[**]

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим белкам и их фрагментам, специфично связывающимся с онкостатином М (OSM), в частности человеческим OSM (hOSM), и ингибирующим связывание OSM с рецептором gp130, но не взаимодействующим непосредственно с остатками сайта II. Изобретение также относится к способу гуманизации антител. Кроме того, раскрыты фармацевтические композиции, способы скрининга и консервативного лечения.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим белкам и их фрагментам, специфично связывающимся с онкостатином М (OSM), в частности человеческим OSM (hOSM), и ингибирующим связывание OSM с рецептором gp130, но не взаимодействующим непосредственно с остатками сайта II. Изобретение также относится к способу гуманизации антител. Кроме того, раскрыты фармацевтические композиции, способы скрининга и консервативного лечения.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201390537 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2014.01.30
(22) Дата подачи заявки
2011.11.21 (51) Int. Cl. C07K16/24 (2006.01)
(54)
АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ОНКОСТАТИНОМ М (OSM)
(31) 61/416,495
(32) 2010.11.23
(33) US
(вв) PCT/EP2011/070604
(87) WO 2012/069433 2012.05.31
(вв) 2012.08.09
(71) Заявитель:
ГЛАКСО ГРУП ЛИМИТЕД (GB)
(72) Изобретатель:
Бембридж Гари Питер, Чун Чунь-ва, Фини Мария, Форд Сюзанна Карен, Керби Айан, Макадам Рут (GB)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к антигенс-вязывающим белкам и их фрагментам, специфично связывающимся с онкостатином М (OSM), в частности человеческим OSM (hOSM), и ингибирую-щим связывание OSM с рецептором gp130, но не взаимодействующим непосредственно с остатками сайта II. Изобретение также относится к способу гуманизации антител. Кроме того, раскрыты фармацевтические композиции, способы скрининга и консервативного лечения.
РСТ/ЕР2011/070604 МПК: С07К 16/24 (2006.01)
АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ОНКОСТАТИНОМ
М (OSM) ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к иммуноглобулинам, специфично связывающимся с онкостатином М (OSM) и в частности человеческим OSM (hOSM).
Настоящее изобретение также относится к способам лечения заболеваний или расстройств указанными иммуноглобулинами, фармацевтическими композициями, содержащими указанные иммуноглобулины, и способам изготовления. Другие воплощения настоящего изобретения будут ясны из приведенного ниже описания.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Онкостатин М представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 28 кДа, принадлежащий цитокиновому семейству интерлейкина-6 (IL-6), включающему IL-6, фактор, ингибирующий лейкемию (LIF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), кардиотропин-1 (СТ-1) и кардиотропин-1-подобный цитокин (см. Kishimoto Т et al (1995) Blood 86: 1243-1254), имеющие общий трансмембранный сигнальный рецептор др130 (см. Тада Т and Kishimoto Т (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 797-819). OSM был изначально обнаружен по его способности ингибировать рост клеточной линии меланомы А375 (см. Malik N (1989) et al Mol Cell Biol 9: 2847-2853). Затем были установлены другие эффекты, и было обнаружено, что он является многофункциональным медиатором, аналогично другим представителям семейства IL-6. Образование OSM происходит в клетках множества типов, включая макрофаги, активированные Т-клетки (см. Zarling JM (1986) PNAS (USA) 83: 9739-9743), полиморфонуклеарные нейтрофилы (см. Grenier A et al (1999) Blood 93:14131421), эозинофилы (см. Tamura S et al (2002) Dev. Dyn. 225: 327-31), дендритные клетки (см. Suda T et al (2002) Cytokine 17:335-340). Он также экспрессируется в поджелудочной железе, почках, яичках, селезенке, желудке, головном мозге (см. Znoyko I et al (2005) Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 283: 182-186) и костном мозге (Psenak О et al (2003) Acta Haematol 109: 68-75). Его основные биологические эффекты включают активацию эндотелия (см. Brown
TJ et al (1993) Blood 82: 33-7), активацию ответа острой фазы (см. Benigni F et al (1996) Blood 87: 1851-1854), индукцию пролиферации и дифференцировки клеток, модуляцию высвобождения воспалительных медиаторов и гемопоэза (см. Tanaka М et al (2003) 102: 3154-3162), ремоделирование кости (см. de Hooge ASK (2002) Am J Pathol 160: 1733-1743) и стимуляцию ангиогенеза (см. Vasse М et al (1999) Arterioscler Thromb Vase Biol 19:1835-1842) и заживления ран.
Рецепторы OSM ((3-рецептор OSM "OSMR(3") экспрессированы на широком спектре клеток, включая эпителиальные клетки, хондроциты, фибробласты (см. Langdon С et al (2003) J Immunol 170: 548-555), нервную ткань, гладкие мышцы, лимфатические узлы, кости, сердце, тонкую кишку, легкие, почки (см. Tamura S et al (2002) Mech Dev 1 15: 127-131) и эндотелиальные клетки. Определенные данные позволяют предполагать, что эндотелиальные клетки являются первичной мишенью OSM. Экспрессия как высоко-, так и низкоаффинных рецепторов на этих клетках повышена в 10-20 раз, и они демонстрируют выраженные и продолжительные изменения фенотипа после стимуляции OSM (см. Modur V et al (1997) J Clin Invest 100: 158168). Кроме того, OSM является сильным аутокринным фактором роста для клеток саркомы Капоши, предположительно имеющих эндотелиальное происхождение (см. Murakami-Mori Ket al (1995) J Clin Invest 96:1319-1327).
Аналогично другим цитокинам семейства IL-6, OSM связывается с трансмембранным сигналтрансдуцирующим гликопротеином др130. Ключевым свойством др130-цитокинов является образование олигомерных рецепторных комплексов, содержащих др130 и один или более корецепторов, в зависимости от лиганда (обзор в Heinrich PC et al (2003) Biochem J. 374: 1-20). В результате, эти цитокины могут опосредовать как общие, так и уникальные биологические активности in vitro и in vivo, в зависимости от состава образуемого рецепторного комплекса. Человеческий OSM (hOSM) отличается от других IL-6-цитокинов тем, что он может образовывать комплексы с др130 и любым из двух корецепторов, LIFR или рецептором онкостатина (OSMR). На Фиг. 27 показано взаимодействие hOSM с gp130, LIFR и OSMR.
Определена кристаллическая структура hOSM, и показано, что она содержит пучок из четырех а-спиралей с двумя потенциальными сайтами гликозилирования. Сайт-направленным мутагенезом в молекуле hOSM
обнаружены два отдельных сайта связывания с лигандом (см. Deller МС et al (2000) Structural Fold Des. 8:863-874). Первый, называемый сайтом II (иногда "сайтом 2"), взаимодействует с др130, и второй сайт, называемый сайтом III (иногда "сайтом 3"), на противоположном конце молекулы, взаимодействует с LIFR или OSMR. Эксперименты с мутагенезом показали, что сайты связывания для LIFR и OSMR почти идентичны, но их можно отличить друг от друга по одной аминокислотной мутации.
Появляется все больше данных, поддерживающих гипотезу о том, что модуляция взаимодействия OSM-gp130 может быть полезной при лечении ревматоидного артрита (RA) и других заболеваний и расстройств, в частности хронических воспалительных заболеваний и расстройств, таких как остеоартрит, идиопатический фиброз легких, боль, воспалительное заболевание легких, сердечно-сосудистое заболевание и псориаз.
OSM обнаружен в синовиальной жидкости (SF) пациентов-людей с RA (см. Hui W et al (1997) 56: 184-7). Эти уровни коррелируют с числом нейтрофилов в SF, уровнями фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа, иногда "TNF") в SF и маркерами деструкции хряща (Manicourt DH et al (2000) Arthritis Rheum 43: 281 -288). Кроме того, синовиальная ткань пациентов с RA секретирует OSM спонтанно ex vivo (см. Okamoto Н et al (1997) Arthritis and Rheumatism 40: 1096-1 105). Также показано, что OSM присутствует в синовиальных макрофагах (Cawston ТЕ et al (1998) Arthritis Rheum 41: 17601771), и, как обсуждено ранее, рецепторы OSM и др130 экспрессированы на эндотелиальных клетках, синовиальных фибробластах, хондроцитах и остеобластах. Аденовирусная экспрессия мышиного OSM (mOSM) в суставах нормальных мышей приводит к тяжелому воспалительному и эрозивному артриту (см. Langdon С et al (2000) Am J Pathol 157: 1187-1196). Сходное агрессивное заболевание наблюдают у мышей-нокаутов по TNF, интерлейкину-1 (IL-1), IL-6 и индуцируемой синтазе оксида азота (iNOS) после аденовирусного введения mOSM (см. de Hooge ASK et al (2003) Arthritis and Rheumatism 48:1750-1761), демонстрируя, что OSM может опосредовать все формы артрита. Экспрессия мышиного OSM с использованием аденовирусно экспрессированного вектора mOSM приводит к поражению зоны роста, типичному для ювенильного идиопатического артрита (см. de Hooge ASK et al (2003) Arthritis and Rheumatism 48:1750-1761). В экспериментальной модели
коллаген-индуцированного артрита терапевтическое введение антитела против OSM мышам предотвращало всякое дальнейшее прогрессирование заболевания. Сходные результаты были получены при профилактическом введении антитела против OSM мышам с пристан-индуцированным артритом, рецидивирующе-ремиттирующией модели, похожей на заболевание человека (см. Plater-Zyberk С et al (2001) Arthritis and Rheumatism 44).
Остеоартрит представляет собой состояние, поражающее суставы. Существует три признака остеоартрита. Он приводит к повреждению хряща -прочной гладкой поверхности, выстилающей кости и обеспечивающей легкие движения в суставах без трения. Он приводит к разрастаниям костей, развивающимся по краям суставов, и он приводит к умеренному воспалению тканей вокруг суставов (синовиту). Показано, что OSM играет важную роль в деструкции хряща, воспалении и обновлении кости, и, следовательно, блокада этого цитокина может играть роль в ключевых аспектах патогенеза заболевания. OSM действует синергично с IL-1 или TNF, индуцируя коллагенолиз в носовом хряще человека, включая распад протеогликанов (PG) и коллагена, при этом последнее коррелирует с индукцией матриксной металлопротеиназы-1 (ММР-1) и матриксной металлопротеиназы-13 (ММР-13). OSM с IL-1 также может индуцировать распад PG в человеческом суставном хряще, но усиление распада коллагена было незначительным (Morgan et al 2006). В ряде исследований с использованием аденовирусных векторов для повышения концентрации цитокинов в суставах показано, что сверхэкспрессия OSM индуцирует воспаление, образование паннуса, деструкцию хряща и эрозию кости (Langdon et al 2000). В целом, литературные данные позволяют предполагать, что OSM, в частности в комбинации с другими цитокинами, индуцирует протеазы, вовлеченные в распад протеогликанов и коллагена, приводящий к деструкции хряща и эрозии кости.
Литературные данные позволяют предполагать, что молекула OSM может быть некоторым образом вовлечена в воспалительный процесс, связанный с псориазом. В работе Boifati et al (1998) показано, что спонтанное высвобождение OSM усилено в органных культурах псориатических поражений, по сравнению с непораженной кожей при псориазе и нормальной кожей. (Kunsfeild et al 2004.) Кератиноциты экспрессируют рецептор данной молекулы, и в ответ на лиганд это приводит к миграции кератиноцитов и увеличивает
толщину восстановленного эпидермиса. Микрочиповый анализ по сравнению геномодулирующих эффектов OSM с 33 различными цитокинами показывает, что он является сильным активатором кератиноцитов и может действовать синергично с провоспалительными цитокинами, индуцируя такие молекулы, как S100A7, и экспрессию (3-дефензина 2, что характерно для кожи при псориазе (Gazel et al 2006).
Литературные данные также позволяют предполагать, что OSM играет роль при воспалительном заболевании легких, таком как астма или фиброз легких. Для этих заболеваний характерно усиленное образование внеклеточного матрикса (ЕСМ) в сочетании с пролиферацией и активацией подэпителиальных фибробластов. OSM обнаружен в жидкости бронхоальвеолярного лаважа пациентов при остром повреждении легких, в частности в случаях пневмонии (Grenier et al 2001).
OSM обнаружен в головном мозге пациентов с рассеянным склерозом (MS), где он локализован в микроглии, астроцитах и инфильтрирующих лейкоцитах (Ruprecht et al 2001). Кроме того, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделенные от пациентов с MS, спонтанно высвобождают больше цитокинов, включая OSM, чем клетки здоровых контрольных субъектов, и пациенты с MS демонстрируют тенденцию к повышенной концентрации OSM в сыворотке (Ensoli et al 2002).
Помимо стимуляции воспаления в головном мозге, OSM может непосредственно способствовать нейродегенерации, признаку болезни Альцгеймера, MS и подгруппы пациентов с инфекцией, вызванной вирусом иммунодефицита человека (HIV). Супернатанты моноцитов HIV-инфицированных пациентов приводят к выраженному ингибированию роста нейробластов и гибели нейронов. Эти эффекты были опосредованы онкостатином М в культуральном супернатанте (Ensoli et al 1999). Поскольку многие HIV-инфицированные пациенты страдают от атрофии головного мозга, обусловленной утратой нейронов, OSM может быть одним из посредников при данной патологии.
В работе Tamura et al предложено, что OSM может быть вовлечен в развитие и поддержание нейропатической боли (2003). В этих исследованиях была обнаружена подгруппа ноцицептивных сенсорных нейронов, экспрессирующих (3-рецептор OSM. Все OSMpR-положительные нейроны также
экспрессировали рецепторы VR1 и Р2ХЗ, которые, как было показано, необходимы для развития как нейропатической, так и воспалительной боли (Jarvis et al 2002, Walker et al 2003). Также было показано, что OSM -/- мыши демонстрировали сниженные болевые ответы на химическую, термическую, висцеральную и механическую боль (Morikawa et al 2004). Интересно наличие у этих животных дефицита VR1+, Р2ХЗ+ малых нейронов, при том, что в остальном эти животные соответствовали норме.
Литературные данные также позволяют предполагать, что OSM играет роль в модуляции биологии раковых клеток. Сообщено, что OSM обладает как ростостимулирующими, так и ростоингибирующими свойствами в исследованиях с использованием опухолевых клеточных линий (Grant and Begly 1999). Он является сильным митогеном для клеток, имеющих происхождение от саркомы Капоши (Miles et al 1992), и для миеломных клеточных линий (Zhang et al 1994). OSM снижает скорость роста и усиливает дифференцировку ряда опухолевых клеточных линий, включая клеточные линии опухолей молочной железы (Douglas et al 1998) и легкого (McKormick et al 2000). Тем не менее, несмотря на то, что OSM может ингибировать рост, по меньшей мере в некоторых клеточных линиях рака молочной железы он усиливает отделение клеток и увеличивает метастатический потенциал (Holzer et al 2004, Jorcyk et al 2006). В некоторых опухолевых клеточных линиях OSM также приводит к повышающей регуляции экспрессии и активированному состоянию рецептора гиалуроновой кислоты CD44 (Cichy et al 2000), связанного с опухолевым ростом и метастазированием (Yu et al 1997). Кроме того, ангиогенные свойства OSM и его способность индуцировать другие ангиогенные факторы в некоторых опухолевых клетках (Repovic et al 2003) позволяют предполагать, что он может способствовать опухолевому ангиогенезу в опухолях, экспрессирующих OSM. Данные научной литературы позволяют предполагать, что OSM играет роль в биологии опухолей, но показывают сложность этого вопроса. Возможно, нейтрализация OSM может быть полезной для лечения некоторых опухолей. С другой стороны, аналогично нейтрализации TNF и IL-6, она связана с некоторым потенциальным риском при других опухолях.
Литературные данные позволяют предполагать потенциальную роль OSM при сердечно-сосудистых заболеваниях. OSM обнаружен в тканевых макрофагах в атеросклеротических поражениях (Modur et al 1997) и в качестве
ангиогенного фактора (Vasse et al 1999) может стимулировать неоваскуляризацию, характерную для атеросклеротических бляшек, предположительно способствующую хрупкости стенок сосудов. Тем не менее, OSM также индуцирует экспрессию других ангиогенных факторов в эндотелиальных клетках; фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (Wijelah et al 1997) и основного фактора роста фибробластов (bFGF) (Bernard et al 1999). Интересно, что плотность рецепторов OSM на человеческих эндотелиальных клетках приблизительно в 10-20 раз выше, чем на других клетках (Brown et al 1991).
Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении терапевтического способа лечения RA и других заболеваний и расстройств, в частности хронических воспалительных заболеваний и расстройств, таких как остеоартрит, идиопатический фиброз легких, рак, астма, боль, сердечнососудистое заболевание и псориаз. В частности, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении иммуноглобулинов, особенно антител, специфично связывающихся с OSM (например, hOSM, в частности его сайтом II) и модулирующих (то есть, ингибирующих или блокирующих) взаимодействие между OSM и др130 при лечении заболеваний и расстройств, чувствительных к модуляции данного взаимодействия.
В WO 99/48523 авторами настоящего изобретения раскрыто применение антагонистов OSM в лечении воспалительных заболеваний и расстройств. В указанной публикации использовано антитело против мышиного OSM в модели артрита на мышах.
Все ссылки на патенты и литературные источники, приведенные в настоящем описании, положительным образом и полностью включены сюда посредством ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1: Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с человеческим др130 - ингибирование связывания человеческого OSM с человеческим др130 посредством 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из четырех повторов анализа.
Фиг. 2: КВ-клеточный анализ (анализ, проведенный на клетках линии KB) - ингибирование человеческого OSM посредством 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 3: КВ-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ посредством 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух повторов анализа.
Фиг. 4: Анализ эндогенного OSM с человеческим др130 -ингибирование связывания эндогенного человеческого OSM с человеческим др130 антителами 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (110) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух доноров.
Фиг. 5: КВ-клеточный анализ - отсутствие ингибирования человеческого LIF посредством 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Коммерческое моноклональное антитело (mAb) против человеческого LIF (R &D Systems, МАВ250) использовали в качестве положительного контроля. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля.
Фиг. 6: КВ-клеточный анализ - ингибирование OSM игрунки посредством 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух повторов анализа.
Фиг. 7: Сравнение последовательностей вариабельных доменов (вариабельных областей) тяжелой цепи (VH) гибридом 2В7, ЗЕЗ, 9G2 и 10G8. В малых рамках показаны остатки, отличающиеся от большинства
("Majority"). В больших рамках в последовательностях показаны гипервариабельные участки (CDR). "protein" - белок.
Фиг. 8: Сравнение последовательностей вариабельных доменов (вариабельных областей) легкой цепи (VL) гибридом 2В7, ЗЕЗ, 9G2 и 10G8. В малых рамках показаны остатки, отличающиеся от большинства ("Majority"). В больших рамках в последовательностях показаны CDR. "protein" - белок.
Фиг. 9. Анализ последовательности вариабельных доменов легкой цепи 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7 в сравнении с неконкурирующим исходным мышиным антителом против OSM 15Е10; сверху на фигуре указано филогенетическое дерево последовательностей VH в сравнении с 15Е10 VL; снизу на рисунке показаны расстояния между парами VH и 15Е10 VL.
Фиг. 10. Анализ последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7 в сравнении с неконкурирующим исходным мышиным антителом против OSM 15Е10; сверху на фигуре указано филогенетическое дерево последовательностей VH в сравнении с 15Е10 VH; снизу на рисунке показаны расстояния между парами VH и 15Е10 VH.
Фиг. 11: Прямой ELISA связывания с человеческим OSM - сравнение связывания химерных 10G8 и 9G2 и химерного 15Е10 (15Е10с) с человеческим OSM.
Фиг. 12: ELISA с человеческим др130 - ингибирование связывания человеческого OSM с человеческим др130 посредством 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM посредством 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 14: КВ-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM в присутствии 25-ной человеческой сыворотки АВ посредством 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM
(15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 15: Анализ эндогенного OSM с человеческим др130 -ингибирование связывания эндогенного человеческого OSM с человеческим др130 антителами 10G8, химерным 10G8, 9G2 и химерным 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух доноров.
Фиг. 16: КВ-клеточный анализ с человеческим LIF - отсутствие ингибирования человеческого LIF посредством 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2. Неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) было добавлено в целях сравнения. Антитело против человеческого LIF (МАВ250, R &D Systems) использовали в качестве положительного контроля. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 17: КВ-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM гуманизированными вариантами 10G8 L1 и L4. 15Е1 Oh было добавлено для сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 18: ELISA с человеческим др130 - ингибирование связывания человеческого OSM с человеческим др130 гуманизированными вариантами 10G8 H0L1, H1L1 и H2L1. 15E10h было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух повторов анализа.
Фиг. 19: Комплекс связывания человеческого OSM с mAb 10G8 -
связывание человеческого OSM с легкой цепью и тяжелой цепью mAb 10G8. Показаны сайты связывания OSM с рецепторами (сайт II и сайт III). Для каждого сайта приведены важные аминокислотные остатки областей связывания с рецепторами.
Фиг. 20: КВ-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM гуманизированными вариантами антител 10G8 H0L1 CDRH1 (гипервариабельный участок 1 тяжелой цепи) и CDRL2 (гипервариабельный участок 2 легкой цепи). 15E10h было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 21: ELISA с человеческим др130 - ингибирование связывания человеческого OSM с человеческим др130 исходным мышиным 10G8, химерным 10G8, гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1. 15Е1 Oh было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 22: КВ-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM исходным мышиным 10G8, химерным 10G8, гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1. 15E10h было добавлено для сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 23: КВ-клеточный анализ - ингибирование человеческого OSM в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ исходным мышиным 10G8, химерным 10G8, гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(H1)L1. 15E10h было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из двух повторов анализа.
Фиг. 24: Анализ эндогенного OSM с человеческим др130 -ингибирование связывания эндогенного человеческого OSM с человеческим др130 исходным мышиным 10G8, химерным 10G8, гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1. 15Е10 было добавлено для сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из четырех доноров.
Фиг. 25: КВ-клеточный анализ с человеческим LIF - отсутствие ингибирования человеческого LIF исходным мышиным 10G8, химерным 10G8,
гуманизированным исходным 10G8 H0L1 (H0L1), H0(huCDRH1)L1. 15Е1 Oh было добавлено для сравнения. Антитело против человеческого LIF (МАВ250, R &D Systems) использовали в качестве положительного контроля. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 26: Анализ с человеческими первичными гепатоцитами -
ингибирование высвобождения сывороточного амилоида A (SAA) посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих гепатоцитов, стимулированных (А) 3 нг/мл и (Б) 10 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех доноров гепатоцитов.
Фиг. 27: Анализ с человеческими первичными гепатоцитами -ингибирование высвобождения С-реактивного белка (CRP) посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих гепатоцитов, стимулированных (А) 3 нг/мл и (Б) 10 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех доноров гепатоцитов.
Фиг. 28: Анализ с человеческими фибробластоподобными синовиоцитами, характерными для ревматоидного артрита (RA-фибробластоподобными синовиоцитами) - ингибирование высвобождения IL-6 посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих RA-фибробластоподобных синовиоцитов (HFLS-RA), стимулированных (А) 0,3 нг/мл и (Б) 3 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех доноров HFLS-RA.
Фиг. 29: Анализ с человеческими RA-фибробластоподобными синовиоцитами - ингибирование высвобождения моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих RA-фибробластоподобных синовиоцитов (HFLS-RA), стимулированных (А) 0,3 нг/мл и (Б) 3 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех доноров HFLS-RA.
Фиг. 30: Анализ с человеческими клетками эндотелия пупочной вены - ингибирование высвобождения IL-6 посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих клеток эндотелия пупочной вены, стимулированных (А) 30 нг/мл и (Б) 100 нг/мл человеческого OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат одного из трех повторов анализа.
Фиг. 31: Анализ с человеческими легочными фибробластами -ингибирование высвобождения МСР-1 посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих легочных фибробластов, стимулированных человеческим OSM. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат (А) одного здорового донора и (Б) одного донора с идиопатическим фиброзом легких (IPF).
Фиг. 32: Анализ с человеческими легочными фибробластами -ингибирование высвобождения IL-6 посредством H0(huCDRH1)L1 из человеческих легочных фибробластов, стимулированных человеческим OSM. Гуманизированное 15Е10 (обозначенное как антитело X) было добавлено в целях сравнения. Показанные данные представляют собой репрезентативный результат (А) одного здорового донора и (Б) одного донора с IPF.
Фиг. 33: Данные о связывании вариантов гипервариабельного участка 3 тяжелой цепи (CDRH3) - проводили аланиновое сканирование остатков, обнаруженных в CDRH3. Представленные данные показывают влияние замены остатков на аффинность связывания.
Фиг. 34: Иллюстрация взаимодействия hOSM cgp130, LIFR и OSMR.
Номенклатура антител. Во избежание сомнений 15E10h и гуманизированное 15Е10 относятся к одному и тому же антителу и обозначены на некоторых графических материалах как антитело X. Кроме того, 10G8/A9 и 10G8 относятся к одному и тому же антителу.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению предложены антигенсвязывающие белки, способные связываться с OSM, например, антитела, специфично связывающиеся с OSM и ингибирующие связывание OSM с рецептором др130, но не взаимодействующие непосредственно с остатками сайта II.
Антитела против OSM по настоящему изобретению относятся к или имеют происхождение от мышиного mAb 10G8. Аминокислотная
последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного 10G8 приведена как SEQ ID N0:26, и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи мышиного 10G8 приведена как SEQ ID N0:28.
Вариабельные области тяжелой цепи (VH) по настоящему изобретению могут содержать следующие CDR или варианты этих CDR (по определению Kabat (Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)):
CDRH1 SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:77;
CDRH2 (гипервариабельный участок 2 тяжелой цепи) SEQ ID N0:2;
CDRH3 (гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи) SEQ ID N0:3.
Вариабельные области легкой цепи (VL) по настоящему изобретению могут содержать следующие CDR или варианты этих CDR (по определению Kabat (Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)):
CDRL1 (гипервариабельный участок 1 легкой цепи) SEQ ID N0:4;
CDRL2 (гипервариабельный участок 2 легкой цепи) SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:78;
CDRL3 (гипервариабельный участок 3 легкой цепи) SEQ ID N0:6.
Согласно изобретению также предложены полинуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь любого из антигенсвязывающих белков, описанных здесь, и полинуклеотид, кодирующий легкую цепь любого из антигенсвязывающих белков, описанных здесь. Такие полинуклеотиды представляют собой кодирующую последовательность, соответствующую эквивалентным полипептидным последовательностям, тем не менее, следует понимать, что такие полинуклеотидные последовательности могут быть клонированы в векторе экспрессии вместе со старт-код оном, подходящей сигнальной последовательностью и стоп-кодоном.
Согласно изобретению также предложена рекомбинантная трансформированная или трансфицированная клетка-хозяин, содержащая один или более полинуклеотиды, кодирующие тяжелую цепь или легкую цепь любого из антигенсвязывающих белков, описанных здесь.
Согласно изобретению также предложен способ получения любого из антигенсвязывающих белков, описанных здесь, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, содержащей первый и второй векторы, где указанный первый вектор содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь
любого из антигенсвязывающих белков, описанных здесь, и указанный второй вектор содержит полинуклеотид, кодирующий легкую цепь любого из антигенсвязывающих белков, описанных здесь, в подходящих культуральных средах, например, культуральных средах без сыворотки крови.
Согласно изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязывающий белок, как описано здесь, и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или профилактики заболевания или расстройства, чувствительного к модуляции взаимодействия между hOSM и др130, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении терапевтического способа лечения RA и других заболеваний и расстройств, в частности хронических воспалительных заболеваний и расстройств, таких как остеоартрит, идиопатический фиброз легких, боль, воспалительное заболевание легких, сердечно-сосудистое заболевание и псориаз. В частности, задача настоящего изобретения состоит в обеспечении иммуноглобулинов, особенно антител, специфично связывающихся с OSM (например, hOSM, в частности его сайтом II) и модулирующих (то есть, ингибирующих или блокирующих) взаимодействие между OSM и др130 при лечении заболеваний и расстройств, чувствительных к модуляции этого взаимодействия.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительным заболеванием или расстройством, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ гуманизации антитела, включающий стадии: получения антитела, не являющегося человеческим антителом, связывающегося с целевым антигеном; определения кристаллографической структуры сокристалла "антитело-антиген"; определения, на основании кристаллической структуры приблизительно 2-5 А, остатков антитела, не являющегося человеческим антителом, непосредственно вовлеченных в связывание с антигеном; мутации
одного или более остатков, не вовлеченных в связывание, с их заменой остатками, имеющими происхождение от человеческой последовательности; и выделения указанного антитела.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению предложен антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с OSM, например, специфично связывающийся с человеческим OSM (hOSM), и ингибирующий связывание OSM с рецептором др130, но не взаимодействующий непосредственно с остатками сайта II.
В другом аспекте изобретения, как описано здесь, антигенсвязывающий белок не связывается непосредственно с остатками Q20, G120, Q16, N124.
В другом аспекте изобретения, как описано здесь, предложен антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с OSM, например, специфично связывающийся с человеческим OSM (hOSM), ингибирующий связывание OSM с рецептором др130 и взаимодействующий с одним или более из остатков 82, 83, 84, 90, 94, 112,115, 122, 123, 152 человеческого OSM.
В одном таком аспекте согласно изобретению предложен антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с OSM, например, специфично связывающийся с человеческим OSM (hOSM), и ингибирующий связывание OSM с рецептором др130, но не взаимодействующий непосредственно с остатками сайта II и не конкурирующий с антителом, имеющим тяжелую цепь SEQ ID N0:79 и легкую цепь SEQ ID N0:80, в конкурентном ELISA-анализе.
В одном таком аспекте согласно изобретению предложен антигенсвязывающий белок, конкурирующий с антигенсвязывающим белком, как описано здесь, за связывание с OSM, например, с человеческим OSM.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM с высокой аффинностью, например, при измерении посредством Biacore антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM с аффинностью 500 пМ или менее или аффинностью 400 пМ или менее, или 300 пМ или менее, или 250 пМ или менее, или 200 пМ или менее, или, например, 140 пМ или менее. В другом воплощении антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM, при измерении посредством Biacore, с аффинностью от приблизительно 100 пМ до приблизительно 500 пМ, или от
приблизительно 100 пМ до приблизительно 300 пМ, или от приблизительно 100 пМ до приблизительно 250 пМ, или от приблизительно 100 пМ до приблизительно 200 пМ. В одном воплощении настоящего изобретения антигенсвязывающий белок связывается с OSM с аффинностью менее 250 пМ. В другом воплощении настоящего изобретения антигенсвязывающий белок связывается с OSM с аффинностью менее 140 пМ.
