[**]

Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии для получения белков и пептидов, содержащему промотор, функционально связанный с представляющим интерес геном, TPL и генами VA I и II, областями прикрепления к матриксу (MAR)/SAR, антибиотиком-маркером. Указанный вектор трансфицируют в подходящую клетку-хозяина.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии для получения белков и пептидов, содержащему промотор, функционально связанный с представляющим интерес геном, TPL и генами VA I и II, областями прикрепления к матриксу (MAR)/SAR, антибиотиком-маркером. Указанный вектор трансфицируют в подходящую клетку-хозяина.

---

(19)
Евразийское
патентное ведомство
(21) 201390461 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43)
Дата публикации заявки
(51) Int. Cl. C12N15/85 (2006.01)
2013.09.30
(22) Дата подачи заявки
2011.10.10
(54) ВЕКТОР ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ
(31) 2806/MUM/2010 (57) Настоящее изобретение относится к вектору
(32) 2010.10.08 экспрессии для получения белков и пептидов, со-
(33) IN держащему промотор, функционально связанный с
(34) PCT/IN2011/000703 представляющим интерес геном, TPL и генами VA
(35) WO 2012/046255 2012.04.12 I и II, областями прикрепления к матриксу (MAR)/
(36) 2012.05.31 SAR, антибиотиком-маркером. Указанный вектор
(71) Заявитель: трансфицируют в подходящую клетку-хозяина.
КАДИЛА ХЕЛЗКЭР ЛИМИТЕД (IN) канаМ"ч^_
(72)
Изобретатель:
Парикх Ашини, Сингх Арун, Мендиратта Санджив Кумар, Гупта Аджит К, Якхаде Манси (IN)
(74)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
2420-195472ЕА/011 ВЕКТОР ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новому вектору экспрессии для высокоэффективной экспрессии рекомбинантных терапевтических белков. В частности, настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему генную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок, и по меньшей мере один функционально связанный повышающий экспрессию элемент, такой как область прикрепления к матриксу. Указанный вектор может дополнительно содержать другие регуляторные элементы. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к клеткам млекопитающих, трансфицированным указанным вектором экспрессии.
Уровень техники
Повышенная потребность в терапевтических белках
преимущественно связана с тем, что они, как правило, являются
высокоспецифичной мишенью действия, что приводит к
значительному снижению и хорошо определенному риску токсичности
по сравнению с лекарственными средствами на основе
низкомолекулярных соединений. Несмотря на наличие всех этих
благоприятных для пациентов качеств, большинство
терапевтических белков остаются недоступными для большинства людей в мире, так как они остаются слишком дорогими. Таким образом, жизненно необходимые или другие важные лекарственные средства, такие как эритропоэтин, дарбепоэтин, ТЫКаза, этанерцепт, гонадотропины, которые значительно повышают качество жизни, и большое число противораковых моноклональных лекарственных средств, таких как ритуксимаб, трастузумаб и другие терапевтические моноклональные антитела и т.д., доступны только для очень небольшого процента людей, тогда как подавляющему большинству они не доступны. Таким образом, существует неотложная необходимость в снижении затрат на эти лекарственные средства.
Основная часть этих высоких затрат связана с их
производством, вследствие их низких выходов. Выход клона зависит от выбора нескольких факторов, таких как внешние факторы, такие как условия культивирования (компоненты среды, температура, рН и т.д.) и дальнейшему процессу очистки; и внутренние факторы, такие как выбор вектора и его регуляторных элементов, таких как промотор, факторы, усиливающие транскрипцию или усиливающие трансляцию, и т.д., и их подходящее расположение, а также выбор подходящей клетки-хозяина. Клетка млекопитающего является наиболее перспективной системой экспрессии для высокоэффективной экспрессии рекомбинантных терапевтических белков, так как она обладает природной способностью к гликозилированию. Кроме того, наиболее вероятно, что посттрансляционные модификации в таких системах экспрессии напоминают посттрансляционные модификации, найденные в клетках человека, экспрессирующих белки, таким образом, обеспечивая физиологическую активность. Однако уровни экспрессии в эукариотических клетках также сильно зависят от другого внутреннего фактора, т.е. участка интеграции рекомбинантной экспрессирующей конструкции, содержащей представляющий интерес ген, в геном клетки-хозяина.
Рекомбинантную экспрессию плазмиды, содержащей
представляющий интерес ген, кодирующий желаемый белок, как правило, используют для получения стабильных трансфектантов СНО или других трансфектантов млекопитающих, экспрессирующих желаемый рекомбинантный белок. В идеальной системе для сверхэкспрессии у эукариот интеграция экспрессирующей кассеты в геном клетки-мишени происходит в положении, обеспечивающем высокую и стабильную или длительную экспрессию. Однако в большинстве современных способов достигают только случайной интеграции плазмидной ДНК в геном клетки-хозяин. Из литературы очевидно, что уровни экспрессии в популяциях клонов, образующихся в результате такого процесса трансфекции, высоко вариабельны (Brian К Lucas et al., Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, No. 9 , R.T. Schimke et al. , Br. J. Cancer (1985), 51, 459- 465, Wurtele H, et al., Gene Ther. 2003 Oct;10 (21) :1791-9. Biotechnol Prog. 2000 Sep-Oct;16 (5) :710-5,
Yoshikawa T et al., Biotechnol Prog. 2000 Sep-Oct;16(5):710-5., Kim NS, et al. , Biotechnol Prog. 2001 Jan-Feb; 17(1):69-75) . Также достаточно низкой является частота трансфектом, несущих стабильно интегрированный рекомбинантный ген, способных к экспрессии высокого уровня желаемого рекомбинантного белка.
Как правило, для идентификации клонов с высоким уровнем экспрессии рекомбинантных белков необходимо подвергать скринингу большое количество стабильно трансфицированных клеток. Полагают, что в основном это связано с влиянием генетического окружения в участке интеграции, так как фактически геном млекопитающих является большим и приблизительно только 0,1% в нем содержит транскрипционно активные последовательности (Little (1993) Nature 366:204). Это явление влияния участка интеграции на экспрессию называют "эффект положения". Эффект положения положительным или отрицательным образом регулирует уровни экспрессии интегрируемого гена посредством любого или всех следующих механизмов - 1) присутствие регуляторных элементов рядом с участком интеграции, которые могут участвовать в регуляции экспрессии интегрированного гена, 2) структура хроматина в участке интеграции, 3) активность метилирования ДНК в участке интеграции. Отрицательное влияние эффекта положения может быть таким же сильным, как сайленсинг гена вследствие метилирования ДНК или деацетилирования гистонов.
Таким образом, очень маловероятно, что технология случайной интеграции плазмиды в геном клеток СНО всегда будет приводить к вставке рекомбинантного гена в транскрипционно активную зону, способствующую высоким уровням экспрессии гена. Это означает, что количество клонов, которые необходимо подвергать скринингу для выявления клона с высокой экспрессией, может быть очень большим.
Для решения задачи проблемы, связанной со случайной интеграцией, в литературе описан поиск систем для интеграции желаемого гена в геном гена сайт-специфическим способом, и эти системы использовали с ограниченным успехом. Например, некоторые группы для опосредованного сайт-специфической
рекомбинацией введения представляющих интерес генов в транскрипционно активные участки генома использовали определенные ферменты. Рекомбиназы, такие как Сге и FLP, выполняют интеграцию и вырезание в одних и тех же участках-мишенях (Sauer, В. (1994) Curr Opin. Biotechnol., 5, 521-527, Sternberg et al, J Mol Biol, 1981,150,467-486, Broach et al, Cell, 198 0,21,501-508). Однако хотя эти рекомбиназы эффективно выполняют интеграцию в клетки млекопитающих, общая частота интеграции, которую они опосредуют, является низкой вследствие избыточной обратной реакции. Таким образом, проблема стабильной и высокой экспрессии остается не решенной.
Традиционно, для получения устойчивых высокопродуктивных линий клеток, как правило, применяли способы увеличения числа копий генов, такие как способ амплификации генов, опосредованный метотрексатом (МТХ). После трансфекции проводят интенсивный поиск одноклеточных клонов с желаемым фенотипом. Также, как правило, посредством малых приращений повышают уровни метотрексата, предоставляя клеткам достаточно времени для стабилизации на каждом уровне приращения. Таким образом, этот способ повышения экспрессии трансфицированных клеток млекопитающих требует большого количества времени и является трудоемким.
Транскрипция эукариотических генов регулируется
разнообразными цис- и транс-действующими регуляторными элементами (Dillon et.al., (1993) Trends Genet. 9:134). Двумя лучше всего охарактеризованными цис-элементами являются промоторы и энхансеры. Промоторы представляют собой последовательности ДНК, расположенные непосредственно рядом с 5'-концом кодирующей последовательность гена. Они содержат несколько участков связывания для транс-действующих факторов транскрипции, формируя основной аппарат транскрипции. Подобным образом, энхансеры также состоят из нескольких сайтов связывания для транс-действующих факторов транскрипции, но они могут располагаться на большом расстоянии выше или ниже по ходу транскрипции от кодирующих последовательностей или даже внутри интронов. Эти элементы могут также действовать независимым от
ориентации образом. Активность промоторов и энхансеров можно детектировать в системах транзиторной экспрессии, и они содержат элементы, которые могут быть или не быть тканеспецифическими.
Авторы настоящего изобретения в своей заявке WO2007017903 уже описали комбинированный эффект регуляторных элементов, таких как а) промотор CMV, Ь) интрон, с) TPL, d) гены VA и е) последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, для достижения высоких уровней экспрессии рекомбинантных белков.
Другой категорией цис-действующих регуляторных элементов являются регуляторные элементы, которые считают регулирующими структуру хроматина, и они включают контролирующие локусы области (LCR) [Grosveld et al. , (1987) Cell 51:975], области прикрепления к матриксу (MAR) [Phi-Van et al. , (1990) Mol. Cell. Biol. 10:2302], области прикрепления к каркасу (SAR) [Gasser and Laemmli (1987) Trens Genet. 3:16], инсуляторные элементы [Kellum and Schedl (1991) Cell 64:941] и ядерную матрикс-связанную ДНК [Bode J et al., (1992) Science 255:195].
MAR и SAR являются сходными энхансерами в том, что они способны действовать на больших расстояниях, но уникальны тем, что их действие можно детектировать только в стабильно трансформированных линиях клеток или у трансгенных животных. LCR также отличается от других типов энхансеров тем, что они зависят от положения и ориентации, и активны тканеспецифически.
Элементы SAR/MAR использовали для устранения недостатков эффектов положения и для обеспечения высокоактивных генов в экспрессирующей конструкции. Они предотвращают воздействие смежных элементов хроматина клетки-хозяина на экспрессию трансгенов. MAR выделены из областей, окружающих активно транскрибирующиеся гены, а также из центромерных и теломерных областей. Они повышает экспрессию желаемого гена, регулируя активность транскрипции.
В существующей литературе описано нескольких различных MAR/SAR, таких как пограничный элемент Scs дрозофилы, MAR hspSAP, Т-клеточный рецептор TCRa мыши, контролирующая локус
область крысы, MAR р-глобина, SAR элемент аполипопротеина В и т.д. из различных видов и различных высокоэкспрессированных генов. Большинство из этих элементов продемонстрировали от низкого до умеренного улучшения уровней экспрессии желаемого гена в клетках СНО (P.A. Girod and Nicolas Mermod, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cell, 2003). В отличие от этого, показано, что MAR лизоцима курицы (cLysMAR) стимулирует в 5-6 раз более высокие уровни экспрессии по сравнению с контролями, где MAR элементы отсутствовали (P.A. Girod and Nicolas Mermod, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cell, 2003) . Также, когда с обеих сторон, фланкирующих экспрессирующую кассету, использовали одинаковые MAR, наблюдали дополнительное увеличение уровней экспрессии в 4-5 раз (Р.А. Girod and Nicolas Mermod, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cell, 2003). Таким образом, очевидно, что cLysMAR представлял собой наиболее перспективный элемент, описанный на известном уровне техники. cLysMAR локализуется гораздо выше по ходу транскрипции от гена лизоцима курицы (Phi-Van and Stratling, EMBO, 7,3, pp 655-64,1988). На линиях трансформированных клеток животных показано, что этот MAR повышает общий уровень экспрессии трансгена и снижает его зависимую от положения вариабельность при помещении вблизи репортерного гена (Stief et al. , Nature, 341, pp 343-345, 1989). Выявлено, что этот эффект распространяется на гетерологичные промоторы и клетки (Phi-Van et al., Molecular and Cellular Biology, 10,5 pp 2302-2307, 1990), а также на тканеспецифичность экспрессии трансгена (McKnight et al., 1992).
В US7422874 описано применение MAR р-глобина в комбинации с регуляторными элементами промотором pSV-gal или pCMV-gal, участком MCS и участком терминации транскрипции в векторной конструкции PMS для повышения экспрессии репортерного гена р-галактозидазы, гена scu-PA и генов SRII TGF-p. Они были способны обеспечивать умеренные уровни экспрессии р-галактозидазы в размере 2 0 мкг/миллион клеток в 8 8% клонов. Они также способны приводить к получению клонов для scu-PA с
уровнями экспрессии в 4 раза более высокими по сравнению с контрольной векторной конструкцией с теми же регуляторными элементами, как указано выше, за исключением MAR. Когда MAR и систему DHFR (дигидрофолатредуктазы) использовали совместно для амплификации генов при экспрессии SRII TGF-p, они были способны обеспечивать получение первичных клонов, продуцирующих 100 нг/миллион клеток/сутки после трансфекции и 10 мкг/миллион клеток/сутки через несколько циклов опосредованной МТХ амплификации генов до 1 мкМ МТХ. Однако уровни экспрессии, получаемые по этому патенту, в настоящее время для биотерапевтических белков, таких ТЫКаза, дарбепоэтин и моноклональные антитела, коммерчески недоступны.
В US7371542 описано использование S/MAR p-IFN в комбинации с регуляторными элементами, промотором CMV, интроном, Ori Р и поли-А, в конструкции вектора экспрессии для повышения экспрессии LTBR-Fc (слитого белка рецептора лимфотоксина бета-Fc IgG) и достижения улучшения уровней экспрессии в клетках СНО по сравнению с контрольным вектором, состоящим из тех же регуляторных элементов, как описанный выше вектор, за исключением MAR, в 4,5 раза. Также выявлено, что использование в векторе экспрессии S/MAR p-IFN увеличивает уровень экспрессии в клетках 293 EBNA при использовании вектора pCEP-LTBR-Fc в 6,3 раза. Однако уровни экспрессии были все еще очень низкими (20 мг/л через 5 суток). Вектор pCB_SMl_LTBR-Fc был способен приводить к получению через 9 суток клонов клеток 2 93 EBNA с продуктивностью 4 0 мг/л. Но уровни продуктивности, получаемые по этому патенту, являются гораздо меньшими, чем желательно для таких биотерапевтических молекул.
В US5731178 описана повышенная экспрессия желаемого гена при использовании cLysMAR в векторной конструкции, содержащей промотор и энхансер. Они продемонстрировали, что использование элемента cLysMAR при устойчивых трансфекциях при использовании элемента MAR в комбинации с энхансерным и промоторным элементами по сравнению с контрольной конструкцией, содержащей только энхансер и промотор, способно улучшать активность репортерного гена CAT более чем в 10 раз, однако сам элемент
MAR не мог продемонстрировать какого-либо существенного воздействия.
В Poljak et al., (1994) Nucleic Acid Res., 22 (21):4386-94) описано повышение экспрессии репортерного гена CAT приблизительно в 15 раз при использовании cLysMAR в комбинации с промотором и энхансером SV4 0. Выявлено, что сам cLysMAR очень плохо повышал экспрессию желаемого гена, а скорее он продемонстрировал ее небольшое снижение.
Таким образом, приведенные выше примеры демонстрируют то, что только контрольных векторных конструкций, содержащих стандартные регуляторные элементы, известные любому специалисту в данной области, недостаточно для поддержания высокой экспрессии. И, кроме того, даже после комбинации с MAR/SAR, уровни экспрессии относительно уровней экспрессии, которые необходимы коммерчески для эффективной продукции рекомбинантных терапевтических средств, не увеличиваются. Таким образом, для достижения желательных уровней экспрессии все еще требовалась уникальная комбинация элементов.
Таким образом, выясняется, что в промышленности существует значительная необходимость в дополнительном повышении экспрессии терапевтических белков для того, чтобы сделать их более доступными. Поэтому чувствуется необходимость в комбинации в векторе экспрессии элементов, которые могут синергически работать наряду с MAR с обеспечением повышенной экспрессии с различными видами генов-мишеней. Авторы настоящего изобретения в приведенном ниже доказали, что для оптимальной экспрессии рекомбинантного белка экономящим время образом необходимо согласованное действие уникальной комбинации регуляторных элементов.
В US7129062 описана совместная трансфекция более 2 не связанных векторов, где один вектор содержит представляющий интерес ген, а второй содержит cLysMAR для повышения экспрессии двух рекомбинантных белков - люциферазы и IgG к резус-антигену D - приблизительно в 20 раз, а также при использованием этой стратегии совместной трансфекции они были способны приводить к продукции IgG к резус-антигену D человека в количестве 200
мг/л. Однако в литературе хорошо описано (DNA Cloning: Mammalian systems; By David M. Glover, B. D. Hames), а также из опыта заявителей хорошо известно, что совместная трансфекция увеличивает гетерогенность и вариабельность в трансфицированной популяции. Кроме того, по настоящему изобретению желательные выходы достигнуты путем использования одиночной трансфекции.
В US20080102523 описано использование MAR р-глобина для повышения экспрессии бета-галактозидазы в 3 раза и иммуноглобулина в б раз по сравнению с контрольной векторной конструкцией, состоящей из промотора-энхансера SV4 0 и/или промотора CMV, участка ori и области поли-А. В указанной выше патентной заявке достигали только умеренного повышения экспрессии посредством воздействия опосредованной МТХ амплификации гена, а также посредством регуляторного элемента MAR р-глобина, таким образом, делая весь процесс трудоемкими и занимающим много времени. Это отличается от настоящего изобретения, где авторы достигли высокой экспрессии с использованием их уникальной комбинации регуляторных элементов и без использования каких-либо длительных и трудоемких способов, подобных способу селекции с MTX-DHFR.
В US5888774 описана высокая экспрессия эритропоэтина при использовании элемента SAR аполипопротеина В человека и описана экспрессия от 1500 до 1700 ME ЕРО/миллион клеток/24 часа. В WO2007017903, принадлежащей авторам изобретения, описан способ получения рекомбинантного эритропоэтина человека на уровне экспрессии 11830 МЕ/мл (91 мкг/мл) через 168 часа культивирования, что эквивалентно 2366-3549 МЕ/106 клеток/24 часа или 18,2-27,3 мкг/106 клеток/24 часа, что значительно выше величин, опубликованных в US5888774. А по настоящему изобретению для нескольких терапевтических белков дополнительно значительно увеличивают уровни экспрессии относительно вектора по WO2007017903.
Таким образом, по-прежнему желательна разработка новых векторов экспрессии для дальнейшего увеличения продуктивности эукариотических клеток-хозяев. Неожиданно, несмотря на очень большое количество информации, полученной в данной области в
течение последних десятилетий, даже в настоящее время
специалист в данной области не может просто взять и выбрать
комбинацию внутренних факторов или регуляторных элементов для
конструирования вектора экспрессии, который мог бы обеспечить
значительно более высокую экспрессию. Кроме того, специалист в
данной области не может стандартным способом экстраполировать
комбинацию подходящих элементов для получения
высокоэффективного вектора экспрессии, так как высокую экспрессию представляющего интерес гена с использованием вектора нельзя просто соотнести только с одним элементом, а для получения устойчивых высокоэкспрессирующих линий желательна комбинация соответствующих элементов. Таким образом, настоящее изобретение относится к решению этой проблемы посредством предоставления новых векторов экспрессии, которые содержат повышающие экспрессию элементы, такие как элемент(ам) MAR лизоцима курицы, в комбинации с другими регуляторными элементами, такими как промотор CMV, интрон, TPL и гены VA, которые играют несколько ролей, например, при увеличении уровней мРНК посредством увеличенной транскрипции, продолжения жизни молекулы мРНК посредством увеличения ее стабильности и посредством увеличения эффективности трансляции, таким образом, действующим синергическим образом, приводя к высокой и стабильной экспрессии рекомбинантного белка в трансфицированных клетках-хозяевах млекопитающих. Комбинация этих элементов в векторе экспрессии по настоящему изобретению, состоящем из экспрессирующей кассеты, фланкированной cLysMAR в цис- или транс- ориентации, приводит к стабильной высокой экспрессии терапевтических белков в линиях трансфицированных клеток. Цели изобретения
Настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, увеличивающему эффективность экспрессии представляющего интерес белка в клетках млекопитающих.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к новому вектору экспрессии, содержащему промотор, функционально связанный с представляющим интерес геном, повышающими экспрессию элементами, другими регуляторными
элементами, т.е. TPL, генами VA I и II или их вариантами, терминатором трансляции и антибиотиком-маркером, где повьшающий экспрессию элемент представляет собой область прикрепления к хроматину.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к конструкции нового вектора экспрессии для экспрессии терапевтических белков и пептидов, где конструкция вектора экспрессии содержит промотор, функционально связанный с участками клонирования, представляющим интерес геном, терминатором трансляции, TPL, генами VA I и II, подходящим антибиотиком-маркером в комбинации с повышающими экспрессию элементами, выбранными из MAR и/или SAR.
В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к новой конструкции вектора экспрессии для экспрессии терапевтических белков и пептидов, где конструкция вектора экспрессии содержит промотор, функционально связанный с участками клонирования, представляющим интерес геном, терминатором трансляции, таким как BGH, интроном, подходящим маркером и необязательно внутренним участком связывания рибосомы в комбинации с повышающими экспрессию элементами, выбранными из MAR и/или SAR.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к новой конструкции вектора экспрессии для экспрессии терапевтических белков и пептидов, где конструкция вектора экспрессии содержит промотор, функционально связанный с участками клонирования, представляющим интерес геном, терминатором трансляции, таким как BGH, TPL, генами VA I и II, интроном, подходящим антибиотиком-маркером и, необязательно, внутренним участком связывания рибосомы в комбинации с повышающими экспрессию элементами, выбранными из MAR и/или SAR.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу экспрессии представляющего интерес гена в клетке-хозяине млекопитающего, которую трансфицируют вектором экспрессии по вариантам осуществления изобретения.
Краткое описание фигур
На фигуре 1 представлена векторная диаграмма pZRCII
На фигуре 2 представлена векторная диаграмма pZRCIII
На фигуре 3 представлена векторная диаграмма pZRCIII-TNK-
Hyg
На фигуре 4 представлена векторная диаграмма pZRCIII-Darbe-Hyg
На фигуре 5 представлена векторная диаграмма pZRCIII-Etanercept-Hyg
На фигуре б представлена векторная диаграмма вектора pZRCIII-FSHa-IRES-FSHp-Hyg
На фигуре 7 представлена векторная диаграмма вектора pZRCIII-FSHp-IRES-FSHa-Hyg
На фигуре 8 представлена векторная диаграмма pZRCIII-TNK-
Puro
На фигуре 9 представлена векторная диаграмма pZRCIII-DARBE-Puro
На фигуре 10 представлена векторная диаграмма вектора pZRCIII-FSHa-IRES-FSHp-Puro
На фигуре 11 представлена векторная диаграмма вектора pZRCIII-FSHa-IRES-FSHp-Neo
На фигуре 12 представлена векторная диаграмма вектора pZRCIII-FSHp-IRES-FSHa-Neo
На фигуре 13 представлена векторная диаграмма pZRCIII-Etanercept-Neo
На фигуре 14 представлена векторная диаграмма pZRCIII-TNK-
Neo
Описание изобретения
Определение
Области прикрепления к хроматину представляют собой структурные компоненты хроматина, которые формируют топологически вынужденные петли ДНК посредством их взаимодействия с белковым ядерным матриксом.
Используемые сокращения:
CMV - Цитомегаловирус
TPL - Состоящая из трех частей лидерная последовательность Гены VA или гены VA I и II - Гены I и II вирус-связанной
РНК
BGH - Бычий гормон роста
Настоящее изобретение относится к новому вектору экспрессии, значительно увеличивающему эффективность экспрессии терапевтических белков и пептидов в клетке-хозяине млекопитающего. Новый вектор дополнительно устраняет недостаток, связанный с эффектом положения, и добавляет преимущество увеличенной транскрипции и трансляции, достигаемых с использованием уникальной комбинации регуляторных элементов.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к новому вектору экспрессии, содержащему промотор, функционально связанный с представляющим интерес геном, повышающими экспрессию элементами, TPL, генами VA I и II или их вариантами, терминатором трансляции и антибиотиком-маркером, где повышающий экспрессию элемент представляет собой область прикрепления к хроматину. Области прикрепления к хроматину выбраны из MAR и SAR.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к вектору экспрессии для получения белков и пептидов, содержащему промотор, функционально связанный с представляющим интерес геном, TPL и генами VA I и II, областями прикрепления к матриксу (MAR)/SAR, терминатором трансляции, антибиотиком-маркером.
В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение относится к новой конструкции вектора экспрессии для экспрессии терапевтических белков и пептидов, где конструкция вектора экспрессии содержит промотор, функционально связанный с участками клонирования, представляющим интерес геном, терминатором трансляции, таким как BGH, интроном, подходящим антибиотиком-маркером и необязательно внутренним участком связывания рибосомы в комбинации с повьшающими экспрессию элементами, выбранными из MAR и/или SAR.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к новой конструкции вектора экспрессии для экспрессии терапевтических белков и пептидов, где конструкция вектора экспрессии содержит промотор, функционально связанный с участками клонирования, представляющим интерес геном,
терминатором трансляции, таким как BGH, TPL, генами VA I и II, интроном, подходящим антибиотиком-маркером и необязательно внутренним участком связывания рибосомы в комбинации с повышающими экспрессию элементами, выбранными из MAR и/или SAR.
По одному из вариантов осуществления настоящего
изобретения промотор выбран из группы, состоящей из промотора
CMV, промотора SV4 0, аденовирусного промотора, промотора бета-
актина, промоторов металлотионеинов, или других
прокариотических или эукариотических вирусных промоторов. В
предпочтительном варианте осуществления используют промотор
CMV.
Как правило, промотор расположен рядом с регулируемым им геном, на той же цепи и выше по ходу транскрипции, т.е. в направлении 5'-области от смысловой цепи, и он способствует транскрипции.
