[**]

Изобретение описывает мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения или растительные клетки, содержащие (а) полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из: (i) полинуклеотида, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере на 71% идентичной SEQ ID NO: 1, 2, 27, 28, или 29, или 51; или (ii) полинуклеотида, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере на 65% идентичной одной из последовательностей SEQ ID NO: 3-23 или 30-50; или (iii) полинуклеотида, кодирующего полипептид NtMRP, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере на 65% идентичной одной из последовательностей SEQ ID NO: 24-26 или 52, где полипептид обладает активностью транспортера тяжелых металлов; или (b) полинуклеотидную конструкцию, содержащую по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов в длину, которая по меньшей мере на 65% идентична участку одной из последовательностей SEQ ID NO: 1-23 или 27-51; или (с) двухцепочечную РНК, содержащую по меньшей мере две последовательности, которые, по меньшей мере, частично комплементарны друг другу, где смысловая цепь содержит первую последовательность, а антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, причем по меньшей мере одна из последовательностей содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов РНК NtMRP; или (d) вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, описанный в пункте (i), (ii) или (iii), или полинуклеотидную конструкцию, описанную в пункте (b).

(57) Реферат / Формула:

Изобретение описывает мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения или растительные клетки, содержащие (а) полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из: (i) полинуклеотида, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере на 71% идентичной SEQ ID NO: 1, 2, 27, 28, или 29, или 51; или (ii) полинуклеотида, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере на 65% идентичной одной из последовательностей SEQ ID NO: 3-23 или 30-50; или (iii) полинуклеотида, кодирующего полипептид NtMRP, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере на 65% идентичной одной из последовательностей SEQ ID NO: 24-26 или 52, где полипептид обладает активностью транспортера тяжелых металлов; или (b) полинуклеотидную конструкцию, содержащую по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов в длину, которая по меньшей мере на 65% идентична участку одной из последовательностей SEQ ID NO: 1-23 или 27-51; или (с) двухцепочечную РНК, содержащую по меньшей мере две последовательности, которые, по меньшей мере, частично комплементарны друг другу, где смысловая цепь содержит первую последовательность, а антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, причем по меньшей мере одна из последовательностей содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов РНК NtMRP; или (d) вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, описанный в пункте (i), (ii) или (iii), или полинуклеотидную конструкцию, описанную в пункте (b).

---

Евразийское (21) 201390325 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K14/415 (2006.01)
2013.09.30 C12N15/82 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2011.08.31
(54) СНИЖЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В РАСТЕНИЯХ
(31) 10009180.0
(32) 2010.09.03
(33) EP
(86) PCT/EP2011/004383
(87) WO 2012/028309 2012.03.08
(88) 2012.06.28
(71) Заявитель:
ФИЛИП МОРРИС ПРОДАКТС С.А. (CH)
(72) Изобретатель: Бовэ Люсьен (CH)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение описывает мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения или растительные клетки, содержащие (а) поли-нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из:
(i) полинуклеотида, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере на 71% идентичной SEQ ID NO: 1, 2, 27, 28, или 29, или 51; или
(ii) полинуклеотида, включающего в себя, состоя-
щего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере на 65% идентичной одной из последовательностей SEQ ID NO: 3-23 или 30-50; или (iii) полинуклеотида, кодирующего полипептид NtMRP, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере на 65% идентичной одной из последовательностей SEQ ID NO: 24-26 или 52, где полипептид обладает активностью транспортера тяжелых металлов; или (b) полинуклеотидную конструкцию, содержащую по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов в длину, которая по меньшей мере на 65% идентична участку одной из последовательностей SEQ ID NO: 1-23 или 27-51; или (с) двухцепочечную РНК, содержащую по меньшей мере две последовательности, которые, по меньшей мере, частично комплементарны друг другу, где смысловая цепь содержит первую последовательность, а антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, причем по меньшей мере одна из последовательностей содержит по меньшей мере 10 смежных нук-леотидов РНК NtMRP; или (d) вектор экспрессии, I содержащий полинуклеотид, описанный в пункте (i), (ii) или (iii), или полинуклеотидную конструкцию, описанную в пункте (b).
lk 2k 3k 4k 3k 6k 7k 8k 9
3'-utr:aueustus 3'-utf~;auguGtus
СТарт-КОДОН laugustus стоп-кодон :oueustus ТраНСКрИПТ laueustus tssiausustus ttsiaugustus
cdsiaueuatus
2420-194156ЕА/042 СНИЖЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В РАСТЕНИЯХ Область изобретения
Настоящее изобретение направлено на полинуклеотиды и полипептиды, кодирующие транспортеры ABC, участвующие в транспорте тяжелых металлов. Настоящее изобретение также направлено на модификацию экспрессии указанных полинуклеотидов или полипептидов в растениях. В частности, настоящее изобретение относится к модуляции (например, к понижению или ингибированию) экспрессии или активности одного или нескольких транспортеров ABC, участвующих в субклеточном транспорте тяжелых металлов.
Введение
Растения получают необходимые тяжелые металлы, такие как цинк и медь, путем абсорбции субстратов ионов металлов из окружающей среды посредством разных механизмов транспорта, опосредуемых трансмембранными транспортерами, экспрессируемыми на поверхности клеток корней и других сосудистых тканей. Один из механизмов включает в себя транспорт токсинов из цитозоля. Например, семейство насосов на основе конъюгатов с глутатионом S (GS-X) представляет собой класс транспортеров АТФ-связывающей кассеты (ABC), отвечающих за устранение/разрушение соединений в растениях, а также в клетках млекопитающих и дрожжей. Молекулярная структура и функции насосов GS-X, кодируемых генами MPR, сМОАТ (каналикулярного мультиспецифического транспортера анионов) и YCF1 (дрожжевого кадмиевого фактора) являются консервативными на протяжении молекулярной эволюции.
Воздействие на растения экзогенных токсинов, таких как микробные продукты, аллелохимикаты, агрохимикаты и тяжелые металлы, делает выживание клеток зависимым от механизмов детоксикации или уменьшения накопления указанных средств. Тяжелые металлы, такие как свинец, кадмий, ртуть и др., представляют собой основные токсичные вещества окружающей среды, которые вызывают образование реакционноспособных окисляющих частиц, разрушение ДНК и инактивацию ферментов путем связывания с активными центрами ферментов в клетках живых
организмов. Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами сильно увеличилось в результате индустриализации и растет в объеме совокупности. Почвы, загрязненные тяжелыми металлами, подавляют нормальный рост растений и вызывают загрязнение продуктов питания. Многие тяжелые металлы являются высокотоксичными для человека и канцерогенными в низких концентрациях.
Безотлагательное уменьшение содержания тяжелых металлов, таких как кадмий, в растениях и растительных продуктах, потребляемых животными и людьми, является в высокой степени желательным и необходимым. Цель настоящего изобретения включает в себя удовлетворение данной потребности.
Аспекты и воплощения изобретения
Аспекты и воплощения настоящего изобретения описаны в прилагающейся формуле изобретения.
В одном аспекте изобретение предлагает выделенный полинуклеотид, выбранный из группы, включающей в себя: выделенный полинуклеотид, включающий в себя, состоящий, или преимущественно состоящий из последовательности, по меньшей мере, на 71% идентичной SEQ ID N0: 1, или SEQ ID N0: 2, или SEQ ID N0: 27, или SEQ ID N0: 28, или SEQ ID N0: 29, или SEQ ID N0: 51; выделенный полинуклеотид, включающий в себя, состоящий, или преимущественно состоящий из последовательности, по меньшей мере, на 65% идентичной одной из последовательностей SEQ ID N0: 3-23 или 30-50; полинуклеотид, кодирующий полипептид NtMRP, включающий в себя, состоящий, или преимущественно состоящий из последовательности, по меньшей мере, на 65% идентичной одной из последовательностей SEQ ID N0: 24-2 6 или 52, причем указанный полипептид предпочтительно обладает активностью транспортера тяжелых металлов.
В другом аспекте изобретение предлагает полинуклеотидную конструкцию, содержащую, по меньшей мере, 15 непрерывных нуклеотидов в длину, которая, по меньшей мере, на 65% идентична участку одной из последовательностей SEQ ID N0: 1-23 или 27-51.
В другом аспекте изобретение предлагает двухцепочечный рибополинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, две
последовательности, которые, по меньшей мере, частично комплементарны друг другу, где смысловая цепь содержит первую последовательность, а антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, причем, по меньшей мере, одна из последовательностей содержит, по меньшей мере, 10 смежных нуклеотидов РНК NtMRP.
Предпочтительно двухцепочечная РНК содержит первую
последовательность, по меньшей мере, на 65% идентичную
последовательности, состоящей, по меньшей мере, из 10
нуклеотидов ДНК NtMRP; вторую последовательность; и третью
последовательность, обратно комплементарную первой
последовательности, расположенную в такой же ориентации, что и первая последовательность, где вторая последовательность расположена между первой последовательностью и третьей последовательностью и находится в функциональной связи с первой последовательностью и третьей последовательностью.
Предпочтительно первая последовательность, по меньшей мере, на 65% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15 SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID No. 23, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, SEQ ID N0:34, SEQ ID N0:35, SEQ ID N0:36, SEQ ID N0:37, SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41, SEQ ID N0:42, SEQ ID N0:43, SEQ ID N0:44, SEQ ID N0:45, SEQ ID N0:46, SEQ ID N0:47, SEQ ID N0:48, SEQ ID N0:49 и SEQ ID N0:50.
Предпочтительно третья последовательность, по меньшей мере, на 65% идентична последовательности, обратно комплементарной одной из последовательностей SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15 SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID No. 23, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31,
SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, SEQ ID N0:34, SEQ ID N0:35, SEQ ID N0:36, SEQ ID N0:37, SEQ ID N0:38, SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41, SEQ ID N0:42, SEQ ID N0:43, SEQ ID N0:44, SEQ ID N0:45, SEQ ID N0:46, SEQ ID N0:47, SEQ ID N0:48, SEQ ID N0:49 и SEQ ID N0:50.
В другом аспекте изобретение предлагает вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид или полинуклеотидную конструкцию.
В другом аспекте изобретение предлагает мутантную, не встречающуюся в природе или трансгенную растительную клетку, содержащую выделенный полинуклеотид, полинуклеотидную конструкцию, двухцепочечный рибополинуклеотид или вектор экспрессии.
В другом аспекте изобретение предлагает мутантное, не встречающееся в природе или трансгенное растение, содержащее мутантную, не встречающуюся в природе или трансгенную растительную клетку.
В другом аспекте изобретение предлагает растительный материал, включающий в себя биомассу, семена или листья, который содержит клетки или ткани указанного растения.
В другом аспекте изобретение предлагает табачное изделие, содержащее часть указанного растения или растительной клетки, или указанный растительный материал.
В другом аспекте изобретение предлагает мутантное, не встречающееся в природе или трансгенное растение с пониженной экспрессией полинуклеотида NtMRP и активностью кодируемого им белка, или активностью кодируемого им белка, в листьях которого наблюдается снижение содержания кадмия, по меньшей мере, на 5% по сравнению с контрольным растением, в котором не наблюдается понижние экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
В другом аспекте изобретение предлагает биомассу, семена или листья, содержащие ткань растения.
В другом аспекте изобретение предлагает способ понижения уровня кадмия, по меньшей мере, в части растения, включающий в себя стадию понижения экспрессии полинуклеотида NtMRP и
активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка, по сравнению с контрольным растением, в котором не наблюдается понижения экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
В другом аспекте изобретение предлагает мутантное, не встречающееся в природе или трансгенное растение, полученное, или которое можно получить с помощью описанного здесь способа, по меньшей мере, в части которого снижено содержание кадмия, по меньшей мере, примерно на 5% по сравнению с контрольным растением, в котором не наблюдается понижение экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
В другом аспекте изобретение предлагает выделенный полипептид NtMRP, экспрессированный с использованием последовательности, описанной в SEQ ID N0: 24-2 6 или SEQ ID N0: 52, причем указанный полипептид предпочтительно обладает активностью транспортера тяжелых металлов.
В другом аспекте изобретение предлагает антитело, способное специфически связываться с выделенным полипептидом.
В другом аспекте изобретение предлагает способ детекции полинуклеотида NtMRP в образце, включающий в себя следующие стадии: (а) получение образца, содержащего полинуклеотид; (Ь) приведение в контакт указанного образца с одним или несколькими праймерами, или одним или несколькими зондами с целью специфической детекции, по меньшей мере, части полинуклеотида NtMRP; и (с) детекция продукта амплификации, наличие которого указывает на присутствие полинуклеотида NtMRP в образце.
Ниже описаны другие аспекты настоящего изобретения.
Химерный ген, содержащий выделенный полинуклеотид, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями.
Полинуклеотидная конструкция или двухцепочечная РНК настоящего изобретения, где полинуклеотид включает в себя, состоит, или преимущественно состоит из по меньшей мере, 15-30 нуклеотидов, 30-50 нуклеотидов, 50-100 нуклеотидов, 100-150
нуклеотидов, 150-200 нуклеотидов, 200-300 нуклеотидов, 300-400 нуклеотидов, 400-500 нуклеотидов, 500-600 нуклеотидов или 6007 00 нуклеотидов.
Конъюгат, содержащий выделенный полинуклеотид, химерный ген, полинуклеотидную конструкцию или двухцепочечную РНК настоящего изобретения и, по меньшей мере, один ковалентно связанный с ним ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент.
Мутантная, не встречающаяся в природе или трансгенная растительная клетка, содержащая выделенный полинуклеотид, химерный ген, полинуклеотидную конструкцию, двухцепочечную РНК, конъюгат или вектор экспрессии настоящего изобретения.
Мутантное, не встречающееся в природе или трансгенное растение, содержащее мутантную, не встречающуюся в природе или трансгенную растительную клетку настоящего изобретения.
Предпочтительно сухая биомасса из собранных листьев представляет собой то же самое, что и контрольное растение.
Биомасса, семена или листья, содержащие ткань растения настоящего изобретения.
Предназначенный для потребления продукт, содержащий биомассу, семена или листья настоящего изобретения, или полученный с использованием биомассы, семян или листьев настоящего изобретения.
Биомасса, семена или листья настоящего изобретения, или предназначенный для потребления продукт настоящего изобретения, в которых содержание кадмия, по меньшей мере, на 5% ниже, чем в биомассе, семенах или листьях контрольного растения, в котором не наблюдается понижение экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
Клеточная линия, содержащая выделенный полинуклеотид, химерный ген, полинуклеотидную конструкцию, двухцепочечную РНК, конъюгат или вектор экспрессии настоящего изобретения.
Способ получения мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения, включающий в себя стадию понижения экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка, по меньшей мере, в
части указанного растения по сравнению с контрольным растением, в котором не наблюдается понижение экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
Способ снижения уровня кадмия, по меньшей мере, в части растения, включающий в себя стадию понижения экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка, по сравнению с контрольным растением, в котором не наблюдается понижение экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
Предпочтительно указанный способ включает в себя первую стадию приведения в контакт указанного растения с полинуклеотидной конструкцией, двухцепочечной РНК, конъюгатом, вектором экспрессии, мегануклеазой или белком "цинковые пальцы".
Предпочтительно указанный способ включает в себя первую или дополнительную стадию приведения в контакт указанного растения с мутагеном.
Мутантное, не встречающееся в природе или трансгенное растение, полученное, или которое можно получить, с помощью способов настоящего изобретения, по меньшей мере, в части которого снижено содержание кадмия, по меньшей мере, примерно на 5% по сравнению с контрольным растением, в котором не наблюдается понижение экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
Способ модулирования (например, понижения или подавления) экспрессии полинуклеотида NtMRP или активности кодируемого им белка в клетке, который включает в себя введение химерного гена, полинуклеотидной конструкции, двухцепочечной РНК, конъюгата или вектора экспрессии настоящего изобретения.
Способ детекции, выделения, амплификации или анализа полинуклеотида NtMRP, включающий в себя стадию получения образца, содержащего полинуклеотид, и гибридизацию указанного полинуклеотида с молекулой полинуклеотида, включающей в себя
последовательность, по меньшей мере, 10 смежных нуклеотидов из выделенной нуклеотидной последовательности настоящего изобретения.
Применение средства, способного модулировать (например, понижать или подавлять) экспрессию полинуклеотида NtMRP и активность кодируемого им белка, или активность кодируемого им белка, с целью снижения, по меньшей мере, в части растения содержания кадмия, по меньшей мере, на 5% по сравнению с контрольным растением, в котором не наблюдается понижения экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
Способ применения настоящего изобретения, где указанное
средство представляет собой полинуклеотид NtMRP, химерный ген
NtMRP, полинуклеотидную конструкцию, содержащую полинуклеотид
NtMRP, антисмысловую РНК, двухцепочечную РНК, кДНК, конъюгат,
содержащий полинуклеотид NtMRP и, по меньшей мере, один
ковалентно связанный с ним ненуклеотидный или
неполинуклеотидный фрагмент, рибозим, мутаген, цинковый палец, маленькую молекулу или мегануклеазу, или производное одного из перечисленных соединений.
В другом аспекте изобретение предлагает способ получения табачного изделия, включающий в себя следующие стадии: (а) получение семян от мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения табака; (Ь) высевание семян и выращивание из них растения; (с) сбор растения; и (d) получение табачного изделия из собранного растения.
Вышеупомянутые воплощения раскрываются как воплощения каждого из описанных выше аспектов.
Некоторые преимущества
Получение мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений (в том числе их биомассы, семян и листьев) с пониженным содержанием кадмия в настоящее время заключает в себе ряд преимуществ.
Например, растения, включающие в себя мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения, можно выращивать в почвах, содержащих разные концентрации кадмия, или
в почвах с концентрацией кадмия ниже желательной. Культивирование указанных растений и полученных из них семян можно осуществлять в широком диапазоне почвенных сред, что позволяет увеличить выбор подходящих для культивирования почв, доступных практикующим специалистам (таким как фермеры).
В следующем примере мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения (в том числе полученные из них биомасса, семена и листья) имеют пониженное содержание кадмия по сравнению с контрольными аналогами и могут непосредственно употребляться в качестве пищевых продуктов. Употребление указанных пищевых продуктов может являться более полезным для здоровья выбором. Растения, подходящие для применения в раскрытых здесь способах, включают в себя растения, пригодные для культивирования в сельском хозяйстве, такие как табак, рис, кукуруза, тыква, соевые бобы, салат-латук, картофель, сорняки, сжигаемые для удобрения, кухонные травы, пшеница, ячмень, морковь и др.
В следующем примере мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения имеют такую же высоту и/или массу, как и контрольные растения. Так, высушенные собранные листья растений практически не отличаются от контрольных, что указывает на то, что модулирование транскриптов NtMRP не оказывает статистически значимого влияния на сухую биомассу. Это является преимуществом, поскольку растения используют для коммерческого получения разных продуктов, таких как табак, и изменение внешнего вида либо может быть не приемлемым для применения в промышленности, либо может приводить к неприемлемому уменьшению выхода продукции.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. На фигуре 1(a) изображена схематическая диаграмма локуса NtMRP4; на фигуре 1(b) показана нуклеотидная последовательность NtMRP4, где участки 5'- и З'-UTR обозначены подчеркиванием; экзоны обозначены заглавными буквами и выделены жирным шрифтом; интроны обозначены строчными буквами нормальным шрифтом; инициирующий кодон и стоп-кодон выделены серым цветом. Последовательности 5'- и 3'-праймеров, используемых для
получения последовательности РНКи NtMRP4, выделены курсивом и перечеркнуты.
Фигура 2 иллюстрирует экспрессию полинуклеотида NtMRP4 в процессе обработки кадмием в гидропонных условиях в течение 7 дней. Проростки KY14 возрастом три недели обрабатывают 0, 0,05 и 0,5 Со!С1г (а), а проростки N. rustica и N. tabacum (TN90) возрастом 4 недели обрабатывают 0,5 мкМ Со!С1г в течение одной недели (Ь). РНК выделяют и анализируют методом полуколичественной ОТ-ПЦР.
Фигура 3 иллюстрирует понижение содержания кадмия в листьях соответственно линиям 1 и 2 РНКи NtMRP4 по сравнению с культивируемыми в полевых условиях растениями дикого типа.
Фигура 4 иллюстрирует уменьшение содержания кадмия в листьях соответственно РНКи NtMRP4 двух культивируемых линий. В данном эксперименте используют контрольный вектор, не содержащий вставки NtMRP4.
На фигуре 5 приведены интрон-экзонная структура и
расположение интронов и экзонов на протяжении геномной
последовательности клона NtPMI-BAC-GOTOWE_5_gflHK ВАС,
включающей в себя участок, кодирующий NtMRP4. Гомология последовательности кДНК (пары оснований 1-4521 верхней части цепи) и геномной последовательности клона ВАС, содержащей участок, кодирующий MRP4 (пары оснований 61781-69748 нижней части цепи), составляет 100%.
На фигуре б показана нуклеотидная последовательность NtMRP3, где участки 5'- и З'-UTR выделены курсивом; экзоны обозначены заглавными буквами и выделены жирным шрифтом; интроны обозначены строчными буквами нормальным шрифтом; инициирующий кодон и стоп-кодон обозначены заглавными буквами и выделены жирным шрифтом и курсивом.
Определения
Технические термины и выражения, используемые в объеме данной заявки, как правило, употребляются в значении, традиционно применяемом в соответствующей области растительной и молекулярной биологии. Все приведенные ниже определения терминов применимы ко всему содержанию данной заявки. Слово
"содержащий" не исключает других элементов или стадий, а единственное число не исключает множественного. Одна стадия может соответствовать функциям нескольких признаков, описанных в формуле изобретения. Термины "практически", "примерно", "приблизительно" и т.п. в применении к признаку или значению, в частности, также точно определяет признак или значение, соответственно. Термин "примерно" в контексте заданного численного значения или диапазона относится к значению или диапазону, варьирующему по отношению к заданному значению или диапазону в пределах 2 0%, в пределах 10%, или в пределах 5%, 4%, 3%, 2% или 1%.
Термин "полинуклеотид" относится к полимеру из нуклеотидов,
который может представлять собой немодифицированный или
модифицированный дезоксирибополинуклеотид (ДНК) или
рибополинуклеотид (РНК). Соответственно, полинуклеотид может представлять собой, без ограничения, геномную ДНК, комплементарную ДНК (кДНК) (например, SEQ ID NO: 27), мРНК или антисмысловую РНК. Кроме того, полинуклеотид может представлять собой одноцепочечную или двухцепочечную ДНК, ДНК, содержащую смесь одноцепочечных и двухцепочечных участков, гибридную молекулу, содержащую ДНК и РНК, или гибридную молекулу, содержащую смесь одноцепочечных и двухцепочечных участков. Полинуклеотид также может включать в себя трехцепочечные участки, состоящие из ДНК, РНК, или той и другой. Полинуклеотид может содержать одно или несколько модифицированных оснований, таких как фосфотиоаты, и может представлять собой пептидополинуклеотид (PNA). Как правило, описанные здесь полинуклеотиды можно собрать из выделенных или клонированных фрагментов кДНК, геномной ДНК, олигонуклеотидов или отдельных нуклеотидов, или из сочетания перечисленных соединений. Хотя описанные здесь полинуклеотидные последовательности показаны как последовательности ДНК, они включают в себя соответствующие последовательности РНК и комплементарные (например, полностью комплементарные) им последовательности ДНК или РНК, в том числе обратно комплементарные последовательности.
Термин "полинуклеотид NtMRP" охватывает полинуклеотиды, в
которых полимер из нуклеотидов включает в себя, состоит, или
преимущественно состоит из последовательности, описанной в SEQ
ID N0: 1, 2, 27, 28, 29 или 51. Данный термин также охватывает
полинуклеотидную последовательность, в значительной степени
гомологичную (т.е. обладающую значительной степенью подобия
последовательностей) или практически идентичную
последовательностям SEQ ID N0: 1, 2, 27, 28, 29 или 51;
фрагментам SEQ ID N0: 1, 2, 27, 28, 29 или 51; и фрагментам, в
значительной степени гомологичным (т.е. обладающим значительной
степенью подобия последовательностей) или практически
идентичным фрагментам SEQ ID N0: 1, 2, 27, 28, 29 или 51.
Последовательность варианта может быть на 60%, 61%, 62%, 63%,
64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,
80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична
последовательности выделенного гена NtMRP, такого как ген
NtMRP3 или ген NtMRP4. Хотя описанные здесь последовательности
полинуклеотида NtMRP показаны как последовательности ДНК, они
включают в себя соответствующие последовательности РНК и
комплементарные (например, полностью комплементарные) им
последовательности ДНК или РНК, в том числе обратно
комплементарные последовательности и антисмысловые
последовательности ДНК или РНК. Примеры фрагментов описаны в SEQ ID N0: 3-23 и 30-50.
Термин "полинуклеотид NtMRP3" относится к воплощению, в
котором полимер из нуклеотидов включает в себя, состоит, или
преимущественно состоит из полинуклеотида, описанного здесь как
SEQ ID N0: 28, или SEQ ID N0: 29, или SEQ ID N0: 51. Данный
термин охватывает варианты полинуклеотида, в значительной
степени гомологичные (т.е. обладающие значительной степенью
подобия последовательностей) или практически идентичные
последовательностям SEQ ID N0: 28, или SEQ ID N0: 29, или SEQ
ID N0: 51; фрагментам SEQ ID N0: 28, или SEQ ID N0: 29, или SEQ
ID N0: 51; и фрагментам, в значительной степени гомологичным
(т.е. обладающим значительной степенью подобия
последовательностей) или практически идентичным фрагментам SEQ ID N0: 28, или SEQ ID N0: 29, или SEQ ID N0: 51. В данном документе последовательность варианта может быть на 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности выделенного гена NtMRP3. Примеры фрагментов описаны в SEQ ID N0: 30-50.
Термин "полинуклеотид NtMRP4" относится к воплощению, в котором полимер из нуклеотидов включает в себя, состоит, или преимущественно состоит из полинуклеотида, описанного здесь как SEQ ID N0: 1, или SEQ ID N0: 2, или SEQ ID N0: 27. Данный термин охватывает варианты полинуклеотида, в значительной степени гомологичные (т.е. обладающие значительной степенью подобия последовательностей) или практически идентичные последовательностям SEQ ID N0: 1, или SEQ ID N0: 2, или SEQ ID N0: 2 7; фрагментам SEQ ID N0: 1, или SEQ ID N0: 2, или SEQ ID N0: 27; и фрагментам, в значительной степени гомологичным (т.е. обладающим значительной степенью подобия последовательностей) или практически идентичным фрагментам SEQ ID N0: 1, или SEQ ID N0: 2, или SEQ ID N0: 27. В данном документе последовательность варианта может быть на 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности выделенного гена NtMRP3. Примеры фрагментов описаны в SEQ ID N0: 3-2 3.
Термин "полипептид NtMRP" относится к полипептиду, который
включает в себя, состоит, или преимущественно состоит из
аминокислотной последовательности, в значительной степени
гомологичной (т.е. обладающей значительной степенью подобия
последовательностей) или практически идентичной
последовательностям SEQ ID N0: 24-2 6 и 52; фрагментам SEQ ID N0: 24-2 6 и 52; и фрагментам, в значительной степени гомологичным (т.е. обладающим значительной степенью подобия последовательностей) или практически идентичным фрагментам SEQ ID N0: 24-26 и 52. Полипептиды NtMRP включают в себя фрагменты и последовательности, характеризующиеся достаточной или
значительной степенью идентичности или подобия SEQ ID N0: 24-2 6 и 52, которые могут функционировать, транспортируя тяжелые металлы (например, кадмий) через клеточные мембраны. Полипептиды NtMRP также включают в себя варианты или мутанты, образовавшиеся в результате введения любых изменений (таких как вставки, делеции или замены аминокислот; изменения в состояниях гликозилирования; изменения, оказывающие влияние на рефолдинг или изомеризацию, трехмерные структуры или самоассоциированные состояния), которые можно получить рекомбинантными методами или выделить из природного источника. Полипептиды NtMRP могут быть линейными, или их можно подвергнуть циклизации с помощью известных методов. Последовательность варианта может быть, по меньшей мере, на 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида NtMRP4.
Термин "полипептид NtMRP3" относится к воплощению, в
котором полипептид включает в себя, состоит, или
преимущественно состоит из последовательности, описанной в SEQ
ID N0: 52, или к полипептиду, который включает в себя, состоит,
или преимущественно состоит из аминокислотной
последовательности, в значительной степени гомологичной (т.е.
обладающей значительной степенью подобия последовательностей)
или практически идентичной последовательности SEQ ID N0: 52;
фрагментам SEQ ID N0: 52; и фрагментам, в значительной степени
гомологичным (т.е. обладающим значительной степенью подобия
последовательностей) или практически идентичным фрагментам SEQ
ID N0: 52. Полипептиды NtMRP3 включают в себя фрагменты и
последовательности, характеризующиеся достаточной или
значительной степенью идентичности или подобия SEQ ID N0: 52,
которые могут функционировать, транспортируя тяжелые металлы
(например, кадмий) через клеточные мембраны. Полипептиды NtMRP3
также включают в себя варианты или мутанты, образованные в
результате введения любых изменений (таких как вставки, делеции
или замены аминокислот; изменения в состояниях
гликозилирования; изменения, оказывающие влияние на рефолдинг
или изомеризацию, трехмерные структуры или самоассоциированные состояния), которые можно получить рекомбинантными методами или выделить из природного источника. Полипептиды NtMRP3 могут быть линейными, или их можно подвергнуть циклизации с помощью известных методов. Как описано в настоящем документе, последовательность варианта может быть, по меньшей мере, на 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида NtMRP3.
Термин "полипептид NtMRP4" относится к воплощению, в
котором полипептид включает в себя, состоит, или
преимущественно состоит из последовательности, описанной в SEQ
ID N0: 24, SEQ ID NO: 2 5 или SEQ ID NO: 2 6, или к полипептиду,
который включает в себя, состоит, или преимущественно состоит
из аминокислотной последовательности, в значительной степени
гомологичной (т.е. обладающей значительной степенью подобия
последовательностей) или практически идентичной
последовательности SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 2 6; фрагментам SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 2 5 или SEQ ID NO: 2 6; и фрагментам, в значительной степени гомологичным (т.е. обладающим значительной степенью подобия последовательностей) или практически идентичным фрагментам SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 2 5 или SEQ ID NO: 26. Полипептиды NtMRP4 включают в себя фрагменты и последовательности, характеризующиеся достаточной или значительной степенью идентичности или подобия SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 2 5 или SEQ ID NO: 2 6, которые могут функционировать, транспортируя тяжелые металлы (например, кадмий) через клеточные мембраны. Полипептиды NtMRP4 также включают в себя варианты или мутанты, образованные в результате введения любых изменений (таких как вставки, делеции или замены аминокислот; изменения в состояниях гликозилирования; изменения, оказывающие влияние на рефолдинг или изомеризацию, трехмерные структуры или самоассоциированные состояния), которые можно получить рекомбинантными методами или выделить из природного источника. Полипептиды NtMRP4 могут быть линейными, или их можно подвергнуть циклизации с помощью известных
методов. Как описано в данном документе, последовательность варианта может быть, по меньшей мере, на 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности полипептида NtMRP4.
Термин "выделенный" относится к объекту, извлеченному из его природной среды, однако данный термин не охватывает понятие степень очистки.
Термин "генная последовательность" относится к нуклеотидной
последовательности полинуклеотидной молекулы или
полинуклеотида, которая кодирует полипептид или биологически активную РНК, и включает в себя нуклеотидную последовательность части кодирующей последовательности, которая кодирует только фрагмент белка.
Термин "вектор" относится к средству доставки
полинуклеотида, которое содержит сочетание полинуклеотидных
компонентов, обеспечивающих транспорт полинуклеотида,
полинуклеотидных конструкций, конъюгатов полинуклеотида и т.п. Подходящие векторы включают в себя эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как циклические двухцепочечные полинуклеотидные плазмиды; линеаризованные двухцепочечные полинуклеотидные плазмиды; а также другие векторы любого происхождения.
Термин "вектор экспрессии" относится к средству доставки полинуклеотида, которое содержит сочетание полинуклеотидных компонентов, обеспечивающих экспрессию полинуклеотида, полинуклеотидных конструкций, конъюгатов полинуклеотида и т.п. Подходящие векторы включают в себя эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как циклические двухцепочечные полинуклеотидные плазмиды; линеаризованные двухцепочечные полинуклеотидные плазмиды; а также другие векторы любого происхождения. Вектор экспрессии содержит, по меньшей мере, промотор, расположенный выше полинуклеотида, полинуклеотидной конструкции или конъюгата полинуклеотида, и находящийся в функциональной связи с полинуклеотидом, полинуклеотидной
конструкцией или конъюгатом полинуклеотида, как описано ниже.
Термин "конструкция" относится к двухцепочечному, рекомбинантному полинуклеотидному фрагменту, содержащему один или несколько полинуклеотидов NtMRP. Конструкция содержит "матричную цепь", основания которой спарены с основаниями комплементарной "смысловой или кодирующей цепи". Используемую конструкцию можно вставить в вектор в двух возможных ориентациях, в такой же (или смысловой) ориентации, как и промотор, входящий в состав вектора, такого как вектор экспрессии, или в противоположной (или антисмысловой) ориентации.
Термин "конъюгат" относится к соединению, образованному в результате ковалентного присоединения ("конъюгирования") полинуклеотида к одному или нескольким фрагментам, которые сами по себе не являются полинуклеотидами или их мономерами ("конъюгированные фрагменты").
Термин "матричная цепь" относится к цепи, последовательность которой комплементарна последовательности "смысловой или кодирующей цепи" полинуклеотидного дуплекса, и включает в себя геномный фрагмент NtMRP, кДНК NtMRP, конструкцию NtMRP, или любой полинуклеотидный фрагмент, содержащий полинуклеотидную последовательность, которая может транскрибироваться под действием РНК-полимеразы. В процессе транскрипции РНК-полимераза перемещается вдоль матричной цепи в 3'-5'-направлении, синтезируя новую РНК.
Термины "смысловая цепь" и "кодирующая цепь" используются в
настоящем документе как взаимозаменяемые и относятся к цепи,
содержащей последовательность, комплементарную
последовательности матирчной цепи в дуплексе ДНК. Например,
последовательность смысловой цепи ("смысловая
последовательность") идентифицированного геномного клона NtMRP обозначают SEQ ID N0: 1 или SEQ ID N0: 2. Например, если смысловая цепь содержит гипотетическую последовательность 5'-T7A7ATCCGGT-3' , то практически идентичная соответствующая последовательность гипотетической мишени мРНК представляет
собой 5'-UAAUCCGGU-3'.
Термин "обратно комплементарная последовательность"
относится к последовательности, комплементарной представляющей
интерес "смысловой последовательности" (например,
последовательности экзона), расположенной в той же цепи и в той же ориентации, что и смысловая последовательность. Например, если цепь содержит гипотетическую последовательность 5'-TAATCCGGT-3' , то обратно комплементарная последовательность представляет собой 5'-ACCGGATTA-3' и может быть функционально связана со смысловой последовательностью, отделенной спейсерной последовательностью.
Термин "РНК-транскрипт NtMRP, NtMRP3 или NtMRP4" включает в себя полирибонуклеотидные молекулы, полученные в представляющей интерес растительной клетке-хозяине в результате транскрипции эндогенного гена или кДНК NtMRP3 или NtMRP4, как описано в данном документе. Таким образом, данный термин включает в себя любые разновидности или варианты РНК, полученные как продукты транскрипции NtMRP3 или NtMRP4, или РНК NtMRP3 или NtMRP4, в том числе разновидности или варианты РНК, которые обладают достаточной степенью подобия на структурном/функциональном уровне. Например, транскрипты NtMRP3 или РНК NtMRP3 включают в себя, без ограничения: (1) пре-мРНК и мРНК, полученные в результате транскрипции выделенных гена или кДНК NtMRP3; (2) пре-мРНК и мРНК, полученные в результате транскрипции любых генов, идентичных, по меньшей мере, на 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности выделенного гена NtMRP3 (то есть, в результате транскрипции других генов, практически идентичных идентифицированному гену NtMRP3 и кодирующих родственные изоформы транспортеров ABC); и (3) пре-мРНК и мРНК, полученные в результате транскрипции аллелей гена NtMRP3. Транскрипты NtMRP3 и РНК NtMRP3 включают в себя варианты РНК, полученные в результате реакций альтернативного сплайсинга гетероядерных РНК ("hnPHK") конкретного гена, варианты мРНК, полученные в результате таких
реакций альтернативного сплайсинга РНК, и любые промежуточные варианты РНК.
В следующем примере транскрипты NtMRP4 или РНК NtMRP4 включают в себя: (1) пре-мРНК и мРНК, полученные в результате транскрипции выделенных гена или кДНК NtMRP4; (2) пре-мРНК и мРНК, полученные в результате транскрипции любых генов, идентичных, по меньшей мере, на 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% последовательности выделенного гена NtMRP4 (то есть, в результате транскрипции других генов, практически идентичных идентифицированному гену NtMRP4 и кодирующих родственные изоформы транспортеров ABC) ; и (3) пре-мРНК и мРНК, полученные в результате транскрипции аллелей гена NtMRP или NtMRP4. РНК-транскрипты NtMRP и NtMRP4 включают в себя варианты РНК, полученные в результате реакций альтернативного сплайсинга гетероядерных РНК ("hnPHK") конкретного гена, варианты мРНК, полученные в результате таких реакций альтернативного сплайсинга РНК, и любые промежуточные варианты РНК.
Термины "гомология", "идентичность" или "подобие" относятся к степени подобия последовательностей двух полипептидных или полинуклеотидных молекул, определяемой путем выравнивания последовательностей. Степень гомологии двух сравниваемых отдельных полинуклеотидных последовательностей является функцией от числа идентичных или совпадающих нуклеотидов в аналогичных положениях. Степень подобия, выраженную в виде процента идентичности, можно определить путем визуального исследования и математического расчета. Альтернативно процент идентичности двух полинуклеотидных последовательностей можно определить путем сравнения информации о последовательностях с помощью компьютерной программы GAP, версия 6.0, описанной Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984), которую можно приобрести в компьютерной группе Genetics университета Висконсина (UWGCG), ClustalW, BLAST, FASTA или Smith-Waterman. Типичные параметры по умолчанию для программы GAP включают в
себя: (1) одинарную матрицу сравнения (присваивающую каждому совпадению значение 1, а несовпадению - 0) нуклеотидов, и взвешенную матрицу сравнения Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, как описано в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) штраф 3,0 за каждый пробел и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом пробеле; и (3) отсутствие штрафа за концевые пробелы. Альтернативно можно использовать разные программы, известные специалистам в области сравнения последовательностей.
Термин "выше по ходу считывания" обозначает направление/положение относительно конкретного элемента вдоль линейной полинуклеотидной последовательности, и указывает на направление/положение в сторону 5'-конца полинуклеотидной последовательности. Термин "выше по ходу считывания" можно использовать как взаимозаменяемый с термином "5'-конец элемнта отнесения".
Термин "функционально связанный" относится к соединению
разных полинуклеотидных элементов, фрагментов или
последовательностей с получением функциональной
транскрипционной конструкции или функционального вектора экспрессии.
Термин "промотор" относится к полинуклеотидному элементу/полинуклеотидной последовательности, как правило, расположенного выше двухцепочечного фрагмента ДНК, такого как конструкция РНКи NtMRP, и функционально связанного с ним. Например, подходящий промотор обеспечивает транскрипционную активацию конструкции РНКи NtMRP путем рекрутинга транскрипционного комплекса, содержащего РНК-полимеразу и разные факторы, с инициацией синтеза РНК. Промоторы можно получить полностью из участков, находящихся по соседству с представляющим интерес нативным геном, или их можно составить из разных элементов, полученных из разных нативных промоторов, или синтетических сегментов ДНК.
Термин "энхансер" относится к полинуклеотидной молекуле,
или к полинуклеотидной последовательности, способной обеспечивать рекрутинг белков, регулирующих транскрипцию, таких как активаторы транскрипции, и увеличивать активацию транскрипции путем повышения активности промотора. Подходящие энхансеры можно получить из участков, находящихся по соседству с представляющим интерес нативным промотором (гомологичные источники), или их можно получить из источников, отличающихся от нативных (гетерологичные источники), и ввести их в состав конструкций NtMRP, таких как векторы экспрессии РНКи, так, чтобы они находились в функциональной связи с представляющим интерес промотором, что позволяет повысить активность или тканеспецифичность промотора. Некоторые энхансеры могут функционировать в любой ориентации относительно ориентации транскрипционного элемента. Например, энхансеры могут располагаться выше или ниже транскрипционного элемента, содержащего промотор и конструкцию NtMRP.
В данном описании термин "растение" относится к любому растению на любой стадии его жизненного цикла или развития, а также к его потомству. В одном воплощении растение представляет собой растение табака, принадлежащее к роду Nicotiana. Предпочтительные виды, сорта, гибриды и разновидности табачного растения описаны в настоящем документе.
Термин "растительная клетка" относится к структурному и физиологическому элементу растения. Растительная клетка может находиться в виде протопласта, не имеющего клеточной стенки, выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки, или в виде части более высокоорганизованного элемента, включающего в себя, без ограничения, ткань растения, орган растения или целое растение.
Термин "растительный материал" относится к любым твердым, жидким или газообразным композициям, или их сочетаниям, получаемым из растения и включающим в себя биомассу, листья, листовые пластинки, жилки, стебли, корни, цветки или части цветков, плоды, пыльцу, яйцеклетки, зиготы, семена, обрезки, секреты, экстракты, культуры клеток или тканей, или любые
другие части или продукты растения. В одном воплощении растительный материал включает в себя или содержит биомассу, семена или листья. В другом воплощении растительный материал включает в себя или содержит листья.
Термин "разновидность" относится к популяции растений, обладающих общими постоянными характеристиками, которые позволяют отличить их от других растений того же вида. Разновидность также характеризуется очень низкой изменчивостью среди отдельных особей, однако может существовать один или несколько признаков, по которым растения одной разновидности могут отличаться друг от друга. Разновидность часто является предметом торговли.
Термин "линия" или "селекционная линия" относится к группе растений, которые используются в процессе селекции растений. Линия отличается от разновидности тем, что она характеризуется низкой изменчивостью среди особей по одному или нескольким представляющим интерес признакам, хотя среди особей может существовать некоторая изменчивость по другим признакам.
Термин "уменьшать" или "уменьшенный" относится к уменьшению примерно на 10%-99%, или к уменьшению, составляющему по меньшей
мере
10%,
меньшей
мере
20%,
меньшей
мере
2 5 ts,
меньшей
мере
30%,
меньшей
мере
40%,
меньшей
мере
50%,
меньшей
мере
60%,
меньшей
мере
70%,
меньшей
мере
75%,
меньшей
мере
80%,
меньшей
мере
90%,
меньшей
мере
95%,
меньшей
мере
98%,
меньшей
мере
99%,
или по меньшей
мере
100%, 200%
или 300% от количества или активности, включающей в себя, без ограничения, полипептидную активность, транскрипционную активность и/или экспрессию белка.
Термин "ингибировать" или "ингибированный" в данном описании относится к уменьшению примерно на 98%-100%, или к уменьшению, составляющему по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, предпочтительно 100%, от количества или активности, включающей в себя, без ограничения, полипептидную активность, транскрипционную активность и/или экспрессию белка.
Термин "увеличивать" или "увеличенный" относится к
увеличению примерно на 10%-99%, или к увеличению, составляющему
по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%,
по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%,
по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%,
по меньшей мере 8 0%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%,
по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, или по меньшей мере
100%, 200% или 3 0 0% от количества или активности, включающей в
себя, без ограничения, полипептидную активность,
транскрипционную активность и/или экспрессию белка.
Термин "контроль" в контексте контрольного растения или контрольных растительных клеток относится к растению или растительным клеткам, в которых экспрессия или активность конкретного гена или белка, такого как NtMRP, не изменяется (например, не повышается или не уменьшается) и, следовательно, такое растение, или такие растительные клетки можно использовать для сравнения с растением, в котором изменена экспрессия или активность конкретного гена или белка, такого как NtMRP. Контрольное растение может содержать пустой вектор. Контрольное растение может представлять собой растение дикого типа.
Подробное описание
В настоящем документе описаны полинуклеотиды и полипептиды NtMRP, в том числе полинуклеотиды и полипептиды NtMRP3 и NtMRP4. Как показано на фигуре б, геномный клон NtMRP3, обозначаемый SEQ ID NO: 2 8 или SEQ ID NO: 2 9, содержит: интрон 1 (SEQ ID N0:30), интрон 2 (SEQ ID N0:31), интрон 3 (SEQ ID N0:32), интрон 4 (SEQ ID N0:33), интрон 5 (SEQ ID N0:34), интрон б (SEQ ID N0:35), интрон 7 (SEQ ID N0:36), интрон 8 (SEQ ID N0:37), интрон 9 (SEQ ID N0:38), интрон 10 (SEQ ID N0:39), экзон 1 (SEQ ID N0:40), экзон 2 (SEQ ID N0:41), экзон 3 (SEQ ID N0:42), экзон 4 (SEQ ID N0:43), экзон 5 (SEQ ID N0:44), экзон 6 (SEQ ID N0:45), экзон 7 (SEQ ID N0:46) экзон 8 (SEQ ID N0:47), экзон 9 (SEQ ID N0:48), экзон 10 (SEQ ID N0:49) и экзон 11 (SEQ ID N0:50).
Разные воплощения направлены на выделенные полинуклеотиды, представляющие собой геномные фрагменты, выделенные из локуса
NtMRP 3, включающие в себя SEQ ID N0:28 или SEQ ID N0:2 9, фрагменты SEQ ID N0:28 или SEQ ID N0:2 9, или их варианты.
Разные воплощения направлены на выделенные полинуклеотиды, представляющие собой последовательности кДНК локуса NtMRP3, которые включают в себя SEQ ID N0:51, фрагменты SEQ ID N0:51, или их варианты. Разные воплощения направлены на варианты выделенного полинуклеотида NtMRP, по меньшей мере, на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичные последовательностям SEQ ID N0:28 или SEQ ID N0:29, или фрагментов SEQ ID N0:28 или SEQ ID N0:29.
Разные воплощения направлены на выделенные полинуклеотиды, комплементарные вариантам полинуклеотида NtMRP, которые, по меньшей мере, на 71%, 72%, 73%, 74% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичны последовательностям SEQ ID N0:28, или SEQ ID N0:29, или SEQ ID N0: 51, или фрагментов SEQ ID N0:28, или SEQ ID N0:29, или SEQ ID N0: 51.
Разные воплощения направлены на выделенные полинуклеотиды, которые могут специфически гибридизоваться в условиях средней или высокой жесткости с полинуклеотидами, содержащими SEQ ID N0:28, или SEQ ID N0:29, или SEQ ID N0: 51, или фрагменты SEQ ID N0:28, или SEQ ID N0:29, или SEQ ID N0: 51.
Как показано на фигуре 1, геномный клон NtMRP4, обозначаемый SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:2, содержит: интрон 1 (SEQ ID N0:3), интрон 2 (SEQ ID N0:4), интрон 3 (SEQ ID N0:5), интрон 4 (SEQ ID N0:6), интрон 5 (SEQ ID N0:7), интрон 6 (SEQ ID N0:8), интрон 7 (SEQ ID N0:9), интрон 8 (SEQ ID N0:10), интрон 9 (SEQ ID N0:11), интрон 10 (SEQ ID N0:12), экзон 1 (SEQ ID N0:13), экзон 2 (SEQ ID N0:14), экзон 3 (SEQ ID N0:15), экзон 4 (SEQ ID N0:16), экзон 5 (SEQ ID N0: 17), экзон 6 (SEQ ID N0: 18), экзон 7 (SEQ ID N0: 19), экзон 8 (SEQ ID N0:20), экзон 9 (SEQ ID N0:21), экзон 10 (SEQ ID N0:21) и экзон 11 (SEQ ID N0:22), или SEQ ID N0: 23.
Разные воплощения направлены на выделенные полинуклеотиды, представляющие собой геномные фрагменты, выделенные из локуса NtMRP4, которые включают в себя SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:2, фрагменты SEQ ID N0:1 или SEQ ID N0:2, или их варианты.
Разные воплощения направлены на выделенную кДНК, содержащую SEQ ID N0:27, фрагменты SEQ ID N0:27, или их варианты.
Разные воплощения направлены на варианты выделенного полинуклеотида NtMRP, по меньшей мере на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичные последовательностям SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0: 27, или фрагментов SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0: 27.
Разные воплощения направлены на выделенные полинуклеотиды, комплементарные вариантам полинуклеотида NtMRP, которые, по меньшей мере, на 71%, 72%, 73%, 74% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичны последовательностям SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:27, или фрагментов SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:27.
Разные воплощения направлены на выделенные полинуклеотиды, которые могут специфически гибридизоваться в условиях средней или высокой жесткости с полинуклеотидами, содержащими SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:27, или фрагменты SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:27.
Описанный здесь полинуклеотид, как правило, содержит фосфодиэфирные связи, хотя в некоторых случаях изобретение охватывает аналоги полинуклеотида, которые могут иметь альтернативные скелеты, содержащие, например, фосфорамидатные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные или 0-метилфосфороамидитные связи; а также пептидполинуклеотидные скелеты и связи. Другие аналоги полинуклеотидов включают в себя полинуклеотиды с положительно заряженными скелетами; неионными скелетами и нерибозными скелетами. Цели модификации рибозофосфатного скелета могут включать в себя, например, повышение стабильности и периода полужизни таких молекул в физиологической среде или получение зондов для биочипа. Можно получить смеси природных полинуклеотидов и их аналогов; альтернативно можно получить смеси разных аналогов полинуклеотидов и смеси природных полинуклеотидов и их аналогов.
Известны разные аналоги полинуклеотидов, например,
содержащие фосфорамидатные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные
или О-метилфосфороамидитные связи; а также
пептидполинуклеотидные скелеты и связи. Другие аналоги полинуклеотидов включают в себя полинуклеотиды с положительно заряженными скелетами; неионными скелетами и нерибозными скелетами. В объем изобретения также входят полинуклеотиды, содержащие один или несколько карбоциклических Сахаров.
Другие аналоги включают в себя пептидполинуклеотидные
(PNA) аналоги. Их скелеты практически являются неионными в нейтральных условиях в отличие от сильно заряженного фосфодиэфирного скелета природных полинуклеотидов. Это может иметь ряд преимуществ. Во-первых, скелет PNA может характеризоваться улучшенной кинетикой гибридизации. PNA характеризуются большими изменениями температуры плавления
(Тпл) при несовпадениях по сравнению с идеально совпадающими парами оснований. Тпл ДНК и РНК обычно уменьшается на 2-4°С при внутреннем несовпадении. Для неионного скелета PNA уменьшение составляет примерно 7-9°С. Подобным образом, вследствие неионной природы указанных скелетов гибридизация присоединенных к ним оснований относительно нечувствительна к концентрации соли. Кроме того, под действием клеточных ферментов PNA не разрушаются или разрушаются в меньшей степени и, следовательно, они могут быть более стабильными.
Способы применения раскрытых полинуклеотидов NtMRP и сочетаний их фрагментов включают в себя применение фрагментов в качестве зондов в анализах полинуклеотидов методом гибридизации, или в качестве праймеров для применения в анализах полинуклеотидов методом амплификации, или применение фрагментов для получения разных полинуклеотидных конструкций, таких как молекулы РНКи. Такие фрагменты обычно содержат, по меньшей мере, примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2 0 или более смежных нуклеотидов последовательности ДНК. В других воплощениях фрагмент ДНК содержит, по меньшей мере, примерно 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 или более смежных нуклеотидов последовательности ДНК. Таким образом, в другом
аспекте изобретение предлагает способ детекции полинуклеотидов NtMRP, включающий в себя применение описанных здесь зондов и/или праймеров.
Основные параметры, влияющие на выбор условий
гибридизации, и руководство по выбору подходящих условий можно
найти в Sambrook, J., Е. F. Fritsch, and Т. Maniatis (1989,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Используя сведения
о генетическом коде в сочетании с описанными выше
аминокислотными последовательностями, можно получить наборы
вырожденных олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды можно
использовать в качестве праймеров, например, в полимеразных
цепных реакциях (ПЦР) , где полинуклеотидные фрагменты выделяют
и амплифицируют. В некоторых воплощениях вырожденные праймеры
можно использовать в качестве зондов для получения
нечеловеческих генетических библиотек. Такие библиотеки
включают в себя, без ограничения, библиотеки кДНК, геномные
библиотеки и даже электронные библиотеки EST (маркеров
экспрессируемых последовательностей) или ДНК.
Идентифицированные с помощью данного способа гомологмчные последовательности можно использовать в качестве зондов для идентификации нечеловеческих последовательностей, гомологичных идентифицированным здесь последовательностям NtMRP.
Также можно использовать полинуклеотиды и олигонуклеотиды (например, праймеры или зонды), которые гибридизуются в условиях пониженной жесткости, в основном в условиях умеренной жесткости, и часто в условиях высокой жесткости, с описанными здесь полинуклеотидами NtMRP. Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации, и руководство по выбору подходящих условий можно найти в Sambrook, J., Е. F. Fritsch, and Т. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), соответственно, рядовые специалисты в данной области могут легко установить условия гибридизации на основе, например, длины или нуклеотидного состава полинуклеотида.
Один из способов достижения условий умеренной жесткости
включает в себя применение раствора для предварительного промывания, содержащего 5х стандартный раствор цитрата натрия, 0,5% додецилсульфата натрия, 1,0 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (рН 8,0), буфера для гибридизации, содержащего примерно 50% формамида, бх стандартный раствор цитрата натрия, температуры гибридизации, составляющей примерно 55°С (или других подобных растворов для гибридизации, таких как раствор, содержащий примерно 50% формамида, и температуры гибридизации, составляющей примерно 42°С) , и условий промывания, включающих в
себя температуру, составляющую примерно 60°С, и раствор для
промывания, содержащий 0,5х стандартный раствор цитрата натрия,
0,1% додецилсульфата натрия. Как правило, условия высокой
жесткости определяют как описанные выше условия гибридизации,
но с промыванием примерно при 68°С раствором, содержащим 0,2х
стандартный раствор цитрата натрия, 0,1% додецилсульфата
натрия. SSPE (lx SSPE содержит 0,15 М хлорид натрия, 10 мМ
фосфат натрия и 1,2 5 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту, рН
7,4) можно заменить стандартным раствором цитрата натрия (1х
стандартный раствор цитрата натрия содержит 0,15 М хлорид
натрия и 15 мМ цитрат натрия) в буферах для гибридизации и
промывания; промывание проводят в течение 15 минут после
завершения гибридизации. Следует понимать, что желательную
степень жесткости можно достичь, варьируя по мере необходимости
температуру промывания и концентрацию солевого раствора для
промывания с учетом основных принципов реакций гибридизации и
стабильности дуплекса, как известно специалистам в данной
области и описано подробно ниже (см., например, Sambrook, J.,
Е. F. Fritsch, and Т. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y.). При гибридизации полинуклеотида с
полинуклеотидом-мишенью с неизвестной последовательностью
предполагают, что длина гибрида равна длине гибридизующегося
полинуклеотида. При гибридизации полинуклеотидов с известными
последовательностями длину гибрида можно определить путем
выравнивания последовательностей полинуклеотидов и
идентификации участка или участков оптимальной
комплементарности последовательностей. Температура гибридизации
в случае образования гибридов с ожидаемой длиной менее 50 пар
оснований должна быть на 5-10°С меньше, чем температура
плавления (Тпл) гибрида, где Тпл определяют по приведенным ниже
уравнениям. Если длина гибридов составляет менее 18 пар
оснований, Тпл (°С)=2(число оснований А+Т)+4(число оснований
G+C) . Если длина гибридов составляет более 18 пар оснований,
Тпл (°С)=81,5+16,6(loglO[Na+])+0,41 (% G+C)-(600/N), где N
обозначает число оснований в гибриде, a [Na+] обозначает
концентрацию ионов натрия в буфере для гибридизации ([Na+] в 1х
стандартном растворе цитрата натрия = 0,165 М) . Как правило,
каждый такой гибридизующийся полинуклеотид имеет длину,
составляющую, по меньшей мере, 2 5% (зачастую по меньшей мере
50%, 60% или 7 0%, и чаще всего по меньшей мере 8 0%) от длины
полинуклеотида, с которым он гибридизуется, и
последовательность, по меньшей мере, на 60% (например, по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, или по меньшей мере на 99%) идентичную последовательности полинуклеотида, с которым он гибридизуется.
Специалистам в данной области известно, что линейная ДНК может иметь две возможные ориентации: в направлении 5'- 3' и в направлении 3'- 5'. Например, если последовательность отнесения расположена в направлении 5'- 3', и вторая последовательность расположена в направлении 5'- 3' в той же полинуклеотидной молекуле/цепи, то последовательность отнесения и вторая последовательность расположены в одном и том же направлении, или имеют одинаковую ориентацию.
Как правило, последовательность промотора и представляющий интерес ген, регулируемый указанным промотором, находятся в одной ориентации. Однако если последовательность отнесения расположена в направлении 5'- 3', а вторая последовательность расположена в направлении 3'- 5' в той же полинуклеотидной молекуле/цепи, то последовательность отнесения и вторая последовательность расположены в антисмысловом направлении, или
имеют антисмысловую ориентацию. Две последовательности, имеющие антисмысловую ориентацию по отношению друг к другу, альтернативно можно описать как имеющие одинаковую ориентацию, если последовательность отнесения (направление 5'- 3') и последовательность, обратно комплементарная последовательности отнесения (последовательность отнесения расположена в направлении 5' - 3') , находятся в одной полинуклеотидной молекуле/цепи. Последовательности, описанные в настоящем документе, приведены в направлении 5'- 3'.
Полипептиды NtMRP включают в себя варианты, образовавшиеся в результате введения любых изменений (таких как вставки, делеции или замены аминокислот; изменения в состояниях гликозилирования; изменения, оказывающие влияние на рефолдинг или изомеризацию, трехмерные структуры или самоассоциированные состояния), которые можно получить рекомбинантными методами или выделить из природного источника. Полипептиды NtMRP3 или NtMRP4 могут быть линейными, или их можно подвергнуть циклизации с помощью известных методов. Полипептиды NtMRP4 содержат по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, или по меньшей мере 4 0 смежных аминокислот.
Разные воплощения направлены на выделенные полипептиды NtMRP3, кодируемые полинуклеотидной последовательностью, включающей в себя, состоящий, или в основном состоящий из SEQ ID N0:28, или SEQ ID N0:29, или SEQ ID N0:51, или фрагменты SEQ ID N0:28, или SEQ ID N0:29, или SEQ ID N0:51, или их варианты.
Разные воплощения направлены на выделенные полипептиды NtMRP4 кодируемые полинуклеотидной последовательностью, включающей в себя, состоящий, или в основном состоящий из SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:27, фрагменты SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:27, или их варианты.
Разные воплощения направлены на варианты выделенного полипептида NtMRP, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичные последовательностям SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:27, или SEQ ID N0:28, или SEQ ID N0:2 9, или SEQ ID N0:51, или фрагментам SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:27, или SEQ ID N0:28, или SEQ ID
N0:29, или SEQ ID N0:51.
Мутантные полипептидные варианты NtMRP, NtMRP3 и NtMRP4 также входят в объем формулы изобретения и раскрываются в данном описании как мутантные полипептидные варианты NtMRP, NtMRP3 и NtMRP4, которые входят в состав мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений (таких как мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения табака).
Термин "не встречающийся в природе" в данном описании относится к объекту (такому как полинуклеотид, генетическая мутация, полипептид, растение, растительная клетка и растительный материал), который не образуется или не существует в природе. Такие не встречающиеся в природе или искусственные объекты, можно получить, синтезировать, инициировать, модифицировать, подвергнуть вмешательству или манипуляциям с помощью способов, описанных в настоящем документе, или известных в данной области. Так, например, не встречающееся в природе растение, не встречающуюся в природе растительную клетку или не встречающийся в природе растительный материал можно получить с помощью традиционных методов селекции, таких как обратное скрещивание, или с помощью методов генетических манипуляций, таких как методы с применением антисмысловых РНК, интерферирующих РНК, мегануклеаз и т.п. В другом примере не встречающееся в природе растение, не встречающуюся в природе растительную клетку или не встречающийся в природе растительный материал можно получить путем интрогрессии или переноса одной или нескольких генетических мутаций (например, одного или нескольких полиморфизмов) из первого растения, или первой растительной клетки, во второе растение, или вторую растительную клетку (которые сами по себе могут встречаться в природе), в результате чего полученные растение, растительная клетка или растительный материал, или их потомство, содержат генетическую структуру (такую как геном, хромосома или ее сегмент), которая не образуется или не встречается в природе. Таким образом, полученные растение, растительная клетка или растительный материал являются искусственными, или не
встречаются в природе. Соответственно, искусственные или не встречающиеся в природе растение или растительную клетку можно получить путем модификации генной последовательности в первом, встречающемся в природе, растении, или в первой, встречающейся в природе, растительной клетке, даже если полученная генная последовательность встречающейся в природе во втором растении, или во второй растительной клетке, генетический фон которых отличается от генетического фона первого растения, или первой растительной клетки. Различия в генетическом фоне можно детектировать по фенотипическим различиям или с помощью известных в данной области методов молекулярной биологии, таких как секвенирование полинуклеотидов, определение присутствия или отсутствия генетических маркеров (таких как микросателлитные РНК-маркеры).
