[**]

Обеспечены лиганды, которые связываются с CLEC-2 и регулируют функцию CLEC-2. Нуклеиновокислотные лиганды CLEC-2, описанные здесь, способны ингибировать CLEC-2-опосредованную агрегацию тромбоцитов и могут также обеспечивать применение в регуляции CLEC-2-опосредуемых процессов, таких как образование тромбов, метастазирование опухолей, лимфоангиогенез, диссеминация ВИЧ, воспалительная реакция, продуцирование цитокинов и фагоцитоз. Здесь описаны также модуляторные молекулы, которые могут обращать активность лиганда CLEC-2 как in vitro, так и in vivo и ex vivo.

(57) Реферат / Формула:

Обеспечены лиганды, которые связываются с CLEC-2 и регулируют функцию CLEC-2. Нуклеиновокислотные лиганды CLEC-2, описанные здесь, способны ингибировать CLEC-2-опосредованную агрегацию тромбоцитов и могут также обеспечивать применение в регуляции CLEC-2-опосредуемых процессов, таких как образование тромбов, метастазирование опухолей, лимфоангиогенез, диссеминация ВИЧ, воспалительная реакция, продуцирование цитокинов и фагоцитоз. Здесь описаны также модуляторные молекулы, которые могут обращать активность лиганда CLEC-2 как in vitro, так и in vivo и ex vivo.

---

Евразийское (21) 201390173 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C12N15/115 (2010.01)
2013.09.30 A61K31/7088 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2011.10.14
(54) НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ CLEC-2
(31) (32) (33)
(86) (87) (88) (71)
(72)
(74)
61/393,191
2010.10.14
PCT/US2011/056422
WO 2012/051571 2012.04.19
2012.06.14
Заявитель:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НОВАМЕДИКА" (RU)
Изобретатель:
Лэйзер Джулиана М., Маханти Санджой К., Вольфф Сэмьюэл К., Редик Кэтрин К., Раскони Кристофер П. (US)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
(57) Обеспечены лиганды, которые связываются с CLEC-2 и регулируют функцию CLEC-2. Нук-леиновокислотные лиганды CLEC-2, описанные здесь, способны ингибировать CLEC-2-опосредо-ванную агрегацию тромбоцитов и могут также обеспечивать применение в регуляции CLEC-2-опосредуемых процессов, таких как образование тромбов, метастазирование опухолей, лимфоан-гиогенез, диссеминация ВИЧ, воспалительная реакция, продуцирование цитокинов и фагоцитоз. Здесь описаны также модуляторные молекулы, которые могут обращать активность лиганда CLEC-2 как in vitro, так и in vivo и ex vivo.
2420-193644ЕА/010
НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ CLEC-2 Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] Эта заявка заявляет приоритет Предварительной заявки на патент США № 61/393,191, поданной 14 октября 2010 года, которая включена здесь посредством ссылки в ее полном виде.
Область техники, к которой относится изобретение
[0002] Данное изобретение относится, в общем, к
фармакологической системе, содержащей нуклеиновокислотный
лиганд, который связывается с белком CLEC-2 и регулирует
активность белка CLEC-2. Эти нуклеиновокислотные лиганды
являются также активно обратимыми с использованием модулятора,
который ингибирует активность этого нуклеиновокислотного
лиганда для нейтрализации его фармакологического действия и
посредством этого разрушения функции CLEC-2. Кроме того, это
изобретение относится к композиции, содержащей
нуклеиновокислотный лиганд и/или модулятор, а также к способам применения этих агентов и композиций в лечении CLEC-2-опосредуемых нарушений.
Уровень техники
[0003] Лектин-подобный рецептор 2 С-типа (CLEC-2) был
недавно идентифицирован с использованием подхода биоинформатики
и был признан в качестве рецептора тромбоцитов (О'Callaghan,
С.A., Current Opinion of Pharmacology, 2009; 9:90-95). CLEC-2
является трансмембранным белком типа 2 с внеклеточным лектин-
подобным доменом С-типа и коротким цитоплазматическим доменом,
содержащим единственный hemlTAM (иммунорецепторный мотив
активации на основе тирозина) YXXL мотив. Фосфорилирование
тирозин 7 в этом цитоплазматическом мотиве запускается
связыванием лиганда после активации Srg-киназ, которое, в свою
очередь, фосфорилирует ряд находящихся ниже по ходу процесса
передающих сигнал белков, в том числе PLCy2. Имеются два
известных природно-встречающихся белка, способных
взаимодействовать с CLEC-2 и опосредовать его физиологические функции трансдукции сигнала; этот эндогенный белок подопланин и белок родоцитин яда змеи, оба из которых запускают активацию тромбоцитов, включающую в себя сильную стимуляцию как агрегации, так и секреции. Inoue-Suzuki et. al., совместно с Kato сообщали, что профиль индуцированной подопланином агрегации тромбоцитов является очень сходным с профилем индуцированной родоцитином агрегации, и идентифицировали CLEC-2 как рецептор для подопланина (Inoue-Suzuki, К.О. et. al., J. Thromb. Haemost. 2011; 9 (suppl 1) : 44-55) . Они также обнаружили, что индуцируемая родоцитином агрегация тромбоцитов является высоко зависимой от генерирования ТхА2 и полимеризации актина в сравнении с агрегацией тромбоцитов, индуцируемой CRP (Inoue, et. al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 256: 114120) . Как родоцитин, так и подопланин взаимодействуют непосредственно с CLEC-2 при микромолярных аффинностях (Kato, Y. et. al., Cancer Sci, 2008; 99:54-61; Ozaki, Y, et.al., J. Throm. Hemost, 2008; 7.191-194). Было показано, что CLEC-2 связывается с опухолевыми клетками через подопланин, и результаты из исследований на мышах указывают на то, что передача сигнала CLEC-2 может стимулировать метастазирование опухолей (Watson, A. A., et al., Biochemistry, 2009; 48: 1098810996).
[0004] Предполагалось также, что CLEC-2 участвует в
нормальном гемостазе и тромбозе in vivo (Spalton, J. С, J.
Throm. Hemost, 2009; 7:1192-1199; Watson, A.A., et al.,
Biochemistry, 2009; 48:10988-10996) в распространении
образования тромбов. Подвергание действию белков
субэндотелиального внеклеточного матрикса после разрушения стенок сосудов запускает активацию и агрегацию тромбоцитов. Недавно было показано на мышах, что лечение анти-СИЕС-2-антителом уменьшает белок из циркулирующих тромбоцитов в течение нескольких дней. CLEC-2-недостаточные мыши обнаруживали тяжелые дефекты образования агрегации тромбоцитов ex vivo и in vivo (May, F., et al., Blood, 2009; 114:34 64-3472). Образование тромбов в условиях протекания ex vivo и in vivo является тяжело
нарушенным, когда мыши являются недостаточными в отношении CLEC-2. CLEC-2-недостаточные мыши проявляют умеренное увеличение времени кровотечения в сравнении с мышами, обработанными агентами, которые ингибируют allb(33, или мышами, которые ингибируют GPlba (May, F., et al., Blood, 2009; 114:3464-3472; Kunicki, Т., Blood, 2009; 114:3364-3365).
[0005] Было также обнаружено, что CLEC-2 опосредует присоединение вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) к тромбоцитам. Связывание рецепторов CLEC-2 на тромбоцитах с ВИЧ-1 может позволить как избегание деструкции тромбоцитов, так и использование этих тромбоцитов для облегчения их трансмиссии (Chaipan, С. et al., J. Virol. 2006; 80 (18): 8951-8960). Предполагается, что передача сигнала CLEC-2 участвует также в регуляции воспалительной реакции в миелоидных дендритных клетках (Mourao-Sa, D. et.al., 2011 Eur. J. Immun. 41:30403053).
[0006] Таким образом, существует необходимость в терапевтических агентах и способах для лечения CLEC-2-опосредуемых нарушений.
Сущность изобретения
[0007] Здесь описаны нуклеиновокислотные лиганды, которые специфически ингибируют CLEC-2, способы идентификации и/или характеристики этих лигандов и терапии для использования этих лигандов.
[0008] В одном аспекте, обеспечен лиганд CLEC-2 или его
фармацевтически приемлемая соль, где этот лиганд содержит
выделенную последовательность нуклеиновой кислоты. В одном
варианте осуществления, по меньшей мере один нуклеотид является
рибонуклеотидом. В другом варианте осуществления, по меньшей
мере один нуклеотид является 2'-фтор-2'-
дезоксипиримидиннуклеотидом. Еще в одном варианте
осуществления, эта выделенная последовательность нуклеиновой кислоты лиганда CLEC-2 содержит смесь рибонуклеотидов и 2'-фтор-2'-дезоксипиримидиннуклеотидов.
[0009] В одном варианте осуществления, этот лиганд CLEC-2 содержит вторичную структуру, содержащую по меньшей мере один
стебель и по меньшей мере одну петлю.
[0010] В одном варианте осуществления, этот лиганд CLEC-2 содержит в направлении 5'-3': первый стебель, который имеет длину 5-10 пар нуклеотидов (п.н.); первую трехнуклеотидную петлю, которая содержит последовательность 5'-GNC-3'; второй стебель, который имеет длину 4 п.н., где указанный второй стебель содержит пару неодназначного спаривания в основании второго стебля; и вторую петлю, содержащую нуклеотидную последовательность 5'-YUYNNRYU-3'.
[ООН] В одном варианте осуществления, этот нуклеиновокислотный лиганд имеет длину от приблизительно 2 0 до приблизительно 100 нуклеотидов (нт) . В другом варианте осуществления, этот лиганд имеет длину от приблизительно 30 до приблизительно 40 или от приблизительно 30 до приблизительно 35 нт. В другом варианте осуществления, этот нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2 имеет длину приблизительно 3 0 нт, 31 нт, 32 нт, 33 нт, 34 нт или 35 нт.
[0012] В одном варианте осуществления, лиганд CLEC-2 содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:4-93, или ее фармацевтически приемлемой соли.
[0013] В одном варианте осуществления, этот лиганд связывается с белком CLEC-2 или его фрагментом. В другом варианте осуществления, этот лиганд связывается с растворимым доменом CLEC-2. Еще в одном варианте осуществления, этот лиганд связывается с внеклеточным доменом CLEC-2. Еще в одном варианте осуществления, этот лиганд связывается с доменом Gln58-Pro230 CLEC-2. В одном варианте осуществления, этот лиганд специфически связывается с белком CLEC-2 (SEQ ID N0:1). В другом варианте осуществления, этот лиганд специфически связывается с внеклеточным доменом CLEC-2(SEQ ID N0:2).
[0014] В одном варианте осуществления, этот лиганд состоит из нуклеотидов, в которых один или несколько из этих нуклеотидов являются модифицированными. В другом варианте
осуществления, модификации нуклеотидов являются
стабилизирующими модификациями. Еще в одном варианте осуществления, эти модификации увеличивают стабильность этого лиганда in vitro и/или in vivo. Еще в одном варианте осуществления, эти модификации увеличивают биодоступность этого лиганда in vivo.
[0015] В одном варианте осуществления, этот лиганд содержит инвертированный тимин на его 3'-конце.
[0016] В одном варианте осуществления, этот лиганд имеет константу диссоциации ("Kd") в отношении CLEC-2 приблизительно 2 0 наномолярную (нМ) или менее.
[0017] В одном варианте осуществления, этот лиганд имеет константу диссоциации в отношении CLEC-2, которая больше чем 0, но меньше чем приблизительно 100 микромолей (мкМ), меньше чем приблизительно 1 мкм, меньше чем приблизительно 500 наномолей (нМ), меньше чем приблизительно 100 нМ, меньше чем приблизительно 50 нМ, меньше чем приблизительно 1 нМ, меньше чем приблизительно 500 пикомолей (пМ), меньше чем приблизительно 300 пМ, меньше чем приблизительно 2 50 пМ или меньше чем приблизительно 2 00 пМ. В одном варианте осуществления, этот лиганд имеет константу диссоциации в отношении CLEC-2, которая находится в диапазонах от приблизительно 0,1 до 10 нМ или от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нМ.
[0018] В одном варианте осуществления, лиганд CLEC-2 связывается с вариантом CLEC-2 и уменьшает или увеличивает функцию варианта CLEC-2, где этот вариант CLEC-2 по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен аминокислотной последовательности CLEC-2 (SEQ ID N0:1) или SEQ ID N0:2).
[0019] В одном варианте осуществления, связывание лиганда CLEC-2 с CLEC-2 стабилизирует активную конформацию CLEC-2. В другом варианте осуществления, связывание лиганда CLEC-2 с CLEC-2 стабилизирует неактивную конформацию CLEC-2.
[0020] В одном варианте осуществления, один или несколько нуклеотидов этого лиганда содержат модифицированный сахар и/или
модифицированное основание. В другом варианте осуществления, эти модификации являются 2'-стабилизирующими модификациями. Еще в одном варианте осуществления, эти 2'-стабилизирующие модификации являются 2'-фтор-модификациями на сахарном кольце нуклеотида.
[0021] В одном варианте осуществления, этот нуклеиновокислотный лиганд для CLEC-2 является обратимым, где этот лиганд CLEC-2, связанный с CLEC-2, может становиться несвязанным. В другом варианте осуществления, этот лиганд CLEC-2, связанный с CLEC-2, становится не связанным с CLEC-2 в присутствии модулятора лиганда CLEC-2.
[0022] В одном аспекте, обеспечен модулятор, который связывает лиганд CLEC-2, где этот модулятор обращает, частично или полностью, активность лиганда CLEC-2.
[0023] В одном варианте осуществления, этот модулятор
содержит выделенную последовательность нуклеиновой кислоты. В
другом варианте осуществления, этот модулятор содержит ДНК-
последовательность, РНК-последовательность, полипептидную
последовательность или любую их комбинации. В одном варианте
осуществления, этот модулятор является нуклеиновокислотным
модулятором, содержащим дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды,
2'-О-метил-2'-дезоксинуклеотиды или смесь
дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов и 2'-О-метил-2' -дезоксинуклеотидов. В другом варианте осуществления, этот нуклеиновокислотный модулятор содержит по меньшей мере один модифицированный дезоксирибонуклеотид и/или по меньшей мере один модифицированный рибонуклеотид.
[0024] В одном варианте осуществления, этот модулятор
содержит олигонуклеотид, который является комплемпентарным по
меньшей мере части нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2. В
другом варианте осуществления, этот модулятор состоит из
олигонуклеотида, который является комплементарным по меньшей
мере части нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2. В другом
варианте осуществления, этот модулятор содержит
олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере части петли в лиганде CLEC-2.
Еще в одном варианте осуществления, этот модулятор содержит олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере части стебля в лиганде CLEC-2. Еще в одном варианте осуществления, этот модулятор содержит олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной по меньшей мере части стебля в лиганде CLEC-2 и по меньшей мере части петли в лиганде CLEC-2.
[0025] В одном варианте осуществления, этот модулятор содержит последовательность, которая более чем на 80%, 85%, 90%, 91%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:63, SEQ ID N0:64 и SEQ ID N0:65. В другом варианте осуществления, этот модулятор содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0:60, SEQ ID N0:61, SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:63, SEQ ID NO:64 и SEQ ID NO:65.
[0026] В одном варианте осуществления, этот модулятор нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 выбран из группы, состоящей из рибозима, ДНК-зима, пептиднуклеиновой кислоты (PNA), морфолинонуклеиновой кислоты (MNA) и "закрытой" нуклеиновой кислоты (LNA).
[0027] В одном варианте осуществления, этот модулятор нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 содержит нуклеиновую кислоту, которая является комплементарной по меньшей мере части нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2. В другом варианте осуществления, этот модулятор выбран из группы, состоящей из рибозима, ДНК-зима, пептиднуклеиновой кислоты (PNA), морфолинонуклеиновой кислоты (MNA) и "закрытой" нуклеиновой кислоты (LNA), где этот модулятор специфически связывается или взаимодействует по меньшей мере с частью нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2.
[0028] В одном варианте осуществления, этот модулятор выбран из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, связывающей белок или пептид, малой молекулы, олигосахарида, нуклеиновой кислоты, связывающей липид, полимера, наночастицы и микросферы, где этот модулятор связывается или взаимодействует по меньшей
мере с частью нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2.
[0029] В одном варианте осуществления, этот модулятор содержит выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, где эта последовательность имеет длину приблизительно 10 нт приблизительно 3 0 нт, приблизительно 10 нт - приблизительно 2 5 нт, приблизительно 10 нт - приблизительно 2 0 нт, приблизительно 10 нт - приблизительно 15 нт или приблизительно 15 нт приблизительно 2 0 нт. В другом варианте осуществления, этот модулятор содержит выделенную последовательность нуклеиновой кислоты, где эта последовательность имеет длину приблизительно 10 нт, 11 нт, 12 нт, 13 нт, 14 нт, 15 нт, 16 нт, 17 нт, 18 нт, 19 нт или 2 0 нт.
[0030] В одном варианте осуществления, один или несколько нуклеотидов нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 и/или нуклеиновокислотного модулятора являются модифицированными. В другом варианте осуществления, один или несколько нуклеотидов содержат модификацию в 2'-гидроксильном положении. В другом варианте осуществления, эта модификация, присутствующая в лиганде CLEC-2, выбрана из группы, состоящей из 2'-фтор. В другом варианте осуществления, одним или несколькими нуклеотидами лиганда CLEC-2 является 2'-фтор-2'-дезоксицитидин или 2'-фтор-2'-дезоксиуридин. Еще в одном варианте осуществления, этими одним или несколькими нуклеотидами модулятора являются 2'-О-метилцитозин, 2'-О-метилуридин, 2'-0-метиладенозин, 2'-О-метилгуанозин или 2'-О-метилцитимидин. Еще в одном варианте осуществления, этими одним или несколькими нуклеотидами являются 2'-фторцитидин, 2'-фторуридин, 2'-фтораденозин или 2'-фторгуанозин.
[0031] В одном варианте осуществления, эта модификация одного или нескольких нуклеотидов нуклеиновокислотного модулятора CLEC-2 содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из 5-фторурацила, 5-фторцитозина, 5-бромурацила, 5-бромцитозина, 5-хлорурацила, 5-хлорцитозина, 5-иодурацила, 5-иодцитозина, 5-метилцитозина, 5-метилурацила, гипоксантина, ксантина, 4-ацетилцитозина, 5-(карбоксигидроксиметил)урацила, 5-карбоксиметиламинометилтиоуридина, 5
карбоксиметиламинометилурацила, дигидроурацила, бета-D-
галактозилквеозина, инозина, Ыб-изопентениладенина, 1-
метилгуанина, 1-метилинозина, 2,2-диметилгуанина, 2-
метиладенина, 2-метилгуанина, 3-метилцитозина, б-метилцитозина,
Ыб-аденина, 7-метилгуанина, 5-метиламинометилурацила, 5-
метоксиаминометил-2-тиоурацила, бета-Б-маннозилквеозина, 5'-
метоксикарбоксиметилурацила, 5-метоксиурацила, 5-
метоксицитозина, 2-метилтио-Ыб-изопентениладенина, урацилоксиуксусной кислоты (v), бутоксозина, псевдоурацила, квеозина, 2-тиоцитозина, 5-метилтиоурацила, 2-тиоурацила, 4-тиоурацила, 5-метилурацила, метилового эфира урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацилоксиуксусной кислоты (v) , 5-метилтиоурацила, 3-(З-амино-З-Ы-карбоксипропил)уридина (асрЗи) и 2,б-диаминопурина.
[0032] В одном варианте осуществления этот модулятор содержит по меньшей мере одну модифицированную сахарную часть.
[0033] В одном варианте осуществления связывание этого модулятора с лигандом CLEC-2 создает суицидное положение в лиганде CLEC-2, разрушая посредством этого вторичную структуру этого лиганда CLEC-2 и приводя к усиленной деструкции этого нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 нуклеазами.
[0034] В одном варианте осуществления связывание этого модулятора с комплексом лиганд CLEC-2-CLEC-2 уменьшает или элиминирует связывание лиганда CLEC-2 с CLEC-2.
[0035] В другом аспекте обеспечен способ модуляции активности лиганда CLEC-2.
[0036] В одном варианте осуществления этот нуклеиновокислотный лиганд специфически связывает CLEC-2 и ингибирует CLEC-2-опосредуемые нарушения. В одном варианте осуществления, этот лиганд ингибирует способность CLEC-2 опосредовать агрегацию тромбоцитов. В одном варианте осуществления, этот лиганд ингибирует способность CLEC-2 опосредовать активацию и секрецию тромбоцитов. В одном варианте осуществления, этот лиганд ингибирует способность CLEC-2 распространять образование тромбов. В одном варианте осуществления, этот лиганд ингибирует способность CLEC-2
взаимодействовать с эндогенным белком подопланином. В одном
варианте осуществления этот лиганд ингибирует способность CLEC-
2 взаимодействовать с опухолевыми клетками. В одном варианте
осуществления этот лиганд ингибирует способность CLEC-2
связывать опухолевые клетки через подопланин и аттрагировать
тромбоциты к участкам опухоли. В одном варианте осуществления,
этот лиганд ингибирует способность CLEC-2 взаимодействовать с
опухолевыми клетками, ингибируя посредством этого
метастазирование. В одном варианте осуществления, этот лиганд
ингибирует способность CLEC-2 взаимодействовать с опухолевыми
клетками, уменьшая посредством этого способность опухолевых
клеток высвобождать факторы роста. В одном варианте
осуществления, этот лиганд ингибирует способность CLEC-2
взаимодействовать с Вирусом Иммунодефицита Человека (ВИЧ). В
одном варианте осуществления, этот лиганд ингибирует
способность CLEC-2 облегчать распространение (диссеминацию)
ВИЧ. В одном варианте осуществления, этот лиганд ингибирует
способность опосредуемой передачей сигнала CLEC-2
воспалительной реакции, продуцирования цитокинов,
взаимодействия тромбоцит-моноцит и адгезии тромбоцитов.
[0037] В одном варианте осуществления, обеспечен способ
модуляции активности нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2
введением модулятора лиганда CLEC-2 хозяину, которому был
введен нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2. В одном варианте
осуществления, этот модулятор может быть олигонуклеотидным
модулятором или его производным, и в некоторых вариантах
осуществления, он является комплементарным части
нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2.
[0038] В дополнительном аспекте, обеспечен способ регуляции функции CLEC-2 с использованием лиганда CLEC-2.
[0039] В одном варианте осуществления, способ регуляции функции CLEC-2 предусматривает введение хозяину терапевтически эффективного количества лиганда CLEC-2. В другом варианте осуществления, этот способ дополнительно предусматривает введение модулятора лиганда CLEC-2 хозяину, которому ранее был введен лиганд CLEC-2.
[0040] В другом аспекте, обеспечен способ лечения или облегчения CLEC-2-опосредованного заболевания или нарушения.
[0041] В одном варианте осуществления, этот способ предусматривает введение хозяину, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества лиганда CLEC-2, который связывается с CLEC-2. В одном варианте осуществления, этот хозяин диагностирован как имеющий опосредуемой тромбоцитами нарушение.
[0042] В одном варианте осуществления, это заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из сердечно-сосудистых нарушений, церебрально-васкулярных нарушений, нарушений периферических сосудов, острого коронарного синдрома, связанных с диабетом нарушений и рака.
[0043] В одном варианте осуществления, этим церебрально-васкулярным нарушением является тромбоз, тромбоэмболия или приступ транзиторной ишемии (TIA). В другом варианте осуществления, острый коронарный синдром обусловлен коронарным тромбозом, нестабильной стенокардией или инфарктом миокарда. Еще в одном варианте осуществления, связанным с диабетом нарушением является диабетическая ретинопатия, диабетическая васкулопатия, атеросклероз, ишемический инсульт, заболевание периферических сосудов, острое повреждение почки или хроническая почечная недостаточность. В одном варианте осуществления, рак выбран из рака легкого, рака молочной железы, рака предстательной железы, тестикулярного рака, рака поджелудочной железы, рака головного мозга, рака костей и рака печени.
[0044] В одном варианте осуществления, этот лиганд CLEC-2
вводят парентеральным введением, внутривенным введением,
внутрикожной доставкой, интраартикулярной доставкой,
внутрисуставной доставкой, внутриоболочечной,
внутрианртериальной доставкой, интракардиальной доставкой, внутримышечной доставкой, подкожной доставкой, интраорбитальной доставкой, интракапсулярной доставкой, интраспинальной доставкой, внутригрудинной доставкой, местной доставкой, доставкой с использованием трансдермального пластыря,
ректальной доставкой, трансбуккальной доставкой, доставкой через влагалищный или уретральный суппозиторий, внутрибрюшинной доставкой, чрескожной доставкой, доставкой через назальный спрей, доставкой через хирургический имплантат, доставкой с использованием хирургической кисточки для внутренних органов, доставкой через инфузионный насос или доставкой через катетер.
[0045] В другом аспекте, обеспечен способ лечения хозяина, нуждающегося в этом, введением лиганда CLEC-2, где этот лиганд CLEC-2 регулирует функцию тромбоцитов.
[0046] В одном варианте осуществления, вводят терапевтически эффективную дозу CLEC-2.
[0047] В одном варианте осуществления, эта терапевтически эффективная доза уменьшает или ингибирует адгезию и/или агрегацию и/или секрецию тромбоцитов.
[0048] В одном аспекте, обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество нуклеиновокислотного лиганда, который связывает CLEC-2.
[0049] В одном аспекте, обеспечена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество модулятора, где этот модулятор обращает активность нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2, который связывает CLEC-2.
[0050] В одном варианте осуществления, эта фармацевтическая композиция содержит лиганд CLEC-2 и фармацевтически приемлемые эксципиенты. В другом варианте осуществления, эта фармацевтическая композиция является жидкостью, подходящей для внутривенной инъекции. Еще в одном варианте осуществления, эта фармацевтическая композиция является жидкостью или дисперсией для подкожного введения.
[0051] В одном аспекте, обеспечен набор, содержащий терапевтически эффективное количество нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 и/или модулятора, который регулирует активность нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2.
[0052] В одном варианте осуществления, этот набор содержит лиганд CLEC-2. В другом варианте осуществления, этот набор содержит модулятор лиганда CLEC-2. Еще в одном варианте осуществления, этот набор содержит как лиганд CLEC-2, так и
модулятор для лиганда CLEC-2.
[0053] Способы, фармацевтические композиции и применения нуклеиновокислотных лигандов, описанные здесь, также обеспечены в качестве модулируемых терапевтических веществ для применения в нарушениях или схемах лечения, требующих антитромбоцитарной или антитромботической терапий. В некоторых вариантах осуществления, этим лечением является хирургическое вмешательство, включающее в себя чрескожные введения. Эти способы могут включать в себя введение нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 хозяину, нуждающемуся в этом, где этот хозяин страдает, или находится при риске этого страдания, от окклюзионного тромботического заболевания или нарушения коронарной, церебральной или периферической сосудистой системы. Дополнительно, обеспечены фармацевтические композиции, в которых нуклеиновокислотный лиганд или его модулятор находятся в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции, содержащие этот модулятор, могут быть сконструированы для введения хозяину, которому вводили нуклеиновокислотный лиганд, для возможности модуляции активности этого лиганда и, следовательно, регуляции коагуляционного состояния хозяина при риске кровотечения.
[0054] В одном аспекте, обеспечен способ определения, активирует или ингибирует лиганд CLEC-2 функцию CLEC-2. В одном варианте осуществления, функцией CLEC-2 является CLEC-2-зависимая или CLEC-2-опосредованная агрегация тромбоцитов. В другом варианте осуществления, обеспечен способ определения, активирует ли лиганд CLEC-2 CLEC-2-зависимую агрегацию тромбоцитов. Еще в одном варианте осуществления, этот способ выполняют in vitro.
[0055] В одном варианте осуществления, этот способ предусматривает
(a) смешивание лиганда CLEC-2 с пробой крови для приготовления обработанной пробы крови;
(b) контактирование этой обработанной пробы крови с вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором);
(c) измерение образования агрегатов тромбоцитов после
(a)
этого контактирования; и
(d) сравнение степени образования агрегатов тромбоцитов, детектируемого в стадии (с) , со степенью образования агрегатов тромбоцитов, полученной с контрольной пробой крови без использования лиганда CLEC-2 для связывания CLEC-2 и ингибирования его взаимодействия с вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором).