По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения участки клонирования можно выбирать, но не ограничиваясь ими, из AatI, Aatll, Accll3I, Асс161, АссбЫ, Acdll, AclNI, As el, Asnl, AspllQl, Ball, BamRl, BanI, Banll, Bbel, Bbill, Bbsl, Bbul, Bbvl6II, Bell, Bcol, Bgll, Bglll, Blnl, Bshl365I, BsiEI, BsiHKAI, Bsil, BspElBspRl, BstZl, CciNI, CfrlOI, CfrMl, Cfr9I, Cfrl, CspAbI, DrdI, DsalEael, EagI, Јamll04I, Јco47III, Eco52I, Ecobll, Eco88I, Eco91I, EcoICRI, ЈcoO109I, EcoRI, ЈcoT14I, FriOI, Fsel, Fspl, Haell, Hi nil, Hindi, Hindll, Kasl, Ksp6321, Kspl, Kpnl, Lspl, Maml, Mfll, М1иШ, Mrol, МгоШ, MspAll, Nael, Narl, Ncol, Ndel, NgoAlV, Mi el, Not J, NspBII, Nspl, NspV, Pad, Pa el, PflMl, PinAl, Plel91, Pme551, Pmel, PpulOl, РриШ, PshBl, Pspl24BI, Psp5II, PspAI, PspALI, PspEI, PstI, PstNHI, Pvul, Pvull, Sad, Sadl, Seal, Sfd, Sfil, Spel, Sphl, Van911, Vnel, Xhol, Xholl, Xmal, Xmalll, Zsp21.
По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения терминатор трансляции выбран из группы, состоящей из последовательностей терминаторов трансляции бычьего гормона роста, аденовирусов и эукариотических вирусов. В предпочтительном варианте осуществления терминатор трансляции
представляет собой поли-А BGH.
В дополнительном варианте осуществления внутренние участки
связывания рибосомы выбраны из IRES пикорнафирусов, IRES
афтовирусов, IRES вируса гепатита A, IRES вируса гепатита С,
IRES пестивируса, IRES вируса энцефаломиокардита,
предпочтительно, IRES вируса энцефаломиокардита.
По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, повышающий экспрессию элемент, такой как область прикрепления к матриксу, выбран из MAR куриного лизоцима, пограничного элемента Scs дрозофилы, MAR hspSAP, Т-клеточного рецептора TCRa мыши, контролирующей локус области крысы, MAR р-глобулина и элемента SAR аполипопротеина В.
В предпочтительном варианте осуществления в 5'-
фланкирующую последовательность или 3'-фланкирующую
последовательность клонируют MAR куриного лизоцима (SEQ ID N0:5) . В наиболее предпочтительном варианте осуществления MAR куриного лизоцима клонируют и в 5'-, и 3'-фланкирующую последовательности транскрипционной конструкции.
По настоящему изобретению представляющий интерес ген
клонируют в вектор экспрессии известным в данной области
способом (SAMBROOK, J. ; FRITSCH, E.F. AND MANIATIS, Т.
Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd ed. N.Y., Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989. 1659). По одному из вариантов осуществления настоящего
изобретения представляющий интерес ген может кодировать
подходящие белки и пептиды, и их функциональные аналоги,
выбранные из тканевого активатора плазминогена, TNK-TPA,
дарбепоэтина, эритропоэтина, инсулина, GCSF, интерлейкина,
фактора некроза опухоли, интерферона, TNFR-IgGFc,
моноклональных антител, таких как ритуксимаб, бевацизумаб, адалимумаб, трастузумаб (международные непатентованные наименования) и их фрагментов, таких как Fc-область, Fab, GLP-I, GLP-II, IGF-I, IGF-II, факторов роста тромбоцитов, FVII, FVIII, FIV и FXIII, экзендина-3, экзендина-4, факторов транскрипции, таких как MYT-2, фактора репрессии NF-кВ NRF, AML1/RUNX1, белка гомеодомена Gtx, факторов трансляции, таких
как эукариотический фактор инициации 4G (elF4G)a,
эукариотический фактор инициации 4G1 (elF4Gl)a, связанного с
доменом смерти белка 5 (DAP5), онкогеноподобных c-myc, L-myc,
Pim-1, протеинкиназы p58PITSLRE, связанных с р53 гормонов,
таких как гонадотропные гормоны, выбранные из
фолликулостимулирующего гормона, хорионического гонадотропина человека, лютеинизирующего гормона человека и т.д. и белка, связывающего тяжелую цепи иммуноглобулина (BiP), белка теплового шока 70, р-субъединицы митохондриальной Н+-АТФ-синтетазы, орнитиндекарбоксилазы, коннексинов 32 и 43, HIF-la, АРС. Таким образом, функциональные аналоги означает белки или пептиды со сходной или идентичной функциональностью с их нативными белками, или пептидами.
Конструкция вектора экспрессии по изобретению содержит
экспрессирующую конструкцию, дополнительно содержащую
функционально связанный промотор, участки клонирования, представляющий интерес ген, терминатор транскрипции, интрон, подходящий антибиотик-маркер, TPL, гены VA I и II. Этот вектор экспрессии обозначен как pZRCII и описан в SEQ ID N0:4(6). В другом варианте осуществления в pZRCII дополнительно клонируют генные последовательности повышающих экспрессию элементов, таких как область прикрепления к матриксу (MAR) или SAR, предпочтительно, MAR. Этот новый вектор экспрессии обозначен как pZRCIII и описан в SEQ ID N0:6. Область прикрепления к матриксу клонируют в 5'- или 3'-фланкирующей области pZRCIII. В предпочтительном варианте осуществления области прикрепления к матриксу клонируют и в 5'-, и в 3'-фланкирующие области pZRCIII. Конструкция pZRCIII по настоящему изобретению представляет собой усовершенствование относительно вектора, известного на известном уровне техники, и значительно повышает экспрессию представляющего интерес гена, а также улучшает эффективность трансфекции. Векторная конструкция по настоящему изобретению pZRCIII подходит для экспрессии всех белков и пептидов.
Подходящий антибиотик-маркер в векторе экспрессии pZRCIII выбран из канамицина, гигромицина, пуромицина и DHFR. В другом
варианте осуществления вектор экспрессии pZRCIII необязательно несет генную последовательность DHFR и/или внутренний участок связывания рибосомы (IRES).
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к новой конструкции вектора экспрессии для экспрессии терапевтических белков и пептидов, где конструкция вектора экспрессии содержит промотор, функционально связанный с участками клонирования, представляющим интерес геном, терминатором трансляции, TPL (SEQ ID N0:2), генами VA I и II (SEQ ID N0:3), подходящим антибиотиком-маркером в комбинации с повышающими экспрессию элементами, выбранными из MAR и/или SAR.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к новой конструкции вектора экспрессии для экспрессии терапевтических белков и пептидов, где конструкция вектора экспрессии содержит промотор, функционально связанный с участками клонирования, представляющим интерес геном, терминатором транскрипции, интроном (SEQ ID N0:1), подходящим маркером и, необязательно, внутренним участком связывания рибосомы в комбинации с повышающими экспрессию элементами, выбранными из MAR и/или SAR.
Вектор экспрессии для получения желаемой экспрессии белков
и пептидов содержит подходящие элементы, но не ограничивается
включением 3 элементов, а именно, состоящей из трех частей
аденовирусной лидерной последовательности на 3'-конце
промотора, гибридного (химерного) интрона, содержащего 5'-
донорный участок аденовирусного основного позднего транскрипта
и 3'-участка сплайсинга иммуноглобулина мыши, который
располагают на 3'-конце TPL (SEQ ID N0:2), генов I и II
аденовирусной VA РНК (SEQ ID N0:3). Область прикрепления к
матриксу клонируют на 5'-фланкирующей последовательности в Mlul
или 3'-фланкирующей последовательности на конце
последовательности поли-А BGH. Ориентация области прикрепления к матриксу является необязательной. Кроме того, элемент MAR по настоящему изобретению не только синергически повышает экспрессию желаемого гена в комбинации с состоящей из трех частей лидерной последовательностью, гибридным (химерным)
интроном, TPL (SEQ ID N0:2) и генами I и II аденовирусной VA РНК (SEQ ID N0:3), но также увеличивают эффективность трансфекции и количества желаемых клонов.
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к новой конструкции вектора экспрессии для экспрессии терапевтических белков и пептидов, где конструкция вектора экспрессии содержит промотор, функционально связанный с участками клонирования, представляющим интерес геном, терминатором транскрипции, TPL (SEQ ID N0:2), генами VA I и II (SEQ ID N0:3), интроном (SEQ ID N0:1), подходящим маркером и, необязательно, внутренним участком связывания рибосомы в комбинации с повышающими экспрессию элементами, выбранными из MAR и/или SAR. В одном из вариантов осуществления вектор экспрессии содержит промотор или его вариант, функционально связанный с представляющим интерес геном, генами VA I и II, или их вариантами, TPL или его вариантом, химерным интроном или его вариантом, антибиотиком-маркером, областями прикрепления к матриксу, необязательно, внутренним участком связывания рибосомы, участком полиаденилирование бычьего гормона роста.
В одном из вариантов осуществления вектор PZRCIII-представляющий интерес ген-гигромицин содержит cLysMAR SEQ ID N0:5, функционально связанную с представляюимщи интерес геном под контролем промотора CMV, TPL, химерным интроном, представленным в SEQ ID N0:1, генами VA I и II SEQ ID N0:3, участками полиаденилирования BGH и множественного клонирования. Участки множественного клонирования включают такие участки рестрикции, как Xhol, NotI. В участок множественного клонирования можно клонировать любой представляющий интерес ген, такой как химически синтезированный ген слитого белка этанерцепта (TNFR-Fc), клонируемый в участок множественного клонирования вектора с элементом MAR лизоцима курицы выше и ниже экспрессирующей кассеты в комбинации с другими регуляторными элементами, такими как промотор CMV, TPL, химерный интрон в экспрессирующей кассете и гены VA, помещаемые вне экспрессирующей кассеты. Вектор содержит ген устойчивости к
гигромицину для отбора трансфектантов. В качестве примера векторной конструкции, получаемой по этому аспекту настоящего изобретения, в соответствии с будапештским договором и с номером доступа МТСС 5656 депонирован вектор pZRCIII-этанерцепт-гигромицин.
В другом варианте осуществления вектор PZRCIII-представляющий интерес ген-неомицин содержит C-Lys-MAR SEQ ID N0:5, функционально связанную с промотором CMV, TPL, химерным интроном A SEQ ID N0:1, генами VA I и II, представленными в SEQ ID N0:3, участками полиаденилирования BGH и множественного клонирования. Участок множественного клонирования содержит такие участки рестрикции как Xhol, NotI. В участок множественного клонирования можно клонировать любой представляющий интерес ген, такой как химически синтезированный ген слитого белка этанерцепта (TNFR-Fc), клонируемый в участок множественного клонирования вектора с элементом MAR лизоцима курицы выше и ниже экспрессирующей кассеты в комбинации с другими регуляторными элементами, такими как промотор CMV, TPL, химерный интрон в экспрессирующей кассете и гены VA, помещаемые вне экспрессирующей кассеты. Вектор содержит ген устойчивости к гигромицину (неомицину) для отбора трансфектантов.
В качестве примера векторной конструкции, получаемой по этому аспекту настоящего изобретения, в соответствии с будапештским договором и с номером доступа МТСС 5657 депонирован вектор pZRCII1-этанерцепт-неомицин.
В другом варианте осуществления вектор PZRCIII-
представляющий интерес reH-IRES-гигромицин содержит cLysMAR SEQ
ID N0:5, функционально связанную с промотором CMV, TPL,
химерным интроном, представленным в SEQ ID N0:1, генами VA I и
II SEQ ID N0:3, участками полиаденилирования BGH и
множественного клонирования. Участки множественного
клонирования содержат такие участки рестрикции как Xhol, NotI. В участок множественного клонирования можно клонировать любой представляющий интерес ген, такой как химически синтезированные гены субъединиц FSH а и FSH р, клонируемые в участок множественного клонирования вектора, и обе субъединицы FSH а и
FSH p функционально связаны друг с другом посредством IRES с элементом MAR лизоцима курицы выше и ниже экспрессирующей кассеты в комбинации с другими регуляторными элементами, такими как промотор CMV, TPL, химерный интрон в экспрессирующей кассете и гены VA, помещаемые вне экспрессирующей кассеты. Вектор содержит ген устойчивости к гигромицину для отбора трансфектантов. В качестве примера векторной конструкции, получаемой по этому аспекту настоящего изобретения, в соответствии с будапештским договором и с номером доступа МТСС 5655 депонирован вектор pZRCIII FSH a-IRES-FSH р-гигромицин.
В одном из вариантов осуществления вектор экспрессии трансфицируют в клетку-хозяина млекопитающего известными специалисту способами. Клетку-хозяина млекопитающего можно выбирать из линии клеток СНО (яичника китайского хомяка), линии клеток ВНК (почки детеныша хомяка) и т.п., которые хорошо известны в отношении коммерческого получения белков. В другом варианте осуществления для дополнительного повышения экспрессии представляющего интерес гена трансфицированную клетку-хозяина дополнительно трансфицируют другим вектором, содержащим подходящие антибиотики, выбранные из канамицина, гигромицина, пуромицина.
В одном из вариантов осуществления линия трансфицированных клеток представляет собой СНО К1, которую выбирают посредством использования гигромицина, пуромицина, канамицина, G418 или других антибиотиков.
Кроме того, если вектор экспрессии несет гены DHFR, линии трансфицированных клеток отбирают посредством использования селекционной среды для DHFR, например, с метотрексатом. Этот отбор основан на постепенном увеличении селекционного давления на линию трансфицированных клеток. (Kaufman and Sharp, 1982; Schimke et al., 1982).
В еще одном варианте осуществления линии трансфицированных клеток выбраны в селекционной среде для глутаминсинтетазы (GS), например, с метионинсульфоксимином (MSX), так как вектор экспрессии несет гены глутаминсинтетазы.
Таким образом, настоящее изобретение относится к новому
вектору экспрессии, содержащему уникальную комбинацию регуляторных элементов, значительно увеличивающему транскрипцию и трансляцию, а также подавляющему эффекты положения интеграции гена, таким образом, обеспечивая синергическое действие для стабильной высокой экспрессии рекомбинантного белка. Кроме того, оно относится к получению терапевтических белков и пептидов, моноклональных антител в промышленном масштабе с минимальными затратами времени вследствие существенного снижения в присутствие типовых элементов необходимости в трудоемком скрининге большого количества клонов. Кроме того вектор экспрессии по настоящему изобретению можно использовать для транзиторной, а также для стабильной экспрессии.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством примеров. Примеры приведены только с целью иллюстрации, и настоящее изобретение не ограничивается только ими.
Пример 1. Конструирование вектора pZRCIII
Полную транскрипционную конструкцию со всеми регуляторными элементами, а именно TPL, VA, промотором CMV, химерным интроном и участками полиаденилирования и терминации последовательности BGH, описанную в поданной ранее патентной заявке WO2007017903 авторов настоящего заявления, химически синтезировали в GeneART, Германия. Эту полную конструкцию, клонированную в клонирующий вектор рМК (GeneART, Германия), назвали pZRCII (фигура 1, SEQ ID N0:4). Химически синтезировали фрагмент ДНК MAR лизоцима курицы (SEQ ID N0:5), (Phi-Van, L. and Stratling, W.H, Biochemistry 35 (33), 10735-10742 (1996)) и клонировали в клонирующий вектор. Два фрагмента MAR лизоцима курицы встраивали в вектор pZRCII в области, фланкирующие любую из сторон экспрессирующей кассеты с использованием участков SacI и Mlul, которые уже предварительно встроены в вектор. Липкий конец SacI добавляли во фрагмент MAR лизоцима курицы посредством ПЦР с использованием праймеров, содержащих участок SacI. Конкретно проводили 4 0 циклов амплификации ПЦР с использованием 100 пикомоль геноспецифических олигонуклеотидных праймеров в объеме 50 мкл, содержащем 50 мМ Tris-Cl (рН8,3),
2,5 мМ МдС1г, 250 мкМ каждого из 4 dNTP и 5 единиц полимеразы Pfu. Каждый цикл амплификации ПЦР состоял из инкубации при 95°С в течение 30 сек (денатурация), 62°С в течение 30 сек (отжиг) и 72°С в течение 2 мин (достройка). Продукт амплификации в реакции ПЦР разделяли на 1% агарозном геле. Желаемый фрагмент размером приблизительно 16 64 пар оснований вырезали из геля и очищали с использованием набора для выделения из геля Qiagen. Этот очищенный фрагмент ДНК лигировали в вектор pZRCII после рестрикционного расщепления вектора и очищенного продукта ПЦР посредством SacI (MBI Fermentas, USA). Продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и полученные трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмиду ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие фрагмента MAR лизоцима курицы посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид, где выявлено наличие корректной интеграции в вектор pZRCII, называли промежуточным вектором pZRCII 1MAR (Sac).
Для добавления липких концов Mlul в другой фрагмент MAR лизоцима курицы его подвергали 4 0 циклам амплификации ПЦР с использованием 100 пикомоль геноспецифических олигонуклеотидных праймеров в объеме 50 мкл, содержащем 50 мМ Tris-Cl (рН8,3), 2,5 мМ МдС1г, 250 мкМ каждого из 4 dNTP и 5 единиц полимеразы Pfu. Каждый цикл амплификации ПЦР состоял из инкубации при 95°С в течение 30 сек (денатурация), 60°С в течение 30 сек (отжиг) и 72°С в течение 2 мин (достройка). Продукт амплификации реакции ПЦР разделяли на 1% агарозном геле. Желаемый фрагмент размером приблизительно 1650 пар оснований вырезали из геля и очищали с использованием набора для выделения из геля Qiagen. Этот очищенный фрагмент ДНК лигировали в вектор pZRCII-lMAR(Sac) после рестрикционного расщепления вектора и очищенного продукта ПЦР Mlul (MBI Fermentas, USA). Продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную приблизительно из 10 таких колоний, анализировали на присутствие фрагмента MAR лизоцима курицы в положении Mlul
посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид, где выявлено наличие корректной интеграции cLysMAR по участку Mlul в вектор pZRCII-lMAR(Sac), назвали pZRCIII (фигура 2, SEQ ID N0:6) .
Пример 2. Конструирование вектора pZRCIII-TNK
Ген тенектеплазы (ТЫКазы или TNK-TPA) (SEQ ID N0:7) химически синтезировали и клонировали в клонирующий вектор рМК (Geneart, Германия). Для клонирования гена TNK в вектор pZRCII, сначала в ген TNK встраивали липкие концы EcoRI и NotI с использованием 4 0 циклов амплификации ПЦР с использованием 100 пикомоль специфических олигонуклеотидных праймеров, содержащих указанные выше участки рестрикции, в объеме 50 мкл, содержащем 50 мМ Tris-Cl (рН8,3), 2,5 мМ МдС12, 250 мкМ каждого из 4 dNTP и 5 единиц полимеразы Pfu. Каждый цикл амплификации ПЦР состоял из инкубации при 95°С в течение 30 сек (денатурация), 60°С в течение 45 сек (отжиг) и 72° С в течение 2 мин (достройка) . Продукт амплификации в реакции ПЦР разделяли на 1% агарозном геле. Желаемый фрагмент размером приблизительно 1710 пар оснований вырезали из геля и очищали с использованием набора для выделения из геля Qiagen. Этот очищенный фрагмент ДНК TNK расщепляли EcoRI и NotI и лигировали в вектор pZRCIII (описанный в примере 1), расщепленный EcoRI и NotI (MBI Fermentas, USA) . Продукт лигирования трансформировали в Тор 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную приблизительно из 10 таких колоний, анализировали на присутствие фрагмента TNK посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид, содержащую ген TNK, интегрированный в вектор pZRCIII назвали pZRCIII-TNK.
Пример 3. Конструирование вектора pZRCIII-TNK-Hyg В транскрипционной конструкции с гигромицином размером приблизительно 1550 пар оснований и содержащей ген устойчивости к гигромицину под контролем промотора и терминатора SV4 0 получали тупые концы с использованием полимеразы Pfu (MBI
Fermentas, USA), а затем лигировали в вектор pZRCIII-TNK, который предварительно расщепляли Kpnl (MBI Fermentas, USA) и получали тупые концы с использованием полимеразы Pfu. Продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие гена устойчивости к гигромицину посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с транскрипционной конструкцией с гигромицином, интегрированной в вектор pZRCIII-TNK, назвали вектором pZRCIII-TNK-Hyg (фигура 3, SEQ ID N0:8). Затем этот вектор подвергали секвенированию ДНК с использованием автоматического секвенатора ДНК (ABI) для подтверждения последовательности клонированного гена TNK. Пример 4. Конструирование вектора pZRCIII-Darbe-Hyg В качестве матрицы для проведения сайт-специфического мутагенеза гена эритропоэтина использовали pZRC-EPO (WO2007017903) с получением генного фрагмента дарбепоэтина (SEQ ID N0:9 и соответствующая последовательность ДНК ID 21) длиной приблизительно 600 п.н., которую затем клонировали в вектор ТА pTZ57R (MBI Fermentas) и назвали pTZ57R-Darbe.
pZRCIII-TNK-Hyg расщепляли Xhol и NotI с удалением гена TNK, а оставшуюся высокомолекулярную ДНК использовали в качестве вектора для лигирования со вставкой гена дарбепоэтина. pTZ57R-Darbe расщепляли Xhol и NotI с выделением на геле генного фрагмента дарбепоэтина приблизительно 600 п.н. Проводили лигирование вектора и вставки, и продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие гена дарбепоэтина посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированным геном дарбепоэтина назвали вектором pZRCIII-Darbe-Hyg (фигура 4, SEQ ID N0:10). Затем этот вектор подвергали секвенированию ДНК с использованием автоматического секвенатора ДНК (ABI) для
подтверждения последовательности клонированного гена
дарбепоэтина.
Пример 5. Конструирование вектора pZRCIII-Etanercept-Hyg
Вектор pZRCIII-Darbe-Hyg расщепляли ферментами Xhol и NotI (MBI Fermentas) с удалением гена дарбепоэтина длиной приблизительно 600 п.н. и получением каркаса вектора приблизительно 94 3 0 п.н. Химически синтезирований ген этанерцепта с кодонами, оптимизированными для СНО (SEQ ID N0:11 и соответствующая последовательность ДНК ID 22), длиной приблизительно 14 81 п.н. выделяли из клонирующего вектора с использованием Xhol и NotI (MBI Fermentas) с получением вставки. Проводили лигирование вектора и вставки, и продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli, и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие гена этанерцепта посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированным геном этанерцепта назвали вектором pZRCIII-Etanercept-Hyg (фигура 5, SEQ ID N0:12). Затем этот вектор подвергали секвенированию ДНК с использованием автоматического секвенатора ДНК (ABI) для подтверждения последовательности клонированного гена этанерцепта.
Пример 6. Конструирование вектора pZRCIII-FSH a-IRES-FSH
P-Hyg
а) Конструирование вектора pZRCIII-FSH a-Hyg Получали каркас вектора длиной приблизительно 94 3 0 п.н. посредством расщепления вектора pZRCIII-Darbe-Hyg Xhol и NotI (MBI Fermentas) с удалением приблизительно 600 п.н. гена дарбепоэтина. Из клонирующего вектор рМА Geneart с использованием ферментов Xhol и NotI (MBI Fermentas) выделяли химически синтезированный ген альфа субъединицы FSH (SEQ ID N0:13 соответствующая последовательность ДНК ID 23) приблизительно 359 п.н. Проводили лигирование вектора и вставки и продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину.
Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие гена альфа субъединицы FSH посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированным геном альфа субъединицы FSH назвали вектором pZRCIII-FSH a-Hyg.
b) Конструирование вектора pZRCIII-FSH a-IRES-FSH ft-Hyg Вектор pZRCIII-FSH a-Hyg расщепляли NotI (MBI Fermentas) с получением каркаса вектора длиной приблизительно 97 90 п.н. Из вектора pIRES Нуд с использованием ферментов NotI и Xmal (MBI Fermentas) выделяли генный фрагмент IRES длиной приблизительно 591 п.н. (SEQ ID N0:14) с получением первой вставки. Из клонирующего вектора рМА Geneart с использованием ферментов Xmal и NotI (MBI Fermentas) выделяли химически синтезированный ген бета субъединицы FSH (SEQ ID N0:15 соответствующая последовательность ДНК ID 24) длиной приблизительно 401 п.н. с получением второй вставки. 2 вставки сливали и слитый генный продукт лигировали с указанным выше вектором. Затем продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие генов IRES и бета субъединицы FSH посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированными генами IRES и бета субъединицы FSH назвали вектором pZRCIII-FSH a-IRES-FSH (З-Hyg (фигура 6, SEQ ID N0:16). Затем этот вектор подвергали секвенированию ДНК с использованием автоматического секвенатора ДНК (ABI) для подтверждения последовательностей клонированных генов FSH а и FSH р. Последовательности клонированных генов подтверждали посредством использования автоматического секвенатора ДНК (ABI) .
Пример 7. Конструирование вектора pZRCIII-FSH (3-IRES-FSH
a-Hyg
а) Конструирование вектора pZRCIII-FSH ft-Hyg
Вектор pZRCIII-FSH a-IRES-FSH p-Hyg расщепляли Xhol и NotI
(MBI Fermentas) с получением после удаления генов FSH a, IRES и FSH р каркаса вектора длиной приблизительно 9430 п.н. Из клонирующего вектора рМА Geneart с использованием ферментов Xhol и NotI (MBI Fermentas) выделяли химически синтезированный ген бета субъединицы FSH длиной приблизительно 4 01 п.н. Проводили лигирование вектора и вставки, и продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli, и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие гена бета субъединицы FSH посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированным геном бета субъединицы FSH назвали вектором pZRCIII-FSH P-Hyg.
Ь) Конструирование вектора pZRCIII-FSH ft-IRES-FSH g-Hyg Вектор pZRCIII-FSH p-Hyg расщепляли NotI (MBI Fermentas) с получением каркаса вектора длиной приблизительно 97 90 п.н. Из вектора pIRES Нуд с использованием ферментов NotI и Xhol (MBI Fermentas) выделяли генный фрагмент IRES длиной приблизительно 591 п.н. с получением первой вставки (IRES). Из клонирующего вектора рМА Geneart с использованием ферментов Xhol и NotI (MBI Fermentas) выделяли химически синтезированный ген альфа субъединицы FSH длиной приблизительно 359 п.н. с получением второй вставки. Затем проводили лигирование трех частей, вектора и 2 вставок. Затем продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие генов IRES и альфа субъединицы FSH посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированными генами IRES и альфа субъединицей FSH назвали вектор pZRCIII-FSH (3-IRES-FSH a-Hyg. (фигура 7) . Последовательности клонированных генов подтверждали посредством использования автоматического секвенатора ДНК (ABI).
Пример 10. Конструирование вектора pZRCIII-TNK-Puromycin
Транскрипционную конструкцию пуромицина длиной
приблизительно 1110 пар оснований, содержащую ген устойчивости к пуромицину под контролем промотора и терминатора SV4 0 и несущую совместимые с ВатЕ! концы лигировали в вектор pZRCIII-TNK, который также расщепляли BamEI (MBI Fermentas, USA). Продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие фрагмента пуромицина посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид, содержащую транскрипционную конструкцию пуромицина, интегрированную в вектор pZRCIII-TNK назвали вектором pZRCIII-TNK-Puro (фигура 8, SEQ ID N0:17). Последовательность клонированного гена TNK подтверждали посредством использования автоматического секвенатора ДНК (ABI).
