|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[**] Настоящее изобретение относится к области профилактики и лечения заболевания почек. Лечение заболевания почек может быть изменено в зависимости от необходимости или вероятности проведения продолжительного диализа. Например, заключение о необходимости проведения продолжительного диализа может быть сделано на основе мониторинга мочевых биомаркеров, связанных с развитием хронического заболевания почек. Например, динамику показателей стандартизированных концентраций гиалуроновой кислоты, рецептора смерти 5 и/или трансформирующего фактора роста β1, измеряемых в течение примерно четырнадцати дней, можно использовать для определения вероятности излечения по сравнению с отсутствием вероятности излечения у пациента, имеющего острое повреждение почек. 
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к области профилактики и лечения заболевания почек. Лечение заболевания почек может быть изменено в зависимости от необходимости или вероятности проведения продолжительного диализа. Например, заключение о необходимости проведения продолжительного диализа может быть сделано на основе мониторинга мочевых биомаркеров, связанных с развитием хронического заболевания почек. Например, динамику показателей стандартизированных концентраций гиалуроновой кислоты, рецептора смерти 5 и/или трансформирующего фактора роста β1, измеряемых в течение примерно четырнадцати дней, можно использовать для определения вероятности излечения по сравнению с отсутствием вероятности излечения у пациента, имеющего острое повреждение почек.
Евразийское (21) 201390439 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. G01N33/50 (2006.01)
2013.09.30 G01N33/68 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки
2011.09.19
(54) БИОМАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК
(31) 61/386,230; 13/235,005
(32) 2010.09.24; 2011.09.16
(33) US
(86) PCT/US2011/052082
(87) WO 2012/040073 2012.03.29
(88) 2012.06.14
(71) Заявитель:
ЮНИВЕРСИТИ ОФ ПИТТСБУРГ-ОФ ДЗЕ КОММОНВЕЛТ СИСТЕМ ОФ ХАЙЕР ЭДЬЮКЕЙШН (US)
(72) Изобретатель:
Зингбартль Кай, Келлум Джон А. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к области профилактики и лечения заболевания почек. Лечение заболевания почек может быть изменено в зависимости от необходимости или вероятности проведения продолжительного диализа. Например, заключение о необходимости проведения продолжительного диализа может быть сделано на основе мониторинга мочевых биомаркеров, связанных с развитием хронического заболевания почек. Например, динамику показателей стандартизированных концентраций гиалуроновой кислоты, рецептора смерти 5 и/или трансформирующего фактора роста pi, измеряемых в течение примерно четырнадцати дней, можно использовать для определения вероятности излечения по сравнению с отсутствием вероятности излечения у пациента, имеющего острое повреждение почек.
2420-194683ЕА/032
БИОМАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПОЧЕК
ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ УЧАСТИИ В РАЗРАБОТКАХ ПРАВИТЕЛЬСТВА Настоящее изобретение выполнено при правительственной поддержке в рамках гранта номер 5R01DK070910-03, предоставленного Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ Настоящее изобретение относится к области профилактики и лечения заболевания почек. Лечение заболевания почек может быть изменено в зависимости от необходимости или вероятности продолжительного диализа. Например, заключение о необходимости проведения продолжительного диализа может быть сделано на основе мониторинга мочевых биомаркеров, связанных с развитием хронического заболевания почек. Например, динамику показателей стандартизированных концентраций гиалуроновой кислоты, рецептора смерти 5 и/или трансформирующего фактора роста (31, измеряемых в течение примерно четырнадцати дней, можно использовать для определения вероятности излечения по сравнению с отсутствием вероятности излечения у пациента, имеющего острое повреждение почек.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Хроническая болезнь почек (CKD) считается одной из основных и быстрорастущих проблем в области здравоохранения, стоящих перед экономически развитыми странами. Только в США 2 6 миллионов человек имеют CKD и еще свыше 2 0 миллионов человек имеют повышенный риск CKD. CKD приводит к диализу и заболеванию сердца, так что связанные с ними медицинские затраты достигают миллиардов долларов. Главной причиной CKD является острое повреждение почек (AKI), которое также связано с существенным увеличением затрат на медицинское обслуживание, особенно если требуется проведение диализа (или связанной с ним процедуры поддержки почек).
Хроническая болезнь почек может развиться в результате воздействия многих различных факторов, но прежде всего, генетической предрасположенности и/или острого повреждения почек. Степень повреждения почек также ассоциирована с постепенным увеличением смертности в отдаленном периоде. Например, смертельные случаи, происходящие в течение одного года после выписки из больницы, могут составлять до 64% в случае пациентов с тяжелым, требующим диализа AKI. Кроме того, используемые в настоящее время маркеры функции/повреждения почек, такие как уровни сывороточного креатинина, являются недостаточными для оценки отдаленного результата заболевания почек. Независимо от инициирующего фактора, хроническая болезнь почек характеризуется высокой долей пациентов, нуждающихся в долгосрочном диализе (т.е., например, заместительная почечная терапия или RRT) . Указанное лечение является дорогостоящим, длительным и может приводить к нежелательным побочным эффектам, включая, но без ограничения, стеноз и/или тромбоз сосудов.
Таким образом, выявление биомаркера, который обеспечивает раннее выявление и последующую стратификацию пациентов с AKI и также позволяет прогнозировать восстановление функции почек, является клиническим средством, который востребован в данной области.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области профилактики и лечения заболевания почек. Лечение заболевания почек может быть изменено в зависимости от необходимости или вероятности продолжительного диализа. Например, заключение о необходимости проведения продолжительного диализа может быть сделано на основе мониторинга мочевых биомаркеров, связанных с развитием хронического заболевания почек. Например, динамику показателей стандартизированных концентраций гиалуроновой кислоты, рецептора смерти 5 и/или трансформирующего фактора роста (31, измеряемых в течение примерно четырнадцати дней, можно использовать для определения вероятности излечения по сравнению с отсутствием вероятности излечения у пациента, имеющего острое повреждение почек.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы и композиции для диагностики, дифференциальной диагностики, определения групп риска, мониторинга, классификации и определения схем лечения у пациентов, с уже диагностированным повреждением или с повышенным риском повреждения функции почек, снижения почечной функции и/или острой почечной недостаточности с помощью измерения одного или более маркеров повреждения почек настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ, включающий: а) получение; i) пациента с проявлением по меньшей мере одного симптома острого поражения почек; и ii) образца биологической жидкости, полученного у пациента, где образец содержит по меньшей мере один почечный биомаркер; Ь) измерение значения у пациента, включающее по меньшей мере одно значение почечного биомаркера в образце; и с) прогнозирование вероятности восстановления функции почек у пациента, исходя из значения, полученного для пациента. В одном варианте осуществления прогнозируют, что восстановление почечной функции произойдет в течение по меньшей мере шестидесяти дней после наступления острого повреждения почек. В одном варианте осуществления образец получают в течение по меньшей мере четырнадцати дней после наступления повреждения почек. В одном варианте осуществления образец получают в течение одного дня после наступления повреждения почек. В одном варианте осуществления прогнозирование включает сравнение значения, полученного для пациента, с пороговым значением. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение включает уровень гиалуроновой кислоты в моче. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение уровня гиалуроновой кислоты в моче составляет приблизительно 12 мкг/мг креатинина. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение уровня гиалуроновой кислоты в моче, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,70. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение
включает уровень гиалуроновой кислоты и по меньшей мере значение одного клинического показателя. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение уровня гиалуроновой кислоты в моче и по меньшей мере значения одного клинического показателя, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,75. В одном варианте осуществления прогностическим значением является уровень трансформирующего фактора роста (31 в моче. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение уровня трансформирующего фактора роста (31 в моче составляет приблизительно 274 пг/мг креатинина. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение уровня трансформирующего фактора роста (31, включающего значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,70. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение включает в себя уровень трансформирующего фактора роста (31 в моче и по меньшей мере значение одного клинического показателя. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение уровня трансформирующего фактора роста (31 в моче и по меньшей мере значения одного клинического показателя, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,74. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение включает уровень рецептора смерти 5 в моче. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение уровня рецептора смерти 5 в моче составляет приблизительно 2,7 нг/мг креатинина. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение уровня рецептора смерти 5 в моче, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,70. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение включает уровень рецептора смерти 5 в моче и значение клинического показателя. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение уровня рецептора смерти 5 в моче и по меньшей мере значения одного клинического показателя,
включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,76. В одном варианте осуществления прогностическое пороговое значение включает по меньшей мере значение одного клинического показателя. В одном варианте осуществления значение клинического показателя выбирают из группы, включающей возраст, оценку по шкале SOFA, индекс коморбидности Чарльсона, или оценку по шкале APACHE II. В одном варианте осуществления значение по меньшей мере одного клинического показателя, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,71. В одном варианте осуществления значение, определяемое у пациента, включает значения по меньшей мере двух клинических показателей, в одном варианте осуществления значения по меньшей мере двух клинических показателей, включающее совокупное значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,74. В одном варианте осуществления значения по меньшей мере двух клинических показателей включают возраст и индекс коморбидности Чарльсона.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ оценки состояния почек, который позволяет произвести стратификацию риска у пациента, включающий: а) получение; i) пациента с проявлением по меньшей мере одного симптома острого поражения почек; ii) образца биологической жидкости, полученного у пациента, где указанный образец содержит по меньшей мере один почечный биомаркер; Ь) измерение значения у пациента, включающее по меньшей мере содержание одного почечного биомаркера в образце; и с) сравнение значения, определяемого у пациента, с пороговым значением биомаркера, при котором устанавливают стратификацию риска. В одном варианте осуществления при сравнении также определяют возрастающее значение почечного биомаркера. В одном варианте осуществления при сравнении также выявляют уменьшающееся значение почечного биомаркера. В одном варианте осуществления значение, определяемое у пациента, включает содержание гиалуроновой кислоты в моче и по меньшей мере
значение одного клинического показателя. В одном варианте
осуществления значение, определяемое у пациента, включает
содержание трансформирующего фактора роста (31. В одном варианте
осуществления значение, определяемое у пациента, включает
содержание рецептора смерти 5. В одном варианте осуществления
значение, определяемое у пациента, также включает по меньшей
мере значение одного клинического показателя. В одном варианте
осуществления образец получают в течение по меньшей мере
четырнадцати дней после наступления острого повреждения почек.
В одном варианте осуществления стратификация риска включает
модифицированную систему критериев (RIFLE) Риск, Повреждение,
Недостаточность, Утрата функции почек, выбранных из группы,
включающей стадию I, стадию II или стадию III. В одном варианте
осуществления стадия I включает категорию риска. В одном
варианте осуществления стадия II включает категорию
повреждения. В одном варианте осуществления стадия III включает
категорию недостаточности. В одном варианте осуществления
стратификация риска включает оценку вероятности восстановления
почечной функции. В одном варианте осуществления вероятность
восстановления почечной функции включает значение биомаркера,
характеризующегося площадью под рабочей характеристической
кривой (AUC ROC) выше порогового значения, равного
приблизительно 0,70. В одном варианте осуществления
стратификация риска включает оценку вероятности
невосстановления почечной функции. В одном варианте осуществления вероятность невосстановления почечной функции включает значение биомаркера, характеризующегося площадью под рабочей характеристической кривой (AUC ROC) ниже порогового значения, равного приблизительно 0,70. В одном варианте осуществления стратификация риска включает определение риска клинического исхода у пациента. В одном варианте осуществления клинический исход включает улучшение почечной функции. В одном варианте осуществления клинический исход включает снижение почечной функции. В одном варианте осуществления снижение почечной функции включает повреждение почек. В одном варианте осуществления повреждение почек является нарастающим. В одном
варианте осуществления риск клинического исхода включает категорию утраты почечной функции. В одном варианте осуществления риск клинического исхода включает категорию терминальной почечной недостаточности. В одном варианте осуществления вероятность осуществления риска клинического исхода сравнивают со значением площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC),определяемым у пациента. В одном варианте осуществления вероятность категории утраты функции возрастает при изменении значения AUC ROC в пределах приблизительно 0,5-0,3. В одном варианте осуществления вероятность категории утраты почечной функции снижается при значении AUC ROC выше 0,5. В одном варианте осуществления вероятность категории терминальной почечной недостаточности возрастает при значении AUC ROC ниже 0,3. В одном варианте осуществления вероятность категории терминальной почечной недостаточности уменьшается при значении AUC ROC выше приблизительно 0,3. В одном варианте осуществления стратификация риска включает определение риска дальнейшего снижения почечной функции у пациента. В одном варианте осуществления риск дальнейшего снижения почечной функции у пациента возрастает при значении AUC ROC ниже 0,5. В одном варианте осуществления риск дальнейшего снижения почечной функции у пациента уменьшается при значении AUC ROC выше 0,5. В одном варианте осуществления предполагается, что последующее снижение почечной функции может произойти в течение 180 дней от момента времени, в который у пациента получали образец биологической жидкости. В одном варианте осуществления предполагается, что дальнейшее снижение почечной функции может произойти в течение периода времени, выбранного из группы, включающей 18 месяцев, 120 дней, 90 дней, 60 дней, 45 дней, 30 дней, 21 дней, 14 дней, 7 дней, 5 дней, 96 часов, 72 часа, 48 часов, 36 часов, 24 часа, 12 часов или меньше. В одном варианте осуществления снижение почечной функции происходит в момент времени 0 часов от времени, в которое получали образец биологической жидкости у пациента, обеспечивая тем самым диагностику текущего состояния.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ, включающий: а) получение пациента, имеющего по меньшей мере один установленный фактор риска почечного заболевания; и Ь) отбор пациента для стратификации риска на основе по меньшей мере одного установленного фактора риска развития заболевания почек. В одном варианте осуществления установленный фактор риска включает почечный биомаркер. В одном варианте осуществления почечный биомаркер выбирают из группы, включающей показатель гиалуроновой кислоты в моче, показатель трансформирующего фактора роста (31 в моче или показатель рецептора смерти 5 в моче. В одном варианте осуществления стратификация риска включает модифицированную систему критериев (RIFLE) Риск, Повреждение, Недостаточность, Утрата функции почек, выбранных из группы, включающей стадию I, стадию II или стадию III. В одном варианте осуществления стадия I включает категорию риска. В одном варианте осуществления стадия II включает категорию повреждения. В одном варианте осуществления стадия III включает категорию недостаточности. В одном варианте осуществления стратификация риска включает категорию утраты функции почек. В одном варианте осуществления стратификация риска включает категорию терминальной стадии почечной недостаточности. В одном варианте осуществления категория риска включает значение AUC ROC, варьирующееся в диапазоне приблизительно 0,6-0,7. В одном варианте осуществления категория повреждения включает значение AUC ROC, варьирующееся в диапазоне приблизительно 0,5-0,6. В одном варианте осуществления категория утраты функции почек включает значение AUC ROC, варьирующееся приблизительно в диапазоне 0,40,5. В одном варианте осуществления категория утраты почечной функции включает значение AUC ROC, варьирующееся приблизительно в диапазоне 0,3-0,4. В одном варианте осуществления категория терминальной почечной недостаточности включает значение AUC ROC ниже 0,3. В одном варианте осуществления заболевание почек выбирают из группы, включающей преренальное заболевание, собственно ренальное заболевание или постренальное заболевание, вызывающее острую почечную недостаточность. В одном варианте
осуществления пациент также имеет по меньшей мере одно
медицинское состояние, выбранное из группы, включающей
предстоящую или перенесенную обширную сосудистую операцию,
аорто-коронарный шунт или другую операцию на сердце; пациента,
имеющего предсуществующую застойную сердечную недостаточность,
преэклампсию, эклампсию, сахарный диабет, гипертензию,
ишемическую болезнь сердца, протеинурию, почечную
недостаточность, показатель клубочковой фильтрации ниже
диапазона нормальных значений, цирроз, показатель сывороточного
креатинина выше диапазона нормальных значений или сепсис. В
одном варианте осуществления пациент также подвергался
воздействию по меньшей мере одного соединения, выбранного из
группы, включающей нестероидные противовоспалительные
препараты, циклоспорины, такролимус, аминогликозиды, фоскарнет, этиленгликоль, гемоглобин, миоглобин, ифосфамид, тяжелые металлы, метотрексат, рентгеноконтрастные средства или стрептозотоцин. В одном варианте осуществления пациента выбирают для стратификации риска на основе уже поставленного диагноза повреждения, выбранного из группы, включающей почечную функцию, снижение почечной функции или острую почечную недостаточность.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ диагностики повреждения почек у пациента. В одном варианте осуществления способ также включает оценку состояния почек для определения, имеется ли у пациента повреждение почечной функции, снижение почечной функции или ARF. В этих вариантах осуществления результат аналитических измерений, такой как измеренная концентрация НА, DR5 и/или TGFpl, коррелирует с наличием или отсутствием изменения в состоянии почек. В одном варианте осуществления способ диагностики включает выявление наличия или отсутствия повреждения почечной функции. В одном варианте осуществления результат аналитических измерений коррелирует с наличием или отсутствием такого повреждения. В одном варианте осуществления способ диагностики включает выявление наличия или отсутствия сниженной функции почек. В одном варианте осуществления
результат аналитических измерений коррелирует с наличием или
отсутствием повреждения, вызывающего снижение функции почек. В
одном варианте осуществления способ диагностики включает
выявление наличия или отсутствия ARF. В одном варианте
осуществления результат аналитических измерений коррелирует с
наличием или отсутствием повреждения, вызывающего ARF. В одном
варианте осуществления способ диагностики включает выявление
пациента, который нуждается в заместительной почечной терапии.
В одном варианте осуществления результат аналитических
измерений коррелирует с необходимостью проведения
заместительной почечной терапии. В одном варианте осуществления способ диагностики включает выявление пациента, который нуждается пересадке почки. В одном варианте осуществления результат аналитических измерений коррелирует с необходимостью проведения трансплантации почек. В одном варианте осуществления каждую измеренную концентрацию(ии) можно сравнить с пороговым значением. В одном варианте осуществления каждую измеренную концентрацию(ии) можно сравнивать с пороговым значением, чтобы определить либо "возрастающий уровень маркера повреждения почек", либо "уменьшающийся уровень маркера повреждения почек".
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ, включающий мониторинг состояния почек у пациента. В одном варианте осуществления результаты мониторинга сравнивают с наличием или отсутствием изменения в состоянии почек у пациента. В одном варианте осуществления состояние почек ухудшается. В одном варианте осуществления пациент имеет повреждение функции почек. В одном варианте осуществления пациент имеет острую почечную недостаточность. В одном варианте осуществления пациент имеет риск развития повреждения почечной функции в связи с наличием одного или более известных факторов риска преренальной, собственно ренальной или постренальной ARF. В одном варианте осуществления измеренную концентрацию(ии) можно сравнить с пороговым значением. В одном варианте осуществления каждую измеренную концентрацию(ии) можно сравнивать с пороговым значением, чтобы определить либо "возрастающий уровень маркера повреждения почек, либо
"уменьшающийся уровень маркера повреждения почек".
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ классификации повреждения почек у пациента. В одном варианте осуществления способ включает оценку состояния почек у пациента. В одном варианте осуществления состояние почек определяется повреждением почек, выбранным из группы, включающей преренальное, собственно почечное или постренальное повреждение. В одном варианте осуществления на основе состояния почек определяют повреждение почек, выбранное из группы, включающей острое повреждение канальцев, острый гломерулонефрит, острый тубулоинтерстициальный нефрит, острую сосудистую нефропатию или инфильтративную стадию заболевания. В одном варианте осуществления на основе состояния почек оценивают вероятность того, что состояние пациента будет прогрессировать до определенной стадии RIFLE. В одном варианте осуществления результат аналитических измерений представляет собой, например, измеренную концентрацию НА, DR5 и/или TGFpl. В одном варианте осуществления измеренную концентрацию сопоставляют с определенной стадией в классификации повреждения и/или в подклассификации повреждения. В одном варианте осуществления измеренную концентрацию можно сравнивать с пороговым значением. В одном варианте осуществления измеренная концентрация является выше порогового значения, при котором присваивается определенная стадия согласно классификации. В одном варианте осуществления измеренная концентрация является ниже порогового значения, при котором может присваиваться другая стадия в соответствии с классификацией.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ, включающий а) получение; i) пациента, где у пациента наблюдается острое повреждение почек; ii) по меньшей мере двух образцов мочи, полученных у пациента; Ь) выявление устойчиво повышенного уровня гиалуроновой кислоты в образцах мочи; с) заключение о необходимости проведения пациенту длительного диализа. В одном варианте осуществления образцы собирают в первый и четырнадцатый дни после начала заместительной терапии в случае тяжелого повреждения почек. В
одном варианте осуществления способ также включает проведение диагностики у пациента с хронической болезнью почек. В одном варианте осуществления диагностику осуществляют по меньшей мере в течение шестидесяти дней после повреждения почек. В одном варианте осуществления способ также подразумевает включение пациента в программу по предотвращению развития хронической болезни почек.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ, включающий а) получение; i) пациента, где пациент имеет острое повреждение почек, где пациент имеет риск развития хронического заболевания почек; ii) по меньшей мере двух образцов мочи, полученных у пациента; Ь) выявление устойчиво повышенного уровня гиалуроновой кислоты в образцах мочи; с) лечение пациента для предотвращения развития хронической болезни почек. В одном варианте осуществления лечение начинают на 14-й день после заболевания почек.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ, включающий: а) получение; i) пациента, имеющего острое повреждение почек; ii) получение нескольких значений концентраций гиалуроновой кислоты и креатинина в моче у пациента, где значения концентраций получают в динамике по времени; Ь) построение графика уровня гиалуроновой кислоты в моче в динамике по времени, где значения нормализуют к концентрациям креатинина в моче; и с) прогнозирование развития хронической болезни почек. В одном варианте осуществления прогноз включает необходимость проведения долговременной заместительной почечной терапии (т.е., например, диализа).
Определения
В рамках изобретения "повреждение функции почек" представляет собой внезапное (т.е., например, в течение 14 дней, предпочтительно в течение 7 дней, более предпочтительно в течение 72 часов и еще более предпочтительно в течение 4 8 часов) измеряемое снижение показателя функции почек. Такое повреждение функции почек может быть идентифицировано, например, по снижению скорости клубочковой фильтрации (GFR) или рассчитанной GFR (eGFR), по уменьшению диуреза, повышению
сывороточного креатинина, повышению сывороточного цистатина С, по необходимости проведения заместительной почечной терапии (т.е., например, диализа) и т.д.
В рамках изобретения "улучшение функции почек" представляет собой внезапное (т.е., например, в течение 14 дней, предпочтительно в течение 7 дней, более предпочтительно в течение 72 часов и еще более предпочтительно в течение 4 8 часов) измеряемое увеличение показателя функции почек. Предпочтительные способы измерения и/или оценки GFR описаны далее.
В рамках изобретения "сниженная функция почек" представляет собой внезапное (т.е., например, в течение 14 дней, предпочтительно в течение 7 дней, более предпочтительно в течение 72 часов и еще более предпочтительно в течение 4 8 часов) снижение функции почек, установленное по увеличению абсолютного значения сывороточного креатинина до 0,1 мг/дл (> 8,8 мкмоль/л) или выше, увеличению значения сывороточного креатинина в процентах на 20% (1,2-кратное увеличение от исходного значения) или выше, или снижению диуреза (документально зафиксированная олигурия менее 0,5 мл/кг в час).
В рамках изобретения "острая почечная недостаточность" или "ARF" представляет собой внезапное (т.е., например, в течение 14 дней, предпочтительно в течение 7 дней, более предпочтительно в течение 72 часов и еще более предпочтительно в течение 4 8 часов) снижение функции почек, установленное по увеличению абсолютного значения креатинина в сыворотке до 0,3 мг/дл (> 2б,4 мкмоль/л) или выше, увеличению значения сывороточного креатинина в процентах на 50% (1,5-кратное увеличение от исходного значения) или выше, или снижению диуреза (документально зафиксированная олигурия менее 0,5 мл/кг в час в течение по меньшей мере б часов) . Указанный термин является синонимом "острого повреждения почек" или "AKI."