В одном таком воплощении это измерено посредством Biacore, например, как изложено в Примере 2.5.1.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM с высокой аффинностью, например, при измерении способом Kinexa в растворе антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM с аффинностью 200 пМ или менее или аффинностью 150 пМ или менее, или 100 пМ или менее, или 50 пМ или менее, или, например, 40 пМ или менее. В другом воплощении антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM, при измерении посредством Kinexa, с аффинностью от приблизительно 10 пМ до приблизительно 200 пМ, или от приблизительно 10 пМ до приблизительно 150 пМ, или от приблизительно 10 пМ до приблизительно 100 пМ, или от приблизительно 10 пМ до приблизительно 70 пМ, или от приблизительно 10 пМ до приблизительно 40 пМ. В одном воплощении настоящего изобретения антигенсвязывающий белок связывается с OSM с аффинностью менее 70 пМ. В другом воплощении настоящего изобретения антигенсвязывающий белок связывается с OSM с аффинностью менее 40 пМ.
В одном таком воплощении это измерено посредством Kinexa, например, как изложено в Примере 2.5.1.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM и нейтрализует OSM в клеточном анализе нейтрализации со средней ингибирующей концентрацией (IC50) от приблизительно 10 пМ до приблизительно 200 пМ, или от приблизительно 10 пМ до приблизительно 150 пМ, или от приблизительно 10 пМ до приблизительно 100 пМ, или от приблизительно 20 пМ до приблизительно 100 пМ, или от приблизительно 20 пМ до приблизительно 100 пМ. В другом воплощении настоящего изобретения антигенсвязывающий белок связывается с OSM и нейтрализует OSM в
клеточном анализе нейтрализации с IC50 приблизительно 20 пМ при аффинности менее 140 пМ.
В одном таком воплощении это измерено клеточным анализом нейтрализации, например, как изложено в Примере 2, разделе 2.2.1.
В одном аспекте согласно настоящему изобретению также предложено, что антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID N0:3 или вариант SEQ ID N0:3, где CDRH3 содержит альтернативные аминокислотные замены, как изложено ниже, в одном или более из следующих положений (с использованием нумерации Kabat):
замену на Ala, Glu, Gly, His, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr или Val в положении 95;
замену на Ala, Cys, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Ser, Thr, Trp или Туг в положении 96;
замену на Ala, Cys, Phe, Met или Ser в положении 97; замену на Ala, Asp, Phe, Gly, Leu, Pro, Gin или Trp в положении 98; замену на Ala, Cys, Pro, Ser, Val или Туг в положении 99; замену на Glu в положении 100В;
замену на Ala, Glu, Phe, Gly, Val или Trp в положении 100C;
замену на Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Thr, Val, Trp или Туг в положении 100D;
замену на Glu, Gly, Ser, Thr или Val в положении 101;
замену на Ala, Phe, Gly, Leu, Pro, Gin, Arg, Ser, Туг, His, lie, Asp или Trp в положении 102.
В другом аспекте изобретения антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID N0:3, или вариант SEQ ID N0:3, где Val102 заменен на Туг, His, Не, Ser, Asp или Gly;
2) CDRH2, как изложено в SEQ ID N0:2, или вариант SEQ ID N0:2, где Thr50 заменен на Gly, Туг, Phe, lie, Glu или Val, и/или Пе51 заменен на Leu, Val, Thr, Ser или Asn, и/или Ser52 заменен на Phe, Trp или His, и/или Gly53 заменен на Asp, Ser или Asn, и/или Gly54 заменен на Ser, и/или Phe56 заменен на Ser, Туг, Thr, Asn, Asp или Arg, и/или Туг58 заменен на Gly, His, Phe, Asp или Asn;
3) CDRL1, как изложено в SEQ ID N0:4, или вариант SEQ ID N0:4, где Ser27A заменен на Asn, Asp, Thr или Glu, и/или Ser27C заменен на Asp, Leu, Туг, Val, lie, Asn, Phe, His, Gly или Thr, и/или Asn31 заменен на Ser, Thr, Lys или
1)
Gly, и/или Phe32 заменен на Туг, Asn, Ala, His, Ser или Arg, и/или Met33 заменен на Leu, Val, Не или Phe;
4) CDRL3, как изложено в SEQ ID N0:6, или вариант SEQ ID N0:6, где Leu89 заменен на Gin, Ser, Gly или Phe, и/или His90 заменен на Gin или Asn, Ser91 заменен на Asn, Phe, Gly, Arg, Asp, His, Thr, Туг или Val, и/или Arg92 заменен на Asn, Туг, Trp, Thr, Ser, Gin, His, Ala или Asp, и/или Glu93 заменен на Asn, Gly, His, Thr, Ser, Ar или Ala, и/или Phe96 заменен на Pro, Leu, Туг, Arg, lie или Trp.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок дополнительно содержит:
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:78.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок дополнительно содержит:
6) CDRH1, как изложено в SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:77, или вариант SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:77, где Туг32 заменен на lie, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu или Asp, и/или Ala33 заменен на Туг, Trp, Gly, Thr, Leu или Val, и/или Met34 заменен на lie, Val или Trp, и/или Ser35 заменен на His, Glu, Asn, Gin, Туг или Thr.
Последовательности вариантов CDR для CDR L1, L2, L3, H1 и Н2 определены с применением мутагенеза или канонической технологии. Структура гипервариабельных участков (CDR) L1, L2, L3, Н1 и Н2 обычно имеет одну из конечного числа конформаций главной цепи. Конкретный класс канонической структуры CDR определяют как длина CDR, так и расположение петель, которое определяют остатки, расположенные в ключевых положениях CDR и каркасных областей (остатки, определяющие структуру, или SDR). Martin and Thornton (1996; J Mol Biol 263:800-815) разработали автоматический способ определения канонических матриц "ключевых остатков". Для определения канонических классов групп CDR применяют кластерный анализ и затем определяют канонические матрицы анализом скрытых гидрофобных остатков, остатков, образующих водородные связи и консервативных глицинов и пролинов. Канонические классы CDR последовательностей антител могут быть определены сравнением последовательностей с матрицами ключевых остатков и определением балльного показателя по каждой матрице с применением матриц тождественности или подобия.
В одном аспекте согласно изобретению предложен антигенсвязывающий белок, содержащий CDRH3 SEQ ID N0:3, CDRH2 SEQ ID N0:2, CDRL1 SEQ ID N0:4 и CDRL3 SEQ ID N0:6, который может дополнительно содержать CDR Н1 SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:77 и CDRL2 SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:78.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID N0:3, CDRH2 SEQ ID N0:2, CDRL1 SEQ ID N0:4, CDRL2 SEQ ID N0:5 и CDRL3 SEQ ID N0:6.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID N0:3, CDRH2 SEQ ID N0:2, CDR H1 SEQ ID N0:1, CDRL1 SEQ ID N0:4, CDRL2 SEQ ID N0:5 и CDRL3 SEQ ID N0:6.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID N0:3, CDRH2 SEQ ID N0:2, CDRH1 SEQ ID N0:1, CDRL1 SEQ ID N0:4, CDRL2 SEQ ID N0:78 и CDRL3 SEQ ID N0:6.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID N0:3, CDRH2 SEQ ID N0:2, CDRH1 SEQ ID N0:77, CDRL1 SEQ ID N0:4, CDRL2 SEQ ID N0:5 и CDRL3 SEQ ID N0:6.
В еще одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит CDRH3 SEQ ID N0:3, CDRH2 SEQ ID N0:2, CDRH1 SEQ ID N0:77, CDRL1 SEQ ID N0:4, CDRL2 SEQ ID N0:78 и CDRL3 SEQ ID N0:6.
В одном аспекте настоящего изобретения антигенсвязывающий белок не взаимодействует непосредственно через CDRH1 с OSM.
В одном аспекте антигенсвязывающий белок не взаимодействует непосредственно через CDRH1 или CDR L2 с OSM.
Антигенсвязывающие белки по изобретению могут содержать вариабельные области тяжелой цепи и вариабельные области легкой цепи по изобретению, которые могут быть форматированы с получением структуры природного антитела или его функционального фрагмента или эквивалента. Таким образом, антигенсвязывающий белок по изобретению может содержать области VH по изобретению, форматированные таким образом, что при образовании ими пары с подходящей легкой цепью образуется полноразмерное антитело, (РаЬ')2-фрагмент, Fab-фрагмент или его эквивалент (такой как scFV, би-, три- или тетратела, Tandabs и так далее). Антитело может представлять собой lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4; или IgM, IgA, IgE или IgD; или их модифицированный вариант. Константный домен тяжелой цепи антитела
может быть выбран соответствующим образом. Константный домен легкой цепи может представлять собой константный домен каппа или лямбда. Кроме того, антигенсвязывающий белок может содержать модификации всех классов, например, димеры IgG, Fc-мутанты, более не связывающиеся с Fc-рецепторами или не опосредующие связывание с C1q. Антигенсвязывающий белок может также представлять собой химерное антитело описанного в WO 86/01533 типа, содержащее антигенсвязывающую область и область, не являющуюся областью иммуноглобулина.
Константную область выбирают в соответствии с любой желаемой функциональностью. lgG1 может обладать литической способностью посредством связывания с комплементом и/или опосредовать ADCC (антителозависимую клеточную цитотоксичность). lgG4 может быть использован тогда, когда необходимо нецитотоксическое блокирующее антитело. Тем не менее, антитела lgG4 могут быть нестабильны при получении, и поэтому альтернативой является модификация обычно более стабильных lgG1. Предложенные модификации описаны в ЕР 0307434, например, мутации в положениях 235 и 237. Таким образом, согласно изобретению предложена литическая или нелитическая форма антигенсвязывающего белка, например, антитела, по изобретению.
В определенных формах антитело по изобретению представляет собой полноразмерное (например, тетрамер H2L2) литическое или нелитическое антитело lgG1, имеющее любые вариабельные области тяжелой цепи, описанные здесь.
Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению имеют происхождение от мышиного антитела, имеющего вариабельные области, как описано в SEQ ID N0:26 и SEQ ID N0:28, или их немышиных эквивалентов, таких как их крысиные, человеческие, химерные или гуманизированные варианты, например, они имеют происхождение от гуманизированного антитела, имеющего тяжелые и легкие цепи, как описано в SEQ ID N0:54 и SEQ ID N0:62.
В одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий выделенный вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из любого из следующего: SEQ ID N0:54, SEQ ID N0:56, SEQ ID N0:58 или SEQ ID N0:74.
В одном аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий выделенный вариабельный домен легкой цепи, выбранный из любого из следующего: SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:64, SEQ ID N0:66 или SEQ ID N0:68.
В другом аспекте изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий выделенный вариабельный домен тяжелой цепи, выбранный из любого из следующего: SEQ ID N0:54, SEQ ID N0:56, SEQ ID N0:58 или SEQ ID N0:74; и выделенный вариабельный домен легкой цепи, выбранный из любого из следующего: SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:64, SEQ ID N0:66 или SEQ ID N0:68.
В другом воплощении изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий выделенный вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID N0:54 и выделенный вариабельный домен легкой цепи SEQ ID N0:62. В другом воплощении антигенсвязывающий белок содержит вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID N0:74 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID N0:62.
В одном аспекте антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID N0:53, и вариабельную область легкой цепи, кодируемую SEQ ID N0:61. В одном аспекте антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую SEQ ID N0:73, и вариабельную область легкой цепи, кодируемую SEQ ID N0:61.
В одном аспекте предложен полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область тяжелой цепи, содержащий SEQ ID N0:53, или SEQ ID N0:55, или SEQ ID N0:57, или SEQ ID N0:73.
В одном аспекте предложен полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:61, или SEQ ID N0:63, или SEQ ID N0:65, или SEQ ID N0:67.
В другом аспекте предложен полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область тяжелой цепи, содержащий SEQ ID N0:53 или SEQ ID N0:73, и полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:61, или SEQ ID N0:63, или SEQ ID N0:65, или SEQ ID N0:67. В еще одном аспекте предложен полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область тяжелой цепи, содержащий
SEQ ID N0:53 или SEQ ID N0:73, и полинуклеотид, кодирующий выделенную вариабельную область легкой цепи, содержащий SEQ ID N0:61.
В другом аспекте антигенсвязывающий белок может содержать любые вариабельные области тяжелой цепи, как описано здесь, в комбинации с любыми легкими цепями, как описано здесь.
В одном аспекте антигенсвязывающий белок представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий один или более CDR по изобретению, описанных здесь, или один или оба вариабельных домена тяжелой или легкой цепи по изобретению, описанных здесь. В одном воплощении антигенсвязывающий белок связывается с OSM примата. В одном таком воплощении антигенсвязывающий белок дополнительно связывается с OSM примата, не являющегося человеком, например, OSM яванского макака. В другом воплощении антигенсвязывающий белок связывается с OSM игрунки.
В одном аспекте предложен антигенсвязывающий белок, связывающийся как с OSM игрунки, так и с OSM человека с аффинностью выше 1 нМ при измерении посредством Biacore или Kinexa.
В качестве дополнительных показаний, способность этих антител нейтрализовать OSM игрунки обеспечивает уникальное средство оценки роли OSM в моделях заболеваний на игрунках, таких как ЕАЕ(экспериментальный острый энцефаломиелит)-модель MS (рассеянный склероз).
В другом аспекте антигенсвязывающий белок выбран из группы, состоящей из однодоменного антитела (dAb), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, диатела, триатела, тетратела, миниантитела и минитела.
В одном аспекте настоящего изобретения антигенсвязывающий белок представляет собой гуманизированное или химерное антитело, в другом аспекте антитело является гуманизированным.
В одном аспекте антитело представляет собой моноклональное антитело.
Согласно настоящему изобретению также предложено, что в одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID N0:3, или вариант SEQ ID N0:3, где CDRH3 содержит альтернативные аминокислотные замены, как изложено ниже, в одном или более из следующих положений (с использованием нумерации Kabat):
замену на Ala, Glu, Gly, His, Leu, Met, Pro, Gin, Ser, Thr или Val в положении 95;
замену на Ala, Cys, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Ser, Thr, Trp или Туг в положении 96;
замену на Ala, Cys, Phe, Met или Ser в положении 97; замену на Ala, Asp, Phe, Gly, Leu, Pro, Gin или Trp в положении 98; замену на Ala, Cys, Pro, Ser, Val или Туг в положении 99; замену на Glu в положении 100В;
замену на Ala, Glu, Phe, Gly, Val или Trp в положении 100C;
замену на Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Thr, Val, Trp или Туг в положении 100D;
замену на Glu, Gly, Ser, Thr или Val в положении 101;
замену на Ala, Phe, Gly, Leu, Pro, Gin, Arg, Ser Туг, His, lie, Asp или Trp в положении 102;
2) CDRH1, как изложено в SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:77, или вариант SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:77, где Туг32 заменен на lie, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu или Asp, и/или Ala33 заменен на Туг, Trp, Gly, Thr, Leu или Val, и/или Met34 заменен на lie, Val или Trp, и/или Ser35 заменен на His, Glu, Asn, Gin, Туг или Thr;
3) CDRH2, как изложено в SEQ ID N0:2, или вариант SEQ ID N0:2, где Thr50 заменен на Gly, Туг, Phe, lie, Glu или Val, и/или Ile51 заменен на Leu, Val, Thr, Ser или Asn, и/или Ser52 заменен на Phe, Trp или His, и/или Gly53 заменен на Asp, Ser или Asn, и/или Gly54 заменен на Ser, и/или Phe56 заменен на Ser, Туг, Thr, Asn, Asp или Arg, и/или Туг58 заменен на Gly, His, Phe, Asp или Asn;
4) CDRL1, как изложено в SEQ ID N0:4, или вариант SEQ ID N0:4, где Ser27A заменен на Asn, Asp, Thr или Glu, и/или Ser27C заменен на Asp, Leu, Туг, Val, lie, Asn, Phe, His, Gly или Thr, и/или Asn 31 заменен на Ser, Thr, Lys или Gly, и/или Phe32 заменен на Туг, Asn, Ala, His, Ser или Arg, и/или Met33 заменен на Leu, Val, Не или Phe;
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:78;
6) CDRL3, как изложено в SEQ ID N0:6, или вариант SEQ ID N0:6, где Leu89 заменен на Gin, Ser, Gly или Phe, и/или His90 заменен на Gin или Asn, Ser91 заменен на Asn, Phe, Gly, Arg, Asp, His, Thr, Туг или Val, и/или Arg92 заменен на Asn, Туг, Trp, Thr, Ser, Gin, His, Ala или Asp, и/или Glu93 заменен на
2)
Asn, Gly, His, Thr, Ser, Ar или Ala, и/или Phe96 заменен на Pro, Leu, Туг, Arg, lie или Trp;
7) каркасную область тяжелой цепи, содержащую следующие остатки:
Val, Не или Gly в положении 2;
Leu или Val в положении 4;
Leu, lie, Met или Val в положении 20;
Cys в положении 22;
Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24;
Gly в положении 26;
lie, Phe, Leu или Ser в положении 29;
Тгр в положении 36;
Тгр в положении 47;
lie, Met, Val или Leu в положении 48;
lie, Leu, Phe, Met или Val в положении 69;
Arg в положении 71;
Ala, Leu, Val, Туг или Phe в положении 78; Leu, Met в положении 80; Туг или Phe в положении 90; Cys в положении 92;
Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
Согласно настоящему изобретению также предложено, что в одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID N0:3;
2) CDRH1, как изложено в SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:77;
3) CDRH2, как изложено в SEQ ID N0:2;
4) CDRL1, как изложено в SEQ ID N0:4;
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:78;
6) CDRL3, как изложено в SEQ ID N0:6;
7) каркасную область тяжелой цепи, содержащую следующие остатки: Val, Не или Gly в положении 2;
Leu или Val в положении 4;
Leu, lie, Met или Val в положении 20;
Cys в положении 22;
Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24;
Gly в положении 26;
Не, Phe, Leu или Ser в положении 29;
Тгр в положении 36;
Тгр в положении 47;
lie, Met, Val или Leu в положении 48;
lie, Leu, Phe, Met или Val в положении 69;
Arg в положении 71;
Ala, Leu, Val, Туг или Phe в положении 78; Leu, Met в положении 80; Туг или Phe в положении 90; Cys в положении 92;
Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
Согласно настоящему изобретению также предложено, что в одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID N0:3;
2) CDRH1, как изложено в SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:77;
3) CDRH2, как изложено в SEQ ID N0:2;
4) CDRL1, как изложено в SEQ ID N0:4;
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:78;
6) CDRL3, как изложено в SEQ ID N0:6;
7) каркасную область тяжелой цепи, содержащую следующие остатки: Val в положении 2;
Leu в положении 4; Leu в положении 20; Cys в положении 22; Ala в положении 24; Gly в положении 26; Phe в положении 29; Тгр в положении 36; Тгр в положении 47; Val в положении 48; Не в положении 69; Arg в положении 71; Leu в положении 78;
Leu в положении 80; Туг в положении 90; Cys в положении 92; Arg в положении 94.
Согласно настоящему изобретению также предложено, что в одном аспекте антигенсвязывающий белок содержит:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID N0:3;
2) CDRH1, как изложено в SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:77;
3) CDRH2, как изложено в SEQ ID N0:2;
4) CDRL1, как изложено в SEQ ID N0:4;
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:78;
6) CDRL3, как изложено в SEQ ID N0:6;
7) каркасную область тяжелой цепи, содержащую следующие остатки: Val в положении 2;
Leu в положении 4; Leu в положении 20; Cys в положении 22; Ala в положении 24; Gly в положении 26; Phe в положении 29; Тгр в положении 36; Тгр в положении 47; Leu в положении 48;
Не, Leu, Phe, Met или Val в положении 69;
Arg в положении 71;
Ala в положении 78;
Leu, Met в положении 80;
Туг или Phe в положении 90;
Cys в положении 92;
Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
Антигенсвязывающие белки, например, антитела по настоящему
изобретению, могут быть получены трансфекцией клетки-хозяина вектором
экспрессии, содержащим кодирующую последовательность
антигенсвязывающего белка по изобретению. Вектор экспрессии или
рекомбинантную плазмиду получают, функциональным связыванием этих кодирующих последовательностей антигенсвязывающего белка с обычными регуляторными контрольными последовательностями, способными контролировать репликацию и экспрессию в клетке-хозяине и/или секрецию из клетки-хозяина. Регуляторные последовательности включают промоторные последовательности, например, цитомегаловирусный (CMV) промотор, и сигнальные последовательности, которые могут иметь происхождение от других известных антител. Сходным образом, может быть получен второй вектор экспрессии, имеющий последовательность ДНК, кодирующую комплементарную легкую или тяжелую цепь антигенсвязывающего белка. В определенных воплощениях этот второй вектор экспрессии идентичен первому, за исключением кодирующих последовательностей и селектируемых маркеров, таким образом, чтобы обеспечить, по возможности, функциональную экспрессию каждой полипептидной цепи. Альтернативно, кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепи антигенсвязывающего белка могут быть расположены на одном векторе.
Выбранную клетку-хозяина котрансфицируют обычными методиками первым и вторым векторами (или просто трансфицируют одним вектором) с получением трансфицированной клетки-хозяина по изобретению, содержащей рекомбинантные или синтетические легкие и тяжелые цепи. Трансфицированную клетку-хозяина затем культивируют обычными методиками с получением конструированного антигенсвязывающего белка по изобретению. Проводят скрининг антигенсвязывающего белка, содержащего ассоциацию рекомбинантной тяжелой цепи и/или легкой цепи, из культуры подходящим анализом, таким как ELISA или радиоиммунный анализ (RIA). Сходные обычные методики могут быть применены для конструирования других антигенсвязывающих белков.
Подходящие векторы для стадий клонирования и субклонирования, используемые в способах и изготовлении композиций по данному изобретению, могут быть выбраны специалистом в данной области техники. Например, можно использовать обычную серию клонирующих векторов pUC. Один вектор, pUC19, имеется в продаже от таких фирм-поставщиков, как Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) или Pharmacia (Uppsala, Sweden). Кроме того, для клонирования может быть использован любой простой в
использовании вектор, способный к быстрой репликации и имеющий множество сайтов клонирования и селектируемых генов (например, генов устойчивости к антибиотикам). Таким образом, выбор клонирующего вектора не является ограничивающим фактором в данном изобретении.
Для векторов экспрессии могут также быть характерны гены, подходящие для усиления экспрессии гетерологичных последовательностей ДНК, например, ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) млекопитающих. Другие векторные последовательности включают сигнальную последовательность "поли-А", такую как соответствующая последовательность бычьего гормона роста (BGH) и последовательность промотора бета-глобина (betaglopro). Полезные здесь векторы экспрессии могут быть синтезированы методиками, хорошо известными специалистам в данной области техники.
Компоненты таких векторов, например, репликоны, селектируемые гены, энхансеры, промоторы, сигнальные последовательности и тому подобное, могут быть получены из коммерческих или природных источников или синтезированы известными способами для использования в управлении экспрессией и/или секрецией продукта рекомбинантной ДНК в выбранном хозяине. Для этой цели могут также быть выбраны другие подходящие векторы экспрессии, многие типы которых известны в данной области техники для экспрессии у млекопитающих, бактерий, насекомых, дрожжей и грибов.
Настоящее изобретение также включает клеточную линию, трансформированную рекомбинантной плазмидой, содержащей кодирующие последовательности антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению. Клетки-хозяева, полезные для клонирования и других манипуляций с этими клонирующими векторами, также хорошо известны. Однако для репликации клонирующих векторов и других стадий конструирования антигенсвязывающих белков по данному изобретению могут быть использованы клетки различных штаммов Е. coli.
Подходящие клетки-хозяева или клеточные линии для экспрессии антигенсвязывающих белков по изобретению включают клетки млекопитающих, такие как NS0 (клетки миеломы мыши NSO), Sp2/0 (клетки мышиной миеломы Sp2/0), СНО (клетки яичника китайского хомячка) (например, DG44), COS (клетки африканской зеленой мартышки), НЕК (эмбриональные клетки почек), фибробласты (например, ЗТЗ) и клетки миеломы, например, возможна
экспрессия в клетке СНО или клетке миеломы. Могут быть использованы клетки человека, что позволяет модифицировать молекулу человеческими паттернами гликозилирования.
Альтернативно, могут быть использованы другие эукариотические клеточные линии. Выбор подходящих клеток-хозяев, являющихся клетками млекопитающих, и способов трансформации, культивирования, амплификации, скрининга, а также получения и очистки продукта известны в данной области техники. См., например, Sambrook et al., процитированную выше.
Бактериальные клетки могут быть полезными в качестве клеток-хозяев, подходящих для экспрессии рекомбинантных Fab или для других воплощений настоящего изобретения (см., например, Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151188 (1992)). Тем не менее, ввиду тенденции белков, экспрессированных в бактериальных клетках, к несвернутой, или неправильно свернутой форме, или негликозилированной форме, будет необходимо проводить скрининг любого рекомбинантного Fab, полученного в бактериальной клетке, на предмет сохранения способности связываться с антигеном. Если молекула, экспрессированная бактериальной клеткой, получена в правильно свернутой форме, эта бактериальная клетка является желаемым хозяином, или, в альтернативных воплощениях, возможна экспрессия молекулы в бактериальном хозяине с последующим рефолдингом. Например, различные штаммы Е. coli, используемые для экспрессии, хорошо известны в качестве клеток-хозяев в области биотехнологии. Различные штаммы В. subtilis, Streptomyces, другие бациллы и тому подобное могут также быть использованы в данном способе.
Там, где желательно, в качестве клеток-хозяев также доступны штаммы дрожжевых клеток, известные специалистам в данной области техники, а также клетки насекомых, например, Drosophila и Lepidoptera, и вирусные системы экспрессии. См., например, Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) и приведенные там ссылки.
Общие способы конструирования векторов, способы трансфекции, необходимые для получения клеток-хозяев по изобретению, и способы культивирования, необходимые для получения антигенсвязывающего белка по изобретению из такой клетки-хозяина, могут представлять собой обычные методики. Обычно способ культивирования по настоящему изобретению
представляет собой свободный от сыворотки способ культивирования, обычно свободное от сыворотки культивирование клеток в суспензии. Сходным образом, после получения антигенсвязывающие белки по изобретению могут быть очищены от содержимого клеточной культуры стандартными способами данной области техники, включая преципитацию с сульфатом аммония, аффинные колонки, хроматографию на колонках, электрофорез в геле и тому подобное. Такие методики входят в компетенцию специалиста в данной области техники и не ограничивают объем данного изобретения. Например, препараты измененных антител описаны в WO 99/58679 и WO 96/16990.
В еще одном способе экспрессии антигенсвязывающих белков может быть применена экспрессия в трансгенном животном, например, как описано в патенте США №4873316. Это относится к системе экспрессии с использованием промотора животного казеина, который при его трансгенном введении млекопитающему позволяет получать желаемый рекомбинантный белок в молоке самки.
В другом воплощении изобретения предложен способ получения антитела по изобретению, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором, кодирующим легкую и/или тяжелую цепь антитела по изобретению, и выделения полученного таким образом антитела.
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения антитела против OSM по настоящему изобретению, связывающегося с человеческим OSM и нейтрализующего его активность, включающий стадии:
а) обеспечения первого вектора, кодирующего тяжелую цепь антитела;
б) обеспечения второго вектора, кодирующего легкую цепь антитела;
в) трансформации клетки-хозяина, являющейся клеткой млекопитающего
(например, СНО), указанными первым и вторым векторами;
г) культивирования клетки-хозяина по стадии (в) в условиях,
способствующих секреции антитела из указанной клетки-хозяина в указанную
культуральную среду;
д) выделения секретированного антитела по стадии (г).
После экспрессии антитела желаемым способом исследуют его активность in vitro с применением подходящего анализа. В настоящее время для качественной и количественной оценки связывания антитела с OSM
применяют обычные форматы ELISA-анализа. Кроме того, другие анализы in vitro могут также быть применены для верификации эффективности нейтрализации перед последующими клиническими исследованиями у людей, проводимыми для оценки сохранения антитела в организме, несмотря на обычные механизмы клиренса.
Доза и продолжительность лечения связаны с относительным сохранением молекул по настоящему изобретению в системе кровообращения у человека и могут быть скорректированы специалистом в данной области техники, в зависимости от состояния, по поводу которого проводят лечение, и общего состояния здоровья пациента. Предполагают, что для достижения максимальной терапевтической эффективности может быть необходимо повторное введение (например, один раз в неделю или один раз в две недели) на протяжении продолжительного периода времени (например, от четырех до шести месяцев).
В одном воплощении настоящего изобретения предложена рекомбинантная трансформированная, трансфицированная или трансдуцированная клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере одну экспрессионную кассету, например, экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антигенсвязывающего белка по изобретению, описанного здесь, и дополнительно содержащую полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антигенсвязывающего белка по изобретению, описанного здесь, или две экспрессионные кассеты, из которых первая кодирует легкую цепь и вторая кодирует тяжелую цепь. Например, в одном воплощении первая экспрессионная кассета содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антигенсвязывающего белка, содержащую ее константную область или антигенсвязывающий фрагмент, связанный с константной областью, по изобретению, описанную здесь, и дополнительно содержит вторую кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антигенсвязывающего белка, содержащую ее константную область или антигенсвязывающий фрагмент, связанный с константной областью, по изобретению, описанную здесь, например, первая экспрессионная кассета содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь, выбранную из SEQ ID N0:70 или SEQ ID N0:76, и вторую экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий легкую цепь, выбранную из SEQ ID N0:72.
Следует понимать, что последовательности, описанные здесь (SEQ ID N0:25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 83), включают последовательности, по существу идентичные, например, последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные, например, по меньшей мере на 91%, или по меньшей мере на 92%, или по меньшей мере на 93%, или по меньшей мере на 94%, или по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 96%, или по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% идентичные последовательностям, описанным здесь.
Для нуклеиновых кислот термин "по существу идентичный" означает, что две нуклеиновые кислоты или их обозначенные последовательности, при их оптимальном выравнивании и сравнении, идентичны, с подходящими нуклеотидными вставками или делециями, в по меньшей мере приблизительно 80% нуклеотидов, по меньшей мере от приблизительно 90% до приблизительно 95% или по меньшей мере от приблизительно 98% до приблизительно 99,5% нуклеотидов. Альтернативно, по существу идентичными являются сегменты, гибридизующиеся в условиях селективной гибридизации с последовательностью, комплементарной данной цепи.
Для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин "идентичный" обозначает степень идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей при оптимальном выравнивании и сравнении с использованием подходящих вставок или делеций. Альтернативно, по существу идентичными являются сегменты ДНК, гибридизующиеся в условиях селективной гибридизации с последовательностью, комплементарной данной цепи.
В другом воплощении изобретения предложена стабильно трансформированная клетка-хозяин, содержащая вектор, содержащий одну или более экспрессионных кассет, кодирующих тяжелую цепь и/или легкую цепь антитела, содержащие их константную область или антигенсвязывающий фрагмент, связанный с константной областью, как описано здесь. Например, такие клетки-хозяева могут содержать первый вектор, кодирующий легкую цепь, и второй вектор, кодирующий тяжелую цепь, например, первый вектор кодирует тяжелую цепь, выбранную из SEQ ID N0:70 или SEQ ID N0:76, и второй вектор кодирует легкую цепь, например, легкую цепь SEQ ID N0:72.
