(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится, в числе прочего, к С5-связывающим полипептидам и использованию полипептидов в способах лечения или профилактики комплемент-связанных нарушений. Также представлены терапевтические наборы, содержащие один или более С5-связывающих полипептидов, и средство для введения полипептидов индивиду.
Евразийское (21) 201390506 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/18 (2006.01)
2013.09.30 C07K16/46 (2006.01)
A61K39/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки C12N15/13 (2006.01)
2011.09.30
(54) ПОЛИПЕПТИДЫ, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТ КОМПОНЕНТ С5 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА
(31) 61/388,902
(32) 2010.10.01
(33) US
(86) PCT/US2011/054143
(87) WO 2012/044893 2012.04.05
(71) Заявитель:
АЛЕКСИОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Гиз Дэвид, Хантер Джеффри В., Спрингхорн Джереми П. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение относится, в числе прочего, к С5-связывающим полипептидам и использованию полипептидов в способах лечения или профилактики комплемент-связанных нарушений. Также представлены терапевтические наборы, содержащие один или более С5-связываю-щих полипептидов, и средство для введения полипептидов индивиду.
2.5-1 1
2420-194775ЕА/017 ПОЛИПЕПТИДЫ, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТ КОМПОНЕНТ С5 КОМПЛЕМЕНТА
ЧЕЛОВЕКА
Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет
предварительной заявки на патент США No. 61/388902, поданной 1 октября 2010 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Область техники
Областью настоящего изобретения является медицина, иммунология, молекулярная биология и химия белка. Уровень техники
Система комплемента действует в сочетании с другими иммунологическими системами организма для защиты от вторжения клеточных и вирусных патогенов. Существует по меньшей мере 25 белков комплемента, которые обнаружены в виде сложного набора белков плазмы и мембранных кофакторов. Белки плазмы составляют приблизительно 10% глобулинов в сыворотке позвоночных. Компоненты комплемента выполняют свои иммунные защитные функции посредством взаимодействия в ряде сложных, но определенных событий ферментативного расщепления и связывания с мембраной. Суммарный каскад реакций комплемента приводит к выработке продуктов с опсоническими, иммунорегуляторными и литическими функциями. Краткое изложение биологических активностей, связанных с активацией комплемента представлено, например, в The Merck Manual, 16th Edition.
Каскад реакций комплемента может проходить через классический путь (CP), лектиновый путь или альтернативный путь (АР) . Лектиновый путь, как правило, инициируется связыванием маннозо-связывающего лектина (MBL) с субстратами с высоким содержанием маннозы. АР может быть антителонезависимым и может быть инициируемым некоторыми молекулами на поверхностях патогенов. CP, как правило, инициируется распознаванием антителом и связыванием с антигенным участком на клетке-мишени. Такие пути совмещаются на СЗ конвертазе - точке, в которой компонент комплемента СЗ расщепляется активной протеазой с
образованием СЗа и СЗЬ.
СЗ конвертаза АР инициируется спонтанным гидролизом компонента комплемента СЗ, который представлен в большом количестве в плазме в крови. Этот процесс, также известный как "холостой ход", происходит посредством спонтанного расщепления тиоэфирной связи в СЗ с образованием C3i или СЗ (ЩО) . Холостой ход облегчается наличием поверхностей, которые содействуют связыванию активированного СЗ и/или имеют нейтральные или положительные характеристики заряда (например, поверхности бактериальных клеток). Это образование СЗ(ЩО) обеспечивает возможность для связывания белка плазмы Фактор В, который в свою очередь обеспечивает возможность Фактору D расщепить Фактор В на Ва и ВЬ. Фрагмент ВЬ остается связанным с СЗ с образованием комплекса, содержащего СЗ(Н20)ВЬ - "текучая фаза" или "инициация" СЗ конвертазы. Несмотря на то, что текучая фаза СЗ конвертазы вырабатывается только в небольших количествах, она может расщепить множество СЗ белков на СЗа и СЗЬ и в результате приводит к образованию СЗЬ и его последующему ковалентному связыванию с поверхностью (например, бактериальная поверхность). Фактор В, связанный с поверхность-связанным СЗЬ, расщепляется фактором D с образованием таким образом поверхность-связанного СЗ конвертазного комплекса АР, содержащего СЗЬ,ВЬ. (См. например, Muller-Eberhard (1988) Алл Rev Biochem 57:321-347 . )
С5 конвертаза АР - (СЗЬ)г/ВЬ образуется в результате добавления второго СЗЬ мономера к АР СЗ конвертазе. (См., например, Medicus et al. (1976) J Exp Med 144:1076-1093 и Fearon et al. (1975) J Exp Med 142: 856-863) . Роль второй СЗЬ молекулы заключается в связывании С5 и его предоставлении для расщепления ВЬ. (См., например, Isenman et al. (1980) J Immunol 124:32 6-331.) СЗ и C5 конвертазы АР стабилизируются добавлением тримерного белка пропердина, как описано, например, в Medicus et al. (197 6), выше. Однако не требуется связывание пропердина для формирования функционирующего альтернативного пути СЗ или С5 конвертазы. См., например, Schreiber et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3948-3952 и Sissons et al. (1980) Proc Natl
AcadSci USA 7_7_: 559-562.
СЗ конвертаза CP образуется в результате взаимодействия компонента комплемента С1, который представляет собой комплекс Clq, Clr и Cls с антителом, которое связано с антигеном-мишенью (например, микробный антиген). Связывание участка Clq С1 с комплексом антитело-антиген вызывает конформационное изменение в С1, которое активирует Clr. Затем активированный Clr расщепляет С1-связанный Cls, с получением посредством этого активированной сериновой протеазы. Активированный Cls расщепляет компонент комплемента С4 на С4Ь и С4а. Подобно СЗЬ, вновь генерированный С4Ь фрагмент содержит высокоактивный тиол, который легко образует амидные или сложноэфирные связи с соответствующими молекулами на мишеневой поверхности (например, микробная клеточная поверхность) . Cls также расщепляет компонент комплемента С2 на С2Ь и С2а. Комплекс, образованный С4Ь и С2а, является СЗ конвертазой CP, которая способна к процессингу СЗ на СЗа и СЗЬ. С5 конвертаза CP - C4b, С2а, СЗЬ -образуется в результате добавления СЗЬ мономера к СЗ конвертазе СР. (См., например, Mtiller-Eberhard (1988), выше и Cooper et al. (1970) J Exp Med 132:775-793).
Кроме роли в качестве СЗ и С5 конвертаз СЗЬ также функционирует в качестве опсонина посредством его взаимодействия с рецепторами комплемента, представленными на поверхностях антигенпрезентирующих клеток, таких как макрофаги и дендритные клетки. В целом считается, что опсоническая функция СЗЬ является одной из наиболее важных антиинфекционных функций системы комплемента. Пациенты с генетическими повреждениями, которые блокируют функцию СЗЬ предрасположены к инфекциям большим разнообразием патогенных организмов, в то время как пациенты с более поздними повреждениями в последовательности каскада реакций комплемента, т.е., пациенты с повреждениями, которые блокируют С5 функции, как обнаружено, более предрасположены только к инфекции Нейссерия, и при этом лишь ненамного более предрасположены.
С5 конвертазы АР и CP расщепляют С5, который представляет собой 190 кДа бета-глобулин, обнаруживаемый в нормальной
сыворотке человека в концентрации приблизительно 75 мкг/мл (0,4 мкМ). С5 гликозилирован, при этом приблизительно 1,5-3 процента его массы приходится на углевод. Зрелый С5 представляет собой гетеродимер из альфа-цепи из 999 аминокислот, 115 кДа, которая связана дисульфидной связью с бета-цепью из 655 аминокислот, 75 кДа. С5 синтезируется в виде одноцепочечного предшественника белкового продукта однокопийного гена (Haviland et al. (1991) J Immunol. 146:3 62-368) . кДНК последовательность транскрипта этого гена предполагает секретируемый предшественник про-С5 из 1658 аминокислот вместе с лидерной последовательностью из 18 аминокислот (см., например, патент США No.6355245).
Предшественник про-С5 расщепляется после аминокислот 655 и 659, с получением бета-цепи в качестве аминоконцевого фрагмента
(аминокислотные остатки от +1 до 655 вышеуказанной
последовательности) и альфа-цепи в качестве карбоксиконцевого
фрагмента (аминокислотные остатки от 660 до 1658 вышеуказанной
последовательности), при этом четыре аминокислоты
(аминокислотные остатки 656-659 вышеуказанной
последовательности) удаляются между ними.
С5а отсщепляется от альфа-цепи С5 или альтернативной, или
классической С5 конвертазой в виде аминоконцевого фрагмента,
содержащего первые 7 4 аминокислоты альфа-цепи (т.е.,
аминокислотные остатки 660-733 вышеуказанной
последовательности). Приблизительно 2 0 процентов массы 11 кДа С5а составляет углевод. Сайтом расщепления для действия конвертазы является аминокислотный остаток 733 вышеуказанной последовательности или непосредственно примыкающий к нему. Соединение, которое может связываться с этим сайтом расщепления или примыкающим к нему будет обладать способностью блокировать доступ ферментов С5 конвертаз к сайту расщепления и вследствие этого действует в качестве ингибитора комплемента. Соединение, которое связывается с С5 в сайте, дистальном к сайту расщепления, может также иметь способность блокировать расщепление С5, например, посредством опосредованного стерическим препятствием ингибирования взаимодействия между С5 и С5 конвертазой. Соединение, в механизме действия
соотносящееся с механизмом ингибитора комплемента слюны клеща OmCI, может также предотвращать расщепление С5 снижением гибкости домена С345С альфа-цепи С5, что уменьшает доступ С5 конвертазы к сайту расщепления С5. См., например, Fredslund et al. (2008) Nat Immunol 9(7): 753-760.
C5 также может быть активированный способом, отличным от С5 конвертазной активности. Ограниченная обработка трипсином (см., например, Minta и Man (1997) J Immunol 119:1597-1602 и Wetsel and Kolb (1982) J Immunol 128:2209-2216) и кислотная обработка (Yamamoto и Gewurz (1978) J Immunol 120:2008 и Damerau et al. (1989) Molec Immunol 2_6: 1133-1142) могут также расщеплять C5 и продуцировать активный C5b.
Расщепление С5 высвобождает С5а, сильный анафилатоксин и хемотаксический фактор и приводит к образованию литического терминального комплементного комплекса, С5Ь-9. С5а и С5Ь-9 также имеют плейотропные клеточные активирующие свойства, посредством усиления амплификации поздних воспалительных факторов, таких как гидролитические ферменты, активные формы кислорода, метаболиты арахидоновой кислоты и различные цитокины.
Первый этап образования терминального комплементного комплекса включает комбинацию С5Ь с Сб, С7 и С8 с образованием С5Ь-8 комплекса на поверхности клетки-мишени. При связывании С5Ь-8 комплекса с несколькими С9 молекулами, образуется мембраноатакующий комплекс (MAC, C5b-9, терминальный комплементный комплекс - ТСС) . Когда достаточное количество MAC включаются в отверстия мембраны клеток-мишеней, они создают (MAC поры) опосредствованный быстрый осмотический лизис клеток-мишеней. Более низкие, нелитические концентрации MAC могут вырабатывать другие эффекты. В частности, мембранное включение небольших количеств С5Ь-9 комплексов в эндотелиальные клетки и тромбоциты может вызывать вредоносную клеточную активацию. В некоторых случаях активация может предшествовать клеточному лизису.
Как указано выше, СЗа и С5а являются анафилатоксинами. Эти активированные компоненты комплемента могут инициировать
дегрануляцию тучных клеток, что высвобождает гистамин из базофилов и тучных клеток, и другие медиаторы воспаления, приводя к сокращению гладких мышц, повышенной проницаемости сосудов, активации лейкоцитов и другим воспалительным явлениям, включая клеточную пролиферацию, приводящую к повышенному содержание паренхиматозных клеток. С5а также функционирует в качестве хемотаксического пептида, который служит для привлечения провоспалительных гранулоцитов к месту активации комплемента.
С5а рецепторы обнаружены на поверхностях бронхиальных и альвеолярных эпителиальных клеток и клеток бронхиальных гладких мышц. С5а рецепторы также обнаружены на эозинофилах, тучных клетках, моноцитах, нейтрофилах и активированных лимфоцитах.
Хотя соответствующим образом функционирующая система комплемента обеспечивает устойчивую защиту против инфицирующих микробов, нецелесообразная регуляция или активация комплемента была задействована в патогенезе множества нарушений, включая, например, ревматоидный артрит (RA) ; волчаночный нефрит; астму; ишемически-реперфузионное повреждение; атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS); болезнь плотного осадка (DDD); ночную пароксизмальную гемоглобинурию (PNH); макулярную дегенерацию (например, связанную с возрастом макулярную дегенерацию (AMD)); гемолиз, синдром увеличения активности печеночных ферментов и низкого содержания тромбоцитов (HELLP); тромбоцитопеническую тромбогемолитическую пурпуру (ТТР); спонтанную потерю плода; Пауци-иммунный васкулит; буллезный эпидермолиз; повторную потерю плода; множественный склероз
(MS); травматическое повреждение мозга; и повреждение, возникшее вследствие инфаркта миокарда, экстрапульмонального шунтирования и гемодиализа. (См., например, Holers et al.
(2 008) Immunological Reviews 223:300-316.) Было
продемонстрировано, что ингибирование комплемента (например,
ингибирование: образования терминального комплемента,
расщепления С5 или активации комплемента), эффективно для лечения некоторых комплемент-связанных нарушений как на животных моделях, так у людей. См., например, Rother et al.
(2007) Nature Biotechnology 25 (11):1256-1264; Wang et al.
(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:8563-8568; Wang et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:8955-8959; Rinder et al. (1995) J Clin Invest 96: 1564-1572; Kroshus et al. (1995) Transplantation 60:1194-1202; Homeister et al. (1993) J Immunol 150: 1055-1064; Weisman et al. (1990) Science 249: 146-151; Amsterdam et al. (1995) Am J Physiol 268:H448-H457; и Rabinovici et al. (1992) J Immunol 149: 1744 1750. Сущность изобретения
Описание основано по меньшей мере частично, на обнаружении
авторами того, что одна аминокислотная замена в анти-С5
одноцепочечном антителе, пекселизумабе (Alexion
Pharmaceuticals, Inc., Cheshire, CT) , дает антителу
значительные физико-химические преимущества. (Пекселизумаб,
который представляет собой одноцепочечный вариант полного
антитела экулизумаба, описан подробно, например, в Whiss (2002)
Curr Opin Investig Drugs 3(6) :870-7; Patel et al. (2005) Drugs
Today (Bare) 41(3):165-70; Thomas et al. (1996) Mol Immunol
33 (17-18) :1389-401; и в патенте США No. 6355245.) А именно,
замещением аргинина (R) в положении 38 (в соответствии с
нумерацией по Rabat и номером аминокислотной
последовательности, представленной в SEQ ID N0:2) аминокислотной последовательности легкой цепи антитела пекселизумаба глутамином (Q) , авторы наблюдали, среди прочего, резкое изменение изоэлектрической точки (pi) антитела. (См. Rabat et al. (1991) "Sequenses of Proteins of Immunological Interest." NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD.) Как предсказано с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей, pi пекселизумаба составляет приблизительно 6,55, тогда как pi R38Q-зaмeщeннoй формы антитела составляет 5,45. R38Q-замещенное антитело может быть получено в растворе вплоть до приблизительно 50 мг/мл при нейтральном рН, тогда как пекселизумаб достигает верхний предел растворимости при приблизительно 2 мг/мл. Это указывает на то, что замена R38Q обеспечивает значительное повышение растворимости антитела.
Повышенная растворимость в водном растворе R38Q-
замещенного антитела, по сравнению с растворимостью
пекселизумаба, является эффективной по нескольким причинам. Во-
первых, для терапевтического применения, для которого
требуется, чтобы антитело было введено индивиду в небольшом
объеме (например, интраокулярное, внутрилегочное,
внутрисуставное или подкожное введение), терапевтическая
эффективность часто зависит от количества антитела, которое
может быть введено в таком небольшом объеме. Это требование для
терапевтического применения делает необходимым получение
антител в высоких концентрациях, например, в виде
высококонцентрированных растворов. Во-вторых,
высококонцентрированные составы антител могут обеспечивать
возможность более взвешенного выбора по отношению к пути
введения. Например, если используется внутривенное вливание,
высококонцентрированный состав обеспечивает возможность более
короткого времени вливания. Для терапевтических применений, для
которых требуется частое и/или длительное введение, возможен
подкожный путь доставки посредством высококонцентрированных
составов, и он может быть более удобным для пациентов, чем
внутривенное вливание. Вследствие этого, возможность получение
антител в высоких концентрациях может повысить комфортность
введения посредством обеспечения легкого введения дома в
качестве альтернативного варианта для пациентов с комплемент-
связанными нарушениями. Другие преимущества
высококонцентрированных составов включают, например, экономию
расходов на получение от уменьшения пространства для хранения
материала и/или количества загрузок продукта.
Как подробно указано в демонстрационных примерах, замена R38Q, однако, существенно не влияет на аффинность антитела к С5, существенно не воздействует на активность антитела, так как и пекселизумаб, и К380_-замещенное антитело предотвращают гемолиз красных кровяных клеток при оценке в гемолитическом анализе.
Соответственно, изобретение относится к С5-связывающим полипептидам, которые имеют, в том числе, одну или более
вышеупомянутых улучшенных характеристик. Полипептиды также
способны ингибировать, например, расщеплять С5 на фрагменты С5а
и С5Ь, и, таким образом, предотвращать образование
терминального комплемента, а также С5а-зависимый воспалительный
ответ. Таким образом, С5-связывающие полипептиды, описанные в
настоящем документе, также могут использоваться для множества
диагностических и терапевтических применений. Например,
полипептиды могут быть использованы для лечения или
профилактики комплемент-связанных заболеваний, в том числе, без
ограничения, ночную пароксизмальную гемоглобинурию, атипичный
гемолитический уремический синдром, возрастную макулярную
дегенерацию (например, влажную и сухую форму AMD), отторжение
трансплантата, ревматоидный артрит, астму, ишемически-
реперфузионное повреждение, атипичный гемолитический
уремический синдром, тромбоцитопеническую тромбогемолитическую
пурпуру, ночную пароксизмальную гемоглобинурию, болезнь
плотного осадка, спонтанную потерю плода, Пауци-иммунный
васкулит, буллезный эпидермолиз, повторную потерю плода,
множественный склероз, травматическое повреждение мозга,
миастению гравис (MG), болезнь Холодовых агглютининов,
дерматомиозит, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, диабет 1
типа, псориаз, пемфигус, аутоиммунную гемолитическую анемию,
идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, Синдром
Гудпасчера, мультифокальную двигательную невропатию,
оптиконевромиелит, антифосфолипидный синдром, синдром Дегоса, комплемент-связанные легочные заболевания (например, астма и хроническая обструктивная болезнь легких), катастрофический антифосфолипидный синдром или любое другое комплемент-связанное заболевание, описанное в настоящем документе и/или известное в данной области.
В одном из аспектов изобретение относится к полипептиду, который связывается с компонентом комплемента человека белком С5. Полипептид может содержать или состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, не является полноразмерным антителом. В некоторых
вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, является одноцепочечным антителом.
Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и означают любую связанную пептидными связями цепь из аминокислот независимо от длины или посттрансляционной модификации.
В другом аспекте изобретение относится к С5-связывающему
полипептиду, который содержит аминокислотную
последовательность, которая более чем на 50 (например, больше или на значение равное 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99) % идентична с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:2, но содержит глутамин в положении 3 8 SEQ ID N0:2.
В другом аспекте изобретение относится к полипептиду, который связывается с компонентом комплемента человека белком С5 и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:2, но не более чем с 30 (например, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1) аминокислотными заменами. Замены могут быть консервативными или неконсервативными. Однако полипептид содержит глутамин в положении 3 8 SEQ ID N0:2.
Консервативные замены, как правило, включают замены между следующими группами: глицин и аланин; валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин, серии и треонин; лизин, гистидин и аргинин; и фенилаланин и тирозин.
В другом аспекте изобретение относится к полипептиду, который содержит по меньшей мере 2 0 (например, 22, 25, 27, 30, 32, 35, 37, 40, 42, 45, 47, 50, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 70, 72, 75, 77, 80, 82, 85, 87, 90, 92, 95, 97, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200, или более) последовательных аминокислот SEQ ID N0:2, где аминокислотная последовательность содержит глутамин в положении 38. В некоторых вариантах
осуществления полипептид содержит по меньшей мере 20, но менее 246 (например, 245, 244, 243, 242, 241, 240, 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190, 185, 180, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90 или менее) последовательных аминокислот, показанных в SEQ ID N0:2, где аминокислотная последовательность содержит глутамин в положении 38.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие
полипептиды являются вариантами с делециями. В вариантах с
делециями могут отсутствовать, например, одна, две, три,
четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 90, или более единичных
аминокислот. В вариантах с делециями также могут отсутствовать
один или более сегментов из двух или более (например, две, три,
четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 90, или более) последовательных
аминокислот или не соседних единичных аминокислот. Таким
образом, в некоторых вариантах осуществления варианты с
делециями могут содержать первый сегмент, содержащий
аминокислоты 1-107 SEQ ID N0:2 (включая глутамин 38) и второй
сегмент, содержащий аминокислоты 125-24 6 SEQ ID N0:2. Два
аминокислотных сегмента могут быть связаны непосредственно
вместе или связаны аминокислотной последовательностью, которая
является гетерологичной аминокислотам 1-107 и 125-246 SEQ ID
N0:2. Например, гетерологичная аминокислотная
последовательность может быть линкерной последовательностью, такой как, но не ограниченной ими, полиглициновая или полисериновая линкерная последовательность описанные, например, в патентах США No. 5525491 и 5258498, описание каждого из которых полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки. Дополнительные полипептидные линкеры известны в данной области и описаны в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть слитым
белком. Слитый белок может содержать один или более С5-
связывающих сегментов (например, С5-связывающие сегменты SEQ ID
N0:2) и один или более сегментов, которые являются
гетерологичными С5 связывающему(им) сегменту(ам).
Гетерологичная последовательность может быть, например, антигенной меткой (например, FLAG, полигистидин, гемагглютинин
(НА), глутатион-Б-трансфераза (GST) или мальтоза-связывающий белок (МВР)). Гетерологичные последовательности также могут быть протеинами, подходящими в качестве диагностических или детектируемых маркеров, например, люцифераза, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или хлорамфеникол-ацетилтрансфераза
(CAT) . Например, слитый белок может содержать первый сегмент,
содержащий аминокислоты 1-107 SEQ ID N0:2 (включая глутамин 38)
и второй сегмент, содержащий аминокислоты 125-24 6 SEQ ID N0:2,
где (i) первый и второй сегменты соединены гетерологичной
аминокислотной последовательностью, например, гетерологичной
линкерной аминокислотной последовательностью, и/или (ii) белок
содержит один или оба аминоконцевой и/или карбоксиконцевой
гетерологичный сегмент, например, карбоксиконцевую антигенную
метку, аминоконцевую гетерологичную последовательность,
кодирующую детектируемый полипептид, или любые гетерологичные
последовательности, описанные в настоящем документе. В
некоторых вариантах осуществления гетерологичная
последовательность может быть нацеливающей группой, которая направляет С5-связывающий сегмент в соответствующую клетку, ткань или микроокружение. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая группа является растворимой формой человеческого рецептора комплемента (например, человеческий рецептор комплемента 2) или антителом (например, одноцепочечное антитело), которое связывается с СЗЬ или C3d. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая группа является антителом, которое связывается с ткане-специфичным антигеном, таким как специфичный по отношению к почкам антиген.