Пример 11. Конструирование вектора pZRCIII-Darbepoetin-
Puro
pZRCIII-TNK-Puro расщепляли Xhol и NotI (MBI Fermentas) с
удалением фрагмента гена TNK. pTZ57R-Darbe расщепляли Xhol и
NotI с выделением на геле фрагмент гена дарбепоэтина длиной
приблизительно 600 п.н. Проводили лигирование вектора и
вставки. Продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е.
coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к
канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких
колоний, анализировали на присутствие фрагмента гена
дарбепоэтина посредством рестрикционного расщепления с
использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из
таких плазмид с интегрированным геном дарбепоэтина назвали
вектором pZRCIII-Darbe-Puro (фигура 9, SEQ ID N0:18).
Последовательность клонированного гена дарбепоэтина
подтверждали посредством использования автоматического секвенатора ДНК (ABI).
Пример 12. Конструирование вектора pZRCIII-FSH a-IRES-FSH p-Puro
Удаляли кассету гигромицина из вектора pZRCIII-FSH a-IRES-
FSH p-Hyg и заменяли транскрипционной конструкцией пуромицина длиной приблизительно 1110 пар оснований, содержащей ген устойчивости к пуромицину под контролем промотора и терминатора SV40, амплифицируемый из pZRCIII-Darbe-Puro с использованием реакции ПЦР со специфическими олигонуклеотидными праймерами. Полученный продукт ПЦР расщепляли с использованием специфических эндонуклеаз и использовали для дальнейшего лигирования с каркасом вектора. Продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие гена устойчивости к пуромицину посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированным геном устойчивости к пуромицину назвали вектором pZRCIII-FSH a-IRES-FSH p-Puro (фигура 10).
Пример 13. Конструирование вектора pZRCIII-FSH a-IRES-FSH
p-Neo
Вектор pZRCIII-FSH a-IRES-FSH (3-Puro расщепляли Рас! и BamEI (MBI Fermentas) с получением после удаления гена устойчивости к пуромицину каркаса вектора длиной приблизительно 998 0 п.н. Из плазмиды pcDNA 3.1 (Invitrogen) выделяли ген устойчивости к неомицину длиной приблизительно 1518 п.н. Проводили лигирование вектора и вставки, и продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli, и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие гена устойчивости к неомицину посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированным геном субъединицы устойчивости к неомицину назвали вектором pZRCIII-FSH a-IRES-FSH p-Neo (фигура 11). Последовательность генов FSH a, IRES и FSH р подтверждали посредством использования автоматического секвенатора ДНК (ABI) .
Пример 14. Конструирование вектора pZRCIII-FSH p-IRES-FSH
a-Neo
a) Конструирование вектора pZRCIII-FSH ft-Neo
Вектор pZRCIII-FSH a-IRES-FSH (3-Neo расщепляли Xhol и NotI (MBI Fermentas) с получением после удаления генов FSH a, IRES и FSH р каркаса вектора длиной приблизительно 9400 п.н. Из клонирующего вектора рМА Geneart с использованием ферментов Xhol и NotI (MBI Fermentas) выделяли химически синтезированный ген бета субъединицы FSH длиной приблизительно 4 01 п.н. Проводили лигирование вектора и вставки, и продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli, и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие гена бета субъединицы FSH посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированным геном бета субъединица FSH назвали вектором pZRCIII-FSH p-Neo.
b) Конструирование вектора pZRCIII-FSH p-IRES-FSH a-Neo Вектор pZRCIII-FSH p-Neo расщепляли NotI (MBI Fermentas) с
получением каркаса вектора длиной приблизительно 9800 п.н. Из вектора pIRES Нуд с использованием ферментов NotI и Xhol (MBI Fermentas) выделяли фрагмент ДНК IRES длиной приблизительно 591 п.н. с получением первой вставки. Из вектора рМА Geneart с использованием ферментов Xhol и NotI (MBI Fermentas) выделяли химически синтезированный ген альфа субъединицы FSH длиной приблизительно 359 п.н. с получением второй вставки. Затем проводили лигирование трех частей, вектора и 2 вставок. Затем продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие генов IRES и альфа субъединицы FSH посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированными генами IRES и альфа субъединицы FSH назвали вектором pZRCIII FSH p-IRES-FSH a-Neo (фигура 12) . Последовательности клонированных генов подтверждали посредством
использования автоматического секвенатора ДНК (ABI).
Пример 17. Конструирование вектора pZRCIII-Etanercept-Neo
Вектор pZRCIII-FSH a-IRES-FSH p-Neo расщепляли ферментами
Xhol и NotI (MBI Fermentas) с удалением генов FSH a, IRES и FSH
р, и получением каркаса вектора длиной приблизительно 94 0 0 п.н.
для использования в клонировании гена ген этанерцепта. Из
вектора pZRCIII-Etanercept-Hyg с использованием ферментов Xhol
и NotI (MBI Fermentas) выделяли ген этанерцепта длиной
приблизительно 14 81 п.н. с получением вставки. Проводили
лигирование вектора и вставки, и продукт лигирования
трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали
на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК,
выделенную приблизительно из нескольких колоний, анализировали
на присутствие гена этанерцепта посредством рестрикционного
расщепления с использованием различных рестрикционных
ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированным геном
этанерцепта назвали вектором pZRCIII-Etanercept-Neo (фигура 13,
SEQ ID N0:19). Последовательность клонированного гена
этанерцепта подтверждали посредством использования
автоматического секвенатора ДНК (ABI).
Пример 18. Конструирование вектора pZRCIII-TNK-Neo Вектор pZRCIII-Etanercept-Neo расщепляли ферментами Xhol и NotI (MBI Fermentas) с удалением гена этанерцепта длиной приблизительно 14 81 п.н. и получением векторной конструкции длиной приблизительно 94 0 0 п.н. После расщепления вектора pZRCIII-TNK-Hyg ферментами Xhol и NotI (MBI Fermentas) получали вставку гена TNK длиной приблизительно 1692 п.н. Проводили лигирование вектора и вставки и продукт лигирования трансформировали в Top 10F' Е. coli и трансформанты оценивали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделенную из нескольких таких колоний, анализировали на присутствие гена TNK посредством рестрикционного расщепления с использованием различных рестрикционных ферментов. Одну из таких плазмид с интегрированным геном TNK назвали вектором pZRCIII-TNK-Neo (фигура 14). Последовательность клонированного гена TNK подтверждали посредством использования автоматического
секвенатора ДНК (ABI).
Пример 19. Экспрессия этанерцепта
Серия I - Стабильная трансфекция в линии клеток CHO-K1-S с использованием вектора pZRCIII-Etanercept-Hyg
Клетки CH0-K1-S Freestyle(tm) стандартным образом культивировали в среде PowerCH02 CD (среда с определенным химическим составом, Lonza), дополненной 4 мМ глутамином. Клетки поддерживали в условиях перемешивания (120 об./мин.) при 37°С и 5% СОг в увлажненном инкубаторе. Клетки каждые 3/4 суток подсчитывали и проводили полную замену среды. Трансфекцию проводили с использованием системы Neon Transfection
(Invitrogen). За одни сутки перед трансфекцией клетки CHO-KI-S пересевали в свежую среду и перед использованием для трансфекции обеспечивали по меньшей мере одно удвоение. Трансфекцию проводили с использованием линеаризованной посредством Sgsl (AscI) плазмиды pZRC III-Etanercept-Hyg в соответствии со стандартными протоколами, описанными производителем (Invitrogen). После трансфекции, клетки переносили в одну лунку 24-луночного планшета, содержащую 1 мл предварительно нагретой среда для культивирования. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СОг в увлажненном инкубаторе. На следующие сутки, для получения минипула, трансфицированную популяцию высевали в 9б-луночные планшеты в среде Pro СНО 5
(Lonza), дополненной 4 мМ глутамином и 600 мкг/мл гигромицина. Через 15-30 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие минипулы переносили в 24-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином и 600 мкг/мл гигромицина, и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Отбирали высокоэкспрессирующие минипулы для проведения лимитирующего разведения до одиночных клеток в 9б-луночных планшетах в среде Pro СНО 5 (Lonza), дополненной с добавлением 4 мМ глутамином и 600 мкг/мл гигромицина. Приблизительно через 15-30 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов отбирали для
анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие клоны переносили в 24-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином и 600 мкг/мл гигромицина, и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Высокоэффективные клоны отбирали для повторной трансфекции.
Серия II - Стабильная повторная трансфекция клонов, получаемых в серии I, с использованием вектора pZRCIII-Е tanercept-Neo
Отбирали высокоэкспрессирующие клоны для проведения
повторной трансфекции с использованием плазмиды pZRC III-
Etanercept-Neo, линеаризованной Sgsl (Acsl), таким же спосбом,
как при трансфекции в серии I. На следующие сутки, для
получения минипула, трансфицированную популяцию высевали в 9 6-
луночные планшеты в среду Pro СНО 5 (Lonza), дополненную 4 мМ
глутамином, 600 мкг/мл гигромицина и 500 мкг/мл неомицина.
Через 15-30 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов
отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA.
Затем отобранные высокоэкспрессирующие минипулы переносили в
24-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет в среду
PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza),
дополненную 4 мМ глутамином и с указанным давлением
антибиотиков, и на каждом уровне анализировали уровни
экспрессии посредством ELISA. Отбирали высокоэффективные
минипулы для проведения лимитирующего разведения до одиночных
клеток в 9 6-луночных планшетах в среде Pro СНО 5 (Lonza),
дополненной 4 мМ глутамином. Снова через 15-30 суток отбирали
супернатанты из 9б-луночных планшетов для анализа образования
продукта посредством ELISA. Затем отобранные
высокоэкспрессирующие клоны переносили в 24-луночный планшет, а
затем в б-луночный планшет в среду PowerCH02 CD (среду с
определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ
глутамином, и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии
посредством ELISA. Повторно трансфицированные
высокоэкспрессирующие клоны отбирали для анализа образования
продукта в перемешиваемых пробирках в режиме с подпиткой. Эти эксперименты проводили с использованием этих выбранных клонов в центрифужных пробирках на шейкере (Kuhner-Germany) при 12 0 об./мин., 37°С, 5% СОг • Через 12 суток клоны обеспечивали выход продукции в диапазоне приблизительно от 7 00 мг/л до 1000 мг/л. Пример 20. Экспрессия TNK
Серия I - Стабильная трансфекция в линии клеток CHO-K1-S с использованием вектора pZRCIII-TNK-Hyg
Клетки CH0-K1-S Freestyle(tm) стандартным образом культивировали в среде PowerCH02 CD (среде с определенным химическим составом, Lonza), дополненной 4 мМ глутамином. Клетки поддерживали в условиях перемешивания (120 об./мин.) при 37°С и 5% СОг в увлажненном инкубаторе. Клетки каждые 3/4 суток подсчитывали и проводили полную замену среды. Трансфекцию проводили с использованием системы Neon Transfection
(Invitrogen). За сутки до трансфекции клетки CHO-KI-S пересевали в свежую среду и перед использованием для трансфекции обеспечивали по меньшей мере одно удвоение. Трансфекцию проводили с использованием линеаризованной Sgsl
(AscI) плазмиды pZRC III-TNK-Hyg в соответствии со стандартными протоколами, описанными производителем (Invitrogen). После трансфекции клетки переносили в одну лунку 24-луночного планшета, содержащую 1 мл предварительно нагретой среды для культивирования. Клетки поддерживали при 37°С, 5% С02 в увлажненном инкубаторе. На следующие сутки, для получения минипула, трансфицированную популяцию высевали в 9б-луночные планшеты в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином и 500 мкг/мл гигромицина. Через 15-30 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие минипулы переносили в 24-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Отбирали высокоэкспрессирующие минипулы для проведения лимитирующего разведения до одиночных клеток в 9б-луночном планшете в среде PowerCH02 CD (среде с определенным химическим
составом, Lonza), дополненной 4 мМ глутамином и 500 мкг/мл гигромицина. Приблизительно через 15-30 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие клоны переносили в 24-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Высокоэффективные клоны отбирали для повторных трансфекций. Высокоэкспрессирующие клоны отбирали для анализа образования продукта в перемешиваемых пробирках в режиме с подпиткой. Эти эксперименты проводили с использованием этих выбранных клонов в 10 мл среды в центрифужных пробирках на шейкере (Kuhner-Germany) при 230 об. /мин., 37°С, 5% СОг. Через 9 суток клон обеспечивал уровни продукции 150 мг/л.
Серия На - Повторная стабильная трансфекция клонов, полученных в серии I, с использованием вектора pZRCIII-TNK-Puro
Высокоэкспрессирующие клоны отбирали для проведения повторных трансфекций с использованием плазмиды pZRC III-TNK-Puro, линеаризованной Sgsl (Acsl) таким же способом, как при трансфекции в серии I. На следующие сутки, для получения минипула, трансфицированную популяцию высевали в 9б-луночные планшеты в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином, 500 мкг/мл гигромицина и 3 мкг/мл пуромицина. Через 15-30 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие минипулы переносили в 2 4-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Отбирали высокоэффективные минипулы для проведения лимитирующего разведения до одиночных клеток в 9б-луночных планшетах в среде PowerCH02 CD (среде с определенным химическим составом, Lonza), дополненной 4 мМ глутамином. Снова через 15-20 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие клоны переносили в 2 4-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет и анализировали уровни экспрессии на
каждом уровне ELISA. Высокоэкспрессирующие клоны отбирали для анализа образования продукта в перемешиваемых пробирках в режиме с подпиткой. Эти эксперименты проводили с использованием этих выбранных клонов в центрифужных пробирках на шейкере (Kuhner-Germany) при 120 об./мин., 37°С, 5% СОг. Через 11 суток клоны обеспечивали уровни продукции 2 90 мг/л.
Серия lib - Повторная стабильная трансфекция клонов, полученных в серии I, с использованием вектора pZRCIII-TNK-Neo
Высокоэкспрессирующие клоны отбирали для проведения повторных трансфекций с использованием плазмиды pZRCIII-TNK-Neo, линеаризованной Sgsl (Acsl), таким же способом, как при трансфекции в серии I. На следующие сутки, для получения минипула, трансфицированную популяцию высевали в 9б-луночные планшеты в среде Pro СНО 5 (Lonza), дополненной 4 мМ глутамином, 600 мкг/мл гигромицина и 500 мкг/мл неомицина. Через 15-30 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие минипулы переносили в 2 4-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином и с указанным давлением антибиотиков, и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Отбирали высокоэффективные минипулы для проведения лимитирующего разведения до одиночных клеток в 9 6-луночных планшетах в среде Pro СНО 5 (Lonza), дополненной 4 мМ глутамином. Снова через 15-30 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие клоны переносили в 2 4-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином, и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Высокоэкспрессирующие клоны отбирали для анализа образования продукта в перемешиваемых пробирках в режиме с подпиткой. Эти эксперименты проводили с использованием этих выбранных клонов в центрифужных пробирках на шейкере
(Kuhner-Germany) при 120 об./мин., 37°С, 5% СОг. Через 10 суток клон обеспечивал уровни продукции 390 мг/л.
Пример 21. Экспрессия дарбепоэтина с использованием вектора pZRCIII-Darbe-Hyg
Серия I - Стабильная трансфекция в линии клеток CHO-K1-S с использованием вектора pZRCIII-Darbe-Hyg
Клетки CH0-K1-S Freestyle(tm) стандартным образом культивировали в среде PowerCH02 CD (среде с определенным химическим составом, Lonza), дополненной 4 мМ глутамином. Клетки поддерживали в условиях перемешивания (120 об./мин.) при 37°С и 5% СОг в увлажненном инкубаторе. Каждые 3/4 суток клетки подсчитывали и проводили полную замену среды. Трансфекцию проводили с использованием системы Neon Transfection
(Invitrogen). За сутки до трансфекции клетки CHO-KI-S пересевали в свежую среду и перед использованием для трансфекции обеспечивали по меньшей мере одно удвоение. Трансфекцию проводили с использованием линеаризованной Sgsl
(AscI) плазмиды pZRCIII-Darbe-Hyg в соответствии со
стандартными протоколами, описанными производителем
(Invitrogen). После трансфекции ДНК клетки переносили в одну лунку 24-луночного планшета, содержащую 1 мл предварительно нагретой среды для культивирования. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СОг в увлажненном инкубаторе. На следующие сутки, для получения минипула, трансфицированную популяцию высевали в 9 6-луночные планшеты в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином и 600 мкг/мл гигромицина. Через 15-20 суток супернатанты из 96-луночного планшета отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие минипулы переносили в 2 4-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Два высокоэкспрессирующих минипула отбирали для проведения лимитирующего разведения до одиночных клеток в 9б-луночных планшетах в среде ProCH05 (Lonza) с добавлением 4 мМ глутамина и 600 мкг/мл гигромицина. Снова через 15-30 суток супернатанты из 9б-луночных планшетов отбирали для анализа
образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие клоны переносили в 2 4-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Высокоэкспрессирующие клоны отбирали для анализа образования продукта в перемешиваемых пробирках в режиме с подпиткой. Эти эксперименты проводили с использованием этих выбранных клонов в 10 мл среды в центрифужных пробирках на шейкере (Kuhner-Germany) при 230 об./мин., 37°С, 5% СОг • Через 11 суток клон обеспечивал уровни продукции 34 0 мг/л.
Пример 22. Экспрессия FSH
Серия I - Стабильная трансфекция в линии клеток CHO-K1-S с использованием вектора pZRCIII-FSH a-IRES-FSH /5-Нуд
Клетки CHO-K1-S Freestyle(tm) стандартным образом культивировали в среде PowerCH02 CD (среде с определенным химическим составом, Lonza), дополненной 4 мМ глутамином. Клетки поддерживали в условиях перемешивания (120 об./мин.) при 37°С и 5% СОг в увлажненном инкубаторе. Каждые 3/4 суток клетки подсчитывали и проводили полную замену среды. Трансфекцию проводили с использованием системы Neon Transfection
(Invitrogen). За сутки до трансфекции клетки CHO-KI-S
пересевали в свежую среду и перед использованием для
трансфекции обеспечивали по меньшей мере одно удвоение.
Трансфекцию проводили, используя линеаризованную Sgsl (AscI)
плазмиду pZRCIII-FSH a-IRES-FSH p-Hyg в соответствии со
стандартными протоколами, описанными производителем
(Invitrogen). После трансфекции, клетки переносили в одну лунку 24-луночного планшета, содержащую 1 мл предварительно нагретой среды для культивирования. Клетки поддерживали при 37°С, 5% СОг в увлажненном инкубаторе. На следующие сутки, для получения минипула, трансфицированную популяцию высевали в 9б-луночные планшеты в среде Pro СНО 5 (Lonza), дополненной 4 мМ глутамином и 600 мкг/мл гигромицина. Через 15-30 суток супернатанты из 96-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие минипулы переносили в 2 4-луночный планшет, а затем в б-луночный
планшет в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином и с указанным давлением антибиотиков, и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Отбирали высокоэкспрессирующие минипулы для проведения лимитирующего разведения до одиночных клеток в 9 6-луночных планшетах в среде Pro СНО 5 (Lonza), дополненной 4 мМ глутамином и 600 мкг/мл гигромицина. Приблизительно через 15-30 суток супернатанты из 96-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие клоны переносили в 2 4-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином и с указанным давлением антибиотиков, и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Высокоэффективные клоны отбирали для повторной трансфекции.