[0056] В одном варианте осуществления, эта вспомогательная молекула (молекула-фасилитатор) иммобилизована на твердом носителе.
[0057] В одном варианте осуществления, этой вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором) является активатор CLEC-2. В другом варианте осуществления, этой вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором) является родоцитин. Еще в одном варианте осуществления, этой вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором) является подопланин.
[0058] В одном варианте осуществления, при использовании в комбинации с активатором CLEC-2, этой вспомогательной молекулой (молекулой-фасилитатором) является растворимый коллаген. В другом варианте осуществления, этим растворимым коллагеном является коллаген типа I, II или III. Еще в одном варианте осуществления, этот способ дополнительно предусматривает добавление активатора CLEC-2 в пробу крови. Еще в одном варианте осуществления, этим активатором CLEC-2 является родоцитин.
[0059] В одном варианте осуществления, этой пробой крови является цельная кровь. В другом варианте осуществления, этой пробой крови является обогащенная тромбоцитами плазма (PRP). Еще в одном варианте осуществления, этой пробой крови являются промытые тромбоциты.
[0060] В одном варианте осуществления, лигандом CLEC-2 является нуклеиновокислотный лиганд (содержащий нуклеиновую кислоту лиганд). В другом варианте осуществления, этот нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2 включает в себя SEQ ID N0:8 или SEQ ID N0:9 или последовательность, произведенную из SEQ ID
NO:8 или SEQ ID N0:9. ОПИСАНИЕ ФИГУР
ФИГ. 1 является диаграммой процесса селекции (отбора) нуклеиновокислотного лиганда SELEX.
ФИГ. 2 показывает условия для Раундов 1-10 селекций Sel2.
ФИГ. 3 показывает обогащение связывания селекций лиганда CLEC-2.
ФИГ. 4 показывает кривые связывания отобранных нуклеиновокислотных лигандов CLEC-2.
ФИГ. 5 иллюстрирует предсказанные вторичные структуры S2-20 Т10 и RB 587.
ФИГ. б показывает конкретные условия для дегенеративной селекции.
ФИГ. 7 иллюстрирует консервацию последовательности дегенеративной селекции S2-20.
ФИГ. 8 показывает районы, комплементарные между лигандом CLEC-2 и модуляторами.
ФИГ. 9А-В показывают графики индуцированной родоцитином агрегации WP тромбоцитов в присутствии лиганда CLEC-2.
ФИГ. 10А-С показывают диаграммы индуцированной родоцитином агрегации тромбоцитов в присутствии лигандов CLEC-2 или в присутствии модуляторов лигандов CLEC-2.
ФИГ. 11А-В показывают диаграммы индуцированной родоцитином экспрессии Р-селектина человека.
ФИГ. 12А-В показывают результаты анализов адгезии тромбоцитов на основе протекания in vitro.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[00 61] Нуклеиновокислотные лиганды (состоящие из нуклеиновых кислот лиганды), также называемые "аптамерами", являются не встречающимися в природе, одноцепочечными нуклеиновыми кислотами, которые принимают специфическую трехмерную форму, которая позволяет связывание с желаемой молекулой-мишенью. Что касается лигандов, которые связываются с пептидами и белками, ассоциация лиганда с его белком-мишенью может приводить к ингибированию функции этого белка, подобно тому, как связывание моноклонального антитела с его белком
мишенью может приводить к ингибированию функции этого белка. Одним уникальным признаком нуклеиновокислотных лигандов является способность генерировать активные регуляторные агенты к ним в форме комплементарных олигонуклеотидов, которые гибридизуются с этим лигандом спариванием оснований Уотсона-Крика. Эти активные регуляторные агенты фундаментально изменяют активную структуру лигандов и, следовательно, нейтрализуют их фармакологическую активность. Данное изобретение обеспечивает соединения, композиции и способы, которые включают в себя нуклеиновокислотные лиганды к CLEC-2 для опосредования биологической функции и взаимодействия CLEC-2. Дополнительно обеспечены модуляторы, которые могут регулировать активность этих нуклеиновокислотных лигандов CLEC-2. Определения
[0062] В данном контексте, будут применяться следующие определения, если не указано иное.
[0063] Термин "приблизительно", при использовании здесь для ссылки на измеряемую величину, такую как величина массы, времени, дозы и т.д., предназначен для включения вариаций ±2 0% или ±10%, ±5%, ±1% или ±0,1% от указанной величины, и как таковые, такие вариации пригодны для выполнения описанного способа.
[0064] "Нуклеиновокислотный лиганд", который может также называться здесь "лигандом" или "аптамером", является нуклеиновой кислотой, которая может образовывать третичную структуру и которая взаимодействует с молекулой-мишенью, "нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2" или "лиганд CLEC-2" или "анти-СЪЕС-2-лиганд" или "нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2" обозначает лиганд или аптамер, который специфически связывается с CLEC-2 или его фрагментом. Этот фрагмент CLEC-2 может быть растворимым фрагментом, таким как внеклеточный домен (ECD) или его фрагмент. Альтернативно, лиганд CLEC-2 связывает молекулу CLEC-2, которая экспрессируется на поверхности клетки или обнаруживается ассоциированной с тромбоцитом. Белок CLEC-2 может быть эндогенно экспрессируемым на клетке или экспрессирован посредством рекомбинантных способов. Эти термины
относятся к олигонуклеотидам, имеющим районы специфического связывания, которые способны образовывать комплексы с рассматриваемой молекулой-мишенью в физиологическом окружении. Аффинность связывания лиганда с молекулой-мишенью определяется в терминах константы диссоциации (Ко!) взаимодействия между этим лигандом и молекулой-мишенью. Обычно, Ко! этого лиганда в отношении этого лиганда находится между приблизительно 0,1 нМ и приблизительно 100 нМ. Специфичность этого связывания определяется в терминах сравнительной константы диссоциации этого лиганда в отношении мишени в сравнении с константой диссоциации в отношении этого лиганда и других материалов в этом окружении или вообще неродственных молекул. Обычно, Ко! для этого лиганда относительно этой мишени будет в 10-раз, 50-раз, 100-раз или 200-раз меньшей, чем Ко! относительно неродственного материала или сопутствующего материала в данном окружении.
[00 65] В применении здесь, в контексте гомологичных
районов, "по существу гомологичная" последовательность является
последовательностью, которая образует одну и ту же вторичную
структуру спариванием Уотсона-Крика в конкретной молекуле. В
некоторых вариантах осуществления, последовательности являются
"по существу гомологичными", если они имеют по меньшей мере
80%, 85% или большую идентичность последовательности, такую как
приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или
99% идентичность последовательности относительно указанного
лиганда. Для большей ясности, такие "по существу гомологичные"
последовательности могут быть также описаны как
последовательности, "имеющие по меньшей мере 80%, 85%, 90% или
95% идентичность последовательности" относительно конкретной
последовательности, или эта последовательность может быть
приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%
или 99% идентичной конкретной последовательности лиганда. В
контексте нуклеиновокислотного лиганда указанной длины, такой
как 50 или менее нуклеотидов, гомологичная последовательность
может быть обнаружена в любом районе, который делает возможным
связывание Уотсона-Крика с образованием одной и той же
вторичной структуры, независимо от идентичности
последовательности в этом конкретном районе.
[0066] Список Последовательностей, поданный с этой заявкой, обеспечивает только первичные последовательности (обеспечивает последовательность нуклеотидов без конкретных модификаций). Понятно, что каждая из последовательностей в этом описании и в представленном Списке Последовательностей может иметь любую комбинацию модификаций, как описано здесь. Последовательности, имеющие модификации, описанные в Таблицах 1-4, ассоциированы, каждая, с конкретным "названием клона" или "названием", которое обеспечивает определенное описание последовательности нуклеиновой кислоты с ее конкретно определенными модификациями.
[0067] "Пара лиганд-модулятор" или "лиганд-модуляторная пара" означает включение указанного лиганда в молекулу-мишень, и лиганд-модулятор, который изменяет вторичную и/или третичную структуру этого лиганда таким образом, что взаимодействие этого лиганда с его мишенью модулируется. Этот модулятор может быть олигонуклеотидом, комплементарным части этого лиганда. Этот модулятор может изменять конформацию этого лиганда для уменьшения способности связывания этого лиганда на 10-100%, 20100%, 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%, или на любой процент в диапазоне между 10% и 100% при физиологических условиях in vitro, ex vivo или in vivo.
[0068] "Модулятор", "антидот", "регулятор" или
"регуляторный агент" относятся к любому фармацевтически приемлемому агенту, который может связывать лиганд или аптамер, как описано здесь, и модифицировать взаимодействие между этим лигандом и его молекулой-мишенью (например, модификацией структуры этого лиганда) желаемым образом.
[0069] "Модулирование" обозначает в данном контексте ослабление, увеличение или некоторое другое измеримое изменение активности.
[0070] "Хозяином" называют млекопитающее, и этот термин включает в себя человека и остальных млекопитающих. Примеры хозяина включают в себя, но не ограничиваются ими, мышей, крыс, хомячков, морских свинок, свиней, кроликов, кошек, собак, коз,
лошадей, овец, коров и людей.
[0071] "Фармацевтически приемлемые" означает в данном контексте материалы, одобренные регулирующим агенством Федерального правительства или правительства штата, или перечисленные в Фармакопее США или других общепризнанных фармакопеях материалы, для применения в людях.
[0072] Фармацевтически эффективной дозой является доза, требуемая для предотвращения, ингибирования появления или лечения (ослабления симптома до некоторой степени) состояния заболевания. Эта фармацевтически эффективная доза зависит от типа заболевания, используемой композиции, способа введения, типа подвергаемого лечению млекопитающего, физических характеристик конкретного рассматриваемого млекопитающего, сопутствующего медикаментозного лечения и других факторов, которые будут известны квалифицированным в данной области специалистам. Обычно, вводят количество между 0,1 мг/кг и 100 мг/кг массы тела в день в зависимости от эффективности нуклеиновокислотного лиганда и модулятора.
[0073] Термин "стабилизированная молекула нуклеиновой
кислоты" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая
менее легко деградируется in vivo (например, посредством
экзонуклеазы или эндонуклеазы) в сравнении с
нестабилизированной молекулой нуклеиновой кислоты. Стабилизация может быть функцией длины и/или вторичной структуры и/или включения химических замен в сахарной или фосфатной частей олигонуклеотидного скелета. Стабилизация может быть получена регуляцией, например, вторичной структуры, которая может стабилизировать молекулу. Например, если 3'-конец молекулы нуклеиновой кислоты комплементарен району слева, эта часть может укладываться обратно и образовывать структуру "стебель-петля", которая стабилизирует эту молекулу.
[0074] Термины "аффинность связывания" и "активность связывания" относятся к тенденции молекулы лиганда связываться или не связываться с мишенью. Энергетика указанных взаимодействий является важной в "активности связывания" и в "аффинности связывания", так как она определяет необходимые
концентрации взаимодействующих партнеров, скорости, при которых эти партнеры способны ассоциироваться, и относительные концентрации связанных и свободных молекул в растворе. Эта энергетика может характеризоваться, среди прочих путей, определением константы диссоциации, Kd.
[0075] "Лечение" или "обработка" означает в данном контексте любое лечение заболевания в млекопитающем, в том числе: (а) защиту против этого заболевания, т.е. недопущение развития клинических симптомов; (Ь) ингибирование этого заболевания, т.е. задержку, устранение, уменьшение или супрессию развития клинических симптомов; и/или (с) облегчение этого заболевания, т.е. вызывание регресса клинических симптомов. Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что в медицине человека не всегда можно отличить "предотвращение" и "супрессию", поскольку эти первичные индуктивные событие или события могут быть неизвестными, латентными, или пациент еще не диагностирован хорошо после появления этого события или этих событий. Таким образом, в данном контексте термин "профилактика" предназначен для использования в качестве элемента "лечения" и включает в себя как "предотвращение", так и "супрессию", как определено здесь. Предполагается, что термин "защита", в данном контексте включает в себя "профилактику".
[0076] Термин "эффективное количество" обозначает дозу, достаточную для обеспечения лечения для подлежащего лечению нарушения или патологического состояния. Она будет варьироваться в зависимости от пациента, заболевания и проводимого лечения.
[0077] Термин "вариант" нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 включает в себя в данном контексте варианты, которые выполняют по существу ту же самую функцию, что и нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2, и содержат по существу ту же самую структуру. CLEC-2
[0078] CLEC-2 является трансмембранным белком,
экспрессируемым на поверхности клеток печени и нескольких
гемопоэтических клеток, включающих в себя моноциты, дендритные клетки, нормальные клетки-киллеры (NK-клетки) и гранулоциты. Из гемопоэтических клеток и лакунарных эндотелиальных клеток печени белок CLEC-2 специфически экспрессируется в тромбоцитах и мегакариоцитарных клетках (Chaipan et al., 2 00 6; J Virol, 80:8951-8960). Было показано, что CLEC-2 опосредует активацию тромбоцитов через Src- и Syk-киназу.
[0079] Первоначально были идентифицированы только экзогенные лиганды для CLEC-2. Они включали в себя змеиный яд, родоцитин (аггретин) и ВИЧ-1, оба из которых, как было показано, активируют тромбоциты и посредством этого активирует агрегацию тромбоцитов. CLEC-2-недостаточность ассоциирована с увеличенными периодами кровотечения и защитой от образования окклюзивного артериального тромба (May et al., 2009, Blood, 114:34 64-3472) . May et al. показали также, что лечение анти-CLEC-2-антителом мышей приводит к полной и высокоспецифической потере CLEC-2 в циркулирующих тромбоцитах в течение нескольких дней, сопровождающейся тяжелыми дефектами в агрегации тромбоцитов.
[008 0] Одним эндогенным лигандом CLEC-2,
идентифицированным недавно Ozaki et al. (2010; J. Throm
Haemos., 7:191-194), является подопланин. Подопланин является
сиалогликопротеином, предположительно участвующим в
индуцируемой опухолями агрегации тромбоцитов и метастазировании опухоли. Подопланин является высокоэкспрессируемым в лимфатическом эндотелии и в подоцитах почки. Экспрессия подопланина не детектируется в эндотелии сосудов. Взаимодействие подопланина с CLEC-2 является важным для разделения крови и лимфатических сосудов во время развития. Исследования показали, что как подопланин-, так и CLEC-2-недостаточные мыши обнаруживают фенотип кровотечения и атипичные сосудистые связи (Schacht, V., et.al., 2003, EMBO, J. 22:3546-3556; Suzuki-Inoue К. et al., 2010, J. Biol. Chem, 285:24494-24507). Исследования предполагают, что CLEC-2 может играть роль в метастазировании гемопоэтических опухолей, так как этот рецептор опосредует индуцированную опухолевыми
клетками активацию тромбоцитов, процесс, о котором известно, что он значимо стимулирует распространение опухолевых клеток (Honn et al., 1992, Cancer Metastasis Rev, 11:325-351; Nieswandt et al., Cancer Res, 1999, 59:1295-1300).
[0081] Аминокислотная последовательность полноразмерного белка CLEC-2 (GenBank Accession No. AAF3 777) представлена ниже:
CLEC-2 (SEQ ID N0:1)
1 MQDSDGYITL NIKTRKPALI SVGSASSSWW RYMALILLIL CVGMVVGLVA LGIWSVKQRN 61 YLQDENENRT GTLQQLAKF.F CQYWKQSEL KGTPKGHKCS PCDTNWRYYG DSCYGFFRHN 121 LTWBBSKQYC ТШНА'ИЛЖ! DNRNIVBYIK ARTHLIRWVG LSRQKSNEVW KWEDGSVISB 181 NMFEFLEDGK GNMNCAYFHSl GKMHPTFCEN KHYLMCERKA GMTKVDQLP
[0082] Внеклеточный домен (ECD) CLEC-2 включает в себя приблизительно аминокислоты 58-22 9 и представлен ниже: CLEC-2 (Gln58-Pro229) (SEQ ID N0:2)
5 8 QRN
61 YLQDENENRT GTLQQLAKF.F CQYWKQSEL KGTFKGKKCS PCDTNWRYYG DSCYGFFRHN
121 LTWEESKQYC TDMNATLLКI DNRNIVBYIK ARTHLIRWVG LSRQKSNEVW RWEDGSVISE
181 NMFEFLEDGK GNKNCAYFHN GKMHPTFCEN KHYLMCERKA GMTKVDQLP
[0083] Внеклеточный домен (ECD) CLEC-2, слитый с N-концевой меткой HislO (SEQ ID N0:3), который используется для селекции (отбора) описанных здесь нуклеиновокислотных лигандов, включает в себя аминокислоты 58-22 9 и представлен ниже:
HHHHffifflHHHQKMYLQDEHI^RTGTLQ EESKQYGTDMI^ATLI..KIDWRNI\'EYIKARTHLIRl'A/G NGKMHPTFC ENKHYLMCERRAGMTKVDQLP
Развитие нуклеиновокислотных лигандов CLEC-2
[0084] Нуклеиновокислотные лиганды, которые специфически
связывают белок CLEC-2, идентифицировали с использованием
способа SELEX. Лиганды, которые первоначально получали
посредством SELEX, затем полностью характеризовали для
понимания свойств лигандов CLEC-2. Такая характеристика
включала в себя секвенирование, сопоставление
последовательностей для определения консервативных
последовательностей, предсказание (прогнозирование) вторичной
структуры и укорочения и анализ мутаций для идентификации районов лигандов, наиболее критических для желаемой функции специфического связывания и ингибирования CLEC-2.
[0085] SELEX обозначает Системную Эволюцию лигандов посредством Экспоненциального Обогащения. Этот способ делает возможной эволюцию in vitro молекул нуклеиновых кислот с высокоспецифическим связыванием молекул-мишеней. Этот SELEX-способ описан, например, в Патентах США с номерами 5,475,096, и 5,270,163 (см. также WO 91/19813).
[0086] В его наиболее базовой форме, этот способ SELEX может быть определен следующими сериями стадий:
1) Готовят кандидатную смесь нуклеиновых кислот с
различающейся последовательностью. Эта кандидатная смесь обычно
включает в себя районы фиксированных последовательностей (т.е.,
каждый из членов этой кандидатной смеси содержит одни и те же
последовательности в одном и том же местоположении) и районы
рандомизированных последовательностей. Эти фиксированные районы
последовательностей отбирают либо: (а) для содействия в стадиях
амплификации, описанных ниже, (Ь) для имитации
последовательности, о которой известно, что она связывается с
мишенью, или (с) для увеличения концентрации конкретной
структурной аранжировки нуклеиновых кислот в этой кандидатной
смеси. Эти рандомизированные последовательности могут быть
полностью рандомизированными (т.е. вероятность нахождения
основания в любом положении равна одному к четырем) или только
частично рандомизированными (например, вероятность нахождения
основания в любом местоположении может быть выбрана на любом
уровне между 0 и 10 0%) .
2) Эту кандидатную смесь контактируют с выбранной мишенью
при условиях, благоприятных для связывания между мишенью и
членами кандидатной смеси. При этих условиях, взаимодействие
между мишенью и нуклеиновыми кислотами этой кандидатной смеси
могут рассматриваться как образование комплексов нуклеиновая
кислота-мишень между этой мишенью и нуклеиновыми кислотами,
имеющими наиболее сильную аффинность в отношении этой мишени.
3) Эти нуклеиновые кислоты с наивысшей аффинностью в
отношении мишени, отделяют от нуклеиновых кислот с меньшей аффинностью в отношении этой мишени. Поскольку только крайне малое число последовательностей (и, возможно, только одна молекула нуклеиновой кислоты), соответствующих нуклеиновым кислотам с наивысшей аффинностью, существуют в этой кандидатной смеси, желательно обычно установить критерии разделения таким образом, что значительное число нуклеиновых кислот в кандидатной смеси (приблизительно 5-50%) сохраняются во время разделения.
4) Нуклеиновые кислоты, отобранные во время разделения как
имеющие относительно более высокую аффинность в отношении
мишени, амплифицируют затем для создания новой кандидатной
смеси, которая обогащена нуклеиновыми кислотами, имеющими
относительно более высокую аффинность в отношении этой мишени.
5) В результате повторения стадий разделения и
амплификации, описанных выше, новообразованная кандидатная
смесь содержит менее и менее слабо связывающих
последовательностей, и средняя степень аффинности этих
нуклеиновых кислот в отношении мишени будет обычно
увеличиваться. Способ SELEX дает кандидатную смесь, содержащую
одну или малое число уникальных нуклеиновых кислот,
представляющих те последовательности нуклеиновых кислот из
исходной кандидатной смеси, которые укладываются в
специфическую вторичную и третичную структуру, делающую
возможной взаимодействие наивысшей аффинности с молекулой-
мишенью .
[0087] Нуклеиновокислотные лиганды, специфические в отношении CLEC-2, могут быть генерированы выполнением SELEX против коротких пептидов, которые представляют внеклеточный домен этой молекулы, с использованием способов SELEX, как описано, например, в Патенте США № 7087735. Альтернативно, нуклеиновокислотные лиганды, специфические в отношении CLEC-2, могут быть выделены выполнением SELEX на интактных тромбоцитах, мембранных фракциях тромбоцитов, обогащенных в отношении этого белка, на очищенном CLEC-2 или на клеточных линиях, специфически сверхэкспрессирующих рецептор CLEC-2, с
использованием способов SELEX, описанных, например, в Патенте США № 6730482.
[008 8] Дополнительно, способ SELEX может быть направлен на выделение специфических нуклеиновокислотных лигандов CLEC-2 с использованием конкурентных схем элюции аффинности, таких как схемы, описанные в Патенте США № 5780228.
[0089] В некоторых вариантах осуществления,
нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2 связывается с рецептором CLEC-2 при физиологических условиях. Физиологическими условиями обычно называют уровень солей и рН раствора. In vitro, физиологические условия обычно копируются в буфере, включающем в себя 150 мМ NaCl, 2 мМ СаС12, 20 мМ HEPES, при рН приблизительно 7,4. В некоторых вариантах осуществления, используют нативные, обычно неактивированные тромбоциты, описанные выше, для скрининга популяции нуклеиновокислотных лигандов и обеспечивают обогащенную популяцию, которая содержит лиганды, направленные на белки, обнаруживаемые на тромбоцитах. Затем эту обогащенную популяцию используют либо против стабильной клеточной линии, сверхэкспрессирующей желаемый рецептор CLEC-2, либо против клеточной линии, которая была транзиторно трансфицирована этим белком. Вторичный скрининг может выполняться либо с использованием модифицированной процедуры SELEX на выделенных рецепторах из этих клеток или на целых клетках, либо посредством конкурентных исследований лиганда или идентификации действий на внутриклеточных путях передачи сигнала.
[0090] Лиганды могут быть также подвергнуты скринингу на ингибирование агрегации тромбоцитов в анализах функции тромбоцитов, таких как Агрегометрия коэффициента пропускания света, выполняемая в богатой тромбоцитами плазме или препаратах промытых тромбоцитов, или Импеданс Агрегометрия, выполняемая в обогащенной тромбоцитами плазме или цельной крови или промытых тромбоцитах с активацией тромбоцитов родоцитином с последующим окрашиванием маркерами активации тромбоцитов и агрегации, включающими в себя анти-СБ62Р (Р-Селектин), анти-РАС1 (активированный GPIIbllla) или анти-фибриноген. Специфичность
конкретного нуклеиновокислотного лиганда в отношении CLEC-2 может дополнительно распознаваться по способности этого лиганда блокировать события внутриклеточной передачи сигнала, запускаемые известными агонистами данного рецептора. Специфичность конкретного нуклеиновокислотного лиганда в отношении CLEC-2 может дополнительно распознаваться по отсутствию действия на агрегацию тромбоцитов при агрегации, запускаемой агонистом, который активирует рецептор, другой, чем CLEC-2.
[0091] Лиганд, описанный здесь, состоит из
последовательности выделенной нуклеиновой кислоты, которая
может быть ДНК или РНК и которая может быть синтезирована с
использованием модифицированных рибо- или
дезоксирибонуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления, описанных здесь, эта последовательность нуклеиновых кислот записана в виде РНК-последовательности. Подобным образом, в некоторых вариантах осуществления, описанных здесь, в которых нуклеиновокислотный лиганд первоначально идентифицирован в виде ДНК-молекулы, эта последовательность нуклеиновокислотного лиганда записана в виде ДНК-молекулы. Понятно, что последовательность нуклеотидов, представленная в форме текста как ДНК-последовательность, неотъемлемо обеспечивает описание соответствующей РНК-последовательности, в которой тимины (Т) в этой ДНК-последовательности заменены уридинами (U) с получением соответствующей РНК-последовательности нуклеотидов. Подобным образом, понятно, что последовательность нуклеотидов, представленная в форме текста как РНК-последовательность, неотъемлемо обеспечивает описание соответствующей ДНК-последовательности, в которой уридины (U) в этой РНК-последовательности заменены тиминами (Т) с получением соответствующей ДНК-последовательности.
[0092] Аффинность связывания лигандов в отношении мишени может быть определена в виде Kd. Величина этой константы диссоциации может быть определена непосредственно при помощи хорошо известных способов, таких как способы связывания
радиолиганда, описанные в Примере 1.
[0093] В некоторых вариантах осуществления, Ко! связывания этого лиганда с CLEC-2 может находиться в диапазоне от приблизительно 1 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 10 пМ до приблизительно 50 нМ или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 2 0 нМ. В других вариантах осуществления, Ко! связывания лиганда с CLEC-2 является по меньшей мере в 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз или 10 раз меньшей, чем Ко! связывания этого лиганда с неродственным белком или другим сопутствующим материалом в окружающей среде. Этим неродственным белком мог бы быть также белок, имеющий мотив, родственный мотивам, присутствующим в CLEC-2, таким как другой рецептор активации или адгезии тромбоцитов.
[0094] Как будет обсуждаться более подробно ниже, активность связывания этого лиганда, полученная и идентифицированная при помощи способа SELEX, может быть дополнительно модифицирована или усилена с использованием большого разнообразия способов генной инженерии.
[0095] В некоторых вариантах осуществления, этот лиганд взаимодействует с внеклеточным доменом CLEC-2. Этот лиганд может препятствовать связыванию эндогенных лигандов с рецептором CLEC-2. В некоторых вариантах осуществления, этот лиганд может ингибировать внутриклеточную передачу сигнала через рецептор CLEC-2. Этот лиганд может также стабилизировать или разрушать конформацию этого рецептора, например, димерную конформацию, так что этот рецептор имеет уменьшенную способность взаимодействовать с эндогенным лигандом, таким как подопланин. В некоторых вариантах осуществления, этот лиганд может влиять на агрегацию тромбоцитов и/или активацию и/или адгезию тромбоцитов и/или секрецию тромбоцитов.
[0096] Описанные здесь нуклеиновокислотные лиганды могут функционировать в качестве активно обратимых агентов. Они являются агентами или фармацевтически активными молекулами, которые, после введения пациенту, могут непосредственно регулироваться введением второго агента. Как описано более подробно ниже, этот второй агент, называемый здесь модулятором,
может выключать или регулировать фармакологическую активность этого лиганда. В результате, фармакологическая активность этого лиганда может обращаться другими средствами, чем, например, клиренс лекарственного средства.
[0097] Описанные здесь лиганды CLEC-2 являются предпочтительно нуклеиновокислотными лигандами CLEC-2, которые специфически связывают внеклеточный домен (ECD) (аминокислотные остатки Gln58-Pro230; SEQ ID N0:2). Лиганды CLEC-2 отбирали с использованием способа SELEX, описанного более подробно ниже и в Примере 1, затем модифицированы для увеличения стабильности, аффинности в отношении CLEC-2 и/или способности регулировать активность CLEC-2.
[0098] Лиганды, выделенные в соответствии с описанными здесь способами, представлены ниже в Таблицах 1-2, приведенных здесь в Примере 2.