Полипептид можно получить путем культивирования трансформированных или рекомбинантных клеток-хозяев в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида. Затем экспрессированный полипептид можно выделить из такой культуры с помощью известных методов очистки. Очистка полипептида также может включать в себя применение аффинной колонки, содержащей средства, способные связываться с полипептидом; одной или нескольких стадий очистки на колонке, содержащей такие аффинные смолы, как конканавалин А-агароза, гепарин-toyopearl(r) или Cibacrom blue 3GA Sepharose(r); одной или нескольких стадий гидрофобной хроматографии с использованием таких смол, как простой фениловый эфир, простой бутиловый эфир или простой пропиловый эфир; или иммуноаффинной хроматографии. Альтернативно полипептид также можно экспрессировать в виде формы, облегчающей очистку. Например, его можно экспрессировать в виде гибрида с таким полипептидом, как мальтозосвязывающий полипептид (МВР), глутатион-5-трансфераза (GST) или тиоредоксин (TRX) . Наборы для экспрессии и очистки таких гибридных полипептидов можно приобрести в New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, N.J.) и InVitrogen, соответственно. К полипептиду также можно присоединить эпитоп и затем очистить его, используя специфическое антитело против
такого эпитопа. И наконец, для дополнительной очистки полипептида можно использовать одну или несколько стадий высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе (ВЭЖХ на обращенной фазе) с применением гидрофобной среды для ВЭЖХ на обращенной фазе, такой как силикагель, содержащий выступающие метильные или другие алифатические группы. Для получения практически гомогенного рекомбинантного полипептида также можно использовать разные сочетания некоторых или всех вышеописанных стадий очистки. Очищенный таким образом полипептид, который практически не содержит других полипептидов, в настоящем описании определяют как "практически очищенный полипептид"; такие очищенные полипептиды включают в себя полипептид NtMRP, его фрагмент, вариант и т.п. Экспрессию, выделение и очистку полипептидов и их фрагментов можно проводить с помощью любых подходящих способов, включающих в себя, без ограничения, описанные здесь способы.
Для аффинной очистки экспрессируемых полипептидов также можно использовать аффинную колонку, содержащую, например, моноклональное антитело против полипептидов. Указанные полипептиды можно удалить с аффинной колонки традиционными методами, например, путем применения буфера для элюирования с высоким содержанием солей и затем диализа в буфере с низким содержанием солей для последующего применения, или путем изменения рН или других факторов, в зависимости от используемой аффинной основы, или путем конкурентного удаления с использованием природного субстрата аффинного фрагмента, такого как полипептид, полученный по способу настоящего изобретения.
Полипептид также можно получить с помощью известных
традиционных методов химического синтеза. Синтетические методы
конструирования полипептидов или их фрагментов известны
специалистам в данной области. Поскольку полученные
синтетическими методами полипептидные последовательности и
нативные полипептиды обладают подобными характеристиками
первичной, вторичной и третичной структуры, или
конформационными характеристиками, они также могут иметь общие биологические свойства, включающие в себя биологическую
активность.
Воплощения направлены на способы получения мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений, которые были модифицированы с целью уменьшения или блокирования транспорта тяжелых металлов (таких как кадмий) в пластину листа путем понижения уровня экспрессии полинуклеотида NtMRP или путем понижения активности кодируемого им белка. Равновесный уровень транскриптов РНК NtMRP можно понизить по сравнению с контрольным растением. Следовательно, число функционально активных транспортеров NtMRP, способных транспортировать тяжелые металлы (например, кадмий) через клеточные мембраны, можно уменьшить так, чтобы снизить уровень кадмия в растении.
Понижение экспрессии полинуклеотида NtMRP может составлять
примерно
10 0%, или уменьше
ние
может составлять
меньшей
мере
10%
, по
меньшей
мере
20%,
меньшей
мере
2 5 ts,
меньшей
мере
30%
, по
меньшей
мере
40%,
меньшей
мере
50%,
меньшей
мере
60%
, по
меньшей
мере
70%,
меньшей
мере
75%,
меньшей
мере
80%
, по
меньшей
мере
90%,
меньшей
мере
95%,
меньшей
мере
%, или 100%
, где
понижение включает
в себя
снижение транскрипционной активности.
Снижение активности белка NtMRP может составлять примерно от 5% до 100%, или снижение составляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 4 0%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, или до 100%.
Ингибирование относится к снижению, которое составляет примерно от 98% до 100%, или к снижению, которое составляет по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, и предпочтитлеьно 100%.
Описанные здесь полинуклеотиды и рекомбинантные конструкции можно использовать для модулирования (например, уменьшения или ингибирования) экспрессии полипептида NtMRP в представляющих интерес видах растений. Как известно, ряд способов, основанных на применении полинуклеотидов, в том числе применение антисмысловых РНК, расщепление РНК под действием
рибозимов, посттранскрипционное молчание генов (PTGS), например, в результате РНК-интерференции (РНКи), и транскрипционное молчание генов (TGS), включают в себя ингибирование экспрессии генов в растениях.
Подходящие полинуклеотиды включают в себя полноразмерные полинуклеотиды, кодирующие полипептиды NtMRP, или фрагменты таких полноразмерных полинуклеотидов. В некоторых воплощениях можно использовать последовательность, комплементарную полноразмерному полинуклеотиду или его фрагменту. Как правило, фрагмент содержит, по меньшей мере, 10 смежных нуклеотидов, например, по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 2 00, 50 0 или более смежных нуклеотидов. Как правило, использование более коротких последовательностей требует применения более высокой степени гомологии.
Таким образом, композиции, способные модулировать (например, понижать или ингибировать) экспрессию или активность NtMRP, включают в себя, без ограничения, последовательность-специфичные полинуклеотиды, которые могут препятствовать транскрипции одного или нескольких эндогенных генов NtMRP; последовательность-специфичные полинуклеотиды, которые могут препятствовать трансляции транскрииптов РНК NtMRP (например, двухцепочечные РНК, миРНК, рибозимы); последовательность-специфичные полипептиды, способные снижать стабильность белков NtMRP; последовательность-специфичные полинуклеотиды, способные уменьшать ферментативную активность белка NtMRP, или связывающую активность белка NtMRP в отношении субстратов или регуляторных белков; антитела, специфичные по отношению к белку NtMRP; низкомолекулярные соединения, которые могут снижать стабильность белка NtMRP, или ферментативную активность белка NtMRP, или связывающую активность белка NtMRP; белки "цинковые пальцы", способные связывать полинуклеотид NtMRP; и мегануклеазы, обладающие активностью в отношении полинуклеотида NtMRP. Антисмысловая технология является одним из хорошо известных методов модулирования (например, понижения или ингибирования) экспрессии полипептида NtMRP. Полинуклеотидную
последовательность гена, подлежащего экспрессии, клонируют и помещают в функциональной связи с регуляторным участком и последовательностью терминации транскрипции так, чтобы транскрибировать антисмысловую цепь РНК. Затем рекомбинантную конструкцию используют для трансформации растений, как описано в данном документе, и получают антисмысловую цепь РНК. Полинуклеотид не обязательно включает в себя всю последовательность гена, подлежащего подавлению, но, как правило, он является практически комплементарным, по меньшей мере, части смысловой цепи гена, подлежащего подавлению.
Полинуклеотид можно транскрибировать в рибозим или каталитическую РНК, которая влияет на экспрессию мРНК. Рибозимы можно сконструировать так, чтобы они специфически спаривались практически с любой РНК-мишенью и расщепляли фосфодиэфирный скелет по конкретному положению, осуществляя функциональную инактивацию РНК-мишени. Гетерологичные полинуклеотиды могут кодировать рибозимы, способные расщеплять конкретные транскрипты мРНК, предотвращая экспрессию полипептида. Для разрушения конкретных мРНК можно использовать рибозимы в виде головки молотка, а также другие рибозимы, способные расщеплять мРНК по специфичным участкам последовательности. Рибозимы в виде головки молотка расщепляют мРНК в положениях, определяемых фланкирующими участками, которые образуют комплементарные пары оснований с мРНК-мишенью. Единственное требование включает в себя содержание в РНК-мишени нуклеотидной последовательности 5'-UG-3'. Способы конструирования и получения рибозимов в виде головки молотка известны в данной области. Последовательности рибозимов в виде головки молотка можно вставить в стабильную РНК, такую как транспортная РНК (тРНК), чтобы повысить эффективность расщепления in vivo.
Например, можно получить конструкцию, содержащую последовательность, которая транскрибируется в РНК, способную гибридизоваться сама с собой, такую как двухцепочечная РНК, имеющая структуру типа "стебель - петля". В некоторых воплощениях одна цепь фрагмента стеблеобразной структуры двухцепочечной РНК содержит последовательность, подобную или
идентичную смысловой кодирующей последовательности
полинуклеотида NtMRP, или ее фрагменту, и содержащую примерно от 10 нуклеотидов до 2 50 0 смежных нуклеотидов в длину. Длина последовательности, подобной или идентичной смысловой кодирующей последовательности может составлять от 10 смежных нуклеотидов до 50 0 смежных нуклеотидов, от 15 смежных нуклеотидов до 300 смежных нуклеотидов, от 2 0 смежных нуклеотидов до 100 смежных нуклеотидов, или от 2 5 смежных нуклеотидов до 100 смежных нуклеотидов. Другая цепь стеблеобразного фрагмента двухцепочечной РНК содержит последовательность, подобную или идентичную антисмысловой цепи кодирующей последовательности полинуклеотида NtMRP, или ее фрагменту, длина которой может быть меньше, такой же или больше, чем длина соответствующей смысловой последовательности. В некоторых случаях одна цепь стеблеобразного фрагмента двухцепочечной РНК содержит последовательность, подобную или идентичную 3'- или 5'-нетранслируемому участку мРНК, кодирующей полипептид NtMRP, или его фрагменту, а другая цепь стеблеобразного фрагмента двухцепочечной РНК содержит последовательность, подобную или идентичную последовательности, комплементарной 3'- или 5'-нетранслируемому участку мРНК, кодирующей полипептид NtMRP, или его фрагменту. В других воплощениях одна цепь стеблеобразного фрагмента двухцепочечной РНК содержит последовательность, подобную или идентичную последовательности интрона пре-мРНК, кодирующей полипептид NtMRP, или ее фрагменту, а другая цепь стеблеобразного фрагмента содержит последовательность, подобную или идентичную последовательности, комплементарной последовательности интрона пре-мРНК, или ее фрагменту.
Петлеобразный фрагмент двухцепочечной РНК может содержать примерно от 3 нуклеотидов до 50 0 0 нуклеотидов, например, примерно от 15 нуклеотидов до 1000 нуклеотидов, примерно от 2 0 нуклеотидов до 500 нуклеотидов, примерно от 25 нуклеотидов до 250 нуклеотидов. Петлеобразный фрагмент РНК может содержать интрон или его фрагмент. Двухцепочечная РНК может содержать ноль, один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь,
девять, десять или более петлеобразных структур.
Конструкцию, содержащую последовательность, функционально связанную с регуляторным участком, или с последовательностью терминации транскрипции, способную транскрибироваться в РНК, которая может представлять собой двухцепочечную РНК, можно использовать для трансформации описанных здесь растений. Способы применения РНКи для подавления экспрессии гена известны специалистам в данной области.
Для подавления экспрессии гена также можно использовать конструкции, содержащие регуляторные участки, функционально связанные с полинуклеотидными молекулами в смысловой ориентации. Продукт транскрипции может быть подобен или идентичен смысловой последовательности, кодирующей полипептид NtMRP, или ее фрагменту. В продукте транскрипции также может отсутствовать участок полиаденилирования, 5'-кэпирующая структура, или может присутствовать не поддающийся сплайсингу интрон. Способы ингибирования экспрессии гена с применением полноразмерной кДНК, а также фрагмента последовательности кДНК известны в данной области.
В некоторых воплощениях для подавления экспрессии гена используют конструкцию, содержащую полинуклеотид, состоящий, по меньшей мере, из одной цепи, которая является матрицей как для смысловой, так и антисмысловой последовательностей, комплементарных друг другу. Смысловая и антисмысловая последовательности могут составлять часть более крупной полинуклеотидной молекулы, или они могут входить в состав отдельных полинуклеотидных молекул, последовательности которых не являются комплементарными. Смысловая или антисмысловая последовательность может представлять собой последовательность, идентичную или комплементарную последовательности мРНК, 3'- или 5'-нетранслируемому участку мРНК, или интрону, входящему в состав пре-мРНК, кодирующей полипептид NtMRP, или фрагменту одной из указанных последовательностей. В некоторых воплощениях смысловая или антисмысловая последовательность является идентичной или комплементарной последовательности регуляторного участка, который управляет транскрипцией гена, кодирующего
полипептид NtMRP. Во всех случаях смысловая последовательность представляет собой последовательность, комплементарную антисмысловой последовательности.
Смысловая и антисмысловая последовательности могут иметь длину, превышающую примерно 10 нуклеотидов (например, примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более нуклеотидов) . Например, длина антисмысловой последовательности может составлять примерно 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 3 0 нуклеотидов. Как правило, длина смысловой и антисмысловой последовательности варьирует примерно от 15 нуклеотидов до 3 0 нуклеотидов, например, примерно от 18 нуклеотидов до 2 8 нуклеотидов, или примерно от 21 нуклеотидов до 2 5 нуклеотидов, или примерно от 2 3 нуклеотидов до 2 5 нуклеотидов.
В некоторых воплощениях антисмысловая последовательность представляет собой последовательность, комплементарную последовательности мРНК, кодирующей описанный здесь полипептид NtMRP, или ее фрагменту. Смысловая последовательность, комплементарная антисмысловой последовательности, может представлять собой последовательность, присутствующую в мРНК, кодирующей полипептид NtMRP. Чтобы снизить уровень целевой мРНК, как правило, смысловую и антисмысловую последовательности конструируют так, чтобы они соответствовали последовательности целевой мРНК, содержащей 15-30 нуклеотидов.
В некоторых воплощениях для подавления экспрессии гена можно использовать конструкцию, содержащую полинуклеотид, по меньшей мере, одна цепь которого является матрицей для нескольких смысловых последовательностей (например, примерно для 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10 или более смысловых последовательностей). Подобным образом, для подавления экспрессии гена можно использовать конструкцию, содержащую полинуклеотид, по меньшей мере, одна цепь которого является матрицей для нескольких антисмысловых последовательностей (например, примерно для 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10 или более антисмысловых последовательностей). Например, конструкция может содержать полинуклеотид, по меньшей мере, одна цепь которого
является матрицей для двух смысловых последовательностей и двух
антисмысловых последовательностей. Несколько смысловых
последовательностей могут быть одинаковыми или разными.
Несколько антисмысловых последовательностей могут быть
одинаковыми или разными. Например, конструкция может содержать
полинуклеотид, одна цепь которого является матрицей для двух
идентичных смысловых последовательностей и двух идентичных
антисмысловых последовательностей, которые являются
комплементарными двум идентичным смысловым последовательностям.
Альтернативно выделенный полинуклеотид может содержать одну цепь, которая является матрицей для (1) двух идентичных смысловых последовательностей, содержащих примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 2 9, 3 0 или более нуклеотидов в длину, (2) одной антисмысловой последовательности, комплементарной двум идентичным смысловым последовательностям, содержащим примерно 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30
или более нуклеотидов в длину, (3) смысловой
последовательности, содержащей примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или
более нуклеотидов в длину, и (4) трех идентичных антисмысловых
последовательностей, комплементарных смысловой
последовательности, содержащей примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или
более нуклеотидов в длину. Предлагаемые в настоящем описании
конструкции могут содержать смысловые и антисмысловые
последовательности в любом порядке. Например, две идентичные
смысловые последовательности могут располагаться перед двумя
идентичными антисмысловыми последовательностями, или между
двумя идентичными антисмысловыми последовательностями.
Полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну цепь, которая является матрицей для одной или нескольких смысловых или антисмысловых последовательностей, может находиться в функциональной связи с регуляторным участком, управляющим транскрипцией молекулы РНК, содержащей смысловую или антисмысловую последовательность (последовательности). Кроме
того, такой полинуклеотид может находиться в функциональной связи с последовательностью терминации транскрипции, такой как терминатор гена нопалинсинтазы (nos). В некоторых случаях два регуляторных участка могут управлять транскрипцией двух транскриптов: один из верхней цепи, а другой из нижней цепи. Два регуляторных участка могут быть одинаковыми или разными. Два транскрипта могут образовывать двухцепочечные молекулы РНК, которые индуцируют деградацию РНК-мишени. В некоторых случаях полинуклеотид может находиться в Т-ДНК или в перенесенной растительной ДНК (Р-ДНК), где левая и правая бордюрные последовательности Т-ДНК, или левая и правая бордюроподобные последовательности Р-ДНК, фланкируют полинуклеотид, или располагаются с каждой стороны полинуклеотида. Полинуклеотидная последовательность между двумя регуляторными участками может содержать примерно от 15 до 300 нуклеотидов в длину, примерно от 15 до 2 00 нуклеотидов в длину, примерно от 15 до 100 нуклеотидов в длину, примерно от 15 до 50 нуклеотидов в длину, примерно от 18 до 50 нуклеотидов в длину, примерно от 18 до 4 0 нуклеотидов в длину, примерно от 18 до 3 0 нуклеотидов в длину, или примерно от 18 до 2 5 нуклеотидов в длину.
Соответственно, композиции, модулирующие (например,
осуществляющие понижающую регуляцию) экспрессию или активность
белка NtMRP, включают в себя последовательность-специфичные
полинуклеотиды, способные препятствовать транскрипции одного
или нескольких эндогенных генов NtMRP; последовательность-
специфичные полинуклеотиды, способные препятствовать трансляции
транскриптов РНК NtMRP (такие как двухцепочечные РНК, миРНК,
рибозимы); последовательность-специфичные полипептиды,
уменьшающие стабильность белков NtMRP; последовательность-специфичные полинуклеотиды, препятствующие ферментативной активности белка NtMRP, или связывающей активности белка NtMRP в отношении субстратов или регуляторных белков; антитела, специфичные к белкам NtMRP; низкомолекулярные соединения, способные уменьшать стабильность белка NtMRP, или ферментативную активность белка NtMRP, или связывающую активность белка NtMRP; белки цинковые пальцы, способные
связывать полинуклеотид NtMRP; и мегануклеазы, обладающие активностью в отношении полинуклеотида NtMRP.
Эффективный антагонист может уменьшать транспорт тяжелых
металлов (таких как кадмий) в листья (например, в структуры
листовой пластины), по меньшей мере, на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%,
30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,
90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. В одном воплощении
последовательность-специфичный полинуклеотид, способный
препятствовать трансляции транскрипта (транскриптов) РНК NtMRP представляет собой РНКи.
РНК-интерференция ("РНКи") или сайленсинг РНК представляет собой эволюционно консервативный процесс, посредством которого конкретные мРНК могут направляться для ферментативной деградации. Чтобы инициировать путь РНКи, двухцепочечные РНК
(например, двухцепочечный РНК-вирус или РНКи полинуклеотиды NtMRP) нужно ввести в клетку, или обеспечить их продукцию в клетке. Двухцепочечные РНК могут превратиться в несколько дуплексов миРНК длиной 21-23 п. о. ("миРНК") под действием РНКаз III, которые представляют собой эндонуклеазы, специфичные к двухцепочечным РНК ("Dicer"). Затем миРНК могут распознаваться индуцируемыми РНК комплексами сайленсинга
("RISC"), которые инициируют раскручивание миРНК посредством
АТФ-зависимого процесса. Раскрученная антисмысловая цепь миРНК
направляет активированный RISC к целевой мРНК (такой как
варианты РНК NtMRP), содержащей последовательность,
комплементарную антисмысловой цепи миРНК. Целевая мРНК и антисмысловая цепь могут образовать спираль А-формы, а главная бороздка спирали А-формы может распознаваться активированным RISC. Целевая мРНК может расщепляться активированным RISC по одному участку, определенному участком связывания 5'-конца цепи миРНК. Активированный RISC может подвергаться рециклизации и катализировать другое событие расщепления.
Векторы экспрессии РНКи NtMRP, содержащие конструкции РНКи NtMRP, кодирующие полинуклеотиды РНКи NtMRP, осуществляют интерференцию РНК, понижая уровень экспрессии мРНК NtMRP, пре-мРНК NtMRP, или родственные варианты РНК NtMRP. Векторы
экспрессии могут содержать промотор, расположенный выше конструкции РНКи NtMRP и находящийся с ней в функциональной связи, как подробно описано в данном документе. Векторы экспрессии РНКи NtMRP могут содержать подходящий минимальный основной промотор, представляющую интерес конструкцию РНКи NtMRP, расположенный выше (5') регуляторный участок, расположенный ниже (3') регуляторный участок, включающий в себя участок терминации транскрипции и сигналы полиаденилирования, а также другие последовательности, известные специалистам в данной области, такие как разные маркеры селекции.
Полинуклеотиды NtMRP можно получить в виде разных форм, включающих в себя двухцепочечные структуры (такие как двухцепочечная молекула РНК, содержащая антисмысловую цепь и комплементарную смысловую цепь), двухцепочечные шпилечные структуры ("дцРНКи"), одноцепочечные структуры (такие как молекула оцРНК, содержащая только антисмысловую цепь). Полинуклеотиды могут иметь дуплексную, асимметричную дуплексную, шпилечную или асимметричную шпилечную вторичную структуру и содержать самокомплементарные смысловые и антисмысловые цепи. Под действием ферментов дцРНКи NtMRP может превращаться в двухцепочечные миРНК NtMRP. Одна из цепей дуплекса миРНК NtMRP может гибридизоваться с комплементарной последовательностью, входящей в состав целевой мРНК NtMRP и родственных вариантов РНК NtMRP. Дуплексы миРНК/мРНК распознаются RISC, который расщепляет РНК NtMRP по нескольким участкам в последовательность-зависимой манере, приводя к разрушению целевой мРНК NtMRP и родственных вариантов РНК NtMRP.
Двухцепочечные молекулы РНК могут включать в себя молекулы миРНК, собранные из одного олигонуклеотида в структуру типа "стебель-петля", где самокомплементарные смысловые и антисмысловые участки молекулы миРНК соединены через нуклеотидный или ненуклеотидный линкер (линкеры), а также молекулы циклической одноцепочечной РНК, содержащие две или более петлеобразные структуры и стебель, содержащий самокомплементарные смысловые и антисмысловые цепи, где
циклическая РНК может подвергаться процессингу как in vivo, так и in vitro, с образованием активной молекулы миРНК, способной опосредовать РНКи.
В настоящем документе также раскрываются маленькие шпилечные молекулы РНК (shPHK), содержащие специфическую антисмысловую последовательность и обратно комплементарную (смысловую) последовательность, как правило, разделенные спейсерной или петлеобразной последовательностью. В результате расщепления спейсерной или петлеобразной последовательности образуется одноцепочечная молекула РНК и комплементарная ей молекула, которые могут гибридизоваться с образованием двухцепочечной молекулы РНК (необязательно с дополнительными стадиями процессинга, которые могут приводить к добавлению или удалению одного, двух, трех или более нуклеотидов на 3'-конце, или на 5'-конце одной из цепей, или обеих цепей). Спейсер может иметь длину, достаточную для обеспечения гибридизации антисмысловой и смысловой последовательностей с образованием двухцепочечной структуры (или стеблеобразной структуры) до расщепления спейсера (и, необязательно, с последующими стадиями процессинга, которые могут приводить к добавлению или удалению одного, двух, трех, четырех или более нуклеотидов на 3'-конце, или на 5'-конце одной из цепей, или обеих цепей) . Как правило, спейсерная последовательность представляет собой независимую нуклеотидную последовательность, расположенную между двумя комплементарными нуклеотидными последовательностями, способными гибридизоваться с образованием двухцепочечного полинуклеотида, содержащего оцРНК. Спейсерная последовательность обычно содержит примерно от 3 до 100 нуклеотидов.
Любой представляющий интерес полинуклеотид РНК NtMRP можно получить путем выбора состава последовательности, размера петлеобразного участка и длины стеблеобразного участка, подходящих для получения шпилечного дуплекса NtMRP. Подходящий диапазон длин стеблеобразных участков шпилечного дуплекса включает в себя длины, составляющие, по меньшей мере, примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 2 0 нуклеотидов, например, примерно 14-30 нуклеотидов, примерно 30-50
нуклеотидов, примерно 50-100 нуклеотидов, примерно 100-150 нуклеотидов, примерно 150-200 нуклеотидов, примерно 200-300 нуклеотидов, примерно 300-400 нуклеотидов, примерно 400-500 нуклеотидов, примерно 500-600 нуклеотидов и примерно 600-700 нуклеотидов. Подходящий диапазон длин петлеобразных участков шпилечного дуплекса включает в себя длины, составляющие примерно 4-2 5 нуклеотидов, примерно 2 5-50 нуклеотидов или больше, если длина стеблеобразного участка шпилечного дуплекса является большой. В некоторых воплощениях молекула двухцепочечной РНК или ssPHK содержит примерно от 15 до 40 нуклеотидов в длину. В другом воплощении молекула миРНК представляет собой молекулу двухцепочечной РНК или ssPHK, содержащую примерно от 15 до 35 нуклеотидов в длину. В другом воплощении молекула миРНК представляет собой молекулу двухцепочечной РНК или ssPHK, содержащую примерно от 17 до 30 нуклеотидов в длину. В другом воплощении молекула миРНК представляет собой молекулу двухцепочечной РНК или ssPHK, содержащую примерно от 19 до 2 5 нуклеотидов в длину. В другом воплощении молекула миРНК представляет собой молекулу двухцепочечной РНК или ssPHK, содержащую примерно от 21 до 23 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях шпилечные структуры, содержащие дуплексные участки длиной более 21 нуклеотида, могут обеспечивать эффективный сайленсинг, опосредуемый миРНК, независимо от последовательности и длины петлеобразной структуры.
Последовательность целевой мРНК обычно содержит примерно от 14 до 50 нуклеотидов в длину. Следовательно, целевую мРНК можно сканировать на участки, содержащие примерно от 14 до 50 нуклеотидов в длину, которые предпочтительно удовлетворяют одному или нескольким из нижеследующих критериев целевой последовательности: отношение A+T/G+C составляет примерно от 2:1 до 1:2; на 5'-конце целевой последовательности присутствует динуклеотид 7АА или динуклеотид СА; последовательность, содержащая, по меньшей мере, 10 смежных нуклеотидов, является уникальной для целевой мРНК; отсутствие "участков", содержащих более трех последовательных остатков гуанина (G) или более трех
последовательных остатков цитозина (С) . Наличие указанных
критериев можно оценить разными методами, известными в данной
области, например, поиск в широко доступных базах данных с
целью определения, является ли выбранная целевая
последовательность уникальной для целевой мРНК, можно проводить
с помощью компьютерных программ, таких как BLAST. Альтернативно
целевую последовательность можно выбрать (и сконструировать
последовательность миРНК) с помощью коммерчески доступного
компьютерного программного обеспечения (такого как
OligoEngine.ТМ. (Seattle, Wash.); Dharmacon, Inc. (Lafayette, Colo.); Target Finder, from Ambion Inc. (Austin, Tex.) and the siRNA Design Tool, QIAGEN, Inc. (Valencia, Calif.)).
В одном воплощении выбирают целевые последовательности мРНК, которые содержат примерно от 14 до 3 0 нуклеотидов в длину и удовлетворяют одному или нескольким из приведенных выше критериев. В другом воплощении выбирают целевые последовательности мРНК, которые содержат примерно от 16 до 3 0 нуклеотидов в длину и удовлетворяют одному или нескольким из приведенных выше критериев. В следующем воплощении выбирают целевые последовательности мРНК, которые содержат примерно от 19 до 3 0 нуклеотидов в длину и удовлетворяют одному или нескольким из приведенных выше критериев. В другом воплощении выбирают целевые последовательности мРНК, которые содержат примерно от 19 до 2 5 нуклеотидов в длину и удовлетворяют одному или нескольким из приведенных выше критериев.
В иллюстративном воплощении молекулы миРНК содержат специфическую антисмысловую последовательность, комплементарную последовательности, содержащей, по меньшей мере, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30 или более смежных нуклеотидов одной из последовательностей, описанных в SEQ ID N0: 1-23.
Специфическая антисмысловая последовательность, входящая в состав молекулы миРНК, может быть идентичной или практически идентичной последовательности, комплементарной целевой последовательности. В одном воплощении специфическая антисмысловая последовательность, входящая в состав молекулы
миРНК, по меньшей мере, примерно на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, комплементарной целевой мРНК. Способы определения идентичности последовательностей известны в данной области и могут включать в себя, например, применение программы BLASTN, предоставляемой Компьютерной группой Университета Висконсина (GCG) , или находящейся на web-сайте NCBI.
Специфическая антисмысловая последовательность описанной
здесь молекулы миРНК может варьировать, отличаясь (например, в
результате нуклеотидной замены, включающей в себя
преобразование или трансверсию) по одному, двум, трем, четырем
или более нуклеотидам от последовательности целевой мРНК. Если
такие нуклеотидные замены присутствуют в антисмысловой цепи
двухцепочечной молекулы РНК, комплементарный нуклеотид
смысловой цепи, с которым замещенный нуклеотид обычно образует
пару оснований, соединенных водородной связью, тоже может быть
необязательно замещен соответствующим образом, причем в объем
изобретения также входят двухцепочечные молекулы РНК, которые
содержат одну или несколько нуклеотидных замен в смысловой
последовательности, но не в антисмысловой цепи. Если
антисмысловая последовательность молекулы миРНК содержит одно
или несколько несовпадений по сравнению с нуклеотидной
последовательностью миРНК и целевой нуклеотидной
последовательностью, как описано выше, несовпадения могут присутствовать на 3'-конце, 5'-конце или в центральной части антисмысловой последовательности.
В другом воплощении молекулы миРНК содержат специфическую антисмысловую последовательность, способную селективно гибридизоваться в жестких условиях с фрагментом природного целевого гена или целевой мРНК. Подходящие жесткие условия включают в себя, например, традиционные условия гибридизации и условия промывания, включающие в себя 1-3 промывания стандартным раствором цитрата натрия, содержащим 0,1-1% додецилсульфата натрия, при 50-70°С, с заменой раствора для промывания примерно через 5-30 минут. Как известно рядовым
специалистам в данной области, жесткость условий гибридизации можно варьировать путем изменения времени, температуры или концентраций растворов, используемых для гибридизации и стадий промывания. Подходящие условия также могут отчасти зависеть от конкретной используемой нуклеотидной последовательности, например последовательности целевой мРНК или целевого гена.
Молекулы РНКи, имеющие дуплексную или двухцепочечную
структуру, такие как двухцепочечные РНК или shPHK, могут
содержать тупые концы, или 3'- или 5'- липкие концы. В данном
описании термин "липкий конец" относится к неспаренному
нуклеотиду, или неспаренным нуклеотидам, которые выступают из
дуплексной структуры, если 3'-конец одной цепи РНК продолжается
за пределами 5'-конца другой цепи (3'-липкий конец), или
наоборот (5'-липкий конец). Нуклеотиды, составляющие липкий
конец, могут представлять собой рибонуклеотиды,
дезоксирибонуклеотиды или их модифицированные версии. В одном воплощении, по меньшей мере, одна цепь молекулы РНКи содержит 3'-липкий конец, длина которого составляет примерно от 1 до б нуклеотидов. В других воплощениях 3'-липкий конец содержит примерно от 1 до 5 нуклеотидов, примерно от 1 до 3 нуклеотидов и примерно от 2 до 4 нуклеотидов в длину.
Если молекула РНКи содержит 3'-липкий конец на одном конце молекулы, другой конец может быть тупым, или он также может быть липким (5' или 3') • Если молекула РНКи содержит липкие концы на обоих концах молекулы, длина липких концов может быть одинаковой или разной. В одном воплощении описанная здесь молекула РНКи содержит 3'-липкие концы длиной примерно от 1 до 3 нуклеотидов на обоих концах молекулы. В другом воплощении молекула РНКи представляет собой двухцепочечную РНК, содержащую 3'-липкий конец длиной 2 нуклеотида на обоих концах молекулы. В следующем воплощении нуклеотиды, составляющие липкий конец РНКи, представляют собой динуклеотиды ТТ или динуклеотиды UU.
При определении процента идентичности молекулы РНКи, содержащей один или несколько липких концов, последовательности целевой мРНК, липкий конец (липкие концы) могут принимать или не принимать в расчет. Например, нуклеотиды из 3'-липкого конца
и не более 2 нуклеотидов из 5'- или 3'-конца двойной цепи можно модифицировать без существенной утраты активности молекулы миРНК.
Молекулы РНКи могут содержать одну или несколько 5'- или 3'-кэпирующих структур. Молекула РНКи может содержать кэпирующую структуру на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи, или и смысловой, и антисмысловой цепи; или на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи, или и смысловой, и антисмысловой цепи молекулы РНКи. Альтернативно, молекула РНКи может содержать кэпирующую структуру как на 3'-конце, так и на 5'-конце молекулы РНКи. Термин "кэпирующая структура" относится к химической модификации, введенной на любом конце олигонуклеотида (см., например, патент США № 5998203), которая защищает молекулу от деградации под действием экзонуклеазы и, кроме того, может облегчать доставку или локализацию в клетке.
Молекулы РНКи также можно модифицировать путем химического
присоединения к молекуле РНКи одного или нескольких фрагментов
или конъюгатов, которые повышают активность, клеточное
распределение, поглощение клетками, биодоступность или
стабильность молекул РНКи. Полинуклеотиды можно синтезировать
или модифицировать с помощью хорошо известных в данной области
способов. Химические модификации могут включать в себя, без
ограничения, 2'-модификации, введение неприродных оснований,
ковалентное присоединение к лиганду и замену фосфатных связей
тиофосфатными связями. В данном воплощении целостность
дуплексной структуры стабилизируется, по меньшей мере, одной,
чаще двумя химическими связями. Образование химической связи
можно осуществлять с помощью ряда хорошо известных методов,
включающих в себя введение ковалентных, ионных или водородных
связей; гидрофобных взаимодействий, вандерваальсовых
взаимодействий или стэкинг-взаимодействий; координацию ионов металлов или применение аналогов пуринов.
В следующем воплощении нуклеотиды в одной или обоих из двух одиночных цепей можно модифицировать с целью предотвращения или ингибирования активации клеточных ферментов, например, включающих в себя, без ограничения, некоторые
нуклеазы. Методы ингибирования активации клеточных ферментов
известны в данной области и включают в себя, без ограничения,
2'-амино-модификации, 2'-фтор-модификации, 2'-алкил-
модификации, модификации, приводящие к образованию
незаряженного скелета, морфолино-модификации, 2'-О-метил-модификации и получение фосфорамидата. Таким образом, по меньшей мере, одну 2'-гидроксильную группу нуклеотидов, входящих в состав двухцепочечной РНК, заменяют химической группой. Кроме того, по меньшей мере, один нуклеотид можно модифицировать с получением замкнутого нуклеотида. Такой замкнутый нуклеотид содержит метиленовый или этиленовый мостик, который соединяет 2'-кислород рибозы с 4'-углеродом рибозы. Введение замкнутого нуклеотида в состав олигонуклеотида улучшает сродство к комплементарной последовательности и повышает температуру плавления на несколько градусов.
Лиганды можно присоединить к молекуле РНКи, например, с целью повышения клеточной абсорбции. В отдельном воплощении, чтобы облегчить непосредственное проникновение через клеточную мембрану, к молекуле присоединяют гидрофобный лиганд. Указанные подходы используют для облегчения проникновения антисмысловых олигонуклеотидов в клетки. В некоторых случаях присоединение катионного лиганда к олигонуклеотидам часто приводит к повышению устойчивости к нуклеазам. Типичные примеры катионных лигандов включают в себя пропиламмоний и диметилпропиламмоний. Антисмысловые олигонуклеотиды могут сохранять высокое сродство связывания в отношении мРНК, если катионный лиганд рассредоточен по всей длине олигонуклеотида.
Описанные здесь молекулы и нуклеотиды можно получить с помощью хорошо известного метода твердофазного синтеза. Дополнительно или альтернативно для такого синтеза можно использовать любые другие средства.
Разные воплощения направлены на векторы экспрессии NtMRP (такие как векторы экспрессии NtMRP3), содержащие полинуклеотид NtMRP или конструкции РНКи NtMRP, которые содержат один или несколько элементов, выбранных из группы, включающей в себя: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 51, интрон 1 (SEQ ID
N0:30), интрон 2 (SEQ ID N0:31), интрон 3 (SEQ ID N0:32), интрон 4 (SEQ ID N0:33), интрон 5 (SEQ ID N0:34), интрон 6 (SEQ ID N0:35), интрон 7 (SEQ ID N0:36), интрон 8 (SEQ ID N0:37), интрон 9 (SEQ ID N0:38), интрон 10 (SEQ ID N0:39), экзон 1 (SEQ ID N0:40), экзон 2 (SEQ ID N0:41), экзон 3 (SEQ ID N0:42) экзон 4 (SEQ ID N0:43), экзон 5 (SEQ ID N0:44), экзон 6 (SEQ ID 30 N0:45), экзон 7 (SEQ ID N0:46), экзон 8 (SEQ ID N0:47), экзон 9
(SEQ ID N0:48), экзон 10 (SEQ ID N0:49) или экзон 11 (SEQ ID N0:50), а также их фрагменты и варианты. Как указано в данном документе, ссылка на конкретные последовательности также включает в себя комплементарные или обратно комплементарные последовательности.
Разные воплощения направлены на векторы экспрессии NtMRP
(такие как векторы экспрессии NtMRP4), содержащие полинуклеотид NtMRP или конструкции РНКи NtMRP, которые содержат один или несколько элементов, выбранных из группы, включающей в себя: SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:27, интрон 1 (SEQ ID N0:3), интрон 2 (SEQ ID N0:4), интрон 3 (SEQ ID N0:5), интрон 4 (SEQ ID N0:6), интрон 5 (SEQ ID N0:7), интрон 6 (SEQ ID N0:8), интрон 7 (SEQ ID N0:9), интрон 8 (SEQ ID N0:10), интрон 9 (SEQ ID N0:11), интрон 10 (SEQ ID N0:12), экзон 1 (SEQ ID N0:13), экзон 2 (SEQ ID N0:14), экзон 3 (SEQ ID NO: 15) экзон 4 (SEQ ID N0:16), экзон 5 (SEQ ID N0:17), экзон 6 (SEQ ID N0:18) экзон 7
(SEQ ID NO: 19) экзон 8 (SEQ ID N0:20), экзон 9 (SEQ ID N0:21), экзон 10 (SEQ ID N0:21), экзон 11 (SEQ ID N0:22) или SEQ ID N0:23, а также их фрагменты и варианты. Как указано в данном документе, ссылка на конкретные последовательности также включает в себя комплементарные или обратно комплементарные последовательности.
Разные воплощения направлены на векторы экспрессии, содержащие: один или несколько полинуклеотидов NtMRP или конструкций РНКи NtMRP (например, полинуклеотид NtMRP3 или конструкции РНКи NtMRP3), последовательности которых, по меньшей мере, на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичны последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: SEQ ID N0: 28, SEQ ID NO: 2 9, интрон
1 (SEQ ID N0:30), интрон 2 (SEQ ID N0:31), интрон 3 (SEQ ID N0:32), интрон 4 (SEQ ID N0:33), интрон 5 (SEQ ID N0:34), интрон 6 (SEQ ID N0:35), интрон 7 (SEQ ID N0:36), интрон 8 (SEQ ID N0:37), интрон 9 (SEQ ID N0:38), интрон 10 (SEQ ID N0:39), экзон 1 (SEQ ID N0:40), экзон 2 (SEQ ID N0:41), экзон 3 (SEQ ID N0:42) экзон 4 (SEQ ID N0:43), экзон 5 (SEQ ID N0:44), экзон 6 (SEQ ID N0:45) экзон 7 (SEQ ID N0:46), экзон 8 (SEQ ID N0:47), экзон 9 (SEQ ID N0:48), экзон 10 (SEQ ID N0:49), экзон 11 (SEQ ID N0:50) или SEQ ID N0:51, а также их фрагменты и варианты, или сочетание двух или более из вышеперечисленных элементов. Как указано в данном документе, ссылка на конкретные последовательности также включает в себя комплементарные или обратно комплементарные последовательности.
Разные воплощения направлены на векторы экспрессии, содержащие: полинуклеотид NtMRP или конструкции РНКи NtMRP (например, полинуклеотид NtMRP4 или конструкции РНКи NtMRP4), последовательности которых, по меньшей мере, на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичны последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, интрон 1 (SEQ ID N0:3), интрон
2 (SEQ ID N0:4), интрон 3 (SEQ ID N0:5), интрон 4 (SEQ ID N0:6), интрон 5 (SEQ ID N0:7), интрон 6 (SEQ ID N0:8), интрон 7
(SEQ ID N0:9), интрон 8 (SEQ ID NO: 10), интрон 9 (SEQ ID NO: 11), интрон 10 (SEQ ID NO: 12), экзон 1 (SEQ ID N0:13), экзон 2
(SEQ ID N0:14), экзон 3 (SEQ ID N0:15), экзон 4 (SEQ ID N0:16), экзон 5 (SEQ ID NO: 17), экзон 6 (SEQ ID NO: 18), экзон 7 (SEQ ID NO: 19), экзон 8 (SEQ ID N0:20), экзон 9 (SEQ ID N0:21), экзон 10 (SEQ ID N0:21), экзон 11 (SEQ ID N0:22) или SEQ ID NO: 23, а также их фрагменты и варианты, или сочетание двух или более из вышеперечисленных элементов. Как указано в данном документе, ссылка на конкретные последовательности также включает в себя комплементарные или обратно комплементарные последовательности.
Разные воплощения направлены на векторы экспрессии, содержащие: полинуклеотид NtMRP или конструкцию РНКи NtMRP, кодирующие полинуклеотиды РНКи NtMRP (например, полинуклеотид
NtMRP3 или конструкции РНКи NtMRP3, кодирующие полинуклеотиды РНКи NtMRP3), способные к самогибридизации с образованием шпилечной структуры, где конструкция содержит (а) первую последовательность, по меньшей мере, на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичную последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, интрон 1 (SEQ ID N0:30), интрон 2
(SEQ ID N0:31), интрон 3 (SEQ ID N0:32), интрон 4 (SEQ ID N0:33), интрон 5 (SEQ ID N0:34), интрон 6 (SEQ ID N0:35), интрон 7 (SEQ ID N0:36), интрон 8 (SEQ ID N0:37), интрон 9 (SEQ ID N0:38), интрон 10 (SEQ ID N0:39), экзон 1 (SEQ ID N0:40), экзон 2 (SEQ ID N0:41), экзон 3 (SEQ ID N0:42) экзон 4 (SEQ ID N0:43), экзон 5 (SEQ ID N0:44), экзон 6 (SEQ ID N0:45), экзон 7
(SEQ ID N0:46), экзон 8 (SEQ ID N0:47), экзон 9 (SEQ ID N0:48),
экзон 10 (SEQ ID N0:49), экзон 11 (SEQ ID N0:50) или SEQ ID
N0:51, а также их фрагменты и варианты, или сочетание двух или
более из вышеперечисленных элементов; (Ь) вторую
последовательность, кодирующую спейсерный элемент, который образует петлю шпилечной структуры; и (с) третью последовательность, включающую в себя последовательность, обратно комплементарную первой последовательности и расположенную в той же ориентации, что и первая последовательность, где вторая последовательность расположена между первой последовательностью и третьей последовательностью и находится в функциональной связи с первой последовательностью и третьей последовательностью. Как указано в данном документе, ссылка на конкретные последовательности также включает в себя комплементарные или обратно комплементарные последовательности.
Разные воплощения направлены на векторы экспрессии, содержащие: полинуклеотид NtMRP или конструкцию РНКи NtMRP, кодирующие полинуклеотиды РНКи NtMRP (например, полинуклеотид NtMRP4 или конструкции РНКи NtMRP4, кодирующие полинуклеотиды РНКи NtMRP4), способные к самогибридизации с образованием шпилечной структуры, где конструкция содержит (а) первую последовательность, по меньшей мере, на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичную
последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, интрон 1 (SEQ ID N0:3), интрон 2 (SEQ ID N0:4), интрон 3 (SEQ ID N0:5), интрон 4 (SEQ ID N0:6), интрон 5
(SEQ ID N0:7), интрон 6 (SEQ ID N0:8), интрон 7 (SEQ ID N0:9), интрон 8 (SEQ ID NO: 10), интрон 9 (SEQ ID NO: 11), интрон 10
(SEQ ID NO: 12), экзон 1 (SEQ ID NO: 13), экзон 2 (SEQ ID N0:14), экзон 3 (SEQ ID N0:15) экзон 4 (SEQ ID N0:16), экзон 5
(SEQ ID N0:17), экзон 6 (SEQ ID N0:18) экзон 7 (SEQ ID N0:19),
экзон 8 (SEQ ID N0:20), экзон 9 (SEQ ID N0:21), экзон 10 (SEQ
ID N0:21), экзон 11 (SEQ ID N0:22), SEQ ID No: 23 или SEQ ID
N0:51, а также их фрагменты и варианты, или сочетание двух или
более из вышеперечисленных элементов; (Ь) вторую
последовательность, кодирующую спейсерный элемент, который образует петлю шпилечной структуры; и (с) третью последовательность, включающую в себя последовательность, обратно комплементарную первой последовательности и расположенную в той же ориентации, что и первая последовательность, где вторая последовательность расположена между первой последовательностью и третьей последовательностью и находится в функциональной связи с первой последовательностью и третьей последовательностью. Как указано в данном документе, ссылка на конкретные последовательности также включает в себя комплементарные или обратно комплементарные последовательности.
Раскрытые последовательности можно использовать для конструирования разных полинуклеотидов NtMRP, которые не образуют шпилечные структуры. Например, двухцепочечную РНК NtMRP можно получить путем (1) транскрипции первой цепи кДНК NtMRP, где кодирующая последовательность находится в функциональной связи с первым промотором, и (2) транскрипции последовательности, обратно комплементарной первой цепи фрагмента кДНК NtMRP и находящейся в функциональной связи со вторым промотором. Подлежащие транскрипции цепи полинуклеотида NtMRP могут находиться в одном векторе экспрессии, или в разных векторах экспрессии. РНК-дуплекс NtMRP, обладающий активностью РНК-интерференции, под действием ферментов может превращаться в миРНК, уменьшающие уровни РНК NtMRP.
Разные воплощения направлены на векторы экспрессии NtMRP,
содержащие: полинуклеотид NtMRP или конструкцию РНКи NtMRP,
кодирующие полинуклеотиды РНКи NtMRP (например, векторы
экспрессии NtMRP3, содержащие полинуклеотид NtMRP3 или
конструкции РНКи NtMRP3, кодирующие полинуклеотиды РНКи
NtMRP3), способные к самогибридизации с образованием шпилечной
структуры, где конструкция содержит (а) первую
последовательность, по меньшей мере, на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: SEQ ID N0:28, SEQ ID N0:29, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:33, SEQ ID N0:34, SEQ ID N0:35, SEQ ID N0:36, SEQ ID N0:37, SEQ ID N0:38, 20 SEQ ID N0:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:41, SEQ ID N0:42, SEQ ID N0:43, SEQ ID N0:44, SEQ ID N0:45, SEQ ID N0:46, SEQ ID N0:47, SEQ ID N0:48, SEQ ID N0:49, SEQ ID N0:50 и SEQ ID N0:51, а также их фрагменты и варианты, или сочетание двух или более из вышеперечисленных элементов; и (Ь) вторую последовательность, включающую в себя последовательность, комплементарную (например, обратно комплементарную) первой последовательности и расположенную в той же ориентации, что и первая последовательность. Как указано в данном документе, ссылка на конкретные последовательности также включает в себя комплементарные или обратно комплементарные последовательности.
Другие воплощения направлены на векторы экспрессии NtMRP,
содержащие: полинуклеотид NtMRP или конструкцию РНКи NtMRP,
кодирующие полинуклеотиды РНКи NtMRP (например, векторы
экспрессии NtMRP4, содержащие полинуклеотид NtMRP4 или
конструкции РНКи NtMRP4, кодирующие полинуклеотиды РНКи
NtMRP4), способные к самогибридизации с образованием шпилечной
структуры, где конструкция содержит (а) первую
последовательность, по меньшей мере, на 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100% идентичную последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID
N0:10, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0: 12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22, SEQ ID No. 23 и SEQ ID N0:27, а также их фрагменты и варианты, или сочетание двух или более из вышеперечисленных элементов; и (Ь) вторую последовательность, включающую в себя последовательность, комплементарную (например, обратно комплементарную) первой последовательности и расположенную в той же ориентации, что и первая последовательность. Как указано в данном документе, ссылка на конкретные последовательности также включает в себя комплементарные или обратно комплементарные последовательности.
Изобретение предлагает разные композиции и способы, которые позволяют модулировать (например, понижать) уровни эндогенной экспрессии членов семейства генов NtMRP путем стимулирования косупрессии гена NtMRP. Феномен косупрессии возникает в результате введения нескольких копий трансгена в растительную клетку-хозяина. Интеграция нескольких копий трансгена приводит к уменьшению экспрессии трансгена и целевого эндогенного гена. Степень косупрессии зависит от степени идентичности последовательностей трансгена и целевого эндогенного гена. Сайленсинг как эндогенного гена, так и трансгена, может быть обусловлен экстенсивным метилированием отключаемых локусов (содержащих эндогенный промотор и представляющий интерес эндогенный ген), которое может препятствовать транскрипции. 7Альтернативно, в некоторых случаях косупрессия эндогенного гена и трансгена может возникать в результате пост-транскрипционного сайленсинга генов ("PTGS"), при котором происходит образование транскриптов, однако повышенная скорость деградации препятствует их накоплению. Полагают, что механизм косупрессии, опосредуемой PTGS, напоминает механизм РНК-интерференции, в котором РНК является и ключевым инициатором, и мишенью, и может опосредоваться, по меньшей мере отчасти, таким же молекулярным механизмом, возможно, включающим в себя РНК-регулируемую деградацию мРНК.
Косупрессию полинуклеотида NtMRP можно достичь путем
интеграции нескольких копий кДНК NtMRP или ее фрагментов, в качестве трансгенов, в геном представляющего интерес растения. Растение-хозяин можно трансформировать вектором экспрессии, содержащим промотор, находящийся в функциональной связи с кДНК NtMRP, или ее фрагментами. Разные воплощения направлены на векторы экспрессии, стимулирующие косупрессию эндогенных генов NtMRP, которые содержат: промотор, функционально связанный с NtMRP (например, кДНК NtMRP), идентифицированным как SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 51, или его фрагментом, таким как один из SEQ ID N0 3-23 или 30-50, или его вариантом, последовательность которого, по меньшей мере, примерно на 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична его последовательности.
Разные воплощения направлены на способы модулирования
(например, понижения или ингибирования) уровня экспрессии
полинуклеотида NtMRP путем интеграции нескольких копий
полинуклеотида NtMRP (например, кДНК NtMRP),
идентифицированного как SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID No 2 8 или SEQ ID NO 2 9 или SEQ ID NO: 51, или его фрагмента, такого как один из SEQ ID N0 3-23 или 30-50, или его варианта, последовательность которого, по меньшей мере, примерно на 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична его последовательности, в геном растения, где указанные способы включают в себя: трансформацию растительной клетки-хозяина вектором экспрессии, который содержит промотор, находящийся в функциональной связи с SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID No: 2 8 или SEQ ID NO: 2 9 или SEQ ID NO: 51, или его фрагментом, таким как один из SEQ ID N0 3-23 или 30-50, или его вариантом, последовательность которого, по меньшей мере, примерно на 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична его последовательности.
Изобретение предлагает разные композиции и способы, позволяющие понизить уровень экспрессии эндогенного гена NtMRP
путем ингибирования трансляции мРНК NtMRP. Растительную клетку-хозяина можно трансформировать вектором экспрессии, содержащим: промотор, находящийся в функциональной связи с полинуклеотидом NtMRP, или его вариантом или фрагментом, расположенным в антисмысловой ориентации по отношению к промотору, чтобы обеспечить экспрессию полинуклеотидов РНК, содержащих последовательность, комплементарную фрагменту мРНК NtMRP.
Разные векторы экспрессии, используемые для ингибирования трансляции мРНК NtMRP, могут содержать: промотор, находящийся в функциональной связи с NtMRP (например, кДНК NtMRP), идентифицированным как SEQ ID N0:1, или SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:27, или SEQ ID N0: 28, или SEQ ID N0: 29, или SEQ ID N0:51, или его фрагментом, таким как один из SEQ ID N0 3-23 или 30-50, или его вариантом, последовательность которого, по меньшей мере, примерно на 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична его последовательности, которая расположена в антисмысловой ориентации по отношению к промотору. Длина антисмысловых полинуклеотидов РНК NtMRP может варьировать в диапазоне, составляющем примерно 15-20 нуклеотидов, примерно 20-30 нуклеотидов, примерно 30-50 нуклеотидов, примерно 50-75 нуклеотидов, примерно 75-100 нуклеотидов, примерно 100-150 нуклеотидов, примерно 150-200 нуклеотидов и примерно 200-300 нуклеотидов.
Изобретение также предлагает способы получения мутантных полинуклеотидов и полипептидов NtMRP. Любое представляющее интерес растение, включающее в себя растительную клетку или растительный материал, можно генетически модифицировать с помощью разных способов индукции мутагенеза, таких как сайт-направленный мутагенез, олигонуклеотид-направленный мутагенез, мутагенез, индуцированный химическими средствами, мутагенез, индуцированный облучением, мутагенез с применением модифицированных оснований, мутагенез с применением рваной дуплексной ДНК, мутагенез с разрывом двойной цепи, мутагенез с применением штаммов-хозяев с дефицитом репарации, мутагенез путем полного синтеза гена, перестановка в ДНК и другие
эквивалентные способы.
Альтернативно гены NtMRP можно инактивировать путем введения транспозонов (например, элементов IS) в геномы представляющих интерес растений. Указанные мобильные генетические элементы можно ввести путем перекрестного оплодотворения, после чего инсерционные мутанты можно подвергнуть скринингу на уменьшение активности белка NtMRP, такой как транспорт кадмия. Разрушенный ген NtMRP, присутствующий в исходном растении, можно ввести в другие растения путем скрещивания исходного растения с растением, не подвергавшимся транспозон-индуцированному мутагенезу, например, путем перекрестного оплодотворения. Можно использовать любые стандартные методы селекции, известные специалистам в данной области. В одном воплощении один или несколько NtMRP-родственных генов можно инактивировать путем вставки одного или нескольких транспозонов. В результате мутаций может происходить гомозиготное разрушение одного или нескольких генов NtMRP, гетерозиготное разрушение одного или нескольких генов NtMRP, или сочетание гомозиготного и гетерозиготного разрушения, если разрушается несколько генов NtMRP. Подходящие транспонируемые элементы могут быть выбраны из двух больших классов, обозначаемых класс I и класс II. Подходящие транспонируемые элементы класса I включают в себя ретротранспозоны, ретропозоны и SINE-подобные элементы. Такие способы известны специалистам в данной области.
Альтернативно гены NtMRP можно инактивировать путем введения рибозимов, полученных из ряда маленьких циклических РНК, способных к саморасщеплению и репликации в растениях. Указанные РНК могут реплицироваться либо отдельно (вироидные РНК) , либо в присутствии хелперного вируса (сателлитные РНК) . Примеры подходящих РНК включают в себя РНК, полученные из вироида avocado sunblotch, и сателлитные РНК, полученные из вируса табака ringspot, вируса преходящей полосатости люцерны, вируса пятнистости бархатистого табака, вируса пятнистости solanum nodiflorum и вируса пятнистости клевера подземного. Специалистам в данной области известны разные рибозимы,
специфичные к целевым РНК.
В некоторых воплощениях экспрессию полипептида NtMRP
модулируют, уменьшают или ингибируют с помощью нетрансгенных
способов, таких как получение мутации в гене NtMRP, включающем
в себя ген NtMRP3 и/или NtMRP4. Способы произвольного введения
мутации в последовательность гена могут включать в себя
химический мутагенез, мутагенез EMS и лучевой мутагенез.
Способы направленного введения одной или нескольких мутаций в
клетку включают в себя, без ограничения, технологию
корректирования генома, такую как мутагенез, опосредованный
нуклеазой цинковые пальцы, "tilling" (исправленных
индуцированных локальных повреждений в геномах) гомологичная
рекомбинация, олигонуклеотид-направленный мутагенез и
мутагенез, опосредованный мегануклеазой.
Некоторые примеры мутаций включают в себя делеции, инсерции и бессмысленные мутации, по меньшей мере, по одному нуклеотиду, однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), простые повторы последовательности. После введения мутации можно провести скрининг с целью идентификации делеций, приводящих к образованию кодонов преждевременной остановки транскрипции или иных нефункциональных генов NtMRP. Скрининг мутантов можно проводить путем секвенирования, или путем применения одного или нескольких зондов или праймеров, специфичных к гену или белку NtMRP. В полинуклеотиды NtMRP также можно ввести специфические мутации, которые могут приводить к уменьшению экспрессии гена NtMRP, снижению стабильности мРНК NtMRP, или снижению стабильности белка NtMRP. В настоящем описании такие растения называют "не встречающиеся в природе" или мутантные растения.
Не встречающиеся в природе и мутантные растения могут содержать любое сочетание одной или нескольких мутаций, приводящих к уменьшению уровня полипептида NtMRP. Например, растения могут содержать одну мутацию в одном гене NtMRP, или несколько мутаций в одном гене NtMRP. Соответственно, настоящее изобретение раскрывает мутантные или не встречающиеся в природе растения (например, мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения табака и т.п., как описано в данном
документе), которые содержат варианты мутантных полипептидов NtMRP, NtMRP3 и NtMRP4.
В одном воплощении мутагенезу подвергают семена растений, из которых выращивают мутантные растения первого поколения. Затем растения первого поколения подвергают самоопылению и из семян растений первого поколения выращивают растения второго поколения, которые подвергают скринингу на мутации в локусе NtMRP. Хотя мутантный растительный материал можно подвергнуть скринингу на мутации, преимущество скрининга растений второго поколения заключается в том, что все соматические мутации соответствуют зародышевым мутациям. Специалистам в данной области известно, что мутантные по NtMRP растения можно получить путем мутагенеза ряда растительных материалов, включающих в себя, без ограничения, семена, пыльцу, ткань или клетки растения. Однако тип подвергаемого мутагенезу растительного материала может иметь значение при проведении скрининга растительного полинуклеотида на мутации. Например, если пыльцу подвергают мутагенезу перед опылением не мутантного растения, из семян, полученных после такого опыления, выращивают растения первого поколения. Все клетки растений первого поколения содержат мутации, введенные в пыльцу; следовательно, указанные растения первого поколения можно подвергнуть скринингу на мутации NtMRP, не ожидая выращивания второго поколения.
Для введения мутаций можно использовать мутагены, в
основном, вызывающие образование точечных мутаций и коротких
делеций, инсерций, трансверсий и/или транзиций, такие как
химические мутагены или облучение. Мутагены включают в себя,
без ограничения, этилметансульфонат (EMS), метилметансульфонат
(MMS), Ы-этил-Ы-нитрозомочевина (ENU), триэтилмеламин (ТЕМ), N-
метил-Ы-нитрозомочевина (MNU), прокарбазин, хлорамбуцил,
циклофосфамид, диэтилсульфат, акриламидный мономер, мелфалан,
азотистый иприт, винкристин, диметилнитрозамин, Ы-метил-Ы'-
нитро-нитрозогуанидин (MNNG), нитрозогуанидин, 2-аминопурин,
7,12-диметил-бенз(а)антрацен (DMBA), этиленоксид,
гексаметилфосфорамид, бисульфан, диэпоксиалканы (диэпоксиоктан
(DEO), диэпоксибутан (BEB) и т.п.), 2-метокси-б-хлор-9[3-(этил-2-хлор-этил)аминопропиламино]акридина дигидрохлорид (ICR-170) и формальдегид. Спонтанные мутации в локусе NtMRP, не вызываемые непосредственно мутагеном, также входят в объем изобретения, при условии, что они вызывают описанные здесь желательные изменения фенотипа. Подходящие мутагенные средства также включают в себя, например, ионизирующее излучение, такое как рентгеновское излучение, гамма-излучение, облучение быстрыми нейронами и УФ-излучение.
Получение растительного полинуклеотида для скрининга на мутацию NtMRP можно осуществить с помощью любого способа получения растительных полинуклеотидов, известного специалистам в данной области.
Полинуклеотиды, полученные из отдельных растений, необязательно можно объединить, чтобы облегчить скрининг на мутации в гене NtMRP у всей популяции растений, полученных из мутантной растительной ткани. Скринингу можно подвергнуть одно или несколько из последующих поколений растений, растительных клеток или растительного материала. Размер необязательно объединенной группы зависит от чувствительности используемого метода скрининга.
После необязательного объединения образцов полинуклеотидов их можно подвергнуть методам амплификации, специфичным к полинуклеотиду NtMRP, таким как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для амплификации последовательности NtMRP, входящей в состав объединенного образца полинуклеотида, можно использовать один или несколько праймеров или зондов, специфичных к гену NtMRP, или последовательности, непосредственно примыкающей к гену NtMRP. Предпочтительно конструируют один или несколько праймеров или зондов, обеспечивающих амплификацию участков локуса NtMRP, в которых полезные мутации встречаются с наибольшей вероятностью. Наиболее предпочтительно конструируют один или несколько праймеров или зондов, позволяющих детектировать мутации в участках экзонов полинуклеотида NtMRP. Кроме того, для простоты скрининга точечных мутаций, предпочтительно конструируют один или несколько праймеров или
зондов, которые не содержат известные полиморфные участки. Чтобы облегчить детекцию продуктов амплификации, один или несколько праймеров или зондов можно пометить с помощью любого традиционного метода ведения метки. Один или несколько праймеров или зондов можно сконструировать на основе описанной здесь последовательности NtMRP, с помощью способов, хорошо известных в данной области. Полиморфизмы можно идентифицировать с помощью известных в данной области способов.