Серия II - Повторная стабильная трансфекция клонов, полученных в серии I, с использованием вектора pZRCIII -FSH a-IRES-FSH p-Neo
Отбирали клоны для проведения повторных трансфекций с использованием плазмиды pZRCIII-FSH a-IRES-FSH p-Neo,
линеаризованной Sgsl (Acsl), таким же способом, как трансфекции в серии I. На следующие сутки, для получения минипула, трансфицированную популяцию высевали в 9б-луночные планшеты в среду Pro СНО 5 (Lonza) , дополненную 4 мМ глутамином, 600 мкг/мл гигромицина и 500 мкг/мл неомицина. Через 15-30 суток супернатанты из 9 6-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие минипулы переносили в 2 4-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином и с указанным давлением антибиотиков, и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Отбирали повторно трансфицированные высокоэффективные минипулы для проведения лимитирующего разведения до одиночных клеток в 9 6-луночных планшетах в среде Pro СНО 5 (Lonza),
дополненной 4 мМ глутамином и с указанным давлением антибиотиков. Снова через 15-30 суток супернатанты из 96-луночных планшетов отбирали для анализа образования продукта посредством ELISA. Затем отобранные высокоэкспрессирующие клоны переносили в 24-луночный планшет, а затем в б-луночный планшет в среду PowerCH02 CD (среду с определенным химическим составом, Lonza), дополненную 4 мМ глутамином и с указанным антибиотическим давлением, и на каждом уровне анализировали уровни экспрессии посредством ELISA. Высокоэкспрессирующие клоны отбирали для анализа образования продукта в перемешиваемых пробирках в режиме с подпиткой. Эти эксперименты проводили с использованием этих выбранных клонов в центрифужных пробирках на шейкере (Kuhner-Germany) при 120 об./мин., 37°С, 5% СОг • Через 10 суток для различных клонов получали уровни продукции в диапазоне приблизительно от 2 0 мг/л до 50 мг/л.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CADILA HEALTHCARE LIMITED
<12 0> ВЕКТОР ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ
<130> 2806-MUM-10
<150> IN: 2806/MUM/2010 <151> 2010-10-08
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
324
<210> <211> <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Химерный интрон
<400> 1
aattaattcg ctgtctgcga gggccagctg ttggggtgag tactccctct caaaagcggg 60
catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga tattcacctg 120
gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc gtccatctgg tcagaaaaga caatcttttt 180
gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga gatctggcca tacacttgag tgacaatgac 240
atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagg tccaactgca ggtcgagcat 300
gcatctaggg cgcccgcact agag 324
<210> 2
<211> 395
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> TPL
<400> 2
gtttagtgaa
ccgtcagatc
ctcttccgca
tcgctgtctg
cgagggccag
ctgttggggt
gagtactccc
tctcaaaagc
gggcatgact
tctgcgctaa
gaatgtcagt
ttccaaaaac
gaggaggatt
tgatattcac
tggcccgcgg
tgatgccttt
gagggtggcc
gcgtccatct
ggtcagaaaa
gacaatcttt
ttgttgtcaa
gcttccttga
tgatgtcata
cttatcctgt
cccttttttt
tccacagctc
gcggttgagg
acaaactctt
cgcggtcttt
ccagtactct
tggatcggaa
acccgtcggc
ctccgaacgg
tactccgcca
ccgagggacc
tgagcgagtc
cgcatcgacc
ggatcggaaa
acctctcgac
gtacc
60 120 180 240 300 360 395
<210> 3 <211> 627
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Гены VA I и II
<400> 3
ggtacctcgg
gacgctctgg
ccggtgaggc
gtgcgcagtc
gttgacgctc
tagaccgtgc
aaaaggagag
cctgtaagcg
ggcactcttc
cgtggtctgg
tggataaatt
cgcaagggta
120
tcatggcgga
cgaccggggt
tcgaaccccg
gatccggccg
tccgccgtga
tccatgcggt
180
taccgcccgc
gtgtcgaacc
caggtgtgcg
acgtcagaca
acgggggagc
gctccttttg
240
gcttccttcc
aggcgcggcg
gctgctgcgc
tagctttttt
ggccactggc
cgcgcgcggc
300
gtaagcggtt
aggctggaaa
gcgaaagcat
taagtggctc
gctccctgta
gccggagggt
360
tattttccaa
gggttgagtc
gcaggacccc
cggttcgagt
ctcgggccgg
ccggactgcg
420
gcgaacgggg
gtttgcctcc
ccgtcatgca
agaccccgct
tgcaaattcc
tccggaaaca
480
gggacgagcc
ccttttttgc
ttttcccaga
tgcatccggt
gctgcggcag
atgcgccccc
540
ctcctcagca
gcggcaagag
caagagcagc
ggcagacatg
cagggcaccc
tccccttctc
600
ctaccgcgtc
aggaggggca
acatccg
627
<210> 4 <211> 4584 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> pZRC II
<400> 4
gtggcacttt
tcggggaaat
gtgcgcggaa
cccctatttg
tttatttttc
taaatacatt
caaatatgta
tccgctcatg
agacaataac
cctgataaat
gcttcaataa
tattgaaaaa
120
ggaagagtat
gattgaacag
gatggcctgc
atgcgggtag
cccggcagcg
tgggtggaac
180
gtctgtttgg
ctatgattgg
gcgcagcaga
ccattggctg
ctctgatgcg
gcggtgtttc
240
gtctgagcgc
gcagggtcgt
ccggtgctgt
ttgtgaaaac
cgatctgagc
ggtgcgctga
300
acgagctgca
ggatgaagcg
gcgcgtctga
gctggctggc
caccaccggt
gttccgtgtg
360
cggcggtgct
ggatgtggtg
accgaagcgg
gccgtgattg
gctgctgctg
ggcgaagtgc
420
cgggtcagga
tctgctgtct
agccatctgg
cgccggcaga
aaaagtgagc
attatggcgg
480
atgccatgcg
tcgtctgcat
accctggacc
cggcgacctg
tccgtttgat
catcaggcga
540
aacatcgtat
tgaacgtgcg
cgtacccgta
tggaagcggg
cctggtggat
caggatgatc
600
tggatgaaga
acatcagggc
ctggcaccgg
cagagctgtt
tgcgcgtctg
aaagcgagca
660
tgccggatgg
cgaagatctg
gtggtgaccc
atggtgatgc
gtgcctgccg
aacattatgg
720
tggaaaatgg
ccgttttagc
ggctttattg
attgcggccg
tctgggcgtg
gcggatcgtt
780
atcaggatat tgcgctggcc acccgtgata ttgcggaaga actgggcggc gaatgggcgg 840
atcgttttct ggtgctgtat ggcattgcgg caccggatag ccagcgtatt gcgttttatc 900
gtctgctgga tgaatttttc taataactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 960
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1020
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1080
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1140
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1200
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1260
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1320
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1380
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1440
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1500
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1560
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1620
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1680
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1740
attaggcacc ccaggcttta cccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 1800
ggagagcgcc caatacgcaa ggaaacagct atgaccatgt taatgcagct ggcacgacag 1860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgaaag gaaggcccat gaggccagtt aattaagagg 1920
tacctcggga cgctctggcc ggtgaggcgt gcgcagtcgt tgacgctcta gaccgtgcaa 1980
aaggagagcc tgtaagcggg cactcttccg tggtctggtg gataaattcg caagggtatc 2040
atggcggacg accggggttc gaaccccgga tccggccgtc cgccgtgatc catgcggtta 2100
ccgcccgcgt gtcgaaccca ggtgtgcgac gtcagacaac gggggagcgc tccttttggc 2160
ttccttccag gcgcggcggc tgctgcgcta gcttttttgg ccactggccg cgcgcggcgt 2220
aagcggttag gctggaaagc gaaagcatta agtggctcgc tccctgtagc cggagggtta 2280
ttttccaagg gttgagtcgc aggacccccg gttcgagtct cgggccggcc ggactgcggc 2340
gaacgggggt ttgcctcccc gtcatgcaag accccgcttg caaattcctc cggaaacagg 2400
gacgagcccc ttttttgctt ttcccagatg catccggtgc tgcggcagat gcgcccccct 2460
cctcagcagc ggcaagagca agagcagcgg cagacatgca gggcaccctc cccttctcct 2520
accgcgtcag gaggggcaac atccgacgcg ttgacattga ttattgacta gttattaata 2580
gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact 2640
tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat 2700
gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta 2760
tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc 2820
tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg 2880
ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg 2940
gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct 3000
ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa 3060
atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 3120
ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatcctc ttccgcatcg ctgtctgcga 3180
gggccagctg ttggggtgag tactccctct caaaagcggg catgacttct gcgctaagaa 3240
tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga tattcactgg cccgcggtga tgcctttgag 3300
ggtggccgcg tccatctggt cagaaaagac aatctttttg ttgtcaagct tccttgatga 3360
tgtcatactt atcctgtccc ttttttttcc acagctcgcg gttgaggaca aactcttcgc 3420
ggtctttcca gtactcttgg atcggaaacc cgtcggcctc cgaacggtac tccgccaccg 3480
agggacctga gcgagtccgc atcgaccgga tcggaaaacc tctcgacgta ccaattaatt 3540
cgctgtctgc gagggccagc tgttggggtg agtactccct ctcaaaagcg ggcatgactt 3600
ctgcgctaag attgtcagtt tccaaaaacg aggaggattt gatattcacc tggcccgcgg 3660
tgatgccttt gagggtggcc gcgtccatct ggtcagaaaa gacaatcttt ttgttgtcaa 3720
gcttgaggtg tggcaggctt gagatctggc catacacttg agtgacaatg acatccactt 3780
tgcctttctc tccacaggtg tccactccca ggtccaactg caggtcgagc atgcatctag 3840
ggcgcccgca ctagaggctc gaggaattcc ccggggatat cgtttaaacc cacgatcgtg 3900
gaagcggccg cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 3960
tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 4020
taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg 4080
gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg 4140
gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg gctctagggg gtatccccac 4200
ggagctcatg gcgcgcctag gccttgacgg ccttccttca attcgcccta tagtgagtcg 4260
tattacgtcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 4320
tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 4380
ggcccgcacc gaaacgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggagcgcc 4440
ctgtagcggc cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 4500
atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 4560
aaaatattaa cgcttacaat ttag 4584
<210> 5
<211> 1668
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> CLysMAR
<400> 5
gcatccataa tataactgta ccaggttttg gtttattaca tgtgactgac ggcttcctat 60
gcgtgctcag aaaacggcag ttgggcactg cactgcccgg tgatggtgcc acggtggctc 120
ctgccgcctt ctttgatatt cactctgttg tatttcatct cttgttgccg atgaaaggat 180
ataacagtct ctgaggaaat acttggtatt tcttctgatc agcgttttta taagtaatgt 240
tgaatattgg ataaggctgt gtgtcctttg tcttgggaga caaagcccac agcaggtggt 300
ggttgggtgg tggcagctca gtgacaggag aggttttttt gcctgttttt tttgttgttt 360
ttttttttta agtaaggtgt tcttttttct tagtaaaatt tctactggac tgtatgtttt 420
gacaggtcag aaacatttct tcaaaagaag aaccttttgg aaactgtaca gcccttttct 480
ttcattccct ttttgctttc tgtgccaatg cctttggttc tgattgcatt atggaaaacg 540
ttgatcggaa cttgaggttt ttatttatag tgtggcttga aagcttggat agctgttgtt 600
acatgagata ccttattaag tttaggccag cttgatgctt tatttttttt cctttgaagt 660
agtgagcgtt ctctggtttt tttcctttga aactggcgag gcttagattt ttctaatggg 720
attttttacc tgatgatcta gttgcatacc caaatgcttg taaatgtttt cctagttaac 780
atgttgataa cttcggattt acatgttgta tatacttgtc atctgtgttt ctagtaaaaa 840
tatatggcat ttatagaaat acgtaattcc tgatttcctt ttttttttat ctctatgctc 900
tgtgtgtaca ggtcaaacag acttcactcc tatttttatt tatagaattt tatatgcagt 960
ctgtcgttgg ttcttgtgtt gtaaggatac agccttaaat ttcctagagc gatgctcagt 1020
aaggcgggtt gtcacatggg ttcaaatgta aaacgggcac gtttgctgct gccttcccag 1080
atccaggaca ctaaactgct tctgcaactg aggtataaat cgcttcagat cccaggaagt 1140
gtagatccac gtgcatattc ttaaagaaga atgaatactt tctaaaatat gttggcatag 1200
gaagcaagct gcatggattt atttgggact taaattattt tggtaacgga gtgcataggt 1260
tttaaacaca gttgcagcat gctaacgagt cacagcattt atgcagaagt gatgcctgtt 1320
gcagctgttt acggcactgc cttgcagtga gcattgcaga taggggtggg gtgctttgtg 1380
tcgtgttggg acacgctgcc acacagccac ctcccgaaca tatctcacct gctgggtact 1440
tttcaaacca tcttagcagt agtagatgag ttactatgaa acagagaagt tcctcagttg 1500
gatattctca tgggatgtct tttttcccat gttgggcaaa gtatgataaa gcatctctat 1560
ttgtaaatta tgcacttgtt agttcctgaa tcctttctat agcaccactt attgcagcag 1620
gtgtaggctc tggtgtggcc tgtgtctgtg cttcaatctt ttaagctt 1668
<210> 6 <211> 7932 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> pZRC III
<400> 6
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120
ggaagagtat gattgaacag gatggcctgc atgcgggtag cccggcagcg tgggtggaac 180
gtctgtttgg ctatgattgg gcgcagcaga ccattggctg ctctgatgcg gcggtgtttc 240
gtctgagcgc gcagggtcgt ccggtgctgt ttgtgaaaac cgatctgagc ggtgcgctga 300
acgagctgca ggatgaagcg gcgcgtctga gctggctggc caccaccggt gttccgtgtg 360
cggcggtgct ggatgtggtg accgaagcgg gccgtgattg gctgctgctg ggcgaagtgc 420
cgggtcagga tctgctgtct agccatctgg cgccggcaga aaaagtgagc attatggcgg 480
atgccatgcg tcgtctgcat accctggacc cggcgacctg tccgtttgat catcaggcga 540
aacatcgtat tgaacgtgcg cgtacccgta tggaagcggg cctggtggat caggatgatc 600
tggatgaaga acatcagggc ctggcaccgg cagagctgtt tgcgcgtctg aaagcgagca 660
tgccggatgg cgaagatctg gtggtgaccc atggtgatgc gtgcctgccg aacattatgg 720
tggaaaatgg ccgttttagc ggctttattg attgcggccg tctgggcgtg gcggatcgtt 780
atcaggatat tgcgctggcc acccgtgata ttgcggaaga actgggcggc gaatgggcgg 840
atcgttttct ggtgctgtat ggcattgcgg caccggatag ccagcgtatt gcgttttatc 900
gtctgctgga tgaatttttc taataactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 960
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1020
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1080
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1140
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1200
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1260
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1320
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1380
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1440
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1500
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1560
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1620
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1680
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1740
attaggcacc ccaggcttta cccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 1800
ggagagcgcc caatacgcaa ggaaacagct atgaccatgt taatgcagct ggcacgacag 1860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgaaag gaaggcccat gaggccagtt aattaagagg 1920
tacctcggga cgctctggcc ggtgaggcgt gcgcagtcgt tgacgctcta gaccgtgcaa 1980
aaggagagcc tgtaagcggg cactcttccg tggtctggtg gataaattcg caagggtatc 2040
atggcggacg accggggttc gaaccccgga tccggccgtc cgccgtgatc catgcggtta 2100
ccgcccgcgt gtcgaaccca ggtgtgcgac gtcagacaac gggggagcgc tccttttggc 2160
ttccttccag gcgcggcggc tgctgcgcta gcttttttgg ccactggccg cgcgcggcgt 2220
aagcggttag gctggaaagc gaaagcatta agtggctcgc tccctgtagc cggagggtta 2280
ttttccaagg gttgagtcgc aggacccccg gttcgagtct cgggccggcc ggactgcggc 2340
gaacgggggt ttgcctcccc gtcatgcaag accccgcttg caaattcctc cggaaacagg 2400
gacgagcccc ttttttgctt ttcccagatg catccggtgc tgcggcagat gcgcccccct 2460
cctcagcagc ggcaagagca agagcagcgg cagacatgca gggcaccctc cccttctcct 2520
accgcgtcag gaggggcaac atccgacgcg tgcatccata atataactgt accaggtttt 2580
ggtttattac atgtgactga cggcttccta tgcgtgctca gaaaacggca gttgggcact 2640
gcactgcccg gtgatggtgc cacggtggct cctgccgcct tctttgatat tcactctgtt 2700
gtatttcatc tcttgttgcc gatgaaagga tataacagtc tctgaggaaa tacttggtat 2760
ttcttctgat cagcgttttt ataagtaatg ttgaatattg gataaggctg tgtgtccttt 2820
gtcttgggag acaaagccca cagcaggtgg tggttgggtg gtggcagctc agtgacagga 2880
gaggtttttt tgcctgtttt ttttgttgtt tttttttttt aagtaaggtg ttcttttttc 2940
ttagtaaaat ttctactgga ctgtatgttt tgacaggtca gaaacatttc ttcaaaagaa 3000
gaaccttttg gaaactgtac agcccttttc tttcattccc tttttgcttt ctgtgccaat 3060
gcctttggtt ctgattgcat tatggaaaac gttgatcgga acttgaggtt tttatttata 3120
gtgtggcttg aaagcttgga tagctgttgt tacatgagat accttattaa gtttaggcca 3180
gcttgatgct ttattttttt tcctttgaag tagtgagcgt tctctggttt ttttcctttg 3240
aaactggcga ggcttagatt tttctaatgg gattttttac ctgatgatct agttgcatac 3300
ccaaatgctt gtaaatgttt tcctagttaa catgttgata acttcggatt tacatgttgt 3360
atatacttgt catctgtgtt tctagtaaaa atatatggca tttatagaaa tacgtaattc 3420
ctgatttcct ttttttttta tctctatgct ctgtgtgtac aggtcaaaca gacttcactc 3480
ctatttttat ttatagaatt ttatatgcag tctgtcgttg gttcttgtgt tgtaaggata 3540
cagccttaaa tttcctagag cgatgctcag taaggcgggt tgtcacatgg gttcaaatgt 3600
aaaacgggca cgtttgctgc tgccttccca gatccaggac actaaactgc ttctgcaact 3660
gaggtataaa tcgcttcaga tcccaggaag tgtagatcca cgtgcatatt cttaaagaag 3720
aatgaatact ttctaaaata tgttggcata ggaagcaagc tgcatggatt tatttgggac 3780
ttaaattatt ttggtaacgg agtgcatagg ttttaaacac agttgcagca tgctaacgag 3840
tcacagcatt tatgcagaag tgatgcctgt tgcagctgtt tacggcactg ccttgcagtg 3900
agcattgcag ataggggtgg ggtgctttgt gtcgtgttgg gacacgctgc cacacagcca 3960
cctcccgaac atatctcacc tgctgggtac ttttcaaacc atcttagcag tagtagatga 4020
gttactatga aacagagaag ttcctcagtt ggatattctc atgggatgtc ttttttccca 4080
tgttgggcaa agtatgataa agcatctcta tttgtaaatt atgcacttgt tagttcctga 4140
atcctttcta tagcaccact tattgcagca ggtgtaggct ctggtgtggc ctgtgtctgt 4200
gcttcaatct tttaagctta cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 4260
aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 4320
aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 4380
tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 4440
gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 4500
cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 4560
tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg 4620
gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 4680
cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 4740
taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 4800
aagcagagct ggtttagtga accgtcagat cctcttccgc atcgctgtct gcgagggcca 4860
gctgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag cgggcatgac ttctgcgcta agaatgtcag 4920
tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca ctggcccgcg gtgatgcctt tgagggtggc 4980
cgcgtccatc tggtcagaaa agacaatctt tttgttgtca agcttccttg atgatgtcat 5040
acttatcctg tccctttttt ttccacagct cgcggttgag gacaaactct tcgcggtctt 5100
tccagtactc ttggatcgga aacccgtcgg cctccgaacg gtactccgcc accgagggac 5160
ctgagcgagt ccgcatcgac cggatcggaa aacctctcga cgtaccaatt aattcgctgt 5220
ctgcgagggc cagctgttgg ggtgagtact ccctctcaaa agcgggcatg acttctgcgc 5280
taagattgtc agtttccaaa aacgaggagg atttgatatt cacctggccc gcggtgatgc 5340
ctttgagggt ggccgcgtcc atctggtcag aaaagacaat ctttttgttg tcaagcttga 5400
ggtgtggcag gcttgagatc tggccataca cttgagtgac aatgacatcc actttgcctt 5460
tctctccaca ggtgtccact cccaggtcca actgcaggtc gagcatgcat ctagggcgcc 5520
cgcactagag gctcgaggaa ttccccgggg atatcgttta aacccacgat cgtggaagcg 5580
gccgcccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 5640
tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat 5700
gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg 5760
caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc 5820
tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc tggggctcta gggggtatcc ccacggagct 5880
cgcatccata atataactgt accaggtttt ggtttattac atgtgactga cggcttccta 5940
tgcgtgctca gaaaacggca gttgggcact gcactgcccg gtgatggtgc cacggtggct 6000
cctgccgcct tctttgatat tcactctgtt gtatttcatc tcttgttgcc gatgaaagga 6060
tataacagtc tctgaggaaa tacttggtat ttcttctgat cagcgttttt ataagtaatg 6120
ttgaatattg gataaggctg tgtgtccttt gtcttgggag acaaagccca cagcaggtgg 6180
tggttgggtg gtggcagctc agtgacagga gaggtttttt tgcctgtttt ttttgttgtt 6240
tttttttttt aagtaaggtg ttcttttttc ttagtaaaat ttctactgga ctgtatgttt 6300
tgacaggtca gaaacatttc ttcaaaagaa gaaccttttg gaaactgtac agcccttttc 6360
tttcattccc tttttgcttt ctgtgccaat gcctttggtt ctgattgcat tatggaaaac 6420
gttgatcgga acttgaggtt tttatttata gtgtggcttg aaagcttgga tagctgttgt 6480
tacatgagat accttattaa gtttaggcca gcttgatgct ttattttttt tcctttgaag 6540
tagtgagcgt tctctggttt ttttcctttg aaactggcga ggcttagatt tttctaatgg 6600
gattttttac ctgatgatct agttgcatac ccaaatgctt gtaaatgttt tcctagttaa 6660
catgttgata acttcggatt tacatgttgt atatacttgt catctgtgtt tctagtaaaa 6720
atatatggca tttatagaaa tacgtaattc ctgatttcct ttttttttta tctctatgct 6780
ctgtgtgtac aggtcaaaca gacttcactc ctatttttat ttatagaatt ttatatgcag 6840
tctgtcgttg gttcttgtgt tgtaaggata cagccttaaa tttcctagag cgatgctcag 6900
taaggcgggt tgtcacatgg gttcaaatgt aaaacgggca cgtttgctgc tgccttccca 6960
gatccaggac actaaactgc ttctgcaact gaggtataaa tcgcttcaga tcccaggaag 7020
tgtagatcca cgtgcatatt cttaaagaag aatgaatact ttctaaaata tgttggcata 7080
ggaagcaagc tgcatggatt tatttgggac ttaaattatt ttggtaacgg agtgcatagg 7140
ttttaaacac agttgcagca tgctaacgag tcacagcatt tatgcagaag tgatgcctgt 7200
tgcagctgtt tacggcactg ccttgcagtg agcattgcag ataggggtgg ggtgctttgt 7260
gtcgtgttgg gacacgctgc cacacagcca cctcccgaac atatctcacc tgctgggtac 7320
ttttcaaacc
atcttagcag
tagtagatga
gttactatga
aacagagaag
ttcctcagtt
7380
ggatattctc
atgggatgtc
ttttttccca
tgttgggcaa
agtatgataa
agcatctcta
7440
tttgtaaatt
atgcacttgt
tagttcctga
atcctttcta
tagcaccact
tattgcagca
7500
ggtgtaggct
ctggtgtggc
ctgtgtctgt
gcttcaatct
tttaagcttg
agctcatggc
7560
gcgcctaggc
cttgacggcc
ttccttcaat
tcgccctata
gtgagtcgta
ttacgtcgcg
7620
ctcactggcc
gtcgttttac
aacgtcgtga
ctgggaaaac
cctggcgtta
cccaacttaa
7680
tcgccttgca
gcacatcccc
ctttcgccag
ctggcgtaat
agcgaagagg
cccgcaccga
7740
aacgcccttc
ccaacagttg
cgcagcctga
atggcgaatg
ggagcgccct
gtagcggcca
7800
ctcaacccta
tctcggtcta
ttcttttgat
ttataaggga
ttttgccgat
ttcggcctat
7860
tggttaaaaa
atgagctgat
ttaacaaaaa
tttaacgcga
attttaacaa
aatattaacg
7920
cttacaattt
7932
<210> 7
<211> 562
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> TNK
<400> 7
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg
20 25 30
Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met
35 40 45
Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn
50 55 60
Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser
65 70 75 80
Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr
85 90 95
Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu
100 105 110
Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr
115 120 125
Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Asn Trp Ser Thr Ala Glu Ser
130 135 140
Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Gln Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro
145 150 155 160
Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His
165 170 175
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val
180 185 190
Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys
195 200 205
Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg
210 215 220
Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn
225 230 235 240
Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala
245 250 255
Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly
260 265 270
Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp
275 280 285
Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr
290 295 300
Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala
305 310 315 320
Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ser Pro
325 330 335
Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile
340 345 350
Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu
355 360 365
Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu
370 375 380
Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp
385 390 395 400
Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser
405 410 415
Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro
420 425 430
Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly
435 440 445
Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys
450 455 460
Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His
465 470 475 480
Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr
485 490 495
Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp
500 505 510
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val
515 520 525
Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly
530 535 540
Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met
545 550 555 560
Arg Pro
<210> 8
<211> 11138
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> pZRC III- TNK- Hyg
<400> 8
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120
ggaagagtat gattgaacag gatggcctgc atgcgggtag cccggcagcg tgggtggaac 180
gtctgtttgg ctatgattgg gcgcagcaga ccattggctg ctctgatgcg gcggtgtttc 240
gtctgagcgc gcagggtcgt ccggtgctgt ttgtgaaaac cgatctgagc ggtgcgctga 300
acgagctgca ggatgaagcg gcgcgtctga gctggctggc caccaccggt gttccgtgtg 360
cggcggtgct ggatgtggtg accgaagcgg gccgtgattg gctgctgctg ggcgaagtgc 420
cgggtcagga tctgctgtct agccatctgg cgccggcaga aaaagtgagc attatggcgg 480
atgccatgcg tcgtctgcat accctggacc cggcgacctg tccgtttgat catcaggcga 540
aacatcgtat tgaacgtgcg cgtacccgta tggaagcggg cctggtggat caggatgatc 600
tggatgaaga acatcagggc ctggcaccgg cagagctgtt tgcgcgtctg aaagcgagca 660
tgccggatgg cgaagatctg gtggtgaccc atggtgatgc gtgcctgccg aacattatgg 720
tggaaaatgg ccgttttagc ggctttattg attgcggccg tctgggcgtg gcggatcgtt 780
atcaggatat tgcgctggcc acccgtgata ttgcggaaga actgggcggc gaatgggcgg 840
atcgttttct ggtgctgtat ggcattgcgg caccggatag ccagcgtatt gcgttttatc 900
gtctgctgga tgaatttttc taataactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 960
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1020
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1080
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1140
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1200
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1260
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1320
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1380
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1440
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1500
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1560
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1620
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1680