[0099] Как описано здесь, аптамеры, которые связывают CLEC-2, выделяли и секвенировали, как описано в Примерах 1-2, что привело к идентификации 2 0 уникальных последовательностей. Один клон, S2-2 0, идентифицировали как ингибитор высокой аффинности CLEC-2-зависимой агрегации тромбоцитов. Этот клон характеризовали дополнительно генерированием укороченных и/или мутированных версий SELEX-отобранной последовательности, как описано в Примерах 3-5. Анализ вторичной структуры клона S2-2 0 (SEQ ID N0:8 или SEQ ID N0:9), использующий программу, доступную в mfold-сервере (mfold.bioinfo.rpi.edu), предсказал консенсусную структуру, в которой лиганд (аптамер) имеет первый стебель с длиной б п.н., но данные показывают, что длина этого первого стебля может находиться в диапазоне от 5 до 10 п.н. и сохранять высокую аффинность в отношении CLEC-2. Таким образом, этот первый стебель аптамера может находиться в диапазоне от приблизительно 3 п.н. до приблизительно 15 п.н. или от приблизительно 4 п.н. до приблизительно 12 п.н., или от приблизительно 5 п.н. до приблизительно 10 п.н.. Представляется, что этот первый стебель имеет длину приблизительно 3 п.н., 4 п.н., 5 п.н., б п.н., 7 п.н., 8 п.н., 9 п.н., 10 п.н., 11 п.н., 12 п.н., 13 п.н., 14 п.н. или 15
п.н.. Предсказано также, что структура лиганда CLEC-2 имеет первую петлю, имеющую последовательность 5'-GAC-3', хотя анализ мутаций показал толерантность мутаций во втором положении структуры этой первой петли. Таким образом, представляется, что эта первая петля лиганда CLEC-2 содержит консенсусную последовательность 5'-GNC-3', в которой N может быть А, Т, С, G или U. 3' (справа) от этой первой петли находится второй стебель, имеющий длину приблизительно 4 п.н. с неодназначной парой нуклеотидов у основания этого стебля, хотя эта длина может варьироваться от приблизительно 3 п.н. до 7 п.н. или от 4 п.н. до приблизительно б п.н.. 3' (справа) от этого второго стебля находится вторая структура петли с последовательностью 5'-CUCAUAUU-3'. Анализ мутаций показал, что предпочтительной консенсусной последовательностью петли 2 может быть 5'-YUYNNRYU'-3', где Y обозначает пиримидин, R обозначает пурин и N обозначает A, G, С, Т или U. Примерами укороченных лигандов CLEC-2, произведенных из S2-20, являются S2-20 Т10 (SEQ ID N0:22) и RB587 (SEQ ID N0:24).
[0100] Определение консенсусной структуры облегчает конструирование лигандов для идентификации одного или нескольких нуклеотидов, которые могут увеличивать или уменьшать структуру и функцию лиганда. Это позволяет один или несколько раз эффективно идентифицировать и тестировать нуклеотидные добавления, делеции и замены для конкретных структур стебля и петли.
[0101] Знание консенсусной (канонической) вторичной структуры позволяет также избегать модификаций, которые могут быть вредными для структуры и функции лиганда. Например, некоторые модификации могут быть консервативными в этой консенсусной вторичной структуре, такие как 2'-фтор в районе стебля или петли. В этих случаях, удаление 2'-фтора из этих стебля или петли лиганда может приводить к потере активности.
[0102] В одном варианте осуществления, этот лиганд является молекулой нуклеиновой кислоты, отобранной при помощи способа SELEX, и включает в себя укороченные и по существу гомологичные последовательности таких молекул. В применении
здесь, в контексте гомологичных районов, "по существу гомологичная" последовательность является последовательностью, которая образует ту же самую вторичную структуру спариванием оснований Уотсона-Крика в конкретной молекуле. В другом варианте осуществления, лиганд, выбранный с использованием способа SELEX, отбирают из группы, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной или является идентичной SEQ ID N0:5-59, или последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID N0:9-14, 16-22, 24, 33, 37, 38, 42, 44-48 и 55-57. Еще в одном варианте осуществления, этот лиганд является лигандом, который имеет константу диссоциации менее приблизительно 10 нМ или менее приблизительно 5 нМ при измерении in vitro в физиологических условиях.
[0103] Лиганды CLEC-2, описанные здесь, могут быть
молекулами нуклеиновых кислот, которые содержат
последовательность, которая отличается от последовательности S2-2 0 наличием в ней делеции в одном или нескольких положениях нуклеотидов в SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8 или SEQ ID N0:9. Лиганд CLEC-2 может быть получен введением любой комбинации одной или нескольких делеций в SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8 или SEQ ID N0:9.
[0104] Лиганд CLEC-2, описываемый здесь, может содержать последовательность, генерированную укорочением (делецией) одного или нескольких нуклеотидов из 5'-конца и/или 3'-конца SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8 или SEQ ID N0:9. Например, лиганд CLEC-2 может быть последовательностью, генерированной делецией первых (5') 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8 или SEQ ID N0:9. В альтернативном варианте осуществления, последние (3') 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 нуклеотидов делетированы из SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8 или SEQ ID N0:9. Еще в одном варианте осуществления, нуклеотиды в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80, или любая их комбинация делетированы из последовательности SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8 или SEQ ID N0:9. В другом варианте осуществления, эта комбинация делетированных последовательностей состоит из 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов.
[0105] В одном предпочтительном варианте осуществления, этот лиганд CLEC-2 содержит последовательность, которая является по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентичной SEQ ID N0:24. В этом варианте осуществления, лиганд CLEC-2 имеет длину в диапазоне от приблизительно 20 п.н. до 40 п.н., 25 п.н. - 30 п.н. или приблизительно 27 п.н. - 33 п.н. Этот лиганд CLEC-2 имеет вторичную структуру, содержащую первый стебель, первую петлю, содержащую 5'-GNC-3' (где N обозначает G, А, Т, С или U) , второй стебель и вторую петлю, содержащую 5'-CUCAUAUU-3' или 5'-YUYNNRYU-3' (где Y обозначает пиримидин, R обозначает пурин и N обозначает A, G, С, Т или U) . В контексте нуклеиновокислотного лиганда SEQ ID N0:24, гомологичная последовательность может быть обнаружена в любом районе, что позволяет посредством спаривания оснований Уотсона-Крика образовывать одну и ту же вторичную структуру, независимо от идентичности последовательности в этом конкретном районе.
[0106] Лиганд CLEC-2, описанный здесь, функционирует для ингибирования активности молекулы CLEC-2 in vitro и/или in vivo. Другими словами, добавление лиганда CLEC-2 может уменьшать активность CLEC-2 в указанном анализе, сконструированном для измерения активности CLEC-2. Например, лиганд CLEC-2 ингибирует функцию CLEC-2. Лиганд CLEC-2 может функционировать ингибированием CLEC-2-зависимых функций тромбоцитов in vitro и/или in vivo.
Модуляторы нуклеиновокислотных лигандов CLEC-2
[0107] В некоторых вариантах осуществления,
нуклеиновокислотные лиганды к CLEC-2 являются обратимыми. В одном аспекте, обеспечен способ модуляции активности лиганда к CLEC-2 введением модулятора лиганда к CLEC-2 хозяину, которому
был введен нуклеиновокислотный лиганд.
[0108] Модуляторы могут включать в себя любой фармацевтически приемлемый агент, который может связываться с нуклеиновокислотным лигандом и модифицировать взаимодействие между этим лигандом и его молекулой-мишенью (например, модификацией структуры этого нуклеиновокислотного лиганда) желаемым образом, или который деградирует, метаболизирует, расщепляет или иным образом химически изменяет нуклеиновокислотный лиганд, для модификации его биологического действия.
[0109] Модуляторы нуклеиновых кислот лигандов CLEC-2,
описанные здесь, сконструированы на основе стандартных правил
спаривания оснований Уотсона-Крика (см. Пример б) . Синтезируют
модуляторные олигонуклеотиды варьирующей длины, чтобы иметь
последовательности, комплементарные лиганду CLEC-2, который,
как было показано, ингибирует функцию CLEC-2. Затем каждый из
этих синтезированных модуляторных олигонуклеотидов тестируют на
его способность связываться с лигандом CLEC-2, например,
посредством анализа смещения подвижности в геле. Затем важно
тестировать, способны или не способны модуляторы, которые
связывают лиганд CLEC-2, также обращать активность лиганда
CLEC-2. Как описано более подробно ниже и в Разделе Примеров,
активность обращения конкретного модулятора может быть
тестирована с использованием анализов, которые оценивают
антитромбоцитарную активность лигандов CLEC-2. Анализы,
выполняемые для идентификации лигандов CLEC-2, которые
ингибируют CLEC-2-опосредуемую агрегацию тромбоцитов, выполняли
также в присутствии модуляторов, которые, как было показано,
связываются с лигандом CLEC-2. Модуляторы могут добавляться к
смеси для анализа до, вместе или после добавления лиганда CLEC-
2. Активность обращения модулятора может быть
продемонстрирована, например, исследованиями агрегации промытых тромбоцитов, анализами индуцированной родоцитином или подопланином агрегации тромбоцитов в цельной крови, богатой тромбоцитами плазме или в препаратах промытых тромбоцитов, анализами проточной цитометрии, выполняемыми с родоцитином или
подопланином, для оценивания экспрессии Р-селектина в присутствии лиганда CLEC-2, и in vitro анализами адгезии тромбоцитов на основе протекания.
[ОНО] В одном предпочтительном варианте осуществления, модулятором нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 является последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере частично комплементарна последовательности нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2. Как показано на Фиг. 8 (и см. Таблицу 4), модуляторы лиганда CLEC-2 RB587 конструировали для гибридизации с разными районами RB58 7. RB581, который комплементарен 16 основаниям 3' первичной последовательности RB587, был эффективен в уменьшении связывания RB587 с CLEC-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда CLEC-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен району лиганда CLEC-2 или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда CLEC-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2, включающим в себя петлю 2, стебель 2 и стебель 1, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 14-31 или 14-26 или 16-31 или 18-31 или 21-31 или 16-26 или 16-29 лиганда CLEC-2 RB587 (SEQ ID N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом CLEC-2 приводит к уменьшению связывания лиганда CLEC-2 с полипептидом CLEC-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени CLEC-2 посредством лиганда CLEC-2.
[0111] В одном предпочтительном варианте осуществления, этот модулятор нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2. Как показано на Фиг. 8 (и см. Таблицу 4), модуляторы лиганда RB587 CLEC-2 сконструированы для гибридизации с
различными районами RB587. RB582, который является комплементарным внутренним 16 основаниям первичной последовательности RB587, был эффективным в уменьшении связывания RB587 с CLEC-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда CLEC-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен району лиганда CLEC-2 или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда CLEC-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2, включающим в себя петлю 2, стебель 2 и часть стебля 1, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 14-31 или 14-29 или 14-27 или 16-29 или 16-27 или 19-29 или 21-31 или 21-29 лиганда CLEC-2 RB587 (SEQ ID N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом CLEC-2 приводит к уменьшению связывания лиганда CLEC-2 с полипептидом CLEC-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени CLEC-2 посредством лиганда CLEC-2 .
[0112] В одном предпочтительном варианте осуществления, этот модулятор нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2. Как показано на Фиг. 8 (и см. Таблицу 4), модуляторы лиганда RB587 CLEC-2 сконструированы для гибридизации с различными районами RB587. RB583, который является комплементарным внутренним 15 основаниям первичной последовательности RB587, был эффективным в уменьшении связывания RB587 с CLEC-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда CLEC-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен району лиганда
CLEC-2 или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда CLEC-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2, включающим в себя петлю 1, стебель 2 и петлю 2, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 7-21 или 9-21 или 9-17 или 7-19 или 7-17 или 7-14 лиганда RB587 CLEC-2 (SEQ ID N0:24) лиганда RB587 CLEC-2 (SEQ ID N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом CLEC-2 приводит к уменьшению связывания лиганда CLEC-2 с полипептидом CLEC-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени CLEC-2 посредством лиганда CLEC-2 .
[0113] В одном предпочтительном варианте осуществления, этот модулятор нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиновокислотного лиганда RB587 CLEC-2. Как показано на Фиг. 8 (и см. Таблицу 4), модуляторы лиганда RB587 CLEC-2 сконструированы для гибридизации с различными районами RB587. RB584, который является комплементарным внутренним 16 основаниям первичной последовательности RB587, был эффективным в уменьшении связывания RB587 с CLEC-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда CLEC-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда CLEC-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2, включающим в себя часть стебля 1, петлю 1, стебель 2 и часть петли 2, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 1-21 или 1-19 или 1-14 или 4-14 или 4-19 или 4-21 или 6-21 или 6-14
лиганда CLEC-2 RB587 (SEQ ID N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом CLEC-2 приводит к уменьшению связывания лиганда CLEC-2 с полипептидом CLEC-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени CLEC-2 посредством лиганда CLEC-2.
[0114] В одном предпочтительном варианте осуществления, этот модулятор нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2. Как показано на Фиг. 8 (и см. Таблицу 4), модуляторы лиганда RB587 CLEC-2 сконструированы для гибридизации с различными районами RB587. RB585, который является комплементарным 18 основаниям 5' первичной последовательности RB587, был эффективным в уменьшении связывания RB587 с CLEC-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда CLEC-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда CLEC-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2, включающим в себя стебель 1, петлю 1, стебель 2 и часть петли 2, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 1-21 или 1-18 или 1-16 или 1-14 или 4-21 или 4-18 или 4-14 или 6-14 или 6-18 или 6-21 лиганда CLEC-2 RB587 (SEQ ID N0:24). Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом CLEC-2 приводит к уменьшению связывания лиганда CLEC-2 с полипептидом CLEC-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени CLEC-2 посредством лиганда CLEC-2.
[0115] В одном предпочтительном варианте осуществления, этот модулятор нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 является нуклеиновой кислотой, которая является по меньшей мере частично комплементарной последовательности нуклеиновокислотного лиганда
CLEC-2. Как показано на Фиг. 8 (и см. Таблицу 4), модуляторы лиганда RB587 CLEC-2 сконструированы для гибридизации с различными районами RB587. RB586, который является комплементарным 13 основаниям 5' первичной последовательности RB587, был эффективным в уменьшении связывания RB587 с CLEC-2, как определено нейтрализацией ингибиторной активности лиганда CLEC-2 в анализах агрегации тромбоцитов и как определено анализами смещения подвижности в геле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, здесь обеспечен модулятор, который комплементарен району лиганда CLEC-2 или способен гибридизоваться с тем же самым районом лиганда CLEC-2. Вследствие этого, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2, включающим в себя стебель 1, петлю 1 и стебель 2, или его частью. В качестве одного конкретного примера, модулятор, описанный здесь, способен гибридизоваться с районом, соответствующим основаниям в положениях приблизительно 1-13 или 1-10 или 6-13 лиганда CLEC-2 RB587 (SEQ ID N0:24) . Кроме того, специфическое взаимодействие этого модулятора с лигандом CLEC-2 приводит к уменьшению связывания лиганда CLEC-2 с полипептидом CLEC-2. Кроме того, этот модулятор может ингибировать или обращать функцию белка-мишени CLEC-2 посредством лиганда CLEC-2 .
[0116] Альтернативные примеры модуляторов включают в себя: олигонуклеотиды, или их аналоги, которые являются комплементарными по меньшей мере части последовательности нуклеиновокислотного лиганда (в том числе рибозимы или ДНК-зимы) . Другие примеры включают в себя пептиднуклеиновые кислоты (PNA), морфолинонуклеиновые кислоты (MNA) или "закрытые" нуклеиновые кислоты (LNA); связывающие нуклеиновую кислоту белки или пептиды; олигосахариды; малые молекулы; или связывающие нуклеиновую кислоту полимеры, липиды, наночастицы или модуляторы на основе микросфер.
[0117] Модуляторы могут быть сконструированы таким образом, что они могут связывать конкретный лиганд с высокой степенью специфичности и желаемой степенью аффинности.
Модуляторы могут быть также сконструированы таким образом, что, после связывания, структура этого лиганда является модифицированной либо в более, либо в менее активную форму. Например, модулятор может быть сконструирован таким образом, что после связывания с нуклеиновокислотным лигандом-мишенью вторичная и/или третичная структура этого лиганда является измененной, посредством чего этот лиганд не может более связываться с его молекулой-мишенью или связывается с его молекулой-мишенью с меньшей аффинностью. Альтернативно, модулятор может быть сконструирован таким образом, что, после связывания, трехмерная структура этого лиганда изменяется таким образом, что аффинность этого лиганда в отношении его молекулы-мишени повышается. То-есть, модулятор может быть сконструирован таким образом, что, после связывания, некоторый структурный мотив модифицируется таким образом, что аффинность этого лиганда увеличивается. В другом варианте осуществления, пара лиганд/модулятор сконструирована таким образом, что связывание этого модулятора с молекулой нуклеиновокислотного лиганда, которая не может связываться с представляющей интерес мишенью, может приводить к продуцированию структурного мотива в этом лиганде, который посредством этого позволяет лиганду связываться с его молекулой-мишенью.
[0118] Модуляторы могут быть также сконструированы для неспецифического связывания с конкретным нуклеиновокислотным лигандом или набором нуклеиновокислотных лигандов с достаточной аффинностью для образования комплекса. Такие модуляторы могут быть в основном ассоциированы с нуклеиновыми кислотами посредством заряд-зарядных взаимодействий. Такие модуляторы могут также одновременно связывать более одного нуклеиновокислотного лиганда. Модулятор может быть сконструирован таким образом, что, после связывания с одним или несколькими нуклеиновокислотными лигандами, структура нуклеиновокислотного лиганда не является значимо измененной относительно ее активной формы, а, скорее, этот модулятор маскирует или стерически предотвращает ассоциацию этого нуклеиновокислотного лиганда с его молекулой-мишенью.
[0119] Нуклеотидные модуляторы могут иметь любую длину, что делает возможным эффективное связывание с молекулой-лигандом. Например, олигонуклеотидные модуляторы могут находиться в диапазоне длин от приблизительно 10 нуклеотидов (нт) до приблизительно 30 нт, от приблизительно 10 нт до приблизительно 2 0 нт или от приблизительно 15 нт. Эти нуклеотидные модуляторы могут иметь длину 8 нт, 9 нт, 10 нт, 11 нт, 12 нт, 13 нт, 14 нт, 15 нт, 16 нт, 17 нт, 18 нт, 19 нт, 20 нт, 21 нт, 22 нт, 23 нт, 24 нт, 25 нт, 26 нт, 27 нт, 28 нт, 29 нт или 3 0 нт. Специалист с обычной квалификацией в данной области может также представить себе нуклеотидные модуляторы, имеющие длины, большие 3 0 нт.
[0120] Нуклеиновокислотный лиганд, описанный здесь, имеет
активную третичную структуру, на которую может влиять
образование подходящей стабильной вторичной структуры. Таким
образом, хотя механизм образования дуплекса между
комплементарным олигонуклеотидным модулятором и
нуклеиновокислотным лигандом сходен с образованием дуплекса между двумя короткими линейными олигорибонуклеотидами, как правила конструирования таких взаимодействий, так и кинетика образования такого продукта могут находиться под влиянием межмолекулярной структуры лиганда.
[0121] Стадия нуклеации первоначального образования пар
нуклеотидов между нуклеиновокислотным лигандом и
олигонуклеотидным модулятором играет важную роль в образовании конечного стабильного дуплекса, и скорость этой стадии в сильной степени повышается нацеливанием олигонуклеотидного модулятора на одноцепочечные петли и/или одноцепочечные 3'- или 5'-хвосты, присутствующие в нуклеиновокислотном лиганде. Для появления оптимального образования межмолекулярного дуплекса, эта свободная энергия является идеально благоприятной для образования межмолекулярного дуплекса относительно образования существующих внутримолекулярных дуплексов в нуклеиновокислотном лиганде-мишени.
[0122] Описанные здесь модуляторы являются обычно олигонуклеотидами, которые содержат последовательность,
комплементарную по меньшей мере части последовательности
нуклеиновокислотного-лиганда-мишени. Например, модуляторный
олигонуклеотид может содержать последовательность,
комплементарную приблизительно б нт (нуклеотидам) - 25 нт, 8 нт 2 0 нт или 10 нт - 15 нт лиганда-мишени. Длина этого модуляторного олигонуклеотида может быть легко оптимизирована с использованием способов, описанных здесь и известных лицам с обычной квалификацией в данной области, с учетом лиганда-мишени и желаемого эффекта. Этот олигонуклеотид может быть произведен с нуклеотидами, несущими D- или L-стереохимию или их смеси. Природно-встречающиеся нуклеозиды имеют D-конфигурацию.
[0123] Хотя эти олигонуклеотидные модуляторы включают в себя последовательность, комплементарную по меньшей мере части нуклеиновокислотного лиганда, абсолютная комплементарность не требуется. Последовательность, "комплементарная по меньшей мере части нуклеиновокислотного лиганда," на которую здесь делается ссылка, является последовательностью, имеющей достаточную комплементарность, чтобы иметь способность гибридизоваться с нуклеиновокислотным лигандом. Эта способность гибридизоваться может зависеть как от степени комплементарности, так и длины этой нуклеиновой кислоты. Обычно, чем больше гибридизующийся олигонуклеотид, тем больше ошибочных спариваний оснований с лигандом-мишенью он может содержать и все еще образовывать стабильный дуплекс (или триплекс в случае его наличия). Специалист с квалификацией в данной области может получить приемлемую степень ошибочных спариваний с использованием стандартных процедур для определения точки плавления гибридизованного комплекса. Эти олигонуклеотиды могут быть одноцепочечными ДНК или РНК или химерными смесями или их производными или модифицированными версиями.
[0124] Модуляторы могут включать в себя модификации как в нуклеиновокислотном скелете, так и в структуре индивидуальных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления, модулятор является нуклеиновой кислотой, комплементарной по меньшей мере одному району петли в этом лиганде. В других вариантах осуществления, модулятор является нуклеиновой
кислотой, комплементарной по меньшей мере одному району стебля
в этом лиганде. В других вариантах осуществления, этот
модулятор является нуклеиновой кислотой, комплементарной по
меньшей мере одному району петли и одному району соседнего
стебля. В некоторых вариантах осуществления, модулятор является
олигонуклеотидом, имеющим по меньшей мере одну
последовательность, которая гибридизуется при физиологических условиях с частью этого лиганда. В зависимости от желаемой функции модулятора, этот модулятор может быть сконструирован для разрушения или стабилизации вторичной и/или третичной структуры нуклеиновокислотного лиганда.
[0125] В некоторых вариантах осуществления, модулятор сконструирован для связывания с "суицидным положением" на этом лиганде и тем самым разрушает последовательность этого лиганда. Одним суицидным положением является одноцепочечная часть лиганда, чувствительная к ферментативному расщеплению. В одном примерном варианте осуществления, это суицидное положение становится одноцепочечным и лабильным после связывания этого модулятора с лигандом, и может усиливать расщепление этого лиганда ферментами в кровотоке, такими как эндонуклеазы крови, или эндонуклеазы печени. В некоторых вариантах осуществления, этот модулятор связывается с лигандом, после чего этот лиганд не может более взаимодействовать с его мишенью.
[0126] В некоторых вариантах осуществления,
последовательность модулятора содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, например, 2'-0-метил- и 2'-фтор-модификацию, которая может включать в себя 2'-О-метилцитозин, 2'-О-метилуридин, 2'-О-метиладенозин, 2'-О-метилгуанозин, 2'-фторцидин или 2'-фторуридин.
[0127] Различные стратегии могут быть использованы для
определения оптимального сайта в нуклеиновокислотном лиганде
для связывания олигонуклеотидным модулятором. Может быть
использована эмпирическая стратегия, в которой комплементарные
олигонуклеотиды "блуждают" вокруг нуклеиновокислотного лиганда.
В соответствии с этим подходом, могут быть использованы
олигонуклеотиды (например, 2'-0-метил- или 2'-
фторолигонуклеотиды с длиной приблизительно 15 нуклеотидов, которые ступенчато с различием приблизительно 5 нуклеотидов находятся на этом лиганде (например, олигонуклеотиды, комплементарные 1-15, 6-20, 11-25 и т.д. лигандам). Эмпирическая стратегия может быть особенно эффективной, так как действие третичной структуры нуклеиновокислотного лиганда на эффективность гибридизации является трудно предсказуемым.
[0128] Такие анализы, как анализы, описанные в Примере б и
8, могут быть использованы для оценивания способности различных
олигонуклеотидов гибридизоваться со специфическим
нуклеиновокислотным лигандом, с особым вниманием в отношении молярного избытка олигонуклеотида, требуемого для достижения полного связывания нуклеиновокислотного лиганда. Способность различных олигонуклеотидных модуляторов увеличивать скорость диссоциации нуклеиновокислотного лиганда из его молекулы-мишени, или ассоциации с его молекулой-мишенью может быть также определена проведением стандартных кинетических исследований с использованием, например, анализов, BIACORE. Олигонуклеотидные модуляторы могут быть выбраны таким образом, что необходим 550-кратный молярный избыток олигонуклеотида, или менее, для модификации желаемым образом взаимодействия между этим лигандом и его молекулой-мишенью.
[0129] Альтернативно, этот нацеленный нуклеиновокислотный лиганд может быть модифицирован таким образом, что он включает в себя одноцепочечный "хвост" (3' или 5') для усиления ассоциации с олигонуклеотидным модулятором. Подходящие "хвосты" могут содержать 1-20 нуклеотидов, 1-10 нуклеотидов, 1-5 нуклеотидов или 3-5 нуклеотидов. "Хвосты" могут быть также модифицированы (например, 2'-0-метил- и 2'-фтормодификацией которая может включать в себя, 2'-О-метилцитозин, 2'-0-метилуридин, 2'-О-метиладенозин, 2'-О-метилгуанозин, 2'-фторцитидин или 2'-фторуридин). Имеющие "хвосты" лиганды могут быть тестированы в анализах связывания и биоанализах (например, как описано в Примерах, приведенных ниже) для подтверждения, что добавление одноцепочечного "хвоста" не разрушает активную структуру нуклеиновокислотного лиганда. Ряд олигонуклеотидов
(например, 2'-О-метилолигонуклеотидов), которые могут
образовать, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пар оснований с последовательностью "хвоста", могут быть сконструированы и тестированы на их способность ассоциироваться только с одним имеющим "хвост" лигандом, а также на их способность увеличивать скорость диссоциации этого лиганда из молекулы-мишени или ассоциации этого лиганда с его молекулой-мишенью. Контроли смешанных последовательностей могут быть использованы для подтверждения, что эффекты были обусловлены образованием дуплекса и не являются неспецифическими эффектами.
[0130] В другом варианте осуществления, этим модулятором является рибозим или ДНК-зим. Ферментативные нуклеиновые кислоты действуют сначала связыванием с РНК- или ДНК-мишенью. Такое связывание осуществляется через мишень-связывающую часть ферментативной нуклеиновой кислоты, которая удерживается в тесной связи с ферментативной частью молекулы, которая действует, расщепляя РНК-мишень. Таким образом, эта ферментативная нуклеиновая кислота сначала распознает и затем связывает РНК- или ДНК-мишень через комплементарное спаривание оснований и после связывания с правильным сайтом действует ферментативно для разрезания РНК-мишени, тем самым позволяя инактивацию РНК-лигандов. Имеются по меньшей мере пять классов рибозимов, каждый из которых проявляет различный тип специфичности. Например, Интроны Группы I имеют размер приблизительно 300-> 1000 нуклеотидов и требуют присутствия U в последовательности-мишени сразу слева (5') от сайта расщепления и связывает 4-6 нуклеотидов в 5'-стороне (слева) от этого сайта расщепления. Другим классом является РНК РНКазы Р (РНК Ml), которые имеют размер приблизительно 290-400 нуклеотидов. Третим классом являются Hammerhead Ribozymes ("Молотоголовые" Рибозимы), которые имеют размер приблизительно 30-40 нуклеотидов. Они требуют последовательности-мишени UH (где Н не является G) непосредственно слева (5') от сайта расщепления и связывают варьирующееся количество нуклеотидов на обеих сторонах от сайта расщепления. Четвертым классом являются Hairpin Ribozymes (Шпилечные Рибозимы), которые имеют размер
приблизительно 50 нуклеотидов. Они требуют последовательность-мишень GUC непосредственно справа (3') от сайта расщепления и связывают 4 нуклеотида на 5'-стороне (слева) от этого сайта расщепления и варьирующееся количество на 3'-стороне от этого сайта расщепления. Пятой группой является Hepatitis Delta Virus
(HDV) Ribozymes (Рибозимы вируса гепатита дельта) которые имеют
размер приблизительно 60 нуклеотидов. ДНК-зимы являются
одноцепочечными и расщепляют как РНК, так и ДНК. Была
предложена общая модель для ДНК-зима, и она известна как модель
"10-23". ДНК-зимы согласно модели "10-23" имеют каталитический
домен из 15 дезоксирибонуклеотидов, фланкированный двумя
доменами распознавания субстрата из семи-девяти
дезоксирибонуклеотидов, каждый.
