носителей, стабилизаторов и изомолитов можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) .
После того, как жидкая фармацевтическая композиция или другие фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, приготовлены, они могут быть лиофилизированы для предотвращения деградации. Методы лиофилизирования жидких композиций известны средним специалистам в данной области техники. Непосредственно перед использованием композиция может быть растворены в стерильном разбавителе (растворе Рингера, дистиллированной воде или стерильном солевом растворе, например), который может включать дополнительные ингредиенты.
После растворения композицию предпочтительно назначают субъектам, используя те методы, которые известны специалистам в данной области техники.
Применение антагонистических анти-СР4 0 антител в
производстве лекарственных средств
Настоящее изобретение также представляет антагонистическое анти-СБ4 0 антитело или белки по изобретению для использования в лечении аутоиммунных заболеваний и/или воспалительных заболеваний у субъекта, где прием лекарственного средства скоординирован, по меньшей мере, с одним другим видом терапевтического лечения.
Под термином "координированный" подразумевают, что лекарственное средство должно быть использовано либо до, либо во время, либо после лечения субъекта, по меньшей мере, одним другим видом терапии. Примеры других видов терапии включают, помимо прочего, те, что описаны выше в настоящем документе, т.е. хирургическую операцию или оперативные вмешательства (например, спленэктомию, лимфаденэктомию, тиреоидэктомию, плазмаферез, лейкофорез, трансплантацию клеток, ткани или органа, перфузию органа, желудочно-кишечные манипуляции, и т.п.), лучевую терапию, терапию такую, как стероидная терапия и нестероидная терапия, гормонотерапия, цитокинотерапия, терапия с дерматологическими веществами (например, местнодействующими
средствами, используемыми для лечения кожных патологий, таких
как аллергия, контактный дерматит и псориаз) ,
иммуносупрессивная терапия, и другие способы
противовоспалительной терапии моноклональными антителами и т.п., где лечение дополнительным терапевтическим воздействием или дополнительными терапевтическими воздействиями происходит до, во время или после лечения субъекта лекарственным средством, включающим антагонистическое анти-СБ4 0 антитело или белки по изобретению, как указано выше в настоящем документе.
В одном таком варианте осуществления, настоящее изобретение представляет антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ для использования в лечении аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания у субъекта, где применение лекарственного средства скоординировано с лечением, по меньшей мере, одним другим видом терапевтического воздействия, как описано выше в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления изобретения,
применение лекарственного средства, включающего
антагонистическое анти-СБ40 антитело, например, моноклональное антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, рассмотренное в настоящем документе, или антиген-связывающий фрагмент вышеперечисленного, скоординировано с лечением двумя другими видами терапевтического воздействия.
В случае, когда применение лекарственного средства, включающего антагонистическое анти-СБ4 0, скоординировано с двумя другими видами терапевтического воздействия, использование лекарственного средства может быть до, во время или после лечения субъекта любым из двух или обоими вместе другими видами терапевтического воздействия.
Изобретение также представляет антагонистическое анти-СБ40 антитело, например, антитело тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, рассмотренное в настоящем документе, для использования в лечении аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания у субъекта, где лекарственное средство используется у субъекта, который предварительно уже прошел курс, по меньшей мере, одного другого вида терапевтического лечения.
Под термином "предварительно прошедший курс терапии" или "предварительный курс терапии" подразумевают, что субъекту был уже проведен один или несколько других видов терапевтического лечения до получения лекарственного средства, включающего антагонистическое анти-СБ4 0 антитело или белок по изобретению.
Нижеприведенные примеры предлагаются в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 демонстрирует включение 3Н-тимидина после того, как 72-часовая культура РВМС человека была стимулирована дозазависимым воздействием Chirl2.12 (незаштрихованный кружок), тАЫ (заштрихованный кружок), тАЬ2 (заштрихованный квадрат), тАЬЗ (заштрихованный треугольник) или CD4 0L человека (незаштрихованный квадрат).
Фиг.2 демонстрирует включение 3Н-тимидина после того, как
72-часовая культура РВМС человека была стимулирована
дозазависимым воздействием Chirl2.12 (незаштрихованный кружок),
тАЫ (заштрихованный кружок), тАЬ2 (заштрихованный квадрат),
тАЬЗ (заштрихованный треугольник) или CD4 0L человека
(незаштрихованный квадрат), изотипический контроль
(заштрихованный ромб) был костимулирован в присутствии либо 5 мкг/мл анти-IgM F(ab')2f либо 1 мкМ CpG2 00 6.
Фиг. 3 демонстрирует включение 3Н-тимидина после того, как 72-часовая культура РВМС человека была стимулирована дозазависимым воздействием Chirl2.12 (незаштрихованный кружок), тАЫ (заштрихованный кружок), тАЬ2 (заштрихованный квадрат), тАЬЗ (черный треугольник) или CD4 0L человека (незаштрихованный квадрат), изотипический контроль (заштрихованный ромб) был костимулирован в присутствии 75 нг/мл IL-4.
Фиг. 4 демонстрирует включение 3Н-тимидина после того, как 72-часовая культура РВМС человека была стимулирована 2 0 мкг/мл CD40L с дозазависимым воздействием Chirl2.12 (незаштрихованный кружок), тАЫ (заштрихованный кружок), тАЬ2 (заштрихованный квадрат), тАЬЗ (черный треугольник) или CD4 0L человека (незаштрихованный квадрат).
Фиг.5 демонстрирует дозазависимое связывание анти-СР4 0
антитело человека с клеточными линиями BJAB, соответственно,
Chirl2.12 (заштрихованный кружок), тАЫ (незаштрихованный
квадрат), тАЬ2 (незаштрихованный треугольник), тАЬЗ
(заштрихованный треугольник).
ПРИМЕРЫ
Материалы
1. Моноклональные антитела
Chirl2.12 (1.9 мг/мл), тАЫ (0,88 мг/мл), тАЬ2 (1,9 мг/мл), и тАЬЗ (1,9 мг/мл) были поставлены в 50 мМ цитрате рН 7,0, 140 мМ NaCl. Изотипический контроль IgG был также использован для отдельных экспериментов (Sigma, St. Louis, USA) .
2. Стимулы активации В-клеток
Кроличьи антитела против фрагмента AfiniPure F(ab') IgM человека были получены из Jackson Immuno Research (Suffolk, UK) , и CpG2006 было получено из Microsynth (Balgach, Switzerland). Рекомбинантный CD4 0L человека был получен, используя стандартные методы, известные средним специалистам в данной области техники. Супернатант, содержащий IL-4 человека, был получен, используя стандартные методы, известные средним специалистам в данной области техники.
3. Реагенты для работы с тканевыми культурами in vitro Культуральная среда для РВМС: RPMI-1640, 10% FBS, 1%
пенициллин/стрептомицин, 1% неосновные аминокислоты, 1% пируват натрия, 5 мМ р-меркаптоэтанол (все из Invitrogen, San Diego, USA) .
Методы
1. Анализ CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС 1.1 Очистка мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС)
Первичные РВМС были очищены из лейкотромбоцитарного слоя цельной крови, полученного от здоровых добровольцев (Blutspendezentrum, Basel). Лейкотромбоцитарный слой был разведен 1:4 PBS без Са2+ и Мд2 + , содержащего 5 мМ ЭДТА, и расфасован аликвотами по 25 мл в пробирки Falcon объемом 50 мл. Поверх разведенного лейкотромбоцитарного слоя наслаивали 14 мл
фиколла Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare) в расчете на одну пробирку Falcon, и центрифугировали при комнатной температуре в течение 20 мин при 2250 об/мин (без торможения) . После центрифугирования слой интерфазы был перенесен в отдельную пробирку Falcon объемом 50 мл. Слои интерфазы из нескольких пробирок (от одного донора) были объединены с образованием объема, равного или меньшего 30 мл. PBS, дополнительно содержащий 5 мМ ЭДТА, был добавлен, и клетки были центрифугированы при комнатной температуре в течение 5 мин при 2250 об/мин. Супернатант удаляли до добавления 15 мл лизирующего эритроциты буфера (RBC) и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем 2 0 мл PBS/5MM ЭДТА были добавлены, и клетки были снова центрифугированы (комнатная температура, 5 мин, 2250 об/мин). Клетки были промыты дважды в PBS/5MM ЭДТА (с промежуточными этапами центрифугирования) и ресуспендированы в 35 мл культуральной среды для РВМС до определения числа живых клеток, используя метод исключения трипанового синего. Клетки, не подлежащие немедленному использованию для стимуляции in vitro, были криоконсервированы. 1.2 Анализ стимуляции РВМС in vitro
Серия из семи двукратных разведений каждого анти-СБ4 0 или изотипического контроля mAb была сделана трижды в 9б-луночных планшетах Costar в присутствии и в отсутствие постоянной дозы величиной 5 мкг/мл анти-IgM F(ab')2f 1 мкМ CpG2006, супернатанта, содержащего IL-4 (75 нг/мл) человека, или 40 мкг/мл рекомбинантного huCD4 0L (указаны конечные концентрации). Начальные концентрации каждого анти-СБ4 0 mAb находились в диапазоне от 20 до 100 мкг/мл в зависимости от эксперимента. CD4 0L был использован в анализе дозозависимого эффекта в качестве положительного контроля для всех экспериментов. Дозы анти-IgM, CpG2006, IL-4 и CD40L были выбраны, руководствуясь предыдущими экспериментами, где способность этих реагентов (по отдельности или в комбинации) индуцировать пролиферацию РВМС или В-клеток была оценена в анализе дозозависимого эффекта (данные не показаны) . РВМС (конечная плотность 8> <104 клеток на лунку) были последовательно добавлены в каждую лунку до
инкубации в течение 3 дней при 37°С/5% СОг. 3Н-тимидин (1 мкКи/50 мкл/лунка) был добавлен в каждую лунку для культивирования в течение последних б часов до сбора клеток и определения включения тимидина, используя сцинтилляционный счетчик MicroBetaTrilux. Важно отметить, что клетки плюс культуральная среда и клетки плюс культуральная среда плюс анти-IgM, IL-4, CpG2 00 6 или CD4 0L контрольные культуры (в отсутствие анти-СБ40 mAb) были включены в каждый эксперимент.
Сцинтилляционные данные были проанализированы программой Excel и программным обеспечением GraphPad Prism. Результаты представлены среднее число импульсов в минуту (срт) (+/-стандартная ошибка среднего) в зависимости от концентрации анти-СР4 0тАЬ в логарифмической шкале. Фоновый уровень положительных контролей и клеток плюс культуральные среды указаны на каждом графике. Значения IC50 или ЕС50 были вычислены в соответствии с результативной аппроксимацией данных с помощью программы Prism.
РВМС были стимулированы, как указано выше, 2 0 мкг/мл CD4 0L в присутствии или в отсутствие дозозависимого эффекта тестируемого анти-СБ4 0 mAb в течение 3 дней. Пролиферацию оценивали по включению ЗН-тимидина после 72 часов культивирования. Результаты представлены в виде среднего значения трижды повторенного культивирования клеток с SEM и характерны для 4 доноров (независимые эксперименты). Значения IC50 для опосредованного анти-СБ4 0 mAb ингибирования представлены в мкг/мл.
2. In vitro анализ агонистов РВМС
РВМС человека были стимулированы, как указано выше в параграфе 1.2, с дозозависимым эффектом Chirl2.12, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ в течение 3 дней либо в отсутствие костимуляции, либо в присутствии либо 5 мкг/мл анти-IgM F(ab')2 либо 1 мкМ CpG2006. Пролиферацию оценивали включением 3Н-тимидина после 72 часов культивирования. Результаты представлены в виде среднего значения трижды повторенного культивирования клеток с SEM и характерны для 4 доноров (независимые эксперименты).
3. Анализ ADCC
50 мкл суспензии РВМС (10х106 клеток/мл) было добавлено в плашкис круглодонными ячейками (Corning Incorporated - Costar #3790), 50 мкл окрашенных кальцеином клеток Raj i (2хЮ5 клеток/мл) и 100 мкл разведения антитела или контролей были добавлены. Максимальный лизис определяли в 2% Triton 100.
