[**]

Данное изобретение предоставляет способы применения бесклеточной текучей среды организма и кровяных клеток при диагностике, прогнозировании или мониторинге заболеваний или патологических состояний. Изобретение также относится к способам применения бесклеточной текучей среды организма и кровяных клеток для идентификации маркеров заболеваний или патологических состояний.

(57) Реферат / Формула:

Данное изобретение предоставляет способы применения бесклеточной текучей среды организма и кровяных клеток при диагностике, прогнозировании или мониторинге заболеваний или патологических состояний. Изобретение также относится к способам применения бесклеточной текучей среды организма и кровяных клеток для идентификации маркеров заболеваний или патологических состояний.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201390150 (13) A1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.09.30
(22) Дата подачи заявки 2011.07.22
(51) Int. Cl.
C12Q1/68 (2006.01) G01N 33/53 (2006.01)
(54)
СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ СИГНАТУР ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЛИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ В ТЕКУЧИХ СРЕДАХ ОРГАНИЗМА
(31) (32)
61/367,006
2010.07.23
(33) US
(86) PCT/US2011/044969
(87) WO 2012/012693 2012.01.26
(88) 2012.06.14
(71) Заявитель:
(72) (74)
ПРЕЗИДЕНТ ЭНД ФЕЛЛОУЗ ОФ ГАРВАРД КОЛЛЕДЖ (US)
Изобретатель: Кассис Амин И. (US)
Представитель: Медведев В.Н. (RU) (57) Данное изобретение предоставляет способы применения бесклеточной текучей среды организма и кровяных клеток при диагностике, прогнозировании или мониторинге заболеваний или патологических состояний. Изобретение также относится к способам применения бесклеточной текучей среды организма и кровяных клеток для идентификации маркеров заболеваний или патологических состояний.
2420-192937ЕА/011
СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ СИГНАТУР ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЛИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ В ТЕКУЧИХ СРЕДАХ ОРГАНИЗМА
ОПИСАНИЕ
Данные о родственных заявках
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет предварительной патентной заявки США № 61/367006, поданной 23 июля 2010 года и включенной в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
Область техники, к которой относится изобретение
[0002] Данное изобретение в целом относится к способам применения бесклеточной текучей среды организма и кровяных клеток при диагностике, прогнозировании или мониторинге заболеваний или патологических состояний. Изобретение также относится к способам применения бесклеточной текучей среды организма и кровяных клеток для идентификации маркеров заболеваний или патологических состояний.
Уровень техники изобретения
[0003] Раннее диагностирование заболевания часто повышает вероятность успешного лечения или излечения данного заболевания. Текущие способы диагностирования, однако, в значительной степени зависят от выведенных для популяции средних значений, полученных у здоровых индивидов. Необходимы персонализированные способы диагностирования, которые делают возможным диагностирование, особенно раннее диагностирование, наличия заболевания или патологического состояния у индивидов, о которых неизвестно, имеют ли они заболевание, или которые имеют рецидивирующее заболевание.
[0004] Лейкоциты начинают развитие как мультипотентные гемопоэтические стволовые клетки в костном мозге и развиваются либо по миелоидной линии дифференцировки (моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы), либо по лимфоидной линии дифференцировки (Т- и В-лимфоциты и естественные клетки-киллеры) . Главная функция миелоидной линии дифференцировки
клетки (например, нейтрофилов и макрофагов) состоит в фагоцитозе возбудителей инфекции, живых нежелательных поврежденных клеток, стареющих и мертвых клеток (апоптотических и омертвевших), а также в очищении от продуктов распада клеток. Фагоциты здоровых животных не размножаются и являются диплоидными, т.е. имеют содержание ДНК, равное 2п. В среднем, каждая клетка включает <10 нг ДНК, <20 нг РНК и ООО нг белка. Нефагоцитарные клетки также являются диплоидными и не вовлечены в интернализацию мертвых клеток или инфекционных организмов и имеют индекс ДНК, равный единице.
[0005] Время жизни различных субпопуляций белых кровяных клеток варьирует от нескольких дней (например, у нейтрофилов) до нескольких месяцев (например, у макрофагов). Как и у других клеточных типов, лейкоциты стареют и, в конце концов, умирают. На протяжении процесса их старения, происходящие из крови и тканей человека фагоциты (например, нейтрофилы) демонстрируют все классические маркеры запрограммированной клеточной смерти (т.е. апоптоза) , включая активацию каспазы, пикнотические ядра и фрагментацию хроматина. Данные клетки также демонстрируют ряд меток "eat-me" (например, фосфатидилсерин, сахара) на внеклеточных поверхностях их клеточных мембран. Вследствие этого, умирающие и мертвые клетки и их субклеточные фрагменты вычищаются из тканей и крови другими фагоцитарными клетками.