[0131] В другом варианте осуществления, модулятор сам является нуклеиновокислотным лигандом. В этом варианте осуществления, генерируют первый лиганд, который связывается с желаемой терапевтической мишенью. Во второй стадии, второй лиганд, который связывается с первым лигандом, генерируют с использованием способа SELEX, описанного здесь, или другого способа и модулируют взаимодействие между терапевтическим лигандом и мишенью. В одном варианте осуществления, этот второй лиганд дезактивирует эффект первого лиганда.
[0132] В другом примерном варианте осуществления этим модулятором является модулятор на основе PNA (ПНК), MNA (МНК), LNA (ЗНК) или РСО. Нуклеооснования этих олигонуклеотидных модуляторов могут быть соединены через связи между нуклеооснованиями, например, пептидильными связями (как в случае пептиднуклеиновых кислот (PNA); Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497 и U.S. Pat. No. 5539082) морфолино-связями
(Qin et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10, 11 (2000); Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 187 (1997); Summerton et al. , Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 63
(1997); Taylor et al., J Biol Chem. 271, 17445 (1996); Partridge et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 169
(1996)), или любой другой природной или модифицированной связью. Этими олигонуклеооснованиями могут быть также
"закрытые" нуклеиновые кислоты (LNAs). Nielsen et al., J Biomol Struct Dyn 17, 175 (1999); Petersen et al. , J Mol Recognit 13, 44 (2000); Nielsen et al., Bioconjug Chem 11, 228 (2000).
[0133] PNA (ПНК) являются соединениями, которые являются аналогами олигонуклеотидов, но различаются в их составе. В ПНК, дезоксирибозный скелет молекулы олигонуклеотида заменен пептидным скелетом. Каждая субъединица этого пептидного скелета присоединена к природно-встречающемуся или не встречающемуся в природе нуклеооснованию. ПНК часто имеет ахиральный полиамидный скелет молекулы, состоящий из N-(2-аминоэтил)глициновых звеньев. Пуриновые или пиримидиновые основания связаны с каждым звеном через метиленкарбонильный линкер (1-3) для нацеливания на комплементарную нуклеиновую кислоту. ПНК связывается с комплементарной РНК или ДНК в параллельной или антипараллельной ориентации в соответствии с правилами спаривания оснований Уотсона-Крика. Этот незаряженный характер PNA-олигомеров усиливает стабильность гибридных дуплексов ПНК/ДНК(РНК) в сравнении с природными гомодуплексами.
[0134] Морфолинонуклеиновые кислоты названы так, поскольку
они собраны из морфолино-субъединиц, каждая из которых содержит
одно из четырех генетических оснований (аденозин, цитозин,
гуанин и тимин), связанных с б-членным морфолиновым кольцом.
Субъединицы этих четырех типов субъединиц соединены в
специфическом порядке неионными фосфордиамидатными
межсубъединичными связями с образованием морфолино-олиго.
[0135] LNA (ЗНК) является классом ДНК-аналогов, которые имеют некоторые признаки, которые делают их превосходными кандидатами для модуляторов. Мономеры LNA (ЗНК) являются бициклическими соединениями, структурно сходными с РНК-мономерами. LNA (ЗНК) имеет большинство химических свойств ДНК и РНК, она является водорастворимой, может разделяться гель-электрофорезом, осаждается этанолом и т.д. (Tetrahedron, 54, 3607-3630 (1998)). Однако, введение мономеров LNA либо в ДНК-, либо в РНК-олиго приводит к высокой тепловой стабильности дуплексов с комплементарной ДНК или РНК, хотя, в то же самое время, подчиняющихся правилам спаривания оснований Уотсона-
Крика.
[0136] Псевдоциклические олигонуклеооснования (РСО) могут быть также использованы в качестве модулятора (см. Патент США № 6383752) . РСО содержат два олигонуклеотидных сегмента, соединенных через их З'-З' или 5'-5'-концы. Один из сегментов ("функциональный сегмент") РСО имеет некоторую функциональность (например, комплементарность относительно РНК-мишени). Другой сегмент ("защитный сегмент") является комплементарным 3'- или 5'-концевой стороне этого функционального сегмента (в зависимости от конца, посредством которого он соединен с функциональным сегментом). В результате комплементарности между функциональным и защитным сегментами, РСО образует внутримолекулярные псевдоциклические структуры в отсутствие нуклеиновых кислот-мишеней (например, РНК) . РСО являются более стабильными, чем общепринятые олигонуклеотиды вследствие присутствия связей З'-З' или 5'-5' и образования внутримолекулярных псевдоциклических структур. Исследования фармакокинетики, тканевого распределения и стабильности в мышах предполагают, что РСО имеют более высокую стабильность in vivo, чем эти характеристики PS-олигонуклеотидов в целом, и фармакинетику и профили тканевого распределения, сходные с этими характеристиками PS-олигонуклеотидов в целом, но быструю элиминацию из выбранных тканей. При подходящем связывании молекул флуорофора и гасителя с РСО данного изобретения эта молекула будет флуоресцировать, когда она находится в линейной конфигурации, но эта флуоресценция гасится в циклической конформации. Этот признак может быть использован для скрининга РСО в качестве потенциальных модуляторов.
[0137] В другом примерном варианте осуществления, эти модуляторы являются модуляторами на основе пептидов. Модуляторы на основе пептидов нуклеиновокислотных лигандов представляют альтернативный молекулярный класс модуляторов относительно олигонуклеотидов или их аналогов. Этот класс модуляторов особенно применим, если достаточно активные олигонуклеотидные модуляторы нуклеиновокислотного лиганда-мишени не могут быть выделены вследствие отсутствия достаточного количества
одноцепочечных районов для усиления нуклеации между этой
мишенью и олигонуклеотидным модулятором. Кроме того, пептидные
модуляторы обеспечивают другую биодоступность и
фармакокинетику, чем олигонуклеотидные модуляторы. В одном примерном варианте осуществления, этим модулятором является протамин (Oney et al., 2009, Nat. Med. 15:1224-1228). Протамины растворимы в воде, не коагулируются нагреванием и содержат аргинин, аланин и серии (большинство содержат также пролин и валин и многие содержат глицин и изолейцин). Модуляторы включают в себя также варианты протамина (см., например, Wakefield et al, J. Surg. Res. 63:280 (1196)) и модифицированные формы протамина, в том числе описанные в Публикации США № 20040121443. Другие модуляторы включают в себя фрагменты протамина, такие как фрагменты протамина, описанные в Патенте США № 6624141 и Публикации США № No. 20050101532. Модуляторы включают в себя также, в основном, пептиды, которые модулирует активность гепарина, другие глюкозаминогликаны или протеогликаны (см., например, Патент США № 59197 61) . В одном примерном варианте осуществления, модуляторы являются пептидами, которые содержат катионные NH-группы, позволяющие стабилизировать заряд-зарядные взаимодействия, такие как поли-L-лизин и поли-Ъ-орнитин.
[0138] Доступны некоторые стратегии для выделения пептидов, способных связываться с нуклеиновокислотным лигандом-мишенью и модулировать активность нуклеиновокислотного лиганда-мишени. Например, были описаны комбинаторные библиотеки кодируемых пептидов на гранулах, и было продемонстрировано, что они содержат пептиды, способные связывать вирусные РНК-последовательности и разрушать взаимодействие между вирусной РНК и вирусном регуляторным белком, который специфически связывает указанную РНК (Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1999, 96:12997). С использованием таких библиотек модуляторы нуклеиновокислотных лигандов могут быть выделены присоединением метки к нуклеиновокислотному лиганду-мишени и инкубированием вместе этой меченой мишени и иммобилизованной на гранулах пептидной библиотеки в условиях, при которых
связывание между некоторыми членами этой библиотек и нуклеиновой кислотой является предпочтительным. Связывание нуклеиновокислотного лиганда со специфическим пептидом на этой грануле заставляет эту гранулу быть "окрашенной" указанной меткой на нуклеиновокислотном лиганде и, следовательно, облегчать идентификацию пептидов, способных связывать мишень, простым выделением этой гранулы. Прямое взаимодействие между пептидами, выделенными такими способами скрининга, и нуклеиновокислотным лигандом-мишенью может быть подтверждено и определено количественно с использованием любого числа анализов связывания, описанных для идентификации модуляторов нуклеиновокислотных лигандов. Способность указанных пептидов модулировать нуклеиновокислотный лиганд-мишень может быть подтверждена подходящими биоанализами.
[0139] В некоторых вариантах осуществления, модулятором является белок. Например, в некоторых вариантах осуществления, нуклеиновокислотный лиганд связан с молекулой биотина. В этих случаях, стрептавидин или авидин вводят для связывания с этим лигандом и обращения эффектов этого лиганда (см. Savi et. al. J Thrombosis and Haemostasis, 6: 1697-1706). Авидин является тетрамерным белком, продуцируемым в яйцеводах птиц, пресмыкающихся и земноводных, который отлагается в белках их яиц. Стрептавидин является тетрамерным белком, очищенным из бактерии Streptomyces avidinii. Этот тетрамерный белок содержит четыре идентичные субединицы (гомотетрамер), каждая из которых может связываться с биотином (Витамином В7, витамином Н) с высокой степенью аффинности и специфичности. Белковый модулятор нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 может быть растворимой частью домена CLEC-2, который связан нуклеиновокислотным лигандом CLEC-2. Например, ECD или его фрагмент полипептида CLEC-2 может конкурировать с нуклеиновокислотным лигандом CLEC-2 за связывание с клеточно-связанным или нативным CLEC-2 для обращения связывания нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 с нативной молекулой CLEC-2.
[0140] В одном дополнительном варианте осуществления, модуляторы являются модуляторами на основе олигосахарида.
Олигосахариды могут взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Например, антибиотические аминогликозиды являются продуктами видов Streptomyces и взаимодействуют с разнообразным множеством молекул РНК, таких как различные рибозимы, РНК-компоненты рибосом и последовательности TAR и RRE ВИЧ-1. Таким образом, олигосахариды могут связываться с нуклеиновыми кислотами и могут быть использованы для модуляции активности нуклеиновокислотных лигандов.
[0141] В другом варианте осуществления, модулятор является модулятором на основе малой молекулы. Малая молекула, которая интеркалируется между лигандом и мишенью или иным образом разрушает или модифицирует связывание между этим лигандом и мишенью, может быть также использована в качестве терапевтического регулятора. Такие малые молекулы могут быть идентифицированы скринингом кандидатов в анализе, который измеряет изменения связывания между лигандом и мишенью с малой молекулой и без малой молекулы, или с использованием анализа in vivo или in vitro, который измеряет различие в биологическом действии этого лиганда в отношении этой мишени с малой молекулой или без малой молекулы. После идентификации малой молекулы, которая проявляет желаемое действие, могут быть использованы способы, такие как комбинаторные подходы для оптимизации этой химической структуры для желаемого регуляторного действия.
[0142] Еще в одном примерном варианте осуществления, этот
модулятор является связывающим нуклеиновую кислоту полимером,
липидом, наночастицей или микросферами. В дополнительных
неограничивающих примерах, этот модулятор может быть выбран из
группы, состоящей из: 1,2-диолеоил-зп-глицеро-З-этилфосфохолина
(EDOPC); дилауроилэтилфосфатидилхолина (EDLPC); EDLPC/EDOPC;
содержащих пиридиний поверхностно-активных веществ;
диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE); (±)-N-(3-аминопропил)-
N,Ы-диметил-2,3-бис(додецилокси)-1-пропанаминийбромида (GAP-
DLRIE) плюс нейтрального ко-липида
диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) (GAP-DLRIE/DOPE); (±)-N,N-диметил-N-[2-(сперминкарбоксамидо)этил]-2,3-бис(диолеилокси-1
пропаниминийпентагидрохлорида (DOSPA);
дилауроилэтилфосфатидилхолина (EDLPC);
этилдимиристоилфосфатидилхолина (EDMPC); (±)-N,N,N-триметил-
2,3-бис(г-октадец-9-енлилокси)-l-пропанаминийхлорида (DOTAP);
(±)-N-2-(2-гидроксиэтил)-N,Ы-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-
пропанаминийбромида (DMRIE); (±)-N,N,Ы-триметил-2,3-бис(z-
октадец-9-енилокси)-1-пропанаминийхлорида (DOTMA); 5-
карбоксиспермилглициндиоктадециламида (DOGS);
дипальмитоилфосфатидилэтаноламин-5-карбоксиспермиламида
(DPPES); 1,З-диолеоилокси-2-(б-карбоксиспермил)пропиламида
(DOSPER); тетраметилтетрапальмитоилспермина (TMTPS
тетраметилтетраолеилспермина (TMTOS
тетраметилтетралаурилспермина (TMTLS
тетраметилтетрамиристилспермина (TMTMS
тетраметилдиолеилспермина (TMDOS);
дифитаноилфосфатидилэтаноламина (DPhPE); и (±)-N-(3-
аминопропил)-N,Ы-диметил-2,3-бис(додецилокси)-1-пропанаминийбромида (GAP-DLRIE).
[0143] спирта); акрилового или метакрилового полимера;
Newkome дендримера; полипропилена;
диметилдиоктадециламмонийбромида (DAB);
цетилтриметиламмонийбромида (СТАВ); альбумина; обработанного
кислотой желатина; полилизина; полиорнитина; полиаргинина;
ДЕАЕ-целлюлозы; ДЕАЕ-декстрана и поли(Ы,Ы-
диметиламиноэтилметакрилата и полипропиламина (РОРАМ).
[0144] В одном варианте осуществления, этот модулятор выбран из хитозана и производных хитозана. Производные хитозана включают в себя водорастворимые наночастицы хитозана (такие как описанные в Патенте США № 6475995; Заявке на патент США № 2006/0013885; Limpeanchob et al. , (2006) Efficacy and Toxicity of Amphotericin B-Chitosan Nanoparticles; Nareusan University Journal 14(2) :27-34) . Вследствие поликатионного характера хитозанового полимера (по существу очень большого полиаминного полимера, состоящего из повторяющихся мономеров глюкозамина), хитозан может быть использован для агрегации и/или инкапсулирования лигандов в полиэлектролитный комплекс in vivo
после инъекции в хозяина. Это основано частично на взаимодействиях первичных аминов, обнаруживаемых на хитозане, и фосфодиэфирного скелета этого лиганда.
[0145] В других вариантах осуществления, модулятор выбран
из группы, состоящей из 1,5-диметил-1,5-
диазаундекаметиленполиметобромида; блок-сополимеров
полиоксиэтилена/полиоксипропилена; поли-Ъ-лизина;
полиамидоамина (РАМАМ); р-циклодекстринсодержащего поликатиона
(CDP); р-циклодекстринсодержащего поликатиона
(имидазолсодержащего варианта) (CDP-Im); полифосфорамидатного полимера (8 кДа, 30 кДА) (PPA-DPA 8 к, PPA-DPA 30 к); полибрена; спермина; РЕ6-блок--РЪЪ-дендримеров; полиэтиленимина
(PEI); маннозы-РЕ1; трансферина-PEI; линейного-PEI (1PEI);
желатина; метакрилата/метакриламида; поли(бета-аминоэфиров);
полиэлектролитных комплексов (РЕС); поли(виниламина) (PVA);
Коллагена; полипропиленимина (PPI); полиаллиламина;
поливинилпиридина; аминоацеталированного поли(винила).
[0146] В некоторых вариантах осуществления, первичные
амины на хитозановом полимере могут быть существенно
модифицированы для изменения водорастворимости и состояния
заряда. Производные хитозана включают в себя
триметилхитозанхлорид (ТМС), который может быть синтезирован
при различных степенях кватернизации;
монокарбоксиметилированный хитозан (МСС), который является
полиамфолитическим полимером; сшитое производное
глутаральдегида (CSGA); тиолированный хитозан (Lee, et al.
(2007) Pharm. Res. 24: 157-67); гликольхитозан (GC), производное хитозана, конъюгированное с этиленгликолем (Lee, et al. (2007) Int J Pharm.); [N-(2-карбоксибензил)хитозан (CBCS)
(Lin, et al. (2007) Carbohydr Res. 342(1): 87-95); бета-
циклодекстринхитозановый полимер (Venter, et al. (2006) Int J
Pharm. 313(1-2):36-42); О-карбоксиметилхитозан; N,0-
карбоксиметилхитозан; или хитозан, химически модифицированный введением ксантатной группы на его скелет.
[0147] В одном варианте осуществления, пустые хитозановые наночастицы генерируют и используют в качестве модуляторов.
Могут быть использованы хитозан или производные хитозана с диапазоном молекулярной массы 10000 Да - > 1000000 Да. В некоторых вариантах осуществления, хитозан имеет молекулярную массу 500000 Да или менее. В некоторых вариантах осуществления, хитозан имеет молекулярную массу 100000 Да или менее. В некоторых вариантах осуществления, хитозан имеет молекулярную массу 10000-90000, 10000-80000, 20000-700000, 30000-70000, приблизительно 30000, приблизительно 4 0000, приблизительно 50000 или приблизительно 60000 Да.
[0148] В некоторых вариантах осуществления, используют
полимеры хитозана, содержащие различные степени
деацетилирования первичных аминов. В этих вариантах осуществления, различные степени деацетилирования изменяют состояние заряда этого полимера и тем самым свойства связывания этого полимера. После контакта этой хитозановой частицы с лигандами в хозяине, лиганды могут связываться с поверхностью наночастицы и становиться захваченными на этой наночастице или входят в эту наночастицу и становятся инкапсулированными посредством ионных взаимодействий.
[0149] В другом варианте осуществления, этот модулятор является микросферой полифосфатного полимера. В некоторых вариантах осуществления, этот модулятор является производным такой микросферы, такой как поли(сополимер L-лактида и этилфосфита) или P(LAEG-EOP) и другие, описанные в Патенте США № 6548302. Такие полимеры могут быть получены таким образом, что они содержат различные функциональные группы в виде части полимерного скелета макромолекулы. В одном примере, эти полимеры могут содержать кватернизованные амины с положительным зарядом при физиологическом рН, так что они могут образовывать комплекс с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами или инкапсулировать одну или несколько нуклеиновых кислот после контакта. В некоторых вариантах осуществления, эти полимеры не содержат положительных зарядов.
[0150] В некоторых вариантах осуществления, модулятор является катионной молекулой. В некоторых вариантах осуществления, этот лиганд образует структуру квартета гуанина
(G-квартет или G-квадруплекс). Эти структуры связаны катионными молекулами. В некоторых вариантах осуществления, эти молекулы являются образующими хелаты металлов молекулами. В некоторых вариантах осуществления этим модулятором является порфирин. В некоторых вариантах осуществления, этим соединением является ТМРуР4. См. Joachimi, et.al. JACS 2007, 129, 3036-3037 и Того, et.al. Analytical Biochemistry 2008, Aug 1, 379 (1) 8-15.
[0151] Модуляторы могут быть идентифицированы обычно посредством анализов связывания, молекулярного моделирования или анализов in vivo или in vitro, которые измеряют модификацию биологической функции. В одном варианте осуществления, связывание модулятора с нуклеиновой кислотой определяют анализом смещения в геле. В другом варианте осуществления, связывание модулятора с нуклеиновокислотным лигандом определяют с использованием анализа BIACORE.
[0152] Для идентификации и селекции (отбора) модуляторов могут быть использованы стандартные анализы связывания. Неограничивающими примерами являются анализы смещения в геле и BIACORE-анализы. То есть, тест-модуляторы могут быть контактированы с нуклеиновокислотными лигандами, чтобы они служили мишенями при условиях тестирования или при типичных физиологических условиях, и выполняют определение, связывается ли этот тест-модулятор действительно с этим лигандом. Затем тест-модуляторы, которые, как было обнаружено, связывают нуклеиновокислотный лиганд, анализируют в подходящем биоанализе
(который будет варьироваться в зависимости от этого лиганда и его молекулы-мишени, например, тесты коагуляции) для определения может ли этот тест-модулятор влиять на биологический эффект, вызываемый этим лигандом на его молекуле-мишени .
[0153] Анализ смещения в геле является хорошо известным способом, используемым для оценивания связывающей способности. Например, нуклеиновокислотный лиганд к CLEC-2 сначала инкубируют с белком CLEC-2 или его фрагментом, или смесью, содержащей белок CLEC-2 или фрагмент, и затем разделяют на геле при помощи электрофореза. После связывания этого лиганда с
данным белком этот комплекс будет большим по размеру и, следовательно, его миграция будет замедляться относительно миграции свободного лиганда, который может быть нанесен на контрольную дорожку в геле в отсутствие белка CLEC-2. Этот лиганд может быть меченым, например, радиоактивной или нерадиоактивной частью молекулы для возможности детектирования комплекса лиганд-СЪЕС-2 в геле. При использовании анализа смещения в геле для скрининга на лиганды, имеющие CLEC-2-связывающую активность, этот комплекс может быть затем экстрагирован из этого геля и выделенный лиганд может быть анализирован для идентификации лигандов, имеющих желаемую активность связывания CLEC-2.
[0154] Анализы смещения в геле могут быть также использованы для скрининга модуляторов на связывание нуклеиновокислотных лигандов с CLEC-2, так как ассоциация этого модулятора с нуклеиновокислотным лигандом замедляет подвижность этого нуклеиновокислотного лиганда относительно подвижности свободного лиганда (см., например, Rusconi et al. , 2002, Nature, 41: 90-94).
[0155] Дополнительно, модуляторы могут быть добавлены к такому формату анализа и подвергнуты скринингу на их способность блокировать ассоциацию нуклеиновокислотного лиганда с CLEC-2. Например, смесь CLEC-2-лиганд может быть инкубирована в присутствии увеличенных количеств потенциального модулятора. Модулятор с желаемой активностью будет специфически уменьшать образование комплекса CLEC-2-лиганд при детектировании анализом смещения в геле.
[0156] Технология BIACORE известна квалифицированному в данной области специалисту как надежный и ценный инструмент для идентификации и анализа макромолярных взаимодействий, в том числе взаимодействий полипептид-нуклеиновая кислота. Таким образом, можно использовать эту технологию для скрининга на нуклеиновокислотные аптамеры или лиганды или идентификации нуклеиновокислотных аптамеров или лигандов, которые специфически связывают белок CLEC-2 или его фрагмент. Технология BIACORE измеряет события связывания на поверхности
сенсорного чипа, так что взаимодействующий агент, присоединенный к этой поверхности, определяет специфичность этого анализа. Другими словами, белок или фрагмент CLEC-2 мог бы быть присоединен к поверхности сенсорного чипа, например, через гистидиновую метку. Затем эти связанные белки CLEC-2 подвергают действию раствора, содержащего потенциальные молекулы лиганда. Связывание нуклеиновокислотного лиганда с белком CLEC-2 дает немедленное изменение в сигнале резонанса поверхностных плазмонов (SPR). Этот сигнал прямо пропорционален массе молекул, которые связываются с этой поверхностью.
[0157] Как описано для анализа смещения в геле, BIACORE мог бы быть использован для идентификации или анализа модуляторов лигандов CLEC-2. Опять, реакционная смесь, действию которой подвергают связанный с чипом белок CLEC-2, может содержать как известный лиганд CLEC-2, так и увеличивающиеся количества модулятора, и эффекты определяют стандартным анализом BIACORE полученного взаимодействия между CLEC-2 и его лигандом.
[0158] Имеются ряд других анализов, которые могут определять, может ли олигонуклеотид или его аналог, пептид, полипептид, олигосахарид или малая молекула связываться с лигандом таким образом, что взаимодействие с этой мишенью модифицируется. Например, анализы смещения электрофоретической подвижности (EMSA), титрационная калориметрия, анализы сцинтилляционной близости, седиментационные равновесные анализы с использованием аналитического ультрацентрифугирования (см., например, www.cores.utah.edu/interaction) , флуоресцентные анализы поляризации, флуоресцентные анализы анизотропии, анализы интенсивности флуоресценции, флуоресцентные резонансные анализы переноса энергии (FRET), анализы связывания на нитроцеллюлозном фильтре, ELISA, ELONA (см., например, Патент США № 5789163), RIA или анализы равновесного диализа могут быть использованы для оценивания способности агента связываться с нуклеиновокислотным лигандом. Могут выполняться прямые анализы, в которых взаимодействие между агентом и нуклеиновокислотным лигандом определяют непосредственно, или конкурентные или
вытеснительные анализы, в которых может определяться способность агента вытеснять этот лиганд из его мишени
(например, см. Green, Bell and Janjic, Biotechniques 30(5),
2001, p. 1094 и Патент США № 6306598) . После идентифицирования
кандидатного модулирующего агента, его способность модулировать
активность нуклеиновокислотного лиганда в отношении его мишени
может подтверждаться в биоанализе. Альтернативно, если
идентифицирован агент, который может модулировать
взаимодействие лиганда с его мишенью, такие анализы связывания могут быть использованы для подтверждения того, что этот агент взаимодействует непосредственно с этим лигандом и может измерять аффинность указанного взаимодействия.
[0159] В другом варианте осуществления, может быть использована масс-спектрометрия для идентификации модулятора, который связывается с нуклеиновокислотным лигандом, сайта
(сайтов) взаимодействия между этим модулятором и нуклеиновокислотным лигандом и относительной аффинности агентов в отношении этого лиганда (см., например, Патент США № 6,329,146). Такие масс-спектральные способы могут быть также использованы для скрининга химических смесей или библиотек, особенно комбинаторных библиотек, на индивидуальные соединения, которые связываются с выбранным лигандом-мишенью, которые могут быть использованы в качестве модуляторов этого лиганда. Кроме того, масс-спектральные способы могут быть использованы для скрининга множественных нуклеиновокислотных лигандов-мишеней одновременно против, например, комбинаторной библиотеки соединений. Кроме того, масс-спектральные способы могут быть использованы для идентификации взаимодействия между множеством молекулярных частиц, в частности, "малых" молекул, и молекулярного сайта взаимодействия на лиганде-мишени.
[0160] В другом варианте осуществления, анализы in vivo или in vitro, которые оценивают эффективность модулятора в модификации взаимодействия между нуклеиновокислотным лигандом и мишенью, которые являются специфическими для подлежащего лечению нарушения, могут быть использованы для идентификации модулятора, который связывается с нуклеиновокислотным лигандом.
Имеются обширные стандартные анализы для биологических свойств, которые хорошо известны и могут быть использованы. Примеры биологических анализов обеспечены в патентах, цитируемых в этой заявке, которые описывают некоторые нуклеиновокислотные лиганды для конкретных применений.
[0161] В одном варианте осуществления, этот модулятор имеет способность значимо связываться с нуклеиновокислотным лигандом в растворе при концентрациях модулятора, меньших, чем десять (10,0) мкМ, один (1,0) мкМ, предпочтительно меньшей, чем 0,1 мкМ, предпочтительно меньшей, чем 0,01 мкМ. Под термином "значимо" имеется в виду, что наблюдается по меньшей мере 50%-ное уменьшение биологической активности-мишени посредством модуляции в присутствии этой мишени, и при 50%-ном уменьшении эту величину называют здесь величиной IC50.
Оптимизация лигандов и модуляторов
[0162] Для того чтобы лиганд был пригоден для применения в качестве терапевтического агента, этот лиганд является предпочтительно недорогим для синтеза, безопасным для применения в хозяине и стабильным in vivo. РНК дикого типа и ДНК-олигонуклеотиды обычно являются нестабильными in vivo вследствие их чувствительности к деградации нуклеазами. Устойчивость к деградации нуклеазами может быть в сильной степени увеличена включением модифицирующих групп в 2'-положении.
[0163] 2'-фтор или аминогруппы могут быть включены в пулы олигонуклеотидов, из которых затем отбирают лиганды. В данном описании, 2'-фторпиримидины используют в реакции транскрипции in vitro для генерирования исходного пула олигонуклеотидов для отбора лигандов (см. Пример 1).
[0164] После исходной идентификации лигандов (с
использованием, например, SELEX) и модуляторов (например, с
конструированием на основе комплементарности
последовательностей) эти лиганды и модуляторы могут быть модифицированы или сконструированы для улучшения их желаемой структуры, функции и/или стабильности различными способами. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, замену конкретных
сахарных остатков, изменение состава и размера конкретных районов и/или структур в этом лиганде и конструирование (дизайн) лигандов, которые могут более эффективно регулироваться модулятором.
