(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к композициям молочно-кислых бактерий (Lactobacilli) человека для перорального и влагалищного введения и к их применению для физиологического восстановления флоры влагалища, физиологического поддержания флоры молочно-кислых бактерий при патологическом дефиците для продуцирования молочно-кислых бактерий, для лечения бессимптомного бактериального вагиноза и предупреждения преждевременных родов, вызванных бактериальным вагинозом.
Евразийское (21) 201390305 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.09.30
(22) Дата подачи заявки
2011.09.13
(51) Int. Cl.
A61K35/74 (2006.01) A61P 15/02 (2006.01) A61P 31/04 (2006.01)
(54) КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВЛАГАЛИЩНОГО И ПЕРОРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ LACTOBACILLUS И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 10176578.2; 61/412,964
(32) 2010.09.14; 2010.11.12
(33) EP; US
(86) PCT/EP2011/065877
(87) WO 2012/035028 2012.03.22
(71) Заявитель:
ЭйчЭсОу ХЕЛТ КЕА ГМБХ (AT)
(72) Изобретатель:
Кисс Герберт, Домиг Конрад Й., Кнайфель Вольфганг, Фирнштайн Хельмут, Унгер Франк М. (AT)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к композициям молочно-кислых бактерий (Lactobacilli) человека для перорального и влагалищного введения и к их применению для физиологического восстановления флоры влагалища, физиологического поддержания флоры молочно-кислых бактерий при патологическом дефиците для продуцирования молочно-кислых бактерий, для лечения бессимптомного бактериального вагиноза и предупреждения преждевременных родов, вызванных бактериальным вагинозом.
РСТ/ЕР2011/065877
МПК: А61К 35/74(2006.01)
А61Р 31/04 (2006.01) А61Р 15/02 (2006.01)
КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВЛАГАЛИЩНОГО И ПЕРОРАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ LACTOBACILLUS И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к композициям для перорального и влагалищного введения молочнокислых бактерий (Lactobacilli) человека и к их применению для физиологического восстановления флоры влагалища, физиологического поддержания флоры молочнокислых бактерий при патологическом дефиците для продуцирования молочнокислых бактерий, лечения бессимптомного бактериального вагиноза и предупреждения преждевременных родов, вызванных бактериальным вагинозом.
Во влагалище здорового человека преобладают различные виды Lactobacillus, которые играют важную роль в защите женщин от урогенитальной инфекции. Lactobacilli способна прикрепляться к эпителию влагалища, ингибировать адгезию и рост патогенов, расходовать питательные вещества, в противном случае доступные для патогенов, и модулировать иммунный ответ хозяина и микроокружение [1, 2]. Наиболее важно то, что Lactobacilli метаболизируют гликоген, содержащийся в клетках свода влагалища, образуя молочную кислоту в качестве конечного продукта. Таким образом, в здоровом влагалище достигаются значения рН 4,0-4,5, уровень, при котором не могут расти многие патогены.
Поскольку влагалищная инфекция является важным механизмом заболевания, ответственного за преждевременные роды [3], поддержание естественного, здорового баланса флоры Lactobacillus во влагалище особенно важно во время беременности. Дефицит Lactobacilli может привести к нарушению микробного равновесия во влагалище, часто приводящему к синдрому бактериального вагиноза [4,5], который может быть ассоциирован с количественным и качественным переходом от обычно присутствующих молочнокислых бактерий к смешанной флоре с преобладанием анаэробных бактерий [6]. Согласно Nugent et al. [7], бактериальный вагиноз характеризуется полной потерей Lactobacilli и сопутствующим увеличением грам-вариабельных
и грам-отрицательных палочковидных микроорганизмов, главными среди которых являются Gardnerella vaginalis, а также виды Bacteroides, Prevotella и Mobiluncus [4, 5]. Однако потеря влагалищных Lactobacilli также делает небеременных женщин чувствительными к инфекции, которая может привести к эндометриту или даже воспалительному заболеванию тазовых органов [8, 9].
Во время менопаузы происходит регрессивное изменение женских половых органов, возможно отражающее предопределенную ожидаемую длительность биологической жизни, взаимосвязанную с нейрогипофизарной эндокринной осью [10]. Главным общим изменением является атрофия влагалища [10]. Частыми жалобами являются влагалищная сухость, жжение, зуд и диспареуния, наряду с дизурией, частым мочеиспусканием и рецидивирующими инфекциями. Урогенитальная атрофия, сопровождающая менопаузу, ассоциирована со снижением секреции эстрогена, ассоциированным с истощением Lactobacilli и повышенной колонизацией патогенными микроорганизмами, ассоциированными с бактериальным вагинозом и инфекциями мочевых путей [11]. У женщин в постменопаузе эстриольная терапия влагалища уменьшает колонизацию Е. coli и увеличивает количество Lactobacilli, в результате чего частота рецидивирующих инфекций мочевых и половых путей значительно снижается [12].
Было описано, что несколько видов Lactobacillus в разной степени заселяют влагалище. В течение некоторого времени считалось, что во флоре здоровых женщин детородного возраста преобладают Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus fermentum, затем Lactobacillus brevis, Lactobacillus jensenii и Lactobacillus casei [13]. В своем исследовании Lactobacillus флоры влагалища [14], Vasquez et al. обнаружили, что во влагалищной флоре большинства участников преобладает один вид Lactobacillus, в то время как присутствие других видов демонстрирует широкую индивидуальную вариабельность. Наиболее часто встречающимися видами являются L. crispatus, L. gasseri, L. iners и L. jensenii. В другом исследовании Reid et al. наиболее часто выделяемыми штаммами Lactobacillus были L. jensenii, L. acidophilus, L. casei и L. gasseri [15]. В последних австрийских исследованиях преобладающие виды Lactobacillus, идентифицированные с помощью видоспецифического ПЦР, а именно L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii и L. rhamnosus использовали для
получения фингерпринтов ДНК. L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii и L. rhamnosus можно рассматривать, как преобладающие во влагалище виды [16].
Для устранения недостатка во флоре Lactobacillus (и, следовательно, в защитной способности флоры влагалища) наиболее распространенным способом замещения молочнокислых бактерий является введение влагалищных суппозиториев, содержащих Lactobacilli. Некоторые авторы считают, что местное применение Lactobacilli, является безопасным и перспективным лечением для предупреждения вагиноза и рецидивирующих инфекций мочевых путей [17].
В то время как влагалищное добавление является давней, широко распространенной практикой замещения Lactobacilli, пероральное введение препарата Lactobacillus представляет собой новую концепцию восстановления нормальной флоры влагалища. Последние результаты показывают, что пробиотические штаммы L. rhamnosus GR-1 (АТСС 55826) и L. reuteri RC-14 (АТСС 55845) могут быть приняты перорально на ежедневной основе в течение двух месяцев без каких-либо побочных эффектов [18]. Их потребление приводит к значительному улучшению флоры влагалища с точки зрения повышенного присутствия Lactobacilli и пониженного присутствия дрожжей и бактерий группы кишечной палочки. В то время как одна группа авторов обсуждает положительные эффекты с точки зрения изменения сопротивляемости слизистой оболочки или пробиотических бактерий, поднимающихся во влагалище из прямой кишки [18], другая группа недавно продемонстрировала посредством видоспецифической ПЦР-амплификации, что L. rhamnosus GR-1 и L. reuteri RC-14 могут быть доставлены во влагалищную среду при пероральном введении [19].
Эти предварительные выводы были подтверждены в рандомизированном, двойном слепом, плацебо-контролируемом исследовании перорально введенных Lactobacilli для улучшения флоры влагалища женщин в постменопаузе. Женщин в постменопаузе с индексом Ньюджента от 4 до 6 (свидетельствующем о промежуточном качестве флоры) в начальном влагалищном мазке рандомизировали на две группы. Женщины в группе воздействия получали пробиотические капсулы, содержащие 2,5 х 109 КОЕ (колониеобразующих единиц) каждого из лиофилизированного L. rhamnosus GR-1 и L. reuteri RC-14, а женщины в контрольной группе получали перорально
плацебо один раз в сутки, обе группы в течение 14 дней. Конечные влагалищные мазки брали на следующий день после последнего введения пробиотика. Двадцать один из 35 субъектов (60%) в группе воздействия и 6 из 37 субъектов (16%) в контрольной группе показывали уменьшение индекса Ньюджента по меньшей мере на 2 балла (р=0,001). Средняя разница в индексе Ньюджента между началом и концом исследования составляла 3 в группе воздействия и 0 в контрольной группе (р= 0,0001 )[20].