[0006] Одной целью представленного изобретения является предоставление способов диагностирования, которые могут облегчить выявление маркеров, специфических для заболеваний или патологических состояний, например, нуклеиновых кислот, белков, углеводов и/или липидов и тому подобное, посредством использования бесклеточных текучих сред организма и кровяных клеток. Еще одна цель данного изобретения состоит в предоставлении способов идентификации маркеров, специфических для заболевания или патологического состояния, а кроме того в применениях подобных маркеров по-отдельности или вместе с любыми известными маркерами для диагностирования заболеваний или патологических состояний.
Сущность изобретения
[0007] Авторы изобретения предложили новые и полезные
способы выявления/диагностирования заболеваний или
патологических состояний посредством использования бесклеточной текучей среды организма в комбинации с нефагоцитарными клетками или фагоцитарными клетками, имеющими содержание ДНК, равное 2п (фагоцитарные клетки =2п). В некоторых вариантах осуществления, бесклеточные текучие среды организма включают компоненты пораженных клеток, такие как ДНК и/или белок, и служат в качестве суррогатов для пораженных клеток, в то время как в других вариантах осуществления в качестве суррогатов для пораженной клетки служат нефагоцитарные клетки или бесклеточные текучие среды организма, при этом фагоцитарные клетки =2п могут служить в качестве контрольных клеток.
[0008] В одном аспекте данное изобретение предоставляет способ диагностирования или помощи при диагностировании заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма; Ь) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток; и с) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем наличия указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[0009] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ оценки риска развития заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма; Ь) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток; и с) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем риска развития
указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[0010] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ прогнозирования или помощи при прогнозировании заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма; Ь) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток; и с) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом идентифицированное различие является показателем прогноза указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[ООН] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ оценки эффективности лечения заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента перед лечением; определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента перед лечением; идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; Ь) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента после лечения; определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента после лечения; идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и с) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие является показателем эффективности лечения указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[0012] В еще одном аспекте данное изобретение
предоставляет способ мониторинга прогрессирования или регрессии заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента в первой временной точке; определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента в первой временной точке; идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; Ь) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента во второй временной точке; определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента во второй временной точке; идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и с) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие является показателем прогрессирования или регрессии указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[0013] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации соединения, способного улучшать течение или лечить заболевание или патологическое состояние у пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента перед введением соединения пациенту; определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента перед введением соединения пациенту; идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; Ь) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента после введения соединения; определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного
или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента после введения соединения; идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и с) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие показывает, что соединение способно улучшать течение или лечить указанное заболевание или патологическое состояние у пациента
[0014] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ диагностирования или помощи при диагностировании заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма; Ь) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма; и с) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем наличия указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[0015] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ оценки риска развития заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма; Ь) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п; и с) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем риска развития указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[0016] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ прогнозирования или помощи при прогнозировании заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или
более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма; Ь) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п; и с) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем прогноза указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[0017] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ оценки эффективности лечения заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента перед лечением; определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п пациента перед лечением; идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; Ь) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента после лечения; определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п пациента после лечения; идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и с) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие является показателем эффективности лечения указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[0018] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ мониторинга прогрессирования или регрессии заболевания или патологического состояния пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента в первой временной точке; определение второго профиля по меньшей мере
одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных
клеток =2п пациента в первой временной точке; идентификацию
первого различия между первым и вторым профилями по меньшей
мере одного или более из указанных маркеров; Ь) определение
третьего профиля одного или более маркеров из образца
бесклеточной текучей среды организма пациента во второй
временной точке; определение четвертого профиля по меньшей мере
одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных
клеток =2п пациента во второй временной точке; идентификацию
второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей
мере одного или более из указанных маркеров; и с) идентификацию
различия между первым различием и вторым различием, при этом
идентифицированное различие является показателем
прогрессирования или регрессии указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
[0019] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации соединения, способного улучшать течение или лечить заболевание или патологическое состояние у пациента, включающий: а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента перед введением соединения пациенту; определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п пациента перед введением соединения пациенту; идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; Ь) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента после введения соединения; определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п пациента после введения соединения; идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; с) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие показывает, что соединение способно
улучшать течение или лечить указанное заболевание или патологическое состояние у пациента.