[0165] Конструирование (дизайн) и оптимизация
нуклеиновокислотного лиганда включает в себя принятие во
внимание вторичной структуры этот лиганда, а также взаимосвязи
между этой вторичной структурой лиганда и контролем модулятора.
В отличие от общепринятых способов модификации нуклеиновых
кислот, конструирование этих лигандов к белку CLEC-2 может
включать в себя рассмотрение действия изменений в отношении
этого лиганда на дизайн потенциальных модуляторов. Если лиганд
модифицирован посредством, например, укорочения,
соответствующий модулятор должен быть сконструирован для контроля укороченного лиганда.
[0166] Вторичная структура лигандов, идентифицированных
при помощи способа SELEX, может быть предсказана различными
способами, известными квалифицированным в данной области
специалистам. Например, каждая последовательность может быть
анализирована с использованием программы, такой как Mfold
(mfold.bioinfo.rpi.edu; см. также Zuker, 2003, Nucleic Acids
Res. 31:3406-3415 и Mathews, et al., 1999, J. Mol. Biol.
288:911-940). Таким образом, сравнительный анализ
последовательностей различных отобранных последовательностей
может быть использован для сопоставления этих
последовательностей на основе консервативных консенсусных вторичных структурных элементов для достижения предсказанной вторичной консенсусной структуры для лигандов CLEC-2.
[0167] CLEC-2 нуклеиновые лиганды CLEC-2, описанные здесь,
могут быть модифицированы варьированием всей длины лиганда, а
также длин структур стебля и петли. Например, могут быть
генерированы укорочения лиганда, в которых часть 5'- и/или 3'-
конца укорочений делетирована из лиганда, отобранного в способе
SELEX. Для определения степени укорочений, которые переносятся
лигандом, одним используемым способом может быть тепловой отжиг
олигонуклеотида (например, ДНК-олигонуклеотида),
комплементарного 5'- или 3'-концевому району этого лиганда, затем сравнение связывания этого лиганда с подвергнутым отжигу олигонуклеотидом и без подвергнутого отжигу олигонуклеотида. Если не наблюдается значимое различие связывания между лигандом с отожженным олигонуклеотидом и лигандом без отожженного олигонуклеотида, это позволяет предполагать, что отожженная часть лиганда является несущественной для связывания этого лиганда с белком-мишенью. Этот способ может выполняться с использованием олигонуклеотидов, которые отжигаются до различных длин 5'- или 3'-концов этого лиганда с определением 5'- и 3'-связей, которые обеспечивают полностью функциональный лиганд.
[0168] В другом варианте осуществления, это конструирование включает в себя уменьшение размера лиганда. В другом варианте осуществления, размер модулятора изменен относительно размера этого лиганда. Еще в одном варианте осуществления, "нитки" гуанинов уменьшены до менее чем четырех гуанинов, или менее чем трех гуанинов, или менее чем двух гуанинов или до отсутствия гуанинов. Однако, совместное действие этих изменений должно решать проблему создания лиганда, который обеспечивает адекватную активность, но легко нейтрализоваться этим модулятором.
[0169] Для нацеливания модулятора, улучшенный лиганд может быть также модифицирован таким образом, что он включает в себя одноцепочечный "хвост" (3' или 5') для стимуляции ассоциации с олигонуклеотидным модулятором. Подходящие "хвосты" могут содержать 1 нт - 20 нт, предпочтительно 1 нт - 10 нт, 1 нт - 5 нт или 3 нт - 5 нт, где этим нуклеотидом в каждом положении в этом "хвосте" могут быть А, С, G, Т или U. Вполне понятно, что такие "хвосты" могут включать в себя модифицированные нуклеотиды, как описано более подробно ниже.
[017 0] Имеющие "хвосты" лиганды могут быть тестированы в
анализах связывания и биоанализах (например, как описано ниже)
для подтверждения, что добавление одноцепочечного "хвоста" не
разрушает активную структуру этого лиганда. Ряд
олигонуклеотидов (например, 2'-О-метилолигонуклеотидов) ,
которые могут образовывать, например, 1, 3 или 5 п.н. с
последовательностью "хвоста", могут быть сконструированы и
тестированы на их способность ассоциироваться с одним лигандом
с "хвостом", а также на их способность увеличивать скорость
диссоциации этого лиганда или скорость ассоциации этого лиганда
с их молекулой-мишенью. Контроли перемешанных
последовательностей могут быть использованы для подтверждения, что эти эффекты обусловлены образованием дуплексов и не являются неспецифическими эффектами.
[0171] Лиганды CLEC-2 могут быть также сконструированы таким образом, что они имеют суицидное положение, которое делает возможной эффективную регуляцию спаренных модуляторов. После связывания лиганда с этим модулятором это суицидное положение становится одноцепочечным и лабильным, облегчающим посредством этого расщепление этого лиганда ферментами, природно представленными в крови, такими как эндонуклеазы крови или эндонуклеазы печени. Это обеспечивает способ для эффективной и безотлагательной элиминации активного лиганда из кровотока.
Химические модификации
[0172] Одной проблемой, встречающейся в терапевтическом
применении нуклеиновых кислот, является то, что олигонуклеотиды
в их фосфодиэфирной форме могут деградироваться в биологических
жидкостях внутриклеточными и внеклеточными ферментами, такими
как эндонуклеазы и экзонуклеазы, до манифестации полного
действия. Некоторые химические модификации нуклеиновокислотного
лиганда могут увеличивать in vivo стабильность
нуклеиновокислотного лиганда или усиливать или опосредовать доставку этого нуклеиновокислотного лиганда. Дополнительно, некоторые химические модификации могут увеличивать аффинность этого нуклеиновокислотного лиганда в отношении его мишени, стабилизацией или стимулированием образования требуемых структурных элементов в нуклеиновокислотном лиганде или обеспечением дополнительных молекулярных взаимодействий с молекулой-мишенью.
[0173] Модификации этих лигандов могут включать в себя, но
не ограничиваются ими, модификации, которые обеспечивают
химические группы, которые включают в себя, но не
ограничиваются ими, химические группы, которые обеспечивают
дополнительный заряд, способность к поляризации, гидрофобность,
образование водородных связей, электростатические
взаимодействия и функциональность в отношении оснований нуклеиновокислотного лиганда или в отношении этого лиганда в целом. Модификации могут находиться в части основания, сахарной части или фосфатном скелете, например, для улучшения таких свойств, как стабильность молекулы и аффинность в отношении предполагаемой мишени. Такие модификации включают в себя, но не ограничиваются ими, сахарные модификации в 2'-положении, пиримидиновые модификации в 5'-положении, пуриновые модификации в 8-положении, модификации при экзоциклических аминах, замену 4-тиоуридина, замену 5-бром- или 5-иодурацила, модификации скелета молекулы, фосфоротиоатные или алкилфосфатные модификации, метилирования, необычные комбинации спаривания оснований, такие как изооснования изоцитидин и изогуанин и т.п. Модификации могут также включать в себя 3'- и 5'-модификации, такие как кэппирование.
[0174] Способ SELEX включает в себя идентификацию
высокоаффинных нуклеиновокислотных лигандов, содержащих
модифицированные нуклеотиды, придающие улучшенные
характеристики на этом лиганде, такие как улучшенная стабильность in vivo или улучшенные характеристики доставки. Примеры таких модификаций включают в себя химические замены в положениях рибозы и/или фосфата и/или положениях оснований. Идентифицированные с использованием SELEX нуклеиновокислотные лиганды, содержащие модифицированные нуклеотиды, описаны в Патенте США № 5660985, который описывает олигонуклеотиды, содержащие нуклеотидные производные, химически модифицированные в 5'- и 2'-положениях пиримидинов. Патент США № 5580737 описывает специфические нуклеиновокислотные лиганды, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных 2'-амино (2'-NH2), 2'-фтором (2'-F) и/или 2'-О-метилом (2'-ОМе).
[0175] Способ SELEX включает в себя объединение отобранных
олигонуклеотидов с другими отобранными олигонуклеотидами и не-олигонуклеотидными функциональными звеньями, описанными в Патентах США с номерами 5637459 и 5683867. Патент США № 5637459 описывает высокоспецифические нуклеиновокислотные лиганды, содержащие один или несколько нуклеотидов, модифицированных 2'-амино (2'-NH2), 2'-фтором (2'-F) и/или 2'-О-метилом (2'-0Ме). Способ SELEX дополнительно включает в себя объединение отобранных нуклеиновокислотных лигандов с липофильными или Не-иммуногенными соединениями, соединениями с высокой молекулярной массой в диагностическом или терапевтическом комплексе, как описано в Патенте США № 6,011,020.
[017 6] При получении нуклеиновокислотных лигандов по способу SELEX, эти модификации могут быть пре- или пост-SELEX-модификациями. Пре-SELEX модификации могут давать лиганды, имеющие как специфичность в отношении в отношении их мишени, так и увеличенную стабильность in vivo. Пост-SELEX модификации, произведенные для 2'-гидроксил-(2'-ОН)-нуклеиновокислотных лигандов, могут приводить к улучшенной стабильности in vivo без вредного действия на способность связывания нуклеиновокислотных лигандов. В одном варианте осуществления, модификации этого лиганда включают в себя 3'-3'-инвертированную фосфодиэфирную связь на 3'-конце этой молекулы и 2'-фтор-(2'-F), 2'-амино (2'-NH2) , 2'-дезокси- и/или 2'-О-метил(2'-ОМе) модификацию некоторых или всех из этих нуклеотидов.
[0177] Описанные здесь лиганды исходно генерировали посредством SELEX с использованием библиотек транскриптов, в которых остатки Сии" были 2'-фторзамещенными и остатки А и G были 2'-ОН.
[0178] В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновые кислоты, образующие этот лиганд, включают в себя модифицированные сахара и/или модифицированные основания. В некоторых вариантах осуществления, эти модификации включают в себя стабилизирующие модификации, такие как 2'-стабилизирующие модификации. В одном варианте осуществления, 2'-стабилизирующие модификации могут включать в себя 2'-фтор-модификации на сахарном кольце.
[0179] В одном варианте осуществления, это конструирование включает в себя уменьшение содержания 2'-гидроксила этого лиганда или этого модулятора или обоих. В другом варианте осуществления это конструирование включает в себя 2'-0-метил-содержание этого лиганда или этого модулятора или обоих.
[0180] В фармацевтических композициях эти лиганды могут быть обеспечены в формах, таких как формы соли, которые улучшают растворимость или биодоступность. Подходящие соли включают в себя неорганические катионы, такие как натрий и калий.
[0181] Любой из олигонуклеотидов этого описания может быть синтезирован стандартными способами, известными в данной области, например, с использованием автоматизированного ДНК-синтезатора (такого как коммерчески доступные ДНК-синтезаторы, доступные, например, из Biosearch, Applied Biosystems).
[0182] Лиганды и модуляторы описываются здесь с использованием сокращений, легко понимаемых квалифицированными специалистами, и иллюстрируются следующим образом: "гА" обозначает 2'ОН А или аденозин; "А" обозначает 2'-дезокси А или 2'-дезоксиаденозин; "тА" обозначает 2'-0-метил А или 2'-метокси-2'-дезоксиаденин; "rG" обозначает 2'-ОН G или гуанозин; "G" обозначает 2'-дезокси G или 2'-дезоксигуанозин; "mG" обозначает 2'-0-метил G или or 2'-метокси-2'-дезоксигуанозин; "fC" обозначает 2'-фтор С или 2'-фтор-2'-дезоксицитидин; "тС" обозначает 2'-0-метил С или метокси-2'-дезоксицитидин; "fU" обозначает 2'-фтор U или 2'-фторуридин; "mU" обозначает 2'-0-метил U или 2'-метоксиуридин; и "iT" обозначает инвертированный 2'Н Т.
Связывание с носителем
[0183] Описанные здесь лиганды могут также включать в себя модификации, которые улучшают биодоступность или стабильность. Такие модификации могут включать в себя конъюгацию с молекулой носителя, которая может включать в себя, но не ограничивается ими, гидрофильную или гидрофобную часть молекулы.
Способы для лечения CLEC-2-опосредованных нарушений [0184] В одном варианте осуществления, обеспечен способ
для лечения CLEC-2-опосредованного нарушения, предусматривающий введение хозяину, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества лиганда или его фармацевтически приемлемой соли, как описано здесь.
[0185] CLEC-2 был впервые идентифицирован как медиатор агрегации тромбоцитов (в отношении обзора, см. Suzuki-Inoue et al, 2011, J. Thromb Haemostasis, 9 (SI) :44-55) . Затем было показано, что CLEC-2 участвует в образовании и стабилизации образовании тромбов. Таким образом, лиганды CLEC-2, которые способны ингибировать функцию или активность CLEC-2, могут быть использованы для терапевтического воздействия на различные опосредованные тромбоцитами нарушения. В одном варианте осуществления, это CLEC-2-опосредованное нарушение включает в себя сосудистое нарушение. В другом варианте осуществления, это сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из острых коронарных синдромов, тромбоза, тромбоэмболии, тромбоцитопении, заболевания периферических сосудов и транзиторного ишемического приступа. Описанные здесь композиции применимы также для лечения цереброваскулярного нарушения, включающего в себя, но не ограничивающегося ими, транзиторный ишемический приступ, ишемический инсульт и эмболию.
[0186] В одном варианте осуществления, CLEC-2-опосредованным нарушением является связанное с диабетом нарушение. В одном варианте осуществления, связанное с диабетом нарушение выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетической васкулопатии, атеросклероза, ишемического инсульта заболевания периферических сосудов, острого почечного повреждения и хронической почечной недостаточности.
[0187] В одном варианте осуществления, это CLEC-2-опосредованное нарушение включает в себя опосредуемое тромбоцитами воспалительное нарушение. В другом варианте осуществления, это опосредуемое тромбоцитами воспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из артрита, ревматоидного артрита, псориатического артрита, реактивного артрита, воспалительного заболевания пишеварительного тракта,
анкилозирующего спондилита и склеродермии.
[0188] В одном варианте осуществления, этим CLEC-2-опосредованным нарушением является рак. Уже давно предполагалось, что тромбоциты участвуют в метастазировании и/или прогрессировании рака (Nash et al., 202, Lancet Oncol, 3:425-430) . Агрегаты тромбоцитов, окружающие опухолевые клетки, могут защищать их от напряжения сдвига и NK-клеток в крови, облегчая посредством этого образование очагов опухолевых клеток. Кроме того, со времени открытия подопланина в качестве эндогенного лиганда CLEC-2, экспериментальные данные позволяли предположить, что CLEC-2/подопланин может быть жизнеспособной мишенью для антиметастатических лекарственных средств. Например, блокирующее анти-подопланин-антитело значимо ингибировало количество метастатических легочных узелков, состоящих из опухолевых клеток, экспрессирующих подопланин (Kato et al., 2008, Cancer Sci, 99:54-61).
[0189] Описанные здесь лиганды CLEC-2, которые, как
показано, ингибируют CLEC-2-опосредованную агрегацию
тромбоцитов, имеют терапевтическое применение в лечении и
ингибировании метастазирования опухолей. В одном варианте
осуществления, рак выбран из группы, состоящей из рака легкого,
рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичек,
рака поджелудочной железы, рака головного мозга, рака костей и
рака печени. Однако, понятно, что лиганды CLEC-2, описанные
здесь, могут быть применимы в лечении или ингибировании любого
рака, который метастазирует или, согласно мнению
квалифицированного специалиста, имеет вероятность
метастазирования.
[0190] В другом варианте осуществления, лиганд CLEC-2 ингибирует инициацию активации тромбоцитов. В других вариантах осуществления, этот лиганд CLEC-2 ингибирует активацию тромбоцитов и провоспалительную реакцию полученных тромбоцитов. В других вариантах осуществления, лиганд CLEC-2 ингибирует адгезию тромбоцитов. В других вариантах осуществления, лиганд CLEC-2 ингибирует агрегацию тромбоцитов. Еще в одном дополнительном варианте осуществления, этот лиганд CLEC-2
ингибирует генерирование тромбина.
[0191] В некоторых вариантах осуществления обеспечен способ лечения или предотвращения образования сосудистого события, в частности, тромботического или тромбоэмболического события, предусматривающий введение нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2, описанного здесь, хозяину, нуждающемуся в этом.
[0192] В одном варианте осуществления, нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2 обеспечивается в течение продолжительного периода времени. В этом случае, модулятор лиганда CLEC-2 может быть использован только в чрезвычайных ситуациях, например, если лечение приводит к кровотечению, в том числе внутричерепному или желудочно-кишечному кровотечению. В другом варианте осуществления, этот модулятор вводят при необходимости неотложной хирургии для пациентов, которые получали лечение нуклеиновокислотным лигандом CLEC-2. В другом варианте осуществления, этот модулятор вводят для контроля концентрации нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 и тем самым продолжительности и интенсивности лечения. В другом варианте осуществления, нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2 обеспечен в качестве тромбоцитарного анестетика во время процедуры искусственного (экстрапульмонарного) кровообращения. В другом варианте осуществления, нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2 вводят для обеспечения периода перехода от пероральных антитромбоцитарных лекарственных средств или перехода к пероральным антитромбоцитарным лекарственным средствам, и этот модулятор используют для обращения нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2, как только устанавливаются терапевтические уровни перорального антитромбоцитарного агента.
[0193] Описанные здесь способы могут быть использованы в комбинации с другой терапией.
[0194] В одном варианте осуществления, хозяина готовят к подверганию хирургическому вмешательству, или он подвергается хирургическому вмешательству, или он был подготовлен к хирургическому вмешательству, которое подвергает его риску окклюзионного тромботического события. В других вариантах осуществления, этот хозяин получает сосуд-трансплантат для
выполнения гемодиализа, который находится при риске закупорки вследствие взаимодействий между этим сосудом и тромбоцитами.
[0195] В одном варианте осуществления, эта терапия включает в себя лечение хозяина терапевтически эффективным количеством противоракового или антитромбатического агента.
[0196] В одном варианте осуществления, эта терапия
включает в себя лечение хозяина терапевтически эффективным
количеством анти-ВИЧ-агента, выбранного из группы, состоящей из
антивирусных агентов ВИЧ, иммуномодуляторов и
противоинфекционных агентов.
Введение и фармацевтическая композиция
[0197] Нуклеиновокислотные лиганды CLEC-2 или модуляторы лиганда CLEC-2, описанные здесь, могут быть приготовлены в виде фармацевтических композиций, которые могут включать в себя, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Точная природа этой композиции будет зависеть, по меньшей мере частично, от природы этого лиганда и/или модулятора, в том числе любых стабилизирующих модификаций, и способа введения. Композиции, содержащие этот модулятор, могут быть сконструированы для введения хозяину, который получал нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2, для возможности модуляции активности этого лиганда, и, следовательно, регуляции антитромбоцитарной активности вводимого нуклеиновокислотнного лиганда CLEC-2.
[0198] Это конструирование и приготовление
фармацевтических или фармакологических композиций будет известно квалифицированным в данной области специалистам в свете данного описания. Обычно, такие композиции могут быть приготовлены в виде инъекционно вводимых препаратов, либо в виде растворов, либо в виде суспензий; твердых форм, подходящих для растворения или для суспендирования в жидкости перед инъекцией; в виде таблеток или других твердых веществ для перорального введения; в виде капсул с пролонгированным действием, в виде жидкостей для перорального введения; в виде эликсиров, сиропов, суппозиториев, гелей или любой другой формы, используемой в данной области, в том числе глазных
капель, кремов, лосьонов, мазей, ингаляционных средств и т.п. Применение стерильных препаратов, таких как промывки на основе солей, хирургами, врачами или работниками медико-санитарной службы для лечения конкретной зоны в операционном поле может быть также особенно полезным. Композиции могут быть также приготовлены для доставки через микроустройства, микрочастицы или губки. Композиции могут быть также нанесены на имплантированные медицинские устройства, такие как стенты, для локальной доставки.
[0199] Фармацевтически применимые композиции, содержащие нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2 или модулятор лиганда CLEC-2, могут быть приготовлены по меньшей мере частично примешиванием фармацевтически активного носителя. Примеры таких носителей и способов приготовления могут быть найдены в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition (Lippincott Williams & Wilkins, 2000) и Ansel et al, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th Ed. (Media, Pa.: Williams & Wilkins, 1995) .
[02 00] Подходящие фармацевтические эксципиенты включают в себя стабилизаторы, антиоксиданты, корректирующие осмоляльность агенты, буферы и корректирующие рН агенты, в том числе, но не только, забуференный фосфатом солевой раствор (ЗФР). Подходящие добавки включают в себя физиологически биосовместимые буферы (например, гидрохлорид трометамина), добавления хелатных соединений (таких как, например, EDTA, DTPA или DTPA-бисамид) или кальций-хелатных комплексов (например, кальций DTPA, CaNaDTPA-бисамид), или, необязательно, добавления солей кальция или натрия (например, хлорида натрия, хлорида кальция, глюконата кальция или лактата кальция). Фармацевтические композиции могут быть упакованы для применения в жидкой форме или могут быть лиофилизированы.
[02 01] Для образования фармацевтически приемлемой
композиции, подходящей для эффективного введения, такие
композиции будут содержать эффективное количество
нуклеиновокислотного лиганда или модулятора. Такие композиции могут содержать добавки более чем одного соединения. Эти
композиции обычно содержат приблизительно 0,1 масс.% приблизительно 50 масс.%, приблизительно 1 масс.% приблизительно 2 5 масс.% или приблизительно 5 масс.% приблизительно 2 0 масс.% активного агента (лиганда или модулятора).
[02 02] Здесь обеспечены фармацевтические композиции для парентерального введения, в том числе для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций или инфузий. Для парентерального введения желательными являются асептические суспензии и растворы. Когда желательной является внутривенное введение, используют изотонические препараты, которые обычно содержат подходящие консерванты. Эти фармацевтические композиции могут быть стерилизованы и/или содержат адъюванты, такие как консервирующие, стабилизирующие, увлажняющие или эмульгирующие агенты, усилители растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферов. Жидкие, особенно инъецируемые композиции могут быть, например, приготовлены растворением, диспергированием и т.д. Активное соединение растворяют в фармацевтически чистом растворителе или смешивают с фармацевтически чистым растворителем, таким как, например, вода, забуференная вода, солевой раствор, 0,4%-ный солевой раствор, 0,3%-ный глицин, гиалуроновая кислота, водная декстроза, глицерин, этанол и т.п., для образования посредством этого инъецируемого раствора или суспензии.
Дополнительно, могут быть приготовлены твердые формы для растворения в жидкости перед инъекцией.
[0203] Для облегчения растворения агента в водной среде, в качестве увлажняющего агента может быть добавлено поверхностно-активное вещество. Поверхностно-активные вещества включают в себя аниогенные детергенты вещества, такие как лаурилсульфат натрия, сульфосукцинат диоктилнатрия и сульфонат диоктилнатрия. Могут быть использованы катионогенные детергенты, и они могут включать в себя хлорид бензалкония или хлорид бензетония. Неионогенные детергенты, которые могли бы быть включены в препарат в качестве поверхностно-активных веществ, включают в себя, но не ограничиваются ими, лауромакрогол 400, полиоксил
40-стеарат, полиоксиэтилированное гидрогенизированное
касторовое масло 10, 50 и 60, моностеарат глицерина, полисорбат 20, 40, 60, 65 и 80, эфир сахарозы и жирной кислоты, метилцелюлозу, карбоксиметилцелюлозу и любой из плюрониковых детергентов, такой как Плюроник F68 и/или Плюроник F127 (например, см. Strappe et al. Eur. J. of Pharm. Biopharm., 2005, 61:126-133). Поверхностно-активные вещества могли бы присутствовать в этом препарате белка или производного, либо отдельно, либо в виде смеси в различных соотношениях.
[02 04] Для перорального введения в форме таблетки или капсулы активный компонент лекарственного средства может объединяться с пероральным, нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т.п. Кроме того, когда это желательно или необходимо, подходящие связывающие агенты, смазывающие вещества, дезинтегрирующие агенты и красящие агенты могут быть также включены в эту смесь. Подходящие связывающие агенты включают в себя, без ограничения, крахмал, желатин, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, сахаристое вещество из кукурузы, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлозу, полиэтиленглиноль, воски и т.п. Смазывающие вещества, используемые в этих лекарственных формах, включают в себя, без ограничения, олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п. Дезинтеграторы включают в себя, без ограничения, крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и т.п.
[02 05] Для жидких форм, используемых в пероральном введении, активный компонент лекарственного средства может быть объединен с подходящим образом ароматизированными суспендирующими или диспергирующими агентами, такими как синтетические и природные камеди, трагакант, аравийская камедь, метилцеллюлоза и т.п. Другие диспергирующие агенты, которые могут быть использованы, включают в себя глицерин и т.п.
[0206] Локальные препараты, содержащие активный компонент лекарственного средства, могут быть смешаны с различными
материалами-носителями, хорошо известными в данной области, такими как, например, спирты, гель aloe vera, аллантоин, глицерин, витаминизированные А- и Е-масла, минеральное масло, PPG2 миристилэфиропропионат, и т.п., для образования, например, спиртовых растворов, локальных детергентов, очищающих кремов, кожных гелей, кожных лосьонов и шампуней в препаратах в виде кремов или гелей.
[02 07] Эти лиганды могут также вводиться в форме липосомных систем доставки, таких как малые однослойные пузырьки, большие однослойные пузырьки и многослойные пузырьки. Липосомы могут быть образованы из различных фосфолипидов, таких как холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины. Активные агенты, вводимые непосредственно (например, отдельно) или в липосомном препарате, описаны, например, в Патенте США № 6147204.
[02 08] Этот лиганд может быть также связан с растворимыми
полимерами в качестве способных к нацеливанию носителей
лекарственных средств. Такие полимеры могут включать в себя
поливинилпирролидон, сополимер пирана,
полигидроксипропилметакрил-амид-фенол, полигидрокси-
этиласпартамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный
пальмитоильными остатками. Кроме того, эти лиганды могут быть
связаны (предпочтительно через ковалентную связь) с классом
биодеградируемых полимеров, применимых в достижении
контролируемого высвобождения лекарственного средства,
например, полиэтиленгликолем (PEG), полимолочной кислотой,
полиэпсилон капролактоном, полиоксазолинами,
полигидроксимасляной кислотой, полиортоэфирами, полиацеталями, полигидро-пиранами, полицианоакрилатами и сшитыми или амфипатическими блоксополимерами гидрогелей. Холестерин и сходные молекулы могут быть связаны с нуклеиновокислотными лигандами для увеличения и пролонгирования биодоступности.
[02 09] Липофильные соединения и неиммуногенные высокомолекулярные соединения, с которыми модуляторы этого изобретения могут быть приготовлены для использования, могут быть получены любым из различных способов, известных в
настоящее время в данной области, или затем разработаны далее.
Обычно их готовят из фосфолипида, например,
дистеароилфосфатидилхолина, и они могут включать в себя другие материалы, такие как нейтральные липиды, например, холестерин, а также модификаторами поверхности, такими как положительно заряженные (например, содержащие стериламин или аминоманнозу или аминоманнит производные холестерина) или отрицательно заряженные (например, диацетилфосфат, фосфатидилглицерин) соединения. Многослойные липосомы могут быть приготовлены общепринятым способом, т.е. помещением выбранного липида на внутреннюю стенку подходящего контейнера или сосуда растворением этого липида в подходящем растворителе, и затем упариванием этого растворителя с оставлением тонкой пленки внутри этого сосуда, или распылительной сушкой. Затем в этот сосуд добавляют водную фазу с применением вихревого движения или вортекса, которое приводит к образованию многослойных липосомных пузырьков (MLV). Однослойные липосомные пузырьки
(UV) могут быть затем приготовлены гомогенизацией, обработкой ультразвуком или экструзией (через фильтры) MLV. Кроме того, UV могут быть образованы способами удаления детергентов. В некоторых вариантах этого описания, этот комплекс содержит липосому с нацеливающим нуклеиновокислотным лигандом
(лигандами), ассоциированными с поверхностью этой липосомы, и инкапсулированным терапевтическим или диагностическим агентом. Предварительно отформованные липосомы могут быть модифицированы для ассоциации с нуклеиновокислотными лигандами. Например, катионная липосома ассоциируется через электростатические взаимодействия с нуклеиновой кислотой. Альтернативно, нуклеиновая кислота, присоединенная к липофильному соединению, такому как холестерин, может быть добавлена к предварительно сформованным липосомам, посредством чего этот холестерин становится ассоциированным с этой липосомной мембраной. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть ассоциирована с этой липосомой во время формования этой липосомы.