В то время как L. rhamnosus GR-1 и L. reuteri RC-14 явно смещали качество флоры влагалища от промежуточного до нормального у 60% женщин из группы воздействия, одной пациентке в группе воздействия, имеющей индекс Ньюджента 8 (свидетельство бактериального вагиноза), при введении не удалось улучшить качество, несмотря на пероральное введение Lactobacillus. Это может указывать на то, что введение одних Lactobacilli не имеет терапевтической эффективности в случае бактериального вагиноза. Действительно, в терапевтических исследованиях, нацеленных на излечение бактериального вагиноза, использовали пробиотическую комбинацию L. rhamnosus GR-1 и L. reuteri RC-14 в качестве дополнения к химиотерапии с использованием метронидазола или тинидазола. Таким образом, в рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование были включены 125 женщин в постменопаузе с диагнозом бактериальный вагиноз. Этих субъектов лечили перорально метронидазолом (500 мг) два раза в сутки с первого по седьмой день и рандомизировали для получения перорального L. rhamnosus GR-1 и L. reuteri RC-14 (1x109 КОЕ каждого) или плацебо два раза в сутки с первого по тридцатый день. Первичным результатом было лечение бактериального вагиноза (отсутствие симптомов или признаков вагиноза) на 30 день. В общей сложности 106 субъектов вернулись для 30-дневного завершения, из которых 88% лечились в группе антибиотик - пробиотик в сравнении с 40% в группе антибиотик плацебо (р <0,001). Из оставшихся субъектов, 30% в группе плацебо и ни один в пробиотической группе не имели бактериального вагиноза, в то время как 30% в группе плацебо и 12% в пробиотической группе попали в промежуточную категорию. В целом, исследование продемонстрировало эффективное применение Lactobacilli и антибиотика в ликвидации бактериального вагиноза у африканских женщин [21]. В аналогичном исследовании, проведенном в
Бразилии, 64 женщины с диагнозом бактериальный вагиноз были рандомизированы на получение однократной дозы тинидазола (2 г) с добавлением либо 2 капсул плацебо, либо двух капсул, содержащих L. rhamnosus GR-1 и L. reuteri RC-14, каждое утро в течение следующих четырех недель. В конце лечения пробиотическая группа имела значительно более высокий уровень излечения бактериального вагиноза (87,5%), чем группа плацебо (50%) (р=0,001). Кроме того, согласно индексу Ньюджента, большее количество женщин было оценено как имеющее "нормальную" влагалищную микрофлору в пробиотической группе (75% против 34,4% в плацебо группе; р=0,011). Это исследование показало, что пробиотик Lactobacillus может приносить пользу женщинам, которых лечили антибиотиками против инфекционного заболевания [22]. Взятые вместе результаты клинических исследований указывают на то, что в случае бактериального вагиноза улучшение индексов Ньюджента с помощью одних пробиотиков, без введения антибиотиков или химиотерапевтических препаратов, не может быть достигнуто посредством препаратов, имеющихся в уровне техники.
Автор настоящего изобретения в настоящее время обнаружил новую пробиотическую композицию, содержащую по меньшей мере четыре штамма Lactobacillus человеческого происхождения, способную улучшать влагалищную флору.
Неожиданно было обнаружено, что в контролируемом клиническом исследовании пероральное введение комбинации Lactobacillus crispatus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus jensenii и Lactobacillus gasseri в течение только двух недель, в отличие от предыдущего уровня техники в отсутствии антибиотика, приводит к снижению индексов Ньюджента участников от среднего значения 8 (свидетельство бактериального вагиноза) до среднего значения 6 (свидетельство промежуточного качества флоры).
Кроме того, штаммы по изобретению продемонстрировали значительное производство внеклеточной перекиси водорода. Так как перекись водорода служит для уничтожения вредных микроорганизмов, это является важным преимуществом композиции штаммов Lactobacilli по изобретению.
Следовательно, объектом настоящего изобретения является диетическая или фармацевтическая композиция на основе микробных культур, предпочтительно лиофилизированных культур или жидких культур, таких как
йогурт и другие ферментированные и/или неферментированные напитки, содержащая по меньшей мере четыре автохтонных по отношению к человеку штамма Lactobacillus, где указанные штаммы, выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus crispatus LBV 88 (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus LBV 96 (DSM 22560), Lactobacillus jensenii LBV 116 (DSM 22567), Lactobacillus gasseri LBV 150N (DSM 22583), Lactobacillus crispatus LBV 10 (DSM 23744), Lactobacillus crispatus LBV 61 (DSM 23745), Lactobacillus jensenii LBV 8 (DSM 23746) Lactobacillus jensenii LBV 110 (DSM 23747), Lactobacillus rhamnosus LBV 69 (DSM 23748), Lactobacillus rhamnosus LBV 136 (DSM 23749), Lactobacillus gasseri LBV 162 (DSM 23750) и Lactobacillus gasseri LBV 62 (DSM 23751), вместе с фармацевтически приемлемыми или приемлемыми для питания носителями, адъювантами и/или эксципиентами.
Двенадцать штаммов, приведенных выше, были представлены в DSMZ для патентного депонирования (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур).
Композиции по настоящему изобретению могут содержать дополнительные питательные компоненты, включающие по меньшей мере один из следующих компонентов: витамины, антиоксиданты, такие как препараты из граната или соевые флавоноиды, волокна (инулин и фруктоолигосахариды), минеральные соли, фитопроизводные, молоко (ферментированное или неферментированное молоко, в том числе йогурт), но не ограниченные ими.
Препарат по изобретению содержит Lactobacilli человеческого происхождения. Эти Lactobacilli представляют физиологическую композицию.
Каждый из вышеупомянутых видов Lactobacillus присутствует в концентрации в интервале от 0,05x 109 КОЕ/г до 30x 109 КОЕ/г, предпочтительно от 0,5 х 109 КОЕ/г до 25 х 109 КОЕ/г.
Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения, композиция содержит комбинацию штаммов Lactobacillus, состоящую из Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567) и Lactobacillus gasseri (DSM 22583). В такой предпочтительной композиции по изобретению Lactobacillus crispatus (DSM 22566) присутствует в диапазоне концентраций от ЗхЮ9 до 22x 109 КОЕ/г, Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560) присутствует в диапазоне концентраций от ЗхЮ9 до 22 x 109 КОЕ/г, Lactobacillus jensenii (DSM 22567) присутствует в
диапазоне концентраций от 0,7 х 10 до 6 х 10 КОЕ/г, Lactobacillus gasseri (DSM 22583) присутствует в диапазоне концентраций от 1 х 109 до 8 х 109 КОЕ/г.
В более предпочтительном воплощении изобретения композиция по настоящему изобретению содержит Lactobacillus crispatus (DSM 22566) в концентрации 6х109 КОЕ/г, Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560) в концентрации 6 х 109 КОЕ/г, Lactobacillus jensenii (DSM 22567) в концентрации 1,2 х 109 КОЕ/г и Lactobacillus gasseri (DSM 22583) в концентрации 1,8 х 109 КОЕ/г.
В другом более предпочтительном воплощении изобретения композиция по настоящему изобретению содержит Lactobacillus crispatus (DSM 22566) в концентрации 20 х 109 КОЕ/г, Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560) в концентрации 20 х 109 КОЕ/г, Lactobacillus jensenii (DSM 22567) в концентрации 4 х 109 КОЕ/г и Lactobacillus gasseri (DSM 22583) в концентрации 6 х 109 КОЕ/г.
Согласно предпочтительному воплощению диетическая или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению имеет композицию, описанную в Таблице 1 или в Таблице 2.