В другом аспекте изобретение относится к конструкции, содержащей С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, и нацеливающую группу. Нацеливающая группа может
быть группой, которая направляет С5-связывающий полипептид к месту активации комплемента такому как, но не ограниченному ими, красные кровяные клетки (например, RBC пациентов, пораженных гемолитической болезнью, такой как PNH), сосудистая система трансплантированного органа, суставное соединение, легкие или глаза. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая группа является растворимой формой рецептора комплемента, например, растворимой формой рецептора комплемента 1 человека или рецептора комплемента 2 человека. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая группа является антителом. В таких вариантах осуществления конструкция является биспецифичным антителом. Нацеливающая группа может быть антителом, которое связывается с СЗЬ и/или C3d. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая группа может быть антителом, которое связывается с ткане-специфичным антигеном, таким как специфичный по отношению к почкам антиген (например, KIM-1).
В некоторых вариантах осуществления любых из С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе, полипептиды могут ингибировать образование и/или активность терминального комплемента. Например, С5-связывающий полипептид может ингибировать расщепление С5 на фрагменты С5а и С5Ь, и посредством этого уменьшать последующее отложение С5Ь-9 на клетках и С5а-опосредованный воспалительный ответ.
В еще одном аспекте изобретение относится к одноцепочечному антителу, которое связывается с компонентом С5 комплемента человека и имеет растворимость между приблизительно 10 мг/мл и приблизительно 60 мг/мл в водном растворе. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело имеет растворимость между приблизительно 2 0 мг/мл и приблизительно 50 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело имеет растворимость между приблизительно 4 0 мг/мл и приблизительно 55 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело имеет растворимость приблизительно 50 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело содержит или состоит из аминокислотной
последовательности SEQ ID N0:2. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело содержит аминокислотную последовательность, которая на более 50 (например, более чем
или на значение равное 51,
52,
53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,
61, 62, 63, 64, 65, 66, 67
, 68,
69,
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,
77, 78, 79, 80, 81, 82, 83
, 84,
85,
86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,
93, 94, 95, 96, 97, 98
или
99)
% идентична аминокислотной
последовательности SEQ
N0:2
В некоторых вариантах
осуществления одноцепочечное антитело содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2, но не более чем с 20 (например, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2 или 1) аминокислотными заменами.
В другом аспекте изобретение относится к: (i) нуклеиновой
кислоте, которая кодирует любые из С5-связывающих полипептидов,
описанных в настоящем документе, (например, варианты, варианты
с делециями, фрагменты, конструкции, биспецифичные антитела или
слитые белки, содержащие аминокислотные последовательности SEQ
ID N0:2); (ii) вектору, содержащему нуклеиновую кислоту; (iii)
клетке, содержащей нуклеиновую кислоту или вектор; и (iv)
способам получения полипептидов (например, любых С5-связывающие
полипептидов, описанных в настоящем документе) с использованием
клетки. Нуклеиновая кислота может содержать или состоять из,
нуклеотидной последовательности SEQ ID N0:1. В некоторых
вариантах осуществления нуклеиновая кислота может содержать или
состоять из нуклеотидов 1-738 SEQ ID N0:1. Нуклеиновая кислота
необязательно может включать последовательность старта
трансляции (ATG) или последовательность терминации трансляции
(например, TGA) . Вектор может содержать нуклеиновую кислоту,
функционально связанную с регулирующей экспрессию
последовательностью. Такой вектор может называться в настоящем документе "вектор экспрессии". Вектор может быть интегрирован в геном клетки или может сохраняться в клетке в виде эписомы. Клетка может быть, например, прокариотической клеткой или эукариотической клеткой. Клетка может быть, например, бактериальной клеткой, грибковой клеткой (например, дрожжевая клетка), клеткой насекомого или клеткой млекопитающего
(например, клетка кролика, клетка мыши, клетка крысы, клетка хомяка, клетка кошки, клетка собаки, клетка козы, клетка коровы, клетка свиньи, клетка лошади или клетка приматов кроме человека). В некоторых вариантах осуществления клетка является клеткой человека. В некоторых вариантах осуществления клетка трансформирована или иммортализована. В некоторых вариантах осуществления клетка является первичной клеткой. Способ получения полипептида (или слитого полипептида) включает культивирование вышеупомянутых клеток при условиях, подходящих для экспрессии полипептида или слитого полипептида клеткой. Способ может также включать выделение полипептида или слитого полипептида из клетки или из среды, в которой она была культивирована.
В еще одном аспекте изобретение относится к клеточному лизату, содержащему любые С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе. Лизат может быть получен из клеток, экспрессирующих полипептид.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей любые С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, и фармацевтически приемлемое эксципиент, разбавитель и/или носитель.
В другом аспекте изобретение относится к стабильной лиофилизированной композиции, содержащей любые С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе. В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему лиофилизированную композицию и водный раствор, содержащий фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель и/или носитель, где раствор предназначен для использования для использования при ресуспендировании лиофилизированной композиции для последующего терапевтического введения человеку, у которого подозревают наличие или у которого имеется риск развития комплемент-связанного нарушения.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтическому раствору, содержащему любые С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, где полипептид представлен (или получен) в растворе в концентрации между приблизительно 10
мг/мл и 100 мг/мл (например, между приблизительно 9 мг/мл и 90 мг/мл; между приблизительно 9 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 10 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 15 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 15 мг/мл и 110 мг/мл; между приблизительно 15 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 20 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 20 мг/мл и 80 мг/мл; между приблизительно 25 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 2 5 мг/мл и 8 5 мг/мл; между приблизительно 2 0 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 25 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 30 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 30 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 40 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 50 мг/мл и 100 мг/мл или между приблизительно 20 мг/мл и 50 мг/мл). В некоторых вариантах осуществления полипептид представлен в растворе в концентрации больше чем (или по меньшей мере равной) 10 (например, больше чем или по меньшей мере равной: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 120, 130, 140 или даже 150) мг/мл. В некоторых вариантах осуществления полипептид представлен в растворе в концентрации приблизительно 50 мг/мл.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу ингибирования образования терминального комплемента и/или С5а. Способ включает приведение биологического образца в контакт с любыми из С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе, в количестве, эффективном для ингибирования образования терминального комплемента и/или С5а в биологическом образце. С5-связывающий полипептид может быть использован в количестве, которое эффективно для ингибирования образования терминального комплемента (или С5а) на по меньшей мере 2 0 (например, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99) %. В некоторых вариантах осуществления С5
связывающий полипептид может быть использован в количестве, которое эффективно для полного ингибирования образования терминального комплемента (и/или С5а) . Биологический образец может быть образцом крови, образцом сыворотки или образцом плазмы. Биологический образец может быть образцом, взятым у индивида (например, человека) с подозрением на наличие или подверженного риску развития комплемент-связанного нарушения. В некоторых вариантах осуществления способ может включать взятие биологического образца у индивида.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения комплемент-связанного нарушения, способ включает введение индивиду, нуждающемуся в этом, любых из С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе, в количестве, эффективном для лечения комплемент-связанного нарушения у индивида. С5-связывающий полипептид может быть введен индивиду в количестве и/или с частотой, эффективными для ингибирования образования в сыворотке индивида терминального комплемента
(и/или С5а) на по меньшей мере 20 (например, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99) %. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть введен в количестве и/или с частотой, эффективными для полного ингибирования образования терминального комплемента
(и/или С5а). В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть введен индивиду в количестве и/или с частотой, эффективными для снижения активности комплемента в сыворотке индивида до уровня, который меньше чем или равен 50
(например, меньше чем 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2 или 1) % от уровня активности комплемента в сыворотке здорового пациента (например, пациент, который не поражен комплемент-связанным нарушением).
В некоторых вариантах осуществления любых способов, описанных в настоящем документе, комплемент-связанное нарушение может быть связанным с альтернативным путем комплемента
нарушением или связанным с классическим путем комплемента
нарушением. Комплемент-связанное нарушение может быть,
например, ночной пароксизмальной гемоглобинурией, атипичным
гемолитическим уремическим синдромом, типичным гемолитическим
уремическим синдромом, возрастной макулярной дегенерацией,
отторжением трансплантата, ревматоидным артритом, комплемент-
связанным легочным заболеванием, ишемически-реперфузионным
повреждением, тромбоцитопенической тромбогемолитической
пурпурой, ночной пароксизмальной гемоглобинурией, болезнью
плотного осадка, возрастной макулярной дегенерацией, спонтанной
потерей плода, Пауци-иммунным васкулитом, буллезным
эпидермолизом, повторной потерей плода, множественным
склерозом, травматическим повреждением мозга, миастенией
гравис, болезнью Холодовых агглютининов, дерматомиозитом,
болезнью Грейвса, тиреоидитом Хашимото, диабетом 1 типа,
псориазом, пемфигусом, аутоиммунной гемолитической анемией,
идиопатической тромбоцитопенической пурпурой, синдромом
Гудпасчера, мультифокальной двигательной невропатией,
оптиконевромиелитом, антифосфолипидным синдромом,
катастрофическим антифосфолипидным синдромом и любыми другими
комплемент-связанными нарушениям, описанным в настоящем
документе или известным в данной области медицины. Отторжение
трансплантата может представлять собой, например, отторжение
трансплантата почки, отторжение трансплантата костного мозга,
отторжение трансплантата кожи, отторжение трансплантата сердца,
отторжение трансплантата легкого или отторжение трансплантата
печени. Легочное заболевание может представлять собой,
например, астму, бронхит, хроническую обструктивную болезнь
легких (COPD), интерстициальные легочные болезни,
злокачественные опухоли легких, дефицит а-1 антитрипсина, эмфизему, бронхоэктаз, облитерирующий бронхиолит, саркоидоз, фиброз легких или диффузное поражение соединительной ткани.
В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, полипептид вводится индивиду внутривенно. В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, полипептид вводится в легкие индивида. В
некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, полипептид вводится индивиду посредством подкожной инъекции. В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, полипептид вводится посредством внутрисуставной инъекции. В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, полипептид вводится индивиду посредством интравитреальной или интраокулярной инъекции. Дополнительные пути местного введения
(например, в глаз, суставное соединение или легкие индивида) описаны в настоящем документе и известны в данной области. Например, в некоторых вариантах осуществления любых способов, описанных в настоящем документе, С5-связывающий полипептид может быть введен в глаз посредством транссклеральной накладки
(см. ниже).
В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, могут включать введение индивиду одного или более дополнительных терапевтических средств. Одно или более дополнительных терапевтических средств могут быть введены вместе в виде отдельных терапевтических композиций, или одна терапевтическая композиция может быть получена так, чтобы она включала одновременно: (i) один или более С5-связывающих полипептидов и (ii) одно или более дополнительных терапевтических средств. Дополнительное терапевтическое средство может быть введено перед, одновременно или после введения С5-связывающего полипептида. Дополнительное средство и С5-связывающий полипептид могут быть введены с использованием одинакового способа доставки или пути, или средство и полипептид могут быть введены с использованием различных способов или путей. Дополнительные терапевтические средства могут быть любыми из описанных в настоящем документе или известных в данной области, если они подходят для лечения или профилактики комплемент-связанного нарушения.
В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, индивид является млекопитающим. В некоторых вариантах осуществления индивид является человеком. Индивид может быть, например, новорожденным или женского пола.
В еще одном аспекте изобретение относится к конъюгатам, содержащим любые из С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе, конъюгированным с гетерологичной группой. Гетерологичная группа может быть ковалентно или нековалентно конъюгирована с полипептидом. Гетерологичная группа может быть детектируемой меткой, такой как, например, ферментативная метка, радиоактивная метка, флуоресцентная метка или люминесцентная метка. Гетерологичная группа может быть, например, первым компонентом специфично связывающейся пары. Например, гетерологичная группа может быть биотином, стрептавидином или аналогом биотина, или стрептавидина.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения
или профилактики комплемент-связанного легочного заболевания,
такого как, но не ограниченного ими, астма, бронхит,
хроническая обструктивная болезнь легких (COPD),
интерстициальные болезни легких, злокачественные опухоли легких, дефицит а-1 антитрипсина, эмфизема, бронхоэктаз, облитерирующий бронхиолит, саркоидоз, фиброз легких и диффузное поражение соединительной ткани. Способы включают введение индивиду одного или более С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе, в количестве, эффективном для лечения или профилактики заболевания. Один или более С5-связывающих полипептидов могут быть, например, введены перед проявлением легочного заболевания, во время проявления легочного заболевания или после проявления легочного заболевания. Один или более С5-связывающих полипептидов могут быть введены, например, внутривенно, подкожно или посредством внутрилегочной доставки. Например, один или более С5-связывающих полипептидов могут быть доставлены в легкие индивида посредством распылителя или ингалятора. В некоторых вариантах осуществления один или более С5-связывающих полипептидов вводятся совместно с по меньшей мере одним (например, одно, два, три, четыре или пять или более) дополнительных средств, подходящих для лечения или профилактики комплемент-связанного легочного нарушения (например, ослабление их симптома). По меньшей мере одно дополнительное средство
может быть, например, кортикостероидом, таким как, но не ограничиваясь им, дексаметазон. Другие дополнительные терапевтические средства, подходящие для использования со способами, описанными в настоящем документе, известны в данной области и описаны в настоящем документе. По меньшей мере одно дополнительное активное средство может быть введено перед, после или одновременно с введением одного или более С5-связывающих полипептидов. По меньшей мере одно дополнительное средство и один или более С5-связывающих полипептидов могут быть введены одинаковым способом или путем доставки. Например, дополнительное активное средство и С5-связывающий полипептид могут быть введены распылителем. В некоторых вариантах осуществления средство и С5-связывающий полипептид вводятся различными способами или путями. Например, С5-связывающий полипептид может быть введен вливанием, и дополнительное активное средство может быть введено распылителем.
В другом аспекте изобретение относится к терапевтическому набору, содержащему один или более С5-связывающих полипептидов и средство для внутрилегочного введения индивиду, у которого подозревают наличие или у которого имеется риск развития комплемент-связанного легочного нарушения. Распылитель может быть, например, распылителем с воздушным потоком, ультразвуковым распылителем, меш-небулайзером или распылителем ударно-волнового типа. Ингалятор может быть, например, дозирующим ингалятором (например, герметизированный дозирующий ингалятор). Композиция может также необязательно содержать инструкции для того, как вводить С5-связывающий(ие) полипептид(ы) индивиду. Набор может также включать одно или более дополнительных активных средств для применения для профилактики или лечения комплемент-связанного нарушения у индивида.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения комплемент-связанного нарушения глаза, такого как, но не ограниченного им, влажная или сухая AMD. Способ включает введение индивиду, пораженному комплемент-связанным нарушением глаза, С5-связывающего полипептида, описанного в настоящем
документе, в количестве и с частотой для лечения нарушения. С5-связывающий полипептид может быть введен индивиду посредством интраокулярного или интравитреального введения. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть введен местно (например, получен в виде глазной капли или как часть пропитывающего, гидратирующего и/или промывающего раствора для контактных линз) или посредством транссклеральной накладки. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающих полипептид может быть введены совместно с одним или более дополнительных терапевтических средств для лечения комплемент-связанного нарушения глаза. Например, С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть введен с VEGF ингибитором (например, антагонист анти-VEGF антитела, такой как бевацизумаб, ранибизумаб, пегаптаниб натрия или вертепорфин (см. ниже)). Как подробно описано далее, С5-связывающий полипептид может быть введен в то же время, перед или после одного или более дополнительных терапевтических средств.
Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности определяется как процентное содержание аминокислот в кандидатной последовательности, которые идентичны к аминокислотам в сравнительной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения разрывов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности последовательности может быть выполнено различными путями, известными в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR) . В целях систематичности в изобретении использовали программное обеспечение BLAST, общедоступное от National Center of Biotechnology Information (U.S.). Подходящие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей, могут быть определены
известными способами.
Если не указано иное, все технические и научные термины,
используемые в настоящем документе, имеют такое же значение,
как обычно понимается средним специалистом в области, к которой
относится данное изобретение. В случае разногласия настоящий
документ, включая определения, имеет приоритет.
Предпочтительные способы и материалы описаны далее, несмотря на то, что способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, также могут быть использованы на практике или при испытании раскрытых в настоящем документе способов и композиций. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие источники, упомянутые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения, например, способы лечения или профилактики комплемент-связанного нарушения, будут понятны из последующих описания, примеров и формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой линейный график, отображающий зависимое от концентрации ингибирование гемолиза эритроцитов курицы двумя одноцепочечными антителами: пекселизумаб (сплошные ромбы) и R3 8Q замещенная форма пекселизумаба (сплошные квадраты). Ось Y представляет видимую абсорбцию при 415 нм в качестве меры высвобождения гемоглобина. Ось X представляет концентрацию (мкг/мл) каждого антитела.
Фиг. 2 представляет собой линейный график, отображающий зависимое от концентрации ингибирование гемолиза эритроцитов курицы R3 8Q замещенной формой пекселизумаба. Источником R3 8Q замещенного антитела, использованным в эксперименте было: (i) R38Q замещенное антитело из 50 мг/мл раствора (сплошные ромбы); (ii) R38Q замещенное антитело из 10 мг/мл раствора (сплошные квадраты); или (iii) R38Q замещенное антитело из 1,9 мг/мл раствора (сплошные треугольники). Ось Y представляет различимую видимую абсорбцию при 415 нм в качестве меры высвобождения гемоглобина. Ось X ось представляет концентрацию (мкг/мл) каждого антитела.
Подробное описание
Изобретение относится к полипептидам, которые связываются с компонентом комплемента С5, а также к нуклеиновым кислотам, которые кодируют полипептиды. Полипептиды могут быть использованы во множестве диагностических и терапевтических применений, таких как способы лечения или профилактики комплемент-связанного нарушения. Не подразумевая ограничение ни в коей мере, иллюстративный полипептиды, нуклеиновые кислоты, конъюгаты, фармацевтические композиции и составы, и способы использования любого из вышеприведенного конкретизированы ниже и пояснены в демонстрационных примерах.
Композиции
Композиции, описанные в настоящем документе, содержат один
или более полипептидов, связывающих компонент С5 комплемента.
Полипептиды содержат одноцепочечные антитела, которые
специфично связываются с С5. С5-связывающие полипептиды могут
иметь аминокислотную последовательность, которая включает, или
состоит из следующей последовательности:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATN LADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK RTGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFSNYWI QWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSS LRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID N0:2).
Как подробно описано в демонстрационных примерах,
одноцепочечное антитело, имеющее аминокислотную
последовательность SEQ ID N0:2, является вариантом одноцепочечного антитела пекселизумаб, в котором аргинин (R) в положении 38 был замещен на глутамин (Q) . Замена R38Q обеспечивает значительные физико-химические преимущества для варианта антитела, включая, например, повышенную растворимость в водном растворе. Вариант антитела содержит: вариабельную область легкой цепи антитела (аминокислоты 1-107 SEQ ID N0:2); две аминокислоты константной области легкой цепи иммуноглобулина (аминокислоты 108 и 109) ; шарнирный пептидный линкер (аминокислоты 110-124 SEQ ID N0:2) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (аминокислоты 125-246 SEQ ID
N0:2).
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий
полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая
на более чем по меньшей мере 50 (например, более чем или на
значение равное 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,
63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,
79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,
95, 96, 97, 98 или 99) % идентична аминокислотной
последовательности SEQ ID N0:2. Аминокислотная
последовательность содержит глутамин в положении 38 SEQ ID N0:2. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит аминокислотную последовательность, на более чем по меньшей мере 50% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2, где полипептид содержит первый аминокислотный сегмент, который идентичен аминокислотам 1-107 SEQ ID N0:2, и второй, сегмент который идентичен аминокислотам 125-24 6 SEQ ID N0:2.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, является вариантом полипептида, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID N0:2, но не более чем с 30 (например, 29, 28,27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2 или 1) аминокислотными заменами. Замены могут быть консервативными или неконсервативными. Однако полипептид должен содержать глутамин в положении 38 SEQ ID N0:2. В некоторых вариантах осуществления полипептид не содержит замены в аминокислотах 1-107 SEQ ID N0:2 и/или не содержит замены в аминокислотах 125-246 SEQ ID N0:2.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид содержит фрагмент полипептида, имеющий по меньшей мере 50% (см. выше) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:2 или фрагмент варианта полипептида, описанный выше. Например, С5-связывающий полипептид может содержать по меньшей мере 2 0 (например, 22, 25, 27, 30, 32, 35, 37, 40, 42, 45, 47, 50, 52, 55, 57, 60, 62, 65, 67, 70, 72, 75, 77, 80, 82, 85, 87, 90, 92, 95, 97, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160,
165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 или 200 или более) последовательных аминокислот SEQ ID N0:2, где аминокислотная последовательность содержит глутамин в положении 38 SEQ ID N0:2. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит по меньшей мере 20, но менее чем 24 6 (например, 245, 244, 243, 242, 241, 240, 235, 230, 225, 220, 215, 210, 205, 200, 195, 190, 185, 180, 175, 170, 165, 160, 155, 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90 или менее) последовательных аминокислот SEQ ID N0:2, где аминокислотная последовательность содержит глутамин в положении 38 SEQ ID N0:2. Все что требуется от фрагмента полипептида - это его связывание с компонентом С5 комплемента.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды являются вариантами с делециями, которые сохраняют глутамин в положении 3 8 SEQ ID N0:2. Как описано выше, в вариантах с делециями может отсутствовать, например, одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 90, или более единичных аминокислот. В вариантах с делециями могут также отсутствовать один или более сегментов из двух или более (например, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 90, или более) последовательных
аминокислот или несоседних отдельных единичных аминокислот.
Делеция может произойти на карбокси-конце и/или амино-конце
полипептида. В некоторых вариантах осуществления делеция может
быть внутренней делецией. Например, С5-связывающий вариант с
делециями полипептида может содержать первый сегмент,
содержащий аминокислоты 1-107 SEQ ID N0:2 (включая глутамин
38), и второй сегмент, содержащий аминокислоты 125-246 SEQ ID
N0:2. Два аминокислотных сегмента могут быть связаны
непосредственно вместе или связаны аминокислотной
последовательностью, которая является гетерологичной первому и
второму сегментам. В некоторых вариантах осуществления
гетерологичная аминокислотная последовательность может быть
13,
полиглициновой или полисериновой линкерной группой, описанной, например, в патентах США No. 5525491 и 5258498, описание каждого из которых полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная аминокислотная последовательность содержит или состоит из GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N0:3).
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий
полипептид, описанный в настоящем документе, может быть слитым
белком. Слитый белок может содержать один или более С5-
связывающих сегментов (например, сегменты аминокислотной
последовательности SEQ ID N0:2) и один или более сегментов,
которые являются гетерологичными С5-связывающему(им)
сегменту(ам). Гетерологичная последовательность может быть,
например, антигенной меткой (например, FLAG, полигистидин,
гемагглютинин (НА), глутатион-Б-трансфераза (GST) или мальтоза-
связывающий белок (МВР)). Гетерологичными последовательностями
также могут быть белки, подходящие в качестве диагностических
или детектируемых маркеров, например, люцифераза, зеленый
флуоресцентный белок (GFP) или хлорамфеникол-ацетилтрансфераза
(CAT) . Например, слитый белок может содержать первый сегмент,
содержащий аминокислоты 1-107 SEQ ID N0:2 (включая глутамин
38), и второй сегмент, содержащий аминокислоты 125-246 SEQ ID
N0:2, где первый и второй сегменты соединены гетерологичной
аминокислотной последовательностью. В другом примере, слитый
белок может содержать С5-связывающий сегмент, содержащий
аминокислоты 1-246 SEQ ID N0:2, и аминоконцевой и/или
карбоксиконцевой гетерологичный сегмент, например,
карбоксиконцевую антигенную метку.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, могут содержать (например, в виде слитого белка) или быть соединены с (например, химически соединены с) гетерологичной группой, которая направляет полипептиды к месту активации комплемента, например, к поверхности красных кровяных клеток (например, красные кровяные клетки у PNH пациента), к почке (например, трансплантированная почка), к суставному соединению (например,
сустав пациента с ревматоидным артритом) или к глазу (например, макула).