[0210] В другом варианте осуществления, стент или медицинское устройство может быть покрыто препаратом,
содержащим лиганд CLEC-2, или модулятор лиганда CLEC-2, в соответствии со способами, известными квалифицированным в данной области специалистам.
[0211] Рассматриваются также терапевтические наборы. Эти наборы содержат реагенты, активные агенты и материалы, которые могут потребоваться для применения на практике описанных выше способов. Эти наборы будут в основном содержать, в подходящих контейнерах, фармацевтически приемлемый препарат лиганда CLEC-2 и/или модулятора лиганда CLEC-2. Если этот набор содержит как лиганд CLEC-2, так и модулятор CLEC-2, этот модулятор CLEC-2, в некоторых вариантах осуществления, является модулятором, который связывает лиганд CLEC-2 в этом наборе. Этот набор может иметь единственный контейнер, и/или он может иметь разные контейнеры для каждого соединения.
Способы введения
[0212] Способы введения лигандов CLEC-2 и/или модуляторов
лигандов CLEC-2 данного изобретения хозяину включают в себя, но
не ограничиваются ими, парентеральное (инъекцией или
постепенной инфузией на протяжении времени), внутривенное,
интрадермальное, интраартикулярное, внутрисуставное,
внутриоболочечное, внутриартериальное, интракардиальное,
внутримышечное, подкожное, интраорбитальное, интракапсулярное, интраспинальное, внутригрудинное, локальное введение, введение с использованием трансдермального пластыря, ректальное, трансбуккальное, с использованием влагалищного или уретрального суппозитория, внутрибрюшинное, чрескожное, с использованием назального спрея, с использованием хирургического имплантата, с использованием хирургической кисточки для внутренних органов, с использованием инфузионного насоса или через катетер. В одном варианте осуществления, этот агент и носитель вводят в препарате медленного высвобождения, таком как имплантат, болюс, микрочастица, микросфера, наночастица или наносфера. В одном варианте осуществления, нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2 доставляется посредством подкожной инъекции или депонирования, включающего в себя подкожную инфузию (например, с использованием осмотического насоса).
[0213] В одном варианте осуществления, нуклеиновокислотный лиганд CLEC-2 доставляется посредством подкожного введения и модулятор доставляется подкожным или внутривенным введением.
[0214] Терапевтические композиции, содержащие лиганды и
модуляторы данного изобретения, могут вводиться внутривенно,
например, инъекцией унифицированной (стандартной) дозы. Термин
"унифицированная (стандартная) доза" при применении в ссылке на
терапевтическую композицию относится к физически дискретным
единицам, подходящим в качестве однократной дозы для хозяина,
причем каждая единица содержит заданное количество активного
материала, рассчитанное для получения желаемого
терапевтического эффекта, в ассоциации с требуемым разбавителем; т.е. носителем или наполнителем.
[0215] Дополнительно, один подход в отношении парентерального введения использует имплантацию систем медленного высвобождения или пролонгированного высвобождения, которое гарантирует, что поддерживается постоянный уровень дозы.
[0216] Обеспечено также локальное введение, например, в интерстиций пораженного сустава. Локальное введение может достигаться инъекцией, например, из шприца или другого изделия, включающего в себя инъекционное устройство, такое как игла. Скорость введения из шприца может регулироваться давлением на протяжении желаемого периода времени для распределения содержимого этого шприца. В другом примере, локальное введение может достигаться инфузией, которая может быть облегчена использованием насоса или другого сходного устройства.
[0217] Обеспечены также репрезентативные, неограничивающие подходы для локального введения в ткань сосудов, и они включают в себя (1) покрытие или импрегнацию ткани сосудов крови гелем, содержащим нуклеиновокислотный лиганд, для доставки in vivo, например, имлантацией этого покрытого или импрегнированного сосуда вместо поврежденного или больного сегмента ткани сосуда, который был удален или обойден; (2) доставку через катетер к сосуду, в котором желательна доставка; (3) подачу насосом композиции в сосуд, который подлежит имплантации в пациента.
Альтернативно, эти соединения могут вводиться в клетки микроинъекцией или липосомным инкапсулированием.
[0218] Обеспечено также введение лигандов CLEC-2 в субъект покрытием медицинских устройств, таких как стенты, фармацевтическими композициями, содержащими этот лиганд. Способы покрытия для получения подходящего высвобождения и введения этого лиганда известны специалисту с обычной квалификацией в данной области.
[0219] Оптимальные схемы для введения доз для описанных здесь композиций могут быть легко установлены квалифицированным в данной области специалистом и могут варьироватся в зависимости от модулятора, пациента и желаемого эффекта. Это эффективное количество может варьироваться в соответствии с различными факторами, такими как состояние, масса, пол, возраст индивидуума и количество вводимого нуклеиновокислотного лиганда. Другие факторы включают в себя способ введения.
[0220] Фармацевтически эффективная доза зависит от типа заболевания, используемой композиции, способа введения и типа получающего лечение млекопитающего, физических характеристик конкретного рассматриваемого млекопитающего, одновременного медикаментозного лечения и других факторов, которые будут известны квалифицированным в этой области медицины специалистам. Обычно, эти композиции будут вводиться в дозах, корректированных в отношении массы тела, например, в дозах, находящихся в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг массы тела до приблизительно 100 мг/кг массы тела. Более часто, эти дозы будут находиться в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг, и более часто от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, или приблизительно от 1,0 до приблизительно 5,0 мг/кг, или приблизительно от 1,0 мг/кг, приблизительно 2,0 мг/кг, приблизительно 3,0 мг/кг, приблизительно 4,0 мг/кг, приблизительно 5,0 мг/кг, приблизительно 6,0 мг/кг, приблизительно 7,0 мг/кг, приблизительно 8,0 мг/кг, приблизительно 9,0 мг/кг или приблизительно 10,0 мг/кг. Обычно, эта доза сначала обеспечивает концентрацию лекарственного средства в плазме
приблизительно 0,002 мкг/мл - приблизительно 2000 мкг/мл лекарственного средства, более часто от приблизительно 2,0 мкг/мл до приблизительно 400 мкг/мл и более часто от приблизительно 10 мкг/мл до 2 00 мкг/мл или приблизительно 2 0 мкг/мл - приблизительно 100 мкг/мл лекарственного средства, приблизительно 2 0 мкг/мл, приблизительно 4 0 мкг/мл, приблизительно 60 мкг/мл, приблизительно 8 0 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 120 мкг/мл, приблизительно 140 мкг/мл, приблизительно 160 мкг/мл, приблизительно 180 мкг/мл или приблизительно 2 00 мкг/мл.
[0221] При введении модулятора в хозяина, которому уже вводили этот лиганд, отношение модулятора к лиганду может корректироваться на основе желаемого уровня ингибирования этого лиганда. Доза модулятора может быть рассчитана на основе корреляции с дозой лиганда. В одном варианте осуществления, это отношение (масса к массе) дозы модулятора к дозе лиганда равно 1:1. В других вариантах осуществления, этот отношение модулятора к лиганду является более высоким, чем 1:1, таким как 2:1 или приблизительно 2:1, 3:1 или приблизительно 3:1, 4:1 или приблизительно 4:1, 5:1 или приблизительно 5:1, 6:1 или приблизительно 6:1, 7:1 или приблизительно 7:1, 8:1 или приблизительно 8:1, 9:1 или приблизительно 9:1, 10:1 или приблизительно 10:1 или более. В других вариантах осуществления, это отношение (масса к массе) дозы модулятора к дозе лиганда равно менее чем 1:1, например, 0,9:1 или приблизительно 0,9:1, 0,8:1 или приблизительно 0,8:1, 0,7:1 или приблизительно 0,7:1, 0,6:1 или приблизительно 0,6:1, 0,5:1 или приблизительно 0,5:1, 0,45:1 или приблизительно 0,45:1, 0,4:1 или приблизительно 0,4:1, 0,35:1 или приблизительно 0,35:1,
0. 3:1 или приблизительно 0,3:1, 0,25:1 или приблизительно 0,25:
1, 0,2:1 или приблизительно 0,2:1, 0,15:1 или приблизительно
0,15:1, 0,1:1 или приблизительно 0,1:1 или менее чем 0,1:1,
например, приблизительно 0,005:1 или менее. В некоторых
вариантах осуществления, это отношение доз (масса к массе)
находится между 0,5:1 и 0,1:1 или между 0,5:1 и 0,2:1, или
между 0,5:1 и 0,3:1. В других вариантах осуществления, это
отношение доз (масса к массе) находится между 1:1 и 5:1, или между 1:1 и 10:1 или между 1:1 и 20:1.
[0222] Эти лиганды могут вводиться внутривенно в единственной суточной дозе, каждый второй день, или вся суточная доза может вводиться в виде нескольких разделенных доз. Введение лиганда и/или модулятора может обеспечиваться один раз в день (q.d.), два раза в день (b.i.d.), три раза в день (t.i.d.) или более часто в случае необходимости. После этого, этот модулятор обеспечивают любым подходящим способом для изменения действия нуклеиновокислотного лиганда введением этого модулятора. Нуклеиновокислотные лиганды могут вводиться подкожно два раза в неделю, один раз в неделю, каждые две недели или один раз в месяц. В некоторых вариантах осуществления, эти лиганды или модуляторы вводят менее часто, чем один раз в день. Например, введение лиганда может проводиться каждый второй день, каждый третий день, каждый четвертый день, один раз в неделю или один раз в месяц.
[0223] В одном варианте осуществления, может быть желательным совместное введение или последовательное введение. Для комбинаторного лечения с использованием более чем одного активного агента, где эти активные агенты находятся в отдельных препаратах доз, эти активные агенты могут вводиться одновременно, или они могут вводиться в ступенчато расположенных точках времени.
[0224] Эти композиции вводят способом, совместимым с этими препаратами доз, и в терапевтически эффективном количестве. Вводимое количество зависит от подлежащего лечению хозяина, способности системы этого хозяина использовать этот активный ингредиент и степени желаемого терапевтического действия. Точные количества активного ингредиента, необходимые для введения, зависят от решения практикующего врача и являются конкретными для каждого индивидуума. Однако, подходящие диапазоны доз для системного введения описаны здесь и зависят от способа введения. Подходящие схемы введения являются также вариабельными, но определяются начальным введением с последующими повторяемыми дозами при одном или нескольких
часовых интервалах посредством последующей инъекции или другого введения. Альтернативно, обеспечена непрерывная внутривенная инфузия, достаточная для поддержания концентраций в крови в диапазонах, указанных для терапий in vivo.
[0225] В некоторых вариантах осуществления, композиции этого описания изобретения могут дополнительно содержать другой терапевтический агент. При использовании второго агента, этот второй агент может вводиться либо в отдельной лекарственной формы, либо в виде части единой лекарственной формы с этими соединениями или композициями. Хотя одно или несколько соединений этого изобретения могут быть использованы в применении монотерапии для лечения нарушения, заболевания или симптома, они могут быть также использованы в комбинированной терапии, в которой применение соединения или композиции (терапевтическиого агента) является объединенным с применением одного или нескольких других терапевтических агентов для лечения тех же самых и/или других типов нарушений, симптомов и заболеваний. Комбинированная терапия включает в себя введение двух или нескольких терапевтических агентов одновременно или последовательно. Эти агенты могут быть введены в любом порядке. Альтернативно, множественные терапевтические агенты могут быть объединены в единую композицию, которая может вводиться пациенту.
Способы характеристики лигандов CLEC-2 и модуляторов лигандов CLEC-2
[0226] В одном аспекте, данное описание изобретения обеспечивает способы для характеристики лигандов CLEC-2, которые могут функционировать в качестве активаторов или ингибиторов CLEC-2. Такие способы оценивают активность CLEC-2 в виде CLEC-2-опосредованной агрегации CLEC-2. В одном варианте осуществления, эти анализы выполняют in vitro или in vivo с использованием анализов адгезии тромбоцитов на основе кровотока цельной крови.
[0227] Различные исследования предполагают, что, хотя CLEC-2 может не требоваться для начального прикрепления к покрытым коллагеном поверхностям, CLEC-2 может требоваться для
стабилизации агрегатов тромбоцитов и роста тромбов. Роль CLEC-2 в тромбозе была исследована, например, с использованием CLEC-2-химер в мышах. Эти исследования предполагают, что CLEC-2 участвует в стабилизации тромбов как in vitro, так и in vivo
(Suzuki-Inoue, К. et al., 2010, J. Biol. Chem. 285, 2449424507) . Эта роль рецептора CLEC-2 в стабилизации агрегатов тромбоцитов in vitro была также недавно продемонстрирована с использованием анализа перфузии крови, где лишенные CLEC-2 тромбоциты были способны прикрепляться нормально к покрытой коллагеном поверхности, но последующее образование стабильных агрегатов тромбоцитов сильно нарушалось при средних - высоких коэффициентах сдвига (May, F. et.al., 2009 Blood, 114:34643472). В результате таких исследований, была выдвинута гипотеза, что CLEC-2 может способствовать росту тромба "отбиранием" функции GPVI в тромбоцитах, рекрутированных к растущему тромбу, которые не будут получать контакта с коллагеном (Neswandt, В. et. al. , 2011, J. Throm. Haemost, 9, suppl 1:92-104). Другими словами, хотя прикрепление тромбоцитов к покрытой коллагеном поверхности и начальное образование тромба зависит от GPVI, дальнейшая агрегация тромбоцитов, т.е. образование тромба, требует CLEC-2.
[022 8] Адгезию тромбоцитов при проточных условиях на покрытых коллагеном поверхностях, использовали рутинным образом для исследования in vitro и in vivo роста и стабильности тромбов. Эти проточные эксперименты выполняли, например, с использованием прибора, такого как BioFlux (Fluxion Biosciences, South San Francisco, CA) , который обеспечивает возможность подражания физиологическому потоку сдвига
(сдвиговому течению) в модели in vitro, с предоставлением также высокопроизводительного формата луночного планшета.
[0229] Спустя немного времени было обнаружено, что анализы
адгезии тромбоцитов in vitro на основе протекания с
использованием цельной крови могли бы быть использованы для
идентификации активаторов или ингибиторов CLEC-2-
опосредованного образования агрегатов тромбоцитов. В одном варианте осуществления, поверхность, которая подвергается
сдвиговому протеканию цельной крови покрывают родоцитином,
который, как известно, эффективно стимулирует CLEC-2-зависимое
образование агрегатов тромбоцитов. Как подробно описано в
Примере 10 (ФИГ. 12А), применение покрытой родоцитином
поверхности поддерживает накапливание активированных
тромбоцитов в тромбах в условиях протекания в цельной крови. Этот способ анализа выполняли затем в присутствии предположительных ингибиторов или активаторов CLEC-2-зависимого образования агрегатов тромбоцитов. Например, пробу цельной крови инкубируют с соединением, о котором известно, что он связывает CLEC-2 (например, с любым из описанных здесь лигандов CLEC-2). Затем может быть сделано сравнение образования агрегатов тромбоцитов в присутствии и в отсуствие этого лиганда CLEC-2. Одним ингибитором CLEC-2-зависимого образования агрегатов тромбоцитов является лиганд CLEC-2, который уменьшает уровень образования агрегатов тромбоцитов по меньшей мере на 50%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% в сравнении с уровнем образования агрегатов тромбоцитов в отсутствие лиганда CLEC-2.
[0230] Этот анализ может быть также использован для идентификации модуляторов лиганда CLEC-2. Опять, как описано в Примере 10, проба цельной крови может быть инкубирована в присутствии лиганда CLEC-2 в дополнительном присутствии или в отсутствие модулятора лиганда CLEC-2. Соединение, которое является функциональным модулятором лиганда CLEC-2, будет обращать активность этого лиганда CLEC-2. Например, если лиганд CLEC-2 уменьшил уровень образования агрегатов тромбоцитов, добавление функционального модулятора лиганда CLEC-2 будет приводить к увеличению образования агрегатов тромбоцитов относительно уровня, наблюдаемого в присутствии только лиганда CLEC-2.
[0231] Во втором протоколе, применимом для характеристики функции лиганда CLEC-2, выполняют анализы адгезии тромбоцитов на основе протекания in vitro с использованием цельной крови, где эту цельную кровь подвергают действию поверхности, покрытой растворимым коллагеном типа I (коллагеном I). Например, Пример 10 (ФИГ. 12В) показывает анализы, выполненные с использованием
BIOFLUX, в которых лунки были покрыты растворимым коллагеном I хвоста крысы. В этом протоколе, пробу цельной крови инкубируют с родоцитином перед протеканием мимо покрытой растворимым коллагеном I поверхности. Присутствие родоцитина в пробе, приводило к образованию более крупных агрегатов тромбоцитов в сравнении с агрегатами тромбоцитов, образованными после протекания крови, лишенной родоцитина. Для тестирования способности лиганда CLEC-2 активировать или ингибировать CLEC-2-опосредованное образование агрегатов тромбоцитов, пробу цельной крови инкубируют с лигандом CLEC-2 перед стадией протекания крови. Инкубирование с лигандом CLEC-2 может выполняться до или после инкубирования с родоцитином. Альтернативно, лиганд CLEC-2 и родоцитин добавляют одновременно с пробой крови. Как описано выше, затем может проводиться образование агрегатов тромбоцитов в присутствии и в отсутствие лиганда CLEC-2. Ингибитор CLEC-2-зависимого образования тромбоцитов является лигандом CLEC-2, который уменьшает уровень образования агрегатов тромбоцитов по меньшей мере на 50%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% в сравнении с уровнем образования агрегатов тромбоцитов в отсутствие лиганда CLEC-2. Далее, модулятор лиганда CLEC-2 может быть охарактеризован в отношении его способности обращать действия лиганда CLEC-2 на CLEC-2-опосредованное образование агрегатов тромбоцитов, как описано выше. Соединение, которое является функциональным модулятором лиганда CLEC-2, будет обращать активность лиганда CLEC-2. Например, если лиганд CLEC-2 уменьшил уровень агрегации тромбоцитов, добавление функционального модулятора лиганда CLEC-2 будет приводить к увеличению образования агрегатов тромбоцитов относительно уровня, наблюдаемого в присутствии только лиганда CLEC-2.
[0232] Понятно, что эти способы анализов для характеристики функциональной активности лигандов CLEC-2 и модуляторов лигандов CLEC-2 не ограничиваются использованием с пробами цельной крови. В некоторых вариантах осуществления, проба крови может включать в себя один или несколько природных компонентов крови. Эта проба крови может, в некоторых вариантах
осуществления, включать в себя один или несколько искусственных компонентов крови. Альтернативно, проба крови, используемая в этом проточном анализе, является пробой, которая содержит цельную кровь или обогащенную тромбоцитами плазму или промытые тромбоциты.
[0233] Функциональная активность лигандов CLEC-2 и модуляторов может быть тестирована с использованием различных клеточных линий, например, эндотелиальных клеток, дендритных клеток, лейкоцитов, моноцитов, нейтрофилов, макрофагов, лимфоидных клеток, иммунных клеток, т.е. природных Т-клеток-киллеров, В-клеток. Различные функциональные анализы, включающие в себя взаимодействия тромбоцит-тромбоцит, взаимодействия тромбоцит-моноцит, взаимодействия тромбоцит-лейкоцит, передачу сигнала кальция, анализы адгезии клеток, анализы секреции, LPS-индуцированные анализы воспалении, анализы миграции клеток, Syk- и Srk-анализы фосфорилирования, анализы ELISA для связывания лигандов, анализы занятия рецепторов на основе проточной цитометрии или анализы с использованием диагностических маркеров. Реагенты и синтетические эквиваленты модулятора рецептора CLEC-2, которые могут быть тестированы с аптамерными лигандами, являются сшитыми антителами, рецепторами CLEC-2 исследований гомофильного взаимодействия, ингибиторами и активаторами малых молекул, пептидами, белками, моноклональными антителами, липопротеинами, липидированными пептидами и т.д.
[0234] Следующие примеры обеспечены для иллюстрации некоторых аспектов описания данного изобретения. Эти примеры не рассматриваются как ограничивающие каким-либо образом объем этого описания.
Пример 1: Идентификация нуклеиновокислотных лигандов к CLEC-2
[0235] Способ SELEX использовали для получения лигандов, которые связывают CLEC-2, как описано и иллюстрировано на Фиг. 1.
[023 6] Библиотеки кандидатных ДНК генерировали тепловым
ПРИМЕРЫ
отжигом и быстрым охлаждением 1 нмоль олиго ДНК-матрицы и 1,5 нмоль олиго 5'-ДНК-праймера. Последовательностями олиго ДНК-матрицы Sel2 для конструирования кандидатной смеси являются: 5'- TCTCGGATCC TCAGCGAGTC GTCTG(N40)CCGCA TCGTCCTCCC ТА-3' (SEQ ID N0:4) (N4 0 представляет 4 0 смежных нуклеотидов, синтезированных с эквимолярными количествами А, Т, G и С) , олиго 5'-праймера и олиго З'-праймера, являются, соответственно, 5'-GGGGGAATTC
TAATACGACT CACTATAGGG AGGACGATGC GG-3' (последовательность
Т7-промотора указана жирным шрифтом), и 5'-TCTCGGATCC
TCAGCGAGTC GTCTG-3'. Эти реакции заполняли Exo-Klenow,
останавливали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 2 мМ и
экстрагировали PCI [фенол:хлороформ:изоамиловый спирт
(25:24:1)] и затем смесью хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) . Этот экстракт обессоливали, концентрировали и невключенные нуклеотиды удаляли с использованием колонки Amicon 10 spin. ДНК-матрицы использовали в реакции транскрипции для генерирования 2'-фторпиримидиновой исходной библиотеки. Условиями транскрипции in vitro были 40 мМ Трис-HCl рН 8,0, 4% PEG-800, 12 мМ MgCl2, 1 мМ спермидин, 0,002% Тритон, 5 мМ ДТТ, 1 мМ rGTP, 1 мМ гАТР, 3 мМ 2'F-CTP, 3 мМ 2'F-UTP, 8 мкг/мл неорганической пирофосфатазы, 0,5 мкМ ДНК-библиотеки и Т7-полимераза. Смеси для транскрипции инкубировали в течение ночи при 37°С, обрабатывали ДНКазой, дважды экстрагировали смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), концентрировали с использованием колонки Amicon 10 spin и очищали в геле на 12% денатурирующем геле электрофореза в ПААГ. РНК элюировали из геля и буфер заменяли и концентрировали с ТЕ-промывками в колонке Amicon 10 spin.
[0237] Селекцию (отбор) CLEC-2 начинали с комплексной библиотекой из ~1014 различных 2-фторпиримидиновых РНК-последовательностей. Этот комплексный пул РНК предварительно очищали против 6HOTHH-PEG6-H1Sб пептида, иммобилизованного на магнитных стрептавидиновых гранулах. Эту предварительно очищенную РНК связывали с очищенным рекомбинантным меченом на N-конце HislO белком CLEC-2 (SEQ ID N0:3). Очищенный меченый
гистидином белок CLEC-2 получали из R &D Systems (Minneapolis, MN), Catalog No. 1718-CL-050, и включали остатки Gln58-Pro229.
[0238] Селекция лиганда CLEC-2 выполняли в буфере для
связывания "F". Буфер для связывания F стоит из 2 0 мМ HEPES рН
7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ СаС12 и 0,01% БСА. Начиная в Раунде 3,
0,0024% тРНК дрожжей включали в раундах реакций связывания.
Комплексы Белок-РНК распределяли на диске 2 5 мм нитроцеллюлозы
с промыванием. Связанную РНК экстрагировали из
нитроцеллюлозного диска инкубацией в PCI (25:24:1). Добавляли воду и эту водную фазу экстрагировали с последующей экстракцией смесью хлороформ:изоамиловый спирт. Полученную связанную РНК осаждали этанолом. Одну четверть этой осажденной РНК отжигали до З'-праймера и обратно транскрибировали с использованием AMV RT. Использовали полную RT-реакцию в ПЦР с 5'- и 3'-праймерами и стандартными условиями ПЦР для генерирования ДНК-матрицы для следующего раунда генерирования РНК. Конкретные условия для каждого раунда селекции показаны на ФИГ. 2.
[0239] Обогащение библиотек лигандов в отношении CLEC-2 подвергали мониторингу в прямых исследованиях связывания с использованием пулов РНК радиоактивно меченых лигандов из соответствующих раундов и растворимого CLEC-2. Исследования связывания выполняли с Р32 меченой на конце РНК, добавляемой к серийным разведениям CLEC-2 в буфере для связывания F. Для приготовления радиоактивно меченых РНК для исследований связывания, сто пикомолей РНК дефосфорилировали Бактериальной Щелочной Фосфатазой при 50°С в течение 1 часа. Эту реакцию экстрагировали смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) и осаждали этанолом. Три пмоль дефосфорилированной РНК метили на конце с использованием Полинуклеотидкиназы Т4 с добавленным буфером и 2 0 мкКи у-32Р-АТФ и затем очищали с использованием спин-колонки Biorad MicroBio Spin Р-30. Меченую на конце РНК разбавляли до конечной концентрации 2 000 имп/мкл и денатурировали нагреванием при 65° С в течение 5 минут. Разведения РНК и CLEC-2 уравновешивали при 37°С перед использованием. РНК (5 мкл) добавляли к варьирующимся
концентрациям CLEC-2 (15 мкл) при 37 °С и инкубировали вместе в течение 5-15 минут. Затем эту комплексную смесь RNA/CLEC-2-белок наносили на нитроцеллюлозную мембрану Protran ВА8 5, нанесенную в виде слоя на мембрану Genescreen Plus Nylon, в 96-луночной вакуумной распределительной системе с промыванием. Эту мембрану экспонировали с использованием фосфоресцирующего экрана, сканировали и количественно обрабатывали с использованием Molecular Dynamics Storm 840 Phosphorimager. Связанную фракцию рассчитывали делением количества импульсов на нитроцеллюлозе на общее количество импульсов и коррекцией в отношении фона. Обогащение связывания селекции CLEC-2 показано на ФИГ. 3.
Пример 2j Секвенирование и идентификация
нуклеиновокислотных лигандов CLEC-2
[0240] Конечные ПЦР-продукты, представляющие aHTH-CLEC-2-обогащенные библиотеки лигандов из Раунда 10 экспериментов SELEX, описанных в Примере 1, расщепляли EcoRI и BamHI, очищали с использованием набора для очистки и направленно клонировали в линеаризованный вектор pUCl. Бактериальные колонии высевали штрихом для получения отдельных клонов и ночные культуры (5 мкл) инокулировали из этих отдельных колоний. Плазмидную ДНК готовили из отдельных колоний с использованием наборов Invitrogen Purelink Quick Plasmid Miniprep и секвенировали с использованием праймера вектора. В целом секвенировали 42 колонии с 20, представляющими уникальные последовательности. Каждую из этих уникальных последовательностей оценивали в отношении CLEC-2-аффинности (в соответствии со способами в Примере 1) и способности ингибировать индуцированную родоцитином CLEC-2-зависимую агрегацию тромбоцитов (в соответствии со способами в Примере 8) . После анализа полученных данных для 20 клонов, идентифицировали лиганд S2-20 как высокоаффинный ингибитор CLEC-2-зависимой агрегации и характеризовали более полно, как описано подробно ниже.
[0241] Последовательности случайного района ДНК, соответствующего РНК случайного района, полноразмерной ДНК, полноразмерной РНК и полноразмерной РНК с модификациями в
отношении аптамера S2-20 показаны в Таблице 1. Полноразмерными называют последовательности, происходящие как из способа SELEX, содержащие последовательности, произведенные как из случайной части библиотек лигандов, используемых в способе SELEX, так и последовательности из фиксированных частей последовательности, фланкирующих этот случайный район.
SEQ ID NO: относятся к немодифицированным версиям лигандов, описанных в столбце, озаглавленном "Модифицированная последовательность", Последовательности перечисляются в 5'-3'-направлении
rG-2'Ribo G; rA-2'Ribo А; fC-2'-фтop С; ги-2'-фтор U [0242] Аффинность aнти-CLEC-2-лигaндa в отношении CLEC-2 определяли прямыми исследованиями связывания радиоактивно меченой РНК лиганда и растворимого CLEC-2, как описано выше в Примере 1. Аффинность aHTH-CLEC-2 лиганда, S2-20, в отношении CLEC-2 была высокой, с Ко! ~1,4 нМ.