Клетки были собраны на дне плашки (3 минуты при 250хд) и инкубированы при 37°С в увлажненной СОг-атмосфере (5%) в течение 1 часа. Клетки были отделены от культуральной среды центрифугированием (3 минуты при 750хд), и 100 мкл супернатанта было перенесено в чистые плашки с темным дном (Corning Incorporated - Costar #3904) для измерения.
Флуоресценцию измеряли при 535нм после возбуждения при 485 нм на спектрофотометре SpectraMax Gemini (Molecular Devices). Специфический лизис был вычислен, используя следующую формулу: (экспериментальное испускание - спонтанное испускание)/(максимальное испускание - спонтанное
испускание)х10 0.
4. Связывание вариантов антитела против CD4 0 человека с человеческой клеточной линией BJAB
Была использована проточная цитометрия для сравнительного анализа связывания различных вариантов фрагмента Fc анти-СО4 0 антитела с клетками BJAB человека. В связи с этим, 2> <105 клеток были посеяны в каждую лунку 9б-луночного планшета с V-образным дном. Планшеты были промыты дважды 200 мкл буфера FACS (PBS, 5% FCS, 2 мМ ЭДТА) в течение 2 мин при 4°С при 1350 хд. Супернатанты были удалены, и клетки были ресуспендированы в 100 мкл буфера FACS, содержащего 8% сыворотку человека (InVitromex, по каталогу № S4190) и инкубированы в течение 10 мин. После двух промывок варианты Fc-фрагмента антитела против CD4 0 человека были добавлены в 50 мкл буфера FACS с 1% сывороткой человека, начиная с концентрации 10 мкг/мл в разведении 1:2. Клетки были инкубированы в течение 3 0 минут на льду с последующими двумя этапами промывок. 50 мкл поликлональных кроличьих поликлональных антител против F(ab')2 IgG-FITC человека (DAKO, по каталогу № F 0315) были добавлены в каждую
лунку и инкубированы в течение 3 0 мин на льду. В конце инкубации клетки были промыты дважды, ресуспендированы в 100 мкл буфера FACS, и была получена информация на FACS Cantoll.
После получения информации средняя интенсивность флуоресцении по каналу FITC была получена в FloJo. Построение графиков и аппроксимация кривой было выполнено с помощью GraphPad Prism 5.0. Ввиду меняющихся интенсивностей между индивидуальными экспериментами, данные были нормированы. Таким образом, наибольшее значение каждой тестовой серии антитела было равно 100%. Нелинейная аппроксимация была проведена для значений в процентах.
5. Анализ CD4OL-опосредованной продукции цитокинов в дендритных клетках моноцитарного происхождения (МоРС)
5.1 Приготовление дендритных клеток моноцитарного происхождения человека
РВМС человека были приготовлены из лейкотромбоцитарных слоев, поставляемых Swiss Red Cross. Лейкотромбоцитарная масса была разбавлена 1:5 в PBS (Invitrogen, по каталогу № 20012019) и расфасована в виде аликвот по 35 мл в пробирках Falcon объемом 50 мл. Затем 13 мл Ficoll (GE Healthcare, по каталогу № 17 144 0-02) были внесены на дно каждой пробирки. Клетки были центрифугированы при 1б8 0хд при комнатной температуре в течение 2 0 мин без торможения. Содержащий РВМС слой был собран и промыт дважды в большом объеме PBS в течение 5 мин при ЮООхд. в конечном итоге клетки были ресуспендированы в 10 мл PBS и посчитаны.
Моноциты человека были выделены методом негативной селекции из ЮОхЮ7 РВМС, используя коммерческий набор по выделению моноцитов kit II производства Miltenyi (Miltenyi, Germany, по каталогу № 130-091-153) на приборе AutoMACS в соответствии с инструкцией производителя. После выделения клетки были промыты дважды в течение 5 мин при ЮООхд при 4°С в культуральной среде RPMI164 0 (Invitrogen, по каталогу № 61870010), 10% FCS (Invitrogen, по каталогу № 16000044, американского происхождения), 1 мМ пирувате натрия (Invitrogen, по каталогу № 11360039), lxNEAA (Invitrogen, по каталогу №
11140035), 1хпенициллин/стрептомицин (Invitrogen, по каталогу № 15140122)). Выделенные моноциты были посчитаны, посеяны в б-луночные планшеты плотностью 0,4хЮ6/мл и были культивированы в течение семи дней при 37°С, 5% СОг. Для дифференцировки моноцитов в дендритные клетки рекомбинант, IL-4 человека [80 нг/мл] и GM-CSF человека [100 нг/мл] (оба продуцируются в лошади), были добавлены к клеточной культуре в начале культивирования.
5.2 Стимуляция дендритных клеток (DC) для цитокиновой секреции
Незрелые дендритные клетки были собраны после 7 дней культивирования путем ополаскивания б-луночных планшетов, объединения клеток в пул и промывания их дважды в течение 5 мин при 14 00хд в культуральной среде. Затем 2> <105 iDC были посеяны в 9б-луночный плоскодонные планшеты (Becton Dickinson, по каталогу № 353072) в 100 мкл. Для положительного контроля клетки были стимулированы MegaCD4 0L (Alexis, по каталогу № ALX-522-110-С010) в концентрации 1 мкг/мл, отрицательный контроль состоял из iDC, находящихся только в культуральной среде. При анализе антагонизма варианты Fc-фрагмента антитела против CD4 0 человека были добавлены в концентрации 10 мкг/мл в разведении 1:2 наряду с 1 мкг/мл MegaCD40L для дозозависимого эффекта. Супернатанты стимулированных клеток были собраны через 2 4 ч для измерения TNFa. При анализе агонизма были добавлены только лишь варианты Fc-фрагмента антитела против CD4 0 человека в концентрации 10 мкг/мл в разведении 1:2, и супернатанты были собраны через 4 8 ч после измерения TNFa. Клетки были посеяны и стимулированы трижды для всех видов анализа.
5.3. Измерения TNF альфа методом ELISA
Для измерения количества TNFa в супернатантах был выполнен метод ELISA следующим образом. Захватывающим антителом анти-TNFa (BD Pharmingen, по каталогу № 55122 0) были покрыты планшеты для ELISA (Greiner, Nunc F96 Maxisorp, по каталогу № 442404) в концентрации 5 мкг/мл в 50 мкл, приходящихся на лунку, в течение ночи при 4°С. Для каждого этапа промывки планшеты были промыты 3 раза 250 мкл в устройстве для мойки
планшетов BioTek Elx. После первой промывки 200 мкл Superblock TBS (Thermo Scientific, Pierce, по каталогу № 37535) были инкубированы в течение часа при 37°С. Затем стандарт TNFa
(рекомбинантный TNFa человека, R &D Systems, по каталогу № 2IOTA) или образец были добавлены в 2 5 мкл. Конечная исходная концентрация стандарта составляла 2 0 нг/мл в серии разведений 1:2. Кроме того, 25 мкл детекторного антитела
(биотинилированного антитела против TNFa человека, BD Pharmingen, по каталогу № 554511) было добавлено в разведении 1:500. Планшеты были инкубированы в течение ночи при 4°С. После промывки, конъюгат авидин-POD (щелочная фосфатаза ExtrAV, Sigma, по каталогу № Е-2636) был разведен 1:5000 в Superblock TBS, добавлен в 50 мкл и инкубирован в течение часа при комнатной температуре. Планшеты были промыты, и 50 мкл субстрата п-нитрофенилфосфата (Sigma, по каталогу № С-3041) было добавлено для развития цветной реакции в течение 15 мин. Планшеты ELISA были сканированы при 450нм с помощью программного обеспечения SoftMax Pro на оборудовании SpectraMax М5 (Molecular Devices).
6. Токсикологическое исследование
Исходной первичной целью токсикологического исследования была оценка потенциальной токсичности высокой дозы (100 мг/кг) тАЫ в сравнении с Chirl2.12.
Тридцать яванских макак маврикийского происхождения было использовано для данного исследования. На момент введения дозы препарата возраст животных составлял от приблизительно 4 до 5 лет, а их вес - от 4,5 до б,б кг для самцов и от 3,1 до 4,3 кг для самок.
тАЫ (50 мг/мл) был назначен внутривенно одной группе яванских макак (5 самцов/5 самок; группа 2) в дозе 100 мг/кг и объемом 2 мл/кг один раз в неделю в течение 5 недель (применение исследуемого препарата на 1, 8, 15, 22, 29 и 36 дни). Дополнительная группа яванских макак (5 самцов/5 самок; группа 3) получала первичное антитело Chirl2.12 внутривенно путем медленной болюсной инфузии в дозе 100 мг/кг и объемом 5 мл/кг. Плацебо тАЫ объемом 2 мл/кг было введено другой группе
яванских макак, которые служили в качестве контролей (5 самцов/5 самок; группа 1). Некропсия была проведена всем животным один или два дня спустя после введения последней дозы препарата.
Было решено включить иммунизацию гемоцианином лимфы улитки (KLH) с целью оценки эффективности обоих антител анти-СБ40. На 2-й день животные были иммунизированы 1 мг KLH, адсорбированного на квасцах, с последующей бустер-инъекцией 0,5 мг KLH, адсорбированного на квасцах, на 23 день. Образцы сыворотки были взяты до иммунизации/бустера, а также на 7 и 14 дни после иммунизации и бустера, соответственно. Титры IgM/IgG, специфичных к KLH, были определены ELISA, используя контрольную сыворотку анти-KLH IgM/IgG яванских макак в качестве стандарта. Образцы крови были взяты накануне трех введений препаратов и на 15, 29 дни и в момент некропсии (день 37/38) с целью иммунофенотипирования необученных В-клеток (CD20+CD21+CD27-). Абсолютное количество необученных CD2 0 В-клеток было вычислено из общего количества лимфоцитов в образце крови и относительного количества необученных CD2 0 В-клеток, посчитанных проточной цитометрией.
Таблица 4
Сводная информация по результатам токсикологического
исследования
Номер группы
Описание группы
Величина
дозы (мг/кг/доза)
Объем дозы* (мл/кг)
Количество животных в группе
Некропсия после 5 недель
Самцы
Самки
Контроль
5 самок/5 самцов
тАЫ
100
5 самок/5 самцов
СЫг12.12
100
5 самок/5 самцов
* На основании последних, на тот момент, данных об индивидуальном весе животного
Оценку токсичности проводили на основании смертности, клинических наблюдений (клинических симптомов, включая
наблюдения после введения дозы препарата, анализа кала, осмотра шерсти и потребления пищи), веса тела, офтальмологических исследований, сердечно-сосудистых исследований, клинической патологии (включая коагуляцию, оценку внешней активации тромбоцитов, гематологию, клиническую химию и анализ мочи), веса органов, макроскопических и микроскопических аутопсийных данных. Иммунофенотипирование крови было выполнено три раза до введения дозы препарата, на 15 и 29 день в фазу дозирования, а также в день некропсии. Кроме того, иммунофенотипирование ткани селезенки и дренирующих лимфатических узлов в местах инъекции гемоцианина лимфы улитки (KLH) было выполнено в момент некропсии. Кроме того, Т-клеточнозависимый антительный ответ (TDAR) на KLH был исследован для непосредственного сравнения влияния вызывающего в полной мере ADCC Chirl2.12 с таковым тАЫ. Образцы крови были взяты от всех животных для токсикокинетической оценки и для возможной оценки антител к лекарственному средству (ADA).
7. Дополнительный анализ in vitro профиля тАЫ
7.1 Очистка РВМС
Мононуклеарные клетки периферической крови человека были получены, как описано выше в разделе 1.1.
7.2 Очистка В-клеток миндалины человека
Капсула миндалины и соединительная ткань были удалены и ткань миндалины затем была нарезана на приблизительно 5 мм большие куски до пропускания через металлическое ячеистое сито с периодическим промыванием средой для В-клеток. Клетки миндалины были затем профильтрованы дважды через 7 0 мкМ ячеистое сито для удаления клеточных обломков. В-клетки были выделены из свежеполученных РВМС, используя коммерческий набор EasySep Negative Selection Human В cell Enrichment Kit (Stemcell Technologies, Vancouver, ВС, Canada). В-клетки были очищены, используя коммерческий набор EasySep Negative Selection Human В cell Enrichment Kit, следуя инструкциям фирмы-производителя (Stemcell Technologies, Vancouver, ВС, Canada).