С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, специфично связываются с компонентом комплемента белком С5 человека (например, белок С5 человека, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0:4). Термины "специфичное связывание" или "специфично связывается" относятся к двум молекулам, образующим комплекс (например, комплекс между С5-связывающим полипептидом и белком-компонентом С5 комплемента), который является относительно стабильным при физиологических условиях. Как правило, связывание считают специфичным, когда константа ассоциации (ка) больше 106 М^с-1. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, имеет константу диссоциации (kd) менее или равную 1СГ3 (например, 8х1СГ4, 5х1СГ4, 2х1СГ4, 1СГ4 или 1СГ5) с-1. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, имеет KD менее 1СГ8, 1СГ9, 1СГ10, 1СГ11 или 1СГ12 М. Константа равновесия KD представляет собой отношение кинетических констант скорости -kd/ka. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, имеет KD менее lxicr9 М (например, менее lxicr10 М) .
Способы определения связывания С5-связывающего полипептида с С5 белком и/или аффинности С5-связывающего полипептида к С5 белку известны в данной области. Например, взаимодействие между С5-связывающим полипептидом и С5 может быть детектировано и/или измерено количественно с использованием множества технологий, таких как, но не ограничиваясь ими, Вестерн-блоттинг, дот-блот, способ плазмонного-поверхностного резонанса (например, Biacore system; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden и Piscataway, N.J.), октет или энзим связанный иммуносорбентный метод исследования (ELISA). См., например, Harlow and Lane (1988) "Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Benny К. C. Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocols," Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A
Practical Guide," W.H. Freeman and Co., NY; Borrebaek (1995) "Antibody Engineering, " 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne et al. (1993) J Immunol Meth 160: 191-198; Jonsson et al. (1993) Ann Biol Clin 51 : 19-26; and Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11 :620-627. См. также патент США No.6355245.
Как описано выше, раскрытые в настоящем документе С5-
связывающие полипептиды могут ингибировать компонент
комплемента С5. В частности, полипептиды ингибируют выработку
анафилотоксина С5а и/или активных фрагментов С5Ь компонента
комплемента белка С5 (например, белок С5 человека).
Соответственно, С5-связывающие полипептиды ингибируют,
например, провоспалительные эффекты С5а и выработку С5Ь-9 мембраноатакующего комплекса (MAC) на поверхности клетки и последующий клеточный лизис. (См., например, Moongkarndi et al.
(1982) Immunobiol 162:397 и Moongkarndi et al. (1983) Immunobiol 165:323).
Подходящие способы для измерения ингибирования С5 расщепления описаны в настоящем документе и известны в данной области. Например, концентрация и/или физиологическая активность С5а и С5Ь в жидкости организма может быть измерена способами, хорошо известными в данной области. Способы для измерения концентрации или активности С5а включают, например, хемотаксические анализы, RIA или ELISA (см., например, Ward и Zvaifler (1971) J Clin Invest 50(3):606-16 и Wurzner et al.
(1991) Complement Inflamm 8_: 328-340) . Для C5b могут быть использованы гемолитические анализы или анализы для растворимого С5Ь-9, как указано выше настоящем документе. Также могут быть использованы другие анализы, известные в данной области.
Ингибирование компонента С5 комплемента может также снижать способность лизировать клетки комплементом в жидкостях организма индивида жидкость. Такие снижения способности лизировать клетки комплементом могут быть измерены способами, широко известными в данной области, таким как, например, стандартным гемолитическим анализом, таким как анализ гемолиза,
описанный Rabat and Mayer (eds), "Experimental Immunochemistry, 2nd Edition," 135-240, Springfield, IL, CC Thomas (1961), страницы 135-139, или стандартная вариация этого анализа, такая как способ гемолиза эритроцитов курицы, как описано, например, в Hillmen et al. (2004) N Engl J Med 350 (6) :552.
С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть получены с использованием множества технологий, известных в области молекулярной биологии и химии белка. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, (например, С5-связывающий полипептид, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2) может быть встроена в вектор экспрессии, который содержит транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, которые содержат, например, промоторные последовательности, сайты связывания рибосомы, последовательности старта и окончания транскрипции, последовательности старта и окончания трансляции, сигналы терминации транскрипции, сигналы полиаденилирования и энхансерные или активаторные последовательности. Регуляторные последовательности включают промотор и последовательности старта и окончания транскрипции. В дополнение, вектор экспрессии может содержать более чем одну репликационную систему так, что он может быть сохраняться в двух различных организмах, например, в клетках млекопитающих или насекомых для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Иллюстративной нуклеиновой кислотой, которая кодирует иллюстративный С5-связывающий полипептид, является следующая:
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGTCCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGAT
AGGGTCACCATCACCTGCGGCGCCAGCGAAAACATCTATGGCGCGCTGAA
CTGGTATCAACAGAAACCCGGGAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACGGTG
CGACGAACCTGGCAGATGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCGGCTCCG
GAACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGACTTCGCT
ACGTATTACTGTCAGAACGTTTTAAATACTCCGTTGACTTTCGGACAGGGT
ACCAAGGTGGAAATAAAACGTACTGGCGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGTGG
ATCTGGTGGTGGCGGTTCTCAAGTCCAACTGGTGCAATCCGGCGCCGAGG
TCAAGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAAGTGTCCTGTAAAGCTAGCGGCTAT
ATTTTTTCTAATTATTGGATTCAATGGGTGCGTCAGGCCCCCGGGCAGGGC
CTGGAATGGATGGGTGAGATCTTACCGGGCTCTGGTAGCACCGAATATAC
CGAAAATTTTAAAGACCGTGTTACTATGACGCGTGACACTTCGACTAGTA
CAGTATACATGGAGCTCTCCAGCCTGCGATCGGAGGACACGGCCGTCTAT
TATTGCGCGCGTTATTTTTTTGGTTCTAGCCCGAATTGGTATTTTGATGTTT
GGGGTCAAGGAACCCTGGTCACTGTCTCGAGCTGA (SEQ ID NO:l).
В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота содержит нуклеотиды 1-738 SEQ ID N0:1, например, в вариантах осуществления, где карбоксиконцевые слитые белки должны быть получены или продуцированы.
Несколько возможных векторных систем доступны для экспрессии С5-связывающих полипептидов из нуклеиновых кислот в клетках млекопитающих. Один класс векторов основывается на интеграции требуемой последовательности гена в геном клетки-хозяина. Клетки, которые имеют стабильно интегрированную ДНК, могут быть отобраны одновременным введением генов устойчивости к лекарственному средству, таких как Е. coli gpt (Mulligan и Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78_:2072) или Tn5 neo (Southern и Berg (1982) Mol Appl Genet 1:321). Селектируемый маркерный ген может или быть связан с геном последовательности ДНК, которая должна быть экспрессирована, или вводиться в ту же клетку котрансфекцией (Wigler et al. (1979) Cell 16:11). Второй класс векторов использует ДНК элементы, которые придают автономно реплицирующиеся способности экстрахромосомной плазмиде. Такие векторы могут быть получены из вирусов животных, таких как папилломавирус быка (Sarver et al. (1982)
Proc Natl Acad Sci USA, 7_9:7147), вирус полиомы (Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 8JL:1292) или вирус SV40 (Lusky и Botchan (1981) Nature 293:79).
Векторы экспрессии могут быть введены в клетки способом, подходящим для последующей экспрессии нуклеиновой кислоты. Способ введения в значительной степени обуславливается типом мишеневой клетки, рассматриваемым ниже. Иллюстративные способы включают преципитацию СаРСм, слияние липосом, липофекцию, электропорацию, вирусную инфекцию, декстран-опосредованную трансфекцию, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов и прямую микроинъекцию.
Подходящие клетки хозяина для экспрессии С5-связывающих полипептидов включают клетки дрожжей, бактерий, насекомых, растений и млекопитающих. Особый интерес представляют бактерии, такие как Е. coli, грибы, такие как Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, клетки насекомых, такие как SF9, клеточные линии млекопитающих (например, клеточные линии человека) , а также первичные клеточные линии (например, первичные клетки млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды могут быть экспрессированы в клетках яичников китайского хомячка (СНО) или в подходящей клеточной линии миеломы, такой как (NS0).
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть экспрессирован в и очищен из трансгенных животных (например, трансгенных млекопитающих). Например, С5-связывающий полипептид может быть получен в трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком (например, грызуны, овцы или козы) и выделен из молока, как описано, например, в Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629; van Kuik-Romeijn et al. (2000) Transgenic Res 9(2): 155-159; и Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231 (1-2) : 147-157.
С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть получены из клеток культивированием клетки хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую антитела, при условиях и в течение промежутка времени, достаточных для того,
чтобы осуществить экспрессию белков. Такие условия для экспрессии белка будут варьироваться в соответствии с выбором вектора экспрессии и клетки хозяина, и будут без труда установлены специалистом в данной области посредством рутинных экспериментов. Например, полипептиды, экспрессированные в Е. coli, могут быть рефолдированы из телец включения (см., например, Hou et al. (1998) Cytokine 1_0:319-30) . Бактериальные системы экспрессии и способы их применения широко известны в данной области (см. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, и Molecular Cloning-A Laboratory Manual-3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)). Выбор кодонов, подходящих векторов экспрессии и подходящих клеток хозяина будет варьироваться в зависимости от ряда факторов и по необходимости может быть легко оптимизирован. С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть экспрессирован в клетках млекопитающих или в других экспрессионных системах, включая, но не ограничиваясь ими, дрожжи, бакуловирусы и экспрессионные системы in vitro (см., например, Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 1_8: 213-220) .
После экспрессии С5-связывающие полипептиды могут быть выделены. Термин "очищенный" или "выделенный" применительно к любым белкам, описанным в настоящем документе (например, С5-связывающий полипептид), относится к полипептиду, который был отделен или очищен от компонентов (например, белки или другие природные биологические или органические молекулы), которые в естественных условиях сопровождают его, например, другие белки, липиды и нуклеиновая кислота, в прокариоте, экспрессирующем белки. Как правило, полипептид является очищенным, когда он составляет по меньшей мере 60 (например, по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97 или 99) % по массе от общего белка в образце.
С5-связывающий полипептид может быть выделен или очищен
множеством путей, известных специалисту в данной области, в
зависимости от того, какие другие компоненты представлены в
образце. Стандартные способы очистки включают
электрофоретические, молекулярные, иммунологические и
хроматографические технологии, включая ионообменную,
гидрофобную, аффинную и обращенно-фазовую HPLC хроматографию. Например, С5-связывающий полипептид может быть очищен с использованием стандартной колонки анти-антитело или, например, колонки с белком-А или белком-G. Также применимы технологии ультрафильтрации и диафильтрации совместно с концентрированием белка. См., например, Scopes (1994) "Protein Purification, 3rd edition," Springer-Verlag, New York City, New York. Степень очистки обязательно будет варьироваться в зависимости от требуемого использования. В некоторых случаях не будет необходима очистка экспрессированного полипептида.
Способы для определения выхода или чистоты очищенного полипептида известны в данной области и включают, например, анализ Бредфорда, УФ-спектроскопию, биуретовый анализ на белки, анализ на белки Лоури, белковый анализ с использованием амидочерного, жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC), масс-спектроскопию (MS) и гель-электрофоретические способы (например, с использованием красителя для белка, такие как окрашивание кумасси голубым или коллоидным серебром).
В некоторых вариантах осуществления эндотоксин может быть удален из составов С5-связывающего полипептида. Способы удаления эндотоксина из белкового образца известны в данной области. Например, эндотоксин может быть удален из белкового образца с использованием множества коммерчески доступных реагентов, включая, без ограничения, наборы для удаления эндотоксинов ProteoSpin(tm) (Norgen Biotek Corporation), гель для удаления эндотоксинов Detoxi-Gel (Thermo Scientific; Pierce Protein Research Products), набор для удаления эндотоксинов MiraCLEAN(r) (Mirus) или Acrodisc(tm) - Mustang(r) E membrane (Pall Corporation).
Способы детектирования и/или измерения количества эндотоксина, представленного в образце (как перед, так и после очистки) известны в данной области, и доступны коммерческие наборы. Например, концентрация эндотоксина в белковом образце может быть определена с использованием хромогенного набора QCL
1000 (BioWhittaker), наборов на основе лизата амебоцитов Лимулус (LAL), таких как наборы Pyrotell(r), Pyrotell(r)-T, Pyrochrome(r), Chromo-LAL и CSE, доступные от Associates of Cape Cod Incorporated.
С5-связывающие полипептиды могут быть модифицированы после их экспрессии и очистки. Модификации могут представлять собой ковалентные или нековалентные модификации. Такие модификации могут быть введены в С5-связывающие полипептиды посредством, например, взаимодействия целевых аминокислотных остатков полипептида с органическим дериватизирующим средством, которое способно к взаимодействию с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Подходящие места для модификации могут быть выбраны с использованием любого множества критериев, включая, например, структурный анализ или анализ аминокислотной последовательности С5-связывающих полипептидов.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды могут быть конъюгированы с гетерологичной группой. В вариантах осуществления, где гетерологичная группа является полипептидом, С5-связывающий полипептид и гетерологичная группа, описанные в настоящем документе, могут быть соединены посредством слитого белка. Гетерологичная группа может быть, например, гетерологичным полипептидом, терапевтическим средством (например, токсин или лекарственное средство) или детектируемой меткой такой как, но не ограниченной ими, радиоактивная метка, ферментативная метка, флуоресцентная метка или люминесцентная метка. Подходящие гетерологичные полипептиды включают, например, антигенную метку (например, FLAG, полигистидин, гемагглютинин (НА), глутатион-Б-трансферазу (GST) или мальтоза-связывающий белок (МВР)) для использования для очистки антител. Гетерологичные полипептиды также включают полипептиды, которые являются подходящими в качестве диагностических или детектируемых маркеров, например, люцифераза, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT). Если гетерологичная группа является полипептидом, то группа может быть включена в
Конъюгаты и слитые белки
состав С5-связывающего полипептида, с получением в результате слитого белка. Гетерологичные полипептиды также включают, например, факторы роста, цитокины и хемокины. Факторы роста могут включать, например, фактор роста эндотелия сосудов
(VEGF), инсулиноподобный фактора роста клеток (IGF), костный
морфогенетический белок (BMP), гранулоцитарный
колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-
макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF),
нейроростовой фактор (NGF); нейротрофический, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эритропоетин (ЕРО), тромбопоэтин (ТРО), миостатин(GDF-8), ростовой фактор дифференцировки-9 (GDF9), основной фактор роста фибробластов (bFGF или FGF2), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста гепатоцитов
(HGF) и нейрегулин (например, NRG1, NRG2, NRG3 или NRG4). Цитокины включают, например, интерфероны (например, IFNy) , факторы некроза опухоли (например, TNFa или TNFp) и интерлейкины (например, от IL-1 до IL-33 (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13 или IL-15)). Хемокины включают, например, 1-309, ТСА-3, MCP-I, MIP-la, MIP-ip, RANTES, СЮ, MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, эотаксин, МСР-5, МСР-4, NCC-I, HCC-I, лейкотактин-1, LEC, NCC-4, TARC, PARC или эотаксин-2. В некоторых вариантах осуществления гетерологичная группа является нацеливающей группой.
Также изобретение относится к конструкции, содержащей С5-
связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, и
нацеливающую группу, которая направляет С5-связывающий
полипептид в соответствующую клетку, ткань или биологическое
микроокружение. Например, конструкция может содержать С5-
связывающий полипептид и нацеливающую группу, которая
направляет полипептид к месту активации комплемента (например,
красные кровяные клетки пациентов с гемолитической болезнью,
такой как PNH, CAD, aHUS или ТТР). Местом активации комплемента
также может быть, например, сосудистая система
трансплантированного органа, глаз пациента с AMD, легкие
пациента с астмой или COPD или суставное соединение пациента, пораженного RA. Такие нацеливающие группы могут включать, например, растворимую форму рецептора комплемента 1 (CR1), растворимую форму рецептора комплемента 2 (CR2) или антитело (или его антиген-связывающий фрагмент), которое связывается с СЗЬ и/или с C3d. Способы получения слитых белков (например, слитые белки, содержащие С5-связывающий полипептид и растворимую форму CR1 человека или CR2 человека) известны в данной области и описаны, например, в патенте США No. 68 972 90; опубликованной патентной заявке США No. 2005265995; и Song et al. (2003) J Clin Invest 1_1_(12) : 1875-1885. Способы получения биспецифичного антитела (например, биспецифичное антитело, содержащее С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, и антитела, которое связывается с СЗЬ и/или C3d) , также известны в данной области и описаны в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может содержать группу, которая направляет полипептид в почку. Такие конструкции могут подходить, например, для лечения комплемент-связанных болезней почек, таких как, но не ограниченных ими, почечное ишемически-реперфузионное повреждение (IRI), отторжение трансплантата почки или гемолитический уремический синдром. Антигены, с которым может связаться нацеливающая в почку группа включают, например, дипептидилпептидазу IV (DPPIV), Lrp2 (мегалин) , Cubn
(кубулин), АЬсс2 (АТР-связывающая кассета, подсемейство С, член
2), АЬсс4 (АТР-связывающая кассета, подсемейство С, член 4),
АЬсЫЬ (АТР-связывающая кассета, подсемейство В, член 1; Р-
гликопротеин), Slclal (эффекторный аминокислотный носитель 1),
Slc3al (цистин, двуосновные и нейтральные аминокислотные
транспортеры), Slc5al (натрий/глюкозный котранспортер 1),
Slc5a2 (натрий/глюкозный котранспортер 2), Slc9a3
(натрий/водородный обмениватель 3), Slcl0a2 (натрий/таурохолат котранспортирующий полипептид), Slcl3a2 (натрий зависимый дикарбоксилатный котранспортер), Sicl5al (олигопептидный транспортер 1), Sicl5a2 (олигопептидный транспортер 2), Sicl7al
(натрий фосфатный транспортер 1), Slcl7a2 (натрий фосфатный транспортер 3), Slcl7a3 (натрий фосфатный транспортер 4), Slcolal (белок 1 транспортер органических анионов), Slc22a4
(транспортер органических катионов 0CTN1), Slc22a5 (транспортер
органических катионов 0CTN2), Slc22all (транспортер
органических анионов 4), Slc34al (натрий фосфатный транспортер II), мегалин (связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности белок 2, LRP2), нейтральную эндопептидазу (NEP), CD10, муцин 2 0 (или другие муцины), повреждающую почки молекулу 1 (KIM-1) или клеточный рецептор 1 вируса гепатита А и мегалин.
Большое разнообразие форматов биспецифичного антитела известно в области конструирования антител и способов создания биспецифичных антител (например, биспецифичное антитело, содержащее С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, и антитело, которое связывается с СЗЬ, C3d или ткане-специфичным антигеном) находятся в рамках компетенции специалиста в данной области. Традиционно, рекомбинантная выработка биспецифичных антител основана на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи имеют различные специфичности (Milstein and Cuello (1983) Nature 305:537-539). Вариабильные домены антитела с требуемой специфичностью связывания (антигенсвязывающий центр антитела) могут быть слиты с последовательностями константных доменов иммуноглобулина. Слияние может включать константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, например, по меньшей мере часть шарнирного участка, областей СН2 и СНЗ. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и, если требуется, легкой цепи иммуноглобулина, вводятся в отдельные вектора экспрессии, и котрансфецируются в подходящем организме хозяина. Подробнее иллюстрацию известных в настоящее время способов получения биспецифичных антител см., например, Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121:210; Публикация PCT No. WO 96/27 011; Brennan et al. (1985) Science 22 9:81; Shalaby et al. , J. Exp. Med. (1992) 175:217-225; Kostelny et al. (1992) J Immunol 148(5) : 1547-1553; Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448; Gruber et al. (1994) J Immunol 152:5368; и
Патент США No. 5534254 описывает несколько различных типов биспецифичных антител, включая, например, одноцепочечные Fv фрагменты, связанные вместе пептидными линкерами, хелатирующими средствами или химическими или дисульфидными соединениями. В другом примере Segal и Bast [(1995) Curr Protocols Immunol Suppl. 14:2.13.1-2.13.16] описывает способы химического поперечного связывания двух моноспецифичных антител с образованием таким образом биспецифичного антитела. Как описано выше, биспецифичное антитело, описанное в настоящем документе, может быть образовано, например, конъюгированием двух одноцепочечных антител, которые выбраны из, например, С5-связывающего полипептида, описанного в настоящем документе, и антитела, которое связывается, например, с СЗЬ, C3d, или специфичного к легким антигена, специфичного к глазам антигена или специфичного к почкам антигена.
Различные технологии создания и выделения фрагментов биспецифичного антитела непосредственно из рекомбинантной культуры клеток также были описаны. Например, биспецифичные антитела, полученные с использованием лейциновой застежки. (См., например, Kostelny et al. (1992) J Immunol 148(5) : 15471553 и de Kruif and Logtenberg (1996) J Biol Chem 271 (13) :76307634.) Пептиды лейциновой застежки из белков Fos и Jun могут быть связаны с Fab' участками двух различных антител слиянием генов. Гомодимеры антитела могут быть восстановлены в шарнирном участке с образованием мономеров и затем заново окислены с образованием гетеродимеров антитела.
В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело может быть тандемным одноцепочечным (sc) Fv фрагментом, который содержит два различных scFv фрагмента, ковалентно связанных
Tutt et al. (1991) J Immunol 147:60. Биспецифичные антитела также включают поперечно связанные или гетероконъюгатные антитела. Гетероконъюгатные антитела могут быть получены с использованием любых подходящих способов поперечного связывания. Подходящие поперечно-связывающие средства широко известны в данной области и раскрыты в патенте США No. 4 67 698 0 вместе с множеством технологий поперечного связывания.
вместе линкером (например, полипептидным линкером) . См., например, Ren-Heidenreich et al. (2004) Cancer 100:1095-1103 and Korn et al. (2004) J Gen Med 6_: 642-651. Примеры линкеров могут включать, но не ограничиваются ими, (Gly4Ser)2,
(Gly4Ser) з (G4S) , (Gly3Ser) 4 (G3S) , SerGly4 и SerGly4SerGly4. В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать или быть, целой или частью константной области тяжелой цепи полипептида, такой как СН1 домен, как описано, например, в Grosse-Hovest et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101: 685868 63. В некоторых вариантах осуществления два фрагмента антитела могут быть ковалентно связаны вместе посредством полиглицин-серинового или полисерин-глицинового линкера, как описано, например, в патентах США No. 7112324 и 5525491, соответственно. См. также патент США No. 5258498. Открытие в отношении инженерии антител и линкеров полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки. Способы получения биспецифичных тандемных scFv антител описаны, например, в Maletz et al. (2001) Int J Cancer 93:409-416; Hayden et al.
(1994) Ther Immunol 1_:3-15; и Honemann et al. (2004) leukemia 1_8: 636-644. Альтернативно, антитела могут быть "линейными антителами", как описано, например, в Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062. Кратко, такие антитела содержат пару тандемных Fd сегментов (VH-CH1-VH-CH1 ) , которые образуют пару антиген связывающих областей.