[0020] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров для заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение второго профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; определение четвертого профиля аналитов из нефагоцитарных клеток у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; с) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния. Необязательно, данный способ дополнительно включает d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию третьего разностного множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является
специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с), присутствующих в третьем разностном множестве.
[0021] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение второго профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение четвертого профиля аналитов из нефагоцитарных клеток у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; с) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния. И необязательно, способ дополнительно включает d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию третьего разностного множества между пятым и
шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с), присутствующих в третьем разностном множестве.
[0022] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение второго профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния, посредством сбора данных; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение четвертого профиля аналитов из нефагоцитарных клеток у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния, посредством сбора данных; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; и с) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния. И необязательно, способ дополнительно включает d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, посредством сбора данных; получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, посредством сбора данных; идентификацию третьего разностного множества между пятым и
шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с), присутствующих в третьем разностном множестве.
[0023] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение второго профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение четвертого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; с) идентификацию одного или более аналитов, присутствующих как в первом разностном множестве, так и во втором разностном множестве, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния. И необязательно, способ дополнительно включает d) определение пятого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию третьего разностного множества между первым и пятым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для первого профиля
относительно пятого профиля; е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с) , присутствующих в третьем разностном множестве.
[0024] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение второго профиля аналитов из фагоцитарных клеток =2п пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; определение четвертого профиля аналитов из фагоцитарных клеток =2п у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; и с) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния. И необязательно, способ дополнительно включает: d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию третьего разностного
множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с), присутствующих в третьем разностном множестве.
[0025] В некоторых вариантах осуществления маркерами или аналитами являются нуклеиновые кислоты (например, нуклеотиды, олигонуклеотиды, ДНК, РНК или гибриды ДНК-РНК), белки (например, аминокислоты, пептиды, ферменты, антигены, антитела, цитокины, липопротеины, гликопротеины или гормоны), липиды (например, жирные кислоты, фосфатиды, холестерин), углеводы (например, моносахариды, дисахариды, полисахариды), метаболиты (например, витамины, первичные метаболиты, вторичные метаболиты) или их комбинации.
[0026] В некоторых вариантах осуществления профилем является профиль нуклеиновых кислот (например, генотипический профиль, профиль однонуклеотидного полиморфизма, профиль мутации гена, профиль числа копий гена, профиль метилирования ДНК, профиль ацетилирования ДНК, профиль дозы хромосом, профиль экспрессии гена), белковый профиль (например, экспрессия белка, активация белка), липидный профиль, углеводный профиль, профиль метаболита или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления профиль определяют посредством качественного анализа, количественного анализа или их комбинаций.
[0027] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или более маркеров повышающе регулируется или активируется в бесклеточных текучих средах организма по сравнению с нефагоцитарными клетками. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или более маркеров понижающе регулируется или ингибируется в образце бесклеточной текучей среды организма по сравнению с нефагоцитарными клетками. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или более маркеров повышающе регулируется или активируется в бесклеточных текучих средах организма по сравнению с фагоцитарными клетками =2п. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или более маркеров
понижающе регулируется или ингибируется в бесклеточных текучих средах организма по сравнению с фагоцитарными клетками =2п.
[0028] В некоторых вариантах осуществления первый профиль, второй профиль, третий профиль, четвертый профиль, пятый профиль или шестой профиль включает отсутствие по меньшей мере одного из одного или более маркеров.
[0029] В некоторых вариантах осуществления различием является по меньшей мере 1,05-кратное, 1,1-кратное, 1,2-кратное, 1,3-кратное, 1,4-кратное, 1,5-кратное, 2-кратное, 2,5-кратное, 3-кратное, 4-кратное, 5-кратное, б-кратное, 7-кратное, 8-кратное, 9-кратное или 10-кратное различие.
[0030] В некоторых вариантах осуществления способы по данному изобретению также включают лизирование фагоцитарных клеток =2п и нефагоцитарных клеток, а также выделение клеточного содержимого из данных клеток. В некоторых вариантах осуществления способы по данному изобретению включают выделение клеточного содержимого из бесклеточных текучих сред организма. В некоторых вариантах осуществления бесклеточные текучие среды организма включают жизнеспособные пораженные клетки, мертвые пораженные клетки, апоптотические пораженные клетки, циркулирующие в крови опухолевые клетки, инфекционные агенты, фетальные клетки, трофобласты или их фрагменты.
[0031] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из одного или более маркеров заболевания или патологического состояния присутствует в клеточном содержимом бесклеточных текучих сред организма. В некоторых вариантах осуществления один или более маркеров указанного заболевания или патологического состояния не содержатся в клеточном содержимом нефагоцитарных клеток или фагоцитарных клеток =2п.