пищевые волокна
Диоксид кремния
Итого
250
Предпочтительными являются применяемые формы композиций по изобретению, подходящие для перорального приема или местного влагалищного введения. В качестве примера пробиотические бактерии для применения у женщин можно вводить перорально в форме капсул или (помещенные в саше) суспендированными в напитке, или в форме ферментированного молока (йогурт). При пероральном приеме ожидается, что они должны выжить при прохождении через желудок и двенадцатиперстную кишку (проявляя определенную устойчивость к кислоте и желчи) и временно
заселить кишечник. Отсюда небольшое количество бактерий поднимется во влагалище и (снова временно) колонизирует влагалищную слизистую оболочку. Пробиотические бактерии также обычно можно использовать в качестве влагалищных капсул или суппозиториев и непосредственно наносить на влагалище. Защитный эффект Lactobacilli против потенциальных патогенов во влагалище осуществляется посредством метаболической активности Lactobacilli. Эти бактерии потребляют гликоген и другие источники глюкозы и производят молочную кислоту. Полученное посредством этого низкое значение рН является вредным для менее желательных бактерий и грибков и, таким образом, защищает слизистую оболочку влагалища от инфекций. Следовательно, фармацевтические композиции по изобретению можно вводить в форме суппозиториев, влагалищных капсул для влагалищного введения или покрытых оболочкой капсул, таблеток, саше, пилюль, ампул, флаконов для перорального введения, а также йогуртов, йогуртных напитков, ферментированного молока, соков и других ферментированных напитков и продуктов.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к диетическим или фармацевтическим композициям, основанным на микробных культурах Lactobacilli, предпочтительно на лиофилизированных культурах или жидких культурах, таких как йогурт и другие ферментированные и/или неферментированные напитки, содержащие по меньшей мере четыре автохтонных по отношению к человеку штамма Lactobacillus, выбранных из группы, состоящей из Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567), Lactobacillus gasseri (DSM 22583), Lactobacillus crispatus (DSM 23744), Lactobacillus crispatus (DSM 23745), Lactobacillus jensenii (DSM 23746) Lactobacillus jensenii (DSM 23747), Lactobacillus rhamnosus (DSM 23748), Lactobacillus rhamnosus (DSM 23749), Lactobacillus gasseri (DSM 23750) и Lactobacillus gasseri (DSM 23751), для применения в лечении влагалищных и мочеполовых инфекций у женщин, вызванных дефицитом Lactobacillus, предпочтительно, выбранных из вагиноза или вагинита, хронического бактериального вагиноза и хронической дрожжевой инфекции, хронической инфекции мочевыводящих путей в менопаузе, атрофического вагинита или вагиноза и аналогичных инфекций, таких как абактериальный вагиноз. Действительно, эти Lactobacilli подходят для
перорального или влагалищного введения с целью физиологического восстановления флоры влагалища и физиологического поддержания флоры Lactobacillus при патологическом дефиците с продуцированием Lactobacilli.
Кроме того, композиции по изобретению особенно подходят для применения в лечении или предупреждении бессимптомного и рецидивирующего бактериального вагиноза во время беременности или при преждевременных родах, вызванных бактериальным вагинозом.
Дополнительные воплощения настоящего изобретения представлены интеграторами, молочными продуктами, напитками и/или пищевыми продуктами для питания человека, отличающимися тем, что они содержат диетическую композицию, как определено выше.
Молочные продукты по настоящему изобретению могут состоять из молока, йогурта, сыра, гомогенизированных продуктов (на основе молока, сыра, фруктов), ферментированного или неферментированного молока (включая сухое молоко, безлактозное молоко, молочные коктейли), содержащих пробиотики. Терапевтический сыр можно получить путем добавления подходящих пробиотических микроорганизмов в концентрированном сушеном виде на определенной фазе обработки сыров для того, чтобы гарантировать доставку необходимой для организма дозы микроорганизмов. Напитки могут представлять собой быстродействующие напитки или воду, содержащую композиции по настоящему изобретению.
Указанные интеграторы, молочные и пищевые продукты особенно подходят для применения в лечении или предупреждении бессимптомного или рецидивирующего бактериального вагиноза, вульвовагинального кандидоза, преждевременных родов, вызванных бактериальным вагинозом или рецидивирующими инфекциями мочевыводящих путей.
Наконец изобретение относится к комбинации четырех пробиотических автохтонных по отношению к человеку штаммов, состоящих из Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567) и Lactobacillus gasseri (DSM 22583), для медицинского применения в лечении поражений мочеполового тракта женщины.
Настоящее изобретение далее описано с иллюстративной целью, но не с целью ограничения, согласно его предпочтительным воплощениям, в следующих примерах и прилагаемых фигурах, где:
На Фиг. 1 показана таблица с результатами противомикробного эффекта 12 выбранных штаммов по изобретению против пяти конкурентных штаммов различных патогенов, таких как Candida krusei, Candida albicans, Candida glabrata, Escherichia coli, Gardnerella vaginalis.
На Фиг. 2 и 3 показана общая средняя концентрация Lactobacilli, доставленных во влагалище в клиническом исследовании в Примере 3. Чашечный подсчет Lactobacilli.
На Фиг. 4 показано изменение индекса Ньюджента и изменение от бактериального вагиноза до промежуточного состояния флоры влагалища в клиническом исследовании в Примере 3. Индекс Ньюджента и стадии вагинальных мазков.
На Фиг. 5 показан анализ концентрации Lactobacilli после перорального введения композиции Lactobacilli [Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567) и Lactobacillus gasseri (DSM 22583)] в клиническом испытании;
На Фиг. 6 показан анализ концентрации Lactobacilli в группе плацебо.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Состав пробиотических композиций по изобретению Патентное депонирование двенадцати выбранных штаммов Двенадцать предпочтительных выбранных штаммов были представлены в DSMZ для патентного депонирования (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур). Они были выбраны из исходного образца 168 колоний, выделенных от 84 женщин. Начальная селекция привела к получению 41 штамма, рассматриваемого в качестве кандидатов для включения в коммерческий продукт (9 штаммов L. rhamnosus, 6 штаммов L. jensenii, 8 штаммов L. crispatus и 18 штаммов L. gasseri). На второй стадии селекции отобрали 12 следующих штаммов: Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567) и Lactobacillus gasseri (DSM 22583), Lactobacillus crispatus (DSM 23744), Lactobacillus crispatus (DSM 23745), Lactobacillus jensenii (DSM 23746) Lactobacillus jensenii (DSM 23747), Lactobacillus rhamnosus (DSM 23748), Lactobacillus rhamnosus (DSM 23749), Lactobacillus gasseri (DSM 23750), Lactobacillus gasseri (DSM 23751), вместе с фармацевтически приемлемыми или
приемлемыми для питания вспомогательными веществами и/или эксципиентами.
Образцы культур, переданные DSMZ для повторного контроля, повторно типировали и они были найдены соответствующими первоначально переданным культурам.
Получение продукта в капсулах
Композиции, согласно изобретению, вводят в форме капсул.
Первая стадия состоит из получения лиофилизированных культур пробиотических штаммов, предназначенных для применения (в предпочтительном воплощении изобретения четыре штамма Lactobacillus rhamnosus LBV 96 (DSM 22560), Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus jensenii (DSM 22567) и Lactobacillus gasseri (DSM 22583)).
Общие стадии, которым следуют при производстве лиофилизированной культуры, включают: активацию штамма (лабораторное субкультивирование), промышленная ферментация, отделение бактериальной биомассы, обычно посредством центрифугирования или нанофильтрации, промывание биомассы, криогенную защиту биомассы, лиофилизацию, дробление "осадка" и стандартизацию количества жизнеспособных клеток на грамм.
После получения штаммов следует пилотное или промышленное смешивание пробиотиков с другими эксципиентами (в случае необходимости можно выполнить надлежащее предварительное смешивание минорных компонентов).
После получения этой конечной смеси капсулы заполняют с помощью подходящего лабораторного или промышленного наполнителя капсул. Механизм может быть ручным, полуавтоматическим или полностью автоматическим. Такой процесс хорошо известен специалистам в данной области.