В рамках изобретения термин "относящийся к сигналу, соответствующему наличию или количеству" аналита, относится к результатам аналитических измерений с применением стандартной кривой, рассчитанной с помощью известных концентраций
соответствующего аналита. Специалисту в данной области понятно, что сигналы, полученные в результате проведения количественного анализа, обычно являются видимым результатом образования комплексов, например, между одним или более антителами и биомолекулой-мишенью (т.е., например, аналитом) и/или полипептидами, содержащими эпитоп(ы), например, с которым связываются антитела. Несмотря на то, что такие тесты могут выявлять полноразмерный биомаркер и результат теста может быть выражен в виде концентрации соответствующего биомаркера, сигнал, получаемый в результате теста, в действительности является результатом определения всех таких "иммунореактивных" полипептидов, представленных в образце.
Термин тест "выполнен с возможностью выявления" аналита, используется в описании, если тест может производить обнаруживаемый сигнал, свидетельствующий о наличии или о величине физиологически значимой концентрации аналита. Например, эпитоп, распознаваемый антителом, обычно составляет порядка 8 аминокислот, так что иммунотест сможет быть выполнен с возможностью обнаружения интересующего маркера, который также будет выявлять полипептиды, с последовательностями, родственными последовательности маркера, при условии, что указанные полипептиды содержат эпитоп(ы), необходимый для связывания с антителом или антителами, используемыми в тесте.
Термин "соответствующий маркер" в рамках изобретения
используется в отношении биомаркера, такого как один из
почечных биомаркеров (т.е., например, маркер повреждения
почек), описанных здесь. Соответствующий маркер также может
обозначать один или более фрагментов, вариантов и т.д.
конкретного маркера или его биосинтетического предшественника,
который может быть выявлен в качестве заместителя самого
маркера или в качестве независимых биомаркеров. Термин также
относится к одному или более полипептидам, представленным в
биологическом образце, которые происходят из предшественника
биомаркера, образующим комплексы с дополнительными
соединениями, такими как связывающие белки, рецепторы, гепарин, липиды, сахара и т.д.
Термин "лицо" или "пациент" в рамках изобретения относится к человеческому или нечеловеческому организму. Таким образом, способы и композиции, описанные здесь в равной степени применимы к заболеванию человека и животных. Кроме того, несмотря на то, что лицо или пациент предпочтительно является живым организмом, изобретение, описываемое здесь, также может быть использовано при проведении посмертного анализа. Предпочтительные лица или пациенты являются человеком, что в рамках изобретения обозначает живого человека, который получает медицинскую помощь в связи с заболеванием или состоянием.
Термин "аналит" в данном контексте, относится к любому измеряемому соединению или молекуле. Предпочтительно, аналит измеряют в образце (т.е., например, в образце жидкости тела). Такой образец может быть получен у лица или пациента, или может быть получен из биологических материалов, предназначенных для предоставления лицу или пациенту. Например, образец может быть получен из почки, которую оценивают для возможной трансплантации пациенту, так что измерение аналита может использоваться для оценки почек на предмет предсуществующего повреждения.
Термин "образец биологической жидкости" в рамках изобретения обозначает любой образец физиологической жидкости, полученный с целью определения диагноза, прогноза, классификации состояния или оценки состояния здоровья соответствующего пациента, например, пациента или донора трансплантата. В определенных вариантах осуществления такой образец может быть получен с целью определения существующего медицинского состояния или действия схемы лечения на состояние здоровья. Предпочтительные образцы биологической жидкости включают, но без ограничения кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, мочу, слюну, слюну или плевральные экссудаты. Кроме того, анализ определенных образцов биологической жидкости можно без труда осуществить после процедуры фракционирования или очистки, например, выделения из цельной крови компонентов сыворотки или плазмы.
способам, с помощью которых подготовленный медицинский специалист может оценить и/или определить вероятность (т.е., например, возможность) наличия или отсутствия у пациента или данного заболевания или состояния. В случае настоящего изобретения "диагноз" включает сопоставление результатов теста
(т.е., например, иммунотеста) на наличие почечного биомаркера настоящего изобретения, необязательно вместе с другими клиническими признаками, для определения наличия или отсутствия острого поражения почек или острой почечной недостаточности у лица или пациента, у которого получали образец, и проводили анализ образца. Если "определяется" такой диагноз, то это не означает, что диагноз является на 100% точным. Таким образом, например, измеренный уровень биомаркера, не превьшающий установленный диагностический порог, может указывать на большую вероятность наличия заболевания у пациента, по сравнению с измеренным уровнем биомаркера, превышающим установленный диагностический порог, который указывает на меньшую вероятность наличия того же самого заболевания.
Термин "прогноз" в рамках изобретения обозначает вероятность (т.е., например, возможность) осуществления определенного клинического исхода. Например, уровень или изменение уровня прогностического индикатора, который в свою очередь связан с повышенной вероятностью заболеваемости
(например, ухудшение функции почек, последующая ARF или смерть), называется "свидетельствующий о повышенной вероятности" неблагоприятного исхода у пациента.
Термин критерии "RIFLE" в рамках изобретения обозначает систему количественной клинической оценки состояния почек, применяемую для установления категорий Риска, Повреждения, Недостаточности и Терминальной стадии почечной недостаточности на основе унифицированного определения острого повреждения почек (AKI). См. публикации Kellum, Crit. Care Med. 36: S141-45
(2008); и Ricci et al, Kidney Int. 73, 538-546 (2008), каждая из которых включена в описание посредством ссылки во всей полноте.
изобретения предусматривает альтернативную систему
классификации для стратификации пациентов с AKI, и может включать стадию I, стадию II и/или стадию III. См. публикацию Mehta et al. , Crit. Care 11:R31 (2007), которая включена в описание посредством ссылки во всей полноте.
Термин "стадия I" в рамках изобретения относится к стратификации риска, включающей категорию риска согласно RIFLE, характеризующуюся повышением сывороточного креатинина на 0,3 мг/дл (> 26,4 мкмоль/л) или более, и/или увеличением на 150% (в 1,5 раза) или более от исходного значения. Альтернативно указанную категорию можно описать значением диуреза менее 0,5 мл/кг в час в течение более чем б часов.
Термин "стадия II" в данном контексте относится к стратификации риска, включающей категорию повреждения согласно RIFLE, характеризующуюся повышением сывороточного креатинина более чем на 200% (> 2-кратное) от исходного значения. Альтернативно указанную категорию можно описать значением диуреза менее 0,5 мл/кг в час в течение более чем 12 часов.
Термин "стадия III" в рамках изобретения относится к стратификации риска, включающей категорию утраты функции почек согласно RIFLE, характеризующуюся повышением сывороточного креатинина более чем на 300%) (> 3-кратное повышение) от исходного значения и/или значением сывороточного креатинина > 354 мкмоль/л, в сочетании с резким повышением по меньшей мере на 44 мкмоль/л. Альтернативно указанную категорию можно описать снижением значения диуреза менее 0,3 мл/кг в час в течение 24 часов или анурией в течение 12 часов.
Термин "категория риска" в рамках изобретения относится к классификации RIFLE, в которой в терминах сывороточного креатинина означает увеличение по меньшей мере в 1,5 раза от исходного значения, или снижение продукции мочи <0,5 мл/кг веса тела/час в течение приблизительно б часов.
Термин "категория повреждения" в рамках изобретения включена в соответствии с классификацией RIFLE, в которой в терминах сывороточного креатинина означает увеличение по меньшей мере в 2,0 раза от исходного значения или снижение
продукции мочи <0,5 мл/кг/час в течение 12 часов.
Термин "категория недостаточности функции почек", который используется в описании, включает в соответствии с классификацией RIFLE, в терминах значений сывороточного креатинина увеличение по меньшей мере в 3 раза от исходного значения или значение креатинина в моче > 355 мкмоль/л (при увеличении > 44 мкмоль/л) или диурез ниже 0,3 мл/кг/час в течение 24 часов, или анурию по меньшей мере в течение 12 часов.
Термин "категория утраты функции" в рамках изобретения
обозначает риск клинического исхода и/или категорию согласно
классификации RIFLE, где риск клинического исхода
характеризуется постоянной необходимостью проведения
заместительной почечной терапии в течение более чем четырех недель.
Термин "категория терминальной стадии почечной недостаточности" или "категория ESRD" в данном контексте, обозначает риск клинического исхода и/или категорию согласно RIFLE, характеризующиеся необходимостью проведения диализа в течение более чем 3 месяцев.
Термин "риск клинического исхода" в рамках изобретения обозначает медицинский прогноз, относящийся либо к восстановлению функции почек, либо к невосстановлению функции почек.
Термин "почечный биомаркер" в рамках изобретения обозначает любое биологическое соединение, связанное с прогрессирующим развитием хронического заболевания почек. В частности, почечный биомаркер может быть маркером повреждения почек. Например, почечный биомаркер может включать гиалуроновую кислоту, рецептор смерти 5, трансформирующий фактор роста (31 или любой из их метаболитов и/или производных.
Термин "положительный биомаркер" в том виде, как термин используется в описании, относится к любому биомаркеру, который определяют как повышенный у пациентов, имеющих заболевание или состояние, при сравнении с пациентами, не имеющими указанное заболевание или состояние.
Термин "отрицательный биомаркер" в том виде, как термин используется в описании, относится к любому биомаркеру, который определяют как сниженный у пациентов, имеющих заболевание или состояние, при сравнении с пациентами, не имеющими указанное заболевание или состояние.
Термин "положительное значение почечного биомаркера" в
данном контексте обозначает повышенную вероятность (т.е.,
например, повышенную возможность) последующего повреждения
функции почек, установленную для пациента, если измеренная
концентрация биомаркера выше определенного порогового значения,
по сравнению с установленной вероятностью, в случае, когда
измеренная концентрация биомаркера ниже определенного
порогового значения. Альтернативно, если измеренная
концентрация биомаркера ниже определенного порогового значения, повышенная вероятность отсутствия повреждения функции почек может быть установлена у пациента, по сравнению с вероятностью, установленной в случае когда измеренная концентрация биомаркера выше определенного порогового значения. Альтернативно, если измеренная концентрация биомаркера ниже определенного порогового значения, у пациента может быть установлено улучшение функции. Положительный маркер повреждения почек может включать, но без ограничения, повышенную вероятность одного или более из перечисленных состояний: острое повреждение почек, прогрессирование заболевания до более тяжелой стадии по шкале AKI, смерть, необходимость проведения заместительной почечной терапии, необходимость удаления токсических веществ, образующихся при повреждении почек, терминальная стадия почечной недостаточности, сердечная недостаточность, инсульт, инфаркт миокарда, развитие хронической болезни почек и т.д.
Термин "отрицательное значение почечного биомаркера" в рамках изобретения обозначает повышенную вероятность (т.е., например, повышенную возможность) последующего повреждения функции почек, установленную у пациента, если измеренная концентрация биомаркера ниже порогового значения, по сравнению с вероятностью, установленной в случае, когда измеренная концентрация биомаркера выше порогового значения.
Альтернативно, если измеренная концентрация биомаркера выше
порогового значения, повышенная вероятность отсутствия
повреждения функции почек может быть установлена у пациента, по
сравнению с вероятностью, установленной в случае, когда
измеренная концентрация биомаркера ниже определенного
порогового значения. Альтернативно, если измеренная
концентрация биомаркера выше порогового значения, у пациента может быть установлено улучшение функции. Отрицательный маркер повреждения почек может включать, но без ограничения, повышенную вероятность одного или более из перечисленного: острое повреждение почек, прогрессирование до следующей стадии AKI, смерть, необходимость проведения заместительной почечной терапии, необходимость удаления токсических веществ, образующихся при повреждении почек, терминальная стадия почечной недостаточности, сердечная недостаточность, инсульт, инфаркт миокарда, развитие хронической болезни почек и т.д.
Термин "предшествующий" и "предсуществование" в рамках изобретения обозначает любой фактор риска (т.е., например, почечный биомаркер), существующий в тот момент, когда образец биологической жидкости получают у пациента.
Термин "прогнозирование" в рамках изобретения относится к способу формирования прогноза и/или предоставлению стратификации риска, где подготовленный медицинский сотрудник проводит анализ информации, касающейся биомаркера, и необязательно вместе с соответствующими клиническими признаками и/или демографическими данными.
Термин "острое заболевание почек/острая
недостаточность/острое повреждение" в рамках изобретения обозначает любое прогрессирующее ухудшение почечной функции в течение часов или дней, приводящее к задержке азотистых продуктов распада (таких как азот мочевины) и креатинина в крови. Задержка указанных веществ также может обозначаться как азотемия. См. в публикации Current Medical Diagnosis & Treatment 2008, 47th Ed, McGraw Hill, New York, стр. 785-815, которая включена в описание посредством ссылки во всей полноте.
почек/недостаточность/повреждение" в рамках изобретения обозначает медицинское состояние, типичные симптомы которого могут включать, но без ограничения гиперфосфатемию (т.е., например, > 4,б мг/дл) или низкие значения скорости клубочковой фильтрации (т.е., например, <90 мл/минуту на 1,7 3 м2 поверхности тела). Однако многие пациенты с CKD могут иметь нормальные уровни фосфатов в сыворотке в сочетании с устойчивым снижением скорости клубочковой фильтрации в течение 3 или более месяцев, или нормальное значение GFR в сочетании с подтвержденными данными о структурном нарушении почек. В некоторых случаях пациентам, у которых диагностирована хроническая болезнь почек, проводят гемодиализ для поддержания нормального гомеостаза крови (т.е., например, уровней мочевины и фосфатов). Альтернативно "хроническая болезнь почек" обозначает медицинское состояние, при котором пациент имеет либо i) устойчивое снижение GFR <б0 мл/мин на 1,73 м2 поверхности тела в течение 3 или более месяцев; либо ii) структурное или функциональное нарушение функции почек в течение 3 или более месяцев даже при отсутствии снижения GFR. Структурные или анатомические нарушения почек можно определить как, но не ограничиваясь ими, персистирующая микроальбуминурия или протеинурия или гематурия, или наличие кист почек. Хроническая почечная недостаточность (хроническая болезнь почек) также может возникнуть в результате патологической утраты функции почек в течение месяцев или лет. См. публикацию: Current Medical Diagnosis & Treatment 2008, 47th Ed, McGraw Hill, New York, pages 785-815, которая включена в описание посредством ссылки во всей полноте.
Термин "приблизительно" в данном описании в контексте любых результатов аналитических измерений обозначает отклонение +/- 5% от данного результата измерения.
Термин "без симптомов" в данном контексте, относится к лицу и/или пациенту, который не имеет заболевания и/или повреждения почек, где симптом заболевания и/или повреждения почек может включать, но без ограничения снижение скорости клубочковой фильтрации (т.е., например, приблизительно 70-89
мл/мин на 1,73 м2 поверхности тела) в течение менее чем трех месяцев.
Термин "скорость клубочковой фильтрации" в рамках изобретения обозначает любое измерение, способное обеспечить определение функции почек. В целом, нормальная скорость клубочковой фильтрации находится в пределах приблизительно 12 090 мл/минуту на 1,73 м2 поверхности тела. Функцию почек считают сниженной при значениях скорости клубочковой фильтрации ниже 90 мл/минуту на 1,73 м2 поверхности тела. Развитие почечной недостаточности возможно в тех случаях, когда значения скорости клубочковой фильтрации опускаются ниже приблизительно 3 0 мл/минуту на 1,7 3 м2 поверхности тела. Обычно диализ задействуют, если значения скорости клубочковой фильтрации опускаются ниже приблизительно 15 мл/минуту на 1,7 3 м2 поверхности тела.
Термин "почечная недостаточность" в рамках изобретения обозначает любую острую внезапную и/или хроническую утрату способности почек удалять продукты жизнедеятельности и концентрировать мочу без потери электролитов.
Термин "биологический образец" в рамках изобретения обозначает любой материал, полученный из живого организма. Например, образец может быть получен из крови, также как и образец мочи, образец сыворотки, образец плазмы и/или образец цельной крови. Альтернативно, образец может быть получен из ткани, отобранной, например, при биопсии. Такой образец ткани может включать, например, ткань почки, сосудистую ткань и/или ткань сердца. Биологический образец также может включать биологические жидкости, включая, но без ограничения, мочу, слюну или пот.
Термин "реагент" в рамках изобретения обозначает любое вещество, используемое для проведения химической реакции с тем, чтобы выявить, измерить, получить и т.д. другие вещества.
Термин "антитело" в рамках изобретения обозначает любой пептид или полипептид, образованный из, смоделированный на основе гена иммуноглобулина, или по существу кодируемый геном иммуноглобулина или генами иммуноглобулина, или их фрагменты,
способные к специфическому связыванию с антигеном или эпитопом. См., например, в Fundamental Immunology, 3rd Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1 93); Wilson et al., J. Immunol. Methods 175:267-273 (1994); и Yarmush et al, J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97 (1992). Термин "антитело" включает, но без ограничения, антигенсвязывающие элементы т.е. "антигенсвязывающие сайты", примерами которых являются фрагменты, субпоследовательности и/или области, определяющие комплементарность (CDR), которые сохраняют способность связывать антиген, включая, но без ограничения: (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, включающий домены VL, VH, CL или CHi; (ii) F (ab' )2~Фрагмент, бивалентный фрагмент, включающий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd фрагмент, включающий домены VH и Сщ; (iv) Fv-фрагмент, включающий домены VL и VH одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al. , Nature 341:544-546 (1989)), который включает домен VH; или (vi) изолированный гипервариабельный участок (CDR). Одноцепочечные антитела также включены посредством ссылки в термин "антитело".
Термин "эпитоп" в рамках изобретения обозначает любую антигенную детерминанту, способную к специфическому связыванию с антителом. Эпитопы, как правило, состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и, как правило, имеют характеристики специфической трехмерной структуры, а также специфические характеристики зарядов.
Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с эпитопами первого, но не второго типа нарушается в присутствии денатурирующих растворителей.
Термин "сравнение" в данном контексте, в отношении применения биомаркеров, обозначает сравнение наличия и/или количества биомаркера (биомаркеров) у пациента с наличием и/или количеством биомаркера у пациентов, которые заведомо имеют данное состояние или имеют повышенный риск развития данного состояния; или сравнение с пациентами, которые заведомо не имеют указанного состояния. Часто, сравнение представлено в
виде сравнения результата теста, выраженного в виде концентрации биомаркера, с заданным пороговым значением, выбранным таким образом, чтобы оно свидетельствовало о наличии или отсутствии заболевания или вероятности какого-либо исхода заболевания в будущем.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 представлены экспериментальные данные, иллюстрирующие экскрецию гиалуроновой кислоты с мочой, нормализованную к значению креатинина в моче у пациентов с проявлениями острого повреждения почек. Образцы получали между первым и четырнадцатым днями после начала заместительной терапии при тяжелом остром повреждении почек (т.е., Dl, D7 и D14). Представленные данные представляют собой результаты, полученные у пациентов, у которых наблюдалось или не наблюдалось выздоровление в течение двадцати восьми дней после повреждения почек (R28 и NR28, соответственно).
На фигуре 2 представлены экспериментальные данные, иллюстрирующие различия в абсолютных значениях в образцах мочи, полученных в Dl, D7 и/или D14, у пациентов, у которых наблюдалось или не наблюдалось выздоровление в течение двадцати восьми дней после повреждения почек (R2 8 и NR2 8, соответственно).
На фигуре 3 представлены экспериментальные данные, иллюстрирующие различия в абсолютных значениях в образцах мочи, полученных в Dl, D7 и/или D14, у пациентов, у которых наблюдалось или не наблюдалось выздоровление в течение шестидесяти дней после повреждения почек (R60 и NR60, соответственно).
На фигуре 4 представлены экспериментальные данные, иллюстрирующие различия в относительных значениях в образцах мочи, полученных в Dl, D7 и/или D14 у пациентов, у которых наблюдалось или не наблюдалось выздоровление в течение двадцати восьми дней после повреждения почек (R2 8 и NR2 8, соответственно).
На фигуре 5 представлены экспериментальные данные, иллюстрирующие различия в относительных значениях в образцах
мочи, полученных в Dl, D7 и/или D14 у пациентов, у которых наблюдалось или не наблюдалось выздоровление в течение шестидесяти дней после повреждения почек (R60 и NR60, соответственно).
На фигуре б представлены экспериментальные данные, иллюстрирующие высокую чувствительность способа прогнозирования необходимости проведения диализа у пациентов в течение шестидесяти дней после повреждения почек, в тех случаях, когда экскреция НА устойчиво возрастала между D1 и D14.
На фигуре 7 представлены экспериментальные данные, иллюстрирующие отношение значений TGF-pl/креатинин в моче в течение первых двадцати одного дня после наступления AKI. Значения указанного отношения были значительно выше у невыздоровевших пациентов как в 7-й день, так и в 14-й день.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области профилактики и лечения заболевания почек. Лечение заболевания почек может быть изменено в зависимости от необходимости или вероятности продолжительного диализа. Например, заключение о необходимости проведения продолжительного диализа может быть сделано на основе мониторинга мочевых биомаркеров, связанных с развитием хронического заболевания почек. Например, динамику показателей стандартизированных концентраций гиалуроновой кислоты, рецептора смерти 5 и/или трансформирующего фактора роста (31, измеряемых в течение примерно четырнадцати дней, можно использовать для определения вероятности излечения по сравнению с отсутствием вероятности излечения у пациента, имеющего острое повреждение почек.
Долгое время в данной области существовала потребность в возможности оптимизации усилий исследователей, направленных на лечение AKI и предотвращение CKD, в соответствии с долгосрочным прогнозом для применения более эффективной клинической стратегии. При использовании такого способа пациенты с прогнозом невосстановления функции почек могли бы избирательно получать более агрессивное лечение. С другой стороны, пациенты с благоприятным прогнозом могли бы избежать более агрессивных
видов вмешательства и их возможных побочных эффектов.
Различные варианты осуществления, представленные здесь, предназначены для решения различных проблем в данной области, которые до настоящего времени ограничивали возможность клиницистов по составлению точного прогноза, кто из пациентов выздоровеет и кто из пациентов не выздоровеет в результате заболевания и/или поражения почек.
I. Повреждение и/или заболевание почек
Почки ответственны за выведение из организма воды и растворенных веществ. Их функции включают поддержание кислотно-щелочного баланса, регуляцию концентрации электролитов, контроль объема циркулирующей крови и регуляцию кровяного давления. В связи с этим, утрата функции почек в результате повреждения и/или заболевания приводит к значительной заболеваемости и летальности. Подробное обсуждение повреждений почек представлено в публикации Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Ed., McGraw Hill, New York, pages 17411830, которая включена в описание посредством ссылки во всей своей полноте. Почки расположены в поясничной области (на задней стенке брюшной полости в верхнем отделе по обе стороны от позвоночника). Они находятся глубоко внутри брюшной полости и защищены позвоночником, нижними ребрами грудной клетки и сильными мышцами спины. Такое расположение защищает почки от воздействия многих внешних факторов. Почки неслучайно хорошо защищены, они представляют собой высоко васкуляризированные органы, то есть они обильно кровоснабжаются. В случае повреждения почек может возникнуть серьезное кровотечение.
Почки могут быть повреждены при нарушении кровеносных сосудов, которые снабжают почки кровью или отводят кровь от почек.
Нарушение может быть в форме аневризмы, артериовенозного свища, артериальной блокады или тромбоза почечной вены. Объем кровотечения зависит от места и степени повреждения. Также возможно профузное кровотечение почек при их центральном повреждении (изнутри), что является опасным для жизни повреждением. К счастью, большинство повреждений почек,
вызванных тупой травмой, происходят периферически, вызывая только ушиб почек (обычно самоизлечивающийся процесс).