[0032] В некоторых вариантах осуществления способы по
данному изобретению также включают сравнение
идентифицированного различия с) с информационным архивом одного или более известных маркеров указанного заболевания или патологического состояния (например, данные, полученные посредством сбора данных).
[0033] В некоторых вариантах осуществления фагоцитарными
клетками являются профессиональные фагоцитарные клетки
(например, нейтрофилы, макрофаги, моноциты, дендритные клетки,
ксантомные клетки, тучные клетки, эозинофилы),
непрофессиональные фагоцитарные клетки (например, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты, мезенхимальные клетки) или их смеси. В некоторых вариантах осуществления нефагоцитарными клетками являются Т-клетки, В-клетки, нулевые клетки, базофилы или их смеси.
[0034] В некоторых вариантах осуществления фагоцитарные клетки (например, фагоцитарные клетки =2п) и нефагоцитарные клетки выделяют из образца текучей среды организма (например, крови, мочи), тканей или клеток (например, белых кровяных клеток, фетальных клеток) пациента.
[0035] В некоторых вариантах осуществления для выделения
фагоцитарных клеток (например, фагоцитарных клеток =2п) и
нефагоцитарных клеток из текучих сред, тканей или клеток
организма или для отделения фагоцитарных клеток > 2п от
фагоцитарных клеток =2п используется стандартная/известная
методика разделения/выделения/очистки клеток, таких как
антитело, проточная цитометрия, сортировка флуоресцентно-
активированных клеток, фильтрование, градиентное
центрифугирование, элюирование, микрофлюидика, методика
разделения в магнитном поле, методика флуоресцентного
разделения в магнитном поле, наноструктура, точечные квантовые
приборы, высокопроизводительные платформы на основе микроскопа
или их комбинации.
[0036] Также, данное изобретение предоставляет маркеры, которые могут быть использованы в способах по данному изобретению и которые могут быть идентифицированы с помощью способов по данному изобретению.
Краткое описание чертежей
[0037] Файл с патентом или заявкой включает по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии публикации данного патента или патентной заявки с цветным чертежом (чертежами) будут предоставляться Офисом по запросу и при оплате необходимого платежа. Изложенные выше и другие признаки и
преимущества представленного изобретения станут более полно понятны из следующего подробного описания иллюстративных вариантов осуществления, сделанных в сочетании с сопровождающими чертежами, на которых:
[0038] Фигура 1 схематично изображает предложенный способ, приводящий к идентификации сигнатур, специфических для заболевания/патологического состояния ДНК, РНК, белка и/или липида внутри плазмы, вслед за сравнениями и вычитанием специфических для пациента врожденных сигнатур, полученных для ДНК, РНК, белков и/или липидов, выделенных из нефагоцитарных лимфоцитов.
[0039] Фигура 2 схематично изображает аналитический способ, используемый для идентификации опухолеспецифических сигнатур, экспрессированных в плазме онкологического больного.
[0040] Фигура 3 схематично изображает общую блок-схему одного варианта осуществления способа по изобретению.
[0041] Фигура 4 схематично изображает общую блок-схему еще одного варианта осуществления способа по изобретению.
[0042] Фигура схематично изображает общую блок-схему еще одного варианта осуществления способа по изобретению.
[0043] Фигура б схематично изображает предложенный путь, ведущий к идентификации сигнатур, специфических для заболевания/патологического состояния ДНК, РНК, белка и липида, внутри плазмы вслед за сравнениями и вычитанием специфических для пациента врожденных сигнатур, полученных для ДНК, РНК, белков и/или липидов, выделенных из БКК с содержанием ДНК, равным 2п.
[0044] Фигура 7 схематично изображает аналитические подходы, используемые для идентификации опухолеспецифических сигнатур у онкологического больного.
[0045] Фигура 8 схематично изображает общую блок-схему еще одного варианта осуществления способа по изобретению.
[0046] Фигура 9 схематично изображает общую блок-схему еще одного варианта осуществления способа по изобретению.
[0047] Фигура 10 показывает профиль FACS человеческих БКК, предварительно окрашенных Hoechst 33342, демонстрируя выделение
диплоидных БКК, а также результаты высокого качества РНК, экстрагированной из данных клеток (RIN=9,2).
[0048] Фигура 11 изображает анализ с помощью гель-электрофореза общей РНК, выделенной из клеток LNCaP и LLC1.
[0049] Фигура 12 перечисляет выход и качество РНК, полученной из мышиных белых кровяных клеток (БКК).