Биспецифичное антитело также может быть диателом. Технология диател, описанная, например, Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448, предоставила альтернативный механизм создания фрагментов биспецифичного антитела. Фрагменты содержат вариабильный домен тяжелой цепи
(VH) , связанный с вариабильным доменом легкой цепи (VL) линкером, который является слишком коротким для того, чтобы позволить объединение между двумя доменами в одной цепи. Соответственно, VH и VL домены одного фрагмента вынуждены объединяться с комплементарными VL и VH доменами другого фрагмента, посредством этого образуя два антиген-связывающих участка. (См., также, например, Zhu et al. (1996) Biotechnology
1^:192-196 и Helfrich et al. (1998) Int J Cancer 76:232-239.) Биспецифичные одноцепочечные диатела (scDb), а также способы получения scDb описаны, например, в Brusselbach et al. (1999) Tumor Targeting Ј:115-123; Kipriyanov et al. (1999) J Mol Biol 293:41-56; и Nettlebeck et al. (2001) Mol Ther 3:882-891.
Изобретение также относится к варианту форм биспецифичных антител, таких как молекулы тетравалентного двойного вариабильного домена иммуноглобулина (DVD-Ig), описанные в Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25(11): 1290-1297. Молекулы DVD-Ig разработаны так, что два различных вариабильных домена легкой цепи (VL) из различных исходных антител связаны в тандем непосредственно или через короткий линкер посредством технологии рекомбинантных ДНК, за ними следует константный домен легкой цепи. Способы получения молекулы DVD-Ig из двух исходных антител дополнительно описаны, например, в публикациях РСТ No. WO 08/024188 и WO 07/024715, описание каждой из которых полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки. Также охватывается биспецифичный формат, описанный, например, в опубликованной патентной заявке США No. 20070004909, описание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.
Иллюстративные анти-СЗЬ антитела, а также способы, подходящие для получения таких антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в публикации РСТ No. WO 87/06344; патенте США No. 6572856; Peng et al. (2004) J Clin Oncol 22 (14S) :2621; и Peng et al. (2005) Cancer Immunol Immunother 54(12) : 1172-9, описания каждого из которых полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки. Иллюстративные анти-СЗо! антитела, а также способы, подходящие для получения таких антител хорошо известны в данной области и описаны, например, в Cruz and Leon (2007) Hybridoma 26(6) :433-4; Koistinen et al. (1989) Complement Inflamm 6(4):270-280; и Dobbie et al. (1987) Transfusion 27(6):453-459, описание каждого из которых полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.
С5-связывающие полипептиды и нацеливающие группы, которые используются для образования молекул биспецифичных антител,
описанных в настоящем документе, могут быть, например,
химерными, гуманизированными, повторно гуманизированными,
деиммунизированными или полностью человеческими. Химерные
антитела получены посредством рекомбинантных процессов хорошо
известных в данной области инженерии антител и имеют
вариабельную область нечеловеческого млекопитающего и
человеческую константную область. Гуманизированные антитела
более точно соответствуют последовательности человеческого
антитела, чем химерные антитела. Сконструированы
гуманизированные вариабильные домены, в которых аминокислотные последовательности одного или более CDR нечеловеческого происхождения трансплантированы в человеческие каркасные области (FR), как описано, например, в Jones et al. (1996) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 и патенте США No. 5530101. Гуманизированное антитело может быть антителом, которое содержит одну или более человеческих каркасных областей, которые не являются зародышевыми. Например, гуманизированное антитело может содержать одну или более каркасных областей, которые подверглись соматической сверхмутации и таким образом больше не являются зародышевыми по существу. (См., например, Abbas, Lichtman, и Pober (2000) "Cell and Molecular Immunology," 4th Edition, W.B. Saunders Company (ISBN:0721682332)). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит человеческие каркасные области зародышевой линии, например, VH области зародышевой линии человека, D области зародышевой линии человека и J области зародышевой линии человека (например, JH области зародышевой линии человека). Центр MRC для белковой инженерии поддерживает онлайн систему баз данных VBase, которая включает аминокислотные последовательности для большого количества каркасных областей зародышевых линий человека. См., например, Welschof et al. (1995) J Immunol Methods 179:203-214; Chothia et al. (1992) J Mol Biol 221:776-798; Williams et al. (1996) J Mol Biol 264:220-232; Marks et al. (1991) Eur J Immunol 21:985991; и Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. Аминокислотные последовательности для совокупности подходящих
каркасных областей зародышевых линий человека также могут быть
получены в базе данных зародышевых линий JOINSOLVER(r) (например,
базы данных Rabat JOINSOLVER(r) или базы данных IMGT
JOINSOLVER(r)), поддерживаемых частично министерством
здравоохранения и социального обеспечения США и Национальными институтами здравоохранения. См., например, Souto-Carneiro et al. (2004) J Immunol. 172:6790-6802.
Полностью человеческие антитела являются антителами,
имеющими вариабильные и константные области (если они
представлены), полученные из иммуноглобулиновых
последовательностей зародышевых линии человека. Антитела
человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые
иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевых линий
человека (например, мутации, введенные посредством случайного
или сайтспецифичного мутагенеза in vitro или посредством
соматической мутации in vivo). Однако термин "антитело
человека" не включает антитела, в которых CDR
последовательности, полученные из зародышевых линий других
видов млекопитающих, таких как мышь, были трансплантированы в
каркасные последовательности человека (т.е., гуманизированные
антитела). Полностью человеческие антитела или антитела
ченловека могут быть получены из трансгенных мышей, несущих
гены антитела человека (несущих вариабильные (V),
дополнительные (D) , соединяющие (J) и константные (С) экзоны)
или из клетки человека. Например, возможно вывести трансгенных
животных (например, мышей) которые способны при иммунизации
продуцировать полный набор антител человека в отсутствии
эндогенной выработки иммуноглобулинов. (См., например,
Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551;
Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Bruggemann et al.
(1993) Year in Immunol. 7_:33; и Duchosal et al. (1992) Nature
355:258.) Могут быть созданы линии трансгенных мышей,
содержащие генетические последовательности из
неперегруппированных генов иммуноглобулинов человека. Последовательности человека могут кодировать как тяжелые, так и легкие цепи антитела человека и будут функционировать корректно
в мышах, подвергаясь перестройке для обеспечения большого набора антител, подобного набору у людей.
Полностью и частично человеческие антитела, описанные выше, являются менее иммуногенными, чем их мышиные или полученные не из человека аналоги антител. Следовательно, менее вероятно, что все эти молекулы (или их производные) вызовут вследствие этого иммунный или аллегический ответ. Соответственно, они лучше подходят для in vivo введения людям, особенно когда необходимо повторное или длительное введение, как это может быть необходимо для лечения биспецифичными антителами, описанными в настоящем документе (например, биспецифичные антитела, содержащие С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, и нацеливающую группу).
Подходящие радиоактивные метки включают, например, 32Р,
33Р, 14С, 125I, 131I, 35S и 3Н. Подходящие флуоресцентные метки
включают, без ограничения, флуоресцин, флуоресцинизотиоцианат
(FITC), зеленый флуоресцентный белок (GFP), DyLight 488,
фикоэритрин (РЕ), пропидиум иодид (PI), PerCP, РЕ-А1еха Fluor(r)
7 00, Су5, аллофикоцианин и Су7. Люминесцентные метки включают,
например, любые из множества люминесцентных хелатов лантанидов
(например, европия или тербия). Например, подходящие хелаты
европия включают хелат европия, образованный
диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTPA) или
тетраазациклододекан-1,4,7,1О-тетрауксусной кислотой (DOTA). Ферментативные метки включают, например, щелочную фосфатазу, CAT, люциферазу и пероксидазу хрена.
Два белка (например, С5-связывающий полипептид и
гетерологичная группа) могут быть поперечно связаны с
использованием любого количества химических кросс-линкеров.
Примерами таких кросс-линкеров являются линкеры, связывающие
два аминокислотных остатка посредством соединения, которое
включает "экранированную" дисульфидную связь. В таких
соединениях дисульфидная связь в поперечно связывающем блоке
защищена (экранирующими группами с обеих сторон дисульфидной
связи) от восстановления воздействием, например,
восстановленного глутатиона или фермента дисульфидредуктазы.
Один из подходящих реагентов, 4-сукцинимидилоксикарбонил-а-
метил-а(2-пиридилтио)толуол (SMPT), образует такое соединение
между двумя белками с использованием концевого лизина в одном
белке и концевого цистеина на другом. Гетеробифункциональные
реагенты, которые поперечно связываются различными
соединительными группами на каждом белке, также могут быть
использованы. Другие подходящие кросс-линкеры включают, без
ограничения, реагенты которые связывают две аминогруппы
(например, Ы-5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид), две
сульфгидрильные группы (например, 1,4-бис-малеимидобутан),
аминогруппу и сульфгидрильную группу (например, т-
малеимидобензоил-Ы-гидроксисукцинимидовый эфир), аминогруппу и
карбоксильную группу (например, 4-[п-
азидосалициламидо]бутиламин), и аминогруппу и гуанидиновую группу, которая представлена в боковой цепи аргинина (например, п-азидофенилглиоксаль моногидрат).
В некоторых вариантах осуществления радиоактивная метка
может быть непосредственно конъюгирована с аминокислотным
остовом С5-связывающего полипептида. Альтернативно,
радиоактивная метка может быть включена в качестве части
большей молекулы (например, 1251 в мета-[ 1251 ] йодофенил-N-
гидроксисукцинимиде ([ 125I]mlPNHS), который связывается со
свободными аминогруппами с образованием мета-йодофенил (mlP)
производных соответствующих белков (см., например, Rogers et
al. (1997) J Nucl Med 3_8: 1221-1229) , или хелата (например, DOTA
или DTPA), который в свою очередь, связываются остовом белка.
Способы конъюгирования радиоактивных меток или больших
молекул/хелатов, содержащих их, с С5-связывающими
полипептидами, описанными в настоящем документе, известны в данной области. Такие способы содержат инкубирование белков с радиоактивной меткой при условиях (например, рН, концентрация соли и/или температура), которые облегчают связывание радиоактивной метки или хелата с белком (см., например, патент США No. 6001329).
Способы конъюгирования флуоресцентной метки (иногда называемой в настоящем документе "флуорофор") к белку
(например, С5-связывающему полипептиду) известны в данной
области химии белка. Например, флуорофоры могут быть
конъюгированы со свободными аминогруппами (например, лизины)
или сульфгидрильными группами (например, цистеины) белков с
использованием сукцинимидильного (NHS) эфира или
тетрафторфенильных (TFP) эфирных групп, присоединенных к флуорофорам. В некоторых вариантах осуществления флуорофоры могут быть конъюгированы с гетеробифункциональной кросс-линкером, таким как сульфо-SMCC. Подходящие способы конъюгации предполагают инкубирование С5-связывающего полипептида с флуорофором при условиях, которые облегчают связывание флуорофора с белком. См., например, Welch и Redvanly (2003) "Handbook of Radiopharmaceuticals: Radiochemistry и Applications," John Wiley и Sons (ISBN 0471495603).
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды могут быть модифицированы, например, группой, которая увеличивает стабилизацию и/или удерживание антител в циркулировании, например, в крови, сыворотке или других тканях. Например, С5-связывающий полипептид может быть пегилирован, как описано, например, в Lee et al. (1999) Bioconjug Chem 10(6) : 973-8; Kinstler et al. (2002) Advanced Drug Deliveries Reviews 5_4:477-485; и Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 5_4:459-47 6. Стабилизирующая группа может увеличивать стабилизацию или удерживание полипептида по меньшей мере в 1,5 раза (например, по меньшей мере в 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 или 50 или более раз).
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть гликозилированы. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть подвержен ферментативной или химической обработке или получен из клетки так, что антитело имеет сниженное гликозилирование или оно отсутствует. Способы получения полипептидов со сниженным гликозилированием известны в данной области и описаны, например, в патенте США No. 69333 68; Wright et al. (1991) EMBO J 10(10) : 2717-2723; и Co et al. (1993) Mol
Immunol 30:1361.
Фармацевтические композиции и составы
Композиции, содержащие С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, могут быть получены в виде фармацевтической композиции, например, для введения индивиду для лечения или профилактики комплемент-связанного нарушения. Фармацевтические композиции обычно будут содержать фармацевтически приемлемый носитель. В используемом в настоящем документе значении "фармацевтически приемлемый носитель" относится к и включает все растворители, дисперсионные среды, покрытия, противобактериальные и противогрибковые средства, изосмотические и замедляющие абсорбцию средства и тому подобное, являющееся физиологически совместимыми. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемую соль, например, соль присоединения кислоты или соль присоединения основания (см. например, Berge et al. (1977) J Pharm Sci 6_6:1-19) .
Композиции могут быть получены в соответствии со стандартными способами. Фармацевтическое получение является общепринятым и дополнительно описано, например, в Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th Edition, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel et al. (1999) "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems," 7th Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); and Kibbe (2000) "Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association," 3rd Edition (ISBN: 091733096X). В некоторых вариантах осуществления композиция может быть получена, например, в виде буферизированного раствора в подходящей концентрации и подходящего для хранения при 2-8°С (например, 4°С). В некоторых вариантах осуществления композиция может быть получена для хранения при температуре ниже 0°С (например, -20°С или -80°С). В некоторых вариантах осуществления композиция может быть получена для хранения вплоть до 2 лет (например, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, семь месяцев, восемь месяцев, девять месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 1 год, 1 1/г года или 2 года) при 2-8°С
(например, 4°С) . Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиции, описанные в настоящем документе, стабильны при хранении в течение по меньшей мере 1 года при 2-8°С (например, 4°С).
Фармацевтические композиции могут быть во множестве форм.
Такие формы включают, например, жидкую, полутвердую и твердую
лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например,
впрыскиваемые и вливаемые растворы), дисперсии или суспензии,
таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории.
Предпочтительная форма отчасти зависит от предполагаемого
способа введения и терапевтического применения. Например,
композиции, содержащие С5-связывающий полипептид,
предназначенные для системной или местной доставки, могут быть
в форме впрыскиваемых или вливаемых растворов. Соответственно,
композиции могут быть получены для введения парентеральным
способом (например, внутривенная, подкожная, внутрибрюшинная
или внутримышечная инъекция). "Парентеральное введение",
"введенный парентерально" и другие грамматически эквивалентные
словосочетания в используемом в настоящем документе значении
относятся к способам введения, отличным от энтерального и
местного введения, обычно посредством инъекции, и включают, без
ограничения, внутривенную, интраназальную, интраокулярную,
легочную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную,
интракапсулярную, внутриглазную, внутрисердечную, внутрикожную,
внутрилегочную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную,
внутрикожную, внутрисуставную, субкапсулярную,
субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную,
внутрицеребральную, интракраниальную, интеркаротидную и интрастернальную инъекцию, и вливание (см. ниже).
Композиции могут быть получены в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или других упорядоченных структур, подходящих для стабильного хранения при высокой концентрации. Стерильные впрыскиваемые растворы могут быть получены включением С5-связывающего полипептида, описанного в настоящем документе, в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов,
перечисленных выше, если это требуется, с последующей стерелизацией фильтрованием. Обычно, дисперсии получены посредством включения С5-связывающего полипептида, описанного в настоящем документе, в стерильную основу, которая содержит основную дисперсную среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных впрыскиваемых растворов, способы получения включают вакуумную сушку и лиофилизацию, в результате которых получается порошок С5-связывающего полипептида, описанного в настоящем документе, а также любого дополнительного требуемого ингредиента (см. ниже) из его предварительно стерильно-отфильтрованного раствора. Подходящая текучесть раствора может поддерживаться, например, посредством использования покрытия, такого как лецитин, посредством сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсии и посредством использования поверхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция впрыскиваемых композиций может быть осуществлена включением в композицию реагента, который замедляет абсорбцию, например, соли моностеарата и желатин.
С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, также могут быть получены в виде композиций иммунолипосом. Липосомы, содержащие антитело могут быть получены способами, известными в данной области, такими как, например, способы, описанные в Epstein et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA _82:3688; Hwang et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 7_7:4030; и патентах США No. 4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем циркулирования раскрыты, например, в патенте США No. 5013556.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть получен с носителем, который будет предохранять соединение от быстрого испускания, как например, состав с контролируемым испусканием, включая импланты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолиевая кислота, коллаген, полиортоэфир и полимолочная
кислота. Многие способы получения таких составов известны в данной области. См., например, J.R. Robinson (1978) "Sustained и Controlled Release Drug Delivery Systemas," Marcel Dekker, Inc., New York.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий
полипептид, описанный в настоящем документе, может быть получен
в виде композиции, подходящей для внутрилегочного введения
(например, для введения посредством ингалятора или распылителя)
млекопитающему, такому как человек. Способы получения таких
композиций хорошо известны в данной области и описаны,
например, в опубликованной патентной заявке США No.
20080202513; патентах США No. 7112341 и 6019968; и публикациях
РСТ No. WO 00/061178 и WO 06/122257, описание каждого из
которых полностью включены в настоящий документ в качестве
ссылки. Составы сухого порошка ингалятора и подходящие системы
для введения составов описаны, например, в опубликованной
патентной заявке США No. 20070235029, публикации РСТ No. WO
00/69887; и патенте США No. 5997848. Дополнительные составы,
подходящие для внутрилегочного введения (а также способы
получения полипептидов) представлены, например, в
опубликованных патентных заявках США No. 20050271660 и 20090110679.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть получен в виде композиции, подходящей для доставки в глаз. В используемом в настоящем документе значении термин "глаз" относится ко всем и любым отдельно анатомическим тканям и структурам, связанным с глазом. Глаз имеет стенку, состоящую из трех различных слоев: внешняя склера, средний сосудистый слой и внутренняя сетчатка. Полость за хрусталиком заполнена желатиноподобной жидкостью, называемой стекловидное тело. Позади глаза расположена сетчатка, которая детектирует свет. Роговица является оптически прозрачной тканью, которая передает изображения в заднюю часть глаза. Роговица включает один путь для проникновения лекарственных средств в глаз. Другие структуры анатомических тканей, связанные с глазом, включают
дренажную систему, которая включает секреторную систему, распределительную систему и выделительную систему. Секреторная система содержит секреторы, которые стимулируются морганием и изменением температуры из-за испарения слез и рефлекторными секреторами, которые имеют эфферентную парасимпатическую иннервацию и секретируют слезы в ответ на физическую или эмоциональную стимуляцию. Распределительная система включает веки и мениск слезы вокруг края век открытого глаза, которые распределяют слезы поверхности глаза морганием, таким образом снижая появление сухих областей.
В некоторых вариантах осуществления один или более С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе, могут быть введены местно, например, посредством местного применения или интравитреальной инъекцией. Например, в некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды могут быть получены для введения посредством глазной капли.
Терапевтический препарат для лечение глаза может содержать
один или более С5-связывающих полипептидов в концентрации от,
приблизительно 0,01 до приблизительно 1% по массе,
предпочтительно, от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,5%
в фармацевтически приемлемом растворе, суспензии или мази.
Препарат будет, предпочтительно, в форме стерильного водного
раствора, содержащего, например, дополнительные ингредиенты,
такие как, но не ограничиваясь ими, консерванты, буферы,
регулирующие тоничность средства, антиоксиданты и
стабилизаторы, неионные смачивающие или осветляющие средства и повышающие вязкость средства.
Подходящие консерванты для использования в таком растворе включают хлорид бензалкония, хлорид бензетония, хлорбутанол, тимеросал и тому подобное. Подходящие буферы включают, например, борную кислоту, гидрокарбонаты натрия и калия, бораты натрия и калия, карбонат натрия и калия, ацетат натрия и гидрофосфат натрия, в количествах, достаточных для поддержания рН между приблизительно рН б и рН 8, и предпочтительно, между приблизительно рН 7 и рН 7,5. Подходящими регулирующими тоничность средствами являются декстран 40, декстран 70,
декстроза, глицерин, калия хлорид, пропиленгликоль и хлорид натрия.
Подходящие антиоксиданты и стабилизаторы включают
гидросульфит натрия, метагидросульфит натрия, тиосульфит натрия
и тиомочевину. Подходящие смачивающие и осветляющие средства
включают полисорбат 80, полисорбат 20, полоксамер 2 82 и
тилоксапол. Подходящие повышающие вязкость средства включают
декстран 40, декстран 7 0, желатин, глицерин,
гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксиметилпропилцеллюлозу, ланолин, метилцеллюлозу, петролатум, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и карбоксиметилцеллюлозу. Препараты могут быть введены местно в глаз индивида, нуждающегося в лечении (например, индивид, пораженный AMD) общепринятыми способами, например, в форме капель или промывание глаза в терапевтическом растворе, содержащем один или более С5-связывающих полипептидов.
В дополнение было разработано множество приспособлений для введения лекарственных средств в витреальную полость глаза. Например, опубликованная патентная заявка США No. 20020026176 описывает содержащую фармацевтический препарат пробку, которая может быть встроена через склеру, так что она переносится в стекловидную полость для доставки фармацевтического средства в стекловидную полость. В другом примере патент США No. 5443505 описывает имплантируемое приспособление для введения в супрахориоидальное пространство или аваскулярный участок для замедленного высвобождения лекарственного средства во внутреннее пространство глаза. В каждом из патентов США No. 5773019 и 6001386 раскрыто имплантируемое приспособление для доставки лекарственного средства, прикрепляемое к склеральной поверхности глаза. Приспособление содержит внутреннее ядро, содержащее эффективное количество средства с низкой растворимостью, покрытого бионеразрушаемым полимером, который является проницаемым для средства с низкой растворимостью. Во время процесса средство с низкой растворимостью проникает через биоразрушаемое полимерное покрытие для замедленного высвобождения из приспособления. Дополнительные способы и
приспособления (например, транссклеральная накладка и доставка посредством контактных линз) для доставки терапевтического средства в глаз описаны, например, в Ambati и Adamis (2002) Prog Retin Eye Res 21(2):145-151; Ranta и Urtti (2006) Adv Drug Delivery Rev 58 (11) : 1164-1181; Barocas и Balachandran (2008) Expert Opin Drug Delivery 5(1): 1-10(10); Gulsen и Chauhan
(2004) Invest Ophthalmol Vis Sci 45:2342-2347; Kim et al.
(2007) Ophthalmic Res 39:244-254; и публикации РСТ No. WO 04/073551, описание которых полностью включены в настоящий документ в качестве ссылки.
Как описано выше, С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, может быть получены в относительно высоких концентрациях в водных фармацевтических растворах. Например, С5-связывающие полипептиды могут быть получены в растворе в концентрации между приблизительно 10 мг/мл и 100 мг/мл
(например, между приблизительно 9 мг/мл и 90 мг/мл; между приблизительно 9 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 10 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 15 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 15 мг/мл и 110 мг/мл; между приблизительно 15 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 20 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 2 0 мг/мл и 8 0 мг/мл; между приблизительно 25 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 25 мг/мл и 85 мг/мл; между приблизительно 20 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 25 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 30 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 30 мг/мл и 50 мг/мл; между приблизительно 40 мг/мл и 100 мг/мл; между приблизительно 50 мг/мл и 100 мг/мл; или между приблизительно 20 мг/мл и 50 мг/мл). В некоторых вариантах осуществления полипептид представлен в растворе в концентрации больше чем (или по меньшей мере или равной) 5 (например, больше чем, по меньшей
мере
или
: равной:
: 5,
7, 8
, 9,
11,
12,
13,
14,
15,
16,
17,
18,
19,
20,
21,
22,
23,
24,
25,
26,
27,
28,
29,
30,
31,
32,
33,
34,
35,
36,
37,
38,
39,
40,
41,
42,
43,
44,
45,
46,
47,
48,
49,
50,
51,
52,
53,
54,
55,
56,
57,
58,
59,
60,
61,
62,
63,
64,
65,
66,
67,
68,
69,
70,
71,
72,
73,
74,
75,
76,
77,
78,
79,
80,
81,
82,
83,
84,
85,
86,
87,
88,
89,
90,
91,
92,
93,
94,
95,
96,
97,
98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 120, 130, 140 или даже 150) мг/мл. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть получен в концентрации больше чем 2 (например, больше чем 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45 или более) мг/мл, но меньше чем 55 (например, менее чем 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, б или менее чем 5) мг/мл. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть получен в водном растворе в концентрации более чем 5 мг/мл и менее чем 50 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть получен в водном растворе в концентрации приблизительно 50 мг/мл. Способы получения белка в водном растворе известны в данной области и описаны, например, в патенте США No. 7390786; McNally и Hastedt (2007), "Protein Formulation and Delivery", Second Edition, Drugs and Pharmaceutical Sciences, Volume 175, CRC Press; и Banga (1995), "Therapeutic peptides and proteins: formulation, processing, and delivery systems," CRC Press. В некоторых вариантах осуществления водный раствор имеет нейтральный рН, например, рН между, например, 6,5 и 8 (например, между и включая 7 и 8). В некоторых вариантах осуществления водный раствор имеет рН приблизительно 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 или 8,0. В некоторых вариантах осуществления водный раствор имеет рН более (или равный) б (например, больше чем или равный 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8 или 7,9), но менее чем рН 8.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие С5-связывающий полипептид, могут быть встроены в генетическую конструкцию, которая будет использована как часть протокола генетической терапий для доставки нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы для экспрессии и получения средств внутри клеток (см. ниже).