Пациенты с недиагностированными почечными состояниями, такими как ангиомиолипома (доброкачественная опухоль), непроходимость мочеточнико-тазового сочленения, (врожденная или приобретенная обструкция UPJ), и другие нарушения, наиболее подвержены повреждениям почек и имеют большую вероятность получить серьезные осложнения, если повреждения имеют место. Другими причинами повреждения почек и кровотечения являются медицинские манипуляции. Процедуры биопсии почек, установки нефростом или другие хирургические операции могут вызывать атипичное соединение артерии и вены (артериовенозный свищ). Обычно такое состояние является самоограничивающейся проблемой, но обычно необходимо тщательное наблюдение. Повреждение почек также может сопровождаться нарушением мочевыводящих путей, вызывающим истечение мочи из почки.
Каждая почка фильтрует приблизительно 1700 литров крови в день и концентрирует жидкость и продукты жизнедеятельности приблизительно в 1 литр мочи в день. Поэтому почки подвергаются воздействию токсических веществ едва ли не больше, чем любой другой орган в организме. В связи с этим, они очень чувствительны к повреждению, вызванному токсическими веществами. Анальгетическая нефропатия является одним из наиболее часто встречающихся типов токсического повреждения. Воздействие свинца, чистящих средств, растворителей, различных видов топлива или других нефротоксических химических веществ (веществ, которые могут быть токсичны для почек), может повреждать почки. Избыточное образование продуктов жизнедеятельности организма, таких как мочевая кислота, (которое может иметь место при подагре или при лечении заболеваний костного мозга, лимфатических узлов или при других нарушениях) также может повреждать почки.
Воспаление (раздражение с отеком и при наличии дополнительных иммуноцитов) , вызванное иммунными ответами на различные виды лечения, инфекцию или другие нарушения, также может повреждать структуры почек, обычно вызывая различные типы
гломерулонефрита или острый тубулярный некроз (омертвление ткани). Аутоиммунные нарушения также могут повреждать почки. Повреждение почек может приводить к кратковременному нарушению с минимальными симптомами или без симптомов. Альтернативно повреждение может представлять угрозу для жизни вследствие кровотечения и связанного с ним шока, или может приводить к острой почечной недостаточности или хронической почечной недостаточности.
Повреждения мочеточника (повреждения трубочек, по которым моча поступает из почек в мочевой пузырь) могут быть вызваны травмой (тупой или проникающей), осложнениями медицинских процедур, и другими заболеваниями в забрюшинном пространстве, такими как ретроперитонеальный фиброз (RPF), забрюшинные саркомы, или раки с метастатическими лимфоузлами. Медицинские вмешательства (такие как хирургические операции OB/GYN перед лучевой терапией или химиотерапией и предшествующие операции на органах брюшной и тазовой полости) повышают риск повреждений мочеточников.
А. Острая почечная недостаточность
Острая (внезапная) почечная недостаточность представляет собой внезапную потерю способности почек удалять продукты метаболизма и концентрировать мочу без потери электролитов. Повреждение почек может быть вызвано многими различными причинами, включая, но без ограничения, снижение кровотока, которое может происходить в случае очень низкого кровяного давления, вызванного травмой, хирургической операцией, серьезными заболеваниями, септическим шоком, кровопотерей, ожогами или дегидратацией, острым тубулярным некрозом (ATN), инфекции, которые поражают непосредственно почки, такие как острый пиелонефрит или сепсис, блокада мочевыводящих путей (обструктивная уропатия), аутоиммунное заболевание почек, такое как интерстициальный нефрит или острый нефротический синдром, нарушения, которые вызывают образование тромбов в мелких кровеносных сосудах почек, идиопатическая тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ITTP), трансфузионная реакция, злокачественная гипертензия, склеродермия, гемолитико
уремический синдром, нарушения при родах, такие как отслойка плаценты с кровотечением или предлежание плаценты.
Симптомы острой почечной недостаточности могут включать,
но не ограничиваться ими, уменьшение количества мочи
(олигурия), задержки поступления мочи (анурия), обильное
мочеиспускание ночью, отек лодыжек, ступней и ног,
генерализованный отек, задержка жидкости, снижение
чувствительности в особенности ладоней и стоп, сниженный аппетит, металлический вкус во рту, упорная икота, изменения психического состояния или настроения, тревожное возбуждение, сонливость, длительный сон, бредовое состояние или спутанность сознания, кома, перепады настроения, затруднение при концентрации внимания, галлюцинации, медленные вялые движения, конвульсии, тремор рук (дражание), тошнота или рвота, которые могут продолжаться в течение нескольких дней, склонность к возникновению синяков, длительное кровотечение, носовые кровотечения, кровянистый стул, боль в боку (между ребрами и бедрами), утомляемость, запах при дыхании или высокое кровяное давление.
Острая почечная недостаточность (ARF) также может обозначаться как острое повреждение почек (AKI) и может быть описано как внезапное (т.е., например, обычно обнаруживаемое в течение приблизительно от 4 8 часов до 1 недели) снижение скорости клубочковой фильтрации (GFR). Указанная утрата фильтрующей способности приводит к задержке в организме азотистых (мочевина и креатинин) и неазотистых продуктов жизнедеятельности, которые в норме экскретируются почками, снижению диуреза или к обоим последствиям. Сообщается, что ARF возникает в виде осложнения приблизительно у 5% госпитализированных пациентов, в 4-15% случаев операций в условиях искусственного кровообращения, и вплоть до 30% случаев поступлений в реанимационное отделение. ARF могут быть классифицированы по происхождению как преренальные, собственно ренальные или постренальные. Собственно ренальное заболевание может далее подразделяться на клубочковые, канальцевые, интерстициальные и васкулярные нарушения. Основные причины ARF
Типичные факторы риска развития острой почечной
недостаточности
описаны совместно с соответствующими факторами риска и сформулированы ниже. См. таблицу 1; в публикации: Merck Manual, 17th ed., Chapter 222, которая включена в описание посредством ссылки во всей полноте.
Пониженный тонус выносящих артериол (приводящий к снижению GFR в результате снижения клубочкового транскапиллярного давления особенно у пациентов с
билатеральным стенозом почечной артерии)
Ингибиторы АСЕ или блокаторы рецептора ангиотензина II
Собственно ренальный
Острое повреждение канальцев
Ишемия (продолжительное или тяжелое преренальное состояние): операция, кровотечение, артериальная или венозная обструкция; токсины: NSAID, циклоспорины, такролимус, аминогликозиды, фоскарнет, этиленгликоль, гемоглобин, миоглобин, ифосфамид, тяжелые металлы, метотрексат, рентгеноконтрастные средства, стрептозотоцин
Острый гломерулонефрит
ANCA-асоциированный: серповидный гломерулонефрит, нодозный полиартериит, синдром Вегенера; гломерулонефрит, вызванный антителами к ГБМ: синдром Гудпасчера; иммунокомплексный гломерулонефрит: волчаночный гломерулонефрит, постинфекционный гломерулонефрит, криоглобулиновый гломерулонефрит
Острый
тубулоинтерстициальный нефрит
реакция на лекарства (например, р-лактамы, NSAID, сульфаниламиды, ципрофлоксацин, тиазидный диуретик, фуросемид, фенитоин, аллопуринол), пиелонефрит, сосочковый некроз
Острая сосудистая нефропатия
васкулит, злокачественная гипертензия, тромботические микроангиопатии, склеродермия, атероэмболия
Инфиль тративные заболевания
Лимфома, саркоидоз, лейкемия
Постренальный
Преципитация в канальцах
Мочевая кислота (распад опухоли), сульфаниламиды, триамтерен, ацикловир, индинавир, метотрексат, прием внутрь полиэтиленгликоля, миеломный белок, миоглобин
Обструкция мочеточника
Внутренние: цилиндры, сгустки, отторгающаяся почечная ткань, грибковый шар, отек, злокачественная опухоль, врожденные дефекты; внешние: злокачественная опухоль, ретроперитонеальный фиброз, травма мочеточника при операции или при при повреждении, вызванном сильным ударом
Обструкция мочевого пузыря
Механическая: доброкачественная простатическая гиперплазия, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, стриктуры уретры, фимоз, парафимоз, клапаны уретры, нарушение проходимости постоянного мочевого катетера; нейрогенная: антихолинергические средства, повреждение верхнего или нижнего мотонейрона
В случае ишемической ARF, течение болезни можно разделить на четыре фазы. Во время начальной фазы, которая продолжается часы или дни, сниженная перфузия почек перерастает в повреждение. Клубочковая ультрафильтрация уменьшается, поток фильтрата снижается из-за наличия дебриса в канальцах, и происходит обратное истечение фильтрата через поврежденный
эпителий. Повреждение почек может быть опосредовано во время
данной фазы реперфузией почек. После инициации следует фаза
распространения повреждения, которая характеризуется
продолжающимся ишемическим повреждением и воспалением, и может включать повреждение эндотелия и застой крови в сосудах, и продолжительность которой составляет 1-2 недели, происходит повреждение почечных клеток, и клубочковая фильтрация и диурез достигают минимума. Затем может наступать фаза восстановления, во время которой восстанавливается почечный эпителий и постепенно восстанавливается GFR. Несмотря на это, выживаемость пациентов с ARF может составлять приблизительно до 60%.
Острое повреждение почек, вызванное радиоконтрастными реагентами (также называемыми контрастными средствами) и другими нефротоксинами, такими как циклоспорин, антибиотики, включая аминогликозиды и противораковые лекарственные препараты, такие как цисплатин, проявляется в течение периода времени, составляющего от нескольких дней до недели. Контраст-индуцированная нефропатия (CIN, которая представляет собой AKI, вызванное рентгеноконтрастными средствами), как считают, вызвана внутрипочечным сужением сосудов (приводящим к ишемическому повреждению) и возникает в результате образования активных форм кислорода, которые оказывают прямое токсическое действие на эпителиальные клетки почечных канальцев. Обычно CIN описывается как острое (начало в течение 24-48 часов), но обратимое (пик заболевания 3-5 дней, разрешение в течение 1 недели) возрастание азота мочевины крови и сывороточного креатинина.
Обычно описываемые критерии для определения и выявления AKI представляют собой внезапное (обычно в течение приблизительно 2-7 дней или в течение периода госпитализации) повышение сывороточного креатинина. Хотя использование повышенного уровня сывороточного креатинина для определения и выявления AKI хорошо обосновано, значение увеличения сывороточного креатинина и время, в течение которого его измеряют для определения AKI, значительно варьируют в публикациях. Обычно относительно большие значения увеличения
сывороточного креатинина, например, увеличение на 100%, 200%, увеличение по меньшей мере на 100% до значения свыше 2 мг/дл и другие определения использовали для выявления AKI. Однако тенденция последнего времени направлена на применение небольших значений увеличения сывороточного креатинина для определения AKI.
Например, сообщалось, что связь между повышенным сывороточным креатинином и AKI ассоциирована с рисками для здоровья. Praught et al. , Curr Opin Nephrol Hypertens 14:265270 (2005); и Chertow et al, J Am Soc Nephrol 16:3365-3370
(2 005) (обе публикации включены в описание посредством ссылки во всей полноте). Как описано в указанных публикациях, известно, что острое ухудшение почечной функции (AKI) и повышенный риск смерти и другие неблагоприятные исходы ассоциированы с очень небольшими значениями увеличения сывороточного креатинина. Указанные повышенные значения креатинина могут быть определены в виде относительной
(процентной) величины или в виде номинальной величины. Сообщалось, что увеличение относительных значений сывороточного креатинина в пределах 2 0% от значения до повреждения является признаком острого ухудшения функции почек (AKI) и повышенного риска для здоровья, но наиболее часто описываемым в литературе значением для определения AKI и повышенного риска для здоровья является относительное увеличение креатинина по меньшей мере на 25%. Сообщалось, что увеличение номинальных значений на 0,3 мг/дл, 0,2 мг/дл или даже на 0,1 мг/дл является признаком ухудшения функции почек и повышенного риска смерти. Различные периоды времени, в течение которых сывороточный креатинин возрастал до указанных пороговых значений, использовали для определения AKI, например, находящиеся в пределах 2 дней, 3 дней, 7 дней, или варьирующийся период времени, определяемый как время пребывания пациента в больнице или в реанимационном отделении. Указанные исследования показывают, что не существует определенного порогового значения увеличения сывороточного креатинина (или периода времени, в течение которого происходит увеличение сывороточного креатинина) при ухудшении функции
почек или AKI, но скорее непрерывное возрастание риска вместе с возрастанием значения сывороточного креатинина.
В другом исследовании сравнивали концентрации сывороточного креатинина с показателями послеоперационной смертности. После операции на сердце пациенты с умеренным снижением сывороточного креатинина (т.е., например, приблизительно от -0,1 до -0,3 мг/дл) имели самый низкий показатель смертности, при этом у пациентов наблюдали более высокий показатель смертности, ассоциированный либо со значительным снижением сывороточного креатинина (т.е., например, больше или равный -0,4 мг/дл), либо с повышением сывороточного креатинина. См. публикацию Lassnigg et al., J Am Soc Nephrol 15:1597-1605 (2004), которая включена в описание посредством ссылки во всей полноте. Указанные результаты исследований позволяют предположить, что даже едва уловимые изменения функции почек, обнаруживаемые по небольшим изменениям уровня креатинина в течение 4 8 часов после проведения операции, могут помочь в прогнозировании исхода заболевания у пациента.
Единая система классификации с использованием сывороточного креатинина для определения AKI в клинических испытаниях и в клинической практике была предложена для стратификации пациентов с AKI. См. публикацию Bellomo et al. , Crit Care 8(4):R204-212 (2004), которая включена в описание посредством ссылки во всей полноте. Например, увеличение сывороточного креатинина на 25% может быть использовано для выявления контраст-индуцированной нефропатии. См. публикацию McCollough et al, Rev Cardiovasc Med. 7(4): 177- 197 (2006), которая включена в описание посредством ссылки во всей полноте. Хотя различные группы исследователей предлагают несколько отличающиеся критерии использования сывороточного креатинина для выявления AKI, общее мнение заключается в том, что небольшие изменения сывороточного креатинина, например, на 0,3 мг/дл (т.е., например, приблизительно на 25%) являются достаточными для выявления AKI, что является отличительным признаком ухудшения функции почек, и что величина изменения сывороточного креатинина может быть показателем тяжести AKI и
риска смерти.
Хотя серия измерений сывороточного креатинина в течение нескольких дней является распространенным методом выявления и диагностики AKI у пациентов, как правило, считают, что использование показателя сывороточного креатинина имеет несколько серьезных ограничений при диагностике, оценке и мониторинге пациентов с AKI. Период времени, в течение которого сывороточный креатинин увеличивается приблизительно на 0,3 мг/дл (25%), считается диагностическим и в случае AKI может составлять 4 8 часов или больше в зависимости от используемого метода определения. Поскольку повреждение клеток при AKI может произойти в течение нескольких часов, увеличение уровней сывороточного креатинина, выявляемое в течение 4 8 часов или более, может оказаться несвоевременным показателем повреждения, и, опираясь на значение сывороточного креатинина можно, таким образом, вызвать задержку в диагностике AKI. Кроме того, сывороточный креатинин не является подходящим показателем для точного определения состояния почек и потребности в лечении во время наиболее острых фаз AKI, когда функция почек стремительно изменяется. До описания некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, не существовало способов установления возможного полного выздоровления пациентов после AKI или необходимости проведения некоторым из них диализа
(кратковременного или продолжительного), или развития у них нежелательных исходов, включающих, но без ограничения, смерть, основные сердечно-сосудистые осложнения или хроническую болезнь почек. Поскольку сывороточный креатинин является показателем скорости фильтрации, он не позволяет различать причины AKI
(преренальная, собственно ренальная, постренальная обструкция, атероэмболическая обструкция и т.д.) или категорию повреждения или место повреждения при собственно ренальном заболевании
(например, канальцевое, клубочковое или интерстициальное по происхождению). Диурез ограничивается аналогичным образом.
Указанные ограничения подчеркивают потребность в более совершенных способах выявления и оценки AKI, в особенности на ранних и субклинических, но также и на поздних стадиях, в тех
случаях, когда может иметь место восстановление функции почек и устранение дефекта почек. Кроме того, необходимо более совершенное выявление пациентов, которые имеют риск развития AKI.
В. Хроническая почечная недостаточность
В отличие от острой почечной недостаточности, хроническая почечная недостаточность развивается медленно. Чаще всего она возникает в результате какого-либо заболевания, которое вызывает постепенную утрату функции почек. Она может изменяться от умеренной дисфункции до тяжелой почечной недостаточности. Хроническая почечная недостаточность может приводить к терминальной стадии почечной недостаточности (ESRD).
Хроническая почечная недостаточность обычно возникает на протяжении ряда лет по мере того как медленно повреждается внутренняя структура почек. На ранних стадиях симптомы могут отсутствовать. В действительности, прогрессирование может происходить настолько медленно, что симптомы появляются, только когда функция почек составляет меньше одной десятой от нормального состояния.
Хроническая почечная недостаточность и ESRD поражают более чем 2 из 1000 человек в США. Диабет и гипертония являются двумя самыми распространенными причинами и составляют большинство случаев. Другие основные причины включают, но без ограничения синдром Альпорта, анальгентическую нефропатию, гломерулонефрит любого типа (одна из самых распространенных причин), камни в почках и инфекцию, обструктивную уропатию, поликистоз почек или рефлюкс-нефропатию. Хроническая почечная недостаточность приводит к накоплению жидкости и продуктов жизнедеятельности в организме, вызывающему нарастание продуктов азотистого обмена в крови (азотемии) и общему ухудшению состояния здоровья. При хронической почечной недостаточности поражается большинство систем организма. Начальные симптомы могут включать, но без ограничения утомляемость, частую икоту, общее болезненное состояние, общий зуд {pruritus) , головную боль, тошноту, рвоту или непреднамеренную потерю веса. Кроме того, поздние симптомы могут включать, но без ограничения, кровь в рвотных массах или
в стуле, сниженную активность, включая сонливость, спутанность
сознания, бредовое состояние, orcoma, сниженную
чувствительность кистей, стоп или других участков, склонность к образованию синяков или к кровотечению, повышенный или сниженный диурез, мышечные судороги или спазмы, конвульсии, или белые кристаллы в и на коже (уремический иней).
Уровни циркулирующих в крови цитокинов и других маркеров воспаления значительно возрастают у пациентов с хронической почечной недостаточностью. Указанное повышение может быть вызвано повышенным образованием цитокинов, их сниженным удалением, или обоими указанными факторами. Однако точно не установлено, в какой степени функция почек сама по себе участвует в создании уремической провоспалительной среды. Связь между воспалением и скоростью клубочковой фильтрации (GFR) описывали у 176 пациентов (возраст 52+/-1 лет; GFR б,5+/-0,1 мл/мин) в состоянии, близком к началу заместительной почечной терапии. См. публикацию Pecoits-Filho et al., "Associations between circulating inflammatory markers and residual renal function in CRF patients" Am J Kidney Dis. 41 (6) : 1212-1218
(2 003) . Например, уровни циркулирующего высокочувствительного С-реактивного белка (hsCRP), фактора некроза опухоли-альфа
(TNF-альфа), интерлейкина-б (IL-б), гиалуронана, и неоптерина измеряли у пациентов утром на тощак. Затем пациентов распределяли в две группы в соотвествии с медианой GFR (6,5 мл/мин). Несмотря на узкий диапазон значений GFR (1,8-16,5 мл/мин), уровни hsCRP, гиалуронана и неоптерина были значительно выше в подгруппе с более низкими значениями GFR, и статистически значимые отрицательные корреляции отмечали между GFR и уровнями IL-б (rho=-0,18; Р <0,05), гиалуронана (rho=-0,25; Р <0,001), и неоптерина (rho=-0,32; Р <0,0005). В многофакторном анализе возраст и GFR были связаны с воспалением, но сердечно-сосудистое заболевание и сахарный диабет не были связаны с воспалением. Указанные результаты показывают, что низкое значение GFR само по себе ассоциировано с воспалительным состоянием, что предполагает снижение элиминации почками провоспалительных цитокинов, повышенное
образование цитокинов при уремии, или неблагоприятное воздействие воспаления на функцию почек. С. Диализ
Диализ (т.е., например, заместительная почечная терапия) представляет собой способ удаления токсических веществ (загрязняющие вещества или продукты метаболизма) из крови, когда почки на способны выполнять свою функцию, и может проводиться с применением нескольких разных методов. Например, перитонеальный диализ позволяет удалить продукты метаболизма путем использования перитонеальной мембраны внутри брюшной полости. Брюшную полость заполняют специальными растворами, которые способствуют удалению токсинов. Растворы остаются в брюшной полости в течение некоторого времени и затем удаляются. Такая форма диализа может производиться в домашних условиях, но должна выполняться каждый день. Альтернативно, может быть осуществлен гемодиализ путем кругового движения крови через специальные фильтры вне организма. Кровь проходит через фильтр вместе с растворами, которые способствуют удалению токсинов.
При диализе используют специальные пути для обеспечения поступления крови в кровеносные сосуды. Доступ может быть временным или постоянным. Временный доступ имеет форму диализных катетеров - полых гибких трубок, вводимых в крупные вены, которые могут обеспечить достаточный кровоток. Большинство катетеров используется в неотложных ситуациях в течение короткого времени. Однако катетеры, называемые туннельными катетерами, могут быть использованы в течение длительных периодов времени, обычно от недель до месяцев. Постоянный доступ создают путем хирургического соединения артерии с веной. Соединение обеспечивает поступление крови в вену с высоким давлением, что приводит к утолщению венозной стенки. Такая вена может перенести повторную пункцию и, кроме того, обеспечивает хорошую скорость кровотока. Соединение между артерией и веной может быть выполнено с применением кровеносных сосудов (артериовенозная фистула или AVF) или искусственного мостика (артериовенозный трансплантат или AVG) . В месте доступа кровь отводится от организма к диализному аппарату. Здесь кровь
течет в противоток со специальным раствором, называемым диализатом. Устраняют нарушения химического состава крови и загрязняющие вещества, и затем кровь возвращается в организм. В основном, большинству пациентов гемодиализ проводят в течение трех сеансов каждую неделю. Каждый сеанс длится 3-4 часа.
Целью диализа является поддержание функций почек,
включающих фильтрацию крови, удаление продуктов
жизнедеятельности, регулирование количества воды в организме, поддержание электролитного баланса или поддержание значения рН крови в диапазоне от 7,35 до 7,45. Кроме того, диализ заменяет некоторые функции почек, которые не работают в достаточной мере, что в противном случае могло бы привести к гибели пациента.
Наиболее часто диализ применяют у пациентов, которые имеют почечную недостаточность, но также он может использоваться в острых ситуациях для быстрого выведения лекарств или ядовитых веществ. Указанная технология может быть жизненно необходимой для пациентов с острой или хронической почечной недостаточностью.