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1740
attaggcacc ccaggcttta cccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 1800
ggagagcgcc caatacgcaa ggaaacagct atgaccatgt taatgcagct ggcacgacag 1860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgaaag gaaggcccat gaggccagtt aattaagagg 1920
atccttatcg attttaccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 1980
ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca 2040
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 2100
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgctcg 2160
aagcggccgg ccgccccgac tctagactat tcctttgccc tcggacgagt gctggggcgt 2220
cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg 2280
cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga 2340
ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca 2400
agaccaatgc ggagcatata cgcccggagc cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc 2460
cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg 2520
ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt 2580
atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg 2640
acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca 2700
ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat 2760
atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg 2820
ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatgg cctccgcgac cggctgcaga 2880
acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag 2940
atgcaatagg tcaggctctc gctgaattcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc 3000
gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta 3060
tttacccgca ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg 3120
ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg 3180
acagacgtcg cggtgagttc aggctttccg gatctatcca tcatggtggc tttaccaaca 3240
gtaccggaat gccaagcttt ttgcaaaagc ctaggcctcc aaaaaagcct cctcactact 3300
tctggaatag ctcagaggcc gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa aaaattagtc 3360
agcgatgggg cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta 3420
ggggcgggac tatggttgct gactaattga gatgcagatc gcagatcctc gggacgctct 3480
ggccggtgag gcgtgcgcag tcgttgacgc tctagaccgt gcaaaaggag agcctgtaag 3540
cgggcactct tccgtggtct ggtggataaa ttcgcaaggg tatcatggcg gacgaccggg 3600
gttcgaaccc cggatccggc cgtccgccgt gatccatgcg gttaccgccc gcgtgtcgaa 3660
cccaggtgtg cgacgtcaga caacggggga gcgctccttt tggcttcctt ccaggcgcgg 3720
cggctgctgc gctagctttt ttggccactg gccgcgcgcg gcgtaagcgg ttaggctgga 3780
aagcgaaagc attaagtggc tcgctccctg tagccggagg gttattttcc aagggttgag 3840
tcgcaggacc cccggttcga gtctcgggcc ggccggactg cggcgaacgg gggtttgcct 3900
ccccgtcatg caagaccccg cttgcaaatt cctccggaaa cagggacgag cccctttttt 3960
gcttttccca gatgcatccg gtgctgcggc agatgcgccc ccctcctcag cagcggcaag 4020
agcaagagca gcggcagaca tgcagggcac cctccccttc tcctaccgcg tcaggagggg 4080
caacatccga cgcgtgcatc cataatataa ctgtaccagg ttttggttta ttacatgtga 4140
ctgacggctt cctatgcgtg ctcagaaaac ggcagttggg cactgcactg cccggtgatg 4200
gtgccacggt ggctcctgcc gccttctttg atattcactc tgttgtattt catctcttgt 4260
tgccgatgaa aggatataac agtctctgag gaaatacttg gtatttcttc tgatcagcgt 4320
ttttataagt aatgttgaat attggataag gctgtgtgtc ctttgtcttg ggagacaaag 4380
cccacagcag gtggtggttg ggtggtggca gctcagtgac aggagaggtt tttttgcctg 4440
ttttttttgt tgtttttttt ttttaagtaa ggtgttcttt tttcttagta aaatttctac 4500
tggactgtat gttttgacag gtcagaaaca tttcttcaaa agaagaacct tttggaaact 4560
gtacagccct tttctttcat tccctttttg ctttctgtgc caatgccttt ggttctgatt 4620
gcattatgga aaacgttgat cggaacttga ggtttttatt tatagtgtgg cttgaaagct 4680
tggatagctg ttgttacatg agatacctta ttaagtttag gccagcttga tgctttattt 4740
tttttccttt gaagtagtga gcgttctctg gtttttttcc tttgaaactg gcgaggctta 4800
gatttttcta atgggatttt ttacctgatg atctagttgc atacccaaat gcttgtaaat 4860
gttttcctag ttaacatgtt gataacttcg gatttacatg ttgtatatac ttgtcatctg 4920
tgtttctagt aaaaatatat ggcatttata gaaatacgta attcctgatt tccttttttt 4980
tttatctcta tgctctgtgt gtacaggtca aacagacttc actcctattt ttatttatag 5040
aattttatat gcagtctgtc gttggttctt gtgttgtaag gatacagcct taaatttcct 5100
agagcgatgc tcagtaaggc gggttgtcac atgggttcaa atgtaaaacg ggcacgtttg 5160
ctgctgcctt cccagatcca ggacactaaa ctgcttctgc aactgaggta taaatcgctt 5220
cagatcccag gaagtgtaga tccacgtgca tattcttaaa gaagaatgaa tactttctaa 5280
aatatgttgg cataggaagc aagctgcatg gatttatttg ggacttaaat tattttggta 5340
acggagtgca taggttttaa acacagttgc agcatgctaa cgagtcacag catttatgca 5400
gaagtgatgc ctgttgcagc tgtttacggc actgccttgc agtgagcatt gcagataggg 5460
gtggggtgct ttgtgtcgtg ttgggacacg ctgccacaca gccacctccc gaacatatct 5520
cacctgctgg gtacttttca aaccatctta gcagtagtag atgagttact atgaaacaga 5580
gaagttcctc agttggatat tctcatggga tgtctttttt cccatgttgg gcaaagtatg 5640
ataaagcatc tctatttgta aattatgcac ttgttagttc ctgaatcctt tctatagcac 5700
cacttattgc agcaggtgta ggctctggtg tggcctgtgt ctgtgcttca atcttttaag 5760
cttacgcgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 5820
gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 5880
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 5940
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 6000
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 6060
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 6120
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 6180
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 6240
agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 6300
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta 6360
gtgaaccgtc agatcctctt ccgcatcgct gtctgcgagg gccagctgtt ggggtgagta 6420
ctccctctca aaagcgggca tgacttctgc gctaagaatg tcagtttcca aaaacgagga 6480
ggatttgata ttcactggcc cgcggtgatg cctttgaggg tggccgcgtc catctggtca 6540
gaaaagacaa tctttttgtt gtcaagcttc cttgatgatg tcatacttat cctgtccctt 6600
ttttttccac agctcgcggt tgaggacaaa ctcttcgcgg tctttccagt actcttggat 6660
cggaaacccg tcggcctccg aacggtactc cgccaccgag ggacctgagc gagtccgcat 6720
cgaccggatc ggaaaacctc tcgacgtacc aattaattcg ctgtctgcga gggccagctg 6780
ttggggtgag tactccctct caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc 6840
caaaaacgag gaggatttga tattcacctg gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc 6900
gtccatctgg tcagaaaaga caatcttttt gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga 6960
gatctggcca tacacttgag tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc 7020
cactcccagg tccaactgca ggtcgagcat gcatctaggg cgcccgcact agaggctcga 7080
ggaattccac catggacgcc atgaagcggg gactgtgctg tgtgctgctg ctgtgtggcg 7140
ccgtgttcgt gtcccctagc caggaaatcc acgcccggtt cagaaggggc gccaggtcct 7200
accaagttat ctgccgggac gaaaagaccc agatgatcta ccagcagcac cagtcctggc 7260
tgcggcccgt gctgcggtcc aaccgggtgg agtactgctg gtgcaactcc ggcagagccc 7320
agtgccactc cgtgcctgtg aagtcctgct ccgagcctag atgcttcaac ggcggcacct 7380
gtcagcaggc cctgtacttc tccgacttcg tgtgccagtg ccctgagggc ttcgccggca 7440
agtgctgcga gatcgacacc cgggccacct gttacgagga ccagggcatc tcctaccggg 7500
gcaactggtc taccgccgag tctggcgccg agtgcaccaa ctggcagtcc tccgccctgg 7560
cccagaagcc ttactctggc agacggcctg acgccatcag actgggcctg ggcaaccaca 7620
actactgccg gaaccctgac cgggactcca agccttggtg ctacgtgttc aaggccggca 7680
agtactcctc cgagttctgc tccacccctg cctgctctga gggcaactcc gactgctact 7740
tcggcaacgg ctccgcctac agaggcaccc actccctgac cgagtccggc gcctcttgcc 7800
tgccttggaa ctccatgatc ctgatcggca aggtgtacac cgcccagaac ccttccgctc 7860
aggccctggg actcggaaag cacaattatt gtcgcaatcc cgacggcgac gccaaacctt 7920
ggtgtcacgt gctgaagaac cggcggctga catgggaata ctgcgacgtg ccttcctgct 7980
ctacctgcgg cctgcggcag tactcccagc ctcagttccg gatcaagggc ggcctgttcg 8040
ccgatatcgc ctcccaccct tggcaggccg ccatcttcgc cgctgctgcc gcttctcctg 8100
gcgagagatt cctgtgcggc ggcatcctga tctccagctg ctggattctg tctgccgccc 8160
actgcttcca ggaacggttc cctcctcacc acctgaccgt gatcctgggc cggacctaca 8220
gagtcgtgcc cggcgaggaa gaacagaaat tcgaggtgga gaagtatatc gtgcacaaag 8280
agttcgacga cgacacctac gacaacgata tcgccctgct gcagctgaag tccgactcct 8340
ccagatgcgc ccaggaatcc tccgtcgttc ggaccgtgtg tctgccacct gccgacctgc 8400
agctgcctga ctggaccgag tgcgagctgt ccggctacgg caagcacgag gccctgtccc 8460
ccttctactc cgagcggctg aaagaagctc atgtacggct gtacccctct agccggtgca 8520
cctcccagca tctgctgaac cggaccgtga ccgacaacat gctgtgtgcc ggcgacacca 8580
gatctggcgg ccctcaggcc aacctgcacg acgcctgcca gggcgatagt ggcggacctc 8640
tcgtgtgcct caacgacggc aggatgaccc tcgtgggcat catctcttgg ggcctgggct 8700
gtggccagaa agacgtgcct ggcgtgtaca ccaaagtgac caactacctg gactggatca 8760
gggacaacat gcggccttga tgagcggccg cccgctgatc agcctcgact gtgccttcta 8820
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 8880
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 8940
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 9000
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 9060
gctctagggg gtatccccac ggagctcgca tccataatat aactgtacca ggttttggtt 9120
tattacatgt gactgacggc ttcctatgcg tgctcagaaa acggcagttg ggcactgcac 9180
tgcccggtga tggtgccacg gtggctcctg ccgccttctt tgatattcac tctgttgtat 9240
ttcatctctt gttgccgatg aaaggatata acagtctctg aggaaatact tggtatttct 9300
tctgatcagc gtttttataa gtaatgttga atattggata aggctgtgtg tcctttgtct 9360
tgggagacaa agcccacagc aggtggtggt tgggtggtgg cagctcagtg acaggagagg 9420
tttttttgcc tgtttttttt gttgtttttt ttttttaagt aaggtgttct tttttcttag 9480
taaaatttct actggactgt atgttttgac aggtcagaaa catttcttca aaagaagaac 9540
cttttggaaa ctgtacagcc cttttctttc attccctttt tgctttctgt gccaatgcct 9600
ttggttctga ttgcattatg gaaaacgttg atcggaactt gaggttttta tttatagtgt 9660
ggcttgaaag cttggatagc tgttgttaca tgagatacct tattaagttt aggccagctt 9720
gatgctttat tttttttcct ttgaagtagt gagcgttctc tggttttttt cctttgaaac 9780
tggcgaggct
tagatttttc
taatgggatt
ttttacctga
tgatctagtt
gcatacccaa
9840
atgcttgtaa
atgttttcct
agttaacatg
ttgataactt
cggatttaca
tgttgtatat
9900
acttgtcatc
tgtgtttcta
gtaaaaatat
atggcattta
tagaaatacg
taattcctga
9960
tttccttttt
tttttatctc
tatgctctgt
gtgtacaggt
caaacagact
tcactcctat
10020
ttttatttat
agaattttat
atgcagtctg
tcgttggttc
ttgtgttgta
aggatacagc
10080
cttaaatttc
ctagagcgat
gctcagtaag
gcgggttgtc
acatgggttc
aaatgtaaaa
10140
cgggcacgtt
tgctgctgcc
ttcccagatc
caggacacta
aactgcttct
gcaactgagg
10200
tataaatcgc
ttcagatccc
aggaagtgta
gatccacgtg
catattctta
aagaagaatg
10260
aatactttct
aaaatatgtt
ggcataggaa
gcaagctgca
tggatttatt
tgggacttaa
10320
attattttgg
taacggagtg
cataggtttt
aaacacagtt
gcagcatgct
aacgagtcac
10380
agcatttatg
cagaagtgat
gcctgttgca
gctgtttacg
gcactgcctt
gcagtgagca
10440
ttgcagatag
gggtggggtg
ctttgtgtcg
tgttgggaca
cgctgccaca
cagccacctc
10500
ccgaacatat
ctcacctgct
gggtactttt
caaaccatct
tagcagtagt
agatgagtta
10560
ctatgaaaca
gagaagttcc
tcagttggat
attctcatgg
gatgtctttt
ttcccatgtt
10620
gggcaaagta
tgataaagca
tctctatttg
taaattatgc
acttgttagt
tcctgaatcc
10680
tttctatagc
accacttatt
gcagcaggtg
taggctctgg
tgtggcctgt
gtctgtgctt
10740
caatctttta
agcttgagct
catggcgcgc
ctaggccttg
acggccttcc
ttcaattcgc
10800
cctatagtga
gtcgtattac
gtcgcgctca
ctggccgtcg
ttttacaacg
tcgtgactgg
10860
gaaaaccctg
gcgttaccca
acttaatcgc
cttgcagcac
atcccccttt
cgccagctgg
10920
cgtaatagcg
aagaggcccg
caccgaaacg
cccttcccaa
cagttgcgca
gcctgaatgg
10980
cgaatgggag
cgccctgtag
cggccactca
accctatctc
ggtctattct
tttgatttat
11040
aagggatttt
gccgatttcg
gcctattggt
taaaaaatga
gctgatttaa
caaaaattta
11100
acgcgaattt
taacaaaata
ttaacgctta
caatttag
11138
<210> 9
<211> 193
<212> БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Дарбепоэтин
<400> 9
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 10
<211> 10023
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> pZRC III- DARBE- Hyg
acgagctgca ggatgaagcg gcgcgtctga gctggctggc caccaccggt gttccgtgtg 360
cggcggtgct ggatgtggtg accgaagcgg gccgtgattg gctgctgctg ggcgaagtgc 420
cgggtcagga tctgctgtct agccatctgg cgccggcaga aaaagtgagc attatggcgg 480
atgccatgcg tcgtctgcat accctggacc cggcgacctg tccgtttgat catcaggcga 540
aacatcgtat tgaacgtgcg cgtacccgta tggaagcggg cctggtggat caggatgatc 600
tggatgaaga acatcagggc ctggcaccgg cagagctgtt tgcgcgtctg aaagcgagca 660
tgccggatgg cgaagatctg gtggtgaccc atggtgatgc gtgcctgccg aacattatgg 720
tggaaaatgg ccgttttagc ggctttattg attgcggccg tctgggcgtg gcggatcgtt 780
atcaggatat tgcgctggcc acccgtgata ttgcggaaga actgggcggc gaatgggcgg 840
atcgttttct ggtgctgtat ggcattgcgg caccggatag ccagcgtatt gcgttttatc 900
gtctgctgga tgaatttttc taataactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 960
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1020
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1080
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1140
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1200
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1260
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1320
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1380
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1440
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1500
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1560
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1620
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1680
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1740
attaggcacc ccaggcttta cccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 1800
ggagagcgcc caatacgcaa ggaaacagct atgaccatgt taatgcagct ggcacgacag 1860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgaaag gaaggcccat gaggccagtt aattaagagg 1920
atccttatcg attttaccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 1980
ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca 2040
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 2100
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgctcg 2160
aagcggccgg ccgccccgac tctagactat tcctttgccc tcggacgagt gctggggcgt 2220
cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg 2280
cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga 2340
ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca 2400
agaccaatgc ggagcatata cgcccggagc cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc 2460
cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg 2520
ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt 2580
atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg 2640
acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca 2700
ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat 2760
atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg 2820
ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatgg cctccgcgac cggctgcaga 2880
acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag 2940
atgcaatagg tcaggctctc gctgaattcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc 3000
gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta 3060
tttacccgca ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg 3120
ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg 3180
acagacgtcg cggtgagttc aggctttccg gatctatcca tcatggtggc tttaccaaca 3240
gtaccggaat gccaagcttt ttgcaaaagc ctaggcctcc aaaaaagcct cctcactact 3300
tctggaatag ctcagaggcc gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa aaaattagtc 3360
agcgatgggg cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta 3420
ggggcgggac tatggttgct gactaattga gatgcagatc gcagatcctc gggacgctct 3480
ggccggtgag gcgtgcgcag tcgttgacgc tctagaccgt gcaaaaggag agcctgtaag 3540
cgggcactct tccgtggtct ggtggataaa ttcgcaaggg tatcatggcg gacgaccggg 3600
gttcgaaccc cggatccggc cgtccgccgt gatccatgcg gttaccgccc gcgtgtcgaa 3660
cccaggtgtg cgacgtcaga caacggggga gcgctccttt tggcttcctt ccaggcgcgg 3720
cggctgctgc gctagctttt ttggccactg gccgcgcgcg gcgtaagcgg ttaggctgga 3780
aagcgaaagc attaagtggc tcgctccctg tagccggagg gttattttcc aagggttgag 3840
tcgcaggacc cccggttcga gtctcgggcc ggccggactg cggcgaacgg gggtttgcct 3900
ccccgtcatg caagaccccg cttgcaaatt cctccggaaa cagggacgag cccctttttt 3960
gcttttccca gatgcatccg gtgctgcggc agatgcgccc ccctcctcag cagcggcaag 4020
agcaagagca gcggcagaca tgcagggcac cctccccttc tcctaccgcg tcaggagggg 4080
caacatccga cgcgtgcatc cataatataa ctgtaccagg ttttggttta ttacatgtga 4140
ctgacggctt cctatgcgtg ctcagaaaac ggcagttggg cactgcactg cccggtgatg 4200
gtgccacggt ggctcctgcc gccttctttg atattcactc tgttgtattt catctcttgt 4260
tgccgatgaa aggatataac agtctctgag gaaatacttg gtatttcttc tgatcagcgt 4320
ttttataagt aatgttgaat attggataag gctgtgtgtc ctttgtcttg ggagacaaag 4380
cccacagcag gtggtggttg ggtggtggca gctcagtgac aggagaggtt tttttgcctg 4440
ttttttttgt tgtttttttt ttttaagtaa ggtgttcttt tttcttagta aaatttctac 4500
tggactgtat gttttgacag gtcagaaaca tttcttcaaa agaagaacct tttggaaact 4560
gtacagccct tttctttcat tccctttttg ctttctgtgc caatgccttt ggttctgatt 4620
gcattatgga aaacgttgat cggaacttga ggtttttatt tatagtgtgg cttgaaagct 4680
tggatagctg ttgttacatg agatacctta ttaagtttag gccagcttga tgctttattt 4740
tttttccttt gaagtagtga gcgttctctg gtttttttcc tttgaaactg gcgaggctta 4800
gatttttcta atgggatttt ttacctgatg atctagttgc atacccaaat gcttgtaaat 4860
gttttcctag ttaacatgtt gataacttcg gatttacatg ttgtatatac ttgtcatctg 4920
tgtttctagt aaaaatatat ggcatttata gaaatacgta attcctgatt tccttttttt 4980
tttatctcta tgctctgtgt gtacaggtca aacagacttc actcctattt ttatttatag 5040
aattttatat gcagtctgtc gttggttctt gtgttgtaag gatacagcct taaatttcct 5100
agagcgatgc tcagtaaggc gggttgtcac atgggttcaa atgtaaaacg ggcacgtttg 5160
ctgctgcctt cccagatcca ggacactaaa ctgcttctgc aactgaggta taaatcgctt 5220
cagatcccag gaagtgtaga tccacgtgca tattcttaaa gaagaatgaa tactttctaa 5280
aatatgttgg cataggaagc aagctgcatg gatttatttg ggacttaaat tattttggta 5340
acggagtgca taggttttaa acacagttgc agcatgctaa cgagtcacag catttatgca 5400
gaagtgatgc ctgttgcagc tgtttacggc actgccttgc agtgagcatt gcagataggg 5460
gtggggtgct ttgtgtcgtg ttgggacacg ctgccacaca gccacctccc gaacatatct 5520
cacctgctgg gtacttttca aaccatctta gcagtagtag atgagttact atgaaacaga 5580
gaagttcctc agttggatat tctcatggga tgtctttttt cccatgttgg gcaaagtatg 5640
ataaagcatc tctatttgta aattatgcac ttgttagttc ctgaatcctt tctatagcac 5700
cacttattgc agcaggtgta ggctctggtg tggcctgtgt ctgtgcttca atcttttaag 5760
cttacgcgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 5820
gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 5880
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 5940
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 6000
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 6060
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 6120
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 6180
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 6240
agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 6300
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta 6360
gtgaaccgtc agatcctctt ccgcatcgct gtctgcgagg gccagctgtt ggggtgagta 6420
ctccctctca aaagcgggca tgacttctgc gctaagaatg tcagtttcca aaaacgagga 6480
ggatttgata ttcactggcc cgcggtgatg cctttgaggg tggccgcgtc catctggtca 6540
gaaaagacaa tctttttgtt gtcaagcttc cttgatgatg tcatacttat cctgtccctt 6600
ttttttccac agctcgcggt tgaggacaaa ctcttcgcgg tctttccagt actcttggat 6660
cggaaacccg tcggcctccg aacggtactc cgccaccgag ggacctgagc gagtccgcat 6720
cgaccggatc ggaaaacctc tcgacgtacc aattaattcg ctgtctgcga gggccagctg 6780
ttggggtgag tactccctct caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc 6840
caaaaacgag gaggatttga tattcacctg gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc 6900
gtccatctgg tcagaaaaga caatcttttt gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga 6960
gatctggcca tacacttgag tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc 7020
cactcccagg tccaactgca ggtcgagcat gcatctaggg cgcccgcact agaggctcga 7080
gccaccatgg gggtgcacga atgtcctgcc tggctgtggc ttctcctgtc cctgctgtcg 7140
ctccctctgg gcctcccagt cctgggcgcc ccaccacgcc tcatctgtga cagccgagtc 7200
ctggagaggt acctcttgga ggccaaggag gccgagaata tcacgacggg ctgtaatgaa 7260
acctgcagct tgaatgagaa tatcactgtc ccagacacca aagttaattt ctatgcctgg 7320
aagaggatgg aggtcgggca gcaggccgta gaagtctggc agggcctggc cctgctgtcg 7380
gaagctgtcc tgcggggcca ggccctgttg gtcaactctt cccaggtgaa cgagaccctg 7440
cagctgcatg tggataaagc cgtcagtggc cttcgcagcc tcaccactct gcttcgggct 7500
ctgggagccc agaaggaagc catctcccct ccagatgcgg cctcagctgc tccactccga 7560
acaatcactg ctgacacttt ccgcaaactc ttccgagtct actccaattt cctccgggga 7620
aagctgaagc tgtacacagg ggaggcctgc aggacagggg acagatgagc ggccgcccgc 7680
tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 7740
ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 7800
gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 7860
aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 7920
tctgaggcgg aaagaaccag ctggggctct agggggtatc cccacggagc tcgcatccat 7980
aatataactg taccaggttt tggtttatta catgtgactg acggcttcct atgcgtgctc 8040
agaaaacggc agttgggcac tgcactgccc ggtgatggtg ccacggtggc tcctgccgcc 8100
ttctttgata ttcactctgt tgtatttcat ctcttgttgc cgatgaaagg atataacagt 8160
ctctgaggaa atacttggta tttcttctga tcagcgtttt tataagtaat gttgaatatt 8220
ggataaggct gtgtgtcctt tgtcttggga gacaaagccc acagcaggtg gtggttgggt 8280
ggtggcagct cagtgacagg agaggttttt ttgcctgttt tttttgttgt tttttttttt 8340
taagtaaggt gttctttttt cttagtaaaa tttctactgg actgtatgtt ttgacaggtc 8400
agaaacattt cttcaaaaga agaacctttt ggaaactgta cagccctttt ctttcattcc 8460
ctttttgctt tctgtgccaa tgcctttggt tctgattgca ttatggaaaa cgttgatcgg 8520
aacttgaggt ttttatttat agtgtggctt gaaagcttgg atagctgttg ttacatgaga 8580
taccttatta agtttaggcc agcttgatgc tttatttttt ttcctttgaa gtagtgagcg 8640
ttctctggtt tttttccttt gaaactggcg aggcttagat ttttctaatg ggatttttta 8700
cctgatgatc tagttgcata cccaaatgct tgtaaatgtt ttcctagtta acatgttgat 8760
aacttcggat ttacatgttg tatatacttg tcatctgtgt ttctagtaaa aatatatggc 8820
atttatagaa atacgtaatt cctgatttcc tttttttttt atctctatgc tctgtgtgta 8880
caggtcaaac agacttcact cctattttta tttatagaat tttatatgca gtctgtcgtt 8940
ggttcttgtg ttgtaaggat acagccttaa atttcctaga gcgatgctca gtaaggcggg 9000
ttgtcacatg ggttcaaatg taaaacgggc acgtttgctg ctgccttccc agatccagga 9060
cactaaactg cttctgcaac tgaggtataa atcgcttcag atcccaggaa gtgtagatcc 9120
acgtgcatat tcttaaagaa gaatgaatac tttctaaaat atgttggcat aggaagcaag 9180
ctgcatggat ttatttggga cttaaattat tttggtaacg gagtgcatag gttttaaaca 9240
cagttgcagc atgctaacga gtcacagcat ttatgcagaa gtgatgcctg ttgcagctgt 9300
ttacggcact gccttgcagt gagcattgca gataggggtg gggtgctttg tgtcgtgttg 9360
ggacacgctg ccacacagcc acctcccgaa catatctcac ctgctgggta cttttcaaac 9420
catcttagca gtagtagatg agttactatg aaacagagaa gttcctcagt tggatattct 9480
catgggatgt cttttttccc atgttgggca aagtatgata aagcatctct atttgtaaat 9540
tatgcacttg ttagttcctg aatcctttct atagcaccac ttattgcagc aggtgtaggc 9600
tctggtgtgg cctgtgtctg tgcttcaatc ttttaagctt gagctcatgg cgcgcctagg 9660
ccttgacggc cttccttcaa ttcgccctat agtgagtcgt attacgtcgc gctcactggc 9720
cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 9780
agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg aaacgccctt 9840
cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggagcgccc tgtagcggcc actcaaccct 9900
atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 9960 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 10020 tag 10023
<210> 11 <211> 489 <212> БЕЛ
БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> Этанерцепт
<400> 11
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
260 265 270
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
275 280 285
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
290 295 300
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
305 310 315 320
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
325 330 335
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
340 345 350
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
355 360 365
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
370 375 380
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
385 390 395 400
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
405 410 415
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
420 425 430
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
435 440 445
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
450 455 460
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
465 470 475 480
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 12
<211> 10911
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> pZRC III - Etanercept - Hyg
gtggcacttt
tcggggaaat
gtgcgcggaa
cccctatttg
tttatttttc
taaatacatt
caaatatgta
tccgctcatg
agacaataac
cctgataaat
gcttcaataa
tattgaaaaa
ggaagagtat
gattgaacag
gatggcctgc
atgcgggtag
cccggcagcg
tgggtggaac
gtctgtttgg
ctatgattgg
gcgcagcaga
ccattggctg
ctctgatgcg
gcggtgtttc
gtctgagcgc
gcagggtcgt
ccggtgctgt
ttgtgaaaac
cgatctgagc
ggtgcgctga
acgagctgca
ggatgaagcg
gcgcgtctga
gctggctggc
caccaccggt
gttccgtgtg
cggcggtgct
ggatgtggtg
accgaagcgg
gccgtgattg
gctgctgctg
ggcgaagtgc
cgggtcagga
tctgctgtct
agccatctgg
cgccggcaga
aaaagtgagc
attatggcgg
atgccatgcg
tcgtctgcat
accctggacc
cggcgacctg
tccgtttgat
catcaggcga
aacatcgtat
tgaacgtgcg
cgtacccgta
tggaagcggg
cctggtggat
caggatgatc
tggatgaaga
acatcagggc
ctggcaccgg
cagagctgtt
tgcgcgtctg
aaagcgagca
tgccggatgg
cgaagatctg
gtggtgaccc
atggtgatgc
gtgcctgccg
aacattatgg
tggaaaatgg
ccgttttagc
ggctttattg
attgcggccg
tctgggcgtg
gcggatcgtt
atcaggatat
tgcgctggcc
acccgtgata
ttgcggaaga
actgggcggc
gaatgggcgg
atcgttttct
ggtgctgtat
ggcattgcgg
caccggatag
ccagcgtatt
gcgttttatc
gtctgctgga
tgaatttttc
taataactgt
cagaccaagt
ttactcatat
atactttaga
ttgatttaaa
acttcatttt
taatttaaaa
ggatctaggt
gaagatcctt
tttgataatc
tcatgaccaa
aatcccttaa
cgtgagtttt
cgttccactg
agcgtcagac
cccgtagaaa