В другом аспекте изобретение предлагает способ получения мутантного растения. Способ включает в себя получение, по меньшей мере, одной клетки растения, содержащего ген, кодирующий функциональный полипептид NtMRP. Затем, по меньшей мере, одну клетку растения обрабатывают в условиях, эффективных для модулирования активности гена NtMRP. По меньшей мере, одну мутантную растительную клетку размножают с получением мутантного растения, в котором уровень полипептида NtMRP изменен по сравнению с контрольным растением. В одном воплощении способа получения мутантного растения, стадия обработки включает в себя воздействие химического средства, вызывающего мутанез, по меньшей мере, на одну клетку, как описано выше, в условиях, эффективных для получения, по меньшей мере, одной мутантной растительной клетки. В другом воплощении данного способа стадия обработки включает в себя облучение, по меньшей мере, одной клетки в условиях, эффективных для получения, по меньшей мере, одной мутантной растительной клетки. Термин "мутантные растения" включает в себя мутантные растения, генотип которых был изменен по сравнению с контрольным растением, предпочтительно с помощью методов, отличных от методов генной инженерии или генной модификации.
В некоторых воплощениях мутантное растение, мутантная растительная клетка или мутантный растительный материал могут содержать одну или несколько мутаций, которые встречаются в природе в другом растении, растительной клетке или растительном материале и отвечают за желательный признак. Указанную мутацию можно ввести (например, путем интрогрессии) в другое растение, другую растительную клетку или другой растительный материал
(такие как растение, растительная клетка или растительный материал, генетический фон которых отличается от генетического фона растения, в которое была введена мутация), чтобы придать им соответствующий признак. Так, например, мутацию, встречающуюся в природе в первом растении, можно ввести во второе растение, генетический фон которого отличается от генетического фона первого растения. Следовательно, специалист в данной области может выбрать и идентифицировать растение, несущее по природе в своем геноме один или несколько мутантных аллелей гена NtMRP, которые придают растению желательный признак. Мутантный аллель (мутантные аллели), встречающийся в природе, можно перенести во второе растение с помощью разных методов, включающих в себя селекцию, обратное скрещивание и интрогрессию, с получением линий, разновидностей или гибридов, которые содержат одну или несколько мутаций в гене NtMRP. С помощью скрининга из пула мутантных растений можно выбрать растения, имеющие желательный признак. Предпочтительно селекцию проводят, используя сведения об описанной здесь нуклеотидной последовательности NtMRP. Следовательно, можно проводить скрининг по генетическому признаку, свидетельствующему об изменении (например, уменьшении) уровня кадмия по сравнению с контролем. Такой способ скрининга может включать в себя применение традиционных методов амплификации и/или гибридизации полинуклеотидов, описанных в настоящем документе. Так, другой аспект относится к способу идентификации мутантного растения, включающему в себя следующие стадии: (а) получение образца из растения, содержащего полинуклеотид NtMRP; и (Ь) определение полинуклеотидной последовательности полинуклеотида NtMRP, где отличие последовательности полинуклеотида NtMRP от последовательности полинуклеотида NtMRP контрольного растения свидетельствует о том, что указанное растение представляет собой мутантное растение NtMRP. В другом аспекте изобретение предлагает способ идентификации мутантного растения, в котором уровень кадмия изменен (например, снижен) по сравнению с контрольным растением, где способ включает в себя следующие стадии: (а) получение образца из растения, подлежащего
скринингу; (b) определение, содержит ли указанный образец одну или несколько мутаций в полинуклеотиде NtMRP; и (с) определение содержания кадмия, по меньшей мере, в части указанного растения; причем содержание в указанном образце полинуклеотида NtMRP с одной или несколькими мутациями, которые изменяют
(например, понижают) экспрессию или активность кодируемого белка по сравнению с контрольным растением и измененное
(например, уменьшенное) содержание кадмия, по меньшей мере, в части растения по сравнению с контрольным растением, в котором экспрессия или активность NtMRP не модулируется (например, не уменьшается) , указывает на растение с природной мутацией, которое содержит измененный (например, сниженный) уровень кадмия. В другом аспекте изобретение предлагает способ получения мутантного растения, которое содержит измененный
(например, сниженный) уровень кадмия по сравнению с контрольным растением, где способ включает в себя следующие стадии: (а) получение образца из первого растения; (Ь) определение, содержит ли указанный образец одну или несколько мутаций в полинуклеотиде NtMRP, которые приводят к изменению (например, снижению) уровня кадмия в растении; и (с) перенос одной или нескольких мутаций во второе растение. Мутацию (мутации) можно перенести во второе растение с помощью разных методов, известных в данной области, таких как рекомбинантные методы, генетические манипуляции, интрогрессия, селекция растений, обратное скрещивание и т.п. В одном воплощении первое растение представляет собой встречающееся в природе растение. В одном воплощении второе растение имеет генетический фон, отличающийся от генетического фона первого растения. В другом аспекте изобретение предлагает способ получения мутантного растения, которое содержит измененный (например, пониженный) уровень кадмия по сравнению с контрольным растением, где способ включает в себя следующие стадии: (а) получение образца из первого растения; (Ь) определение, содержит ли указанный образец одну или несколько мутаций в полинуклеотиде NtMRP, которые приводят к изменению (например, снижению) уровня кадмия в растении; и (с) интрогрессию одной или нескольких мутаций из
первого во второе растение. В одном воплощении стадия интрогрессии включает в себя селекцию растений, необязательно включающую в себя обратное скрещивание и т.п. В одном воплощении первое растение представляет собой встречающееся в природе растение. В одном воплощении второе растение имеет генетический фон, отличающийся от генетического фона первого растения. В одном воплощении первое растение не относится к культурному сорту (элитному сорту). В одном воплощении второе растение относится к культурному сорту (элитному сорту). Другой аспект относится к мутантному растению (включающему в себя культурный сорт или элитный сорт мутантного растения), полученному, или которое можно получить с помощью описанных здесь способов. В некоторых воплощениях мутантные растения могут содержать одну или несколько мутаций, локализованных только в конкретном участке растения, например, в последовательности полинуклеотида NtMRP. В соответствии с данным воплощением, остальные геномные последовательности мутантного растения остаются такими же, или практически такими же, как последовательности, присутствующие в растении до мутагенеза.
В некоторых воплощениях мутантные растения могут содержать
одну или несколько мутаций, локализованных в нескольких
участках растения, например, в последовательности
полинуклеотида NtMRP и в одном или нескольких других участках генома. В соответствии с данным воплощением, остальные геномные последовательности мутантного растения не являются такими же, или практически такими же, как последовательности растения до мутагенеза. В некоторых воплощениях в мутантных растениях одна или несколько мутаций могут отсутствовать в одном или нескольких, двух или более, трех или более, четырех или более, или пяти или более экзонах полинуклеотида NtMRP; или одна или несколько мутаций могут отсутствовать в одном или нескольких, двух или более, трех или более, четырех или более, или пяти или более интронах полинуклеотида NtMRP; или одна или несколько мутаций могут отсутствовать в промоторе полинуклеотида NtMRP; или одна или несколько мутаций могут отсутствовать в 3'
нетранслируемом участке полинуклеотида NtMRP; или одна или несколько мутаций могут отсутствовать в 5'-нетранслируемом участке полинуклеотида NtMRP; или одна или несколько мутаций могут отсутствовать в кодирующем участке полинуклеотида NtMRP; или одна или несколько мутаций могут отсутствовать в некодирующем участке полинуклеотида NtMRP; или в любом сочетании из двух или более, трех или более, четырех или более, пяти или более; или шести или более частей растения.
В другом аспекте изобретение предлагает способ идентификации растения, растительной клетки или растительного материала, содержащих мутацию в гене, кодирующем NtMRP, где способ включает в себя следующие стадии: (а) мутагенез растения, растительной клетки или растительного материала; (Ь) получение образца полинуклеотида из указанных растения, растительной клетки или растительного материала, или их потомков; и (с) определение полинуклеотидной последовательности гена, кодирующего NtMRP, или его варианта или фрагмента, где изменение указанной последовательности свидетельствует о наличии в ней одной или нескольких мутаций.
Белки цинковые пальцы можно использовать для модулирования
(например, понижения или ингибирования) экспрессии или
активности NtMRP. В разных воплощениях геномную
полинуклеотидную последовательность, содержащую часть
кодирующей последовательности или всю кодирующую
последовательность полинуклеотида NtMRP, подвергают мутагенезу, опосредуемому нуклеазой цинковые пальцы. Геномную полинуклеотидную последовательность проверяют на наличие уникального участка связывания белка цинковые пальцы. 7Альтернативно, геномную полинуклеотидную последовательность проверяют на наличие двух уникальных участков связывания белка цинковые пальцы, где оба участка находятся на противоположных цепях близко друг к другу, например, на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, б или более пар оснований. Соответственно, изобретение предлагает белки цинковые пальцы, которые связываются с полинуклеотидами NtMRP. ДНК-связывающий домен или мотив цинковых пальцев содержит примерно 30 аминокислот,
организованных в бета-бета-альфа структуру, альфа-спираль (а-спираль) которой включается в двойную спираль ДНК. Термин "альфа-спираль" относится к мотиву вторичной структуры белка, образующему правозакрученную или левозакрученную спираль, в которой атом водорода каждой группы N-H аминокислоты связан с группой С=0 аминокислоты в положении -4 относительно первой аминокислоты. Термин "бета-складка" (р-складка) в данном описании относится к мотиву вторичной структуры, содержащему бета-цепи (р-цепи), в котором первая цепь соединена водородными связями со второй цепью с образованием замкнутой структуры. Термин "бета-бета-альфа структура" в данном описании относится к структуре белка, которая содержит р-складку, включающую в себя две антипараллельные р-цепи, и одну а-спираль. Термин "ДНК-связывающий домен цинковых пальцев" относится к белковому домену, содержащему ион цинка и способному связываться со специфической последовательностью ДНК, состоящей из трех пар оснований. Термин "неприродный ДНК-связывающий домен цинковых пальцев" относится к ДНК-связывающему домену цинковых пальцев, который не встречается в клетке или организме, содержащем ДНК, подлежащую модификации.
Ключевыми аминокислотами ДНК-связывающего домена или
мотива цинковых пальцев, которые связываются с
последовательностью целевой ДНК из трех пар оснований, являются аминокислоты -1, +1, +2, +3, +4, +5 и +6 относительно начала альфа-спирали (а-спирали). Аминокислоты в положениях -1, +1, +2, +3, +4, +5 и +6 относительно начала а-спирали ДНК-связывающего домена или мотива цинковые пальцы можно модифицировать с сохранением скелета бета-складки (р-складки) с получение новых ДНК-связывающих доменов или мотивов, которые связывают разные последовательности из трех пар оснований. Таким образом, новый ДНК-связывающий домен может представлять собой неприродный ДНК-связывающий домен цинковых пальцев. Помимо распознавания последовательности из трех пар оснований аминокислотами в положениях -1, +1, +2, +3, +4, +5 и +6 относительно начала а-спирали, некоторые из указанных аминокислот также могут взаимодействовать с парой оснований вне
участка распознавания последовательности из трех пар оснований. Путем объединения двух, трех, четырех, пяти, шести или более ДНК-связывающих доменов или мотивов цинковых пальцев, можно получить белок цинковые пальцы, который специфически связывается с более длинной последовательностью ДНК. Например, белок цинковые пальцы, содержащий два ДНК-связывающих домена или мотива цинковых пальцев может распознавать специфическую последовательность из шести пар оснований, а белок цинковые пальцы, содержащий четыре ДНК-связывающих домена или мотива, может распознавать специфическую последовательность из двенадцати пар оснований. Белок цинковые пальцы может содержать два или более природных ДНК-связывающих доменов или мотивов цинковых пальцев, или два или более неприродных ДНК-связывающих доменов или мотивов цинковых пальцев, полученных из природного белка цинковые пальцы или из белка цинковые пальцы дикого типа путем усечения, или удлинения, или сайт-направленного мутагенеза в сочетании с методом селекции, включающим в себя, без ограничения, селекцию методом фагового дисплея, селекцию с использованием бактериальной двугибридной системы или селекцию с использованием бактериальной одногибридной системы, или любое сочетание природных и неприродных ДНК-связывающих доменов цинковые пальцы. Термин "усечение" в данном контексте относится к белку цинковые пальцы, который содержит не полное число ДНК-связывающих доменов или мотивов цинковых пальцев, обнаруженных в природном белке цинковые пальцы. Термин "удлинение" в данном контексте относится к белку цинковые пальцы, который содержит большее число ДНК-связывающих доменов или мотивов, чем природный белок цинковые пальцы. Методы выбора из геномных последовательностей полинуклеотидных последовательностей, связывающихся с белком цинковые пальцы, известны в данной области.
Способы конструирования доменов белка цинковые пальцы, связывающих специфичные нуклеотидные последовательности, уникальные для целевого гена, известны в данной области. Рассчитано, что последовательность, содержащая 18 нуклеотидов, является достаточной для определения уникального местоположения
в геноме высших организмов. Следовательно, домены белка цинковые пальцы содержат б цинковых пальцев, каждый из которых содержит альфа-спираль, специально сконструированную для взаимодействия с конкретным триплетом. Однако в некоторых случаях может быть желательной более короткая или более длинная целевая нуклеотидная последовательность. Так, домены цинковых пальцев в белках могут содержать от 2 до 12 пальцев, например, от 3 до 8 пальцев, от 5 до 7 пальцев, или б пальцев.
Используемые белки цинковые пальцы могут содержать, по меньшей мере, один полипептид цинкового пальца, соединенный через линкер, предпочтительно, через гибкий линкер, по меньшей мере, со вторым ДНК связывающим доменом, который необязательно представляет собой второй полипептид цинковых пальцев. Белок цинковые пальцы может содержать более двух ДНК-связывающих доменов, а также один или несколько регуляторных доменов. Полипептиды цинковых пальцев можно сконструировать рекомбинантными методами так, чтобы они распознавали определенный участок представляющего интерес гена.
В одном воплощении белок цинковые пальцы содержит каркас (или скелет), полученный из природного белка цинковые пальцы. Можно использовать каркас (или скелет), полученный из любого природного белка цинковые пальцы. Например, можно использовать белок цинковые пальцы, содержащий каркас (или скелет), полученный из белка цинковые пальцы, включающего в себя мотив С2Н2 .
В другом конкретном воплощении белок цинковые пальцы содержит каркас (или скелет), полученный из белка цинковые пальцы, в природе функционирующего в растительных клетках. Например, белок цинковые пальцы может содержать цинковый палец СЗН, мотив QALGGH, мотив цинкового пальца RING-H2, аминокислотный мотив С2Н2, мотив цинкового пальца Arabidopsis LSD1 и мотив цинкового пальца доменных белков BBF/Dof.
Белок цинковые пальцы можно предоставить растительным клеткам с помощью любого подходящего известного в данной области способа. Например, к растительным клеткам можно добавить экзогенный белок цинковые пальцы и затем поддерживать
растительные клетки в условиях, обеспечивающих связывание белка цинковые пальцы с целевой нуклеотидной последовательностью и регуляцию экспрессии целевого гена в растительных клетках.
7Лльтернативно, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок цинковые пальцы, можно экспрессировать в растительных клетках, и затем поддерживать растительные клетки в условиях, обеспечивающих связывание экспрессированного белка цинковые пальцы с целевой нуклеотидной последовательностью и регуляцию экспрессии целевого гена в растительных клетках.
Ген цинковых пальцев можно экспрессировать в растении с
использованием любого подходящего растительного вектора
экспрессии. Типичные векторы, подходящие для экспрессии генов в
высших растениях, хорошо известны в данной области. Помимо
гибрида с регуляторными доменами, белок цинковые пальцы
зачастую можно экспрессировать в виде гибридного белка с
мальтозо-связывающим белком ("МВР"), глутатион-Б-трансферазой
(GST), гексагистидином, с-тус или эпитопом FLAG,
обеспечивающего простоту очистки, мониторинг экспрессии или мониторинг клеточной и субклеточной локализации.
В одном воплощении мутантное или не встречающееся в природе растение или мутантную или не встречающуюся в природе растительную клетку получают путем мутагенеза, опосредованного нуклеазой цинковые пальцы.
В конкретном воплощении геномную последовательность ДНК, содержащую всю последовательность, кодирующую полинуклеотид NtMRP, или ее часть, модифицируют путем мутагенеза, опосредованного нуклеазой цинковые пальцы. Геномную последовательность ДНК проверяют на наличие уникального участка связывания белка цинковые пальцы. Альтернативно геномную последовательность ДНК проверяют на наличие двух уникальных участков связывания белка цинковые пальцы, где оба участка расположены на противоположных цепях близко друг к другу. Два участка-мишени белка цинковые пальцы могут находиться на расстоянии 0, 1, 2, 3, 4, 5, б или более пар оснований друг от друга. Участок связывания белка цинковые пальцы может находиться в кодирующей последовательности гена NtMRP, или в
регуляторном элементе, регулирующем экспрессию гена NtMRP, включающем в себя, без ограничения, промоторный участок гена NtMRP. В частности, один или оба из белков цинковые пальцы представляют собой не природные белки цинковые пальцы.
Соответственно, изобретение предлагает белки цинковые пальцы, способные связываться с полинуклеотидом NtMRP. Предполагается, что способ изменения генной последовательности, такой как геномная последовательность ДНК, кодирующая ген NtMRP, путем мутагенеза, опосредованного нуклеазой цинковые пальцы, необязательно включает в себя одну или несколько из следующих стадий: (i) получение, по меньшей мере, двух белков цинковые пальцы, которые селективно связываются с разными целевыми участками генной последовательности; (ii) конструирование двух конструкций экспрессии, которые кодируют разные нуклеазы цинковые пальцы, включающие в себя один из двух разных неприродных белков цинковые пальцы, полученных на стадии (i), и нуклеазу, функционально связанную с последовательностью, регулирующей экспрессию, способной функционировать в растительной клетке; (iii) введение двух конструкций экспрессии в растительную клетку с получением двух разных нуклеаз цинковые пальцы, которые осуществляют разрыв двойной цепи геномной последовательности ДНК в геноме растительной клетки, по меньшей мере, в одном из целевых участков, или вблизи него. Введение двух конструкций экспрессии в растительную клетку можно проводить одновременно или последовательно, причем данная стадия необязательно включает в себя селекцию клеток, получивших первую конструкцию.
Термин двухцепочечной разрыв (DSB) в настоящем описании относится к разрыву обоих цепей ДНК или РНК. Двухцепочечный разрыв может происходить в участке геномной последовательности ДНК с удалением из одного из целевых участков не более чем 51500 пар оснований, предпочтительно не более чем 5-200 пар оснований, предпочтительно не более чем 5-2 0 пар оснований. Двухцепочечный разрыв может способствовать негомологичному соединению концов, приводящему к мутации в геномной последовательности ДНК в целевом участке или вблизи него.
Термин "негомологичное соединение концов (NHEJ)" в настоящем
описании относится к механизму репарации, который
восстанавливает двухцепочечный разрыв путем непосредственного
лигирования, без применения гомологичной матрицы, и,
следовательно, может приводить к образованию
последовательности, с точки зрения мутагенности родственной последовательности, существующей до двухцепочечного разрыва.
Способ может необязательно дополнительно включать в себя
стадию (iv) введения в растительную клетку полинуклеотида,
содержащего, по меньшей мере, первый участок гомологии по
отношению к нуклеотидной последовательности выше
двухцепочечного разрыва и второй участок гомологии по отношению к нуклеотидной последовательности ниже двухцепочечного разрыва. Полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая соответствует полинуклеотидной последовательности NtMRP, содержащей делецию или вставку гетерологичной нуклеотидной последовательности. Таким образом, полинуклеотид может обеспечивать гомологичную рекомбинацию в целевом участке или вблизи него, приводящую к вставке гетерологичной последовательности в геном, или к делеции геномной последовательности ДНК. Полученная в растительной клетке геномная последовательность ДНК может содержать мутацию, подавляющую ферментативную активность экспрессированного мутантного белка NtMRP, кодон ранней терминации трансляции, или мотив последовательности, препятствующий соответствующему процессингу пре-мРНК с образованием мРНК и приводящий к уменьшению экспрессии или инактивации гена. Способы нарушения синтеза белка путем изменения последовательности гена, кодирующего белок, известны специалистам в данной области.
Нуклеазу цинковые пальцы можно сконструировать путем гибридизации первого полинуклеотида, кодирующего белок цинковые пальцы, который связывается с полинуклеотидом NtMRP, со вторым полинуклеотидом, кодирующим неспецифическую эндонуклеазу, включающую в себя, без ограничения, эндонуклеазы типа IIS. Эндонуклеаза типа IIS представляет собой фермент рестрикции, содержащий отдельный домен распознавания и домен
эндонуклеазного расщепления, причем фермент расщепляет ДНК по участкам, удаленным из участка распознавания. Неограничивающие примеры эндонуклеаз типа IIS включают в себя, без ограничения, Aarl, Bael, Cdil, Drdll, Ecil, Fokl, Faul, Gdill, Hgal, Ksp632I, MboII, Pflll08I, Rlel08I, RleAI, Sapl, TspDTI или UbaPI.
Способы разработки и конструирования гибридных белков,
способы селекции и отделения эндонуклеазного домена
эндонуклеазы типа IIS от домена распознавания
последовательности, способы разработки и конструирования
нуклеазы цинковые пальцы, включающей в себя гибрид белка
цинковые пальцы и эндонуклеазы, известны в данной области. В
конкретном воплощении нуклеазный домен нуклеазы цинковые пальцы
представляет собой Fokl. Гибрид белка цинковые пальцы и
нуклеазы Fokl может содержать спейсер, состоящий из двух пар
оснований, или, альтернативно, спейсер может состоять из трех,
четырех, пяти, шести или более пар оснований. В одном
воплощении описан гибридный белок, содержащий спейсер из семи
пар оснований, так, что эндонуклеаза первой нуклеазы цинковые
пальцы может димеризоваться при контактировании со второй
нуклеазой цинковые пальцы, где два белка цинковые пальцы,
составляющую указанную нуклеазу цинковые пальцы, могут
связываться выше и ниже целевой последовательности ДНК. При
димеризации нуклеаза цинковые пальцы может вводить
двухцепочечный разрыв в целевую нуклеотидную
последовательность, который сопровождается негомологичным соединением концов или гомологичной рекомбинацией с экзогенной нуклеотидной последовательностью, гомологичной участкам, фланкирующим с обеих сторон двухцепочечный разрыв.
В следующем воплощении изобретение предлагает гибридный белок, содержащий белок цинковые пальцы и энхансерный белок, который функционирует как активатор цинковые пальцы. Активатор цинковые пальцы можно использовать в способе повышения регуляции или активации транскрипции гена NtMRP, включающем в себя следующие стадии: (i) получение рекомбинантным методом белка цинковые пальцы, который связывается с участком промотора
или с последовательностью, функционально связанной с кодирующей последовательностью гена NtMRP, (ii) получение гибрида указанного белка цинковые пальцы и активатора транскрипции, (iii) получение экспрессионной конструкции, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный активатор цинковые пальцы, под контролем промотора, способного функционировать в клетке, такой как растительная клетка, (iv) введение указанной генной конструкции в клетку, (v) культивирование клетки и обеспечение экспрессии активатора цинковые пальцы, и (vi) характеристика клетки с повышенной экспрессией белка NtMRP.
В следующем воплощении изобретение предлагает гибридный белок, содержащий белок цинковые пальцы и репрессор гена, который функционирует как репрессор цинковые пальцы. Репрессор цинковые пальцы можно использовать в способе осуществления понижающей регуляции или репрессии транскрипции полинуклеотида NtMRP, включающем в себя следующие стадии: (i) получение рекомбинантным методом белка цинковые пальцы, который связывается с участком промотора или с последовательностью, функционально связанной с полинуклеотидом NtMRP, (ii) получение гибрида указанного белка цинковые пальцы и репрессора транскрипции, (iii) получение генной конструкции, содержащей полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный репрессор цинковые пальцы, под контролем промотора, способного функционировать в клетке, такой как растительная клетка, (iv) введение указанной генной конструкции в клетку, (v) обеспечение экспрессии репрессора цинковые пальцы, и (vi) характеристика клетки с пониженной экспрессией белка NtMRP.
В следующем воплощении изобретение предлагает гибридный белок, содержащий белок цинковые пальцы и метилазу, который функционирует как метилаза цинковые пальцы. Метилазу цинковые пальцы можно использовать в способе осуществления понижающей регуляции или ингибирования экспрессии полинуклеотида NtMRP в клетке, такой как растительная клетка, путем метилирования участка промотора полинуклеотида NtMRP, где способ включает в себя следующие стадии: (i) получение рекомбинантным методом
белка цинковые пальцы, который связывается с участком промотора полинуклеотида NtMRP, и (ii) получение гибрида указанного белка цинковые пальцы и метилазы, и (iii) получение генной конструкции, содержащей полинуклеотид, кодирующий указанную метилазу цинковые пальцы, под контролем промотора, способного функционировать в клетке, и (iv) введение указанной генной конструкции в клетку, и (v) обеспечение экспрессии метилазы цинковые пальцы, и (vi) характеристика клетки, в которой экспрессия белка NtMRP снижена или практически отсутствует. В разных воплощениях с помощью описанных здесь способов можно выбрать белок цинковые пальцы, который связывается с регуляторной последовательностью полинуклеотида NtMRP. Более конкретно, регуляторная последовательность может содержать участок инициации транскрипции, старт-кодон, участок экзона, участок границы экзон-интрон, терминатор или стоп-кодон. Белок цинковые пальцы можно гибридизовать с нуклеазой, активаторным или репрессорным белком.
В разных воплощениях нуклеаза цинковые пальцы вводит двухцепочечный разрыв в регуляторный участок, кодирующий участок или некодирующий участок геномной последовательности ДНК полинуклеотида NtMRP, и приводит к уменьшению, ингибированию или существенному ингибированию уровня экспрессии полинуклеотида NtMRP, или к уменьшению, ингибированию или существенному ингибированию активности кодируемого белка.
Изобретение также предлагает способ модификации клетки,
такой как растительная клетка, где геном растительной клетки
модифицируют путем мутагенеза, опосредованного нуклеазой
цинковые пальцы, где указанный способ включает в себя следующие
стадии: (а) идентификация и получение, по меньшей мере, двух
неприродных белков цинковые пальцы, которые селективно
связываются с разными целевыми участками, с целью модификации
геномной нуклеотидной последовательностью; (Ь) экспрессия, по
меньшей мере, двух гибридных белков, каждый из которых содержит
нуклеазу и один из, по меньшей мере, двух неприродных белков
цинковые пальцы, в растительной клетке, так, чтобы ввести
двухцепочечный разрыв в геномную нуклеотидную
последовательность растительного генома, предпочтительно в
целевом участке геномной нуклеотидной последовательности, или
вблизи него; и, необязательно, (с) введение в клетку
полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность,
которая содержит первый участок, гомологичный
последовательности, расположенной выше двухцепочечного разрыва,
и второй участок, гомологичный последовательности,
расположенной ниже двухцепочечного разрыва, так, чтобы
обеспечить рекомбинацию полинуклеотида с геномной ДНК. Также
описываются клетки, содержащие одну или несколько
экспрессионных конструкций, содержащих нуклеотидную
последовательность, которая кодирует один или несколько гибридных белков.
В другом аспекте описание дополнительно предлагает способы получения мутантных, не встречающихся в природе, трансгенных или иных генетически модифицированных растений с использованием мегануклеаз, таких как I-Crel. Встречающиеся в природе мегануклеазы, а также рекомбинантные мегануклеазы можно использовать для того, чтобы осуществить специфический двухцепочечный разрыв по одному участку или по относительно небольшому числу участков геномной ДНК растения, с целью разрушения гена NtMRP. Мегануклеаза может представлять собой рекомбинантную мегануклеазу с измененными свойствами, касающимися распознавания ДНК. Доставку белков мегануклеазы в растительные клетки можно осуществлять посредством ряда разных механизмов, известных в данной области. Мегануклеаза может представлять собой рекомбинантную мегануклеазу с измененными свойствами, касающимися распознавания ДНК. Данная ссылка описывает способы основанного на структуре рекомбинантного получения мегануклеаз из природной мегануклеазы I-Crel. Такие рекомбинантные мегануклеазы могут распознавать и расщеплять заранее определенные последовательности ДНК размером 22 пары оснований, обнаруженные в геномах растений. Доставку белков мегануклеазы в растительные клетки можно осуществлять посредством ряда разных механизмов, известных в данной области.
Аспекты изобретения позволяют использовать мегануклеазы
для инактивации полинуклеотида NtMRP в растительной клетке или в растении. Аспекты также относятся к способу инактивации полинуклеотида NtMRP в растении с использованием мегануклеазы, который включает в себя следующие стадии: (а) получение растительной клетки, содержащей полинуклеотид NtMRP; (b) введение мегануклеазы или конструкции, кодирующей мегануклеазу, в указанную растительную клетку; и (с) инактивация полинуклеотида NtMRP под действием мегануклеазы.
Мегануклеазы можно использовать для расщепления участков
распознавания мегануклеазы в участках, кодирующих полинуклеотид
NtMRP. Такое расщепление часто приводит к делеции ДНК по
участку распознавания мегануклеазой с последующей мутагенной
репарацией ДНК посредством негомологичного соединения концов.
Такие мутации в кодирующей последовательности гена обычно
являются достаточными для инактивации гена. Данный способ
включает в себя вначале доставку экспрессионной кассеты
мегануклеазы в растительную клетку с помощью подходящего метода
трансформации. Для максимальной эффективности желательно
присоединить к экспрессионной кассете мегануклеазы
селектируемый маркер, позволяющий выбрать успешно
трансформированные клетки в присутствии селекционного средства. Данный способ приводит к интеграции экспрессионной кассеты мегануклеазы в геном, однако он может быть не желательным, если для получения растения требуется разрешение контролирующего органа. В таких случаях экспрессионную кассету мегануклеазы (и связанного с ней селектируемого маркерного гена) можно удалить из растений последующих поколений с помощью традиционных методов селекции. Альтернативно растительные клетки можно вначале трансформировать экспрессионной кассетой мегануклеазы, не содержащей селектируемый маркер, и выращивать их на среде, не содержащей селекционное средство. В таких условиях фракция обработанных клеток приобретает экспрессионную кассету мегануклеазы и экспрессирует рекомбинантную мегануклеазу временно, без интеграции экспрессионной кассеты мегануклеазы в геном. Поскольку это не вносит вклад в эффективность трансформации, последняя процедура трансформации требует
проведения скрининга для большего числа обработанных клеток, чтобы получить желательную модификацию генома.
После доставки экспрессионной кассеты мегануклеазы растительные клетки выращивают вначале в условиях, типичных для конкретной используемой процедуры трансформации. Это может означать выращивание трансформированных клеток на среде при
температуре ниже 2б°С, зачастую в темноте. Такие стандартные
условия можно использовать в течение периода времени,
предпочтительно составляющего от 1 до 4 дней, чтобы позволить
растительной клетке восстановиться после процесса
трансформации. В любой момент после указанного начального периода восстановления температуру выращивания можно повысить, чтобы стимулировать активность рекомбинантной мегануклеазы в отношении расщепления и изменить участок распознавания мегануклеазой.
В некоторых воплощениях может быть желательно удалить весь полинуклеотид NtMRP из генома растения. Такие воплощения можно осуществить с помощью пары рекомбинантных мегануклеаз, каждая из которых расщепляет участок распознавания мегануклеазой с каждой стороны предназначенного для удаления участка. Рекомбинантные конструкции, которые предлагает настоящее изобретение, можно использовать для трансформации растений или растительных клеток с целью модулирования (например, уменьшения или ингибирования) уровня экспрессии белка NtMRP. Рекомбинантная полинуклеотидная конструкция может содержать полинуклеотид, кодирующий описанный здесь полипептид NtMRP, функционально связанный с регуляторным участком, подходящим для экспрессии полипептида NtMRP в растении или клетке. Таким образом, полинуклеотид может содержать последовательность, кодирующую описанный здесь полипептид NtMRP или его вариант.
Полипептид NtMRP, кодируемый рекомбинантным
полинуклеотидом, может представлять собой нативный полипептид NtMRP, или он может быть гетерологичным по отношению к клетке. В некоторых случаях рекомбинантная конструкция содержит полинуклеотид, который уменьшает или ингибирует экспрессию
NtMRP-модулирующего полипептида (полипептидов), функционально связанный с регуляторным участком. Примеры подходящих регуляторных участков описаны в данном документе.
Изобретение также предлагает векторы, содержащие рекомбинантные полинуклеотидные конструкции, такие как описанные здесь конструкции. Подходящие векторные основы включают в себя, например, традиционно используемые в данной области, такие как плазмиды, вирусы, искусственные хромосомы, ВАС, YAC или РАС. Подходящие векторы экспрессии включают в себя, без ограничения, плазмиды и вирусные векторы, полученные, например, из бактериофагов, бакуловирусов и ретровирусов. Многочисленные векторы и системы экспрессии можно приобрести на рынке.
Векторы также могут содержать, например, точки начала репликации, участки присоединения каркаса (SAR) или маркеры. Маркерный ген может придавать растительной клетке селектируемый фенотип. Например, маркер может придавать устойчивость к биоциду, такую как устойчивость к антибиотику (включающему в себя канамицин, G418, блеомицин или гигромицин) или к гербициду
(включающему в себя глифосат, хлорсульфурон или фосфинотрицин). Кроме того, вектор экспрессии может содержать маркерную последовательность, облегчающую обработку или детекцию
(например, очистку или локализацию) экспрессируемого полипептида. Маркерные последовательности, такие как последовательности люциферазы, бета-глюкуронидазы (GUS), зеленого флуоресцентного белка (GFP), глутатион-Б-трансферазы
(GST), полигистидина, с-тус или гемагглютинина, обычно экспрессируют в виде гибрида с кодируемым полипептидом. Такие маркеры можно вставить в любой участок полипептида, в том числе, их можно присоединить к карбоксильному концу или амино-концу.
Разные воплощения направлены на мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения, модифицированные с целью понижения уровня экспрессии гена NtMRP с помощью разных методов, используемых для понижения или сайленсинга экспрессии гена NtMRP, с получением растений,
содержащих пониженный уровень экспрессии транспортеров NtMRP в представляющих интерес тканях растений. Скорость транспорта тяжелых металлов и характер распределения транспорта тяжелых металлов, в частности транспорта кадмия, могут быть изменены в растениях, полученных с использованием раскрытых здесь способов и композиций.
Растения, подходящие для применения в способе генетической
модификации, включают в себя однодольные и двудольные растения
и системы растительных клеток, в том числе, относящиеся к видам
одного из следующих семейств: Acanthaceae, Alliaceae,
Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae,
Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae,
Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae или Vitaceae.
Подходящие виды могут включать в себя члены родов Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola,
Veratrum, Vinca, Vitis и Zea.
Подходящие виды могут включать в себя Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (большой бородач), Pennisetum purpureum (слоновая трава), Phalaris arundinacea (канареечник), Cynodon dactylon (бермудская трава), Festuca arundinacea (овсяница гигантская) , Spartina pectinata (луговая спартина), Medicago sativa (люцерна), Arundo donax (арундо тростниковый), Secale cereale (рожь), Salix spp. (ива), Eucalyptus spp. (эвкалипт), Triticosecale (пшеница triticum рожь times), бамбук, Helianthus annuus (подсолнечник), Carthamus tinctorius (сафлор), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина), Elaeis guineensis (пальма), Linum usitatissimum (лен), Brassica juncea, Beta vulgaris (сахарная свекла), Manihot esculenta (маниок), Lycopersicon esculentum (томат), Lactuca sativa (салат-латук), Musa paradisiaca (банан), Solanum tuberosum (картофель), Brassica oleracea (брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста), Camellia sinensis (чай), Fragaria ananassa (земляника), Theobroma cacao (какао), Coffea arabica (кофе), Vitis vinifera (виноград), Ananas comosus (ананас), Capsicum annum (острый и сладкий перец), Allium сера (лук), Cucumis melo (дыня), Cucumis sativus (огурец), Cucurbita maxima (тыква), Cucurbita moschata (тыква), Spinacea oleracea (шпинат), Citrullus lanatus (арбуз), Abelmoschus esculentus (окра), Solanum melongena (баклажан), Rosa spp. (роза), Dianthus caryophyllus (гвоздика), Petunia spp. (петуния), Poinsettia pulcherrima (пуансеттия), Lupinus albus (люпин), Uniola paniculata (овес), полевичник (Agrostis spp.), Populus tremuloides (осина), Pinus spp. (сосна), Abies spp. (ель), Acer spp. (клен), Hordeum vulgare (ячмень), Poa pratensis (мятлик), Lolium spp. (плевел) и Phleum pratense (тимофеевка), Panicum virgatum (просо), Sorghum bicolor (сорго, суданская трава), Miscanthus giganteus (мискантус), Saccharum sp. (energycane), Populus balsamifera (тополь), Zea mays (кукуруза), Glycine max (соевые бобы), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Gossypium hirsutum (хлопок), Oryza sativa (рис),
Helianthus annuus (подсолнечник), Medicago sativa (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла) или Pennisetum glaucum (просо американское).
Разные воплощения направлены на мутантные растения, не встречающиеся в природе растения или трансгенные растения, модифицированные с целью модулирования (например, понижения или ингибирования) уровня экспрессии гена NtMRP, с получением растений, таких как растения табака с пониженным уровнем экспрессии NtMRP в представляющих интерес тканях по сравнению с контрольным растением. Раскрытые композиции и способы можно применять к любым видам рода Nicotiana, включающим в себя N. rustica и N. tabacum (например, LA В21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 и Petico). Другие виды включают в себя N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. гибрид, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides и N. x sanderae.
Изобретение также охватывает применение сортов табака и элитных сортов табака. Следовательно, трансгенное, не встречающееся в природе или мутантное растение может представлять собой разновидность табака или элитный сорт табака, который содержит один или несколько трансгенов, одну
или несколько генетических мутаций, или их сочетание. Генетическая мутация (мутации) (например, один или несколько полиморфизмов) может представлять собой мутации, которые не существуют в природе в отдельной разновидности табака или в отдельном сорте табака (таком как элитный сорт табака), или она может представлять собой генетическую мутацию (мутации), которая встречается в природе, при условии, что мутация не встречается в природе в отдельной разновидности табака или в отдельном сорте табака (таком как элитный сорт табака).
Особенно полезные разновидности Nicotiana tabacum включают в себя табак Берлей, темный табак, табак трубоогневой сушки и табак восточного типа. Неограничивающие примеры разновидностей или сортов включают в себя: BD 64, СС 101, СС 2 00, СС 27, СС 301, СС 400, СС 500, СС 600, СС 700, СС 800, СС 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, DT 538 LC Galpao табак, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, гибрид 403LC, гибрид 404LC, гибрид 501 LC, К 149, К 326, К 346, К 358, К394, К 399, К 730, KDH 959, КТ 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, табак 'Perique', PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RGH 51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, Tl 1406, Tl 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, В 13P, Xanthi (Mitchell-Мог), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC номер 2 Гибрид 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, P01, P02, РОЗ, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, Banket Al, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki
Jember, C104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage El, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Изобретение также охватывает подразновидности перечисленных выше сортов с низкой степенью преобразования, даже если они специально не указаны в данном описании.
В другом аспекте изобретение предлагает мутантное, не встречающееся в природе или трансгенное растение, описанное в данном документе, которое было дополнительно модифицировано с целью понижения экспрессии транспортеров NtHMA, что может дополнительно снизить содержание кадмия в растении. Применение транспортеров NtHMA для снижения содержания кадмия в растении описано в W02009074325. Таким образом, в соответствии с одним воплощением получают мутантную, не встречающуюся в природе или трансгенную растительную клетку, содержащую выделенный полинуклеотид NtMRP, химерный ген NtMRP, полинуклеотидную конструкцию NtMRP, двухцепочечную РНК NtMRP, конъюгат NtMRP и/или вектор экспрессии NtMRP наряду с выделенным полинуклеотидом NtHMA, химерным геном NtHMA, полинуклеотидной конструкцией NtHMA, двухцепочечной РНК NtHMA, конъюгатом NtHMA и/или вектором экспрессии NtHMA.
Воплощения также направлены на композиции и способы,
которые можно использовать для получения мутантных растений, не
встречающихся в природе растений, гибридных растений или
трансгенных растений, модифицированных с целью модулирования
(например, понижения или ингибирования) экспрессии или
активности NtMRP, приводящего к снижению количества кадмия,
накапливаемого в растениях, по сравнению с контролем. В
некоторых воплощениях внешний вид (например, фенотип)
полученных растений подобен или практически идентичен внешнему
виду контрольных растений. Разные фенотипические
характеристики, такие как степень зрелости, число листьев на
растение, высота стебля, угол вставки листа, размер листа (ширина и длина), длина междоузлия и отношение пластина листа-жилки, можно оценить путем полевых наблюдений. В предпочтительном воплощении высота и масса полученных растений практически идентичны высоте и массе контрольных растений. В другом предпочтительном воплощении значительные различия в сухих собранных листьях полученных и контрольных растений отсутствуют, свидетельствуя о том, что модулирование транскриптов NtMRP не оказывает статистически значимого влияния на сухую биомассу.
Один аспект относится к семенам мутантного растения, не встречающегося в природе растения, гибридного растения или трансгенного растения. Предпочтительно семя представляет собой семя табака. Другой аспект относится к пыльце или семяпочке мутантного растения, не встречающегося в природе растения, гибридного растения или трансгенного растения. Кроме того, изобретение описывает мутантное растение, не встречающееся в природе растение, гибридное растение, трансгенное растение, которое дополнительно содержит полинуклеотид, отвечающий за мужскую стерильность.
Изобретение также предлагает тканевую культуру
регенерируемых клеток мутантного растения, не встречающегося в
природе растения, гибридного растения, трансгенного растения,
или его части, причем указанную культуру можно регенерировать с
получением растений, способных экспрессировать все
морфологические и физиологические характеристики исходного растения. Способные к регенерации клетки включают в себя, без ограничения, клетки листьев, пыльцы, зародышей, семядолей, гипокотилей, корней, кончиков корней, пыльников, цветков и их частей, семяпочек, побегов, стеблей, черенков, сердцевины и семенных коробочек, или полученных из них каллюса или протопластов.
В некоторых воплощениях растение с изменением (например, понижением или ингибированием) экспрессии полинуклеотида NtMRP может содержать пониженные уровни тяжелого металла, такого как кадмий, особенно в листьях. Уровень кадмия можно снизить, по
меньшей мере, примерно на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более, например, на 100%, 125%, 150%, 200% или более, по сравнению с уровнем кадмия в соответствующем контрольном растении, в котором экспрессию полинуклеотида NtMRP не модулируют (например, не понижают или не ингибируют). В некоторых воплощениях растение, в котором модулируют (например, понижают или ингибируют) экспрессию полинуклеотида NtMRP, может содержать повышенный или пониженный уровень кадмия в корнях. В некоторых воплощениях растение, в котором модулируют (например, понижают или ингибируют) экспрессию полинуклеотида NtMRP, может содержать пониженный или повышенный уровень кадмия в корнях и пониженный уровень кадмия в листьях. В некоторых воплощениях растение, в котором модулируют (например, понижают или ингибируют) экспрессию полинуклеотида NtMRP, может содержать пониженный уровень кадмия в заготавливаемой биомассе.
Экспрессию можно оценить с помощью методов, включающих в
себя, например, ПЦР с обратной транскриптазой, нозерн-блоттинг,
РНКазную защиту, удлинение праймеров, вестерн-блоттинг, гель-
электрофорез белков, иммунопреципитацию, ферментные
иммуноанализы, анализы с использованием чипов и масс-
спектрометрию. Следует отметить, что в случае экспрессии
полипептида под контролем тканеспецифичного промотора или
промотора, обеспечивающего экспрессию во всех тканях,
экспрессию можно анализировать в целом растении, или в
выбранной ткани. Подобным образом, если полипептид
экспрессируется в определенном промежутке времени, таком как
период развития или индукции, экспрессию можно избирательно
анализировать в желательном промежутке времени.
Популяцию мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений можно подвергнуть скринингу или селекции с выявлением членов популяции, имеющих желательный признак или фенотип. Например, популяцию потомства одиночного события трансформации можно подвергнуть скринингу с выявлением растений, имеющих желательный уровень экспрессии полипептида
или полинуклеотида NtMRP. Для определения уровня экспрессии можно использовать физические и биохимические методы. Такие методы включают в себя саузерн-анализ или ПЦР-амплификацию, используемые для детекции полинуклеотида; нозерн-блоттинг, S1 РНКазную защиту, удлинение праймеров или амплификацию методом ПЦР с обратной транскриптазой, используемые для детекции транскриптов РНК; ферментативные анализы, используемые для детекции ферментативной или рибозимной активности полипептидов и полинуклеотидов; а также гель-электрофорез белков, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, ферментные иммуноанализы, используемые для детекции полипептидов. Для детекции присутствия или экспрессии полипептидов или полинуклеотидов также можно использовать другие методы, такие как гибридизация in situ, ферментативное окрашивание и иммуноокрашивание.
Популяцию растений можно подвергнуть скринингу с выявлением растений, имеющих желательный признак, такой как модулированный (например, пониженный или ингибированный) уровень кадмия. Селекцию или скрининг можно проводить на одном или нескольких поколениях, или в нескольких географических регионах. В некоторых случаях мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения можно выращивать и подвергать селекции в условиях, которые индуцируют желательный фенотип, или иным образом являются необходимыми для получения желательного фенотипа у мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения. Кроме того, селекцию или скрининг можно проводить на определенной стадии развития, на которой может проявляться фенотип растения. Селекцию или скрининг можно проводить с целью выбора мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений, характеризующихся статистически значимым отличием по содержанию кадмия от контрольного растения, в котором экспрессию или активность полинуклеотида или белка NtMRP не модулируют (например, не уменьшают или не ингибируют). Описанные здесь мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растительные клетки и растения содержат один или несколько рекомбинантных полинуклеотидов, таких как выделенный полинуклеотид, химерный ген, полинуклеотидная
конструкция, двухцепочечная РНК, конъюгат или вектор
экспрессии. Растение или растительную клетку можно
трансформировать рекомбинантным полинуклеотидом с интеграцией
его в геном и достижением стабильной трансформации. Стабильно
трансформированные клетки обычно сохраняют введенный
полинуклеотид после каждого клеточного деления. Растение или
растительную клетку также можно временно трансформировать, без
интеграции рекомбинантного полинуклеотида в геном. Временно
трансформированные клетки после каждого деления обычно
полностью или частично утрачивают введенный рекомбинантный
полинуклеотид, который не детектируется в дочерних клетках
после достаточного числа клеточных делений. Способы введения
полинуклеотидов в однодольные и двудольные растения известны в
данной области и включают в себя, например, трансформацию,
опосредованную Agrobacterium, трансформацию, опосредованную
вирусным вектором, электропорацию и трансформацию с
использованием генной пушки. Систему Agrobacterium, позволяющую
осуществлять интеграцию чужеродного полинуклеотида в
растительные хромосомы, тщательно исследуют, модифицируют и
применяют для получения рекомбинантных растений. Оголенные
молекулы рекомбинантного полинуклеотида, которые содержат
полинуклеотидные последовательности, соответствующие
исследуемому очищенному белку и функционально связанные, в
смысловой или антисмысловой ориентации, с регуляторными
последовательностями, присоединяют к подходящей
последовательности Т-ДНК традиционными способами. Полученные
молекулы вводят в протопласты табака с помощью стандартных
методов, включающих в себя применение полиэтиленгликоля или
электропорацию. Альтернативно такие векторы, которые содержат
молекулы рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего
исследуемый очищенный белок, вводят в живые клетки Agrobacterium, из которых полинуклеотид переносят в растительные клетки. Трансформацию оголенным полинуклеотидом, без применения векторной последовательности Т-ДНК, можно проводить путем гибридизации протопластов с полинуклеотид-содержащими липосомами или путем электропорации. Оголенный
полинуклеотид, без применения векторной последовательности Т-ДНК, также можно использовать для трансформации клеток путем высокоскоростной бомбардировки инертными микрочастицами.
Если клетку или культивируемую ткань используют в качестве реципиентной ткани для трансформации, при желании растения можно регенерировать из трансформированных культур с помощью методов, известных специалистам в данной области.
Выбор регуляторных участков для включения в состав
рекомбинантной конструкции зависит от нескольких факторов,
включающих в себя, без ограничения, эффективность,
селективность, возможность индуцирования, желательный уровень
экспрессии и клеточно- или тканеспецифичной экспрессии.
Рутинным способом, известным специалистам в данной области,
является модуляция экспрессии кодирующей последовательности
путем выбора подходящих регуляторных участков и их
соответствующего расположения относительно кодирующей
последовательности. Транскрипцию полинуклеотида можно
модулировать подобным образом. Некоторые подходящие регуляторные участки инициируют транскрипцию только или преимущественно в клетках определенных типов. Способы идентификации и характеристики регуляторных участков в растительном геномном полинуклеотиде известны в данной области.
Подходящие промоторы включают в себя тканеспецифичные промоторы, распознаваемые тканеспецифичными факторами, присутствующими в разных типах тканей или клеток (например, корень-специфичные промоторы, росток-специфичные промоторы, ксилема-специфичные промоторы), или присутствующими на разных стадиях развития, или появляющимися в ответ на разные условия окружающей среды. Подходящие промоторы включают в себя конститутивные промоторы, которые могут активироваться в большинстве типов клеток в отсутствии специфичных индукторов. Примеры промоторов, подходящих для регуляции продукции полипептида РНКи NtMRP, включают в себя промоторы вируса мозаики цветной капусты 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos или убихитина или фазеолина. Специалисты в данной области могут получить разные вариации рекомбинантных
промоторов.
Тканеспецифичные промоторы представляют собой элементы,
регулирующие транскрипцию, способные функционировать только в
определенных клетках или тканях, таких как вегетативные ткани
или репродуктивные ткани, на определенных стадиях развития
растения. Тканеспецифичная экспрессия может быть
предпочтительной, например, если экспрессию полинуклеотидов
желательно проводить в определенных тканях. Примеры
тканеспецифичных промоторов, зависимых от стадии развития,
включают в себя промоторы, которые могут инициировать
транскрипцию только (или преимущественно) в определенных
тканях, включающих в себя вегетативные ткани, такие как корни
или листья, или репродуктивные ткани, такие как плоды,
семяпочки, семена, пыльца, пестики, цветки или любая
зародышевая ткань. Промоторы, специфичные к репродуктивным
тканям, могут включать в себя, например, пыльник-специфичные,
семяпочка-специфичные, зародыш-специфичные, эндосперм-
специфичные, оболочка-специфичные, специфичные к семенам и семенной оболочке, пыльца-специфичные, лепесток-специфичные, чашелистик-специфичные или их сочетания.
Подходящие лист-специфичные промоторы включают в себя
пируват, промотор ортофосфатдикиназы (PPDK) растения С4 (маис),
промотор cab-mlCa+2 маиса, промотор myb-родственного гена
(Atmyb5) Arabidopsis thaliana, промоторы
рибулозобифосфатдекарбоксилазы (RBCS) (например, генов томата
RBCS1, RBCS2 и RBCS3A, экспрессируемых в листьях и выращенной
на свету рассаде, RBCS1 и RBCS2, экспрессируемых в
развивающихся плодах томата, или промотор
рибулозобифосфаткарбоксилазы, экспрессируемой почти
исключительно в мезофилльных клетках листовых пластин и листовых влагалищах на высоких уровнях).
Подходящие специфичные к увяданию промоторы включают в себя промотор томата, функционирующий на стадии созревания плодов, увядания и опадения листьев, промотор гена маиса, кодирующего цистеинпротеазу. Можно использовать подходящие пыльник-специфичные промоторы. Можно выбрать подходящие корень
предпочтительные промоторы, известные специалистам в данной области. Подходящие семя-специфичные промоторы включают в себя как семя-специфичные промоторы (промоторы, активные в период развития семени, такие как промоторы запасных белков семени) и промоторы, специфичные для периода проращивания семени (такие как промоторы, активные в период проращивания семени). Такие семя-специфичные промоторы включают в себя, без ограничения, Ciml (цитокин-индуцируемый промотор); CZ19B1 (зеин маиса размером 19 кДа); milps (миоинозитол-1-фосфатсинтаза); mZE40-2, также известный как Zm-40; nuclc; и celA (целлюлозосинтаза). Гама-зеин представляет собой эндосперм-специфичный промотор. Glob-1 представляет собой зародыш-специфичный промотор. В случае двудольных семя-специфичные промоторы включают в себя, без ограничения, бета-фазеолин бобовых, напин, р-конглицинин, лектин соевых бобов, круциферин и т.п. В случае однодольных семя-специфичные промоторы включают в себя, без ограничения, промотор зеина маиса размером 15 кДа, промотор зеина размером 22 кДа, промотор зеина размером 27 кДа, промотор д-зеина, промотор у_зеина размером 27 кДа (такой как промотор gzw64A, Genbank, номер доступа S78780), восковой промотор, промотор shrunken 1, промотор shrunken 2, промотор глобулина 1 (см Genbank, номер доступа L22344), промотор Itp2, промотор ciml, промоторы маиса endl и end2, промотор nucl, промотор Zm4 0, eepl и еер2; led, промотор тиоредоксина Н; промотор mlipl5, промотор PCNA2; и промотор shrunken-2.
Примеры индуцируемых промоторов включают в себя промоторы, отвечающие на воздействие патогена, анаэробные условия, повышенную температуру, свет, засуху, низкую температуру или высокую концентрацию соли. Патоген-индуцируемые промоторы включают в себя промоторы белков, связанных с патогенезом (белки PR) , которые индуцируются после инфекции патогена (например, белки PR, белки SAR, бета-1,3-глюканаза, хитиназа).
Помимо растительных промоторов можно использовать другие подходящие промоторы, например, промоторы бактериального происхождения, такие как промотор октопинсинтазы, промотор нопалинсинтазы и другие промоторы, полученные из плазмиды Ti),
или вирусные промоторы (например, промоторы 35S и 19S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV), конститутивные промоторы вируса мозаики табака, промоторы вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 19S и 35S, или промотор вируса мозаики 35S норичника).
Примеры конъюгированных фрагментов включают в себя макромолекулярные соединения, такие как белки (например, антитела), жирнокислотные цепи, остатки Сахаров, гликопротеины, полимеры (например, полиэтиленгликоль) или их сочетания. Олигонуклеотид можно конъюгировать с фрагментом, который повышает поглощение олигонуклеотида клеткой.
Неограничивающие примеры фрагментов включают в себя, без
ограничения, антитела, полипептиды, липидные фрагменты, такие
как фрагмент холестерина, холевую кислоту, простой тиоэфир,
например, гексил-э-тритилтиол, тиохолестерин, алифатическую
цепь, например, остатки додекандиола или ундецил, фосфолипид,
например, дигексадецил-гас-глицерин или триэтиламмония 1-ди-о-
гексадецил-гас-глицеро-Б-п-фосфонат, полиаминовую или
полиэтиленгликолевую цепь, адамантануксусную кислоту,
пальмитиловый фрагмент, октадециламин или гексиламино-карбонил-оксихолестериновый фрагмент.
Фрагмент может представлять собой положительно заряженный полимер, такой как положительно заряженный пептид, содержащий, например, примерно от 1 до 50 аминокислотных остатков в длину, или полиалкиленоксид, такой как полиэтиленгликоль (PEG) или полипропиленгликоль. Предпочтительно положительно заряженный полимер, такой как полиалкиленоксид, может быть присоединен к олигомеру через линкер, такой как высвобождаемый линкер.
Для измерения экспрессии полипептида NtMRP можно определить количество мРНК, кодирующей полипептид NtMRP, в клетке, например, методом ПЦР или нозерн-блоттинга. Для определения изменения количества полипептида NtMRP в образце можно использовать детекцию NtMRP с помощью антител против NtMRP, позволяющую определить количество полипептида NtMRP в клетке с помощью известных методов. Альтернативно можно измерить биологическую активность (например, транспорт тяжелого металла, такого как кадмий) до и после контакта с тестируемым
средством.
В другом воплощении изобретение предлагает антитела, обладающие иммунореактивностью в отношении полипептидов. Полипептиды NtMRP, их фрагменты, варианты, гибридные полипептиды и т.п., описанные выше, можно использовать в качестве "иммуногенов" для получения антител, обладающих иммунореактивностью по отношению к ним. Такие антитела специфически связываются с полипептидами посредством антиген-связывающих участков антитела. Специфически связывающиеся антитела представляют собой антитела, которые специфично распознают и связывают полипептиды семейства NtMRP, их гомологи и варианты, но не другие молекулы. В одном воплощении антитела являются специфичными к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность NtMRP, описанную в данном документе, и не вступают в перекрестные реакции с другими полипептидами.
Более конкретно, полипептиды, фрагменты, варианты, гибридные полипептиды и т.п. содержат антигенные детерминанты или эпитопы, которые вызывают образование антител. Указанные антигенные детерминанты или эпитопы могут быть линейными или конформационными (прерывающимися). Линейные эпитопы состоят из одной секции аминокислот полипептида, тогда как конформационные или прерывающиеся эпитопы состоят из аминокислотных секций разных участков полипептидной цепи, которые после укладки полипептида находятся в непосредственной близи друг к другу. Эпитопы можно идентифицировать с помощью любого известного в данной области способа. Кроме того, эпитопы полипептидов можно использовать в качестве реагентов для исследований при проведении анализов и для очистки специфичных связывающих антител от веществ, таких как поликлональная сыворотка или супернатанты культивируемых гибридом. Такие эпитопы или их варианты можно получить с помощью известных в данной области методов, таких как твердофазный синтез, химическое или ферментативное расщепление полипептида, или технологии рекомбинантных ДНК.
С помощью традициционных методов можно получить как поликлональные, так и моноклональные антитела против
полипептидов. Изобретение также охватывает гибридомные клеточные линии, которые продуцируют моноклональные антитела, специфичные к полипептидам. Такие гибридомы можно получить и идентифицировать с помощью традиционных методов. Антитела можно получить в результате иммунизации разных животных-хозяев путем введения полипептида NtMRP, его фрагмента, варианта или мутанта. Такие животные-хозяева включают в себя, в числе прочих, кроликов, мышей и крыс. Для усиления иммунного ответа можно использовать разные адъюванты. В зависимости от вида хозяина такие адъюванты включают в себя, без ограничения, адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол, и человеческие адъюванты потенциального применения, такие как BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Моноклональные антитела можно получить традиционными методами. Такие моноклональные антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включающему в себя IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и все их подклассы.
Антитела также можно использовать для детекции присутствия полипептидов или их фрагментов in vitro или in vivo. Антитела также можно использовать для очистки полипептидов или их фрагментов методом иммуноаффинной хроматографии.
Разные воплощения предлагают мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения, а также биомассу и семена, в которых уровень экспрессии полинуклеотида NtMRP значительно снижен с целью уменьшения или блокирования транспорта кадмия в пластине листа. Пластина листа может входить в состав разных продуктов потребления, включающих в себя разные табачные изделия, такие как сигары, сигареты и не дающие дыма табачные изделия (то есть негорючие).
% Уменьшения кадмия в указанных табачных изделиях и не дающих дыма продуктах может составлять, по меньшей мере, примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или
100%, 200% или 300%, по сравнению с продуктами потребления, полученными из немутантных, не встречающийся в природе или нетрансгенных аналогов. В некоторых воплощениях содержание кадмия в указанных табачных изделиях и не дающих дыма продуктах может находиться в диапазоне примерно от 0,01 до 0,05 миллионных долей (м.д.), примерно от 0,01 до 0,1 м.д., примерно от 0,01 до 0,5 м.д., примерно от 0,01 до 1,0 м.д., или примерно от 0,01 до 5 м.д. В некоторых воплощениях содержание кадмия в указанных табачных изделиях и не дающих дыма продуктах составляет примерно 0,001 м.д. или менее, примерно 0,01 м.д. или менее, или примерно 0,05 м.д. или менее, или примерно 0,49 м.д. или менее, или примерно 0,5 м.д. или менее. Степень накопления кадмия в растениях может существенно варьировать в зависимости от нескольких параметров, обусловленных сложностью генотипа и условиями выращивания. Например, концентрации кадмия в листьях табака, выращенного в полевых условиях, могут сильно варьировать в зависимости от таких факторов, как агроклимат, качество земли, используемый сорт, а также тип и источник используемого удобрения. Кроме того, относительный характер распределения кадмия в разных частях растения табака может варьировать в зависимости от вида, органа/ткани и условий выращивания (включающих в себя полевые условия и гидропонные условия). Средняя концентрация кадмия в листьях (в том числе в сосудах и жилках) табака, выращенного в полевых условиях, может находиться в диапазоне, составляющем примерно от 0,5 до 5 м.д. (миллионных долей или микрограмм/грамм сухой массы листьев табака). Однако во многих публикациях уровень кадмия приводится без указания стадии созревания табака, разновидности табака или конкретных частей листьев (например, пластин листа, отделенных от черенков), собранных для анализа. У некоторых разновидностей нижние листья могут накапливать более высокое содержание кадмия, чем средние и нижние листья. Что касается внутриклеточного уровня, кадмий можно обнаружить в разных компонентах растительной клетки, включающих в себя клеточную стенку, цитоплазму, хлоропласт, ядро и вакуоли.
Кроме того, содержание кадмия, измеряемое в листьях
табака, может значительно варьировать в зависимости от уровня кадмия в почве, в которой выращивают растения табака. В листьях табака, выращенного в загрязненных кадмием регионах, содержание кадмия может составлять примерно 35 м.д. или выше, тогда как содержание кадмия в листьях генетически идентичных аналогов, выращенных в незагрязненных регионах, может находиться в диапазоне, составляющем примерно от 0,4 до 8 м.д. Вакуоли листьев растений, выращенных в загрязненных кадмием регионах, могут накапливать очень высокие концентрации кадмия. Способы применения раскрытых композиций к конкретным представляющим интерес видам растений известны специалистам в данной области.
Содержание тяжелых металлов в растениях можно измерить с помощью разных способов, известных в данной области. Предпочтительный способ включает в себя применение масс-спектрофотометрии с индуктивно сопряженной плазмой ("ICP-MS," Agilent 7500А; Agilent Technologies, Palo Alto, CA).