Экспрессионные конструкции таких компонентов могут быть введены в любой терапевтически эффективный носитель, например, любые состав или композиция, способные к эффективной доставке составного гена в клетки in vivo. Подходы включают внесение подвергаемого воздействию гена в вирусные векторы, включая рекомбинантные ретровирусы, аденовирус, адено-связанный вирус, лентивирус и вирус-1 (HSV-1) простого герпеса или рекомбинантные бактериальные или эукариотические плазмиды. Вирусные векторы могут трансфицировать клетки напрямую; плазмидная ДНК может быть доставлена с помощью, например, катионных липосом (липофекция) или дериватизированного
(например, конъюгированное антитело), конъюгатов полилизина, грамицидина S, искусственных оболочек вирусов или других таких внутриклеточных носителей, а также прямой инъекцией генетической конструкции или преципитацией СаРСС^ (см., например, WO04/060407), проведенной in vivo. (см. также, "Ех vivo Approaches," далее.) Примеры подходящих ретровирусов включают pLJ, pZIP, pWE и рЕМ, которые известны специалисту в данной области (см., например, Eglitis et al. (1985) Science 230: 1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:76407644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10892-10895; Hwu et al.
(1993) J Immunol 150:4104-4115; патенты США No 4868116 и 4980286; публикация РСТ No. WO89/07136, WO89/02468, WO89/05345, и WO92/07573) . Другая система вирусной доставки генов использует полученные из аденовируса векторы (см., например, Berkner et al. (1988) BioTechniques _б:61б; Rosenfeld et al.
(1991) Science 252:431-434; и Rosenfeld et al. (1992) Cell 6_8: 143-155) . Подходящие аденовирусные векторы, полученные из штамма аденовируса Ad типа 5 dl324 или других штаммов
аденовируса (например, Ad2, Ad3, Ad7 и т.д.), известны специалисту в данной области. Еще одна вирусная векторная система, подходящая для доставки, подвергаемого воздействию гена в адено-связанный вирус (AAV). См., например, Flotte et al. (1992) Am J Respir Cell Mol Biol 2=349-356; Samulski et al. (1989) J Virol _63:3822-3828; и McLaughlin et al. (1989) J Virol 62:1963- 1973.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть получен с одним или более дополнительных активных средств, подходящих для лечения или профилактики комплемент-связанного нарушения (например, АР-связанное нарушение или CP-связанное нарушение) у индивида. Дополнительные средства для лечения комплемент-связанного нарушения у индивида будут варьироваться в зависимости от конкретного нарушения, подвергающегося лечению, но могут включать, без ограничения, противогипертоническое средство (например, ингибитор ангиотензин-превращающего фермента) [для использования при лечении, например, HELLP-синдрома], антикоагулянт, кортикостероид (например, преднизон) или иммуносупрессорное средство (например, винкристин или циклоспорин А). Примеры антикоагулянтов включают, например, варфарин (Кумадин), аспирин, гепарин, фениндион, фондапаринукс, идрапаринукс и ингибиторы тромбина (например, аргатробан, лепирудин, бивалирудин или дабигатран). С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, также может быть получен с фибринолитическим средством (например, анкрод, Е-аминокапроновая кислота, антиплазмин-ai, простациклин, и дефибротид) для лечения комплемент-связанного нарушения. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть получен с гиполипидемическим средством, таким как ингибитор гидроксиметилглутарил СоА редуктазы. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть получен или использоваться с анти-СБ2 0 средством, таким как ритуксимаб (Rituxan(tm); Biogen Idee, Cambridge, MA) . В некоторых вариантах осуществления, например, для лечения RA С5-связывающий полипептид может быть получен с один или обоими из
инфликсимаба (Remicade(r); Centocor, Inc.) и метотрексата
(Rheumatrex(r), Trexall(r)). В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть получен с нестероидным противовоспалительным лекарственным средством (NSAID). Многие различные NSAID доступны, некоторые без рецепта, включая ибупрофен (Advil(r), Motrin(r), Nuprin (r)) и напроксен (Alleve(r)), и многие другие доступны по рецепту, включая мелоксикам (Mobic(r)), этодолак
(Lodine(r)), набуметон (Relafen(r)), сулиндак (Clinoril(r)), толементин (Tolectin(r)), холин салицилат магния (Trilasate(r)), диклофенак (Cataflam(r), Voltaren(r), Arthrotec(r)), Diflusinal
(Dolobid(r)), индометицин (Indocin(r)), кетопрофен (Orudis(r), Oruvail(r)), оксапрозин (Daypro(r)) и пироксикам (Feldene(r)). В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть получен для использования с антигипертензивным средством, средством против припадка (например, сульфат магния) или антитромботическим средством. Антигипертензивные средства включают, например, лабеталол, гидралазин, нифедипин, блокаторы кальциевых каналов, нитроглицерин или нитропруссид натрия.
(См., например, Mihu et al. (2007) J Gastrointestin Liver Dis 16(4):419-424.). Антитромботические средства включают, например, гепарин, антитромбин, простациклин или низкую дозу аспирина.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий
полипептид, описанный в настоящем документе, может быть получен
для введения (например, внутрилегочное введение) с по меньшей
мере одним дополнительным активным средством для лечения
легочного нарушения. По меньшей мере одно активное средство
может быть, например, анти-IgE антителом (например,
омализумаб), анти-1Ъ-4 антителом или анти-1Ъ-5 антителом, анти-
IgE ингибитором (например, монтелукаст натрия),
симпатомиметиком (например, альбутерол), антибиотиком
(например, тобрамицин), дезоксирибонуклеазой (например, пульмозим), антихолинергическим лекарственным средством
(например, бромид ипратропия), кортикостероидом (например, дексаметезон), агонистом р-адренорецептора, лейкотриеновым
ингибитором (например, зилейтон), ингибитором 5-липоксигеназы, ингибитором PDE, антагонистом CD23, антагонистом IL-13, ингибитором выброса цитокинов, антагонистом HI рецептора гистамина, антигистамином, противовоспалительным средством (например, кромолин натрия) или ингибитором выброса гистамина.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть получен для введения с одним или более дополнительных терапевтических средств для использования в лечении комплемент-связанного нарушения глаза. Такие дополнительные терапевтические средства могут быть, например, бевацизумабом или Fab фрагментом бевацизумаба или ранибизумабом, оба из которых продаются у Roche Pharmaceuticals, Inc., и пегаптанибом натрия (Mucogen(r); Pfizer, Inc.). Такой набор может также необязательно включать инструкции для введения С5-связывающего полипептида индивиду.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть получен для введения индивиду вместе с внутривенной терапией гамма-глобулином (IVIG), плазмоферезом, замещением плазмы или заменой плазмы. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть получен для использования перед, во время или после, транслантации почки.
Когда С5-связывающий полипептид должен быть использован в комбинации с вторым активным средством, средства могут быть получены отдельно или совместно. Например, соответствующие фармацевтические композиции могут быть смешаны, например, непосредственно перед введением, и введены вместе или могут быть введены отдельно, например, в одно и то же или различное время (см. ниже).
Как описано выше, композиция может быть получена так, что она содержит терапевтически эффективное количество С5-связывающего полипептида, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления композиция может быть получена так, чтобы она включала субтерапевтическое количество С5-связывающего полипептида и субтерапевтическое количество одного или более дополнительные активных средств так, что эти
компоненты в совокупности являются терапевтически эффективными для лечения или профилактики комплемент-связанного нарушения (например, связанного с альтернативным путем комплемента нарушения комплемента или связанного с классическим путем комплемента нарушения) у индивида. Способы определения терапевтически эффективной дозы средства, такого как терапевтическое антитело, известны в данной области и описаны в настоящем документе. Применения
С5-связывающие полипептиды, их конъюгаты и композиции любого из вышеприведенного могут быть использованы в ряде диагностических и терапевтических приложений. Например, детектируемо меченные С5-связывающие полипептиды могут быть использованы в анализах для детектирования наличия или количества С5, представленного в биологическом образце. Подходящие способы использования антитела в диагностических анализах известны в данной области и включают, без ограничения, ELISA, применения резонансного переноса энергии флуоресценции, технологии Вестерн-блоттинга и дот-блота. См., например, Sambrook et al., выше и Ausubel et al., выше.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в качестве положительных контролей в анализах, разработанных для идентификации дополнительных новых соединений для лечения комплемент-опосредованного нарушения. Например, С5-связывающий полипептид, который ингибирует образование терминального комплемента и/или выработку С5а, может быть использован в качестве положительного контроля в анализе для идентификации дополнительных соединений (например, небольшие молекулы, аптамеры или антитела), которые снижают или прекращают С5а выработку или образование MAC.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды мыши, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в качестве суррогатного антитела в мышиных моделях человеческой болезни. Это может быть особенно полезно, когда С5-связывающий полипептид человека (например, одноцепочечное
анти-С5 антитело) не дает перекрестную реакцию с мышиным С5 и/или и вероятно будет вызывать ответ против анти-человеческого антитела в мыши, которой введено гуманизированное антитело. Соответственно, исследователь, желающий изучить эффект С5-связывающего полипептида в лечении болезни (например, AMD, астмы или RA) , может использовать мышиный С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, в подходящей мышиной модели болезни. Если исследователь может установить эффективность в мышиной модели болезни с использованием С5-связывающего полипептида мыши, то результаты могут обеспечить экспериментальную проверку концепции для использования человеческого С5-связывающего полипептида в лечении болезни у людей.
С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы в терапевтических способах, как подробно описано далее.
Способы лечения
Вышеописанные композиции (например, любые из С5-
связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе или
их фармацевтические композиции) подходят в, в том числе, в
способах лечения или профилактики множества комплемент-
связанных нарушений (например, АР-связанные нарушения или СР-
связанные нарушения) у индивида. Композиции могут быть введены
индивиду, например, человеку с использованием множества
способов, которые отчасти зависят от пути введения. Путь может
быть, например, внутривенной инъекцией или вливанием (IV),
подкожной инъекцией (SC), внутрибрюшинной (IP) инъекцией,
внутрилегочной инъекцией, интраокулярной инъекцией,
внутрисуставной инъекцией или внутримышечной инъекцией (IM).
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид терапевтически доставляется индивиду посредством местного введения. В используемом в настоящем документе значении "местное введение" или "местная доставка" относится к доставке, которая не зависит от переноса композиции или средства к его предполагаемой мишеневой ткани или месту через сосудистую систему. Например, композиция может быть доставлена
инъекцией или имплантацией композиции или средства или инъекцией или имплантацией приспособления, содержащего композицию или средство. После местного введения в окружающее пространство мишеневой ткани или места, композиция или средство или один или более их компонентов, могут диффундировать к предполагаемой мишеневой ткани или месту.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий
полипептид может быть местно введен в сустав (например,
суставное соединение). Например, в вариантах осуществления, где
комплемент-связанное нарушение является артритом, полипептид
может быть введен непосредственно в сустав (например, в
суставную щель) или в окружающее пространство сустава. Примеры
внутрисуставных соединений, в которые может быть местно введен
С5-связывающий полипептид, включают, например, шейку бедра,
колено, локоть, запястье, грудиноключичный, височно-челюстной,
кистевой, предплюсневой, голеностопный и любой другой сустав,
подверженный артритическим заболеваниям. С5-связывающий
полипептид также может быть введен в сумку, такую как,
например, акромиальная, двуглаво-лучевая, дистальная
лучелоктевая, дельтовидная, инфрапателлярная, седалищная и любая другая сумка, известная в данной области медицины.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть местно введен в глаз, например, для лечения пациентов, пораженных комплемент-связанным нарушением глаза, таким как влажная или сухая AMD. В используемом в настоящем документе значении термин "глаз" относится ко всем анатомическим тканям и структурам, связанным с глазом. Глаз имеет стенку, составленную из трех отдельных слоев: внешняя склера, средний сосудистый слой и внутренняя сетчатка. Полость за хрусталиком заполнена желатиноподобной жидкостью, называемой стекловидное тело. Позади глаза расположена сетчатка, которая детектирует свет. Роговица является оптически прозрачной тканью, которая передает изображения в заднюю часть глаза. Роговица включает один путь проникновения лекарственного средства в глаз. Другие структуры анатомических тканей, связанные с глазом, включают слезную дренажную систему, которая
включает секреторную систему, распределительную систему и выделительную систему. Секреторная система содержит секреторы, которые стимулируются морганием и температурным изменением из-за испарения слез, и рефлекторных секреторов, которые имеют эфферентную парасимпатическую иннервацию и секретируют слезы в ответ на физическую или эмоциональную стимуляцию. Распределительная система включает веки и мениск слезы, вокруг краев век открытого глаза, которые распределяют слезы по поверхности глаза морганием, таким образом, снижая появление сухих областей.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид вводится в заднюю полость глаза. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид вводится интравитреально. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид вводится транссклерально.
В некоторых вариантах осуществления, например, в вариантах осуществления для лечения или профилактики комплемент-связанного легочного нарушения, такого как COPD или астма, С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, также может быть введен индивиду через легкое. Легочная доставка лекарственного средства могут быть обеспечена ингаляцией, и введение ингаляцией в настоящем документе может быть оральным и/или назальным. Примеры фармацевтических приспособлений для легочной доставки включают дозирующие ингаляторы, ингаляторы сухого порошка (DPI) и распылители. Например, С5-связывающий полипептид может быть введен легкие индивида посредством ингалятора сухого порошка. Такие ингаляторы являются приспособления без распыляющего вещества, которые доставляют диспергируемые и стабильные составы сухого порошка в легкие. Ингаляторы сухого порошка хорошо известны в данной области медицины и включают, без ограничения: TurboHaler(r) (AstraZeneca; London, England) ингалятор AIR(r) (Alkermes(r); Cambridge, Massachusetts); Rotahaler(r) (GlaxoSmithKline; London, England); и Eclipse(tm) (Sanofi-Aventis; Paris, France). См. также, например, публикации РСТ No. WO 04/026380, WO 04/024156 и WO 01/78693. DPI приспособления были использованы для легочного
введения полипептидов, таких как инсулин и гормон роста. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть введен внутрилегочно посредством дозирующего ингалятора. Такие ингаляторы основаны на газе-вытеснителе для доставки отдельной дозы соединения в легкие. Примеры соединений, введенных дозирующими ингаляторами, включают, например, Astovent(r) (Boehringer-Ingelheim; Ridgefield, Connecticut) и Flovent(r) (GlaxoSmithKline). См. также, например, патенты США No. 6170717; 5447150 и 6095141.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид может быть введен в легкие индивида посредством распылителя. Распылители используют сжатый воздух для доставки соединения в виде сжиженного аэрозоля или миста. Распылитель может быть, например, распылителем струйного типа (например, воздушные или жидкостные распылители струйного типа) или ультразвуковым распылителем. Дополнительные приспособления и способы внутрилегочного введения представлены, например, в опубликованных патентных заявках США No. 20050271660 и 20090110679, описание каждой из которых полностью включены в настоящий документ в качестве ссылоки.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, вводится посредством внутрилегочного введения индивиду, нуждающемуся в нем. Например, один или более С5-связывающих полипептидов могут быть доставлены посредством распылителя или ингалятора индивиду (например, человеку), пораженному комплемент-связанным легочным нарушением, таким как астма или COPD.
Установлено, что в некоторых вариантах осуществления один или более С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе, могут вводиться систематично для использования для лечения, например, RA, влажной или сухой AMD, астмы и/или COPD.
Подходящая доза С5-связывающего полипептида, описанного в настоящем документе, доза которого способна к лечению или профилактики комплемент-связанного нарушения у индивида, может зависеть от множества факторов, включая, например, возраст,
пол, и вес индивида, который должен быть подвергнут лечению, и
конкретного используемого ингибиторного соединения. Например,
для лечения пожилого индивида с RA может требоваться
отличающаяся доза С5-связывающего полипептида по сравнению с
дозой С5-связывающего полипептида, которая требуется для
лечения более молодого индивида. Другие факторы, влияющие на
дозу, введенную индивиду, включают, например, тип или тяжесть
комплемент-связанного нарушения. Например, индивиду, имеющему
RA, может требоваться введение отличающейся дозировки С5-
связывающего полипептида, чем индивиду с AMD. Другие факторы
могут включать, например, другие медицинские нарушения,
одновременно или предварительно воздействующие на индивида,
общее состояние здоровья индивида, генетическая
предрасположенность индивида, диету, время введения, скорости экскреции, комбинацию лекарственного средства и любых других дополнительных терапевтических средств, которые вводятся индивиду. Также необходимо понимать, что специфичная дозировка и схема лечения для любого конкретного индивида будет зависеть от оценки лечащего врача-терапевта (например, врач или средний медицинский работник).
Антитело, описанное в настоящем документе, может быть введено в виде фиксированной дозы или в виде дозы миллиграмм на килограмм (мг/кг). В некоторых вариантах осуществления доза также может быть выбрана для снижения или избегания выработки антител или других иммунных ответов хозяина против одного или более активных антитела в композиции. Без ограничения никоим образом характерные дозы антитела включают, например, 1-100 мкг/кг, 0,5-50 мкг/кг, 0,1-100 мкг/кг, 0,5-25 мкг/кг, 1-20 мкг/кг и 1-10 мкг/кг, 1-100 мг/кг, 0,5-50 мг/кг, 0,1-100 мг/кг, 0,5-25 мг/кг, 1-20 мг/кг и 1-10 мг/кг. Характерные дозы антитела, описанные в настоящем документе, включают, без ограничения, 0,1 мкг/кг, 0,5 мкг/кг, 1,0 мкг/кг, 2,0 мкг/кг, 4 мкг/кг, и 8 мкг/кг, 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4 мг/кг и 8 мг/кг.
Фармацевтическая композиция может содержать терапевтически эффективное количество антитела, описанного в настоящем
документе. Такие эффективные количества могут быть без труда определены средним специалистом в области отчасти на основании эффекта введенного антитела или комбинаторного эффекта антитела и одного или более дополнительных активных средств, если используется более чем одно средство. Терапевтически эффективное количество антитела, описанного в настоящем документе, может также варьироваться в соответствии с факторами, такими как стадия заболевания, возраст, пол и вес индивидуума и способности антитела (и одного или более дополнительных активных средств) вызывать требуемый ответ у индивидуума, например, улучшение по меньшей мере одного параметра заболевания, например, улучшение по меньшей мере одного симптома комплемент-связанного нарушения. Например, терапевтически эффективное количество С5-связывающего полипептида может ингибировать (ослаблять тяжесть или исключать встречаемость) и/или предотвращать конкретное нарушение и/или любой из симптомов конкретного нарушения, известного в данной области или описанного в настоящем документе. Терапевтически эффективное количество также является таким, при котором любые токсические или вредоносные эффекты композиции перевешиваются терапевтически благоприятными эффектами.
Подходящие дозы для человека любых из С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе, могут дополнительно быть оценены, например, в фазе I исследований с эскалацией дозы. См., например, van Gurp et al. (2 008) Am J Transplantation 8(8): 1711-1718; Hanouska et al. (2007) Clin Cancer Res 13(2, part 1) :523-531; и Hetherington et al. (2006) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10): 3499-3500.
Без ограничения никоим образом иллюстративные способы введения одноцепочечного антитела, такого как одноцепочечное анти-С5 антитело (которое ингибирует расщепление С5), описаны, например, в Granger et al. (2003) Circulation 10 8:1184; Haverich et al. (2006) Алл Thorac Surg 82_: 486-492; и Testa et al. (2008) J Thorac Cardiovasc Surg 136 (4) :884-893.
Подразумевается, что термины "терапевтически эффективное количество" или "терапевтически эффективная доза", или подобные
термины, используемые в настоящем документе, обозначают количество средства, которое будет вызывать желаемый биологический или медицинский ответ (например, улучшение одного или более симптомов комплемент-связанного нарушения). В некоторых вариантах осуществления композиция, описанная в настоящем документе, содержит терапевтически эффективное количество С5-связывающего полипептида. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит любые из С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе, и одно или более (например, одно, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, 10 или 11, или более) дополнительных терапевтических средств, так, что композиция в целом является терапевтически эффективной. Например, композиция может содержать С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, и иммуносупрессорное средство, где полипептид и средство имеют такую концентрацию, что при смешении они терапевтически эффективны для лечения или профилактики комплемент-связанного нарушение у индивида.
Токсичность и терапевтическая эффективность таких композиции могут быть определены известными фармацевтическими процедурами в клеточных культурах или экспериментальных животных (например, животные модели любых комплемент-связанных нарушений, описанных в настоящем документе). Такие процедуры могут быть использованы, например, для определения LD50 (доза смертельная для 50% популяции) и ED50 (доза терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз токсического и терапевтического эффектов является терапевтическим индексом и может быть выражено как соотношение LD50/ED50. С5-связывающий полипептид, который проявляет высокий терапевтический индекс, предпочтителен. Несмотря на то, что могут быть использованы композиции, которые проявляют токсические побочные эффекты, необходимо проявлять осторожность при разработке системы доставки, которая направляет такие соединения к месту пораженной ткани, и минимизировать потенциальный вред для нормальных клеток и посредством этого снизить побочные эффекты.
Данные, полученные из анализов клеточной культуры и
исследований на животных, могут быть использованы в составлении диапазона дозировок для использования на людях. Дозировка таких антител обычно лежит в диапазоне циркулирующих концентраций С5-связывающих полипептидов, которые включают ED50 с маленькой или без токсичности. Дозировка может варьироваться в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для С5-связывающего полипептида, используемого как описано в настоящем документе (например, для лечения или профилактики комплемент-связанного нарушения), терапевтически эффективная доза может быть установлена первоначально из анализов культуры клеток. Доза может быть составлена в моделях на животных для достижения диапазона циркулирующих концентрации в плазме, который включает IC50 (т.е., концентрацию тестируемого соединения, которая достигает полумаксимальное ингибирование симптомов), что определено в культуре клеток. Такая информация может быть использована для более тщательного определения подходящих доз для людей. Уровни в плазме могут быть измерены, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией или ELISA.
В некоторых вариантах осуществления способы могут быть выполнены совместно с другими способами лечения комплемент-связанных нарушений. Например, композиция может быть введена индивиду в то же время, перед или после плазмофереза, IVIG терапии, замещения плазмы или замены плазмы. См., например, Appel et al. (2005) J Am Soc Nephrol 16:1392-1404. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, не вводится совместно с IVIG. В некоторых вариантах осуществления композиция может быть введена индивиду в то же время, перед или после трансплантации почки.