II. Мочевые биомаркеры повреждения почек
В настоящее время не существует эффективных видов лечения, улучшающих восстановление функции почек, или улучшающих непосредственный и отдаленный исходы после AKI. Кроме того, методы прогнозирования восстановления функции почек также являются недостаточными. Увеличение роли биомаркеров в раннем выявлении заболевания почек и/или повреждения почек может способствовать выявлению новых прогностических средств для определения клинических исходов повреждения почек. Потенциальные кандидаты-биомаркеры восстановления функции почек включают, но без ограничения молекулы, экспрессированные в метаболических путях, приводящих к регенерации и пролиферации, а также маркеры фиброза и апоптоза. Кроме того, биомаркеры почечного повреждения также могут служить для раннего распознавания разрешения болезни, и, тем самым, увеличивать шансы на выздоровление. Острое повреждение почек (AKI) имеет расчетный показатель заболеваемости приблизительно 2000 на
миллион населения, и указанный показатель возрастает. Ali et al., "Incidence and outcomes in acute renal injury: a comprehensive population-based study" J Am Soc Nephrol 18:12921298 (2007). Приблизительно у 5% пациентов, поступающих в отделение реанимации во всем мире, развивается тяжелая форма AKI, требующая применения диализа. Uchino et al., "Acute renal failure in critically ill patients: a multinational, multicenter study" JAMA 294:813-818 (2005). Недавно проведенное в США многоцентровое исследование показало, что только менее чем у 60% пациентов, перенесших тяжелую форму AKI, функция почек восстанавливалась в течение двух месяцев. Palevsky et al., "Intensity of renal support in critically ill patients with acute kidney injury" NEngl J Med 359:7-20 (2008). Таким образом, у большого числа пациентов AKI прогрессирует до терминальной стадии почечной недостаточности (ESRD).
Однако поскольку только у части пациентов с AKI не удавалось восстановить функцию почек, воздействия, направленные на улучшение показателей выздоровления или на обеспечение поддержания функции почек (например, ранний диализ), не могут быть избирательно выбраны соответствующим образом без некоторых средств, позволяющих определить, у каких пациентов восстановится функция почек, и у каких пациентов не восстановится (т.е., например, доступность неинвазивных биомаркеров). В настоящее время прогнозирование клинического риска восстановления функции почек после AKI является крайне ограниченным. Таким образом, создание неинвазивного биомаркера, который позволяет провести раннее прогнозирование восстановления функции почек, является давно назревшей потребностью в области лечения заболеваний почек.
Выявление таких неинвазивных маркеров (т.е., например, мочевого биомаркера) может значительно усовершенствовать определение отдаленного прогноза, что позволит изменить программу исследований, направленных на лечение AKI и предотвращение ESRD. Другими словами, обладая способностью прогнозировать, у кого из пациентов функция почек не восстановится, врач может направить ограниченные ресурсы на
разработку и применение агрессивных форм лечения пациентов с установленным повышенным риском. С другой стороны, пациенты с благоприятным прогнозом могут избежать более активных вмешательств и их возможных неблагоприятных эффектов, что высвобождает средства для лечения пациентов, которые в этом нуждаются, и позволяет снизить медицинские затраты в целом.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы и композиции для оценки функции почек у пациента. Как описано здесь, количественное определение различных маркеров повреждения почек, описанных здесь, может быть использовано для диагностики, прогнозирования, стратификации риска, определения стадии заболевания, мониторинга, определения категории повреждения и определения последующего диагноза и схем лечения у пациентов с уже поставленным диагнозом, или имеющих риск повреждения функции почек, снижения функции почек и/или острой почечной недостаточности (также называемой острым повреждением почек).
Почечные биомаркеры, которые описаны здесь, можно использовать по отдельности или в виде панелей, включающих совокупность почечных биомаркеров, для стратификации риска. В одном варианте осуществления стратификация риска позволяет выявить пациентов, подверженных в будущем риску: i) повреждения функции почек; ii) прогрессирования заболевания до снижения функции почек; iii) прогрессирования заболевания до ARF; или iv) улучшения функции почек и т.д. В одном варианте осуществления стратификация риска позволяет обнаружить уже существующее заболевание, включая выявление пациентов, которые: i) имеют повреждение функции почек; ii) имеют повреждение, которое до снижения функции почек; или iii) имеют повреждение, которое прогрессирует до ARF и т.д. В одном варианте осуществления стратификация риска позволяет осуществлять мониторинг ухудшения и/или улучшения функции почек. В одном варианте осуществления стратификация риска позволяет предсказать будущий результат медицинского лечения, включая, но без ограничения, улучшение или ухудшение функции почек, снижение или возрастание риска смерти, снижение или возрастание
риска необходимости начала или продолжения проведения пациенту заместительной почечной терапии (т.е., гемодиализа, перитонеального диализа, гемофильтрации и/или пересадки почки), снижение или возрастание риска выздоровления пациента в результате повреждения функции почек, снижение или возрастание риска выздоровления пациента в результате ARF, снижение или возрастание риска прогрессирования заболевания у пациента до терминальной стадии почечной недостаточности, снижение или возрастание риска прогрессирования заболевания у пациента до хронической почечной недостаточности, снижение или возрастание риска отторжения пересаженной почки у пациента, и т.д.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы оценки состояния почек у пациента. В одном варианте осуществления способ предусматривает образец биологической жидкости, полученный у пациента. В одном варианте осуществления способ включает осуществление теста с использованием образца биологической жидкости для обнаружения одного или более почечных биомаркеров, выбранных из группы, включающей, но без ограничения гиалуроновую кислоту (НА), рецептор смерти 5 (DR5) или трансформирующий фактор роста (31 (TGF (31) . Затем результат аналитических измерений, например, измеренную концентрацию НА, DR5, и/или TGF(31, сравнивают с пороговым значением, чтобы определить состояние почек у пациента.
Сравнения, проводимые для определения состояния почек пациента, могут включать в себя, но без ограничения, сравнение результата при осуществлении одного или более из следующего: стратификация риска, диагноз, прогноз, определение стадии заболевания, классификация и мониторинг состояния пациента, как описано здесь. Таким образом, настоящее изобретение предлагает использование одного или более почечных биомаркеров настоящего изобретения для оценки заболевания и/или повреждения почек.
Ряд методов может быть использован для установления требуемого порогового значения с целью применения в указанных способах. Например, пороговое значение можно определить в популяции здоровых пациентов путем выбора значения концентрации
почечного биомаркера, представляющего собой 75-й, 85-й, 90-й,
95-й или 99-й процентиль биомаркера, который измеряют у
здоровых пациентов. Альтернативно пороговое значение можно
определить в популяции "заболевших" пациентов, например,
пациентов, уже имеющих повреждение или имеющих
предрасположенность к повреждению (например, развитие ARF или другой клинический результат, например, смерть, диализ, пересадка почки и т.д.), путем выбора значения концентрации почечного биомаркера, представляющего собой 75-й, 85-й, 90-й, 95-й или 99-й процентиль биомаркера, который измеряют у заболевших пациентов. В другом варианте изобретения пороговое значение может быть определено на основании предшествующего измерения почечного биомаркера у того же самого пациента; то есть, динамика изменения уровня биомаркера у пациента может быть использована для определения риска у пациента.
Приведенное выше обсуждение не означает, однако, что
применение почечных биомаркеров, предусмотренных в описании,
ограничивается их сравнением с соответствующими отдельными
пороговыми значениями. Другие методы объединения результатов
тестов могут включать применение множественной логистической
регрессии, логлинейное моделирование, анализ с применением
нейронных сетей, анализ размерностей типа "п-из-m", анализ
методом дерева решений, вычисление отношений значений маркеров
и т.д. Указанный перечень методов не является ограничивающим. В
указанных методах обобщенный результат, который получают путем
объединения значений отдельных биомаркеров, можно
рассматривать, как если бы он сам являлся значением биомаркера; то есть пороговое значение может быть определено для обобщенного результата, как описано здесь для отдельных биомаркеров, и обобщенный результат для отдельного пациента сравнивают с указанным пороговым значением.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает применение мочевого биомаркера, гиалуроновой кислоты (НА), для прогнозирования восстановления функции почек после повреждения и/или заболевания. В одном варианте осуществления определение значения биомаркера позволяет
провести стратификацию пациента, чтобы адаптировать интенсивность лечения и, таким образом, предотвратить дополнительные долговременные осложнения.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способ, включающий составление отдаленного прогноза повреждения и/или заболевания почек на ранней стадии после наступления повреждения и/или заболевания почек. В одном варианте осуществления способ позволяет предсказать необходимость проведения длительного диализа, в тех случаях, когда значение НА в моче постоянно нарастает между D1 и D14 после начала заместительной терапии при тяжелом остром повреждении почек. В одном варианте осуществления способ позволяет предсказать необходимость проведения длительного диализа, если значение НА в моче постоянно нарастает между D1 и D14 после начала заместительной терапии при тяжелом остром повреждении почек. В одном варианте осуществления продолжительность диализа составляет по меньшей мере шестьдесят (60) дней после повреждения почек. В одном варианте осуществления продолжительность диализа составляет по меньшей мере шестьдесят (60) дней после диагностирования заболевания почек.
Некоторые результаты, приводимые в описании, получены для сорока трех (43) пациентов, участвовавших в большом многоцентровом рандомизированном контролируемом исследовании, в котором изучали эффект различных доз RRT на выживаемость при AKI. В одном варианте осуществления выживаемость после AKI коррелировала со значениями биомаркера гиалуроновой кислоты в моче (НА) . Хотя это и не имеет отношения к пояснению принципа настоящего изобретения, НА (т.е., например, гиалуронан или гиалурат) содержит несульфатированный гликозаминогликан, и НА широко распространена в соединительной, эпителиальной и нервной тканях. НА также считается одним из нескольких компонентов внеклеточного матрикса и может быть вовлечена в восстановление и ремоделирование тканей путем опосредования клеточной пролиферации и миграции, синтеза и деградации внеклеточного матрикса. Например, согласно наблюдениям, фрагментированная НА
накапливается при повреждении тканей и может стимулировать экспрессию генов системы воспаления с помощью различных иммуноцитов в месте повреждения. Кроме того, обнаружено, что снижение клиренса НА приводило к развитию стойкого воспаления.
В одном варианте осуществления применение биомаркера позволяет прогнозировать отсутствие восстановления функции почек, при котором зависимость от диализа составляет свыше шестидесяти (60) дней. В одном варианте осуществления отсутствие восстановления функции почек включает увеличение уровня биомаркера выше его исходного значения по меньшей мере в течение четырнадцати (14) дней. В одном варианте осуществления прогноз, составленный с учетом значения биомаркера, подтвержден результатами анализа рабочей характеристической кривой (ROC). В одном варианте осуществления с помощью анализа ROC получают расчетные значения, включающие, но без ограничения, площадь под кривой, построенной по экспериментальным точкам, и/или площадь под кривой, вычисляемую с использованием линейного трапециадального суммирования (критерий знаковых рангов Уилкоксона). В одном варианте осуществления площадь под кривой, построенной по экспериментальным точкам = 0,9686, с оценкой средней квадратической ошибки = 0,0518. В одном варианте осуществления площадь под кривой, вычисляемую с использованием линейного трапециадального суммирования (критерий знаковых рангов Вилкоксона) = 0,9692 с оценкой средней квадратической ошибки = 0,05 68). См. фигуру 5.
А. Гиалуроновая кислота
Гиалуроновая кислота (НА) считается повсеместно распространенным гликозаминогликаном соединительной ткани, который присутствует in vivo в виде высокомолекулярного компонента большинства внеклеточных матриксов. НА не установлена в качестве основного компонента кортикального интерстиция здоровой почки. Hansell et al. , "Hyaluronan content in the kidney in different states of body hydration" Kidney Int 58:2061-2068 (2000) . Тем не менее, НА экспрессируется клетками эпителия проксимального отдела канальцев почек (РТС) после острого и хронического повреждения почек, которое вызывается
различными заболеваниями. См. публикации Sibalic et al., "Upregulated renal tubular CD44, hyaluronan, and osteopontin in kdkd mice with interstitial nephritis" Nephrol Dial Transplant 12:1344-1353 (1997); и Lewington et al., "Expression of CD44 in kidney after acute ischemic injury in rats" Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 278:R247-254 (2000) . Кроме того, повышенное накопление НА в интерстициальном пространстве связано с протеинурией и изменением функции почек при прогрессирующем заболевании почек. Sano et al., "Localization and roles of CD44, hyaluronic acid and osteopontin in IgA nephropathy" Nephron 89:416-421 (2001).
Связывание НА с ее основным рецептором, CD44, способствует развитию воспаления посредством взаимодействия между НА и CD4 4, экспрессированном на воспалительных клетках. Melin et al., "Ischemia-induced renal expression of hyaluronan and CD44 in diabetic rats" Nephron Exp Nephrol 103:e86-94 (2006). Связывание HA/CD4 4 приводит в действие метаболический путь, опосредуемый митоген-активируемой протеинкиназой (МАРК), и усиливает миграцию РТС, процесс, который участвует в трансдифференцировке эпителиальных клеток в фибробласты и в прогрессировании почечного фиброза. Yang et al., "Dissection of key events in tubular epithelial to myofibroblast transition and its implications in renal interstitial fibrosis", J Pathol 159:14 65-1475 (2001). В ишемических почках больных диабетом содержание почечной НА начинало возрастать уже через 24 часа и значительно увеличивалось в течение 1-8 недель после ишемически-реперфузионного (I/R) повреждения почек. Okajima К: "Regulation of inflammatory responses by natural anticoagulants" Immunol Rev 184:258-274 (2001).
Гиалуроновая кислота (также называемая в данной области "гиалурат" и "гиалуронан", и сокращенно обозначаемая НА), представляет собой гликозаминогликан, состоящий из прямой неразветвленной полисахаридной цепи, состоящей из чередующихся остатков Ы-ацетил-Б-глюкозамина и D-глюкуроновой кислоты. См. публикации Laurent et al, "Hyaluronan" FASEB J 6:2397-2404 (1992); и Delpech et al, "Hyaluronan: fundamental principles
and applications in cancer" J Intern Med 242: 41-48 (1997). HA представлена повсеместно в различных типах биологического материала, включая материал бактериального и животного происхождения. У человека НА в высоких концентрациях обнаруживается в пупочном канатике, в стекловидном теле, в хряще и в синовиальной жидкости. В небольших количествах НА представлена в CSF, лимфе, крови, сыворотке и моче. Уровни НА связаны с заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, цирроз печени и опухоль Вильмса. НА связывают, в целом, с неспецифическими опухолями, но до настоящего времени не осуществляли применение НА для выявления, лечения и контроля заболевания при определенных клинических формах опухолей. Известно, что НА играет роль в развитии тяжелых патофизиологических состояний, включая рак.
Например, показано, что уровни НА возрастали в животных моделях опухолей (например, карцинома кроликов V2) и при различных формах рака у человека (например, рак легких, опухоль Вильмса, рак молочной железы и т.д.). См. публикацию Knudson et al., "The role and regulation of tumor associated hyaluronan" в The Biology of hyaluronan (J. Whelan, ed.), pp. 150-169, New York, Wiley Chichister (Ciba Foundation Symposium 143), 1989). В опухолевых тканях НА способствует адгезии и миграции опухолевых тканей, а также обеспечивает некоторую защиту против иммунного надзора.
Также отмечается, что небольшие фрагменты НА стимулируют ангиогенез, и указанные фрагменты обнаруживают в моче пациентов с карциномой мочевого пузыря и в опухолевых тканях. См. публикации Sattar et al., "Does hyaluronan have a role in endothelial cell proliferation of the synovium?" Semin Arthritis Rheum 22:37 13 (1992); Lokeshwar VB, Selzer MG. Differences in hyaluronic acid mediated functions and signaling in arterial, microvessel, and vein-derived human endothelial cells. J Biol Chem 2000; 275:27641-27649. Фрагменты гиалуроновой кислоты образуются, когда гиалуронидаза, HAase эндогликозидаза, разрушает НА-полимер. См. публикации Csoka ТВ, Frost GI, Stern R. Hyaluronidases in tissue invasion. Invasion
Metastasis 1997;17:297-311 ; и Roden L, Campbell P, Fraser JR, Laurent TC, Petroff H, Thompson JN. Enzymatic pathways of hyaluronan catabolism в: Whelan J, editor. The Biology of Hyaluronan. New York: Wiley Chichister 1989:60-86. Тест для определения показателя НА был предложен для выявления карциномы мочевого пузыря, безотносительно стадии заболевания. См. публикацию Lokeshwar VB, Obek С, Pham НТ, Wei D, Young MJ, Duncan RC. Urinary hyaluronic acid and hyaluronidase: markers for bladder cancer detection and evaluation of grade. J Urol 2000;163:348-356.
Недавно опубликованы результаты исследования эффективности
теста HA-HAase при осуществлении мониторинга рецидива опухоли
мочевого пузыря, в сравнении со стандартным тестом BTA-Stat.
Lokeshwar et al. , Bladder Tumor Markers for Monitoring
Recurrence and Screening Comparison of Hyaluronic Acid-
Hyaluronidase and BTA-Stat Tests Cancer 95:61-72 (2002).
Результаты указанного исследования позволяют предположить, что
биохимический тест, например, тест HA-HAase позволяет выявить
рецидив опухоли мочевого пузыря раньше, чем цистоскопия. Если
указанное раннее выявление может обеспечить клиническое
преимущество в терминах исхода заболевания, цистоскопия может
потерять статус безусловного золотого стандарта при оценке
чувствительности, специфичности и точности теста,
предназначенного для мониторинга рецидива опухоли. Интересным продолжением данного исследования было бы лечение пациентов с раком предстательной железы, и в случае увеличения простатического специфического антигена после радикальной простатоэктомии или лучевой терапии тест HA-HAase мог бы быть эффективным дополнением для мониторинга рецидива карциномы мочевого пузыря. Благодаря своей более чем 90% чувствительности и 8 6% точности, тест HA-HAase может быть эффективным дополнением цистоскопии при мониторинге рецидива карциномы мочевого пузыря. Ложно-положительный результат теста HA-HAase заключает в себе существенный риск рецидива опухоли в течение пяти месяцев. Таким образом, возможно, что комбинация биохимических тестов может обеспечить эффективный мониторинг
рецидивов карциномы мочевого пузыря, что предусматривает не менее 50% уменьшения числа процедур цистоскопического наблюдения.
Гиалуронидаза (HAase) представляет собой фермент, относящийся к эндогликозидазам, который расщепляет НА путем гидролиза N-ацетилглюкозаминидных связей в НА. Ограниченное расщепление НА гиалуронидазой приводит к образованию фрагментов НА определенной длины (-3-25 дисахаридных звеньев) которые оказывают ангиогенное действие (West et al., Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronic acid. Science, 228: 1324-1326, 1985). У позвоночных, гиалорунидазы можно разделить на два класса, гиалуронидазы активные при нейтральных значениях рН (оптимум рН 5,0), и гиалуронидазы, активные при кислых значениях рН (рН 3,5-4,0) (Roden et al. , Enzymatic pathways of hyaluronan catabolism. B: The Biology of hyaluronan, (J. Whelan, ed.), pp. 60-86, New York, Wiley Chichister (Ciba Foundation Symposium 143), 1989; West et al. , Gold, Purification and properties of hyaluronidase from human liver. Biochem. J., 205: 69-74, 1982; Fraser and Laurent, Turnover and metabolism of Hyaluronan. in: Biology of Hyaluronan, (J. Whelan, ed.), pp. 41-59, New York, Wiley Chichister (Ciba Foundation Symposium 143), 1989; Zhu et al., Molecular cloning of a mammalian hyaluronidase reveals identity with hemopexin, a serum heme-binding protein. J. Biol. Chem., 269: 32092-32097, 1994; Lin et al., A hyaluronidase activity of the sperm plasma membrane protein PH-20 enables sperm to penetrate the cumulus layer surrounding the egg. J. Cell Biol., 125: 1157-1163, 1995). Например, гиалорунидаза тестикулярного типа является нейтральной гиалорунидазой, тогда как гиалорунидаза печени характеризуется кислым значением рН оптимума. Известно, что согласованные действия НА и гиалуронидаз играют важную роль в эмбриональном развитии, образовании и развитии сосудов, ремоделировании сосудов, иммунном надзоре и прогрессировании опухолей (См. публикации McCormick and Zetter, Adhesive interactions in angiogenesis and metastasis. Pharmacol. Ther., 53: 239- 260, 1992; Hobarth et
al., Topical chemo-prophylaxis of superficial bladder cancer by mitomycin С and adjuvant hyaluronidase, Eur. Urol., 21 : 206210, 1992; Knudson et al., The role and regulation of tumor-associated hyaluronan. In: The Biology of Hyaluronan (J. Whelan, ed.) pp. 150-169, New York, Wiley, Chichester (Ciba Foundation Symposium 143), 1989; Lin et al., Urinary hyaluronic acid is a Wilms' tumor marker. J. Ped. Surg., 30: 304-308, 1995; Stern et al., Hyaluronidase levels in urine from Wilms' tumor patients. J. Natl. Cane. Inst., 83: 1569-1574, 1991). В. Рецептор смерти 5
Рецептор смерти 5 (DR5) считается проапоптотическим рецептором, который активируется родственным фактору некроза опухоли лигандом, индуцирующим апоптоз (TRAIL). Считают, что TRAIL является растворимой формой эндогенного апоптоз-индуцирующего лиганда, вызывающего апоптоз в различных типах клеток и участвующего в последующем воспалении и фиброзе. Сообщалось, что мыши, дефицитные по TRAIL или DR5, являлись относительно устойчивыми к развитию воспаления и последующего фиброза. См. публикации Wang et al. , "Over-expression of C/EBP-альфа induces apoptosis in cultured rat hepatic stellate cells depending on p53 and peroxisome proliferator-activated receptor-gamma" Biochem Biophys Res Commun 380:286-291 (2009); и Takeda et al., "Death receptor 5 mediated-apoptosis contributes to cholestatic liver disease" Proc Natl Acad Sci US A 105:10895-10900 (2008).
Результаты, представленные в описании, иллюстрируют метод скрининга для серий белков, экскретируемых с мочой, которые имеют отношение к воспалению, сепсису, острому повреждению почек и острой почечной недостаточности. В указанной панели белков, мочевой рецептор смерти 5 (DR5) идентифицирован в качестве потенциального биомаркера восстановления функции почек после тяжелого AKI. Рецептор смерти 5 (также известный как TRAILR2) является членом суперсемейства фактора некроза опухоли (TNF) и является рецептором для родственного фактору некроза опухоли лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL). После связывания TRAIL с его рецепторами (DR4 и DR5) запускается
каскад событий, приводящих к активации NFkB и апоптозу. Shetty et al., "Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) up-regulates рецептор смерти 5 (DR5) mediated by NFkB activation in epithelial cell lines" Apoptosis 7:413-420 (2002) .
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает мочевой биомаркер, включающий в себя DR5, позволяющий прогнозировать восстановления функции почек после AKI. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предполагает мочевой биомаркер, включающий в себя DR5, обеспечивающий стратификацию пациента для определения интенсивности лечения после AKI и предотвращения отдаленных осложнений.
С. Трансформирующий фактор роста (31
Трансформирующий фактор роста (31 (TGF(31) представляет собой секретируемый белок, который выполняет в клетке различные функции, включая, но без ограничения, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. TGFpl может действовать непосредственно путем стимуляции синтеза компонентов внеклеточного матрикса и снижения продукции коллагеназы, или косвенно, при помощи других профибриногенных факторов, таких как фактор роста соединительной ткани (CTGF), который может играть роль в развитии гломерулосклероза, интерстициального фиброза и атрофии канальцев, возникающих при терминальной почечной недостаточности, независимо от первоначальной этиологии. Wolf G., "Renal injury due to renin-angiotensin-aldosterone system activation of the transforming growth factor -beta pathway" Kidney Int 70: 1914-1919 (2006) . TGF(31 также экспрессируется в больших количествах после ишемически-реперфузионного (I/R) повреждения почек и вызывает утрату кровеносных сосудов путем индукции перехода эндотелиальных по фенотипу клеток в трансдифференцировку клеток с фенотипом фибробластов/миофибробластов.
Данные, представленные здесь, позволяют провести отбор серий белков, секретируемых с мочой, связанных с функциональным состоянием почек. В указанной панели мочевой трансформирующий
фактор роста (31 (TGF(31) идентифицирован как потенциальный биомаркер восстановления функции почек после тяжелого AKI. TGF(31 представляет собой фактор роста, участвующий в эмбриональном развитии и в заживлении и восстановлении ткани. Известно, что TGF(31 вовлечен в сигнальную систему клеток канальцевого эпителия почек. Sakurai et al., "An in vitro tubulogenesis system using cell lines derived from the embryonic kidney shows dependence on multiple soluble growth factors" Proc Natl Acad Sci USA 94:6279-6284 (1997).