Описанные здесь мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения могут иметь другие применения, например, в сельском хозяйстве. Например, описанные здесь мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения можно использовать для получения кормов для животных и пищевых продуктов для людей. Семена описанных здесь растений можно кондиционировать и упаковать в упаковочный материал с помощью известных в данной области способов с получением промышленного изделия. В данной области известны такие упаковочные материалы, как бумага и ткань. Упаковка семян может содержать этикетку, такую как бирка или этикетка, прикрепленная к упаковочному материалу, этикетка, отпечатанная на упаковочном материале, или этикетка, вставленная в упаковку, где этикетка содержит описание семян, находящихся в упаковке.
Растение, несущее мутантную аллель NtMRP, можно использовать в программе селекции растений с получением полезных линий, разновидностей и гибридов. В частности, осуществляют интрогрессию мутантной аллели NtMRP в описанные выше разновидности, имеющие коммерческую ценность. Таким образом, изобретение предлагает способы селекции растений,
которые включают в себя скрещивание описанного здесь мутантного растения, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения с растением, содержащим другой набор генов. Способ может дополнительно включать в себя скрещивание потомства растения с другим растением и, необязательно, повторение скрещивания до получения потомства с желательными генетическими признаками или желательным генетическим фоном. Одна из целей, достигаемых с помощью таких методов селекции, включает в себя введение желательного генетического признака в другие разновидности, селекционные линии, гибриды или сорта, в особенности, в те из них, которые имеют коммерческую ценность. Другая цель включает в себя обеспечение накопления модификаций разных генов в одной разновидности, в одной линии, в одном гибриде или в одном сорте растения. Можно проводить внутривидовые и межвидовые скрещивания. Дочерние растения, полученные в результате таких скрещиваний, также называемые селекционные линии, являются примерами не встречающихся в природе растений.
В одном воплощении изобретение предлагает способ получения не встречающегося в природе растения, включающий в себя: (а) скрещивание мутантного или трансгенного растения со вторым растением с получением семян потомства; (Ь) выращивание семян потомства в условиях выращивания растения с получением не встречающегося в природе растения. Способ может дополнительно включать в себя: (с) скрещивание предыдущего поколения не встречающегося в природе растения самого с собой, или с другим растением с получением семян потомства; (d) выращивание семян потомства, полученных на стадии (с), в условиях выращивания растения с получением других не встречающихся в природе растений; и (е) повторение стадий (с) и (d) скрещивания и выращивания несколько раз с получением следующих поколений не встречающихся в природе растений. Способ может необязательно включать в себя перед стадией (а) стадию получения исходного растения, содержащего охарактеризованный набор генов, который не является идентичным набору генов мутантного или трансгенного растения. В некоторых воплощениях, в зависимости от программы
селекции, стадии скрещивания и выращивания повторяют от 0 до 2 раз, от 0 до 3 раз, от 0 до 4 раз, от 0 до 5 раз, от 0 до б раз, от 0 до 7 раз, от 0 до 8 раз, от 0 до 9 раз или от 0 до 10 раз, получая поколения не встречающихся в природе растений. Обратное скрещивание является примером такого способа, в котором потомство скрещивают с родительскими или с другим растением, генетически подобным родительскому растению, с получением дочернего растения в следующем поколении, набор генов которого близок набору генов одного из родителей. Методы селекции растений, в частности селекции растений табака, хорошо известны и могут использоваться в описанных здесь способах. Описание дополнительно предлагает не встречающиеся в природе растения, полученные с помощью указанных способов.
В некоторых воплощениях описанных здесь способов линии, полученные в результате селекции и скрининга на вариантные гены NtMRP, анализируют в полевых условиях с помощью стандартных полевых методик. Используют контрольные генотипы, включающие в себя исходный немутантный родительский генотип, причем компоненты располагают на поле по рандомизированной полноблочной схеме, или по другой подходящей полевой схеме. Для табака используют стандартные агрономические приемы, например, табак собирают, взвешивают и берут образцы для химических и других традиционных анализов до и в процессе заготовки. Проводят статистические анализы данных, чтобы подтвердить подобие выбранных линий родительской линии. Необязательно проводят цитогенетические анализы выбранных растений, чтобы подтвердить взаимозависимость набора хромосом и спаривания хромосом.
Для переноса мутантных аллелей гена (генов) NtMRP в другие растения табака, или воспроизведения мутантных аллелей гена (генов) NtMRP в других растениях табака, как описано в данном документе, можно использовать программу маркер-опосредуемой селекции (MAS) с применением "отпечатков пальцев" ДНК, однонуклеотидного полиморфизма, микросателлитных маркеров или подобных им методов. Например, селекционер может создавать сегрегирующие популяции путем гибридизации генотипа,
содержащего мутантный аллель, с агрономически желательным
генотипом. Растения поколения F2 или поколения, полученные в
результате обратного скрещивания, можно подвергать скринингу с
использованием маркера, полученного из геномной
последовательности (геномных последовательностей) NtMRP, или ее фрагмента (фрагментов), с помощью одного из перечисленных здесь методов. Растения, идентифицированные как содержащие мутантный аллель, можно подвергнуть обратному скрещиванию или самоопылению с получением второй популяции, подлежащей скринингу. В зависимости от ожидаемого характера наследования или используемой технологии MAS, может возникнуть необходимость самоопыления выбранных растений перед каждым циклом обратного скрещивания, с целью идентификации отдельных желательных растений. Обратное скрещивание или другую процедуру селекции можно повторять до получения рекуррентного родительского растения с желательным фенотипом.
В соответствии с настоящим описанием успешные скрещивания, проводимые в рамках программы селекции, дают фертильные растения поколения F1. Выбранные растения F1 можно подвергнуть скрещиванию с одним из родительских растений, после чего растения первого поколения обратного скрещивания подвергают самоопылению с получением популяции, которую вновь подвергают скринингу на экспрессию варианта гена NtMRP (например, нулевой версии гена NtMRP). Стадии обратного скрещивания, самоопыления и скрининга повторяют, например, по меньшей мере 4 раза до тех пор, пока последний скрининг не выявит фертильное растение, в достаточной степени подобное рекуррентному родительскому растению. Данное растение при желании подвергают самоопылению и полученное потомство снова подвергают скринингу, чтобы подтвердить, что в растении наблюдается экспрессия варианта гена NtMRP. В некоторых воплощениях скринингу на экспрессию варианта гена NtMRP подвергают популяцию растений поколения F2, например, растение, которое не экспрессирует NtMRP вследствие отсутствия гена NtMRP, идентифицируют с помощью стандартных методов, таких как метод ПЦР с использованием праймеров, полученных на основе информации об описанной здесь нуклеотидной
последовательности NtMRP.
Гибридные разновидности можно получить путем
предотвращения самоопыления женских родительских растений (то есть, растений, дающих семена) первой разновидности, предоставление пыльце мужских родительских растений второй разновидности возможности оплодотворять женские родительские растения, и проращивание гибридных семян F1 с получением женских растений. Самоопыление женских растений можно предотвратить путем удаления несозревших пестиков на ранней стадии развития цветков. Альтернативно образование пыльцы у женских родительских растений можно предотвратить, используя форму, характеризующуюся мужской стерильностью. Например, мужская стерильность может быть обусловлена цитоплазматической мужской стерильностью (CMS) или трансгенной мужской стерильностью, где трансген ингибирует микроспорогенез и/или образование пыльцы, или самонесовместимостью. Особенно часто используют женские родительские растения, характеризующиеся CMS. В воплощениях, в которых женские родительские растения характеризуются CMS, пыльцу, собранную из мужских фертильных растений, вручную наносят на рыльца пестиков женских родительских растений, характеризующихся CMS, и собирают полученные семена F1.
Описанные здесь разновидности и линии можно использовать для получения простых гибридов F1. В таких воплощениях растения родительских разновидностей можно вырастить как практически гомогенные примыкающие друг к другу популяции, чтобы обеспечить природное перекрестное опыление мужскими родительскими растениями женских родительских растений. Семена F1, образовавшиеся на женских родительских растениях, селективно собирают традиционными методами. Разновидности родительских растений можно выращивать вместе, при этом собирают смесь гибридных семян F1, образовавшихся на женском родительском растении, и семян, образовавшихся на мужском родительском растении в результате самоопыления. Альтернативно можно проводить трехстадийные скрещивания, где гибрид первого скрещивания F1 используют в качестве женского родительского
растения, которое скрещивают с другим мужским родительским растением. В качестве другой альтернативы можно получить гибриды двойного скрещивания, где потомство F1 двух разных одиночных скрещиваний скрещивают само с собой.
Популяцию мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений можно подвергнуть скринингу или отбору по членам популяции, которые имеют желательный признак или фенотип. Например, популяцию потомства, содержащего одно событие трансформации, можно подвергнуть скринингу на растения, имеющие желательный уровень экспрессии полипептида или полинуклеотида NtMRP. Физические и биохимические методы можно использовать для идентификации уровней экспрессии. Такие методы включают в себя саузерн-анализ или амплификацию ПЦР для детекции полинуклеотидов; нозерн-блоттинг, РНКазную защиту S1, удлинение праймеров или амплификацию ПЦР с обратной транскриптазой для детекции транскриптов РНК; ферментативные анализы для детекции ферментативной или рибозимной активности полипептидов и полинуклеотидов; и гель-электрофорез белков, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию и ферментные иммуноанализы для детекции полипептидов. Для детекции присутствия или экспрессии полипептидов или полинуклеотидов также можно использовать другие методы, такие как гибридизация in situ, окрашивание ферментами и иммуноокрашивание.
В данном документе описаны мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растительные клетки и растения, содержащие один или несколько рекомбинантных полинуклеотидов, таких как один или несколько выделенных полинуклеотидов NtMRP, одна или несколько полинуклеотидных конструкций, одна или несколько двухцепочечных РНК, один или несколько конъюгатов, или один или несколько векторов/векторов экспрессии.
Экспрессию NtMRP можно определить с помощью методов, включающих в себя, например, ПЦР с обратной транскриптазой, нозерн-блоттинг, РНКазную защиту, удлинение праймеров, вестерн-блоттинг, гель-электрофорез белков, иммунопреципитацию, ферментные иммуноанализы, анализы с использованием чипов и масс-спектрометрию. Следует отметить, что в случае экспрессии
полипептида под контролем тканеспецифичного промотора или промотора, обеспечивающего экспрессию во всех тканях, экспрессию можно анализировать в целом растении, или в выбранной ткани. Подобным образом, если полипептид экспрессируется в определенном промежутке времени, таком как период развития или индукции, экспрессию можно избирательно анализировать в желательном промежутке времени.
Без ограничения, описанные здесь растения можно модифицировать с другими целями, до или после модуляции
(например, уменьшения или ингибирования) экспрессии или активности NtMRP. Одна или несколько из нижеследующих генетических модификаций может присутствовать в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях. В одном воплощении один или несколько других генов, участвующих в поглощении или транспорте тяжелых металлов, модифицируют с получением растений или частей растений (таких как листья) с пониженным содержанием тяжелых металлов по сравнению с контрольными растениями или их частями, не содержащими модификации (модификаций). Неограничивающие примеры включают в себя гены семейства средств, обеспечивающих диффузию катионов
(CDF), семейства Zrt-, Irt-подобных белков (ZIP), семейства катионообменных средств (САХ), семейства транспортеров меди
(СОРТ), семейства транспортирующих тяжелые металлы АТФ-аз Р-типа (НМА, описанных в W02009074325), семейства гомологов макрофагальных белков, ассоциированных с естественной устойчивостью (NRAMP), и других членов семейства транспортеров АТФ-связывающей кассеты (АБС), которые участвуют в транспорте тяжелых металлов, таких как кадмий. Термин тяжелый металл в настоящем описании включает в себя переходные металлы. В другом воплощении модифицируют один или несколько генов, участвующих в превращении азотсодержащих метаболических промежуточных соединений, с получением растений или частей растений (таких как листья), которые после нагревания продуцируют более низкие уровни по меньшей мере одного табак-специфичного нитрозамина
(такого как 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон, N-нитрозонорникотин, N-нитрозоанатабин и N-нитрозоанабазин), чем
контрольные растения или их части. Неограничивающие примеры генов, которые можно модифицировать, включают в себя гены, кодирующие никотиндеметилазу, такие как CYP82E4, CYP82E5 и CYP82E10, участвующие в превращении никотина в норникотин, которые описаны в W02006091194, W02008070274, W02009064771 и PCT/US2011/021088.
Примеры других модификаций включают в себя изменение устойчивости к гербицидам, таким как глифосат, который является активным ингредиентом многих гербицидов широкого спектра действия. Устойчивые к глифосату трансгенные растения получают путем переноса гена агоА (глифосат-синтетаза EPSP из Salmonella typhimurium и E.coli). Устойчивые к сульфонилмочевине трансгенные растения получают путем введения мутантного гена ALS (ацетолактатсинтетазы) Arabidopsis. Белок ОБ фотосистемы II из мутантного Amaranthus hybridus вводят в растения с получением атразин-устойчивых трансгенных растений; а бромксинил-устойчивые трансгенные растения получают путем введения гена bxn бактерии Klebsiella pneumoniae. В другом примере модификация приводит к получению растений, устойчивых к насекомым. Применение токсинов Bacillus thuringiensis (Bt) может представлять собой эффективный способ замедления появления Bt-устойчивых вредителей, как было недавно проиллюстрировано на брокколи, где постепенно увеличивающиеся гены Bt crylAc и crylC контролируют устойчивость капустной моли к какому-либо одному белку и значительно замедляют эволюцию устойчивых насекомых. В другом примере модификация приводит к получению растений, устойчивых к заболеваниям, вызываемым патогенами (такими как вирусы, бактерии, грибки). С помощью рекомбинатных способов получены растения, экспрессирующие ген Ха21 (отвечающий за устойчивость к бактериальным заболеваниям), и растения, экспрессирующие как гибридный ген Bt, так и ген хитиназы (отвечающий за устойчивость к желтому стеблееду и толерантность к sheath). В другом примере модификация приводит к изменению репродуктивной способности, такому как мужская стерильность. В другом примере модификация приводит к получению растений, устойчивых к абиотическому стрессу (обусловленному,
например, засухой, изменением температуры и содержания солей), и толерантные трансгенные растения получают путем введения гена ацилглицеринфосфатного фермента Arabidopsis; генов, кодирующих маннитдегидрогензу и сорбитдегидрогензу, которые участвуют в синтезе маннита и сорбита, улучшая устойчивость к засухе. Другая иллюстративная модификация позволяет получить растения, которые продуцируют белки, обладающие иммуногенными свойствами, подходящими для применения у людей. Например, можно использовать растения, способные продуцировать белки, N-гликановые конъюгаты которых практически не содержат альфа-1,3-связанных остатков фукозы, бета-1,2-связанных остатков ксилозы, или тех и других. Другие иллюстративные модификации позволяют получить растения с улучшенными запасными белками и маслами, растения с повышенной эффективностью фотосинтеза, растения, характеризующиеся повышенным сроком хранения, растения с повышенным содержанием углеводов и растения, устойчивые к грибкам; растения, кодирующие фермент, участвующий в биосинтезе алкалоидов. В объем изобретения также входят трансгенные растения с модулированной экспрессией S-аденозил-Ъ-метионина (SAM) и/или гамма-синтазы цистатионина (CGS).
Без ограничения, описанные здесь растения можно дополнительно модифицировать. Примеры таких дополнительных модификаций включают в себя, без ограничения: (а) Получение растений, устойчивых к гербицидам. Например, глифосат, является активным ингредиентом многих гербицидов широкого спектра действия. Устойчивые к глифосату трансгенные растения получают путем переноса гена агоА (глифосат-синтетазы EPSP из Salmonella typhimurium и E.coli); Устойчивые к сульфонилмочевине трансгенные растения получают путем введения мутантного гена ALS (ацетолактатсинтетазы) Arabidopsis; Белок ОБ фотосистемы II мутантного Amaranthus hybridus вводят в растения с получением атразин-устойчивых трансгенных растений; а бромксинил-устойчивые трансгенные растения получают путем введения гена bxn бактерии Klebsiella pneumoniae; (b) Получение растений, устойчивых к насекомым. Применение токсинов Bacillus thuringiensis (Bt) может представлять собой эффективный способ
замедления появления Bt-устойчивых вредителей, как было недавно
проиллюстрировано на брокколи, где постепенно увеличивающиеся
гены Bt crylAc и crylC контролируют устойчивость капустной моли
к какому-либо одному белку и значительно замедляют эволюцию
устойчивых насекомых; (с) Получение растений, устойчивых к
вирусам. Растения, устойчивые к вирусу мозаики табака, получают
путем введения белков вирусной оболочки. Другие устойчивые к
вирусам трансгенные растения включают в себя растения
картофеля, устойчивые к вирусу картофеля, RSV-устойчивый рис и
YMV-устойчивые фасоль мунга и зеленый горох; (d) Получение
растений, устойчивых к бактериям. Рекомбинантными методами
получают растения, экспрессирующие ген Ха21 (отвечающий за
устойчивость к бактериальным заболеваниям), и растения,
экспрессирующие как гибридный ген Bt, так и ген хитиназы
(отвечающий за устойчивость к желтому стеблееду и толерантность
к sheath); (е) Получение растений, устойчивых к стрессу:
Трансгенные растения, устойчивые к низким температурам,
получают путем введения гена ацилглицеринфосфатного фермента
Arabidopsis; гены, кодирующие маннитдегидрогензу и
сорбитдегидрогензу, которые участвуют в синтезе маннита и
сорбита, улучшают устойчивость к засухе; (f) Получение
растений, которые продуцируют белки, обладающие иммуногенными
свойствами, подходящими для применения у людей. Например, можно
использовать растения, способные продуцировать белки, N-
гликановые конъюгаты которых практически не содержат альфа-1,3-
связанных остатков фукозы, бета-1,2-связанных остатков ксилозы,
или тех и других; и (д) Другие примеры трансгенных растений
включают в себя растения с улучшенными запасными белками и
маслами, растения с повышенной эффективностью фотосинтеза,
растения, характеризующиеся повышенным сроком хранения,
растения с повышенным содержанием углеводов и растения,
устойчивые к грибкам; растения, кодирующие фермент, участвующий
в биосинтезе алкалоидов; гены бактериального пути детоксикации
органической ртути (ртутной редуктазы, merA) и
ртутьорганической лиазы, merB, объединяют путем скрещивания в Arabidopsis, и полученные растения, экспрессирующие оба гена,
могут расти в среде, содержащей концентрацию метилртути, в 50 раз превышающую концентрацию, в которой могут расти растения дикого типа.
Один или несколько таких признаков можно ввести путем интрогрессии в мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения табака из другого сорта табака, или их можно непосредственно использовать для трансформации указанных растений. Интрогрессию признака (признаков) в мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения табака можно осуществить с помощью любого способа селекции растений, известного в данной области, например, такого как чистосортовое разведение, обратное скрещивание, двойная гаплоидная селекция и т.п. (см., Wernsman, Е. A, and Rufty, R. С. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.) , MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp.) . Описанные выше методы молекулярной биологии, в частности, методы с применением RFLP и микросателлитных маркеров можно использовать при обратных скрещиваниях, чтобы идентифицировать потомство с наивысшей степенью генетической идентичности в отношении рекуррентного родителя. Указанные методы позволяют ускорить получение разновидностей, генетическая идентичность которых в отношении рекуррентного родителя составляет по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 99%, еще более предпочтительно полученные разновидности являются генетически идентичными рекуррентному родителю и дополнительно содержат признак (признаки), полученный путем интрогрессии от донорного родителя. Анализ генетической идентичности можно проводить с использованием молекулярных маркеров, известных в данной области.
Последнее поколение обратного скрещивания можно подвергнуть самоопылению, чтобы получить потомство чистой линии, содержащее переданный полинуклеотид (полинуклеотиды). Как правило, полученные растения имеют практически все морфологические и физиологические характеристики мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений помимо
переданного признака (признаков) (такого как один или несколько признаков, связанных с одним геном). Точная схема обратного скрещивания зависит от признака, подлежащего изменению, с определением подходящего метода тестирования. Хотя обратное скрещивание проще проводить, если передаваемый признак представляет собой доминантную аллель, рецессивную аллель также можно передавать. В данном случае может возникнуть необходимость в тестировании потомства с целью определения успешной передачи желательного признака.
Разные воплощения предлагают мутантные растения, не встречающиеся в природе растения или трансгенные растения, а также биомассу с пониженным уровнем экспрессии полинуклеотида NtMRP, обуславливающем уменьшение накопления кадмия.
Части таких растений, в частности растений табака, более
конкретно листовые пластины и жилки растений табака, можно
включить в состав, или использовать для получения разных
продуктов потребления, включающих в себя, без ограничения,
аэрозоль-образующие вещества, аэрозоль-образующие устройства,
курительные изделия, изделия, которые можно курить, не дающие
дыма продукты и табачные изделия. Примеры аэрозоль-образующих
веществ включают в себя, без ограничения, композиции табака,
табак, экстракт табака, измельченный табак, измельченный
наполнитель, сушеный табак, взорванный табак,
гомогенизированный табак, восстановленный табак и трубочный табак. Курительные изделия и изделия, которые можно курить, представляют собой типы аэрозоль-образующих устройств. Примеры курительных изделий и изделий, которые можно курить, включают в себя, без ограничения, сигареты, тонкие сигарки и сигары. Примеры не дающих дыма продуктов включают в себя жевательные табаки и нюхательные табаки. В некоторых аэрозоль-образующих устройствах для получения аэрозоля вместо горения используют нагревание табачной композиции или другого аэрозоль-образующего вещества с использованием одного или нескольких электронагревательных элементов. В другом типе нагревательного аэрозоль-образующего устройства аэрозоль получают путем переноса тепла из горючего топливного элемента или источника
тепла на физически отдельное аэрозоль-образующее вещество, которое может располагаться внутри источника тепла, около источника тепла или под источником тепла. Не дающие дыма табачные продукты и разные табак-содержащие аэрозоль-образующие вещества могут содержать табак в любой форме, включающей в себя сухие частицы, кусочки, гранулы, порошки или взвеси, нанесенные на другие ингредиенты, смешанные с другими ингредиентами, окруженные другими ингредиентами или иным образом объединенные с другими ингредиентами в любом формате, таком как хлопья, пленки, таблетки, пены или гранулы. В данном описании термин "курение" используют для описания типа аэрозоля, продуцируемого курительными изделиями, такими как сигареты, или в результате горения аэрозоль-образующего вещества.
В одном воплощении изобретение также предлагает высушенное вещество, полученное из описанных здесь мутантных, трансгенных и не встречающихся в природе растений табака. Способы сушки зеленых листьев табака известны специалистам в данной области и включают в себя, без ограничения, воздушную сушку, огневую сушку, дымовую сушку и солнечную сушку. Способ сушки зеленых листьев табака зависит от типа собираемого табака. Например, виргинский дымовой табак (светлый) обычно получают путем дымовой сушки, табак Берлей и некоторые темные сорта обычно получают путем воздушной сушки, а трубочный табак, жевательный табак и нюхательный табак обычно получают путем огневой сушки.
В другом воплощении изобретение описывает табачные
продукты, включающие в себя табак-содержащие аэрозоль-
образующие вещества, включающие в себя листья, предпочтительно
сушеные листья, полученные из описанных здесь мутантных
растений табака, трансгенных растений табака или не
встречающихся в природе растений табака. Описанные здесь
табачные продукты могут включать в себя смешанный табачный
продукт, который может дополнительно содержать
немодифицированный табак.
Мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения могут иметь другие применения, например, в сельском хозяйстве. Например, описанные здесь мутантные, не
встречающиеся в природе или трансгенные растения можно использовать для получения кормов для животных и пищевых продуктов для людей.
Описание также предлагает способы получения семян, включающие в себя культивирование описанного здесь мутантного растения, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения, и собирание семян культивируемых растений. Семена описанных здесь растений можно кондиционировать и упаковать в упаковочный материал с помощью известных в данной области способов с получением промышленного изделия. В данной области известны такие упаковочные материалы, как бумага и ткань. Упаковка семян может содержать этикетку, такую как бирка или этикетка, прикрепленная к упаковочному материалу, этикетка, отпечатанная на упаковочном материале, или этикетка, вставленная в упаковку, где этикетка содержит описание семян, находящихся в упаковке.
Изобретение охватывает композиции, способы и наборы для генотипирования растений с целью идентификации, селекции или выведения, которые могут включать в себя средства детекции присутствия полинуклеотида NtMRP в образце полинуклеотида. Соответственно, изобретение предлагает композицию, содержащую один или несколько праймеров для специфичной амплификации, по меньшей мере, части полинуклеотида NtMRP, и, необязательно, один или несколько зондов и один или несколько реагентов для проведения амплификации или детекции.
Соответственно, изобретение раскрывает ген-специфичные олигонуклеотидные праймеры или зонды, содержащие примерно 10 или более смежных полинуклеотидов, соответствующих полинуклеотиду NtMRP. Указанные праймеры или зонды могут содержать или включать в себя примерно 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50 или более смежных полинуклеотидов, способных гибридизоваться (например, специфично гибридизоваться) с полинуклеотидом NtMRP. В некоторых воплощениях праймеры или зонды могут содержать или включать в себя примерно 10-50 смежных нуклеотидов, примерно 10-40 смежных нуклеотидов, примерно 10-30 смежных нуклеотидов или примерно 15-30 смежных нуклеотидов, которые можно
использовать в последовательность-зависимых методах
идентификации генов (таких как саузерн-гибридизация), или
выделения генов (таких как гибридизация in situ бактериальных
колоний или бактериофагальных бляшек) или детекции генов (таких
как амплификация или детекция полинуклеотида с использованием
одного или нескольких праймеров). Можно сконструировать один
или несколько специфичных праймеров или зондов и использовать
их для амплификации или детекции полноразмерного полинуклеотида
NtMRP или его части. В конкретном примере амплификацию
полинуклеотидного фрагмента, кодирующего полинуклеотид NtMRP,
такой как ДНК или РНК, осуществляют методом полимеразной цепной
реакции с использованием двух праймеров. Полимеразную цепную
реакцию также можно проводить с использованием одного праймера,
полученного из полинуклеотидной последовательности NtMRP, и
второго праймера, способного гибридизоваться с
последовательностями, расположенными выше и ниже
последовательности полинуклеотида NtMRP, включающими в себя промоторную последовательность NtMRP, 3'-конец предшественника мРНК или последовательность, входящую в состав вектора. Примеры термических и изотермических методов амплификации полинуклеотидов in vitro хорошо известны в данной области. Образец может представлять собой растение, растительную клетку или растительный материал, или он может быть получен из них, или образец может представлять собой продукт, изготовленный или полученный из растения, растительной клетки или растительного материала, как описано в данном документе.
Таким образом, в другом аспекте изобретение предлагает способ детекции полинуклеотида NtMRP в образце, включающий в себя следующие стадии: (а) получение образца, содержащего, или предположительно содержащего полинуклеотид; (Ь) приведение указанного образца в контакт с одним или несколькими праймерами, или одним или несколькими зондами с целью специфичной детекции, по меньшей мере, части полинуклеотида NtMRP; и (с) детекция присутствия продукта амплификации, где присутствие продукта амплификации указывает на присутствие полинуклеотида NtMRP в образце. В следующем аспекте изобретение
также предлагает применение одного или нескольких праймеров или
зондов для специфической детекции, по меньшей мере, части
полинуклеотида NtMRP. Изобретение также предлагает наборы для
детекции, по меньшей мере, части полинуклеотида NtMRP, которые
содержат один или несколько праймеров или зондов для
специфической детекции, по меньшей мере, части полинуклеотида
NtMRP. Набор может содержать реагенты для амплификации
полинуклеотидов, например, методом полимеразной цепной реакции
(ПЦР), или реагенты для методов детекции с применением
гибридизации полинуклеотидных зондов, таких как саузерн-
блоттинг, нозерн-блоттинг, гибридизация in situ, или микрочипы.
Набор может содержать реагенты для методов детекции с
применением связывания антител, таких как вестерн-блоттинг,
ELISA, масс-спектрометрия SELDI или применение индикаторных
полосок. Набор может содержать реагенты для секвенирования ДНК.
Набор может содержать реагенты и/или инструкции для определения
содержания тяжелых металлов, таких как кадмий. В некоторых
воплощениях набор может содержать инструкции по проведению
одного или нескольких из описанных способов. Описанные наборы
можно использовать для определения генетической идентичности,
филогенетических исследований, генотипирования,
гаплотипирования, анализа происхождения или селекции растений, в частности, наряду с оценкой содоминирования.
Настоящее описание также предлагает способ генотипирования
растения, растительной клетки или растительного материала,
содержащих полинуклеотид NtMRP. Генотипирование предоставляет
средства идентификации гомологов пары хромосом и может
использоваться для выявления сегрегантов в популяции растений.
Методы на основе применения молекулярных маркеров можно
использовать для филогенетических исследований, характеристики
генетических взаимоотношений среди разновидностей
сельскохозяйственной культуры, идентификации гибридов, полученных в результате скрещиваний, или соматических гибридов, локализации сегментов хромосом, влияющих на моногенетические признаки, клонирования на основе картирования и анализа наследования количественных признаков. В конкретном способе
генотипирования можно использовать любое число аналитических
методов, основанных на применении молекулярных маркеров, таких
как амплификация полиморфизмов длин фрагментов (AFLP). AFLP
возникают в результате аллельных различий среди фрагментов
амплификация, обусловленных вариабельностью нуклеотидных
последовательностей. Таким образом, изобретение описывает
способы сегрегации NtMRP, а также хромосомных
последовательностей, генетически связанных с указанными генами или полинуклеотидами, с использованием таких методов, как анализ AFLP.
Далее изобретение описывается со ссылкой на нижеследующие примеры, которые не предназначаются для ограничения объема изобретения, определенного в формуле изобретения.
Примеры
Нижеследующие примеры приведены для иллюстрации, но не для ограничения. Если не указано иначе, используются традиционные методы и способы молекулярной биологии, биологии растений, биоинформатики и селекции растений.
Пример 1: Идентификация геномной последовательности ДНК NtMRP3
Библиотека ВАС табака. Библиотеку бактериальных искусственных хромосом (ВАС) получают следующим способом: ядра выделяют из листьев выращенных в теплице растений разновидности Hicks Broad Leaf Nicotiana tabacum. Высокомолекулярную ДНК выделяют из ядер стандартными способами, частично расщепляют BamHI и HindiII и клонируют в участках BamHI или HindiII ВАС-вектора plNDIG05. Получают более 320000 клонов со средней длиной вставки 135 миллионов пар оснований, что перекрывает геном табака примерно в 9,7 раз.
Сборка последовательности генома табака. Большое число случайно выбранных клонов ВАС подвергают секвенированию методом Сэнджера, получая более 1780000 неочищенных последовательностей со средней длиной 550 пар оснований. Метиловую фильтрацию используют для трансформации штамма Mcr+ Escherichia coli и выделения только гипометилированной ДНК. Сборку всех последовательностей осуществляют с помощью программы для сборки
генома CELERA, получая более 800000 последовательностей, включающих в себя более 200000 контигов и 596970 отдельных последовательностей. Размер контигов варьирует от 120 до 15300 пар оснований со средней длиной 1100 пар оснований.
Геномную последовательность ДНК NtMRP3 идентифицируют путем секвенирования ВАС-содержащей части генома, которая включает в себя ДНК NtMRP3. Последовательность приведена на фигуре б.
Пример 2: Трансформация разновидностей табака векторами экспрессии, содержащими РНКи NtMRP3
Семена табака стерилизуют и проращивают в чашке Петри, содержащей основную среду MS, дополненную 5 мл/л смеси растительных консервантов (РРМ). Проростки, полученные примерно через 7-10 дней после прорастания семян, используют для трансформации разными векторами экспрессии, содержащими РНКи NtMRP3. Отдельную колонию Agrobacterium tumefaciens LBA4404 вносят в жидкую среду LB, содержащую 50 мг/л канамицина (моносульфата канамицина), и инкубируют в течение 48 ч при 28°С и возвратно-поступательном встряхивании (150 циклов/мин). Культивированные клетки собирают центрифугированием (6000xg, 10 мин) и суспендируют до получения конечной плотности 0,4-0,7 OD60o в 2 0 мл жидкой среды MS, содержащей 2 0 г/л сахарозы. Эксплантаты рассады возрастом 7-10 дней погружают в суспензию бактерий на 5 мин и затем их промокают стерильной фильтровальной бумагой. Пятьдесят эксплантатов помещают в аликвоты среды для агара REG объемом 4 0 мл (основная среда MS, содержащая 0,1 мг/л 1-нафталинуксусной кислоты (NAA) и 1 мг/л бензиламинопурина (ВАР)) в чашках Петри размером 100 мм * 2 0 мм. Эксплантаты культивируют совместно с Agrobacterium при 25°С. После совместного культивирования в течение 3 дней эксплантаты промывают и переносят в среду RCPK (среда REG, содержащая 100 мг/л канамицина, 500 мг/л карбенициллина и 5 мл РРМ) для селекции трансформантов. Эксплантаты субкультивируют каждые 2 недели. После выращивания в селективных условиях в течение 8-12 недель выжившие растения, представляющие собой трансформанты, содержащие интегрированные в их геномы
экспрессионные конструкции РНКи NtMRP3, переносят в среду для образования корневой системы (основная среда MS, содержащая 100 мг/л канамицина). Пустившие корни растения переносят в горшки для дальнейшего выращивания.
Пример 3: Экспрессия полинуклеотида NtMRP3 в растениях табака
Чтобы определить экспрессию полинуклеотида NtMRP3, общую клеточную РНК выделяют из разных частей растений. Общую РНК выделяют, используя реагент TRI(r) (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) . Чтобы удалить примеси ДНК, очищенную РНК обрабатывают не содержащей РНКазы ДНКазой (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX) . Чтобы синтезировать первую цепь кДНК, примерно 10 мкг общей РНК подвергают обратной транскрипции с использованием набора High Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Чтобы измерить уровень транскриптов NtMRP3 в образцах, проводят количественную 2-стадийную ПЦР с обратной транскриптазой в соответствии с методом, основанным на применении зонда Taqman MGB. Смесь для проведения обратной транскрипции содержит 4 мкМ смеси dNTP, 1х рассеянные праймеры, 1х буфер для обратной транскрипции, 10 г кДНК, 50 ед. обратной транскриптазы MultiScribe (Applied Biosystems), 2 ед. ингибитора РНКазы Superase-In (Ambion) и не содержащую нуклеазу воду. Смесь для ПЦР содержит 1х универсальную основную смесь для ПЦР Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA) , 400 нМ прямой праймер, 4 00 нМ обратный праймер, 2 50 нМ зонд Taqman MGB, 2 нг кДНК, и не содержащую нуклеазу воду. ПЦР с обратной транскриптазой проводят с использованием системы ABI 7500, работающей в режиме реального времени (Applied Biosystems, Foster City, CA) , и следующие условия амплификации: 50°С в течение 2 мин; 95°С в течение 10 мин; 40 циклов при 95°С в течение 15 сек.; и 60°С в течение 1 мин.
Пример 4: Сайленсинг экспрессии полинуклеотида NtMRP3 в растениях табака
Первая частичная последовательность, кодирующая
предполагаемую транскрипцию NtMRP3, обнаружена с использованием
аннотаций Tobacco Genome Initiative (TGI). На основе данной конкретной последовательности получают праймеры, обеспечивающие сайленсинг экспрессии полинуклеотида NtMRP3 в растениях табака посредством механизма РНКи. Соответствующую последовательность РНКи NtMRP3 амплифицируют методом ПЦР с обратной транскриптазой, используя в качестве матрицы кДНК, и затем вставляют ее в вектор Gateway pB7GWIWG2(II) при посредстве исходного вектора, в точности следуя инструкциям производителя (Invitrogen). Указанный вектор содержит промотор (промотор вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S), обеспечивающий конститутивную экспрессию трансгена во всех тканях растения, и ген bar для селекции по устойчивости к гербициду с использованием Basta на планшетах с агаром (30 мг/мл). Затем конструкцию вставляют в геном табака Берлей KY14, используя Agrobacterium tumefasciens и классическую процедуру листового диска. Каллюсы регенерируют с получением отдельных линий, которые подвергают селекции по Basta. Затем идентифицируют линии с сайленсингом РНКи, используя метод ПЦР с обратной транскриптазой, и выращивают их для получения семян. Семена Т1 собирают, снова выращивают на Basta-содержащих агарных планшетах для проведения селекции, после чего устойчивые растения выращивают на плавающих лотках и затем культивируют на поле.
Примерно 500 мг растения взвешивают и обрабатывают 10 мл концентрированной HNO3, используя в качестве реакционной системы систему расщепления 5 с ускорением под действием микроволнового облучения (СЕМ corporation, Mathews, NC) . Концентрации тяжелых металлов определяют методом масс-спектрофотометрии с индуктивно сопряженной плазмой ("ICP-MS", Agilent 7500А; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). В качестве нетрансгенного контрольного табака в сравнимых условиях получают образец, состоящий из листьев табака Вирджиния, СТА-VTL-2 сертифицированных в Польше.
Пример 5: Идентификация геномной последовательности ДНК NtMRP4
Геномную последовательность ДНК NtMRP4 идентифицируют
путем секвенирования ВАС-содержащей части генома, которая включает в себя ДНК NtMRP4. Последовательность приведена на фигуре 1.
Пример 6: Трансформация разновидностей табака векторами экспрессии, содержащими РНКи NtMRP4
Семена табака стерилизуют и проращивают в чашке Петри, содержащей основную среду MS, дополненную 5 мл/л смеси растительных консервантов (РРМ). Проростки, полученные примерно через 7-10 дней после прорастания семян, используют для трансформации разными векторами экспрессии, содержащими РНКи NtMRP4. Отдельную колонию Agrobacterium tumefaciens LBA4404 вносят в жидкую среду LB, содержащую 50 мг/л канамицина
(моносульфата канамицина), и инкубируют в течение 4 8 ч при 2 8°С и возвратно-поступательном встряхивании (150 циклов/мин). Культивированные клетки собирают центрифугированием (бОООхд, 10 мин) и суспендируют до получения конечной плотности 0,4-0,7 OD60o в 2 0 мл жидкой среды MS, содержащей 2 0 г/л сахарозы. Эксплантаты рассады возрастом 7-10 дней погружают в суспензию бактерий на 5 мин и затем промокают стерильной фильтровальной бумагой. Пятьдесят эксплантатов помещают в аликвоты среды для агара REG объемом 40 мл (основная среда MS, содержащая 0,1 мг/л 1-нафталинуксусной кислоты (NAA) и 1 мг/л бензиламинопурина
(ВАР) ) в чашках Петри размером 100 мм х 20 мм. Эксплантаты культивируют совместно с Agrobacterium при 25°С. После совместного культивирования в течение 3 дней эксплантаты промывают и переносят в среду RCPK (среда REG, содержащая 100 мг/л канамицина, 500 мг/л карбенициллина и 5 мл РРМ) для селекции трансформантов. Эксплантаты субкультивируют каждые 2 недели. После выращивания в селективных условиях в течение 8-12 недель выжившие растения, представляющие собой трансформанты, содержащие интегрированные в их геномы экспрессионные конструкции РНКи NtMRP4, переносят в среду для образования корневой системы (основная среда MS, содержащая 100 мг/л канамицина). Пустившие корни растения переносят в горшки для дальнейшего выращивания.
Пример 7: Экспрессия полинуклеотида NtMRP4 в растениях табака
Чтобы определить экспрессию полинуклеотида NtMRP4, общую клеточную РНК выделяют из разных частей растений. Общую РНК выделяют, используя реагент TRI(r) (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО) . Чтобы удалить примеси ДНК, очищенную РНК обрабатывают не содержащей РНКазы ДНКазой (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX). Чтобы синтезировать первую цепь кДНК, примерно 10 мкг общей РНК подвергают обратной транскрипции с использованием набора High Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Чтобы измерить уровень транскриптов NtMRP4 в образцах, проводят количественную 2-стадийную ПЦР с обратной транскриптазой в соответствии с методом, основанным на применении зонда Taqman MGB. Смесь для проведения обратной транскрипции содержит 4 мкМ смеси dNTP, 1х рассеянные праймеры, 1х буфер для обратной транскрипции, 10 г кДНК, 50 ед. обратной транскриптазы MultiScribe (Applied Biosystems), 2 ед. ингибитора РНКазы Superase-In (Ambion) и не содержащую нуклеазу воду. Смесь для ПЦР содержит 1х универсальную основную смесь для ПЦР Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA) , 400 нМ прямой праймер, 4 00 нМ обратный праймер, 2 50 нМ зонд Taqman MGB, 2 нг кДНК, и не содержащую нуклеазу воду. ПЦР с обратной транскриптазой проводят с использованием системы ABI 7500, работающей в режиме реального времени (Applied Biosystems, Foster City, CA) , и следующие условия амплификации: 50°С в течение 2 мин; 95°С в течение 10 мин; 40 циклов при 95°С в течение 15 сек.; и 60°С в течение 1 мин.
Метод ПЦР с обратной транскриптазой с использованием кДНК из лепестков, тычинок, пестиков, чашелистиков, коробочек, стеблей, листьев и корней показывает, что полинуклеотид NtMRP4 экспрессируется в тканях табака.
Если растения табака культивируют в гидропонном растворе, экспрессия полинуклеотида NtMRP4 подвергается небольшой повышающей регуляции под действием кадмия как в корнях, так и в листьях проростков N. Tabacum (TN90, см. фигуру 2) . Однако,
хотя обнаружено, что полинуклеотид NtMRP4 также индуцируется в листьях N. rustica, для корней N. rustica получены данные, противоположные данным, полученным для N. tabacum (понижающая регуляция), это позволяет предположить, что полинуклеотид NtMRP4 может играть роль в накоплении кадмия в корнях и в высокой толерантности к кадмию N. rustica.
Пример 8: Сайленсинг экспрессии полинуклеотида NtMRP4 в растениях табака
Первая частичная последовательность (CHO_SL.022xb24fl.abl), кодирующая предполагаемую транскрипцию NtMRP4, обнаружена с использованием аннотаций Tobacco Genome Initiative (TGI). На основе данной конкретной последовательности получают праймеры, обеспечивающие сайленсинг экспрессии полинуклеотида NtMRP4 в растениях табака посредством механизма РНКи (фигура 1) . Соответствующую последовательность РНКи NtMRP4 амплифицируют методом ПЦР с обратной транскриптазой, используя в качестве матрицы кДНК, и затем вставляют ее в вектор Gateway pB7GWIWG2(II) с помощью исходного вектора, в точности следуя инструкциям производителя (Invitrogen). Указанный вектор содержит промотор (промотор вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S), обеспечивающий конститутивную экспрессию трансгена во всех тканях растения, и ген bar для селекции по устойчивости к гербициду с использованием Basta на планшетах с агаром (30 мг/мл). Затем конструкцию вставляют в геном табака Берлей KY14, используя Agrobacterium tumefasciens и классическую процедуру листового диска. Каллюсы регенерируют с получением отдельных линий, которые подвергают селекции по Basta. Затем идентифицируют линии с сайленсингом РНКи, используя метод ПЦР с обратной транскриптазой, и выращивают их для получения семян. Фигура 3 демонстрирует, что сайленсинг NtMRP4 является эффективным в трансгенных линиях, включающих в себя линии 1 и 2. Семена Т1 собирают и снова выращивают на Basta-содержащих агарных планшетах для проведения селекции, после чего устойчивые растения выращивают на плавающих лотках и затем культивируют на поле.
Примерно 500 мг растения взвешивают и обрабатывают 10 мл
концентрированной HNO3, используя в качестве реакционной системы систему расщепления 5 с ускорением под действием микроволнового облучения (СЕМ corporation, Mathews, NC) . Концентрации тяжелых металлов определяют методом масс-спектрофотометрии с индуктивно сопряженной плазмой ("ICP-MS," Agilent 7500А; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). В качестве нетрансгенного контрольного табака в сравнимых условиях получают образец, состоящий из листьев табака Вирджиния, СТА-VTL-2 сертифицированных в Польше.
Фигура 4 демонстрирует уменьшение содержания кадмия в листьях примерно на 2 0% в двух тестируемых линиях, содержащих РНКи NtMRP4 (линии 1 и 2), после двух последовательных полевых экспериментов в течение двух последовательных лет. В каждом случае один эксперимент состоит из четырех независимых повторов 4 собранных растений (растение дикого типа, растения линий 1 и 2 и вектор-содержащее контрольное растение на второй год полевого эксперимента), рандомизированных в блоках. Кроме того, к блокам добавляют контрольные образцы, чтобы контролировать территориальные тенденции. Анализы линий, содержащих РНКи NtMRP4, демонстрируют сильное статистически значимое уменьшение среднего уровня кадмия.
Пример 9: Анализ высоты и массы растений, полученных из растений табака с сайленсингом экспрессии полинуклеотида NtMRP4.
Высота и масса линий с сайленсингом NtMRP4 немного
изменяется по сравнению с контрольными растениями. Однако
отсутствуют значительные различия в сухих собранных листьях
растений, содержащих РНКи NtMRP4, и растений дикого типа или
вектор-содержащих контрольных растений, свидетельствуя о том,
что деградация транскриптов NtMRP4 статистически значимого
влияния на сухую биомассу. Полученные результаты подтверждают в
другом полевом эксперименте, демонстрирующем, что
сверхэкспрессия AtMRP4 (гомологичного полинуклеотиду NtMRP4) в том же табачном фоне (KY14) приводит к увеличению накопления кадмия в листьях на 10-30% (в зависимости от трансгенных линий). Очевидно, что деградация мРНК, кодирующей белок NtMRP4,
значительно снижает уровень кадмия в листьях табака.
Пример 10: Идентификация EMS-индуцированных мутантов по NtMRP4
Библиотеку ДНК получают с использованием растений
Nicotiana tabacum, подвергавшихся воздействию
этилметансульфоната (EMS) с последующим скринингом на мутанты по экзону 1 и экзону 2 полинуклеотида NtMRP4 методом секвенирования соответствующей части гена NtMRP4 отдельных растений.
Для секвенирования экзона 1 используют NtMRP4ExonlFW (5'-CATCTCCTTACGAAGGATACTACC-3') и NtMRP4Exonl REV (5-GCTGCAAGCTCTCCTTTTCTAA-3'), а для секвенирования экзона 2 используют NtMRP4Exon2FW (5'-GTGCAATCTGGCAAATATAGTGAG-3') и NtMRP4Exon2REV (5'-AAAATGACATAGGAGCATGCAGTA-3'). Обзор всех мутаций, обнаруженных в экзоне 1 и в экзоне 2 полинуклеотида NtMRP4, приведен в таблице 1. Указаны исходный кодон (кодон ori) и мутантный кодон (кодон mut), а также исходная аминокислота (AS ori) и замещающая ее аминокислота (AS mut), или стоп-кодон.
Пример 11: Схема исследования для выбора участков-мишеней нуклеазы цинковые пальцы
В данном примере показано, как проводить исследование гена NtMRP4 путем анализа встречаемости уникальных участков-мишеней в заданной генной последовательности по сравнению с конкретной геномной базой данных с целью разработки средств для модификации экспрессии гена. Участки-мишени, идентифицированные с помощью способов настоящего изобретения, включают в себя описанные ниже мотивы последовательностей, причем применение всех указанных участков или мотивов для модификации соответствующей генной последовательности растения, такого как табак, входит в объем изобретения. Алгоритм поиска
Разработана компьютерная программа, позволяющая проводить скрининг введенной запрашиваемой (целевой) нуклеотидной последовательности по встречаемости двух мотивов фиксированной
длины подпоследовательности ДНК, разделенных спейсером
определенного размера, с использованием подстрочной матрицы в
базе данных ДНК, такой как, например, последовательность генома
табака, собранная в примере 1. Для конструирования подстрочной
матрицы и поиска используют открытый источник libdivsufsort
library-2.О.О (http://code.google.eom/р/libdivsufsort / ) ,
который трансформирует любую введенную последовательность по методу Бурроу-Виллера. Программа сканирует полноразмерную введенную (целевую) нуклеотидную последовательность и возвращает все сочетания подпоследовательностей, встречающиеся менее определенного числа раз, в выбранную базу данных ДНК.
Выбор целевого участка запрашиваемой последовательности для мутагенеза, опосредованного нуклеазой цинковые пальцы.
ДНК-связывающий домен цинковых пальцев распознает нуклеотидную последовательность из трех пар оснований. Нуклеаза цинковые пальцы включает в себя белок цинковые пальцы, содержащий один, два, три, четыре, пять, шесть или более ДНК-связывающих доменов цинковых пальцев, и неспецифичную нуклеазу, такую как фермент рестрикции IIS. Нуклеазу цинковые пальцы можно использовать для введения двухцепочечного разрыва в целевую последовательность. Для введения двухцепочечного разрыва требуется пара нуклеаз цинковые пальцы, одна из которых связывается с плюс- (верхней) цепью целевой последовательности, а вторая с минус- (нижней) цепью той же целевой последовательности, разделенными 0, 1, 2, 3, 4, 5, б или более нуклеотидами. Путем применения множественного числа 3 для каждого из двух мотивов подпоследовательности ДНК, программу можно использовать для идентификации двух участков-мишеней белка цинковые пальцы, разделенных спейсером заданной длины.
Входные данные для программы:
1. Целевая запрашиваемая последовательность ДНК
2. База данных ДНК, по которой предполагается проводить
поиск
3. Фиксированный размер первого мотива последовательности
ДНК
4. Фиксированный размер спейсера
5. Фиксированный размер второго мотива последовательности
ДНК
6. Пороговое число встречаемости сочетания входных данных 3 и 5, разделенных входными данными 4, в выбранной базе данных ДНК, составляющей входные данные 2
Выходные данные программы:
Список нуклеотидных последовательностей, где для каждой
последовательности указано значение встречаемости
последовательности в базе данных ДНК при максимальном значении пороговых входных данных б.
Пример 12: Профилирование экспрессии транскриптов NtMRP3 и NtMRP4 в табаке
Разработка и анализ ExonArray табака. Используя клоны ВАС, полученные по способу примера 1, идентифицируют 2 72 342 экзона путем объединения и сравнения библиотеки маркеров экспрессируемых последовательностей табака и метил-фильтрованных последовательностей, полученных в результате секвенирования ВАС. Для каждого из указанных экзонов конструируют четыре олигонуклеотида размером 2 5 мер, которые используют для конструирования ExonArray табака. ExonArray конструируют в Affymetrix (Santa Clara, USA), используя стандартные методы.
Экспрессия NtMRP3 и NtMRP4 в табаке. РНК выделяют из видов Nicotiana, выращенных на Cd+ (загрязненных Cd) и Cd-(дефицитных по Cd) почвах, и анализируют с помощью стандартных методов гибридизации и аналитических средств. Профилирование экспрессии проводят, чтобы идентифицировать набор генов, связанный с накоплением Cd, и определить влияние почвенного Cd на изменение содержания транскриптов NtMRP3 и NtMRP4. Используемые зонды NtMRP3 и NtMRP4 расположены в первом и последнем экзонах, а также в участке 3'UTR. Результаты, приведенные в таблице 2, показывают, что листья растений N. tabacum, выращенных в загрязненной Cd почве, накапливают больше Cd, чем листья растений N. Rustica, выращенных в такой же почве. Корни растений N. tabacum накапливают меньше Cd, чем корни растений N. rustica. Интересно, что ни NtMRP3, ни NtMRP4
не регулируются Cd, однако их экспрессия различается в двух видах Nicotiana, позволяя предположить, что оба гена по-разному управляют поглощением, перемещением и накоплением Cd в видах Nicotiana (результаты приведены в виде log 2, соответствующего среднему значению от трех биологичесских повторов). В качестве контроля показана экспрессия трех внутренних генов (UBP12, экзонов 1 и 2), а-тубулина и рибосомального белка S16.
Любая публикация, цитированная или описанная здесь, предлагает соответствующую информацию, раскрытую до даты подачи настоящей заявки. Приведенные здесь высказывания не следует понимать, как допущение, что авторы изобретения управомочены относить к более ранней дате такие описания. Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в данный документ в качестве ссылки. Специалисты в данной области могут осуществить разные модификации и вариации, не отступая от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение описано со ссылкой на конкретные предпочтительные воплощения, следует понимать, что заявляемое изобретение не должно ограничиваться такими конкретными воплощениями ненадлежащим образом. Действительно, предполагается, что разные модификации описанных вариантов осуществления изобретения, очевидные для специалистов в области клеточной биологии, молекулярной биологии и биологии растений, или в родственных областях, входят в объем приведенной ниже формулы изобретения.