"Индивид" в используемом в настоящем документе значении может быть любым млекопитающим. Например, индивид может быть человеком, приматами кроме человека (например, мартышка, бабуин или шимпанзе) , лошадью, коровой, свиньей, овцой, козой, собакой, кошкой, кроликом, морской свинкой, песчанкой, хомяком, крысой или мышью. В некоторых вариантах осуществления индивид является новорожденным (например, новорожденный человек).
В используемом в настоящем документе значении индивид, "нуждающийся в профилактики", "нуждающийся в лечении", или "нуждающийся в таковом" относится к индивиду, который по оценке соответствующего практикующего клинициста (например, врач, медсестра или средний медработник в случае людей; ветеринар в случае млекопитающих кроме человека) объективно получит пользу от данного лечения (такого как лечение композицией, содержащей С5-связывающий полипептид).
Как описано выше, С5-связывающие полипептиды, описанные в
настоящем документе, могут быть использованы для лечения
множества комплемент-связанных нарушений таких как, например,
АР-связанные нарушения и/или CP-связанные нарушения. Такие
нарушения включают, без ограничения, ревматоидный артрит (RA) ;
синдром антифосфолипидных антител; волчаночный нефрит; легочные
нарушения; ишемически-реперфузионное повреждение; атипичный
гемолитико-уремический синдром (aHUS); типичный или
инфекционный гемолитико-уремический синдром (tHUS); болезнь
плотного осадка (DDD); ночную пароксизмальную гемоглобинурию
(PNH); оптиконевромиелит (NMO); мультифокальную двигательную
невропатию (MMN); множественный склероз (MS); макулярную
дегенерацию (например, возрастную макулярную дегенерацию
(ВМД)); гемолиз, увеличение активности печеночных ферментов и
синдром низкого содержания тромбоцитов (HELLP);
тромбоцитопеническую тромбогемолитическую пурпуру (ТТР);
спонтанную потерю плода; Пауци-иммунный васкулит; буллезный
эпидермолиз; повторную потерю плода; и травматическое
повреждение мозга. (См., например, Holers (2008) Immunological
Reviews 223:300-316 и Holers and Thurman (2004) Molecular
Immunology 4_1: 147-152. ) . В некоторых вариантах осуществления
комплемент-связанное нарушение является комплемент-связанным
васкулярным нарушением, таким как, но не ограниченным ими,
кардиоваскулярное нарушение, миокардит, цереброваскулярное
нарушение, периферическое (например, мышечно-скелетное)
васкулярное нарушение, реноваскулярное нарушение,
мезентериальное/кишечное васкулярное нарушение,
реваскуляризация по отношению к трансплантатам и/или реплантам,
васкулит, нефрит пурпура Шенлейна-Геноха, связанный с красной
волчанкой васкулит, васкулит, связанный с ревматоидным
артритом, иммунный комплексный васкулит, болезнь Такаясу,
дилатационная кардиомиопатия, диабетическая ангиопатия, болезнь
Кавасаки (артериит), венный газовый эмбол (VGE) и рестеноз
после внесения стента, ротационной атерэктомии и чрескожной
транслюминальной коронарной ангиопластики (РТСА). (См.,
например, опубликованные патентные заявки США No. 20070172483.)
Дополнительные комплемент-связанные нарушения включают, без
ограничения, MG, CAD, дерматомиозит, болезнь Грейвса,
атеросклероз, болезнь Альцгеймера, синдром Гийена-Барре,
синдром Дегоса, отторжение трансплантата (например, отторжение
имплантата), системный воспалительный ответ, септический шок,
повреждение спинного мозга, гломерулонефрит, тиреоидит
Хашимото, диабет 1 типа, псориаз, пемфигус, аутоиммунную
гемолитическую анемию (AIHA), идиопатическую
тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), Синдром Гудпасчера,
антифосфолипидный синдром (APS и катастрофический APS (CAPS).
Легочные нарушения включают, например, хроническое
обструктивное легочное нарушение (COPD) , астму, фиброз легких, бронхит, эмфизему, облитерирующий бронхиолит и саркоидоз. Дополнительные легочные нарушения, которые могут быть вылечены или предотвращены с использованием композиций и способов, описанных в настоящем документе, представлены, например, в опубликованной патентной заявке США No. 20050271660. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающие полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть использованы в способах лечения тромботической микроангиопатии (ТМА), например, ТМА, связанная с комплемент-связанным нарушением, как любые из комплемент-связанных нарушений, описанных в настоящем документе.
В используемом в настоящем документе значении индивид "подверженный риску развития комплемент-связанного нарушения" (например, АР-связанное нарушение или CP-связанное нарушение) является индивидом, имеющим один или более (например, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь, или более) факторов риска
для развития нарушения. Факторы риска будут варьироваться в зависимости от конкретного комплемент-связанного нарушения, но хорошо известны в данной области медицины. Например, факторы риска для развития DDD включают, например, предрасположенность для развития заболевания, т.е., семейный анамнез заболевания или генетическая предрасположенность к развитию заболевания, такая как, например, одна или более мутаций в гене, кодирующем фактор Н комплемента (CFH) , Н-связанный фактор комплемента 5
(CFHR5) и/или компонент комплемента СЗ (СЗ) . Такие DDD-связанные мутации, а также способы определения того, несет ли индивид одну или более мутаций известны в данной области и описаны, например, в Licht et al. (2006) Kidney Int 70:42-50; Zipfel et al. (2006) "The role of complement in membranoproliferative glomerulonephritis," In: Complement and Kidney Disease, Springer, Berlin, pages 199-221; Ault et al.
(1997) J Biol Chem 272:25168-75; Abrera-Abeleda et al. (2006) J Med Genet 43 :582-589; Poznansky et al. (1989) J Immunol 143:1254-1258; Jansen et al. (1998) Kidney Int 53:331-349; and Hegasy et al. (2002) Am J Pathol 161 :2027-2034. Таким образом, человеком, подверженным риску развития DDD может быть, например, человек, который имеет одну или более DDD-связанных мутаций в гене, кодирующем CFH, или человек с семейным анамнезом развития болезни.
Факторы риска ТТР хорошо известны в данной области медицины и включают, например, предрасположенность к развитию заболевания, т.е., семейный анамнез заболевания или генетическую предрасположенность к развитию заболевания такого как, например, одна или более мутаций в гене ADAMTS13. ADAMTS13 мутации, связанные с ТТР, подробно рассмотрены в, например, Levy et al. (2001) Nature 413:488-494; Kokame et al. (2004) Semin Hematol 41_: 34-40; Licht et al. (2004) Kidney Int 66: 955958; и Noris et al. (2005) J Am Soc Nephrol 16: 1177-1183. Факторы риска для ТТР также включают заболевания или средства, о которых известно, что они ускоряют ТТР или повторное проявление ТТР, такие как, но не ограничиваясь ими, рак, бактериальные инфекции (например, инфекции Bartonella sp.),
вирусные инфекции (например, HIV и вирус саркомы Капоши), беременность или операция. См., например, Avery et al. (1998) Am J Hematol 5_8: 148-149 и Tsai, выше. ТТР или повторное проявление ТТР, также было связано с использованием некоторых терапевтических средств (лекарственных средств), включая, например, тиклопидин, FK506, кортикостероиды, тамоксифен или циклоспорин А (см., например, Gordon et al. (1997) Sem Hematol 3_4 (2) : 140-147) . В дальнейшем в настоящем документе, такие проявления ТТР могут быть, когда это применимо, называться, например, "связанные с инфекцией ТТР," "связанные с беременностью ТТР", или "связанные с лекарственным средством ТТР" . Таким образом, человек, подверженный риску развития ТТР, может быть, например, человеком, который имеет одну или более ТТР-связанных мутаций в гене ADAMTS13. Человек, подверженный риску развития повторной формы ТТР, может быть человеком, например, который имел ТТР и имеет инфекцию, является беременным или подвергается операции.
Факторы риска для aHUS хорошо известны в данной области медицины и включают, например, предрасположенность к развитию заболевания, т.е., семейный анамнез заболевания или генетическая предрасположенность к развитию заболевания, такая как, например, одна или более мутаций в факторе комплемента Н
(CFH), мембранном кофакторном белке (МСР; CD46), С4Ь-связывающем белке, факторе комплемента В (CFB) или факторе комплемента I (CFI) . (См., например, Warwicker et al. (1998) Kidney Int 53:836-844; Richards et al. (2001) Am J Hum Genet 68:485-490; Caprioli et al. (2001) Am Soc Nephrol 12:297-307; Neuman et al. (2003) J Med Genet 40:676-681; Richards et al.
(2006) Proc Natl Acad Sci USA 100: 12966-12971; Fremeaux-Bacchi et al. (2005) J Am Soc Nephrol 17:2017-2025; Esparza-Gordillo et al. (2005) Hum Mol Genet 14:703-712; Goicoechea de Jorge et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104 (1) : 24 0-245; Blom et al.
(2008) J Immunol 180 (9) :6385-91; and Fremeaux-Bacchi et al.
(2004) J Med Genet 41:e84). (См. также Kavanagh et al. (2006) выше) . Факторы риска также включают, например, инфекцию Streptococcus pneumoniae, беременность, рак, воздействие
противораковых средств (например, хинин, митомицин С, цисплатин или блеомицин), воздействие иммунотерапевтических средств
(например, циклоспорин, ОКТЗ или интерферон), воздействие антитромбоцитарных средств (например, тиклопидин или клопидогрель), HIV инфекция, трансплантация, аутоиммунная болезнь и смешанная метилмалоновая ацидурия и гомоцистинурия
(сЫС) . См., например, Constant inescu et al. (2004,) Am J Kidneys Dis 43_: 976-982; George (2003) Curr Opin Hematol 10 : 339344; Gottschall et al. (1994) Am J Hematol 47:283-289; Valavaara et al. (1985) Cancer 55:47-50; Miralbell et al.
(1996) J Clin Oncol JL4:579-585; Dragon-Durey et al. (2005) J Am Soc Nephrol 16:555-63; и Becker et al. (2004) Clin Infect Dis 39:S267-S275.
Факторы риска для HELLP хорошо известны в данной области медицины и включают, например, многократную беременность, материнский возраст более 2 5 лет, европеоидную расу, наличие предэклампсии или HELLP в предыдущей беременности и историю плохого исхода беременности. (См., например, Sahin et al. (2001) Nagoya Med J 44(3): 145-152; Sullivan et al. (1994) Am J Obstet Gynecol 111:940-943; и Padden et al. (1999) Am Fam Physician 60(3) :829-836) . Например, беременная женщина европеоидной расы, у которой развилась предэклампсия во время первой беременности, может быть подвержена риску развития HELLP синдрома во время или после второй беременности.
Факторы риска для CAD хорошо известны в данной области медицины и включают, например, заболевания или средства, о которых известно, что они ускоряют CAD или повторное проявление CAD, такое как, но не ограниченное ими, новообразования или инфекции (например, бактериальные и вирусные инфекции). Заболевания, о которых известно, что они связаны с развитием CAD, включают, например, инфекцию HIV (и AIDS), инфекцию гепатитом С, инфекцию Mycoplasma pneumonia, инфекцию вирусом Эпштейна-Барр (EBV), инфекцию цитомегаловирусом (CMV), краснуху или инфекционный мононуклеоз. Новообразования, связанные с CAD, включают, без ограничения, неходжкинскую лимфому. В дальнейшем в настоящем документе такие проявления CAD могут быть, где
целесообразно, называться, например, "связанные с инфекцией CAD" или "связанные с новообразованием CAD". Таким образом, человеком, подверженным риску развития CAD, может быть, например, человек, имеющий HIV инфекцию, краснуху или лимфому. См. также, например, Gertz (2006) Hematology JL: 19-23; Horwitz et al. (1977) Blood 50:195-202; Finland and Barnes (1958) AMA Arch Intern Med 191:462-466; Wang et al. (2004) Acta Paediatr Taiwan 45:293-295; Michaux et al. (1998) Алл Hematol 76:201204; и Chang et al. (2004) Cancer Genet Cytogenet 152:66-69.
Факторы риска для миастении гравис (MG) хорошо известны в
данной области медицины и включают, например,
предрасположенность к развитию заболевания, т.е., семейный анамнез заболевания или генетическая предрасположенность к развитию заболевания, такого как семейная MG. Например, некоторые HLA типы связывают с повышенным риском развития MG. Факторы риска для MG включают прием внутрь или воздействие некоторых MG-индуцирующих лекарственных средств, таких как, но не ограничиваясь им, D-пеницилламин. См., например, Drosos et al. (1993) Clin Exp Rheumatol 11(4) : 387-91 and Kaeser et al. (1984) Acta Neurol Scand Suppl 100:39-47. MG может быть эпизодическим, индивид, который предварительно испытывал один или более симптомов MG, может быть подвержен риску рецидива. Таким образом, человеком, подверженным риску развития MG, может быть, например, человек, имеющий семейный анамнез MG, и/или человек, принявший внутрь или которому было введено MG-индуцирующее лекарственное средство, такое как D-пеницилламин.
В используемом в настоящем документе значении индивидом, "подверженным риску развития CAPS", является индивид, имеющий один или более (например, две, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь или более) факторов риска развития нарушения. Приблизительно 60% частоты возникновения заболевания CAPS предшествуются ускоряющим событием, таким как инфекция. Таким образом, факторы риска для CAPS включают заболевания, о которых известно, что они ускоряют CAPS, такие как, но не ограниченные ими, некоторые виды рака (например, рак желудка, рак яичников, лимфома, лейкемия, эндометриальный рак, аденокарцинома и рак
легкого), беременность, послеродовой период, трансплантация, первичная APS, ревматоидный артрит (RA), системная красная волчанка (SLE), операция (например, операция на глаз) и некоторые инфекции. Инфекции включают, например, инфекцию парвовирусом В19 и инфекцию гепатитом С. В дальнейшем в этом документе такие проявления CAPS могут называться, например, "связанные с раком CAPS", "связанные с трансплантацией CAPS", "связанные с RA CAPS", "связанные с инфекцией CAPS", или "связанные с SLE CAPS." См., например, Soltesz et al. (2000) Haematologia (Budep) 30 (4) : 303-311; Ideguchi et al. (2007) Lupus 16 (1) : 59-64; Manner et al. (2008) Am J Med Sci 335 (5) :394-7; Miesbach et al. (2006) Autoimmune Rev 6(2):94-7; Gomez-Puerta et al. (2006) Autoimmune Rev 6(2) :85-8; Gomez-Puerta et al. (2006) Semin Arthritis Rheum 35 (5) :322-32; Kasamon et al. (2005) Haematologia 90(3) :50-53; Atherson et al. (1998) Medicine 77(3): 195-207; and Canpolat et al. (2008) Clin Pediatr 47(6) :593-7. Таким образом, человеком, подверженным риску развития CAPS, может быть, например, человек, который имеет первичный CAPS и/или рак, о котором известно, что он связан с CAPS.
Из вышеприведенного ясно, что индивиды "подверженные риску развития комплемент-связанного нарушения" (например, АР-связанного нарушения или CP-связанного нарушения) не являются всеми индивидами в пределах соотвествующих видов.
Индивид "с подозрением на наличие комплемент-связанного нарушения" (например, связанное с альтернативным путем комплемента нарушение) является индивидом, имеющим один или более (например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или 10 или более) симптомов болезни. Симптомы таких нарушений будут варьироваться в зависимости от конкретного нарушения, но они известны специалисту в области медицины. Например, симптомы DDD включают, например, одно или оба из гематурии и протеинурии; острый нефритический синдром; развитие друзы и/или нарушение зрения; приобретенную очаговую липодистрофию и ее осложнения; и наличие сывороточного СЗ нефритического фактора (C3NeF), аутоантитело, направленное
против СЗЬВЬ, СЗ конвертазы альтернативного пути комплемента.
(См., например, Appel et al. (2005), выше) . Симптомы aHUS
включают, например, тяжелую форму гипертензии, протеинурию,
уремию, сонливость/утомляемость, раздражительность,
тромбоцитопению, микроангиопатическую гемолитическую анемию и
нарушение почечной функции (например, острая почечная
недостаточность). Симптомы ТТР включают, например,
микротромбозы, тромбоцитопению, жар, низкую экспрессию или
активность металлопротеазы ADAMTS13, флюктуирующие расстройства
центральной нервной системы, почечную недостаточность,
микроангиопатическую гемолитическую анемию, ушиб, пурпуру,
тошноту и рвоту (например, в результате ишемии в ЖКТ или при
задействовании центральной нервной системы), боль в груди из-за
сердечной ишемии, припадки и мышечную и суставную боль.
Симптомы RA могут включать, например, скованность, опухание,
утомляемость, анемию, потерю в весе, жар и, зачастую,
деструктивную боль. Некоторые распространенные симптомы
ревматоидного артрита включают тугоподвижность суставов при
пробуждении, которая длится час или дольше; опухание суставов
определенного пальца или запястья; опухание мягкой ткани вокруг
суставов и опухание обоих сторон сустава. Опухание может
происходить с болью или без нее и может ухудшаться постепенно
или оставаться одинаковым в течение нескольких лет перед
развитием. Симптомы HELLP известны в данной области медицины и
включают, например, недомогание, эпигастральную боль, тошноту,
рвоту, головную боль, боль в правом верхнем квадранте,
гипертензию, протеинурию, затуманенное зрение,
гастроинтестинальное кровотечение, гипогликемию, парестезию, увеличение активности печеночных ферментов/повреждение печени, анемию (гемолитическую анемию) и низкое количество тромбоцитов, любые из которых в комбинации с беременностью или недавней беременностью. (См., например, Tomsen (1995) Am J Obstet Gynecol 172:1876-1890; Sibai (1986) Am J Obstet Gynecol 162:311-316; и Padden (1999), выше.) Симптомы PNH включают, например, гемолитическую анемию (пониженное количество красных кровянных клеток), гемоглобинурию (наличие гемоглобина в моче
особенно заметное после сна) и гемоглобинемию (наличие гемоглобина в кровотоке). Известно, что пораженные PNH индивиды имеют пароксизм, который определяется как возникновение темноокрашенной мочи, дисфагии, утомляемости, эректильной дисфункции, тромбоза и повторяющейся абдоминальной боли.
Симптомы CAPS хорошо известны в данной области медицины и
включают, например, гистопатологические признаки множественной
закупорки мелких кровеносных сосудов; наличие антифосфолипидных
антител (обычно с высоким титром), васкулярные тромбозы,
тяжелую мультиорганную дисфункцию, злокачественную гипертензию,
синдром острой дыхательной недостаточности, диссеминированную
внутрисосудистую коагуляцию, микроангиопатическую
гемолитическую анемию, шизоциты и тромбоцитопению. CAPS можно отличить от APS по тому, что пациенты с CAPS обычно имеют тяжелую полиорганную дисфункцию или недостаточность, что характеризуется быстрой, диффузной ишемией малых сосудов и тромбозами, преимущественно затрагивающими паренхиматозные органы. В отличие от этого, APS связан с единичными венозными или артериальными закупорками кровеносных сосудов от средних до крупных. Симптомы MG включают, например, утомляемость и ряд связанных с мышечной слабостью заболеваний, включая: птоз (одного или обоих глаз), диплопию, неустойчивую походку, подавленные или искривленные выражения лица и затрудненность пережевывания, речи или проглатывания. В некоторых случаях, индивид может иметь частичный или полный паралич дыхательных мышц. Симптомы CAD включают, например, боль, жар, бледность, анемию, сниженный поток крови конечностям (например, с гангреной) и почечную болезнь или острую почечную недостаточность. В некоторых вариантах осуществления симптомы могут иметь место после воздействия холодных температур.
Из вышеприведенного ясно, что индивиды "с подозрением на наличие комплемент-связанного нарушения" не являются всеми индивидами в пределах соответствующих видов.
В некоторых вариантах осуществления способы могут включать идентификацию индивида как имеющего, с подозрением на наличие или подверженного риску развития комплемент-связанного
нарушения. Подходящие способы идентификации индивида известны в
данной области. Например, подходящие способы (например,
технологии секвенирования или применение микрочипов) для
определения того, имеет ли обследуемый человек DDD-связанную
мутацию в гене CFH, CFHR5 или СЗ, описаны, например, в Licht et
al. (2006) Kidney Int 7_0:42-50; Zipfel et al. (2006), выше;
Ault et al. (1997) J Biol Chem 212:25168-75; Abrera-Abeleda et
al. (2006) J Med Genet 43:582-589; Poznansky et al. (1989) J
Immunol 143:1254-1258; Jansen et al. (1998) Kidney Int 53:331-
349; и Hegasy et al. (2002) Am J Pathol 161:2027-2034. Способы
детектирования наличия характерных DDD-связанных
электроноплотных отложений также хорошо известны в данной области. Например, медицинский работник может взять биопсию ткани из почки пациента и подвергнуть ткань электронной микроскопии. Медицинский работник может также анализировать ткань посредством иммунофлуоресценции для детектирования наличия СЗ с использованием анти-СЗ антитела и/или световой микроскопии для определения того, имеет ли место мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит. См., например, Walker et al. (2007) Mod Pathol 20:605-616 и Habib et al. (1975) Kidney Int 1_: 204-215. В некоторых вариантах осуществления идентификация индивида как имеющего DDD может включать анализ образца крови на наличие C3NeF. Способы детектирования наличия C3NeF в крови описаны, например, в Schwertz et al. (2001) Pediatr Allergy Immunol 12:166-172.
В некоторых вариантах осуществления медицинский работник может определить, имеет ли место повышенная активация комплемента в сыворотке индивида. Признаки повышенной активации комплемента включают, например, снижение СН50, уменьшение СЗ и повышение C3dg/C3d. См., например, Appel et al. (2005), выше. В некоторых вариантах осуществления медицинский работник может обследовать глаз индивида на свидетельства развития друзы и/или других зрительных патологий, таких как AMD. Например, медицинский работник может использовать тесты функционирования сетчатки, такие как, но не ограниченные ими, темновая адаптация, электроретинография и электроокулография (см.,
например, Colville et al. (2003) Am J Kidney Dis <4_2:E2-5) .
Способы идентификации индивида, как имеющего, с подозрением на наличие или подверженного риску развития, ТТР также известны в данной области. Например, Miyata et al. описывают множество анализов для измерения ADAMTS13 активности в биологическом образце, взятом у индивида (Curr Opin Hematol (2007) 14(3) :277-283) . Подходящие анализы ADAMTS13 активности, а также фенотипически нормальные пределы ADAMTS13 активности у человека, описаны, например, в Tsai (2003) J Am Soc Nephrol Г4: 1072-1081; Furlan et al. (1998) New Engl J Med 339:15781584; Matsumoto et al. (2004) Blood 103: 1305-1310; и Mori et al. (2002) Transfusion 42:572-580. Способы детектирования наличия ингибиторов ADAMTS13 (например, аутоантител, которые связывают ADAMTS13) в биологическом образце, взятом у индивида, известны в данной области. Например, образец сыворотки пациента может быть смешан с образцом сыворотки индивида без ТТР для детектирования наличия анти-АОАМТЭ13 антител. В другом примере иммуноглобулиновый белок может быть выделен из сыворотки пациента и использован в in vitro анализах активности ADAMTS13 для определения присутствия анти-АОАМТЭ13 антитела. См., например, Dong et al. (2008) Am J Hematol 83 (10): 815-817. В некоторых вариантах осуществления риск развития ТТР может быть определен посредством оценки того, несет ли пациент одну или более мутаций в гене ADAMTS13. Подходящие способы (например, нуклеиново-кислотные чипы или ДНК секвенирование) для детектирования мутации в гене ADAMTS13 известны в данной области и описаны, например, в Levy et al., выше; Kokame et al., выше; Licht et al., выше; и Noris et al., выше.