В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает мочевой биомаркер, включающий в себя TGF(31, позволяющий прогнозировать восстановление функции почек после AKI. В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает мочевой биомаркер, включающий в себя TGF(31, обеспечивающий стратификацию пациента для определения интенсивности лечения после AKI и предотвращения отдаленных осложнений.
D. Результаты клинических испытаний
1. Дизайн эксперимента
Недавно проведенное исследование восстановления функции почек (BioMARK) представляло собой наблюдательное когортное исследование, проводимое в виде части исследования сети клинических испытаний острой почечной недостаточности, проводимых Национальными институтами здравоохранения США и министерством по делам ветеранов США (VA/NIH) (в дальнейшем обозначаемое как исследование ATN). Исследование ATN включало в себя многоцентровое проспективное исследование двух стратегий заместительной почечной терапии у пациентов в критическом состоянии с острым повреждением почек. Исследование ATN проводили в период времени между ноябрем 2003 и июлем 2007 в 27 медицинских центрах управления по делам бывших военнослужащих и в университетских медицинских центрах. Все взрослые пациенты (18 лет или старше) имели AKI, клинически соответствующее острому тубулярному некрозу (определяемому как клинические условия ишемического или нефротоксического повреждения и наличие олигурии или повышенного сывороточного креатинина) и
требующее проведения заместительной почечной терапии (RRT), а также недостаточность одной или более систем органов, помимо почек, или сепсис.
Критериями невключения пациентов являлись: i) исходный сывороточный креатинин выше 2 мг/дл у мужчин или выше 1,5 мг/дл у женщин; ii) AKI согласно клиническим данным, имеющее другую этиологию, чем острый тубулярный некроз; iii) перенесенная трансплантация почек; iv) беременность; v) ущемление; vi) вес выше 12 0 кг; vii) не является кандидатом для RRT; viii) атональное состояние; или ix) предполагаемая выживаемость пациента менее 2 8 дней вследствие необратимого состояния. Пациенты, подходящие для участия в исследовании, не должны были иметь более одной сессии периодического гемодиализа и поддерживающего низко-эффективного диализа или более чем 24 часа непрерывной заместительной почечной терапии перед рандомизацией.
В качестве подисследования, проводимого в рамках исследования ATN, некоторые пациенты, зарегистрированные в Медицинском центре Университета Питтсбурга, в медицинском центре VA Питтсбурга, в клинике Кливленда, научном центре здоровья Университета Техаса в Хьюстоне, и в Медицинском центре Универститета Вашингтона просили об участии в проведении серии измерений отобранных перспективных биомаркеров (т.е., например, гиалуроновая кислота, трансформирующий фактор роста (31 или рецептор смерти 5). Указанное конкретное исследование требовало дополнительной формы информированного согласия для определения биомаркеров, и всего данные по 7 6 случаям из указанных 5 центров получали для анализа и включали в исследование. Одобрение было получено от Экспертного совета Университета Питтсбурга и всех участвующих в исследовании центров.
2. Сбор и анализ данных
Истории болезней участников исследования рассматривали проспективно для получения данных, фиксируемых при госпитализации, включая исходные демографические показатели, последовательное изменение почечной функции и/или наличие олигурии (которую определяли по диурезу <4 0 0 мл/день). Наличие
сепсиса определяли с использованием критериев синдрома системной воспалительной реакции.
Определение восстановления почечной функции было изменено в результате 2-ой Международной согласительной конференции Инициативной группы по улучшению качества острого диализа
(ADQI). Восстановление почечной функции определяли как длительное выживание или отсутствие потребности в диализе. Невосстановление почечной функции определяли как невыживание или потребность в диализе.
Свежие образцы мочи получали в следующие моменты времени: день 1, день 7 и день 14 после включения в исследование. После центрифугирования в течение 5 минут при 1000 * g при 4° С, образцы мочи разливали по аликвотам и хранили при -8 0°С. Образцы не подвергали размораживанию и повторному замораживанию перед проведением исследования. Концентрации креатинина в моче измеряли с применением коммерчески доступного ферментного теста
(DZ072B, Diazyme labs, California, USA) ; НА в моче измеряли с применением коммерчески доступного теста (Echelon Biosciences, Salt Lake City, USA) ; и TGFpl измеряли с применением коммерчески доступного теста (R &D, Minneapolis, USA). Все измерения проводили в соответствии с инструкциями производителей. Количество DR5 измеряли с помощью хемилюминисцентного иммунотеста с применением автоматического анализатора (IMMULITE; Diagnostic Products Corp, Los Angeles, California).
Исход восстановления функции почек в виде независимости от диализа определяли, когда он имел место на 60-й день. Исходные характеристики сравнивали среди пациентов, у которых функции почек восстановились после AKI на 60-й день после включения в исследование, и пациентов, у которых не восстановились функции почек. Непрерывные данные выражали как среднее значение ± SD и сравнивали с применением критерия Стьюдента или критерий суммы рангов Уилкоксона. Категориальные группирующие данные выражали в виде отношений и сравнивали с применением критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера. Уровни почечного биомаркера стандартизировали по концентрациям креатинина в моче и
анализировали в каждый момент времени. Затем проводили анализ с использованием наибольшего относительного изменения в течение первых 14 дней по сравнению с днем 1 и последним доступным измерением для каждого пациента. Затем применяли метод логистической регрессии для обработки набора данных, чтобы оценить связь между каждым потенциальным биомаркером и восстановлением после AKI. В результате получали значение площади рабочей характеристической кривой (AUC ROC) для оценки точности прогноза каждого почечного биомаркера. Оптимальные точки отсечения определяли как наибольшее значение суммы чувствительности и специфичности. Для оценки предсказательной способности каждого почечного биомаркера при его добавлении к традиционным клиническим прогностическим показателям, клиническую прогностическую модель идентифицировали на основе анализа AUC ROC и затем к клинической модели добавляли по отдельности каждый почечный биомаркер. Значения AUC ROC, полученные в комбинированных моделях, сравнивали со значениями AUC ROC клинической модели. Все анализы выполняли с применением SAS 9.0 (SAS Institute, Сагу, NC) при уровне значимости 0,05. 3. Результаты
Клинические характеристики 7 6 пациентов кратко сформулированы в таблице 2.
Продолжительность пребывания в клинике перед рандомизацией
8,41 + 1, 14
10,24±8,48
6,71±5,00
0, 083
Индекс коморбидности Чарльсона
4,09±3,34
4,88±2,69
3,34±3,75
0, 008
оценка APACHE II
23,35±7,15
24,97±6,78
21,77±7,24
0, 062
Непочечная оценка SOFA -дыхательная система, день 1
2,50±1,07
2,63±1,19
2,38±0,95
0,296
Непочечная оценка SOFA -коагуляция, день 1
1,59±1,28
1,58±1,32
1,61±1,25
0, 926
Непочечная оценка SOFA -печень, день 1
1,63±1,41
2,10±1,45
1,11±1,20
0, 030
Непочечная оценка SOFA -сердечно-сосудистая система, день 1
2,24±1,68
2,50±1,64
1,97±1,70
0, 173
Непочечная оценка SOFA - ЦНС, день 1
2,21±1,39
2,08±1,50
2,34±1,28
0, 454
общая оценка SOFA, день 1
10,91±3,40
11,94±3,81
9,75±2,49
0, 035
Оценка почечной недостаточности, вызванной ARI, по шкале клиники Кливленда, день 1
11,91±2,96
12,21±2,97
11,61 ±2,97
0,490
a. Обобщенные результаты исследований, полученные в День 1
В группах пациентов с восстановлением и невосстановлением
функции почек было одинаковое число участников. Не наблюдали существенных различий при сравнении групп восстановления и невосстановления функции почек в отношении пола, расы, функции почек на исходном уровне или клинических оценок в баллах, полученных в 1-й день (т.е., например, оценки по шкале APACHE II и/или оценки почечной недостаточности ARF по шкале отделения интенсивной терапии клиники Кливленда). Средние значения возраста, продолжительности пребывания в отделении реанимации перед рандомизацией, индекса коморбидности Чарльсона, общей оценки SOFA в 1-й день были значительно выше в группе невосстановления функции почек, по сравнению с группой восстановления функции почек. Среди причин, вызывающих AKI, наиболее высокое процентное значение соответствовало ишемии (97,4%) в группе невосстановления функции почек, по сравнению с 76,3% в группе восстановления функции почек. Согласно наблюдениям, сепсис также чаще являлся причиной развития AKI в группе невосстановления почечной функции, чем в группе восстановления почечной функции (71,05% и 60,53%, соответственно).
b. Прогнозирование восстановления функции почек в течение
60 дней
В пяти (5) различных моделях комбинаций отдельных биомаркеров определяли наилучшее значение площади под кривой ROC (AUC ROC) для прогнозирования восстановления функции почек в течение 60 дней. См. таблицу 3.
Наибольшее
относительное изменение
0, 78 (0, 65, 0, 90)
<0,001
Цанные последнего доступного дня
0, 30 (0, 18, 0, 42)
0,001
DR5
день 1
0, 56 (0, 43, 0, 69)
0,381
день 7
0, 64 (0, 48, 0, 80)
0,083
день 14
0, 68 (0, 51, 0, 82)
0,088
Наибольшее
относительное изменение
0, 67 (0, 47, 0, 90)
0, 032
Цанные последнего доступного дня
0, 70 (0, 58, 0, 83)
0,001
TGFp 1
день 1
0, 61 (0, 48, 0, 74)
0,089
день 7
0, 52 (0, 35, 0, 68)
0,848
день 14
0, 70 (0, 48, 0, 91)
0,074
Наибольшее
относительное изменение
0, 68 (0, 53, 0, 83)
0,016
Цанные последнего доступного дня
0, 57 (0, 43, 0, 70)
0, 327
Результаты показывают, что значения НА, полученные на 14-й день, TGFpl, полученные на 14-й день, и последние доступные значения DR5 являлись наилучшими прогностическими показателями восстановления функции почек после AKI, причем значения AUC ROC изменялись в диапазоне от 0,7 0 до 0,89. Оптимизированная клиническая модель представляла собой комбинацию возраста и индекса коморбидности Чарльсона, которая показывала статистически достоверное значение AUC ROC 0,74 для восстановления после AKI. Значительное улучшение значений AUC ROC наблюдали при добавлении мочевых почечных биомаркеров в клиническую модель. Значения AUC ROC в модели с применением клинических показателей, комбинированных с изменениями относительных значений НА, DR5, и TGF (31, составляли 0,83, 0, 86, 0, 84 и 0,91 соответственно, при этом значение AUC ROC достигало 0,97 при комбинировании уровня НА, соответствующего 14-му дню, с показателем возраста (Р <0,001 во всех упомянутых выше моделях; таблица 4).
Наибольшее
0,84 (0,72,
<0,001
относительное
0, 96)
изменение
Пороговые значения мочевых биомаркеров
Важные временные точки для каждого мочевого моркера устанавливали с использованием максимальных значений AUC ROC. Порог клинической значимости устанавливали путем определения максимальной суммы чувствительности и специфичности в указанных выше пяти моделях. См. таблицу 3. На 14-й день наблюдали наиболее высокие значения чувствительности 0,93 и специфичности 0,83 при значении НА, равном 12 мкг/мг креатинина. Хотя с более низким значением чувствительности, последние доступные значения DR5 и значения TGFpl на 14-й день также являлись прогностическими. См. таблицу 5.
Не обнаружили достоверных различий в исходном состоянии функции почек, сочетании сепсиса, оценок APACHE II или выраженности RRT при сравнении групп пациентов с восстановлением функции почек и отсутствием восстановления функции почек. Однако обнаружили, что пациенты в группе невосстановления функции почек были старше, характеризовались большей склонностью к ишемии почек, более длительным пребыванием в реанимационном отделении перед проведением RRT, имели больше сопутствующих заболеваний и более высокие оценки
SOFA. Результаты позволяют предположить, что комбинация возраста, общей оценки SOFA в день 1 и индекса коморбидности Чарльсона составляет предпочтительную модель прогнозирования клинических исходов.
Указанные результаты также показывают, что изменения
относительных значений мочевых биомаркеров НА, DR5, и TGFpl
коррелируют в значительной степени с неблагоприятными исходами
AKI. Указанные три (3) почечных биомаркера свидетельствуют о
биологических процессах происходящего в почках накопления
внеклеточного матрикса, клеточного апоптоза,
трансдифференцировки с изменением собственного клеточного фенотипа и повреждения эпителиальных клеток канальцев, соответственно. Хотя это и не имеет отношения к пояснению принципа настоящего изобретения, считают, что поскольку значения, полученные в 1-й день, отображают выраженность поражения и интегральные клеточные ответы, относительное изменение указанных почечных биомаркеров может отражать степень восстановления функции почек независимо от индивидуальных исходных характеристик. Кроме того, сильная связь между значениями НА в 14-й день и исходами заболевания позволяет предположить, что накопление внеклеточного матрикса может играть роль в процессе восстановления функции почек.
III. Результаты аналитических измерений состояния почек Возможность применения результата аналитического измерения определенного почечного биомаркера для разделения двух популяций можно установить с помощью анализа ROC. Например, кривые ROC, полученные для "первой" субпопуляции (т.е., например, популяции с предрасположенностью к одному или более последующим изменениям в состоянии почек) и "второй" субпопуляции (т.е., например, популяции без предрасположенности к одному или более последующим изменениям в состоянии почек). Расчет указанных кривых ROC и определение площади под указанными кривыми ROC позволяет провести количественный анализ прогностической способности результата аналитический измерений. В некоторых вариантах осуществления прогностическая способность, установленная с помощью результатов аналитических
измерений, описанных здесь, включает значение AUC ROC больше, чем 0,5, предпочтительно по меньшей мере 0,6, более предпочтительно 0,7, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,8 и еще более предпочтительно по меньшей мере 0,9, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,95. А. Иммунологические тесты
В целом, иммунотесты предусматривают взаимодействие образца, содержащего или предположительно содержащего биомаркер, представляющий интерес, по меньшей мере с одним антителом, которое специфически связывается с биомаркером. Затем образуется обнаруживаемый сигнал, свидетельствующий о наличии или о количестве комплексов, образованных при связывании полипептидов в образце с антителом. Затем обнаруживаемый сигнал соотносят с наличием или количеством биомаркера в образце. Описаны многочисленные способы и устройства, относящиеся к обнаружению и анализу биологических маркеров. См., например, патенты США №№ 6143576; 6113855; 6019944; 5985579; 5947124; 5939272; 5922615; 5885527; 5851776; 5824799; 5679526; 5525524; и 5480792, и справочник The Immunoassay Handbook, David Wild, ed. Stockton Press, New York, 1994, каждый из которых включен в описание посредством ссылки во всей полноте, включая все таблицы, иллюстрации и формулы изобретений.
В многочисленных методах и устройствах для проведения иммунологического анализа могут применяться меченые молекулы в различных форматах сэндвич, конкурентного или неконкурентного методов анализа, для создания сигнала, который зависит от наличия или количества биомаркера, представляющего интерес. Подходящие форматы анализов включают также хроматографический метод анализа, масс-спектрографический метод анализа и метод белкового блоттинга. Кроме того, определенные способы или устройства, такие как биосенсоры и иммунотесты с оптическим детектированием, могут быть использованы для определения наличия или количества аналитов без необходимости использования меченой молекулы. См., например, патенты США 5631171; и 5955377, каждый из которых включен в описание посредством
ссылки во всей полноте, включая все таблицы, иллюстрации и формулы изобретения. Робототизированное оборудование для проведения иммунотестов является коммерчески доступным и включает, но без ограничения, системы Beckman ACCESS(r), Abbott AXSYM(r), Roche ELECSYS(r), Dade Behring STRATUS(r). Но может быть использован любой подходящий иммунотест, например, иммуноферментные тесты (ELISA), радиоиммунные тесты (RIA), тесты на основе конкурентного связывания и т.п.
Антитела или другие полипептиды могут быть иммобилизованы на различные твердые фазы для применения в иммунотестах. Твердые фазы, которые можно использовать для иммобилизации специфически связывающихся членов, включают, но без ограничения, твердые фазы, разработанные и/или применяемые в качестве твердых фаз в твердофазных анализах связывания. Примеры подходящих твердых фаз включают, но не ограничиваются ими, мембранные фильтры, различные виды бумаги на основе целлюлозы, бусины (включая полимерные, латексные и парамагнитные частицы), стеклянные, кремневые пластинки, микрочастицы, наночастицы, гели TentaGel, AgroGel, PEGA, SPOCC, и многолуночные планшеты. Например, тест-полоска может быть получена путем нанесения антитела или ряда антител в наборе на твердую подложку. Затем полоску можно погрузить в тестируемый образец и затем быстро провести стадии отмывок и обнаружения для получения измеряемого сигнала, такого как окрашенное пятно. Антитела или другие полипептиды могут связываться со специфическими зонами устройств для проведения теста либо путем конъюгирования непосредственно с поверхностью устройства для проведения теста, либо путем непрямого связывания. Во втором случае, в качестве примера, антитела или другие полипептиды могут быть иммобилизованы на частицах или на других твердых подложках, и указанная твердая подложка иммобилизована на поверхности устройства для проведения теста.
В определенных вариантах осуществления метод анализа почечного биомаркера в моче включает иммунологический анализ. Например, антитела, предназначенные для применения в таких тестах, могут специфически связываться с эпитопом почечного
биомаркера, представляющего интерес, и также могут связываться с одним или более полипептидами, которые являются "родственными", в том виде как этот термин определяется в дальнейшем. В одном варианте осуществления почечный биомаркер, представляющий интерес, является полноразмерным маркером (т.е., например, белком). В одном варианте осуществления почечный биомаркер, представляющий интерес, является маркером, состоящим из белкового фрагмента (т.е., например, пептидом). Иммунотесты доступны в многочисленных форматах, совместимых образцами биологической жидкости, включая, но без ограничения, мочу, кровь, сыворотку, слюну, слезы и плазму.
В этом смысле, обнаруживаемые сигналы, которые получали в
результате иммунотеста, могут представлять собой
непосредственный результат образования комплексов между одним или более антителами и биомолекулой-мишенью (т.е., например, аналитом) и полипептидами, содержащими необходимый эпитоп(ы), с которым связываются антитела. Несмотря на то, что такие тесты могут выявлять полноразмерный биомаркер, и результат теста может быть выражен в виде концентрации биомаркера, представляющего интерес, сигнал, получаемый в тесте, фактически может являться результатом всех таких "иммунореактивных" полипептидов, представленных в образце.
Экспрессию биомаркеров также можно определить с помощью других иммунотестов, включая количественные измерения белка (т.е., например, дот-блот анализ, вестерн-блоттинг, хроматографические методы, масс-спектрометрия и т.д.) и количественные определения нуклеиновых кислот (количественная оценка мРНК). Указанный перечень тестов не является ограничивающим. Упомянутые выше стадии способа не следует истолковывать в том смысле, что результаты аналитических измерений почечного биомаркера применяют в отрыве от способов, описанных в настоящем документе.
Скорее, дополнительные переменные или другие клинические показатели могут быть включены в описанные здесь способы. Например, способы стратификации, диагностики, классификации, мониторинга и т.д., которые описаны здесь, могут быть
объединены с одним или более клиническими показателями,
имеющими отношение к популяции пациентов, включая, но без
ограничения, демографическую информацию (например, вес, пол,
возраст, раса), медицинскую историю (например, семейный
анамнез, разновидность операции, предшествующая болезнь, такая
как аневризма, застойная сердечная недостаточность,
преэклампсия, эклампсия, сахарный диабет, гипертония,
ишемическая болезнь сердца, протеинурия, почечная
недостаточность, или сепсис, тип токсического воздействия, например, NSAID, циклоспорины, такролимус, аминогликозиды, фоскарнет, этиленгликоль, гемоглобин, миоглобин, ифосфамид, тяжелые металлы, метотрексат, рентгеноконтрастные средства или стрептозотоцин), значения клинических показателей (например, давление крови, температура, частота дыхания), шкалы оценки риска (шкала APACHE, шкала PREDICT, шкала оценки рискаТ1М1 для UA/NSTEMI, Фрамингемская шкала риска), скорость клубочковой фильтрации, рассчитанную скорость клубочковой фильтрации, скорость образования мочи, концентрацию креатинина в сыворотке или плазме крови, концентрацию креатинина в моче, фракциональную экскрецию натрия, концентрацию натрия в моче, отношение креатинин мочи к креатинину сыворотки или креатинину плазмы, удельный вес мочи, осмоляльность мочи, отношение азот мочевины мочи к азоту мочевины плазмы, отношение BUN к креатинину в плазме, индекс почечной недостаточности, рассчитанный как натрий мочи/(креатинин мочи/креатинин плазмы), концентрацию нейтрофильной желатиназы (NGAL) в сыворотке или плазме, концентрацию NGAL в моче, концентрацию цистатина С в сыворотке или плазме, концентрацию сердечного тропонина в сыворотке или плазме, концентрацию BNP в сыворотке или плазме, концентрацию NTproBNP в сыворотке или плазме, и концентрацию proBNP в сыворотке или плазме. Другие результаты измерений функции почек, которые можно объединить с одним или более результатами аналитических измерений почечного биомаркера описаны далее в настоящем документе. См. в публикации: Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Ed., McGraw Hill, New York, pages 1741-1830; и в: Current Medical Diagnosis
& Treatment 2008, 47th Ed, McGraw Hill, New York, pages 785815, каждая из которых включена в описание посредством ссылки во всей полноте.
При измерении более чем одного биомаркера, отдельные биомаркеры могут быть измерены в образцах, полученных в одно и тоже время, или могут быть определены в образцах, полученных в разные моменты (например, раньше или позже) времени. Отдельные биомаркеры также можно измерить в одном и том же образце или в разных образцах биологической жидкости. Например, количество одного почечного биомаркера может быть измерено в образце сыворотки или плазмы, и количество другого почечного биомаркера может быть измерено в образце мочи. Кроме того, определение вероятности может объединять в себе результат аналитических измерений почечного биомаркера и значения изменений во времени одной или более дополнительных переменных.
В. Детектируемые метки
Создание детектируемого сигнала от детектируемой метки
может быть осуществлено с применением различных оптических,
акустических и электрохимических методов. Примеры методов
детектирования включают, но без ограничения, флуоресценцию,
радиохимическое детектирование, методы, основанные на
отражательной способности, абсорбции, амперометрии,
электрической проводимости, электрическом сопротивлении, интерферометрии, эллипсометрии, и т.д. В некоторых из указанных методов антитело твердой фазы может быть соединено с датчиком (например, датчик на основе дифракционной решетки, электрохимический датчик и т.д.) для создания сигнала, тогда как в других методах сигнал создается датчиком, который пространственно отделен от антитела твердой фазы (например, флуориметр, в котором применяется источник возбуждающего света и приемник оптического излучения). Данный перечень не является ограничивающим. Биосенсоры на основе антител также можно использовать для определения наличия или количества аналитов, что в некоторых случаях устраняет необходимость применения меченой молекулы.
необходимы методы детекции, и один из наиболее распространенных
методов количественного определения для получения результатов
аналитических измерений представляет собой конъюгирование
детектируемой метки с белком или нуклеиновой кислотой, которые
обладают аффинностью к одному из соединений в биологической
системе, которую изучают. Детектируемые метки, применяемые в
иммунотестах, описанных выше, могут включать, но без
ограничения, молекулы, которые сами по себе являются
детектируемыми (например, флуоресцентные группировки, метки с
электрохимическими свойствами, метки eel (обладающие
электрохимической люминесценцией), хелаты металлов, коллоидные
частицы металлов и т.д.), а также молекулы, которые могут быть
обнаружены опосредованно, по образованию детектируемого
продукта реакции (например, с помощью ферментов, таких как
пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и т.д.) или путем
применения специфически связывающейся молекулы, которая сама
может быть детектируемой (например, меченое антитело, которое
связывается с вторичным антителом, биотином, дигоксигенином,
мальтозой, олигогистидином, 2,4-динитробензолом,
фениларсенатом, ss-ДНК, ds-ДНК, и т.д.).