Экзон 1
NtMRP4-l
attgaatcttt
cgcgagtccga
uuc
phe
uuu
phe
Экзон 1
NtMRP4-l
aatctttccgc
agtccgagt
gag
glu
aag
lys
Экзон 1
NtMRP4-l
agtacggatg
ttgtccaagtt
ugg
trp
uga
stop
Экзон 1
NtMRP4-l
agttcttgtact
aatagctggt
uca
ser
uua
leu
Экзон 1
NtMRP4-l
cattgtcttgt
gagcactcct
ugg
trp
uag
stop
Экзон 1
NtMRP4-l
ttgtcttgtg
agcactcctc
ugg
trp
uga
stop
Экзон 1
NtMRP4-l
tggagcactc
tcttctagt
ecu
pro
cuu
leu
Экзон 1
NtMRP4-l
tcttctagttg
tacgctcactt
gcu
ala
guu
val
Экзон 1
NtMRP4-l
atcccgcttg
cgcaggaaca
gcg
ala
acg
thr
Экзон 1
NtMRP4-l
atcccgcttg
cgcaggaaca
gug
val
aug
met
Экзон 1
NtMRP4-l
gaaccgatca
ggctttccct
agg
arg
aag
lys
Экзон 1
NtMRP4-l
aaccgatcag
gctttccctc
agg
arg
aga
arg
Экзон 1
NtMRP4-l
catgatctca
tttcacaagca
cuu
leu
uuu
cys
Экзон 1
NtMRP4-l
atctcttgata
attggacaaat
aga
arg
aaa
lys
Экзон 2
NtMRP4-2
tattagaagct
gaatggatttt
gga
gly
aga
arg
Экзон 2
NtMRP4-2
ttcaccgcga
atctctcttc
аса
thr
aua
ile
Экзон 2
NtMRP4-2
aaacaaccaaa
agagcaatgc
gag
gly
aag
lys
Экзон 2
NtMRP4-2
ccttgaagaat
aaaatcttctc
uca
ser
uua
leu
Экзон 2
NtMRP4-2
agaatcaaaat
ttctcgaagat
ucu
ser
uuu
phe
Экзон 2
NtMRP4-2
tatctaaggaa
aaaacggaga
gaa
glu
aaa
lys
Экзон 2
NtMRP4-2
tcaacagtcta
atctga
аса
thr
aua
ile
Экзон 2
NtMRP4-2
atctgatagg
gggattctaaa
ggg
gly
agg
arg
Экзон 2
NtMRP4-2
acttataaag
aagaagaaag
gaa
glu
aaa
lys
Экзон 2
NtMRP4-2
aacttataaag
aagaagaaag
gaa
glu
aaa
lys
Экзон 2
NtMRP4-2
aaggaagaa
aaagagaaactg
gaa
glu
aaa
lys
Экзон 2
NtMRP4-2
gctatatatta
tgaagcttttg
acu
thr
auu
ile
Экзон 2
NtMRP4-2
gctatatatta
tgaagcttttg
acu
thr
auu
ile
Экзон 2
NtMRP4-2
gaagcttttg
atggtgggg
gga
gly
gaa
glu
Экзон 2
NtMRP4-2
ttggatggtg
ggcgtagtgct
ugg
trp
uga
stop
Экзон 2
NtMRP4-2
ttgtggcaaa
ttctctaatg
agu
ser
aau
asn
Экзон 2
NtMRP4-2
gttctctaat
gcaagtga
aug
leu
aua
leu
Экзон 2
NtMRP4-2
gcaaagttct
taatggcaag
cua
leu
uua
leu
Экзон 2
NtMRP4-2
tattggctg
catatgaaac
gca
ala
аса
thr
Экзон 2
NtMRP4-2
caacaaatga
atgcttaatt
gag
glu
gaa
glu
Экзон 2
NtMRP4-2
cttcagcrgay
gtgccatgtcct
cgu
arg
ugu
cys
Экзон 2
NtMRP4-2
tgtccttcaat
cttctctgtt
ecu
pro
ucu
ser
Экзон 2
NtMRP4-2
ggcatgggaa
aacattttaa
gaa
glu
aaa
lys
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (затенение показывает расположение экзонов)
SEQ ID No. 1 (последовательность ДНК NtMRP4, содержащая 5'- и З'-UTR)
atggatatgaggaacagtatgtcttcagaatcttgtttagcatcactttcttgttctgc
ctccacatttcaatcgtcagaggattcagcagttgttaaatggttaagattcattttcct
ctctccatgtccacaaaggactcttctatcttccattgatgtgctgcttttgcttacttt
cattgtatttgcagtacaaaagttgtactcaaagttgaggtccaatgagcactctacttc
tagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacttctgttagaaccaatctttggtt
taagctgtctctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcatttt
ggttattgtgggaaattcccagtcgccttggaaagtcatagatggactgtattggttgtt
tcaggcgattacacatgttgtaatcactatactaatagttcatgagaaaagatttcacgc
tatttcccatccactgtccctgcgcgtgttttggattgcaaactttgtagttatgagttt
gttctttggttgtgggatcacaaggcttgtgtcacttaaggaaattgatcctaatttaag
aatggatgatataagttcattagtttcatttcctatttctgttgttctcttcattgttgc
cattaaaggttcgaccggagttgctgtaattagtgattctgaatctcacttaagtgatga
aaccaatggttatgaactcctggataaatccagtgtgagtggctttgcttcagcttctct
aatatcgaaagccttttggatttggatgaaccctttactgcaaaaaggttacaagtcacc
tctcaagattgatgaagttccttcactttccccactgcatagagcagagaaaatgtctca
acttttcgaaagaaattggcctaaacctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaac
attgctgcgttgcttttggaaggaagttatttttactgccattcttgcagtaattagggt
atgtgttatgtatgtagggccaacactcatacaaagatttgttgattacacagcaggaaa
gaggacatctccttatgaaggatactaccttataggaactctcctaatagccaaatttgt
ggaagttctaacctctcatcagttcaactttaactcccaaaagcttggcatgcttattcg
agcgacacttctcacttctttgtataagaaggggttaaggttgtcatgctcagctagaca
ggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgctcagcagctgtccga
tatgatgctacagctacattccatttggctcatgccattgcaagtttctgtggctttagg
catcctttatacttacctcggtgcttcaactgttgtaacgctagctggacttgcagcagt
gatggtatttgtggtgtttggaactaaaagaaacaacaggtttcaatttaacatcatgaa
gaatcgtgattctagaatgaaagcgacaaatgagatgcttaattatatgcgcgttataaa
gttccaggcatgggaagaacattttaacaaaagaattgaatccttccgcgaatccgagta
tggatggttgtccaagttcttgtactcaatcgctgggaatatcattgtcttgtggagcac
tcctcttctagtggctacactcacttttggaagtgcaatcttgttgggaatcccgcttgg
tgcagggacagtgttcactgcaacatctctcttcaagatgttgcaggaaccgatcagggc
tttccctcaatccatgatctcactttcacaagcaatgatatctcttgatagattggacaa
atatatgatgagtaaggagttagtggataaagctgtggaaagactagaaggttgtggggg
tacaattgctatgcaggtgaaagatggagctttttgctgggatgatgaaaacagtaaaga
agaattgaaaaatgtaaactttgagattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggac
agttggggcggggaagtcttccctccttgcatctgtacttggtgagatgcacaagttgtc
gggtcaggtatggctctcatccttctgtttgtttgattaatacaaactttgctgccaatt
accttttgccccttgttgctacctcttttctgtggtataaaaaattaatgtaggctaatg
tgtagagtggaggtattatatgcagaacaattgcaatcaagcaattacctgtgagatact
attttgttttcatattagtggactggtacattctcattggtgtatcgtttgatctccacc
aaagcagaggttttactggccgacagagtcaaactactgtgcttcactccttttactcca
atccttagtagtctttgcttctaatgaacttcaagcgtgtaatagaaacaccattatatt
attagctgattagttactttacaattccagagcatatttacattttctgcttggttgtct
attactctggataacagtcctaaatgcaagcaaaatcaactgtgttttcagtcttgagct
gaccaattagttcatgatgtcctcagcttgtccaagctggtgcctcaccggaattatgtg
ggaccttcgtacttaatcaactagttcaccttcttcttaaaaatattgaatgatttgatt
ggttaatagttccttaaatgtagtaattatttgctaacttactttaccaaccccttgtcc
aacaggtcacaatttgtggttcaactgcctatgttgcacaaacatcgtggattcagaatg
gcacgatacaagaaaatatcctgtttggtatgccaatgaacagagacagatacaaggaag
tgatccgggtttgctgcttggagaaggacttggaaataatggagtttggagaccagactg
aaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggtcagaagcagcgaatccagcttgcaa
gagctgtttaccaggactgtgatatttatcttctagatgatgtattcagtgcagttgatg
ctcacactggctctgaaatcttcaaggttagaagtccacaatgtcatgtgtcattgaaga
tttaatttaagatagaaattacattgtttcattctgcaaattatggacctatcagagaaa
aatcatggattttgaatggctactttccccagtgaagacacatatcatttcctgggagga
agatgtgaaagtggcaagctatttactccaaaaagtataatctaaaagacttttattaag tttggaaggcttaatccatcatttgttatctgttgtctacttgtctttattaaaattctt cttagtccaatcactttcgatgaagttgactagtcttagtcacctgaatactttaaatct ttgccttggtgtctctatattttcagccatctcaattccgaagctcatatttgttttctc tttgtaatgtccatctgaaagtttcatgcttttttgcaggaatgtgtgaggggaattctt aaagataaaaccattttgcttgtcacacaccaagttgacttcttgcataatgttgacctg atccttgtaagtttcagagtgttttatcaacccctttggaaccaagtgtcaagagtagtg tttcttggttgttaaatgattcacatgtgtgttggtttctataaaacctgaactttatgt tttatcagagtgttttgctttcttgaaggtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctgg caaatataatgagatattagaagctggaatggattttaaagagctagtagctgcacatga gacctctttagaacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccttgaaga atcaaaatcttctcgaagattatctaaggaagaaaacggagatgataaatctcaacagtc tacatctgataggggggattctaaacttataaaggaagaagaaagagaaactggaaaagt cagtcctcgtgtgtacaagctatatattactgaagcttttggatggtggggtgtagtgct agttatcttgttttcgttcttgtggcaaagttctctaatggcaagtgattattggctggc atatgaaacttcagcggatcgtgccatgtccttcaatccttctctgtttattgggatata cggtgttattgcagttgtttcttcgttgctgatagtgatcaggatgtattttgtgacact tatggggctcaagactgcccaaatatttttcggacagattctttacagcatactgcatgc tcctatgtcattttttgacacaacaccttccggaagaattctgagtcgggtaaatttctg aggacaagtttttccttttgcatgtaaattcaaactttgctgcttagatgattaaataat gaaaaatatccattgcatgttttaatgtgtatgacatgttagaattttgaatagaagttc attcactgatgttgagatgttttgttttttttctgcaggcatctaatgatcagaccaaca ttgatgtcttcctcccgttttttatgaatctcactttggccatgtttatcacactgctcg gcatcatcatcatcacatgccaatattcttggcctaccgtactacttttgattcctctgg gttggcttaatatctggtaccgggtatgagcactgtttataacagccgtccttttttctt ttcttgtctgaactcaaatttgaatcctttgtttagaggcaattagtctgctctgagcat tttggctgacagttattatgtatattaaaaggcaacttttttattcgttctgtccagcta aaactttttacttaaaatgtggttaactgcatatttctgtgtctcctattttttgattat ttgcaactctgatcaatctagatttggggaaggcttgttgttagttgatgactagatact aagctcacatctacattggttgcaagtagaattttcaagttgtcattcacttatattgtt tgaactaggagattagcattcttctgcaaggagccctgaatgcttgaaaagttaaacaga aaagaaaaagttcagggcagatagacataatgtgttaaagtaattcaattggagcacaga tatatgacatgtgttatttgggagctacgaaaaagataaggactattatgtagactacaa ttgaaataacaggtaattcatttctggtttacagggatattatcttgcaacatctcgtga attgactcggcttgactcaattacaaaagcacctgttattcatcatttctctgaaagcat ctcaggtgttatgactatacgttgctttaggaagcaggagatgttttgtaacgagaatgt aaaccgagtgaattccaatctgcgaatggatttccacaacaatggatccaatgaatggtt gggctttcgactggaattgatgggaagcttacttctttgtgtttctgcaatgttcatgat tgtcttacctagcagcatcatcaagccaggtataacaccgtccaatgctcatttatggga attataaattctagtatttgataatccttctgtactttagatctacctgctctactgaaa aatgaaatgagtatgaggaaatagaatatccgttgagcatttatgtctttctattaaaaa tttgcattctatcttcttgtttcaagtcaaaatcttgaacaactatatctagagaatttt ccttcttgtgaagtaatgcatatatacatcaagagaagtcagagttgctgaatgaaatag tagatcaaatttaagtgttgtgcctataaagaattgtatggtgagattgaatatagtggt catattattttctcaatcttagtgattaaagtattccatacaaacagacaagcatttagt cgtgcattcattggcactacaaaattatcaaccaagagtaatattctttcagctttcctc tgtatatgtgtgttctattctggagctgaagataactaatattcttttttatttctacag aaaatgttggtttgtcactatcatatggcttgtctcttaatagtgtcctattctggtcca tctttgtgagttgctttgtggaaaataaaatggtttctgtcgaaagattaaaacagttct cagaaataccatcagaagcagagtggagaaagatggattttctcccaccttcaagttggc caagccgtgggaatgttgagcttgaaaacgtgcaggtaataattctaactaattctgtgg ttgctatttgctagcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttcatagtaaggaagag agggtagctgtattaacaagcctacagattctttaatttcaaatatgttacgttgaatct ctatattgtttgttctactggtcaacaggttagatatcgtccgaacactcctctagtgct taaaggagttactctcagcattagagggggagagaagataggtgttgttggtcgtacagg gggtggaaaatcaacattaattcaagttttctttcgtttggtggagcctgcagctggaag aataatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttcatgatcttagatctcgctt cgggatcattccccaagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc cattggacaatattcagatgatgaaatttggaaggtaatctaacttgctgactgaaataa
tttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctgagtgctgaga tctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagca tatactccagtgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgca gagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattc accaggtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggttctttgcggaattatgcaacca actttttatgtgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggtaaatcata gttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat gttagccaagtagtagtaaatgcatga
SEQ ID No. 2 (последовательность ДНК NtMRP4, не содержащая 5'- и З'-UTR)
atggatatgaggaacagtatgtcttcagaatcttgtttagcatcactttcttgttctgc
ctccacatttcaatcgtcagaggattcagcagttgttaaatggttaagattcattttcct
ctctccatgtccacaaaggactcttctatcttccattgatgtgctgcttttgcttacttt
cattgtatttgcagtacaaaagttgtactcaaagttgaggtccaatgagcactctacttc
tagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacttctgttagaaccaatctttggtt
taagctgtctctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcatttt
ggttattgtgggaaattcccagtcgccttggaaagtcatagatggactgtattggttgtt
tcaggcgattacacatgttgtaatcactatactaatagttcatgagaaaagatttcacgc
tatttcccatccactgtccctgcgcgtgttttggattgcaaactttgtagttatgagttt
gttctttggttgtgggatcacaaggcttgtgtcacttaaggaaattgatcctaatttaag
aatggatgatataagttcattagtttcatttcctatttctgttgttctcttcattgttgc
cattaaaggttcgaccggagttgctgtaattagtgattctgaatctcacttaagtgatga
aaccaatggttatgaactcctggataaatccagtgtgagtggctttgcttcagcttctct
aatatcgaaagccttttggatttggatgaaccctttactgcaaaaaggttacaagtcacc
tctcaagattgatgaagttccttcactttccccactgcatagagcagagaaaatgtctca
acttttcgaaagaaattggcctaaacctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaac
attgctgcgttgcttttggaaggaagttatttttactgccattcttgcagtaattagggt
atgtgttatgtatgtagggccaacactcatacaaagatttgttgattacacagcaggaaa
gaggacatctccttatgaaggatactaccttataggaactctcctaatagccaaatttgt
ggaagttctaacctctcatcagttcaactttaactcccaaaagcttggcatgcttattcg
agcgacacttctcacttctttgtataagaaggggttaaggttgtcatgctcagctagaca
ggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgctcagcagctgtccga
tatgatgctacagctacattccatttggctcatgccattgcaagtttctgtggctttagg
catcctttatacttacctcggtgcttcaactgttgtaacgctagctggacttgcagcagt
gatggtatttgtggtgtttggaactaaaagaaacaacaggtttcaatttaacatcatgaa
gaatcgtgattctagaatgaaagcgacaaatgagatgcttaattatatgcgcgttataaa
gttccaggcatgggaagaacattttaacaaaagaattgaatccttccgcgaatccgagta
tggatggttgtccaagttcttgtactcaatcgctgggaatatcattgtcttgtggagcac
tcctcttctagtggctacactcacttttggaagtgcaatcttgttgggaatcccgcttgg
tgcagggacagtgttcactgcaacatctctcttcaagatgttgcaggaaccgatcagggc
tttccctcaatccatgatctcactttcacaagcaatgatatctcttgatagattggacaa
atatatgatgagtaaggagttagtggataaagctgtggaaagactagaaggttgtggggg
tacaattgctatgcaggtgaaagatggagctttttgctgggatgatgaaaacagtaaaga
agaattgaaaaatgtaaactttgagattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggac
agttggggcggggaagtcttccctccttgcatctgtacttggtgagatgcacaagttgtc
gggtcaggtatggctctcatccttctgtttgtttgattaatacaaactttgctgccaatt
accttttgccccttgttgctacctcttttctgtggtataaaaaattaatgtaggctaatg
tgtagagtggaggtattatatgcagaacaattgcaatcaagcaattacctgtgagatact
attttgttttcatattagtggactggtacattctcattggtgtatcgtttgatctccacc
aaagcagaggttttactggccgacagagtcaaactactgtgcttcactccttttactcca
atccttagtagtctttgcttctaatgaacttcaagcgtgtaatagaaacaccattatatt
attagctgattagttactttacaattccagagcatatttacattttctgcttggttgtct
attactctggataacagtcctaaatgcaagcaaaatcaactgtgttttcagtcttgagct gaccaattagttcatgatgtcctcagcttgtccaagctggtgcctcaccggaattatgtg ggaccttcgtacttaatcaactagttcaccttcttcttaaaaatattgaatgatttgatt ggttaatagttccttaaatgtagtaattatttgctaacttactttaccaaccccttgtcc aacaggtcacaatttgtggttcaactgcctatgttgcacaaacatcgtggattcagaatg gcacgatacaagaaaatatcctgtttggtatgccaatgaacagagacagatacaaggaag tgatccgggtttgctgcttggagaaggacttggaaataatggagtttggagaccagactg aaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggtcagaagcagcgaatccagcttgcaa gagctgtttaccaggactgtgatatttatcttctagatgatgtattcagtgcagttgatg ctcacactggctctgaaatcttcaaggttagaagtccacaatgtcatgtgtcattgaaga tttaatttaagatagaaattacattgtttcattctgcaaattatggacctatcagagaaa aatcatggattttgaatggctactttccccagtgaagacacatatcatttcctgggagga agatgtgaaagtggcaagctatttactccaaaaagtataatctaaaagacttttattaag tttggaaggcttaatccatcatttgttatctgttgtctacttgtctttattaaaattctt cttagtccaatcactttcgatgaagttgactagtcttagtcacctgaatactttaaatct ttgccttggtgtctctatattttcagccatctcaattccgaagctcatatttgttttctc tttgtaatgtccatctgaaagtttcatgcttttttgcaggaatgtgtgaggggaattctt aaagataaaaccattttgcttgtcacacaccaagttgacttcttgcataatgttgacctg atccttgtaagtttcagagtgttttatcaacccctttggaaccaagtgtcaagagtagtg tttcttggttgttaaatgattcacatgtgtgttggtttctataaaacctgaactttatgt tttatcagagtgttttgctttcttgaaggtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctgg caaatataatgagatattagaagctggaatggattttaaagagctagtagctgcacatga gacctctttagaacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccttgaaga atcaaaatcttctcgaagattatctaaggaagaaaacggagatgataaatctcaacagtc tacatctgataggggggattctaaacttataaaggaagaagaaagagaaactggaaaagt cagtcctcgtgtgtacaagctatatattactgaagcttttggatggtggggtgtagtgct agttatcttgttttcgttcttgtggcaaagttctctaatggcaagtgattattggctggc atatgaaacttcagcggatcgtgccatgtccttcaatccttctctgtttattgggatata cggtgttattgcagttgtttcttcgttgctgatagtgatcaggatgtattttgtgacact tatggggctcaagactgcccaaatatttttcggacagattctttacagcatactgcatgc tcctatgtcattttttgacacaacaccttccggaagaattctgagtcgggtaaatttctg aggacaagtttttccttttgcatgtaaattcaaactttgctgcttagatgattaaataat gaaaaatatccattgcatgttttaatgtgtatgacatgttagaattttgaatagaagttc attcactgatgttgagatgttttgttttttttctgcaggcatctaatgatcagaccaaca ttgatgtcttcctcccgttttttatgaatctcactttggccatgtttatcacactgctcg gcatcatcatcatcacatgccaatattcttggcctaccgtactacttttgattcctctgg gttggcttaatatctggtaccgggtatgagcactgtttataacagccgtccttttttctt ttcttgtctgaactcaaatttgaatcctttgtttagaggcaattagtctgctctgagcat tttggctgacagttattatgtatattaaaaggcaacttttttattcgttctgtccagcta aaactttttacttaaaatgtggttaactgcatatttctgtgtctcctattttttgattat ttgcaactctgatcaatctagatttggggaaggcttgttgttagttgatgactagatact aagctcacatctacattggttgcaagtagaattttcaagttgtcattcacttatattgtt tgaactaggagattagcattcttctgcaaggagccctgaatgcttgaaaagttaaacaga aaagaaaaagttcagggcagatagacataatgtgttaaagtaattcaattggagcacaga tatatgacatgtgttatttgggagctacgaaaaagataaggactattatgtagactacaa ttgaaataacaggtaattcatttctggtttacagggatattatcttgcaacatctcgtga attgactcggcttgactcaattacaaaagcacctgttattcatcatttctctgaaagcat ctcaggtgttatgactatacgttgctttaggaagcaggagatgttttgtaacgagaatgt aaaccgagtgaattccaatctgcgaatggatttccacaacaatggatccaatgaatggtt gggctttcgactggaattgatgggaagcttacttctttgtgtttctgcaatgttcatgat tgtcttacctagcagcatcatcaagccaggtataacaccgtccaatgctcatttatggga attataaattctagtatttgataatccttctgtactttagatctacctgctctactgaaa aatgaaatgagtatgaggaaatagaatatccgttgagcatttatgtctttctattaaaaa tttgcattctatcttcttgtttcaagtcaaaatcttgaacaactatatctagagaatttt ccttcttgtgaagtaatgcatatatacatcaagagaagtcagagttgctgaatgaaatag tagatcaaatttaagtgttgtgcctataaagaattgtatggtgagattgaatatagtggt catattattttctcaatcttagtgattaaagtattccatacaaacagacaagcatttagt cgtgcattcattggcactacaaaattatcaaccaagagtaatattctttcagctttcctc tgtatatgtgtgttctattctggagctgaagataactaatattcttttttatttctacag
aaaatgttggtttgtcactatcatatggcttgtctcttaatagtgtcctattctggtcca
tctttgtgagttgctttgtggaaaataaaatggtttctgtcgaaagattaaaacagttct
cagaaataccatcagaagcagagtggagaaagatggattttctcccaccttcaagttggc
caagccgtgggaatgttgagcttgaaaacgtgcaggtaataattctaactaattctgtgg
ttgctatttgctagcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttcatagtaaggaagag
agggtagctgtattaacaagcctacagattctttaatttcaaatatgttacgttgaatct
ctatattgtttgttctactggtcaacaggttagatatcgtccgaacactcctctagtgct
taaaggagttactctcagcattagagggggagagaagataggtgttgttggtcgtacagg
gggtggaaaatcaacattaattcaagttttctttcgtttggtggagcctgcagctggaag
aataatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttcatgatcttagatctcgctt
cgggatcattccccaagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc
cattggacaatattcagatgatgaaatttggaaggtaatctaacttgctgactgaaataa
tttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctgagtgctgaga
tctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagca
tatactccagtgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgca
gagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattc
accaggtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggttctttgcggaattatgcaacca
actttttatgtgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggtaaatcata
gttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga
gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca
cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc
agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca
ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta
tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat
gttagccaagtagtagtaaatgcagagtcattagcctatttgttttggattttgtgag
tttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatcccttgtttgtatagattg
ctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaagaatgta
aacatgcgtaatttgacctattatagcagattatttgtcttattttccaggtcgctgatt
ccacttattaggagtagttacacgtatttatcttttaagtgaaataatagtgtaaagttt
cttttggcactgtcggtgtaaagaagttaaactcctttctttaaccccggcatttcttat
tcatgcaggaatagcaaaagagtttgacaaaccatctcgtttgcttgaaaggccttcact
ttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgatcctctgagctctaac
SEQ ID NO: 3 (Интрон 1)
gtatggctctcatccttctgtttgtttgattaatacaaactttgctgccaattaccttttgccccttgttgctacct cttttctgtggtataaaaaattaatgtaggctaatgtgtagagtggaggtattatatgcagaacaattgcaatcaag caattacctgtgagatactattttgttttcatattagtggactggtacattctcattggtgtatcgtttgatctcca ccaaagcagaggttttactggccgacagagtcaaactactgtgcttcactccttttactccaatccttagtagtctt tgcttctaatgaacttcaagcgtgtaatagaaacaccattatattattagctgattagttactttacaattccagag catatttacattttctgcttggttgtctattactctggataacagtcctaaatgcaagcaaaatcaactgtgttttc agtcttgagctgaccaattagttcatgatgtcctcagcttgtccaagctggtgcctcaccggaattatgtgggacct tcgtacttaatcaactagttcaccttcttcttaaaaatattgaatgatttgattggttaatagttccttaaatgtag taattatttgctaacttactttaccaaccccttgtccaacag
SEQ ID NO: 4 (Интрон 2)
gttagaagtccacaatgtcatgtgtcattgaagatttaatttaagatagaaattacattgtttcattctgcaaatta tggacctatcagagaaaaatcatggattttgaatggctactttccccagtgaagacacatatcatttcctgggagga agatgtgaaagtggcaagctatttactccaaaaagtataatctaaaagacttttattaagtttggaaggcttaatcc atcatttgttatctgttgtctacttgtctttattaaaattcttcttagtccaatcactttcgatgaagttgactagt cttagtcacctgaatactttaaatctttgccttggtgtctctatattttcagccatctcaattccgaagctcatatt tgttttctctttgtaatgtccatctgaaagtttcatgcttttttgcag
SEQ ID NO: 5 (Интрон 3)
gtaagtttcagagtgttttatcaacccctttggaaccaagtgtcaagagtagtgtttcttggttgttaaatgattca catgtgtgttggtttctataaaacctgaactttatgttttatcagagtgttttgctttcttgaag
SEQ ID NO: 6 (Интрон 4)
gtaaatttctgaggacaagtttttccttttgcatgtaaattcaaactttgctgcttagatgattaaataatgaaaaa tatccattgcatgttttaatgtgtatgacatgttagaattttgaatagaagttcattcactgatgttgagatgtttt gttttttttctgcag
SEQ ID NO: 7 (Интрон 5)
gtatgagcactgtttataacagccgtccttttttcttttcttgtctgaactcaaatttgaatcctttgtttagaggc aattagtctgctctgagcattttggctgacagttattatgtatattaaaaggcaacttttttattcgttctgtccag ctaaaactttttacttaaaatgtggttaactgcatatttctgtgtctcctattttttgattatttgcaactctgatc aatctagatttggggaaggcttgttgttagttgatgactagatactaagctcacatctacattggttgcaagtagaa ttttcaagttgtcattcacttatattgtttgaactaggagattagcattcttctgcaaggagccctgaatgcttgaa aagttaaacagaaaagaaaaagttcagggcagatagacataatgtgttaaagtaattcaattggagcacagatatat gacatgtgttatttgggagctacgaaaaagataaggactattatgtagactacaattgaaataacaggtaattcatt tctggtttacag
SEQ ID NO: 8 (Интрон 6)
gtataacaccgtccaatgctcatttatgggaattataaattctagtatttgataatccttctgtactttagatctac ctgctctactgaaaaatgaaatgagtatgaggaaatagaatatccgttgagcatttatgtctttctattaaaaattt gcattctatcttcttgtttcaagtcaaaatcttgaacaactatatctagagaattttccttcttgtgaagtaatgca tatatacatcaagagaagtcagagttgctgaatgaaatagtagatcaaatttaagtgttgtgcctataaagaattgt atggtgagattgaatatagtggtcatattattttctcaatcttagtgattaaagtattccatacaaacagacaagca tttagtcgtgcattcattggcactacaaaattatcaaccaagagtaatattctttcagctttcctctgtatatgtgt gttctattctggagctgaagataactaatattcttttttatttctacag
SEQ ID NO: 9 (Интрон 7)
gtaataattctaactaattctgtggttgctatttgctagcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttcatagta aggaagagagggtagctgtattaacaagcctacagattctttaatttcaaatatgttacgttgaatctctatattgt ttgttctactggtcaacag
SEQ ID NO: 10 (Интрон 8)
gtaatctaacttgctgactgaaataatttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctga gtgctgagatctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagcatatactcc agtgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgca
SEQ ID NO: 11 (Интрон 9)
agtcattagcctatttgttttggattttgtgagtttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatccc ttgtttgtatagattgctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaa
SEQ ID NO: 12 (Интрон 10)
agtcattagcctatttgttttggattttgtgagtttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatccc ttgtttgtatagattgctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaa
SEQ ID NO: 13 (Экзон 1)
tggatatgaggaacagtatgtcttcagaatcttgtttagcatcactttcttgttctgcctccacatttcaatcgtca gaggattcagcagttgttaaatggttaagattcattttcctctctccatgtccacaaaggactcttctatcttccat tgatgtgctgcttttgcttactttcattgtatttgcagtacaaaagttgtactcaaagttgaggtccaatgagcact ctacttctagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacttctgttagaaccaatctttggtttaagctgtct
ctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcattttggttattgtgggaaattcccagtcgcc ttggaaagtcatagatggactgtattggttgtttcaggcgattacacatgttgtaatcactatactaatagttcatg agaaaagatttcacgctatttcccatccactgtccctgcgcgtgttttggattgcaaactttgtagttatgagtttg ttctttggttgtgggatcacaaggcttgtgtcacttaaggaaattgatcctaatttaagaatggatgatataagttc attagtttcatttcctatttctgttgttctcttcattgttgccattaaaggttcgaccggagttgctgtaattagtg attctgaatctcacttaagtgatgaaaccaatggttatgaactcctggataaatccagtgtgagtggctttgcttca gcttctctaatatcgaaagccttttggatttggatgaaccctttactgcaaaaaggttacaagtcacctctcaagat tgatgaagttccttcactttccccactgcatagagcagagaaaatgtctcaacttttcgaaagaaattggcctaaac ctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaacattgctgcgttgcttttggaaggaagttatttttactgccatt cttgcagtaattagggtatgtgttatgtatgtagggccaacactcatacaaagatttgttgattacacagcaggaaa gaggacatctccttatgaaggatactaccttataggaactctcctaatagccaaatttgtggaagttctaacctctc atcagttcaactttaactcccaaaagcttggcatgcttattcgagcgacacttctcacttctttgtataagaagggg ttaaggttgtcatgctcagctagacaggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgctcagca gctgtccgatatgatgctacagctacattccatttggctcatgccattgcaagtttctgtggctttaggcatccttt atacttacctcggtgcttcaactgttgtaacgctagctggacttgcagcagtgatggtatttgtggtgtttggaact aaaagaaacaacaggtttcaatttaacatcatgaagaatcgtgattctagaatgaaagcgacaaatgagatgcttaa ttatatgcgcgttataaagttccaggcatgggaagaacattttaacaaaagaattgaatccttccgcgaatccgagt atggatggttgtccaagttcttgtactcaatcgctgggaatatcattgtcttgtggagcactcctcttctagtggct acactcacttttggaagtgcaatcttgttgggaatcccgcttggtgcagggacagtgttcactgcaacatctctctt caagatgttgcaggaaccgatcagggctttccctcaatccatgatctcactttcacaagcaatgatatctcttgata gattggacaaatatatgatgagtaaggagttagtggataaagctgtggaaagactagaaggttgtgggggtacaatt gctatgcaggtgaaagatggagctttttgctgggatgatgaaaacagtaaagaagaattgaaaaatgtaaactttga gattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggacagttggggcggggaagtcttccctccttgcatctgtacttg gtgagatgcacaagttgtcgggtcag
SEQ ID NO: 14 (Экзон 2)
gtcacaatttgtggttcaactgcctatgttgcacaacatcgtggattcagaatggcacgatacaagaaaatatcctg tttggtatgccaatgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggtttgctgcttggagaaggacttggaaataat ggagtttggagaccagactgaaataggagaacgtggcatcaacctcagtggtggtcagaagcagcgaatccagcttg caagagctgtttaccaggactgtgatatttatcttctagatgatgtattcagtgcagttgatgctcacactggctct gaaatcttcaag
SEQ ID NO: 15 (Экзон 3)
gaatgtgtgaggggaattcttaaagataaaaccattttgcttgtcacacaccaagttgacttcttgcataatgttga cctgatcctt
SEQ ID NO: 16 (Экзон 4)
gtcatgcgagatgggatgatcgtgcaatctggcaaatataatgagatattagaagctggaatggattttaaagagct agtagctgcacatgagacctctttagaacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccttgaagaat caaaatcttctcgaagattatctaaggaagaaaacggagatgataaatctcaacagtctacatctgataggggggat tctaaacttataaaggaagaagaaagagaaactggaaaagtcagtcctcgtgtgtacaagctatatattactgaagc ttttggatggtggggtgtagtgctagttatcttgttttcgttcttgtggcaaagttctctaatggcaagtgattatt ggctggcatatgaaacttcagcggatcgtgccatgtccttcaatccttctctgtttattgggatatacggtgttatt gcagttgtttcttcgttgctgatagtgatcaggatgtattttgtgacacttatggggctcaagactgcccaaatatt tttcggacagattctttacagcatactgcatgctcctatgtcattttttgacacaacaccttccggaagaattctga gtcgg
SEQ ID NO: 17 (Экзон 5)
gcatctaatgatcagaccaacattgatgtcttcctcccgttttttatgaatctcactttggccatgtttatcacact gctcggcatcatcatcatcacatgccaatattcttggcctaccgtactacttttgattcctctgggttggcttaata tctggtaccgg
SEQ ID NO: 18 (Экзон 6)
ggatattatcttgcaacatctcgtgaattgactcggcttgactcaattacaaaagcacctgttattcatcatttctc tgaaagcatctcaggtgttatgactatacgttgctttaggaagcaggagatgttttgtaacgagaatgtaaaccgag tgaattccaatctgcgaatggatttccacaacaatggatccaatgaatggttgggctttcgactggaattgatggga agcttacttctttgtgtttctgcaatgttcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccag
SEQ ID NO: 19 (Экзон 7)
aaaatgttggtttgtcactatcatatggcttgtctcttaatagtgtcctattctggtccatctttgtgagttgcttt gtggaaaataaaatggtttctgtcgaaagattaaaacagttctcagaaataccatcagaagcagagtggagaaagat ggattttctcccaccttcaagttggccaagccgtgggaatgttgagcttgaaaacgtgcag
SEQ ID NO: 20 (Экзон 8)
gttagatatcgtccgaacactcctctagtgcttaaaggagttactctcagcattagagggggagagaagataggtgt tgttggtcgtacagggggtggaaaatcaacattaattcaagttttctttcgtttggtggagcctgcagctggaagaa taatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttcatgatcttagatctcgcttcgggatcattccccaagag ccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccccattggacaatattcagatgatgaaatttggaag
SEQ ID NO: 21 (Экзон 9)
agcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattcaccag SEQ ID NO: 21 (Экзон 10)
ttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaagagtgatgctaaaacgtagc agacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattcacagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcga ggactttgcggcctgtactataatcagcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgtta tagatgcag
SEQ ID NO: 22 (Экзон 11)
gaatagcaaaagagtttgacaaaccatctcgtttgcttgaaaggccttcactttttggggctttggttcaagaatat gccaaccgatcctctgagctctaa
SEQ ID NO: 23 (последовательность РНКи)
aagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgaccc
cattggacaatattcagatgatgaaatttggaaggtaatctaacttgctgactgaaataa tttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctgagtgctgaga tctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagca tatactccagtgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgca gagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaaacccgaaaaacttgattc accaggtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggttctttgcggaattatgcaacca actttttatgtgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggtaaatcata gttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgggaaga gtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattca cagacagatgcagtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatc agcattgcccacagaataccaacagtcatggactgtgatagagttcttgttatagatgca ggtgctgatttctctccttttactttgtaccttattttgaatctggtaaatgattattta tctgtatgtgatggtttccaaccaatcatagtcagtacctttatgaagaaattgcctaat gttagccaagtagtagtaaatgcatgaagtcattagcctatttgttttggattttgtgag tttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatcccttgtttgtatagattg ctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaagaatgta aacatgcgtaatttgacctattatagcagattatttgtcttattttccaggtcgctgatt ccacttattaggagtagttacacgtatttatcttttaagtgaaataatagtgtaaagttt cttttggcactgtcggtgtaaagaagttaaactcctttctttaaccccggcatttcttat tcatgcaggaatagcaaaagagtttgacaaaccatctcgtttgcttgaaaggccttcact
ttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgat SEQ ID NO: 24
(белковая последовательность NtMRP4; 5'-3' рамка считывания 1; - обозначает предполагаемый стоп-кодон)
MDMRNSMSSESCLASLSCSASTFQSSEDSAWKWLRFIFLSPCPQRTLLSSIDVLLLLTF IVFAVQKLYSKLRSNEHSTSSIDKPLIAHNRTSSPWKVIDGLYWLFQAITHWITILIVH EKRFHAISHPLSLRVFWIANFWMSLFFGCGITRLVSLKEIDPNLRMDDISSLVSFPISV VLFIVAIKGSTGVAVISDSESHLSDETNGYELLDKSSV3GFASASLISKAFWIWMNPLLQ KGYKSPLKIDEVPSLSPLHRAEKMSQLFERNWPKPEEISKHPVRTTLLRCFWKEVIFTAI LAVIRVCVMYVGPTLIQRFVDYTAGKRTSPYEGYYLIGTLLIAKFVEVLTSHQFNFNSQK LGMLIRATLLTSLYKKGLRLSCSARQAHGVGQIWYMAVDAQQLSDMMLQLHSIWLMPLQ VSVALGILYTYLGASTWTLAGLAAVMVFWFGTKRNNRFQFNIMKNRDSRMKATNEMLN YMRVIKFQAWEEHFNKRIESFRESEYGWLSKFLYSIAGNIIVLWSTPLLVATLTFGSAIL LGIPLGAGTVFTATSLFKMLQEPIRAFPQSMISLSQAMISLDRLDKYMMSKELVDKAVER LEGCGGTIAMQVKDGAFCWDDENSKEELKNWFEIRKGELAAWGTVGAGKSSLLASVLG EMHKLSGQVTICGSTAYVAQTSWIQNGTIQENILFGMPMNRDRYKEVIRVCCLEKDLEIM EFGDQTEIGERGINLSGGQKQRIQLARAVYQDCDIYLLDDVFSAVDAHTGSEIFKECVRG ILKDKTILLVTHQVDFLHNVDLILVMRDGMIVQSGKYNEILEAGMDFKELVAAHETSLEL VDVETTKESNASLEESKSSRRLSKEENGDDKSQQSTSDRGD3KLIKEEERETGKVSPRVY KLYITEAFGWWGVVLVILFSFLWQSSLMASDYWLAYETSADRAMSFNPSLFIGIYGVIAV VSSLLIVIRMYFVTLMGLKTAQIFFGQILYSILHAPMSFFDTTPSGRILSRASNDQTNID VFLPFFMNLTLAMFITLLGIIIITCQYSWPTVLLLIPLGWLNIWYRGYYLATSRELTRLD SITKAPVIHHFSESISGVMTIRCFRKQEMFCNENWRVNSNLRMDFHNNGSNEWLGFRLE LMGSLLLCVSAMFMIVLPSSIIKPENVGLSLSYGLSLNSVLFWSIFVSCFVENKMVSVER LKQFSEIPSEAEWRKMDFLPPSSWPSRGNVELENVQVRYRPNTPLVLKGVTLSIRGGEKI GWGRTGGGKSTLIQVFFRLVEPAAGRIIIDDVDISRLGLHDLRSRFGIIPQEPVLFEGT VRSNIDPIGQYSDDEIWKEPRTLPTQRCGVFKTRKT-FTSC-RR-LECRTEAASLLGKS DAKT-QTSIYG-GNCLC-FTDRCSDSENHPRGLCGLYYNQHCPQNTNSHGL-SSCYRCR C-FLSFYFVPYFESGK-LFICM-WFPTNHSQYLYEEIA-C-PSSSKCM
SEQ ID NO: 25
(белковая последовательность NtMRP4; 5'-3' рамка считывания 2; - обозначает предполагаемый стоп-кодон)
WI-GTVCLQNLV-HHFLVLPPHFNRQRIQQLLNG-DSFSSLHVHKGLFYLPLMCCFCLLS LYLQYKSCTQS-GPMSTLLLALISL-LHTTGLLRLGKS-MDCIGCFRRLHML-SLY-FM RKDFTLFPIHCPCACFGLQTL-L-VCSLWGSQGLCHLRKLILI-EWMI-VH-FHFLFLL FSSLLPLKVRPELL-LVILNLT-VMKPMVMNSWINPV-VALLQLL-YRKPFGFG-TLYCK KVTSHLSRLMKFLHFPHCIEQRKCLNFSKEIGLNLKKYQSILSEQHCCVAFGRKLFLLPF LQ-LGYVLCM-GQHSYKDLLITQQERGHLLMKDTTL-ELS-PNLWKF-PLISSTLTPKS LACLFERHFSLLCIRRG-GCHAQLDRLMVLDRL-IIWPSMLSSCPI-CYSYIPFGSCHCK FLWL-ASFILTSVLQLL-R-LDLQQ-WYLWCLELKETTGFNLTS-RIVILE-KRQMRCLI ICAL-SSRHGKNILTKELNPSANPSMDGCPS SCTQSLGISLSCGALLF-WLHSLLEVQSC WESRLVQGQCSLQHLSSRCCRNRSGLSLNP-SHFHKQ-YLLIDWTNI-VRS-WIKLWKD -KWGVQLLCR-KMELFAGMMKTVKKN-KM-TLRLEKESLQQ-WGQLGRGSLPSLHLYLV RCTSCRVRSQFVVQLPMLHKHRGFRMARYKKISCLVCQ-TETDTRK-SGFAAWRRTWK-W SLETRLK-ENVASTSVWRSSESSLQELFTRTVIFIF-MMYSVQLMLTLALKSSRNV-GE FLKIKPFCLSHTKLTSCIMLT-SLSCEMG-SCNLANIMRY-KLEWILKS-LHMRPL-NL LTWKQPKRAMPPLKNQNLLEDYLRKKTEMINLNSLHLIGGILNL-RKKKEKLEKSVLVCT SYILLKLLDGGV-C-LSCFRSCGKVL-WQVIIGWHMKLQRIVPCPSILLCLLGYTVLLQL
FLRC SGCIL-HLWGSRLPKYFSDRFFTAYCMLLCHFLTQHLPEEF-VGHLMIRPTLM
SSSRFL-ISLWPCLSHCSASSSSHANILGLPYYF-FLWVGLISGTGDIILQHLW-LGLT QLQKHLLFIISLKASQVL-LYVALGSRRCFVTRM-TE-IPICEWISTTMDPMNGWAFDWN -WEAYFFVFLQCS-LSYLAASSSQKMLVCHYHMACLLIVSYSGPSL-VALWKIKWFLSKD -NSSQKYHQKQSGERWIFSHLQVGQAVGMLSLKTCRLDIVRTLL-CLKELLSALEGERR-VLLWQGVENQH-FKFSFWWSLQLEE-SLMT-IYPDLGFMILDLASGSFPKSQSFLKEL -EATLTPLDNIQMMKFGRSLERCQLKDWSLKPEKLDSPWDNGDNWSVGQRQLLCLGRV MLKRSRLLFMDEATASVDSQTDAVIQKIIREDFAACTIISIAHRIPTVMDCDRVLVIDAG ADFSPFTLYLILNLVNDYLSVCDGFQPIIVSTFMKKLPNVSQVWNA-
SEQ ID NO: 26
(белковая последовательность NtMRP4; 5'-3' рамка считывания 3; - обозначает предполагаемый стоп-кодон)
GYEEQYVFRILFSITFLFCLHISIVRGFSSC-MVKIHFPLSMSTKDSSIFH-CAAFAYFH
CICSTKWLKVEVQ-ALYF-H-ASNCTQQDFFALESHRWTVLWSGDYTCCNHYTNSS-
EKISRYFPSTVPARVLDCKLCSYEFVLWLWDHKACVT-GN-S-FKNG-YKFISFISYFCC
SLHCCH-RFDRSCCN-F-ISLK-NQWL-TPG-IQCEWLCFSFSNIESLLDLDEPFTAK
RLQVTSQD-SSFTFPTA-SRENVSTFRKKLA-T-RNIKASCPNNIAALLLEGSYFYCHS
CSN-GMCYVCRANTHTKIC-LHSRKEDISL-RILPYRNSPNSQICGSSNLSSVQL-LPKA
WHAYSSDTSHFFV-EGVKWMLS-TGSWCWTDCKLYGRRCSAAVRYDATATFHLAHAIAS
FCGFRHPLYLPRCFNCCNASWTCSSDGICGWN-KKQQVSI-HHEES-F-NESDK-DA-L
YARYKVPGMGRTF-QKN-ILPRIRWMWQVLVLNRWEYHCLVEHSSS3GYTHFWKCNLV
GNPAWCRDSVHCNISLQDVAGTDQGFPSIHDLTFTSNDIS-IGQIYDE-GVSG-SCGKT
RRLWGYNCYAGERWSFLLG-KQ-RRIEKCKL-D-KRRACSSSGDSWGGEVFPPCICTW-
DAQWGSGHNLWFNCLCCTNIVDSEWHDTRKYPVWYANEQRQIQGSDPGLLLGEGLGNNG
WRPD-NRRTWHQPQWWSEAANPACKSCLPGL-YLSSR-CIQCS-CSHWL-NLQGMCEGN
S-R-NHFACHTPS-LLA-C-PDPCHARWDDRAIWQI-DIRSWNGF-RASSCT-DLFRTC
-RGNNQREQCLP-RIKIFSKII-GRKRR-ISTVYI-GGF-TYKGRRKRNWKSQSSCVQ
AIYY-SFWMVGCSASYLVFVLVAKFSNGK-LLAGI-NFSGSCHVLQSFSVYWDIRCYCSC
FFVADSDQDVFCDTYGAQDCPNIFRTDSLQHTACSYVIF-HNTFRKNSESGI-SDQH-C
LPPVFYESHFGHVYHTARHHHHHMPIFLAYRTTFDSSGLA-YLVPGILSCNIS-IDSA-L
NYKSTCYSSFL-KHLRCYDYTLL-EAGDVL-RECKPSEFQSANGFPQQWIQ-MVGLSTGI
DGKLTSLCFCNVHDCLT-QHHQARKCWFVTIIWLVS-CPILVHLCELLCGK-NGFCRKI
KTVLRNTIRSRVEKDGFSPTFKLAKPWEC-A-KRAG-ISSEHSSSA-RSYSQH-RGREDR
CCWSYRGWKININSSFLSFGGACSWKNNH-RRYIQTWAS-S-ISLRDHSPRASPF-RNC
EKQH-PHWTIFR-NLEGASNAANSKMWCL-NPKNLIHQLLITEITGVSDRGSFFAWEE-
C-NVADFYLWMRQLPLLIHRQMQ-FRKSSARTLRPVL-SALPTEYQQSWTVIEFLL-MQV
LISLLLLCTLF-IW-MIIYLYVMVSNQS-SVPL-RNCLMLAK МН
SEQ ID NO: 27
(последовательность кДНК NtMRP4, полученная на основе результатов прямого секвенирования кДНК)
atggatatgaggaacagtatgtcttcagaatcttgtttagcatcactttcttgttctgcctccacatttcaatcgtc
agaggattcagcagttgttaaatggttaagattcattttcctctctccatgtccacaaaggactcttctatcttcca
ttgatgtgctgcttttgcttactttcattgtatttgcagtacaaaagttgtactcaaagttgaggtccaatgagcac
tctacttctagcattgataagcctctaattgcacacaacaggacttctgttagaaccaatctttggtttaagctgtc
tctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcattttggttattgtgggaaattcccagtcgc
cttggaaagtcatagatggactgtattggttgtttcaggcgattacacatgttgtaatcactatactaatagttcat
gagaaaagatttcacgctatttcccatccactgtccctgcgcgtgttttggattgcaaactttgtagttatgagttt
gttctttggttgtgggatcacaaggcttgtgtcacttaaggaaattgatcctaatttaagaatggatgatataagtt
cattagtttcatttcctatttctgttgttctcttcattgttgccattaaaggttcgaccggagttgctgtaattagt
gattctgaatctcacttaagtgatgaaaccaatggttatgaactcctggataaatccagtgtgagtggctttgcttc
agcttctctaatatcgaaagccttttggatttggatgaaccctttactgcaaaaaggttacaagtcacctctcaaga
ttgatgaagttccttcactttccccactgcatagagcagagaaaatgtctcaacttttcgaaagaaattggcctaaa
cctgaagaaatatcaaagcatcctgtccgaacaacattgctgcgttgcttttggaaggaagttatttttactgcca
ttcttgcagtaattagggtatgtgttatgtatgtagggccaacactcatacaaagatttgttgattacacagcagga
aagaggacatctccttatgaaggatactaccttataggaactctcctaatagccaaatttgtggaagttctaacctc
tcatcagttcaactttaactcccaaaagcttggcatgcttattcgagcgacacttctcacttctttgtataagaagg
ggttaaggttgtcatgctcagctagacaggctcatggtgttggacagattgtaaattatatggccgtcgatgctcag
cagctgtccgatatgatgctacagctacattccatttggctcatgccattgcaagtttctgtggctttaggcatcct
ttatacttacctcggtgcttcaactgttgtaacgctagctggacttgcagcagtgatggtatttgtggtgtttggaa
ctaaaagaaacaacaggtttcaatttaacatcatgaagaatcgtgattctagaatgaaagcgacaaatgagatgctt
aattatatgcgcgttataaagttccaggcatgggaagaacattttaacaaaagaattgaatccttccgcgaatccga
gtatggatggttgtccaagttcttgtactcaatcgctgggaatatcattgtcttgtggagcactcctcttctagtgg
ctacactcacttttggaagtgcaatcttgttgggaatcccgcttggtgcagggacagtgttcactgcaacatctctc
ttcaagatgttgcaggaaccgatcagggctttccctcaatccatgatctcactttcacaagcaatgatatctcttga
tagattggacaaatatatgatgagtaaggagttagtggataaagctgtggaaagactagaaggttgtgggggtacaa
ttgctatgcaggtgaaagatggagctttttgctgggatgatgaaaacagtaaagaagaattgaaaaatgtaaacttt
gagattagaaaaggagagcttgcagcagtagtggggacagttggggcggggaagtcttccctccttgcatctgtact
tggtgagatgcacaagttgtcgggtcaggtcacaatttgtggttcaactgcctatgttgcacaaacatcgtggattc
agaatggcacgatacaagaaaatatcctgtttggtatgccaatgaacagagacagatacaaggaagtgatccgggtt
tgctgcttggagaaggacttggaaataatggagtttggagaccagactgaaataggagaacgtggcatcaacctcag tggtggtcagaagcagcgaatccagcttgcaagagctgtttaccaggactgtgatatttatcttctagatgatgtat tcagtgcagttgatgctcacactggctctgaaatcttcaaggaatgtgtgaggggaattcttaaagataaaaccatt ttgcttgtcacacaccaagttgacttcttgcataatgttgacctgatccttgtcatgcgagatgggatgatcgtgca atctggcaaatataatgagatattagaagctggaatggattttaaagagctagtagctgcacatgagacctctttag aacttgttgacgtggaaacaaccaaagagagcaatgcctcccttgaagaatcaaaatcttctcgaagattatctaag gaagaaaacggagatgataaatctcaacagtctacatctgataggggggattctaaacttataaaggaagaagaaag agaaactggaaaagtcagtcctcgtgtgtacaagctatatattactgaagcttttggatggtggggtgtagtgctag ttatcttgttttcgttcttgtggcaaagttctctaatggcaagtgattattggctggcatatgaaacttcagcggat cgtgccatgtccttcaatccttctctgtttattgggatatacggtgttattgcagttgtttcttcgttgctgatagt gatcaggatgtattttgtgacacttatggggctcaagactgcccaaatatttttcggacagattctttacagcatac tgcatgctcctatgtcattttttgacacaacaccttccggaagaattctgagtcgggcatctaatgatcagaccaac attgatgtcttcctcccgttttttatgaatctcactttggccatgtttatcacactgctcggcatcatcatcatcac atgccaatattcttggcctaccgtactacttttgattcctctgggttggcttaatatctggtaccggggatattatc ttgcaacatctcgtgaattgactcggcttgactcaattacaaaagcacctgttattcatcatttctctgaaagcatc tcaggtgttatgactatacgttgctttaggaagcaggagatgttttgtaacgagaatgtaaaccgagtgaattccaa tctgcgaatggatttccacaacaatggatccaatgaatggttgggctttcgactggaattgatgggaagcttacttc tttgtgtttctgcaatgttcatgattgtcttacctagcagcatcatcaagccagaaaatgttggtttgtcactatca tatggcttgtctcttaatagtgtcctattctggtccatctttgtgagttgctttgtggaaaataaaatggtttctgt cgaaagattaaaacagttctcagaaataccatcagaagcagagtggagaaagatggattttctcccaccttcaagtt ggccaagccgtgggaatgttgagcttgaaaacgtgcaggttagatatcgtccgaacactcctctagtgcttaaagga gttactctcagcattagagggggagagaagataggtgttgttggtcgtacagggggtggaaaatcaacattaattca agttttctttcgtttggtggagcctgcagctggaagaataatcattgatgacgtagatatatccagacttgggcttc atgatcttagatctcgcttcgggatcattccccaagagccagtcctttttgaaggaactgtgagaagcaacattgac cccattggacaatattcagatgatgaaatttggaagagcctcgaacgctgccaactcaaagatgtggtgtctttaaa acccgaaaaacttgattcaccagttgttgataacggagataactggagtgtcggacagaggcagcttctttgcttgg gaagagtgatgctaaaacgtagcagacttctatttatggatgaggcaactgcctctgttgattcacagacagatgca gtgattcagaaaatcatccgcgaggactttgcggcctgtactataatcagcattgcccacagaataccaacagtcat ggactgtgatagagttcttgttatagatgcaggaatagcaaaagagtttgacaaaccatctcgtttgcttgaaaggc cttcactttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgatcctctgagctctaa
SEQ ID No. 28 (последовательность ДНК NtMRP3, содержащая 5'- и З'-UTR)
ccgtcaacccagtcttggccaccacataaacacagctttgacttgtctctcccttttccctattttcaccacccttt tcaatttcccaccttatattcattattatatttaatcaatcaaatcaaagttggaaaaaaagggagtaataatcaaa tggagtagtatatacataccagaacaatgaaagagcactcataagctaaagcccataattcatcacgaaaccacaat atagaggaaacctgacgtgtcccttaaaatctaaccttgaacctctgagacctccaaaaaaaacati
ftatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgt ai-r-aM-arrM-ai-hr'i-i-hnr'arT'i-rranai-hnttccttgtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcai : : • ¦
attacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgactaatcaatgtttt gtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatg
ас ас
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^g t a a g a atсatсg111at у ¦_. ¦_. с ¦_. у у а у С d а у с у у а у d а у у d d d L L с L L у у L а у L L d С С L L L L L L L L d L у С L d L у с L у с а у ЦННИНЯН1
шшшшшшшшшншшшшшшшшшшшшшшяшишвшшшшшшшшишшшшшяшшяшшшяш
j ^^^^^^j^^actaatcttcgttaataatgttacacgacgatgat gatgaaaattaggggactctagactagtaccttagtcgatagtgttttgagtttccatctgtggacaccatagcttg aacaagaaccagcgaaatgcaggtcatgcctgtggcttgagggaaactgcaacaatcctatggcagggaaagaaacc tacatctagtgatgcaatattgattgtgaagtggcatttgtttttgtttagactttttgatgagaaaatgtatacgt aactttgtgtttacaataatttgaatgtatgttgagtcaagtgattagttagttaagagtgcacggattttgctact tctgggtaaaagaagtaaaccttgttgttgagagttgaaagtgaaattactagtgtcgaattttgccgcataagcta aatgaaacacttttacgataaactcctagtgcaacaaaggaaaaattcattggcaagactagctgtttatgtttcac gac
SEQ ID No. 29 (последовательность ДНК NtMRP3, не содержащая 5'- и З'-UTR)
:tttgccttcacaattattctac ;tacatttaagtggtgagtttgt
attaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaactttt
SEQ ID No, 30 (Интрон 1 NtMRP3)
gtatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttctttgcacctgggattgttcctt gtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcag
SEQ ID No. 31 (Интрон 2 NtMRP3)
gtaagtcctttcatatatatgctttattttcatgcttgatatattttacctagccacttgattgacccatcctttaa
ttgcag
SEQ ID No. 32 (Интрон3 NtMRP3)
gtactctttcctttcagtaattatggtttgcttaatatcatatatagacttaactcatttaactatgatatttctct tcag
SEQ ID No. 33 (Интрон 4 NtMRP3)
gtaagtgaatgattacattttctttatttagccccttttttttccttattagtgtcaatctttctgttacatgacta
atcaatgttttgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactcaaatgtactttggtatgaaaacag
SEQ ID No. 34 (Интрон 5 NtMRP3)
gttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactatatgctttttcacaaagtgagtcata actttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcattgcag
SEQ ID No. 35 (Нитрон 6 NtMRP3)
gtaagttctctatcttcatgttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgt ttcttgatttacag
SEQ ID No. 36 (Интрон 7 NtMRP3)
gtaaattaagttattctctggtgttaattatgcaggttaatttgttggtatgggttggtatatctgaaaacttttaa
tag
SEQ ID No. 37 (Интрон 8 NtMRP3)
gtgacagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagataggaaaatgacaaattttattttattgagaa actttgtttgatgttatgcttcag
SEQ ID No. 38 (Интрон 9 NtMRP3)
gtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccacttttagagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgc
SEQ ID No. 39 (Интрон 10 NtMRP3)
gtaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaattcttggtagttaccttttttttatgctatgctg cag
SEQ ID No. 40 (Экзон 1 NtMRP3)
SEQ ID No. 41 (Экзон 2 NtMRP3)
SEQ ID No. 42 (Экзон 3 NtMRP3)
SEQ ID No. 43 (Экзон 4 NtMRP3)
SEQ ID NO. 44 (Экзон 5 NtMRP3)
SEQ 1С - No 45 ¦ - NtMRn;
SEQ ID No. 46 (Экзон 7 NtMRP3)
SEQ ID No. 47 (Экзон 8 NtMRP3)
SEQ ID No, 48 (Экзон 9 NtMRP3)
SEQ ID No, 49 (Экзон 10 NtMRP3)
SEQ ID No 50 (Экзон 11 NtMRP3)
SEQ ID NO: 51
(последовательность кДНК NtMRP3, предсказанная на основе последовательности клона ВАС)
atggaaattgcaaagggcatgtctgtgtttcaatctttgaggagggacaataatgctggc сасаааcagagtagtactaggaatgctaggttcttgtactacaaatcaaacttgttttgt tcaataggtctagceatctttagctttgtgttatgtttgttagctcatttttattggtat agaaatggttggtcagaagaaaaaattataacccttttggattttgcattaaagttgcta
gcttggttgtcaatctctgttttcttgcacacccagttccttaattcttуtgaaaceaaa taccctcttgttttaagagtttggtgggggcttttcttctttgtttcttgttattgcctt
gttatagaccttgtttatggggaaaagaaccaatctttaccaactcaattttgtatacct gatgttgttttcactcttatggggttattcttctgttttgttgggtttattgttaaaaca gagagtgaggagaatatgcttcaggaacccctcttaaatggtagtgttgccaatggcatg gactcaaagaagtctactggggatcaaactgtcaccccttatgccaatgctaacattttt agtctctttactttctcttggatgggtcccctaatttctgttggcaacaagaaaccatta gaccttgaggatgttcctcagcttcactttgatgatagtgtcaaagggagttttcctatt tttagagaaaaactagaatctgtgggtgggggaaatagtaaccgtgtgactaccttcatg ctggtgaaggctttggttttcacagcacggaaggagatagtgttatcggctctcttcgtg cttctttacgctctggcgtcttttgttggcccgtacctcattgataccttagttcagtat ctgaatggaaaacgagactttgataatgaaggttatgtcttagtggctgcattcttcgtt gcaaagttggtggagtgtttggcgcaaaggcattggtttttcaaggtgcagcagggaggg tatcgggcacgggcagcactggtttccaaaatctacaacaagggtttaaccctctcctgt cagtcaaagcaaagccacactagtggagagatcatcaattttatgacagttgatgccgag aggattggtgacttcggttggtatatgcatgatccttggatggtaatcatacaagttgct ctggcattggtgatactctataaaaatcttggcctagctgctatcgccgcgtttgttgct acaataatagtgatgttggcaaacatccctttagggagtttgcaggagaagtttcaggag aaactcatggaatcgaaagatagaaggatgaaggctacatctgaagtcttaaggaatatg agaatactcaagcttcaagcttgggagatgaagtttctgtctaggatcttggacctcagg actacagaggcaggatggttgatgaaatatgtgtacacatcagctatgactacttttgtc ttctgggttgctcctacatttgtttctgtgacgacctttggcgctgcaatgcttatggga atcccacttgaatctgggaagatattgtctgcacttgcgacatttagaattcttcaagag cccatctacaatctcccagatacaatttcaatgattgctcaaaccaaagtttctcttgat cgtattgcatctttcctttctcttgatgacttgcagcctgatgtcatagagaagcttcca aaaggtagttctgatgaagcaattgagattgtaggtgggaacttcgcttgggatgcatec acctcgactccacttctaaaggatgtaaatcttagagtgcttaatggcatgagagttgcc atttgtggtacagttggttcaggaaaatcaagcttactgtctagcattttaggagagatg cccaaattatcagggactattaaacttagtggaacgaaggcttatgttgcacagtcgccc tggatacagagtggaaagatagaggagaacatattatttggtaaagagatgcagagggag aagtatgataaagttcttgaagcgtgctccttaaagaaagacctggaaattctctctttt ggcgatcaaacagaaataggggagaggggcattaatttgagcggtggacagaagcagaga atacagattgctcgtgctctttaccaagatgctgatgtttacctatttgatgatccgttc agtgctgtggatgctcataccggatcccatctcttcagtgaatgtataatggggctattg aattcaaaaacagttttatatgttacacatcaagtggagtttttgcctgctgcggatttg atcttggtcatgaaagatggaaggatcagtgaaactgggaaatacaatgatcttctcaaa ttaggtagtgacttcatggaacttgtgggtgctcaccaagaagctttaacagcaattgac acagttaagggagaagcattgagaaagagtgaggaaatgactggtgataatacaaatgta cagaaggataaaaatatttcagatggccaaaatggtaaagtggatgatattgttggaaca aagggacaaattgttcaggaggaggaaagagagaaaggtagtgttggtttttcagtttac tggaaatatataacaactgcatatggaggtgctcttgtgccatttatgctgttggcacaa gttggttttcagctccttcaaattggaagcaattattggatggcgtgggcaactcccgtc tcaaagagtgagccacctcctgttgggagttctactctcatcattgtctatgttgcttta ggaattgcaagtgctttatgcatccttgctagaaccatgtttcttgttaccgctggatat aagacagcctctttgcttttccataaaatgcatctttgcattttccgtgctccaatgtcc ttcttcgatgccacaccgagtgggcggattctaaacagagcatcgacagatcaaagtgca attgatctgaatgttcccattcaagttggatcctttgccttcacaataatacagctttta gggattattggagtaatgtcacaagttgcatggcaggtcttcattgtctttattccggtc attgcagtttgcatctggttggagcaatattacataccatcagcacgagaactggcacgg ctaaatgggacatgcaaagctccagtaatacagcactttgccgagacaatttcaggatca agcacaattagaagtttcgatcaggaatctagattccaggacacaagtatgaaattgata gacaattattctcggcctaagtttcacatcgctgctgcaatggagtggctttgtttgcgt ttggatatgttatctctgatcacttttgctttctctttaattttcttgatctctcttcct gttggaacaattgacccaagtgttgctggcttagctgttacatatgggcttaatctgaac ataatacaagctcgggttgtttggaatctttgtatgatggaaaataaaattatttctgtt gaaagaatacttcagtatactgctcttccaagtgaatctcctcttatcatagaatccaac agaccagaccctaactggccatcttgtggagaggttgattttagcaatcttcaggtccga tatgctcctcacatgcctctcgtgttgcgaggccttacatgcactttctttggtggaaag aagactggaattgtcggtaggacaggcagcggtaaatctactctaatacagaccctcttc cgcatagttgaaccagctgctggacaaataaaaatagatggtatcagcatctcctcaatt ggtttgcatgatctacggtctagattgagtataattccacaggatccaactatgtttgag
ggaacagttcgcagcaacctagacccgcttgaagagtattcagatgaacaaatttgggag gcgctcgataagtgtcagctaggagaagaagtgaggaagaaagaaggcaaactttattct acagtatctgagaatggagagaactggagtgtaggccaaaggcagctggtctgccttggc cgtgtgctactgaaaaagagcaaggtcctggtccttgacgaggctacagcatctgtcgac actgcaactgataatcttattcagcaaactctaaggctgcacttctctgattccacggtt ataaccattgctcataggattacatctgtgcttgacagtgatatggtcctactattagat catgggctcattgctgaatacggcactccagccaggttgttagagaacgaatcctcattg tttgctaagctcgtggcagagtatagtatgaggtcaaattcaagttttgagaatgtttca gacatgtga
SEQ ID NO: 52
(белковая последовательность NtMRP3, 5'-3'; - обозначает предполагаемый стоп-кодон)