В дополнение, способы идентификация индивида, как имеющего, с подозрением на наличие или подверженного риску развития aHUS известны в данной области. Например, лабораторные испытания могут быть выполнены для определения того, имеет ли обследуемый человек тромбоцитопению, микроангиопатическую гемолитическую анемию или острую почечную недостаточность. Тромбоцитопения может быть диагностирована медицинским специалистом, как одно или более из: (i) количество тромбоцитов
менее чем 150000/мм3 (например, менее чем 60000/мм3) ; (ii) снижение продолжительности жизни тромбоцитов, отражающее повышенное разрушение тромбоцитов в циркулировании; и (iii) гигантские тромбоциты, наблюдаемые в мазке периферической крови, что согласуется с вторичной активацией тромбоцитопоэза. Микроангиопатическая гемолитическая анемия может быть диагностирована медицинским специалистом, как одно или более из следующего: (i) концентрации гемоглобина, которые меньше 10 мг/дл (например, меньше 6,5 мг/дл); (ii) повышенные концентрации лактатдегидрогеназы (LDH) в сыворотке (> 4б0 Е/л) ; (iii) гипербилирубинемия, ретикулоцитоз, циркулирующий свободный гемоглобин и низкие или недетектируемые концентрации гаптоглобина; и (iv) детектирование фрагментированных красных кровяных клеток (шизоциты) с типичными признаками зубчатых или шлемовидных клеток в мазке периферической крови вместе негативным тестом Кумбса. (См., например, Kaplan et al. (1992) "Hemolytic Uremic Syndrome and Thrombotic Thrombocytopenic Purpura," Informa Health Care (ISBN 0824786637) и Zipfel (2005) "Complement and Kidney Disease," Springer (ISBN 3764371668).)
Индивид также может быть идентифицирован как имеющий aHUS установлением концентраций СЗ и С4 в крови как меры активации или дисрегуляции комплемента. В дополнение, как ясно из вышеприведенного описания, индивид может быть идентифицирован как имеющий генетический aHUS посредством идентификации индивида, как несущего одну или более мутаций в гене, связанном с aHUS, таком как CFI, CFB, CFH или МСР (выше) . Подходящие способы детектирования мутации в гене включают, например, технологии ДНК секвенирования и нуклеиново-кислотные чипы. (См., например, Breslin et al. (2006) Clin Am Soc Nephrol 1_:88-99 и Goicoechea de Jorge et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:240-245).
Способы диагностирования индивида, как имеющего, с подозрением на наличие или подверженного риску развития RA, также известны в данной области медицины. Например, медицинский работник может обследовать мелкие суставы рук, запястий, ног, и колен для идентификации воспаления в симметричном
распределении. Работник может также выполнить ряд тестов для исключения других типов воспаления суставов, включая артрит из-за инфекции или подагру. В дополнение, ревматоидный артрит связан с аномальными антителами в кровотоке пораженных пациентов. Например, антитело называемое "ревматоидный фактор" обнаружено приблизительно у 8 0% пациентов. В другом примере антицитруллиновое антитело присутствует у многих пациентов с ревматоидным артритом, и таким образом оно подходит в диагностике ревматоидного артрита при оценке пациентов с необъяснимым воспалением суставов. См., например, van Venrooij et al. (2008) Алл NY Acad Sci 1143:268-285 и Habib et al.
(2007) Immunol Invest 37(8) :84 9-857. Другое антитело, называемое "антинуклеарное антитело" (ANA) также часто бывает обнаружено у пациентов с ревматоидным артритом. См., например, Benucci et al. (2008) Clin Rheumatol 2_7 (1): 91-95; Julkunen et al. (2005) Scan J Rheumatol 34(2): 122-124; и Miyawaki et al.
(2005) J Rheumatol 32 (8) : 1488-1494.
Медицинский работник может также обследовать скорость оседания эритроцитов для содействия диагностированию RA у индивида. Скорость оседания может быть использована как грубый показатель воспаления суставов, и обычно является более быстрой во время вспышки болезни и более медленной во время ремиссий. Другим исследованием крови, которое может быть использовано для измерения степени воспаления в организме, является С-реактивный белок.
Кроме того, рентгеновское облучение суставов также может быть использовано для диагностирования ревматоидного артрита у индивида. По мере того, как RA прогрессирует, рентгеновское облучение может показать костные эрозии, характерные для ревматоидного артрита в суставах. Рентгеновское облучение суставов также может быть полезным при наблюдении за прогрессированием болезни и разрушением сустава с течением времени. Сканирование костей, процедура исследования с использованием радиоактивности, может продемонстрировать воспаленные суставы.
Способы идентификации индивида как имеющего, с подозрением
на наличие или подверженного риску развития HELLP известны в данной области медицины. Отличительные симптомы HELLP синдрома включают гемолиз, увеличение активности печеночных ферментов и низкое количество тромбоцитов. Таким образом, множество тестов может быть выполнено с кровью индивида для определения уровня гемолиза, концентрации любого из множества печеночных ферментов и уровня тромбоцитов в крови. Например, наличие шизоцитов и/или повышенный свободный гемоглобин, билирубин или LDH уровни в сыворотке являются признаком интраваскулярного гемолиза. Рутинные лабораторные исследования могут быть использованы для определения количества тромбоцитов, а также уровня ферментов печени в крови таких как, но не ограниченных ими, аспартатаминотрансфераза (AST) и аланинтрансаминаза (ALT). Подходящие способы идентификации индивида, как имеющего HELLP синдром также описаны, например, в Sibai et al. (1993), выше; Martin et al. (1990), выше; Padden (1999), выше; и Gleicher and Buttino (1998) "Principles & Practice of Medical Therapy in Pregnancy," 3rd Edition, Appleton & Lange (ISBN 083857677X).
Способы идентификации, индивида, как имеющего, с подозрением на наличие или подверженного риску развития PNH известны в данной области медицины. Лабораторная оценка гемолиза обычно включает гематологические, серологические тесты и исследование мочи. Гематологические тесты включают исследование мазка крови на морфологические нарушения красных кровяных клеток (RBC) и измерение количества ретикулоцитов во всей крови (для определения выравнивания костным мозгом потери RBC) . Серологический тесты включают лактатдегидрогеназу (LDH; часто выполняется) и свободный гемоглобин (не часто выполняется) в качестве прямой меры гемолиза. LDH уровни в отсутствии повреждения тканей в других органах могут подходить в диагностике и мониторинге пациентов с гемолизом. Другие серологические тесты включают билирубин или гаптоглобин, как меры продуктов распада или резерва выводимости, соответственно. Тесты мочи включают билирубин, гемосидерин и свободный гемоглобин и обычно используются для измерения большой тяжести гемолиза и дифференциации интраваскулярной и экстраваскулярной
этиологий гемолиза в большей степени, чем рутинный мониторинг гемолиза. Дополнительно, количество RBC, RBC гемоглобин и гематокрит обычно выполняются для определения степени любой сопровождающей анемии.
Подходящие способы идентификации индивида как имеющего MG могут быть качественными или количественными. Например, медицинский работник может обследовать состояние двигательных функций индивида с использованием физического исследования. Другие качественные тесты включают, например, тест ледяного обертывания, где ледяное обертывание применяется по отношению к глазу индивида (в случае зрительного MG) для определения того, если один или более симптомов (например, птоз) улучшаются при холоде (см., например, Sethi et al. (1987) Neurology 37(8) :1383-1385) . Другие тесты включают, например, "спящий тест", который основан на тенденции MG симптомов повышаться после отдыха. В некоторых вариантах осуществления количественный или полуколичественный тесты может быть применены медицинским работником для определения того, если индивид имеет, с подозрением на наличие или подвержен риску развития MG. Например, медицинский работник может выполнить тест для детектирования наличия или определения количества MG-связанных аутоантител в образце сыворотки, полученном у индивида. MG-связанные аутоантитела включают, например, антитела, которые связываются с и модулируют активность ацетилхолинового рецептора (AChR), мышечно-специфического рецептора тирозинкиназы (MuSK) и/или бороздчатого белка. (См., например, Conti-Fine et al. (2006), выше.). Подходящие анализы, подходящие для детектирование наличия или определения количества MG-связанного антитела в биологическом образце, известны в данной области и описаны, например, в Hoch et al.
(2001) Nat Med 2:365-368; Vincent et al. (2004) Semin Neurol 2_4:125-133; McConville et al. (2004) Алл Neurol 55:580-584; Boneva et al. (2006) J Neuroimmunol 177:119-131; и Romi et al.
(2005) Arch Neurol 62:442-446.
Дополнительные способы диагностирования MG включают,
например, электродиагностические тесты (например,
одноволоконная электромиография) и тенсилон (или эдрофониум) тест, который включает введение индивиду ингибитора ацетилхолинэстеразы эдрофониум и мониторинг индивида на улучшение одного или более симптомов. См., например, Pascuzzi
(2003) Semin Neurol 23(1) :8 3-8 8; Katirji et al. (2002) Neurol Clin 2_0: 557-586; и "Guidelines in Electrodiagnostics Medicine. American Association of Electrodiagnostics Medicine," Muscle Nerve 15:229-253.
Индивид может быть идентифицирован как имеющий CAD, используя анализ для детектирования наличия или количества
(титра) агглютинирующих аутоантител, которые связываются с антигеном I на красных кровяных клетках. Антитела могут быть моноклональными (например, моноклональные IgM или IgA) или поликлональными. Подходящие способы детектирования таких антител описаны, например, в Christenson and Dacie (1957) Br J Haematol 3_: 153-164 и Christenson et al. (1957) Br J Haematol 3_: 2 62-275. Индивид также может быть диагностирован, как имеющий CAD с использованием одного или более из общего анализа крови
(СВС), анализа мочи, биохимических исследований и теста Кумбса для тестирования гемолиза в крови. Например, биохимические исследования могут быть использованы для детектирования повышенных уровней лактазы дегидрогеназы, повышенных уровней неконъюгированного билирубина, низких уровней гаптоглобина и/или наличия свободного гемоглобина в плазме, все из которых могут быть свидетельствовать об остром гемолизе. Другие тесты, которые могут быть использованы для детектирования CAD, включают детектирование уровней комплемента в сыворотке. Например, из-за истощения во время острой фазы гемолиза, измеренные уровни комплемента в плазме (например, С2, СЗ, и С4) понижены при CAD.
Типичный (или инфекционный) HUS, в отличие от aHUS, часто идентифицируется по продромальному периоду диареи, часто кровянистой по природе, что происходит в результате инфекции продуцирующим шига-токсин микроорганизмом. Индивид может быть идентифицирован как имеющий типичный HUS, когда шига-токсины и/или сывороточные антитела против шига-токсина или LPS
детектируются в стуле индивидуума. Подходящие способы для тестирования анти-шига-токсин антител или LPS известны в данной области. Например, способы детектирования антител, которые связывают шига-токсины Stxl и Stx2 или LPS у людей описаны, например, в Ludwig et al. (2001) J Clin Microbiol 3_9(6) :22 722279.
В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть введен индивиду в виде монотерапии. Альтернативно, как описано выше, антитело может быть введено индивиду в виде комбинационной терапии с другим лечением, например, другое лечение для DDD, ТТР, влажной или сухой AMD, aHUS, PNH, RA, HELLP, MG, CAD, CAPS, tHUS, астмы, COPD или любых других комплемент-связанных нарушений, известных в данной области или описанных в настоящем документе. Например, комбинационная терапия может включать введение индивиду (например, пациенту-человеку) одного или более дополнительных средств (например, антикоагулянты, антигипертензивы или кортикостероиды), которые обеспечивают терапевтическую выгоду индивиду, который имеет или подвержен риску развития DDD. В некоторых вариантах осуществления комбинационная терапия может включать введение индивиду (например, пациенту-человеку) С5-связывающего полипептида и иммуносупрессорного средства, такого как Remicade(r), для использования при лечении RA. В некоторых вариантах осуществления С5-связывающий полипептид и один или более дополнительных активных средств вводятся в одно и то же время. В других вариантах осуществления, С5-связывающий полипептид вводится первым по времени, и одно или более дополнительных активных средств вводятся вторыми по времени. В некоторых вариантах осуществления одно или более дополнительных активных средств вводятся первыми по времени, и С5-связывающий полипептид вводится вторым по времени.
С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе, может заместить или усилить предварительно введенную или вводимую в настоящее время терапию. Например, при лечении С5-связывающим полипептидом, введение одного или более
дополнительных активных средств может быть остановлено или уменьшено, например, быть введено в более низких уровнях. В некоторых вариантах осуществления может поддерживаться введение предшествующей терапии. В некоторых вариантах осуществления предшествующая терапия будет поддерживаться до тех пор, пока уровень С5-связывающего полипептида не достигнет уровня, достаточного для обеспечения терапевтического эффекта. Два метода лечения могут быть введены в комбинации.
Мониторинг индивида (например, пациент-человек) на улучшение комплемент-связанного нарушения, как это определяется в настоящем документе, означает оценку индивида на изменение параметра болезни, например, улучшение в одном или более симптомом болезни (например, улучшение одного или более симптомов легочного нарушения). Такие симптомы включают любые из симптомов комплемент-связанных нарушений, известных в данной области и/или описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления оценка выполняется по меньшей мере через 1 час, например, по меньшей мере через 2, 4, б, 8, 12, 24 или 48 часов, или по меньшей мере 1 день, 2 дня, 4 дня, 10 дней, 13 дней, 2 0 дней или более, или по меньшей мере через 1 неделю, 2 недели, 4 недели, 10 недель, 13 недель, 20 недель или более после введения. Индивид может быть оценен в один или более из следующих периодов: перед началом лечения; во время лечения; или после того, как один или более элементов лечения были введены. Оценка может включать оценку необходимости в дальнейшем лечении, например, оценка того, должны ли быть изменены дозировка, кратность введения или длительность лечения. Она также включает оценку необходимости в добавлении или снижении выбранного терапевтического воздействия, например, добавление или снижение любых вариантов лечения любых комплемент-связанных нарушений, описанных в настоящем документе.
Ex vivo подходы. Ex vivo стратегия для лечения или профилактики комплемент-связанного нарушения (например, АР-связанное нарушение или CP-связанное нарушение) может включать трансфицирование или трансдуцирование одной, или более клеток,
взятых у индивида, полинуклеотидом, кодирующим С5-связывающий полипептид, описанный в настоящем документе.
Затем трансфицированные или трансдуцированные клетки возвращаются индивиду. Клетки могут быть любыми из широкого спектра типов, включая, без ограничения, гемопоэтические клетки (например, клетки костного мозга, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, Т клетки или В клетки), фибробласты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты или мышечные клетки. Такие клетки могут действовать в качестве источника (например, постоянного или периодического источника) С5-связывающего полипептида в течение времени, которое они выживают в индивиде. В некоторых вариантах осуществления векторы и/или клетки могут быть сконфигурированы для индуцибильной или репрессируемой экспрессии С5-связывающего полипептида (см., например, Schockett et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 5173-5176 и патент США No. 7056897).
Предпочтительно, клетки получены у индивида
(аутологические), но потенциально могут быть получены у индивида видов, отличных от индивида (аллогенные).
Подходящие способы получения клеток у индивида и трансдуцирование или трансфицирование клеток известны в данной области молекулярной биологии. Например, этап трансдукции может быть выполнен любым стандартным средством, используемым для ех vivo генетической терапии, включая кальциево-фосфатную, липофекцию, электропорацию, вирусную инфекцию (см. выше) и биолистический перенос гена. (См., например, Sambrook et al. (выше) и Ausubel et al. (1992) "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates.)
Альтернативно, могут быть использованы липосомы или полимерные микрочастицы. Клетки, которые были трансфицированы, могут быть отобраны, например, для экспрессии кодирующей последовательности или гена устойчивости к лекарственному средству.
Терапевтические наборы
Изобретение также относится к терапевтическим и диагностическим наборам, содержащим, среди прочего, один или
более из С5-связывающих полипептидов, описанных в настоящем документе. Терапевтические наборы могут содержать, например, подходящее средство для доставки одного или более С5-связывающих полипептидов индивиду. В некоторых вариантах осуществления средство подходит для подкожной доставки антитела или их антиген-связывающего фрагмента индивиду. Средство может представлять собой, например, шприц или осмотический насос.
В некоторых вариантах осуществления средство подходит для внутрилегочной доставки С5-связывающего полипептида индивиду, например, для использования при лечении или профилактики комплемент-связанного легочного нарушения, такого как, но не ограниченного ими, COPD или астма. Соответственно, средство может быть, например, оральным или назальным ингалятором (см. выше) . Ингалятор может быть, например, дозирующим ингалятором (MDI), ингалятором сухого порошка (DPI) или распылителем. Такой набор также может необязательно включать инструкции для введения (например, самовведения) С5-связывающего полипептида индивиду.
Терапевтические наборы могут включать, например, один или более дополнительных активных средств для лечения или профилактики комплемент-связанного нарушения и/или улучшения их симптома. Например, терапевтические наборы, разработанные для использования в лечении или профилактики комплемент-связанного легочного нарушения, могут включать один или более дополнительных активных средств, включая, но не ограничиваясь ими, другое терапевтическое средство на основе антитела
(например, анти-IgE антитело, анти-1Ъ-4 антитело или анти-1Ъ-5 антитело), низкомолекулярный анти-IgE ингибитор (например, монтелукаст натрия), симпатомиметик (например, альбутерол), антибиотик (например, тобрамицин), дезоксирибонуклеазу
(например, пульмозим), антихолинергическое лекарственное средство (например, бромид ипратропия), кортикостероид
(например, дексаметезон), агонист р-адренорецептора, ингибитор лейкотриена (например, зилейтон) , ингибитор 5-липоксигеназы, ингибитор фосфодиэстеразы (PDE), антагонист CD23, антагонист IL-13, ингибитор выброса цитокинов, антагонист Н1-гистаминового
рецептора, антигистамин, противовоспалительное средство
(например, кромолин натрия или любое другое
противовоспалительное средство, известное в данной области или описанное в настоящем документе) или ингибитор выброса гистамина.
В некоторых вариантах осуществления средство может быть пригодно для введения С5-связывающего полипептида, описанного в настоящем документе, в глаз индивида, нуждающегося в этом, например, индивиду, пораженному AMD. Средство может быть, например, шприцом, транс-склеральной накладкой или даже контактными линзами, содержащими полипептид. Средство в некоторых вариантах осуществления может быть капельницей для глаз, где С5-связывающий полипептид получен для такого введения. Средство также может быть, например, контактными линзами в вариантах осуществления, в которых, например, С5-связывающий полипептид получен как часть увлажняющего, очищающего или пропитывающего раствора для контактных линз. Такие терапевтические наборы могут также включать, например, один или более дополнительных терапевтических средств для использования при лечении комплемент-связанного нарушения глаза. Терапевтические средства могут представлять собой, например, бевацизумаб или Fab фрагмент бевацизумаба, ранибизумаб, оба из которых продаются Roche Pharmaceuticals, Inc., пегаптаниб натрия (Mucogen(r); Pfizer, Inc.) и вертепорфин (Visudyne(r); Novartis). Такой набор может также необязательно включать инструкции для введения С5-связывающего полипептида индивиду.
В некоторых вариантах осуществления средство может подходить для внутрисуставного введения С5-связывающего полипептида, описанного в настоящем документе, индивиду, нуждающемуся в этом, например, индивиду, пораженному RA. Средство может быть, например, шприцом или двухцилиндровый шприцом. См., например, патенты США No. 6065645 и 6698622. Двухцилиндровый шприц пригоден для введения в сустав двух различных композиций только одной инъекцией. Два отдельных шприца могут быть объединены для использования при введении
терапевтического средства во время отбора жидкости из колена для анализа (пункция) двухтактным образом. Дополнительные терапевтические средства, которые могут быть введены совместно с С5-связывающим полипептидом двухцилиндровым шприцом или которые обычно могут быть иным образом включены в терапевтические наборы, описанные в настоящем документе, включают, например, NSAID, кортикостероиды, метотрексат, гидроксихлорохин, анти-TNF средства, такие как этанерцепт и инфликсимаб, истощающее В клетки средство, такое как ритуксимаб, антагонист интерлейкина-1 или Т клеточное ко-стимуляторно блокирующее средство, такое как абатацепт. Такой набор может также, необязательно, включать инструкции для введения С5-связывающего полипептида индивиду.
Следующие примеры предусмотрены для неограничивающей иллюстрации изобретения.
Пример 1. Замена R38Q не влияет в значительной мере на связывание с С5
Кинетику связывания между компонентом С5 комплемента и пекселизумабом (описан выше) или вариантом пекселизумаба исследовали в использованием системы Biacore(tm) 3000 (Biacore, GE Healthcare). Вариант пекселизумаба содержит следующую аминокислотную последовательность:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGALNWYQQKPGKAPKLLIYGATN
LADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNVLNTPLTFGQGTKVEIK
RTGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFSNYWI
QWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTEYTENFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSS
LRSEDTAVYYCARYFFGSSPNWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:2).
Аминокислотная последовательность варианта отличается от аминокислотной последовательности пекселизумаба двумя аминокислотами. Во-первых, вариант одноцепочечного антитела не содержит аминоконцевой аланин, который представлен в пекселизумабе. Вариант антитела также содержит замену аргинина (R) в положении 38 пекселизумаба на глутамин (Q) (выделенный жирным шрифтом выше). В дальнейшем в этом документе вариант одноцепочечного антитела называется "R38Q scFv".
Белок С5 человека получали у Advanced Research
Technologies (No. по каталогу A120; Montreal, Quebec, Canada). R38Q scFv готовили в 1,9 мг/мл растворе, содержащем 0,01% Tween-80. Кинетику связывания между R38Q scFv и С5 измеряли непосредственно иммобилизированием антитела на СМ5 сенсорном чипе (Biacore, GE Healthcare) . Все измерения выполняли при температуре поверхности сенсора 25°С.
Различные концентрации С5 пропускали через поверхность чипа, содержащего связанный R38Q scFv. Концентрации от 0,1875 нМ до 2 4 нМ С5 оценивали со временем диссоциации 150 0 секунд. Кинетику связывания между R3 8Q scFv и С5 определяли с использованием 1:1 модели Ленгмюра (кинетические данные представлены в таблице 1) . После приведения данных в соответствие с моделью Ленгмюра, определяли, что KD взаимодействия между R3 8Q scFv и С5 равна 108 пМ. При схожих условиях определяли, что KD взаимодействия между пекселизумабом и С5 равна 390 пМ. Такие данные указывают на то, что замена R38Q не влияет в значительной мере на способность R38Q scFv антитела связываться с С5.
Самоассоциацию R38Q scFv также оценивали с использованием Biacore. Кратко, R38Q scFv иммобилизировали непосредственно на СМ5 сенсорном чипе, и различные концентрации (0,6-75 мкМ) R38Q scFv пропускали через поверхность чипа. Несмотря на то, что данные, полученные в данных самоассоциации не соответствовали модели Ленгмюра сами по себе (х2 0, 621 и остатки ± 3,5), определяли, что KD равна 32 мкМ, что было сопоставимо с предшествующими исследованиями с пекселизумабом при схожих условиях.
Пример 2. Замена R38Q не влияет в значительной мере на ингибирование гемолиза
Пекселизумаб является сильнодействующим ингибитором
гемолиза in vitro. Для определения того, воздействует замена R38Q на способность антитела R38Q scFv ингибировать гемолиз, антитело оценивали в in vitro анализе гемолиза красных кровяных клеток.
Анализ гемолиза красных кровяных клеток в целом подробно описан, например, в Rinder et al. (1995) J Clin Invest 96:15641572. Кратко, нормальную сыворотку человека добавляли в многочисленные лунки 9б-луночного аналитического планшета, так что концентрация сыворотка в каждой лунке была приблизительно 10%. Различные концентрации (20, 10, 5, 2,5, 1, и 0,5 мкг/мл) пекселизумаба или R3 8Q замещенного антитела добавляли к содержащим сыворотку лункам. Некоторые из содержащих сыворотку лунок не содержали антитело и служили в качестве отрицательных контролей.