Создание твердых фаз и конъюгатов с детектируемыми метками
часто включает применение химических сшивателей. Сшивающие
реагенты могут содержать по меньшей мере две функциональные
группы, и обычно их разделяют на гомофункциональные сшиватели
(содержащие одинаковые функциональные группы) и
гетерофункциональные сшиватели (содержащие различные
функциональные группы).
Гомобифункциональные сшиватели, которые образуют сшивки за счет аминогрупп, сульфгидрильных групп или за счет неспецифических реакций, являются коммерчески доступными во многих источниках. Малеимиды, алкил- и арил- галогениды, альфа-галоацилы и пиридилдисульфиды содержат тиольные функциональные группы и взаимодействуют с сульфгидрильными группами с образованием тиол-эфирных связей, тогда как пиридилсульфиды взаимодействуют с сульфгидрильными группами с образованием различных дисульфидов. Продукт реакции пиридилсульфида является
расщепляемым. Имидоэфиры также используются для создания белок-белковых поперечных сшивок. Различные гетеробифункциональные сшиватели, каждый из которых обладает различными свойствами для успешного осуществления конъюгации, являются коммерчески доступными.
С. Анализы количественного определения гиалуроновой кислоты
Содержание гиалуроновой кислоты в моче можно определить путем сбора утренних свежевыпущенных (средняя порция мочи) образцов мочи, которые хранят при -20°С до проведения теста. Тест количественного определения НА может быть построен на основе планшетного теста ELISA для определения гиалуронана с применением доменной области G1 биотинилированного протеогликана (связывающей НА) . Fosang et al. Matrix, 10:306313 (1990) . В одном варианте осуществления тест может быть модифицирован путем использования 9б-луночных титрационных микропланшетов, покрытых НА, выделенной из пупочного канатика человека (25 мкг/мл), которые инкубируют с серийными разведениями образцов мочи в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) +0,05% Tween 20 (PBS+Tween), и биотинилированный НА-связывающий белок, выделенный из хрящей носа быка (1 мкг/мл). После инкубации при комнатной температуре в течение 16 часов лунки промывали раствором PBS+Tween. НА-связывающий белок, связавшийся с указанными лунками, определяли количественно с применением системы обнаружения на основе образования авидин-биотинового комплекса и субстрата ABTS (2,2' азино-бис(3-этил-бензотиазолин-б-сульфоновая кислота)) (Vector Laboratories, Burlingame, Calif). Стандартный график можно построить путем нанесения значений абсорбции (4 05 нм) как функции значений концентрации НА (нг/мл), выделенной из пупочного канатика человека. С помощью такого графика можно рассчитать концентрацию НА в каждом разведении образца мочи. В результате проведения нескольких таких определений определяют среднее значение концентрации НА для каждого образца и затем стандартизируют по концентрации креатинина (мг/мл) в образце мочи.
Показано, что описанный выше тест НА изобретения выявлял рак мочевого пузыря с чувствительностью приблизительно 8 8%, при использовании предела отсечки приблизительно 500 нг/мл. См. Lokeshwar, et al. Methods for detection and evaluation of bladder cancer, патент США № 6350571 (который включен в описание посредством ссылки). Хотя это неважно для понимания настоящего изобретения, пределы отсечения концентрации НА могут варьировать, и следует принимать во внимание распределение в популяции. Установление предела отсечения концентрации НА для получения подходящих прогностических факторов продолжительного диализа может включать рассмотрение различных факторов, включая, но без ограничения, возраст, диету, концентрацию белка в образце, влияние окружающей среды, наследственность, состояние гидратации, историю болезни, физическое состояние, пол, вес или тому подобное.
В одном варианте осуществления количественный анализ НА
включает нанесение НА на поверхность твердой фазы. Хотя это не
связано с пониманием механизма, лежащего в основе изобретения,
НА можно получить из любого подходящего источника, такого как
пупочный канатик человека. Твердая фаза может представлять
собой любую подходящую твердую фазу, включая нитроцеллюлозу и
т.п. и предпочтительно лунки микропланшета. После нанесения НА
на твердую фазу, поверхность твердой фазы предпочтительно
отмывают с применением подходящего буфера (буферов). Поскольку
на поверхности твердой фазы еще остаются участки, способные к
связыванию с НА или другими молекулами, перед внесением образца
предпочтительно добавить блокирующее вещество, чтобы закрыть
какую-либо часть поверхности твердой фазы, на которой не
адсорбировалась НА. Примеры подходящих блокирующих веществ
включают у_гл°булин и альбумин, полученные от коров или других
животных. Бычий сывороточный альбумин является
предпочтительным. После блокирования свободных участков твердой фазы поверхность твердой фазы предпочтительно отмывают с применением подходящего буфера(буферов).
Затем НА-связывающий белок (НАВР) добавляют к блокированной твердой подложке в присутствии образца
биологической жидкости, полученного у пациента,
предположительно имеющего повреждение почек, и инкубируют в условиях, позволяющих НАВР связаться с НА, нанесенной на твердую подложку, и НА мочи (если имеется в наличии). Время и условия инкубации могут изменяться в широких пределах, но время инкубации приблизительно от 4 до 16 часов, и температура инкубации приблизительно от 4°С до 37°С соответствуют требованиям. Тем не менее, также возможны более продолжительное или более короткое время инкубации и более высокая или более низкая температура инкубации.
НАВР, подходящий для применения в количественных анализах настоящего изобретения, можно выделить из различных источников, например, из хрящей носа быка (Tengblad, Biochim. Biophys. Acta, 578: 281-289, 1979), хрящей ларингалов свиньи (Fosang et al., Matrix, 10: 306-313, 1990). После связывания НАВР с иммобилизованной НА и/или НА, содержащейся в образце, поверхность твердой фазы предпочтительно отмывают с применением подходящего буфера (буферов). Затем определяют количество НАВР, связавшегося с НА, иммобилизованной на твердой подложке. Предпочтительно, НАВР биотинилирован, и связанный НАВР визуализируется после инкубации с конъюгатом авидин-фермент и любым субстратом фермента, который образует окрашенный продукт. В такой системе детекции не используют радиоактивные метки, множественные маркеры (т.е., молекулы фермента) иммобилизуются каждым НАВР, связанным с твердой подложкой, и сигнал (т.е., окрашенный продукт) увеличивается за счет числа оборотов фермента. Однако любая подходящая система маркеров может быть использована в сочетании с НАВР.
Примеры подходящих систем маркеров включают системы с использованием ферментов, флуоресценции, хемилюминесценции, фермент-субстратных взаимодействий, изотопных маркеров, радиометок и т.п. Предпочтительно, определение количества НАВР, связанного с НА, нанесенного на твердую подложку, осуществляют с применением системы детектирования на основе авидин-биотина. В другой полезной системе маркеров используется кератин-сульфат и антитела к кератин-сульфату. Уровни НА в моче можно
эффективно измерить с применением считывающего устройства для микропланшетов, и экстраполировать на основе значений стандартной калибровочной кривой. Затем количество НАВР, связавшегося с иммобилизованной НА, можно сопоставить с наличием рака мочевого пузыря у пациента, у которого брали образец биологической жидкости.
При количественном анализе НА в качестве стандарта предпочтительно используют очищенную гиалуроновую кислоту. НА-связывающие фрагменты, применяемые в упомянутом выше анализе, можно выделить из НА пупочного канатика человека (приблизительно 500 мг) путем обработки 20000 ЕД тестикулярной гиалуронидазы (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) при 37°C. В течение различных интервалов времени. Полученные фрагменты НА разделяли на колонке Sephadex G-50 (1, 5 * 120 см) . Собирали фракции объемом десять мл и проводили количественный анализ содержания уроновой кислоты (Bitter and Muir, A modified uronic acid carbazole reaction. Anal. Biochem., 4:330-334, 1962). Фракции объединяли с получением трех препаратов, Fl, F2 и F3. Число восстанавливающих концов в каждой фракции определяли по методу Дайджерта (Dygert et al., Determination of reducing sugars with improved precision. Anal. Biochem., 13: 367-374, 19 65). Поскольку каждый линейный полисахарид НА или его фрагмент содержит один восстанавливающий конец, длину цепи каждого фрагмента рассчитывали исходя из числа восстанавливающих концов на моль уроновой кислоты. Диапазон размеров олигосахаридов в каждой фракции также определяли путем включения 3Н меченой НА (полученной, как описано в публикации Lokeshwar et al. , Ankyrin binding domain of CD44(GP85) is required for the expression of hyaluronic acid-mediated adhesion function. J. Cell Biol., 126 1099-1 109, 1994) во время расщепления НА и проведения анализа фрагментов с помощью гель-электрофреза и радиофотографии.
Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения необходимость проведения длительного диализа может быть предсказана с помощью количественного измерения НА в образце биологической жидкости (например, в образце мочи),
полученном у пациента, предположительно имеющего повреждение и/или заболевание почек. Любая подходящая методика анализа может быть использована для определения наличия и количества НА, включая радиоизотопные анализы, сэндвич-анализы, анализы ингибирования и т.п. Однако предпочтительно НА измеряют в анализе конкурентного связывания. Более предпочтительно количественный тест изобретения работает таким же образом, как тест ELISA, но без необходимости использования механизмов с участием антител.
В одном варианте осуществления необходимость применения длительного диализа может быть предсказана с применением способа, включающего:
(a) нанесение НА на твердую подложку (предпочтительно, лунки микротитрационного планшета);
(b) контактирование и инкубацию НА-связывающего белка (НАВР) с твердой подложкой с нанесенной НА в присутствии образца жидкости (например, образца мочи), полученного у пациента, предположительно имеющего повреждение и/или заболевание почек, в условиях, позволяющих НАВР связаться с НА, иммобилизованной на твердой подложке, и с НА, содержащейся в образце, (если имеется в наличии);
(c) определение количества НАВР, связавшегося с НА, нанесенной на твердую подложку, и определение на основании этого количества НА, представленной в образце.
Хотя это и не имеет отношения к пояснению принципа настоящего изобретения, если НА присутствует в образце, меньшее количество НАВР будет связываться с иммобилизованной НА, как установлено, например, при сравнении со стандартом. Другими словами уменьшение количества НАВР, связанного с иммобилизованной НА (по сравнению с контрольными значениями) означает присутствие повышенного количества НА в образце. В одном варианте осуществления повышенный уровень НА в моче является прогностическим показателем длительного диализа.
В одном варианте осуществления способ также может включать обнаружение сигнала, ассоциированного с или произведенного связанным НАВР. Хотя это и не имеет отношения к пояснению
принципа настоящего изобретения, количество НАВР, связавшегося с НА, иммобилизованной на твердой подложке, можно использовать для определения количества НА, представленного в образце. Например, устройство для считывания микропланшетов можно использовать для измерения оптической плотности окрашенного продукта, в качестве косвенного показателя количества биотинилированного НАВР, связавшегося с твердой подложкой (например, конъюгат авидин-фермент и меченый субстрат используют для получения окрашенного продукта). Максимальное значение оптической плотности можно получить при инкубации лунок, покрытых НА, с буфером, без добавления НА или образца, содержащего НА. Затем можно построить стандартную кривую путем нанесения на график значений оптической плотности в виде функции количества нг/лунка или 0,2 мл НА. С использованием стандартного графика можно рассчитать концентрацию НА (нг/мл) в каждом разведении образца. В результате нескольких таких измерений можно определить среднее значение концентрации НА в каждом образце. Можно измерить концентрацию креатинина, чтобы стандартизировать концентрации НА. В одном варианте осуществления определение вероятности необходимости проведения пациенту длительного диализа можно определить с помощью следующих расчетов на основе стандартизированного уровня НА в моче: НА (нг/мл) экстраполированное из графика зависимости от времени * коэффициент разбавления/мг/мл белка в моче. Например, низкое показание оптической плотности свидетельствует о существенном количестве НА в образце мочи, которое само является показателем необходимости проведения длительного диализа пациенту.
1. Выделение НА и фрагментов НА из мочи пациентов Образцы мочи здоровых пациентов и пациентов можно подвергнуть 10-кратному концентрированию и диализу против PBS. Приблизительно 2 мл каждого диализованного образца (содержащего приблизительно 2 0 мг белка) наносили на колонку с Sepharose б CL-B (1,5 х 120 см) (Pharmacia, Piscataway, N.J.), уравновешенную PBS. Через колонку пропускали PBS со скоростью 7 мл/час, и собирали фракции в объеме 3,5 мл. Содержание НА во
фракциях оценивали с помощью теста, подобного ELISA, как описано выше. Поскольку глобулярные белки, используемые в качестве стандартных маркеров, и линейные полисахариды, такие как НА и фрагменты НА, отличаются по форме, для калибровки колонки использовали НА пупочной вены человека (Mr. приблизительно 2> <10б D) и фрагменты НА, Fl, F2 и F3.
Тест, подобный ELISA, может включать применение биотинилированного НА-связывающего белка для определения концентрации НА в образцах мочи. Поскольку известно, что уровни НА в моче (присутствующие, как правило, в количестве нг) зависят от состояния гидратации организма и диуреза, указанные уровни стандартизируют по содержанию креатинина в моче.
D. Количественный анализ корреляций
В некоторых вариантах осуществления результат аналитических измерений почечного биомаркера коррелирует с одним или более последующими изменениями функции почек, в одном варианте осуществления стратификация риска включает определение вероятности (т.е., например, возможности) последующего улучшения функции почек у пациента.
В одном варианте осуществления результат аналитических измерений почечного биомаркера коррелирует с вероятностью указанного последующего улучшения функции почек. В одном варианте осуществления способ позволяет определить вероятность указанного последующего повреждения функции почек. В одном варианте осуществления стратификация риска включает определение у пациента риска прогрессирования заболевания до острой почечной недостаточности (ARF).
В одном варианте осуществления результат аналитического измерения почечного биомаркера коррелирует с вероятностью прогрессирования заболевания до острой почечной недостаточности (ARF) . В одном варианте осуществления способ стратификации риска включает в себя определение риска исхода заболевания для пациента.
В одном варианте осуществления результат аналитических измерений коррелирует с вероятностью осуществления клинического исхода, зависящего от повреждения почек, имеющегося у пациента.
Соответственно, можно провести сравнение значения (значений) измеренной концентрации можно сравнить с пороговым значением, при котором идентифицируют либо "положительный маркер повреждения почек", либо "отрицательный маркер повреждения почек". В одном варианте осуществления стратификация риска включает в себя определение у пациента риска последующего снижения функции почек. В некоторых вариантах осуществления, способ позволяет установить вероятность, риск или возможность того, что событие, представляющее интерес, произойдет с большей или меньшей вероятностью в течение 180 дней от момента времени получения образца биологической жидкости у пациента. В некоторых вариантах осуществления установленная вероятность, риск или возможность относятся к событию, представляющему интерес, которое происходит в течение периода времени, включающего, но без ограничения, 18 месяцев, 120 дней, 90 дней, 60 дней, 45 дней, 30 дней, 21 день, 14 дней, 7 дней, 5 дней, 96 часов, 72 часа, 48 часов, 36 часов, 24 часа, 12 часов или меньше. Альтернативно оценка риска в 0 часов времени от момента получения образца биологической жидкости соответствует диагнозу текущего состояния.
Выбор диагностического порога включает среди прочего рассмотрение вероятности заболевания, распределение истинных и ложных диагнозов при различных пороговых значениях теста, и оценивает последствия лечения (или отсутствия лечения) на основании диагноза. Например, при рассмотрении вопроса о применении специфической терапии, характеризующейся высокой эффективностью и низким уровнем риска, необходимо проведение небольшого числа тестов, поскольку для врачей является приемлемой значительная диагностическая погрешность. С другой стороны, в ситуациях, когда варианты лечения менее эффективны и более рискованы, врачам часто требуется более высокая степень диагностической достоверности. Таким образом, анализ результативности затрат включен в выбор диагностического порога.
1. Пороговые значения
Подходящие пороговые значения можно определить различными способами. Например, в одном рекомендованном диагностическом пороге для диагностики острого инфаркта миокарда используют сердечный тропонин, при этом диагностический порог устанавливается как 97,5-й процентиль значения концентрации сердечного тропонина, измеренного в нормальной популяции. Другой способ определения диагностического порога включает измерение серии образцов, полученных от одного пациента, где предшествующий "исходный" результат используют для мониторинга изменений во времени уровня биомаркера.
Популяционные исследования также можно использовать для
выбора пороговых значений. Например, Рабочая Оперативная
Характеристика ("ROC") происходит из области теории обнаружения
сигнала, разработанной во время Второй мировой войны для
анализа радиолокационных изображений, и ROC-анализ часто
используют для выбора порогового значения, чтобы различить
"заболевшую" субпопуляцию и "незаболевшую" субпопуляцию.
Прогнозирующая способность уравновешивает встречаемость ложно-
положительных результатов (например, когда пациент имеет
положительный результат теста, но на самом деле не имеет
заболевания) и ложно-отрицательных результатов (т.е., например,
когда пациент имеет отрицательный результат теста, означающий
что он здоров, хотя на самом деле он болен) . Для построения
кривой ROC, определяют долю истинно положительных результатов
(TPR) и долю ложноположительных результатов (FPR), учитывая,
что порог принятия решения изменяется непрерывно. Поскольку TPR
равно чувствительности и FPR равно (1 - специфичность), гарфик
ROC иногда называют графиком зависимости чувствительности от (1
- специфичность). Идеальный тест будет иметь площадь под кривой
ROC равную 1,0; тест со случайным результатом будет иметь
площадь 0,5. Пороговое значение выбирают, чтобы обеспечить
приемлемый уровень специфичности и чувствительности, обычно
определяемый сложением значений специфичности и
чувствительности. Таким образом, чем выше рассчитанное пороговое значение, тем больше прогнозирующая способность
конкретного результата аналитических измерений в соответствии с анализом. В данном случае, "заболевшая" относится к популяции, имеющей одну характеристику (например, наличие заболевания или состояния или появление некого исхода) и "незаболевшая" популяция не имеет указанной характеристики. В то время как один порого принятия решения является самым простым применением указанного метода, можно использовать несколько порогов принятия решения. Например, значениям ниже первого порога может быть поставлено в соответствие отсутствие заболевания с относительно высокой достоверностью, и значениям выше второго порога наличие заболевания может быть поставлено в соответствие также с относительно высокой достоверностью. Между двумя пороговыми значениями может рассматриваться область соответствующая неясному диагнозу. Данный пример приведен только в качестве иллюстрации
Помимо сравнений с пороговыми значениями, другие методы корреляции результатов аналитических измерений с классификацией пациента (т.е., например, наличие или отсутствие заболевания, вероятность исхода и т.д.) включают в себя, но без ограничения дерево принятия решений, множество правил, байесовский метод, и методы нейронных сетей. Указанные методы могут давать значения вероятности, представляющие степень принадлежности пациента или пациента к одной классификации, выбранной из множества классификаций.
Несколько пороговых значений также можно использовать для оценки состояния почек у лица и/или пациента.
Например, многопороговый метод позволяет объединять "первую" субпопуляцию, имеющую предрасположенность к одному или более последующих изменений в состоянии почек, наличию повреждения почек, к соответствию классификации и т.д. со "второй" субпопуляцией, которая не имеет предрасположенности, в одну группу. Указанную объединенную группу затем подразделяют на три или более равных частей (т.е., например, тертили, квартили, квинтили и т.д., в зависимости от числа подгрупп). Отношение шансов назначали пациентам на основании того, в какую подгруппу они попадали. При рассмотрении варианта осуществления
с применением терцилей самый низкий или самый высокий терциль можно использовать в качестве стандарта для сравнения с другими подгруппами. В указанной референсной подгруппе устанавливают отношение шансов, равное 1. Во втором терциле устанавливают отношение шансов, которое связано с отношением шансов в первом терциле. То есть, пациент во втором терциле имеет в 3 раза большую вероятность развития последующих изменений в состоянии почек по сравнению с пациентом в первом терциле. В третьем терциле также устанавливают отношение шансов, которое связано с первым терцилем.
2. Специфичность и чувствительность
В некоторых вариантах осуществления измеренную концентрацию одного или более почечных биомаркеров, или комбинации таких биомаркеров, можно рассматривать как непрерывные переменные. Например, концентрацию любого конкретного биомаркера можно преобразовать в соответствующую вероятность последующего снижения функции почек у пациента, наличие повреждения, соответствие классификации повреждения почек и т.д. Альтернативно пороговое значение может обеспечить достаточный уровень специфичности и чувствительности при разделении популяции пациентов на группы, такие как "первая" субпопуляция (например, с предрасположенностью к одному или более последующих изменений в состоянии почек, наличию повреждения, соответствию классификации повреждения почек, и т.д.) и "вторую" субпопуляцию, которая не имеет предрасположенности.
В одном варианте осуществления пороговую величину выбирают, чтобы отделить первую и вторую популяции с помощью одного или более измерений теста на точность:
i) отношение шансов выше, чем 1, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 2 или больше, или приблизительно 0,5 или меньше, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 3 или больше, или приблизительно 0,33 или меньше, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 4 или больше, или приблизительно 0,25 или меньше, еще более предпочтительно по меньшей мере
приблизительно 5 или больше, или приблизительно 0,2 или меньше, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 или больше, или приблизительно 0,1 или меньше;
ii) специфичность выше 0,5, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,6, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,7, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,8, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,9 и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,95, в сочетании с соответствующим значением чувствительности выше, чем 0,2, предпочтительно выше, чем приблизительно 0,3, более предпочтительно выше, чем приблизительно 0,4, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,5, еще более предпочтительно приблизительно 0,6, еще более предпочтительно выше, чем приблизительно 0,7, еще более предпочтительно выше, чем приблизительно 0,8, более предпочтительно выше, чем приблизительно 0,9, и наиболее предпочтительно выше, чем приблизительно 0,95;
iii) чувствительность выше, чем 0,5, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,6, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,7, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,8, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,9 и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,95, с соответствующим значением специфичности выше, чем 0,2, предпочтительно выше, чем приблизительно 0,3, более предпочтительно выше, чем приблизительно 0,4, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 0,5, еще более предпочтительно приблизительно 0,6, еще более предпочтительно выше, чем приблизительно 0,7, еще более предпочтительно выше, чем приблизительно 0,8, более предпочтительно выше, чем приблизительно 0,9, и наиболее предпочтительно выше, чем приблизительно 0,95;
iv) по меньшей мере приблизительно 75% чувствительность, в
сочетании по меньшей мере с приблизительно 7 5% специфичностью;
отношение правдоподобности положительного результата
исследования (вычисляемое как чувствительность/(1
специфичность)) выше, чем 1, по меньшей мере приблизительно 2,
ii)
более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 3, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 5, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10; или
v) отношение правдоподобности отрицательного результата
исследования (вычисляемое как (1
чувствительность)/специфичность) меньше 1, меньше или равно приблизительно 0,5, более предпочтительно меньше или равно приблизительно 0,3, и наиболее предпочтительно меньше или равно приблизительно 0,1.
Описаны различные оценки для определения точности теста, и они применяются для определения эффективности данного биомаркера. См. публикацию Fischer et al., Intensive Care Med. 29:1043-1051 (2003) . Указанные оценки точности включают, но без ограничения, чувствительность и специфичность, прогностические значения, отношения правдоподобия, диагностические отношения шансов, и величины AUC ROC. Например, значения AUC ROC соответствуют вероятности того, что классификатор оценит случайно выбранный положительный случай выше, чем случайно выбранный отрицательный случай. Соответственно, можно считать , что значение AUC ROC эквивалентно U-критерию Манна-Уитни, в котором проверяют разницу медиан при сравнении оценок, полученных в двух рассматриваемых группах, если группы состоят из непрерывных данных, или в критерии суммы рангов Уилкоксона.