В другом воплощении настоящего изобретения предложена клетка-хозяин по изобретению, описанная здесь, представляющая собой эукариотическую клетку, например, представляющая собой клетку млекопитающего. Примеры таких клеточных линий включают СНО или NS0.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ получения антитела, содержащего его константную область или антигенсвязывающий фрагмент, связанный с константной областью, по изобретению, описанного здесь, включающий стадию культивирования клетки-хозяина в культуральных средах, например, свободных от сыворотки культуральных средах.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ по изобретению, описанный здесь, где указанное антитело дополнительно очищают до степени очистки по меньшей мере 95% или более (например, 98% или более), по сравнению с указанным антителом, содержащим свободные от сыворотки культуральные среды.
В еще одном воплощении предложена фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязывающий белок и фармацевтически приемлемый носитель.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен набор, содержащий композицию по изобретению, описанную здесь, вместе с инструкциями по применению.
Способ введения терапевтического агента по изобретению может представлять собой любой подходящий способ введения, обеспечивающий доставку агента хозяину. Антигенсвязывающие белки и фармацевтические композиции по изобретению особенно полезны для парентерального введения, то есть подкожного (п/к), интратекального, внутрибрюшинного, внутримышечного (в/м) или внутривенного (в/в).
Терапевтические агенты по изобретению могут быть изготовлены в форме фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество антигенсвязывающего белка по изобретению в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. В одном воплощении профилактический агент по изобретению представляет собой водную суспензию или раствор, содержащий антигенсвязывающий белок в форме, готовой для инъекции. В одном воплощении суспензия или раствор
забуферены при физиологическом рН. В одном воплощении композиции для парентерального введения будут содержать раствор антигенсвязывающего белка по изобретению или их смесь, растворенную в фармацевтически приемлемом носителе. В одном воплощении носитель представляет собой водный носитель. Может быть использовано множество водных носителей, например, 0,9% физиологический раствор, 0,3% глицин и тому подобное. Эти растворы могут быть стерилизованы и в целом свободны от твердых частиц. Эти растворы могут быть стерилизованы обычными хорошо известными методиками стерилизации (например, фильтрацией). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такого как коррекция рН, буферные агенты и так далее. Концентрация антигенсвязывающего белка по изобретению в такой фармацевтической композиции может варьировать в широких пределах, то есть, от менее чем приблизительно 0,5%, обычно от 1% или от по меньшей мере приблизительно 1% до приблизительно 15 или 20% по массе, и ее выбор будет основан главным образом на объемах жидкости, вязкости и так далее, в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
Таким образом, фармацевтическая композиция по изобретению для внутримышечной инъекции может быть изготовлена таким образом, что она содержит приблизительно 1 мл стерильной забуференной воды и от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мг, например, от приблизительно 50 нг до приблизительно 30 мг или от приблизительно 5 мг до приблизительно 25 мг антигенсвязывающего белка, например, антитела по изобретению. Сходным образом, фармацевтическая композиция по изобретению для внутривенной инфузии может быть изготовлена таким образом, что она содержит приблизительно 250 мл стерильного раствора Рингера и от приблизительно 1 до приблизительно 30 или от 5 мг до приблизительно 25 мг антигенсвязывающего белка по изобретению на мл раствора Рингера. Современные способы изготовления композиций для парентерального введения хорошо известны или будут очевидны специалистам в данной области техники и описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. Относительно изготовления композиций с антигенсвязывающими белками по
изобретению для внутривенного введения см. Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000); Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and В ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992); Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300; Imamura, К et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274; Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039; Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922; и Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002), содержание которых полностью включено сюда посредством ссылки, и к которым следует обращаться читателю.
В одном воплощении терапевтический агент по изобретению, присутствующий в фармацевтическом препарате, представлен в стандартных лекарственных формах. Подходящая терапевтически эффективная доза будет легко определена специалистами в данной области техники. Подходящие дозы могут быть вычислены для пациентов в соответствии с их массой тела, например, подходящие дозы могут быть в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 мг/кг, например, от приблизительно 1 приблизительно 20 мг/кг, например, от приблизительно 10 до приблизительно 20 мг/кг или, например, от приблизительно 1 до приблизительно 15 мг/кг, например, от приблизительно 10 до приблизительно 15 мг/кг. Для эффективного лечения таких состояний, как астма или IPF, у человека подходящие дозы могут быть в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мг, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 мг, например, приблизительно 500 мг, например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 100 мг, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 80 мг, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 60 мг, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 40 мг, или, например, от приблизительно 1 до приблизительно 100 мг, или от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг антигенсвязывающего белка по данному изобретению, который может быть введен парентерально, например,
подкожно, внутривенно или внутримышечно. По необходимости, такая доза может быть введена повторно через подходящие интервалы времени, подходящим образом выбранные врачом.
Антигенсвязывающие белки, описанные здесь, могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед применением. Показано, что эта методика эффективна при использовании обычных иммуноглобулинов, и могут быть применены известные в данной области техники методики лиофилизации и восстановления.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительной артропатией, такой как ревматоидный артрит, ювенильный артрит, остеоартрит, псориатический артрит и анкилозирующий спондилит, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного заболеванием или расстройством, выбранным из диабета 1 типа, псориаза, воспалительного заболевания кишечника (IBD), включая болезнь Крона и язвенный колит (UC), системной красной волчанки (SLE, волчанки), атопического дерматита, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких (COPD), пневмонии, эозинофильного эзофагита, системного склероза (SS) или идиопатического фиброза легких (IPF), синдрома Шегрена, склеродермии, васкулитов (включая артериит Такаясу, гигантоклеточный (височный) артериит, узелковый полиартериит, гранулематоз Вегенера, болезнь Кавасаки, изолированный васкулит центральной нервной системы (CNS), артериит Чарджа-Стросса, микроскопический полиартериит/полиангиит, гиперчувствительный васкулит (аллергический васкулит), пурпуру Шенлейна-Геноха и эссенциальный криоглобулинемический васкулит), недифференцированной спондилоартропатии (USpA), анкилозирующего спондилита (AS), болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD), первичного билиарного цирроза (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), рассеянного склероза (MS) и астмы, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего
белка, как описано здесь. Любое одно или более из приведенных выше заболеваний может быть заболеванием-мишенью для способа лечения по изобретению.
В определенном аспекте заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из остеоартрита (OA), псориаза, идиопатического фиброза легких (IPF), системного склероза (SS), синдрома Шегрена, склеродермии или рассеянного склероза (MS).
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой остеоартрит.
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой псориаз.
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание или расстройство представляет собой фиброзирующее заболевание или расстройство.
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой идиопатический фиброз легких (IPF).
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой системный склероз (SS).
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой синдром Шегрена.
В одном аспекте настоящего изобретения аутоиммунное заболевание представляет собой склеродермию.
В другом аспекте изобретения предложен способ уменьшения или предотвращения деструкции хряща у пациента-человека, страдающего от такой деструкции (или предрасположенного к ней), включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка указанному пациенту, как описано здесь.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ уменьшения образования TNF-альфа у пациента, пораженного заболеванием или расстройством, чувствительным к снижению TNF-альфа, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
В другом аспекте изобретения предложен способ лечения внесуставных проявлений артритического заболевания или расстройства, например,
синдрома Фелти, и/или лечения образования атеросклеротических бляшек, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь, пациенту-человеку, страдающему от внесуставных проявлений артритического заболевания или расстройства.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного заболеванием, имеющим происхождение от эндотелиальных клеток, включающий стадии введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного фиброзирующими заболеваниями или расстройствами, такими как идиопатический фиброз легких, прогрессирующий системный склероз (склеродермия), фиброз печени, гранулемы печени, шистосомоз и лейшманиоз, включающий стадии введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного заболеванием или расстройством центральной нервной системы, таким как рассеянный склероз (MS), болезнь Альцгеймера (AD) и другие деменции, что помимо этого связано с применением в лечении боли, в частности нейропатической и/или воспалительной боли, включающий стадии введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
Также предложено применение антигенсвязывающего белка, как описано здесь, в изготовлении лекарственного средства для лечения заболеваний и расстройств, как описано здесь.
Например, в одном аспекте изобретения предложено применение антигенсвязывающего белка, как описано здесь, для применения в лечении или профилактике заболеваний и расстройств, чувствительных к модуляции взаимодействия между hOSM и др130.
В другом аспекте изобретения предложено применение антигенсвязывающего белка, как описано здесь, для применения в лечении или профилактике воспалительной артропатии, такой как ревматоидный артрит,
ювенильный артрит, остеоартрит, псориатический артрит и анкилозирующий спондилит.
В еще одном аспекте изобретения предложено применение
антигенсвязывающего белка, как описано здесь, для применения в лечении или
профилактике заболевания или расстройства, выбранного из диабета 1 типа,
псориаза, воспалительного заболевания кишечника (IBD), включая болезнь
Крона и язвенный колит (UC), системной красной волчанки (SLE, волчанки),
атопического дерматита, аллергического ринита, хронической обструктивной
болезни легких (COPD), пневмонии, эозинофильного эзофагита, системного
склероза (SS) или идиопатического фиброза легких (IPF), синдрома Шегрена,
склеродермии, васкулитов (включая артериит Такаясу, гигантоклеточный
(височный) артериит, узелковый полиартериит, гранулематоз Вегенера,
болезнь Кавасаки, изолированный васкулит CNS, артериит Чарджа-Стросса,
микроскопический полиартериит/полиангиит, гиперчувствительный васкулит
(аллергический васкулит), пурпуру Шенлейна-Геноха и эссенциальный
криоглобулинемический васкулит), недифференцированной
спондилоартропатии (USpA), анкилозирующего спондилита (AS), болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD), первичного билиарного цирроза (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), рассеянного склероза (MS) и астмы, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка, как описано здесь.
Например, в определенном аспекте предложено применение антигенсвязывающего белка для применения в лечении или профилактике остеоартрита (OA), псориаза, идиопатического фиброза легких (IPF) или рассеянного склероза (MS).
Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения описаны далее в подробном описании изобретения и его воплощениях.
В одном аспекте согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязывающий белок по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения или профилактики воспалительных заболеваний и/или расстройств, например, воспалительной артропатии, такой как ревматоидный артрит, ювенильный артрит, остеоартрит, псориатический
артрит и анкилозирующий спондилит, или заболеваний и/или расстройств, выбранных из диабета 1 типа, псориаза, воспалительного заболевания кишечника (IBD), включая болезнь Крона и язвенный колит (UC), системной красной волчанки (SLE, волчанки), атопического дерматита, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких (COPD), пневмонии, эозинофильного эзофагита, системного склероза (SS) или идиопатического фиброза легких (IPF), синдрома Шегрена, склеродермии, васкулитов (включая артериит Такаясу, гигантоклеточный (височный) артериит, узелковый полиартериит, гранулематоз Вегенера, болезнь Кавасаки, изолированный васкулит CNS, артериит Чарджа-Стросса, микроскопический полиартериит/полиангиит, гиперчувствительный васкулит (аллергический васкулит), пурпуру Шенлейна-Геноха и эссенциальный криоглобулинемический васкулит), недифференцированной спондилоартропатии (USpA), анкилозирующего спондилита (AS), болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD), первичного билиарного цирроза (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), рассеянного склероза (MS) и астмы.
В другом воплощении настоящего изобретения предложен способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества антигенсвязывающего белка по изобретению, как описано здесь, например, предложен способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, включающий стадию введения фармацевтической композиции, содержащей антигенсвязывающий белок по изобретению, как описано здесь, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. В другом воплощении предложен способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, выбранным, например, из воспалительной артропатии, такой как ревматоидный артрит, ювенильный артрит, остеоартрит, псориатический артрит и анкилозирующий спондилит, или выбранным из диабета 1 типа, псориаза, воспалительного заболевания кишечника (IBD), включая болезнь Крона и язвенный колит (UC), системной красной волчанки (SLE, волчанки), атопического дерматита, аллергического ринита, хронической обструктивной болезни легких (COPD), пневмонии, эозинофильного эзофагита, системного
склероза (SS) или идиопатического фиброза легких (IPF), синдрома Шегрена,
склеродермии, васкулитов (включая артериит Такаясу, гигантоклеточный
(височный) артериит, узелковый полиартериит, гранулематоз Вегенера,
болезнь Кавасаки, изолированный васкулит CNS, артериит Чарджа-Стросса,
микроскопический полиартериит/полиангиит, гиперчувствительный васкулит
(аллергический васкулит), пурпуру Шенлейна-Геноха и эссенциальный
криоглобулинемический васкулит), недифференцированной
спондилоартропатии (USpA), анкилозирующего спондилита (AS), болезни "трансплантат против хозяина" (GVHD), первичного билиарного цирроза (РВС), первичного склерозирующего холангита (PSC), идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP), рассеянного склероза (MS) и астмы.
В альтернативном аспекте изобретения предложен способ гуманизации антитела, не являющегося человеческим антителом, или его фрагмента, включающий стадии:
а) переноса одного или более CDR, не являющихся человеческими CDR,
на человеческую акцепторную каркасную область с получением химерного или
гуманизированного антитела;
б) связывания химерного или гуманизированного антитела с его
антигеном;
в) определения остатков антитела, непосредственно вовлеченных в
связывание с антигеном;
г) мутации одного или более остатков, не вовлеченных в стадию (в), с их
заменой остатками человеческой эмбриональной последовательности;
д) выделения указанного антитела.
В другом аспекте остатки антитела, вовлеченные в связывание с антигеном, могут быть определены кристаллографией, гомологичным моделированием, стыковкой белков, мутагенезом или линейным пептидным картированием.
Например, в одном таком аспекте изобретения, как описано здесь, получают кристаллографическую структуру сокристалла "антитело-антиген" и остатки, вовлеченные в связывание, определяют с точностью приблизительно 2-5 А.
Термин "не являющийся человеческим" включает любое антитело, в котором возможны некоторые мутации или замены, приближающие его к
человеческой эмбриональной последовательности, снижая, таким образом, вероятность иммуногенности.
В одном аспекте по меньшей мере один CDR заменен эмбриональной последовательностью. В другом аспекте по меньшей мере два CDR заменены эмбриональной последовательностью. В еще одном аспекте по меньшей мере 5 остатков заменены остатками эмбриональной последовательности, например, по меньшей мере 7, или по меньшей мере 8, или по меньшей мере 9, или по меньшей мере 10 остатков заменены остатками эмбриональной последовательности.
Перенос моноклональных антител, не являющихся человеческими антителами, или их фрагментов, на человеческие акцепторные последовательности часто связан с внесением дополнительных изменений в каркасные области для восстановления правильного взаимодействия CDR-участков с антигеном; это часто называют обратными мутациями. В одном воплощении настоящего изобретения для восстановления правильного взаимодействия CDR-участков с антигеном необходимы обратные мутации.
В альтернативном воплощении человеческая акцепторная каркасная область может быть включена в антитело с одним или более CDR, не являющимися человеческими CDR, с получением химерного антитела. В еще одном альтернативном воплощении последовательность может быть получена синтезом олигонуклеотидов.
CDR (или остатки гипервариабельных участков) антитела, не являющегося человеческим антителом, включают в акцепторные каркасные области человеческих VL и/или VH. Например, возможно включение остатков, соответствующих остаткам CDR по Kabat, остаткам гипервариабельных петель по Chothia, остатков Abm и/или контактных остатков.
В одном воплощении предложен способ гуманизации антитела, включающий стадии:
а) получения антитела, не являющегося человеческим антителом,
связывающегося с целевым антигеном;
б) определения кристаллографической структуры сокристалла
"антитело-антиген";
в) определения, на основании кристаллической структуры, с точностью
приблизительно 2-5 А (0,2-0,5 нм) остатков антитела, не являющегося
человеческим антителом, непосредственно вовлеченных в связывание с антигеном;
г) мутации одного или более остатков, не вовлеченных в стадию (в), с их
заменой остатками, имеющими происхождение от человеческой
последовательности;
д) выделения указанного антитела.
В другом воплощении способов, описанных здесь, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют связывание с их антигеном. Например, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют связывание с их антигеном, по сравнению с антителом, не являющимся человеческим антителом. Например, антитело по стадии (д) имеет аффинность связывания (KD) в пределах или лучше 10-кратной аффинности антитела, не являющегося человеческим антителом, по стадии (а), например, антитело по стадии (д) имеет аффинность связывания (KD) в пределах или лучше 3-5-кратной аффинности антитела, не являющегося человеческим антителом, по стадии (а).
Например, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют связывание с их антигеном в пределах 1000 нМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore, или в пределах 500 нМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore, или в пределах 100 нМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore. Например, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют связывание с их антигеном в пределах 500 пМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore, или в пределах 300 пМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore, или в пределах 100 пМ антитела, не являющегося человеческим антителом, при измерении посредством Biacore. Например, антитело по стадии (д) связывается с его антигеном с аффинностью (KD), равной или менее 400 пМ, или равной или менее 300 пМ, или равной или менее 200 пМ, или равной или менее 140 пМ.
В другом воплощении способов, описанных здесь, антитело или связывающий фрагмент антитела сохраняют те же канонические структуры, что и антитело или фрагмент антитела, не являющиеся человеческими.
В еще одном воплощении антитело или фрагмент антитела, не являющиеся человеческими, имеют происхождение от животного, не являющегося человеком, например, мыши, крысы, кролика, представителя семейства Верблюдовых или акулы.
В другом воплощении антитело или фрагмент антитела, не являющиеся человеческими, имеют происхождение от мыши.
В еще одном воплощении антитело или фрагмент антитела, не являющиеся человеческими, представляют собой моноклональное антитело, поликлональное антитело или мультиспецифичное антитело, или они могут представлять собой отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, например, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина представителя семейства Верблюдовых или акулы, или они могут представлять собой домен, являющийся производным белкового каркаса, не являющегося человеческим и не являющегося антителом.
В еще одном воплощении антитело, не являющееся человеческим антителом, представляет собой моноклональное антитело.
В одном воплощении способов, описанных здесь, в человеческую акцепторную последовательность включены по меньшей мере 2 CDR, не являющихся человеческими CDR, или в человеческую акцепторную последовательность включены по меньшей мере 3 CDR, или по меньшей мере 4 CDR, или по меньшей мере 5 CDR, или все 6 CDR.
В другом воплощении способов, описанных здесь, остатки, подлежащие мутации с их заменой остатками, имеющими происхождение от человеческой последовательности, непосредственно не вовлеченные в связывание с антигеном и еще не являющиеся человеческими, могут представлять собой остатки CDR, или каркасных областей, или как CDR, так и каркасных областей. В другом воплощении проводят мутацию по меньшей мере 1 CDR с его заменой человеческой эмбриональной последовательностью, или проводят мутацию по меньшей мере 2 CDR, или проводят мутацию по меньшей мере 3 CDR, или проводят мутацию по меньшей мере 4 CDR.
В еще одном воплощении проводят мутацию по меньшей мере 5 остатков с их заменой человеческой эмбриональной последовательностью, или проводят мутацию по меньшей мере 7 остатков, или по меньшей мере 10 остатков, или по меньшей мере 15 остатков, или по меньшей мере 20 остатков,
или по меньшей мере 40 остатков, или по меньшей мере 60 остатков с их заменой человеческой эмбриональной последовательностью.
В еще одном воплощении способов, описанных здесь, остатки антитела, непосредственно вовлеченные в связывание с антигеном, определяют с точностью приблизительно 2-5 А, или приблизительно 3-5 А, или приблизительно 3-4 А, или приблизительно 3,5 А.
В еще одном воплощении способов, описанных здесь, предложено антитело, получаемое таким способом.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
При использовании здесь термин "антигенсвязывающий белок" относится к антителам, фрагментам антител и другим белковым конструкциям, способным связываться с человеческим OSM и нейтрализовать его.
Термины Fv, Fc, Fd, Fab или F(ab)2 использованы в их стандартных значениях (см., например, Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
Термин "антитело" использован здесь в наиболее широком смысле и, конкретно, включает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела).
При использовании здесь термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из популяции по существу однородной антител, то есть, отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных происходящих естественным образом мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны и направлены против одного антигенного сайта связывания. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, обычно содержащих разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене.
"Химерное антитело" относится к типу конструированного антитела, где часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, имеющим происхождение от донорного антитела определенного класса или подкласса, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим
последовательностям антител, имеющим происхождение от другого вида или принадлежащим другому классу или подклассу антител, а также к фрагментам таких антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567 и Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855) (1984)).
"Гуманизированное антитело" относится к типу конструированного антитела, один или более CDR которого имеют происхождение от донорного иммуноглобулина, не являющегося человеческим, а оставшиеся части молекулы, имеющие происхождение от иммуноглобулинов, имеют происхождение от одного (или более) человеческого иммуноглобулина (иммуноглобулинов). Кроме того, поддерживающие остатки каркасной области могут быть изменены для сохранения аффинности связывания (см., например, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Подходящее человеческое антитело-акцептор может представлять собой антитело, выбранное из обычной базы данных, например базы данных КАВАТ(r), базы данных Los Alamos и базы данных Swiss Protein, по гомологии нуклеотидным и аминокислотным последовательностям донорного антитела. Человеческое антитело, характеризующееся гомологией каркасным областям донорного антитела (на аминокислотной основе), может быть подходящим для обеспечения константной области тяжелой цепи и/или каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи для введения донорных CDR. Сходным образом можно выбрать подходящее акцепторное антитело, которое может быть источником константных доменов легкой цепи или каркасных областей вариабельного домена легкой цепи. Следует отметить, что нет необходимости в том, чтобы тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела имели происхождение от одного и того же акцепторного антитела. В предшествующем уровне техники описаны несколько способов получения таких гуманизированных антител, см., например, ЕР-А-0239400 и ЕР-А-054951.
В зависимости от обстоятельств, для полинуклеотидов и полипептидов "идентичность" означает сравнение, вычисленное с применением алгоритма, представленного в (1) и (2) ниже.
(1) Идентичность полинуклеотидов вычисляют, умножая общее число нуклеотидов в данной последовательности на целое число, определяющее процент идентичности, разделенное на 100, с последующим вычитанием
полученного числа из указанного общего числа нуклеотидов в указанной последовательности, или:
пп < хп - (хп • у),
где пп представляет собой число нуклеотидных изменений, хп представляет собой общее число нуклеотидов в данной последовательности, у представляет собой 0,95 для 95%, 0,97 для 97% или 1,00 для 100%, и • является символом оператора умножения, и где любое нецелое произведение хп и у округляют в сторону уменьшения до ближайшего целого числа перед его вычитанием из хп. Изменения полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, могут приводить к появлению нонсенс-мутаций, миссенс-мутаций или мутаций со сдвигом рамки считывания в этой кодирующей последовательности и посредством этого изменять полипептид, кодируемый полинуклеотидом после таких изменений.
(2) Идентичность полипептидов вычисляют, умножая общее число аминокислот на целое число, определяющее процент идентичности, разделенный на 100, с последующим вычитанием полученного числа из указанного общего числа аминокислот, или:
па < ха - (ха • у),
где па представляет собой число аминокислотных изменений, ха представляет собой общее число аминокислот в последовательности, у представляет собой 0,95 для 95%, 0,97 для 97% или 1,00 для 100%, и • является символом оператора умножения, и где любое нецелое произведение ха и у округляют в сторону уменьшения до ближайшего целого числа перед его вычитанием из ха.
"Выделенный" означает измененный "рукой человека" из его естественного состояния, измененный или извлеченный из его исходной среды, или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, естественным образом присутствующий в живом организме, не является "выделенным", но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от веществ, с которыми он сосуществует в его естественном состоянии, является "выделенным", включая, без ограничения, включая случаи, когда такой полинуклеотид или полипептид введен обратно в клетку, даже если эта клетка представляет собой клетку того же вида или типа, что и клетка, из которой был выделен этот полинуклеотид или полипептид.
В настоящем описании и последующей формуле изобретения термины "содержащий/включающий" и "содержит/включает" включают "состоящий из" и "состоит из". То есть, предполагают, что эти слова означают возможное включение других элементов или целых, не указанных конкретно, там, где позволяет контекст.
При использовании в настоящем описании в связи с антигенсвязывающими белками по изобретению термин "специфично связывается" означает, что антигенсвязывающий белок связывается с человеческим OSM (hOSM) без связывания с другими человеческими белками или с несущественным связыванием с ними. Тем не менее, термин не исключает того факта, что антигенсвязывающие белки по изобретению могут также быть перекрестно реактивными в отношении других форм OSM, например, OSM приматов.
При использовании в данном описании в связи с в связи с антигенсвязывающими белками по изобретению термин "непосредственное взаимодействие" означает, что при связывании антигенсвязывающего белка с человеческим OSM (hOSM) определенные остатки антигенсвязывающего белка расположены в пределах 3,5 А (0,35 нм) от определенных остатков hOSM.
При использовании в настоящем описании в связи с в связи с антигенсвязывающими белками по изобретению термин "ингибирование" означает, что биологическая активность OSM снижена в присутствии антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению, по сравнению с активностью OSM в отсутствие таких антигенсвязывающих белков. Ингибирование может быть обусловлено, но не ограничено, связыванием с одним или более блокирующим лигандом, предотвращением активации рецептора лигандом, "даун"-регуляцией OSM или воздействием на эффекторную функцию. Антитела по изобретению могут нейтрализовать OSM. Уровни нейтрализации могут быть измерены несколькими способами, например, с применением анализов, как изложено в примерах ниже, например, в разделе 2.2.1, в КВ-клеточном анализе нейтрализации. OSM способен индуцировать высвобождение интерлейкина-6 из клеток KB посредством передачи сигнала через комплекс Gp130/OSMR. Нейтрализацию OSM в этом анализе измеряют, оценивая способность моноклональных антител против OSM ингибировать образование IL-6.
Если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны к нейтрализации, это указывает на ингибирование взаимодействия человеческого OSM с его рецептором др130. Антитела, рассматриваемые как антитела, обладающие нейтрализующей активностью против человеческого OSM, будут иметь IC50 менее 10 микрограмм/мл, или менее 5 микрограмм/мл, или менее 2 микрограмм/мл, или менее 1 микрограмм/мл, или менее 0,1 микрограмм/мл в КВ-клеточном анализе нейтрализации, как изложено в Примере 2.2.1.
"CDR" определены как области аминокислотных последовательностей антитела, определяющие комплементарность, представляющие собой гипервариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. В вариабельной части иммуноглобулина присутствуют три CDR (или CDR-участка) тяжелой цепи и три CDR (или CDR-области) легкой цепи. Таким образом, при использовании здесь "CDR" может относиться ко всем трем CDR тяжелой цепи или всем трем CDR легкой цепи (или, если это уместно, всем CDR тяжелой цепи и всем CDR легкой цепи).
CDR обеспечивают большинство контактных остатков для связывания антитела с антигеном или эпитопом. Рассматриваемые в данном изобретении CDR имеют происхождение от последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи донорного антитела и включают аналоги встречающихся в природе CDR, также имеющие или сохраняющие ту же специфичность связывания антигена и/или нейтрализующую способность, что и донорное антитело, от которого они имеют происхождение.
Последовательности CDR антител могут быть определены по системе нумерации Kabat (Kabat et al; (Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987)), альтернативно, они могут быть определены с использованием системы нумерации Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), способа контактного определения (MacCallum R.M., and Martin A.C.R. and Thornton J.M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745) или любого другого принятого способа нумерации остатков антитела и определения CDR, известного специалисту в данной области техники.
Другие системы нумерации последовательностей CDR, доступные специалисту в данной области техники, включают способ "АЬМ" (University of Bath) и "контактный" способ (University College London). Для получения
"минимальной связывающей единицы" может быть определена минимальная область, общая для по меньшей мере двух способов из способов Kabat, Chothia, АЬМ и контактного способа. Минимальная связывающая единица может представлять собой небольшую часть CDR.
В Таблице 1 ниже представлено одно определение с использованием каждой системы нумерации для каждого CDR или связывающей единицы. В Таблице 1 для нумерации аминокислотной последовательности вариабельного домена использована схема нумерации Kabat. Следует отметить, что некоторые определения CDR могут варьировать в зависимости от конкретной используемой публикации.
Термины "VH" и "VL" использованы здесь для обозначения вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи антитела, соответственно.
При использовании здесь термин "домен" относится к свернутой белковой структуре, третичная структура которой не зависит от остальной части белка. Обычно домены обеспечивают дискретные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перемещены на другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена.
"Отдельный вариабельный домен антитела" представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антител. Таким образом, он включает полноразмерные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более петель были заменены последовательностями, не характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые были процессированы или содержат N- или С-концевые удлиняющие сегменты, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, сохраняющие по меньшей мере связывающую активность и специфичность полноразмерного домена.
Фраза "отдельный вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL), специфично связывающемуся с антигеном или эпитопом, независимо от других вариабельных области или домена. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может быть представлен в формате (например, гомо- или гетеромультимера) с другими отличающимися вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не являются необходимыми для связывания антигена отдельным вариабельным доменом иммуноглобулина (то есть, где отдельный вариабельный домен иммуноглобулина связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). "Однодоменное антитело" или "dAb" представляет собой то же, что "отдельный вариабельный домен иммуноглобулина", способный связываться с антигеном, как данный термин использован здесь. Отдельный вариабельный домен иммуноглобулина может представлять собой вариабельный домен человеческого антитела, но также включает отдельные вариабельные домены антител других видов, таких как грызуны (например, как раскрыто в WO 0029004), акулы-няньки и VHH dAb представителей семейства Верблюдовых. VHH представителей семейства Верблюдовых представляют собой полипептиды отдельных вариабельных доменов иммуноглобулинов, имеющие происхождение от видов, включающих верблюда, ламу, альпаку, одногорбого верблюда и гуанако, образующих антитела из тяжелых цепей, естественным образом лишенные легких цепей. Такие домены VHH могут быть гуманизированы стандартными методиками, доступными в данной области техники, и такие домены все еще рассматривают как "однодоменные антитела" по изобретению. При использовании здесь "VH"
включает домены VHH представителей семейства Верблюдовых. NARV являются отдельными вариабельными доменами иммуноглобулинов другого типа, которые были обнаружены у хрящевых рыб, включая акулу-няньку. Эти домены также известны как вариабельные области нового антигенного рецептора (Novel Antigen Receptor) (обычно сокращаемые как V(NAR) или NARV). Более подробно см. Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006) и US 20050043519 А.