MEIAKGMSVFQSLRRDNNAGHKQSSTRNARFLYYKSTLFCSIGLAIFSFVLCLLAHFYWY
VIDLVYGEKNQS LPTQFCIPDWFTLMGLFFC FVGFIVKTES EENMLQEPLLNGSVANGM DSKKSTGDQTVTPYANANIFSLFTFSWMGPLISVGNKKPLDLEDVPQLHFDDSVKGS FPI
LNGKRDFDNEGWLVAAFFVAKLVECLAQRHWFFKVQQGGYRARAALVSKIYNKGLTLSC Q S KpSHTSGEIIN FMTVDAERIGD FGWYMHD PWMVIIQVALALVILYKNLGLAAIAAFVA TlIVMLANIPLGSLQEKFQEKLMESKDRRMKATSEVLRNMRILKLQAWEMKFLSRILDLR TTEAGWLMKYVYTSAMTTFVFWVAPTFVSVTTFGAAMLMGIPLESGKILSALATFRILQE PIYNLPDTISMIAQTKVSLDRIASFLSLDDLQPDVIEKLPKGS SDEAIEIVGGNFAWDAS TSTPLLKDVNLRVLNGMRVAICGTVGSGKSSLLSSILGEMPKLSGTIKLSGTKAYVAQSP WIQSGKIEENILFGKEMQREKYDKVLEACSLKKDLEILS FGDQTEIGERGINLSGGQKQR IQIARALYQDADVYLFDDPFSAVDAHTGSHLFSECIMGLLNSKTVLYVTHQVEFLPAADL
QKDKNISDGQNGKVDDIVGTKGQIVQEEEREKGSVGFSVYWKYITTAYGGALVPFMLLAQ VGFQLLQIGSNYWMAWATPVSKSEPPPVGSSTLIIVYVALGIASALCILARTMFLVTAGY KTASLLFHKMHLCIFRAPMSFFDATPSGRILNRASTDQSAIDLNVPIQVGSFAFTIIQLL GIIGVMSQVAWQVFIVFIPVIAVCIWLEQYYIPSARELARLNGTCKAPVIQHFAETISGS
STIRS FDQES RFQDTSMKLIDNYS RPKFHIAAAMEWLCLRLDMLS LIT FAFSLIFLISLP
RIVEPAAGQIKIDGISISSIGLHDLRSRLSIIPQDPTMFEGTVRSNLDPLEEYSDEQIWE ALDKCQLGEEVRKKEGKLYSTVSENGENWSVGQR.QLVCLGRVLLKKSKVLVLDEATASVD
FAKLVAEYSMRSNSSFENVSDM-
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Philip Morris Products S.A. Bovet, Lucien
<12 0> Снижение содержания тяжелых металлов в растениях <130> 307486-20547 <140> PCT/EP2011/004383
<141> 2011-08-31
<150> EP 10009180.0 <151> 2010-09-03
<160> 148
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1 <211> 9001
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 1
tcctagtact gtaagtgaac cagcaaggaa actgcaaagt agatttcttg ttcatcaaat 60
aaatccttga gctgagagat atgatttttt ctaaggaatt tctctttggc tctctgtagt 120
ggtgagtttg attcatattt caatctagtt tttagctttg cttaaaagct tcttcttgcc 180
actagaccaa atccttttcc tttttgcatg acactttttt gagtttcatt tctcttattt 240
atagagaaaa tcttttgatg gggatggttt tttttctctt ttgcattaat gattagaatt 300
tatcattgtt aaatggtact ccctcaataa ctttttgatt taaaaaaaaa actgtccttt 360
cattcataat catcatctcc tttattatat tactctaaac tgttgctaaa gttccttttt 420
gtatattttc cctacatgaa cttttgctgt actgtgaaag ttgatgaact tttattgtac 480
aatgttttgg tccagtagct aacagccctt ttatttaatt ctgagaggtc tctttctctt 540
tctcttcaca ctttcacatg tttccgtttc ctgtagattt ctcctttctc tttccttggt 600
tctttttcca actcataatc ttcatgtgat ttcaattttt gtttgttttt attccatcct 660
ttgtctcttt tgatatgggt gacaaacatc ttctcttgct gaataaaaat ttcacctttt 720
ttcagtgtat gcagattcag gggatataaa gacataaagg atgaatcttt tatggtataa 780
catggatatg aggaacagta tgtcttcaga atcttgttta gcatcacttt cttgttctgc 840
ctccacattt caatcgtcag aggattcagc agttgttaaa tggttaagat tcattttcct 900
ctctccatgt ccacaaagga ctcttctatc ttccattgat gtgctgcttt tgcttacttt 960
cattgtattt gcagtacaaa agttgtactc aaagttgagg tccaatgagc actctacttc 1020
tagcattgat aagcctctaa ttgcacacaa caggacttct gttagaacca atctttggtt 1080
taagctgtct ctgattttgt cagctatttt agccttatct tctatagttt tatgcatttt 1140
ggttattgtg ggaaattccc agtcgccttg gaaagtcata gatggactgt attggttgtt 1200
tcaggcgatt acacatgttg taatcactat actaatagtt catgagaaaa gatttcacgc 1260
tatttcccat ccactgtccc tgcgcgtgtt ttggattgca aactttgtag ttatgagttt 1320
gttctttggt tgtgggatca caaggcttgt gtcacttaag gaaattgatc ctaatttaag 1380
aatggatgat ataagttcat tagtttcatt tcctatttct gttgttctct tcattgttgc 1440
cattaaaggt tcgaccggag ttgctgtaat tagtgattct gaatctcact taagtgatga 1500
aaccaatggt tatgaactcc tggataaatc cagtgtgagt ggctttgctt cagcttctct 1560
aatatcgaaa gccttttgga tttggatgaa ccctttactg caaaaaggtt acaagtcacc 1620
tctcaagatt gatgaagttc cttcactttc cccactgcat agagcagaga aaatgtctca 1680
acttttcgaa agaaattggc ctaaacctga agaaatatca aagcatcctg tccgaacaac 1740
attgctgcgt tgcttttgga aggaagttat ttttactgcc attcttgcag taattagggt 1800
atgtgttatg tatgtagggc caacactcat acaaagattt gttgattaca cagcaggaaa 1860
gaggacatct ccttatgaag gatactacct tataggaact ctcctaatag ccaaatttgt 1920
ggaagttcta acctctcatc agttcaactt taactcccaa aagcttggca tgcttattcg 1980
agcgacactt ctcacttctt tgtataagaa ggggttaagg ttgtcatgct cagctagaca 2040
ggctcatggt gttggacaga ttgtaaatta tatggccgtc gatgctcagc agctgtccga 2100
tatgatgcta cagctacatt ccatttggct catgccattg caagtttctg tggctttagg 2160
catcctttat acttacctcg gtgcttcaac tgttgtaacg ctagctggac ttgcagcagt 2220
gatggtattt gtggtgtttg gaactaaaag aaacaacagg tttcaattta acatcatgaa 2280
gaatcgtgat tctagaatga aagcgacaaa tgagatgctt aattatatgc gcgttataaa 2340
gttccaggca tgggaagaac attttaacaa aagaattgaa tccttccgcg aatccgagta 2400
tggatggttg tccaagttct tgtactcaat cgctgggaat atcattgtct tgtggagcac 2460
tcctcttcta gtggctacac tcacttttgg aagtgcaatc ttgttgggaa tcccgcttgg 2520
tgcagggaca gtgttcactg caacatctct cttcaagatg ttgcaggaac cgatcagggc 2580
tttccctcaa tccatgatct cactttcaca agcaatgata tctcttgata gattggacaa 2640
atatatgatg agtaaggagt tagtggataa agctgtggaa agactagaag gttgtggggg 2700
tacaattgct atgcaggtga aagatggagc tttttgctgg gatgatgaaa acagtaaaga 2760
agaattgaaa aatgtaaact ttgagattag aaaaggagag cttgcagcag tagtggggac 2820
agttggggcg gggaagtctt ccctccttgc atctgtactt ggtgagatgc acaagttgtc 2880
gggtcaggta tggctctcat ccttctgttt gtttgattaa tacaaacttt gctgccaatt 2940
accttttgcc ccttgttgct acctcttttc tgtggtataa aaaattaatg taggctaatg 3000
tgtagagtgg aggtattata tgcagaacaa ttgcaatcaa gcaattacct gtgagatact 3060
attttgtttt catattagtg gactggtaca ttctcattgg tgtatcgttt gatctccacc 3120
aaagcagagg ttttactggc cgacagagtc aaactactgt gcttcactcc ttttactcca 3180
atccttagta gtctttgctt ctaatgaact tcaagcgtgt aatagaaaca ccattatatt 3240
attagctgat tagttacttt acaattccag agcatattta cattttctgc ttggttgtct 3300
attactctgg ataacagtcc taaatgcaag caaaatcaac tgtgttttca gtcttgagct 3360
gaccaattag ttcatgatgt cctcagcttg tccaagctgg tgcctcaccg gaattatgtg 3420
ggaccttcgt acttaatcaa ctagttcacc ttcttcttaa aaatattgaa tgatttgatt 3480
ggttaatagt tccttaaatg tagtaattat ttgctaactt actttaccaa ccccttgtcc 3540
aacaggtcac aatttgtggt tcaactgcct atgttgcaca aacatcgtgg attcagaatg 3600
gcacgataca agaaaatatc ctgtttggta tgccaatgaa cagagacaga tacaaggaag 3660
tgatccgggt ttgctgcttg gagaaggact tggaaataat ggagtttgga gaccagactg 3720
aaataggaga acgtggcatc aacctcagtg gtggtcagaa gcagcgaatc cagcttgcaa 3780
gagctgttta ccaggactgt gatatttatc ttctagatga tgtattcagt gcagttgatg 3840
ctcacactgg ctctgaaatc ttcaaggtta gaagtccaca atgtcatgtg tcattgaaga 3900
tttaatttaa gatagaaatt acattgtttc attctgcaaa ttatggacct atcagagaaa 3960
aatcatggat tttgaatggc tactttcccc agtgaagaca catatcattt cctgggagga 4020
agatgtgaaa gtggcaagct atttactcca aaaagtataa tctaaaagac ttttattaag 4080
tttggaaggc ttaatccatc atttgttatc tgttgtctac ttgtctttat taaaattctt 4140
cttagtccaa tcactttcga tgaagttgac tagtcttagt cacctgaata ctttaaatct 4200
ttgccttggt gtctctatat tttcagccat ctcaattccg aagctcatat ttgttttctc 4260
tttgtaatgt ccatctgaaa gtttcatgct tttttgcagg aatgtgtgag gggaattctt 4320
aaagataaaa ccattttgct tgtcacacac caagttgact tcttgcataa tgttgacctg 4380
atccttgtaa gtttcagagt gttttatcaa cccctttgga accaagtgtc aagagtagtg 4440
tttcttggtt gttaaatgat tcacatgtgt gttggtttct ataaaacctg aactttatgt 4500
tttatcagag tgttttgctt tcttgaaggt catgcgagat gggatgatcg tgcaatctgg 4560
caaatataat gagatattag aagctggaat ggattttaaa gagctagtag ctgcacatga 4620
gacctcttta gaacttgttg acgtggaaac aaccaaagag agcaatgcct cccttgaaga 4680
atcaaaatct tctcgaagat tatctaagga agaaaacgga gatgataaat ctcaacagtc 4740
tacatctgat aggggggatt ctaaacttat aaaggaagaa gaaagagaaa ctggaaaagt 4800
cagtcctcgt gtgtacaagc tatatattac tgaagctttt ggatggtggg gtgtagtgct 4860
agttatcttg ttttcgttct tgtggcaaag ttctctaatg gcaagtgatt attggctggc 4920
atatgaaact tcagcggatc gtgccatgtc cttcaatcct tctctgttta ttgggatata 4980
cggtgttatt gcagttgttt cttcgttgct gatagtgatc aggatgtatt ttgtgacact 5040
tatggggctc aagactgccc aaatattttt cggacagatt ctttacagca tactgcatgc 5100
tcctatgtca ttttttgaca caacaccttc cggaagaatt ctgagtcggg taaatttctg 5160
aggacaagtt tttccttttg catgtaaatt caaactttgc tgcttagatg attaaataat 5220
gaaaaatatc cattgcatgt tttaatgtgt atgacatgtt agaattttga atagaagttc 5280
attcactgat gttgagatgt tttgtttttt ttctgcaggc atctaatgat cagaccaaca 5340
ttgatgtctt cctcccgttt tttatgaatc tcactttggc catgtttatc acactgctcg 5400
gcatcatcat catcacatgc caatattctt ggcctaccgt actacttttg attcctctgg 5460
gttggcttaa tatctggtac cgggtatgag cactgtttat aacagccgtc cttttttctt 5520
ttcttgtctg aactcaaatt tgaatccttt gtttagaggc aattagtctg ctctgagcat 5580
tttggctgac agttattatg tatattaaaa ggcaactttt ttattcgttc tgtccagcta 5640
aaacttttta cttaaaatgt ggttaactgc atatttctgt gtctcctatt ttttgattat 5700
ttgcaactct gatcaatcta gatttgggga aggcttgttg ttagttgatg actagatact 5760
aagctcacat ctacattggt tgcaagtaga attttcaagt tgtcattcac ttatattgtt 5820
tgaactagga gattagcatt cttctgcaag gagccctgaa tgcttgaaaa gttaaacaga 5880
aaagaaaaag ttcagggcag atagacataa tgtgttaaag taattcaatt ggagcacaga 5940
tatatgacat gtgttatttg ggagctacga aaaagataag gactattatg tagactacaa 6000
ttgaaataac aggtaattca tttctggttt acagggatat tatcttgcaa catctcgtga 6060
attgactcgg cttgactcaa ttacaaaagc acctgttatt catcatttct ctgaaagcat 6120
ctcaggtgtt atgactatac gttgctttag gaagcaggag atgttttgta acgagaatgt 6180
aaaccgagtg aattccaatc tgcgaatgga tttccacaac aatggatcca atgaatggtt 6240
gggctttcga ctggaattga tgggaagctt acttctttgt gtttctgcaa tgttcatgat 6300
tgtcttacct agcagcatca tcaagccagg tataacaccg tccaatgctc atttatggga 6360
attataaatt ctagtatttg ataatccttc tgtactttag atctacctgc tctactgaaa 6420
aatgaaatga gtatgaggaa atagaatatc cgttgagcat ttatgtcttt ctattaaaaa 6480
tttgcattct atcttcttgt ttcaagtcaa aatcttgaac aactatatct agagaatttt 6540
ccttcttgtg aagtaatgca tatatacatc aagagaagtc agagttgctg aatgaaatag 6600
tagatcaaat ttaagtgttg tgcctataaa gaattgtatg gtgagattga atatagtggt 6660
catattattt tctcaatctt agtgattaaa gtattccata caaacagaca agcatttagt 6720
cgtgcattca ttggcactac aaaattatca accaagagta atattctttc agctttcctc 6780
tgtatatgtg tgttctattc tggagctgaa gataactaat attctttttt atttctacag 6840
aaaatgttgg tttgtcacta tcatatggct tgtctcttaa tagtgtccta ttctggtcca 6900
tctttgtgag ttgctttgtg gaaaataaaa tggtttctgt cgaaagatta aaacagttct 6960
cagaaatacc atcagaagca gagtggagaa agatggattt tctcccacct tcaagttggc 7020
caagccgtgg gaatgttgag cttgaaaacg tgcaggtaat aattctaact aattctgtgg 7080
ttgctatttg ctagcatttg cacaaaagga aaactataaa aagttcatag taaggaagag 7140
agggtagctg tattaacaag cctacagatt ctttaatttc aaatatgtta cgttgaatct 7200
ctatattgtt tgttctactg gtcaacaggt tagatatcgt ccgaacactc ctctagtgct 7260
taaaggagtt actctcagca ttagaggggg agagaagata ggtgttgttg gtcgtacagg 7320
gggtggaaaa tcaacattaa ttcaagtttt ctttcgtttg gtggagcctg cagctggaag 7380
aataatcatt gatgacgtag atatatccag acttgggctt catgatctta gatctcgctt 7440
cgggatcatt ccccaagagc cagtcctttt tgaaggaact gtgagaagca acattgaccc 7500
cattggacaa tattcagatg atgaaatttg gaaggtaatc taacttgctg actgaaataa 7560
tttacaaaaa tctcaaaata tagtacagag ttagccaaac atgtcttctg agtgctgaga 7620
tctttttgga ttataaattc tgtaagagca acatactatt tgttagtgag aagaaaagca 7680
tatactccag tgttttgtta tctcccagaa tgtctctaac atgaaatcgt gtacattgca 7740
gagcctcgaa cgctgccaac tcaaagatgt ggtgtcttta aaacccgaaa aacttgattc 7800
accaggtaaa ttttcctcct ctacgtcatc cttgtggttc tttgcggaat tatgcaacca 7860
actttttatg tgtttcaaat atatatactg ataactgaat actgtcattg gtaaatcata 7920
gttgttgata acggagataa ctggagtgtc ggacagaggc agcttctttg cttgggaaga 7980
gtgatgctaa aacgtagcag acttctattt atggatgagg caactgcctc tgttgattca 8040
cagacagatg cagtgattca gaaaatcatc cgcgaggact ttgcggcctg tactataatc 8100
agcattgccc acagaatacc aacagtcatg gactgtgata gagttcttgt tatagatgca 8160
ggtgctgatt tctctccttt tactttgtac cttattttga atctggtaaa tgattattta 8220
tctgtatgtg atggtttcca accaatcata gtcagtacct ttatgaagaa attgcctaat 8280
gttagccaag tagtagtaaa tgcatgaagt cattagccta tttgttttgg attttgtgag 8340
tttcatactt caaactggaa gcttatgcta tactatctga tcccttgttt gtatagattg 8400
ctttcttttc ctttttctcg gatttatctt atatataagc ggacagagta aaagaatgta 8460
aacatgcgta atttgaccta ttatagcaga ttatttgtct tattttccag gtcgctgatt 8520
ccacttatta ggagtagtta cacgtattta tcttttaagt gaaataatag tgtaaagttt 8580
cttttggcac tgtcggtgta aagaagttaa actcctttct ttaaccccgg catttcttat 8640
tcatgcagga atagcaaaag agtttgacaa accatctcgt ttgcttgaaa ggccttcact 8700
ttttggggct ttggttcaag aatatgccaa ccgatcctct gagctctaac cacactattt 8760
tggctttcat gccttttgct gtaaattgca gctatcttgg aggataggtg aaacaggaaa 8820
aatacctatc caaatgttac atagatttcc aaatagtgtt atctcctact aagctatcca 8880
gtagattttt ggaaatgtaa caatattggg attaacaatt gtaattgatg aatctattaa 8940
tcaaatacaa tgattattct gttatagatg tagtctgtgc aatgttatat agactgattt 9000
c 9001
<210> 2
<211> 7526
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 2
atggatatga ggaacagtat gtcttcagaa tcttgtttag catcactttc ttgttctgcc 60
tccacatttc aatcgtcaga ggattcagca gttgttaaat ggttaagatt cattttcctc 120
tctccatgtc cacaaaggac tcttctatct tccattgatg tgctgctttt gcttactttc 180
attgtatttg cagtacaaaa gttgtactca aagttgaggt ccaatgagca ctctacttct 240
agcattgata agcctctaat tgcacacaac aggacttctg ttagaaccaa tctttggttt 300
aagctgtctc tgattttgtc agctatttta gccttatctt ctatagtttt atgcattttg 360
gttattgtgg gaaattccca gtcgccttgg aaagtcatag atggactgta ttggttgttt 420
caggcgatta cacatgttgt aatcactata ctaatagttc atgagaaaag atttcacgct 480
atttcccatc cactgtccct gcgcgtgttt tggattgcaa actttgtagt tatgagtttg 540
ttctttggtt gtgggatcac aaggcttgtg tcacttaagg aaattgatcc taatttaaga 600
atggatgata taagttcatt agtttcattt cctatttctg ttgttctctt cattgttgcc 660
attaaaggtt cgaccggagt tgctgtaatt agtgattctg aatctcactt aagtgatgaa 720
accaatggtt atgaactcct ggataaatcc agtgtgagtg gctttgcttc agcttctcta 780
atatcgaaag ccttttggat ttggatgaac cctttactgc aaaaaggtta caagtcacct 840
ctcaagattg atgaagttcc ttcactttcc ccactgcata gagcagagaa aatgtctcaa 900
cttttcgaaa gaaattggcc taaacctgaa gaaatatcaa agcatcctgt ccgaacaaca 960
ttgctgcgtt gcttttggaa ggaagttatt tttactgcca ttcttgcagt aattagggta 1020
tgtgttatgt atgtagggcc aacactcata caaagatttg ttgattacac agcaggaaag 1080
aggacatctc cttatgaagg atactacctt ataggaactc tcctaatagc caaatttgtg 1140
gaagttctaa cctctcatca gttcaacttt aactcccaaa agcttggcat gcttattcga 1200
gcgacacttc tcacttcttt gtataagaag gggttaaggt tgtcatgctc agctagacag 1260
gctcatggtg ttggacagat tgtaaattat atggccgtcg atgctcagca gctgtccgat 1320
atgatgctac agctacattc catttggctc atgccattgc aagtttctgt ggctttaggc 1380
atcctttata cttacctcgg tgcttcaact gttgtaacgc tagctggact tgcagcagtg 1440
atggtatttg tggtgtttgg aactaaaaga aacaacaggt ttcaatttaa catcatgaag 1500
aatcgtgatt ctagaatgaa agcgacaaat gagatgctta attatatgcg cgttataaag 1560
ttccaggcat gggaagaaca ttttaacaaa agaattgaat ccttccgcga atccgagtat 1620
ggatggttgt ccaagttctt gtactcaatc gctgggaata tcattgtctt gtggagcact 1680
cctcttctag tggctacact cacttttgga agtgcaatct tgttgggaat cccgcttggt 1740
gcagggacag tgttcactgc aacatctctc ttcaagatgt tgcaggaacc gatcagggct 1800
ttccctcaat ccatgatctc actttcacaa gcaatgatat ctcttgatag attggacaaa 1860
tatatgatga gtaaggagtt agtggataaa gctgtggaaa gactagaagg ttgtgggggt 1920
acaattgcta tgcaggtgaa agatggagct ttttgctggg atgatgaaaa cagtaaagaa 1980
gaattgaaaa atgtaaactt tgagattaga aaaggagagc ttgcagcagt agtggggaca 2040
gttggggcgg ggaagtcttc cctccttgca tctgtacttg gtgagatgca caagttgtcg 2100
ggtcaggtat ggctctcatc cttctgtttg tttgattaat acaaactttg ctgccaatta 2160
ccttttgccc cttgttgcta cctcttttct gtggtataaa aaattaatgt aggctaatgt 2220
gtagagtgga ggtattatat gcagaacaat tgcaatcaag caattacctg tgagatacta 2280
ttttgttttc atattagtgg actggtacat tctcattggt gtatcgtttg atctccacca 2340
aagcagaggt tttactggcc gacagagtca aactactgtg cttcactcct tttactccaa 2400
tccttagtag tctttgcttc taatgaactt caagcgtgta atagaaacac cattatatta 2460
ttagctgatt agttacttta caattccaga gcatatttac attttctgct tggttgtcta 2520
ttactctgga taacagtcct aaatgcaagc aaaatcaact gtgttttcag tcttgagctg 2580
accaattagt tcatgatgtc ctcagcttgt ccaagctggt gcctcaccgg aattatgtgg 2640
gaccttcgta cttaatcaac tagttcacct tcttcttaaa aatattgaat gatttgattg 2700
gttaatagtt ccttaaatgt agtaattatt tgctaactta ctttaccaac cccttgtcca 2760
acaggtcaca atttgtggtt caactgccta tgttgcacaa acatcgtgga ttcagaatgg 2820
cacgatacaa gaaaatatcc tgtttggtat gccaatgaac agagacagat acaaggaagt 2880
gatccgggtt tgctgcttgg agaaggactt ggaaataatg gagtttggag accagactga 2940
aataggagaa cgtggcatca acctcagtgg tggtcagaag cagcgaatcc agcttgcaag 3000
agctgtttac caggactgtg atatttatct tctagatgat gtattcagtg cagttgatgc 3060
tcacactggc tctgaaatct tcaaggttag aagtccacaa tgtcatgtgt cattgaagat 3120
ttaatttaag atagaaatta cattgtttca ttctgcaaat tatggaccta tcagagaaaa 3180
atcatggatt ttgaatggct actttcccca gtgaagacac atatcatttc ctgggaggaa 3240
gatgtgaaag tggcaagcta tttactccaa aaagtataat ctaaaagact tttattaagt 3300
ttggaaggct taatccatca tttgttatct gttgtctact tgtctttatt aaaattcttc 3360
ttagtccaat cactttcgat gaagttgact agtcttagtc acctgaatac tttaaatctt 3420
tgccttggtg tctctatatt ttcagccatc tcaattccga agctcatatt tgttttctct 3480
ttgtaatgtc catctgaaag tttcatgctt ttttgcagga atgtgtgagg ggaattctta 3540
aagataaaac cattttgctt gtcacacacc aagttgactt cttgcataat gttgacctga 3600
tccttgtaag tttcagagtg ttttatcaac ccctttggaa ccaagtgtca agagtagtgt 3660
ttcttggttg ttaaatgatt cacatgtgtg ttggtttcta taaaacctga actttatgtt 3720
ttatcagagt gttttgcttt cttgaaggtc atgcgagatg ggatgatcgt gcaatctggc 3780
aaatataatg agatattaga agctggaatg gattttaaag agctagtagc tgcacatgag 3840
acctctttag aacttgttga cgtggaaaca accaaagaga gcaatgcctc ccttgaagaa 3900
tcaaaatctt ctcgaagatt atctaaggaa gaaaacggag atgataaatc tcaacagtct 3960
acatctgata ggggggattc taaacttata aaggaagaag aaagagaaac tggaaaagtc 4020
agtcctcgtg tgtacaagct atatattact gaagcttttg gatggtgggg tgtagtgcta 4080
gttatcttgt tttcgttctt gtggcaaagt tctctaatgg caagtgatta ttggctggca 4140
tatgaaactt cagcggatcg tgccatgtcc ttcaatcctt ctctgtttat tgggatatac 4200
ggtgttattg cagttgtttc ttcgttgctg atagtgatca ggatgtattt tgtgacactt 4260
atggggctca agactgccca aatatttttc ggacagattc tttacagcat actgcatgct 4320
cctatgtcat tttttgacac aacaccttcc ggaagaattc tgagtcgggt aaatttctga 4380
ggacaagttt ttccttttgc atgtaaattc aaactttgct gcttagatga ttaaataatg 4440
aaaaatatcc attgcatgtt ttaatgtgta tgacatgtta gaattttgaa tagaagttca 4500
ttcactgatg ttgagatgtt ttgttttttt tctgcaggca tctaatgatc agaccaacat 4560
tgatgtcttc ctcccgtttt ttatgaatct cactttggcc atgtttatca cactgctcgg 4620
catcatcatc atcacatgcc aatattcttg gcctaccgta ctacttttga ttcctctggg 4680
ttggcttaat atctggtacc gggtatgagc actgtttata acagccgtcc ttttttcttt 4740
tcttgtctga actcaaattt gaatcctttg tttagaggca attagtctgc tctgagcatt 4800
ttggctgaca gttattatgt atattaaaag gcaacttttt tattcgttct gtccagctaa 4860
aactttttac ttaaaatgtg gttaactgca tatttctgtg tctcctattt tttgattatt 4920
tgcaactctg atcaatctag atttggggaa ggcttgttgt tagttgatga ctagatacta 4980
agctcacatc tacattggtt gcaagtagaa ttttcaagtt gtcattcact tatattgttt 5040
gaactaggag attagcattc ttctgcaagg agccctgaat gcttgaaaag ttaaacagaa 5100
aagaaaaagt tcagggcaga tagacataat gtgttaaagt aattcaattg gagcacagat 5160
atatgacatg tgttatttgg gagctacgaa aaagataagg actattatgt agactacaat 5220
tgaaataaca ggtaattcat ttctggttta cagggatatt atcttgcaac atctcgtgaa 5280
ttgactcggc ttgactcaat tacaaaagca cctgttattc atcatttctc tgaaagcatc 5340
tcaggtgtta tgactatacg ttgctttagg aagcaggaga tgttttgtaa cgagaatgta 5400
aaccgagtga attccaatct gcgaatggat ttccacaaca atggatccaa tgaatggttg 5460
ggctttcgac tggaattgat gggaagctta cttctttgtg tttctgcaat gttcatgatt 5520
gtcttaccta gcagcatcat caagccaggt ataacaccgt ccaatgctca tttatgggaa 5580
ttataaattc tagtatttga taatccttct gtactttaga tctacctgct ctactgaaaa 5640
atgaaatgag tatgaggaaa tagaatatcc gttgagcatt tatgtctttc tattaaaaat 5700
ttgcattcta tcttcttgtt tcaagtcaaa atcttgaaca actatatcta gagaattttc 5760
cttcttgtga agtaatgcat atatacatca agagaagtca gagttgctga atgaaatagt 5820
agatcaaatt taagtgttgt gcctataaag aattgtatgg tgagattgaa tatagtggtc 5880
atattatttt ctcaatctta gtgattaaag tattccatac aaacagacaa gcatttagtc 5940
gtgcattcat tggcactaca aaattatcaa ccaagagtaa tattctttca gctttcctct 6000
gtatatgtgt gttctattct ggagctgaag ataactaata ttctttttta tttctacaga 6060
aaatgttggt ttgtcactat catatggctt gtctcttaat agtgtcctat tctggtccat 6120
ctttgtgagt tgctttgtgg aaaataaaat ggtttctgtc gaaagattaa aacagttctc 6180
agaaatacca tcagaagcag agtggagaaa gatggatttt ctcccacctt caagttggcc 6240
aagccgtggg aatgttgagc ttgaaaacgt gcaggtaata attctaacta attctgtggt 6300
tgctatttgc tagcatttgc acaaaaggaa aactataaaa agttcatagt aaggaagaga 6360
gggtagctgt attaacaagc ctacagattc tttaatttca aatatgttac gttgaatctc 6420
tatattgttt gttctactgg tcaacaggtt agatatcgtc cgaacactcc tctagtgctt 6480
aaaggagtta ctctcagcat tagaggggga gagaagatag gtgttgttgg tcgtacaggg 6540
ggtggaaaat caacattaat tcaagttttc tttcgtttgg tggagcctgc agctggaaga 6600
ataatcattg atgacgtaga tatatccaga cttgggcttc atgatcttag atctcgcttc 6660
gggatcattc cccaagagcc agtccttttt gaaggaactg tgagaagcaa cattgacccc 6720
attggacaat attcagatga tgaaatttgg aaggtaatct aacttgctga ctgaaataat 6780
ttacaaaaat ctcaaaatat agtacagagt tagccaaaca tgtcttctga gtgctgagat 6840
ctttttggat tataaattct gtaagagcaa catactattt gttagtgaga agaaaagcat 6900
atactccagt gttttgttat ctcccagaat gtctctaaca tgaaatcgtg tacattgcag 6960
agcctcgaac gctgccaact caaagatgtg gtgtctttaa aacccgaaaa acttgattca 7020
ccaggtaaat tttcctcctc tacgtcatcc ttgtggttct ttgcggaatt atgcaaccaa 7080
ctttttatgt gtttcaaata tatatactga taactgaata ctgtcattgg taaatcatag 7140
ttgttgataa cggagataac tggagtgtcg gacagaggca gcttctttgc ttgggaagag 7200
tgatgctaaa acgtagcaga cttctattta tggatgaggc aactgcctct gttgattcac 7260
agacagatgc agtgattcag aaaatcatcc gcgaggactt tgcggcctgt actataatca 7320
gcattgccca cagaatacca acagtcatgg actgtgatag agttcttgtt atagatgcag 7380
gtgctgattt ctctcctttt actttgtacc ttattttgaa tctggtaaat gattatttat 7440
ctgtatgtga tggtttccaa ccaatcatag tcagtacctt tatgaagaaa ttgcctaatg 7500
ttagccaagt agtagtaaat gcatga 7526
<210> 3
<211> 102
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 3
gttagaacca atctttggtt taagctgtct ctgattttgt cagctatttt agccttatct 60 tctatagttt tatgcatttt ggttattgtg ggaaattccc ag 102
<210> 4 <211> 65 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 4
gtatggctct catccttctg tttgtttgat taatacaaac tttgctgcca attacctttt 60
gccccttgtt gctacctctt ttctgtggta taaaaaatta atgtaggcta atgtgtagag 120
tggaggtatt atatgcagaa caattgcaat caagcaatta cctgtgagat actattttgt 180
tttcatatta gtggactggt acattctcat tggtgtatcg tttgatctcc accaaagcag 240
aggttttact ggccgacaga gtcaaactac tgtgcttcac tccttttact ccaatcctta 300
gtagtctttg cttctaatga acttcaagcg tgtaatagaa acaccattat attattagct 360
gattagttac tttacaattc cagagcatat ttacattttc tgcttggttg tctattactc 420
tggataacag tcctaaatgc aagcaaaatc aactgtgttt tcagtcttga gctgaccaat 480
tagttcatga tgtcctcagc ttgtccaagc tggtgcctca ccggaattat gtgggacctt 540
cgtacttaat caactagttc accttcttct taaaaatatt gaatgatttg attggttaat 600
agttccttaa atgtagtaat tatttgctaa cttactttac caaccccttg tccaacag 658
<210> 5 <211> 433 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 5
gttagaagtc cacaatgtca tgtgtcattg aagatttaat ttaagataga aattacattg 60
tttcattctg caaattatgg acctatcaga gaaaaatcat ggattttgaa tggctacttt 120
ccccagtgaa gacacatatc atttcctggg aggaagatgt gaaagtggca agctatttac 180
tccaaaaagt ataatctaaa agacttttat taagtttgga aggcttaatc catcatttgt 240
tatctgttgt
ctacttgtct
ttattaaaat
tcttcttagt
ccaatcactt
tcgatgaagt
300
tgactagtct
tagtcacctg
aatactttaa
atctttgcct
tggtgtctct
atattttcag
360
ccatctcaat
tccgaagctc
atatttgttt
tctctttgta
atgtccatct
gaaagtttca
420
tgcttttttg
cag
433
<210> 6 <211> 142 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 6
gtaagtttca
gagtgtttta
tcaacccctt
tggaaccaag
tgtcaagagt
agtgtttctt
ggttgttaaa
tgattcacat
gtgtgttggt
ttctataaaa
cctgaacttt
atgttttatc
120
agagtgtttt
gctttcttga
142
<210> 7 <211> 169
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 7
gtaaatttct
gaggacaagt
ttttcctttt
gcatgtaaat
tcaaactttg
ctgcttagat
gattaaataa
tgaaaaatat
ccattgcatg
ttttaatgtg
tatgacatgt
tagaattttg
120
aatagaagtt
cattcactga
tgttgagatg
ttttgttttt
tttctgcag
169
<210> 8 <211> 551
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 8
gtatgagcac
tgtttataac
agccgtcctt
ttttcttttc
ttgtctgaac
tcaaatttga
atcctttgtt
tagaggcaat
tagtctgctc
tgagcatttt
ggctgacagt
tattatgtat
120
attaaaaggc
aactttttta
ttcgttctgt
ccagctaaaa
ctttttactt
aaaatgtggt
180
taactgcata
tttctgtgtc
tcctattttt
tgattatttg
caactctgat
caatctagat
240
ttggggaagg
cttgttgtta
gttgatgact
agatactaag
ctcacatcta
cattggttgc
300
aagtagaatt
ttcaagttgt
cattcactta
tattgtttga
actaggagat
tagcattctt
360
ctgcaaggag
ccctgaatgc
ttgaaaagtt
aaacagaaaa
gaaaaagttc
agggcagata
420
gacataatgt
gttaaagtaa
ttcaattgga
gcacagatat
atgacatgtg
ttatttggga
480
gctacgaaaa
agataaggac
tattatgtag
actacaattg
aaataacagg
taattcattt
540
ctggtttaca
551
<211> 511 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 9
gtataacacc
gtccaatgct
catttatggg
aattataaat
tctagtattt
gataatcctt
ctgtacttta
gatctacctg
ctctactgaa
aaatgaaatg
agtatgagga
aatagaatat
120
ccgttgagca
tttatgtctt
tctattaaaa
atttgcattc
tatcttcttg
tttcaagtca
180
aaatcttgaa
caactatatc
tagagaattt
tccttcttgt
gaagtaatgc
atatatacat
240
caagagaagt
cagagttgct
gaatgaaata
gtagatcaaa
tttaagtgtt
gtgcctataa
300
agaattgtat
ggtgagattg
aatatagtgg
tcatattatt
ttctcaatct
tagtgattaa
360
agtattccat
acaaacagac
aagcatttag
tcgtgcattc
attggcacta
caaaattatc
420
aaccaagagt
aatattcttt
cagctttcct
ctgtatatgt
gtgttctatt
ctggagctga
480
agataactaa
tattcttttt
tatttctaca
511
<210> 10 <211> 173 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 10
gtaataattc
taactaattc
tgtggttgct
atttgctagc
atttgcacaa
aaggaaaact
ataaaaagtt
catagtaagg
aagagagggt
agctgtatta
acaagcctac
agattcttta
120
atttcaaata
tgttacgttg
aatctctata
ttgtttgttc
tactggtcaa
cag
173
<210> 11 <211> 207 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 11
gtaatctaac
ttgctgactg
aaataattta
caaaaatctc
aaaatatagt
acagagttag
ccaaacatgt
cttctgagtg
ctgagatctt
tttggattat
aaattctgta
agagcaacat
120
actatttgtt
agtgagaaga
aaagcatata
ctccagtgtt
ttgttatctc
ccagaatgtc
180
tctaacatga
aatcgtgtac
attgcag
207
<210> 12 <211> 116 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 12
gtaaattttc
ctcctctacg
tcatccttgt
ggttctttgc
ggaattatgc
aaccaacttt
ttatgtgttt
caaatatata
tactgataac
tgaatactgt
cattggtaaa
tcatag
116
<211> 279 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 13
atggatatga ggaacagtat gtcttcagaa tcttgtttag catcactttc ttgttctgcc 60
tccacatttc aatcgtcaga ggattcagca gttgttaaat ggttaagatt cattttcctc 120
tctccatgtc cacaaaggac tcttctatct tccattgatg tgctgctttt gcttactttc 180
attgtatttg cagtacaaaa gttgtactca aagttgaggt ccaatgagca ctctacttct 240
agcattgata agcctctaat tgcacacaac aggacttct 279
<210> 14
<211> 1725
<212> ДНК
-1 о ^ т\т-:"
<213> Nicotiana tabacum
<400> 14
tcgccttgga aagtcataga tggactgtat tggttgtttc aggcgattac acatgttgta 60
atcactatac taatagttca tgagaaaaga tttcacgcta tttcccatcc actgtccctg 120
cgcgtgtttt ggattgcaaa ctttgtagtt atgagtttgt tctttggttg tgggatcaca 180
aggcttgtgt cacttaagga aattgatcct aatttaagaa tggatgatat aagttcatta 240
gtttcatttc ctatttctgt tgttctcttc attgttgcca ttaaaggttc gaccggagtt 300
gctgtaatta gtgattctga atctcactta agtgatgaaa ccaatggtta tgaactcctg 360
gataaatcca gtgtgagtgg ctttgcttca gcttctctaa tatcgaaagc cttttggatt 420
tggatgaacc ctttactgca aaaaggttac aagtcacctc tcaagattga tgaagttcct 480
tcactttccc cactgcatag agcagagaaa atgtctcaac ttttcgaaag aaattggcct 540
aaacctgaag aaatatcaaa gcatcctgtc cgaacaacat tgctgcgttg cttttggaag 600
gaagttattt ttactgccat tcttgcagta attagggtat gtgttatgta tgtagggcca 660
acactcatac aaagatttgt tgattacaca gcaggaaaga ggacatctcc ttatgaagga 720
tactacctta taggaactct cctaatagcc aaatttgtgg aagttctaac ctctcatcag 780
ttcaacttta actcccaaaa gcttggcatg cttattcgag cgacacttct cacttctttg 840
tataagaagg ggttaaggtt gtcatgctca gctagacagg ctcatggtgt tggacagatt 900
gtaaattata tggccgtcga tgctcagcag ctgtccgata tgatgctaca gctacattcc 960
atttggctca tgccattgca agtttctgtg gctttaggca tcctttatac ttacctcggt 1020
gcttcaactg ttgtaacgct agctggactt gcagcagtga tggtatttgt ggtgtttgga 1080
actaaaagaa acaacaggtt tcaatttaac atcatgaaga atcgtgattc tagaatgaaa 1140
gcgacaaatg agatgcttaa ttatatgcgc gttataaagt tccaggcatg ggaagaacat 1200
tttaacaaaa gaattgaatc cttccgcgaa tccgagtatg gatggttgtc caagttcttg 1260
tactcaatcg
ctgggaatat
cattgtcttg
tggagcactc
ctcttctagt
ggctacactc
1320
acttttggaa
gtgcaatctt
gttgggaatc
ccgcttggtg
cagggacagt
gttcactgca
1380
acatctctct
tcaagatgtt
gcaggaaccg
atcagggctt
tccctcaatc
catgatctca
1440
ctttcacaag
caatgatatc
tcttgataga
ttggacaaat
atatgatgag
taaggagtta
1500
gtggataaag
ctgtggaaag
actagaaggt
tgtgggggta
caattgctat
gcaggtgaaa
1560
gatggagctt
tttgctggga
tgatgaaaac
agtaaagaag
aattgaaaaa
tgtaaacttt
1620
gagattagaa
aaggagagct
tgcagcagta
gtggggacag
ttggggcggg
gaagtcttcc
1680
ctccttgcat
ctgtacttgg
tgagatgcac
aagttgtcgg
gtcag
1725
<210> 15 <211> 320 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 15
gtcacaattt
gtggttcaac
tgcctatgtt
gcacaacatc
gtggattcag
aatggcacga
tacaagaaaa
tatcctgttt
ggtatgccaa
tgaacagaga
cagatacaag
gaagtgatcc
120
gggtttgctg
cttggagaag
gacttggaaa
taatggagtt
tggagaccag
actgaaatag
180
gagaacgtgg
catcaacctc
agtggtggtc
agaagcagcg
aatccagctt
gcaagagctg
240
tttaccagga
ctgtgatatt
tatcttctag
atgatgtatt
cagtgcagtt
gatgctcaca
300
ctggctctga
aatcttcaag
320
<210> 16 <211> 87 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 16
gaatgtgtga
ggggaattct
taaagataaa
accattttgc
ttgtcacaca
ccaagttgac
ttcttgcata
atgttgacct
gatcctt
<210> 17 <211> 621 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 17
gtcatgcgag
atgggatgat
cgtgcaatct
ggcaaatata
atgagatatt
agaagctgga
atggatttta
aagagctagt
agctgcacat
gagacctctt
tagaacttgt
tgacgtggaa
120
acaaccaaag
agagcaatgc
ctcccttgaa
gaatcaaaat
cttctcgaag
attatctaag
180
gaagaaaacg
gagatgataa
atctcaacag
tctacatctg
atagggggga
ttctaaactt
240
ataaaggaag
aagaaagaga
aactggaaaa
gtcagtcctc
gtgtgtacaa
gctatatatt
300
actgaagctt
ttggatggtg
gggtgtagtg
ctagttatct
tgttttcgtt
cttgtggcaa
360
agttctctaa tggcaagtga ttattggctg gcatatgaaa cttcagcgga tcgtgccatg 420
tccttcaatc cttctctgtt tattgggata tacggtgtta ttgcagttgt ttcttcgttg 480
ctgatagtga tcaggatgta ttttgtgaca cttatggggc tcaagactgc ccaaatattt 540
ttcggacaga ttctttacag catactgcat gctcctatgt cattttttga cacaacacct 600
tccggaagaa ttctgagtcg g 621
<210> 18 <211> 165
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 18
gcatctaatg atcagaccaa cattgatgtc ttcctcccgt tttttatgaa tctcactttg 60
gccatgttta tcacactgct cggcatcatc atcatcacat gccaatattc ttggcctacc 120
gtactacttt tgattcctct gggttggctt aatatctggt accgg 165
<210> 19 <211> 295
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 19
ggatattatc ttgcaacatc tcgtgaattg actcggcttg actcaattac aaaagcacct 60
gttattcatc atttctctga aagcatctca ggtgttatga ctatacgttg ctttaggaag 120
caggagatgt tttgtaacga gaatgtaaac cgagtgaatt ccaatctgcg aatggatttc 180
cacaacaatg gatccaatga atggttgggc tttcgactgg aattgatggg aagcttactt 240
ctttgtgttt ctgcaatgtt catgattgtc ttacctagca gcatcatcaa gccag 295
<210> 20 <211> 215 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 20
aaaatgttgg tttgtcacta tcatatggct tgtctcttaa tagtgtccta ttctggtcca 60
tctttgtgag ttgctttgtg gaaaataaaa tggtttctgt cgaaagatta aaacagttct 120
cagaaatacc atcagaagca gagtggagaa agatggattt tctcccacct tcaagttggc 180
caagccgtgg gaatgttgag cttgaaaacg tgcag 215
<210> 21 <211> 306 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 21
gttagatatc gtccgaacac tcctctagtg cttaaaggag ttactctcag cattagaggg 60
ggagagaaga taggtgttgt tggtcgtaca gggggtggaa aatcaacatt aattcaagtt 120
ttctttcgtt tggtggagcc tgcagctgga agaataatca ttgatgacgt agatatatcc 180
agacttgggc ttcatgatct tagatctcgc ttcgggatca ttccccaaga gccagtcctt 240
tttgaaggaa ctgtgagaag caacattgac cccattggac aatattcaga tgatgaaatt 300
<210> 22
<211> 64
<212> ДНК
-1 о ^ т\т-:"
tggaag 306
<213> Nicotiana tabacum
<400> 22
agcctcgaac gctgccaact caaagatgtg gtgtctttaa aacccgaaaa acttgattca 60 ccag 64
<210> 23 <211> 1281 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 23
aagagccagt cctttttgaa ggaactgtga gaagcaacat tgaccccatt ggacaatatt 60
cagatgatga aatttggaag gtaatctaac ttgctgactg aaataattta caaaaatctc 120
aaaatatagt acagagttag ccaaacatgt cttctgagtg ctgagatctt tttggattat 180
aaattctgta agagcaacat actatttgtt agtgagaaga aaagcatata ctccagtgtt 240
ttgttatctc ccagaatgtc tctaacatga aatcgtgtac attgcagagc ctcgaacgct 300
gccaactcaa agatgtggtg tctttaaaac ccgaaaaact tgattcacca ggtaaatttt 360
cctcctctac gtcatccttg tggttctttg cggaattatg caaccaactt tttatgtgtt 420
tcaaatatat atactgataa ctgaatactg tcattggtaa atcatagttg ttgataacgg 480
agataactgg agtgtcggac agaggcagct tctttgcttg ggaagagtga tgctaaaacg 540
tagcagactt ctatttatgg atgaggcaac tgcctctgtt gattcacaga cagatgcagt 600
gattcagaaa atcatccgcg aggactttgc ggcctgtact ataatcagca ttgcccacag 660
aataccaaca gtcatggact gtgatagagt tcttgttata gatgcaggtg ctgatttctc 720
tccttttact ttgtacctta ttttgaatct ggtaaatgat tatttatctg tatgtgatgg 780
tttccaacca atcatagtca gtacctttat gaagaaattg cctaatgtta gccaagtagt 840
agtaaatgca tgaagtcatt agcctatttg ttttggattt tgtgagtttc atacttcaaa 900
ctggaagctt atgctatact atctgatccc ttgtttgtat agattgcttt cttttccttt 960
ttctcggatt tatcttatat ataagcggac agagtaaaag aatgtaaaca tgcgtaattt 1020
gacctattat agcagattat ttgtcttatt ttccaggtcg ctgattccac ttattaggag 1080
tagttacacg tatttatctt ttaagtgaaa taatagtgta aagtttcttt tggcactgtc 1140
ggtgtaaaga agttaaactc ctttctttaa ccccggcatt tcttattcat gcaggaatag 1200
caaaagagtt tgacaaacca tctcgtttgc ttgaaaggcc ttcacttttt ggggctttgg 1260
ttcaagaata tgccaaccga t 1281
<210> 24
<211> 1488
<212> БЕЛОК
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1357)..(1357)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1362)..(1363)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1366)..(1366)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1385)..(1385)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1392)..(1392)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1398)..(1398)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1432)..(1433)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1442)..(1442)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1457)..(1457)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1463)..(1463)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1479)..(1479)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1481)..(1481)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<400> 24
Met Asp Met Arg Asn Ser Met Ser Ser Glu Ser Cys Leu Ala Ser Leu
1 5 10 15
Ser Cys Ser Ala Ser Thr Phe Gln Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Val
20 25 30
Lys Trp Leu Arg Phe Ile Phe Leu Ser Pro Cys Pro Gln Arg Thr Leu
35 40 45
Leu Ser Ser Ile Asp Val Leu Leu Leu Leu Thr Phe Ile Val Phe Ala
50 55 60
Val Gln Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Ser Asn Glu His Ser Thr Ser
65 70 75 80
Ser Ile Asp Lys Pro Leu Ile Ala His Asn Arg Thr Ser Ser Pro Trp
85 90 95
Lys Val Ile Asp Gly Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Ala Ile Thr His Val
100 105 110
Val Ile Thr Ile Leu Ile Val His Glu Lys Arg Phe His Ala Ile Ser
115 120 125
His Pro Leu Ser Leu Arg Val Phe Trp Ile Ala Asn Phe Val Val Met
130 135 140
Ser Leu Phe Phe Gly Cys Gly Ile Thr Arg Leu Val Ser Leu Lys Glu
145 150 155 160
Ile Asp Pro Asn Leu Arg Met Asp Asp Ile Ser Ser Leu Val Ser Phe
165 170 175
Pro Ile Ser Val Val Leu Phe Ile Val Ala Ile Lys Gly Ser Thr Gly
180 185 190
Val Ala Val Ile Ser Asp Ser Glu Ser His Leu Ser Asp Glu Thr Asn
195 200 205
Gly Tyr Glu Leu Leu Asp Lys Ser Ser Val Ser Gly Phe Ala Ser Ala
210 215 220
Ser Leu Ile Ser Lys Ala Phe Trp Ile Trp Met Asn Pro Leu Leu Gln
225 230 235 240
Lys Gly Tyr Lys Ser Pro Leu Lys Ile Asp Glu Val Pro Ser Leu Ser
245 250 255
Pro Leu His Arg Ala Glu Lys Met Ser Gln Leu Phe Glu Arg Asn Trp
260 265 270
Pro Lys Pro Glu Glu Ile Ser Lys His Pro Val Arg Thr Thr Leu Leu
275 280 285
Arg Cys Phe Trp Lys Glu Val Ile Phe Thr Ala Ile Leu Ala Val Ile
290 295 300
Arg Val Cys Val Met Tyr Val Gly Pro Thr Leu Ile Gln Arg Phe Val
305 310 315 320
Asp Tyr Thr Ala Gly Lys Arg Thr Ser Pro Tyr Glu Gly Tyr Tyr Leu
325 330 335
Ile Gly Thr Leu Leu Ile Ala Lys Phe Val Glu Val Leu Thr Ser His
340 345 350
Gln Phe Asn Phe Asn Ser Gln Lys Leu Gly Met Leu Ile Arg Ala Thr
355 360 365
Leu Leu Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Gly Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala
370 375 380
Arg Gln Ala His Gly Val Gly Gln Ile Val Asn Tyr Met Ala Val Asp
385 390 395 400
Ala Gln Gln Leu Ser Asp Met Met Leu Gln Leu His Ser Ile Trp Leu
405 410 415
Met Pro Leu Gln Val Ser Val Ala Leu Gly Ile Leu Tyr Thr Tyr Leu
420 425 430
Gly Ala Ser Thr Val Val Thr Leu Ala Gly Leu Ala Ala Val Met Val
435 440 445
Phe Val Val Phe Gly Thr Lys Arg Asn Asn Arg Phe Gln Phe Asn Ile
450 455 460
Met Lys Asn Arg Asp Ser Arg Met Lys Ala Thr Asn Glu Met Leu Asn
465 470 475 480
Tyr Met Arg Val Ile Lys Phe Gln Ala Trp Glu Glu His Phe Asn Lys
485 490 495
Arg Ile Glu Ser Phe Arg Glu Ser Glu Tyr Gly Trp Leu Ser Lys Phe
500 505 510
Leu Tyr Ser Ile Ala Gly Asn Ile Ile Val Leu Trp Ser Thr Pro Leu
515 520 525
Leu Val Ala Thr Leu Thr Phe Gly Ser Ala Ile Leu Leu Gly Ile Pro
530 535 540
Leu Gly Ala Gly Thr Val Phe Thr Ala Thr Ser Leu Phe Lys Met Leu
545 550 555 560
Gln Glu Pro Ile Arg Ala Phe Pro Gln Ser Met Ile Ser Leu Ser Gln
565 570 575
Ala Met Ile Ser Leu Asp Arg Leu Asp Lys Tyr Met Met Ser Lys Glu
580 585 590
Leu Val Asp Lys Ala Val Glu Arg Leu Glu Gly Cys Gly Gly Thr Ile
595 600 605
Ala Met Gln Val Lys Asp Gly Ala Phe Cys Trp Asp Asp Glu Asn Ser
610 615 620
Lys Glu Glu Leu Lys Asn Val Asn Phe Glu Ile Arg Lys Gly Glu Leu
625 630 635 640
Ala Ala Val Val Gly Thr Val Gly Ala Gly Lys Ser Ser Leu Leu Ala
645 650 655
Ser Val Leu Gly Glu Met His Lys Leu Ser Gly Gln Val Thr Ile Cys
660 665 670
Gly Ser Thr Ala Tyr Val Ala Gln Thr Ser Trp Ile Gln Asn Gly Thr
675 680 685
Ile Gln Glu Asn Ile Leu Phe Gly Met Pro Met Asn Arg Asp Arg Tyr
690 695 700
Lys Glu Val Ile Arg Val Cys Cys Leu Glu Lys Asp Leu Glu Ile Met
705 710 715 720
Glu Phe Gly Asp Gln Thr Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Asn Leu Ser
725 730 735
Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile Gln Leu Ala Arg Ala Val Tyr Gln Asp
740 745 750
Cys Asp Ile Tyr Leu Leu Asp Asp Val Phe Ser Ala Val Asp Ala His
755 760 765
Thr Gly Ser Glu Ile Phe Lys Glu Cys Val Arg Gly Ile Leu Lys Asp
770 775 780
Lys Thr Ile Leu Leu Val Thr His Gln Val Asp Phe Leu His Asn Val
785 790 795 800
Asp Leu Ile Leu Val Met Arg Asp Gly Met Ile Val Gln Ser Gly Lys
805 810 815
Tyr Asn Glu Ile Leu Glu Ala Gly Met Asp Phe Lys Glu Leu Val Ala
820 825 830
Ala His Glu Thr Ser Leu Glu Leu Val Asp Val Glu Thr Thr Lys Glu
835 840 845
Ser Asn Ala Ser Leu Glu Glu Ser Lys Ser Ser Arg Arg Leu Ser Lys
850 855 860
Glu Glu Asn Gly Asp Asp Lys Ser Gln Gln Ser Thr Ser Asp Arg Gly
865 870 875 880
Asp Ser Lys Leu Ile Lys Glu Glu Glu Arg Glu Thr Gly Lys Val Ser
885 890 895
Pro Arg Val Tyr Lys Leu Tyr Ile Thr Glu Ala Phe Gly Trp Trp Gly
900 905 910
Val Val Leu Val Ile Leu Phe Ser Phe Leu Trp Gln Ser Ser Leu Met
915 920 925
Ala Ser Asp Tyr Trp Leu Ala Tyr Glu Thr Ser Ala Asp Arg Ala Met
930 935 940
Ser Phe Asn Pro Ser Leu Phe Ile Gly Ile Tyr Gly Val Ile Ala Val
945 950 955 960
Val Ser Ser Leu Leu Ile Val Ile Arg Met Tyr Phe Val Thr Leu Met
965 970 975
Gly Leu Lys Thr Ala Gln Ile Phe Phe Gly Gln Ile Leu Tyr Ser Ile
980 985 990
Leu His Ala Pro Met Ser Phe Phe Asp Thr Thr Pro Ser Gly Arg Ile
995 1000 1005
Leu Ser Arg Ala Ser Asn Asp Gln Thr Asn Ile Asp Val Phe Leu
1010 1015 1020
Pro Phe Phe Met Asn Leu Thr Leu Ala Met Phe Ile Thr Leu Leu
1025 1030 1035
Gly Ile Ile Ile Ile Thr Cys Gln Tyr Ser Trp Pro Thr Val Leu
1040 1045 1050
Leu Leu Ile Pro Leu Gly Trp Leu Asn Ile Trp Tyr Arg Gly Tyr
1055 1060 1065
Tyr Leu Ala Thr Ser Arg Glu Leu Thr Arg Leu Asp Ser Ile Thr
1070 1075 1080
Lys Ala Pro Val Ile His His Phe Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val
1085 1090 1095
Met Thr Ile Arg Cys Phe Arg Lys Gln Glu Met Phe Cys Asn Glu
1100 1105 1110
Asn Val Asn Arg Val Asn Ser Asn Leu Arg Met Asp Phe His Asn
1115 1120 1125
Asn Gly Ser Asn Glu Trp Leu Gly Phe Arg Leu Glu Leu Met Gly
1130 1135 1140
Ser Leu Leu Leu Cys Val Ser Ala Met Phe Met Ile Val Leu Pro
1145 1150 1155
Ser Ser Ile Ile Lys Pro Glu Asn Val Gly Leu Ser Leu Ser Tyr
1160 1165 1170
Gly Leu Ser Leu Asn Ser Val Leu Phe Trp Ser Ile Phe Val Ser
1175 1180 1185
Cys Phe Val Glu Asn Lys Met Val Ser Val Glu Arg Leu Lys Gln
1190 1195 1200
Phe Ser Glu Ile Pro Ser Glu Ala Glu Trp Arg Lys Met Asp Phe
1205 1210 1215
Leu Pro Pro Ser Ser Trp Pro Ser Arg Gly Asn Val Glu Leu Glu
1220 1225 1230
Asn Val Gln Val Arg Tyr Arg Pro Asn Thr Pro Leu Val Leu Lys
1235 1240 1245
Gly Val Thr Leu Ser Ile Arg Gly Gly Glu Lys Ile Gly Val Val
1250 1255 1260
Gly Arg Thr Gly Gly Gly Lys Ser Thr Leu Ile Gln Val Phe Phe
1265 1270 1275
Arg Leu Val Glu Pro Ala Ala Gly Arg Ile Ile Ile Asp Asp Val
1280 1285 1290
Asp Ile Ser Arg Leu Gly Leu His Asp Leu Arg Ser Arg Phe Gly
1295 1300 1305
Ile Ile Pro Gln Glu Pro Val Leu Phe Glu Gly Thr Val Arg Ser
1310 1315 1320
Asn Ile Asp Pro Ile Gly Gln Tyr Ser Asp Asp Glu Ile Trp Lys
1325 1330 1335
Glu Pro Arg Thr Leu Pro Thr Gln Arg Cys Gly Val Phe Lys Thr
1340 1345 1350
Arg Lys Thr Xaa Phe Thr Ser Cys Xaa Xaa Arg Arg Xaa Leu Glu
1355 1360 1365
Cys Arg Thr Glu Ala Ala Ser Leu Leu Gly Lys Ser Asp Ala Lys
1370 1375 1380
Thr Xaa Gln Thr Ser Ile Tyr Gly Xaa Gly Asn Cys Leu Cys Xaa
1385 1390 1395
Phe Thr Asp Arg Cys Ser Asp Ser Glu Asn His Pro Arg Gly Leu
1400 1405 1410
Cys Gly Leu Tyr Tyr Asn Gln His Cys Pro Gln Asn Thr Asn Ser
1415 1420 1425
His Gly Leu Xaa Xaa Ser Ser Cys Tyr Arg Cys Arg Cys Xaa Phe
1430 1435 1440
Leu Ser Phe Tyr Phe Val Pro Tyr Phe Glu Ser Gly Lys Xaa Leu
1445 1450 1455
Phe Ile Cys Met Xaa Trp Phe Pro Thr Asn His Ser Gln Tyr Leu
1460 1465 1470
Tyr Glu Glu Ile Ala Xaa Cys Xaa Pro Ser Ser Ser Lys Cys Met
1475 1480 1485
<210> 25
<211> 1488
<212> БЕЛОК
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (3)..(3)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (13)..(13)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (35)..(35)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (72)..(72)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (86)..(86)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (99)..(99)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (113)..(113)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (117)..(118)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (142)..(142)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (144)..(144)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (165)..(165)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (170)..(170)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (173)..(173)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (195)..(195)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (203)..(203)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (218)..(218)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (226)..(226)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (235)..(235)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (303)..(303)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (311)..(311)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (337)..(337)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (341)..(342)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (349)..(349)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (378)..(378)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (394)..(394)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (407)..(407)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (425)..(425)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (438)..(438)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (440)..(440)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (446)..(446)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (465)..(465)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (472)..(472)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (485)..(485)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (529)..(529)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (571)..(571)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (578)..(578)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (588)..(589)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (593)..(593)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (601)..(601)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (612)..(612)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (628)..(628)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (631)..(631)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (643)..(643)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (699)..(699)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (707)..(707)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (719)..(719)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (728)..(728)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (758)..(758)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<221> УЧАСТОК
<222> (778)..(778)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (802)..(802)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (810)..(810)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (821)..(821)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (830)..(831)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (838)..(838)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (885)..(885)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (913)..(913)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (915)..(915)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (927)..(927)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (965)..(967)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (973)..(973)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1009)..(1009)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1027)..(1027)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1055)..(1055)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1076)..(1076)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1099)..(1099)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1115)..(1115)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1118)..(1118)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1141)..(1141)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1154)..(1154)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1187)..(1187)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1201)..(1201)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1245)..(1245)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1260)..(1260)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1273)..(1273)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1288)..(1288)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1293)..(1293)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1321)..(1321)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1488)..(1488)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<400> 25