Пример 3: Зондирование укорочения последовательности анти-CLEC-2-лиганда
[0243] Скрининг S2-20 на потенциальную вторичную структуру
проводили с использованием mfold-сервера
(mfold.bioinfo.rpi.edu). Описание этих способов можно найти на сайте сервера, а также в М. Zuker (2003) "Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction." Nucleic
Укорочения S2-20
Acids Res. 31 (13), 3406-15 и D.H. Mathews, et al. (1999) "Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure" J. Mol. Biol. 288, 911-940. Генерировали ряд укороченных соединений для анти-CLEC-2-лиганда S2-2 0 (Таблица 2) и определяли их аффинность в отношении CLEC-2 (Таблица 2). За исключением RB587, все укороченные соединения транскрибировали in vitro из ДНК-матриц. RB587 синтезировали на ДНК/РНК-синтезаторе Mermade 12 с idT, предварительно загруженным CPG. Данные связывания для полноразмерного аптамера S2-20, укороченного S2-20 Т10, и RB587 показаны на ФИГ. 4.
SEQ ID NO: относится к немодифицированным версиям лигандов, описанных в столбце, озаглавленном "Модифицированная последовательность", Последовательности перечисляются в 5'-3'-направлении
rG-2'Ribo G; rA-2'Ribo A; fC-2'^Top С; Ш-2'-фтор U
[0244] Вторичная структура укороченных S2-20 Т10 и RB587
представлена в ФИГ. 5. Предсказанные границы 5'- и 3'-концов являются достаточными для образования Стебля 1 и функциональных анти-СЪЕС-2-лигандов. Если 3'-часть стебля 1 удалена, как в S2-2 0 Т5, связывание с CLEC-2 уничтожается. Данные связывания для S2-20 Т7 и S2-20 Т8 указывают на то, что стебель 1 может иметь длину 5 п.н. и все еще сохранять сравнимую аффинность связывания. Удлинение стебля 1, с б п.н. до 8-10 п.н., как показано с S2-20 Тб ext8 и S2-20 Тб extlO, также связывало CLEC-2 с высокой аффинностью. Таким образом, стебель 1 может иметь длину 5-10 п.н. со сравнимыми аффинностями связывания.
[0245] Стебель 2 является стеблем из 4 п.н., предпочтительно с парой нуклеотидов неоднозначного спаривания в нижней части. S2-20 Т10 имеет единственную замену, изменяющую пару нуклеотидов нижней части стебля 2 из U-G в C-G. Эта замена хорошо переносится, как продемонстрировано значимым
(приблизительно 30-кратным) увеличением Kd.
Пример 4: Мутационное зондирование последовательности анти-СЪЕС-2-лиганда
[024 6] Генерировали ряд мутантных соединений для укорочений S2-2 0, содержащих нуклеотидные мутации в районах петли, и определяли их аффинность связывания в отношении CLEC-2
(Таблица 3) . За исключением RB58 8, все мутантные укорочения транскрибировались in vitro из ДНК-матриц. RB5887 синтезировали на ДНК/РНК-синтезаторе Mermade 12 с idT, предварительно загруженным CPG.
Mut 9
S2--2 0 TIO Mut. .10
rGrGrGrA
ЈUrCfCrGrGrAfСfUrGrGrGfCrAfCrAfUrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 60
3 5
S2-2 0 Tl 0 Mut. 11
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfСfUrGrGrGfCfUrGrAfUrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 6 0
S2-2 0 Tl 0 Mutl2
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfСfUrGrGrGfCfUfCfUfUrAfUfUfCfCfCrGfCrG?CrAfUfC
") Л
S2-2 0 Tl 0 Mat 13
rGrGrGrA
f UrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfCrArArAfUtUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
2 .4
3 8
32-20 Tl 0 Mut 14
rGrGrGrA -
fUrGfCrGrGrAfСfUrGrGrGfCfUfCrAfUfUfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 6 0
S2-20
TIO
Mutlb
rGrGrGrA --
fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfCrAfUrArAfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
3 0
S2-20 TIO Hut 16
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfCrAfUrAfUrAfCfCtCrGfCrGfCrAfUfC
> 6 0
S2-20 TIO Mut 17
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfUfUfCrAfUrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
8 . 8
S2-20 TIO Mut 18
rGrGrGrA-
f UrGf CrGrGrAf CfUrGrGrGfCfСf CrAf UrAfUf UfCfCf CrGf CrGf CrAf UfC
51 . 7
S2-2 0 TIO Mut 19
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfUrAfUrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
5 . 7
S2-20 TIO Mut 2 0
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfCrGfUrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
1. 2
S2-2C
TIO
Mut21
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfCrAfCrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
i 7
32-20 TIO Mut2 2
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfCrAfUrGfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
.J , о
S2-2 0 TIO Kut2 3
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfСfUfCrAfUrAfСfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
6. ','
л ^
S2-2 0 Tl 0 Mut 2 4
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfCrAfUrAfUfCfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 60
4 9
82 - 2 0 TIO Mut2 5
rGrGrGrA
ЈUrGfCrGrArAfCfUrGrGrGfCfUfCrAfUrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 6 0
ir f)
S2 - 2 0 TIO Mut2 6
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfUfUrGrGrGfCfUfCrAfUrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 60
S2-2G
TIO
Mut27
rGrGrGrA
fUrGfCrGrGrAfСfUrGrGrGfCfUfCrAfUfCfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 60
S2 - 2 0 TIO Mut 2 8
rGrGrGrA fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfC-
fUrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfOfС
> 60
,32-2 0 TIO Mut2 9
rGrGrGrA - fUrGfCrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfCrAfU-
fUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 6 0
S2-20 T4
Mut 3 0
rGrGrGrArGrGrAfCrGrAfUrGfCrGrGfUfCfUrGrGrGfCfUfCrAfUrAfUfUfCfС fCrGfCrGf CrAfUf С
6 . 3
.32-20 T4
Mut 31
rGrGrGrArGrGrAfCrGrAf UrG fCrGrGrGfС fUrGrGr G fС fUfCrAf UrAfUfUfС fС f С r G f С rG fCrAfUfC
4 . 3
j 32-20 j T4 j Hut32
| ,32-20
1 Mut33
rGrGrOrArGrGrAfCrGrAfOrGfCrGrerAfcrorGrOrGfCfOfCrArGrAfOfnfCfC
fCrGfCrGfCrAfUfC
12 .4
i'G г Gii'Gi" A -~ ¦"•-" <•¦* - *•
fUrGfCrGfUrAfCfUrGrGrGfCfUfCrAfUrAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 6 0
S2-20 T4 j Mut37
rGrGrGrA fUrGECrGrGrAfCfUrGrGrGfCfUfCrA
rAfUfUfCfCfCrGfCrGfCrAfUfC
> 60
SEQ ID NO: относится к немодифицированным версиям лигандов, описанных в столбце, озаглавленном "Модифицированная последовательность", Последовательности перечисляются в 5'-3'-направлении
rG-2'Ribo G; rA-2'Ribo А; гС-2'-фтор С; гсТ-2'-фтор U
[0247] Эта вторичная структура укороченной
последовательности S2-20 (ФИГ. 5) показывает, что имеются две структуры петли, где петля 1 является 5'-GAC-3' и петля 2 является 5'-CUCAUAUIJ-3' . Посредством мутационного анализа удалось получить более тщательное определение структур петель.
[0248] В основании 1 петли 1 замена либо А (мутант 25), С
(мутант 7), либо U (мутант 33) не были хорошо переносимыми. Мутант 7 по существу не имел специфического связывания с белком CLEC-2, и его химически синтезированную версию (RB58 8) использовали в качестве отрицательного контроля в дальнейших исследованиях. Второе основание петли 1 легко воспринимало замену либо G (мутант 31), либо U (мутант 8), что позволяет предполагать, что это положение способно переносить либо пурины, либо пиримидины. Данные связывания двойного мутанта
(мутанта 1) согласуются с данными моносайтовых мутантов. Третье основание петли 1, предпочтительно является С. Замена С на другой пиримидин U (мутант 2 6) не была хорошо переносимой, и не была заменой G (мутант б) . На основании этих данных, петля 1 может быть описана как имеющая консенсусную последовательность 5-GNC-3', где "N" представляет любое из оснований (A, G, С, Т или U).
[0249] Петля 2 является петлей из 8 оснований с последовательностью 5'-CUCAUAUU-3'. Анализ мутантов позволяет предполагать, что пиримидин является предпочтительным для основания 1. Замена U (мутант 17) хорошо переносилась, но
наблюдали слабую потерю аффинности. Замена основания 1 на G
(мутант 9) не переносилась хорошо. U является предпочтительным во втором основании петли 2, и замена либо А (мутант 10), либо С (мутант 18) не переносилась хорошо. Пиримидин является предпочтительным в третьем основании петли 2 (мутант 19) и замена на пурин (мутант 11) не переносилась хорошо. Основание 4 петли 2 могло переносить пурин (мутант 20) или пиримидин
(мутант 12). Хотя это положение может выносить либо пурин, либо пиримидин, делеция этого основания не переносилась хорошо
(мутант 28). Кроме того, замена на G (мутант 32) также переносилась. Хотя это положение могло легко переносить замены, делеция этого положения не переносилась хорошо (мутант 37) . Пурин является предпочтительным в основании б петли 2. Замена этого пурина (мутант 22) переносилась, но пиримидиновые замены
(как мутант 14, так и мутант 27) переносились. Пиримидин является предпочтительным в основании 7 петли 2 (мутант 23) . Замена на А (мутант 15) в основании 7 приводит к увеличению Kd. Хотя связывание мутанта 15 (Kd ~30 нМ) является значительно лучшим, чем многих из других генерированных конструктов мутантов, пурин в этом положении является менее желательным, чем пиримидин. U является предпочтительным в основании 8 петли 2. Замена этого U либо на С (мутант 24), либо А (мутант 16) не переносились хорошо.
[0250] На основании этих данных, предпочтительная консенсусная последовательность петли 2 может быть представлена следующим образом: 5'-Y U Y N N R Y U-3', где "Y" представляет пиримидин, "R" представляет пурин и "N" представляет любой из этих четырех оснований.
Пример 5: Вырожденный SELEX
[0251] Для идентификации ключевых нуклеотидов в последовательности лиганда CLEC-2 S2-2 0 выполняли вырожденный SELEX. Исходным матричным олиго для вырожденного SELEX была последовательность S2-20 с вырожденностью, введенной конструированием в район N4 0. Синтез этого вырожденного матричного олиго S2-2 0 был основан на 60% исходных оснований и 13,3% каждого из оставшихся трех оснований на протяжении
последовательности случайного района S2-20. Введением вырожденной версии последовательности S2-2 0 в селективное давление SELEX, можно определить, какие замены нуклеотидов являются предпочтительными для связывания с CLEC-2. Исходный пул вырожденных РНК S2-2 0 имел сравнимое связывание с "наивным" пулом Sel 2 для CLEC-2. После четырех раундов отбора, аффинность связывания пула РНК раунда 4 из вырожденного отбора был сравним с РНК раунда 10 из первоначального отбора.
Конкретные условия для вырожденного отбора S2-2 0 показаны на ФИГ. б. Сорок три аптамера из раунда 3 и сорок шесть аптапмеров из раунда 4 клонировали и секвенировали, как описано в Примере 2.
[0252] Исходный вырожденный пул конструировали с 60% консервативностью исходной последовательности. Посредством анализа коэффициентов частоты замен в отдельных положениях, можно определить, какие основания легко переносят замену. Частота каждого нуклеотида в отдельных положениях для последовательностей как раунда 3, так и раунда 4 для случайного района иллюстрирована на ФИГ. 7. Первые 2 4 нуклеотида в случайном районе этих последовательностей являются высоко консервативными. Положения оснований 25-40 содержат значимо меньшую консервативность, в сравнении с фоном 60%, согласно конструированию. Эти данные согласуются с данными укорочений, показывая минимальный незаменимый район, необходимый для связывания с CLEC-2.
[02 53] Этот вырожденный анализ отбора выявил также стебель 1, который мог бы выносить неоднозначные пары оснований, а также некоторые минимальные несвязанные основания, с предположением, что структура этого стебля остается интактной. В соответствии с данными укорочения, стебель 2 был высококонсервативным в вырожденном отборе, с парой оснований U-G в нижней части, предпочитаемой со 100%-ной частотой.
[0254] Для петли 1, первое основание (G) в этой петле произведено из 5'-фиксированного района и в результате в этом положении не наблюдались мутации. В основании 2 (А) петли 1, по-видимому, нет предпочтения в отношении А, но наблюдали
другие замены, и репрезентация А в этом положении, по-видимому, уменьшается по мере прогрессирования от раунда 3 до раунда 4. В соответствии с мутационными данными, С в третьем основании в петле 1 был консервативным в 100% этих последовательностей как из раунда 3, так из раунда 4. Для петли 2, сходные наблюдения получали при сравнении результатов этого вырожденного отбора с данными мутаций в Примере 3.
[0255] В общем и целом, часть случайного района, участвующего в связывании с CLEC-2 (основания 1-24 случайного района), совмещалась в высокой степени с исходной последовательностью S2-20. Остальные основания этого случайного района (основания 25-40), которые не являются необходимыми в минимальной структуре, были гораздо более дивергентными.
Пример 6: Регуляторные агенты для последовательности анти-CLEC-2-лиганда
[0256] Лиганды кодируют информацию, необходимую для конструирования модуляторов нуклеиновых кислот, или регуляторных агентов для них, на основе правил спаривания комплементарных оснований Уотсона-Крика. Эффективность конкретного регуляторного агента зависит от нескольких факторов, включающих в себя доступность района-мишени этого лиганда для нуклеации регуляторным агентом, а также отсутствие внутренней вторичной структуры или ограниченная внутренняя вторичная структура в этом регуляторном агенте, которая требовала бы денатурации перед образованием полного дуплекса с этим лигандом. Для определения районов анти-СЪЕС-2-лигандов, которые могли бы быть предпочтительными районами для ассоциации с нуклеиновокислотными модуляторами, ряд регуляторных агентов
(См. Таблицу 4 и ФИГ. 8) были сконструированы для RB587.
[0257] Для тестирования эффективности всех шести регуляторных агентов (RB581-58 6) использовали анализ смещения
(сдвига) в геле. В этом анализе, RB587 метили на конце у-Р32-А1Ф и добавляли в следовых количествах к немеченому RB587 и затем инкубировали либо с буфером, либо с различными молярными отношениями одного из шести регуляторных агентов. Более конкретно, молярную концентрацию немеченого RB58 7 поддерживали
постоянно при 1 мкМ, тогда как диапазон регуляторного агента (8
мкМ - 0,25 мкМ) добавляли в реакционную смесь, приводя к
диапазону молярных отношений 1:8-1:0,25 RB587 к регуляторному
агенту. Реакции инкубировали в течение 15 минут при 37 °С,
наносили на гель, содержащий 16% нативный
полиакриламид/О,5хТВЕ/2 мМ СаС1г и подвергали электрофорезу в
течение 3 часов при 10 В. Затем этот гель снимали, заворачивали
в Saran-обертку, экспонировали с использованием экрана
формирователя сигналов изображения фосфора в течение 1 часа в
светонепроницаемой кассете и сканировали при помощи Storm 840.
Полученный скан показывал нативное положение одного RB58 7, и
RB58 7 плюс варьирующих молярных количеств регуляторного агента,
смещенных кверху вследствие гибридизации этого лиганда с
регуляторнвм агентом. Результаты минимального молярного
отношения регуляторного агента, необходимого для разрушения
нативной укладки RB587, показаны в Таблице 4. Эта вторичная
структура анти-СЪЕС-2-лиганда способна эффективно
Регуляторные агенты
модулироваться с использованием регуляторных агентов.
SEQ ID NO: относятся к немодифицированным версиям лигандов, описанных в столбце, озаглавленном "Модифицированная последовательность", Последовательности перечисляются в 5'-3'-направлении
mU=2'-О-метилуридин; тА=2'-О-метиладенозин; mG=2'-0-метилгуанозин; тС=2'-О-метилцитозин
Пример 7: Способы оценивания антитромбоцитарной активности анти-CLEC-2-лигандов
Приготовление промытых тромбоцитов (WP) и исследования
агрегации:
[0258] Промытые тромбоциты человека готовили в основном, как описано Mustard et al. (1972; Br.J.Haematol 22, 193-204) . Вкратце, кровь человека собирали в виде одной шестой объема буфера кислота/цитрат/декстроза (ACD) (85 мМ цитрат натрия, 65 мМ лимонная кислота и 110 мМ глюкоза), помещали в водяную баню при 37°С и выдерживали в течение 30 минут, затем центрифугировали при 2 50хд в течение 16 минут при комнатной температуре. Богатую тромбоцитами плазму удаляли и центрифугировали при 22 00хд в течение 13 минут при комнатной температуре, затем ресуспендировали в 40 мл HEPES-забуференного раствора Тироде (136,5 мМ NaCl, 2,68 мМ КС1, 1 мМ МдС12, 2 мМ СаС12, 12 мМ NaHC03, 0, 43 мМ NaH2P04, 5,5 мМ глюкоза, 5 мМ HEPES рН 7,4, 0,35% бычий сывороточный альбумин), содержащего 10 Е/мл гепарин и 5 мкМ (конечная концентрация) простагландин 12
(PGI2). Эту суспензию тромбоцитов инкубировали в водяной бане 37°С в течение 10 минут, добавляли 5 мкМ (конечная концентрация) PGI2 и эту смесь центрифугировали при 1900хд в течение 8 минут. Полученный осадок ресуспендировали в 4 0 мл забуференного HEPES раствора Тироде, содержащего 5 мкМ
(конечная концентрация) PGI2, и затем инкубировали в течение 10 минут в водяной бане 37°С и центрифугировали при 1900хд в течение 8 минут. Этот осадок ресуспендировали при плотности ЗхЮ8 тромбоцитов/мл в забуференном HEPES растворе Тироде, содержащем 0,1 Е/мл апиразы картофеля, и инкубировали в водяной бане 37°С перед использованием в исследованиях агрегометрии.
[0259] Индуцированную родоцитином (Aggretin; покупаемый из Frankfurt University Hospital) агрегацию WP тромбоцитов, определяли измерением трансмиссии света через 0,5 мл суспензии перемешиваемых (12 0 0 об/мин) промытых тромбоцитов (42 5 мкл промытых тромбоцитов, 2 5 мкл фибриногена, 2 5 мкл ингибиторов или контролей и 2 5 мкл родоцитина) в люмиагрегометре при 37°С
(Chrono-Log Corp. Havertown, PA). Фон этого прибора устанавливали с использованием 0,5 мл забуференным Hepes раствора Тироде. Перед измерениями агрегации, суспензию тромбоцитов дополняли 1 мг/мл фибриногена (конечная
концентрация). Агрегацию тромбоцитов инициировали добавлением указанных концентраций родоцитина (для получения процентной агрегации между 70-90%) и трансмиссию света непрерывно регистрировали в течение по меньшей мере б минут. Для скрининга анти-СЪЕС-2-лигандов или контролей на способность блокировать индуцированную родоцитином агрегации тромбоцитов, анти-СЪЕС-2-лиганды добавляли к суспензии тромбоцитов при разведении для получения желаемой конечной концентрации и инкубировали в течение 3 минут перед добавлением родоцитина и эту реакцию регистрировали в течение 4-6 минут после добавления родоцитина.
[02 60] Эффективность родоцитина определяли для каждого донора из максимальной степени процентной агрегации, полученной из кривой доза-ответ с использованием серийных разведений родоцитина из диапазона приблизительно 3-60 нМ в буфере 2 0 мМ Трис рН 8,0, 50 мМ NaCl, для определения подходящей действующей концентрации. Способность анти-СЪЕС-2-лигандов ингибировать индуцированную родоцитином агрегацию тромбоцитов тестировали в препаратах WP, как описано выше, с использованием широкого диапазона концентраций анти-СЪЕС-2-лиганда. ФИГ. 9А и 9В показывает графики индуцированной WP агрегации CLEC-2 лигандов. S2-20 (След 2 и След 6; 1 мкМ и 0,5 мкМ); RB587 (След 1 и След 5; 1 мкМ и 0,5 мкМ); RB588 (След 3 и След 7; 1 мкМ и 0,5 мкМ); и Контроли (След 4 и След 8; 2 0 нМ родоцитин). Положение спустя б минут после добавления родоцитина отмечено на следе толстой направленной вниз стрелкой. Как показано на ФИГ. 9А и 9В, аптамеры S2-20 и RB587 были полностью эффективными в ингибировании индуцированной родоцитином агрегации WP в присутствии приблизительно 20-30 нМ агониста родоцитина.
Пример 8: Способы для оценивания антитромботической активности анти-СЪЕС-2-лигандов полноразмерного клона S2-20 и укороченного RB58 7 в анализах индуцируемой родоцитином агрегации тромбоцитов
[02 61] Промытые тромбоциты человека готовили в основном, как описано выше. Эффективность родоцитина определяли для каждого донора из максимальной степени процентной агрегации, полученной из кривой доза-ответ с использованием серийных
разведений родоцитина из приблизительно 3-60 нМ, для определения подходящей действующей концентрации, как описано в Примере 7. Способность анти-СЪЕС-2-лигандов ингибировать индуцированную родоцитином агрегацию тромбоцитов тестировали в препаратах WP, как описано выше. Данные из анализа доза-ответ S2-20 и RB587 представлены на ФИГ. 10А и 10В. ФИГ. 10А является диаграммой индуцированной родоцитином агрегации тромбоцитов, выраженной в виде процента от контроля для варьирующихся концентраций клона S2-2 0 нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 в промытых тромбоцитах человека. ФИГ. 10В является диаграммой индуцированной родоцитином агрегации тромбоцитов, выраженной в виде процентв от контроля для варьирующихся концентраций клона S2-20 нуклеиновокислотных лигандов CLEC-2 RB587 и неактивного мутанта RB58 8 в промытых тромбоцитах человека. Наблюдали по существу полное ингибирование агрегации в присутствии 0,5 мкМ S2-20 или RB587 в течение б минут после добавления родоцитина.
Анализы родоцитин-индуцированной агрегации тромбоцитов человека для тестирования нуклеиновокислотных модуляторов нуклеиновокислотных лигандов CLEC-2 в WP.
[02 62] Промытые тромбоциты человека (WP) готовили в основном, как описано ранее. При тестировании широкого диапазона концентраций ингибиторов нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 получают величину 1Сэ5-юо- Эти величины IC95-100 представляют концентрацию ингибитора, необходимую для ингибирования на приблизительно 95-100% агрегации, вызываемой конкретной концентрацией рассматриваемых агонистов. При тестировании модуляторов на их способность обращения антитромботической активности, тромбоциты инкубируют в течение 3 минут с 2-4 мкМ аптамеров CLEC-2 (IC95-100) или буфером-F, с последующим добавлением различных молярных концентраций модуляторов (4:1; 2:1; 1:1 модуляторы:аптамеры) в течение 10 минут перед добавлением родоцитина и эту реакцию регистрируют в течение б минут. ФИГ. ЮС показывает диаграммы индуцированной родоцитином агрегации тромбоцитов, выраженной в виде процента от контроля для варьирующихся концентраций одного нуклеиновокислотного лиганда RB58 7 или в комбинации с
модуляторами лиганда CLEC-2 RB581, RB582, RB583, RB584, RB585 и RB58 6 в промытых тромбоцитах человека.
Пример 9: Анализ функции активации тромбоцитов с использованием проточной цитометрии (Р-Селектин; экспрессия CD62-P) с родоцитином (Аггретином)
Исследования с исполвзованием проточной цитометрии: [02 63] Проточную цитометрию с использованием Р-селектин-специфического антитела выполняли для оценивания способности аптамеров CLEC-2 ингибировать индуцированную родоцитином экспрессию Р-селектина человека. Экспрессия Р-селектина на поверхности тромбоцитов является маркером активации тромбоцитов. Суспензию промытых тромбоцитов человека (плотность Зх108 клеток/мл) разводили до 1/10 в буфере Тироде и хранили при 37°С. 5 мкл каждого соединения в буфере-F (Пул SEL2, S2-20, S2-20 Т4, S2-20 Т5, S2-20 Тб; 20 мкМ исходный раствор RB587 и RB588) добавляли в пробирки для анализа на 5 мл. Немедленно, добавляли 50 мкл разведенных тромбоцитов и осторожно смешивали. Эти пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение 3 минут. 2,5 мкл родоцитина (3,331 мкМ исходный раствор готовили в буфере 20 мМ Трис, 50 мМ NaCl, рН 8,0) добавляли в каждую пробирку, перемешивали и инкубировали в течение еще 5 минут. Эти пробирки переносили на лед и охлаждали в течение минуты. 2 0 мкл антитела CD62P-PE (Becton Dickinson; Cat#550561) добавляли в каждую пробирку и инкубировали в течение 2 0 минут на льду. Эти суспензии тромбоцитов в каждой пробирке дополнительно разводили 0, б мл охлажденного на льду ЗФР и анализировали в FACS-Calibur.
Детектирование экспрессии CD62 с исполвзованием FACS-Calibur:
[0264] Два отдельных дот-плота (один log SSC vs FSC и log FSC vs FL2-H) и гистограмму создавали на зоне обзора. Тромбоциты идентифицировали с использованием дот-плота SSC vs FSC (прибор корректировали для правильного обзора). Создавали один представляющий интерес район 1 (R1) вокруг этих тромбоцитов (во избежание подсчета остатков клеток как тромбоцитов). Тромбоциты в районе 1 (R1) наблюдали на дот-плоте
FSC vs FL2-H (с коррекцией FL2 с использованием контроля). Тромбоциты наблюдали также на построенных в виде гистограммы величинах vs FL2-H. Квадрантный статистический маркер устанавливали на дот-плоте FSC vs FL2-H с использованием контрольной пробирки и определяли статистические параметры (контроль; неокрашенные тромбоциты). Все эти пробы, начиная с находящегося в покое контроля (плюс антитело), собирали. Результаты строили в виде % от контроля (150 нМ активация родоцитина; нижний правый квадрант, обработанный как общая 10 0% активация) с использованием GraphPad Prism.
[0265] FACS-анализ, описанный выше, использовали для тестирования способности аптамеров S2-20, RB587 и 3 укорочений S2-2 0, ингибировать индуцированную родоцитином экспрессию Р-селектина в WP. Полученные данные иллюстрированы на ФИГ. НА и 11В, которые обеспечивают диаграммы индуцированной родоцитином экспрессии Р-селектина человека с использованием проточной цитометрии с Р-селектин-РЕ-антителом. Активность выражена в виде процента от контроля для 2 мкМ клона S2-2 9 и укорочений нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 в промытых тромбоцитах человека (ФИГ. 11 А) или 2 мкМ нуклеиновокислотного лиганда CLEC-2 RB587 и неактивного мутанта RB588 в промытых тромбоцитах человека (ФИГ. 11 В).
[0266] Лиганды CLEC-2 S2-20, RB587, S2-20-T4 и S2-20-T6, каждый, были способны значимо уменьшать индуцированную родоцитином экспрессию Р-селектина на поверхности WP человека, тогда как укорочения S2-20-T5 и RB588, которые не связывают CLEC-2, не обнаруживали ингибиторной активности, демонстрируя корреляцию между аффинностью лигандов в отношении CLEC-2 и ингибированием активности CLEC-2.
Пример 10: Хл vitro анализ адгезии тромбоцитов на основе протекания в цельной крови на активность аптамера CLEC-2 с использованием Bioflux(tm) 200 (Fluxion Biosciences, Inc.)
[02 67] Лиганды CLEC-2 характеризовали в отношении их способности ингибировать опосредованную CLEC-2 агрегацию тромбоцитов с использованием in vitro анализа адгезии тромбоцитов на основе протекания в присутствии цельной крови.