Термин "эпитопсвязывающий домен" относится к домену, специфично связывающему антиген или эпитоп независимо от других вариабельных области или домена; он может представлять собой однодоменное антитело (dAb), например, отдельный вариабельный домен иммуноглобулина человека, представителя семейства Верблюдовых или акулы, или он может представлять собой домен, являющийся производным каркаса, выбранного из группы, состоящей из CTLA-4 (эвитело (Evibody)); липокалина; молекул, имеющих происхождение от белка А, таких как Z-домен белка А (аффитело (Affibody), SpA), А-домен (авимер (Avimer)/Maxibody); белков теплового шока, таких как GroEl и GroES; трансферрина (транстело (Trans-body)); белка с анкириновыми повторами (DARPin); пептидного аптамера; домена лектина С-типа (тетранектин (Tetranectin)); человеческого у_кРисталлина и человеческого убиквитина (аффилины (affilin)); PDZ-доменов; токсина скорпиона; доменов человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца; и фибронектина (аднектин (adnectin)); которые были подвержены конструированию белков для получения связывания с лигандом, отличающимся от природного лиганда.
CTLA-4 (антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами) представляет собой рецептор семейства CD28, экспрессированный, главным образом, на CD4+ Т-клетках. Его внеклеточный домен имеет характерную для иммуноглобулинов структуру, подобную вариабельному домену. Петли, соответствующие CDR антител, могут быть заменены гетерологичной последовательностью для придания различных свойств связывания. Молекулы CTLA-4, конструированные таким образом, чтобы они имели другие специфичности связывания, также известны как эвитела. Более подробно см. Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001).
Липокалины представляют собой семейство внеклеточных белков, осуществляющих транспорт малых гидрофобных молекул, таких как стероиды, билины, ретиноиды и липиды. Они имеют ригидную (3-складчатую вторичную структуру с несколькими петлями на открытом конце конической структуры, которые могут быть конструированы для связывания различных целевых антигенов. Размер антикалинов составляет 160-180 аминокислот, и они имеют происхождение от липокалинов. Более подробно см. Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US 7250297 B1 и US 20070224633.
Аффитело представляет собой каркас, имеющий происхождение от белка A Staphylococcus aureus, который может быть конструирован для связывания антигена. Домен состоит из трехспирального пучка из приблизительно 58 аминокислот. При рандомизации поверхностных остатков были получены библиотеки. Более подробно см. Protein Eng. Des. Sel. 17, 455462 (2004) и ЕР 1641818 А1.
Авимеры представляют собой многодоменные белки, имеющие происхождение от семейства каркасов А-домена. Нативные домены из приблизительно 35 аминокислот принимают определенную структуру, связанную дисульфидными связями. Появление разнообразия обусловлено перетасовкой природного разнообразия, демонстрируемого семейством А-доменов. Более подробно см. Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) и Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007).
Трансферрин представляет собой мономерный транспортный гликопротеин сыворотки. Трансферрины могут быть конструированы для связывания различных целевых антигенов введением пептидных последовательностей в случайную поверхностную петлю. Примеры конструированных трансферриновых каркасов включают транстело (Trans-body). Более подробно см. J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).
Конструированные белки с анкириновыми повторами (DARPins) имеют происхождение от анкирина, представляющего собой семейство белков, опосредующих присоединение интегральных мембранных белков к цитоскелету. Один анкириновый повтор представляет собой мотив из 33 остатков, состоящий их двух а-спиралей и одного (3-поворота. Они могут быть конструированы для связывания различных целевых антигенов рандомизацией остатков первой а-спирали и (3-поворота каждого повтора. Их связывающая
поверхность может быть расширена увеличением числа модулей (способ созревания аффинности). Более подробно см. J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003), J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) и US 20040132028A1.
Фибронектин представляет собой каркас, который может быть конструирован для связывания антигена. Аднектины состоят из остова природной аминокислотной последовательности 10 домена из 15 повторяющихся единиц человеческого фибронектина III типа (FN3). Три петли на одном конце (3-сэндвича могут быть конструированы для придания аднектину способности специфично распознавать интересующую терапевтическую мишень. Более подробно см. Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US 20080139791, WO 2005056764 и US 6818418 B1.
Пептидные аптамеры представляют собой комбинаторные молекулы распознавания, состоящие из константного каркасного белка, обычно тиоредоксина (ТгхА), содержащие напряженную вариабельную пептидную петлю, введенную в активный сайт. Более подробно см. Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005).
Микротела имеют происхождение от встречающихся в природе микробелков длиной 25-50 аминокислот, содержащих 3-4 цистеиновых связи; примеры микробелков включают KalataBI, конотоксин и ноттины. Микробелки имеют петлю, которая может быть конструирована для включения до 25 аминокислот без влияния на общую конформацию микробелка. Более подробно о конструированных ноттиновых доменах см. WO 2008098796.
Другие эпитопсвязывающие домены включают белки, использованные в качестве каркаса для конструирования свойств связывания различных целевых антигенов, включая человеческий у_кРисталлин и человеческий убиквитин (аффилины), домены человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца, PDZ-домены Ras-связывающего белка AF-6, токсины скорпиона (харибдотоксин), домен лектина С-типа (тетранектины), обзор которых приведен в Chapter 7 -Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) и Protein Science 15:14-27 (2006). Эпитопсвязывающие домены по настоящему изобретению могут меть происхождение от любого из этих альтернативных белковых доменов.
При использовании здесь термин "антигенсвязывающий сайт" относится к сайту белка, способному специфично связываться с антигеном, он может представлять собой отдельный домен, например, эпитопсвязывающий домен, или он может представлять собой спаренные домены VH/VL, что можно обнаружить в стандартном антителе. В некоторых воплощениях изобретения антигенсвязывающие сайты могут быть обеспечены одноцепочечными доменами Fv (ScFv).
Термины "mAbdAb" и "dAbmAb" использованы здесь для обозначения антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению. Эти два термина могут быть использованы взаимозаменяемо, и предполагают, что при использовании здесь они имеют одинаковое значение.
При использовании здесь термин "антигенсвязывающий белок" относится к антителам, фрагментам антител, например, однодоменному антителу (dAb), ScFv, FAb, FAb2 и другим белковым конструкциям. Антигенсвязывающие молекулы могут содержать по меньшей мере один вариабельный домен иммуноглобулина, например, антитела, однодоменные антитела (dAb), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv, диатела, mAbdAb, аффитела, гетероконъюгатные антитела или биспецифичные антитела. В одном воплощении антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело. В другом воплощении антигенсвязывающая молекула представляет собой dAb, то есть отдельный вариабельный домен иммуноглобулина, такой как VH, VHH или VL, специфично связывающийся с антигеном или эпитопом, независимо от других вариабельных области или домена. Антигенсвязывающие молекулы могут быть способны связывать две мишени, то есть, они могут представлять собой белки с двумя мишенями. Антигенсвязывающие молекулы могут представлять собой комбинацию антител и антигенсвязывающих фрагментов, такую как, например, одно или более однодоменных антител и/или один или более ScFv, связанные с моноклональным антителом. Антигенсвязывающие молекулы могут также содержать домен, не являющийся доменом иммуноглобулина, например, домен, являющийся производным каркаса, выбранного из группы, состоящей из: CTLA-4 (эвитело); липокалина; молекул, имеющих происхождение от белка А, таких как Z-домен белка А (аффитело, SpA); А-домена (авимер/Maxibody); белков теплового шока, таких как GroEl и GroES; трансферрина (транстело); повторяющегося анкиринового белка
(DARPin); пептидного аптамера; домена лектина С-типа (тетранектин); человеческого у-кристаллина и человеческого убиквитина (аффилины); PDZ-доменов; токсина скорпиона; доменов человеческих ингибиторов протеаз типа Кунитца; и фибронектина (аднектина); конструированный для обеспечения связывания с OSM. При использовании здесь "антигенсвязывающий белок" будет способен быть антагонистом человеческого OSM и/или нейтрализовать человеческий OSM. Кроме того, антигенсвязывающий белок может ингибировать и/или блокировать активность OSM связыванием с OSM и предотвращением связывания природного лиганда с рецептором др130 и/или активации рецептора др130.
При использовании здесь подразумевают, что термин "эффекторная функция" относится к одному или более из ответов, опосредованных антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью (ADCC-активностью) и комплементзависимой цитотоксической активностью (CDC-активностью), Fc-опосредованного фагоцитоза и рециклирования антител через FcRn-рецептор. Эффекторные функции антител IgG, включая ADCC и ADCP, опосредованы взаимодействием константной области тяжелой цепи с семейством FcY-рецепторов, присутствующих на поверхности иммунокомпетентных клеток. У людей они включают FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRI 11 (CD16). Взаимодействие с антигенсвязывающим белком, связанным с антигеном, и образование комплекса Fc/Fcy приводят к ряду эффектов, включая цитотоксичность, активацию иммунокомпетентных клеток, фагоцитоз и высвобождение воспалительных цитокинов.
Полагают, что эффекторные функции антигенсвязывающего белка опосредованы взаимодействием между константной областью антигенсвязывающего белка и различными Fc-рецепторами (FcR). Эффекторная функция может приводить к существенным биологическим эффектам, в частности антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), фиксации комплемента (комплементзависимой цитотоксичности или CDC) и эффектам на период полувыведения/клиренс антигенсвязывающего белка. Обычно для способности опосредовать эффекторную функцию необходимо связывание антигенсвязывающего белка с антигеном, и не все антигенсвязывающие белки будут опосредовать каждую эффекторную функцию.
Эффекторная функция может быть оценена несколькими способами, включая, например, оценку посредством связывания FcyRIII с натуральными клетками-киллерами или оценку посредством связывания FcyRI моноцитами/макрофагами для оценки эффекторной функции ADCC. Например, эффекторная функция ADCC антигенсвязывающего белка по настоящему изобретению может быть оценена в анализе с натуральными клетками-киллерами. Примеры таких анализов могут быть обнаружены в Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010.
Примеры анализов для определения функции CDC включают анализы, описанные в 1995 J Imm Meth 184:29-38.
Некоторые изотипы человеческих константных областей, в частности изотипы lgG4 и lgG2, исходно лишены функций (а) активации комплемента по классическому пути и (б) антителозависимой клеточной цитотоксичности. В зависимости от желаемого эффекторного свойства могут быть проведены различные модификации константной области тяжелой цепи антигенсвязывающих белков. Независимо друг от друга несколько авторов сообщили, что для константных областей lgG1, содержащих определенные мутации, характерно уменьшение связывания с Fc-рецепторами и, таким образом, сниженная ADCC и CDC (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991 , 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51; 1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001,75 (24); 12161-12168).
В одном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий такую константную область, что антигенсвязывающий белок имеет сниженную эффекторную функцию ADCC и/или эффекторную функцию активации комплемента. В одном таком воплощении константная область тяжелой цепи может содержать естественным образом дефектную константную область изотипа lgG2 или lgG4, или мутантную константную область lgG1. Примеры подходящих модификаций описаны в ЕР 0307434. Один пример включает замены остатков аланина в положениях 235 и 237 (нумерация EU).
Также было описано, что человеческие константные области lgG1, содержащие определенные мутации или измененное гликозилирование на остатке Asn297, усиливают связывание с Fc-рецепторами. Также было показано, что в некоторых случаях они усиливают ADCC и CDC (Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechanskyet al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).
В одном воплощении настоящего изобретения такие мутации расположены в одном или более из положений, выбранных из 239, 332 и 330 (lgG1), или эквивалентных положений других изотипов IgG. Примеры подходящих мутаций представляют собой S239D, I332E и A330L. В одном воплощении антигенсвязывающий белок по изобретению, описанный здесь, содержит мутации в положениях 239 и 332, например, S239D и I332E, или в другом воплощении он содержит мутации в трех или более положениях, выбранных из 239, 332 и 330, например S239D, I332E и A330L (нумерация EU).
В альтернативном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий константную область тяжелой цепи с таким измененным профилем гликозилирования, что антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию. Например, где антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию ADCC или усиленную эффекторную функцию CDC, или где он имеет как усиленную эффекторную функцию ADCC, так и усиленную эффекторную функцию CDC. Примеры подходящих способов получения антигенсвязывающих белков с измененным профилем гликозилирования описаны в WO 2003011878, WO 2006014679 и ЕР 1229125, все из которых могут быть применены к антигенсвязывающим белкам по настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения антигенсвязывающего белка по изобретению, включающий стадии:
а) культивирования рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор
экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, как описано здесь,
где ген FUT8, кодирующий альфа-1,6-фукозилтрансферазу, рекомбинантной
клетки-хозяина инактивирован; и
б) выделения антигенсвязывающего белка.
Такие способы получения антигенсвязывающих белков могут быть проведены, например, с использованием технологической системы
POTELLIGENT(tm), доступной от BioWa, Inc. (Princeton, NJ), в которой клетки CHOK1 SV без функциональной копии гена FUT8 продуцируют моноклональные антитела, обладающие усиленной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксической (ADCC) активностью, повышенной по сравнению с идентичным моноклональным антителом, продуцируемым в клетке с функциональным геном FUT8. Аспекты технологической системы POTELLIGENT(tm) описаны в US 7214775, US 6946292, WO 0061739 и WO 0231240, все из которых включены сюда посредством ссылки. Специалисты в данной области техники также определят другие подходящие системы.
В одном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий химерную константную область тяжелой цепи, например, антигенсвязывающий белок, содержащий химерную константную область тяжелой цепи с по меньшей мере одним доменом СН2 lgG3, таким образом, что антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию, например, где он имеет усиленную функцию ADCC, или усиленную функцию CDC, или усиленные функции ADCC и CDC. В одном таком воплощении антигенсвязывающий белок может содержать один домен СН2 lgG3, или оба домена СН2 lgG3.
Также предложен способ получения антигенсвязывающего белка по изобретению, включающий стадии:
а) культивирования рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор
экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, как описано здесь,
содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую Fc-домен,
имеющий аминокислотные остатки Fc-доменов lgG1 и lgG3; и
б) выделения антигенсвязывающего белка.
Такие способы получения антигенсвязывающих белков могут быть проведены, например, с использованием технологической системы COMPLEGENT (tm), доступной от BioWa, Inc. (Princeton, NJ) и Kyowa Hakko Kogyo (в настоящее время, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd., где проводят культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор экспрессии, в котором экспрессирована последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный Fc-домен, имеющий аминокислотные остатки Fc-доменов lgG1 и lgG3, с получением антигенсвязывающего белка, имеющего усиленную комплементзависимую цитотоксическую (CDC) активность,
повышенную по сравнению с в остальном идентичным антигенсвязывающим белком без такого химерного Fc-домена. Аспекты технологической системы COMPLEGENT описаны в WO 2007011041 и US 20070148165, каждая из которых включена сюда посредством ссылки. В альтернативном воплощении CDC-активность может быть повышена введением последовательность-специфичных мутаций в Fc-область цепи IgG. Специалисты в данной области техники также определят другие подходящие системы.
Специалистам в данной области техники будет ясно, что такие модификации могут быть использованы не только по отдельности, но и в комбинации друг с другом для дополнительного усиления эффекторной функции.
В одном таком воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий константную область тяжелой цепи, содержащую химерную константную область тяжелой цепи, например, антигенсвязывающий белок, содержащий по меньшей мере один домен СН2 lgG3 и один домен СН2 lgG1, имеющий одну или более мутаций в положениях, выбранных из 239, 332 и 330 (например, мутации могут быть выбраны из S239D, I332E и A330L), таким образом, что антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию, например, где он имеет одну или более из следующих функций: усиленную ADCC или усиленную CDC, например, где он имеет усиленную ADCC и усиленную CDC. В одном воплощении домен СН2 lgG1 имеет мутации S239D и I332E.
В альтернативном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий химерную константную область тяжелой цепи, имеющий измененный профиль гликозилирования. В одном таком воплощении константная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере один домен СН2 lgG3 и один домен СН2 lgG1 и имеет такой измененный профиль гликозилирования, что соотношение фукозы и маннозы составляет 0,8:3 или менее, например, где антигенсвязывающий белок дефукозилирован, таким образом, что указанный антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию, по сравнению с эквивалентным антигенсвязывающим белком с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина без указанных мутаций и измененного профиля гликозилирования, например, где он имеет одну или более из следующих функций: усиленную функцию ADCC или
усиленную функцию CDC, например, где он имеет усиленную функцию ADCC и усиленную функцию CDC. В альтернативном воплощении антигенсвязывающий белок имеет по меньшей мере один домен СН2 lgG3 и по меньшей мере один константный домен тяжелой цепи lgG1, где оба домена СН2 IgG содержат мутации в соответствии с описанными здесь ограничениями.
В одном аспекте изобретения предложен способ получения антигенсвязывающего белка по изобретению, описанного здесь, включающий стадии:
а) культивирования рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей вектор
экспрессии, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, как описано здесь,
и дополнительно содержащий нуклеотидную последовательность Fc,
кодирующую химерный Fc-домен, имеющий аминокислотные остатки Fc-
доменов lgG1 и lgG3, и где ген FUT8, кодирующий альфа-1,6-
фукозилтрансферазу, рекомбинантной клетки-хозяина инактивирован; и
б) выделения антигенсвязывающего белка.
Такие способы получения антигенсвязывающих белков могут быть проведены, например, с использованием технологической системы ACCRETAMAB(tm), доступной от BioWa, Inc. (Princeton, NJ), сочетающей технологические системы POTELLIGENT(tm) и COMPLEGENT(tm), с получением антигенсвязывающего белка, имеющего как усиленную ADCC-активность, так и усиленную CDC-активность, повышенную по сравнению с в остальном идентичным моноклональным антителом без химерного Fc-домена, имеющего фукозу на олигосахариде.
В еще одном воплощении настоящего изобретения предложен антигенсвязывающий белок, содержащий мутантную и химерную константную область тяжелой цепи и имеющий измененный профиль гликозилирования, таким образом, что антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию, например, где он имеет одну или более из следующих функций: усиленную функцию ADCC или усиленную функцию CDC. В одном воплощении мутации выбраны из положений 239, 332 и 330, например, мутации выбраны из S239D, I332E и A330L. В другом воплощении константная область тяжелой цепи содержит по меньшей мере один домен СН2 lgG3 и один домен СН2 lgG1. В одном воплощении константная область тяжелой цепи имеет такой измененный профиль гликозилирования, что соотношение фукозы и маннозы
составляет 0,8:3 или менее, например, антигенсвязывающий белок дефукозилирован, таким образом, что указанный антигенсвязывающий белок имеет усиленную эффекторную функцию, по сравнению с эквивалентным нехимерным антигенсвязывающим белком или с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина без указанных мутаций и измененного профиля гликозилирования.
Другой способ модификации антигенсвязывающих белков по настоящему изобретению включает увеличение периода полувыведения таких белков in vivo модификацией константного домена иммуноглобулина или РсРчП(неонатальный Рс-рецептор)-связывающего домена.
У взрослых млекопитающих FcRn, также известный как неонатальный Fc-рецептор, играет ключевую роль в поддержании уровней антител в сыворотке, действуя как защитный рецептор, связывающийся с антителами изотипа IgG и предотвращающий их деградацию. Эндотелиальные клетки поглощают молекулы IgG посредством эндоцитоза, и если они связываются с FcRn, происходит их возвращение в циркуляцию. В отличие от этого, молекулы IgG, не связывающиеся с FcRn, проникают в клетки и направляются по лизосомальному метаболическому пути, где происходит их деградация.
Полагают, что неонатальный FcRn-рецептор вовлечен как в клиренс антител, так и в их трансцитоз через ткани (см. Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 и Ghetie et al (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766). Остатки человеческого lgG1, которые, как установлено, взаимодействуют непосредственно с человеческим FcRn, включают Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435. Замены в любом из этих положений, описанных в этом разделе, могут обеспечить увеличенный период полувыведения из сыворотки и/или измененные эффекторные свойства антигенсвязывающих белков по изобретению.
Антигенсвязывающие белки по настоящему изобретению могут иметь аминокислотные модификации, повышающие аффинность константного домена или его фрагмента в отношении FcRn. Увеличение периода полувыведения терапевтических и диагностических IgG и других биологически активных молекул имеет множество преимуществ, включая уменьшение количества и/или частоты введения этих молекул. Таким образом, в одном воплощении предложен антигенсвязывающий белок по изобретению,
предложенный здесь, или слитый белок, содержащий полноразмерный константный домен IgG, или его часть (FcRn-связывающую часть), или константный домен IgG, имеющий одну или более из этих аминокислотных модификаций, и белок, не являющийся IgG, или небелковую молекулу, конъюгированную с таким модифицированным константным доменом IgG, где присутствие модифицированного константного домена IgG увеличивает период полувыведения антигенсвязывающего белка in vivo.
В РСТ-публикации № WO 00/42072 раскрыт полипептид, содержащий вариант Fc-области с измененной аффинностью связывания с FcRn, содержащий аминокислотные модификации в любом одном или более из аминокислотных положений 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и 447 Fc-области, где нумерация остатков Fc-области соответствует нумерации EU (Kabat et al).
В РСТ-публикации № WO 02/060919 А2 раскрыт модифицированный IgG, содержащий константный домен IgG, содержащий одну или более аминокислотных модификаций, по сравнению с константным доменом IgG дикого типа, где модифицированный IgG имеет увеличенный период полувыведения, по сравнению с периодом полувыведения IgG, имеющего константный домен IgG дикого типа, и где одна или более аминокислотных модификаций расположены в одном или более из положений 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389 и 428-435.
Shields et al. (2001, J Biol Chem; 276:6591-604) применяли мутагенез аланиновым сканированием для изменения остатков Fc-области человеческого антитела lgG1 и затем оценивали связывание с человеческим FcRn. Положения, эффективно изменявшие связывание с FcRn при их замене на аланин, включают I253, S254, Н435 и Y436. Другие положения, продемонстрировавшие менее выраженное уменьшение связывания, представляют собой следующее: E233-G236, R255, К288, L309, S415 и Н433. Некоторые аминокислотные положения продемонстрировали улучшение связывания с FcRn при их замене на аланин; среди них следует отметить Р238, Т256, Е272, V305, Т307, Q311, D312, К317, D376, Е380, Е382, S424 и N434. Многие другие аминокислотные положения продемонстрировали незначительное улучшение (D265, N286, V303, К360, Q362 и А378) или
отсутствие изменений (S239, К246, К248, D249, М252, Е258, Т260, S267, Н268, S269, D270, К274, N276, Y278, D280, V282, Е283, Н285, Т289, К290, R292, Е293, Е294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, Е318, К320, К322, S324, К326, А327, Р329, Р331, ЕЗЗЗ, К334, Т335, S337, К338, К340, Q342, R344, Е345, Q345, Q347, R356, М358, Т359, К360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, Е388, N389, N390, К392, L398, S400, D401, К414, R416, Q418, Q419, N421, V422, Е430, Т437, К439, S440, S442, S444 и К447) связывания с FcRn.
Наиболее выраженный эффект был обнаружен у комбинированных вариантов с улучшенным связыванием с FcRn. При рН 6,0, вариант E380A/N434A продемонстрировал увеличение связывания с FcRn более чем в 8 раз относительно нативного lgG1, по сравнению с 2-кратным увеличением при Е380А и 3,5-кратным - при N434A. Добавление к этому Т307А приводило к 12-кратному улучшению связывания относительно нативного lgG1. В одном воплощении антигенсвязывающий белок по изобретению содержит мутации E380A/N434A и имеет увеличенное связывание с FcRn.
Dall'Acqua et al. (2002, J Immunol.; 169:5171-80) описали случайный мутагенез и скрининг фаговых дисплейных библиотек фрагмента человеческого lgG1 "шарнирная область-Рс-область" против мышиного FcRn. Они раскрыли случайный мутагенез положений 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385387, 389, 428, 433, 434 и 436. Наибольшие улучшения стабильности комплекса "lgG1-человеческий FcRn" происходят при замене остатков, расположенных в полосе вдоль области контакта Fc-FcRn (М252, S254, Т256, Н433, N434 и Y436) и, в меньшей степени, при замене периферийных остатков, таких как V308, L309, Q311, G385, Q386, Р387 и N389. Вариант с наиболее высокой аффинностью в отношении человеческого FcRn был получен сочетанием мутаций M252Y/S254T/T256E и H433K/N434F/Y436H и продемонстрировал повышение аффинности в 57 раз, по сравнению с lgG1 дикого типа. In vivo такой мутантный человеческий lgG1 продемонстрировал увеличение периода полувыведения из сыворотки яванского макака приблизительно в 4 раза, по сравнению с lgG1 дикого типа.
Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен вариант антигенсвязывающего белка с оптимизированным связыванием с FcRn. В предпочтительном воплощении указанный вариант антигенсвязывающего белка содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию Fc
области указанного антигенсвязывающего белка, выбранную из группы, состоящей из 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 и 447 Fc-области, по сравнению с указанным исходным полипептидом, где нумерация аминокислот Fc-области соответствует нумерации EU по Kabat.
В другом аспекте изобретения модификации представляют собой M252Y/S254T/T256E.
Кроме того, в различных публикациях описаны способы получения физиологически активных молекул, периоды полувыведения которых модифицированы включением в молекулы FcRn-связывающего полипептида (WO 97/43316; патент США № 5869046; патент США № 5747035; WO 96/32478; WO 91/14438), или слиянием молекул с антителами, аффинности связывания которых с FcRn сохранены, но аффинности в отношении других Fc-рецепторов существенно снижены (WO 99/43713), или слиянием с FcRn-связывающими доменами антител (WO 00/09560; патент США № 4703039).
Кроме того, также предложены способы получения антигенсвязывающего белка с уменьшенным биологическим периодом полувыведения. Вариант IgG, в котором His435 заменен на аланин, приводит к селективному уменьшению связывания с FcRn и значительному уменьшению периода полувыведения из сыворотки (Firan et al. 2001, International immunology 13:993). В патенте США № 6165745 раскрыт способ получения антигенсвязывающего белка с уменьшенным биологическим периодом полувыведения включением мутации в сегмент ДНК, кодирующий антигенсвязывающий белок. Мутация включает аминокислотную замену в положении 253, 310, 311, 433 или 434 Fc-области и шарнирного домена.
При использовании здесь подразумевают, что термин "антитело или его фрагмент, не являющиеся человеческими", относится к антителам или их фрагментам, имеющим происхождение от любого вида, не являющегося человеком, где термин "человеческий" включает химерные антитела.
Термин "донорное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), предоставляющему аминокислотные последовательности его вариабельных доменов, CDR, или его другие функциональные фрагменты или аналоги первому иммуноглобулину-партнеру, обеспечивая измененную область, кодирующую иммуноглобулин, и получаемое в результате измененное экспрессированное антитело с антигенной специфичностью и нейтрализующей активностью, характерной для донорного антитела.
Термин "акцепторное антитело" относится к антителу (моноклональному и/или рекомбинантному), гетерологичному по отношению к донорному антителу, предоставляющему все (или любую часть, но предпочтительно все) аминокислотные последовательности, кодирующие его каркасные области тяжелой и/или легкой цепи и/или его константные области тяжелой и/или легкой цепи, первому иммуноглобулину-партнеру. Человеческое антитело представляет собой акцепторное антитело.
При использовании здесь подразумевают, что термин "человеческая акцепторная последовательность" относится к каркасной области антитела или его фрагмента, содержащей аминокислотную последовательность каркасной области VH или VL, имеющей происхождение от человеческого антитела или его фрагмента, или к каркасной области человеческой консенсусной последовательности, в которую могут быть включены CDR вида, не являющегося человеком.
При использовании здесь термин "включение" CDR или гипервариабельных участков включает любой способ расположения CDR, не являющихся человеческими CDR, в человеческой акцепторной каркасной области. Следует понимать, что это может быть осуществлено различными способами, например, нуклеиновые кислоты, кодирующие желаемую аминокислотную последовательность, могут быть получены мутацией нуклеиновых кислот, кодирующих последовательность вариабельного домена, не являющегося человеческим, таким образом, что остатки его каркасных областей заменены остатками человеческой акцепторной каркасной области, или мутацией нуклеиновых кислот, кодирующих последовательность человеческого вариабельного домена, таким образом, что CDR заменены остатками, не являющимися человеческими, или синтезом нуклеиновых кислот,
кодирующих желаемую последовательность. В одном воплощении конечную последовательность получают компьютерным моделированием (in silico).
Далее настоящее изобретение описано только посредством примеров. Приложенная формула изобретения может включать обобщение одного или более из следующих примеров.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение и селекция моноклональных антител 1.1. Способ иммунизации
Было идентифицировано mAb против человеческого OSM S1681 10G08(1)1A09 ("10G8") из гибридом, имеющих происхождение от мышей, иммунизированных рекомбинантным гликозилированным человеческим OSM (К598). Самок мышей SJL (п = 2, Harlan, UK, HOST SP06-06031) иммунизировали обычным способом с использованием в общей сложности 10 мкг белка внутрибрюшинно с А802-подбным адъювантом. Повторные иммунизации проводили с использованием 5 мкг белка. После каждой повторной иммунизации проводили пробный забор крови, и мышь с наилучшим ответом (168#4) была выбрана для слияния с получением гибридомы (R16092/177-198). Извлекали селезенку, вскрывали ее и проводили индуцированное PEG1500 слияние соматических клеток с клетками мышиной миеломы Х63 AG 8 653.GFP.Bcl-2.11 (BioCat 112754; R17209/58). Полученные в результате слияния клетки высевали на 10 96-луночных планшетов и 5 планшетов Nunc OmniTray с метилцеллюлозой, содержащей полутвердую среду. Колонии из полутвердых сред отбирали в 5 96-луночных планшетов.
1.2. Способ скрининга 1.2.1. Первичный скрининг
Первичный скрининг резервных антител против OSM был основан на селекции гибридомного материала, способного связываться с человеческим OSM и, для селекции молекул против сайта II, ингибировать связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором др130. Положительные гибридомные супернатанты, полученные при этом скрининге, анализировали посредством BIACore-анализа кинетики диссоциации для селекции гибридом с наилучшим связыванием.
При слиянии были получены более 3000 клонов, 86 из которых продемонстрировали существенное связывание с OSM при ELISA связывания.
Анализ активности против сайта II проводили с использованием положительных гибридом посредством ELISA с др130 с человеческим OSM и OSM яванского макака. Гибридомные клоны, ингибировавшие связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с человеческим др13, анализировали посредством BIACore-анализа кинетики диссоциации. Из четырех клонов с наилучшим связыванием с человеческим OSM при анализе диссоциации, 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7, получали моноклональные антитела и проводили их повторный скрининг. Различий между связывающей активностью моноклональных антител от каждой гибридомы, определенной посредством BIACore, ELISA и ингибирования др130, не было. Дочерние клоны 10G8.A9, 9G2.C1, 2В7.А6 и ЗЕЗ.А1 криоконсервировали и использовали для свободного от сыворотки более крупномасштабного получения и очистки. Эти клоны использовали далее при вторичном скрининге.
12.2. Вторичный скрининг Вторичный скрининг для ранжирования четырех дочерних клонов, 10G8/A9, 9G2/C1, 2В7/А6 и ЗЕЗ/А1, включал кинетический анализ BIACore против человеческого OSM/OSM яванского макака; ELISA с человеческим др130 и человеческим OSM/OSM яванского макака; КВ-клеточный анализ нейтрализации с человеческим OSM/OSM яванского макака. В дополнение к этому анализировали способность нейтрализовать эндогенный имеющий происхождение от нейтрофилов человеческий OSM, сохранять нейтрализующую способность в 25%-ной человеческой сыворотке АВ и реактивность против человеческого LIF.