Предпочтительный состав
Активный состав, используемый в клиническом исследовании, то есть композиция 1, указан в следующей Таблице 3:
жизнеспособных
клеток
(КОЕ/доза)
клеток (КОЕ/доза)
L.crispatus Lbv88 (DSM 22566)
1 х 109
1,5 х 109
L. rhamnosus LbV96 (DSM 22560)
1 х 109
1,5 x10е
L. jensenii LbV 116 (DSM 22567)
0,2 х 109
0,3 х 109
L. gasseri LbV 150N (DSM 22583)
0,3 х 109
0,45 х 109
Мальтодекстрин картофеля
161
Нерастворимые пищевые волокна
Диоксид кремния
Итого
250
Соответствующий состав продукта (с учетом 5-кратно повышенной дозировки), то есть композиция 2, подробно описан в следующей Таблице 4:
Таблица 4
Композиция 2
Количество (м г/доза)
Гарантированное число
жизнеспособных
клеток
(КОЕ/доза)
Исходное число жизнеспособных клеток (КОЕ/доза)
L.crispatus Lbv88 (DSM 22566)
1 х 109
5х109
L. rhamnosus LbV96 (DSM 22560)
1 х 109
5х109
L. jensenii LbV 116 (DSM 22567)
0,2 х 109
1 х 109
L. gasseri LbV 150N
0,3 х 10у
1,5 х 10у
(DSM 22583)
Мальтодекстрин картофеля
Нерастворимые пищевые волокна
Диоксид кремния
Итого
250
Приготовление обогащенного пробиотиками свежего молока для применения человеком
Была произведена оценка стабильности четырех штаммов Lactobacillus jensenii LbV 116 (DSM 22567), Lactobacillus rhamnosus LbV 96 (DSM 22560), Lactobacillus gasseri LbV 150N (DSM 22583) и Lactobacillus crispatus LbV 88 (DSM 22566) в стандартном, пастеризованном свежем молоке.
Суточной дозой молока считается 167 мл (приблизительно содержимое стакана). Целью является гарантировать 2,5 млрд. жизнеспособных клеток в конце срока годности. Предложенный состав был определен согласно продукту, который в настоящее время проходит клинические испытания в университетском госпитале Вены.
Избыток, рассматриваемый при первой оценке, являлся 5-кратным.
В следующей Таблице 5 показан подробный состав:
Lactobacillus crispatus LbV 88 (DSM 22566)
299,4
миллиард
миллиард
Итого (порошок)
150
898,2
Свежее пастеризованное молоко
167
1,000
В следующей Таблице 6 сообщаются предварительные данные о стабильности четырех штаммов в молоке при хранении при 4°С:
Средний срок хранения промышленного, пастеризованного свежего молока составляет 6 суток. В любом случае мы решили оценить стабильность вплоть до 15 суток, чтобы получить более полное представление о поведении бактериальных клеток в молоке.
Как можно заключить из приведенных выше данных, пробиотики по изобретению очень стабильны в свежем промышленном молоке. Данные свидетельствуют, что этот проект возможен лишь с небольшим избытком во время изготовления.
Другой рассмотренный аспект заключается в том, что рН остается практически неизменным даже через 15 суток хранения при 4°С. Это означает, что пробиотики метаболически неактивны в этих условиях, что безусловно является желательным аспектом
ПРИМЕР 2: Сравнительный анализ пробиотических микроорганизмов по изобретению и коммерческих продуктов
A. Молекулярное сравнение с выбранными конкурентными штаммами Молекулярное типирование выделенных штаммов в сравнении с рядом
конкурентных штаммов выполняли несколькими способами (RAPD-PCR (полимеразная цепная реакция со случайной амплификацией полиморфной ДНК), GTG5 REP-PCR (полимеразная цепная реакция повторяющихся экстрагенных палиндромных последовательностей с использованием GTG5 праймера, PFGE (гель-электрофорез в пульсирующем поле).
Исследовали следующие доступные на рынке конкурентные штаммы.
Lactobacillus rhamnosus GR-1 (АТСС 55826) (Ombe(r) product - см.
EP1137423)
Lactobacillus reuteri RC-14 (ATCC 55845) (Ombe(r) product - см.
EP1137423)
Lactobacillus casei rhamnosus (Gynophilus(r))
Lactobacillus acidophilus (Gynoflor(r))
Lactobacillus gasseri (Doderlein Med(r))
Lactobacillus LN 40 (Ellen(r))
Lactobacillus fermentum LN 99 (Ellen(r))
Lactobacillus casei LN 133-2 (Ellen(r)) Выбранные штаммы отличались от всех конкурентных штаммов, исследованных с помощью RAPD-PCR и праймера 4. PFGE после рестрикции с помощью Ара\ или Sma\ также показала различия между исследованными штаммами (данные не показаны).
B. Тестирование противомикробных свойств против выбранных патогенов
in vitro
Тесты для объяснения противомикробного механизма действия выполняли, используя два штамма на целевой вид (Lactobacillus crispatus: LBV 10 (DSM 23744), LBV 88 (DSM 22566); Lactobacillus gasseri: LBV 162 (DSM 23750), LBV 150N (DSM 22583); Lactobacillus jensenii: LBV 110 (DSM23747), LBV 8 (DSM 23746); Lactobacillus rhamnosus: LBV 69 (DSM 23748), LBV 96 (DSM 22560)), на трех патогенных влагалищных штаммах (Gardnerella vaginalis Ga 3, Candida albicans Cd 30 и Candida glabrata Cd 34 - см. Таблицу 5), используя метод мазка-точечного нанесения.
Здесь противомикробный эффект живых активных штаммов Lactobacilli тестировали против живых активных патогенных штаммов. Параллельные мазки штаммов Lactobacilli сначала помещали на чашку агара на расстоянии примерно 2 см. При образовании противомикробных веществ и выделении их штаммами Lactobacilli, они диффундируют в ростовую среду и формируют противомикробную ингибирующую полосу, в которую точечно наносят живые патогенные штаммы. В то же время точечное нанесение тех же патогенных штаммов осуществляют за пределами параллельного мазка в качестве контроля роста. Отсутствие роста или слабый рост патогенных штаммов внутри мазка по сравнению с контролем роста за пределами мазка указывает на образование противомикробных веществ тестируемыми Lactobacilli [23].
Экспериментальная модель
Параллельные мазки штаммов Lactobacilli на чашке агара на
Требованием для метода мазка-точечного нанесения является способ культивирования, при котором и Lactobacilli и патогенные штаммы демонстрируют хороший рост, что оказалось проблемой главным образом при культивировании Gardnerella vaginalis. В ходе испытания нескольких способов культивирования тестировали Gardnerella vaginalis, для которого нейтрализованный МРС крахмальный агар (рН 6,7, 1% крахмала) оказался наилучшей питательной средой.
расстоянии примерно 2 см (с использованием различных ростовых сред в зависимости от тестируемых патогенных штаммов: см. Таблицу 8). Инкубация мазков при 37°С, 24 ч, анаэробно.
Точечное нанесение 5 мкл активных патогенных штаммов между параллельными мазками и в качестве контроля роста за пределами мазков с последующей инкубацией (разные условия в зависимости от тестируемых патогенных штаммов: см. Таблицу 8).
Оценка роста (или ингибирования) патогенных штаммов и документирование результатов. Культивирование Lactobacilli
Культивирование из глубоко замороженной культуры, хранящейся при -80°С в 2 мл МРС бульона (37°С, 24 ч, анаэробно).
Фракционированный мазок на МРС агаре (37°С, 48 ч, анаэробно).
Инокуляция колонии в 10 мл МРС бульона (37°С, 18 ч, анаэробно).
Параллельный мазок из этой культуры наносят на чашки с агаром. Candida albicans и Candida glabrata
Культивирование из глубоко замороженной культуры, хранящейся при -80°С в 2 мл МРС бульона (37°С, 24 ч, аэробно).
Фракционированный мазок на МРС агаре (37°С, 48 ч, аэробно).
Инокуляция колонии в 10 мл МРС бульона (37°С, 18 ч, аэробно).
точечно наносят 5 мкл бульона из этой культуры . Candida crusei
Культивирование из глубоко замороженной культуры, хранящейся при -80°С в 2 мл BHI бульона (бульон с сердечно-мозговой вытяжкой) (37°С, 24 ч, аэробно).
Фракционированный мазок на BHI агаре (37°С, 48 ч, аэробно). Инокуляция колонии в 10 мл BHI бульона (37°С, 18 ч, аэробно), точечно наносят 5 мкл бульона из этой культуры. Escherichia coli
Культивирование из глубоко замороженной культуры, хранящейся при -80°С в 2 мл BHI бульона (37°С, 24 ч, аэробно).
Фракционированный мазок на BHI агаре (37°С, 48 ч, аэробно). Инокуляция колонии в 10 мл BHI бульона (37°С, 18 ч, аэробно).
точечно наносят 5 мкл бульона из этой культуры. Gardnerella vaginalis
Культивирование из глубоко замороженной культуры, хранящейся при -80°С в 2 мл BHI бульона (37°С, 24 ч, анаэробно).