7.3 Оценка значений ЕС50 связывания CD40, используя РВМС или В-клетки человека и отличных от человека приматов
Серия из семи двукратных разведений каждого анти-СР4 0 или изотипического контрольного mAb была сделана трижды в 9 6-луночном планшете в присутствии концентраций ЕС8 0 человеческого рекомбинантного CD154 и IL-4. Начальные концентрации каждого анти-СР40 mAb находились в диапазоне от 20 до 100 мкг/мл в зависимости от эксперимента. Клетки и контроли среды были использованы в качестве отрицательных контролей для всех экспериментов. РВМС (макака-резус, яванского макака или человека) или В-клетки миндалины (только человеческие) были последовательно добавлены в каждую лунку до инкубации в течение 3 дней при 37°С/5% СОг. 3Н-тимидин (1 мкКи/50 мкл/лунка) был добавлен в каждую лунку для культивирования в течение последних б часов до сбора клеток и определения включения тимидина, используя сцинтилляционный счетчик.
РВМС (макака-резус, яванского макака или человека) или В-клетки миндалины (только человеческие) были инкубированы при 4°С в течение 3 0 мин с очищенными мечеными тАЫ или изотипическими контрольными антителами в исследовании дозозависимого эффекта (диапазон конечной концентрации 2,50,00125 мкг/мл). Клетки были затем промыты до инкубации с биотинилированными антителами против IgG человека (перекрестно реагирующими с таковыми отличных от человека приматов) и против IgG человека с минимальной перекрестной реактивностью с таковыми отличных от человека приматов (NHP) (R10; важно отметить, что было возможно различить В-клетки человека с мембранной экспрессией IgG либо по наличию окрашивания анти-IgM, либо путем дифференциальной интенсивности FACS-окрашивания). Клетки были снова инкубированы при 4°С в течение 3 0 мин до отмывки и подвержены заключительному окрашиванию со стрептавидин-FITC в течение 20 мин при 4°С. Затем клетки были промыты, и была выполнена оценка экспрессии CD4 0 на клетках CD2 0+ методом проточной цитометрии.
7.4 Оценка ингибирования СР154-индуцированной пролиферации РВМС или В-клеток человека и отличных от человека приматов
7.4
8. Эффективность тАЫ в сочетании с циклоспорином А в модели аллотрансплантации почек у яванского макака 8.1 Животные
Все используемые яванские макаки (Масаса fascicularis)
были самцами в возрасте 7,5-9 лет (#5529/#5533, #5523/#5524 и
#553б/#5538) , выведенные в неволе, с массой тела 7,7±0,9 кг и
родом из Филиппин (Siconbrec, Makati City, Philippines) . В
момент трансплантации животные имели нормальные
гематологические показатели, нормальный биохимический анализ сыворотки и мочи и у них не было обнаружено туберкулеза, сальмонеллы/шигеллы, антител против вирусных антигенов (Герпеса В, вируса Т-клеточного лейкоза обезьян, вируса иммунодефицита обезьян, ретровируса типа D обезьян, гепатита В) и свойственных им экто/эндопаразитов. Однако у всех животных были выявлены антитела против цитомегаловируса и вируса гепатита A (HAV)
(исследованы в 2010; животное #5536 не имело антител к HAV) . У животного #552 3 был положительный копрологический анализ на Balantidium coli в декабре 2010.
В течение первой недели после операции животных содержали в одиночных телеметрических клетках, обеспечивающие визуальный контакт с другими животными. Остальное время животных #553б/#5538 содержали вместе и 4 оставшихся животных содержали выделенно друг от друга в течение всего эксперимента
(несовместимые животные). Всех животных содержали в условиях заданной температуры (20-24°С), по меньшей мере, 40% влажности и естественного светового цикла. Всех кормили, по меньшей мере, два раза в день смесью фруктов и овощей. Вода и гранулы Kliba Nafag 3446 (Kaiseraugst, Germany) были предоставлены неограниченно.
Все эксперименты были выполнены в соответствии со швейцарскими нормами условий содержания животных по лицензии BS1555.
8.2 Экспериментальные условия
8.2.1 Трансплантация почек и послеоперационное наблюдение Пары донор/реципиент были выбраны ориентируясь на совпадение по антигенам АВО, отсутствию совпадений по экзону 2 DRB (Blancher A, Tisseyre Р, Dutaur М, et al. (2006) Immunogenetics; 58(4):269-82) и ответы в односторонней реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR), имеющие показатели MLR-стимуляции (MLR-Sls) больше 7 и меньше 47 (Bigaud М, Maurer С, Vedrine, et al. (2004) J. Pharmacol. Toxicol. Methods; 50(2):153-9). Результаты этого отбора представлены в таблице б и заключались в двойной трансплантации (обмен трансплантатами между 2 донорами). Каждому реципиенту имплантировали телеметрический зонд (Data Sciences Inc, USA) для мониторинга артериального кровяного давления, частоты сердечных сокращений и двигательной активности.
Для операции общая анестезия была вызвана кетамином; 10 мг/кг, внутримышечно, (в.м.) в сочетании с атропином (0,05 мг/кг в.м.) и поддерживалась вентиляцией N2O/O2 (50:50) и пропофолом внутривенно (в.в.) (4-10 мг/кг/ч; с добавлением 5-10 мг болюсов в случае необходимости). Почки донора были изъяты, промыты холодным (4°С) раствором UW (University of Wisconsin) (время консервирования холодом меньше или равно 4 часам) и гетеротопически трансплантированы, используя стандартные микрососудистые технологии для создания анастомоза конец в бок между почечной веной трансплантата и полой веной реципиента и между почечной артерией трансплантата и дистальным участком аорты реципиента (время создания анастомоза меньше или равно 4 0 минутам). Уретеро-цистонеостомия была выполнена сразу после появления мочи из трансплантата. Собственные почки были удалены. Послеоперационное обезболивание обеспечивали введением
бупренорфином, 0,01-0,02 мг/кг, в.м., три раза в день); антибиотики (цефотаксим, 25 мг/кг, в.м., два раза в день или цефтриаксон, 50 мг/кг, в.м. в 1% лидокаине, четыре раза в день). Обезболивание и введение антибиотиков проводили в течение 5 дней. Всякий раз, когда происходило заметное повышение или снижение числа тромбоцитов, назначали аспирин в дозе 5 мг/кг в.м. ежедневно (Aspegic, Sanofi-Aventis, Meyrin, Switzerland).
У реципиентов контролировали изменения клинических и
сердечнососудистых показателей, веса тела, потребления еды и
воды (пополнялось до макс. 100-150 мл/кг/день), выведения мочи,
гематологии (используя Beckmann Coulter ACT5Diff),
биохимический анализ сыворотки и мочи (используя анализатор
Vetscan analyzer для ежедневного определения
SCrea/SUrea/SAmylase и анализатор Beckmann Synchron СХ5 для заключительного подтверждения данных по образцам сыворотки и мочи) . Уровни сывороточного креатинина и мочевины (SUrea) были использованы в качестве маркеров функции трансплантата. Чрескожные биопсии под ультразвуковым наблюдением были выполнены иглой 16G, как описано ранее (Gaschen L, Kunkler А, Menninger К, et al. (2001) Vet. Radiol. Ultrasound; 42(3):259-64), в условиях общей анестезии на 30 день (только для животных #5529 и #5533). Кроме того, был также проведен специальный контроль свертываемости крови и агрегации тромбоцитов у животных #5529/#5533 и #5523/#5524 до и после трансплантации.
Реципиентам, в конечном счете, была проведена эвтаназия в случае (i) тяжелой степени отторжения трансплантата (например, Screa больше 500 мкмоль/л или Surea больше 20 ммоль/л), ассоциированная или нет с повышенной бальной ультразвуковой оценкой; или (ii) общих проблем со здоровьем и/или явных клинических признаков тяжелого недомогания. В момент некропсии аллотрансплантаты почек были изъяты (включая мочеточник и анастомоз) наряду с другими важными органами и обработаны для дальнейшего гистологического анализа.
Основная информация о комбинациях донор/реципиент и используемой схемы лечения
Реципиент
Вес тела (кг)
Донор
АВО
MLR-SI (односторонняя)
mAbl/CsA (мг/кг, в.в./перорально)
Дата трансплантации
5529 б1
7.35
5533 8
В/В
30/20
21.09.10
5533 8
6.1
5529 б1
в/в
30/20
21.09.10
5523 8
8.2
5524 ^
в/в
30/20
18.01.11
5524 б1
8.3
5523 8
в/в
30/20
18.01.11
5536 8
5538 8
в/в
30/20
07.06.11
5538 8
8.45
5536 б1
в/в
30/20
07.06.11
8.2.2 Воздействие тАЫ и циклоспоринаА (CsA)
тАЫ поставляли в жидкой форме при температуре хранения -8 0°С, будучи размороженным только в день инфузии. Был применен в дозе 30 мг/кг/в.в. еженедельно, за исключением первых трех доз в день -1, 0 и 1 (до и после трансплантации) . CsA для перорального применения (р.о.) представлял собой первичный концентрат микроэмульсии (раствор для питья Sandimmun Neoral (RTM), 100 мг/мл, Novartis Pharma AG). CsA применяли в ежедневной дозе (начиная с -1 дня), равной 20 мг/кг/р.о., в сочетании с тАЫ (смотрите таблицу б) .
8.2.3 Мониторинг фармакокинетики (РК), иммуногенности (антитело приматов против человеческого иммуноглобулина) и фармакодинамика (PD) тАЫ
Образцы крови (50 0 мкл сыворотки) были взяты (до внутривенного введения дозы препарата) для определения воздействия тАЫ в день -1, 3, 7 (исходный уровень и 15 мин), 14, 28, 42, 56, 70, 84 и 100. Для анализа CsA образцы крови были взяты до перорального введения дозы или CsA (С0/С24) и спустя 2 часа после применения (С2) . С2 соответствует пиковым уровням абсорбции CsA. Все образцы хранили при -80°С до дальнейшего использования (CsA detection kit, Hot Star Taq
Master Mix, Qiagen Minnesota, US) . Образцы для mAbl-иммуногенности были взяты (50 мкл сыворотки) в день -1, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 84 и 100 и хранили при -80°С. Вкратце, девяносто шестилуночные планшеты для микротитрования были покрыты рекомбинантным CD4 0 человека. Их хранили при 4°С в пределах ночи. После блокирования стандарты калибратора (Cs), образцы контроля качества (QC) и опытные экземпляры образцов, содержащие тАЫ, были добавлены в планшет. Планшет был инкубирован при +25°С в пределах 120 минут с перемешиванием. После промывки планшета мышиные антитела против легкой цепи каппа человека с последующим использованием HRP овечьего антимышиного (H+L) конъюгата были добавлены в планшет для определения сколько-нибудь тАЫ, связанного с рекомбинантным CD4 0. Для визуализации этого связывания был добавлен хромогенный субстрат (ТМВ) и интенсивность окрашивания
(поглощения) была прямо пропорциональна концентрации имеющегося тАЫ. Концентрация тАЫ в образцах затем была вычислена из калибровочной кривой. Образцы PD были получены на 2-3 дни до трансплантации в качестве исходных уровней (0,5 мл в гепарине). Впоследствии коллекция образцов была проанализирована по той же схеме, что и для образцов РК. CD2 0+ и CD3+ клетки были посчитаны с помощью TruCount Tubes (Becton Dickinson, по каталогу № 340334), используемые в соответствии с инструкциями фирмы-производителя с помощью mAb против CD4 0-APC человека
(клон 5СЗ, Becton Dickinson, по каталогу № 555591), против CD3-РегСР человека (клон SP34-2, Becton Dickinson, по каталогу № 552851) и mAb против CD20-FITC человека (клон LT20, Immunotools, по каталогу № 21279203X2). Данные были получены на проточном цитометре LSRII (Becton Dickinson Biosciences), используя программное обеспечение DIVA (версия 6.1.1) . Лимфоциты и гранулы были введены в FSC/SSC дот-блот в соответствии с размером и зернистостью, и впоследствии в них была проанализирована экспрессия CD2 0 и CD3. 8.2.4 Гистология
Все полученные ткани (биопсия трансплантата или аутопсийный материал) были исследованы макроскопически и
фиксированы в 4% формалине, содержащем буферный раствор. После дегидратации они были заключены в парафин. Парафиновые блоки были нарезаны толщиной 3 мкм и окрашены гематоксилином и эозином (НЕ) . Три дополнительных окрашивания (Шифф-йодной кислотой, трихромом и методом Верхофа) были выполнены на срезах почки. Образцы биопсии и аутопсии были исследованы опытным патоморфологом и были выставлены баллы в соответствии с классификацией Banff 07 патологии аллотрансплантата почки
(Solez К, Colvin RB, Racusen LC et al (2008) Am. J. Transplant; 8(4):753-60). Независимая оценка была также выполнена приглашенными экспертами.