Анализ BIACore
Анализ BIACore продемонстрировал, что 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7 имели более высокие аффинности в отношении человеческого OSM, чем альтернативное неконкурирующее мышиное антитело против OSM (15Е10) (Таблица 1). 10G8 показало наибольшую активность в отношении как человеческого OSM (приблизительно 550 мП), так и OSM яванского макака (приблизительно 310 пМ). По сравнению с 15Е10, 10G8 имело в 8 раз/0,9 log большую аффинность в отношении человеческого OSM и в 11 раз/1 log большую аффинность в отношении OSM яванского макака. Как 10G8, так и 9G2 демонстрировали большую аффинность в отношении OSM яванского макака, чем в отношении человеческого OSM.
В ELISA с человеческим др130 используют относительно высокие уровни OSM (25 нг/мл), что уменьшает способность данного анализа разделять высокоаффинные и низкоаффинные антитела, поскольку лиганд присутствует в избытке. После четырех повторов этого анализа было показано, что 10G8 наиболее активно блокирует связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором др130 в данном анализе (Фиг. 1; Таблица 2). Таблица 2: ELISA с человеческим др130 - Результаты четырех повторов ELISA с человеческим др130 для ранжирования активности 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7 против человеческого OSM и OSM яванского макака. Неконкурирующее мышиное антитело 15Е10 и рабочее отрицательное контрольное антитело
Анализ с человеческим др130 повторяли в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ. Два повтора этого анализа показали, что все четыре наиболее удачных антитела 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7, а также 15Е10, сохраняли свою способность блокировать связывание человеческого OSM и OSM яванского макака с др130 (данные не показаны).
КВ-клеточный анализ нейтрализации
OSM индуцирует высвобождение IL-6 из клеток KB (человеческой эпителиальной клеточной линии, экспрессирующей матричную РНК (мРНК) рецепторов др130 и OSM). Кратко, клетки KB стимулировали с использованием 1 нг/мл OSM +/- различные концентрации антител в течение 16-18 часов при 37°С и высвобождение IL-6 мониторировали посредством ELISA. В КВ-клеточном анализе нейтрализации используют меньшее количество OSM, по сравнению с анализом с др130 (1 нг/мл против 25 нг/мл). Это повышает разрешение анализа для разделения высокоаффинных и низкоаффинных нейтрализующих агентов. По сравнению с антителом 15Е10, 10G8 было в 15 раз/1,2 log активнее против человеческого OSM в КВ-клеточном анализе нейтрализации. На основании трех повторов анализа 10G8 было ранжировано первым во всех повторах с получением среднего значения IC50 8 нг/мл против человеческого OSM и 6 нг/мл против OSM яванского макака (Фиг. 2; Таблица 3). 9G2 было ранжировано вторым в этом анализе с IC50 18 нг/мл и 15 нг/мл против человеческого OSM и OSM яванского макака, соответственно.
Таблица 3: КВ-клеточный анализ нейтрализации - Результаты трех повторов КВ-клеточного анализа нейтрализации для ранжирования активности 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7 против человеческого OSM и OSM яванского макака. Антитело 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в качестве отрицательного контроля
Ранжирование
против человеческого OSM
Антитело
Человеческий OSM Средняя IC50 (мкг/мл, ± SD)
OSM яванского макака Средняя IC50 (мкг/мл, ± SD) (ранжирование против OSM яванского макака)
10G8
0,008 ± 0,003 (53 пМ)
0,006 ±0,002 (1) (40 пМ)
9G2
0,018 ±0,008 (120 пМ)
0,015 ±0,006 (2) (100 пМ)
2В7
0,049 ±0,003 (327 пМ)
0,344 ±0,186 (6) (2,3 нМ)
ЗЕЗ
0,054 ±0,034 (360 пМ)
0,150 ±0,013 (5) (1 нМ)
15Е10
0,279 ±0,161 (1,9 нМ)
0,035 ±0,013 (4) (233 пМ)
В присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ 10G8, 9G2 и ЗЕЗ сохраняли свою способность нейтрализовать как человеческий OSM, так и OSM яванского макака (Фиг. 3). Для 15Е10 и 2В7 не удалось получить выравнивающие кривые достаточного качества для вычисления показателей IC50. Как и в КВ-клеточном анализе без человеческой сыворотки, наиболее активным антителом было 10G8, при этом 9G2 было ранжировано вторым. В присутствии 25%-ной сыворотки АВ наблюдали некоторое снижение активности. В некоторой степени это может быть обусловлено тем, что сыворотка АВ препятствует считыванию результатов данного анализа. В этом анализе наблюдали более высокие фоновые уровни IL-6, чем в анализе без человеческой сыворотки.
Эндогенный человеческий OSM (анализ сдр130)
Все четыре наиболее удачных антитела, 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7, а также антитело 15Е10, ингибировали эндогенный человеческий OSM четырех отдельных доноров (Фиг. 4). Этот нативный OSM был получен стимуляцией нейтрофилов здоровых людей гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF).
Реактивность в отношении человеческого LIF (КВ-клеточный анализ
нейтрализации)
Человеческий LIF является наиболее близкородственным по отношению к человеческому OSM представителем семейства IL-6. Начальные исследования продемонстрировали отсутствие реактивности 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7 в отношении человеческого LIF, указывая на то, что эти антитела OSM-специфичны (Фиг. 5).
Реактивность в отношении OSM игрунки (КВ-клеточный анализ нейтрализации) Было показано, что все четыре наиболее удачные молекулы, 10G8, 9G2, ЗЕЗ и 2В7, нейтрализовали OSM игрунки в КВ-клеточном анализе нейтрализации (Фиг. 6). 15Е10 и панель из трех дополнительных антител против человеческого OSM, 10D3DLE, ОМ4.11.17 и ОМ4.11.31, также не приводили к нейтрализации OSM игрунки.
На основании двух повторов анализа, 10G8 наиболее активно нейтрализовало OSM игрунки, при этом 9G2 было ранжировано вторым. 12.3. Моноклональные антитела, выбранные для продолжения Из четырех антител 10G8 было выбрано в качестве наиболее удачного антитела для химеризации на основании его ранжирования первым во всех анализах, приведенных выше. 9G2 было также выбрано для химеризации в качестве резервной молекулы на случай трудностей при гуманизации.
1.3. Конструирование антител и селекция группы наиболее удачных
антител
13.2. Последовательности вариабельных областей Гены вариабельных областей четырех выбранных моноклональных антител, 2В7, ЗЕЗ, 9G2 и 10G8, выделяли и секвенировали параллельно для получения соответствующих химерных антител. Из гибридомных клеточных осадков выделяли общую РНК. Кодирующие последовательности генов вариабельных областей (V-генов) тяжелой и легкой цепи амплифицировали полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (RT-PCR) или быстрой амплификацией 5'-концов кДНК (5'-RACE) и затем проводили ТА-клонирование для анализа последовательности. Амплификацию V-генов проводили дважды для каждого антитела для обеспечения верификации правильных последовательностей от двух независимых реакций. Последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи получали для всех 4 гибридомных клонов. Выравнивание белковых последовательностей показало, что антитела имели высокую степень идентичности последовательностей в вариабельных областях как тяжелой, так и легкой цепи (Фиг. 7 и 8). Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи этих антител изложены в SEQ ID N0:26-48. См. Таблицу А.
Сравнение последовательностей четырех наиболее удачных моноклональных антител с антителом 15Е10 показало лишь 50-60%-ную идентичность в легкой (Фиг. 9) или тяжелой (Фиг. 10) цепи. Это показывает, что рассматриваемые антитела связываются с эпитопами, отличающимися от эпитопов, распознаваемых антителом 15Е10.
13.3. Клонирование антител 1.3.3.1. Конструирование химерных антител
10G8 и 9G2 были получены в форме химерных антител переносом мышиных областей VH и VL, описанных выше, на кодон-оптимизированный человеческий гамма 1 Fc дикого типа и человеческие константные области каппа, соответственно. Химерные антитела использовали для подтверждения функциональности клонированных мышиных вариабельных областей (V-областей), проводили их очистку и использовали в качестве контроля при исследовании гуманизированных конструкций. PCR-праймеры были разработаны на основании 5'- и З'-последовательностей ДНК, определенных в разделе 2.3.1, с включением сайтов рестрикции, необходимых для клонирования в векторы экспрессии млекопитающих Rlx и рТТ5. Также разрабатывали праймеры для замены нативной сигнальной последовательности сигнальной последовательностью кампата (Campath). Сайты Hind III и Spe I были конструированы по краям домена VH, ЧТО ПОЗВОЛЯЛО проводить клонирование в модифицированный вектор Rid или рТТ5, содержащий человеческую константную область (С-область) v1. Включение сайта Spe I в последовательность каркасной области 4 приводило к одной аминокислотной замене в каркасной области 4 (FR4) в положении 108. В области VH 9G2 внутренний сайт Spel был расположен на 5'-конце последовательности ДНК, PCR-праймер для химерного 9G2 был разработан для удаления этого внутреннего сайта Spel. Сайты Hind III и BsiWI были конструированы по краям домена VL, что позволяло проводить клонирование в модифицированный вектор Rln или рТТ5, содержащий человеческую константную область каппа.
Идентифицировали клоны с правильными последовательностями VH И VL и получали плазмиды для экспрессии в клетках СНО или НЕК.
1.3.3.2. Экспрессия химерных антител
Плазмиды Rid и Rln, кодирующие домены VH И VL химерных 10G8 и 9G2, соответственно, использовали для котрансфекции клеток СНОЕ1А электропорацией и экспрессировали их в поликлональной клеточной культуре. Плазмиды рТТ, кодирующие домены VH И VL химерных 10G8 и 9G2, использовали для котрансфекции клеток НЕК293 с применением липидного способа трансфекции для обеспечения транзиторной эписомной экспрессии; при трансфекции в эписомной системе экспрессии возможно получение миллиграммовых количеств антитела. Полученные химерные антитела (10G8c и 9G2c) очищали из супернатантов клеточных культур аффинной хроматографией на сефарозе с белком А. Качество очищенных антител контролировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и гель-хроматографией.
1.3.3.3. Анализ данных связывания ELISA связывания с человеческим OSM
Оба химерных антитела, 10G8 и 9G2, успешно связывались с человеческим OSM, в большей степени, чем химерное 15Е10 (15Е10с) (Фиг. 11). Данный анализ представлял собой прямой ELISA, где человеческий OSM сорбировали в концентрации 1 мкг/мл и связанные антитела выявляли с использованием антитела против человеческого IgG.
Анализ BIACore
Анализ BIACore показал незначительное уменьшение или отсутствие уменьшения связывания химерных молекул 10G8 и 9G2 с человеческим OSM или OSM яванского макака, по сравнению с исходными мышиными антителами (Таблица 4). Химерное 10G8 ранжировано первым (654 пМ), за ним следует химерное 9G2 (1,33 нМ). Все антитела продемонстрировали большую аффинность в отношении OSM яванского макака, чем в отношении человеческого OSM.
Таблица 4: Кинетика BIACore - кинетика связывания антитела 10G8,
ELISA с человеческим др130 В ELISA с человеческим др130 используют относительно высокие уровни OSM (25 нг/мл), что уменьшает способность данного анализа разделять высокоаффинные и низкоаффинные антитела, поскольку лиганд присутствует в избытке. После трех повторов этого анализа химерное 10G8 было наиболее эффективным антителом при ингибировании связывания как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором др130. Значения для исходного мышиного 10G8 и химерного 10G8, полученные в данном анализе, были очень близки (Фиг. 12; Таблица 5). Значимых различий между 9G2 и химерным антителом 9G2 не было.
Таблица 5: ELISA с человеческим др130 - Результаты трех повторов ELISA с человеческим др130 для ранжирования активности 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2 против человеческого OSM и OSM яванского макака. Антитело 15Е10 было добавлено в целях сравнения. Рабочее антитело использовали в
сыворотки АВ как с человеческим OSM, так и с OSM яванского макака. Все молекулы сохраняли свою активность в 25%-ной сыворотке. Против человеческого OSM и OSM яванского макака химерное 10G8 и исходное мышиное 10G8 были ранжированы первым и вторым соответственно. Значения IC50 этих двух молекул были сходны. Значимых различий между химерным 9G2, ранжированным третьим, и исходным мышиным 9G2 не наблюдали (данные не показаны).
КВ-клеточный анализ нейтрализации Исходное мышиное 10G8 действовало аналогично химерному антителу (Фиг. 13; Таблица 6). Исходное мышиное 9G2 и химерное 9G2 были ранжированы в данном анализе третьим и четвертым, соответственно.
Таблица 6: КВ-клеточный анализ нейтрализации - Результаты трех повторов КВ-клеточного анализа нейтрализации для ранжирования активности 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2 против человеческого OSM и OSM
яванского макака. Антитело 15Е10 было добавлено в целях сравнения.
Химерное 9G2
0,231 ±0,287 (1,5 нМ)
0,031 ± 0,008 (2) (207 пМ)
15Е10
Недопустимое значение
0,057 ± 0,036 (5) (380 пМ)
В присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2 сохраняли свою способность нейтрализовать как человеческий OSM, так и OSM яванского макака (Фиг. 14). В присутствии 25%-ной сыворотки АВ наблюдали некоторое снижение активности. В то время как при использовании начальной концентрации антител 1 мкг/мл показатели IC50 вычислить не удалось, наблюдали отчетливый эффект титрования на нейтрализацию для всех антител, за исключением неродственного отрицательного контроля. В некоторой степени это снижение активности может быть обусловлено тем, что сыворотка АВ препятствует считыванию результатов анализа. В этом анализе наблюдали более высокие фоновые уровни IL-6, чем в анализе без человеческой сыворотки.
Эндогенный человеческий OSM (анализ сдр130) 10G8, химерное 10G8, 9G2 и химерное 9G2 ингибировали эндогенный человеческий OSM двух отдельных доноров (Фиг. 15). По этим двум донорам 10G8 и химерное 10G8 были совместно ранжированы первыми, в то время как 9G2 и химерное 9G2 были ранжированы третьим и четвертым, соответственно (Таблица 7). Этот нативный OSM был получен GM-CSF-стимуляцией нейтрофилов здоровых людей. Таблица 7: Анализ эндогенного OSM с человеческим др130 - Результаты
двух доноров нейтрофилов в ELISA с человеческим др130 для оценки активности 10G8, химерного 10G8, 9G2 и химерного 9G2 против эндогенного человеческого OSM. Рабочее антитело использовали в качестве
отрицательного контроля
Человеческий LIF является наиболее близкородственным по отношению к человеческому OSM представителем семейства IL-6. Три повтора КВ-клеточного анализа с человеческим LIF показали, что 10G8, химерное 10G8, 9G2 и химерное 9G2 не нейтрализовали человеческий LIF. Имеющееся в продаже антитело против человеческого LIF нейтрализовало LIF в данном анализе (Фиг. 16). Это доказывает специфичность этих антител в отношении OSM.
Пример 2: Гуманизация
2.1.1. Способ гуманизации тяжелой цепи После BLAST-анализа эмбриональных баз данных человеческих V-генов человеческая эмбриональная IGHV3_7, на 74% идентичная (включая CDR) последовательности вариабельной области тяжелой цепи мышиного 10G8, была выбрана в качестве предпочтительной акцепторной каркасной области для гуманизации. Эмбриональную V-область виртуально (in silico) комбинировали с подходящей FR4, в данном случае минигеном JH2 (Kabat Vol. II), на основании сходства последовательностей. Первые шесть остатков минигена JH2 входят в участок CDR3, замещаемый входящим CDR из донорного антитела. На основании сравнения последовательностей и возможного эффекта на функцию антител были получены три гуманизированных варианта тяжелой цепи. Конструкция НО была результатом прямого переноса мышиных CDR из 10G8 (с использованием определения Kabat) в человеческую акцепторную каркасную область, выбранную выше. Конструкции Н1 и Н2 основаны на НО, и обе содержат одну дополнительную мутацию каркасной области, разную в каждой конструкции; положения 2 и 105, соответственно.
2.1.2. Гуманизация легкой цепи После BLAST-анализа эмбриональных баз данных человеческих V-генов человеческая эмбриональная IGKV4_1, на 64% идентичная (включая CDR) последовательности вариабельной области легкой цепи мышиного 10G8, была выбрана в качестве предпочтительной акцепторной каркасной области для гуманизации. Эмбриональную V-область виртуально (in silico) комбинировали с подходящей FR4, в данном случае минигеном J-области каппа-4 (Kabat Vol. II), на основании сходства последовательностей. Первые два остатка минигена JK-4 входят в CDR3-y4acTOK и идентичны последним двум остаткам CDR3 легкой
цепи мышиного 10G8. На основании сравнения последовательностей и возможного эффекта на функцию антител были получены пять гуманизированных вариантов легкой цепи. Конструкция L0 была результатом прямого переноса мышиных CDR из 10G8 (с использованием определения Kabat) в человеческую акцепторную каркасную область, выбранную выше. Конструкции L1, L2 и L3 основаны на L0, и каждая из них содержит одну дополнительную мутацию каркасной области, разную в каждой конструкции; положения 46, 84 и 103, соответственно. Конструкция L4 содержит все три указанные выше обратные мутации.
2.1.3. Конструирование гуманизированных векторов
Последовательности ДНК гуманизированных вариабельных областей оптимизировали с использованием программного обеспечения LETO 1.0 (Entelechon GmbH) и синтезировали заново наращиванием перекрывающихся олигонуклеотидов и PCR-амплификацией. Праймеры содержали сайты рестрикции для клонирования в векторы экспрессии млекопитающих и сигнальные последовательности человеческих иммуноглобулинов для секреции. Гуманизированные вариабельные области тяжелой цепи Н0-Н2 клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие человеческую константную область гамма-1, с использованием Hind 111 и Spel. Параллельно гуманизированные вариабельные области легкой цепи L0-L4 клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие человеческую константную область каппа, с использованием Hindi 11 и BsiWI.
2.1.4. Начальный скрининг панели гуманизированных вариантов
Для скрининга и сокращения панели гуманизированных вариантов (3 тяжелые цепи х 5 легких цепей = 15), антитела экспрессировали в клетках НЕК и оценивали посредством BIACore, ELISA и функциональных анализов. 2.2. Биологические анализы гуманизированных антител 10G8: химерные и
гуманизированные mAb 2.2.1. Вторичный скрининг
Вторичный скрининг для ранжирования гуманизированных антител 10G8, приведенных в Таблице 9, включал кинетический анализ BIACore против человеческого OSM; ELISA с человеческим др130 и человеческим OSM/OSM яванского макака, КВ-клеточный анализ нейтрализации с человеческим
OSM/OSM яванского макака. В дополнение к этому анализировали способность блокировать связывание с др130 в 25%-ной человеческой сыворотке АВ.
Анализ BIACore
Начальный BIACore-анализ трансфекционных супернатантов продемонстрировал, что гуманизированные варианты L1 и L4 имели большие аффинности в отношении человеческого OSM, чем гуманизированные варианты L0, L2 и L3 (Таблица 8). Эти мутации легкой цепи улучшали аффинность, по сравнению с прямым переносом самим по себе (HOLO) и химерным 10G8. Варианты тяжелых цепей Н1 и Н2 оказывали незначительный эффект на аффинность антител в сравнении с прямым переносом НО.
Анализ полученных в большем количестве очищенных вариантов L1 и L4 показал, что аффинности этих mAb в отношении как человеческого OSM, так и и OSM яванского макака отличались крайне незначительно (Таблица 9). Таблица 8: Кинетика BIACore - кинетика связывания пятнадцати трнансфекционных супернатантов с резервными гуманизированными
В КВ-клеточном анализе нейтрализации используют меньшее количество OSM, по сравнению с анализом с др130 (1 нг/мл против 25 нг/мл). Это повышает разрешающую способность данного анализа для разделения высокоаффинных и низкоаффинных нейтрализующих агентов. Скрининг конструкций начальных вариантов НО, Н1, Н2, L0, L1, L2, L3 и L4 КВ-клеточным анализом показал превосходство конструкций L1 (данные не показаны). Эти варианты, вместе с вариантами L4, показавшими хорошие результаты в анализе BIACore, получали в более крупных партиях для дальнейших анализов. На основании трех повторов анализа гуманизированные варианты 10G8 L1 были ранжированы первыми с получением среднего значения IC50 14 нг/мл против человеческого OSM и 10 нг/мл против OSM яванского макака (Фиг. 17; Таблица 10).
Таблица 10: КВ-клеточный анализ нейтрализации - Результаты трех повторов КВ-клеточного анализа нейтрализации для ранжирования активности гуманизированных вариантов 10G8 L1 и L4 против человеческого OSM и OSM
ELISA с человеческим др130
В ELISA с человеческим др130 используют относительно высокие уровни OSM (25 нг/мл), что уменьшает способность данного анализа разделять высокоаффинные и низкоаффинные антитела, поскольку лиганд присутствует в избытке. После двух повторов этого анализа с гуманизированными вариантами 10G8 L1 было показано, что все три варианта одинаково блокировали связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором др130 в данном анализе (Фиг. 18).
Анализ с человеческим др130 также проводили в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ. Два повтора этого анализа показали, что все антитела, а именно гуманизированные варианты 10G8 H0L1, H1L1 и H2L1, сохраняли свою способность блокировать связывание человеческого OSM и OSM яванского макака с др130 (данные не показаны). 2.3. Выделение Fab-фрагментов и кристаллизация комплекса mAb 10G8-
OSM
2.3.2. Получение Fab-фрагментов
Fab-фрагменты исходного антитела 10G8 получали расщеплением иммобилизированным на гранулах папаином (Pierce 20341) в течение 20 ч при 37°С в буфере, содержащем 20 мМ фосфатный буфер, рН 7, 10 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) и 10 мМ L-цистеин. После расщепления гранулы удаляли с использованием одноразовой пластиковой колонки, затем Fab-фрагменты очищали от контаминирующих Fc-фрагментов и нерасщепленного антитела с применением хроматографии с белком типа А (MabSelect, GE Healthcare 17-5438-03). Несвязанную фракцию, содержащую Fab-фрагменты, дополнительно очищали с применением гель-хроматографии (SEC) с 200pg Superdex (GE Healthcare 17-1069-01) с использованием буфера с 25 мМ HEPES, рН 7,7, 150 мМ NaCI в качестве подвижной фазы. Комплекс получали, смешивая 11,5 мг очищенных Fab (GRITS30249) с 5,75 мг рекомбинантного OSM (GRITS23122) в молярном соотношении 1:1 в течение 1,5 ч при 4°С. Затем проводили очистку комплекса от веществ, не вошедших в комплекс, с применением SEC с 200pqSuperdex. Полученный комплекс концентрировали до 44 мг/мл общего белка (выход 9,2 мг) с использованием устройства для центрифужной концентрации, оборудованного мембраной 10kMWCO (Vivaspin VS2002). Компоненты комплекса верифицировали с применением N-концевого секвенирования, масс-спектрометрии и SDS-PAGE. Функциональную связывающую активность Fab-фрагментов в отношении OSM подтверждали с применением анализа ингибирования с др130 (данные не показаны).
2.3.2. Кристаллизация комплекса 10G8-OSM Получали комплекс Fab-фрагментов mAb 10G8 против OSM с OSM и проводили его кристаллизацию при 20°С с использованием PEG3500 как преципитата. Кристаллы оптимизировали, направляли на анализ на Европейскую установку синхротронного излучения (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)) и определяли их структуру с разрешением 3,5 A. mAb 10G8 связывалось с цепями В и С OSM с хорошей поверхностной комплементарностью и блокировало связывание сайта II OSM с рецептором др130 исключительно ввиду стерического несоответствия, без непосредственного взаимодействия с какими-либо остатками сайта II. Остатки, непосредственно вовлеченные в связывание (расстояние менее 5 А) при разрешении 3,5 А, показаны в Таблице 11 и на Фиг. 19. Этот блокирующий
эффект был обусловлен, главным образом, легкой цепью. Четыре CDR, CDRH2, НЗ и CDRL1 и L3, связывались с цепями В и С OSM, непосредственно или через опосредованные водой взаимодействия. Существенных изменений в молекуле в молекуле OSM при связывании с mAb 10G8 не было. Поскольку два CDR, CDRH1 и L2, не участвовали в связывании, были получены варианты антитела, где один или оба этих CDR были заменены человеческой последовательностью. Это может приводить к уменьшению иммуногенности молекулы, по сравнению с гуманизированным антителом при прямом переносе.
2.3.4. Гуманизированное антитело 10G8: замена человеческими CDR При определении кристаллической структуры самостоятельно полученного комплекса mAb 10G8 против OSM и OSM было установлено, что CDRH1 и CDRL2 непосредственно не участвуют в связывании с антигеном. Подходящие человеческие эмбриональные CDR были выбраны для замены этих мышиных эмбриональных CDR. Исследовали эффекты человеческих эмбриональных последовательностей двух CDRH1 и двух CDRL2 на связывание с антигеном. Для CDR как тяжелой, так и легкой цепи исследовали последовательности исходной человеческой эмбриональной акцепторной каркасной области (IGHV3_7 и IGKV4_1, соответственно), и, кроме того, на основании гомологии CDR и расположенных рядом с ними каркасных областей были выбраны две дополнительные человеческие эмбриональные последовательности (IGHV3_23 и IGKV1_5). Соответствующие мышиные CDR в V-областях гуманизированных НО и L1 заменяли человеческими эмбриональными последовательностями CDRH1 и CDRL2. Новые V-области синтезировали заново наращиванием перекрывающихся олигонуклеотидов и PCR-амплификацией, как в разделе 1.1.4.
2.4. Биологические анализы гуманизированных антител 10G8: гуманизированное mAb 10G8 H0L1 и гуманизированное mAb 10G8 с гуманизированным несвязывающим CDR 2.4.1. Вторичный скрининг Анализ BIACore
BIACore-анализ трансфекционных супернатантов различных гуманизированных конструкций CDRH1 и CDRL2 10G8 H0L1 продемонстрировал, что единственным антителом, полностью сохранявшим аффинность исходного mAb в отношении человеческого OSM, была молекула H0(IGHV3_23)L1 (Таблица 12). Эта конструкция, а также две другие молекулы с
ближайшими значениями KD, H0L1(IGKV4_1) и H0(IGHV3_23)L1 (IGK4_1), были получены в большем количестве и очищены для дальнейшего исследования.
Таблица 12: Кинетика BIACore - Кинетика связывания трансфекционных супернатантов гуманизированных вариантов 10G8 H0L1 CDRH1 и CDRL2 резервного антитела против OSM с OSM яванского макака и
КВ-клеточный анализ нейтрализации продемонстрировал, что гуманизированная конструкция 10G8 H0(IGHV3_23)L1 (отмеченная как H0('CDRH1)L1) показывает активность, очень сходную с исходным
гуманизированным mAb 10G8 H0L1 (отмеченным как H0L1). Любая замена несвязывающего CDRL2 человеческой последовательностью приводила к снижению нейтрализующей активности, как видно из данных по антителам H0L1(IGKV4_1) (отмеченного H0L1(huCDRL2)) и H0(IGHV3_23)L1 (IGK4_1) (отмеченного H0(huCDRH1)L1 (huCDRL2)) (Фиг. 20, Таблица 13).
Таблица 13: КВ-клеточный анализ нейтрализации - Результаты трех повторов КВ-клеточного анализа нейтрализации для ранжирования активности гуманизированных вариантов 10G8 H0L1 CDRH1 и CDRL2 против человеческого OSM и OSM яванского макака
2.5. Биологические анализы гуманизированных антител 10G8: гуманизированное mAb 10G8 H0(IGHV3_23)L1
2.5.1. Вторичный скрининг Анализ BIACore
Анализ BIACore проводили с очищенным mAb H0(IGHV3_23)L1 и ранжировали его против химерного 10G8 и исходного гуманизированного mAb 10G8 H0L1. Аффинности mAb H0(IGHV3_23)L1 и исходного mAb H0L1 в отношении как человеческого OSM, так и OSM яванского макака отличались незначительно или не отличались (Таблица 6). mAb H0(IGHV3_23)L1 имело в 6,5 раз (0,8 log) большую аффинность в отношении человеческого OSM, по сравнению с альтернативным неконкурирующим гуманизированным антителом против OSM 15E10h. В данном исследовании использовали новую партию OSM, что привело к уменьшению значений KD, тем не менее, различия между гуманизированными вариантами и неконкурирующим антителом остались неизменными.
Таблица 14: Кинетика BIACore - Кинетика связывания очищенного mAb H0(IGHV3_23)L1 с OSM яванского макака и человеческим OSM, по сравнению с
химерным 10G8 и по сравнению с исходным гуманизированным mAb 10G8 H0L1 и альтернативным неконкурирующим гуманизированным антителом
против OSM
OSM яванского макака
Человеческий OSM
Ка (М-1, с-
Kd (с-1)
KD (нМ)
Ка (М-1, с-
Kd (с-1)
KD (нМ)
Химерное10G8
2,50Е+05
6,63Е-05
266
4,27Е+05
7,87Е-05
184
H0(CDRH1 IGHV3_23)L1
4,23Е+05
8,39Е-05
199
7,09Е+05
9,65Е-05
136
H0L1
4,27Е+05
8,31 Е-05
195
7,12Е+05
8,90Е-05
125
15E10h
5,07Е+05
3,24Е-04
640
7,36Е+05
6,49Е-04
882
Жидкофазный анализ аффинности Kinexa (Sapidyne Instruments 3200) применяли для определения общей аффинности антитела против OSM H0(huCDRH1)L1 и гуманизированного 15Е10 (неродственного антитела против OSM) в отношении человеческого OSM, OSM яванского макака, макака-резуса и игрунки (Таблица 15). Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения.
Гранулы с OSM получали адсорбцией (полиметилметакрилатные гранулы - РММА) или аминным сочетанием (NHS-активированные сефарозные гранулы). Спектр изученных молекул OSM приводил к необходимости получения гранул, покрытых OSM в различных концентрациях. Для жидкофазной части анализа антитела в фиксированной концентрации инкубировали с широким спектром концентраций OSM и позволяли им достичь равновесия инкубацией при комнатной температуре в течение по меньшей мере 2 ч перед продолжением анализа. Гранулы с OSM затем использовали для определения количества свободного антитела, присутствовавшего в жидких образцах, по связыванию свободного антитела с матрицей гранулы с OSM с его последующим выявлением с использованием подходящего вторичного антитела (противочеловеческого или противомышиного, в зависимости от исследуемой конструкции), меченного флуоресцентным красителем. Кривые связывания строили с применением аналитического программного обеспечения Kinexa Pro, включенного в прибор. Затем объединяли результаты нескольких экспериментов с использованием разных начальных концентраций антитела и анализировали их с применением аналитического программного обеспечения n-curve для более точного определения аффинности.