agatcaaagg
atcttcttga
gatccttttt
ttctgcgcgt
aatctgctgc
ttgcaaacaa
aaaaaccacc
gctaccagcg
gtggtttgtt
tgccggatca
agagctacca
actctttttc
cgaaggtaac
tggcttcagc
agagcgcaga
taccaaatac
tgttcttcta
gtgtagccgt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1320
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1380
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1440
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1500
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1560
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1620
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1680
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1740
attaggcacc ccaggcttta cccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 1800
ggagagcgcc caatacgcaa ggaaacagct atgaccatgt taatgcagct ggcacgacag 1860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgaaag gaaggcccat gaggccagtt aattaagagg 1920
atccttatcg attttaccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 1980
ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca 2040
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 2100
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgctcg 2160
aagcggccgg ccgccccgac tctagactat tcctttgccc tcggacgagt gctggggcgt 2220
cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg 2280
cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga 2340
ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca 2400
agaccaatgc ggagcatata cgcccggagc cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc 2460
cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg 2520
ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt 2580
atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg 2640
acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca 2700
ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat 2760
atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg 2820
ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatgg cctccgcgac cggctgcaga 2880
acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag 2940
atgcaatagg tcaggctctc gctgaattcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc 3000
gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta 3060
tttacccgca ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg 3120
ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg 3180
acagacgtcg cggtgagttc aggctttccg gatctatcca tcatggtggc tttaccaaca 3240
gtaccggaat gccaagcttt ttgcaaaagc ctaggcctcc aaaaaagcct cctcactact 3300
tctggaatag ctcagaggcc gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa aaaattagtc 3360
agcgatgggg cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta 3420
ggggcgggac tatggttgct gactaattga gatgcagatc gcagatcctc gggacgctct 3480
ggccggtgag gcgtgcgcag tcgttgacgc tctagaccgt gcaaaaggag agcctgtaag 3540
cgggcactct tccgtggtct ggtggataaa ttcgcaaggg tatcatggcg gacgaccggg 3600
gttcgaaccc cggatccggc cgtccgccgt gatccatgcg gttaccgccc gcgtgtcgaa 3660
cccaggtgtg cgacgtcaga caacggggga gcgctccttt tggcttcctt ccaggcgcgg 3720
cggctgctgc gctagctttt ttggccactg gccgcgcgcg gcgtaagcgg ttaggctgga 3780
aagcgaaagc attaagtggc tcgctccctg tagccggagg gttattttcc aagggttgag 3840
tcgcaggacc cccggttcga gtctcgggcc ggccggactg cggcgaacgg gggtttgcct 3900
ccccgtcatg caagaccccg cttgcaaatt cctccggaaa cagggacgag cccctttttt 3960
gcttttccca gatgcatccg gtgctgcggc agatgcgccc ccctcctcag cagcggcaag 4020
agcaagagca gcggcagaca tgcagggcac cctccccttc tcctaccgcg tcaggagggg 4080
caacatccga cgcgtgcatc cataatataa ctgtaccagg ttttggttta ttacatgtga 4140
ctgacggctt cctatgcgtg ctcagaaaac ggcagttggg cactgcactg cccggtgatg 4200
gtgccacggt ggctcctgcc gccttctttg atattcactc tgttgtattt catctcttgt 4260
tgccgatgaa aggatataac agtctctgag gaaatacttg gtatttcttc tgatcagcgt 4320
ttttataagt aatgttgaat attggataag gctgtgtgtc ctttgtcttg ggagacaaag 4380
cccacagcag gtggtggttg ggtggtggca gctcagtgac aggagaggtt tttttgcctg 4440
ttttttttgt tgtttttttt ttttaagtaa ggtgttcttt tttcttagta aaatttctac 4500
tggactgtat gttttgacag gtcagaaaca tttcttcaaa agaagaacct tttggaaact 4560
gtacagccct tttctttcat tccctttttg ctttctgtgc caatgccttt ggttctgatt 4620
gcattatgga aaacgttgat cggaacttga ggtttttatt tatagtgtgg cttgaaagct 4680
tggatagctg ttgttacatg agatacctta ttaagtttag gccagcttga tgctttattt 4740
tttttccttt gaagtagtga gcgttctctg gtttttttcc tttgaaactg gcgaggctta 4800
gatttttcta atgggatttt ttacctgatg atctagttgc atacccaaat gcttgtaaat 4860
gttttcctag ttaacatgtt gataacttcg gatttacatg ttgtatatac ttgtcatctg 4920
tgtttctagt aaaaatatat ggcatttata gaaatacgta attcctgatt tccttttttt 4980
tttatctcta tgctctgtgt gtacaggtca aacagacttc actcctattt ttatttatag 5040
aattttatat gcagtctgtc gttggttctt gtgttgtaag gatacagcct taaatttcct 5100
agagcgatgc tcagtaaggc gggttgtcac atgggttcaa atgtaaaacg ggcacgtttg 5160
ctgctgcctt cccagatcca ggacactaaa ctgcttctgc aactgaggta taaatcgctt 5220
cagatcccag gaagtgtaga tccacgtgca tattcttaaa gaagaatgaa tactttctaa 5280
aatatgttgg cataggaagc aagctgcatg gatttatttg ggacttaaat tattttggta 5340
acggagtgca taggttttaa acacagttgc agcatgctaa cgagtcacag catttatgca 5400
gaagtgatgc ctgttgcagc tgtttacggc actgccttgc agtgagcatt gcagataggg 5460
gtggggtgct ttgtgtcgtg ttgggacacg ctgccacaca gccacctccc gaacatatct 5520
cacctgctgg gtacttttca aaccatctta gcagtagtag atgagttact atgaaacaga 5580
gaagttcctc agttggatat tctcatggga tgtctttttt cccatgttgg gcaaagtatg 5640
ataaagcatc tctatttgta aattatgcac ttgttagttc ctgaatcctt tctatagcac 5700
cacttattgc agcaggtgta ggctctggtg tggcctgtgt ctgtgcttca atcttttaag 5760
cttacgcgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 5820
gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 5880
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 5940
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 6000
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 6060
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 6120
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 6180
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 6240
agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 6300
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta 6360
gtgaaccgtc agatcctctt ccgcatcgct gtctgcgagg gccagctgtt ggggtgagta 6420
ctccctctca aaagcgggca tgacttctgc gctaagaatg tcagtttcca aaaacgagga 6480
ggatttgata ttcactggcc cgcggtgatg cctttgaggg tggccgcgtc catctggtca 6540
gaaaagacaa tctttttgtt gtcaagcttc cttgatgatg tcatacttat cctgtccctt 6600
ttttttccac agctcgcggt tgaggacaaa ctcttcgcgg tctttccagt actcttggat 6660
cggaaacccg tcggcctccg aacggtactc cgccaccgag ggacctgagc gagtccgcat 6720
cgaccggatc ggaaaacctc tcgacgtacc aattaattcg ctgtctgcga gggccagctg 6780
ttggggtgag tactccctct caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc 6840
caaaaacgag gaggatttga tattcacctg gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc 6900
gtccatctgg tcagaaaaga caatcttttt gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga 6960
gatctggcca tacacttgag tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc 7020
cactcccagg tccaactgca ggtcgagcat gcatctaggg cgcccgcact agaggctcga 7080
gccatggctc cagtggctgt gtgggctgct ctggctgtgg gcctggaact gtgggccgct 7140
gctcacgctc tgcctgctca ggtggccttc accccttatg cccctgagcc tggctccacc 7200
tgcaggctgc gggagtacta cgaccagacc gcccagatgt gctgctccaa gtgctctcct 7260
ggccagcacg ccaaggtgtt ctgcaccaag acctccgaca ccgtgtgcga ctcttgcgag 7320
gactccacct acacccagct ctggaactgg gtgcccgagt gcctgtcctg cggctccaga 7380
tgctcctccg accaggtgga gacacaggcc tgtacacggg agcagaatcg gatttgcaca 7440
tgcaggcctg gctggtactg cgccctgtcc aagcaggaag gatgcaggct gtgcgcccct 7500
ctgaggaagt gcagacctgg cttcggcgtg gctaggcctg gcaccgagac atccgacgtc 7560
gtgtgcaagc cttgtgcccc tggcaccttc tccaacacca catcctccac cgacatctgc 7620
cggcctcacc agatctgcaa cgtggtggcc atccctggca acgccagcat ggacgccgtg 7680
tgcacctcca cctcccccac cagatctatg gcccctggcg ccgtgcatct gcctcagcct 7740
gtgtccaccc ggtcccagca tacccagcct acacctgagc cctctaccgc cccttctacc 7800
tccttcctgc tgcctatggg cccttctcct ccagctgagg gctctaccgg cgacgagcct 7860
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggaggc 7920
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 7980
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 8040
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 8100
tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 8160
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 8220
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacaccc tgcctccttc ccgggaggag 8280
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaagg gcttctaccc ctccgatatc 8340
gccgtggaat gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 8400
ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 8460
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 8520
cagaagagct tatccctgtc tcctggcaag tgataagcgg ccgcccgctg atcagcctcg 8580
actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 8640
ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 8700
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 8760
tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa 8820
agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacggagctc gcatccataa tataactgta 8880
ccaggttttg gtttattaca tgtgactgac ggcttcctat gcgtgctcag aaaacggcag 8940
ttgggcactg cactctgttg acttggtatt gtgtcctttg gtgacaggag tcttttttct tcaaaagaag tgtgccaatg ttatttatag tttaggccag tttcctttga gttgcatacc acatgttgta acgtaattcc acttcactcc gtaaggatac ttcaaatgta tctgcaactg ttaaagaaga atttgggact gctaacgagt cttgcagtga acacagccac agtagatgag tttttcccat agttcctgaa tgtgtctgtg tccttcaatt acgtcgtgac tttcgccagc gcagcctgaa tcttttgatt cactgcccgg tatttcatct tcttctgatc tcttgggaga aggttttttt tagtaaaatt aaccttttgg cctttggttc tgtggcttga cttgatgctt aactggcgag caaatgcttg tatacttgtc tgatttcctt tatttttatt agccttaaat aaacgggcac aggtataaat atgaatactt taaattattt cacagcattt gcattgcaga ctcccgaaca ttactatgaa gttgggcaaa tcctttctat cttcaatctt cgccctatag tgggaaaacc tggcgtaata tggcgaatgg tataagggat tgatggtgcc cttgttgccg agcgttttta caaagcccac gcctgttttt tctactggac aaactgtaca tgattgcatt aagcttggat
tatttttttt
gcttagattt taaatgtttt atctgtgttt
ttttttttat
tatagaattt ttcctagagc gtttgctgct cgcttcagat tctaaaatat tggtaacgga atgcagaagt taggggtggg tatctcacct acagagaagt gtatgataaa agcaccactt ttaagcttga tgagtcgtat ctggcgttac gcgaagaggc gagcgccctg tttgccgatt acggtggctc atgaaaggat taagtaatgt agcaggtggt tttgttgttt tgtatgtttt gcccttttct atggaaaacg agctgttgtt cctttgaagt ttctaatggg cctagttaac ctagtaaaaa ctctatgctc tatatgcagt gatgctcagt gccttcccag cccaggaagt gttggcatag gtgcataggt gatgcctgtt gtgctttgtg gctgggtact tcctcagttg gcatctctat attgcagcag gctcatggcg tacgtcgcgc ccaacttaat ccgcaccgaa tagcggccac tcggcctatt ctgccgcctt ataacagtct tgaatattgg ggttgggtgg
ttttttttta
gacaggtcag ttcattccct ttgatcggaa acatgagata agtgagcgtt attttttacc atgttgataa tatatggcat tgtgtgtaca ctgtcgttgg aaggcgggtt atccaggaca gtagatccac gaagcaagct tttaaacaca gcagctgttt tcgtgttggg tttcaaacca gatattctca ttgtaaatta gtgtaggctc cgcctaggcc tcactggccg cgccttgcag acgcccttcc tcaaccctat ggttaaaaaa ctttgatatt ctgaggaaat ataaggctgt tggcagctca agtaaggtgt aaacatttct ttttgctttc cttgaggttt ccttattaag ctctggtttt tgatgatcta cttcggattt ttatagaaat ggtcaaacag ttcttgtgtt gtcacatggg ctaaactgct gtgcatattc gcatggattt gttgcagcat acggcactgc acacgctgcc tcttagcagt tgggatgtct tgcacttgtt tggtgtggcc ttgacggcct tcgttttaca cacatccccc caacagttgc ctcggtctat tgagctgatt
9000 9060 9120 9180 9240 9300 9360 9420 9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380 10440 10500 10560 10620 10680 10740 10800 10860
taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta g 10911
<210> 13 <211> 116 <212>
БЕЛОК
<213> Искусственный
<220>
<223> FSH альфа <400> 13
Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro
20 25 30
Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro
35 40 45
Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro
50 55 60
Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu
65 70 75 80
Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly
85 90 95
Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr
100 105 110
Tyr His Lys Ser
115
<210> 14 <211> 599
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> IRES <400> 14
gcggccgcgc cgcactagag gaattccgcc cctctccccc cccccctaac gttactggcc 60 gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc accatattgc 120 cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta 180 ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag 240
ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga 300
accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg
360
caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat
420
ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta
480
tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa
540
aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataa
599
<212> БЕЛОК <213> Искусственный
<223> FSH бета
<400> 15
Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile
1 5 10 15
Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys
20 25 30
Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly
35 40 45
Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys
50 55 60
Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg
65 70 75 80
Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val
85 90 95
Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys
100 105 110
Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys
115 120 125
Glu
<211> 10801
<212> ДНК
<213> Искусственная
<223> pZRC III- FSH альфа- IRES- FSH бета- Hyg
<400> 16
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120
ggaagagtat gattgaacag gatggcctgc atgcgggtag cccggcagcg tgggtggaac 180
gtctgtttgg ctatgattgg gcgcagcaga ccattggctg ctctgatgcg gcggtgtttc 240
gtctgagcgc gcagggtcgt ccggtgctgt ttgtgaaaac cgatctgagc ggtgcgctga 300
acgagctgca ggatgaagcg gcgcgtctga gctggctggc caccaccggt gttccgtgtg 360
cggcggtgct ggatgtggtg accgaagcgg gccgtgattg gctgctgctg ggcgaagtgc 420
cgggtcagga tctgctgtct agccatctgg cgccggcaga aaaagtgagc attatggcgg 480
atgccatgcg tcgtctgcat accctggacc cggcgacctg tccgtttgat catcaggcga 540
aacatcgtat tgaacgtgcg cgtacccgta tggaagcggg cctggtggat caggatgatc 600
tggatgaaga acatcagggc ctggcaccgg cagagctgtt tgcgcgtctg aaagcgagca 660
tgccggatgg cgaagatctg gtggtgaccc atggtgatgc gtgcctgccg aacattatgg 720
tggaaaatgg ccgttttagc ggctttattg attgcggccg tctgggcgtg gcggatcgtt 780
atcaggatat tgcgctggcc acccgtgata ttgcggaaga actgggcggc gaatgggcgg 840
atcgttttct ggtgctgtat ggcattgcgg caccggatag ccagcgtatt gcgttttatc 900
gtctgctgga tgaatttttc taataactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 960
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1020
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1080
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1140
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1200
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1260
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1320
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1380
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1440
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1500
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1560
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1620
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1680
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1740
attaggcacc ccaggcttta cccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 1800
ggagagcgcc caatacgcaa ggaaacagct atgaccatgt taatgcagct ggcacgacag 1860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgaaag gaaggcccat gaggccagtt aattaagagg 1920
atccttatcg attttaccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 1980
ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca 2040
gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 2100
tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgctcg 2160
aagcggccgg ccgccccgac tctagactat tcctttgccc tcggacgagt gctggggcgt 2220
cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg 2280
cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga 2340
ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca 2400
agaccaatgc ggagcatata cgcccggagc cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc 2460
cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg 2520
ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt 2580
atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg 2640
acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca 2700
ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat 2760
atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg 2820
ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatgg cctccgcgac cggctgcaga 2880
acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag 2940
atgcaatagg tcaggctctc gctgaattcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc 3000
gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta 3060
tttacccgca ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg 3120
ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg 3180
acagacgtcg cggtgagttc aggctttccg gatctatcca tcatggtggc tttaccaaca 3240
gtaccggaat gccaagcttt ttgcaaaagc ctaggcctcc aaaaaagcct cctcactact 3300
tctggaatag ctcagaggcc gaggcggcct cggcctctgc ataaataaaa aaaattagtc 3360
agcgatgggg cggagaatgg gcggaactgg gcggagttag gggcgggatg ggcggagtta 3420
ggggcgggac tatggttgct gactaattga gatgcagatc gcagatcctc gggacgctct 3480
ggccggtgag gcgtgcgcag tcgttgacgc tctagaccgt gcaaaaggag agcctgtaag 3540
cgggcactct tccgtggtct ggtggataaa ttcgcaaggg tatcatggcg gacgaccggg 3600
gttcgaaccc cggatccggc cgtccgccgt gatccatgcg gttaccgccc gcgtgtcgaa 3660
cccaggtgtg cgacgtcaga caacggggga gcgctccttt tggcttcctt ccaggcgcgg 3720
cggctgctgc gctagctttt ttggccactg gccgcgcgcg gcgtaagcgg ttaggctgga 3780
aagcgaaagc attaagtggc tcgctccctg tagccggagg gttattttcc aagggttgag 3840
tcgcaggacc cccggttcga gtctcgggcc ggccggactg cggcgaacgg gggtttgcct 3900
ccccgtcatg caagaccccg cttgcaaatt cctccggaaa cagggacgag cccctttttt 3960
gcttttccca gatgcatccg gtgctgcggc agatgcgccc ccctcctcag cagcggcaag 4020
agcaagagca gcggcagaca tgcagggcac cctccccttc tcctaccgcg tcaggagggg 4080
caacatccga cgcgtgcatc cataatataa ctgtaccagg ttttggttta ttacatgtga 4140
ctgacggctt cctatgcgtg ctcagaaaac ggcagttggg cactgcactg cccggtgatg 4200
gtgccacggt ggctcctgcc gccttctttg atattcactc tgttgtattt catctcttgt 4260
tgccgatgaa aggatataac agtctctgag gaaatacttg gtatttcttc tgatcagcgt 4320
ttttataagt aatgttgaat attggataag gctgtgtgtc ctttgtcttg ggagacaaag 4380
cccacagcag gtggtggttg ggtggtggca gctcagtgac aggagaggtt tttttgcctg 4440
ttttttttgt tgtttttttt ttttaagtaa ggtgttcttt tttcttagta aaatttctac 4500
tggactgtat gttttgacag gtcagaaaca tttcttcaaa agaagaacct tttggaaact 4560
gtacagccct tttctttcat tccctttttg ctttctgtgc caatgccttt ggttctgatt 4620
gcattatgga aaacgttgat cggaacttga ggtttttatt tatagtgtgg cttgaaagct 4680
tggatagctg ttgttacatg agatacctta ttaagtttag gccagcttga tgctttattt 4740
tttttccttt gaagtagtga gcgttctctg gtttttttcc tttgaaactg gcgaggctta 4800
gatttttcta atgggatttt ttacctgatg atctagttgc atacccaaat gcttgtaaat 4860
gttttcctag ttaacatgtt gataacttcg gatttacatg ttgtatatac ttgtcatctg 4920
tgtttctagt aaaaatatat ggcatttata gaaatacgta attcctgatt tccttttttt 4980
tttatctcta tgctctgtgt gtacaggtca aacagacttc actcctattt ttatttatag 5040
aattttatat gcagtctgtc gttggttctt gtgttgtaag gatacagcct taaatttcct 5100
agagcgatgc tcagtaaggc gggttgtcac atgggttcaa atgtaaaacg ggcacgtttg 5160
ctgctgcctt cccagatcca ggacactaaa ctgcttctgc aactgaggta taaatcgctt 5220
cagatcccag gaagtgtaga tccacgtgca tattcttaaa gaagaatgaa tactttctaa 5280
aatatgttgg cataggaagc aagctgcatg gatttatttg ggacttaaat tattttggta 5340
acggagtgca taggttttaa acacagttgc agcatgctaa cgagtcacag catttatgca 5400
gaagtgatgc ctgttgcagc tgtttacggc actgccttgc agtgagcatt gcagataggg 5460
gtggggtgct ttgtgtcgtg ttgggacacg ctgccacaca gccacctccc gaacatatct 5520
cacctgctgg gtacttttca aaccatctta gcagtagtag atgagttact atgaaacaga 5580
gaagttcctc agttggatat tctcatggga tgtctttttt cccatgttgg gcaaagtatg 5640
ataaagcatc tctatttgta aattatgcac ttgttagttc ctgaatcctt tctatagcac 5700
cacttattgc agcaggtgta ggctctggtg tggcctgtgt ctgtgcttca atcttttaag 5760
cttacgcgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta 5820
gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 5880
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 5940
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 6000
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 6060
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 6120
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 6180
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 6240
agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 6300
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta 6360
gtgaaccgtc agatcctctt ccgcatcgct gtctgcgagg gccagctgtt ggggtgagta 6420
ctccctctca aaagcgggca tgacttctgc gctaagaatg tcagtttcca aaaacgagga 6480
ggatttgata ttcactggcc cgcggtgatg cctttgaggg tggccgcgtc catctggtca 6540
gaaaagacaa tctttttgtt gtcaagcttc cttgatgatg tcatacttat cctgtccctt 6600
ttttttccac agctcgcggt tgaggacaaa ctcttcgcgg tctttccagt actcttggat 6660
cggaaacccg tcggcctccg aacggtactc cgccaccgag ggacctgagc gagtccgcat 6720
cgaccggatc ggaaaacctc tcgacgtacc aattaattcg ctgtctgcga gggccagctg 6780
ttggggtgag tactccctct caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc 6840
caaaaacgag gaggatttga tattcacctg gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc 6900
gtccatctgg tcagaaaaga caatcttttt gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga 6960
gatctggcca tacacttgag tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc 7020
cactcccagg tccaactgca ggtcgagcat gcatctaggg cgcccgcact agaggctcga 7080
gccaccatgg actactaccg gaagtacgcc gccatcttcc tggtgaccct gtccgtgttc 7140
ctgcacgtgc tgcactctgc ccctgacgtg caggactgcc ctgagtgcac cctgcaggaa 7200
aacccattct tcagccagcc tggcgcccct atcctgcagt gcatgggctg ctgcttctcc 7260
agagcctacc ctacccctct gcggtccaag aaaaccatgc tggtgcagaa aaacgtgacc 7320
tccgagtcta cctgctgcgt ggccaagtcc tacaacagag tgaccgtgat gggcggcttc 7380
aaggtggaga accacaccgc ctgccactgc tctacctgct actaccacaa gtcctgatga 7440
gcggccgcgc cgcactagag gaattccgcc cctctccccc cccccctaac gttactggcc 7500
gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc accatattgc 7560
cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta 7620
ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag 7680
ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga 7740
accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc acgtgtataa gatacacctg 7800
caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat 7860
ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta 7920
tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg tgtttagtcg aggttaaaaa 7980
aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataac 8040
ccgggccacc atgaagaccc tgcagttctt cttcctgttc tgctgctgga aggccatctg 8100
ctgcaactct tgcgagctga ccaacatcac aatcgccatc gagaaagagg aatgccggtt 8160
ctgcatctcc atcaacacca cttggtgcgc cggctactgc tacacccgcg acctggtgta 8220
caaggaccct gcccggccta agatccagaa aacctgcacc ttcaaagaac tggtgtacga 8280
gacagtgcgg gtgccaggct gcgctcacca cgccgactcc ctgtacacct accctgtggc 8340
cacccagtgc cactgcggca agtgcgactc cgactccacc gactgtaccg tgcggggcct 8400
gggcccttct tactgctcct tcggcgagat gaaggaatga tgaccagcgg ccgcccgctg 8460
atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 8520
ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 8580
atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa 8640
gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc 8700
tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacggagctc gcatccataa 8760
tataactgta ccaggttttg gtttattaca tgtgactgac ggcttcctat gcgtgctcag 8820
aaaacggcag ttgggcactg cactgcccgg tgatggtgcc acggtggctc ctgccgcctt 8880
ctttgatatt cactctgttg tatttcatct cttgttgccg atgaaaggat ataacagtct 8940
ctgaggaaat acttggtatt tcttctgatc agcgttttta taagtaatgt tgaatattgg 9000
ataaggctgt gtgtcctttg tcttgggaga caaagcccac agcaggtggt ggttgggtgg 9060
tggcagctca gtgacaggag aggttttttt gcctgttttt tttgttgttt ttttttttta 9120
agtaaggtgt tcttttttct tagtaaaatt tctactggac tgtatgtttt gacaggtcag 9180
aaacatttct tcaaaagaag aaccttttgg aaactgtaca gcccttttct ttcattccct 9240
ttttgctttc tgtgccaatg cctttggttc tgattgcatt atggaaaacg ttgatcggaa 9300
cttgaggttt ttatttatag tgtggcttga aagcttggat agctgttgtt acatgagata 9360
ccttattaag tttaggccag cttgatgctt tatttttttt cctttgaagt agtgagcgtt 9420
ctctggtttt tttcctttga aactggcgag gcttagattt ttctaatggg attttttacc 9480
tgatgatcta gttgcatacc caaatgcttg taaatgtttt cctagttaac atgttgataa 9540
cttcggattt acatgttgta tatacttgtc atctgtgttt ctagtaaaaa tatatggcat 9600
ttatagaaat acgtaattcc tgatttcctt ttttttttat ctctatgctc tgtgtgtaca 9660
ggtcaaacag acttcactcc tatttttatt tatagaattt tatatgcagt ctgtcgttgg 9720
ttcttgtgtt gtaaggatac agccttaaat ttcctagagc gatgctcagt aaggcgggtt 9780
gtcacatggg ttcaaatgta aaacgggcac gtttgctgct gccttcccag atccaggaca 9840
ctaaactgct tctgcaactg aggtataaat cgcttcagat cccaggaagt gtagatccac 9900
gtgcatattc ttaaagaaga atgaatactt tctaaaatat gttggcatag gaagcaagct 9960
gcatggattt atttgggact taaattattt tggtaacgga gtgcataggt tttaaacaca 10020
gttgcagcat gctaacgagt cacagcattt atgcagaagt gatgcctgtt gcagctgttt 10080
acggcactgc cttgcagtga gcattgcaga taggggtggg gtgctttgtg tcgtgttggg 10140
acacgctgcc acacagccac ctcccgaaca tatctcacct gctgggtact tttcaaacca 10200