Приготовление целвной крови для эксперимента с перфузией и протеканием:
[02 68] Кровь брали из здорового волонтера в антикоагулянт РРАС (0,3 мМ) в шприцы на 60 мл с использованием иглы 19G х Ч дюйма. Эту кровь немедленно метили флуоресцентно 4 мкМ Calcein-АМ (Invitrogen P/N С3100 MP) в течение 1 часа при 37°С
(Calcein-AM добавляли к крови очень осторожно перевертыванием пробирки несколько раз для перемешивания и эту кровь использовали в пределах 3,5 часов вытягивания). При выполнении этого эксперимента с покрытыми фибриллярным коллагеном или родоцитином лунками, этот эксперимент начинали сразу же с использованием установок протекания цельной крови 5 дин/см2 при 37°С с использованием программы Bioflux(tm). При выполнении этого эксперимента с покрытой коллагеном хвоста крысы поверхностью, цельную кровь активировали 165 нМ родоцитином в течение 2 минут и затем этот эксперимент начинали немедленно с использованием установок протекания цельной крови 5 дин/см2 при 37°С с использованием программы Bioflux(tm). Эти данные (флуоресцентных изображений агрегатов тромбоцитов) собирали с использованием инвертированного микроскопа с временными интервалами флуоресценции (Zeiss 200М Axiovert Microscope, присоединенного к камере устройства Axiocam Charged-Coupled Device и программе Axiovision) в течение каждых б секунд для общей продолжительности 6-10 минут. Для тестирования тест-изделий
(аптамера CLEC-2 RB587 и неактивного контрольного лиганда RB58 8) 2 00 мкл меченой крови инкубировали с указанными концентрациями аптамеров (или буфера-F; в объеме 10 мкл) в течение 3-5 минут при комнатной температуре перед добавлением во входную лунку. Форматированные изображения файла тегированных изображений (формата Tiff) использовали для расчета интенсивности флуоресценции с использованием программы Bioflux Montage(tm) и затем эту таблицу результатов экспортировали в Microsoft excel и строили с использованием Graphpad Prism
(ФИГ.12А и ФИГ.12В).
Эксперименты с покрытой родоцитином поверхноствю:
[02 69] Родоцитин эффективно стимулирует зависимую от CLEC
2 агрегацию тромбоцитов (Пример 7; ФИГ. 9 и 10). Авторы анализировали образование агрегатов тромбоцитов на покрытой родоцитином поверхности для исследования аптамеров CLEC-2 в условиях протекания. Для этих экспериментов протекания рутинным образом использовали 48-луночные планшеты Bioflux (P/N 9000017) . Для покрытия родоцитином, эти планшеты примировали буфером 20 мМ Трис рН 8,0, 50 мМ NaCl в течение 5 минут при 5 дин/см2 и затем 50 мкг/мл разведенного родоцитина перфузировали из выходной лунки в течение 10 минут при 5 дин/см2. Покрытые коллагеном планшеты использовали в качестве контролей. Для покрытия коллагеном эти планшеты примировали 0,02 М уксусной кислотой в течение 5 минут при 5 дин/см2 и затем 25 мкг/мл разведенного фибриллярного коллагена (Chrono-Log P/N 385) в 0,02 М уксусной кислоте перфузировали из выходной лунки в течение 10 минут при 5 дин/см2. Протекание останавливали и этот планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Белки покрытия промывали ЗФР при 5 дин/см2 в течение 10 минут. Планшет блокировали полным заполнением входной лунки (1 мл) 5% м/о БСА/ЗФР и перфузировали в канал при 5 дин/см2 в течение 15 минут. Протекание останавливали и этот планшет инкубировали в течение дополнительных 10 минут при комнатной температуре. Избыток ЗФР/БСА удаляли из всех лунок и этот планшет хранили при комнатной температуре для использования в тот же самый день или хранили при 4 в ЗФР/БСА до двух дней.
[0270] ФИГ. 12А показывает статические видеоизображения с флуоресцентными конечными точками действий лигандов CLEC-2 на накапливание тромбоцитов на покрытой родоцитином поверхности, подвергнутой действию протекающей цельной крови (А=покрытие родоцитина 50 мкг/мл; В=контрольное покрытие 25 мкг/мл фибриллярного коллагена; C-F покрытые 50 мкг/мл родоцитина, С=3 мкМ RB58 7; D=3 мкм RB58 8; Е=4 мкМ RB58 8; и Р=4 мкМ RB58 7) . График G показывает измерение данных поверхностей прикрепленных тромбоцитов, рассчитанных с использованием программы Fluxion Montage(tm). Эти данные выражены в виде процентной максимальной реакции неактивного мутанта RB58 8 на покрытой родоцитином поверхности. Как показано на ФИГ. 12А, родоцитин, поддерживал
накапливание активированных тромбоцитов в агрегатах тромбоцитов при условиях протекания в цельной крови. RB587, но не неактивный мутантный контрольный RB58 8, специфически блокировал эту активность (ФИГ. 12 А, сравните панели С с D и F с Е).
Эксперименты с покрытой растворимым коллагеном-I хвоста крысы поверхноствю:
[0271] Авторы также анализировали способность
активированных родоцитином (CLEC-2-специфическим агонистом) образовывать большие агрегаты тромбоцитов на покрытой коллагеном хвоста крысы поверхности в сравнении с неактивированными тромбоцитами при протекании. Затем авторы анализировали возможную функцию CLEC-2 в этом процессе с использованием RB587. Для этого анализа, планшеты покрывали 100 мкг/мл растворимого Коллагена I хвоста крысы (Invitrogen; Cat#A10483-01) , как описано выше. Эти планшеты примировали 0,02 М уксусной кислотой в течение 5 минут при 5 дин/см2 и затем 2 5 мкг/мл разведенного фибриллярного коллагена (Chrono-Log P/N 385) или 100 мкг/мл растворимого Коллагена хвоста крысы в 0,02 М уксусной кислоте перфузировали из выходной лунки в течение 10 минут при 5 дин/см2. Протекание останавливали и этот планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Белки покрытия промывали ЗФР при 5 дин/см2 в течение 10 минут. Планшет блокировали полным заполнением входной лунки (1 мл) 5% м/о БСА/ЗФР и перфузировали в этот канал при 5 дин/см2 в течение 15 минут. Протекание останавливали и этот планшет инкубировали в течение дополнительных 10 минут при комнатной температуре. Избыток ЗФР/БСА удаляли из всех лунок и этот планшет хранили при комнатной температуре для использования в тот же самый день или хранили при 4°С в ЗФР/БСА до двух дней.
[0272] ФИГ. 12В показывает статические видеоизображения с флуоресцентными конечными точками действий лигандов CLEC-2 на накапливание тромбоцитов на покрытой растворимым коллагеном хвоста крысы поверхности, подвергнутой действию протекающей цельной крови в присутствии и в отсутствие обработки агонистом родоцитина (А=2 5 мкг/мл фибриллярного коллагена; В=10 0 мкг/мл фибриллярного коллагена; С=10 0 мкг/мл коллагена хвоста крысы
плюс обработка 165 нМ родоцитином; D=10 0 мкг/мл коллагена хвоста крысы плюс буфер F; Е=10 0 мкг/мл коллагена хвоста крысы плюс 3 мкМ RB587 плюс обработка 165 нМ родоцитином); F=100 мкг/мл коллагена хвоста крысы плюс 3 мкМ RB58 8 плюс обработка 165 нМ родоцитином). График G показывает измерение данных поверхностей прикрепленных тромбоцитов, рассчитанных с использованием программы Fluxion Montage(tm). Эти данные выражены в виде процента от максимальной реакции неактивного мутанта RB58 8 на покрытой коллагеном хвоста крысы поверхности в присутствии родоцитина. Как показано на ФИГ. 12В присутствие агониста родоцитина значимо увеличивало размер агрегатов тромбоцитов, прикрепленных к покрытой коллагеном хвоста крысы поверхности в сравнении с необработанной цельной кровью. При предварительном инкубировании цельной крови RB587, с последующей активацией родоцитином, размер агрегатов тромбоцитов уменьшался опять до агрегатов фона, наблюдаемых с растворимым коллагеном из хвоста крысы в отсутствие родоцитина (ФИГ. 12В - изображения В, D, Е и график G) . Неактивный мутантный контроль, RB58 8, не оказывал действия на размер агрегатов тромбоцитов (панель F ФИГ. 12В).
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Layzer, Juliana M.
Mahanty, Sanjoy K. Wolff, Samuel C. Redick, Catherine C. Rusconi, Christopher P.
<12 0> НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ CLEC-2
<130> 10815-8013.WO00
<140> Not yet assigned
<141> Filed herewith
<150> US 61/393,191
<151> 2010-10-14 <160> 68
<170> PatentIn version 3.5
227
БЕЛОК
<210> <211> <212>
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Ile Thr Leu Asn Ile Lys Thr Arg Lys
1 5 10 15
Pro Ala Leu Ile Ser Val Gly Ser Ala Ser Ser Ser Trp Trp Arg Val
20 25 30
Met Ala Leu Ile Leu Leu Ile Leu Cys Val Gly Met Val Val Gly Leu
35 40 45
Val Ala Leu Gly Ile Trp Ser Val Met Gln Arg Asn Tyr Leu Gln Asp
50 55 60
Glu Asn Glu Asn Arg Thr Gly Thr Leu Gln Gln Leu Ala Lys Arg Cys
65 70 75 80
Gln Tyr Val Val Lys Gln Ser Glu Leu Lys Gly Thr Phe Lys Gly His
85 90 95
Lys Cys Ser Pro Cys Asp Thr Asn Trp Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser Cys
100 105 110
Tyr Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr Trp Glu Glu Ser Lys Gln Tyr
115 120 125
Cys Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu Lys Ile Asp Asn Arg Asn Ile
130 135 140
Val Glu Tyr Ile Lys Ala Arg Thr His Leu Ile Arg Trp Val Gly Leu
145 150 155 160
Ser Arg Gln Lys Ser Asn Glu Val Trp Lys Trp Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Ile Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu Glu Asp Gly Lys Gly Asn Met
180 185 190
Asn Cys Ala Tyr Phe His Asn Gly Lys Met His Pro Thr Cys Glu Asn
195 200 205
Lys His Tyr Leu Met Cys Glu Arg Lys Ala Gly Met Thr Lys Val Asp
210 215 220
Gln Leu Pro
225
<210> 2 <211> 170 <212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gln Arg Asn Tyr Leu Gln Asp Glu Asn Glu Asn Arg Thr Gly Thr Leu
1 5 10 15
Gln Gln Leu Ala Lys Arg Cys Gln Tyr Val Val Lys Gln Ser Glu Leu
20 25 30
Lys Gly Thr Phe Lys Gly His Lys Cys Ser Pro Cys Asp Thr Asn Trp
35 40 45
Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser Cys Tyr Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr
50 55 60
Trp Glu Glu Ser Lys Gln Tyr Cys Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu
65 70 75 80
Lys Ile Asp Asn Arg Asn Ile Val Glu Tyr Ile Lys Ala Arg Thr His
85 90 95
Leu Ile Arg Trp Val Gly Leu Ser Arg Gln Lys Ser Asn Glu Val Trp
100 105 110
Lys Trp Glu Asp Gly Ser Val Ile Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Lys Gly Asn Met Asn Cys Ala Tyr Phe His Asn Gly Lys
130 135 140
Met His Pro Thr Cys Glu Asn Lys His Tyr Leu Met Cys Glu Arg Lys
145 150 155 160
Ala Gly Met Thr Lys Val Asp Gln Leu Pro 165 170
<210> <211> <212> 3
180 БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> His-меченый CLEC-2
<400> 3
His His His His His His His His His His Gln Arg Asn Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Asp Glu Asn Glu Asn Arg Thr Gly Thr Leu Gln Gln Leu Ala Lys Arg
20 25 30
Cys Gln Tyr Val Val Lys Gln Ser Glu Leu Lys Gly Thr Phe Lys Gly
35 40 45
His Lys Cys Ser Pro Cys Asp Thr Asn Trp Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser
50 55 60
Cys Tyr Gly Phe Phe Arg His Asn Leu Thr Trp Glu Glu Ser Lys Gln
65 70 75 80
Tyr Cys Thr Asp Met Asn Ala Thr Leu Leu Lys Ile Asp Asn Arg Asn
85 90 95
Ile Val Glu Tyr Ile Lys Ala Arg Thr His Leu Ile Arg Trp Val Gly
100 105 110
Leu Ser Arg Gln Lys Ser Asn Glu Val Trp Lys Trp Glu Asp Gly Ser
115 120 125
Val Ile Ser Glu Asn Met Phe Glu Phe Leu Glu Asp Gly Lys Gly Asn
130 135 140
Met Asn Cys Ala Tyr Phe His Asn Gly Lys Met His Pro Thr Cys Glu
145 150 155 160
Asn Lys His Tyr Leu Met Cys Glu Arg Lys Ala Gly Met Thr Lys Val
165 170 175
Asp Gln Leu Pro
180
<210> 4
<211> 82
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<221> misc feature
<222> (26)7.(65)
<223> n представляет собой a, c, g, или t
<400> 4
tctcggatcc tcagcgagtc gtctgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnccgca tcgtcctccc ta 82
<210> 5
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 5
actgggctca tattcccgcg catcttacta cctcggttat 40
<210> <211> <212>
РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 6
acugggcuca uauucccgcg caucuuacua ccucgguuau 40
<210> <211> <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 7
gggaggacga tgcggactgg gctcatattc ccgcgcatct tactacctcg gttatcagac 60 gactcgctga ggatccgaga 80
<210> 8
<211> 80
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 8
gggaggacga ugcggacugg gcucauauuc ccgcgcaucu uacuaccucg guuaucagac 60 gacucgcuga ggauccgaga 80
<210> 9
<211> 80
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(3)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (4)..(4)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (5)..(6)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (7)..(7)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (8)..(8)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (9)..(9)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (10)..(10)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (11)..(11)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (12)..(12)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (13)..(13)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (14)..(15)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (16)..(16)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (17)..(17)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (19)..(21)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (22)..(22)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (23)..(23)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (24)..(24)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (25)..(25)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (26)..(26)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (27)..(27)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (28)..(29)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (30)..(32)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (33)..(33)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (34)..(34)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (36)..(36)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (37)..(37)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (38)..(38)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (39)..(39)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (42)7.(42)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (43)..(43)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (44)..(44)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (45)7.(45)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (46)7.(47)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (48)7.(48)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (49)7.(49)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (50)..(51)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (52)..(53)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (54)..(54)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (55)..(55)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (56)..(56)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (57)..(57)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (58)..(58)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (59)..(59)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (60)..(60)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (61)..(61)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (62)..(62)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (63)..(63)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (64)..(64)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (65)..(65)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (66)..(66)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (67)..(67)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (68)..(68)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (69)..(69)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<220>
<221> misc feature
<222> (71)7.(72)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (73)..(73)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (74)7.(74)
<223> U= 2' Fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> (75)7.(76)
<223> C = 2' Fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (77)..(77)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (78)7.(78)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> (79)..(79)
<223> g=2' Ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (80)..(80)
<223> a=2' Ribo A
<400> 9
gggaggacga ugcggacugg gcucauauuc ccgcgcaucu uacuaccucg guuaucagac 60 gacucgcuga ggauccgaga 80
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 10
gggaggacga ugcggacugg gcucauauuc ccgcgcaucu uacuaccucg guuaucagac 60 gacucgcuga ggauccgaga 80
<210> 11
<211> 55
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 11
gggaggacga ugcggacugg gcucauauuc ccgcgcaucu uacuaccucg guuau 55
12 49
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 12
gggaggacga ugcggacugg gcucauauuc ccgcgcaucu uacuaccuc 49
<210> <211> <212>
13 45 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 13
gggaggacga ugcggacugg gcucauauuc ccgcgcaucu uacua 45
14 39
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 14
gggaggacga ugcggacugg gcucauauuc ccgcgcauc 39
15 33 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 15
gggaggacga ugcggacugg gcucauauuc ccg 33
<210> 16
<211> 35
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 16
gggagaugcg gacugggcuc auauucccgc gcauc 35
17 37 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 17
gggagaugcg gacugggcuc auauucccgc gcaucuc 37
<210> <211> <212>
18 39 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 18
gggagaugcg gacugggcuc auauucccgc gcaucuccc 39
19 33
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 19
gggagagcgg acugggcuca uauucccgcg cuc 33
<210> <211> <212>
20 33 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 20
gggagaucgg acugggcuca uauucccgcg auc 33
21 33
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 21
gggagauggg acugggcuca uauucccgcc auc 33
<210> <211> <212>
22 33 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 22
gggaugcgga cugggcucau auucccgcgc auc 33
23 33
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 23
gggaugcgga ccgggcucau auucccgcgc auc 33
24 31 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 24
gaugcggacu gggcucauau ucccgcgcau c 31
<210> <211> <212>
25 35 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 25
gggagaugcg cucugggcuc auauucccgc gcauc 35
26 35
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 26
gggagaugcg gacuggggac auauucccgc gcauc 35
<210> 27
<211> 35
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 27
gggagaugcg gacugggcug uuauucccgc gcauc 35
28 35
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 28
gggagaugcg gacugggcuc aauuucccgc gcauc 35
<210> <211> <212>
29 35 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 29
gggagaugcg gacugggcuc auaaacccgc gcauc 35
30 35
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 30
gggagaugcg gagugggcuc auauucccgc gcauc 35
31 35 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 31
gggagaugcg cacugggcuc auauucccgc gcauc 35
<210> 32
<211> 31
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 32
gaugcgcacu gggcucauau ucccgcgcau c 31
33 35 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 33
gggagaugcg gucugggcuc auauucccgc gcauc 35
<210> <211> <212>
34 33 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 34
gggaugcgga cuggggucau auucccgcgc auc 33
35 33
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 35
gggaugcgga cugggcacau auucccgcgc auc 33
<210> <211> <212>
36 33 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 36
gggaugcgga cugggcugau auucccgcgc auc 33
<210> 37
<211> 33
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 37
gggaugcgga cugggcucuu auucccgcgc auc 33
<210> <211> <212>
38 33 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 38
gggaugcgga cugggcucaa auucccgcgc auc 33
39 33
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 39
gggaugcgga cugggcucau uuucccgcgc auc 33
<210> <211> <212>
40 33 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 40
gggaugcgga cugggcucau aaucccgcgc auc 33
41 33
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 41
gggaugcgga cugggcucau auacccgcgc auc 33
42 33 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 42
gggaugcgga cuggguucau auucccgcgc auc
<210> 43
<211> 33
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 43
gggaugcgga cugggcccau auucccgcgc auc 33
44 33 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 44
gggaugcgga cugggcuuau auucccgcgc auc 33
<210> <211> <212>
33 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 45
gggaugcgga cugggcucgu auucccgcgc auc 33
46 33
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 46
gggaugcgga cugggcucac auucccgcgc auc 33
<210> <211> <212>
33 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 47
gggaugcgga cugggcucau guucccgcgc auc 33
<210> 48
<211> 33
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<400> 48
gggaugcgga cugggcucau acucccgcgc auc 33
<210> <211> <212>
33 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 49
gggaugcgga cugggcucau auccccgcgc auc 33
50 33
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 50
gggaugcgaa cugggcucau auucccgcgc auc 33
51 33 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 51
gggaugcgga uugggcucau auucccgcgc auc 33
52 33 РНК
<210> <211> <212>
? О 1 О ^
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 52
gggaugcgga cugggcucau cuucccgcgc auc 33
<210> 53
<211> 32
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 53
gggaugcgga cugggcucua uucccgcgca uc 32
<210> <211> <212>
54 32 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 54
gggaugcgga cugggcucau uucccgcgca uc 32
55 39
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 55
gggaggacga ugcggucugg gcucauauuc ccgcgcauc 39
<210> <211> <212>
56 39 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 56
gggaggacga ugcgggcugg gcucauauuc ccgcgcauc 39
57 39
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 57
gggaggacga ugcggacugg gcucagauuc ccgcgcauc 39
58 33 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 58
gggaugcgua cugggcucau auucccgcgc auc
<210> 59
<211> 32
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 59
gggaugcgga cugggcucaa uucccgcgca uc 32
60 16 РНК
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 60
gaugcgcggg aauaug 16
<210> <211> <212>
61 16 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 61
ugcgcgggaa uaugag 16
62 15
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 62
aauaugagcc caguc 15
<210> <211> <212>
63 16 РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 63
uaugagccca guccgc 16
<210> 64
<211> 18
<212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер <400> 64
augagcccag uccgcauc 18
<210> <211> <212>
РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 65
cccaguccgc auc 13
<210> <211>
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 66
gggggaattc taatacgact cactataggg aggacgatgc ggtaatacga ctcactatag 60 ggaggacgat gcgg 74
<210> 67
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<400> 67
tctcggatcc tcagcgagtc gtctg 25
68 32
<210> <211> <212> РНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> RB587
<220>
<221> misc feature
<222> (1),T4),(6),(7),(11),(12),(13),(25),(27)
<223> G представляет собой 2'ribo G
<220>
<221> misc feature
<222> (2),T8),(17),(19),(29)
<223> A представляет собой 2'ribo A
<220>
<221> misc feature
<222> T5),T9),T14),T16),T22),T23),T24),T26),T28),T31)
<223> C представляет собой 2'-fluoro C
<220>
<221> misc feature
<222> (3),T10),(15),(7),(18),(20),(21),(30)
<223> U представляет собой 2'-fluoro U
<220>
<221> misc feature
<222> T32)
<223> n представляет собой инвертированный деокситимидин
<400> 68
gaugcggacu gggcucauau ucccgcgcau cn
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Нуклеиновокислотный лиганд, который связывает CLEC-2, где указанный лиганд содержит последовательность нуклеиновой кислоты и где указанная последовательность нуклеиновой кислоты образует по меньшей мере одну структуру стебля и по меньшей мере одну структуру петли, или его фармацевтически приемлемая соль .
2. Лиганд по п. 1, где этот лиганд содержит, в 5'-3'-направлении:
первый стебель, длина которого составляет 5-10 пар оснований;
первую трехнуклеотидную петлю, которая содержит последовательность 5'-GNC-3';
второй стебель, длина которого составляет 4 пары оснований, где указанный второй стебель содержит пару неоднозначного спаривания в основании второго стебля; и
вторую петлю, содержащую нуклеотидную последовательность 5' -YUYNNRYIJ- 3' .
3. Лиганд по п. 1, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична SEQ ID N0:7, или SEQ ID N0:8, или SEQ ID N0:9.
4. Лиганд по п. 1, где указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID N0:24.
5. Лиганд по любому из предыдущих пунктов, где указанный лиганд связывает CLEC-2 с константой диссоциации в диапазоне от приблизительно 0,1 нМ до 10 нМ.
6. Фармацевтическая композиция, содержащая лиганд по любому из предыдущих пунктов или его фармацевтически приемлемую соль .
7. Модулятор, который связывается специфически с лигандом CLEC-2,
где указанный модулятор содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты; и
где указанный лиганд CLEC-2 содержит первую
последовательность нуклеиновой кислоты.
8. Способ лечения CLEC-2-опосредованного нарушения,
предусматривающий введение хозяину, нуждающемуся в этом,
терапевтически эффективного количества лиганда по любому из
пунктов 1-6 или его фармацевтически приемлемой соли.
9. Способ по п. 8, где CLEC-2-опосредованным нарушением является опосредованное тромбоцитами нарушение.
10. Способ по п. 8 или 9, где опосредованное тромбоцитами
нарушение выбрано из группы, состоящей из сосудистого
нарушения, сердечно-сосудистого нарушения, нарушения
периферических сосудов, церебрально-васкулярного нарушения,
опосредованного тромбоцитами воспалительного нарушения,
связанного с диабетом нарушения, рака и ВИЧ-инфекции.
11. Способ по п. 10, где сосудистое нарушение выбрано из группы, состоящей из острого коронарного синдрома, тромбоза, тромбоэмболии, тромбоцитопении, заболевания периферических сосудов и транзиторного ишемического приступа.
12. Способ по п. 10, где церебрально-васкулярное нарушение выбрано из группы, состоящей из транзиторного ишемического приступа, ищемического инсульта и эмболии.
13. Способ по п. 10, где опосредованное тромбоцитами
воспалительное нарушение выбрано из группы, состоящей из
артрита, ревматоидного артрита, псориатического артрита,
реактивного артрита, воспалительного заболевания
пищеварительного тракта, анкилозирующего спондилита и
склеродермии.
14. Способ по п. 10, где рак выбран из группы, состоящей из рака легкого, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичка, рака поджелудочной железы, рака головного мозга, рака костей и рака печени.
15. Способ по п. 10, где связаное с диабетом нарушение выбрано из группы, состоящей из диабетической ретинопатии, диабетической васкулопатии, атеросклероза, ишемического инсульта, заболевания периферических сосудов, острого повреждения почки и хронической почечной недостаточности.
16. Способ определения того, активирует или ингибирует
лиганд CLEC-2 CLEC-2-зависимое образование агрегатов тромбоцитов, предусматривающий
(a) смешивание лиганда CLEC-2 с пробой крови для получения обработанной пробы крови,
(b) приведение этой обработанной пробы крови в контакт с вспомогательной молекулой, где указанная вспомогательная молекула иммобилизована на твердом носителе;
(c) измерение образования агрегатов тромбоцитов после указанного приведения в контакт;
(с!) сравнение степени образования агрегатов тромбоцитов, детектированной на стадии (с), со степенью агрегации тромбоцитов, полученной при использовании контрольной пробы крови без лиганда CLEC-2 для приведения в контакт с вспомогательной молекулой.
17. Способ по п. 16, где вспомогательная молекула
представляет собой активатор CLEC-2.
18. Способ по п. 16 или 17, где вспомогательная молекула
представляет собой растворимый коллаген типа I, II или III, и
где способ дополнительно предусматривает добавление родоцитина
к пробе крови.
19. Способ по п. 16, 17 или 18, дополнительно
предусматривающий смешивание обработанной пробы крови с
модуляторной молекулой перед стадией (Ь) , где указанная
модуляторная молекула способна связывать указанную регуляторную
молекулу лиганда.
20. Набор, содержащий лиганд CLEC-2 и фармацевтический эксципиент.
21. Набор по п. 20, дополнительно содержащий модулятор, который специфически связывает лиганд CLEC-2.
22. Набор, содержащий модулятор, который специфически связывается с лигандом CLEC-2.
По доверенности
193644
Инкубируйте со специфической мишенью
Фиг.1
Раунд
[CLEC-2] мкМ
ЮЛЛЯИНПООООООООООЮСООООООвОдООООВ
[РНК]мкМ
РНК: Белок
РНК (нмоль)
0.07
0.7
0.15
1.5
0.14
1.88
0.05
0.6
0.048
0.672
7 8
0.008
0.096
0.005
0.09
0.002
0.038
0,0015
0.027
Фиг.2
CLEC-2 (мкМ)
Фиг.З
Связывание S2-20 FL, S2-20 Т10 и RB587 с CLEC-2
о; zr го
о; го i i го со о; m о
о; го i i го m о о.
0.00001 0.0001
0.001 0.01 0.1 1
CLEC-2 (мкМ)
RB587
Односайтовое связывание (гипербола)
Величины наилучшей подгонки
Вмакс
0.8215
0.002892
r0-rG- r(r)- f € $2-20 TIO
Фиг.бА
rG- t
: **** X W X,
rG rG""**tC l::0-fu
rG -fC
f C-rG
rG-fC I I
3-fc-idH
R8587
Фиг.бВ
A G
О \
\ ч0 ° и и о " А
G-C С-G G-C U-А ? A -U G --C Ф
0 RB581
? R8582 A RB583 О RB5S4 V RB585 ^ RB586
Фиг.8
Фиг.ЭА
Фиг.ЭВ
Клон S2-20 агрегации промытых тромбоцитов человека Родоцитин 8-30 нМ (п=4; 2 мкМ п=1)
Фиг. 10A
Агрегация WP человека Родоцитин 8-30 15-18 нМ
Фиг.ЮВ
120-
100-
80-
60-
40-
20-
V- V- x x
А Л
X X
Контроль Л ^ П> ЛЛ <^ ^
Индуцированные родоцитином WP человека Экспрессия Р-селектина с использованием антитела CD62P-PE (2 мкМ РНК)
Контроль RB588 RB587
Индуцированные родоцитином WP человека Экспрессия Р-селектина с использованием антитела CD62P-PE (2 мкМ РНК)
Фиг.12В
100 мкг/мл коллагена из хвоста крысы + родоцитин (165 нМ)
<222> (70)..(70)
<223> a=2' Ribo A
<222> (70)..(70)
<223> a=2' Ribo A
<222> (70)..(70)
<223> a=2' Ribo A
<222> (70)..(70)
<223> a=2' Ribo A
<222> (70)..(70)
<223> a=2' Ribo A
<222> (70)..(70)
<223> a=2' Ribo A
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
<220>
<223> Синтетический олигомер
10/1
10/1
10/1
10/1
10/1
3/1
3/1
16/1
16/1