H0(huCDRH1)L1 показывает большую аффинность в отношении человеческого OSM, как было определено ранее анализом Biacore. В отличие от Biacore, где антитело было связано с поверхностью чипа, в Kinexa для оценки аффинности используют свободное антитело и лиганд в жидкой фазе, что в большей степени соответствует естественному состоянию. Таблица 15: Кинетика Kinexa - Кинетика связывания очищенного резервного
антитела против OSM H0(huCDRH1)L1 и гуманизированного 15Е10 с
человеческим OSM, OSM яванского макака, макака-резуса и игрунки
эксперименте с рецептором для использования микрограммовых количеств OSM будет необходимо более 40 нМ антитела.
Общий вывод состоит в том, что связывание гуманизированного 15Е10 с OSM игрунки значительно слабее его связывания с человеческим OSM.
ELISA с человеческим др130
В ELISA с человеческим др130 используют избыток OSM (25 нг/мл), что уменьшает способность данного анализа разделять высокоаффинные и низкоаффинные антитела. После трех повторов анализа с др130 было подтверждено, что все антитела, исходное мышиное 10G8, химерное 10G8, исходное гуманизированное 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1, активно блокировали связывание как человеческого OSM, так и OSM яванского макака с рецептором др130 в данном анализе (Фиг. 21). Ввиду высоких уровней антигена в этом анализе, провести четкое ранжирование не представлялось возможным.
Анализ с человеческим др130 повторяли в присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ и 25%-ной смешанной человеческой синовиальной
жидкости. Три повтора этого анализа для каждой матрицы показали, что все антитела, исходное мышиное 10G8, химерное 10G8, исходное гуманизированное 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1, а также 15E10h сохраняли свою способность блокировать связывание человеческого OSM и OSM яванского макака с др130 (данные не показаны).
КВ-клеточный анализ нейтрализации КВ-клеточный анализ нейтрализации позволяет лучше разделить высокоаффинные и низкоаффинные нейтрализующие агенты, чем анализ с др130, благодаря использованию низких (1 нг/мл) уровней OSM. На основании трех повторов анализа для H0(huCDRH1)L1 было получено среднее значение IC50 30 нг/мл против человеческого OSM, 41 нг/мл против OSM яванского макака и 36 нг/мл против OSM игрунки (Фиг. 22; Таблица 17).
Таблица 17: КВ-клеточный анализ нейтрализации - Результаты трех повторов КВ-клеточного анализа нейтрализации для ранжирования активности H0(huCDRH1)L1 против человеческого OSM, OSM яванского макака и игрунки.
HO(huCDRHI) L1
0,0030 ± 0,0015 (20 пМ)
0,0041 ± 0,0025 (4) (27 пМ)
0,0036 ± 0,0024 (3) (24 пМ)
Химерное 10G8
0,0052 ± 0,0064 (35 пМ)
0,0011 ± 0,0004 (1)(7 пМ)
0,0271 ± 0,0450 (4) (181 пМ)
0,0391 ±
0,0054 ±
Отсутствие
15E10h
0,0207
0,0020
нейтрализаци
(261 пМ)
(5) (36 пМ)
В присутствии 25%-ной человеческой сыворотки АВ или 25%-ной смешанной человеческой синовиальной жидкости (H0(huCDRH1)L1 и 15Е1 Oh сохраняли свою способность нейтрализовать как человеческий OSM, так и OSM яванского макака (Фиг. 23). В присутствии 25%-ной сыворотки АВ или 25%-ной смешанной синовиальной жидкости наблюдали некоторое снижение активности. Вероятнее всего, это обусловлено тем, что эти матрицы препятствует считыванию результатов данного анализа. В этом анализе наблюдали более высокие фоновые уровни IL-6, чем в нормальном анализе.
Было показано, что, в отличие от 15E10h, H0(huCDRH1)L1 нейтрализовало OSM игрунки в КВ-клеточном анализе нейтрализации. Панель из трех дополнительных антител против человеческого OSM, 10D3DLE, ОМ4.11.17 и ОМ4.11.31, также не приводила к нейтрализации OSM игрунки. Анализ эндогенного человеческого OSM с др130
Исходное мышиное 10G8, химерное 10G8, исходное гуманизированное 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1 )1_1, а также 15E10h ингибировали эндогенный человеческий OSM от четырех отдельных доноров (Фиг. 24). По результатам этих четырех доноров различие между исходным mAb H0L1 и mAb H0(huCDRH1)L1 была крайне незначительной; эти mAb были ранжированы выше исходного мышиного 10G8 и химерного 10G8 (Таблица 18). H0(huCDRH1)L1 было приблизительно в 12 раз (1,09 log) активнее, чем 15E10h. Нативный OSM был получен GM-CSF-стимуляцией нейтрофилов здоровых людей.
Таблица 18: Анализ эндогенного OSM с человеческим др130 - Результаты четырех доноров нейтрофилов в ELISA с др130 для оценки активности исходного мышиного 10G8, химерного 10G8, исходного гуманизированного
10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1 )L1 против эндогенного человеческого OSM. 15Е1 Oh было добавлено в целях сравнения. Неродственное антитело использовали в качестве отрицательного контроля
нейтрализации)
Человеческий LIF является наиболее близкородственным по отношению к человеческому OSM представителем семейства IL-6. Три повтора КВ-клеточного анализа с человеческим LIF показали, что исходное мышиное 10G8, химерное 10G8, исходное гуманизированное 10G8 H0L1 (H0L1) и H0(huCDRH1)L1 или 15E10h не нейтрализовали человеческий LIF. 15Е1 Oh было добавлено в целях сравнения. Имеющееся в продаже антитело против человеческого LIF нейтрализовало LIF в данном анализе (Фиг. 25). Это доказывает специфичность этих антител в отношении OSM.
Анализ с человеческими первичными гепатоцитами
Человеческие первичные гепатоциты чувствительны к OSM и высвобождают белки острой фазы, такие как SAA и CRP, в ответ на стимуляцию OSM. H0(huCDRH1)L1 дозозависимым образом ингибировало индуцированное человеческим OSM высвобождение SAA (Фиг. 26) и CRP (Фиг. 27) из гепатоцитов трех отдельных доноров. Гуманизированное 15Е10 было добавлено в целях сравнения.
Эквивалентные анализы проводили с использованием человеческих первичных клеток других типов. Они включали человеческие клетки эндотелия пупочной вены, человеческие фибробластоподобные синовиоциты пациентов с ревматоидным артритом, человеческие легочные фибробласты здоровых людей и пациентов с идиопатическим фиброзом легких (данные не показаны). Как и в предыдущих анализах, H0(huCDRH1)L1 нейтрализует OSM активнее гуманизированного 15Е10. Кратность превышения активности H0(huCDRH1)L1
над активностью гуманизированного 15Е10 варьирует в зависимости от клеточной линии и концентрации OSM.
2.6. Биофизическое описание Определяли основные биофизические свойства H0(huCDRH1)L1, а также исходного гуманизированного mAb 10G8 H0L1. На антитела воздействовали стрессовыми условиями внешней среды, такими как:
- температура, инкубацией в течение 14 суток при 4°С или 37°С;
- пять циклов замерзания-оттаивания;
- форсированное дезамидирование инкубацией с 1%-ным бикарбонатом аммония при 37°С в течение 48 часов.
Ни одно антитело не показало уменьшения биофизических изменений или снижения активности после указанных выше стрессовых воздействий. 2.6. Гуманизированные антитела с вариантами CDRH3 2.6.1. Конструирование гуманизированных антител с вариантами CDRH3
Замену каждого остатка CDRH3 (SEQ ID N0:3) альтернативным аминокислотным остатком проводили с использованием полноразмерной последовательности тяжелой цепи НО (IGHV3_23) SEQ ID N0:75 (последовательность вариабельной области: SEQ ID N0:74) на плазмиде рТТ (Национальный научно-исследовательский совет, Канада (National Research Council, Canada) с модифицированным множественным сайтом клонирования (MCS)) в качестве исходной молекулы. Применяли методику сайт-направленного мутагенеза (SDM), в соответствии с которой конструируют олигонуклеотиды, содержащие последовательность NNK (N = A/TG/C; К = G или Т) в положении аминокислотной замены. Полимеразную цепную реакцию (PCR) применяли для получения новых плазмид, содержащих замену, и секвенирование ДНК применяли для идентификации клонов с аминокислотными заменами. Таким образом, были выделены варианты, имеющие от 10 до 17 различных аминокислот в каждом из 12 положений CDRH3. Антитела с вариантами CDRH3 получали котрансфекцией векторами рТТ, содержащими вариант НО (IGHV3_23) с легкой цепью L1 (SEQ ID N0: 72), и анализом связывания супернатантов.
Были получены 164 варианта CDRH3, и они были исследованы в последующем анализе (см. разделы 2.6.2 и 2.6.3).
2.6.2. Экспрессия вариантов CDRH3 в клетках НЕК 293 6Е
Плазмиды рТТ, кодирующие тяжелую цепь (НО (IGHV3_23)) с вариантами CDRH3 и легкую цепь L1, использовали для транзиторной котрансфекции клеток НЕК 293 6Е и экспрессировали их в малом масштабе для получения антитела. Антитела анализировали непосредственно из супернатанта тканевой культуры.
2.6.3. Кинетический анализ супернатантов тканевых культур с вариантами
CDRH3
Начальные кинетические анализы для скрининга CDRH3 проводили на ProteOn XPR36 (Biorad Laboratories), и определенные супернатанты были отобраны для более точного кинетического анализа на BiaCore Т100.
Для анализа ProteOn противочеловеческий IgG (GE Healthcare/Biacore BR-1008-39) сочетали с чипом GLM (Biorad Laboratories 176-5012) первичным аминным сочетанием. Варианты CDRH3 иммобилизовали непосредственно на этой поверхности и рекомбинантный человеческий OSM пропускали над поверхностью с иммобилизованными антителами в концентрации 256, 64, 16, 4 и 1 нМ, инъекцию буфера самого по себе (то есть 0 нМ) использовали для двойного контроля кривых связывания. После связывания с OSM поверхности с иммобилизованными антителами восстанавливали с использованием 3 М МдС1г, удаляя ранее захваченные антитела и подготавливая поверхность к следующему циклу иммобилизации и анализа связывания. Затем данные адаптировали к модели 1:1 (с переносом массы), включенной в аналитическое программное обеспечение ProteOn. Анализ проводили с использованием HBS-ЕР (Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69) при температуре 25°С.
Похожий способ применяли для анализа конструкций с использованием Biacore Т100. Противочеловеческий IgG (GE Healthcare/Biacore BR-1008-39) сочетали с чипом СМ5 (GE Healthcare/Biacore BR-1006-68) первичным аминным сочетанием, антитела иммобилизовали на этой поверхности и рекомбинантный человеческий OSM пропускали над поверхностью с иммобилизованными антителами в концентрации 256, 64, 16, 4 и 1 нМ, инъекцию буфера самого по себе (то есть 0 нМ) использовали для двойного контроля кривых связывания. Восстановление проводили с применением введений 3 М МдСЬ или 100 мМ фосфорной кислоты или с использованием обоих реагентов. Данные адаптировали к модели 1:1, включенной в аналитическое программное
обеспечение Biacore Т100. Анализ проводили с использованием HBS-EP (Biacore/GE-Healthcare BR-1006-69) при температуре 25°С.
Полученные данные о связывании представлены на Фиг. 33. Список последовательностей (Таблица А)
Описание
Аминокислотная последовательность
Полинуклеотидная последовательность
10G8 CDRH1
SEQ ID N0:1
10G8 CDRH2
SEQ ID N0:2
10G8 CDRH3
SEQ ID N0:3
10G8 CDRL1
SEQ ID N0:4
10G8 CDRL2
SEQ ID N0:5
10G8 CDRL3
SEQ ID N0:6
ЗЕЗ CDRH1
SEQ ID N0:7
ЗЕЗ CDRH2
SEQ ID N0:8
ЗЕЗ CDRH3
SEQ ID N0:9
ЗЕЗ CDRL1
SEQ ID N0:10
ЗЕЗ CDRL2
SEQ ID N0:11
ЗЕЗ CDRL3
SEQ ID N0:12
2В7 CDRH1
SEQ ID N0:13
2В7 CDRH2
SEQ ID N0:14
2В7 CDRH3
SEQ ID N0:15
2В7 CDRL1
SEQ ID N0:16
2В7 CDRL2
SEQ ID N0:17
2В7 CDRL3
SEQ ID N0:18
9G2 CDRH1
SEQ ID N0:19
9G2 CDRH2
SEQ ID N0:20
9G2 CDRH3
SEQ ID N0:21
9G2 CDRL1
SEQ ID N0:22
9G2 CDRL2
SEQ ID N0:23
9G2 CDRL3
SEQ ID N0:24
Домен VH 10G8 (мышиный)
SEQ ID N0:26
SEQ ID N0:25
Домен VL 10G8 (мышиный)
SEQ ID N0:28
SEQ ID N0:27
Домен VH ЗЕЗ (мышиный)
SEQ ID N0:30
SEQ ID N0:29
Домен VL ЗЕЗ (мышиный)
SEQ ID N0:32
SEQ ID N0:31
Домен VH 2В7 (мышиный)
SEQ ID N0:34
SEQ ID N0:33
Домен VL 2В7 (мышиный)
SEQ ID N0:36
SEQ ID N0:35
Домен VH 9G2 (мышиный)
SEQ ID N0:38
SEQ ID N0:37
Домен VL 9G2 (мышиный)
SEQ ID N0:40
SEQ ID N0:39
Домен VH 10G8 (химерный)
SEQ ID N0:42
SEQ ID N0:41
Домен VL 10G8 (химерный)
SEQ ID N0:44
SEQ ID N0:43
Домен VH 9G2 (химерный)
SEQ ID N0:46
SEQ ID N0:45
Домен VL 9G2 (химерный)
SEQ ID N0:48
SEQ ID N0:47
Человеческая эмбриональная акцепторная нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи IGHV3_7
SEQ ID N0:50
SEQ ID N0:49
Человеческая эмбриональная акцепторная нуклеотидная последовательность вариабельного домена легкой цепи IGKV4J
SEQ ID N0:52
SEQ ID N0:51
VH гуманизированной НО 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:54
SEQ ID N0:53
VH гуманизированной Н1 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:56
SEQ ID N0:55
VH гуманизированной Н2 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с
SEQ ID N0:58
SEQ ID N0:57
применением программы Leto)
VL гуманизированной LO 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:60
SEQ ID N0:59
VL гуманизированной L1 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:62
SEQ ID N0:61
VL гуманизированной L2 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:64
SEQ ID N0:63
VL гуманизированной L3 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:66
SEQ ID N0:65
VL гуманизированной L4 10G8 (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:68
SEQ ID N0:67
Зрелая тяжелая цепь НО (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением LETO)
SEQ ID N0:70
SEQ ID N0:69
Зрелая легкая цепь L1 (нуклеотидная
SEQ ID N0:72
SEQ ID N0:71
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
Гуманизированный вариант VH НО (нуклеотидная последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:74
SEQ ID N0:73
Зрелая тяжелая цепь НО (IGHV3_23 CDRH1) (нуклеотидная
последовательность была кодон-оптимизирована с применением программы Leto)
SEQ ID N0:76
SEQ ID N0:75
CDRH1 человеческой эмбриональной тяжелой цепи IGHV3_23
SEQ ID N0:77
CDRL2 человеческой эмбриональной легкой цепи IGKV1_5
SEQ ID N0:78
Тяжелая цепь 15E10h
SEQ ID N0:79
Легкая цепь 15E10h
SEQ ID N0:80
VH ВЗ гуманизированного 15Е10
SEQ ID N0:81
VL L2 гуманизированного 15Е10
SEQ ID N0:82
Человеческий OSM
SEQ ID N0:84
SEQ ID N0:83
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID N0:1 - CDRH1 10G8
NYAMS
SEQ ID N0:2 - CDRH2 10G8
TISDGGSFTYYLDNVRG
SEQ ID N0:3 - CDRH3 10G8
DVGHTTFWYFDV
SEQ ID N0:4 - CDRL1 10G8
RASKSVSAAGYNFMH
SEQ ID N0:5 - CDRL2 10G8
YASNLES
SEQ ID N0:6 - CDRL3 10G8
LHSREFPFT
SEQ ID N0:7-CDRH1 3E3
SYAMS
SEQ ID N0:8 - CDRH2 3E3
TISDGGSFTYYFANIQG
SEQ ID N0:9 - CDRH3 3E3
DVGLTTFWYFDV
RASKSVSPSGYDFMH
YASELES
QHSREFPFT
NYAMS
TISDGGGYTYYLDNGQG
DVGLTTFWYFDV
RASKSVSPSSYNFMH
YASNLES
QHSREFPFT
SEQ ID N0:10 - CDRL1 3E3
SEQ ID N0:11 - CDRL2 3E3
SEQ ID N0:12 - CDRL3 3E3
SEQ ID N0:13 - CDRH1 2B7
SEQ ID N0:14 - CDRH2 2B7
SEQ ID N0:15 - CDRH3 2B7
SEQ ID N0:16 - CDRL1 2B7
SEQ ID N0:17 - CDRL2 2B7
SEQ ID N0:18 - CDRL3 2B7
SEQ ID N0:19 - CDRH1 9G2
NYAMS
SEQ ID N0:20 - CDRH2 9G2
TISDGGSFTYYLDNVKG
SEQ ID N0:21 - CDRH3 9G2
DVGHTTFWYFDV
SEQ ID N0:22 - CDRL1 9G2
RASKSVSASGYNFMH
SEQ ID N0:23 - CDRL2 9G2
YASNLES
SEQ ID N0:24 - CDRL3 9G2
QHSREFPFT
SEQ ID N0:25 - нуклеотидная последовательность VH 10G8
GAAATGCAACTGGTGGAGTCTGGGGAAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA
GAGCCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA
GGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG
AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACCTTTTGGTACTT
CGATGTCTGGGGCTCAGGGACCGCGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N0:26 - аминокислотная последовательность VH 10G8
EMQLVESGEGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKSLEWVATISDGGSFTYYLDNVRG RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGSGTAVTVSS
SEQ ID N0:27 - нуклеотидная последовательность VL 10G8
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC CTGTAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCAGCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAA
CCAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCA GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGG ATGCTGTAACATATTACTGTCTGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAA CCTGGAAATAAAA
SEQ ID N0:28 - аминокислотная последовательность VL 10G8
DIVLTQSPVFLVVSLGQRATISCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFS GSGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCLHSREFPFTFGGGTNLEIK
SEQ ID N0:29 - нуклеотидная последовательность VH ЗЕЗ
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAACCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC
TGTGTACCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA
GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATTTTGCCAATATAC
AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATACCAAGAACAACCTATACCTGCAAATGAACCATCTG
AAGTCTGAGGACGCAGGCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGCCTTACTACGTTTTGGTATTT
CGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N0:30 - аминокислотная последовательность VH ЗЕЗ
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCVPSGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSFTYYFANIQG RFTISRDNTKNNLYLQMNHLKSEDAGMYYCARDVGLTTFWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID N0:31 - нуклеотидная последовательность VL ЗЕЗ
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAACTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC
CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTCCATCTGGCTATGATTTCATGCACTGGTATCAACAGAAG
CCAGGACAGCCGCCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCGAACTAGAATCTGGGGTCCCTGGCA
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAAGAAGA
TGCTGCAACATATTTCTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAG
CTGGAAATAAAA
SEQ ID N0:32 - аминокислотная последовательность VL ЗЕЗ
DIVLTQSPASLTISLGQRATISCRASKSVSPSGYDFMHWYQQKPGQPPKLLIKYASELESGVPGRFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYFCQHSREFPFTFGGGTKLEIK
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAACCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA GAGGCTGGAGTGGGTCGCGACCATTAGTGATGGTGGTGGTTACACCTACTATTTAGACAATGGA CAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAGATGAGCCATC TGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACTTACTACGTTTTGGTAC TTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N0:34 - аминокислотная последовательность VH 2B7
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGGYTYYLDNGQ GRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCARDVGLTTFWYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID N0:35 - нуклеотидная последовательность VL 2B7
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTCCTTAGTTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC
CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTCCATCTAGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAGAC
CAGGACAGCCGCCCAAACTCCTCATCACGTATGCTTCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAG
GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAAGAGGAT
GCTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAGGC
TGGAAATAAAA
SEQ ID N0:36 - аминокислотная последовательность VL 2B7
DIVLTQSPVSLVISLGQRATISCRASKSVSPSSYNFMHWYQQRPGQPPKLLITYASNLESGVPARFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPFTFGGGTRLEIK
SEQ ID N0:37 - нуклеотидная последовательность VH 9G2
GAAGTACAACTAGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA
GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA
AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG
AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACGTTTTGGTACTT
CGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID N0:38 - аминокислотная последовательность VH 9G2
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEVWATISDGGSFTYYLDNVKG RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGTGTTVTVSS
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC
CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCATCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAAC
CAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAG
GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGAT
GCTGTAACATATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGC
TGGAAATAAAA
SEQ ID N0:40 - аминокислотная последовательность VL 9G2
DIVLTQSPVFLVISLGQRATISCRASKSVSASGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCQHSREFPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID N0:41 - нуклеотидная последовательность VH химерного 10G8
GAAATGCAACTGGTGGAGTCTGGGGAAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA
GAGCCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA
GGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG
AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACCTTTTGGTACTT
CGATGTCTGGGGCTCAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGT
GTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG
TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCG
TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCG
TGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC
CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCC
TGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCT
GATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA
GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGA
GGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCT
GAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACC
ATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT
GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATC
GCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG
GACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAG
GGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCC
TGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
EMQLVESGEGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKSLEWVATISDGGSFTYYLDNVRG
RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGSGTLVTVSSASTKGPSVFPL
APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT
QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:43 - нуклеотидная последовательность VL химерного 10G8
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC
CTGTAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCAGCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAA
CCAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCA
GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGG
ATGCTGTAACATATTACTGTCTGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAA
CCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAG
CTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAG
GTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCA
GGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGA
GAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAG
CTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID N0:44 - аминокислотная последовательность VL химерного 10G8
DIVLTQSPVFLWSLGQRATISCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFS GSGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCLHSREFPFTFGGGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:45 - нуклеотидная последовательность VH химерного 9G2
GAAGTACAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGGAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC
TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAA
GAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGATGGTGGTAGTTTCACCTACTATCTAGACAATGTAA
AGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTATTTGCAAATGAGCCATTTG
AAGTCTGACGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATGTGGGACATACTACGTTTTGGTACTT
CGATGTCTGGGGCACAGGGACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGT
GTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG
TGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCG
TGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCG
TGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC
CAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCC
TGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCT
GATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGA
GGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGA
GGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCT
GAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACC
ATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGAT
GAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATC
GCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTG
GACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAG
GGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCC
TGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID N0:46 - аминокислотная последовательность VH химерного 9G2
EVQLVESGGGLVEPGGSLKLSCAASGFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISDGGSFTYYLDNVKG
RFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSDDTAMYYCARDVGHTTFWYFDVWGTGTLVTVSSASTKGPSVFPL
APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT
QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:47 - нуклеотидная последовательность VL химерного 9G2
GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGTTTTCTTAGTTATATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTC
CTGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTGCATCTGGCTATAATTTCATGCACTGGTACCAACAGAAAC
CAGGACAGCCGCCCAAAGTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAG
GTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGAT
GCTGTAACATATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGC
TGGAAATAAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCT
GAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGT
GCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGG
ACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGA
AGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCT
TCAACCGGGGCGAGTGC
DIVLTQSPVFLVISLGQRATISCRASKSVSASGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIKYASNLESGVPARFSG SGSGTDFTLNIHPVEEEDAVTYYCQHSREFPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:49 - Человеческая эмбриональная акцепторная нуклеотидная
последовательность VH IGHV3_7
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTC
CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGG
AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTG
TGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAG
CCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGA
SEQ ID N0:50 - Человеческая эмбриональная акцепторная аминокислотная последовательность VH IGHV3_7
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
SEQ ID N0:51 - Человеческая эмбриональная акцепторная нуклеотидная
последовательность VL IGKV4_1
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCA
ACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGCTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCAG
CAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCC
CTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGC
TGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAGTACT
SEQ ID N0:52 - Человеческая эмбриональная акцепторная аминокислотная последовательность VL IGKV4_1
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYST
SEQ ID N0:53 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VH гуманизированной НО 10G8
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID N0:54 - Аминокислотная последовательность VH гуманизированной HO 10G8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID N0:55 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VH гуманизированной Н1 10G8
GAGATGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID N0:56 - Аминокислотная последовательность VH гуманизированной Н1 10G8
EMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID N0:57 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VH гуманизированной Н2 10G8
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCTCCGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID N0:58 - Аминокислотная последовательность VH гуманизированной Н2 10G8
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGSGTLVTVSS
SEQ ID N0:59 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной LO 10G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA
GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:60 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной LO 10G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID N0:61 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной L1 10G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:62 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной L1 10G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID N0:63 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной L2 10G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGTGGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAAGGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:64 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной L2 10G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDWVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID N0:65 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной L3 10G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG
AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAACGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:66 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной L3 10G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTNVEIK
SEQ ID N0:67 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность VL гуманизированной L4 10G8
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC GAGGACGTCGTGGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC ACCAACGTGGAGATCAAG
SEQ ID N0:68 - Аминокислотная последовательность VL гуманизированной L4 10G8
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDWVYYCLHSREFPFTFGGGTNVEIK
SEQ ID N0:69 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность зрелой тяжелой цепи НО
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC
TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAACTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG
CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA
CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA
CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT
CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG
CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGA
CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC
GTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGC
CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCT
AAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAC
GAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACC
AAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC
CAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTA
TCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCC
CTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCC
CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC
CCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA
TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACC
CAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID N0:70 - Аминокислотная последовательность зрелой тяжелой цепи НО
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR
GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFP
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG
TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV
WDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:71 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность зрелой легкой цепи L1
GACATCGTGATGACTCAGAGCCCCGATAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAAAGGGCCACCATC
AACTGCAGGGCCAGCAAGAGCGTGAGCGCTGCCGGCTACAACTTCATGCACTGGTACCAGCAG
AAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGGTGCTGATCTACTACGCCTCCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCA
GACAGGTTCAGCGGATCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCAAGCCTGCAGGCC
GAGGACGTCGCCGTGTACTACTGCCTGCACAGCAGGGAGTTCCCCTTCACCTTTGGCGGCGGC
ACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGAT
GAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAG
GCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGAC
CGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGA
CTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGAC
CAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID N0:72 - Аминокислотная последовательность зрелой легкой цепи L1
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSAAGYNFMHWYQQKPGQPPKVLIYYASNLESGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCLHSREFPFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:73 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность гуманизированного варианта VH НО
(IGHV3_23 CDRH1)
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC
SEQ ID N0:74 - Аминокислотная последовательность гуманизированного
варианта VH НО (IGHV3_23 CDRH1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFWYFDVWGRGTLVTVSS
SEQ ID N0:75 - Кодон-оптимизированная с помощью программы Leto нуклеотидная последовательность зрелой тяжелой цепи НО (IGHV3 23
GAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCCGGCGGGAGCCTGAGACTCTC
TTGCGCCGCTAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCCGG
CAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCAGCGACGGCGGCAGCTTCACCTACTATCTGGACAA
CGTGAGGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAA
CAGCCTGAGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGTCGGCCACACCACCTT
CTGGTACTTCGACGTCTGGGGCAGGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGG
CCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGG
GCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGA
CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC
GTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAG
CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGC
CCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCT
AAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAC
GAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACC
AAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCAC
CAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTA
TCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCC
CTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCC
CAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCC
CCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGA
TGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACC
CAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID N0:76 - Аминокислотная последовательность зрелой тяжелой
цепи НО (IGHV3_23 CDRH1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISDGGSFTYYLDNVR
GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGHTTFVVYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFP
LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG
TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV
WDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:77 - CDRH1 человеческой эмбриональной тяжелой цепи
IGHV3_23
SYAMS
SEQ ID N0:78 - CDRL2 человеческой эмбриональной легкой цепи IGKV15
KASSLES
SEQ ID N0:79 - Аминокислотная последовательность тяжелой цепи
гуманизированного 15Е10
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWVAVIWRGGSTDYNAAFM
SRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPNSNFYWYFDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPL
APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT
QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL
PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID N0:80 - Аминокислотная последовательность легкой цепи
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSGSSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIEDTSNLASGIPARFSGSGSGT DYTLTISNLEPEDFAVYYCQQWSSYPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC
SEQ ID N0:81 - VH ВЗ гуманизированного 15Е10
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEVWAVIWRGGSTDYNAAFM SRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPNSNFYWYFDVWGRGTLV (TVSS)
SEQ ID N0:82 - VL L2 гуманизированного 15Е10
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSGSSSVSYMYWYQQKPGQAPRLLIEDTSNLASGIPARFSGSGSGT DYTLTISNLEPEDFAVYYCQQWSSYPPTFGQGTKLEIK
SEQ ID N0:83 - Полинуклеотидная последовательность
человеческого OSM
ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC
CTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCGGCTATAGGCAGCTGCTCGAAAGAG
TACCGCGTGCTCCTTGGCCAGCTCCAGAAGCAGACAGATCTCATGCAGGAC
ACCAGCAGACTCCTGGACCCCTATATACGTATCCAAGGCCTGGATGTTCCT
AAACTGAGAGAGCACTGCAGGGAGCGCCCCGGGGCCTTCCCCAGTGAGGAG
ACCCTGAGGGGGCTGGGCAGGCGGGGCTTCCTGCAGACCCTCAATGCCACA
CTGGGCTGCGTCCTGCACAGACTGGCCGACTTAGAGCAGCGCCTCCCCAAG
GCCCAGGATTTGGAGAGGTCTGGGCTGAACATCGAGGACTTGGAGAAGCTG
CAGATGGCGAGGCCGAACATCCTCGGGCTCAGGAACAACATCTACTGCATG
GCCCAGCTGCTGGACAACTCAGACACGGCTGAGCCCACGAAGGCTGGCCGG
GGGGCCTCTCAGCCGCCCACCCCCACCCCTGCCTCGGATGCTTTTCAGCGC
AAGCTGGAGGGCTGCAGGTTCCTGCATGGCTACCATCGCTTCATGCACTCA
GTGGGGCGGGTCTTCAGCAAGTGGGGGGAGAGCCCGAACCGGAGCCGGAGA
CACAGCCCCCACCAGGCCCTGAGGAAGGGGGTGCGCAGGACCAGACCCTCC
AGGAAAGGCAAGAGACTCATGACCAGGGGACAGCTGCCCCGGTAG