tcttagcagt agtagatgag ttactatgaa acagagaagt tcctcagttg gatattctca 10260
tgggatgtct tttttcccat gttgggcaaa gtatgataaa gcatctctat ttgtaaatta 10320
tgcacttgtt agttcctgaa tcctttctat agcaccactt attgcagcag gtgtaggctc 10380
tggtgtggcc tgtgtctgtg cttcaatctt ttaagcttga gctcatggcg cgcctaggcc 10440
ttgacggcct tccttcaatt cgccctatag tgagtcgtat tacgtcgcgc tcactggccg 10500
tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 10560
cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgaa acgcccttcc 10620
caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gagcgccctg tagcggccac tcaaccctat 10680
ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa 10740
tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta 10800
g 10801
<210> 17 <211> 10710
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> pZRC III- TNK- Puro
<400> 17
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120
ggaagagtat gattgaacag gatggcctgc atgcgggtag cccggcagcg tgggtggaac 180
gtctgtttgg ctatgattgg gcgcagcaga ccattggctg ctctgatgcg gcggtgtttc 240
gtctgagcgc gcagggtcgt ccggtgctgt ttgtgaaaac cgatctgagc ggtgcgctga 300
acgagctgca ggatgaagcg gcgcgtctga gctggctggc caccaccggt gttccgtgtg 360
cggcggtgct ggatgtggtg accgaagcgg gccgtgattg gctgctgctg ggcgaagtgc 420
cgggtcagga tctgctgtct agccatctgg cgccggcaga aaaagtgagc attatggcgg 480
atgccatgcg tcgtctgcat accctggacc cggcgacctg tccgtttgat catcaggcga 540
aacatcgtat tgaacgtgcg cgtacccgta tggaagcggg cctggtggat caggatgatc 600
tggatgaaga acatcagggc ctggcaccgg cagagctgtt tgcgcgtctg aaagcgagca 660
tgccggatgg cgaagatctg gtggtgaccc atggtgatgc gtgcctgccg aacattatgg 720
tggaaaatgg ccgttttagc ggctttattg attgcggccg tctgggcgtg gcggatcgtt 780
atcaggatat tgcgctggcc acccgtgata ttgcggaaga actgggcggc gaatgggcgg 840
atcgttttct ggtgctgtat ggcattgcgg caccggatag ccagcgtatt gcgttttatc 900
gtctgctgga tgaatttttc taataactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 960
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1020
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1080
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1140
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1200
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1260
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1320
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1380
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1440
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1500
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1560
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1620
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1680
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1740
attaggcacc ccaggcttta cccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 1800
ggagagcgcc caatacgcaa ggaaacagct atgaccatgt taatgcagct ggcacgacag 1860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgaaag gaaggcccat gaggccagtt aattaagagg 1920
taccggatct gcgatctgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg 1980
cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatcg ctgactaatt 2040
ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga 2100
ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg gcattccggt actgttggta 2160
aagccaccat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtccccc 2220
gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg 2280
acccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg 2340
ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca 2400
cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt 2460
tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc 2520
ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg 2580
gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg 2640
ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg 2700
tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg 2760
gtgcctgatc tagctagagt cggggcggcc ggccgcttcg agcagacatg ataagataca 2820
ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa 2880
tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca 2940
acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca 3000
agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcg ataaggatcc tcgggacgct ctggccggtg 3060
aggcgtgcgc agtcgttgac gctctagacc gtgcaaaagg agagcctgta agcgggcact 3120
cttccgtggt ctggtggata aattcgcaag ggtatcatgg cggacgaccg gggttcgaac 3180
cccagatccg gccgtccgcc gtgatccatg cggttaccgc ccgcgtgtcg aacccaggtg 3240
tgcgacgtca gacaacgggg gagcgctcct tttggcttcc ttccaggcgc ggcggctgct 3300
gcgctagctt ttttggccac tggccgcgcg cggcgtaagc ggttaggctg gaaagcgaaa 3360
gcattaagtg gctcgctccc tgtagccgga gggttatttt ccaagggttg agtcgcagga 3420
cccccggttc gagtctcggg ccggccggac tgcggcgaac gggggtttgc ctccccgtca 3480
tgcaagaccc cgcttgcaaa ttcctccgga aacagggacg agcccctttt ttgcttttcc 3540
cagatgcatc cggtgctgcg gcagatgcgc ccccctcctc agcagcggca agagcaagag 3600
cagcggcaga catgcagggc accctcccct tctcctaccg cgtcaggagg ggcaacatcc 3660
gacgcgtgca tccataatat aactgtacca ggttttggtt tattacatgt gactgacggc 3720
ttcctatgcg tgctcagaaa acggcagttg ggcactgcac tgcccggtga tggtgccacg 3780
gtggctcctg ccgccttctt tgatattcac tctgttgtat ttcatctctt gttgccgatg 3840
aaaggatata acagtctctg aggaaatact tggtatttct tctgatcagc gtttttataa 3900
gtaatgttga atattggata aggctgtgtg tcctttgtct tgggagacaa agcccacagc 3960
aggtggtggt tgggtggtgg cagctcagtg acaggagagg tttttttgcc tgtttttttt 4020
gttgtttttt ttttttaagt aaggtgttct tttttcttag taaaatttct actggactgt 4080
atgttttgac aggtcagaaa catttcttca aaagaagaac cttttggaaa ctgtacagcc 4140
cttttctttc attccctttt tgctttctgt gccaatgcct ttggttctga ttgcattatg 4200
gaaaacgttg atcggaactt gaggttttta tttatagtgt ggcttgaaag cttggatagc 4260
tgttgttaca tgagatacct tattaagttt aggccagctt gatgctttat tttttttcct 4320
ttgaagtagt gagcgttctc tggttttttt cctttgaaac tggcgaggct tagatttttc 4380
taatgggatt ttttacctga tgatctagtt gcatacccaa atgcttgtaa atgttttcct 4440
agttaacatg ttgataactt cggatttaca tgttgtatat acttgtcatc tgtgtttcta 4500
gtaaaaatat atggcattta tagaaatacg taattcctga tttccttttt tttttatctc 4560
tatgctctgt gtgtacaggt caaacagact tcactcctat ttttatttat agaattttat 4620
atgcagtctg tcgttggttc ttgtgttgta aggatacagc cttaaatttc ctagagcgat 4680
gctcagtaag gcgggttgtc acatgggttc aaatgtaaaa cgggcacgtt tgctgctgcc 4740
ttcccagatc caggacacta aactgcttct gcaactgagg tataaatcgc ttcagatccc 4800
aggaagtgta gatccacgtg catattctta aagaagaatg aatactttct aaaatatgtt 4860
ggcataggaa gcaagctgca tggatttatt tgggacttaa attattttgg taacggagtg 4920
cataggtttt aaacacagtt gcagcatgct aacgagtcac agcatttatg cagaagtgat 4980
gcctgttgca gctgtttacg gcactgcctt gcagtgagca ttgcagatag gggtggggtg 5040
ctttgtgtcg tgttgggaca cgctgccaca cagccacctc ccgaacatat ctcacctgct 5100
gggtactttt caaaccatct tagcagtagt agatgagtta ctatgaaaca gagaagttcc 5160
tcagttggat attctcatgg gatgtctttt ttcccatgtt gggcaaagta tgataaagca 5220
tctctatttg taaattatgc acttgttagt tcctgaatcc tttctatagc accacttatt 5280
gcagcaggtg taggctctgg tgtggcctgt gtctgtgctt caatctttta agcttacgcg 5340
ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 5400
cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 5460
caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 5520
gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 5580
tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 5640
ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 5700
attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 5760
gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 5820
ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 5880
aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg 5940
tcagatcctc ttccgcatcg ctgtctgcga gggccagctg ttggggtgag tactccctct 6000
caaaagcggg catgacttct gcgctaagaa tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga 6060
tattcactgg cccgcggtga tgcctttgag ggtggccgcg tccatctggt cagaaaagac 6120
aatctttttg ttgtcaagct tccttgatga tgtcatactt atcctgtccc ttttttttcc 6180
acagctcgcg gttgaggaca aactcttcgc ggtctttcca gtactcttgg atcggaaacc 6240
cgtcggcctc cgaacggtac tccgccaccg agggacctga gcgagtccgc atcgaccgga 6300
tcggaaaacc tctcgacgta ccaattaatt cgctgtctgc gagggccagc tgttggggtg 6360
agtactccct ctcaaaagcg ggcatgactt ctgcgctaag attgtcagtt tccaaaaacg 6420
aggaggattt gatattcacc tggcccgcgg tgatgccttt gagggtggcc gcgtccatct 6480
ggtcagaaaa gacaatcttt ttgttgtcaa gcttgaggtg tggcaggctt gagatctggc 6540
catacacttg agtgacaatg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca 6600
ggtccaactg caggtcgagc atgcatctag ggcgcccgca ctagaggctc gaggaattcc 6660
accatggacg ccatgaagcg gggactgtgc tgtgtgctgc tgctgtgtgg cgccgtgttc 6720
gtgtccccta gccaggaaat ccacgcccgg ttcagaaggg gcgccaggtc ctaccaagtt 6780
atctgccggg acgaaaagac ccagatgatc taccagcagc accagtcctg gctgcggccc 6840
gtgctgcggt ccaaccgggt ggagtactgc tggtgcaact ccggcagagc ccagtgccac 6900
tccgtgcctg tgaagtcctg ctccgagcct agatgcttca acggcggcac ctgtcagcag 6960
gccctgtact tctccgactt cgtgtgccag tgccctgagg gcttcgccgg caagtgctgc 7020
gagatcgaca cccgggccac ctgttacgag gaccagggca tctcctaccg gggcaactgg 7080
tctaccgccg agtctggcgc cgagtgcacc aactggcagt cctccgccct ggcccagaag 7140
ccttactctg gcagacggcc tgacgccatc agactgggcc tgggcaacca caactactgc 7200
cggaaccctg accgggactc caagccttgg tgctacgtgt tcaaggccgg caagtactcc 7260
tccgagttct gctccacccc tgcctgctct gagggcaact ccgactgcta cttcggcaac 7320
ggctccgcct acagaggcac ccactccctg accgagtccg gcgcctcttg cctgccttgg 7380
aactccatga tcctgatcgg caaggtgtac accgcccaga acccttccgc tcaggccctg 7440
ggactcggaa agcacaatta ttgtcgcaat cccgacggcg acgccaaacc ttggtgtcac 7500
gtgctgaaga accggcggct gacatgggaa tactgcgacg tgccttcctg ctctacctgc 7560
ggcctgcggc agtactccca gcctcagttc cggatcaagg gcggcctgtt cgccgatatc 7620
gcctcccacc cttggcaggc cgccatcttc gccgctgctg ccgcttctcc tggcgagaga 7680
ttcctgtgcg gcggcatcct gatctccagc tgctggattc tgtctgccgc ccactgcttc 7740
caggaacggt tccctcctca ccacctgacc gtgatcctgg gccggaccta cagagtcgtg 7800
cccggcgagg aagaacagaa attcgaggtg gagaagtata tcgtgcacaa agagttcgac 7860
gacgacacct acgacaacga tatcgccctg ctgcagctga agtccgactc ctccagatgc 7920
gcccaggaat cctccgtcgt tcggaccgtg tgtctgccac ctgccgacct gcagctgcct 7980
gactggaccg agtgcgagct gtccggctac ggcaagcacg aggccctgtc ccccttctac 8040
tccgagcggc tgaaagaagc tcatgtacgg ctgtacccct ctagccggtg cacctcccag 8100
catctgctga accggaccgt gaccgacaac atgctgtgtg ccggcgacac cagatctggc 8160
ggccctcagg ccaacctgca cgacgcctgc cagggcgata gtggcggacc tctcgtgtgc 8220
ctcaacgacg gcaggatgac cctcgtgggc atcatctctt ggggcctggg ctgtggccag 8280
aaagacgtgc ctggcgtgta caccaaagtg accaactacc tggactggat cagggacaac 8340
atgcggcctt gatgagcggc cgcccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 8400
ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 8460
gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 8520
ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat 8580
gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg 8640
gggtatcccc acggagctcg catccataat ataactgtac caggttttgg tttattacat 8700
gtgactgacg gcttcctatg cgtgctcaga aaacggcagt tgggcactgc actgcccggt 8760
gatggtgcca cggtggctcc tgccgccttc tttgatattc actctgttgt atttcatctc 8820
ttgttgccga tgaaaggata taacagtctc tgaggaaata cttggtattt cttctgatca 8880
gcgtttttat aagtaatgtt gaatattgga taaggctgtg tgtcctttgt cttgggagac 8940
aaagcccaca gcaggtggtg gttgggtggt ggcagctcag tgacaggaga ggtttttttg 9000
cctgtttttt ttgttgtttt ttttttttaa gtaaggtgtt cttttttctt agtaaaattt 9060
ctactggact gtatgttttg acaggtcaga aacatttctt caaaagaaga accttttgga 9120
aactgtacag cccttttctt tcattccctt tttgctttct gtgccaatgc ctttggttct 9180
gattgcatta tggaaaacgt tgatcggaac ttgaggtttt tatttatagt gtggcttgaa 9240
agcttggata gctgttgtta catgagatac cttattaagt ttaggccagc ttgatgcttt 9300
attttttttc ctttgaagta gtgagcgttc tctggttttt ttcctttgaa actggcgagg 9360
cttagatttt tctaatggga ttttttacct gatgatctag ttgcataccc aaatgcttgt 9420
aaatgttttc ctagttaaca tgttgataac ttcggattta catgttgtat atacttgtca 9480
tctgtgtttc tagtaaaaat atatggcatt tatagaaata cgtaattcct gatttccttt 9540
tttttttatc tctatgctct gtgtgtacag gtcaaacaga cttcactcct atttttattt 9600
atagaatttt atatgcagtc tgtcgttggt tcttgtgttg taaggataca gccttaaatt 9660
tcctagagcg atgctcagta aggcgggttg tcacatgggt tcaaatgtaa aacgggcacg 9720
tttgctgctg ccttcccaga tccaggacac taaactgctt ctgcaactga ggtataaatc 9780
gcttcagatc ccaggaagtg tagatccacg tgcatattct taaagaagaa tgaatacttt 9840
ctaaaatatg ttggcatagg aagcaagctg catggattta tttgggactt aaattatttt 9900
ggtaacggag tgcataggtt ttaaacacag ttgcagcatg ctaacgagtc acagcattta 9960
tgcagaagtg atgcctgttg cagctgttta cggcactgcc ttgcagtgag cattgcagat 10020
aggggtgggg tgctttgtgt cgtgttggga cacgctgcca cacagccacc tcccgaacat 10080
atctcacctg ctgggtactt ttcaaaccat cttagcagta gtagatgagt tactatgaaa 10140
cagagaagtt cctcagttgg atattctcat gggatgtctt ttttcccatg ttgggcaaag 10200
tatgataaag catctctatt tgtaaattat gcacttgtta gttcctgaat cctttctata 10260
gcaccactta ttgcagcagg tgtaggctct ggtgtggcct gtgtctgtgc ttcaatcttt 10320
taagcttgag ctcatggcgc gcctaggcct tgacggcctt ccttcaattc gccctatagt 10380
gagtcgtatt acgtcgcgct cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc 10440
tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag 10500
cgaagaggcc cgcaccgaaa cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg 10560
agcgccctgt agcggccact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt 10620
ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 10680
tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag 10710
<210> 18 <211> 9595
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> pZRC III- DARBE- Puro
<400> 18
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120
ggaagagtat gattgaacag gatggcctgc atgcgggtag cccggcagcg tgggtggaac 180
gtctgtttgg ctatgattgg gcgcagcaga ccattggctg ctctgatgcg gcggtgtttc 240
gtctgagcgc gcagggtcgt ccggtgctgt ttgtgaaaac cgatctgagc ggtgcgctga 300
acgagctgca ggatgaagcg gcgcgtctga gctggctggc caccaccggt gttccgtgtg 360
cggcggtgct ggatgtggtg accgaagcgg gccgtgattg gctgctgctg ggcgaagtgc 420
cgggtcagga tctgctgtct agccatctgg cgccggcaga aaaagtgagc attatggcgg 480
atgccatgcg tcgtctgcat accctggacc cggcgacctg tccgtttgat catcaggcga 540
aacatcgtat tgaacgtgcg cgtacccgta tggaagcggg cctggtggat caggatgatc 600
tggatgaaga acatcagggc ctggcaccgg cagagctgtt tgcgcgtctg aaagcgagca 660
tgccggatgg cgaagatctg gtggtgaccc atggtgatgc gtgcctgccg aacattatgg 720
tggaaaatgg ccgttttagc ggctttattg attgcggccg tctgggcgtg gcggatcgtt 780
atcaggatat tgcgctggcc acccgtgata ttgcggaaga actgggcggc gaatgggcgg 840
atcgttttct ggtgctgtat ggcattgcgg caccggatag ccagcgtatt gcgttttatc 900
gtctgctgga tgaatttttc taataactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 960
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1020
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1080
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1140
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1200
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1260
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1320
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1380
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1440
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1500
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1560
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1620
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1680
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1740
attaggcacc ccaggcttta cccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 1800
ggagagcgcc caatacgcaa ggaaacagct atgaccatgt taatgcagct ggcacgacag 1860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgaaag gaaggcccat gaggccagtt aattaagagg 1920
taccggatct gcgatctgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg 1980
cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatcg ctgactaatt 2040
ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga 2100
ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg gcattccggt actgttggta 2160
aagccaccat gaccgagtac aagcccacgg tgcgcctcgc cacccgcgac gacgtccccc 2220
gggccgtacg caccctcgcc gccgcgttcg ccgactaccc cgccacgcgc cacaccgtcg 2280
acccggaccg ccacatcgag cgggtcaccg agctgcaaga actcttcctc acgcgcgtcg 2340
ggctcgacat cggcaaggtg tgggtcgcgg acgacggcgc cgcggtggcg gtctggacca 2400
cgccggagag cgtcgaagcg ggggcggtgt tcgccgagat cggcccgcgc atggccgagt 2460
tgagcggttc ccggctggcc gcgcagcaac agatggaagg cctcctggcg ccgcaccggc 2520
ccaaggagcc cgcgtggttc ctggccaccg tcggcgtctc gcccgaccac cagggcaagg 2580
gtctgggcag cgccgtcgtg ctccccggag tggaggcggc cgagcgcgcc ggggtgcccg 2640
ccttcctgga gacctccgcg ccccgcaacc tccccttcta cgagcggctc ggcttcaccg 2700
tcaccgccga cgtcgaggtg cccgaaggac cgcgcacctg gtgcatgacc cgcaagcccg 2760
gtgcctgatc tagctagagt cggggcggcc ggccgcttcg agcagacatg ataagataca 2820
ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa 2880
tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca 2940
acaattgcat tcattttatg tttcaggttc agggggaggt gtgggaggtt ttttaaagca 3000
agtaaaacct ctacaaatgt ggtaaaatcg ataaggatcc tcgggacgct ctggccggtg 3060
aggcgtgcgc agtcgttgac gctctagacc gtgcaaaagg agagcctgta agcgggcact 3120
cttccgtggt ctggtggata aattcgcaag ggtatcatgg cggacgaccg gggttcgaac 3180
cccagatccg gccgtccgcc gtgatccatg cggttaccgc ccgcgtgtcg aacccaggtg 3240
tgcgacgtca gacaacgggg gagcgctcct tttggcttcc ttccaggcgc ggcggctgct 3300
gcgctagctt ttttggccac tggccgcgcg cggcgtaagc ggttaggctg gaaagcgaaa 3360
gcattaagtg gctcgctccc tgtagccgga gggttatttt ccaagggttg agtcgcagga 3420
cccccggttc gagtctcggg ccggccggac tgcggcgaac gggggtttgc ctccccgtca 3480
tgcaagaccc cgcttgcaaa ttcctccgga aacagggacg agcccctttt ttgcttttcc 3540
cagatgcatc cggtgctgcg gcagatgcgc ccccctcctc agcagcggca agagcaagag 3600
cagcggcaga catgcagggc accctcccct tctcctaccg cgtcaggagg ggcaacatcc 3660
gacgcgtgca tccataatat aactgtacca ggttttggtt tattacatgt gactgacggc 3720
ttcctatgcg tgctcagaaa acggcagttg ggcactgcac tgcccggtga tggtgccacg 3780
gtggctcctg ccgccttctt tgatattcac tctgttgtat ttcatctctt gttgccgatg 3840
aaaggatata acagtctctg aggaaatact tggtatttct tctgatcagc gtttttataa 3900
gtaatgttga atattggata aggctgtgtg tcctttgtct tgggagacaa agcccacagc 3960
aggtggtggt tgggtggtgg cagctcagtg acaggagagg tttttttgcc tgtttttttt 4020
gttgtttttt ttttttaagt aaggtgttct tttttcttag taaaatttct actggactgt 4080
atgttttgac aggtcagaaa catttcttca aaagaagaac cttttggaaa ctgtacagcc 4140
cttttctttc attccctttt tgctttctgt gccaatgcct ttggttctga ttgcattatg 4200
gaaaacgttg atcggaactt gaggttttta tttatagtgt ggcttgaaag cttggatagc 4260
tgttgttaca tgagatacct tattaagttt aggccagctt gatgctttat tttttttcct 4320
ttgaagtagt gagcgttctc tggttttttt cctttgaaac tggcgaggct tagatttttc 4380
taatgggatt ttttacctga tgatctagtt gcatacccaa atgcttgtaa atgttttcct 4440
agttaacatg ttgataactt cggatttaca tgttgtatat acttgtcatc tgtgtttcta 4500
gtaaaaatat atggcattta tagaaatacg taattcctga tttccttttt tttttatctc 4560
tatgctctgt gtgtacaggt caaacagact tcactcctat ttttatttat agaattttat 4620
atgcagtctg tcgttggttc ttgtgttgta aggatacagc cttaaatttc ctagagcgat 4680
gctcagtaag gcgggttgtc acatgggttc aaatgtaaaa cgggcacgtt tgctgctgcc 4740
ttcccagatc caggacacta aactgcttct gcaactgagg tataaatcgc ttcagatccc 4800
aggaagtgta gatccacgtg catattctta aagaagaatg aatactttct aaaatatgtt 4860
ggcataggaa gcaagctgca tggatttatt tgggacttaa attattttgg taacggagtg 4920
cataggtttt aaacacagtt gcagcatgct aacgagtcac agcatttatg cagaagtgat 4980
gcctgttgca gctgtttacg gcactgcctt gcagtgagca ttgcagatag gggtggggtg 5040
ctttgtgtcg tgttgggaca cgctgccaca cagccacctc ccgaacatat ctcacctgct 5100
gggtactttt caaaccatct tagcagtagt agatgagtta ctatgaaaca gagaagttcc 5160
tcagttggat attctcatgg gatgtctttt ttcccatgtt gggcaaagta tgataaagca 5220
tctctatttg taaattatgc acttgttagt tcctgaatcc tttctatagc accacttatt 5280
gcagcaggtg taggctctgg tgtggcctgt gtctgtgctt caatctttta agcttacgcg 5340
ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 5400
cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 5460
caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 5520
gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 5580
tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 5640
ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 5700
attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata 5760
gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 5820
ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca 5880
aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg 5940
tcagatcctc ttccgcatcg ctgtctgcga gggccagctg ttggggtgag tactccctct 6000
caaaagcggg catgacttct gcgctaagaa tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga 6060
tattcactgg cccgcggtga tgcctttgag ggtggccgcg tccatctggt cagaaaagac 6120
aatctttttg ttgtcaagct tccttgatga tgtcatactt atcctgtccc ttttttttcc 6180
acagctcgcg gttgaggaca aactcttcgc ggtctttcca gtactcttgg atcggaaacc 6240
cgtcggcctc cgaacggtac tccgccaccg agggacctga gcgagtccgc atcgaccgga 6300
tcggaaaacc tctcgacgta ccaattaatt cgctgtctgc gagggccagc tgttggggtg 6360
agtactccct ctcaaaagcg ggcatgactt ctgcgctaag attgtcagtt tccaaaaacg 6420
aggaggattt gatattcacc tggcccgcgg tgatgccttt gagggtggcc gcgtccatct 6480
ggtcagaaaa gacaatcttt ttgttgtcaa gcttgaggtg tggcaggctt gagatctggc 6540
catacacttg agtgacaatg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca 6600
ggtccaactg caggtcgagc atgcatctag ggcgcccgca ctagaggctc gagccaccat 6660
gggggtgcac gaatgtcctg cctggctgtg gcttctcctg tccctgctgt cgctccctct 6720
gggcctccca gtcctgggcg ccccaccacg cctcatctgt gacagccgag tcctggagag 6780
gtacctcttg gaggccaagg aggccgagaa tatcacgacg ggctgtaatg aaacctgcag 6840
cttgaatgag aatatcactg tcccagacac caaagttaat ttctatgcct ggaagaggat 6900
ggaggtcggg cagcaggccg tagaagtctg gcagggcctg gccctgctgt cggaagctgt 6960
cctgcggggc caggccctgt tggtcaactc ttcccaggtg aacgagaccc tgcagctgca 7020
tgtggataaa gccgtcagtg gccttcgcag cctcaccact ctgcttcggg ctctgggagc 7080
ccagaaggaa gccatctccc ctccagatgc ggcctcagct gctccactcc gaacaatcac 7140
tgctgacact ttccgcaaac tcttccgagt ctactccaat ttcctccggg gaaagctgaa 7200
gctgtacaca ggggaggcct gcaggacagg ggacagatga gcggccgccc gctgatcagc 7260
ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 7320
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 7380
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 7440
ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 7500
ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgga gctcgcatcc ataatataac 7560
tgtaccaggt tttggtttat tacatgtgac tgacggcttc ctatgcgtgc tcagaaaacg 7620
gcagttgggc actgcactgc ccggtgatgg tgccacggtg gctcctgccg ccttctttga 7680
tattcactct gttgtatttc atctcttgtt gccgatgaaa ggatataaca gtctctgagg 7740
aaatacttgg tatttcttct gatcagcgtt tttataagta atgttgaata ttggataagg 7800
ctgtgtgtcc tttgtcttgg gagacaaagc ccacagcagg tggtggttgg gtggtggcag 7860
ctcagtgaca ggagaggttt ttttgcctgt tttttttgtt gttttttttt tttaagtaag 7920
gtgttctttt ttcttagtaa aatttctact ggactgtatg ttttgacagg tcagaaacat 7980
ttcttcaaaa gaagaacctt ttggaaactg tacagccctt ttctttcatt ccctttttgc 8040
tttctgtgcc aatgcctttg gttctgattg cattatggaa aacgttgatc ggaacttgag 8100
gtttttattt atagtgtggc ttgaaagctt ggatagctgt tgttacatga gataccttat 8160
taagtttagg ccagcttgat gctttatttt ttttcctttg aagtagtgag cgttctctgg 8220
tttttttcct ttgaaactgg cgaggcttag atttttctaa tgggattttt tacctgatga 8280
tctagttgca tacccaaatg cttgtaaatg ttttcctagt taacatgttg ataacttcgg 8340
atttacatgt tgtatatact tgtcatctgt gtttctagta aaaatatatg gcatttatag 8400
aaatacgtaa ttcctgattt cctttttttt ttatctctat gctctgtgtg tacaggtcaa 8460
acagacttca
ctcctatttt
tatttataga
attttatatg
cagtctgtcg
ttggttcttg
8520
tgttgtaagg
atacagcctt
aaatttccta
gagcgatgct
cagtaaggcg
ggttgtcaca
8580
tgggttcaaa
tgtaaaacgg
gcacgtttgc
tgctgccttc
ccagatccag
gacactaaac
8640
tgcttctgca
actgaggtat
aaatcgcttc
agatcccagg
aagtgtagat
ccacgtgcat
8700
attcttaaag
aagaatgaat
actttctaaa
atatgttggc
ataggaagca
agctgcatgg
8760
atttatttgg
gacttaaatt
attttggtaa
cggagtgcat
aggttttaaa
cacagttgca
8820
gcatgctaac
gagtcacagc
atttatgcag
aagtgatgcc
tgttgcagct
gtttacggca
8880
ctgccttgca
gtgagcattg
cagatagggg
tggggtgctt
tgtgtcgtgt
tgggacacgc
8940
tgccacacag
ccacctcccg
aacatatctc
acctgctggg
tacttttcaa
accatcttag
9000
cagtagtaga
tgagttacta
tgaaacagag
aagttcctca
gttggatatt
ctcatgggat
9060
gtcttttttc
ccatgttggg
caaagtatga
taaagcatct
ctatttgtaa
attatgcact
9120
tgttagttcc
tgaatccttt
ctatagcacc
acttattgca
gcaggtgtag
gctctggtgt
9180
ggcctgtgtc
tgtgcttcaa
tcttttaagc
ttgagctcat
ggcgcgccta
ggccttgacg
9240
gccttccttc
aattcgccct
atagtgagtc
gtattacgtc
gcgctcactg
gccgtcgttt
9300
tacaacgtcg
tgactgggaa
aaccctggcg
ttacccaact
taatcgcctt
gcagcacatc
9360
cccctttcgc
cagctggcgt
aatagcgaag
aggcccgcac
cgaaacgccc
ttcccaacag
9420
ttgcgcagcc
tgaatggcga
atgggagcgc
cctgtagcgg
ccactcaacc
ctatctcggt
9480
ctattctttt
gatttataag
ggattttgcc
gatttcggcc
tattggttaa
aaaatgagct
9540
gatttaacaa
aaatttaacg
cgaattttaa
caaaatatta
acgcttacaa
tttag
9595
<210> 19 <211> 10869
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> pZRC III- Etanercept- Neo
<400> 19
gtggcacttt
tcggggaaat
gtgcgcggaa
cccctatttg
tttatttttc
taaatacatt
caaatatgta
tccgctcatg
agacaataac
cctgataaat
gcttcaataa
tattgaaaaa
120
ggaagagtat
gattgaacag
gatggcctgc
atgcgggtag
cccggcagcg
tgggtggaac
180
gtctgtttgg
ctatgattgg
gcgcagcaga
ccattggctg
ctctgatgcg
gcggtgtttc
240
gtctgagcgc
gcagggtcgt
ccggtgctgt
ttgtgaaaac
cgatctgagc
ggtgcgctga
300
acgagctgca
ggatgaagcg
gcgcgtctga
gctggctggc
caccaccggt
gttccgtgtg
360
cggcggtgct
ggatgtggtg
accgaagcgg
gccgtgattg
gctgctgctg
ggcgaagtgc
420
cgggtcagga
tctgctgtct
agccatctgg
cgccggcaga
aaaagtgagc
attatggcgg