точечно наносят 5 мкл бульона из этой культуры.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты представлены на Фиг. 1. В итоге:
Все штаммы Lactobacilli и пять конкурирующих штаммов демонстрируют сильное ингибирование Gardnerella vaginalis.
Со всеми Lactobacilli ингибирование Escherichia coli либо было не очень существенным, либо ингибирование нельзя было обнаружить.
Тесты по ингибированию Candida albicans молочнокислыми бактериями показали некоторые большие различия в силе ингибирующего эффекта разных штаммов. Это были, главным образом, штаммы Lactobacillus rhamnosus, которые вызывали ингибирование роста Candida albicans от очень сильного до полного.
Ингибирование Candida glabrata молочнокислыми бактериями было значительно слабее, чем ингибирование, полученное с Candida albicans. Здесь наиболее существенным ингибирующий эффект также наблюдался у
Lactobacillus rhamnosus.
Значительные различия в силе ингибирования также можно установить в тестах ингибирования Candida krusei. Очень сильное ингибирование штаммов Candida krusei как правило было вызвано большинством Lactobacilli и опять штаммы Lactobacillus rhamnosus, как правило, имели несколько больший ингибирующий эффект, чем представители трех других видов. В тестах ингибирования Candida krusei, в отличие от других тестов, наблюдалось изменение силы ингибирования во времени. Сила ингибирования для некоторых штаммов значительно различалась через 48 часов и через 120 часов. Почти во всех случаях ингибирующий эффект был менее значительным в 120 часов, чем в 48 часов. С. Взаимный антагонизм изолятов Lactobacilli
Исследовали взаимные негативные влияния на рост с использованием метода точечного нанесения-покрытия для большинства комбинаций 12 выбранных штаммов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культивирование
Культивирование из глубоко замороженной культуры, хранящейся при -80°С в 2 мл МРС бульона (37°С, 24 ч, аэробно).
Фракционированный мазок на МРС агаре (37°С, 48 ч, аэробно). Инокуляция колонии в 10 мл МРС бульона (37°С, 18 ч, аэробно). Точечное нанесение 5 мкл бульона из этой культуры на чашки агара или перенесение 200 мкл бактериальной суспензии в 4,5 мл мягкого агара.
Метод точечного нанесения-покрытия
Точечное нанесение 10 мкл бактериальной суспензии для каждого из 11 штаммов сравнивали на МРС агаре: инкубация при 37° С, 24 ч, аэробно.
Перенесение 200 мкл бактериальной суспензии тестируемого штамма (12 штаммов) в 4,5 мл мягкого агара. Покрытие чашек агара с точечным нанесением в предыдущий день выполняли с помощью этой бактериальной суспензии в мягком агаре. Инкубация при 37° С, 24 ч, аэробно.
- Оценка и документирование взаимного ингибирования через 24 часа и 48 часов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Силу взаимного ингибирования оценивали визуально по шкале между - (нет ингибирования) и +++ (очень сильное ингибирование), как показано в следующей ниже Таблице 9.
Таблица 9: Взаимное ингибирование 12 штаммов Lactobacilli
LBV
LBV
LBV
LBV
LBV
LBV
LBV
LBV
LBV
LBV
LBV
LBV
150
162
110
116
136
LBV 10
-/+
-/+
-/+
crispatus
LBV 61
-/+
LBV 88
++/ +++
-/+
-/+
+/ ++
LBV 62
-/+
-/+
gasseri
LBV 150
+/ ++
LBV 162
+/ ++
-/+
-/+
LBV 8
jensenii
LBV 110
+/ ++
+/ ++
-/+
LBV 116
-/+
-/+
LBV 69
+++
+++
+++
+/ ++
L. rhamnosus
LBV 96
+++
+++
+++
-/+
+/ ++
+/ ++
LBV 136
+++
+++
+++
+/ ++
LBV10: DSM 23744; LBV61: DSM 23745; LBV88: DSM 22566; LBV62: DSM 23751; LBV150N: DSM22583; LBV162: DSM 23751; LBV 8: DSM 23746; LBV 110: DSM 23747; LBV116: DSM 22567; LBV69: DSM 23748; LBV96: DSM 22560; LBV136: DSM 23749
Были установлены значительные различия ингибирующих эффектов 12 штаммов друг против друга.
Три штамма Lactobacillus crispatus продемонстрировали или отсутствие ингибирующего эффекта, или лишь слабый ингибирующий эффект на штаммы других видов. Однако сами эти штаммы в значительной степени ингибировались всеми другими штаммами.
Штаммы Lactobacillus jensenii и Lactobacillus gasseri главным образом ингибировали штаммы Lactobacillus crispatus в то время как ингибирующий эффект по отношению к другим штаммам был достаточно слабым.
Наиболее сильный ингибирующий эффект был установлен для штаммов Lactobacillus rhamnosus. Они очень сильно ингибировали три штамма Lactobacillus crispatus и сильно ингибировали представителей Lactobacillus jensenii и Lb gasseri. Каждый штамм также показал сильный ингибирующий эффект по отношению к двум другим штаммам Lactobacillus rhamnosus.
Взаимодействия являются минимальными для предпочтительной комбинации Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567) и Lactobacillus gasseri (DSM 22583). В последних условиях только штамм Lactobacillus crispatus DSM 22566 сильно ингибировался штаммом Lactobacillus rhamnosus DSM 22560.
ПРИМЕР 3: Пилотное исследование с композицией Lactobacilli [Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567) и Lactobacillus gasseri (DSM 22583)] no изобретению
В уникальном пилотном исследовании композицию человеческих Lactobacilli (культивирование человеческих Lactobacilli) тестировали in vivo. Эти человеческие Lactobacilli выделяли из исследования беременных женщин. Lactobacilli при беременности играют важную роль в защите женщин от влагалищных инфекций для того, чтобы защитить плод путем поддержания здоровой флоры при беременности. Влагалищная инфекция при беременности
ассоциирована с преждевременными родами, ранним родам и плохом исходе беременности.
На сегодняшний день имеются данные исследования 9 женщин (неовлагалище, нет связи с брюшной полостью, нет матки); Lactobacilli (Композиция 1, Таблица 1) вводили перорально, влагалищные пробы брали перед пероральным введением, затем через неделю после ежедневного перорального приема и третьи влагалищные пробы через одну неделю без лечения пробиотиками брали, чтобы увидеть долгосрочный эффект.
На Фиг. 2 и 3 показана общая средняя концентрация Lactobacilli: в начале исследования уровни были низкими (среднее значение 3,07Е+06; SD (стандартное отклонение) +/-5,23Е+07); после перорального приема концентрация увеличивалась (среднее значение 5,77Е+07; SD 1,72Е08); через одну неделю, интервал без дозирования, уровни были выше, чем до терапии (среднее значение 2,71 Е+07).
На Фиг. 4 показано изменение индекса Ньюджента и изменение от бактериального вагиноза (стадия 3) до промежуточного состояния флоры влагалища (стадия 2): Среднее значение индекса Ньюджента перед введением пробиотиков составляло 8 (SD 1,07), что означает стадию 3 флоры влагалища (бактериальный вагиноз в клинических терминах). Через одну неделю улучшение индексов Ньюджента до значения 6 (SD 0,79), что означает стадию 2, промежуточное состояние флоры, отсутствие бактериального вагиноза. Через еще одну неделю этот клинический микробиологический диагноз не менялся, индекс Ньюджента составлял 6 (SD 1,79), стадия 2 (SD 0,55).
ПРИМЕР 4: Промежуточный анализ текущего клинического испытания
Способность перорально введенного препарата из четырех пробиотических штаммов молочных бактерий по изобретению [Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567) и Lactobacillus gasseri (DSM 22583)] улучшать качество флоры неовлагалища изучали в плацебо-контролируемом двойном слепом клиническом исследовании (п=70).
На сегодняшний день испытание завершили 31 женщина.
Протокол лечения был следующим:
Исходный мазок (индекс Ньюджента и культура и ПЦР-тест анаэробной бактерии). Пероральное введение композиции Lactobacilli в течение
одной недели.
Второй мазок (индекс Ньюджента и культура и ПЦР-тест анаэробной бактерии). Одна неделя без пробиотиков.