SEQ ID N0:84 - Аминокислотная последовательность человеческого OSM
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAAIGSCSKEYRVLLGQLQKQTDLMQD
TSRLLDPYIRIQGLDVPKLREHCRERPGAFPSEETLRGLGRRGFLQTLNAT
LGCVLHRLADLEQRLPKAQDLERSGLNIEDLEKLQMARPNILGLRNNIYCM
AQLLDNSDTAEPTKAGRGASQPPTPTPASDAFQRKLEGCRFLHGYHRFMHS
VGRVFSKWGESPNRSRRHSPHQALRKGVRRTRPSRKGKRLMTRGQLPR.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Глаксо Груп Лимитед
<120> Антигенсвязывающие белки,связывающиеся с онкостатином М (OSM)
<130> PB63694 <160> 84
<170> FastSEQ для Windows версия 4.0
<210> 1
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Мышь
<400> 1
Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 2 <211> 17 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 2
Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 3 <211> 12 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 3
Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 4 <211> 15 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 4
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala Gly Tyr Asn Phe Met His
1 5 10 15
<210> 5 <211> 7 <212> ПРТ <213> Мышь
<210> 6 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 6
Leu His Ser Arg Glu Phe Pro Phe Thr 1 5
<210> 7 <211> 5 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 7
Ser Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 8 <211> 17 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 8
Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Phe Ala Asn Ile Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 9 <211> 12 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 9
Asp Val Gly Leu Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 10 <211> 15 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 10
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Pro Ser Gly Tyr Asp Phe Met His
1 5 10 15
<210> 11 <211> 7 <212> ПРТ <213> Мышь
<210> 12 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 12
Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Phe Thr 1 5
<210> 13 <211> 5 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 13
Asn Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 14 <211> 17 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 14
Thr Ile Ser Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Gly Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 15 <211> 12 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 15
Asp Val Gly Leu Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 16 <211> 15 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 16
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Pro Ser Ser Tyr Asn Phe Met His
1 5 10 15
<210> 17 <211> 7 <212> ПРТ <213> Мышь
<212> ПРТ <213> Мышь
<400> 18
Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Phe Thr 1 5
<210> 19 <211> 5 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 19
Asn Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 20 <211> 17 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 20
Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 21 <211> 12 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 21
Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 22 <211> 15 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 22
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Met His
1 5 10 15
<210> 23 <211> 7 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 23
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<210> 24 <211> 9 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 24
Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Phe Thr 1 5
<210> 25 <211> 363
<212> ДНК
<213> Мышь <400> 25
gaaatgcaac tggtggagtc tggggaaggc ttagtggagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga gcctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagttt cacctactat 180 ctagacaatg taaggggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtat 240 ttgcaaatga gccatttgaa gtctgacgac acagccatgt attactgtgc aagagatgtg 300 ggacatacta ccttttggta cttcgatgtc tggggctcag ggaccgcggt caccgtctcc 360 tca 363
<210> 26 <211> 121 <212> ПРТ <213> Мышь
Leu
Val
Glu
Ser
Gly
Glu
Leu
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser 25
Trp
Val
Arg
Gln
Thr 40
Pro
Ser
Asp
Gly
Gly
Ser
Ser
Phe
Phe
Thr
Ile
Arg
Asp
Ser
His
Gly
Val
Leu
Lys
Ser
Asp
Val 100 Ala
His Thr
Thr Val
Thr Ser
1 О n
Phe 105 Ser
<400> 26 Glu Met G
1 5 10 15
Ser
35 40 45
Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Ty
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Ly
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser His Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cy
90 95 Trp Tyr Phe Asp Val Tr 110
Ala Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27 <211> 333 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 27
gacattgtgc tgacacagtc tcctgttttc ttagttgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcctgta gggccagcaa aagtgtcagt gcagctggct ataatttcat gcactggtac 120
caacagaaac caggacagcc gcccaaagtc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgtaacatat tactgtctgc acagtaggga gtttccgttc 300
acgttcggag gggggaccaa cctggaaata aaa 333
<210> 28 <211> 111 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Leu Val Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Val Thr Tyr Tyr Cys Leu His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 363
<212> ДНК <213> Мышь
<400> 29
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaaac ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgtac cctctggatt cactttcagt agttatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagttt cacctactat 180 tttgccaata tacagggccg attcaccatc tccagagaca ataccaagaa caacctatac 240 ctgcaaatga accatctgaa gtctgaggac gcaggcatgt attactgtgc aagagatgtg 300 ggccttacta cgttttggta tttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363
<210> 30 <211> 121
<212> ПРТ
<213> Мышь
Glu
Ser
Val
Gln
Leu
Val
Glu
Ser
Gly
Gly
Leu
Lys
Leu
20 Trp
Ser
Cys
Val
Pro
Ser
Pro
Ala
Met
Ser
Ile
Val
Arg
Gln
Thr
Ser
Ala
Thr
Gly
Ser
Asp
Gly
Gly
Ser
Phe
Gln 65
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Arg
Asp
Leu
Gln
Met
Asn
His
Gly
Leu
Lys
Ser
Glu
Ala
Arg
Asp
Val 100 Thr
Leu
Thr
Thr
Phe 105 Ser
Thr
Gly
Thr 115
Val
Thr
Val
Ser 120
10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ty 30
Glu Lys Arg Leu Glu Trp Va 45
Thr Tyr Tyr Phe Ala Asn Il 60
Asn Thr Lys Asn Asn Leu Ty 75 80 Asp Ala Gly Met Tyr Tyr Cy 90 95 Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gl 110
<210> 31 <211> 333 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 31
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttaactatat ctctggggca gagggccacc 60
atctcctgca gggccagcaa aagtgtcagt ccatctggct atgatttcat gcactggtat 120
caacagaagc caggacagcc gcccaaactc ctcatcaagt atgcatccga actagaatct 180
ggggtccctg gcaggttcag tggcagtggg tctgggacag atttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aagaagatgc tgcaacatat ttctgtcagc acagtaggga gtttccgttc 300
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa
333
<210> 32 <211> 111 <212> ПРТ <213> Мышь
<210> 33 <211> 364
<212> ДНК
<213> Мышь <400> 33
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaaac ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcgacc attagtgatg gtggtggtta cacctactat 180 ttagacaatg gacagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac 240 ctgcagatga gccatctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagagatgtg 300 ggacttacta cgttttggta ccttcgatgt ctggggcaca gggaccacgg tcaccgtctc 360 ctca 364
<210> 34 <211> 121 <212> ПРТ <213> Мышь
<211> 333
<212> ДНК
<213> Мышь
<400> 35
gacattgtgc tgacacagtc tcctgtttcc ttagttatat ctctggggca gagggccacc 60 atctcctgca gggccagcaa aagtgtcagt ccatctagct ataatttcat gcactggtac 120 caacagagac caggacagcc gcccaaactc ctcatcacgt atgcttccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aagaggatgc tgcaacatat tactgtcagc acagtaggga gtttccgttc 300 acgttcggag gggggaccag gctggaaata aaa 333
<210> 36 <211> 111 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 36 Asp I 1
<210> 37 <211> 363 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 37
gaagtacaac tagtggagtc tgggggaggc ttagtggagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagttt cacctactat 180 ctagacaatg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtat 240 ttgcaaatga gccatttgaa gtctgacgac acagccatgt attactgtgc aagagatgtg 300 ggacatacta cgttttggta cttcgatgtc tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363
<210> 38 <211> 121 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser His Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
110
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
120
Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
11С ion
115
<210> 39 <211> 333 <212> ДНК <213> Мышь
<400> 39
gacattgtgc tgacacagtc tcctgttttc ttagttatat ctctggggca gagggccacc 60 atctcctgca gggccagcaa aagtgtcagt gcatctggct ataatttcat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc gcccaaagtc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgtaacatat tactgtcagc acagtaggga gtttccgttc 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333
<210> 40 <211> 111 <212> ПРТ <213> Мышь
<400> 40
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Leu Val Ile Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ser
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Val Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 41 <211> 1353 <212> ДНК
<213> Химерная последовательность
<400> 41
gaaatgcaac tggtggagtc tggggaaggc ttagtggagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga gcctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagttt cacctactat 180 ctagacaatg taaggggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtat 240 ttgcaaatga gccatttgaa gtctgacgac acagccatgt attactgtgc aagagatgtg 300 ggacatacta ccttttggta cttcgatgtc tggggctcag ggacactagt gaccgtgtcc 360 agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgaacc ggtgaccgtg 480 tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gtaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagagct gtgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctggga 720 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780 cccgaggtga cctgtgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agcccaggga ggagcagtac 900 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960
aaggagtaca agtgtaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aag 1353
<210> 42 <211> 451 <212> ПРТ
<213> Химерная последовательность
Glu
Met
Gln
Leu
Val
Glu
Ser
Gly
Glu
Gly
Gly
Ser
Leu
Lys
Leu
20 Trp
5 Ser
Cys
Ala
Ala
Ser
Pro
Ala
Met
Ser
Ile
Val
Arg
Gln
Thr
Ser
Glu
Ala
Thr
Gly
Ser
Asp
Gly
Gly
Ser
Phe
Thr
Arg 65
Leu
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Leu
Arg
Asp
Asn
Gln
Met
Ser
His
Gly
Lys
Ser
Asp
Asp
Trp
Ala
Arg
Asp
Val 100
Leu
His
Thr
Thr
Phe 105 Ser
Ser
Gly
Thr 115
Val
Thr
Val
Ser 120
Ala
Val
Phe 130
Pro
Leu
Ala
Pro
Ser 135
Ser
Lys
Ser
Ala 145 Ser
Leu
Gly
Cys
Leu
Val 150 Ala
Lys
Asp
Tyr
Phe
Trp
Asn
Ser
Gly 165
Leu
Thr
Ser
Gly 170
Val
Leu
Gln
Ser 180 Ser
Ser
Gly
Leu
Tyr
Ser 185 Thr
Leu
Pro
Ser
Ser 195
Leu
Gly
Thr
Gln 200
Tyr
Lys
Pro 210
Ser
Asn
Thr
Lys
Val 215
Asp
Lys
Lys
Asp 225 Gly
Lys
Thr
His
Thr
Cys 230
Leu
Pro
Pro
Cys
Pro
Pro
Ser
Val
Phe 245 Pro
Phe
Pro
Pro
Lys
250 Val
Ile
Ser
Arg
Thr 260 Glu
Glu
Val
Thr
Cys 265 Trp
Glu
Asp
Pro 275 Ala
Val
Lys
Phe
Asn 280 Arg
Tyr
His
Asn 290 Val
Lys
Thr
Lys
Pro 295 Thr
Glu
Glu
Arg 305
Lys
Val
Ser
Val
Leu
310
Lys
Val
Leu
His
Glu
Tyr
Lys
Cys 325 Ser
Val
Ser
Asn
Lys
330 Gln
Glu
Lys
Thr
Ile 340 Pro
Lys
Ala
Lys
Gly 345 Glu
Tyr
Thr
Leu
355
Cys
Pro
Ser
Arg
Asp 360 Phe
Leu
Leu
Thr 370 Glu
Leu
Val
Lys
Gly 375 Pro
Tyr
Pro
Trp 385
Ser
Asn
Gly
Gln 390
Glu
Asn
Asn
Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
Lys Ser Leu Glu Trp Val
Tyr Tyr Leu Asp Asn Val 60
Ala Lys Asn Asn Leu Tyr 75 80 Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 95
Tyr Phe Asp Val Trp Gly 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala 140
Pro Glu Pro Val Thr Val 155 160 Val His Thr Phe Pro Ala 175
Ser Ser Val Val Thr Val 190
Ile Cys Asn Val Asn His 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met 255
Val Val Asp Val Ser His 270
Val Asp Gly Val Glu Val 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly
315 320 Ala Leu Pro Ala Pro Ile 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 43 <211> 654
<212> ДНК
<213> Химерная последовательность
<400> 43
gacattgtgc tgacacagtc tcctgttttc ttagttgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcctgta gggccagcaa aagtgtcagt gcagctggct ataatttcat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc gcccaaagtc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgtaacatat tactgtctgc acagtaggga gtttccgttc 300 acgttcggag gggggaccaa cctggaaata aaacgtacgg tggccgcccc cagcgtgttc 360 atcttccccc ccagcgatga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 420 aacaacttct acccccggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480 ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540 agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600 acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654
<210> 44 <211> 218 <212> ПРТ
<213> Химерная последовательность
Leu
Val
Val
Ser
Leu
15 Ala
Gly
Lys
Ser
Val
Ser
Gln
Ala
Lys
Pro
Gly
Gly
Pro
Pro
Glu
Ser
Thr
Cys
Val
Pro
Ala
Phe
Tyr
Leu Leu
Asn His
Ile
Ser 95
His
Arg
Asn
Leu
Glu
Ile 110
Lys
Arg
Pro
Pro
Ser 125
Asp
Glu
Gln
Leu
Leu
140
Asn
Asn
Phe
Tyr
Asp 155 Asp
Asn Ser
Ala
Lys
Leu Asp
Gln
Ser 175 Glu
Ser 160 Thr
Lys
Ala
Asp
Tyr 190 Ser
Lys
Gln
Gly
Leu
205
Ser
Pro
<400> 44
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe
1 5 10
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25 Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gln Gln 35 40
Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu
50 55 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Val Thr Tyr
85 90 Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr
100 105 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
115 120 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
130 135 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 145 150 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 165 170 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
180 185 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
195 200 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 45 <211> 1353
<212> ДНК
<213> Химерная последовательность
<400> 45
gaagtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtggagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagttt cacctactat 180 ctagacaatg taaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtat 240 ttgcaaatga gccatttgaa gtctgacgac acagccatgt attactgtgc aagagatgtg 300 ggacatacta cgttttggta cttcgatgtc tggggcacag ggacactagt gaccgtgtcc 360 agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgaacc ggtgaccgtg 480 tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gtaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagagct gtgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctggga 720 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780 cccgaggtga cctgtgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agcccaggga ggagcagtac 900 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgtaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aag 1353
<210> 46 <211> 451
<212> ПРТ
<213> Химерная последовательность
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser His Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Thr Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
450
Pro Gly Lys
<210> 47 <211> 654
<212> ДНК
<213> Химерная последовательность
<400> 47
gacattgtgc tgacacagtc tcctgttttc ttagttatat ctctggggca gagggccacc 60 atctcctgca gggccagcaa aagtgtcagt gcatctggct ataatttcat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc gcccaaagtc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgtaacatat tactgtcagc acagtaggga gtttccgttc 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgtacgg tggccgcccc cagcgtgttc 360 atcttccccc ccagcgatga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 420 aacaacttct acccccggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480 ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540 agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600 acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654
<210> 48 <211> 218 <212> ПРТ
<213> Химерная последовательность
<400> 48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Phe Leu Val Ile Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ser
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
65 70
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly 100
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
115
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 130 135 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 145 150
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
165
m, o^,^ T^,, o^,^ o^,^ m "u " т " ¦¦,
180
195
Thr Lys Ser Phe Asn Arg 210 215
Gly
Thr
Asp
Phe 75
Thr
Leu
Asn
Ile
His
Val
Thr
Tyr
Thr
Tyr
Cys
Gln
His
Ser 95
Lys
Arg
Gly
Gly 105
Ile
Lys
Leu
Glu
Ile 110 Asp
Arg
Phe 120 Val
Phe
Pro
Pro
Ser 125 Asn
Glu
Gln
Val
Cys
Leu
Leu
140
Asn
Phe
Tyr
Trp
Lys
Val
Asp 155 Asp
Asn
Ala
Leu
Gln
Ser 160 Thr
Thr
Glu
Gln 170
Ser
Ser
Lys
Asp
Ser 175 Glu
Thr
Leu
185 Thr
Lys
Ala
Asp
Tyr 190 Ser
Lys
Val 200 Gly
His
Gln
Gly
Leu
205
Ser
Pro
Glu
Cys
<210> 49 <211> 294 <212> ДНК
<213> Homo Sapiens
<400> 49
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 50 <211> 98
<212> ПРТ <213> Человек
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 51 <211> 300 <212> ДНК
<213> Homo Sapiens
<400> 51
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact
tttactgggc atctacccgg 180 ggacagattt cactctcacc 240 gtcagcaata ttatagtact 300
<210> 52 <211> 100 <212> ПРТ
<213> Homo Sapiens
10 15 Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Se
25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gl
40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Va 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Th 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gl 90 95
<210> 53 <211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo Sapiens и Mus musculus
<400> 53
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtccagc ccggcgggag cctgagactc 60 tcttgcgccg ctagcggctt caccttcagc aactacgcca tgagctgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccacc atcagcgacg gcggcagctt cacctactat 180 ctggacaacg tgaggggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt actactgcgc cagggacgtc 300 ggccacacca ccttctggta cttcgacgtc tggggcaggg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363
<210> 54 <211> 121 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo Sapiens и Mus musculus
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
110
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
120
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
lie ion
115
<210> 55
<211> 363
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus <400> 55
gagatgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtccagc ccggcgggag cctgagactc 60 tcttgcgccg ctagcggctt caccttcagc aactacgcca tgagctgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccacc atcagcgacg gcggcagctt cacctactat 180 ctggacaacg tgaggggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt actactgcgc cagggacgtc 300 ggccacacca ccttctggta cttcgacgtc tggggcaggg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363
<210> 56 <211> 121
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<210> 57 <211> 363 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo Sapiens и Mus musculus
<400> 57
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtccagc ccggcgggag cctgagactc 60 tcttgcgccg ctagcggctt caccttcagc aactacgcca tgagctgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccacc atcagcgacg gcggcagctt cacctactat 180 ctggacaacg tgaggggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt actactgcgc cagggacgtc 300 ggccacacca ccttctggta cttcgacgtc tggggctccg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agc 363
<210> 58 <211> 121 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<210> 59 <211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 59
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga aagggccacc 60 atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct acaacttcat gcactggtac 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctact acgcctccaa cctggagagc 180 ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatctca 240 agcctgcagg ccgaggacgt cgccgtgtac tactgcctgc acagcaggga gttccccttc 300 acctttggcg gcggcaccaa ggtggagatc aag 333
<210> 60 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61 <211> 333 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 61
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga aagggccacc 60 atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct acaacttcat gcactggtac 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaaggtg ctgatctact acgcctccaa cctggagagc 180 ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatctca 240 agcctgcagg ccgaggacgt cgccgtgtac tactgcctgc acagcaggga gttccccttc 300 acctttggcg gcggcaccaa ggtggagatc aag 333
<210> 62 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
Val
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Asp
Ser 10
Leu
Ala
Thr
Phe
Ile
Asn
Cys
Arg
Ala
Gln
Ser
Lys
Asn 35
Leu
Met
His
Trp
Tyr
Ser
Gln
Lys
Ile
Tyr
Tyr
Ala 55
Asn
Leu
Glu
Ser
Gly
Ser
Gly
Asp
Ser
Gly
Thr
Asp
Phe
Tyr
Gln
Ala
Glu
Thr
Val
Ala
Val
Tyr
Thr
Pro
Phe 100
Phe
Gly
Gly
Gly 105
Lys
<400> 62 Asp Ile
1 5 10 15
Val Ser Al 30
Gly Gln Pr 45
Gly Val Pr
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
His Ser
Ile Ly 110
<210> 63 <211> 333 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 63
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga aagggccacc 60 atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct acaacttcat gcactggtac 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctact acgcctccaa cctggagagc 180 ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatctca 240 agcctgcagg ccgaggacgt cgtggtgtac tactgcctgc acagcaggga gttccccttc 300 acctttggcg gcggcaccaa ggtggagatc aag 333
<210> 64 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 64
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Val Val Tyr Tyr Cys Leu His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 65 <211> 333
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 65
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga aagggccacc 60 atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct acaacttcat gcactggtac 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatctact acgcctccaa cctggagagc 180 ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatctca 240 agcctgcagg ccgaggacgt cgccgtgtac tactgcctgc acagcaggga gttccccttc 300 acctttggcg gcggcaccaa cgtggagatc aag 333
<210> 66 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
Val
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Asp
Ser
Ser
Leu
Ala
Thr
Phe
Ile
Asn
Cys
Arg
Ala
Gln
Lys
Asn 35
Met
His
Trp
Tyr 40
Gln
Lys
Leu
Ile
Tyr
Tyr
Ala
Ser
Ser
Asn
Leu
Glu
Ser
Gly
Ser
Gly 70
Gly
Thr
Asp
Phe 75
Gln
Ala
Glu 85 Thr
Asp
Val
Ala
Val
Tyr 90 Thr
Tyr
Pro
Phe
Phe
Gly
Gly
Gly
Asn
<400> 66
sp Ile V
1 5 10 15
Val Ser Al 30
Gly Gln Pr 45
Gly Val Pr
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
Se 95
T T , s
100
105
110
<210> 67 <211> 333 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 67
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga aagggccacc 60 atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct acaacttcat gcactggtac 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaaggtg ctgatctact acgcctccaa cctggagagc 180 ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatctca 240 agcctgcagg ccgaggacgt cgtggtgtac tactgcctgc acagcaggga gttccccttc 300 acctttggcg gcggcaccaa cgtggagatc aag 333
<210> 68 <211> 111 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
Val
Met
Thr
Gln
Ser
Pro
Asp
Ser 10
Leu
Ala
Thr
Phe
Ile
Asn
Cys
Arg
Ala
Gln
Ser
Lys
Asn 35
Leu
Met
His
Trp
Tyr
Ser
Gln
Lys
Ile
Tyr
Tyr
Ala 55
Asn
Leu
Glu
Ser
Gly
Ser
Gly
Asp
Ser
Gly
Thr
Asp
Phe
Tyr
Gln
Ala
Glu
Thr
Val
Val
Val
Tyr
Thr
Pro
Phe 100
Phe
Gly
Gly
Gly 105
Asn
<400> 68 Asp Ile
1 5 10 15
Val Ser Al 30
Gly Gln Pr 45
Gly Val Pr
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75 80
His Ser
Ile Ly 110
<210> 69 <211> 1353 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 69
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtccagc ccggcgggag cctgagactc 60 tcttgcgccg ctagcggctt caccttcagc aactacgcca tgagctgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccacc atcagcgacg gcggcagctt cacctactat 180 ctggacaacg tgaggggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt actactgcgc cagggacgtc 300 ggccacacca ccttctggta cttcgacgtc tggggcaggg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgaacc ggtgaccgtg 480 tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gtaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gtgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctggga 720 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780 cccgaggtga cctgtgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agcccaggga ggagcagtac 900 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgtaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aag 1353
<210> 70 <211> 451 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 71 <211> 654
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 71
gacatcgtga tgactcagag ccccgatagc ctggccgtga gcctgggcga aagggccacc 60 atcaactgca gggccagcaa gagcgtgagc gctgccggct acaacttcat gcactggtac 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaaggtg ctgatctact acgcctccaa cctggagagc 180 ggcgtgccag acaggttcag cggatctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatctca 240 agcctgcagg ccgaggacgt cgccgtgtac tactgcctgc acagcaggga gttccccttc 300 acctttggcg gcggcaccaa ggtggagatc aagcgtacgg tggccgcccc cagcgtgttc 360 atcttccccc ccagcgatga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 420 aacaacttct acccccggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480 ggcaacagcc aggagagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540 agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600 acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654
<210> 72 <211> 218 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 72
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ala Ala
20 25 30
Gly Tyr Asn Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu His Ser Arg
85 90 95
Glu Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
215
<210> 73
<211> 360
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 73
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtccagc ccggcgggag cctgagactc 60 tcttgcgccg ctagcggctt caccttcagc tacgccatga gctgggtgag gcaggccccc 120 ggcaagggcc tggagtgggt ggccaccatc agcgacggcg gcagcttcac ctactatctg 180 gacaacgtga ggggcaggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacag cctgtacctg 240 cagatgaaca gcctgagggc cgaggatacc gccgtgtact actgcgccag ggacgtcggc 300 cacaccacct tctggtactt cgacgtctgg ggcaggggca cactagtgac cgtgtccagc 360
<210> 74 <211> 121
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
Glu 1
Ser
Val
Gln
Leu
Val
Glu
Ser
Gly
Gly
Leu
Arg
Leu
20 Trp
Ser
Cys
Ala
Ala
Ser
Pro
Ala
Met
Ser 35
Ile
Val
Arg
Gln
Ala
Ser
Ala
Thr
Gly
Ser
Asp
Gly
Gly
Ser
Phe
Arg 65
Arg
Phe
Thr
Ile 70
Arg
Asp
Leu
Gln
Met
Asn
Ser
Gly
Leu
Arg
Ala
Glu
Ala
Arg
Asp
Val 100
Leu
His
Thr
Thr
Phe 105 Ser
Arg
Gly
Thr 115
Val
Thr
Val
Ser 120
10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ty 30
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Va
Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Va 60
Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ty 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cy 90 95 Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gl 110
<210> 75 <211> 1353 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 75
gaggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc ctggtccagc ccggcgggag cctgagactc 60 tcttgcgccg ctagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccacc atcagcgacg gcggcagctt cacctactat 180 ctggacaacg tgaggggcag gttcaccatc agcagggaca acgccaagaa cagcctgtac 240 ctgcagatga acagcctgag ggccgaggat accgccgtgt actactgcgc cagggacgtc 300 ggccacacca ccttctggta cttcgacgtc tggggcaggg gcacactagt gaccgtgtcc 360 agcgccagca ccaagggccc cagcgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtg aaggactact tccccgaacc ggtgaccgtg 480 tcctggaaca gcggagccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg accgtgccca gcagcagcct gggcacccag 600 acctacatct gtaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660 cccaagagct gtgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctggga 720 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780 cccgaggtga cctgtgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agcccaggga ggagcagtac 900 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgtaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aag 1353
<210> 76 <211> 451 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Leu Asp Asn Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Gly His Thr Thr Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp 225 Gly
Lys Pro
Thr Ser
His Val
Thr
Phe 245 Pro
Cys 230
Leu
Ile
Ser
Arg
Thr 260
Glu
Glu
Glu
Asp
Pro 275 Ala
Val
Lys
His
Asn 290
Val
Lys
Thr
Lys
Arg 305
Val
Ser
Val
Leu 310
Lys
Glu
Tyr
Lys
Cys 325 Ser
Lys
Glu
Lys
Thr
Ile 340
Lys
Tyr
Thr
Leu
355
Cys
Pro
Pro
Ser
Leu
Thr 370
Glu
Leu
Leu
Val
Lys
Trp 385 Val
Ser Asp
Asn Ser
Gly
Asp 405 Trp
Gln 390 Gly
Asp
Lys
Ser
Arg 420
Gln
His
Glu
Ala 435
Lys
Leu
His
Asn
Pro
Gly
450
Pro
Pro
Cys
Pro
Ala 235
Phe
Pro
Pro
Lys
250 Val
Pro
Val
Thr
Cys 265
Val
Phe
Asn 280
Trp
Tyr
Val
Pro 295 Thr
Arg
Glu
Glu
Gln
Val
Leu
His
Gln 315 Ala
Val
Ser
Asn
Lys
330 Gln
Ala
Lys
Gly 345 Glu
Pro
Arg
Asp 360 Phe
Leu
Thr
Gly 375
Tyr
Pro
Ser
Pro
Glu
Asn
Asn
Tyr 395
Ser
Phe
Phe
Leu
410 Val
Tyr
Gln
Gly
Asn 425 Thr
Phe
His
Tyr 440
Gln
Lys
Pro
Glu
Leu
Leu
Gly 240
Lys
Asp
Thr
Leu
255 Ser
Met
Val
Asp
Val 270 Val
His
Asp
Gly 285
Glu
Val
Tyr 300
Asn
Ser
Thr
Tyr
Asp
Trp
Leu
Asn
Gly 320 Ile
Leu
Pro
Ala
Pro 335 Gln
Arg
Glu
Pro 350 Gln
Val
Lys
Asn 365 Ile
Val
Ser
Asp 380
Ala
Val
Glu
Lys
Thr
Thr
Pro
Pro 400 Val
Ser
Lys
Leu
Thr 415 Val
Ser
Cys
Ser 430
Met
Ser
Leu
445
Ser
Leu
Ser
<210> 77
<211> 5
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 77
Ser Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 78 <211> 7 <212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 78
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 79 <211> 450 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 79
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
Gly
Val
His
Ile
Trp
Val
Arg
Gln
Ala
Ser
Pro
Ala
Val 50
Trp
Arg
Gly
Gly 55
Thr
Ser 65 Gln
Arg
Phe
Thr
Ile
Ser 70 Arg
Lys
Asp
Asn
Met
Asn
Ser
Leu
85 Ser
Ala
Glu
Asp
Lys
Ser
Pro
Asn 100 Val
Asn
Phe
Tyr
Trp 105 Ala
Gly
Thr
Leu
115
Leu
Thr
Val
Ser
Ser 120
Lys
Phe
Pro 130 Gly
Ala
Pro
Ser
Ser 135 Asp
Ser
Leu
145
Cys
Leu
Val
Lys
150
Tyr
Phe
Trp
Asn
Ser
Gly
Ala 165 Gly
Leu
Thr
Ser
Gly
Leu
Gln
Ser
Ser
1 on
Leu
Tyr
Ser
Leu
IOC
Leu Gl 45
7\ 1 ^ 7\ 1 -
75 80 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 90 95 Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val
170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
Thr 310 Val
Val
Leu
His
Gln
Asp 315
Leu
Trp
Leu
Asn
Ser
Asn
Lys
Ala 330 Pro
Pro
Ala
Pro
Ala
Lys
Gly
Gln 345
Leu
Arg
Glu
Pro
Gln 350 Val
Arg
Asp
Glu 360 Tyr
Thr
Lys
Asn
Gln 365 Ala
Gly
Phe 375 Glu
Pro
Ser
Asp
Ile 380 Thr
Val
Pro 390
Asn
Asn
Tyr
Lys
395
Thr
Pro
Ser
Phe
Phe
Leu
Tyr 410 Phe
Ser
Lys
Leu
Thr
Gln
Gly
Asn
Val 425 Gln
Ser
Cys
Ser
Val 430
Leu
His
Tyr
Thr 440
Lys
Ser
Leu
Ser 445
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340
Thr Leu Pro Pro S 355
Thr Cys Leu Val L 370
Glu Ser Asn Gly G
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420
435
Gly Lys
450
<210> 80 <211> 213 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<223> Homo sapiens и Mus musculus
Val
Leu
Thr
Gln
Ser
Pro
Ala
Thr
Ser
Leu
Ala
Thr 20
Gln
Leu
Ser
Cys
Ser
Gly
Gln
Ser
Tyr
Ser
Gln
Lys
Pro
Gly
Gly
Ala
Pro
Asn
Leu
Ala
Ser
Thr
Ile
Pro
Ala
Gly
Thr
Asp
Tyr 70
Leu
Thr
Ile
Ser 75
Ala
Val
Tyr
Thr
Tyr
Cys
Gln
Gln
Trp
Lys
Ser
Gln
Gly 100
Ile
Lys
Leu
Glu
Ile 105 Asp
Arg
Phe 115
Val
Phe
Pro
Pro
Ser 120 Asn
Glu
Gln
Val
Cys
Leu
Leu
135
Asn
Phe
Tyr
Trp
Lys
Val
Asp 150 Asp
Asn
Ala
Leu
Gln
Ser 155 Thr
Thr
Glu
Gln
165
Ser
Ser
Lys
Asp
Ser 170 Glu
Thr
Leu 180 Thr
Lys
Ala
Asp
Tyr 185 Ser
Lys
Val
195
Gly
His
Gln
Gly
Leu
200
Ser
Pro
Glu
Cys
<400> 80
Glu Ile
1 5 10 15
r Val Ser Ty 30
Leu Leu Il
g Phe Ser Gl
50 55 60
Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser As
65 70 75 80
Tyr Pro Pro
Val Ala Al 110
Lys Ser Gl
125
Arg Glu Al
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Leu Ser
175
Lys Val Tyr 190
Thr Lys Ser 205
Gly Glu Cys
210
<210> 81 <211> 120
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Homo sapiens и Mus musculus
Gln
Leu
Val 5
Arg
Leu
Ser
His
Ile
Trp Trp
Val Arg
Phe
Thr
Ile
<400> 81 Gln Val
1 5 10 15
er Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr As
25 30
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gl
40 45
Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Al
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys As
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Ser Pro Asn Ser Asn Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<211> 106 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<223> Homo sapiens и Mus musculus
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
1 5 10
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Gly Ser
20 25 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50 55 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 65 70 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 85 90
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
Leu
Ser
Leu
Ser
Pro 15
Gly
Ser
Ser
Val
Ser 30
Leu
Tyr
Met
Pro
Arg
Leu
Phe
Ile
Glu
Ala
Arg 60
Ser
Gly
Ser
Ser 75
Ser
Asn Ser
Leu Tyr
Glu Pro
Pro
Pro 95
Glu
80 Thr
<210> 83 <211> 759
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 83
atgggggtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcggc tataggcagc tgctcgaaag agtaccgcgt gctccttggc 120 cagctccaga agcagacaga tctcatgcag gacaccagca gactcctgga cccctatata 180 cgtatccaag gcctggatgt tcctaaactg agagagcact gcagggagcg ccccggggcc 240 ttccccagtg aggagaccct gagggggctg ggcaggcggg gcttcctgca gaccctcaat 300 gccacactgg gctgcgtcct gcacagactg gccgacttag agcagcgcct ccccaaggcc 360 caggatttgg agaggtctgg gctgaacatc gaggacttgg agaagctgca gatggcgagg 420 ccgaacatcc tcgggctcag gaacaacatc tactgcatgg cccagctgct ggacaactca 480 gacacggctg agcccacgaa ggctggccgg ggggcctctc agccgcccac ccccacccct 540 gcctcggatg cttttcagcg caagctggag ggctgcaggt tcctgcatgg ctaccatcgc 600 ttcatgcact cagtggggcg ggtcttcagc aagtgggggg agagcccgaa ccggagccgg 660 agacacagcc cccaccaggc cctgaggaag ggggtgcgca ggaccagacc ctccaggaaa 720 ggcaagagac tcatgaccag gggacagctg ccccggtag 759
<210> 84 <211> 252
<212> ПРТ
<213> Homo sapiens
<400> 84
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser
20 25 30
Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gln Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu
35 40 45
Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly
50 55 60
Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala
65 70 75 80
Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu
85 90 95
Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys Val Leu His Arg Leu Ala Asp
100 105 110
Leu Glu Gln Arg Leu Pro Lys Ala Gln Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu
115 120 125
Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu
130 135 140
Gly 145 Asp
Leu
Arg
Asn
Asn
Ile 150 Thr
Tyr
Cys
Met
Ala
Gln 155 Gly
Leu
Leu
Asp
Asn
Ser 160 Pro
Thr
Ala
Glu
Pro 165 Ala
Lys
Ala
Gly
Arg 170 Gln
Ala
Ser
Gln
Pro 175 Gly
Thr
Pro
Thr
Pro 180 His
Ser
Asp
Ala
Phe 185 Phe
Arg
Lys
Leu
Glu 190 Gly
Cys
Arg
Phe
Leu
195
Lys
Gly
Tyr
His
Arg 200 Pro
Met
His
Ser
Val 205 Arg
Arg
Val
Phe
Ser 210 Gln
Trp
Gly
Glu
Ser 215 Gly
Asn
Arg
Ser
Arg 220 Arg
His
Ser
Pro
His 225 Gly
Ala
Leu
Arg
Lys
230 Thr
Val
Arg
Arg
Thr 235 Pro
Pro
Ser
Arg
Lys
240
Lys
Arg
Leu
Met 245
Arg
Gly
Gln
Leu
250
Arg
1. Антигенсвязывающий белок, специфично связывающийся с онкостатином М (OSM) и ингибирующий связывание OSM с рецептором др130, но не взаимодействующий непосредственно с остатками сайта II.