Кроме того, иммуногистохимия по выявлению белка комплемента C4d была выполнена, используя поливалентное анти-C4d антитело, пригодное для окрашивания парафиновых срезов
(Regele Н, Exner М, Watschinger В, et al. 2001, Nephrol, Dial. Transplant; 16: 2058-2066). C4b считают стабильным и надежным маркером острого гуморального отторжения (AHR). После фиксации и заключения в парафин стекла (SuperFrostPlus, RTM, Menzel-Glaeser, Germany) с нанесенными срезами толщиной 3 мкм были приготовлены и высушены в течение ночи в термостате при 37°С для оптимальной адгезии к стеклам. Срезы отторгнутых почек человека были добавлены в качестве положительного контроля. Перед использованием стекла со срезами ткани были депарафинированы в ксилоле (10 мин), регидратированы путем проводки через ряд концентраций этанола и помещены в дистиллированную воду. Демаскирование антигена было выполнено варкой под давлением величиной 1 бар в течение 10 мин в цитратном буфере (рН 6.0), как описано ранее (Segerer S, Mack М, Regele Н, Kerjaschki D, Schlondorff D. Kidney Int. 1999; 56: 52-64). Для иммуноокрашивания была использована следующая методика: (i) инактивировать эндогенную пероксидазу 0,5% Н2Ог в абсолютном метаноле в течение 2 0 мин при комнатной температуре;
(ii) промыть срезы на стеклах в 0,01 М PBS, рН 7,4 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany); (iii) инкубировать срезы на стеклах 4% обезжиренным порошковым молоком "Rapilait" в PBS
(Migros Genossenschaftsbund, Switzerland) в течение 60 мин при
комнатной температуре; отобрать раствор, не промывать; (iv) инкубировать один срез на стекле с кроличьими рАЬ против C4d человека (Biomedica Medizinprodukte, Vienna, Austria) 1:40 в PBS, содержащем 1% NGtS, в течение ночи при +4°С. Второй срез на стекле служил в качестве отрицательного контроля путем нанесения кроличьего изотипического контроля (Zymed Laboratories Inc, USA) вместо первичного антитела; (v) промыть стекла со срезами в 0,01М PBS, рН 7,4; (vi) инкубировать все стекла со срезами с биотинилированными овечьими антителами против IgG кролика (Vector Laboratories, Inc. USA) 1:200 в PBS, содержащем 1% NGtS, в течение 3 0 минут при комнатной температуре; (vii) промыть стекла со срезами в 0,01М PBS, рН 7,4; (viii) инкубировать со стрептавидином/HRP (Vector Laboratories, Inc. USA) в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, (ix) проявить активность HRP с помощью АЕС+ (DakoCytomation Corp., Carpenteria, USA) в течение 8-10 мин, контролировать интенсивность окрашивания микроскопически, промыть дистиллированной водой, (х) докрасить Dako (RTM) Automation Hematoxylin (DakoCytomation Corp., Carpenteria, USA) в течение 2 мин и поменять окраску на синюю в проточной водопроводной воде в течение 5 мин; (xi) заключить в водную заливочную среду (Medite Medizintechnik AG, Switzerland).
Пример 1: Оценка агонистической активности тАЫ, тАЬ2 и
тАЬЗ
Экспериментальные данные основаны на использовании выделенных, нефракционированных исходных РВМС человека. Препараты всех РВМС (вместо выделенных В-клеток или моноцитов) более точно воспроизводят ситуацию in vivo, где анти-СР40 mAb могут оказывать разнообразные прямые и непрямые воздействия на различные клеточные типы лейкоцитов. Используя этот анализ пролиферации РВМС, было выявлено, что негликозилированные анти-CD40 тАЫ (N297A) и тАЬ2 (D265A), которые сохранили аминокислотную последовательность антиген-связывающей области, остались без изменений по сравнению с исходным Chirl2.12 mAb, сохранили неагонистические, блокирующие CD4 0L свойства исходного Chirl2.12 mAb. Антитело тАЬЗ (мутант LALA) проявляло
слабые агонистические свойства в присутствии IL-4.
В частности, экспериментальные данные демонстрируют, что ни один из молчащих фрагментов Fc анти-СБ4 0 mAb не был способен стимулировать клеточное деление РВМС человека (п=4 донора), результат, подобный тому, что наблюдают с исходным Chirl2.12 mAb (смотрите фиг.1). РВМС пролиферировали в ответ на CD4 0L. Ни тАЫ, ни тАЬ2 не могли усилить индуцированную CpG2 00 6 или анти-IgM F(ab')2 пролиферацию РВМС (фиг.2). Кроме того, Chirl2.12 не смог усилить индуцированную анти-IgM F(ab')2 пролиферацию РВМС, однако в отличие от тАЫ и тАЬ2, оно полностью ингибировало индуцированную CpG пролиферацию РВМС.
В присутствии IL-4, тАЬЗ (LALA мутация) индуцировало низкие, но воспроизводимые (п=4 донора) уровни включения тимидина выше тех, что индуцировал IL-4 в отдельности, в то время как тАЫ, тАЬ2 и Chirl2.12 не обладали таким свойством (фиг.З). Вместе взятые эти результаты указывают на то, что за исключением тАЬЗ, (в присутствии IL-4) ни одно из анти-СБ40 mAb не обладало агонистической активностью.
Упомянутые выше результаты также отчетливо
продемонстрировали, что тАЫ и тАЬ2 не обладали агонистической активностью в присутствии костимулирующих сигналов. Эти данные имеют важное значение, поскольку, полагают, что лейкоциты пациента с хроническим аутоиммунным заболеванием могут иметь активированный или частично активированный фенотип и, следовательно, могут быть сенсибилизированы к сигнальному пути, опосредованному CD4 0, или другим стимулам. Было замечено, что Chirl2.12 (но не молчащий фрагмент Fc mAb или CD40L) полностью ингибировало Ср62 0 0б-индуцированную пролиферацию РВМС. CpG2 00 6 является синтетическим лигандом для Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), рецептора, демонстрирующего связывание патогена и ssDNA (одноцепочечную ДНК) хозяйского происхождения. У человека TLR9 экспрессируется В-клетками и (в меньшей степени) моноцитами в периферической крови. Поскольку CpG-содержащие ODN, как было уже показано, усиливают ADCC (Мода, et al. 2008), можно предположить, что CpG2006 способен усилить ADCC, опосредуемую Fc фрагментом IgGl эмбрионального типа исходного Chirl2.12 mAb.
Пример 2: Оценка способности молчащего фрагмента Fc анти-CD40 mAb блокировать CD4OL-опосредуемую пролиферацию РВМС
Предыдущие данные указывали на то, что Chirl2.12 может блокировать CD4OL-опосредуемую пролиферацию первичных В-клеток человека и клеточных линий В-клеточной лимфомы человека. Мы измерили ингибирование CD4OL-опосредованной пролиферации РВМС под действием Chirl2.12 и трех антител по изобретению тАЫ, тАЬ2, тАЬЗ. В нижеприведенной таблице 7 представлены значения IC50 для такого ингибирования в мг/мл (результаты представлены в виде среднего значения по трижды повторенным экспериментам на культурах с SEM и характерны для 4 доноров, независимые эксперименты). Результаты демонстрируют, что Chirl2.12 может также ингибировать CD4OL-опосредуемую пролиферацию РВМС. Кроме того, тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ также полностью блокировали CD40L-опосредуемое деление РВМС с эффективностью, подобной Chirl2.12. Ни одно из анти-СР4 0 mAb не блокировало индуцируемую анти-IgM + IL-2 пролиферацию РВМС (данные не показаны), предполагая, что блокирующая активность анти-СР4 0 mAb зависела от мишени (и не была связана с функцией Fc).
Таблица 7
Значения IC50 для опосредуемого анти-СБ40 mAb ингибирования
Пример 3: Связывание вариантов антитела против CD40 человека с клеточной линией BJAB человека
Для исключения возможных изменений в специфическом связывании с CD4 0, связывание трех вариантов тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ было протестировано в сравнении с исходным Chirl2.12 на В-клеточной линии, BJAB, которая конститутивно экспрессирует CD4 0. Связывание было протестировано при титровании дозы, начиная с 10 мкг/мл при разведении 1:2.
Для сравнения кривых, полученных в разных экспериментах, наибольшее значение медианы интенсивности флуоресценции при каждом индивидуальном титровании дозы принимали за 10 0% связывания, и была применена нелинейная аппроксимация. В двух отдельных экспериментах все четыре варианта антител Chirl2.12, тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ, демонстрировали эквивалентные кривые связывания на клетках BJAB (фиг.5). Никаких изменений связывающей способности данных вариантов антител не могли наблюдать при различных мутациях связывающей области Fc Chirl2.12.
Таким образом, приведенные выше результаты, показали, что мутация связывающего сайта Fc не влияла на сайт связывания CD4 0 различных областей исходного Chirl2.12. тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ сохраняли эквивалентное связывание CD4 0 на клетках BJAB.
Пример 4: Стимуляция/ингибирование секреции TNF альфа из дендритных клеток человека моноцитарного происхождения под действием вариантов Fc анти-СТЭ40
Стимуляция секреции TNF альфа из МоРС человека под действием вариантов Fc анти-СР4 0
Некоторые антитела против СР4 0 человека, как было показано, оказывают агонистическое воздействие на различные клеточные популяции (Gruber 1989) . Для исключения того, что Fc-варианты тАЫ, тАЬ2, тАЬЗ и Chirl2.12 приводят к активации МоРС, мы исследовали могут ли антитела сами по себе индуцировать секрецию TNFa при инкубации в течение 4 8 ч с клетками. В отличие от антагонистического анализа семидневную культуру MoDC человека культивировали в течение 4 8 ч только в присутствии всех четырех анти-СР4 0 вариантов для получения дозозависимой кривой, начиная с 10 мкг/мл. Затем в супернатантах было проанализировано количество TNFa методом ELISA. Все анти-СР40 варианты тАЫ, тАЬ2, тАЬЗ и Chirl2.12 не индуцировали секрецию TNFa из МоРС по сравнению с CP4 0L-стимуляцией в качестве положительного контроля (данные не представлены). Никакой зависимости от дозы не было обнаружено для всех четырех вариантов антитела. Количество TNFa значительно не поднималось выше уровня такового
нестимулированных MoDC (данные не представлены). Следовательно, агонистическую активность этих четырех антител можно исключить.
Ингибирование секреции TNF альфа из МоРС человека под действием вариантов Fc анти-СР4 0
Исходное антитело Chirl2.12 блокирует взаимодействие СР40-CP40L и, следовательно, должно также блокировать активацию клетки. Стимуляция СР4 0 на дендритных клетках человека моноцитарного происхождения под действием триммера CP4 0L приводит, например, к секреции провоспалительных цитокинов, таких как TNFa (Ма 2009). Опять-таки, изменение фрагмента Fc не должно повлиять на блокирующие функции вариантов при сравнении с Chirl2.12. Все четыре антитела должны ингибировать CP40L-опосредуемую секрецию TNFa из МоРС человека с эквивалентным значением IC50.
Таким образом, семидневную культуру МоРС человека стимулировали в течение 2 4 ч MegaCP4 0L двойным тримерным, рекомбинантным конструктом в присутствии всех четырех блокирующих анти-СР4 0 вариантов. Затем в супернатантах было проанализировано количество TNFa методом ELISA. Все Fc-мутированные варианты тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ демонстрировали одинаковое дозозависимое ингибирование подобно Chirl2.12 в трех независимых экспериментах (данные не представлены). Предварительные результаты также демонстрируют подобное ингибирование секреции IL-23 из МоРС человека (данные не представлены).