Третий мазок (индекс Ньюджента и культура и ПЦР-тест анаэробной бактерии)
На Фиг. 5 показаны результаты в единицах концентрации Lactobacilli во влагалище во время исследования (1: исходный мазок; 2: после перорального приема; 3: наблюдение). На Фиг. 6 показаны результаты параллельного анализа, выполненного в группе плацебо. Первые данные показали значительное повышение концентрации Lactobacilli после одной недели перорального введения. В группе плацебо не наблюдалось увеличения Lactobacilli.
ПРИМЕР 5: Сравнение между штаммами Lactobacilli конкурирующего продукта (Ellen) и штаммами по изобретению Штаммы Lactobacilli Штаммы Lactobacilli из уровня техники:
- L. gasseri (LN40, Tam1, Lb311)
- L. fermentum (LN99, Tam2, Lb312)
- L. rhamnosus (casei) (LN 113-2, Tam3, Lb 313) далее называемые штаммы "Ellen". Штаммы Lactobacilli по изобретению:
- L. rhamnosus DSM22560 (LBV96, Lb322)
- L. crispatus DSM22566 (LBV88, Lb323)
- L. jensenii DSM22567 (LBV116, Lb324)
- L. gasseri DSM 22583 (LBV150N, Lb325) Методики эксперимента
Следующий анализ выполняли на штаммах "Ellen" в сравнении со штаммами по изобретению.
а. Культура из криогенно замороженной культуры
б. Оценка роста в аэробной или анаэробной культуре
в. Способность снижать значение рН (потенциал подкисления)
г. Устойчивость к кислоте (раствор HCI - устойчивость к желудочному
соку)
д. Устойчивость к солям желчных кислот
е. Образование внеклеточной перекиси водорода (Н2О2)
а. Культура из криогенно замороженной культуры
Все штаммы успешно росли в МРС бульоне из криогенно замороженных культур, хранящихся при -80°С. Возраст всех культур, используемых для исследования, были не более 24 ч.
б. Оценка роста в аэробной или анаэробной культуре
Оценка интенсивности роста в аэробной или анаэробной культуре является важным критерием в селекции штаммов. Оценку роста проводили на основе фракционированных культур штаммов из мазка на чашках с МРС-агаром, инкубируемых в течение 48 ч при 37°С в аэробных или анаэробных условиях. Диаметры колоний оценивали оптически (+++, ++, +). Чашки с агаром документировали с помощью цифровой фотографии. Результаты, полученные на основании двух анализов, показаны в следующей ниже Таблице 10:
Оба штамма Lactobacillus rhamnosus (ELLEN LN 113-2 и L. rhamnosus DSM22560) росли хорошо. В аэробных условиях наблюдался несколько лучший рост штамма L. gasseri DSM 22583 по сравнению со штаммом ELLEN L. gasseri LN 40.
в. Способность снижать значение рН (подкисляющая активность)
Способность семи штаммов снижать рН определяли после инкубации в анаэробных условий в течение 48 ч при 37°С в 10 мл МРС-бульона (исходное значение рН = 5,8). Значения рН, полученные в бульонах, определяли в трех параллелях с использованием стандартного рН-метра. Полученная способность снижать рН (среднее арифметическое трех измерений) показана в следующей ниже Таблице 11.
рН 3,729 рН 4,186 рН 3,824
Таблица 11 L. gasseri (LN40, Tam1, Lb311) L. fermentum (LN99, Tam2, Lb312) L. rhamnosus (LN 113-2, Tam3, Lb 313)
pH 3,657 pH 3,636 pH 3,946 pH 4,147
L. rhamnosus DSM22560 (LBV96, Lb322)
L. crispatus DSM22566 (LBV88, Lb323) L. jensenii DSM22567 (LBV116, Lb324) L. gasseri DSM 22583 (LBV150N, Lb325)
В то время как ELLEN штамм L. gasseri LN 40 способен снижать pH ниже соответствующего уровня, достигаемого L. gasseri DSM 22583 (рН = 3,73 против. рН 4,15), штаммы L. rhamnosus показывали обратный результат (LN 113-2: рН = 3,82 против DSM 22560 рН = 3,66). Наиболее значительное снижение значения рН достигнуто штаммом L. crispatus DSM22566 (рН = 3,64).
г. Устойчивость к воздействию кислоты (раствор HCI -устойчивость к желудочному соку)
Устойчивость штаммов Lactobacillus к воздействию кислоты в течение 3 часов определяли в двух параллелях в МРС бульоне, доведенном до значений рН 2, 2,5, 3, 3,5 и 4 при помощи 1 М соляной кислоты. 9,9 мл порции подкисленных бульонов инокулировали 100 мкл стартовой культуры в МРС бульоне и инкубировали при 37° С в течение 3 ч в анаэробных условиях. Определение исходного количества бактерий (присутствующего в каждом инокуляте) выполняли параллельно, используя чашечный метод подсчёта (в двух экземплярах, 37°С, 48 ч, анаэробные условия). Через 3 часа инкубации, чашечный подсчет культур, инкубированных при различных значениях рН, определяли, используя аналогичную процедуру. Устойчивость рассчитывали по отношению к соответствующему исходному чашечному подсчету. Результаты показаны в следующей ниже Таблице 12, как среднее арифметическое двух независимых исследований.
исходный чашечный подсчет 1,1 х 105
рН2,0
4,7 х 104
рН2,5
8,0 х 104
рН 3,0
1,4 х 107
рН 3,5
1,2х 107
рН 4,0
1,5 х 107
L. jensenii DSM22567 (LBV116, Lb324)
исходный чашечный подсчет 6,9 х 105
рН2,0
нет роста
рН2,5
1,1 х 104
рН 3,0
6,4 х 105
рН 3,5
4,1 х 106
рН 4,0
1,1 х 107
L. gasseri DSM 22583 (LBV150N, Lb325)
исходный чашечный подсчет 1,1 х 104
рН2,0
2,2 х 10ь
рН2,5
1,2х 106
рН 3,0
1,9х 106
рН 3,5
2,5 х 106
рН 4,0
1,4 х 106
L. gasseri DSM 22583 показал наиболее высокую устойчивость при воздействии кислоты. Чашечный подсчет этого штамма не уменьшался, и даже увеличивался при таком низком значении рН как 2,0. В отличие от ELLEN штамма L. rhamnosus LN 113-2, L. rhamnosus DSM 22560 продемонстрировал повышенный чашечный подсчет при значениях рН 2,5, 3,0, 3,5 и 4,0 и уменьшенный подсчет только при рН = 2.
Снижение рН является важным механизмом действия, посредством которого Lactobacilli убивают нежелательные микроорганизмы.
Что касается устойчивости в желудочном соке и роста в кислых условиях, то штаммы Lactobacilli по изобретению демонстрируют явные преимущества.
д. Устойчивость к солям желчных кислот
Устойчивость к солям желчных кислот исследовали с использованием фракционированных мазков 7 штаммов на чашках с МРС агаром с разными концентрациями солей желчных кислот (0%; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4% и 0,5% (B8756-100G, Bile Salts, Sigma). После анаэробной инкубация при 37°С в течение 48 ч визуально оценивали уровень роста: очень хороший (+++), хороший (++), незначительный (+), отсутствие роста (-). В следующей ниже Таблице 13 показаны результаты устойчивости к солям желчных кислот (среднее от двух определений).
Все штаммы по изобретению показывали лучшую переносимость солей желчных кислот (0,2 %). Более высокая концентрация солей желчных кислот в двенадцатиперстной кишке приводит к смерти многих бактерий. Штаммы по изобретению демонстрируют здесь явное преимущество, особенно важное при пероральном применении.
е. Образование внеклеточной перекиси водорода.
Для определения Н2О2 выбрали и применяли два метода.
• 7 штаммов Lactobacilli исследовали на их способность продуцировать Н2О2 с использованием полуколичественных Н202 тест-полосок (1.10081.0001, Merck). После инкубации в МРС бульоне при 37°С в течение 48 ч в анаэробных условиях культуры встряхивали на ротационном шейкере в течение 60 мин в аэробных условиях. В Таблице 14 показаны результаты полуколичественного определения образования Н2О2.