2. Антигенсвязывающий белок по п. 1, не связывающийся непосредственно ни с одним из остатков Q20, G120, Q16 и N124.
3. Антигенсвязывающий белок по п. 1, взаимодействующий с одним или более из остатков 82, 83, 84, 90, 94, 112,115, 122, 123, 152 человеческого OSM.
4. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-3, содержащий гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи (CDRH3) SEQ ID N0:3 или вариант SEQ ID N0:3, содержащий одно или более из следующего:
замены на Ala, Glu, Gly, His, Leu, Met, Pro, Gln, Ser, Thr или Val в положении 95;
замены на Ala, Cys, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Ser, Thr, Trp или Туг в положении 96;
замены на Ala, Cys, Phe, Met или Ser в положении 97; замены на Ala, Asp, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln или Trp в положении 98; замены на Ala, Cys, Pro, Ser, Val или Туг в положении 99; замены на Glu в положении 100В;
замены на Ala, Glu, Phe, Gly, Val или Trp в положении 100C;
замены на Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Leu, Ser, Thr, Val, Trp или Туг в положении 100D;
замены на Glu, Gly, Ser, Thr или Val в положении 101;
замены на Ala, Phe, Gly, Leu, Pro, Gln, Arg, Ser, Tyr, His, lie, Asp или Trp в положении 102.
5. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-3, содержащий:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID N0:3, или вариант SEQ ID N0:3, где Val102 заменен на Туг, His, Не, Ser, Asp или Gly;
2) гипервариабельный участок 2 тяжелой цепи (CDRH2), как изложено в SEQ ID N0:2, или вариант SEQ ID N0:2, где Thr50 заменен на Gly, Туг, Phe, Не, Glu или Val, и/или Пе51 заменен на Leu, Val, Thr, Ser или Asn, и/или Ser52 заменен на Phe, Тгр или His, и/или Gly53 заменен на Asp, Ser или Asn, и/или
1)
Gly54 заменен на Ser, и/или Phe56 заменен на Ser, Туг, Thr, Asn, Asp или Arg, и/или Туг58 заменен на Gly, His, Phe, Asp или Asn;
3) гипервариабельный участок 1 легкой цепи (CDRL1), как изложено в SEQ ID N0:4, или вариант SEQ ID N0:4, где Ser27A заменен на Asn, Asp, Thr или Glu, и/или Ser27C заменен на Asp, Leu, Туг, Val, lie, Asn, Phe, His, Gly или Thr, и/или Asn 31 заменен на Ser, Thr, Lys или Gly, и/или Phe32 заменен на Туг, Asn, Ala, His, Ser или Arg, и/или Met33 заменен на Leu, Val, lie или Phe;
4) гипервариабельный участок 3 легкой цепи (CDRL3), как изложено в SEQ ID N0:6, или вариант SEQ ID N0:6, где Leu89 заменен на Gln, Ser, Gly или Phe, и/или His90 заменен на Gln или Asn, Ser91 заменен на Asn, Phe, Gly, Arg, Asp, His, Thr, Туг или Val, и/или Arg92 заменен на Asn, Туг, Trp, Thr, Ser, Gln, His, Ala или Asp, и/или Glu93 заменен на Asn, Gly, His, Thr, Ser, Ar или Ala, и/или Phe96 заменен на Pro, Leu, Tyr, Arg, lie или Trp.
6. Антигенсвязывающий белок по п. 5, дополнительно содержащий:
1) гипервариабельный участок 1 тяжелой цепи (CDRH1), как изложено в SEQ ID N0:1, или вариант SEQ ID N0:1, где Туг32 заменен на lie, His, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu или Asp, и/или Ala33 заменен на Туг, Trp, Gly, Thr, Leu или Val, и/или Met34 заменен на lie, Val или Тгр, и/или Ser35 заменен на His, Glu, Asn, Gln, Туг или Thr.
2) гипервариабельный участок 2 легкой цепи (CDRL2), как изложено в SEQ ID N0:5.
7. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-6, содержащий CDRH3
с SEQ ID N0:3, CDRH2 с SEQ ID N0:2, CDRL1 с SEQ ID N0:4 и CDRL3 с SEQ ID
N0:6.
8. Антигенсвязывающий белок по п. 7, дополнительно содержащий
CDRH1 с SEQ ID N0:1 и CDRL2 с SEQ ID N0:5.
9. Антигенсвязывающий белок по п. 8, содержащий:
1) CDRH3, как изложено в SEQ ID N0:3;
2) CDRH1, как изложено в SEQ ID N0:1;
3) CDRH2, как изложено в SEQ ID N0:2;
4) CDRL1, как изложено в SEQ ID N0:4;
5) CDRL2, как изложено в SEQ ID N0:5;
6) CDRL3, как изложено в SEQ ID N0:6; и
7) каркасную область тяжелой цепи, содержащую следующие остатки:
Val, Не или Gly в положении 2;
Leu или Val в положении 4;
Leu, lie, Met или Val в положении 20;
Cys в положении 22;
Thr, Ala, Val, Gly или Ser в положении 24;
Gly в положении 26;
lie, Phe, Leu или Ser в положении 29;
Тгр в положении 36;
Тгр в положении 47;
lie, Met, Val или Leu в положении 48;
lie, Leu, Phe, Met или Val в положении 69;
Arg в положении 71;
Ala, Leu, Val, Туг или Phe в положении 78; Leu, Met в положении 80; Туг или Phe в положении 90; Cys в положении 92;
Arg, Lys, Gly, Ser, His или Asn в положении 94.
10. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-9, не
взаимодействующий непосредственно через CDRH1 или CDRL2 с OSM.
11. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащий вариабельный домен тяжелой цепи, кодируемый SEQ ID N0:73, и вариабельный домен легкой цепи, кодируемый SEQ ID N0:71.
12. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащий вариабельный домен тяжелой цепи с SEQ ID N0:74 и вариабельный домен легкой цепи с SEQ ID N0:72.
13. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-12, представляющий собой гуманизированное антитело.
14. Антигенсвязывающий белок по п. 13, где антитело представляет собой lgG1.
15. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 13-14, при связывании которого с OSM сокристалл содержит элементарную ячейку, имеющую
11.
приблизительно следующие размеры: а = 168,525 A, b = 81,614 А, с = 55,540 А и бета = 106,60 градусов.
16. Антигенсвязывающий белок, содержащий гипервариабельный
участок (CDR) по любому из пп. 1-10, представляющий собой фрагмент,
являющийся Fab, Fab', F(ab')2, Fv, диателом, триателом, тетрателом,
миниантителом, минителом, выделенным вариабельным доменом тяжелой
цепи (VH) или выделенным вариабельным доменом легкой цепи (VL).
17. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-16, дополнительно связывающийся с OSM примата, не являющегося человеком.
18. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-17, связывающийся с OSM с аффинностью менее 40 пМ.
19. Антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-18, не конкурирующий с антителом, имеющим тяжелую цепь с SEQ ID N0:79 и легкую цепь с SEQ ID N0:80, в конкурентном твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA-анализе).
20. Антигенсвязывающий белок, конкурирующий с антигенсвязывающим белком по любому из пп. 1-19.
21. Антигенсвязывающий белок, связывающийся как с OSM игрунки, так и с OSM человека с аффинностью выше 1 нМ при измерении посредством Biacore или Kinexa.
22. Рекомбинантная трансформированная, трансфицированная или трансдуцированная клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антигенсвязывающего белка по п. 12, и дополнительно содержащую полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антигенсвязывающего белка по п. 12.
23. Клетка-хозяин по п. 22, представляющая собой клетку млекопитающего.
24. Клетка-хозяин по п. 23, представляющая собой клетку СНО (клетка яичника китайского хомячка) или NS0 (клетка миеломы мыши).
25. Фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязывающий белок по любому из пп. 1-21 и фармацевтически приемлемый носитель.
22.
26. Способ лечения пациента-человека, пораженного воспалительным расстройством или заболеванием, включающий стадию введения композиции по п. 25.
27. Применение композиции по п. 25 в лечении пациента-человека, пораженного воспалительной артропатией, ревматоидным артритом, остеоартритом, идиопатическим фиброзом легких (IPF), системным склерозом, синдромом Шегрена, склеродермией и/или псориазом.
28. Способ гуманизации антитела, не являющегося человеческим антителом, или его фрагмента, включающий стадии:
а) переноса одного или более CDR, не являющихся человеческими CDR,
на человеческую акцепторную каркасную область с получением химерного или
гуманизированного антитела;
б) связывания химерного или гуманизированного антитела с его
антигеном;
в) определения эпитопной/паратопной структуры антитела, связанного с
антигеном;
г) определения остатков антитела, непосредственно вовлеченных в
связывание с антигеном;
д) мутирования одного или более остатков, не вовлеченных в стадию (г),
с их заменой остатками человеческой эмбриональной последовательности;
е) выделения указанного антитела.
29. Антитело, получаемое способом по п. 28.
29.
о; s i
со о
CL S
80 60 40 20
Фиг. 1: ELISA с человеческим др130
I ! I l| I-ГТ-ГТТТТ]-
l l l I I 111 I II I III I
¦ ш
I0G8/A9
9G2/C1
ЗЕЗ/А!
2В7.-А6
15 Е Ю mAb
отрицательного контроля
.7 - W, -~ V- Д" V ¦ -
•JJLL-1 I I Lt.l L__ij Ul_U_Llll J LLXLUJL
100
s i
е-о
гиб
-20
"1 I. ¦
ф If
-•- ICG8.A9
-Щ- 9G2C1
<н ?ЕЗ/А1
^ Г'ВГЛО
15 ЕЮ mAb
"V" отрицательного контроля
о; s i
со о
CL S
80 60 40 20 О -20
0,001 0,01 0,1 1
Концентрация антитела (мкг/мл)
со о
CL S
S |_
I 120 !00
10 мкг/мл
1 мкг/мл
0,1 мкг/мл
-10G8 SG2 ЗЕТ
15Е10
mAb отрицательного контроля
Концентрация mAb (мкг/мл)
ТТЛ] 1-I I I I I 11| 1-I I I I I И| 1-I МММ
о; s i
со о
CL S
40 -
А +
• +
* 10G8/A9 -Щ- 9G2CI -А- ЗЕЗ/А1
2В7/А6 15 ЕЮ
+ mAb против LIF mAb
А/- отрицательного контроля
0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 6: КВ-клеточный анализ
о; s i
со о
CL S
100 80
60 40
20 h О -20
т^т^гтгп
* V ¦ # "
¦ I0G6/A9
* 9G2G1 t ЗЕЗ.'А I
2В?/А6
If:. ЕЮ mAb
V отрицательного контроля
JL_J_J_J_L
J_J_J_JJJJ
0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 7
Е V Q L V Е
SLKLSCAASG
^
Большинство
2В7 VH белок ЗЕЗ VH белок 9G2 VH белок 10G8 VH белок
Большинство
2В7 VH белок ЗЕЗ VH белок 9G2 VH белок 10G8 VH белок
Большинство
121 3
121 S
121 S
121 S
2В7 VH белок ЗЕЗ VH белок 9G2 VH белок 10G8 VH белок
Обозначение "Обозначение 1": последовательности
остатки в рамках, отличающиеся от консенсуснои
Фиг. 8
l'o 1
2'о 1
з'о 1
ГП L
F Т
_FJ L
4'о 1
5'о
б'с
1 i
7'о 1
о'о 1
э'с
Большинство
2В7 VL белок ЗЕЗ VL белок 9G2 VT, белок 10G8 YL белок
Большинство
2В7 VL белок ЗЕЗ VL белок 9G2 VL белок
10G8 YL белок
Большинство
2В7 VL белок ЗЕЗ VL белок 9G2 VL белок 10G8 YL белок
Большинство
91 91 91 91
У с у Н 5
rF~] С У Н S
Y С У Н S
Y С| ГЕ~| II-9-
Г Е> F Т F Р F Т F Р F Т ¦F-e-F-f]
Т G~
F С
F G
F G
Т [R_ L Е
Т К L Е
Т К L Е
Т [W L Е
110
¦+¦
I I I
2В7 VL белок ЗЕЗ VL белок 9G2 VL белок 10G8 YL белок
Обозна1 ение "Обозначение 1": последовательности
остатки в рамках, отличающиеся от консенсуснои
Фиг. 9
Белок 9G2 VL
¦ Белок 10G8 VL
¦ Белок2В7 VL ¦Белок ЗЕЗ VL
¦ Белок15Е10 VL
28,в.
25 20 15 10
Нуклеотидные замены (хЮО)
Процент идентичности
Белок 2В7 VH Белок ЗЕЗ VH Белок 9G2 VH Белок10G8 VH 15Е10 VH
40,0.
30 25 20 15
Нуклеотидные замены (хЮО)
WflP"aVi"]j|
15Е10 VH Белок 2В7 VH Белок ЗЕЗ VH Белок 9G2 VH Белок 10G8 VH
1,2
8 1
I-о
5 0,8
о т
0,6
0,4
? 0,2 х
& 0
0,001
0,01 0,1 1
Концентрация антитела (нМ)
¦Химерное 10G8
- Химерное 9G2 Химерное 15Е10
¦ Отриц. контроль
Фиг. 12: ELISA с человеческим др130
100 80
40 20 0 -20
го 60
IO S |_
CL-
ГШ] 1-I I I I I И| 1-I I I I I 11|
/ /
.А /
у-^ -у ^
1111| I || I I I I I I 1111
-•- 10G8
--в- 10G8Ch
A 9G2
L У G2C П
15 ЕЮ mAb
-^г.. отрицательного контроля
0,01 0,1 1
Концентрация антитела (мкг/мл)
О ими 1-i i 1111! | 1-i ммм! 1-1 I I ! I 11|
о о
О О О О
¦ л'
-Ў • Т
II ''А .
nnl' ^ I I М М III | I |
-#- 10G8
10G8Ch -A- 9G2
... 9G2Ch
-Ў- 15 ЕЮ
mAb
отрицательного контроля
0,001 0,01 0,1 1
Концентрация антитела (мкг/мл)
У 1-й
mAb
отрицательного контроля
0,001 0,01 0,1 1
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 15: Анализ эндогенного OSM с человеческим др130
120
100
80 НО 40 20
0 -20 -40 -60
\\\\\ 1
1 1 1 1ПЦ 1 !
ЧИИ| !
1 1 1 ПК! 1
1 1 !Ы1|
' А
.,Ў
...
'Х-
JUJ! L
Jjjjjjj_±_i.
JUJJJjJ_±_
L±HJl\
-ф~ IQG6 lOGSCh
A 9G2
9G2Ch
-f- 15 ЕЮ mAb
w отрицательного контроля
0,001 0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
I го ш о
CL S
Фиг.
100 30 50 40 У) 0
-20
-?о
-S0 -100
16: КВ-клеточный анализ с человеческим LIF
ТТТТ] I I I • t i ;> '| I I I I I I ||[ ! 1 ГТТТТТ
- ' * + 1- t " -
т 4
J-LUll I i...X.i.i.J..i~l J L.,1 lMi
0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
-D-
H0L1
H1L1 H2L1
-О-
H0L4
-V-
H1L4
-о-
H2L4
Химерное 10G8
15E10h
0,001 0,01 0,1 1
Концентрация антитела (мкг/мл)
H0L1 H1L1 H2L1
Химерное 10G8
15E10h
mAb
отрицательного контроля
0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 19: Комплекс связывания человеческого OSM с mAb 10G8
Сайт II OSM
, Q20;G120;
Q16; N124
Сайт III OSM
F160; К163
> OSM
Тяжелая > цепь mAb 10G8
Фиг. 20: КВ-клеточный анализ
ттщ 1-I imiij !-! i им'] г-( ими;
i 60 го со
§. 40 г s ю
> J
Е 20 i s
-20
НО LI
HOi'CDRHI)
HOi'CDRHI)
LH;CDRL2S
H0L1 ("CDRL2)
If.EIOh mAb
отрицательного контроля
_ШИ] i i_i_LLLLi! _J L_jJJJllL_i_j_LL±^
0,001 0,01 0,1 1
Концентрация антитела (мкг/мл)
I0GB
мои
(htitJDRHf'l LI
Химерное 10G8
15Е10h mAb
отрицательного контроля
0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 22: КВ-клеточный анализ
100 гтг
40 h
20 L
т-ГТТТТП1 1-гт ._
" X •
H0LI Н0;Н11'1
Химерное 10G8
15E10I1
mAb
отрицательного контроля
JJJiJl_J__l_iJJ^
-L t i i
0,001 0,01 0,1 1
Концентрация антитела (мкг/мл)
!00
0,1
* ГПТГ Г 7 Т 1 Т "П| " 7 1 Т ITГГГГ* 1 "Г Tl'TTI
0,01
IO".iH
HOLl
HOiH'l L!
Химерное
10G8
15ЕКФ
mAb
отрицательного
контроля
о; s i
со о
CL S
ю Е
Концентрация антитела (мкг/мл) Фиг. 24
ттщ-i i i "мм;-i мппп-i-ГРТГП-I 1 I I11II
J J LLLLid I 1 I .И II11 I ¦ I I Mill I J Llll.il.
I0G8
HOL I
ihliCDRH 11 LI
Химерное 10G8
iSFIOh mAb
отрицательного контроля
0,001 0,01 0,1 1 10
Концентрация антитела (мкг/мл)
о; s i
со о
CL S
120 100
60 40 20
тттпт
тпттт
11 ft
Фиг. 25
тттптщ
ж Г Ж *
и УI и 14,
10*3.5
H0LI HOiHI 11
Антитело против LIF
Химерное 10G8
l5EI0h mAb
отрицательного контроля
0,01
0,1
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 26: Анализ с человеческими гепатоцитами - SAA
Концентрация mAb (нМ) Концентрация mAb (нМ)
Фиг. 28: Анализ с человеческими фибробластоподобными
синовиоцитами - IL-6
Антитело X
H0(iiuCDRH1jL1
100-1
80-
60-
40-
20-
40-
А Б
Фиг. 30: Анализ с человеческими клетками эндотелия пупочной вены А
Концентрация антитела против OSM (мкг/мл)
Фиг. 31: Анализ с человеческими легочными фибробластами - МСР-1
Эффект антитела против OSM на МСР-1 после стимуляции OSM (3 нг/мл) (норма)
Эффект антитела против OSM на МСР-1 после стимуляции OSM (3 нг/мл) (IPF)
; гон
• 3 нг/мл OSM + антитело X
* 3 нг/мл OSM + H0(huCDRH1)L1 ф 3 нг/мл + изотип
# Без стимуляции
мое мое
•| ж
V 20М О.
S 10ОС
• 3 нг/мл OSM + антитело X A3 нг/мл OSM + H0(huCDRH1)L1 ¦3 нг/мл + изотип §Без стимуляции
Л Щ > <Щ 1Щ !Щ ЧЩ *Щ 1Щ 1ШЦ 1Щ 11
1 ч6 4> чй Ns> чй к" ч" > $> Концентрация антитела (мкг/мл)
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 32: Анализ с человеческими легочными фибробластами - IL-6 А Б
Эффект антитела против OSM на IL-6 после Эффект антитела против OSM на IL-6 после
стимуляции OSM (3 нг/мл) (норма) стимуляции OSM (3 нг/мл) (IPF)
150
3100
* 3 нг/мл OSM + антитело X
А 3 нг/мл OSM + HO(huCDRH1)L1
* 3 нг/мл + изотип
* Без стимуляции
1500
-Ь woe их
• 3 нг/мл OSM + антитело X А 3 нг/мл OSM + H0(huCDRH1)L1
¦ 3 нг/мл + изотип
# Без стимуляции
Ьц чщ ишц i
0 4 4 Концентрация антитела (мкг/мл)
6 *
U ? ? $ ? к* $ ?
Концентрация антитела (мкг/мл)
Фиг. 33
Положение
100
100A
100B
100C
100D
101
102
Ala
5,76 E-10
5,72 E-10
4,86 E-10
6,59 E-10
5,41 E-10
8,55 E-09
8,10 E-09
4,81 E-09
3,94 E-10
8,69 E-10
1,55 E-09
3,38 E-10
Cys
6,64 E-10
6,51 E-10
1,50 E-09
7,08 E-10
8,95 E-09
8,92 E-09
8,12 E-09
5,86 E-10
Asp
4,42 E-10
4,94 E-10
4.24 E-09
4,27 E-08
2,32 E-08
6,72 E-10
3,55 E-10
Glu
7,85 E-10
1,10 E-09
1.28 E-09
4,91 E-10
4,82 E-10
6,88 E-10
4,26 E-10
Phe
6,1 E-10
6,37 E-10
3,25 E-10
2,54 E-07
4,47 E-10
3,37 E-09
3,65 E-10
4,50 E-10
2,60 E-09
4,25 E-10
Gly
5,17 E-10
4,88 E-10
3,07 E-10
1,11 E-09
5,25 E-09
1,81 E-08
6,31 E-08
2,21 E-08
3,88 E-10
6,61 E-10
7,10 E-10
4,06 E-10
His
4,99 E-10
4,80 E-10
1.74 E-10
1,56 E-08
3,97 E-08
3.62 E-08
1,20 E-09
Ile
7,18 E-09
1,69 E-09
1,87 E-08
Z46 E-08
4,55 E-08
Lys
6,71 E-10
2,45 E-08
4.06 E-09
4.31 E-09
4,71 E-08
8,73 E-10
2,83 E-09
Leu
5,68 E-10
5,55 E-10
2,19 E-09
7,42 E-10
1,56 E-09
4,20 E-08
3,35 E-09
1,62 E-08
4,24 E-10
4,26 E-10
Met
6,49 E-10
8,09 E-10
6.93 E-09
1.62 E-09
5,19 E-09
4.03 E-08
Asn
1,33 E-09
6,58 E-09
4,02 E-08
Pro
4,42 E-10
2,35 E-09
3,15 E-08
9,86 E-10
5,53 E-10
3,65 E-08
1,14 E-08
1,05 E-09
5,01 E-09
4,11 E-10
Gln
5,70 E-10
7,29 E-10
1,46 E-08
3,35 E-09
1,17 E-09
1,10 E-09
3,37 E-10
Arg
6,84 E-09
1,56 E-08
1,85 E-09
3,02 E-09
6,80 E-09
2,13 E-08
1,09 E-09
1,34 E-09
2,18 E-09
5,33 E-10
Ser
7,60 E-10
4,67 E-10
6,32 E-10
1,09 E-09
8,27 E-10
1,65 E-09
1,83 E-08
7,74 E-09
1,20 E-09
6,61 E-10
7,72 E-10
4,44 E-10
Thr
6,32 E-10
4,97 E-10
3,64 E-09
1,66 E-09
3,99 E-10
4,57 E-10
3,34 E-08
8,57 E-09
1,09 E-09
5,91 E-10
7,07 E-10
Val
5,70 E-10
4,88 E-10
2,01 E-09
1,00 E-09
7,14 E-10
1,45 E-08
9,05 E-09
4,12 E-08
5,60 E-10
6,75 E-10
4,40 E-10
4,26 E-10
Тгр
1,86
9,79
1,67
3,17
4,99
6,90
4,95
6,87
7,11
2,07
5,33
Е-08
Е-10
Е-09
Е-10
Е-09
Е-09
Е-10
Е-10
Е-10
Е-10
Е-10
Туг
6,78
2.07
4,44
1.41
6.76
3,64
5,09
Е-10
Е-09
Е-10
Е-08
Е-09
Е-10
Е-10
отсутствие связывания
остаток дикого типа снижение связывания в 3 раза
данные, полученные в отдельном эксперименте
Фиг. 34
Тип I Тип II
5ш V3. JAK. ги5 МРК
яванского макака
Анализ Kinexa
101
101
103
103
104
104
SEQ ID N0:33 - нуклеотидная последовательность VH 2B7
SEQ ID N0:33 - нуклеотидная последовательность VH 2B7
105
105
SEQ ID N0:39 - нуклеотидная последовательность VL 9G2
SEQ ID N0:39 - нуклеотидная последовательность VL 9G2
106
106
SEQ ID N0:42 - аминокислотная последовательность VH химерного 10G8
SEQ ID N0:42 - аминокислотная последовательность VH химерного 10G8
107
108
SEQ ID N0:48 - аминокислотная последовательность VL химерного 9G2
110
110
116
116
<400> 5
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<400> 5
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<400> 11
Tyr Ala Ser Glu Leu Glu Ser 1 5
<400> 11
Tyr Ala Ser Glu Leu Glu Ser 1 5
<400> 17
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<210> 1 <211> 9
<400> 17
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<210> 1 <211> 9
110
110
110
<220>
<220>
<220>
<220>
<220>
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1/18
100
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
1/18
100
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
1/18
100
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
1/18
100
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
1/18
100
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
1/18
100
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
2/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 3: КВ-клеточный анализ
2/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 3: КВ-клеточный анализ
2/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 3: КВ-клеточный анализ
2/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 3: КВ-клеточный анализ
3/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 5: КВ-клеточный анализ
3/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 5: КВ-клеточный анализ
3/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 5: КВ-клеточный анализ
3/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 5: КВ-клеточный анализ
3/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 5: КВ-клеточный анализ
3/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 5: КВ-клеточный анализ
4/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
4/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
4/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
4/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
4/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
4/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
4/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
4/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
5/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
5/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
5/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
5/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
5/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
5/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
6/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
8/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
7/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 13: КВ-клеточный анализ
8/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
9/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 17: КВ-клеточный анализ
9/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 17: КВ-клеточный анализ
9/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 17: КВ-клеточный анализ
9/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 17: КВ-клеточный анализ
9/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 17: КВ-клеточный анализ
9/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 17: КВ-клеточный анализ
9/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 17: КВ-клеточный анализ
9/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 17: КВ-клеточный анализ
10/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
10/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
10/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
10/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
10/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
10/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
10/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
10/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
11/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
12/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 23: КВ-клеточный анализ
11/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
12/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 23: КВ-клеточный анализ
11/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
12/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 23: КВ-клеточный анализ
11/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
12/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 23: КВ-клеточный анализ
13/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
12/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 23: КВ-клеточный анализ
13/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
12/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 23: КВ-клеточный анализ
13/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
12/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
Фиг. 23: КВ-клеточный анализ
14/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
14/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
14/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
14/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
14/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
14/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
15/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
16/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
16/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
17/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
17/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
17/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
17/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
18/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)
18/18
Антигенсвязывающие белки, связывающиеся с онкостатином М (OSM)