Была использована нелинейная аппроксимация для определения IC50 всех четырех антител, и было вычислено среднее значение IC50 из этих экспериментов. Среднее значение IC50 четырех вариантов в отношении секреции TNFa из МоРС человека находилось в диапазоне от 32 до 4 0 нг/мл (таблица 8) . Таким образом, мутации фрагмента Fc не оказывают влияния на антагонистический эффект вариантов антител.
IC50 различных вариантов Fc в отношении ингибирования TNF
альфа
Среднее значение
SEM
Chirl2.12
п. с.
тАЫ
тАЬ2
тАЬЗ
Значение IC50 приведено в нг/мл для различных вариантов Fc против CD4 0 человека для трех независимых экспериментов. Нелинейная аппроксимирующая кривая в эксперименте #1 для Chirl2.12 не позволила точно оценить IC50 (п.с. = не вычислено).
Таким образом, приведенные выше результаты показали, что все четыре варианта были неактивны в отношении стимуляции секреции TNFa из MoDC. Гораздо более важным является тот факт, что все варианты тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ ингибировали CD4 0L-опосредованную цитокиновую продукцию MoDC человека со схожей эффективностью in vitro при сравнении с Chirl2.12.
Пример 5: Суммирование данных
Сравнительные данные
Приведенная ниже таблица 9 суммирует некоторые из важных свойств антител тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ по изобретению при сравнении с исходным антителом Chirl2.12.
Пример 6: Краткое описание пригодных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей для использования изобретения
ДНК, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь CHIR-12.12
ДНК, кодирующая полноразмерную легкую цепь CHIR-12 . 12
ДНК, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь тАЫ
ДНК, кодирующая полноразмерную легкую цепь тАЫ
ДНК, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь пАЬ2
ДНК, кодирующая полноразмерную легкую цепь тАЬ2
ДНК, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь тАЬЗ
ДНК, кодирующая полноразмерную легкую цепь тАЬЗ
Аминокислотная последовательность CD40 человека
Пример 7: Пригодные аминокислотные и нуклеотидные последовательности для использования изобретения на практике
SEQ ID NO:
Подробные аминокислотные или нуклеотидные последовательности
SYGMH
VISYEESNRYHADSVKG
DGGIAAPGPDY
RSSQSLLYSNGYNYLD
LGSNRAS
MQARQTPFT
QVQLVE S GGGWQPGRS LRL S CAAS GFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYC ARDGGIAAPGPDYWGQGTLVTVSS
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQS PQVLISLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQA RQTPFTFGPGTKVDIR
QVQLVE S GGGWQPGRS LRL S CAAS GFTFS S YGMHWVRQAPGKGLEWV AVISYEESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYC ARDGGIAAPGPDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPASKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQS PQVLISLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQA RQTPFTFGPGTKVDIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
QVQLVE S GGGWQPGRS LRL S CAAS GFTFS S YGMHWVRQAPGKGLEWV AVISYEESNRYH ADSVKGRFTI SRDNSKITLY LQMNSLRTED TAVYYCARDGGIAAPGPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYASTYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
DIVMTQSPLS LTVTPGEPAS ISCRSSQSLL YSNGYNYLDW YLQKPGQSPQVLISLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQARQTPFTFGPGTKVD IRRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISYEESNRYH ADSVKGRFTI SRDNSKITLY LQMNSLRTED TAVYYCARDGGIAAPGPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVWAVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
DIVMTQSPLS LTVTPGEPAS ISCRSSQSLL YSNGYNYLDW YLQKPGQSPQVLISLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQARQTPFTFGPGTKVD IRRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNN FY PRE AKVQWKVDNAL Q SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAVISYEESNRYH ADSVKGRFTI SRDNSKITLY LQMNSLRTED TAVYYCARDGGIAAPGPDYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
DIVMTQSPLS LTVTPGEPAS ISCRSSQSLL YSNGYNYLDW YLQKPGQSPQVLISLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQARQTPFTFGPGTKVD IRRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNN FY PRE AKVQWKVDNAL Q SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWAVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGG TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTAT GGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTG GСAG T TATAT CATATGAGGAAAGTAATAGATACСAT GCAGACT ССGT G AAG G G С С GAT T СAC СAT С T С СAGAGACAAT T С CAAGATСACGС T GTAT CTGCAAATGAACAGCCTCAGAACTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGAGATGGGGGTATAGCAGCACCTGGGCCTGACTACTGGGGCCAG GGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCAAGTACCAAGGGCCCATCCGTC TTCCCCCTGGCGCCCGCTAGCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCC CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCG TGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC T С СAG СAG С T T G G G СAC С CAGAC С TACAT С T G СAAC G T GAAT СACAAG С С СAG СAACAC СAAG G T G GACAAGAGAG T T G G T GAGAG GCCAGCACAG GGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGAC GCATCCCGGCTATGCAGTCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGT CTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGA GAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGG TGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAG ACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCC 2 0 ACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTC CTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATC T T G T GACAAAAC T СACACAT GCCCACCGTGCCCAGG TAAG CCAGCCCA GGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTG CATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCT CTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCA ACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGC GGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG TCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT ССAACAAAGСССTСССAGCССССATСGAGAAAACСATСТССAAAGССА AAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTC GGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCT ACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTATAG СAAG CTCACCGTG GACAAGAG CAGGTGGCAGCAG GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGACCGTCACCCCTGGA GAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCCAGTCAGAGCCTCCTGTATAGT AAT G GATACAAC TAT T T GGAT T G G TAC С T G СAGAAG С СAG G G СAG T С T CCACAGGTCCTGATCTCTTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCT GAC AG G T T С AG T G G С AG T G GAT С AG G С AC AGAT T T T AC AC T GAAAAT С AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCT CGACAAACTCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAGA CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAG CAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC TAT С С СAGAGAG G С СAAAG TACAG T G GAAG G T G GATAAC G С С С T С СAA Т С G G G TAAC ТСС СAG GAGAG T G T СACAGAG СAG GACAG СAAG GACAG С AC С TACAG С С T СAG СAG CAC С С T GAC G С T GAG СAAAG CAGAC TAC GAG AAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCG С С С G T СACAAAGAG С T T СAACAG G G GAGAG T G T
CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGG TCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTAC GGCATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTG GCCGTGATCTCCTACGAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTG AAGGGCCGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGATCACCCTGTAC CTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGC GCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCTGGACCTGATTATTGGGGCCAG GGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTG TTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCC TGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTG CTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCC TCTAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG CCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGAC AAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGA CCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC TCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAG GACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCAC AAC G С СAAGAC СAAG С С СAGAGAG GAACAG TAC G С С T С CAC С TAC С G G GTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAA GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAA AAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCACAGGTGTAC ACACTGCCCCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTG ACCTGTCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGG GAG T С СAAC G GACAG С С С GAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTG CTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGAC AAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCAC GAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCC GGCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGACACCTGGC GAGCCTGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCC AACGGCTACAACTACCTGGACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCC CCACAGGTGCTGATCTCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCC GACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGATC TCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGGCC CGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGGCACCAAGGTGGACATCCGG CGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAG CAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTC TACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG AG С G G СAACAG С СAG GAGAG С G T СAC С GAG СAG GACAG СAAG GAC T С С AC С TACAG CCT GAG СAG CAC С С T GAC С С T GAG СAAG G С С GAC TAC GAG AAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGC CCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGG TCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTAC GGCATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTG GCCGTGATCTCCTACGAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTG AAGGGCCGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGATCACCCTGTAC CTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGC GCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCTGGACCTGATTATTGGGGCCAG GGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTG TTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCT CTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCC TGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTG CTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCC TCTAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAG CCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGAC AAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGA CCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC TCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGTCCCACGAG GACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCAC AAC G С СAAGAC СAAG С С CAGAGAG GAACAG TACAAC T С CAC С TAC С G G GTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAA GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAA AAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCACAGGTGTAC ACACTGCCCCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTG ACCTGTCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGG GAG T С СAAC G GACAG С С С GAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTG CTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGAC AAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCAC GAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCC GGCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGACACCTGGC GAGCCTGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCC AACGGCTACAACTACCTGGACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCC CCACAGGTGCTGATCTCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCC GACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGATC TCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGGCC CGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGGCACCAAGGTGGACATCCGG CGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAG CAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTC TACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG AG С G G СAACAG С СAG GAGAG С G T СAC С GAG СAG GACAG СAAG GAC T С С AC С TACAG CCT GAG СAG CAC С С T GAC С С T GAG СAAG G С С GAC TAC GAG AAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGC CCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGG TCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTAC GGCATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTG GCCGTGATCTCCTACGAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTG AAGGGCCGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGATCACCCTGTAC CTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGC GCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCTGGACCTGATTATTGGGGCCAG GGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCCTCCGTG TTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCCGGCGGCACAGCTGCT CTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCC TGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTG CTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTCACAGTGCCT T СAAG СAG С С T G G G CAC С CAGAC CTATATCTG СAAC G T GAAC СACAAG CCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGAC AAGACCCACACCTGTCCTCCCTGCCCTGCTCCTGAAGCTGCTGGCGGC CCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC TCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAG GATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAC AAC G С СAAGAC СAAG С С T С G G GAG GAACAG TACAAC T С CAC С TAC С G G GTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAA GAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAA AAGACAATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTGTAC ACCCTGCCACCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTG ACCTGTCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGG GAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTG CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGAC AAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCAC GAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCC GGCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGACACCTGGC GAGCCTGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCC AACGGCTACAACTACCTGGACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCC CCACAGGTGCTGATCTCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCC GACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGATC TCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTGTACTACTGCATGCAGGCC CGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGGCACCAAGGTGGACATCCGG CGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAG CAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTC TACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAG AG С G G СAACAG С СAG GAGAG С G T СAC С GAG СAG GACAG СAAG GAC T С С AC С TACAG CCT GAG СAG CAC CCT GAC CCT GAG СAAG G С С GAC TAC GAG AAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGC CCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLV SDCTEFTETECLPCGESEFLDT
WNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACES CVLHRSCSPGFGVKQIATGVSD
TICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLWQQAGTNKTDWCGP QDRLRALWIPIIFGILFAILL
VLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGC QPVTQEDGKESRISVQERQ
Пример 8: Результаты токсикологического анализа
Первоочередной задачей токсикологического исследования было определение токсичности тАЫ после еженедельного внутривенного введения яванскому макаку в течение 5 недель (6 применений исследуемого препарата). Не молчащая (ADCC) версия этого антитела (Chirl2.12) была также использована с целью сравнения эффектов ADCC-активного антитела с ADCC-молчащей версией (тАЫ) .
Кроме того, животные были иммунизированы KLH, чтобы оценить эффективность обоих анти-СО40 АЬ.
Не было зафиксировано смертельных исходов или изменений массы тела, клинических симптомов и оцениваемого потребления пищи, обусловленных лечением тАЫ или Chirl2.12. Местные реакции в местах инъекции KLH были аналогичны во всех группах.
Также не было никаких связанных с применением элемента тестирования данных в офтальмологических и сердечно-сосудистых исследованиях.
В гематологическом анализе небольшое, но статистически значимое, снижение процентного и абсолютного числа базофилов было обнаружено у животных, леченных тАЫ и Chirl2.12: связь с
применением элемента тестирования не может быть исключена. Анализ мочи выявил кетоны в моче 1/5 самок, леченных тАЫ, и 2/5 самок, леченных Chirl2.12, с невыясненной связью с дозированием препарата. В клиническом биохимическом анализе обнаружили незначительную тенденцию к повышению концентраций липазы в случае леченных Chirl2.12 самцов, а также одной самки, леченной Chirl2.12, однако это имело ограниченную токсикологическую значимость.
На свертываемость крови не повлияло лечение тАЫ или Chirl2.12, руководствуясь данными протромбинового времени, активированного частичного протромбинового времени и фибриногена. Число тромбоцитов оказалось в нормальном диапазоне значений. Концентрации Р-селектина или SCD4 0L в плазме не указывали на активацию тромбоцитов.