480
atgccatgcg tcgtctgcat accctggacc cggcgacctg tccgtttgat catcaggcga 540
aacatcgtat tgaacgtgcg cgtacccgta tggaagcggg cctggtggat caggatgatc 600
tggatgaaga acatcagggc ctggcaccgg cagagctgtt tgcgcgtctg aaagcgagca 660
tgccggatgg cgaagatctg gtggtgaccc atggtgatgc gtgcctgccg aacattatgg 720
tggaaaatgg ccgttttagc ggctttattg attgcggccg tctgggcgtg gcggatcgtt 780
atcaggatat tgcgctggcc acccgtgata ttgcggaaga actgggcggc gaatgggcgg 840
atcgttttct ggtgctgtat ggcattgcgg caccggatag ccagcgtatt gcgttttatc 900
gtctgctgga tgaatttttc taataactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 960
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1020
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1080
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1140
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1200
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt 1260
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1320
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1380
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1440
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1500
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1560
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1620
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1680
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1740
attaggcacc ccaggcttta cccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 1800
ggagagcgcc caatacgcaa ggaaacagct atgaccatgt taatgcagct ggcacgacag 1860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgaaag gaaggcccat gaggccagtt aattaactgt 1920
ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 1980
aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 2040
gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc 2100
cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa 2160
ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt 2220
gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca 2280
ttttcggatc tgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat 2340
tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac 2400
agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc 2460
tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag gcagcgcggc 2520
tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag 2580
cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc 2640
ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg 2700
atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc 2760
ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc 2820
cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga 2880
cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca 2940
tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg 3000
atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg 3060
ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg 3120
gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga 3180
ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg 3240
gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat 3300
tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 3360
tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 3420
ggatcctcgg gacgctctgg ccggtgaggc gtgcgcagtc gttgacgctc tagaccgtgc 3480
aaaaggagag cctgtaagcg ggcactcttc cgtggtctgg tggataaatt cgcaagggta 3540
tcatggcgga cgaccggggt tcgaacccca gatccggccg tccgccgtga tccatgcggt 3600
taccgcccgc gtgtcgaacc caggtgtgcg acgtcagaca acgggggagc gctccttttg 3660
gcttccttcc aggcgcggcg gctgctgcgc tagctttttt ggccactggc cgcgcgcggc 3720
gtaagcggtt aggctggaaa gcgaaagcat taagtggctc gctccctgta gccggagggt 3780
tattttccaa gggttgagtc gcaggacccc cggttcgagt ctcgggccgg ccggactgcg 3840
gcgaacgggg gtttgcctcc ccgtcatgca agaccccgct tgcaaattcc tccggaaaca 3900
gggacgagcc ccttttttgc ttttcccaga tgcatccggt gctgcggcag atgcgccccc 3960
ctcctcagca gcggcaagag caagagcagc ggcagacatg cagggcaccc tccccttctc 4020
ctaccgcgtc aggaggggca acatccgacg cgtgcatcca taatataact gtaccaggtt 4080
ttggtttatt acatgtgact gacggcttcc tatgcgtgct cagaaaacgg cagttgggca 4140
ctgcactgcc cggtgatggt gccacggtgg ctcctgccgc cttctttgat attcactctg 4200
ttgtatttca tctcttgttg ccgatgaaag gatataacag tctctgagga aatacttggt 4260
atttcttctg atcagcgttt ttataagtaa tgttgaatat tggataaggc tgtgtgtcct 4320
ttgtcttggg agacaaagcc cacagcaggt ggtggttggg tggtggcagc tcagtgacag 4380
gagaggtttt tttgcctgtt ttttttgttg tttttttttt ttaagtaagg tgttcttttt 4440
tcttagtaaa atttctactg gactgtatgt tttgacaggt cagaaacatt tcttcaaaag 4500
aagaaccttt tggaaactgt acagcccttt tctttcattc cctttttgct ttctgtgcca 4560
atgcctttgg ttctgattgc attatggaaa acgttgatcg gaacttgagg tttttattta 4620
tagtgtggct tgaaagcttg gatagctgtt gttacatgag ataccttatt aagtttaggc 4680
cagcttgatg ctttattttt tttcctttga agtagtgagc gttctctggt ttttttcctt 4740
tgaaactggc gaggcttaga tttttctaat gggatttttt acctgatgat ctagttgcat 4800
acccaaatgc ttgtaaatgt tttcctagtt aacatgttga taacttcgga tttacatgtt 4860
gtatatactt gtcatctgtg tttctagtaa aaatatatgg catttataga aatacgtaat 4920
tcctgatttc cttttttttt tatctctatg ctctgtgtgt acaggtcaaa cagacttcac 4980
tcctattttt atttatagaa ttttatatgc agtctgtcgt tggttcttgt gttgtaagga 5040
tacagcctta aatttcctag agcgatgctc agtaaggcgg gttgtcacat gggttcaaat 5100
gtaaaacggg cacgtttgct gctgccttcc cagatccagg acactaaact gcttctgcaa 5160
ctgaggtata aatcgcttca gatcccagga agtgtagatc cacgtgcata ttcttaaaga 5220
agaatgaata ctttctaaaa tatgttggca taggaagcaa gctgcatgga tttatttggg 5280
acttaaatta ttttggtaac ggagtgcata ggttttaaac acagttgcag catgctaacg 5340
agtcacagca tttatgcaga agtgatgcct gttgcagctg tttacggcac tgccttgcag 5400
tgagcattgc agataggggt ggggtgcttt gtgtcgtgtt gggacacgct gccacacagc 5460
cacctcccga acatatctca cctgctgggt acttttcaaa ccatcttagc agtagtagat 5520
gagttactat gaaacagaga agttcctcag ttggatattc tcatgggatg tcttttttcc 5580
catgttgggc aaagtatgat aaagcatctc tatttgtaaa ttatgcactt gttagttcct 5640
gaatcctttc tatagcacca cttattgcag caggtgtagg ctctggtgtg gcctgtgtct 5700
gtgcttcaat cttttaagct tacgcgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 5760
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 5820
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 5880
tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 5940
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 6000
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 6060
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 6120
tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 6180
cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 6240
cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 6300
ataagcagag ctggtttagt gaaccgtcag atcctcttcc gcatcgctgt ctgcgagggc 6360
cagctgttgg ggtgagtact ccctctcaaa agcgggcatg acttctgcgc taagaatgtc 6420
agtttccaaa aacgaggagg atttgatatt cactggcccg cggtgatgcc tttgagggtg 6480
gccgcgtcca tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt caagcttcct tgatgatgtc 6540
atacttatcc tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 6600
tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg 6660
acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gacgtaccaa ttaattcgct 6720
gtctgcgagg gccagctgtt ggggtgagta ctccctctca aaagcgggca tgacttctgc 6780
gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc ccgcggtgat 6840
gcctttgagg gtggccgcgt ccatctggtc agaaaagaca atctttttgt tgtcaagctt 6900
gaggtgtggc aggcttgaga tctggccata cacttgagtg acaatgacat ccactttgcc 6960
tttctctcca caggtgtcca ctcccaggtc caactgcagg tcgagcatgc atctagggcg 7020
cccgcactag aggctcgagc catggctcca gtggctgtgt gggctgctct ggctgtgggc 7080
ctggaactgt gggccgctgc tcacgctctg cctgctcagg tggccttcac cccttatgcc 7140
cctgagcctg gctccacctg caggctgcgg gagtactacg accagaccgc ccagatgtgc 7200
tgctccaagt gctctcctgg ccagcacgcc aaggtgttct gcaccaagac ctccgacacc 7260
gtgtgcgact cttgcgagga ctccacctac acccagctct ggaactgggt gcccgagtgc 7320
ctgtcctgcg gctccagatg ctcctccgac caggtggaga cacaggcctg tacacgggag 7380
cagaatcgga tttgcacatg caggcctggc tggtactgcg ccctgtccaa gcaggaagga 7440
tgcaggctgt gcgcccctct gaggaagtgc agacctggct tcggcgtggc taggcctggc 7500
accgagacat ccgacgtcgt gtgcaagcct tgtgcccctg gcaccttctc caacaccaca 7560
tcctccaccg acatctgccg gcctcaccag atctgcaacg tggtggccat ccctggcaac 7620
gccagcatgg acgccgtgtg cacctccacc tcccccacca gatctatggc ccctggcgcc 7680
gtgcatctgc ctcagcctgt gtccacccgg tcccagcata cccagcctac acctgagccc 7740
tctaccgccc cttctacctc cttcctgctg cctatgggcc cttctcctcc agctgagggc 7800
tctaccggcg acgagcctaa gtcctgcgac aagacccaca cctgtccccc ctgccctgcc 7860
cctgaactgc tgggaggccc cagcgtgttc ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg 7920
atgatctccc ggacccccga agtgacctgc gtggtggtgg acgtgtccca cgaggaccct 7980
gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc 8040
agagaggaac agtacaactc cacctaccgg gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 8100
gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc aaggtgtcca acaaggctct gcctgccccc 8160
atcgaaaaga cctccttccc ttctacccct aagaccaccc gtggacaagt ctgcacaacc gcccgctgat cccgtgcctt gaaattgcat gacagcaagg atggcttctg atccataata gtgctcagaa gccgccttct aacagtctct aatattggat ttgggtggtg tttttttaag caggtcagaa cattcccttt gatcggaact atgagatacc tgagcgttct tttttacctg gttgataact tatggcattt tgtgtacagg gtcgttggtt ggcgggttgt ccaggacact agatccacgt agcaagctgc ccatctccaa gggaggagat ccgatatcgc cccctgtgct cccggtggca actacaccca cagcctcgac ccttgaccct cgcattgtct gggaggattg aggcggaaag taactgtacc aacggcagtt ttgatattca gaggaaatac aaggctgtgt gcagctcagt taaggtgttc acatttcttc ttgctttctg tgaggttttt ttattaagtt ctggtttttt atgatctagt tcggatttac atagaaatac tcaaacagac cttgtgttgt cacatgggtt aaactgcttc gcatattctt atggatttat ggccaagggc gaccaagaac cgtggaatgg ggactccgac gcagggcaac gaagagctta tgtgccttct ggaaggtgcc gagtaggtgt ggaagacaat aaccagctgg aggttttggt gggcactgca ctctgttgta ttggtatttc gtcctttgtc gacaggagag ttttttctta aaaagaagaa tgccaatgcc atttatagtg taggccagct tcctttgaaa tgcataccca atgttgtata gtaattcctg ttcactccta aaggatacag caaatgtaaa tgcaactgag aaagaagaat ttgggactta cagccccgcg caggtgtccc gagtccaacg ggctcattct gtgttctcct tccctgtctc agttgccagc actcccactg cattctattc agcaggcatg ggctctaggg ttattacatg ctgcccggtg tttcatctct ttctgatcag ttgggagaca gtttttttgc gtaaaatttc ccttttggaa tttggttctg tggcttgaaa tgatgcttta ctggcgaggc aatgcttgta tacttgtcat atttcctttt tttttattta ccttaaattt acgggcacgt gtataaatcg gaatactttc aattattttg agcctcaggt tgacctgtct gacagcccga tcctgtactc gctccgtgat ctggcaagtg catctgttgt tcctttccta
tggggggtgg
ctggggatgc ggtatcccca tgactgacgg atggtgccac tgttgccgat cgtttttata aagcccacag ctgttttttt tactggactg actgtacagc attgcattat gcttggatag ttttttttcc ttagattttt aatgttttcc ctgtgtttct ttttttatct tagaatttta cctagagcga ttgctgctgc cttcagatcc taaaatatgt gtaacggagt gtacaccctg ggtcaagggc gaacaactac caagctgacc gcacgaggcc ataagcggcc ttgcccctcc ataaaatgag ggtggggcag ggtgggctct cggagctcgc cttcctatgc ggtggctcct gaaaggatat agtaatgttg caggtggtgg tgttgttttt tatgttttga ccttttcttt ggaaaacgtt ctgttgttac tttgaagtag ctaatgggat tagttaacat agtaaaaata ctatgctctg tatgcagtct tgctcagtaa cttcccagat caggaagtgt tggcatagga gcataggttt
8220 8280 8340 8400
8460 8520 8580 8640
8700 8760
8820 8880 8940 9000 9060
9120 9180
9240 9300 9360 9420 9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080
taaacacagt tgcagcatgc taacgagtca cagcatttat gcagaagtga tgcctgttgc 10140
agctgtttac ggcactgcct tgcagtgagc attgcagata ggggtggggt gctttgtgtc 10200
gtgttgggac acgctgccac acagccacct cccgaacata tctcacctgc tgggtacttt 10260
tcaaaccatc ttagcagtag tagatgagtt actatgaaac agagaagttc ctcagttgga 10320
tattctcatg ggatgtcttt tttcccatgt tgggcaaagt atgataaagc atctctattt 10380
gtaaattatg cacttgttag ttcctgaatc ctttctatag caccacttat tgcagcaggt 10440
gtaggctctg gtgtggcctg tgtctgtgct tcaatctttt aagcttgagc tcatggcgcg 10500
cctaggcctt gacggccttc cttcaattcg ccctatagtg agtcgtatta cgtcgcgctc 10560
actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 10620
ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgaaac 10680
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga gcgccctgta gcggccactc 10740
aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 10800
ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt 10860
acaatttag 10869
<210> 20 <211> 1710
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> TNK (последовательность ДНК, соответствующая SEQ ID NC1: 7)
<400> 20
gaattccacc atggacgcca tgaagcgggg actgtgctgt gtgctgctgc tgtgtggcgc 60
cgtgttcgtg tcccctagcc aggaaatcca cgcccggttc agaaggggcg ccaggtccta 120
ccaagttatc tgccgggacg aaaagaccca gatgatctac cagcagcacc agtcctggct 180
gcggcccgtg ctgcggtcca accgggtgga gtactgctgg tgcaactccg gcagagccca 240
gtgccactcc gtgcctgtga agtcctgctc cgagcctaga tgcttcaacg gcggcacctg 300
tcagcaggcc ctgtacttct ccgacttcgt gtgccagtgc cctgagggct tcgccggcaa 360
gtgctgcgag atcgacaccc gggccacctg ttacgaggac cagggcatct cctaccgggg 420
caactggtct accgccgagt ctggcgccga gtgcaccaac tggcagtcct ccgccctggc 480
ccagaagcct tactctggca gacggcctga cgccatcaga ctgggcctgg gcaaccacaa 540
ctactgccgg aaccctgacc gggactccaa gccttggtgc tacgtgttca aggccggcaa 600
gtactcctcc gagttctgct ccacccctgc ctgctctgag ggcaactccg actgctactt 660
cggcaacggc tccgcctaca gaggcaccca ctccctgacc gagtccggcg cctcttgcct 720
gccttggaac tccatgatcc tgatcggcaa ggtgtacacc gcccagaacc cttccgctca 780
ggccctggga ctcggaaagc acaattattg tcgcaatccc gacggcgacg ccaaaccttg 840
gtgtcacgtg ctgaagaacc ggcggctgac atgggaatac tgcgacgtgc cttcctgctc 900
tacctgcggc ctgcggcagt actcccagcc tcagttccgg atcaagggcg gcctgttcgc 960
cgatatcgcc tcccaccctt ggcaggccgc catcttcgcc gctgctgccg cttctcctgg 1020
cgagagattc ctgtgcggcg gcatcctgat ctccagctgc tggattctgt ctgccgccca 1080
ctgcttccag gaacggttcc ctcctcacca cctgaccgtg atcctgggcc ggacctacag 1140
agtcgtgccc ggcgaggaag aacagaaatt cgaggtggag aagtatatcg tgcacaaaga 1200
gttcgacgac gacacctacg acaacgatat cgccctgctg cagctgaagt ccgactcctc 1260
cagatgcgcc caggaatcct ccgtcgttcg gaccgtgtgt ctgccacctg ccgacctgca 1320
gctgcctgac tggaccgagt gcgagctgtc cggctacggc aagcacgagg ccctgtcccc 1380
cttctactcc gagcggctga aagaagctca tgtacggctg tacccctcta gccggtgcac 1440
ctcccagcat ctgctgaacc ggaccgtgac cgacaacatg ctgtgtgccg gcgacaccag 1500
atctggcggc cctcaggcca acctgcacga cgcctgccag ggcgatagtg gcggacctct 1560
cgtgtgcctc aacgacggca ggatgaccct cgtgggcatc atctcttggg gcctgggctg 1620
tggccagaaa gacgtgcctg gcgtgtacac caaagtgacc aactacctgg actggatcag 1680
ggacaacatg cggccttgat gagcggccgc 1710
<210> 21 <211> 601 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Дарбепоэтин (последовательность ДНК, соответствующая SEQ ID NC: 9)
<400> 21
ctcgagccac catgggggtg cacgaatgtc ctgcctggct gtggcttctc ctgtccctgc 60
tgtcgctccc tctgggcctc ccagtcctgg gcgccccacc acgcctcatc tgtgacagcc 120
gagtcctgga gaggtacctc ttggaggcca aggaggccga gaatatcacg acgggctgta 180
atgaaacctg cagcttgaat gagaatatca ctgtcccaga caccaaagtt aatttctatg 240
cctggaagag gatggaggtc gggcagcagg ccgtagaagt ctggcagggc ctggccctgc 300
tgtcggaagc tgtcctgcgg ggccaggccc tgttggtcaa ctcttcccag gtgaacgaga 360
ccctgcagct gcatgtggat aaagccgtca gtggccttcg cagcctcacc actctgcttc 420
gggctctggg agcccagaag gaagccatct cccctccaga tgcggcctca gctgctccac 480
tccgaacaat cactgctgac actttccgca aactcttccg agtctactcc aatttcctcc 540
ggggaaagct gaagctgtac acaggggagg cctgcaggac aggggacaga tgagcggccg 600
c 601
<210> 22 <211> 1489 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Этанерцепт (последовательность ДНК, соответствующая SEQ ID NO: 11)
<400> 22
ctcgagccat ggctccagtg gctgtgtggg ctgctctggc tgtgggcctg gaactgtggg 60
ccgctgctca cgctctgcct gctcaggtgg ccttcacccc ttatgcccct gagcctggct 120
ccacctgcag gctgcgggag tactacgacc agaccgccca gatgtgctgc tccaagtgct 180
ctcctggcca gcacgccaag gtgttctgca ccaagacctc cgacaccgtg tgcgactctt 240
gcgaggactc cacctacacc cagctctgga actgggtgcc cgagtgcctg tcctgcggct 300
ccagatgctc ctccgaccag gtggagacac aggcctgtac acgggagcag aatcggattt 360
gcacatgcag gcctggctgg tactgcgccc tgtccaagca ggaaggatgc aggctgtgcg 420
cccctctgag gaagtgcaga cctggcttcg gcgtggctag gcctggcacc gagacatccg 480
acgtcgtgtg caagccttgt gcccctggca ccttctccaa caccacatcc tccaccgaca 540
tctgccggcc tcaccagatc tgcaacgtgg tggccatccc tggcaacgcc agcatggacg 600
ccgtgtgcac ctccacctcc cccaccagat ctatggcccc tggcgccgtg catctgcctc 660
agcctgtgtc cacccggtcc cagcataccc agcctacacc tgagccctct accgcccctt 720
ctacctcctt cctgctgcct atgggccctt ctcctccagc tgagggctct accggcgacg 780
agcctaagtc ctgcgacaag acccacacct gtcccccctg ccctgcccct gaactgctgg 840
gaggccccag cgtgttcctg ttccccccaa agcccaagga caccctgatg atctcccgga 900
cccccgaagt gacctgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggaccctgaa gtgaagttca 960
attggtacgt ggacggcgtg gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggaacagt 1020
acaactccac ctaccgggtg gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg 1080
gcaaagagta caagtgcaag gtgtccaaca aggctctgcc tgcccccatc gaaaagacca 1140
tctccaaggc caagggccag ccccgcgagc ctcaggtgta caccctgcct ccttcccggg 1200
aggagatgac caagaaccag gtgtccctga cctgtctggt caagggcttc tacccctccg 1260
atatcgccgt ggaatgggag tccaacggac agcccgagaa caactacaag accacccccc 1320
ctgtgctgga ctccgacggc tcattcttcc tgtactccaa gctgaccgtg gacaagtccc 1380
ggtggcagca gggcaacgtg ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact 1440
acacccagaa gagcttatcc ctgtctcctg gcaagtgata agcggccgc 1489
<210> 23 <211> 365
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> FSH альфа ((последовательность ДНК, соответствующая SEQ ID NO: 13) <400> 23
ctcgagccac catggactac taccggaagt acgccgccat cttcctggtg accctgtccg 60
tgttcctgca cgtgctgcac tctgcccctg acgtgcagga ctgccctgag tgcaccctgc 120
aggaaaaccc attcttcagc cagcctggcg cccctatcct gcagtgcatg ggctgctgct 180
tctccagagc ctaccctacc cctctgcggt ccaagaaaac catgctggtg cagaaaaacg 240
tgacctccga gtctacctgc tgcgtggcca agtcctacaa cagagtgacc gtgatgggcg 300
gcttcaaggt ggagaaccac accgcctgcc actgctctac ctgctactac cacaagtcct 360
gatga 365
<210> 24 <211> 415 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> FSH бета (( последовательность ДНК, соответствующая SEQ ID NO: 15)
<400> 24
cccgggccac catgaagacc ctgcagttct tcttcctgtt ctgctgctgg aaggccatct 60
gctgcaactc ttgcgagctg accaacatca caatcgccat cgagaaagag gaatgccggt 120
tctgcatctc catcaacacc acttggtgcg ccggctactg ctacacccgc gacctggtgt 180
acaaggaccc tgcccggcct aagatccaga aaacctgcac cttcaaagaa ctggtgtacg 240
agacagtgcg ggtgccaggc tgcgctcacc acgccgactc cctgtacacc taccctgtgg 300
ccacccagtg ccactgcggc aagtgcgact ccgactccac cgactgtacc gtgcggggcc 360
tgggcccttc ttactgctcc ttcggcgaga tgaaggaatg atgaccagcg gccgc 415
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Вектор экспрессии, содержащий промотор, функционально связанный с представляющим интерес геном, повьшающими экспрессию элементами, TPL, генами VA I и II или их вариантами, терминатором трансляции и антибиотиком-маркером, где повьшающий экспрессию элемент представляет собой область прикрепления к хроматину.
2. Вектор экспрессии по п. 1, который дополнительно содержит
a) интрон или его варианты
b) необязательно внутренний участок связывания рибосомы или его варианты
3. Вектор экспрессии по п. 1, где область прикрепления к хроматину представляет собой подходящую область прикрепления к матриксу.
4. Вектор экспрессии по п. 1, где область прикрепления к хроматину представляет собой подходящую область прикрепления к каркасу.
5. Вектор экспрессии по п. 3, где область прикрепления к матриксу выбрана из пограничного элемента Scs дрозофилы, MAR hspSAP, Т-клеточного рецептора TCRa мыши, контролирующей локус области крысы, MAR р-глобина.
6. Вектор экспрессии по п. 3 или 5, где область прикрепления к матриксу представляет собой cLysMAR.
7. Вектор экспрессии по п. 5, где cLysMAR содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID N0:5.
8. Вектор экспрессии по п. 1, где промотор выбран из группы, состоящей из промотора CMV, промотора SV4 0, промотора аденовируса, промотора бета-актина, промоторов металлотионеинов или других промоторов прокариотических, или эукариотических вирусов, предпочтительно, промотор CMV.
9. Вектор экспрессии по п. 2, где внутренний участок связывания рибосомы представляет собой IRES вируса энцефаломиокардита.
10. Вектор экспрессии по пп. 2 и 9, где внутренний участок связывания рибосомы содержит нуклеотидную последовательность
3.
SEQ ID N0:14.
11. Вектор экспрессии по п. 1, где гены VA I и II содержат нуклеотидную последовательность SEQ ID N0:3.
12. Вектор экспрессии по п. 1, где TPL содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID N0:2.
13. Вектор экспрессии по п. 2, где химерный интрон содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID N0:1.
14. Вектор экспрессии по п. 1, где представляющий интерес ген кодирует белки и пептиды и их аналоги, выбранные из тканевого активатора плазминогена, TNK-TPA, дарбепоэтина, эритропоэтина, инсулина, GCSF, интерлейкина, фактора некроза опухоли, интерферона, TNFR-IgGFc, моноклональных антител, таких как ритуксимаб, бевацизумаб, адалимумаб, трастузумаб и их фрагментов, таких как Fc-область, Fab, GLP-I, GLP-II, IGF-I, IGF-II, факторов роста тромбоцитов, FVII, FVIII, FIV и FXIII, экзендина-3, экзендина-4, факторов транскрипции, таких как MYT-2, фактора репрессии NF-кВ NRF, AML1/RUNX1, белка гомеодомена Gtx, факторов трансляции, таких как эукариотический фактор инициации 4G (elF4G)a, эукариотический фактор инициации 4G1 (elF4Gl)a, связанного с доменом смерти белка 5 (DAP5), онкогеноподобных c-myc, L-myc, Pim-1, протеинкиназы p58PITSLRE, связанных с р53 гормонов, выбранных из гонадотропных гормонов, выбранных из фолликулостимулирующего гормона, хорионического гонадотропина человека, лютеинизирующего гормона человека и т.д., и белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулина (BiP), белка теплового шока 70, р-субъединицы митохондриальной Н+-АТФ-синтетазы, орнитиндекарбоксилазы, коннексинов 32 и 43, HIF-la, АРС.
15. Вектор экспрессии по п. 1, где антибиотик-маркер выбран из канамицина, пуромицина, гигромицина и неомицина.
16. Вектор экспрессии по любому из пп. 1-15, где cLysMAR клонируют в любой области, фланкирующей экспрессирующую кассету.
17. Вектор экспрессии по пп. 1 и 2, который содержит представляющий интерес ген, функционально связанный с
а) Промотором или его вариантом
b) генами VA I и II или их вариантами
c) TPL или его вариантом
с!) химерным интроном или его вариантом
e) антибиотиком-маркером
f) областями прикрепления к матриксу
д) Необязательно внутренним участком связывания рибосомы h) последовательностью полиаденилирования бычьего гормона роста.
18. Вектор экспрессии по любому из пп. 1-17 с номером доступа МТСС 5655.
19. Вектор экспрессии по любому из пп. 1-18 с номером доступа МТСС 5656.
20. Вектор экспрессии по любому из пп. 1-19 с номером доступа МТСС 5657.
21. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по любому из пп. 1-20.
22. Клетка-хозяин по п. 20, выбранная из линий клеток СНО или ВНК, или их производных.
23. Способ получения белков и пептидов, и их вариантов, включающий
a) конструирование вектора экспрессии по любому из пп. 1-
22;
b) трансформацию указанного вектора экспрессии в
подходящую клетку-хозяина, экспрессирующую представляющие
интерес белок или пептид.
24. Способ получения белков и пептидов и их вариантов, включающий
a) конструирование вектора экспрессии по любому из пп. 123;
b) трансфекцию указанного вектора экспрессии в подходящую клетку-хозяина;
c) отбор подходящей трансфицированной клетки-хозяина,
экспрессирующей представляющие интерес белок или пептид;
с!) повторную трансфекцию подходящей клетки-хозяина, отобранной на стадии (с), вектором экспрессии по любому из пп. 1-23;
е) экспрессию подходящей повторно трансфицированной клеткой-хозяином представляющих интерес белка или пептида.
25. Способ по пп. 23 и 24, где вектор экспрессии обладает номером доступа МТСС 5655.
26. Способ по пп. 23 и 24, где вектор экспрессии обладает номером доступа МТСС 5656.
27. Способ по пп. 23 и 24, где вектор экспрессии обладает номером доступа МТСС 5657.
28. Способ по пп. 2 3 и 24, где белки и пептиды выбраны из тканевого активатора плазминогена, TNK-TPA, дарбепоэтина, эритропоэтина, инсулина, GCSF, интерлейкина, фактора некроза опухоли, интерферона, TNFR-IgGFc, моноклональных антител, таких как ритуксимаб, бевацизумаб, адалимумаб, трастузумаб и их фрагментов, таких как Fc-область, Fab, GLP-I, GLP-II, IGF-I, IGF-II, фактора роста тромбоцитов, FVII, FVIII, FIV и FXIII, экзендина-3, экзендина-4, гормонов, таких как гонадотропные гормоны, выбранные из фолликулостимулирующего гормона, хорионического гонадотропина человека, лютеинизирующего гормона человека.
По доверенности
1/7 ФИГ.1
Канамицин
Канамицин
2/7
ФИГ.З
Канамицин
plJC OK!/)"" //
/ /
' Гигромицин
pZRC III-"INK - I
и-И у
Канамицин
" MAR Интрон (tm) i-M\
Гигромицин
JHSf 111
JIF 11 ( pZRC III- Darbe - Hyg
Дарбепоэтин¦ '¦
Интрон" ^,,L p, \i\
3/7
ФИГ.5
Канамицин
pUC (ЖЬ
А Гигромицин
\\\к /
Y. IJZRC ill- Этанерцепт-
Гигромицин
4/7
ФИГ.7
МАК
pZRC III- FSH p -IKKS-FSH a- Kbч\ Гигромицин
IRES
FSH бета
FSH альфь
IT I.
Канамицин
5/7
6/7
Канамицин
IKIV
FSH бета ^/ Интрон~
TPL Р <Л|Х
If млн
7/7
ФИГ.13
/ / N ч
f \\ Неомицин
\1\K \\
7; [j/KC III- Этанерцепт
В(.н I I ¦ V'ii J,,
4 .-v
Этанерцепт^к\ . '•
Интрон ~ --r"^, ...
ФИГ.14
Канамицин
pl < OKL'
Неомицин
МАК ggg \\
\ pZRCIII-TNK-Ni-.. !;
\ A
w MAM
TPL pCMV
<220>
Канамицин
Канамицин
Канамицин
Канамицин
Канамицин
Канамицин
Канамицин
Канамицин
Канамицин
Канамицин
Канамицин