Как обсуждалось выше, подходящие тесты могут характеризоваться одним или более из следующих результатов указанных различных измерений: специфичность выше, чем 0,5, предпочтительно по меньшей мере 0, б, более предпочтительно по меньшей мере 0,7, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,8, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,9 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,95, вместе с соответствующими значениями чувствительности выше, чем 0,2, предпочтительно выше 0,3, более предпочтительно выше 0,4, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,5, еще более предпочтительно 0,6, еще более предпочтительно выше, чем 0,7, еще более предпочтительно выше, чем 0,8, более предпочтительно выше, чем 0,9, и наиболее предпочтительно выше, чем 0,95; чувствительность выше, чем 0,5,
предпочтительно по меньшей мере 0, б, более предпочтительно по меньшей мере 0,7, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,8, и еще более предпочтительно по меньшей мере 0,9 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,95, с соответствующим значением специфичности выше, чем 0,2, предпочтительно выше, чем 0,3, более предпочтительно, выше, чем 0,4, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,5, еще более предпочтительно 0,6, еще более предпочтительно выше, чем 0,7, еще более предпочтительно выше, чем 0,8, более предпочтительно выше, чем 0,9, и наиболее предпочтительно выше, чем 0,95; по меньшей мере 75% чувствительность, в сочетании с по меньшей мере 75% специфичностью; площадь под кривой ROC больше, чем 0,5, предпочтительно по меньшей мере 0,6, более предпочтительно 0,7, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,8, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,9, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,95; отношение шансов, отличающееся от 1, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 2 или больше, или приблизительно 0,5 или меньше, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 3 или больше или приблизительно 0,33 или меньше, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 4 или больше или приблизительно 0,2 5 или меньше, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 5 или больше или приблизительно 0,2 или меньше, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 или больше или приблизительно 0,1 или меньше; отношение правдоподобности положительного результата исследования (рассчитываемое как чувствительность/(1 - специфичность)) выше, чем 1, по меньшей мере 2, более предпочтительно по меньшей мере 3, еще более предпочтительно по меньшей мере 5, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10; и/или отношение правдоподобности отрицательного результата исследования (рассчитываемое как (1 -чувствительность)/специфичность) меньше чем 1, меньше или равно 0,5, более предпочтительно мешьше или равно 0,3, и наиболее предпочтительно мешьше или равно 0,1.
Е. Количественные анализы клинических показателей Дополнительные клинические показатели могут быть
объединены с результатом аналитических измерений почечного
биомаркера настоящего изобретения для улучшения
чувствительности и специфичности сопоставлений для стратификации риска, классификации, диагностики и/или прогноза повреждения и/или заболевания почек. Указанные показатели включают, но без ограничения, другие биомаркеры, связанные с состоянием почек.
Примеры с указанием общего названия биомаркера, а также идентификационного номера в базе данных белковых последовательностей Swiss-Prot для биомаркера или его предшественника, включают, но без ограничения: актин (Р68133); аденозиндезаминаза-связывающий белок (DPP4, Р27487); альфа-1-кислый гликопротеин 1 (Р02763); Альфа-1-микроглобин (Р02760); альбумин (Р02768); ангиотензиногеназу (ренин, Р00797); аннексии А2 (Р07355) ; бета-глюкуронидазу (Р08236) ; В-2-микроглобин
(Р61679); бета-галактозидазу (Р16278); ВМР-7 (Р18075); натрийуретический пептид головного мозга (proBNP, BNP-32, NTproBNP; Р16860); кальций-связывающий белок бета (SlOO-бета, Р04271); карбоангидразу (Q16790); казеинкиназу 2 (Р68400); кадгерин-3 (Р07858); церулоплазмин (Р00450); кластерин
(Р10909); компонент комплемента СЗ (Р01024); цистеин-богатый белок (CYR61, О00622); цитохром С (Р99999); эпидермальный фактор роста (EGF, Р01133); эндотелин-1 (Р05305); секреторный фетуин-А (Р02765); белок, связывающийся с жирными кислотами, выделенный из сердца (FABP3, Р05413); белок, связывающийся с жирными кислотами, выделенный из печени (Р07148); ферритин
(легкая цепь, Р02793; тяжелая цепь Р02794); фруктоза-1,б-дифосфатазу (Р09467); GRO-альфа (CXCL1, (Р09341); гормон роста
(Р01241); фактор роста гепатоцитов (Р14210); инсулиноподобный фактор роста I (Р01343); иммуноглобулин G; легкие цепи иммуноглобулина (каппа и лямбда); интерферон гамма (Р01308); лизозим (Р61626); интерлейкин-1 альфа (Р01583); интерлейкин-2
(Р60568); интерлейкин-4 (Р60568); интерлейкин-9 (Р15248);
интерлейкин-12р4О (Р29460); интерлейкин-13 (Р35225);
интерлейкин-1б (Q14005); молекулу клеточной адгезии L1
(Р32004); лактатдегидрогеназу (Р00338); лейцинаминопептидазу
(Р28838); альфа-субъединицу меприна A (Q16819); бета-субъединицу меприна A (Q16820); мидкин (Р21741); М1Р2-альфа (CXCL2, Р19875); ММР-2 (Р08253); ММР-9 (Р14780); нетрин-1 (095631); нейтральную эндопептидазу (Р08473); остеопонтин (Р10451); ренальный папиллярный антиген 1 (RPA1); ренальный папиллярный антиген 2 (RPA2); ретинолсвязывающий белок (Р0 94 55); рибонуклеазу; S100 кальцийсвязывающий белок Аб (Р06703); компонент Р сывороточного амилоида (Р02743); изоформа Na+/H+ переносчика (NHE3, Р48764); спермидин/спермин N1-ацетилтрансферазу (Р21673); TGF-бета 1 (Р01137); трансферрин (Р02787); фактор "трилистника" 3 (TFF3, Q07654); Toll-подобный белок 4 (О00206); общий белок; антиген, ассоциированный с тубулоинтерстициальным нефритом (Q9UJW2); уромодулин (белок Тамма-Хорсфалла, Р07911).
1. Усовершенствования стратификации риска
В контексте стратификации риска биомаркер, представляющий собой клинический показатель, который может облегчить определение состояния почек, включает в себя, без ограничения, такие вещества как: адипонектин (Q15848); щелочная фосфатаза
(Р05186); аминопептидаза N (Р15144); кальбиндинБ2 8к (Р05937);
цистатин С (Р01034); 8 субъединица FIFO АТФазы (Р03928); гамма-
глутамилтрансфераза (Р19440); GSTa (альфа-глутатион-S-
трансфераза, Р08263); GSTpi (глутатион-Б-трансфераза Р; GST class-pi; Р09211); IGFBP-1 (Р08833); IGFBP-2 (Р18065); IGFBP-6
(Р24592); интегральный белок мембраны 1 (Itml, Р46977); интерлейкин-б (Р05231); интерлейкин-8 (Р10145); интерлейкин-18
(Q14116); IP-10 (10 кДа белок, индуцированный интерфероном гамма, Р02778); IRPR (IFRD1, 000458); изовалерил-СоА дегидрогеназа (IVD, Р26440); 1-ТАС/CXCL11 (014625); кератин 19
(Р08727); Kim-1 (клеточный рецептор 1 вируса гепатита А, 043656); L-аргинин:глицин амидинотрансфераза (Р50440); лептин
(Р41159); липокалин 2 (NGAL, Р80188); МСР-1 (Р13500); MIG
(монокин, индуцированный гамма-интерфероном Q07325); М1Р-1а
(Р10147); MIP-3a (Р78556); М1Р-1бета (Р13236); MIP-ld (Q16663); NAG (N-aцeтил-бeтa-D-глюкoзaминидaзa, Р54802); переносчик органических ионов (0СТ2, 015244); остеопротегерин (014788);
белок Р8 (О60356); ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1, Р05121); ProANP(l-98) (Р01160); протеинфосфатаза 1-бета (PPI-бета, Р62140); Rab GDI-бета (Р50395); почечный калликреин (Q86U61); RT1.B-1 (альфа) цепь интегрального белка мембраны (Q5Y7A8); член 1А суперсемейства растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNFR-I, Р19438); член 1В суперсемейства растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNFR-II, Р20333); тканевой ингибитор металлопротеаз 3 (TIMP-3, Р35625); uPAR (Q034 05) могут быть объединены с результатом аналитических измерений маркера повреждения почек настоящего изобретения. F. Показатели демографической информации
Другие клинические показатели, которые могут быть использованы в сочетании с почечным биомаркером
Измерения настоящего изобретения содержат демографические данные, включая, но без ограничения вес, пол, возраст, расу, историю болезни, семейный анамнез, вид операции, предшествующие заболевания, такие как аневризма, застойная сердечная недостаточность, преэклампсия, эклампсия, сахарный диабет, гипертония, ишемическая болезнь сердца, протеинурия, почечная недостаточность или сепсис, тип токсического воздействия, например, NSAID, циклоспорины, такролимус, аминогликозиды, фоскарнет, этиленгликоль, гемоглобин, миоглобин, ифосфамид, тяжелые металлы, метотрексат, рентгеноконтрастные средства или стрептозотоцин), клинические показатели (например, давление крови, температура, частота дыхания), шкалы оценки риска (шкала APACHE, шкала PREDICT, шкала оценки риска TIMI для UA/NSTEMI, Фрамингемская шкала риска), измерение общего белка в моче, скорость клубочковой фильтрации, рассчитанная скорость клубочковой фильтрации, скорость образования мочи, концентрация креатинина в сыворотке или плазме крови, измерение почечного папиллярного антигена 1 (RPA1); измерение почечного папиллярного антигена 2 (RPA2); концентрация креатинина в моче, фракциональная экскреция натрия, концентрация натрия в моче, отношение креатинин мочи к креатинину сыворотки или креатинину плазмы, удельный вес мочи, осмоляльность мочи, отношение азот мочевины мочи к азоту мочевины плазмы, отношение BUN к
креатинину в плазме, и/или индекс почечной недостаточности, рассчитанный как натрий мочи/(креатинин мочи/креатинин плазмы). Другие результаты измерений функции почек, которые можно объединить с результатом аналитических измерений маркера повреждения почек, описаны ниже. См. в публикации: Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Ed., McGraw Hill, New York, стр 1741-1830; и в публикации: Current Medical Diagnosis & Treatment 2008, 47th Ed, McGraw Hill, New York, стр. 785-815, каждая из которых включена в описание посредством ссылки во всей полноте.
Таким образом, комбинирование результатов измерений почечного биомаркера с результатами измерений клинических показателей может включать применение множественной логистической регрессии, логлинейного моделирования, анализа нейронных сетей, анализ размерностей типа "п из т", анализа методом дерева решений и т.д. Указанный перечень не является ограничивающим.
G. Общепринятые методы диагностики функции почек Как отмечалось выше, термины "острое ренальное (или почечное) повреждение" и "острая ренальная (или почечная) недостаточность" в рамках изобретения обычно описывают, отчасти, в терминах изменений сывороточного креатинина от исходного значения. Наиболее общепринятые определения ARF характеризуются общими элементами, которые включают, но без ограничения, использование сывороточного креатинина и, часто, диуреза. Могут быть представлены пациенты с почечной дисфункцией, у которых недоступно исходное измерение почечной функции для применения в указанном сопоставлении. В таком случае можно оценить исходную величину сывороточного креатинина, принимая, что пациент исходно имел нормальное значение GFR.
1. Скорость клубочковой фильтрации и креатинин Скорость клубочковой фильтрации (GFR) обычно определяют как объем жидкости, отфильтрованной ренальными (почечными) клубочковыми капиллярами внутри капсулы почечного тельца за единицу времени. Скорость клубочковой фильтрации (GFR) можно
рассчитать путем количественного определения любого химического соединения, которое характеризуется стабильным уровнем в крови, и свободно фильтруется, но не реабсорбируется и не секретируется почками. GFR обычно выражают в единицах мл/мин.
При стандартизации значения GFR на площадь поверхности тела, можно принять значение GFR приблизительно 75-100 мл/мин на 1,73 м2. Таким образом, измеренная скорость представляет собой количество вещества в моче, которое исходно получают из расчетного объема крови.
Существует несколько различных методик, применяемых для расчета или оценки скорости клубочковой фильтрации (GFR или eGFR) . В клинической практике, однако, для оценки GFR используют клиренс креатинина. Креатинин в норме продуцируется организмом (креатинин является метаболитом креатина, который обнаруживается в мышцах). Он свободно фильтруется почечными клубочками, но также интенсивно секретируется почечными канальцами в очень небольших количествах, так что клиренс креатинина дает завышенные значения существующей GFR на 10-20%. Указанная погрешность является приемлемой, учитывая легкость, с которой рассчитывается клиренс креатинина.
Клиренс креатинина (ССг) можно рассчитать, если известны значения концентрации креатинина в моче (UCr), скорости диуреза (V) , и концентрации креатинина в плазме крови (РСг) . Поскольку произведение концентрации в моче и скорости диуреза дает в результате скорость экскреции креатинина, клиренсом креатинина также называют его скорость экскреции (UCrxV), деленную на концентрацию креатинина в плазме. Обычно это выражается математически как:
Обычно проводят сбор мочи в течение 2 4 часов, от утра одного дня, когда мочевой пузырь считают пустым, до утра следующего дня, когда считают содержимое мочевого пузыря, с проведением в тот же период времени сравнительного анализа крови.
x 24 - часовой объем x 24 x 60 мин
Чтобы обеспечить возможность сравнения результатов, полученных у пациентов разного размера, часто проводят коррекцию ССг по площади поверхности тела (BSA) и выражают в сравнении со стандартными размерами человека в виде мл/мин/1,7 3 м2. В то время как у большинства взрослых пациентов показателю BSA соответствует значение 1,7 (1,6-1,9), значения ССг у очень полных или худых пациентов следует корректировать по фактическому существующему значению BSA:
г - Ccr х L73
^Ст-corrected В§ А.
Точность измерения клиренса креатинина (даже при правильно выполненном сборе мочи) ограничена, поскольку, когда скорость клубочковой фильтрации (GFR) падает, секреция креатинина увеличивается, и соответственно, возрастание сывороточного креатинина является менее значительным. Таким образом, экскреция креатинина является значительно больше, чем его содержание в моче, что приводит к потенциально значительно завышенной оценке GFR (двукратное различие). Однако в диагностических целях важно определить остается ли функция почек стабильной, или она становится хуже или лучше. Указанное изменение часто определяют с помощью мониторинга сывороточного креатинина. Как и клиренс креатинина, сывороточный креатинин не является точным показателем GFR при неустойчивом состоянии ARF. Тем не менее, степень изменений сывороточного креатинина от исходного значения будет отражать изменения GFR. Измерение сывороточного креатинина не представляет сложностей и его значение является специфичным для функции почек.
В целях определения диуреза на почасовой основе мл/кг/час, в соотвествии с требованиями сбор и количественный анализ мочи следует проводить каждый час. Для случаев, когда, например, известны только суммарные данные за 24 часа, и не известны значения веса пациентов, описаны небольшие изменения критериев
диуреза RIFLE. Например, принимают, что средний вес пациента составляет 70 кг, с которым состояние пациентов оценивают по шкале RIFLE на основе следующих значений : <35 мл/час (риск), <21 мл/час (повреждение) или <4 мл/час (недостаточность). Bagshaw et al., Nephrol. Dial. Transplant. 23:1203-1210 (2008). 2. Выбор схемы лечения
После постановки диагноза врач без труда может выбрать схему лечения, которая согласуется с диагнозом, например, начать заместительную почечную терапию, прекратить поступление соединений, повреждающих почки, назначить трансплантацию почки, отложить или отменить процедуры, которые оказывают повреждающее действие на почки, изменить прием диуретических средств, начать целенаправленную терапию и т.д. Различные схемы адекватного лечения различных заболеваний обсуждались ранее применительно к методам диагностики, описанными здесь. См., например, Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17th Ed. Merck Research Laboratories, Whitehouse Station, NJ, 1999. Кроме того, поскольку способы и композиции, описанные здесь, предоставляют прогностическую информацию, почечные биомаркеры настоящего изобретения могут быть использованы для мониторинга во время курса лечения. Например, прогноз улучшения состояния или прогноз ухудшения состояния может показывать, что определенный вид лечения является или не является эффективным.
IV. Антитела
Антитела, используемые в описанных здесь иммунотестах, предпочтительно специфически связываются с маркером повреждения почек настоящего изобретения. Термин "специфически связывается" не означает, что антитело связывается исключительно со своей предполагаемой мишенью, поскольку, как отмечалось выше, антитело связывается с любым полипептидом, демонстрирующим эпитоп(ы), с которым связывается антитело. Скорее, антитело "специфически связывается", если его аффинность в отношении его предполагаемой мишени приблизительно в 5 выше, по сравнению с его аффинностью в отношении молекулы, не являющейся мишенью, которая не демонстрирует соответствующий эпитоп(ы). Предпочтительно аффинность антитела выше по меньшей мере
приблизительно в 5 раз, предпочтительно в 10 раз, более предпочтительно в 25 раз, еще более предпочтительно в 50 раз и наиболее предпочтительно в 100 раз или больше в отношении молекулы-мишени, чем его аффинность в отношении молекулы, не являющейся мишенью. В некоторых вариантах осуществления антитела связываются с аффинностью по меньшей мере приблизительно 107 1УГ1, и предпочтительно значение аффинности связывания находится в диапазоне приблизительно от 108 1УГ1 до 109 1УГ1 приблизительно от 109 1УГ1 до 1010 1УГ1, или приблизительно от 1010 1УГ1 до 1012 1УГ1.
Аффинность можно рассчитать как Kd=K0ff/Kon (Koff представляет собой константу скорости диссоциации, Коп представляет собой константу скорости ассоциации и Ко! представляет собой константу равновесия). Аффинность можно определить в состоянии равновесия путем измерения связанной фракции (г) меченого лиганда, взятого в различных концентрациях
(с). Данные наносят на график с использованием уравнения Скэтчарда: r/c=K(n-r): где г = число молей связанного лиганда/число молей рецептора в состоянии равновесия; с = концентрация свободного лиганда в состоянии равновесия; К = равновесная константа ассоциации; и п = число участков связывания лиганда в молекуле рецептора. При графическом анализе г/с наносят на ось Y и г наносят на ось X, получая таким образом график Скэтчарда. Определение аффинности антител с помощью анализа Скэтчарда хорошо известно в данной области. См., например, van Erp et al., J Immunoassay 12:425-443 (1991); and Nelson et al. , Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-68
(1988).
В многочисленных публикациях рассматривается применение технологии фагового дисплея для создания и скрининга библиотек полипептидов для связывания выбранного аналита. См., например, Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science 249:404-406 (1990); Scott et al, Science 249:386-388 (1990); и Ladner et al, патент США № 5571698 (все источники включены в описание посредством ссылки). Основной принцип методов фагового дисплея состоит в установлении
физической взаимосвязи между ДНК, кодирующей искомый полипептид, и самим полипептидом. Указанная физическая взаимосвязь обеспечивается фаговой частицей, которая демонстрирует полипептид в виде части капсида, заключающего в себе фаговый геном, который кодирует полипептид. Установление физической взаимосвязи между полипептидами и их генетическим материалом обеспечивает одновременное проведение масс-скрининга очень большого числа фагов, несущих различные полипептиды. Фаг, демонстрирующий полипептид, обладающий аффинностью к мишени, связывается с мишенью, и указанный фаг обогащают путем проведения скрининга аффинности связывания с мишенью. Идентичность полипептидов, демонстрируемых фагом, можно определить на основании их соответствующих геномов. С применением указанных методов, полипептид с установленной аффинностью связывания в отношении желаемой мишени можно затем синтезировать подходящими способами в большом объеме. См., например, патент США № 6057098, который включен в описание во всей полноте, в том числе все таблицы, фигуры и формула изобретения.
Антитела, полученные такими способами, затем могут быть подвергнуты отбору с помощью первичного скрининга по определению аффинности и специфичности связывания с очищенным полипептидом, представляющим интерес, и, если необходимо, в сравнении с результатами аффинности и специфичности связывания антител с полипептидами, связывание с которыми необходимо исключить. Процедура скрининга может включать иммобилизацию очищенных полипептидов в отдельных лунках микротитрационных планшетов. Раствор, содержащий предполагаемое антитело или группу антител, затем помещают в соответствующие лунки микропланшета и инкубируют в течение приблизительно от 3 0 мин до 2 часов. Лунки микропланшета затем отмывают и второе меченое антитело (например, антимышиное антитело, конъюгированное со щелочной фосфатазой, если вызванные антитела являются мышиными антителами) добавляют в лунки планшета и инкубируют приблизительно в течение 3 0 мин и затем отмывают. При добавлении субстрата в лунки цветная реакция возникает в случае
присутствия антитела к иммобилизованному
полипептиду(полипептидам).
Антитела, идентифицированные таким образом, затем могут быть подвергнуты анализу для определения аффинности и специфичности связывания в тесте выбранного дизайна. При разработке иммунотестов для определения белка-мишени, очишенный белок-мишень используют в качестве стандарта для оценки чувствительности и специфичности иммунотеста с использованием антител, которые были отобраны. Поскольку аффинность связывания различных антител может отличаться; определенные пары антител (например, в сэндвич-анализе) могут препятствовать друг другу пространственно, и т.д., выполнение анализа с применением антитела может быть более важным показателем, чем абсолютная аффинность и специфичность антитела. V. Наборы
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также предлагает устройства и наборы для осуществления способов, описанных здесь. Подходящие наборы включают реагенты, достаточные для осуществления теста по меньшей мере в отношении одного из описанных маркеров повреждения почек, вместе с инструкциями по выполнению описанных сравнений с пороговыми значениями.
В определенных вариантах осуществления реагенты для осуществления указанных тестов предоставляются в устройстве для проведения теста, и такие устройства для проведения теста могут быть включены в указанный набор. Предпочтительные реагенты могут включать одно или более иммобилизованных антител, иммобилизованное антитело включает антитело, которое выявляет заданный биомаркер-мишень(мишени), связанный с твердой подложкой. В случае иммуноферментных сэндвич-анализов, такие реагенты также могут включать одно или более детектируемых меченых антител, включая антитело, которое обнаруживает заданный биомаркер-мишень(мишени), связанный с детектируемой меткой. Дополнительные необязательные элементы, которые могут предоставляться как часть устройства для проведения теста, описаны ниже.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает наборы для проведения анализа описанных маркеров повреждения почек. Набор содержит реагенты для проведения анализа по меньшей мере одного тестового образца, который включает по меньшей мере одно антитело, которое является маркером повреждения почек. Набор также может включать устройства и инструкции по выполнению одного или более диагностических и/или прогностических сравнений, описанных здесь. Предпочтительные наборы будут включать пару антител для выполнения сэндвич-анализа или меченые частицы для выполнения конкурентного анализа для определения аналита. Предпочтительно, пара антител включает первое антитело, конъюгированное с твердой фазой, и второе антитело, конъюгированное с детектируемой меткой, где первое и второе антитело связывают маркер повреждения почек. Наиболее предпочтительно антитела представляют собой моноклональные антитела. Инструкции по применению набора и выполнению сравнений могут быть представлены в форме этикетки, которая дает ссылку на письменный или другим образом зарегистрированный материал, который прилагается, или иным способом дополняет набор во время его производства, транспортировки, продажи или применения. Например, термин "этикетка" охватывает рекламные листовки и буклеты, упаковочные материалы, инструкции, аудио и видио кассеты, компьютерные диски, а также текст, отпечатанный непосредственно на наборах.