• Агаровая среда для определения Н2О2: добавление 0,25 мг/мл 3,3',5,5'-тетраметил-бензидина (ТМВ) (860336, Sigma) и 0,01 мг/мл пероксидазы хрена (P8375-2KU, Sigma) к МРС-агару. 7 штаммов Lactobacilli фрагментарно сеяли штрихом на среду и инкубировали при 37°С в течение 5 суток в анаэробных условиях (Genbag Anaerob System, Biomerieux). Затем чашки подвергали воздействию атмосферного воздуха и интенсивность образования Н2О2 оценивали через 30 и 60 минут (синяя окраску при воздействии кислорода из-за образования Н2О2). В Таблице 15 показаны результаты, полученные с помощью метода определения образования Н2О2 на агаре.
Таблица 14
Время
LN 113-
LBV
LBV
LBV
LBV
оценки
116
150N
30 мин
60 мин
+++
+++
+++
В то время как ни один из штаммов ELLEN не продуцировал измеряемый уровень перекиси водорода, штамм L. rhamnosus LBV 96 (DSM22560) демонстрировал незначительное образование, а другие штаммы по изобретению демонстрировали значительное образование внеклеточной перекиси водорода (см. Таблицы 14 и 15). Так как перекись водорода служит для уничтожения вредных микроорганизмов, это является важным преимуществом композиции штаммов Lactobacilli по изобретению.
ЛИТЕРАТУРА
1. Erickson KL, Hubbard NE. Probiotic immunomodulation in health and disease. J Nutr. 2000;130(2S Suppl):403-409.
2. Reid G, Cook RL, Bruce AW. Examination of strains of lactobacilli for properties that may influence bacterial interference in the urinary tract. J Urol. 1987 Aug;138(2):330-5.
3. Goldenberg, R. L, J. C. Hauth, and W. W. Andrews. 2000. Intrauterine infection and preterm delivery. N. Engl. J. Med. 342:1500-1507.
4. Spiegel, C. A., R. Amsel, D. Eschenbach et al. 1980. Anaerobic bacteria in nonspecific vaginitis. N. Engl. J. Med. 303:601-607.
5. Spiegel, C. A. 1991. Bacterial vaginosis. Clin. Microbiol. Rev. 4:485502.
6. Forsum, U., E. Hoist, P. G. Larsson et al. 2005. Bacterial vaginosis - a microbiological and immunological enigma. APMIS. 113:81-90.
7. Nugent, R. P., M. A. Krohn, and S. L. Hillier. 1991. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29:297-301.
8. Korn, A., G. Bolan, N. Padian et al. 1995. Plasma cell endometritis in women with symptomatic bacterial vaginosis. Obstet. Gynecol. 85:387-390.
9. Ness, R., S. Hillier, K. Kip et al. 2004. Bacterial vaginosis and risk of pelvic inflammatory disease. Obstet. Gynecol. 104:761-769.
10. Pandit L, Ouslander JG. Postmenopausal vaginal atrophy and atrophic vaginitis. Am J Med Sci. 1997; 314(4):228-31.
11. Ginkel PD, Soper DE, Bump RC, Dalton HP. The vaginal flora in postmenopausal women: the effect of estrogen replacement therapy. Infect Dis Obstet Gynecol. 1993; 1 94-97.
12. Raz R, Stamm WE. A controlled trial of intravaginal estriol in postmenopausal women with recurrent urinary tract infection. N Eng J Med. 1993; 329 (11):735-6.
13. Kandler, O., and N. Weiss. 1986. Genus Lactobacillus, pp. 1063-1065. In, P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe, and J. G. Holt (eds.), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol 2, 9th ed. Williams and Wilkins, Baltimore.
14. Vasquez, A., T. Jakobsson, S. Ahrne, U. Frosum, and G. Molin. 2002. Vaginal Lactobacillus flora of healthy Swedish women. J. Clin. Microbiol. 40:27462749.
15. Reid, G., J. A. McGroarty, L. Tomeczek, and A. W. Bruce. 1996. Identification and plasmid profiles of Lactobacillus species from the vagina of 100
2.
healthy women. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 15:23-26.
16. H. Kiss, B. Kogler, L. Petricevic, I. Sauerzapf, S. Klayraung, K. Domig, H. Viernstein, W. Kneifel. Vaginal Lactobacillus microbiota of healthy women in the late first trimester of pregnancy BJOG 2007; 114: 1402-1407
17. Uehara S, Monden K, Nomoto K, Seno Y, Kariyama R, Kumon H. A pilot study evaluating the safety and effectiveness of Lactobacillus vaginal suppositories in patients with recurrent urinary tract infection. Int J Antimicrob Agents. 2006 ;28(1):30-4.
18. Reid G. Charbonneau D, Erb J, Kochanowski B, Beuerman D, Poehner R, Bruce AW. Oral use of Lactobacillus rhamnosus GR-1 and L. fermentum GR-14 significantly alters vaginal flora: randomized, placebo-controlled trial in 64 healthy women. FEMS Immunology and Medical Microbiology 2003; 35:131-134.
19. Morelli L, Zonenenschain D, Del Piano M, Cognein A. Utilization of the intestinal tract as a delivery system for urogenital probiotics. J. Clin. Gastroenterol. 2004; 38 (6): 107-10.
20. Petricevic L, Unger FM, Viernstein H, Kiss H. Placebo-controlled, double-blind trial of Lactobacillus orally administered to improve the vaginal flora of postmenopausal women. Eur J Obstet Gyn R В 2008; 141: 54-57
21. Anukam K, Osazuwa E, Ahonkhai I, Ngwu M, Osemene G, Bruce AW, Reid G. Augmentation of antimicrobial metronidazole therapy of bacterial vaginosis with oral probiotic L.rhamnosus GL-1 and L. reuteri RC-14: randomized, double blind, placebo controlled trial. Microbes and Infection, 2006, 8: 1450-54.
22. Martinez RCR, Francescini SA, Patta MC, Quintana SM, Gomes ВС De Martinis ECP, Reid G. Improved cure of bacterial vaginosis with single dose of tinidazole (2 g), Lactobacillus rhamnosus GR-1, and Lactobacillus reuteri RC-14: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Can J Microbiol. 2009;55(2):133-8.
23. JIN L, L. TAO, S.I. PAVLOVA, J-S. SO, N. KIWANUKA, Z. NAMUKWAYA and B.A.SABERBEIN: Species diversity and relative abundance of vaginal lactic acid bacteria from women in Uganda and Korea. Journal of Applied Microbiology. 2007; 102, 1107-115.
16.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Диетическая или фармацевтическая композиция на основе микробных
культур, предпочтительно лиофилизированных культур или жидких культур,
содержащая по меньшей мере четыре автохтонных по отношению к человеку
штамма Lactobacillus, где указанные штаммы выбраны из группы, состоящей из
Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560),
Lactobacillus jensenii (DSM 22567), Lactobacillus gasseri (DSM 22583),
Lactobacillus crispatus (DSM 23744), Lactobacillus crispatus (DSM 23745),
Lactobacillus jensenii (DSM 23746) Lactobacillus jensenii (DSM 23747),
Lactobacillus rhamnosus (DSM 23748), Lactobacillus rhamnosus (DSM 23749),
Lactobacillus gasseri (DSM 23750), Lactobacillus gasseri (DSM 23751), вместе с
фармацевтически приемлемыми или приемлемыми для питания
вспомогательными веществами и/или эксципиентами.
2. Диетическая или фармацевтическая композиция по п. 1, где
комбинация штаммов Lactobacillus состоит из Lactobacillus crispatus (DSM
22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567)
и Lactobacillus gasseri (DSM 22583).
3. Диетическая или фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-2,
где каждый из указанных видов присутствует в концентрации в диапазоне от
0,05 х 109 КОЕ/г до 30 х 109 КОЕ/г, предпочтительно от 0,5 х 109 КОЕ/г до 25 х
109 КОЕ/г.
4. Диетическая или фармацевтическая композиция по п. 2, где
Lactobacillus crispatus (DSM 22566) присутствует в концентрации в диапазоне от
3 х 109 до 22 х 109 КОЕ/г, Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560) присутствует в
концентрации в диапазоне от 3 х 109 до 22 х 109 КОЕ/г, Lactobacillus jensenii
(DSM 22567) присутствует в концентрации в диапазоне от 0,7 х 109 до 6 х 109
КОЕ/г, Lactobacillus gasseri (DSM 22583) присутствует в концентрации в
диапазоне от 1 х 109 до 8 х 109 КОЕ/г.