Trp Ile Xaa Gly Thr Val Cys Leu Gln Asn Leu Val Xaa His His Phe
1 5 10 15
Leu Val Leu Pro Pro His Phe Asn Arg Gln Arg Ile Gln Gln Leu Leu
20 25 30
Asn Gly Xaa Asp Ser Phe Ser Ser Leu His Val His Lys Gly Leu Phe
35 40 45
Tyr Leu Pro Leu Met Cys Cys Phe Cys Leu Leu Ser Leu Tyr Leu Gln
50 55 60
Tyr Lys Ser Cys Thr Gln Ser Xaa Gly Pro Met Ser Thr Leu Leu Leu
65 70 75 80
Ala Leu Ile Ser Leu Xaa Leu His Thr Thr Gly Leu Leu Arg Leu Gly
85 90 95
Lys Ser Xaa Met Asp Cys Ile Gly Cys Phe Arg Arg Leu His Met Leu
100 105 110
Xaa Ser Leu Tyr Xaa Xaa Phe Met Arg Lys Asp Phe Thr Leu Phe Pro
115 120 125
Ile His Cys Pro Cys Ala Cys Phe Gly Leu Gln Thr Leu Xaa Leu Xaa
130 135 140
Val Cys Ser Leu Val Val Gly Ser Gln Gly Leu Cys His Leu Arg Lys
145 150 155 160
Leu Ile Leu Ile Xaa Glu Trp Met Ile Xaa Val His Xaa Phe His Phe
165 170 175
Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu Leu Pro Leu Lys Val Arg Pro Glu
180 185 190
Leu Leu Xaa Leu Val Ile Leu Asn Leu Thr Xaa Val Met Lys Pro Met
195 200 205
Val Met Asn Ser Trp Ile Asn Pro Val Xaa Val Ala Leu Leu Gln Leu
210 215 220
Leu Xaa Tyr Arg Lys Pro Phe Gly Phe Gly Xaa Thr Leu Tyr Cys Lys
225 230 235 240
Lys Val Thr Ser His Leu Ser Arg Leu Met Lys Phe Leu His Phe Pro
245 250 255
His Cys Ile Glu Gln Arg Lys Cys Leu Asn Phe Ser Lys Glu Ile Gly
260 265 270
Leu Asn Leu Lys Lys Tyr Gln Ser Ile Leu Ser Glu Gln His Cys Cys
275 280 285
Val Ala Phe Gly Arg Lys Leu Phe Leu Leu Pro Phe Leu Gln Xaa Leu
290 295 300
Gly Tyr Val Leu Cys Met Xaa Gly Gln His Ser Tyr Lys Asp Leu Leu
305 310 315 320
Ile Thr Gln Gln Glu Arg Gly His Leu Leu Met Lys Asp Thr Thr Leu
325 330 335
Xaa Glu Leu Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Trp Lys Phe Xaa Pro Leu Ile
340 345 350
Ser Ser Thr Leu Thr Pro Lys Ser Leu Ala Cys Leu Phe Glu Arg His
355 360 365
Phe Ser Leu Leu Cys Ile Arg Arg Gly Xaa Gly Cys His Ala Gln Leu
370 375 380
Asp Arg Leu Met Val Leu Asp Arg Leu Xaa Ile Ile Trp Pro Ser Met
385 390 395 400
Leu Ser Ser Cys Pro Ile Xaa Cys Tyr Ser Tyr Ile Pro Phe Gly Ser
405 410 415
Cys His Cys Lys Phe Leu Trp Leu Xaa Ala Ser Phe Ile Leu Thr Ser
420 425 430
Val Leu Gln Leu Leu Xaa Arg Xaa Leu Asp Leu Gln Gln Xaa Trp Tyr
435 440 445
Leu Trp Cys Leu Glu Leu Lys Glu Thr Thr Gly Phe Asn Leu Thr Ser
450 455 460
Xaa Arg Ile Val Ile Leu Glu Xaa Lys Arg Gln Met Arg Cys Leu Ile
465 470 475 480
Ile Cys Ala Leu Xaa Ser Ser Arg His Gly Lys Asn Ile Leu Thr Lys
485 490 495
Glu Leu Asn Pro Ser Ala Asn Pro Ser Met Asp Gly Cys Pro Ser Ser
500 505 510
Cys Thr Gln Ser Leu Gly Ile Ser Leu Ser Cys Gly Ala Leu Leu Phe
515 520 525
Xaa Trp Leu His Ser Leu Leu Glu Val Gln Ser Cys Trp Glu Ser Arg
530 535 540
Leu Val Gln Gly Gln Cys Ser Leu Gln His Leu Ser Ser Arg Cys Cys
545 550 555 560
Arg Asn Arg Ser Gly Leu Ser Leu Asn Pro Xaa Ser His Phe His Lys
565 570 575
Gln Xaa Tyr Leu Leu Ile Asp Trp Thr Asn Ile Xaa Xaa Val Arg Ser
580 585 590
Xaa Trp Ile Lys Leu Trp Lys Asp Xaa Lys Val Val Gly Val Gln Leu
595 600 605
Leu Cys Arg Xaa Lys Met Glu Leu Phe Ala Gly Met Met Lys Thr Val
610 615 620
Lys Lys Asn Xaa Lys Met Xaa Thr Leu Arg Leu Glu Lys Glu Ser Leu
625 630 635 640
Gln Gln Xaa Trp Gly Gln Leu Gly Arg Gly Ser Leu Pro Ser Leu His
645 650 655
Leu Tyr Leu Val Arg Cys Thr Ser Cys Arg Val Arg Ser Gln Phe Val
660 665 670
Val Gln Leu Pro Met Leu His Lys His Arg Gly Phe Arg Met Ala Arg
675 680 685
Tyr Lys Lys Ile Ser Cys Leu Val Cys Gln Xaa Thr Glu Thr Asp Thr
690 695 700
Arg Lys Xaa Ser Gly Phe Ala Ala Trp Arg Arg Thr Trp Lys Xaa Trp
705 710 715 720
Ser Leu Glu Thr Arg Leu Lys Xaa Glu Asn Val Ala Ser Thr Ser Val
725 730 735
Val Val Arg Ser Ser Glu Ser Ser Leu Gln Glu Leu Phe Thr Arg Thr
740 745 750
Val Ile Phe Ile Phe Xaa Met Met Tyr Ser Val Gln Leu Met Leu Thr
755 760 765
Leu Ala Leu Lys Ser Ser Arg Asn Val Xaa Gly Glu Phe Leu Lys Ile
770 775 780
Lys Pro Phe Cys Leu Ser His Thr Lys Leu Thr Ser Cys Ile Met Leu
785 790 795 800
Thr Xaa Ser Leu Ser Cys Glu Met Gly Xaa Ser Cys Asn Leu Ala Asn
805 810 815
Ile Met Arg Tyr Xaa Lys Leu Glu Trp Ile Leu Lys Ser Xaa Xaa Leu
820 825 830
His Met Arg Pro Leu Xaa Asn Leu Leu Thr Trp Lys Gln Pro Lys Arg
835 840 845
Ala Met Pro Pro Leu Lys Asn Gln Asn Leu Leu Glu Asp Tyr Leu Arg
850 855 860
Lys Lys Thr Glu Met Ile Asn Leu Asn Ser Leu His Leu Ile Gly Gly
865 870 875 880
Ile Leu Asn Leu Xaa Arg Lys Lys Lys Glu Lys Leu Glu Lys Ser Val
885 890 895
Leu Val Cys Thr Ser Tyr Ile Leu Leu Lys Leu Leu Asp Gly Gly Val
900 905 910
Xaa Cys Xaa Leu Ser Cys Phe Arg Ser Cys Gly Lys Val Leu Xaa Trp
915 920 925
Gln Val Ile Ile Gly Trp His Met Lys Leu Gln Arg Ile Val Pro Cys
930 935 940
Pro Ser Ile Leu Leu Cys Leu Leu Gly Tyr Thr Val Leu Leu Gln Leu
945 950 955 960
Phe Leu Arg Cys Xaa Xaa Xaa Ser Gly Cys Ile Leu Xaa His Leu Trp
965 970 975
Gly Ser Arg Leu Pro Lys Tyr Phe Ser Asp Arg Phe Phe Thr Ala Tyr
980 985 990
Cys Met Leu Leu Cys His Phe Leu Thr Gln His Leu Pro Glu Glu Phe
995 1000 1005
Xaa Val Gly His Leu Met Ile Arg Pro Thr Leu Met Ser Ser Ser
1010 1015 1020
Arg Phe Leu Xaa Ile Ser Leu Trp Pro Cys Leu Ser His Cys Ser
1025 1030 1035
Ala Ser Ser Ser Ser His Ala Asn Ile Leu Gly Leu Pro Tyr Tyr
1040 1045 1050
Phe Xaa Phe Leu Trp Val Gly Leu Ile Ser Gly Thr Gly Asp Ile
1055 1060 1065
Ile Leu Gln His Leu Val Asn Xaa Leu Gly Leu Thr Gln Leu Gln
1070 1075 1080
Lys His Leu Leu Phe Ile Ile Ser Leu Lys Ala Ser Gln Val Leu
1085 1090 1095
Xaa Leu Tyr Val Ala Leu Gly Ser Arg Arg Cys Phe Val Thr Arg
1100 1105 1110
Met Xaa Thr Glu Xaa Ile Pro Ile Cys Glu Trp Ile Ser Thr Thr
1115 1120 1125
Met Asp Pro Met Asn Gly Trp Ala Phe Asp Trp Asn Xaa Trp Glu
1130 1135 1140
Ala Tyr Phe Phe Val Phe Leu Gln Cys Ser Xaa Leu Ser Tyr Leu
1145 1150 1155
Ala Ala Ser Ser Ser Gln Lys Met Leu Val Cys His Tyr His Met
1160 1165 1170
Ala Cys Leu Leu Ile Val Ser Tyr Ser Gly Pro Ser Leu Xaa Val
1175 1180 1185
Ala Leu Trp Lys Ile Lys Trp Phe Leu Ser Lys Asp Xaa Asn Ser
1190 1195 1200
Ser Gln Lys Tyr His Gln Lys Gln Ser Gly Glu Arg Trp Ile Phe
1205 1210 1215
Ser His Leu Gln Val Gly Gln Ala Val Gly Met Leu Ser Leu Lys
1220 1225 1230
Thr Cys Arg Leu Asp Ile Val Arg Thr Leu Leu Xaa Cys Leu Lys
1235 1240 1245
Glu Leu Leu Ser Ala Leu Glu Gly Glu Arg Arg Xaa Val Leu Leu
1250 1255 1260
Val Val Gln Gly Val Glu Asn Gln His Xaa Phe Lys Phe Ser Phe
1265 1270 1275
Val Trp Trp Ser Leu Gln Leu Glu Glu Xaa Ser Leu Met Thr Xaa
1280 1285 1290
Ile Tyr Pro Asp Leu Gly Phe Met Ile Leu Asp Leu Ala Ser Gly
1295 1300 1305
Ser Phe Pro Lys Ser Gln Ser Phe Leu Lys Glu Leu Xaa Glu Ala
1310 1315 1320
Thr Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ile Gln Met Met Lys Phe Gly Arg
1325 1330 1335
Ser Leu Glu Arg Cys Gln Leu Lys Asp Val Val Ser Leu Lys Pro
1340 1345 1350
Glu Lys Leu Asp Ser Pro Val Val Asp Asn Gly Asp Asn Trp Ser
1355 1360 1365
Val Gly Gln Arg Gln Leu Leu Cys Leu Gly Arg Val Met Leu Lys
1370 1375 1380
Arg Ser Arg Leu Leu Phe Met Asp Glu Ala Thr Ala Ser Val Asp
1385 1390 1395
Ser Gln Thr Asp Ala Val Ile Gln Lys Ile Ile Arg Glu Asp Phe
1400 1405 1410
Ala Ala Cys Thr Ile Ile Ser Ile Ala His Arg Ile Pro Thr Val
1415 1420 1425
Met Asp Cys Asp Arg Val Leu Val Ile Asp Ala Gly Ala Asp Phe
1430 1435 1440
Ser Pro Phe Thr Leu Tyr Leu Ile Leu Asn Leu Val Asn Asp Tyr
1445 1450 1455
Leu Ser Val Cys Asp Gly Phe Gln Pro Ile Ile Val Ser Thr Phe
1460 1465 1470
Met Lys Lys Leu Pro Asn Val Ser Gln Val Val Val Asn Ala Xaa
1475 1480 1485
<210> 26
<211> 1487
<212> БЕЛОК
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (32)..(32)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (52)..(52)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (75)..(75)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (80)..(80)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (82)..(83)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (120)..(120)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (158)..(158)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (161)..(161)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (163)..(163)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (168)..(168)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (187)..(187)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (196)..(197)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (199)..(199)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (204)..(205)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (210)..(210)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (214)..(214)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (249)..(250)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (259)..(259)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (273)..(273)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (275)..(275)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (304)..(304)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (320)..(320)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (331)..(331)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (356)..(356)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (374)..(374)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (384)..(384)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (454)..(454)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (462)..(462)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (468)..(468)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (470)..(470)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (476)..(476)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (479)..(479)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (494)..(494)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<221> УЧАСТОК
<222> (498)..(498)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (581)..(582)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (590)..(590)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (595)..(595)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (620)..(621)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (624)..(624)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (633)..(633)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (635)..(635)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (660)..(660)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (726)..(726)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (753)..(753)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (759)..(759)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (765)..(765)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (771)..(771)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (782)..(782)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (784)..(784)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (794)..(794)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (798)..(798)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (800)..(800)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (817)..(818)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (827)..(827)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (834)..(834)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (841)..(841)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (853)..(853)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (863)..(863)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (869)..(870)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (877)..(878)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (882)..(882)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (905)..(905)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (930)..(930)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (936)..(936)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1000)..(1000)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1013)..(1014)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1019)..(1019)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1061)..(1061)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1074)..(1074)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1079)..(1079)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1092)..(1092)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1104)..(1104)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1111)..(1111)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1132)..(1132)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1158)..(1158)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1177)..(1178)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1193)..(1193)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1230)..(1230)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1232)..(1232)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1237)..(1237)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1247)..(1247)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1254)..(1254)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1290)..(1291)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1301)..(1301)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1303)..(1303)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1317)..(1317)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1325)..(1325)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1333)..(1334)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1351)..(1351)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1380)..(1380)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1382)..(1382)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1404)..(1404)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1418)..(1418)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1437)..(1437)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1452)..(1452)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1455)..(1455)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1469)..(1469)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<221> УЧАСТОК
<222> (1474)..(1474)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1483)..(1485)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<400> 26
Gly Tyr Glu Glu Gln Tyr Val Phe Arg Ile Leu Phe Ser Ile Thr Phe
1 5 10 15
Leu Phe Cys Leu His Ile Ser Ile Val Arg Gly Phe Ser Ser Cys Xaa
20 25 30
Met Val Lys Ile His Phe Pro Leu Ser Met Ser Thr Lys Asp Ser Ser
35 40 45
Ile Phe His Xaa Cys Ala Ala Phe Ala Tyr Phe His Cys Ile Cys Ser
50 55 60
Thr Lys Val Val Leu Lys Val Glu Val Gln Xaa Ala Leu Tyr Phe Xaa
65 70 75 80
His Xaa Xaa Ala Ser Asn Cys Thr Gln Gln Asp Phe Phe Ala Leu Glu
85 90 95
Ser His Arg Trp Thr Val Leu Val Val Ser Gly Asp Tyr Thr Cys Cys
100 105 110
Asn His Tyr Thr Asn Ser Ser Xaa Glu Lys Ile Ser Arg Tyr Phe Pro
115 120 125
Ser Thr Val Pro Ala Arg Val Leu Asp Cys Lys Leu Cys Ser Tyr Glu
130 135 140
Phe Val Leu Trp Leu Trp Asp His Lys Ala Cys Val Thr Xaa Gly Asn
145 150 155 160
Xaa Ser Xaa Phe Lys Asn Gly Xaa Tyr Lys Phe Ile Ser Phe Ile Ser
165 170 175
Tyr Phe Cys Cys Ser Leu His Cys Cys His Xaa Arg Phe Asp Arg Ser
180 185 190
Cys Cys Asn Xaa Xaa Phe Xaa Ile Ser Leu Lys Xaa Xaa Asn Gln Trp
195 200 205
Leu Xaa Thr Pro Gly Xaa Ile Gln Cys Glu Trp Leu Cys Phe Ser Phe
210 215 220
Ser Asn Ile Glu Ser Leu Leu Asp Leu Asp Glu Pro Phe Thr Ala Lys
225 230 235 240
Arg Leu Gln Val Thr Ser Gln Asp Xaa Xaa Ser Ser Phe Thr Phe Pro
245 250 255
Thr Ala Xaa Ser Arg Glu Asn Val Ser Thr Phe Arg Lys Lys Leu Ala
260 265 270
Xaa Thr Xaa Arg Asn Ile Lys Ala Ser Cys Pro Asn Asn Ile Ala Ala
275 280 285
Leu Leu Leu Glu Gly Ser Tyr Phe Tyr Cys His Ser Cys Ser Asn Xaa
290 295 300
Gly Met Cys Tyr Val Cys Arg Ala Asn Thr His Thr Lys Ile Cys Xaa
305 310 315 320
Leu His Ser Arg Lys Glu Asp Ile Ser Leu Xaa Arg Ile Leu Pro Tyr
325 330 335
Arg Asn Ser Pro Asn Ser Gln Ile Cys Gly Ser Ser Asn Leu Ser Ser
340 345 350
Val Gln Leu Xaa Leu Pro Lys Ala Trp His Ala Tyr Ser Ser Asp Thr
355 360 365
Ser His Phe Phe Val Xaa Glu Gly Val Lys Val Val Met Leu Ser Xaa
370 375 380
Thr Gly Ser Trp Cys Trp Thr Asp Cys Lys Leu Tyr Gly Arg Arg Cys
385 390 395 400
Ser Ala Ala Val Arg Tyr Asp Ala Thr Ala Thr Phe His Leu Ala His
405 410 415
Ala Ile Ala Ser Phe Cys Gly Phe Arg His Pro Leu Tyr Leu Pro Arg
420 425 430
Cys Phe Asn Cys Cys Asn Ala Ser Trp Thr Cys Ser Ser Asp Gly Ile
435 440 445
Cys Gly Val Trp Asn Xaa Lys Lys Gln Gln Val Ser Ile Xaa His His
450 455 460
Glu Glu Ser Xaa Phe Xaa Asn Glu Ser Asp Lys Xaa Asp Ala Xaa Leu
465 470 475 480
Tyr Ala Arg Tyr Lys Val Pro Gly Met Gly Arg Thr Phe Xaa Gln Lys
485 490 495
Asn Xaa Ile Leu Pro Arg Ile Arg Val Trp Met Val Val Gln Val Leu
500 505 510
Val Leu Asn Arg Trp Glu Tyr His Cys Leu Val Glu His Ser Ser Ser
515 520 525
Ser Gly Tyr Thr His Phe Trp Lys Cys Asn Leu Val Gly Asn Pro Ala
530 535 540
Trp Cys Arg Asp Ser Val His Cys Asn Ile Ser Leu Gln Asp Val Ala
545 550 555 560
Gly Thr Asp Gln Gly Phe Pro Ser Ile His Asp Leu Thr Phe Thr Ser
565 570 575
Asn Asp Ile Ser Xaa Xaa Ile Gly Gln Ile Tyr Asp Glu Xaa Gly Val
580 585 590
Ser Gly Xaa Ser Cys Gly Lys Thr Arg Arg Leu Trp Gly Tyr Asn Cys
595 600 605
Tyr Ala Gly Glu Arg Trp Ser Phe Leu Leu Gly Xaa Xaa Lys Gln Xaa
610 615 620
Arg Arg Ile Glu Lys Cys Lys Leu Xaa Asp Xaa Lys Arg Arg Ala Cys
625 630 635 640
Ser Ser Ser Gly Asp Ser Trp Gly Gly Glu Val Phe Pro Pro Cys Ile
645 650 655
Cys Thr Trp Xaa Asp Ala Gln Val Val Gly Ser Gly His Asn Leu Trp
660 665 670
Phe Asn Cys Leu Cys Cys Thr Asn Ile Val Asp Ser Glu Trp His Asp
675 680 685
Thr Arg Lys Tyr Pro Val Trp Tyr Ala Asn Glu Gln Arg Gln Ile Gln
690 695 700
Gly Ser Asp Pro Gly Leu Leu Leu Gly Glu Gly Leu Gly Asn Asn Gly
705 710 715 720
Val Trp Arg Pro Asp Xaa Asn Arg Arg Thr Trp His Gln Pro Gln Trp
725 730 735
Trp Ser Glu Ala Ala Asn Pro Ala Cys Lys Ser Cys Leu Pro Gly Leu
740 745 750
Xaa Tyr Leu Ser Ser Arg Xaa Cys Ile Gln Cys Ser Xaa Cys Ser His
755 760 765
Trp Leu Xaa Asn Leu Gln Gly Met Cys Glu Gly Asn Ser Xaa Arg Xaa
770 775 780
Asn His Phe Ala Cys His Thr Pro Ser Xaa Leu Leu Ala Xaa Cys Xaa
785 790 795 800
Pro Asp Pro Cys His Ala Arg Trp Asp Asp Arg Ala Ile Trp Gln Ile
805 810 815
Xaa Xaa Asp Ile Arg Ser Trp Asn Gly Phe Xaa Arg Ala Ser Ser Cys
820 825 830
Thr Xaa Asp Leu Phe Arg Thr Cys Xaa Arg Gly Asn Asn Gln Arg Glu
835 840 845
Gln Cys Leu Pro Xaa Arg Ile Lys Ile Phe Ser Lys Ile Ile Xaa Gly
850 855 860
Arg Lys Arg Arg Xaa Xaa Ile Ser Thr Val Tyr Ile Xaa Xaa Gly Gly
865 870 875 880
Phe Xaa Thr Tyr Lys Gly Arg Arg Lys Arg Asn Trp Lys Ser Gln Ser
885 890 895
Ser Cys Val Gln Ala Ile Tyr Tyr Xaa Ser Phe Trp Met Val Gly Cys
900 905 910
Ser Ala Ser Tyr Leu Val Phe Val Leu Val Ala Lys Phe Ser Asn Gly
915 920 925
Lys Xaa Leu Leu Ala Gly Ile Xaa Asn Phe Ser Gly Ser Cys His Val
930 935 940
Leu Gln Ser Phe Ser Val Tyr Trp Asp Ile Arg Cys Tyr Cys Ser Cys
945 950 955 960
Phe Phe Val Ala Asp Ser Asp Gln Asp Val Phe Cys Asp Thr Tyr Gly
965 970 975
Ala Gln Asp Cys Pro Asn Ile Phe Arg Thr Asp Ser Leu Gln His Thr
980 985 990
Ala Cys Ser Tyr Val Ile Phe Xaa His Asn Thr Phe Arg Lys Asn Ser
995 1000 1005
Glu Ser Gly Ile Xaa Xaa Ser Asp Gln His Xaa Cys Leu Pro Pro
1010 1015 1020
Val Phe Tyr Glu Ser His Phe Gly His Val Tyr His Thr Ala Arg
1025 1030 1035
His His His His His Met Pro Ile Phe Leu Ala Tyr Arg Thr Thr
1040 1045 1050
Phe Asp Ser Ser Gly Leu Ala Xaa Tyr Leu Val Pro Gly Ile Leu
1055 1060 1065
Ser Cys Asn Ile Ser Xaa Ile Asp Ser Ala Xaa Leu Asn Tyr Lys
1070 1075 1080
Ser Thr Cys Tyr Ser Ser Phe Leu Xaa Lys His Leu Arg Cys Tyr
1085 1090 1095
Asp Tyr Thr Leu Leu Xaa Glu Ala Gly Asp Val Leu Xaa Arg Glu
1100 1105 1110
Cys Lys Pro Ser Glu Phe Gln Ser Ala Asn Gly Phe Pro Gln Gln
1115 1120 1125
Trp Ile Gln Xaa Met Val Gly Leu Ser Thr Gly Ile Asp Gly Lys
1130 1135 1140
Leu Thr Ser Leu Cys Phe Cys Asn Val His Asp Cys Leu Thr Xaa
1145 1150 1155
Gln His His Gln Ala Arg Lys Cys Trp Phe Val Thr Ile Ile Trp
1160 1165 1170
Leu Val Ser Xaa Xaa Cys Pro Ile Leu Val His Leu Cys Glu Leu
1175 1180 1185
Leu Cys Gly Lys Xaa Asn Gly Phe Cys Arg Lys Ile Lys Thr Val
1190 1195 1200
Leu Arg Asn Thr Ile Arg Ser Arg Val Glu Lys Asp Gly Phe Ser
1205 1210 1215
Pro Thr Phe Lys Leu Ala Lys Pro Trp Glu Cys Xaa Ala Xaa Lys
1220 1225 1230
Arg Ala Gly Xaa Ile Ser Ser Glu His Ser Ser Ser Ala Xaa Arg
1235 1240 1245
Ser Tyr Ser Gln His Xaa Arg Gly Arg Glu Asp Arg Cys Cys Trp
1250 1255 1260
Ser Tyr Arg Gly Trp Lys Ile Asn Ile Asn Ser Ser Phe Leu Ser
1265 1270 1275
Phe Gly Gly Ala Cys Ser Trp Lys Asn Asn His Xaa Xaa Arg Arg
1280 1285 1290
Tyr Ile Gln Thr Trp Ala Ser Xaa Ser Xaa Ile Ser Leu Arg Asp
1295 1300 1305
His Ser Pro Arg Ala Ser Pro Phe Xaa Arg Asn Cys Glu Lys Gln
1310 1315 1320
His Xaa Pro His Trp Thr Ile Phe Arg Xaa Xaa Asn Leu Glu Gly
1325 1330 1335
Ala Ser Asn Ala Ala Asn Ser Lys Met Trp Cys Leu Xaa Asn Pro
1340 1345 1350
Lys Asn Leu Ile His Gln Leu Leu Ile Thr Glu Ile Thr Gly Val
1355 1360 1365
Ser Asp Arg Gly Ser Phe Phe Ala Trp Glu Glu Xaa Cys Xaa Asn
1370 1375 1380
Val Ala Asp Phe Tyr Leu Trp Met Arg Gln Leu Pro Leu Leu Ile
1385 1390 1395
His Arg Gln Met Gln Xaa Phe Arg Lys Ser Ser Ala Arg Thr Leu
1400 1405 1410
Arg Pro Val Leu Xaa Ser Ala Leu Pro Thr Glu Tyr Gln Gln Ser
1415 1420 1425
Trp Thr Val Ile Glu Phe Leu Leu Xaa Met Gln Val Leu Ile Ser
1430 1435 1440
Leu Leu Leu Leu Cys Thr Leu Phe Xaa Ile Trp Xaa Met Ile Ile
1445 1450 1455
Tyr Leu Tyr Val Met Val Ser Asn Gln Ser Xaa Ser Val Pro Leu
1460 1465 1470
Xaa Arg Asn Cys Leu Met Leu Ala Lys Xaa Xaa Xaa Met His
1475 1480 1485
<210> 27
<211> 4521 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 27
atggatatga ggaacagtat gtcttcagaa tcttgtttag catcactttc ttgttctgcc 60
tccacatttc aatcgtcaga ggattcagca gttgttaaat ggttaagatt cattttcctc 120
tctccatgtc cacaaaggac tcttctatct tccattgatg tgctgctttt gcttactttc 180
attgtatttg cagtacaaaa gttgtactca aagttgaggt ccaatgagca ctctacttct 240
agcattgata agcctctaat tgcacacaac aggacttctg ttagaaccaa tctttggttt 300
aagctgtctc tgattttgtc agctatttta gccttatctt ctatagtttt atgcattttg 360
gttattgtgg gaaattccca gtcgccttgg aaagtcatag atggactgta ttggttgttt 420
caggcgatta cacatgttgt aatcactata ctaatagttc atgagaaaag atttcacgct 480
atttcccatc cactgtccct gcgcgtgttt tggattgcaa actttgtagt tatgagtttg 540
ttctttggtt gtgggatcac aaggcttgtg tcacttaagg aaattgatcc taatttaaga 600
atggatgata taagttcatt agtttcattt cctatttctg ttgttctctt cattgttgcc 660
attaaaggtt cgaccggagt tgctgtaatt agtgattctg aatctcactt aagtgatgaa 720
accaatggtt atgaactcct ggataaatcc agtgtgagtg gctttgcttc agcttctcta 780
atatcgaaag ccttttggat ttggatgaac cctttactgc aaaaaggtta caagtcacct 840
ctcaagattg atgaagttcc ttcactttcc ccactgcata gagcagagaa aatgtctcaa 900
cttttcgaaa gaaattggcc taaacctgaa gaaatatcaa agcatcctgt ccgaacaaca 960
ttgctgcgtt gcttttggaa ggaagttatt tttactgcca ttcttgcagt aattagggta 1020
tgtgttatgt atgtagggcc aacactcata caaagatttg ttgattacac agcaggaaag 1080
aggacatctc cttatgaagg atactacctt ataggaactc tcctaatagc caaatttgtg 1140
gaagttctaa cctctcatca gttcaacttt aactcccaaa agcttggcat gcttattcga 1200
gcgacacttc tcacttcttt gtataagaag gggttaaggt tgtcatgctc agctagacag 1260
gctcatggtg ttggacagat tgtaaattat atggccgtcg atgctcagca gctgtccgat 1320
atgatgctac agctacattc catttggctc atgccattgc aagtttctgt ggctttaggc 1380
atcctttata cttacctcgg tgcttcaact gttgtaacgc tagctggact tgcagcagtg 1440
atggtatttg tggtgtttgg aactaaaaga aacaacaggt ttcaatttaa catcatgaag 1500
aatcgtgatt ctagaatgaa agcgacaaat gagatgctta attatatgcg cgttataaag 1560
ttccaggcat gggaagaaca ttttaacaaa agaattgaat ccttccgcga atccgagtat 1620
ggatggttgt ccaagttctt gtactcaatc gctgggaata tcattgtctt gtggagcact 1680
cctcttctag tggctacact cacttttgga agtgcaatct tgttgggaat cccgcttggt 1740
gcagggacag tgttcactgc aacatctctc ttcaagatgt tgcaggaacc gatcagggct 1800
ttccctcaat ccatgatctc actttcacaa gcaatgatat ctcttgatag attggacaaa 1860
tatatgatga gtaaggagtt agtggataaa gctgtggaaa gactagaagg ttgtgggggt 1920
acaattgcta tgcaggtgaa agatggagct ttttgctggg atgatgaaaa cagtaaagaa 1980
gaattgaaaa atgtaaactt tgagattaga aaaggagagc ttgcagcagt agtggggaca 2040
gttggggcgg ggaagtcttc cctccttgca tctgtacttg gtgagatgca caagttgtcg 2100
ggtcaggtca caatttgtgg ttcaactgcc tatgttgcac aaacatcgtg gattcagaat 2160
ggcacgatac aagaaaatat cctgtttggt atgccaatga acagagacag atacaaggaa 2220
gtgatccggg tttgctgctt ggagaaggac ttggaaataa tggagtttgg agaccagact 2280
gaaataggag aacgtggcat caacctcagt ggtggtcaga agcagcgaat ccagcttgca 2340
agagctgttt accaggactg tgatatttat cttctagatg atgtattcag tgcagttgat 2400
gctcacactg gctctgaaat cttcaaggaa tgtgtgaggg gaattcttaa agataaaacc 2460
attttgcttg tcacacacca agttgacttc ttgcataatg ttgacctgat ccttgtcatg 2520
cgagatggga tgatcgtgca atctggcaaa tataatgaga tattagaagc tggaatggat 2580
tttaaagagc tagtagctgc acatgagacc tctttagaac ttgttgacgt ggaaacaacc 2640
aaagagagca atgcctccct tgaagaatca aaatcttctc gaagattatc taaggaagaa 2700
aacggagatg ataaatctca acagtctaca tctgataggg gggattctaa acttataaag 2760
gaagaagaaa gagaaactgg aaaagtcagt cctcgtgtgt acaagctata tattactgaa 2820
gcttttggat ggtggggtgt agtgctagtt atcttgtttt cgttcttgtg gcaaagttct 2880
ctaatggcaa gtgattattg gctggcatat gaaacttcag cggatcgtgc catgtccttc 2940
aatccttctc tgtttattgg gatatacggt gttattgcag ttgtttcttc gttgctgata 3000
gtgatcagga tgtattttgt gacacttatg gggctcaaga ctgcccaaat atttttcgga 3060
cagattcttt acagcatact gcatgctcct atgtcatttt ttgacacaac accttccgga 3120
agaattctga gtcgggcatc taatgatcag accaacattg atgtcttcct cccgtttttt 3180
atgaatctca ctttggccat gtttatcaca ctgctcggca tcatcatcat cacatgccaa 3240
tattcttggc ctaccgtact acttttgatt cctctgggtt ggcttaatat ctggtaccgg 3300
ggatattatc ttgcaacatc tcgtgaattg actcggcttg actcaattac aaaagcacct 3360
gttattcatc atttctctga aagcatctca ggtgttatga ctatacgttg ctttaggaag 3420
caggagatgt tttgtaacga gaatgtaaac cgagtgaatt ccaatctgcg aatggatttc 3480
cacaacaatg gatccaatga atggttgggc tttcgactgg aattgatggg aagcttactt 3540
ctttgtgttt ctgcaatgtt catgattgtc ttacctagca gcatcatcaa gccagaaaat 3600
gttggtttgt cactatcata tggcttgtct cttaatagtg tcctattctg gtccatcttt 3660
gtgagttgct ttgtggaaaa taaaatggtt tctgtcgaaa gattaaaaca gttctcagaa 3720
ataccatcag aagcagagtg gagaaagatg gattttctcc caccttcaag ttggccaagc 3780
cgtgggaatg ttgagcttga aaacgtgcag gttagatatc gtccgaacac tcctctagtg 3840
cttaaaggag ttactctcag cattagaggg ggagagaaga taggtgttgt tggtcgtaca 3900
gggggtggaa aatcaacatt aattcaagtt ttctttcgtt tggtggagcc tgcagctgga 3960
agaataatca ttgatgacgt agatatatcc agacttgggc ttcatgatct tagatctcgc 4020
ttcgggatca ttccccaaga gccagtcctt tttgaaggaa ctgtgagaag caacattgac 4080
cccattggac aatattcaga tgatgaaatt tggaagagcc tcgaacgctg ccaactcaaa 4140
gatgtggtgt ctttaaaacc cgaaaaactt gattcaccag ttgttgataa cggagataac 4200
tggagtgtcg gacagaggca gcttctttgc ttgggaagag tgatgctaaa acgtagcaga 4260
cttctattta tggatgaggc aactgcctct gttgattcac agacagatgc agtgattcag 4320
aaaatcatcc gcgaggactt tgcggcctgt actataatca gcattgccca cagaatacca 4380
acagtcatgg actgtgatag agttcttgtt atagatgcag gaatagcaaa agagtttgac 4440
aaaccatctc gtttgcttga aaggccttca ctttttgggg ctttggttca agaatatgcc 4500
aaccgatcct ctgagctcta a 4521
<210> 28 <211> 6190 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 28
ccgtcaaccc agtcttggcc accacataaa cacagctttg acttgtctct cccttttccc 60
tattttcacc acccttttca atttcccacc ttatattcat tattatattt aatcaatcaa 120
atcaaagttg gaaaaaaagg gagtaataat caaatggagt agtatataca taccagaaca 180
atgaaagagc actcataagc taaagcccat aattcatcac gaaaccacaa tatagaggaa 240
acctgacgtg tcccttaaaa tctaaccttg aacctctgag acctccaaaa aaaacatcat 300
ggaaattgca aagggcatgt ctgtgtttca atctttgagg tatgttggcg ttgatgaatc 360
cctccgaaac cccattttct tacgtgtcat tagttgttct ttgcacctgg gattgttcct 420
tgtaattctt gggttgtgtt gttggaatac aatcaggagg gacaataatg ctggccacaa 480
acagagtagt actaggaatg ctaggttctt gtactacaaa tcaaccttgt tttgttcaat 540
aggtctagcc atctttagct ttgtgttatg tttgttagct catttttatt ggtatagaaa 600
tggttggtca gaagaaaaaa ttataaccct tttggatttt gcattaaagt tgctagcttg 660
gttgtcaatc tctgttttct tgcacaccca gttccttaat tcttgtgaaa ccaaataccc 720
tcttgtttta agagtttggt gggggctttt cttctttgtt tcttgttatt gccttgttat 780
agaccttgtt tatggggaaa agaaccaatc tttaccaact caattttgta tacctgatgt 840
tgttttcact cttatggggt tattcttctg ttttgttggg tttattgtta aaacagagag 900
tgaggagaat atgcttcagg aacccctctt aaatggtagt gttgccaatg gcatggactc 960
aaagaagtct actggggatc aaactgtcac cccttatgcc aatgctaaca tttttagtct 1020
ctttactttc tcttggatgg gtcccctaat ttctgttggc aacaagaaac cattagacct 1080
tgaggatgtt cctcagcttc actttgatga tagtgtcaaa gggagttttc ctatttttag 1140
agaaaaacta gaatctgtgg gtgggggaaa tagtaaccgt gtgactacct tcatgctggt 1200
gaaggctttg gttttcacag cacggaagga gatagtgtta tcggctctct tcgtgcttct 1260
ttacgctctg gcgtcttttg ttggcccgta cctcattgat accttagttc agtatctgaa 1320
tggaaaacga gactttgata atgaaggtta tgtcttagtg gctgcattct tcgttgcaaa 1380
gttggtggag tgtttggcgc aaaggcattg gtttttcaag gtgcagcagg gagggtatcg 1440
ggcacgggca gcactggttt ccaaaatcta caacaagggt ttaaccctct cctgtcagtc 1500
aaagcaaagc cacactagtg gagagatcat caattttatg acagttgatg ccgagaggat 1560
tggtgacttc ggttggtata tgcatgatcc ttggatggta atcatacaag ttgctctggc 1620
attggtgata ctctataaaa atcttggcct agctgctatc gccgcgtttg ttgctacaat 1680
aatagtgatg ttggcaaaca tccctttagg gagtttgcag gagaagtttc aggagaaact 1740
catggaatcg aaagatagaa ggatgaaggc tacatctgaa gtcttaagga atatgagaat 1800
actcaagctt caagcttggg agatgaagtt tctgtctagg atcttggacc tcaggactac 1860
agaggcagga tggttgatga aatatgtgta cacatcagct atgactactt ttgtcttctg 1920
ggttgctcct acatttgttt ctgtgacgac ctttggcgct gcaatgctta tgggaatccc 1980
acttgaatct gggaagatat tgtctgcact tgcgacattt agaattcttc aagagcccat 2040
ctacaatctc ccagatacaa tttcaatgat tgctcaaacc aaagtttctc ttgatcgtat 2100
tgcatctttc ctttctcttg atgacttgca gcctgatgtc atagagaagc ttccaaaagg 2160
tagttctgat gaagcaattg agattgtagg tgggaacttc gcttgggatg catccacctc 2220
gactccactt ctaaaggatg taaatcttag agtgcttaat ggcatgagag ttgccatttg 2280
tggtacagtt ggttcaggaa aatcaagctt actgtctagc attttaggag agatgcccaa 2340
attatcaggg actattaaac ttagtggaac gaaggcttat gttgcacagt cgccctggat 2400
acagagtgga aagatagagg agaacatatt atttggtaaa gagatgcaga gggagaagta 2460
tgataaagtt cttgaagcgt gctccttaaa gaaagacctg gaaattctct cttttggcga 2520
tcaaacagaa ataggggaga ggggcattaa tttgagcggt ggacagaagc agagaataca 2580
gattgctcgt gctctttacc aagatgctga tgtttaccta tttgatgatc cgttcagtgc 2640
tgtggatgct cataccggat cccatctctt cagtgtaagt cctttcatat atatgcttta 2700
ttttcatgct tgatatattt tacctagcca cttgattgac ccatccttta attgcaggaa 2760
tgtataatgg ggctattgaa ttcaaaaaca gttttatatg ttacacatca agtggagttt 2820
ttgcctgctg cggatttgat cttggtactc tttcctttca gtaattatgg tttgcttaat 2880
atcatatata gacttaactc atttaactat gatatttctc ttcaggtcat gaaagatgga 2940
aggatcagtg aaactgggaa atacaatgat cttctcaaat taggtagtga cttcatggaa 3000
cttgtgggtg ctcaccaaga agctttaaca gcaattgaca cagttaaggg agaagcattg 3060
agaaagagtg aggaaatgac tggtgataat acaaatgtac agaaggataa aaatatttca 3120
gatggccaaa atggtaaagt ggatgatatt gttggaacaa agggacaaat tgttcaggag 3180
gaggaaagag agaaaggtag tgttggtttt tcagtttact ggaaatatat aacaactgca 3240
tatggaggtg ctcttgtgcc atttatgctg ttggcacaag ttggttttca gctccttcaa 3300
attggaagca attattggat ggcgtgggca actcccgtct caaagagtga gccacctcct 3360
gttgggagtt ctactctcat cattgtctat gttgctttag gaattgcaag tgctttatgc 3420
atccttgcta gaaccatgtt tcttgttacc gctggatata agacagcctc tttgcttttc 3480
cataaaatgc atctttgcat tttccgtgct ccaatgtcct tcttcgatgc cacaccgagt 3540
gggcggattc taaacagagt aagtgaatga ttacattttc tttatttagc cccttttttt 3600
tccttattag tgtcaatctt tctgttacat gactaatcaa tgttttgtga aaattagcta 3660
gtaatttcag aattaactca aatgtacttt ggtatgaaaa caggcatcga cagatcaaag 3720
tgcaattgat ctgaatgttc ccattcaagt tggatccttt gccttcacaa taatacagct 3780
tttagggatt attggagtaa tgtcacaagt tgcatggcag gtcttcattg tctttattcc 3840
ggtcattgca gtttgcatct ggttggaggt tgctacgacc acctttttcg tgttctttgc 3900
cttcacaatt attctactat atgctttttc acaaagtgag tcataacttt agcgacattc 3960
ataaacgtga gttacattta agtggtgagt ttgttttcat tgcagcaata ttacatacca 4020
tcagcacgag aactggcacg gctaaatggg acatgcaaag ctccagtaat acagcacttt 4080
gccgagacaa tttcaggatc aagcacaatt agaagtttcg atcaggaatc tagattccag 4140
gacacaagta tgaaattgat agacaattat tctcggccta agtttcacat cgctgctgca 4200
atggagtggc tttgtttgcg tttggatatg ttatctctga tcacttttgc tttctcttta 4260
attttcttga tctctcttcc tgttggaaca attgacccaa gtaagttctc tatcttcatg 4320
ttttctttcc ttgaagtttg ttgtgttgaa taactcttaa gagcacattt tctccgtttc 4380
ttgatttaca ggtgttgctg gcttagctgt tacatatggg cttaatctga acataataca 4440
agctcgggtt gtttggaatc tttgtatgat ggaaaataaa attatttctg ttgaaagaat 4500
acttcagtat actgctcttc caagtgaatc tcctcttatc atagaatcca acagaccaga 4560
ccctaactgg ccatcttgtg gagaggttga ttttagcaat cttcaggtaa attaagttat 4620
tctctggtgt taattatgca ggttaatttg ttggtatggg ttggtatatc tgaaaacttt 4680
taataggtcc gatatgctcc tcacatgcct ctcgtgttgc gaggccttac atgcactttc 4740
tttggtggaa agaagactgg aattgtcggt aggacaggca gcggtaaatc tactctaata 4800
cagaccctct tccgcatagt tgaaccagct gctggacaaa taaaaataga tggtatcagc 4860
atctcctcaa ttggtttgca tgatctacgg tctagattga gtataattcc acaggatcca 4920
actatgtttg agggaacagt tcgcagcaac ctagacccgc ttgaagagta ttcagatgaa 4980
caaatttggg aggtgacagc ttggttttgc ctatttttgg atttattttg tttcagatag 5040
gaaaatgaca aattttattt tattgagaaa ctttgtttga tgttatgctt caggcgctcg 5100
ataagtgtca gctaggagaa gaagtgagga agaaagaagg caaactttat tctacaggta 5160
acttcaagaa ccacatcatt ttctgatgat ttccactttt agagctgtaa taatcatctt 5220
cattgcgttg ctgcagtatc tgagaatgga gagaactgga gtgtaggcca aaggcagctg 5280
gtctgccttg gccgtgtgct actgaaaaag agcaaggtcc tggtccttga cgaggctaca 5340
gcatctgtcg acactgcaac tgataatctt attcagcaaa ctctaaggct gcacttctct 5400
gattccacgg ttataaccat tgctcatagg attacatctg tgcttgacag tgatatggtc 5460
ctactattag atcatggtaa gaatcatcgt ttatgttctg gagcaagcgg agaaggaaat 5520
tcttggtagt tacctttttt ttatgctatg ctgcagggct cattgctgaa tacggcactc 5580
cagccaggtt gttagagaac gaatcctcat tgtttgctaa gctcgtggca gagtatagta 5640
tgaggtcaaa ttcaagtttt gagaatgttt cagacatgtg agtctcagaa actaatcttc 5700
gttaataatg ttacacgacg atgatgatga aaattagggg actctagact agtaccttag 5760
tcgatagtgt tttgagtttc catctgtgga caccatagct tgaacaagaa ccagcgaaat 5820
gcaggtcatg cctgtggctt gagggaaact gcaacaatcc tatggcaggg aaagaaacct 5880
acatctagtg atgcaatatt gattgtgaag tggcatttgt ttttgtttag actttttgat 5940
gagaaaatgt atacgtaact ttgtgtttac aataatttga atgtatgttg agtcaagtga 6000
ttagttagtt aagagtgcac ggattttgct acttctgggt aaaagaagta aaccttgttg 6060
ttgagagttg aaagtgaaat tactagtgtc gaattttgcc gcataagcta aatgaaacac 6120
ttttacgata aactcctagt gcaacaaagg aaaaattcat tggcaagact agctgtttat 6180
gtttcacgac 6190
<210> 29 <211> 5383
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum <400> 29
atggaaattg caaagggcat gtctgtgttt caatctttga ggtatgttgg cgttgatgaa 60
tccctccgaa accccatttt cttacgtgtc attagttgtt ctttgcacct gggattgttc 120
cttgtaattc ttgggttgtg ttgttggaat acaatcagga gggacaataa tgctggccac 180
aaacagagta gtactaggaa tgctaggttc ttgtactaca aatcaacctt gttttgttca 240
ataggtctag ccatctttag ctttgtgtta tgtttgttag ctcattttta ttggtataga 300
aatggttggt cagaagaaaa aattataacc cttttggatt ttgcattaaa gttgctagct 360
tggttgtcaa tctctgtttt cttgcacacc cagttcctta attcttgtga aaccaaatac 420
cctcttgttt taagagtttg gtgggggctt ttcttctttg tttcttgtta ttgccttgtt 480
atagaccttg tttatgggga aaagaaccaa tctttaccaa ctcaattttg tatacctgat 540
gttgttttca ctcttatggg gttattcttc tgttttgttg ggtttattgt taaaacagag 600
agtgaggaga atatgcttca ggaacccctc ttaaatggta gtgttgccaa tggcatggac 660
tcaaagaagt ctactgggga tcaaactgtc accccttatg ccaatgctaa catttttagt 720
ctctttactt tctcttggat gggtccccta atttctgttg gcaacaagaa accattagac 780
cttgaggatg ttcctcagct tcactttgat gatagtgtca aagggagttt tcctattttt 840
agagaaaaac tagaatctgt gggtggggga aatagtaacc gtgtgactac cttcatgctg 900
gtgaaggctt tggttttcac agcacggaag gagatagtgt tatcggctct cttcgtgctt 960
ctttacgctc tggcgtcttt tgttggcccg tacctcattg ataccttagt tcagtatctg 1020
aatggaaaac gagactttga taatgaaggt tatgtcttag tggctgcatt cttcgttgca 1080
aagttggtgg agtgtttggc gcaaaggcat tggtttttca aggtgcagca gggagggtat 1140
cgggcacggg cagcactggt ttccaaaatc tacaacaagg gtttaaccct ctcctgtcag 1200
tcaaagcaaa gccacactag tggagagatc atcaatttta tgacagttga tgccgagagg 1260
attggtgact tcggttggta tatgcatgat ccttggatgg taatcataca agttgctctg 1320
gcattggtga tactctataa aaatcttggc ctagctgcta tcgccgcgtt tgttgctaca 1380
ataatagtga tgttggcaaa catcccttta gggagtttgc aggagaagtt tcaggagaaa 1440
ctcatggaat cgaaagatag aaggatgaag gctacatctg aagtcttaag gaatatgaga 1500
atactcaagc ttcaagcttg ggagatgaag tttctgtcta ggatcttgga cctcaggact 1560
acagaggcag gatggttgat gaaatatgtg tacacatcag ctatgactac ttttgtcttc 1620
tgggttgctc ctacatttgt ttctgtgacg acctttggcg ctgcaatgct tatgggaatc 1680
ccacttgaat ctgggaagat attgtctgca cttgcgacat ttagaattct tcaagagccc 1740
atctacaatc tcccagatac aatttcaatg attgctcaaa ccaaagtttc tcttgatcgt 1800
attgcatctt tcctttctct tgatgacttg cagcctgatg tcatagagaa gcttccaaaa 1860
ggtagttctg atgaagcaat tgagattgta ggtgggaact tcgcttggga tgcatccacc 1920
tcgactccac ttctaaagga tgtaaatctt agagtgctta atggcatgag agttgccatt 1980
tgtggtacag ttggttcagg aaaatcaagc ttactgtcta gcattttagg agagatgccc 2040
aaattatcag ggactattaa acttagtgga acgaaggctt atgttgcaca gtcgccctgg 2100
atacagagtg gaaagataga ggagaacata ttatttggta aagagatgca gagggagaag 2160
tatgataaag ttcttgaagc gtgctcctta aagaaagacc tggaaattct ctcttttggc 2220
gatcaaacag aaatagggga gaggggcatt aatttgagcg gtggacagaa gcagagaata 2280
cagattgctc gtgctcttta ccaagatgct gatgtttacc tatttgatga tccgttcagt 2340
gctgtggatg ctcataccgg atcccatctc ttcagtgtaa gtcctttcat atatatgctt 2400
tattttcatg cttgatatat tttacctagc cacttgattg acccatcctt taattgcagg 2460
aatgtataat ggggctattg aattcaaaaa cagttttata tgttacacat caagtggagt 2520
ttttgcctgc tgcggatttg atcttggtac tctttccttt cagtaattat ggtttgctta 2580
atatcatata tagacttaac tcatttaact atgatatttc tcttcaggtc atgaaagatg 2640
gaaggatcag tgaaactggg aaatacaatg atcttctcaa attaggtagt gacttcatgg 2700
aacttgtggg tgctcaccaa gaagctttaa cagcaattga cacagttaag ggagaagcat 2760
tgagaaagag tgaggaaatg actggtgata atacaaatgt acagaaggat aaaaatattt 2820
cagatggcca aaatggtaaa gtggatgata ttgttggaac aaagggacaa attgttcagg 2880
aggaggaaag agagaaaggt agtgttggtt tttcagttta ctggaaatat ataacaactg 2940
catatggagg tgctcttgtg ccatttatgc tgttggcaca agttggtttt cagctccttc 3000
aaattggaag caattattgg atggcgtggg caactcccgt ctcaaagagt gagccacctc 3060
ctgttgggag ttctactctc atcattgtct atgttgcttt aggaattgca agtgctttat 3120
gcatccttgc tagaaccatg tttcttgtta ccgctggata taagacagcc tctttgcttt 3180
tccataaaat gcatctttgc attttccgtg ctccaatgtc cttcttcgat gccacaccga 3240
gtgggcggat tctaaacaga gtaagtgaat gattacattt tctttattta gccccttttt 3300
tttccttatt agtgtcaatc tttctgttac atgactaatc aatgttttgt gaaaattagc 3360
tagtaatttc agaattaact caaatgtact ttggtatgaa aacaggcatc gacagatcaa 3420
agtgcaattg atctgaatgt tcccattcaa gttggatcct ttgccttcac aataatacag 3480
cttttaggga ttattggagt aatgtcacaa gttgcatggc aggtcttcat tgtctttatt 3540
ccggtcattg cagtttgcat ctggttggag gttgctacga ccaccttttt cgtgttcttt 3600
gccttcacaa ttattctact atatgctttt tcacaaagtg agtcataact ttagcgacat 3660
tcataaacgt gagttacatt taagtggtga gtttgttttc attgcagcaa tattacatac 3720
catcagcacg agaactggca cggctaaatg ggacatgcaa agctccagta atacagcact 3780
ttgccgagac aatttcagga tcaagcacaa ttagaagttt cgatcaggaa tctagattcc 3840
aggacacaag tatgaaattg atagacaatt attctcggcc taagtttcac atcgctgctg 3900
caatggagtg gctttgtttg cgtttggata tgttatctct gatcactttt gctttctctt 3960
taattttctt gatctctctt cctgttggaa caattgaccc aagtaagttc tctatcttca 4020
tgttttcttt ccttgaagtt tgttgtgttg aataactctt aagagcacat tttctccgtt 4080
tcttgattta caggtgttgc tggcttagct gttacatatg ggcttaatct gaacataata 4140
caagctcggg ttgtttggaa tctttgtatg atggaaaata aaattatttc tgttgaaaga 4200
atacttcagt atactgctct tccaagtgaa tctcctctta tcatagaatc caacagacca 4260
gaccctaact ggccatcttg tggagaggtt gattttagca atcttcaggt aaattaagtt 4320
attctctggt gttaattatg caggttaatt tgttggtatg ggttggtata tctgaaaact 4380
tttaataggt ccgatatgct cctcacatgc ctctcgtgtt gcgaggcctt acatgcactt 4440
tctttggtgg aaagaagact ggaattgtcg gtaggacagg cagcggtaaa tctactctaa 4500
tacagaccct cttccgcata gttgaaccag ctgctggaca aataaaaata gatggtatca 4560
gcatctcctc aattggtttg catgatctac ggtctagatt gagtataatt ccacaggatc 4620
caactatgtt tgagggaaca gttcgcagca acctagaccc gcttgaagag tattcagatg 4680
aacaaatttg ggaggtgaca gcttggtttt gcctattttt ggatttattt tgtttcagat 4740
aggaaaatga caaattttat tttattgaga aactttgttt gatgttatgc ttcaggcgct 4800
cgataagtgt cagctaggag aagaagtgag gaagaaagaa ggcaaacttt attctacagg 4860
taacttcaag aaccacatca ttttctgatg atttccactt ttagagctgt aataatcatc 4920
ttcattgcgt tgctgcagta tctgagaatg gagagaactg gagtgtaggc caaaggcagc 4980
tggtctgcct tggccgtgtg ctactgaaaa agagcaaggt cctggtcctt gacgaggcta 5040
cagcatctgt cgacactgca actgataatc ttattcagca aactctaagg ctgcacttct 5100
ctgattccac ggttataacc attgctcata ggattacatc tgtgcttgac agtgatatgg 5160
tcctactatt agatcatggt aagaatcatc gtttatgttc tggagcaagc ggagaaggaa 5220
attcttggta gttacctttt ttttatgcta tgctgcaggg ctcattgctg aatacggcac 5280
tccagccagg ttgttagaga acgaatcctc attgtttgct aagctcgtgg cagagtatag 5340
tatgaggtca aattcaagtt ttgagaatgt ttcagacatg tga 5383
<210> 30 <211> 117 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 30
gtatgttggc gttgatgaat ccctccgaaa ccccattttc ttacgtgtca ttagttgttc 60
tttgcacctg ggattgttcc ttgtaattct tgggttgtgt tgttggaata caatcag 117
<210> 31
<211> 83
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 31
gtaagtcctt tcatatatat gctttatttt catgcttgat atattttacc tagccacttg 60 attgacccat cctttaattg cag 83
<210> 32 <211> 81 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 32
gtactctttc ctttcagtaa ttatggtttg cttaatatca tatatagact taactcattt 60 aactatgata tttctcttca g 81
<210> 33 <211> 145 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 33
gtaagtgaat gattacattt tctttattta gccccttttt tttccttatt agtgtcaatc 60
tttctgttac atgactaatc aatgttttgt gaaaattagc tagtaatttc agaattaact 120
caaatgtact ttggtatgaa aacag 145
<210> 34
<211> 137
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 34
gttgctacga ccaccttttt cgtgttcttt gccttcacaa ttattctact atatgctttt 60
tcacaaagtg agtcataact ttagcgacat tcataaacgt gagttacatt taagtggtga 120
gtttgttttc attgcag 137
<210> 35 <211> 91 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 35
gtaagttctc tatcttcatg ttttctttcc ttgaagtttg ttgtgttgaa taactcttaa 60 gagcacattt tctccgtttc ttgatttaca g 91
<211> 80 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 36
<210> 37
<211> 101
<212> ДНК
/Т1 оч т\т ~
gtaaattaag ttattctctg gtgttaatta tgcaggttaa tttgttggta tgggttggta 60 tatctgaaaa cttttaatag 80
<213> Nicotiana tabacum
<400> 37
gtgacagctt ggttttgcct atttttggat ttattttgtt tcagatagga aaatgacaaa 60
ttttatttta ttgagaaact ttgtttgatg ttatgcttca g 101
<210> 38 <211> 79 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 38
gtaacttcaa gaaccacatc attttctgat gatttccact tttagagctg taataatcat 60 cttcattgcg ttgctgcag 79
<210> 39 <211> 80 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 39
gtaagaatca tcgtttatgt tctggagcaa gcggagaagg aaattcttgg tagttacctt 60 ttttttatgc tatgctgcag 80
<210> 40
<211> 41
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 40
atggaaattg caaagggcat gtctgtgttt caatctttga g 41
<210> 41 <211> 2218 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 41
gagggacaat aatgctggcc acaaacagag tagtactagg aatgctaggt tcttgtacta 60
caaatcaacc ttgttttgtt caataggtct agccatcttt agctttgtgt tatgtttgtt 120
agctcatttt tattggtata gaaatggttg gtcagaagaa aaaattataa cccttttgga 180
ttttgcatta aagttgctag cttggttgtc aatctctgtt ttcttgcaca cccagttcct 240
taattcttgt gaaaccaaat accctcttgt tttaagagtt tggtgggggc ttttcttctt 300
tgtttcttgt tattgccttg ttatagacct tgtttatggg gaaaagaacc aatctttacc 360
aactcaattt tgtatacctg atgttgtttt cactcttatg gggttattct tctgttttgt 420
tgggtttatt gttaaaacag agagtgagga gaatatgctt caggaacccc tcttaaatgg 480
tagtgttgcc aatggcatgg actcaaagaa gtctactggg gatcaaactg tcacccctta 540
tgccaatgct aacattttta gtctctttac tttctcttgg atgggtcccc taatttctgt 600
tggcaacaag aaaccattag accttgagga tgttcctcag cttcactttg atgatagtgt 660
caaagggagt tttcctattt ttagagaaaa actagaatct gtgggtgggg gaaatagtaa 720
ccgtgtgact accttcatgc tggtgaaggc tttggttttc acagcacgga aggagatagt 780
gttatcggct ctcttcgtgc ttctttacgc tctggcgtct tttgttggcc cgtacctcat 840
tgatacctta gttcagtatc tgaatggaaa acgagacttt gataatgaag gttatgtctt 900
agtggctgca ttcttcgttg caaagttggt ggagtgtttg gcgcaaaggc attggttttt 960
caaggtgcag cagggagggt atcgggcacg ggcagcactg gtttccaaaa tctacaacaa 1020
gggtttaacc ctctcctgtc agtcaaagca aagccacact agtggagaga tcatcaattt 1080
tatgacagtt gatgccgaga ggattggtga cttcggttgg tatatgcatg atccttggat 1140
ggtaatcata caagttgctc tggcattggt gatactctat aaaaatcttg gcctagctgc 1200
tatcgccgcg tttgttgcta caataatagt gatgttggca aacatccctt tagggagttt 1260
gcaggagaag tttcaggaga aactcatgga atcgaaagat agaaggatga aggctacatc 1320
tgaagtctta aggaatatga gaatactcaa gcttcaagct tgggagatga agtttctgtc 1380
taggatcttg gacctcagga ctacagaggc aggatggttg atgaaatatg tgtacacatc 1440
agctatgact acttttgtct tctgggttgc tcctacattt gtttctgtga cgacctttgg 1500
cgctgcaatg cttatgggaa tcccacttga atctgggaag atattgtctg cacttgcgac 1560
atttagaatt cttcaagagc ccatctacaa tctcccagat acaatttcaa tgattgctca 1620
aaccaaagtt tctcttgatc gtattgcatc tttcctttct cttgatgact tgcagcctga 1680
tgtcatagag aagcttccaa aaggtagttc tgatgaagca attgagattg taggtgggaa 1740
cttcgcttgg gatgcatcca cctcgactcc acttctaaag gatgtaaatc ttagagtgct 1800
taatggcatg agagttgcca tttgtggtac agttggttca ggaaaatcaa gcttactgtc 1860
tagcatttta ggagagatgc ccaaattatc agggactatt aaacttagtg gaacgaaggc 1920
ttatgttgca cagtcgccct ggatacagag tggaaagata gaggagaaca tattatttgg 1980
taaagagatg cagagggaga agtatgataa agttcttgaa gcgtgctcct taaagaaaga 2040
cctggaaatt ctctcttttg gcgatcaaac agaaataggg gagaggggca ttaatttgag 2100
cggtggacag
aagcagagaa
tacagattgc
tcgtgctctt
taccaagatg
ctgatgttta
2160
cctatttgat
gatccgttca
gtgctgtgga
tgctcatacc
ggatcccatc
tcttcagt
2218
<210> 42 <211> 87 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 42
gaatgtataa
tggggctatt
gaattcaaaa
acagttttat
atgttacaca
tcaagtggag
tttttgcctg
ctgcggattt
gatcttg
<210> 43 <211> 633 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 43
gtcatgaaag
atggaaggat
cagtgaaact
gggaaataca
atgatcttct
caaattaggt
agtgacttca
tggaacttgt
gggtgctcac
caagaagctt
taacagcaat
tgacacagtt
120
aagggagaag
cattgagaaa
gagtgaggaa
atgactggtg
ataatacaaa
tgtacagaag
180
gataaaaata
tttcagatgg
ccaaaatggt
aaagtggatg
atattgttgg
aacaaaggga
240
caaattgttc
aggaggagga
aagagagaaa
ggtagtgttg
gtttttcagt
ttactggaaa
300
tatataacaa
ctgcatatgg
aggtgctctt
gtgccattta
tgctgttggc
acaagttggt
360
tttcagctcc
ttcaaattgg
aagcaattat
tggatggcgt
gggcaactcc
cgtctcaaag
420
agtgagccac
ctcctgttgg
gagttctact
ctcatcattg
tctatgttgc
tttaggaatt
480
gcaagtgctt
tatgcatcct
tgctagaacc
atgtttcttg
ttaccgctgg
atataagaca
540
gcctctttgc
ttttccataa
aatgcatctt
tgcattttcc
gtgctccaat
gtccttcttc
600
gatgccacac
cgagtgggcg
gattctaaac
aga
633
<210> 44
<211> 165
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 44