У животных, леченных Chirl2.12, иммунофенотипирование крови выявило выраженное снижение CD2 0+ В-клеток, что являлось ожидаемым фармакологическим действием этого антитела. Особенно фракция CD2 0НИЗКИИСР21+ В-клеток (которых рассматривают как CD4овысокии) была обеднена под действием Chirl2.12. Однако также было значительно снижено количество CD2 oBbICOKMMCD21~ В-клеток, особенно к концу исследования. Преимущественно была обеднена фракция не обученных В-клеток CD20+CD21+CD27~ под действием ADCC-активных антител Chirl2.12, в то время как на фракцию В-клеток памяти CD20+CD21+CD27+ почти не было оказано никакого влияния. Также было обнаружено приблизительное снижение на 50% абсолютного числа CD16+ NK-клеток у животных, леченных Chirl2.12. Как и ожидалось, после лечения тАЫ (которое является ADCC-молчащим) значительного снижения числа CD2 0+ В-клеток не было обнаружено, так же как и не было какого-либо снижения абсолютного числа CD16+ NK-клеток. Единственной фракцией В-клеток, демонстрирующей умеренное снижение количества во время дозирования препарата, были CD2 oBbICOKMMCD21~ В-клетки. Известно, что эти клетки являются специфичными для макак и происходят из герминативного центра, следовательно, эти данные нельзя экстраполировать на человека.
Иммунофенотипирование селезенки и дренирующих KLH
лимфатических узлов при некропсии выявило схожую картину. Было обнаружено снижение относительного количества CD2 0+ В-клеток у леченных Chirl2.12 животных, однако никакого относящегося к данному случаю снижения числа CD2 0+ В-клеток не наблюдали у животных, леченных тАЫ, с небольшим вплоть до умеренного снижения CD21~ В-клеток (в лимфатических узлах обоих полов, в селезенке - только у самцов). Не было различий в результатах иммунофенотипирования для правого и левого лимфатических узлов, дренирующих сайт инъекции KLH.
Т-клеточно-зависимая реакция антител (TDAR) показала, что при сравнении с контрольной группой, не было обнаружено IgG и IgM ответа на KLH у животных, леченных тАЫ или Chirl2.12. Поскольку блокирование активации В-клеток путем ингибирования взаимодействия CD4 0 - лиганда CD4 0 подразумевает фармакологическое действие тАЫ, и поскольку полагают, что под действием Chirl2.12 обедняется фракция В-клеток, эти данные не рассматриваются как токсикологически значимые.
Токсикокинетическая оценка выявила, что минимальные концентрации препарата увеличивались в ходе исследования, указывая на накопление тАЫ и Chirl2.12. Средние значения минимальных концентраций после введения 4-й и 5-й дозы были сходными, указывая на близость к условиям стационарного состояния после введения 5-й дозы для тАЫ и Chirl2.12. Среднее значение воздействия (оба пола) в течение интервала дозирования (AUCT) после 4-й и 5-й дозы составляло 906 и 990 ч.мг/мл, соответственно для тАЫ, и 757 и 751 ч.мг/мл, соответственно для Chirl2.12. Значения AUCT также указывали на близость к условиям стационарного состояния после введения 5-й дозы.
При макроскопическом исследовании не было выявлено каких-либо доказательств токсического целевого повреждения органов, и вес органов также находился в пределах нормы для данного вида.
Микроскопически, связь с применением элемента тестирования в отношении двух антител обнаружили во всех органах лимфатической системы (селезенке и лимфатических узлах (брыжеечных, нижнечелюстных, подмышечных и паховых)), где тАЫ и Chirl2.12 вызывали полную супрессию герминативного центра
развития в кортикальных В-клеточных областях. CD2 0-иммуноокрашивание ткани селезенки и дренирующих KLH и контралатеральных лимфатических узлов выявило уменьшенный размер лимфоидных фолликулов в селезенке, а также обеднение фракции В-клеток в селезенке и лимфатических узлах, эффект, который был намного более выражен у животных, леченных Chirl2.12, по сравнению с таковыми, леченными тАЫ. Данные по герминативному центру у животных, леченных тАЫ, соответствовали снижению числа CD21~ В-клеток, обнаруженного при иммунофенотипировании. CD40-иммуноокрашивание выявило значительное снижение окрашивания CD4 0 в лимфатических узлах и селезенке после лечения либо тАЫ, либо Chirl2.12.
В заключение, руководствуясь результатами данного
исследования, еженедельное внутривенное введение тАЫ или
Chirl2.12 в течение 5 недель (б назначений) в концентрации 100
мг/кг самцам и самкам яванских макак было хорошо переносимым.
При иммунофенотипировании обнаружена уменьшение числа В-клеток
у животных, леченных Chirl2.12, но не у животных, леченных
тАЫ, за исключением CD21~ В-клеток, однако TDAR
продемонстрировал отсутствие IgG и IgM реакции после
иммунизации KLH у тАЫ- и Chirl2.12-леченных животных. При
гистопатологическом исследовании выявлено отсутствие
герминативных центров в селезенке и лимфатических узлах у тАЫ-и Chirl2.12-леченных животных. Воздействие на В-клетки является целевым фармакологическим действием и, следовательно, не рассматривается в качестве неблагоприятного эффекта. Принимают во внимание, что уровень ненаблюдаемого неблагоприятного эффекта (NOAEL) закреплен за дозой, равной 100 мг/кг, тАЫ и Chirl2.12 в условиях данного исследования.
Пример 9: Дополнительный in vitro анализ профиля тАЫ Связывание и функциональная перекрестная реактивность тАЫ была определена между лейкоцитами человека, макака-резус, яванского макака. В таблице 10 представлены данные прямого сравнения связывания ЕС50 для тАЫ во всех трех видах.
тАЫ связывается с CD20 клетками (В-клетки) всех трех видов с соизмеримыми значениями ЕС50. Кроме того, тАЫ может ингибировать СР154+1Ъ-4-индуцируемую пролиферацию В-клеток миндалины человека, а также РВМС яванского макака и макака-резус. Вместе взятые эти результаты указывают на то, что способность тАЫ связывать CD40 и ингибировать CD154-индуцируемую пролиферацию В-клеток человека или РВМС отличных от человека приматов была очень схожей. Данные по наличию занятости рецептора in vitro (RO) и функциональное ингибирование позволили определить взаимосвязь между этими двумя переменными величинами для каждого вида (таблица 11).
Таблица 11
а Растворимый CD154 + 1Ъ4-индуцируемая пролиферация РВМС у макака-резус и В-клеток миндалины у человека
ь При условии, что KD in vivo у макака-резус и у человека такая же, как рассчитанная в исследовании PK/PD у яванского макака.
с При условии, что тАЫ значительно выше [мишени] в применяемом уравнении Хилла-Ленгмюра.
Результаты указывают на то, что приблизительно в 2 раза
меньше RO требуется тАЫ, чтобы ингибировать пролиферацию РВМС у макака-резус на 50% по сравнению с В-клетками человека. У человека, полное ингибирование может быть получена при приблизительно 7 5% RO (величина теоретически найдена in vivo).
Пример 10: Исследование трансплантата
Жизнеспособность трансплантата
Комбинированное лечение тАЫ (30 мг/кг внутривенно) и циклоспорина А, 2 0 мг/кг перорально во время аллотрансплантации почек приводило к значительному пролонгированию выживаемости б животных, включенных в исследование. Трансплантаты были функциональны в течение больше 91*, 31, больше 92*, больше 92*, больше 98* и больше 98* дней (среднее значение: больше 83,6 дня) у животных #5529, #5533, #5523, #5524, #5536 и #5538, соответственно (* конец протокола). Выживаемость у не леченных животных (или леченных субтерапевтическими IS-дозами) находилась в диапазоне от 7 до 10 дней (статистические данные).
Животному #5533 провели эвтаназию на 31 день после трансплантации из-за острой почечной недостаточности и анурии. Эта патология возникает после поддержания гипертензивного периода и анестезии для забора биопсийного материала.
Поелетрансплантационное наблюдение
(а) сывороточные концентрации креатинина (SCrea) и мочевины (SUrea)
SCrea был основным параметром, используемым для оценки функции почек. У всех б животных уровни SCrea повышались выше исходного уровня в первый день после трансплантации (от 81,8±14,б до 221,5137,1 мкмоль/л) . Такое повышение SCrea является распространенной особенностью в течение первой недели после трансплантации (таблица 12).
Изменения SCrea, наблюдаемые у реципиентов аллотрансплантата почек NHP, леченных комбинированной терапией тАЫ и CsA в дозе 30 и 20 мг/кг, соответственно
Дни после трансплантации
Уровень SCrea (мкмоль/л)
#5536
#5538
#5523
#5524
#5529
#5533
101
109
106
105
234
238
213
198
277
169
190
261
148
155
243
191
112
189
136
141
110
110
111
172
193
206
102
139
101
166
209
165
103
156
113
181
277
157
175
114
162
192
117
111
206
112
156
155
124
111
191
133
119
111
100
170
139
119
106
122
629
103
135
110
100
104
104
128
111
109
108
107
113
110
101
114
124
108
115
113
103
118
104
106
101
107
129
105
111
102
122
103
112
101
112
105
110
120
115
115
103
132
110
104
107
101
116
100
105
103
124
105
120
109
103
109
121
105
103
101
102
113
109
101
104
120
126
110
107
103
111
112
108
100
112
119
112
105
117
133
В течение первой недели концентрации SUrea претерпевала быстрый подъем выше исходного уровня, измеренного в 0 день (4,5±1,3 ммоль/л) (таблица 13). У животных #5529/#5533 и #553б/#5538 уровни SUrea составляли 16-20 ммоль/л (3-5 день), в то время как у животных #552 3 и #552 4 эти величины составляли 9 или 8 ммоль/л (7 день), соответственно.
Таблица 13
Изменения SUrea, наблюдаемые у реципиентов аллотрансплантата почек NHP, леченных комбинированной терапией тАЫ и CsA в
Через одну неделю после трансплантации, функция почек имела тенденцию к нормализации, и SCrea/SUrea становилось ближе к исходному уровню. Однако, у животных #5533, #5523 и #5524 (но не #5529, #5536 и #5538) зафиксировано дополнительное увеличение SCrea/Surea между 7 днем и 19-25 днями после трансплантации, указывая на почечную дисфункцию. Во время этого периода можно было наблюдать такие признаки, как полидипсия/полиурия (#5523 и #5524), высокий поддерживаемый уровень сывороточного кальция (SCa) (#5533) или увеличение объема трансплантата (#5523 и #5524).
После 20-25 дня у животных #5529, #5523, #5524, #5536 и #553 8 отмечали улучшения и прекрасную работу почек вплоть до конца исследования. Однако, на 31 день у животного №5533 зафиксировано выраженное увеличение уровней SCrea/SUrea, подтверждая острую почечную недостаточность (SCrea; 629 мкмоль/л и SUrea; 18 ммоль/л). Эта патология имела место после поддерживаемого гипертензивного периода и процедуры биопсии за день до эвтаназии. Во время этого периода были зафиксированы гипертензивные пики (приблизительно 170 мм рт.ст. систолический) и эпизод гипотензии (приблизительно 4 0 мм рт.ст. систолический).
(Ь) Сывороточные концентрации амилазы, липазы, вес тела и число тромбоцитов
Сывороточные концентрации амилазы немного увеличивались у всех животных приблизительно в 1,3 раза в 1-7 дни после трансплантации (311153 ед/л в 0 день и 418166, 8 ед/л на 7 день
после трансплантации) (таблица 14) . У животного #5533 зафиксировано наибольшая концентрация амилазы, измеряемая в исследовании в 1 день после трансплантации (1050 ед/л). До трансплантации не было выявлено каких-либо различий в уровнях амилазы до введения первой дозы тАЫ и через 24 часа (-1 день и 0 день).
Таблица 14
Сывороточные концентрации амилазы (ед/л) у животных с трансплантацией почек, леченных комбинированием тАЫ в дозе
Сывороточные концентрации липазы претерпевали, в среднем, небольшие изменения до и после трансплантации (таблица 15) . Только в конце экспериментального протокола отмечали незначительное увеличение (84 день; 2,18 раза). У животного #5533 зафиксирована наибольшая концентрация липазы, измеренная в 1 день (284,4 ед/л). Данные по концентрации липазы у животных #5536 и #5538 отсутствовали. Изменения концентраций амилазы и липазы были аналогичными уровням, обнаруженным в других экспериментах по трансплантации, используя других антитела или низкомолекулярные соединения (данные не представлены).