Куриные эритроциты (Lampire Biological Laboratories,
Piperville, PA) промывали и ресуспендировали в буфере в
конечной концентрации 5x107 клеток/мл. Эритроциты
сенсибилизировали для лизиса инкубированием клеток с композицией поликлонального антитела против куриных красных кровяных клеток. Сенсибилизированные эритроциты добавляли в лунки 9б-луночного планшета, и планшет инкубировали при 37 °С в течение 3 0 минут. Высвобождение гемоглобина измеряли видимой абсорбцией при 415 нм с использованием микропланшет-ридера.
Как показано на фиг. 1, и пекселизумаб, и R38Q замещенное антитело ингибируют гемолиз эритроцитов, при этом каждый имеет IC50 приблизительно 2 мкг/мл. Такие результаты указывают на то, что замена R38Q не воздействует на способность R38Q scFv ингибировать гемолиз in vitro.
Пример 3. R38Q scFv проявляет повышенную растворимость по сравнению с пекселизумабом
Оценивали растворимость R3 8Q scFv. Различные количества R38Q scFv добавляли к забуференному фосфатом раствору (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, рН 7). Растворы R38Q scFv вплоть до 50 мг/мл могли быть получены в буфере. В отличие от этого, предел растворимости пекселизумаба в таком же буфере составлял
приблизительно 2 мг/мл. Такие результаты, продемонстрировали, что замена R38Q повышала растворимость варианта антитела в водном растворе.
Олигомеризация белков является существенным фактором риска для высококонцентрированных растворов белков (например, антител) и олигомеризация может воздействовать на активность биологически активного белка. См., например, Treuheit et al.
(2002) Pharm Res JL9 (4 ) : 511-516 и Shire et al. (2004) J Pharm Sci 93_: 1390-1402. Для характеризации степени олигомеризации
(если она произойдет) R38Q scFv в растворе с высокими концентрациями несколько растворов (1,9 мг/мл, 10 мг/мл и 50 мг/мл) антител готовили в фосфатном буфере (10 мМ фосфат натрия, 150 мМ хлорид натрия, рН 7) . Состояние олигомеризации R38Q scFv в растворе анализировали подверганием 20 мкг белка из каждого раствора эксклюзионной хроматографии (SEC) высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Результаты экспериментов суммированы в таблице 2. (Димерная форма R38Q scFv является доминирующей формой антитела в растворе.) Такие результаты продемонстрировали, что R38Q scFv образует олигомерные объекты в растворе, и что процентное содержание олигомерных объектов в растворе возрастает с концентрацией.
как относительная площадь.
** 50 мг/мл раствор также содержал приблизительно 21,5%
Пример 4. R38Q scFv обратимо олигомеризуется в растворе с высокой концентрацией
олигомеров более высокого порядка. НО означает "не обнаружены."
Для определения того, является ли зависимая от концентрации олигомеризация R38Q scFv в растворе обратимой, выполняли следующий эксперимент. Сперва готовили 50 мг/мл раствор R38Q scFv в следующем буфере: 10 мМ фосфата натрия рН 7, 150 мМ хлорида натрия и 0,01% Tween 20. Затем 50 мг/мл раствор разбавляли до 2 мг/мл и инкубировали в течение различного времени (108, 1100, 5762 минут) при 4-5°С перед подверганием 2 0 мкг 2 мг/мл образца SEC HPLC. Результаты эксперимента суммированы в таблице 3.
НО означает "не обнаружены."
После разбавления и через некоторое время олигомерные формы R38Q scFv более высокого порядка, обнаруженные в 50 мг/мл растворе, диссоциируют на объекты более низкого порядка. Например, после 57 62 минут в разбавленном 2 мг/мл растворе не было обнаружено гексамерных, гептамерных, октомерных объектов или более высокого порядка. На самом деле, процентное содержание преобладающей димерной формы через 57 62 минут после разбавления до раствора 2 мг/мл (73,53%) составляло приблизительно такое же количество, что было представлено в неразбавленном 1,9 мг/мл растворе, проанализированным выше (77,28%; см. таблицу 2). Такие результаты указывают на то, что зависимая от концентрации олигомеризация R38Q scFv в растворе является обратимой. Результаты также указывают на то, что
мультимерные и олигомерные формы более высокого порядка R38Q scFv, представленные в высококонцентрированном растворе, при разбавлении перед введением или при разбавлении при введении индивиду вероятно диссоциируют на преобладающую димерную форму.
Пример 5. Высококонцентрированный R38Q scFv состав не воздействует в значительной мере на активность антитела
Как отмечено выше, олигомеризация биологически активных белков может в некоторых случаях воздействовать на биологическую активность белка. Для определения того, воздействует ли обратимая олигомеризация R38Q scFv на его биологическую активность, несколько растворов (1,9 мг/мл, 10 мг/мл и 50 мг/мл) антител готовили в фосфатном буфере (10 мМ натрия фосфат, 150 мМ хлорид натрия, рН 7), как описано выше, и оценивали в in vitro анализе гемолиза (см. выше).
Нормальную сыворотку человека добавляли во множественные лунки 9б-луночного аналитического планшета. R38Q scFv белок из раствора 50 мг/мл добавляли в набор содержащих сыворотку лунок в таком количестве, что конечная концентрация антитела в лунке составляла 10, 5, 2,5, 1,25, 0,75, 0,375 или 0,188 мкг/мл, соответственно. Белок антитело R38Q scFv из растворов 10 мг/мл и 1,9 мг/мл также добавляли в параллельные наборы содержащих сыворотку лунок в количествах, достаточных для достижения таких же конечных концентраций антитела в лунках. Некоторые содержащие сыворотку лунки не содержали антитело и служили в качестве отрицательных контролей.
Сенсибилизированные эритроциты добавляли в лунки 9 6-луночного планшета, и планшет инкубировали при 37 °С в течение 3 0 минут. Высвобождение гемоглобина измеряли видимой абсорбцией при 415 нм с использованием микропланшет-ридера.
Как показано на фиг. 2, обратимая зависимая от концентрации олигомеризация белка R38Q scFv не воздействует в значительной мере на способность антитела ингибировать in vitro гемолиз красных кровяных клеток курицы. Такие результаты указывают на то, что R38Q scFv белок, присутствующий в мультимерных и олигомерных формах более высокого порядка в высококонцентрированных растворах, сохраняет биологическую
активность. Результаты также указывают на то, что при
разбавлении перед введением или при разбавлении при введении
индивиду R3 8Q scFv белок, представленный в
высококонцентрированных растворах, способен терапевтически ингибировать гемолиз у индивида.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано на основании его специфичных вариантов осуществления, специалист в данной области должен понимать, что различные изменения могут быть внесены, и эквиваленты могут быть замещены, без отклонения от главной сущности и выхода за объем изобретения. В дополнение, многие модификации могут быть адаптированы к конкретной ситуации, материалу, смеси химически связанных веществ, процесса, этапа и этапов процесса, в отношении цели, сущности и объема настоящего описания. Подразумевается, что все такие модификации входят в объем изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> David Gies, Jeffrey W. Hunter, and Jeremy P. Springhorn <120> ПОЛИПЕПТИДЫ, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТ КОМПОНЕНТ С5 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА <130> ALXN-156-001 <140>
<141> 2010-10-01
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
741 ДНК
<213> Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированное одноцепочечное антитело, которое связывается с компонентом C5 комплемента человека, и транслированная аминокислотная последовательность антитела
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(741)
<400> 1
gat atc cag atg acc cag tcc ccg tcc tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gat agg gtc acc atc acc tgc ggc gcc agc gaa aac atc tat ggc gcg 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
ctg aac tgg tat caa cag aaa ccc ggg aaa gct ccg aag ctt ctg att 144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tac ggt gcg acg aac ctg gca gat gga gtc cct tct cgc ttc tct gga 192
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
tcc ggc tcc gga acg gat ttc act ctg acc atc agc agt ctg cag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gac ttc gct acg tat tac tgt cag aac gtt tta aat act ccg ttg 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu
85 90 95
act ttc gga cag ggt acc aag gtg gaa ata aaa cgt act ggc ggt ggt 336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly
100 105 110
ggt tct ggt ggc ggt gga tct ggt ggt ggc ggt tct caa gtc caa ctg 384
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
115 120 125
gtg caa tcc ggc gcc gag gtc aag aag cca ggg gcc tca gtc aaa gtg
432
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
130 135 140
tcc tgt aaa gct agc ggc tat att ttt tct aat tat tgg att caa tgg 480
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Gln Trp
145 150 155 160
gtg cgt cag gcc ccc ggg cag ggc ctg gaa tgg atg ggt gag atc tta 528
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Leu
165 170 175
ccg ggc tct ggt agc acc gaa tat acc gaa aat ttt aaa gac cgt gtt 576
Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe Lys Asp Arg Val
180 185 190
act atg acg cgt gac act tcg act agt aca gta tac atg gag ctc tcc 624
Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser
195 200 205
agc ctg cga tcg gag gac acg gcc gtc tat tat tgc gcg cgt tat ttt 672
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe
210 215 220
ttt ggt tct agc ccg aat tgg tat ttt gat gtt tgg ggt caa gga acc 720
Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
ctg gtc act gtc tcg agc tga 741
Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 2
<211> 246
<212> БЕЛОК
<213> Аминокислотная последовательность гуманизированного одноцепочечного антитела, которое связывается с компонентом C5 комплемента
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Asn Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
115 120 125
Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val
130 135 140
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Gln Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Leu
165 170 175
Pro Gly Ser Gly Ser Thr Glu Tyr Thr Glu Asn Phe Lys Asp Arg Val
180 185 190
Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser
195 200 205
Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Phe
210 215 220
Phe Gly Ser Ser Pro Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser 245
<210> 3
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Примерная аминокислотная последовательность линкера,
представленного в варианте антитела пекселизумаб
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 4 <211> 1676 <212> БЕЛОК
<213> Примерная аминокислотная последовательность белка компонента C5 несформированного комплемента человека
<400> 4
Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr
1 5 10 15
Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg
20 25 30
Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu
35 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe
50 55 60
Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln
65 70 75 80
Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln
85 90 95
Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser
100 105 110
Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile
115 120 125
His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg
130 135 140
Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val
145 150 155 160
Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu
165 170 175
Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser
180 185 190
Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp
195 200 205
Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu
210 215 220
Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr
245 250 255
Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg
260 265 270
Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln
275 280 285
Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu
290 295 300
Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn
305 310 315 320
Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe
325 330 335
Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr
340 345 350
Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro
355 360 365
Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly
370 375 380
Gly Val Pro Val Ile Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu
385 390 395 400
Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly
405 410 415
Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu
420 425 430
Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala
435 440 445
Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr
450 455 460
Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu
465 470 475 480
His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile
485 490 495
Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe
500 505 510
Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile
515 520 525
Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr
530 535 540
Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp
545 550 555 5б0
Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser
565 570 575
Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met
580 585 590
Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala
595 б00 б05
Val Tyr Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe
б10 б15 б20
Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu
б25 б30 б35 б40
Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn
б45 б50 б55
Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile
бб0 бб5 б70
Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala
б75 б80 б85
Lys Tyr Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys
б90 б95 700
Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu
705 710 715 720
Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser
725 730 735
Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu
740 745 750
His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr
755 760 765
Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys
770 775 780
Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln
785 790 795 800
Gly Ile Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys
805 810 815
Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser
820 825 830
Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr
835 840 845
Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly
850 855 860
Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser
865 870 875 880
Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val
885 890 895
Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe
900 905 910
Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg
915 920 925
Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu
930 935 940
Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro
945 950 955 960
Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile
965 970 975
Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu
980 985 990
Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala
995 1000 1005
Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His
1010 1015 1020
Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro
1025 1030 1035
Leu Ile Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met
1040 1045 1050
Leu Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val
1055 1060 1065
Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu
1070 1075 1080
Arg Val Leu Gly Gln Val Asn Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn
1085 1090 1095
Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu
1100 1105 1110
Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys
1115 1120 1125
Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr
1130 1135 1140
Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile
1145 1150 1155
Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Asn
1160 1165 1170
Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu
1175 1180 1185
Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro
1190 1195 1200
Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val
1205 1210 1215
Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu Gln
1220 1225 1230
His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val
1235 1240 1245
Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp
1250 1255 1260
Ile Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln
1265 1270 1275
Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala
1280 1285 1290
Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg
1295 1300 1305
Leu Ser Met Asp Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu
1310 1315 1320
His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val
1325 1330 1335
Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly
1340 1345 1350
Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr
1355 1360 1365
Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr
1370 1375 1380
Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp
1385 1390 1395
Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Arg Glu
1400 1405 1410
Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile Ser Leu
1415 1420 1425
Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val
1430 1435 1440
Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly
1445 1450 1455
His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu
1460 1465 1470
Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu
1475 1480 1485
Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys
1490 1495 1500
Gln Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys
1505 1510 1515
Val Cys Glu Gly Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly
1520 1525 1530
Gln Met Gln Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg
1535 1540 1545
Lys Gln Thr Ala Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val
1550 1555 1560
Ser Ile Thr Ser Ile Thr Val Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys
1565 1570 1575
Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu
1580 1585 1590
Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn
1595 1600 1605
Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu
1610 1615 1620
Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro
1625 1630 1635
Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg Asp Thr Thr
1640 1645 1650
Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala
1655 1660 1665
Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys 1670 1675
34054132_1
34054132_1
34054132_1
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полипептид, содержащий: (i) аминокислоты 1-107 SEQ ID
N0:2 и (ii) аминокислоты 125-24 6 SEQ ID N0:2, при условии, что
полипептид не является полноразмерным антителом.
2. Полипептид, содержащий аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична
аминокислотной последовательности, содержащей: (i) аминокислоты
1-107 SEQ ID N0:2 и (ii) аминокислоты 125-246 SEQ ID N0:2, где
полипептид связывается с компонентом комплемента С5 человека, и
аминокислотная последовательность полипептида содержит остаток
глутамина в положении 3 8 SEQ ID N0:2, при условии, что
полипептид не является полноразмерным антителом.
3. Полипептид, содержащий: (i) аминокислоты 1-107 SEQ ID N0:2 и (ii) аминокислоты 125-246 SEQ ID N0:2, с не более чем 10 аминокислотными заменами в (i) или (ii), где полипептид связывается с С5 компонентом комплемента человека, и аминокислотная последовательность содержит остаток глутамина в положении 38 SEQ ID N0:2, при условии, что полипептид не является полноразмерным антителом.
4. Полипептид, который содержит по меньшей мере 50 соседних аминокислот SEQ ID N0:2, где полипептид связывается с С5 компонентом комплемента человека, и по меньшей мере 50 аминокислот содержат остаток глутамина в положении 3 8 SEQ ID N0:2, при условии, что полипептид не является полноразмерным антителом.
5. Полипептид по любому из пп.1-4, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID N0:2.
6. Полипептид по любому из пп.1-5, где аминокислотная последовательность полипептида состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2.
7. Слитый полипептид, содержащий:
(a) полипептид по любому из пп.1-5; и
(b) аминокислотную последовательность, которая
гетерологична аминокислотам 1-107 и 125-246 SEQ ID N0:2.
8. Слитый полипептид по п. 7, где слитый полипептид является одноцепочечным антителом.
8.
9. Слитый полипептид, содержащий:
(a) полипептид по любому из пп.1-5; и
(b) нацеливающую группу, которая направляет полипептид (а) к месту активации комплемента.
10. Слитый полипептид по п. 9, где нацеливающая группа содержит растворимую форму рецептора комплемента 1 или растворимую форму рецептора комплемента 2.
11. Слитый полипептид по п. 9, где нацеливающая группа содержит антитело, которое связывается с компонентом комплемента СЗЬ или компонентом комплемента C3d.
12. Слитый полипептид по п. 9, где нацеливающая группа содержит антитело, которое связывается с ткане-специфичным антигеном.
13. Слитый полипептид по п.12, где ткань является почечной тканью.
14. Слитый полипептид по п.13, где нацеливающая группа содержит антитело, которое связывается с человеческим KIM-1.
15. Нуклеиновая кислота, кодирующая (а) полипептид по любому из пп.1-6 или (Ь) слитый полипептид по любому из пп.7-14 .
16. Нуклеиновая кислота по п.15, где нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.
17. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.15 или 16.
18. Вектор по п.17, где нуклеиновая кислота функционально связана с регулирующей экспрессию последовательностью.
19. Клетка, содержащая вектор по п.17 или 18.
20. Клетка по п.19, где клетка является бактериальной клеткой.
21. Клетка по п.19, где клетка является клеткой млекопитающего.
22. Клетка по п.21, где клетка млекопитающего является клеткой человека или клеткой грызуна.
23. Способ получения полипептида, при этом способ содержит культивирование клетки по любому из пп. 19-22 при условиях, подходящих для экспрессии полипептида или слитого полипептида.
24. Способ по п.23, дополнительно содержащий выделение
полипептида или слитого полипептида из клетки или из среды, в которой она культивировалась.
25. Полипептид или слитый полипептид, полученный по
способу по п.2 3 или 24.
26. Фармацевтическая композиция, содержащая:
полипептид по любому из пп.1-6 или 25, или слитый полипептид по любому из пп. 7-14 или 2 5; и фармацевтически приемлемый носитель.
27. Фармацевтический раствор, содержащий (а) полипептид по любому из пп.1-6 или 25, или (Ь) слитый полипептид по любому из пп.7-14 или 25, где полипептид или слитый полипептид представлен в растворе в концентрации между 5 мг/мл и 100 мг/мл.
28. Фармацевтический раствор по п.27, где концентрация полипептида или слитого полипептида в растворе составляет по меньшей мере 10 мг/мл, но меньше или равна 100 мг/мл.
29. Фармацевтический раствор по п.27, где концентрация полипептида или слитого полипептида в растворе составляет по меньшей мере 10 мг/мл, но меньше или равна 50 мг/мл.
30. Фармацевтический раствор по п.27, где концентрация полипептида или слитого полипептида в растворе составляет по меньшей мере 2 0 мг/мл, но меньше или равна 50 мг/мл.
31. Фармацевтический раствор по п.27, где концентрация полипептида или слитого полипептида в растворе составляет по меньшей мере 5 мг/мл, но меньше 30 мг/мл.
32. Способ ингибирования образования терминального
комплемента в биологическом образце, способ содержит приведение
биологического образца в контакт с терапевтическим средством в
количестве, эффективном для ингибирования терминального
комплемента в биологическом образце, где биологический образец
способен к выработке терминального комплемента в отсутствии
терапевтического средства и где терапевтическое средство
представляет собой (а) полипептид по любому из пп.1-6 или 25,
или (Ь) слитый полипептид по любому из пп.7-14 или 25.
33. Способ по п.32, где биологический образец является
образцом сыворотки.
34. Способ по п.33, где образец сыворотки взят у индивида, имеющего, с подозрением на наличие или подверженного риску развития комплемент-связанного нарушения.
35. Способ для лечения индивида, имеющего комплемент-связанное нарушение, способ содержит введение индивиду, имеющему комплемент-связанное нарушение, терапевтического средства в количестве, эффективном для лечения комплемент-связанного нарушения, где терапевтическое средство представляет собой (а) полипептид по любому из пп.1-6 или 25, или (Ь) слитый полипептид по любому из пп.7-14 или 25.
36. Способ лечения индивида, имеющего комплемент-связанное нарушение, способ содержит введение индивиду, имеющему комплемент-связанное нарушение, терапевтической композиции в количестве, эффективном для лечения комплемент-связанного нарушения, где терапевтическая композиция представляет собой (а) фармацевтическую композицию по п. 2 6 или (Ь) фармацевтический раствор по любому из пп.27-31.
37. Способ по п.35 или 36, где комплемент-связанное нарушение является ночной пароксизмальной гемоглобинурией.
38. Способ по п.35 или 36, где комплемент-связанное нарушение является атипичным гемолитическим уремическим синдромом.
39. Способ по п.35 или 36, где комплемент-связанное нарушение является возрастной макулярной дегенерацией.
40. Способ по п.35 или 36, где комплемент-связанное нарушение является отторжением трансплантата.
41. Способ по п.40, где индивид является индивидом, имеющим, с подозрением на наличие или подверженным риску развития отторжения костного мозга, отторжения почечного трансплантата, отторжения кожного трансплантата, отторжения сердечного трансплантата, отторжения легочного трансплантата или отторжения печеночного трансплантата.
42. Способ по п.35 или 36, где комплемент-связанное нарушение выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, легочного заболевания, ишемически-реперфузионного повреждения, атипичного гемолитического уремического синдрома,
37.
тромбоцитопенической тромбогемолитической пурпуры, ночной
пароксизмальной гемоглобинурии, болезни плотного осадка,
возрастной макулярной дегенерации, спонтанной потери плода,
Пауци-иммунного васкулита, буллезного эпидермолиза, повторной
потери плода, множественного склероза, травматического
повреждения мозга, миастении гравис, болезни Холодовых
агглютининов, дерматомиозита, синдрома Дегоса, болезни Грейвса,
тиреоидита Хашимото, диабета 1 типа, псориаза, пемфигуса,
аутоиммунной гемолитической анемии, идиопатической
тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Гудпасчера,
мультифокальной двигательной невропатии, оптиконевромиелита,
антифосфолипидного синдрома и катастрофического
антифосфолипидного синдрома.
43. Способ по п.42, где легочное заболевание выбрано из группы, состоящей из хронического обструктивного легочного нарушения (COPD), астмы, фиброза легких, бронхита, эмфиземы, облитерирующего бронхиолита и саркоидоза.
44. Способ по любому из пп.35-43, где полипептид или слитый полипептид вводится индивиду внутривенно.
45. Способ по любому из пп.35-43, где полипептид или слитый полипептид вводится в легкие индивида.
46. Способ по любому из пп.35-43, где полипептид или слитый полипептид вводится индивиду подкожно.
47. Способ по любому из пп.35-4 6, дополнительно содержащий введение одного или более дополнительных терапевтических средств для лечения комплемент-связанного нарушения.
48. Способ по любому из пп.35-47, где индивид является человеком.
49. Конъюгаты, содержащие: (i) полипептид по любому из пп.1-6 или 2 5; и (ii) гетерологичную группу, конъюгированную с полипептидом.
50. Конъюгаты по п.49, где гетерологичная группа ковалентно конъюгирована с полипептидом.
51. Конъюгаты по п.49, где гетерологичная группа нековалентно конъюгирована с полипептидом.
52. Конъюгаты по любому из пп.4 9-51, где гетерологичная
группа является детектируемой меткой.
53. Конъюгаты по любому из пп.4 9-51, где гетерологичная
группа является первым членом пары специфичного связывания.
54. Набор для использования при лечении индивида, имеющего, с подозрением на наличие или подверженного риску развития комплемент-связанного нарушения, набор содержит:
(i) терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из: (а) одного или более полипептидов по любому из пп.1-б или 25, (Ь) слитого полипептида по любому из пп.7-14 или 25, (с) конъюгатов по любому из пп.49-53, (d) фармацевтической композиции по п. 2 6 и (е) фармацевтического раствора по любому из пп.2 7-31; и
(ii) средство для доставки терапевтического средства.
55. Набор по п.54, где средство подходит для подкожной доставки терапевтического средства индивиду.
56. Набор по п.54, где средство подходит для интраокулярной доставки терапевтического средства индивиду.
57. Набор по п.54, где средство подходит для внутрисуставной доставки терапевтического средства индивиду.
58. Набор по любому из пп.54-57, где средство является шприцом.
59. Набор по п.57, где средство является двухцилиндровым шприцом.
60. Набор по п.56, где средство является транссклеральной накладкой или контактными линзами, содержащими терапевтическое средство.
61. Набор по п.54, где средство подходит для
внутрилегочной доставки терапевтического средства индивиду.
62. Набор по п.61, где средство является ингалятором или распылителем.
63. Набор по любому из пп. 54-62, дополнительно содержащий по меньшей мере одно дополнительное активное средство для использования при лечении комплемент-связанного нарушения у индивида.
По доверенности
1.8
(1)