В одном варианте осуществления изобретение предлагает диагностические наборы для оценки вероятности необходимости проведения продолжительного диализа. В одном варианте осуществления набор включает НА и/или HAase, НАВР и маркер или НАВР, конъюгированный с маркером, и вспомогательные реагенты, подходящие для использования при выявлении наличия НА и/или HAase в биологическом образце (т.е., например, в образце мочи). Пример диагностического набора, предлагаемого настоящим изобретением, представляет собой общепринятое устройство в виде тест-полоски.
полоски может обеспечивать количественный анализ НА для определения необходимости проведения продолжительного диализа. Например, применение общепринятого метода твердофазного иммуноанализа в форме тест-полоски может быть использовано для количественного анализа НА, как описано выше. В одном варианте осуществления тест-полоска может быть покрыта или пропитана НА, при этом тест-полоска может быть использована для тестирования любой биологической жидкости, включая, но без ограничения, мочу.
Экспериментальная часть
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение выполнено с возможностью осуществления целей и получения упомянутых результатов и преимуществ, а также преимуществ, присущих им. Примеры, приведенные в описании, являются типичными для предпочтительных вариантов осуществления, иллюстративными и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Пример 1
Стандартизированные значения гиалуроновой кислоты в образцах мочи человека
Гиалуроновую кислоту определяли в моче человека, как описано выше. Динамику изменений значений гиалуроновой кислоты определяли путем сбора проб и определения количества НА в моче в течение двух недель (т.е. в течение четырнадцати дней D1-D14) . Представленные данные показывают пациентов, которые выздоревели, и пациентов, которые не невыздоровели в течение двадцати восьми (28) дней после того, как они перенесли повреждение почек, (т.е., например, R2 8 = выздоровевшие пациенты; и NR2 8 = невыздоровевшие пациенты). За время четырнадцатидневного (14) периода сбора образцов, анализ образцов осуществляли в 1-й день (D1), в 7-й день (D7), и в 14-й день (D14). См. фигуру 1.
Результаты показывают, что у выздоровевших пациентов наиболее высокое значение гиалуроновой кислоты наблюдали в D1, и оно постепенно снижалось в D7 и D14. Напротив, у невыздоровевших пациентов значение гиалуроновой кислоты
устойчиво возрастало в течение того же периода времени. Очевидно, результаты позволяют предположить, что значение гиалуроновой кислоты находится в корреляционной зависимости с вероятностью выздоровления после повреждения почек. Пример 2
Определение абсолютных стандартизированных значений концентрации гиалуроновой кислоты в образцах мочи человека
Результаты в данном примере устанавливают различия между стандартизированными абсолютными значениями концентраций гиалуроновой кислоты в образцах, полученных в Dl, D7 и/или D14 после повреждения почек, собранных как описано в Примере 1 для пациентов, у которых наблюдали восстановление функции почек в течение двадцати восьми дней (R28) и шестидесяти дней (R60) после повреждения почек, и для пациентов, у которых не наблюдали восстановление функции почек (NR2 8 и NR60).
Результаты показывают, что между днем 1 и днем 7, а также между днем 1 и днем 14 у выздоровевших пациентов наблюдали явное снижение стандартизированных значений экскреции гиалуроновой кислоты (т.е., например, экскреция гиалуроновой кислоты в абсолютных значениях снижалась в течение указанного периода времени). Однако различие между значениями, полученными в день 7 и день 14, было незначительным, что означает, что скорость экскреции оставалась неизменной. В отличие от этого, у невыздоровевших пациентов различия между значениями, полученными в день 1 и день 7, а также между значениями, полученными в день 1 и день 14, показали очевидное увеличение стандартизированных показателей экскреции гиалуроновой кислоты (т.е., например, экскреция гиалуроновой кислоты в абсолютных значениях возрастала в течение указанного периода времени). Также скорость экскреции не изменялась между днями 7 и 14. См. фигуры 2 и 3.
Пример 3
Относительные стандартизированные значения гиалуроновой кислоты в образцах мочи человека
В указанном Примере данные, соответствующие Примеру 2, представляют в другом графическом варианте, чтобы дополнительно
проиллюстрировать степень различий между выздоровевшими пациентами и невыздоровевшими пациентами. Так, в частности, результаты представлены в виде отношения в процентах (т.е., D7+D1, D14+D1, D7+D14 или D14+D7).
Результаты показывают, что у выздоровевших пациентов относительное значение экскреции гиалуроновой кислоты неуклонно снижается между 1-м и 14-м днями, тогда различие между относительными значениями, полученными в 14-й и 7-й дни, является несущественным. Результат согласуется с интерпретацией приведенных выше данных, что позволяет предположить, что гиалуроновая кислота снижается со временем у пациентов, выздоравливающих после повреждения почек. Напротив, результаты показывают, что у невыздоровевших пациентов относительные значения экскреции гиалуроновой кислоты остаются повышенными на протяжении всего периода времени. Данный результат согласуется с интерпретацией приведенных выше данных, что позволяет предположить, что гиалуроновая кислота возрастает со временем у пациентов, невыздоровевших после повреждения почек. См. фигуры 4 и 5.
Пример 4
Прогнозирование необходимости проведения длительного диализа в D14 после повреждения почек
Данные, соответствующие Примеру 2, анализировали и представляли в другом графическом варианте, чтобы оценить связь между истинно-положительными результатами и ложно-положительными результатами. В частности, в условиях постоянного нарастания НА/креатинин в моче (т.е., различие между результатами измерений в D1 и в D14) отмечали высокую чувствительность метода прогнозирования того, что пациенту потребуется проведение длительного диализа в D60 после повреждения почек. См. фигуру б. В заключение необходимо отметить, что данные позволяют предположить, что пациенты с проявлением постоянно нарастающего значения НА в моче между D1 и D14 после повреждения почек будут нуждаться в диализе в D60 (и по всей вероятности позже).
Пример 5
TGF-pi является показателем восстановления функции почек после АКТ.
Данное исследование являлось вспомогательным для более крупного многоцентрового рандомизированного контролируемого испытания по изучению эффекта различных доз заместительной почечной терапии на выживаемость при AKI, которое включало 2 4 пациента.
Значение TGF-pl в моче было значительно выше на 14-й день после проявления AKI у пациентов, у которых функция почек не восстановилась в течение 60 дней, по сравнению с пациентами, у которых функция почек восстановилась (р <0,01). См. фигуру 7.
Значения TGF-pl в моче являлись показателем восстановления функции почек в течение 60 дней, если при использовании образцов, полученных на 14-й день после наступления AKI, площадь под рабочей характеристической кривой (AUC ROC) составляла 0,81 (оцененная стандартная ошибка = 0,09). Кроме того, при рассмотрении изменения TGF-pl в моче от 1-го дня до 14-го дня, площадь под кривой AUC R0C возрастала до 0,84 (р <0,01) . TGF-pl измеряли с применением коммерчески доступного набора для проведения теста ELISA (R &D Systems, Minneapolis, MN) .
Пример 6
Рецептор смерти 5 (DR5) является показателем восстановления функции почек после АКТ.
Данное исследование являлось вспомогательным для более крупного многоцентрового рандомизированного контролируемого испытания по изучению эффекта различных доз заместительной почечной терапии на выживаемость при AKI, которое включало 2 5 пациентов.
Значения DR5 в моче были значительно выше на 14-й день после наступления AKI у пациентов, у которых не наблюдали восстановления функции почек на 60-й день, по сравнению с пациентами, у которых наблюдали восстановление функции почек. См. таблицу б.
Таблица б
Значения DR5 у пациентов с восстановившейся и не восстановившейся функцией почек в течение 60 дней. (А) Средние значения показателей DR5, полученные в дни 1 и 14, пациенты с невосстановившейся функцией почек и пациенты с восстановившейся
функцией почек. (В) Средние значения log показателей DR5, полученные в дни 1 и 14, пациенты с невосстановившейся функцией почек и пациенты с восстановившейся функцией почек
Значения DR5 в моче являются показателями восстановления функции почек в течение 60 дней, при использовании образцов, полученных на 14-й день после наступления AKI и характеризующихся площадью под рабочей характеристической кривой (AUC ROC) 0,90 (р <0,02). DR5 измеряли с применением коммерчески доступного набора (Invitrogen, Carlsbad, СА). Система для осуществления теста основана на внеклеточной мультиплексной платформе Luminex(c) с применением гранул Luminex(c) для определения цитокинов воспаления 5-plex, + IL-10, TNF-Ri, и TNF-R2 .
Хотя настоящее изобретение было описано и рассмотрено на примерах достаточно подробно, для того, чтобы специалист в данной области техники мог осуществить и применить его, должны быть очевидны различные альтернативные варианты, модификации и улучшения, которые могут быть произведены без отступления от существа и объема настоящего изобретения. Примеры, предоставленные в описании, отражают предпочтительные варианты осуществления, приводятся в качестве типичных примеров и не предназначены для ограничения объема изобретения. Модификации и другие применения могут быть выполнены специалистами в данной области. Указанные модификации входят в объем изобретения и
определены объемом формулы изобретения.
Специалисту в данной области понятно, что различные замены и модификации могут быть внесены в раскрытое здесь изобретение без отступления от существа и объема настоящего изобретения.
Все патенты и публикации, упомянутые в описании, являются показательными на уровне среднего специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Все патенты и публикации включены посредством ссылки в равной мере, как если бы каждая отдельная публикация специфически и самостоятельно указывалась как включенная посредством ссылки.
Настоящее изобретение, иллюстративно описанное здесь, подходящим образом может применяться на практике в отсутствие любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые не были здесь конкретно раскрыты. Таким образом, например, в каждом случае любой из терминов "включающий в себя", "преимущественно состоящий из" и "состоящий из" может быть заменен любым из двух других терминов. Использованные термины и выражения применены с целью описания, а не с целью ограничения, и применение данных терминов и выражений не имеет целью исключить любые эквиваленты указанных и описанных признаков или их частей, но подразумевается, что внутри объема заявленного изобретения возможны различные изменения. Поэтому следует понимать, что, хотя настоящее изобретение было подробно раскрыто с помощью предпочтительных вариантов воплощения и необязательных признаков, специалист в данной области техники может прибегнуть к модификации и вариации, раскрытых здесь понятий, и что такие модификации и вариации подпадают под объем настоящего изобретения, определенный прилагаемой формулой изобретения.
Другие варианты осуществления отражены в формуле изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ, включающий:
a) получение;
i) пациента с проявлением по меньшей мере одного симптома
острого поражения почек; и
ii) образца биологической жидкости, полученного от
указанного пациента, где указанный образец содержит по меньшей
мере один почечный биомаркер;
b) измерение у пациента значения, включающего значение по меньшей мере одного указанного почечного биомаркера в указанном образце; и
c) определение указанной вероятности восстановления
функции почек у пациента на основе указанного значения,
измеренного у пациента.
2. Способ по п.1, в котором указанная прогнозируемая вероятность восстановления функции почек осуществляется в течение по меньшей мере шестидесяти дней после наступления указанного острого повреждения почек.
3. Способ по п.1, в котором указанный образец получен по меньшей мере в течение четырнадцати дней после наступления указанного повреждения почек.
4. Способ по п.1, в котором указанный образец получен в течение одного дня после наступления указанного повреждения почек.
5. Способ по п.1, в котором указанный прогноз включает сравнение указанного значения пациента с пороговым значением.
6. Способ по п.5, в котором указанное пороговое значение включает уровень гиалуроновой кислоты в моче.
7. Способ по п.5, в котором указанное пороговое значение гиалуроновой кислоты в моче составляет приблизительно 12 мкг/мг креатинина.
8. Способ по п. 5, в котором указанное пороговое значение уровня гиалуроновой кислоты в моче, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,70.
2.
включает уровень гиалуроновой кислоты в моче и значение по меньшей мере одного клинического показателя.
10. Способ по п. 9, в котором указанное пороговое значение указанного уровня гиалуроновой кислоты в моче и указанное значение по меньшей мере одного клинического показателя, включающее в себя значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,75.
11. Способ по п.1, в котором указанное пороговое значение включает уровень трансформирующего фактора роста (31 в моче.
12. Способ по п.11, в котором указанное пороговое значение указанного уровня трансформирующего фактора роста (31 в моче составляет приблизительно 274 пг/мг креатинина.
13. Способ по п.11, в котором указанное пороговое значение указанного уровня трансформирующего фактора роста (31 в моче, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,70.
14. Способ по п.1, в котором указанное пороговое значение включает указанный уровень трансформирующего фактора роста (31 в моче и по меньшей мере значение одного клинического показателя.
15. Способ по п.14, в котором указанное пороговое значение указанного уровня трансформирующего фактора роста (31 в моче и указанного значения по меньшей мере одного клинического показателя, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,74 .
16. Способ по п.1, в котором указанное пороговое значение включает уровень рецептора смерти 5 в моче.
17. Способ по п.16, в котором указанное пороговое значение указанного уровня рецептора смерти 5 в моче составляет приблизительно 2,7 нг/мг креатинина.
18. Способ по п.16, в котором указанное пороговое значение указанного уровня рецептора смерти 5 в моче, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,70.
10.
включает уровень указанного рецептора смерти 5 в моче и значение клинического показателя.
20. Способ по п.19, в котором указанное пороговое значение указанного уровня рецептора смерти 5 в моче и указанное значение по меньшей мере одного клинического показателя, включающее в себя значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,76.
21. Способ по п.1, в котором указанное пороговое значение включает значение по меньшей мере одного клинического показателя.
22. Способ по п.21, в котором указанное значение клинического показателя выбрано из группы, включающей возраст, оценку по шкале SOFA, индекс коморбидности Чарльсона и оценку по шкале APACHE II.
23. Способ по п.21, в котором указанное значение по меньшей мере одного клинического показателя, включающее значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляет по меньшей мере 0,71.
24. Способ по п.1, в котором указанное значение пациента включает значения по меньшей мере двух клинических показателей.
25. Способ по п.24, в котором указанные значения по меньшей мере двух клинических показателей, включающие в себя значение площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC), составляют по меньшей мере 0,74.
26. Способ по п.24, в котором указанные значения по меньшей мере двух клинических показателей включают возраст и индекс коморбидности Чарльсона.
27. Способ, включающий:
a) получение;
i) пациента с проявлением по меньшей мере одного симптома
острого поражения почек; и
ii) образца биологической жидкости, полученного от
указанного пациента, где указанный образец содержит по меньшей
мере один почечный биомаркер;
значение по меньшей мере одного почечного биомаркера в указанном образце; и
с) сравнение указанного значения пациента с пороговым значением биомаркера, при котором устанавливают стратификацию риска.
28. Способ по п.27, в котором указанное сравнение также идентифицирует повышенное значение почечного биомаркера.
29. Способ по п.27, в котором указанное сравнение также идентифицирует сниженное значение почечного биомаркера.
30. Способ по п.27, в котором указанное значение пациента включает значение гиалуроновой кислоты в моче и значение по меньшей мере одного клинического показателя.
31. Способ по п.27, в котором указанное значение пациента
включает значение трансформирующего фактора роста (31-
32. Способ по п.27, в котором указанное значение пациента
включает значение рецептора смерти 5.
33. Способ по п.27, в котором указанное значение пациента также включает значение по меньшей мере одного клинического показателя.
34. Способ по п.27, в котором указанный образец получают в течение по меньшей мере четырнадцати дней после наступления указанного острого повреждения почек.
35. Способ по п.27, в котором указанная стратификация риска включает категорию риска.
36. Способ по п.27, в котором указанная стратификация риска включает категорию повреждения.
37. Способ по п.27, в котором указанная стратификация риска включает категорию недостаточности.
38. Способ по п.27, в котором указанная стратификация риска включает определение вероятности восстановления функции почек.
39. Способ по п.38, в котором указанная вероятность восстановления функции почек включает значение указанного биомаркера, характеризующееся площадью под рабочей характеристической кривой (AUC ROC) выше порогового значения приблизительно 0,70.
33.
40. Способ по п.27, в котором указанная стратификация риска включает определение вероятности невосстановления функции почек.
41. Способ по п.40, в котором указанная вероятность невосстановления функции почек включает значение указанного биомаркера, характеризующееся площадью под рабочей характеристической кривой (AUC ROC) ниже порогового значения приблизительно 0,70.
42. Способ по п.27, в котором указанная стратификация риска включает определение риска клинического исхода у пациента.
43. Способ по п.42, в котором указанный риск клинического исхода включает улучшение функции почек.
44. Способ по п.42, в котором указанный риск клинического исхода включает снижение функции почек.
45. Способ по п.44, в котором указанное снижение функции почек включает повреждение почек.
46. Способ по п.45, в котором указанное повреждение почек является прогрессирующим.
47. Способ по п.42, в котором указанный риск клинического исхода включает категорию утраты функции почек.
48. Способ по п.42, в котором указанный риск клинического
исхода включает категорию терминальной почечной
недостаточности.
49. Способ по п.42, в котором вероятность осуществления указанного риска клинического исхода сравнивают со значением площади под рабочей характеристической кривой (AUC ROC) пациента.
50. Способ по п.49, в котором указанная вероятность указанной категории утраты функции возрастает, если значение AUC ROC изменяется в пределах приблизительно 0,5-0,3.
51. Способ по п.49, в котором указанная вероятность указанной категории утраты функции снижается при значении AUC ROC выше 0,5.
52. Способ по п.49, в котором указанная вероятность указанной категории терминальной почечной недостаточности
33.
возрастает при значении AUC R0C ниже 0,3.
53. Способ по п.49, в котором указанная вероятность указанной категории терминальной почечной недостаточности снижается при значении AUC ROC приблизительно выше 0,3.
54. Способ по п.27, в котором указанная стратификация риска включает определение у пациента риска снижения функции почек в будущем.
55. Способ по п.54, в котором указанный риск снижения в будущем функции почек у пациента возрастает при значении AUC ROC ниже 0,5.
56. Способ по п.54, в котором указанный риск снижения в будущем функции почек у пациента снижается при значении AUC ROC выше 0,5.
57. Способ по п.54, в котором предполагают, что указанное последующее снижение функции почек произойдет в течение 180 дней с момента получения образца биологической жидкости у пациента.
58. Способ по п.54, в котором предполагают, что указанное последующее снижение функции почек произойдет в течение периода времени, выбранного из группы, включающей 18 месяцев, 120 дней, 90 дней, 60 дней, 45 дней, 30 дней, 21 день, 14 дней, 7 дней, 5 дней, 96 часов, 72 часа, 48 часов, 36 часов, 24 часа, 12 часов и меньше.
59. Способ по п.54, в котором указанное снижение функции почек происходит в момент времени 0 часов от времени получения образца биологической жидкости у пациента, обеспечивая тем самым диагностику текущего состояния.
60. Способ, включающий:
a) получение пациента, имеющего по меньшей мере один установленный фактор риска развития заболевания; и
b) отбор пациента для стратификации риска на основе по меньшей мере одного установленного фактора риска развития заболевания почек.
61. Способ по п.60, в котором указанный установленный фактор риска включает почечный биомаркер.
61.
выбран из группы, включающей показатель гиалуроновой кислоты в моче, показатель трансформирующего фактора роста (31 в моче и показатель рецептора смерти 5 в моче.
63. Способ по п.61, в котором указанная стратификация риска включает категорию риска.
64. Способ по п.61, в котором указанная стратификация риска включает категорию повреждения.
65. Способ по п.61, в котором указанная стратификация риска включает категорию почечной недостаточности.
66. Способ по п.61, в котором указанная стратификация риска включает категорию утраты функции почек.
67. Способ по п.61, в котором указанная стратификация риска включает категорию терминальной стадии почечной недостаточности.
68. Способ по п.63, в котором указанная категория риска включает значение AUC ROC, варьирующееся в диапазоне приблизительно 0,6-0,7.
69. Способ по п.64, в котором указанная категория повреждения включает значение AUC ROC, варьирующееся в диапазоне приблизительно 0,5-0,6.
70. Способ по п.65, в котором указанная категория почечной недостаточности включает значение AUC ROC, варьирующееся в диапазоне приблизительно 0,4-0,5.
71. Способ по п.66, в котором указанная категория утраты функции почек включает величину AUC ROC, варьирующуюся в диапазоне приблизительно 0,3-0,4.
72. Способ по п.67, в котором указанная категория терминальной стадии почечной недостаточности включает величину AUC ROC ниже 0,3.
73. Способ по п.60, в котором указанное заболевание почек выбрано из группы, включающей преренальное заболевание, собственно ренальное заболевание и постренальную форму острой почечной недостаточности.
74. Способ по п.60, в котором указанный пациент также имеет по меньшей одно медицинское состояние, выбранное из группы, включающей предстоящую или перенесенную обширную
63.
операцию на сосудах, аорто-коронарное шунтирование или другую операцию на сердце; пациент имеет предшествующую застойную сердечную недостаточность, преэклампсию, эклампсию, сахарный диабет, гипертонию, ишемическую болезнь сердца, протеинурию, почечную недостаточность, величину клубочковой фильтрации ниже нормального диапазона значений, цирроз, уровень сывороточного креатинина выше нормального диапазона значений и сепсис.
75. Способ по п.60, в котором указанный пациент также
подвергался воздействию по меньшей мере одного соединения,
выбранного из группы, включающей нестероидные
противовоспалительные лекарства, циклоспорины, такролимус,
аминогликозиды, фоскарнет, этиленгликоль, гемоглобин,
миоглобин, ифосфамид, тяжелые металлы, метотрексат,
рентгеноконтрастные средства или стрептозотоцин.
76. Способ по п.60, в котором указанный пациент также выбран для стратификации риска на основе уже известного диагноза повреждения, выбранного из группы, включающей функцию почек, сниженную функцию почек и острую почечную недостаточность.
По доверенности
CO T
4000
CO CD CL
3000 2000 1000 0
Фиг.1
CR CO
S T
X о CD
§ i
CD S
3 со
К CD
< <
Фиг.2
Фиг.З
<
3000
2000
1000
Ч2Я P7> ") 4№* Фиг.4
800
# a
CD Т CD 3Z со
CD -О
-0 СЦ CD I-
CD T О
CD CD CL
600
400
200
Фиг.5
0.6-
Площадь под ROC-кривой: площадь под кривой соответствия = 0,9686; оцененная стандартная ошибка = 0,0516; площадь, вычисленная по правилу трапеций (критерий Уилкоксона) = 0,9692; оцененная стандартная ошибка = 0,0568
0.4-
0,2-
-I-
0.2
0.4 0.6 "о!Г 1
Ложно-положительные случаи (1 - специфичность)
Фиг.6
TGFpi/креатинин
45 п
10 r.ot"a
СОИ"
¦ rnir> ¦i. median к max ж q3
° ^° А#
день 1 день 7
различаются статистически
день 14
день 21
Фиг.7
(1)
Термин "диагноз" в рамках изобретения относится к
Термин "диагноз" в рамках изобретения относится к
Термин "модифицированные критерии RIFLE" в рамках
Термин "модифицированные критерии RIFLE" в рамках
Термин "хроническое заболевание
Для количественных определений биологической активности
В одном варианте осуществления устройство в виде тест-
101
101
9. Способ по п.1, в котором указанное пороговое значение
9. Способ по п.1, в котором указанное пороговое значение
102
102
19. Способ по п.1, в котором указанное пороговое значение
19. Способ по п.1, в котором указанное пороговое значение
103
103
b) измерение у пациента значения, включающего указанное
b) измерение у пациента значения, включающего указанное
104
104
105
106
62. Способ по п.1, в котором указанный почечный биомаркер
108
108
1/7
1/7
1/7
1/7
1/7
1/7
2/7
2/7
2/7
2/7
3/7
3/7
4/7
4/7
5/7
5/7
5/7
5/7
5/7
5/7
6/7
6/7
7/7
7/7
7/7
7/7
7/7
7/7
|