gcatcgacag
atcaaagtgc
aattgatctg
aatgttccca
ttcaagttgg
atcctttgcc
ttcacaataa
tacagctttt
agggattatt
ggagtaatgt
cacaagttgc
atggcaggtc
120
ttcattgtct
ttattccggt
cattgcagtt
tgcatctggt
tggag
165
<211> 295
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
caatattaca taccatcagc acgagaactg gcacggctaa atgggacatg caaagctcca 60
gtaatacagc actttgccga gacaatttca ggatcaagca caattagaag tttcgatcag 120
gaatctagat tccaggacac aagtatgaaa ttgatagaca attattctcg gcctaagttt 180
cacatcgctg ctgcaatgga gtggctttgt ttgcgtttgg atatgttatc tctgatcact 240
<210> 46
<211> 215
<212> ДНК
-1 о ^ т\т-:"
tttgctttct ctttaatttt cttgatctct cttcctgttg gaacaattga cccaa 295
<213> Nicotiana tabacum
<400> 46
gtgttgctgg cttagctgtt acatatgggc ttaatctgaa cataatacaa gctcgggttg 60
tttggaatct ttgtatgatg gaaaataaaa ttatttctgt tgaaagaata cttcagtata 120
ctgctcttcc aagtgaatct cctcttatca tagaatccaa cagaccagac cctaactggc 180
catcttgtgg agaggttgat tttagcaatc ttcag 215
<210> 47 <211> 306 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 47
gtccgatatg ctcctcacat gcctctcgtg ttgcgaggcc ttacatgcac tttctttggt 60
ggaaagaaga ctggaattgt cggtaggaca ggcagcggta aatctactct aatacagacc 120
ctcttccgca tagttgaacc agctgctgga caaataaaaa tagatggtat cagcatctcc 180
tcaattggtt tgcatgatct acggtctaga ttgagtataa ttccacagga tccaactatg 240
tttgagggaa cagttcgcag caacctagac ccgcttgaag agtattcaga tgaacaaatt 300
tgggag 306
<210> 48 <211> 64 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 48
gcgctcgata agtgtcagct aggagaagaa gtgaggaaga aagaaggcaa actttattct 60 acag 64
<210> 49 <211> 240 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 49
tatctgagaa tggagagaac tggagtgtag gccaaaggca gctggtctgc cttggccgtg
tgctactgaa
aaagagcaag
gtcctggtcc
ttgacgaggc
tacagcatct
gtcgacactg
120
caactgataa
tcttattcag
caaactctaa
ggctgcactt
ctctgattcc
acggttataa
180
ccattgctca
taggattaca
tctgtgcttg
acagtgatat
ggtcctacta
ttagatcatg
240
<210> 50 <211> 125 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 50
ggctcattgc
tgaatacggc
actccagcca
ggttgttaga
gaacgaatcc
tcattgtttg
ctaagctcgt
ggcagagtat
agtatgaggt
caaattcaag
ttttgagaat
gtttcagaca
120
tgtga
125
<210> 51 <211> 4389 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 51
atggaaattg
caaagggcat
gtctgtgttt
caatctttga
ggagggacaa
taatgctggc
cacaaacaga
gtagtactag
gaatgctagg
ttcttgtact
acaaatcaac
cttgttttgt
120
tcaataggtc
tagccatctt
tagctttgtg
ttatgtttgt
tagctcattt
ttattggtat
180
agaaatggtt
ggtcagaaga
aaaaattata
acccttttgg
attttgcatt
aaagttgcta
240
gcttggttgt
caatctctgt
tttcttgcac
acccagttcc
ttaattcttg
tgaaaccaaa
300
taccctcttg
ttttaagagt
ttggtggggg
cttttcttct
ttgtttcttg
ttattgcctt
360
gttatagacc
ttgtttatgg
ggaaaagaac
caatctttac
caactcaatt
ttgtatacct
420
gatgttgttt
tcactcttat
ggggttattc
ttctgttttg
ttgggtttat
tgttaaaaca
480
gagagtgagg
agaatatgct
tcaggaaccc
ctcttaaatg
gtagtgttgc
caatggcatg
540
gactcaaaga
agtctactgg
ggatcaaact
gtcacccctt
atgccaatgc
taacattttt
600
agtctcttta
ctttctcttg
gatgggtccc
ctaatttctg
ttggcaacaa
gaaaccatta
660
gaccttgagg
atgttcctca
gcttcacttt
gatgatagtg
tcaaagggag
ttttcctatt
720
tttagagaaa
aactagaatc
tgtgggtggg
ggaaatagta
accgtgtgac
taccttcatg
780
ctggtgaagg
ctttggtttt
cacagcacgg
aaggagatag
tgttatcggc
tctcttcgtg
840
cttctttacg
ctctggcgtc
ttttgttggc
ccgtacctca
ttgatacctt
agttcagtat
900
ctgaatggaa
aacgagactt
tgataatgaa
ggttatgtct
tagtggctgc
attcttcgtt
960
gcaaagttgg
tggagtgttt
ggcgcaaagg
cattggtttt
tcaaggtgca
gcagggaggg
1020
tatcgggcac
gggcagcact
ggtttccaaa
atctacaaca
agggtttaac
cctctcctgt
1080
cagtcaaagc
aaagccacac
tagtggagag
atcatcaatt
ttatgacagt
tgatgccgag
1140
aggattggtg acttcggttg gtatatgcat gatccttgga tggtaatcat acaagttgct 1200
ctggcattgg tgatactcta taaaaatctt ggcctagctg ctatcgccgc gtttgttgct 1260
acaataatag tgatgttggc aaacatccct ttagggagtt tgcaggagaa gtttcaggag 1320
aaactcatgg aatcgaaaga tagaaggatg aaggctacat ctgaagtctt aaggaatatg 1380
agaatactca agcttcaagc ttgggagatg aagtttctgt ctaggatctt ggacctcagg 1440
actacagagg caggatggtt gatgaaatat gtgtacacat cagctatgac tacttttgtc 1500
ttctgggttg ctcctacatt tgtttctgtg acgacctttg gcgctgcaat gcttatggga 1560
atcccacttg aatctgggaa gatattgtct gcacttgcga catttagaat tcttcaagag 1620
cccatctaca atctcccaga tacaatttca atgattgctc aaaccaaagt ttctcttgat 1680
cgtattgcat ctttcctttc tcttgatgac ttgcagcctg atgtcataga gaagcttcca 1740
aaaggtagtt ctgatgaagc aattgagatt gtaggtggga acttcgcttg ggatgcatcc 1800
acctcgactc cacttctaaa ggatgtaaat cttagagtgc ttaatggcat gagagttgcc 1860
atttgtggta cagttggttc aggaaaatca agcttactgt ctagcatttt aggagagatg 1920
cccaaattat cagggactat taaacttagt ggaacgaagg cttatgttgc acagtcgccc 1980
tggatacaga gtggaaagat agaggagaac atattatttg gtaaagagat gcagagggag 2040
aagtatgata aagttcttga agcgtgctcc ttaaagaaag acctggaaat tctctctttt 2100
ggcgatcaaa cagaaatagg ggagaggggc attaatttga gcggtggaca gaagcagaga 2160
atacagattg ctcgtgctct ttaccaagat gctgatgttt acctatttga tgatccgttc 2220
agtgctgtgg atgctcatac cggatcccat ctcttcagtg aatgtataat ggggctattg 2280
aattcaaaaa cagttttata tgttacacat caagtggagt ttttgcctgc tgcggatttg 2340
atcttggtca tgaaagatgg aaggatcagt gaaactggga aatacaatga tcttctcaaa 2400
ttaggtagtg acttcatgga acttgtgggt gctcaccaag aagctttaac agcaattgac 2460
acagttaagg gagaagcatt gagaaagagt gaggaaatga ctggtgataa tacaaatgta 2520
cagaaggata aaaatatttc agatggccaa aatggtaaag tggatgatat tgttggaaca 2580
aagggacaaa ttgttcagga ggaggaaaga gagaaaggta gtgttggttt ttcagtttac 2640
tggaaatata taacaactgc atatggaggt gctcttgtgc catttatgct gttggcacaa 2700
gttggttttc agctccttca aattggaagc aattattgga tggcgtgggc aactcccgtc 2760
tcaaagagtg agccacctcc tgttgggagt tctactctca tcattgtcta tgttgcttta 2820
ggaattgcaa gtgctttatg catccttgct agaaccatgt ttcttgttac cgctggatat 2880
aagacagcct ctttgctttt ccataaaatg catctttgca ttttccgtgc tccaatgtcc 2940
ttcttcgatg ccacaccgag tgggcggatt ctaaacagag catcgacaga tcaaagtgca 3000
attgatctga atgttcccat tcaagttgga tcctttgcct tcacaataat acagctttta 3060
gggattattg gagtaatgtc acaagttgca tggcaggtct tcattgtctt tattccggtc 3120
attgcagttt gcatctggtt ggagcaatat tacataccat cagcacgaga actggcacgg 3180
ctaaatggga catgcaaagc tccagtaata cagcactttg ccgagacaat ttcaggatca 3240
agcacaatta gaagtttcga tcaggaatct agattccagg acacaagtat gaaattgata 3300
gacaattatt ctcggcctaa gtttcacatc gctgctgcaa tggagtggct ttgtttgcgt 3360
ttggatatgt tatctctgat cacttttgct ttctctttaa ttttcttgat ctctcttcct 3420
gttggaacaa ttgacccaag tgttgctggc ttagctgtta catatgggct taatctgaac 3480
ataatacaag ctcgggttgt ttggaatctt tgtatgatgg aaaataaaat tatttctgtt 3540
gaaagaatac ttcagtatac tgctcttcca agtgaatctc ctcttatcat agaatccaac 3600
agaccagacc ctaactggcc atcttgtgga gaggttgatt ttagcaatct tcaggtccga 3660
tatgctcctc acatgcctct cgtgttgcga ggccttacat gcactttctt tggtggaaag 3720
aagactggaa ttgtcggtag gacaggcagc ggtaaatcta ctctaataca gaccctcttc 3780
cgcatagttg aaccagctgc tggacaaata aaaatagatg gtatcagcat ctcctcaatt 3840
ggtttgcatg atctacggtc tagattgagt ataattccac aggatccaac tatgtttgag 3900
ggaacagttc gcagcaacct agacccgctt gaagagtatt cagatgaaca aatttgggag 3960
gcgctcgata agtgtcagct aggagaagaa gtgaggaaga aagaaggcaa actttattct 4020
acagtatctg agaatggaga gaactggagt gtaggccaaa ggcagctggt ctgccttggc 4080
cgtgtgctac tgaaaaagag caaggtcctg gtccttgacg aggctacagc atctgtcgac 4140
actgcaactg ataatcttat tcagcaaact ctaaggctgc acttctctga ttccacggtt 4200
ataaccattg ctcataggat tacatctgtg cttgacagtg atatggtcct actattagat 4260
catgggctca ttgctgaata cggcactcca gccaggttgt tagagaacga atcctcattg 4320
tttgctaagc tcgtggcaga gtatagtatg aggtcaaatt caagttttga gaatgtttca 4380
<210> 52
<211> 1463
<212> БЕЛОК
^OIO^ Т\Т -I ~ " 4-
gacatgtga 4389
<213> Nicotiana tabacum
<220>
<221> УЧАСТОК
<222> (1463)..(1463)
<223> Xaa обозначает предполагаемый стоп-кодон
<400> 52
Met Glu Ile Ala Lys Gly Met Ser Val Phe Gln Ser Leu Arg Arg Asp
1 5 10 15
Asn Asn Ala Gly His Lys Gln Ser Ser Thr Arg Asn Ala Arg Phe Leu
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ser Thr Leu Phe Cys Ser Ile Gly Leu Ala Ile Phe Ser
35 40 45
Phe Val Leu Cys Leu Leu Ala His Phe Tyr Trp Tyr Arg Asn Gly Trp
50 55 60
Ser Glu Glu Lys Ile Ile Thr Leu Leu Asp Phe Ala Leu Lys Leu Leu
65 70 75 80
Ala Trp Leu Ser Ile Ser Val Phe Leu His Thr Gln Phe Leu Asn Ser
85 90 95
Cys Glu Thr Lys Tyr Pro Leu Val Leu Arg Val Trp Trp Gly Leu Phe
100 105 110
Phe Phe Val Ser Cys Tyr Cys Leu Val Ile Asp Leu Val Tyr Gly Glu
115 120 125
Lys Asn Gln Ser Leu Pro Thr Gln Phe Cys Ile Pro Asp Val Val Phe
130 135 140
Thr Leu Met Gly Leu Phe Phe Cys Phe Val Gly Phe Ile Val Lys Thr
145 150 155 160
Glu Ser Glu Glu Asn Met Leu Gln Glu Pro Leu Leu Asn Gly Ser Val
165 170 175
Ala Asn Gly Met Asp Ser Lys Lys Ser Thr Gly Asp Gln Thr Val Thr
180 185 190
Pro Tyr Ala Asn Ala Asn Ile Phe Ser Leu Phe Thr Phe Ser Trp Met
195 200 205
Gly Pro Leu Ile Ser Val Gly Asn Lys Lys Pro Leu Asp Leu Glu Asp
210 215 220
Val Pro Gln Leu His Phe Asp Asp Ser Val Lys Gly Ser Phe Pro Ile
225 230 235 240
Phe Arg Glu Lys Leu Glu Ser Val Gly Gly Gly Asn Ser Asn Arg Val
245 250 255
Thr Thr Phe Met Leu Val Lys Ala Leu Val Phe Thr Ala Arg Lys Glu
260 265 270
lie Val Leu Ser Ala Leu Phe Val Leu Leu Tyr Ala Leu Ala Ser Phe
275 280 285
Val Gly Pro Tyr Leu Ile Asp Thr Leu Val Gln Tyr Leu Asn Gly Lys
290 295 300
Arg Asp Phe Asp Asn Glu Gly Tyr Val Leu Val Ala Ala Phe Phe Val
305 310 315 320
Ala Lys Leu Val Glu Cys Leu Ala Gln Arg His Trp Phe Phe Lys Val
325 330 335
Gln Gln Gly Gly Tyr Arg Ala Arg Ala Ala Leu Val Ser Lys Ile Tyr
340 345 350
Asn Lys Gly Leu Thr Leu Ser Cys Gln Ser Lys Gln Ser His Thr Ser
355 360 365
Gly Glu Ile Ile Asn Phe Met Thr Val Asp Ala Glu Arg Ile Gly Asp
370 375 380
Phe Gly Trp Tyr Met His Asp Pro Trp Met Val Ile Ile Gln Val Ala
385 390 395 400
Leu Ala Leu Val Ile Leu Tyr Lys Asn Leu Gly Leu Ala Ala Ile Ala
405 410 415
Ala Phe Val Ala Thr Ile Ile Val Met Leu Ala Asn Ile Pro Leu Gly
420 425 430
Ser Leu Gln Glu Lys Phe Gln Glu Lys Leu Met Glu Ser Lys Asp Arg
435 440 445
Arg Met Lys Ala Thr Ser Glu Val Leu Arg Asn Met Arg Ile Leu Lys
450 455 460
Leu Gln Ala Trp Glu Met Lys Phe Leu Ser Arg Ile Leu Asp Leu Arg
465 470 475 480
Thr Thr Glu Ala Gly Trp Leu Met Lys Tyr Val Tyr Thr Ser Ala Met
485 490 495
Thr Thr Phe Val Phe Trp Val Ala Pro Thr Phe Val Ser Val Thr Thr
500 505 510
Phe Gly Ala Ala Met Leu Met Gly Ile Pro Leu Glu Ser Gly Lys Ile
515 520 525
Leu Ser Ala Leu Ala Thr Phe Arg Ile Leu Gln Glu Pro Ile Tyr Asn
530 535 540
Leu Pro Asp Thr Ile Ser Met Ile Ala Gln Thr Lys Val Ser Leu Asp
545 550 555 560
Arg Ile Ala Ser Phe Leu Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Asp Val Ile
565 570 575
Glu Lys Leu Pro Lys Gly Ser Ser Asp Glu Ala Ile Glu Ile Val Gly
580 585 590
Gly Asn Phe Ala Trp Asp Ala Ser Thr Ser Thr Pro Leu Leu Lys Asp
595 600 605
Val Asn Leu Arg Val Leu Asn Gly Met Arg Val Ala Ile Cys Gly Thr
610 615 620
Val Gly Ser Gly Lys Ser Ser Leu Leu Ser Ser Ile Leu Gly Glu Met
625 630 635 640
Pro Lys Leu Ser Gly Thr Ile Lys Leu Ser Gly Thr Lys Ala Tyr Val
645 650 655
Ala Gln Ser Pro Trp Ile Gln Ser Gly Lys Ile Glu Glu Asn Ile Leu
660 665 670
Phe Gly Lys Glu Met Gln Arg Glu Lys Tyr Asp Lys Val Leu Glu Ala
675 680 685
Cys Ser Leu Lys Lys Asp Leu Glu Ile Leu Ser Phe Gly Asp Gln Thr
690 695 700
Glu Ile Gly Glu Arg Gly Ile Asn Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg
705 710 715 720
Ile Gln Ile Ala Arg Ala Leu Tyr Gln Asp Ala Asp Val Tyr Leu Phe
725 730 735
Asp Asp Pro Phe Ser Ala Val Asp Ala His Thr Gly Ser His Leu Phe
740 745 750
Ser Glu Cys Ile Met Gly Leu Leu Asn Ser Lys Thr Val Leu Tyr Val
755 760 765
Thr His Gln Val Glu Phe Leu Pro Ala Ala Asp Leu Ile Leu Val Met
770 775 780
Lys Asp Gly Arg Ile Ser Glu Thr Gly Lys Tyr Asn Asp Leu Leu Lys
785 790 795 800
Leu Gly Ser Asp Phe Met Glu Leu Val Gly Ala His Gln Glu Ala Leu
805 810 815
Thr Ala Ile Asp Thr Val Lys Gly Glu Ala Leu Arg Lys Ser Glu Glu
820 825 830
Met Thr Gly Asp Asn Thr Asn Val Gln Lys Asp Lys Asn Ile Ser Asp
835 840 845
Gly Gln Asn Gly Lys Val Asp Asp Ile Val Gly Thr Lys Gly Gln Ile
850 855 860
Val Gln Glu Glu Glu Arg Glu Lys Gly Ser Val Gly Phe Ser Val Tyr
865 870 875 880
Trp Lys Tyr Ile Thr Thr Ala Tyr Gly Gly Ala Leu Val Pro Phe Met
885 890 895
Leu Leu Ala Gln Val Gly Phe Gln Leu Leu Gln Ile Gly Ser Asn Tyr
900 905 910
Trp Met Ala Trp Ala Thr Pro Val Ser Lys Ser Glu Pro Pro Pro Val
915 920 925
Gly Ser Ser Thr Leu Ile Ile Val Tyr Val Ala Leu Gly Ile Ala Ser
930 935 940
Ala Leu Cys Ile Leu Ala Arg Thr Met Phe Leu Val Thr Ala Gly Tyr
945 950 955 960
Lys Thr Ala Ser Leu Leu Phe His Lys Met His Leu Cys Ile Phe Arg
965 970 975
Ala Pro Met Ser Phe Phe Asp Ala Thr Pro Ser Gly Arg Ile Leu Asn
980 985 990
Arg Ala Ser Thr Asp Gln Ser Ala Ile Asp Leu Asn Val Pro Ile Gln
995 1000 1005
Val Gly Ser Phe Ala Phe Thr Ile Ile Gln Leu Leu Gly Ile Ile
1010 1015 1020
Gly Val Met Ser Gln Val Ala Trp Gln Val Phe Ile Val Phe Ile
1025 1030 1035
Pro Val Ile Ala Val Cys Ile Trp Leu Glu Gln Tyr Tyr Ile Pro
1040 1045 1050
Ser Ala Arg Glu Leu Ala Arg Leu Asn Gly Thr Cys Lys Ala Pro
1055 1060 1065
Val Ile Gln His Phe Ala Glu Thr Ile Ser Gly Ser Ser Thr Ile
1070 1075 1080
Arg Ser Phe Asp Gln Glu Ser Arg Phe Gln Asp Thr Ser Met Lys
1085 1090 1095
Leu Ile Asp Asn Tyr Ser Arg Pro Lys Phe His Ile Ala Ala Ala
1100 1105 1110
Met Glu Trp Leu Cys Leu Arg Leu Asp Met Leu Ser Leu Ile Thr
1115 1120 1125
Phe Ala Phe Ser Leu Ile Phe Leu Ile Ser Leu Pro Val Gly Thr
1130 1135 1140
Ile Asp Pro Ser Val Ala Gly Leu Ala Val Thr Tyr Gly Leu Asn
1145 1150 1155
Leu Asn Ile Ile Gln Ala Arg Val Val Trp Asn Leu Cys Met Met
1160 1165 1170
Glu Asn Lys Ile Ile Ser Val Glu Arg Ile Leu Gln Tyr Thr Ala
1175 1180 1185
Leu Pro Ser Glu Ser Pro Leu Ile Ile Glu Ser Asn Arg Pro Asp
1190 1195 1200
Pro Asn Trp Pro Ser Cys Gly Glu Val Asp Phe Ser Asn Leu Gln
1205 1210 1215
Val Arg Tyr Ala Pro His Met Pro Leu Val Leu Arg Gly Leu Thr
1220 1225 1230
Cys Thr Phe Phe Gly Gly Lys Lys Thr Gly Ile Val Gly Arg Thr
1235 1240 1245
Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu Ile Gln Thr Leu Phe Arg Ile Val
1250 1255 1260
Glu Pro Ala Ala Gly Gln Ile Lys Ile Asp Gly Ile Ser Ile Ser
1265 1270 1275
Ser Ile Gly Leu His Asp Leu Arg Ser Arg Leu Ser Ile Ile Pro
1280 1285 1290
Gln Asp Pro Thr Met Phe Glu Gly Thr Val Arg Ser Asn Leu Asp
1295 1300 1305
Pro Leu Glu Glu Tyr Ser Asp Glu Gln Ile Trp Glu Ala Leu Asp
1310 1315 1320
Lys Cys Gln Leu Gly Glu Glu Val Arg Lys Lys Glu Gly Lys Leu
1325 1330 1335
Tyr Ser Thr Val Ser Glu Asn Gly Glu Asn Trp Ser Val Gly Gln
1340 1345 1350
Arg Gln Leu Val Cys Leu Gly Arg Val Leu Leu Lys Lys Ser Lys
1355 1360 1365
Val Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ser Val Asp Thr Ala Thr
1370 1375 1380
Asp Asn Leu Ile Gln Gln Thr Leu Arg Leu His Phe Ser Asp Ser
1385 1390 1395
Thr Val Ile Thr Ile Ala His Arg Ile Thr Ser Val Leu Asp Ser
1400 1405 1410
Asp Met Val Leu Leu Leu Asp His Gly Leu Ile Ala Glu Tyr Gly
1415 1420 1425
Thr Pro Ala Arg Leu Leu Glu Asn Glu Ser Ser Leu Phe Ala Lys
1430 1435 1440
Leu Val Ala Glu Tyr Ser Met Arg Ser Asn Ser Ser Phe Glu Asn
1445 1450 1455
Val Ser Asp Met Xaa 1460
<210> 53
<211> 386
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 53
ttgttgataa cggagataac tggagtgtcg gacagaggca gcttctttgc ttgggaagag 60 tgatgctaaa acgtagcaga cttctattta tggatgaggc aactgcctct gttgattcac 120
agacagatgc agtgattcag aaaatcatcc gcgaggactt tgcggcctgt actataatca 180
gcattgccca cagaatacca acagtcatgg actgtgatag agttcttgtt atagatgcag 240
gtgctgattt ctctcctttt actttgtacc ttattttgaa tctggtaaat gattatttat 300
ctgtatgtga tggtttccaa ccaatcatag tcagtacctt tatgaagaaa ttgcctaatg 360
ttagccaagt agtagtaaat gcatga 386
<210> 54
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность: Олигонуклеотид NtMRP4Exon1FW
<400> 54
catctcctta cgaaggatac tacc 24
<210> 55
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность: Олигонуклеотид NtMRP4Exon1REV
<400> 55
gctgcaagct ctccttttct aa 22
<210> 56
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность: Олигонуклеотид NtMRP4Exon2FW
<400> 56
gtgcaatctg gcaaatatag tgag 24
<210> 57
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая последовательность: Олигонуклеотид NtMRP4Exon2REV
<400> 57
aaaatgacat aggagcatgc agta 24
<210> 58 <211> 12 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 58
gaagctggaa tg
<213> Nicotiana tabacum
<400> 59
attttaaaga g 11
<210> 60
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 60
gatcgacact 10
<210> 61 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 61
aggttgtcat g 11
<210> 62
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 62
tcagctagac 10
<210> 63
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 63
tgctcagcta 10
<210> 64 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 64
acaggctcat g 11
<210> 65 <211> 10 <212> ДНК
<400> 65
tgttggacag
<210> 66
<211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 66
caggctcatg 10
<210> 67
<211> 12
<212> ДНК
/Т1 Оч Т\Т ~
<213> Nicotiana tabacum
<400> 67
attgtaaatt at 12
<210> 68
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 68
ccgtagatgc t 11
<210> 69
<211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 69
agcagctttc 10
<210> 70 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 70
gcagctgtcc 10
<210> 71
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 71
atatgatgct a 11
<210> 72
<211> 10
<212> ДНК
/Т1 Оч Т\Т ~
<400> 72
gctacagcta
<210> 73 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 73
attccatttg 10
<210> 74
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 74
ctcatgccat t 11
<210> 75
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 75
tgccattgca a 11
<210> 76 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 76
tttctgtggc 10
<210> 77
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 77
ctttagccat c 11
<210> 78
<211> 10
<212> ДНК
/Т1 Оч Т\Т ~
<213> Nicotiana tabacum
<400> 78
tttatactta 10
<210> 79
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 79
ttcaactgtt 10
<211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 80
taacactagc 10
<210> 81
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 81
<210> 82
<211> 11
<212> ДНК
-1 о ^ т\т-:"
tggacttgca 10
<213> Nicotiana tabacum
<400> 82
cagtgatggt a 11
<210> 83 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 83
aggcaacaaa t 11
<210> 84 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 84
ttataaagtt 10
<210> 85
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 85
caggcatggg 10
<210> 86
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 86
caggcatggg a 11
<210> 87 <211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 87
attgaatctt t 11
<210> 88
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 88
cgcgagtccg a 11
<210> 89
<211> 11
<212> ДНК
-1 о ^ т\т-:"
<213> Nicotiana tabacum
<400> 89
aatctttccg c 11
<210> 90 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 90
agtacggatg 10
<210> 91
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 91
ttgtccaagt t 11
<210> 92
<211> 12
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 92
agttcttgta ct 12
<210> 93 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 93
aatagctggt 10
<210> 94 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 94
cattgtcttg t 11
<210> 95 <211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 95
gagcactcct 10
<210> 96 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 96
ttgtcttgtg 10
<210> 97
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 97
agcactcctc 10
<210> 98
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 98
tggagcactc 10
<210> 99 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 99
tcttctagtt g 11
<210> 100
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 100
<210> 101
<211> 10
<212> ДНК
/О 1 о -NT-;^.
tacgctcact t 11
<213> Nicotiana tabacum
<400> 101
atcccgcttg 10
<210> 102 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 102
cgcaggaaca 10
<210> 103
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 103
gaaccgatca 10
<210> 104
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 104
ggctttccct 10
<210> 105 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 105
aaccgatcag 10
<210> 106 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 106
gctttccctc 10
<210> 107
<211> 10
<212> ДНК
/Т1 Оч Т\Т ~
<213> Nicotiana tabacum
<400> 107
catgatctca 10
<210> 108
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 108
tttcacaagc a 11
<210> 109
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 109
atctcttgat a 11
<210> 110
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 110
attggacaaa t 11
<210> 111 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 111
tattagaagc t 11
<210> 112
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 112
gaatggattt t 11
<210> 113 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 113
ttcaccgcga 10
<210> 114
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 114
atctctcttc 10
<210> 115
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
aaacaaccaa a 11
<210> 116
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 116
<210> 117
<211> 11
<212> ДНК
-1 о ^ т\т-:"
agagcaatgc 10
<213> Nicotiana tabacum
<400> 117
ccttgaagaa t 11
<210> 118
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 118
aaaatcttct c 11
<210> 119 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 119
agaatcaaaa t 11
<210> 120
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 120
ttctcgaaga t 11
<210> 121
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 121
tatctaagga a 11
<210> 122 <211> 10 <212> ДНК
<400> 122
aaaacggaga
<213> Nicotiana tabacum
<400> 123
tcaacagtct a 11
<210> 124
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 124
atctgatagg 10
<210> 125
<211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 125
gggattctaa a 11
<210> 126
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 126
acttataaag 10
<210> 127
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 127
aagaagaaag 10
<210> 128 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 128
aacttataaa g 11
<210> 129
<211> 12
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 129
aaagagaaac tg
<210> 130
<211> 11
<212> ДНК
-1 о ^ т\т-:"
<213> Nicotiana tabacum
<400> 130
gctatatatt a 11
<210> 131 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 131
tgaagctttt g 11
<210> 132
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 132
gaagcttttg 10
<210> 133
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 133
ttggatggtg 10
<210> 134 <211> 11 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 134
ggcgtagtgc t 11
<210> 135
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 135
ttgtggcaaa 10
<210> 136 <211> 10 <212> ДНК
<400> 136
ttctctaatg
<210> 137 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 137
gttctctaat 10
<210> 138
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 138
gcaaagttct 10
<210> 139
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 139
taatggcaag 10
<210> 140 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 140
catatgaaac 10
<210> 141
<211> 10
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 141
caacaaatga 10
<210> 142
<211> 10
<212> ДНК
/Т1 Оч Т\Т ~
<213> Nicotiana tabacum
<400> 142
atgcttaatt 10
<210> 143
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 143
cttcagcrga y 11
<211> 12
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 144
gtgccatgtc ct 12
<210> 145
<211> 11
<212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 145
tgtccttcaa t 11
<210> 146 <211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 146
cttctctgtt 10
<210> 147
<211> 10 <212> ДНК
<213> Nicotiana tabacum
<400> 147
<210> 148
<211> 10
<212> ДНК
/Т1 Оч Т\Т ~
ggcatgggaa 10
<213> Nicotiana tabacum
<400> 148
aacattttaa
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растение или растительная клетка, содержащие
(a) полинуклеотид, выбранный из группы состоящий из:
(i) полинуклеотида, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере, на 71% идентичной SEQ ID N0: 1, 2, 27, 28, или 29, или 51; или
(ii) полинуклеотида, включающего в себя, состоящего или преимущественно состоящего из последовательности, по меньшей мере, на 65% идентичной одной из последовательностей SEQ ID N0: 3-23 или 30-50; или
(iii) полинуклеотида, кодирующего полипептид NtMRP,
включающий в себя, состоящий или преимущественно состоящий из
последовательности, по меньшей мере, на 65% идентичной одной из
последовательностей SEQ ID N0: 24-2 6 или 52, где полипептид
обладает активностью транспортера тяжелых металлов; или
(b) полинуклеотидную конструкцию, содержащую, по меньшей мере, 15 смежных нуклеотидов в длину, которая, по меньшей мере, на 65% идентична участку одной из последовательностей SEQ ID N0: 1-23 или 27-51; или
(c) двухцепочечную РНК, содержащую, по меньшей мере, две последовательности, которые, по меньшей мере, частично комплементарны друг другу, где смысловая цепь содержит первую последовательность, а антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, причем, по меньшей мере, одна из последовательностей содержит, по меньшей мере, 10 смежных нуклеотидов РНК NtMRP; или
(с!) вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, описанный в пункте (i), (ii) или (iii), или полинуклеотидную конструкцию, описанную в пункте (Ь).
2. Мутантное, не встречающееся в природе или трансгенное растение, в котором понижена экспрессия полинуклеотида NtMRP и активность кодируемого им белка, или активность кодируемого им белка, а также снижено содержание кадмия в листьях указанного растения, по меньшей мере, на 5% по сравнению с контрольным
2.
растением, в котором не наблюдается понижение экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
3. Растительный материал, включающий в себя биомассу, семена или листья, содержащие клетки или ткани растения по пункту 1 или 2.
4. Табачный продукт, содержащий часть растения по пункту 1 или 2, или растительный материал по пункту 3.
5. Способ уменьшения уровня кадмия, по меньшей мере, в части растения, включающий в себя стадию понижения экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка, по сравнению с контрольным растением, в котором не наблюдается понижение экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
6. Мутантное, не встречающееся в природе или трансгенное растение, полученное, или которое можно получить с помощью способа по пункту 5, по меньшей мере, в части которого содержание кадмия снижено, по меньшей мере, примерно на 5% по сравнению с контрольным растением, в котором не наблюдается понижение экспрессии полинуклеотида NtMRP и активности кодируемого им белка, или активности кодируемого им белка.
7. Выделенный полипептид NtMRP, экспрессируемый
полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из:
(i) полинуклеотида, который включает в себя, состоит или преимущественно состоит из последовательности, по меньшей мере, на 71% идентичной последовательности SEQ ID N0: 1, 2, 27, 28, или 2 9, или 51; или
(ii) полинуклеотида, который включает в себя, состоит, или преимущественно состоит из последовательности, по меньшей мере, на 65% идентичной последовательности SEQ ID N0: 3-23 или 30-50; или
выделенный полипептид NtMRP, который включает в себя, состоит или преимущественно состоит из последовательности, описанной в SEQ ID No: 24-2 6 или 52, где полипептид обладает активностью транспортера тяжелых металлов.
8. Антитело, способное специфично связываться с выделенным
полипептидом по пункту 7.
9. Способ детекции полинуклеотида NtMRP в образце,
включающий в себя следующие стадии:
(a) получение образца, содержащего полинуклеотид;
(b) приведение указанного образца в контакт с одним или несколькими праймерами или одним или несколькими зондами с целью специфичной детекции, по меньшей мере, части полинуклеотида NtMRP; и
(c) детекция присутствия продукта амплификации, где
присутствие продукта амплификации указывает на присутствие
полинуклеотида NtMRP в образце.
10. Выделенный полинуклеотид, выбранный из группы,
состоящей из:
выделенного полинуклеотида, который включает в себя, состоит, или преимущественно состоит из последовательности, по меньшей мере, на 71% идентичной последовательности SEQ ID NO: 1, 2, 2 7, 28, или 2 9, или 51;
выделенного полинуклеотида, который включает в себя, состоит, или преимущественно состоит из последовательности, по меньшей мере, на 65% идентичной последовательности SEQ ID NO: 3-23 или 30-50;
полинуклеотида, кодирующего полипептид NtMRP, который включает в себя, состоит, или преимущественно состоит из последовательности, по меньшей мере, на 65% идентичной последовательности SEQ ID NO: 24-2 6 или 52, где полипептид обладает активностью транспортера тяжелых металлов.
11. Полинуклеотидная конструкция, из, по меньшей мере, 15 смежных нуклеотидов в длину, и, по меньшей мере, на 65% идентичная участку одной из последовательностей SEQ ID N0: 1-23 или 2 7-51.
12. Двухцепочечная РНК, содержащая, по меньшей мере, две последовательности, которые, по меньшей мере, частично комплементарны друг другу, где смысловая цепь содержит первую последовательность, а антисмысловая цепь содержит вторую последовательность, причем, по меньшей мере, одна из
11.
последовательностей содержит, по меньшей мере, 10 смежных нуклеотидов РНК NtMRP.
13. Двухцепочечная РНК по пункту 12, содержащая
первую последовательность, по меньшей мере на 65% идентичную последовательности, содержащей, по меньшей мере, 10 нуклеотидов NtMRP3 или NtMRP4;
вторую последовательность; и
третью последовательность, содержащую последовательность, обратно комплементарную первой последовательности, и расположенную в той же ориентации, что и первая последовательность,
где вторая последовательность расположена между первой последовательностью и третьей последовательностью, и находится в функциональной связи с первой последовательностью и с третьей последовательностью.
14. Двухцепочечная РНК по пункту 12 или 13, где первая последовательность, по меньшей мере, на 65% идентична последовательности, выбранной из группы, включающей в себя: SEQ ID NO: 3-23 и 30-50, и/или где третья последовательность, по меньшей мере, на 65% идентична последовательности, обратно комплементарной соответствующей последовательности SEQ ID NO: 3-23 и 30-50.
15. Вектор экспрессии, содержащий выделенный полинуклеотид по пункту 10 или полинуклеотидную конструкцию по пункту 11.
По доверенности
1/11
194156
(а)
(b)
ФИГ. 1
11111 i i i i i i 11
lfc 2к Зк 4к 5к бк 7к 8к
3'-utr:augustus
5'-utr;augustus
cds;augustus
ген Iaugustus
интрон :augustus ¦
старт-кодон : augustus стоп-кодон: augustus транскрипт:augustus
tss:augustus tts:augustus
tcctagtactgtaagtgaaccagcaaggaaactgcaaagtagatttcttgttcatcaaat aaatccttgagctgagagatatgattttttctaaggaatttctctttggctctctgtagt ggtgagtttgattcatatttcaatctagtttttagctttgcttaaaagcttcttcttgcc actagaccaaatccttttcctttttgcatgacacttttttgagtttcatttctcttattt atagagaaaatcttttgatggggatggttttttttctcttttgcattaatgattagaatt tatcattgttaaatggtactccctcaataactttttgatttaaaaaaaaaactgtccttt cattcataatcatcatctcctttattatattactctaaactgttgctaaagttccttttt gtatattttccctacatgaacttttgctgtactgtgaaagttgatgaacttttattgtac aatgttttggtccagtagctaacagcccttttatttaattctgagaggtctctttctctt tctcttcacactttcacatgtttccgtttcctgtagatttctcctttctctttccttggt tctttttccaactcataatcttcatgtgatttcaatttttgtttgtttttattccatcct ttgtctcttttgatatgggtgacaaacatcttctcttgctgaataaaaatttcacctttt ttcagtgtatgcagattcaggggatataaagacataaaggatgaatcttttatggtataa cATGGATATGAGGAACAGTATGTCTTCAGAATCTTGTTTAGCATCACTTTCTTGTTCTGC
CTCCACATTTCAATCGTCAGAGGATTCAGCAGTTGTTAAATGGTTAAGATTCATTTTCCT CTCTCCATGTCCACAAAGGACTCTTCTATCTTCCATTGATGTGCTGCTTTTGCTTACTTT CATTGTATTTGCAGTACAAAAGTTGTACTCAAAGTTGAGGTCCAATGAGCACTCTACTTC TAGCATTGATAAGCCTCTAATTGCACACAACAGGACTTCTgttagaaccaatctttggtt taagctgtctctgattttgtcagctattttagccttatcttctatagttttatgcatttt ggttattgtgggaaattcccagTCGCCTTGGAAAGTCATAGATGGACTGTATTGGTTGTT TCAGGCGATTACACATGTTGTAATCACTATACTAATAGTTCATGAGAAAAGATTTCACGC TATTTCCCATCCACTGTCCCTGCGCGTGTTTTGGATTGCAAACTTTGTAGTTATGAGTTT GTTCTTTGGTTGTGGGATCACAAGGCTTGTGTCACTTAAGGAAATTGATCCTAATTTAAG AATGGATGATATAAGTTCATTAGTTTCATTTCCTATTTCTGTTGTTCTCTTCATTGTTGC CATTAAAGGTTCGACCGGAGTTGCTGTAATTAGTGATTCTGAATCTCACTTAAGTGATGA AACCAATGGTTATGAACTCCTGGATAAATCCAGTGTGAGTGGCTTTGCTTCAGCTTCTCT AATATCGAAAGCCTTTTGGATTTGGATGAACCCTTTACTGCAAAAAGGTTACAAGTCACC TCTCAAGATTGATGAAGTTCCTTCACTTTCCCCACTGCATAGAGCAGAGAAAATGTCTCA ACTTTTCGAAAGAAATTGGCCTAAACCTGAAGAAATATCAAAGCATCCTGTCCGAACAAC ATTGCTGCGTTGCTTTTGGAAGGAAGTTATTTTTACTGCCATTCTTGCAGTAATTAGGGT ATGTGTTATGTATGTAGGGCCAACACTCATACAAAGATTTGTTGATTACACAGCAGGAAA GAGGACATCTCCTTATGAAGGATACTACCTTATAGGAACTCTCCTAATAGCCAAATTTGT GGAAGTTCTAACCTCTCATCAGTTCAACTTTAACTCCCAAAAGCTTGGCATGCTTATTCG AGCGACACTTCTCACTTCTTTGTATAAGAAGGGGTTAAGGTTGTCATGCTCAGCTAGACA GGCTCATGGTGTTGGACAGATTGTAAATTATATGGCCGTCGATGCTCAGCAGCTGTCCGA TATGATGCTACAGCTACATTCCATTTGGCTCATGCCATTGCAAGTTTCTGTGGCTTTAGG CATCCTTTATACTTACCTCGGTGCTTCAACTGTTGTAACGCTAGCTGGACTTGCAGCAGT GATGGTATTTGTGGTGTTTGGAACTAAAAGAAACAACAGGTTTCAATTTAACATCATGAA GAATCGTGATTCTAGAATGAAAGCGACAAATGAGATGCTTAATTATATGCGCGTTATAAA GTTCCAGGCATGGGAAGAACATTTTAACAAAAGAATTGAATCCTTCCGCGAATCCGAGTA TGGATGGTTGTCCAAGTTCTTGTACTCAATCGCTGGGAATATCATTGTCTTGTGGAGCAC TCCTCTTCTAGTGGCTACACTCACTTTTGGAAGTGCAATCTTGTTGGGAATCCCGCTTGG TGCAGGGACAGTGTTCACTGCAACATCTCTCTTCAAGATGTTGCAGGAACCGATCAGGGC TTTCCCTCAATCCATGATCTCACTTTCACAAGCAATGATATCTCTTGATAGATTGGACAA ATATATGATGAGTAAGGAGTTAGTGGATAAAGCTGTGGAAAGACTAGAAGGTTGTGGGGG TACAATTGCTATGCAGGTGAAAGATGGAGCTTTTTGCTGGGATGATGAAAACAGTAAAGA AGAATTGAAAAATGTAAACTTTGAGATTAGAAAAGGAGAGCTTGCAGCAGTAGTGGGGAC AGTTGGGGCGGGGAAGTCTTCCCTCCTTGCATCTGTACTTGGTGAGATGCACAAGTTGTC GGGTCAGgtatggctctcatccttctgtttgtttgattaatacaaactttgctgccaatt accttttgccccttgttgctacctcttttctgtggtataaaaaattaatgtaggctaatg tgtagagtggaggtattatatgcagaacaattgcaatcaagcaattacctgtgagatact
attttgttttcatattagtggactggtacattctcattggtgtatcgtttgatctccacc aaagcagaggttttactggccgacagagtcaaactactgtgcttcactccttttactcca atccttagtagtctttgcttctaatgaacttcaagcgtgtaatagaaacaccattatatt attagctgattagttactttacaattccagagcatatttacattttctgcttggttgtct attactctggataacagtcctaaatgcaagcaaaatcaactgtgttttcagtcttgagct gaccaattagttcatgatgtcctcagcttgtccaagctggtgcctcaccggaattatgtg ggaccttcgtacttaatcaactagttcaccttcttcttaaaaatattgaatgatttgatt ggttaatagttccttaaatgtagtaattatttgctaacttactttaccaaccccttgtcc aacagGTCACAATTTGTGGTTCAACTGCCTATGTTGCACAAACATCGTGGATTCAGAATG GCACGATACAAGAAAATATCCTGTTTGGTATGCCAATGAACAGAGACAGATACAAGGAAG TGATCCGGGTTTGCTGCTTGGAGAAGGACTTGGAAATAATGGAGTTTGGAGACCAGACTG AAATAGGAGAACGTGGCATCAACCTCAGTGGTGGTCAGAAGCAGCGAATCCAGCTTGCAA GAGCTGTTTACCAGGACTGTGATATTTATCTTCTAGATGATGTATTCAGTGCAGTTGATG CTCACACTGGCTCTGAAATCTTCAAGgttagaagtccacaatgtcatgtgtcattgaaga tttaatttaagatagaaattacattgtttcattctgcaaattatggacctatcagagaaa aatcatggattttgaatggctactttccccagtgaagacacatatcatttcctgggagga agatgtgaaagtggcaagctatttactccaaaaagtataatctaaaagacttttattaag tttggaaggcttaatccatcatttgttatctgttgtctacttgtctttattaaaattctt cttagtccaatcactttcgatgaagttgactagtcttagtcacctgaatactttaaatct ttgccttggtgtctctatattttcagccatctcaattccgaagctcatatttgttttctc tttgtaatgtccatctgaaagtttcatgcttttttgcagGAATGTGTGAGGGGAATTCTT AAAGATAAAACCATTTTGCTTGTCACACACCAAGTTGACTTCTTGCATAATGTTGACCTG ATCCTTgtaagtttcagagtgttttatcaacccctttggaaccaagtgtcaagagtagtg tttcttggttgttaaatgattcacatgtgtgttggtttctataaaacctgaactttatgt tttatcagagtgttttgctttcttgaagGTCATGCGAGATGGGATGATCGTGCAATCTGG CAAATATAATGAGATATTAGAAGCTGGAATGGATTTTAAAGAGCTAGTAGCTGCACATGA GACCTCTTTAGAACTTGTTGACGTGGAAACAACCAAAGAGAGCAATGCCTCCCTTGAAGA ATCAAAATCTTCTCGAAGATTATCTAAGGAAGAAAACGGAGATGATAAATCTCAACAGTC TACATCTGATAGGGGGGATTCTAAACTTATAAAGGAAGAAGAAAGAGAAACTGGAAAAGT CAGTCCTCGTGTGTACAAGCTATATATTACTGAAGCTTTTGGATGGTGGGGTGTAGTGCT AGTTATCTTGTTTTCGTTCTTGTGGCAAAGTTCTCTAATGGCAAGTGATTATTGGCTGGC ATATGAAACTTCAGCGGATCGTGCCATGTCCTTCAATCCTTCTCTGTTTATTGGGATATA CGGTGTTATTGCAGTTGTTTCTTCGTTGCTGATAGTGATCAGGATGTATTTTGTGACACT TATGGGGCTCAAGACTGCCCAAATATTTTTCGGACAGATTCTTTACAGCATACTGCATGC TCCTATGTCATTTTTTGACACAACACCTTCCGGAAGAATTCTGAGTCGGgtaaatttctg aggacaagtttttccttttgcatgtaaattcaaactttgctgcttagatgattaaataat gaaaaatatccattgcatgttttaatgtgtatgacatgttagaattttgaatagaagttc
attcactgatgttgagatgttttgttttttttctgcagGCATCTAATGATCAGACCAACA TTGATGTCTTCCTCCCGTTTTTTATGAATCTCACTTTGGCCATGTTTATCACACTGCTCG GCATCATCATCATCACATGCCAATATTCTTGGCCTACCGTACTACTTTTGATTCCTCTGG
GTTGGCTTAATATCTGGTACCGGgtatgagcactgtttataacagccgtccttttttctt ttcttgtctgaactcaaatttgaatcctttgtttagaggcaattagtctgctctgagcat tttggctgacagttattatgtatattaaaaggcaacttttttattcgttctgtccagcta aaactttttacttaaaatgtggttaactgcatatttctgtgtctcctattttttgattat ttgcaactctgatcaatctagatttggggaaggcttgttgttagttgatgactagatact aagctcacatctacattggttgcaagtagaattttcaagttgtcattcacttatattgtt tgaactaggagattagcattcttctgcaaggagccctgaatgcttgaaaagttaaacaga aaagaaaaagttcagggcagatagacataatgtgttaaagtaattcaattggagcacaga tatatgacatgtgttatttgggagctacgaaaaagataaggactattatgtagactacaa ttgaaataacaggtaattcatttctggtttacagGGATATTATCTTGCAACATCTCGTGA ATTGACTCGGCTTGACTCAATTACAAAAGCACCTGTTATTCATCATTTCTCTGAAAGCAT CTCAGGTGTTATGACTATACGTTGCTTTAGGAAGCAGGAGATGTTTTGTAACGAGAATGT AAACCGAGTGAATTCCAATCTGCGAATGGATTTCCACAACAATGGATCCAATGAATGGTT GGGCTTTCGACTGGAATTGATGGGAAGCTTACTTCTTTGTGTTTCTGCAATGTTCATGAT TGTCTTACCTAGCAGCATCATCAAGCCAGgtataacaccgtccaatgctcatttatggga attataaattctagtatttgataatccttctgtactttagatctacctgctctactgaaa aatgaaatgagtatgaggaaatagaatatccgttgagcatttatgtctttctattaaaaa tttgcattctatcttcttgtttcaagtcaaaatcttgaacaactatatctagagaatttt ccttcttgtgaagtaatgcatatatacatcaagagaagtcagagttgctgaatgaaatag tagatcaaatttaagtgttgtgcctataaagaattgtatggtgagattgaatatagtggt catattattttctcaatcttagtgattaaagtattccatacaaacagacaagcatttagt cgtgcattcattggcactacaaaattatcaaccaagagtaatattctttcagctttcctc tgtatatgtgtgttctattctggagctgaagataactaatattcttttttatttctacag AAAATGTTGGTTTGTCACTATCATATGGCTTGTCTCTTAATAGTGTCCTATTCTGGTCCA TCTTTGTGAGTTGCTTTGTGGAAAATAAAATGGTTTCTGTCGAAAGATTAAAACAGTTCT CAGAAATACCATCAGAAGCAGAGTGGAGAAAGATGGATTTTCTCCCACCTTCAAGTTGGC CAAGCCGTGGGAATGTTGAGCTTGAAAACGTGCAGgtaataattсtаасtaattсtgtgg ttgctatttgctagcatttgcacaaaaggaaaactataaaaagttcatagtaaggaagag agggtagctgtattaacaagcctacagattctttaatttcaaatatgttacgttgaatct ctatattgtttgttctactggtcaacagGTTAGATATCGTCCGAACACTCCTCTAGTGCT TAAAGGAGTTACTCTCAGCATTAGAGGGGGAGAGAAGATAGGTGTTGTTGGTCGTACAGG GGGTGGAAAATCAACATTAATTCAAGTTTTCTTTCGTTTGGTGGAGCCTGCAGCTGGAAG AATAATCATTGATGACGTAGATATATCCAGACTTGGGCTTCATGATCTTAGATCTCGCTT CGGGATCATTCCCCAAGAGCCAGTCCTTTTTGAAGGAACTGTGAGAAGCAACATTGACCC
CATTGGACAATATTCAGATGATGAAATTTGGAAGg taatctaacttgctgactgaaataa tttacaaaaatctcaaaatatagtacagagttagccaaacatgtcttctgagtgctgaga tctttttggattataaattctgtaagagcaacatactatttgttagtgagaagaaaagca tatactccagtgttttgttatctcccagaatgtctctaacatgaaatcgtgtacattgca gAGCCTCGAACGCTGCCAACTCAAAGATGTGGTGTCTTTAAAACCCGAAAAACTTGATTC ACCAGgtaaattttcctcctctacgtcatccttgtggttctttgcggaattatgcaacca actttttatgtgtttcaaatatatatactgataactgaatactgtcattggtaaatcata gTTGTTGATAACGGAGATAACTGGAGTGTCGGACAGAGGCAGCTTCTTTGCTTGGGAAGA GTGATGCTAAAACGTAGCAGACTTCTATTTATGGATGAGGCAACTGCCTCTGTTGATTCA CAGACAGATGCAGTGATTCAGAAAATCATCCGCGAGGACTTTGCGGCCTGTACTATAATC AGCATTGCCCACAGAATACCAACAGTCATGGACTGTGATAGAGTTCTTGTTATAGATGCA GGTGCTGATTTCTCTCCTTTTACTTTGTACCTTATTTTGAATCTGGTAAATGATTATTTA TCTGTATGTGATGGTTTCCAACCAATCATAGTCAGTACCTTTATGAAGAAATTGCCTAAT GTTAGCCAAGTAGTAGTAAATGCATGAagtcattagcctatttgttttggattttgtgag tttcatacttcaaactggaagcttatgctatactatctgatcccttgtttgtatagattg ctttcttttcctttttctcggatttatcttatatataagcggacagagtaaaagaatgta aacatgcgtaatttgacctattatagcagattatttgtcttattttccaggtcgctgatt ccacttattaggagtagttacacgtatttatcttttaagtgaaataatagtgtaaagttt cttttggcactgtcggtgtaaagaagttaaactcctttctttaaccccggcatttcttat tcatgcaggaatagcaaaagagtttgacaaaccatctcgtttgcttgaaaggccttcact ttttggggctttggttcaagaatatgccaaccgatcctctgagctctaaccacactattt tggctttcatgccttttgctgtaaattgcagctatcttggaggataggtgaaacaggaaa aatacctatccaaatgttacatagatttccaaatagtgttatctcctactaagctatcca gtagatttttggaaatgtaacaatattgggattaacaattgtaattgatgaatctattaa tcaaatacaatgattattctgttatagatgtagtctgtgcaatgttatatagactgattt
ФИГ. 2
Росток Корень
CdCI2
О 0.05 0.5 0 0.05 0.5
тубулин ^^^^^^И ^^^^^^Я
NtMRP4
# / # /
$ / / #
^ *
Корень Корень Лист Лист
NtMRP4
ФИГ. 3
Дикий
ТИП
° ^- CN СО ^ Ю
5 5 5 к к к
т ? 5 s s s
.5 ^ s s s s
^ ^ ^ с; с; c;
NtMRP4
тубулин
Линия 1
Линия 2
векторный контроль
ФИГ. 5
62k
63k
64k
65k
66k
67k
68k
69k
nrna:sin4cc
ФИГ. 6
ccgtcaacccagtcttggccaccacataaacacagctttgacttgtctctcccttttccctattttcaccacccttttca atttcccaccttatattcattattatatttaatcaatcaaatcaaagttggaaaaaaagggagtaataatcaaatggagt agtatatacataccagaacaatgaaagagcactcataagctaaagcccataattcatcacgaaaccacaatatagaggaa acctgacgtgtcccttaaaatctaaccttgaacctctgagacctccaaaaaaaacati ATGGAAATTGCAAAGGGCATGT CTGTGTTTCAATCTTTGAG ftatgttggcgttgatgaatccctccgaaaccccattttcttacgtgtcattagttgttct ttgcacctgggattgttccttgtaattcttgggttgtgttgttggaatacaatcai GAGGGACAATAATGCTGGCCACAA
TTGTGTTATGTTTGTTAGCTCATTTTTATTGGTATAGAAATGGTTGGTCAGAAGAAAAAATTATAACCCTTTTGGATTTT GCATTAAAGTTGCTAGCTTGGTTGTCAATCTCTGTTTTCTTGCACACCCAGTTCCTTAATTCTTGTGAAACCAAATACCC TCTTGTTTTAAGAGTTTGGTGGGGGCTTTTCTTCTTTGTTTCTTGTTATTGCCTTGTTATAGACCTTGTTTATGGGGAAA AGAACCAATCTTTACCAACTCAATTTTGTATACCTGATGTTGTTTTCACTCTTATGGGGTTATTCTTCTGTTTTGTTGGG TTTATTGTTAAAACAGAGAGTGAGGAGAATATGCTTCAGGAACCCCTCTTAAATGGTAGTGTTGCCAATGGCATGGACTC AAAGAAGTCTACTGGGGATCAAACTGTCACCCCTTATGCCAATGCTAACATTTTTAGTCTCTTTACTTTCTCTTGGATGG GTCCCCTAATTTCTGTTGGCAACAAGAAACCATTAGACCTTGAGGATGTTCCTCAGCTTCACTTTGATGATAGTGTCAAA GGGAGTTTTCCTATTTTTAGAGAAAAACTAGAATCTGTGGGTGGGGGAAATAGTAACCGTGTGACTACCTTCATGCTGGT GAAGGCTTTGGTTTTCACAGCACGGAAGGAGATAGTGTTATCGGCTCTCTTCGTGCTTCTTTACGCTCTGGCGTCTTTTG T T GGC CC GTAC С T CAT T GATACC T TAGT T CAGTAT С T GAAT GGAAAAC GAGACT T T GATAAT GAAGGT TAT GTC T TAGT G GCTGCATTCTTCGTTGCAAAGTTGGTGGAGTGTTTGGCGCAAAGGCATTGGTTTTTCAAGGTGCAGCAGGGAGGGTATCG GGCAC GGGCAGCACT GGTT T С CAAAAT С TACAACAAGGGT T TAAC CCTCTCCTGT CAGT CAAAGCAAAGCСACACTAGTG GAGAGATCATCAATTTTATGACAGTTGATGCCGAGAGGATTGGTGACTTCGGTTGGTATATGCATGATCCTTGGATGGTA ATCATACAAGTTGCTCTGGCATTGGTGATACTCTATAAAAATCTTGGCCTAGCTGCTATCGCCGCGTTTGTTGCTACAAT AATAGTGATGTTGGCAAACATCCCTTTAGGGAGTTTGCAGGAGAAGTTTCAGGAGAAACTCATGGAATCGAAAGATAGAA GGATGAAGGCTACATCTGAAGTCTTAAGGAATATGAGAATACTCAAGCTTCAAGCTTGGGAGATGAAGTTTCTGTCTAGG ATCTTGGACCTCAGGACTACAGAGGCAGGATGGTTGATGAAATATGTGTACACATCAGCTATGACTACTTTTGTCTTCTG GGTTGCTCCTACATTTGTTTCTGTGACGACCTTTGGCGCTGCAATGCTTATGGGAATCCCACTTGAATCTGGGAAGATAT TGTCTGCACTTGCGACATTTAGAATTCTTCAAGAGCCCATCTACAATCTCCCAGATACAATTTCAATGATTGCTCAAACC AAAGTTTCTCTTGATCGTATTGCATCTTTCCTTTCTCTTGATGACTTGCAGCCTGATGTCATAGAGAAGCTTCCAAAAGG TAGTTCTGATGAAGCAATTGAGATTGTAGGTGGGAACTTCGCTTGGGATGCATCCACCTCGACTCCACTTCTAAAGGATG TAAATCTTAGAGTGCTTAATGGCATGAGAGTTGCCATTTGTGGTACAGTTGGTTCAGGAAAATCAAGCTTACTGTCTAGC AT T T TAGGAGAGATGC С CAAATTAT CAGGGACTATT AAACTTAGTGGAACGAAGGCTTATGTTGCACAGTСGCCСTGGAT ACAGAGT GGAAAGATAGAGGAGAACATAT TAT T TGGTAAAGAGAT GCAGAGGGAGAAGTATGATAAAGTT С T TGAAGC GT
GGACAGAAGCAGAGAATACAGATTGCTCGTGCTCTTTACCAAGATGCTGATGTTTACCTATTTGATGATCCGTTCAGTGC TGTGGATGCTCATACCGGATCCCATCTCTTCAGT catatatatgctttattttcatgcttgatatattt tacctagccacttgattgacccatcctttaattgcai GAAT GTATAAT GGGGCTATT GAAT T СAAAAACAGT T T TATAT G TTACACATCAAGTGGAGTTTTTGCCTGCTGCGGATTTGATCTTG ftactctttcctttcagtaattatggtttgcttaat atcatatatagacttaactcatttaactatgatatttctcttce GTCATGAAAGATGGAAGGATCAGTGAAACTGGGAA ATACAATGATCTTCTCAAATTAGGTAGTGACTTCATGGAACTTGTGGGTGCTCACCAAGAAGCTTTAACAGCAATTGACA
CAGT TAAGGGAGAAGCATT GAGAAAGAGTGAGGAAATGACTGGTGATAATACAAATGTACAGAAGGATAAAAATAT TT СA GAT GGCCAAAAT GGTAAAGT GGAT GATAT TGT T GGAACAAAGGGACAAATTGTTСAGGAGGAGGAAAGAGAGAAAGGTAG TGTTGGTTTTTCAGTTTACTGGAAATATATAACAACTGCATATGGAGGTGCTCTTGTGCCATTTATGCTGTTGGCACAAG TTGGTTTTCAGCTCCTTCAAATTGGAAGCAATTATTGGATGGCGTGGGCAACTCCCGTCTCAAAGAGTGAGCCACCTCCT GTTGGGAGTTCTACTCTCATCATTGTCTATGTTGCTTTAGGAATTGCAAGTGCTTTATGCATCCTTGCTAGAACCATGTT TCTTGTTACCGCTGGATATAAGACAGCCTCTTTGCTTTTCCATAAAATGCATCTTTGCATTTTCCGTGCTCCAATGTCCT ТС T T С GAT GCCACAC С GAGT GGGC GGAT T CTAAACAGA aatgattacattttctttatttagccccttttttt
tgtgaaaattagctagtaatttcagaattaactca GCAT С GACAGAT СAAAGTGCAATTGATСTGAATGTTСCCATTCAAGTTGGATСCTTT GCCTTCACAATAATACAGCTTTTAGGGATTATTGGAGTAATGTCACAAGTTGCATGGCAGGTCTTCATTGTCTTTATTCC GGT СATT GCAGT T TGCАТС T GGT T GGAGfttgctacgaccacctttttcgtgttctttgccttcacaattattctactat atgctttttcacaaagtgagtcataactttagcgacattcataaacgtgagttacatttaagtggtgagtttgttttcat CAATATTACATACCATCAGCACGAGAACTGGCACGGCTAAATGGGACATGCAAAGCTCCAGTAATACAGCACTTT GCCGAGACAATTTCAGGATCAAGCACAATTAGAAGTTTCGATCAGGAATCTAGATTCCAGGACACAAGTATGAAATTGAT AGACAATTATTCTCGGCCTAAGTTTCACATCGCTGCTGCAATGGAGTGGCTTTGTTTGCGTTTGGATATGTTATCTCTGA TCACTTTTGCTTTCTCTTTAATTTTCTTGATCTCTCTTCCTGTTGGAACAATTGACCCAA ftaagttctctatcttcatg ttttctttccttgaagtttgttgtgttgaataactcttaagagcacattttctccgtttcttgatttacai GTGTTGCTG GCTTAGCTGTTACATATGGGCTTAATCTGAACATAATACAAGCTCGGGTTGTTTGGAATCTTTGTATGATGGAAAATAAA ATTATTTCTGTTGAAAGAATACTTCAGTATACTGCTCTTCCAAGTGAATCTCCTCTTATCATAGAATCCAACAGACCAGA CCCTAACTGGCCATCTTGTGGAGAGGTTGATTTTAGCAATCTTCAG aaattaagttattctctggtgttaattatgca
GTCCGATATGCTCCTCACATGCCTCTCGTGTTGC GAGGCCTTACATGCACTTTCTTTGGTGGAAAGAAGACTGGAATTGTCGGTAGGACAGGCAGCGGTAAATCTACTCTAATA CAGACCCTCTTCCGCATAGTTGAACCAGCTGCTGGACAAATAAAAATAGATGGTATCAGCATCTCCTCAATTGGTTTGCA TGATCTACGGTCTAGATTGAGTATAATTCCACAGGATCCAACTATGTTTGAGGGAACAGTTCGCAGCAACCTAGACCCGC T T GAAGAGTAT T СAGAT GAACAAAT TT GGGAG cagcttggttttgcctatttttggatttattttgtttcagatag gaaaatgacaaattttattttattgagaaactttgtttgatgttatgcttcai GC GCT С GATAAGT GT СAGC TAGGAGAA GAAGTGAGGAAGAAAGAAGGCAAACTTTATTСTACAGjtaacttcaagaaccacatcattttctgatgatttccactttt agagctgtaataatcatcttcattgcgttgctgcs TAT С T GAGAAT GGAGAGAAC TGGAGT GTAGGC CAAAGGCAGC T G GTCTGCCTTGGCCGTGTGCTACTGAAAAAGAGCAAGGTCCTGGTCCTTGACGAGGCTACAGCATCTGTCGACACTGCAAC TGATAATCTTATTCAGCAAACTCTAAGGCTGCACTTCTCTGATTCCACGGTTATAACCATTGCTCATAGGATTACATCTG T GC T T GACAGTGATAT GGT С С TAC TAT TAGAT CAT Gftaagaatcatcgtttatgttctggagcaagcggagaaggaaat tcttggtagttaccttttttttatgctatgctgcc GGC T СATT GC T GAATACGGCAC T С CAGCCAGGTTGTTAGAGAAC GAATCCTCATTGTTTGCTAAGCTCGTGGCAGAGTATAGTATGAGGTCAAATTCAAGTTTTGAGAATGTTTCAGACATGTG ^gtctcagaaactaatcttcgttaataatgttacacgacgatgatgatgaaaattaggggactctagactagtaccttag tcgatagtgttttgagtttccatctgtggacaccatagcttgaacaagaaccagcgaaatgcaggtcatgcctgtggctt gagggaaactgcaacaatcctatggcagggaaagaaacctacatctagtgatgcaatattgattgtgaagtggcatttgt ttttgtttagactttttgatgagaaaatgtatacgtaactttgtgtttacaataatttgaatgtatgttgagtcaagtga ttagttagttaagagtgcacggattttgctacttctgggtaaaagaagtaaaccttgttgttgagagttgaaagtgaaat tactagtgtcgaattttgccgcataagctaaatgaaacacttttacgataaactcctagtgcaacaaaggaaaaattcat tggcaagactagctgtttatgtttcacgac
(19)
130
130
133
133
144
144
<210> 9
<210> 9
<210> 13
<210> 13
<220>
<220>
<220>
<220>
<210> 36
<400> 45
<400> 45
<213> Nicotiana tabacum
<213> Nicotiana tabacum
<213> Nicotiana tabacum
<213> Nicotiana tabacum
<210> 80
<210> 80
<400> 115
<400> 115
<213> Nicotiana tabacum
<213> Nicotiana tabacum
<213> Nicotiana tabacum
<213> Nicotiana tabacum
<210> 144
<210> 144
2/11
2/11
6/11
6/11
7/11
7/11
7/11
7/11
8/11
8/11