Таблица 15
Сывороточные концентрации липазы (ед/л) у четырех животных с трансплантацией почек, леченных комбинированием тАЫ в дозе
14 день
12, 9
1,25
1,08
56 день
16,6
3,41
1,38
84 день
26,2
21, 06
2,18
Быстрая и значительная потеря массы тела в основном наблюдали у животных #5529, #5533 и #5536. У всех трансплантированных животных она варьировала от -4 до -18% во время первых 21 дней после трансплантации. Однако потеря массы тела имела тенденцию к восстановлению после этого временного периода и до конца исследования.
Число тромбоцитов было в норме (300-4 00 клеток х103/мкл) или повышено во время посттрансплантационного периода 600-800 клеток х103/мкл. Животному #552 9 проводили лечение аспирином в течение 3 дней (7-9 день) вследствие быстрого роста числа тромбоцитов. У животного #5533 отмечали долговременный тромбоцитоз (больше 1000 клеток х103/мкл) и ему проводили лечение аспирином в период 7-2 6 дни.
(с) уровни тАЫ в крови и число В-клеток
Контрольные изучение и анализ PK/PD были проведены ранее, в которых яванскому макаку внутривенно вводили единичную дозу антитела, равную 10 мг/кг (данные не показаны). В этом исследовании профили зависимости концентрации от времени демонстрировали четкое мишень-опосредованное распределение (TMD), где у одного животного обнаружили более быстрый клиренс по сравнению с другими животными вследствие вероятно более высокого уровня экспрессии мишени, подчеркивая роль уровней экспрессии мишени в регулировании РК. В этом исследовании также пришли к заключению о том, что в случае сывороточных концентраций тАЫ свыше приблизительно 5 микрограмм/мл это обусловливает почти 100% занятость рецептора CD40.
Дизайн исследования трансплантации (еженедельные и высокие уровни дозирования тАЫ - 30 мг/кг и отсутствие фазы восстановления/отмывки) не обеспечили того же уровня анализа и моделирования как в случае ранее проведенного исследования PK/PD. Тем не менее были получены следующие наблюдения (сведены в таблицу 16); i) тАЫ не был обнаружен в образцах, полученных
до введения первой дозы, ii) тАЫ выявляли на протяжении всей
фазы дозирования препарата и iii) во всех собранных образцах
межиндивидуальные минимальные концентрации препарата
варьировали (1200-2500 микрограмм/мл для яванского макака 5524, 1000-2000 микрограмм/мл для яванского макака 5523 и 850-2400 микрограмм/мл для яванского макака 552 9). Значения экспозиции были значительно выше (в 170-500 раз) концентрации, необходимой для получения полной рецепторной занятости у яванского макака.
Таблица 16
Сывороточные концентрации тАЫ у яванских макак #5533, #5529,
#5523 и #5524
тАЫ (микрограмм/мл)
Время
Яванский
Яванский
Яванский
Яванский
(дни)
макак 5533
макак 5529
макак 5523
макак 5524
591
618
1315
1384
682
1003
1033
1135
7, 01
1557
1553
2452
2669
925
1037
1463
1744
654
896
1672
1965
851
1770
1259
1896
1991
1283
2385
1641
2534
2191
1266
2402
2069
1066
2071
Была также проведена оценка тестового анализа иммуногенности (анти-тАЫ антитела макака) в этом исследовании. Все образцы были отрицательными, но высокие уровни тАЫ в этих образцах могли потенциально препятствовать их детектирования вследствие лекарственной интерференции.
Частичное обеднение фракции CD2 0+ клеток можно было наблюдать с течением времени во всех леченных животных. Подобные наблюдения были зафиксированы в ранее проведенном исследовании PK/PD (данные не показаны).
Результаты гистологического анализа
При гистопатологическом исследовании аллотрансплантатов почек отмечено отсутствие острого и хронического отторжения трансплантата #5523, #5524, #5529 и #5538, и пограничные изменения в трансплантате #5536, который достиг конца эксперимента (результаты сведены в таблицу 17). Были обнаружены минимальные периваскулярные или интерстициальные инфильтраты у животных #5523, #5524 и #5538, и повышенное содержание гломерулярных паренхиматозных клеток у животного #552 9.
Отсутствие формирования герминативного центра во вторичных лимфоидных органах. Никаких других изменений, связанных с лечением.
#5536
Биопсия
Нет
Нет
11-0002
Аутопсия
104/8
Banff: пограничные изменения (минимальные мультифокальные интерстициальные инфильтраты с минимальным фокальным тубулитом), фокальные плазматические клетки
Отсутствие формирования герминативного центра во вторичных лимфоидных органах. Никаких других изменений, связанных с лечением.
#5538
Биопсия
Нет
Нет
11-0002
Аутопсия
114/9
Banff: нет отторжения (присутствуют минимальные мультифокальные интерстициальные инфильтраты)
Отсутствие формирования герминативного центра во вторичных лимфоидных органах. Одностороннее фокальное лимфо-гистиоцитарное воспаление легкого. Никаких других изменений, связанных с лечением.
У животного #5533, которому провели эвтаназию на 31 день после трансплантации, обнаружили тубулярную дилатацию, интерстициальные инфильтраты и фиброз, но только минимальный тубулит. Кроме того, была обнаружена значительная эозинофильная инфильтрация вблизи мочеточника и абсцесс рядом с анастомозом. Все эти данные указывают на длительное нарушение функции почек, но отторжение может быть не подтверждено.
Иммуноокрашивание C4d было отрицательным во всех случаях.
Отсутствие герминативного центра размножения с фолликулярной атрофией или без нее было обнаружено в лимфоидных органах всех животных. Цекоколит, обусловленный инфекцией Balantidium coli, был диагностирован у животных #5529 и #5533.
Никаких других изменений, связанных с лечением, обнаружено не было.
Исследование трансплантации - обсуждение
Цель исследования трансплантации, на модели отторжения аллотрансплантата почек отличных от человека приматов, состояла в оценке положительного эффекта тАЫ, назначаемого в виде комбинированной терапии с субтерапевтической дозой циклоспорина А. Кроме того, актуальной являлась оценка отсутствия побочных эффектов на модели, в которой имеет место индукция системного воспаления.
В условиях применения в виде комбинированной терапии с субтерапевтической дозой CsA (20 мг/кг перорально), эффективность воздействия тАЫ проявлялась в увеличении жизнеспособности аллотрансплантата почки у NHP. Среднее значение выживаемости трансплантата составляло больше 83,б дней, и 5 из б животных дожили до конца экспериментального протокола (рассчитан на 91-98 дней).
Результатом целевого воздействия на CD40, используя неагонистическое блокирующее антитело анти-СР4 0 (тАЫ), являлось пролонгирование жизнеспособности трансплантата почки или кусочка ткани, трансплантированной NHP. Кроме того, нам удалось продемонстрировать лучшую эффективность и безопасность использования тАЫ (которое является молчащим Fc) по сравнению с ранее описанным Chirl2.12 (полностью человеческое
моноклональное анти-СР40 антитело изотипа IgGl/каппа, обусловливающее обеднение фракции В-клеток и обладающее блокирующими свойствами совместной стимуляции).
В течение всего посттрансплантационного периода отмечено
отсутствие какого-либо значимого клинического патологического
осложнения (например, небольшое увеличение уровня
амилазы/липазы было связано с обычным нарушением функции почек после трансплантации). Однако у животных #5333, #5523 и #5524 было обнаружено снижение функции почек в период 7-19 дни. Этот период времени обычно характеризуется восстановлением уровней SCrea/SUrea, кровяного давления и объема трансплантата у животных после трансплантации. У этих животных были обнаружены такие признаки нарушения функции почек, как повышенные уровни SCrea/SUrea (у всех 3 животных) , временное увеличение объема трансплантата (#5523, #5524) или полидипсия/полиурия (#5523, #5524). Одна из гипотез заключается в том, что у этих животных развивался ранний процесс отторжения трансплантата, который становился контролируемым после 3 недель лечения тАЫ. Это отклонение от нормы в ранней посттрансплантационной фазе может быть следствием различий, вызванных иммунологическим способом действия молекулы (Fc-молчащей), направленно воздействующей на CD4О-сигнальный путь.
Одному животному (#5533) провели эвтаназию на 31 день вследствие острой почечной недостаточности (без отторжения). Этот исход был обусловлен неполным восстановлением функции почек после процедуры трансплантации. Признаками, указывающими на недостаточную функцию почек, были высокие уровни SUrea (1119 ммоль/л) или поддерживаемые высокие концентрации SCa (больше 2,8 ммоль/л). Предсмертное отторжение трансплантата ускорялось сохраняющейся гипертензией (больше 140 мм рт.ст, систолическое) в сочетании с гипотензией, что наблюдали во время анестезии, применяемой во время процедуры взятия биопсийного материала, и высокие гипертензивные пики были зарегистрированы ночью до эвтаназии (приблизительно 170 мм рт.ст., систолическое) (Palmer BF (2002) N. Engl. J. Med; 347 (1 б):1256-1261) . Все эти события не могут быть обусловлены лечением тАЫ, а могут быть связаны
только с индивидуальными различиями в посттрансплантационную фазу.
Высокая эффективность комбинированной терапии может быть также продемонстрирована гистологически. Пять из шести трансплантатов были отличного качества к концу эксперимента. Отсутствие герминативного центра размножения было также продемонстрировано в эксперименте по трансплантации с Chirl2.12. Никаких других изменений, связанных с лечением, обнаружено не было.
У одного из долгожителей (#5529) развился цекоколит, вызванный Balantidium coli. Хотя эта инфекция часто встречается у макак и обычно бессимптомно протекает, иммуносупрессия может приводить к обострению заболевания (Schuster FL, Ramirez-Avila L, (2008) Clin. Microbiol. Rev; 21(4): 626-38). У этих животных не было обнаружено никаких клинических симптомов заболевания, таких как диарея или потеря массы тела.
Рассматривая результаты мониторинга числа В-клеток, частичное обеднение со временем этой фракции клеток наблюдали у всех леченных животных. Это частичное обеднение клеточной фракции, по-видимому, не является следствием опосредованного активным Fc-рецептором уменьшения числа клеток, поскольку тАЫ является молчащим антителом, которое не связывается с FcR и не опосредует in vitro ADCC. Частичное обеднение фракции клеток может быть отражением отсутствия герминативных центров, что было обнаружено при гистологическом анализе в конце эксперимента. Это частичное обеднение фракции клеток может быть следствием отсутствия жизнеобеспечивающих сигналов.
В заключение необходимо отметить, что результаты исследования трансплантации поддерживают использование тАЫ (и как само собой разумеющееся, другие антитела и белки по изобретению) в качестве эффективных молекул для лечения отторжения трансплантата почек в комбинированной терапии с отличными показателями безопасности. Отличные показатели безопасности и эффективность дополнительно подтверждают пригодность антител по изобретению в лечении аутоиммунных нарушений и/или воспалительных нарушений, и в предотвращении
отторжения трансплантата, опосредуемого проведением сигнала CD4 0L через CD4О-сигнальный путь в клетках, экспрессирующих CD40 антиген.