5. Диетическая или фармацевтическая композиция по п. 4, где
Lactobacillus crispatus (DSM 22566) присутствует в концентрации 6 х 109 КОЕ/г,
Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560) присутствует в концентрации 6 х 109
КОЕ/г, Lactobacillus jensenii (DSM 22567) присутствует в концентрации 1,2 х 109
КОЕ/г, Lactobacillus gasseri (DSM 22583) присутствует в концентрации 1,8 х 109
КОЕ/г.
6. Диетическая или фармацевтическая композиция по п. 4, имеющая
7. Диетическая или фармацевтическая композиция по п. 4, имеющая следующий состав:
Композиция 2
Количество (мг/доза)
Гарантированное
число жизнеспособных
клеток (КОЕ/доза)
Исходное число жизнеспособных клеток (КОЕ/доза)
L.crispatus Lbv88 (DSM 22566)
1 х 109
5х 109
L. rhamnosus LbV96
1 х 109
5х 109
(DSM 22560)
L. jensenii LbV 116 (DSM 22567)
0,2 х 109
1 х 109
L. gasseri LbV 150N (DSM 22583)
0,3 х 109
1,5 х 109
Мальтодекстрин картофеля
Нерастворимые пищевые волокна
Диоксид кремния
Итого
250
8. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-7, подходящая для перорального приема или местного влагалищного введения.
9. Фармацевтическая композиция по п. 8 в форме суппозиториев, влагалищных капсул для влагалищного введения или покрытых оболочкой капсул, таблеток, саше, пилюль, ампул, флаконов для перорального приема, йогуртов, йогуртовых напитков, ферментированного молока, соков и других ферментированных напитков и продуктов питания.
10. Диетическая или фармацевтическая композиция по любому из пп.1-9 для применения в лечении инфекции влагалища и женских половых органов, мочеполовой инфекции и инфекций мочевыводящих путей, вызванных дефицитом Lactobacillus, предпочтительно выбранной из вагиноза или вагинита, хронического бактериального вагиноза и хронической дрожжевой инфекции, хронической инфекции мочевыводящих путей в менопаузе, атрофического вагинита или вагиноза и инфекций, аналогичных абактериальному вагинозу.
11. Диетическая или фармацевтическая композиция по п. 10 для применения в лечении или предупреждении бессимптомного или рецидивирующего бактериального вагиноза во время беременности или при преждевременных родах, вызванных бактериальным вагинозом.
12. Интеграторы, молочные продукты, напитки и/или пищевые продукты для питания человека и/или животных, отличающиеся тем, что они
10.
содержат диетическую композицию по любому из пп. 1 - 7.
13. Интеграторы, молочные продукты, напитки и/или пищевые продукты по п. 12 для применения в лечении или предупреждении бессимптомного или рецидивирующего бактериального вагиноза, преждевременных родов, вызванных бактериальным вагинозом, вульвовлагалищного кандидоза.
14. Комбинация четырех пробиотических штаммов Lactobacillus, состоящая из Lactobacillus crispatus (DSM 22566), Lactobacillus rhamnosus (DSM 22560), Lactobacillus jensenii (DSM 22567) и Lactobacillus gasseri (DSM 22583), для медицинского применения в лечении заболеваний мочеполового тракта женщин.
13.
Фиг. 1
через 48 ч
через 120 ч
через 48 ч
через 48 ч
через 48ч
через 72 ч
Cd 25
Cd 26
Cd 25
Cd 26
Cd 30
Cd 31
Cd 33
Cd 34
Ее 5
Ее 6
Ga 1
Ga3
Lb. crispatus
LBV 6
+++
+++
+++
+++
-/+
+++
+++
LBV 10
+++
++/+++
+/++
+++
++/+++
-/+
+++
+++
LBV 33
+++
+++
+++
+++
-/+
-/+
+++
+++
LBV 48
+++
+/++
+++
+++
-/+
-/+
-/+
-/+
+++
+++
LBV 61
+++
++/+++
+++
+/++
-/+
-/+
+++
+++
LBV 88
+/++
-/+
+++
+++
LBV 92
+++
+++
+++
+/++
-/+
-/+
+++
+++
LBV 100
+++
+++
+++
+++
+++
+++
-/+
-/+
+++
+++
LBV 13
+++
+++
+++
+/++
-/+
+++
+++
LBV 26
+++
+++
+++
-/+
+++
+++
LBV 28
+++
+++
LBV 38
++/+++
+++
+++
LBV 58
+++
+++
+++
+++
+++
+/++
-/+
+++
+++
LBV 62
+++
++/+++
+++
-/+
+++
-/+
-/+
+++
+++
LBV 63
+++
+++
+++
++/+++
+/++
-/+
+++
+++
LBV 65
-/+
++/+++
-/+
+++
+++
Lb. gass
LBV 121
+++
+++
LBV 133
+++
+++
+++
-/+
+++
+++
LBV 146
+++
+++
LBV 149
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
LBV 150
+++
+++
+++
+++
+++
+/++
-/+
+++
+++
LBV 151
+++
-/+
+++
+++
+++
LBV 152
+++
+++
+++
+++
+++
+/++
-/+
-/+
+++
+++
LBV 162
+++
+++
+++
+++
+++
-/+
+++
+++
LBV 165
+++
+++
+++
+/++
-/+
+++
+++
LBV 166
-/+
-/+
-/+
+++
+++
полное ингибирование
очень сильное
+++
ингибирование
сильное ингибирование
незначительное
ингибирование
нет ингибироания
Cd 25, 26
Candida krusei
Cd 30, 31
Candida albicans
Cd 33, 34
Candida glabrata
Ее 5, 6
Escherichia coli
Ga 1, 3
Gardnerella vaginalis
о o
2. CD
!=:
с о
я я
(л 43 К
cr X О
а а
Я Я
я я
о 2 Я
к к
рз рз
и я
В я о
Фиг.1 (продолжение)
через 48 ч
через 120 ч
через 48 ч
через 48 ч
через 48ч
через 72 ч
Cd 25
Cd 26
Cd 25
Cd 26
Cd 30
Cd 31
Cd 33
Cd 34
Ее 5
Ее 6
Ga 1
Ga3
Lb. jensenii
LBV 2
+++
+++
+++
-/+
+++
+++
LBV 3
++/+++
-/+
-/+
+++
+++
LBV 8
+++
+++
+++
+/++
-/+
-/+
+++
+++
LBV 110
+++
+++
+++
+++
-/+
-1+
+++
+++
LBV 111
+++
+++
-/+
-1+
+++
+++
LBV 116
+/++
-/+
+/++
+++
+++
LBV 69
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+/++
+/++
-/+
+++
+++
nosus
LBV 81
+++
+++
-/+
+++
+++
LBV 96
+++
+++
+++
+++
+++
-/+
+++
+++
LBV 106
+++
+++
+++
+++
+/++
-/+
+++
+++
LBV 136
+++
+++
+/++
+/++
-/+
+++
+++
LBV 143
+++
-/+
+++
+++
LBV 147
+++
+++
+++
+++
+++
+++
-/+
+++
+++
LBV 153
+++
+++
+/++
+/++
-/+
+++
+++
LBV 161
+++
+++
+/++
+/++
-/+
+++
+++
¦S о
LB 262
+++
+++
+++
+++
+++
+++
LB 263
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
¦С a
LB 264
+++
+++
+++
+++
+++
§ *
LB 265
+++
+++
++/+++
+++
+++
LB 266
+++
+++
+++
1 мазок
2 мазок
Фиг. 2
3 мазок
о <-+
о сг
о Я 2. а
Я= 43
с ? и 43
fcl СГ
Я О
М 03
о 2 я о
я а я я
и га
fa Я
я о
4,50Е+08 4,00Е+08 3,50Е+08
? 3,00Е+08 Е
2 2,50Е+08 сг
Ь 2,00Е+08
g 1,50Е+08
1,00Е+08 |"
5,00Е+07 |"
0,00Е+00 L О
мазок
Фиг. 3
!=:
Р SQ
й со
с о
р > 1 р и я
я о
(л 43 Я
со со
о> о> X Й о 0>
я я я я
1 мазок
2 мазок
3 мазок Фиг. 4
Ньюджент Стадия
Р SQ
й со
с о
р р я
я о > 1 о
(л 43 Я
я о
со со
0> о Я Й о> сг> Я Я
я я
Фиг. 5
Композиции для влагалищного и перорального введения Lactobacillus и их применение
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