Заключение
Данных о том, что анти-СБ4 0 антитела индуцируют гемостатические процессы у пациентов, еще не было опубликовано, однако увеличение уровня ферментов поджелудочной железы у пациентов, страдающих В-клеточной лимфомой, получающих анти-CD40 Ab Chirl2.12, и возможный риск развития панкреатита исключает использование этого Fc-компетентного анти-СБ4 0 антитела при хронических аутоиммунных заболеваниях и трансплантации по причинам безопасности. В связи с этим, мы получили Fc-молчащие IgGl анти-СБ4 0 антитела (тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ), не способные опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) как in vitro, так и in vivo. тАЫ обладало способностью пролонгировать жизнеспособность аллотрансплантата почек отличных от человека приматов в сочетании с субтерапевтическими дозами циклоспорина. Кроме того, тАЫ обладало способностью полностью подавлять первичный и вторичный ответ антител на иммунизацию Т клеточно-зависимым антигеном. Существенным является то, что не было фактов наличия гемостатических осложнений или патологической гистологической картины поджелудочной железы в исследовании трансплантата или иммунизации. В совокупности эти результаты предполагают, что тАЫ будет использоваться в качестве безопасного и эффективного терапевтического средства и может быть использовано для лечения пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, в патогенез которых вовлечены В-лимфоциты и антиген-презентирующие клетки, или переносящих аллотрансплантацию, где взаимодействия CD4 0-CD154 вовлечены в развитие патологии.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Novartis AG
<120> Молчащие Fc-варианты анти-СО40 антител
<130> РАТ54423
<150> US 61/413567
<151> 2010-11-15
<160> 28
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> Белок
<213> Человек
<400> 1
Ser Туг Gly Met His 1 5
<210> 2
<211> 17
<212> Белок
<213> Человек
<400> 2
Val lie Ser Туг Glu Glu Ser Asn Arg Туг His Ala Asp Ser Val Lys
15 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> Белок
<213> Человек
<400> 3
Asp Gly Gly He Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 15 10
<210> 4
<211> 16
<212> Белок
<213> Человек
<400> 4
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp
15 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> Белок
<213> Человек
<400> 5
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 6
<211> 9
<212> Белок
<213> Человек
<400> 6
Met Gin Ala Arg Gin Thr Pro Phe Thr 1 5
<210> 7
<211> 120
<212> Белок
<213> Человек
<400> 7
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val He Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys He Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Gly He Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 8 <211> 112 <212> Белок
<213> Человек <400> 8
Asp Не Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Val Leu He Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala
85 90 95
Arg Gin Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Arg
100 105 110
<210> 9
<211> 450
<212> Белок
<213> Человек
<400> 9
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val He Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys He Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Gly He Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gin
100
105
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu
325 330 335
Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys 450
<210> 10
<211> 219
<212> Белок
<213> Человек
<400> 10
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Val Leu He Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala
85 90 95
Arg Gin Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Arg
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 11
<211> 450
<212> Белок
<213> Человек
<400> 11
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val He Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys He Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Gly He Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu
325 330 335
Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys 450
<210> 12
<211> 219
<212> Белок
<213> Человек
<400> 12
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Val Leu He Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala
85 90 95
Arg Gin Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Arg
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 13
<211> 450
<212> Белок
<213> Человек
<400> 13
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val He Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys He Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Gly He Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145
150
155
160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu
325 330 335
Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys 450
<210> 14
<211> 219
<212> Белок
<213> Человек
<400> 14
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Val Leu He Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala
85 90 95
Arg Gin Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Arg
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 15
<211> 450
<212> Белок
<213> Человек
<400> 15
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val He Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys He Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Gly He Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu
325 330 335
Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys 450
<210> 16
<211> 219
<212> Белок
<213> Человек
<400> 16
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Val Leu He Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala
85 90 95
Arg Gin Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Arg
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 17
<211> 217
<212> Белок
<213> Человек
<400> 17
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
15 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gin Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
<210> 18
<211> 217
<212> Белок
<213> Человек
<400> 18
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
15 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val
180 185 190
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
<210> 19
<211> 217
<212> Белок
<213> Человек
<400> 19
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
15 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val
180 185 190
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215
<210> 20 <211> 1956 <212> ДНК <213> Человек
<400> 20
caggtgcagt tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg aggaaagtaa tagataccat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagat cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctcag aactgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatggg 300
ggtatagcag cacctgggcc tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
gcaagtacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgcccg ctagcaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttggtgag 660
aggccagcac agggagggag ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac 720
gcatcccggc tatgcagtcc cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac 780
ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct cagggagagg gtcttctggc tttttcccca 840
ggctctgggc aggcacaggc taggtgcccc taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg 900
tgctgggctc agacctgcca agagccatat ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc 960
accccaaagg ccaaactctc cactccctca gctcggacac cttctctcct cccagattcc 1020
agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 1080
accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc 1140
tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct 1200
cttcctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca 1260
aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc 1320
acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca 1380
agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg 1440
tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc 1500
tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag 1560
ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca 1620
acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1680
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1740
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1800
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1860
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1920
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1956
<210> 21 <211> 657 <212> ДНК <213> Человек
<400> 21
gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgaccgtca cccctggaga gccggcctcc 60
atctcctgca ggtccagtca gagcctcctg tatagtaatg gatacaacta tttggattgg 120
tacctgcaga agccagggca gtctccacag gtcctgatct ctttgggttc taatcgggcc 180
tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctcg acaaactcca 300
ttcactttcg gccctgggac caaagtggat atcagacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 22 <211> 1350 <212> ДНК <213> Человек
<400> 22
caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60
tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180
gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300
ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc 420
ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagtcctcc 540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcta gctctctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacgcc 900
tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagccacag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag 1080
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140
gccgtggagt gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320
cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag 1350
<210> 23 <211> 657 <212> ДНК <213> Человек
<400> 23
gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct 60
atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg 120
tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc 180
tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc 240
tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc 300
ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360
ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag 600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657
<210> 24 <211> 1350 <212> ДНК
<213> Человек <400> 24
caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60
tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180
gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300
ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc 420
ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagtcctcc 540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcta gctctctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggccgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagccacag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag 1080
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140
gccgtggagt gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320
cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag 1350
<210> 25 <211> 657 <212> ДНК <213> Человек
<400> 25
gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct 60
atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg 120
tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc 180
tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc 240
tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc 300
ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360
ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag 600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657
<210> 26 <211> 1350 <212> ДНК <213> Человек
<400> 26
caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60
tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180
gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300
ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360
gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt ccagcaagtc tacctccggc 420
ggcacagctg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ctgagcctgt gacagtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac ctctggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540
ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtcaca gtgccttcaa gcagcctggg cacccagacc 600
tatatctgca acgtgaacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggagcct 660
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccctgccctg ctcctgaagc tgctggcggc 720
ccttctgtgt tcctgttccc tccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggatc ctgaagtgaa gttcaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ctcgggagga acagtacaac 900
tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaagtctc caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgaaaa gacaatctcc 1020
aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtgtacaccc tgccacccag ccgggaggaa 1080
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaagg gcttctaccc ttccgatatc 1140
gccgtggagt gggagtctaa cggccagcct gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaaactga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320
cagaagtccc tgtccctgtc tcccggcaag 1350
<210> 27 <211> 657 <212> ДНК <213> Человек
<400> 27
gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct 60
atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg 120
tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc 180
tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc 240
tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc 300
ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360
ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag 600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657
<210> 28
<211> 277
<212> Белок
<213> Человек
<400> 28
Met Val Arg Leu Pro Leu Gin Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
15 10 15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gin Tyr Leu
20 25 30
He Asn Ser Gin Cys Cys Ser Leu Cys Gin Pro Gly Gin Lys Leu Val
35 40 45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50 55 60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gin His
65 70 75 80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gin Gin Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Glu Thr Asp Thr He Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100 105 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115 120 125
Phe Gly Val Lys Gin He Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr He Cys Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145 150 155 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gin Gin
165 170 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gin Asp Arg Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Val Val He Pro He He Phe Gly He Leu Phe Ala He
195 200 205
Leu Leu Val Leu Val Phe He Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210 215 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gin Glu Pro Gin Glu He Asn Phe Pro Asp
225 230 235 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gin Glu Thr Leu His
245 250 255
Gly Cys Gin Pro Val Thr Gin Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg He Ser
260 265 270
Val Gin Glu Arg Gin 275
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенное антитело или белок, включающие антиген-связывающую область антитела, направленную против целевого полипептида CD4 0 (SEQ ID N0:28), характеризуемые тем, что указанное антитело или белок
a. связывает полипептид CD4 0 с величиной KD, равной 10 нМ или менее, и
b. включает молчащий фрагмент Fc IgG.
2. Выделенное антитело или белок по п.1, где указанное антитело или белок ингибирует CD4OL-индуцируемое проведение сигнала с величиной IC50, равной 50 нг/мл или менее.
3. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1 или 2, где указанное антитело или белок не обладают или имеют низкую агонистическую активность в отношении CD4 0 сигнального пути.
4. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1-3, где указанное антитело или белок включают молчащий фрагмент Fc IgG, выбранный из группы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18 или SEQ ID N0:19.
5. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1-4, включающие вариабельные области тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL), имеющие, по меньшей мере, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности VH SEQ ID N0:9 и VL SEQ ID N0:10, соответственно.
6. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1-5, выбранные из группы, состоящей из:
a. антитела тАЫ, содержащего аминокислотную
последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:11 и аминокислотную
последовательность легкой цепи SEQ ID N0:12,
b. антитела тАЬ2, содержащего аминокислотную
последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:13 и аминокислотную
последовательность легкой цепи SEQ ID N0:14, и
c. антитела тАЬЗ, содержащего аминокислотную
последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0:15 и аминокислотную
последовательность легкой цепи SEQ ID N0:16.
7. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1-6 для использования в качестве лекарственного средства.
7.
8. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1-7 для использования в лечении аутоиммунных нарушений и/или воспалительных нарушений.
9. Выделенное антитело или белок по любому из пп.1-8 для использования в предотвращении или снижении риска отторжения трансплантата при трансплантации.
10. Выделенное антитело или белок по п.7 для использования в лечении рассеянного склероза, системной красной волчанки, синдрома Шегрена, ревматоидного артрита, отторжения трансплантата и реакции "трансплантат против хозяина".
11. Фармацевтическая композиция, включающая антитело или белок по любому из пп.1-6, в комбинации, по меньшей мере, с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, разбавителем или носителем.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, дополнительно включающая другие активные ингредиенты.
13. Жидкая фармацевтическая композиция, включающая антитело или белок по любому из пп.1-6, по меньшей мере, с буфером.
14. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или белок по любому из пп.1-6.
15. Клонирующий или экспрессионный вектор, включающий одну или несколько нуклеиновых кислот по п.14.
16. Клонирующий или экспрессионный вектор по п.15, включающий, по меньшей мере, одну из нижепредставленных кодирующих последовательностей (а)-(с), функционально связанных с последовательностью пригодного промотора:
(a) SEQ ID N0:22 и SEQ ID N0:23;
(b) SEQ ID N0:24 и SEQ ID N0:25; или,
(c) SEQ ID N0:26 и SEQ ID N0:27.
17. Клетка-хозяин, включающая один или несколько
клонирующих или экспрессионных векторов по пп.15-16.
18. Процесс получения антитела или белка по любому из
пп.1-6, включающий культивирование клетки-хозяина по п.17,
очистку и извлечение указанного антитела или белка.
По доверенности
ш о
S S о .
1000-
500-
клетки + среды 0l,ri> i
I 1 1 1 1 1
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Концентрация [мкг/мл]
CpG2006
Анти-IgM F(ab')2
20000n
6000л
о и J)
15000-клетки + CpG
10000-
5000
1 I 1
ш о и л
4000-
2000-
клетки + среды q.
о о о о
клетки + анти-IgM клетки + среды QJ
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Концентрация [мкг/мл]
-0.5 0.0 0.5 1.0 Концентрация
-I 1
1.5 2.0
[мкг/мл]
2000-
А А А Ж
клетки + IL-4
клетки + среды Q_
5Т г т ~* I T
I 1 1 1 1 1
¦0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Концентрация [мкг/мл]
2000-1
i 1 1 1 1
-2-1012
Концентрация [мкг/мл]
5/5 ФИГ.5
log концентрации [мкг/мл]
log концентрации [мкг/мл]
Таблица 5
Таблица 6
Таблица 6
Таблица 8
100
Таблица 10
102
Таблица 12
102
Таблица 12
103
103
109
Таблица 17
108
Ill
Ill
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
195 200 205
115
115
1/5
ФИГ.1
1/5
ФИГ.1
1/5
ФИГ.1
1/5
ФИГ.1
1/5
ФИГ.1
1/5
ФИГ.1
1/5
ФИГ.1
1/5
ФИГ.1
2/5
ФИГ.2
2/5
ФИГ.2
2/5
ФИГ.2
2/5
ФИГ.2
2/5
ФИГ.2
2/5
ФИГ.2
2/5
ФИГ.2
4/5
ФИГ.4
4/5
ФИГ.4