[0 050] Фигуры 13A-13D изображают матрицы, демонстрирующие семь активированных (> 2 кратно), связанных с раком генов, выявленных в нейтрофилах бестимусных мышей-носителей опухолей LNCaP (рак предстательной железы человека). (А) Опухоль LNCaP. (В) Нейтрофилы, полученные у бестимусных мышей-носителей опухолей LNCaP (NT) . (С) Т-клетки, полученные у бестимусных мышей-носителей опухоли LNCaP (ТТ) . (D) Нейтрофилы, полученные у бестимусных мышей, не носителей опухолей (NN). Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей-носителей опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах мышей, не носителей опухолей (D) , и в нефагоцитарных Т-клетках (С) . Экспрессия в NT была ^2 кратна экспрессии в NN и ТТ.
[0051] Фигуры 14A-14D изображают матрицы, демонстрирующие три активированных, связанных с раком гена, выявленных в макрофагах бестимусных мышей-носителей опухоли LNCaP (рак предстательной железы человека). (А) Опухоль LNCaP. (В) Макрофаги, полученные у бестимусных мышей-носителей опухолей LNCaP (МТ) . (С) Т-клетки, полученные у бестимусных мышей-носителей опухолей LNCaP (ТТ) . (D) Макрофаги, полученные у бестимусных мышей, не носителей опухолей (MN) . Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей-носителей опухоли (В), и минимально экспрессированные в макрофагах мышей, не носителей опухолей (D) , и в нефагоцитарных Т-клетках (С) . Экспрессия в МТ была ^2 кратна экспрессии в MN и ТТ.
[0 052] Фигуры 15A-15D изображают матрицы, демонстрирующие четыре активированных (> 2 кратно), связанных с раком гена, выявленные в нейтрофилах бестимусных мышей-носителей опухоли LS174T (рак толстой кишки человека). (А) Опухоль LS174T. (В)
Нейтрофилы, полученные у бестимусных мышей-носителей опухолей LS174T (NT) . (С) Т-клетки, полученные у бестимусных мышей-носителей опухолей LS17 4T (ТТ) . (D) Нейтрофилы, полученные у бестимусных мышей, не носителей опухолей (NN) . Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей-носителей опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах мышей, не носителей опухолей
(D) , и в нефагоцитарных Т-клетках (С) . Экспрессия в NT была ^2 кратна экспрессии в NN и ТТ.
[0053] Фигуры 16A-16D изображают матрицы, демонстрирующие три активированных (> 2 кратно), связанных с раком гена, выявленные в макрофагах бестимусных мышей-носителей опухоли LS174T (рак толстой кишки человека). (А) Опухоль LS174T. (В) Макрофаги, полученные у бестимусных мышей-носителей опухолей LS174T (МТ) . (С) Т-клетки, полученные у бестимусных мышей-носителей опухолей LS174T (ТТ) . (D) Макрофаги, полученные у бестимусных мышей, не носителей опухолей (MN) . Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей-носителей опухоли (В), и минимально экспрессированные в макрофагах мышей, не носителей опухолей
(D) , и в нефагоцитарных Т-клетках (С) . Экспрессия в МТ > 2 кратна экспрессии в MN и ТТ.
[0054] Фигуры 17A-17D изображают матрицы, демонстрирующие пять активированных (> 2 кратно), связанных с раком генов, выявленных в нейтрофилах мышей С57/В1-носителей опухоли LLC1
(метастатический рак легких мышей). (А) Опухоль LLC1. (В) Нейтрофилы, полученные у мышей С57/В1-носителей опухоли LLC1
(NT). (С) Т-клетки, полученные у мышей С57/В1-носителей опухоли LLC1 (ТТ). (D) Нейтрофилы, полученные у мышей С57/В1, не носителей опухолей (NN). Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей-носителей опухоли (В) , и минимально экспрессированные в нейтрофилах мышей, не носителей опухолей (D), и в нефагоцитарных Т-клетках (С) . Экспрессия в NT была ^2 кратна экспрессии в NN и ТТ.
[0055] Фигуры 18A-18D изображают матрицы, демонстрирующие
два активированных (> 2 кратно), связанных с раком гена, выявленных в макрофагах у мышей С57/В1-носителей опухоли LLC1
(метастатический рак легких мышей). (А) Опухоль LLC1. (В) Макрофаги, полученные у мышей С57/В1-носителей опухоли LLC1
(МТ). (С) Т-клетки, полученные у мышей С57/В1-носителей опухоли LLC1 (ТТ). (D) Макрофаги, полученные у мышей С57/В1, не носителей опухолей (MN). Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей-носителей опухоли (В) , и минимально экспрессированные в нейтрофилах мышей, не носителей опухолей (D), и в нефагоцитарных Т-клетках (С) . Экспрессия в МТ была ^2 кратна экспрессии в MN и ТТ.
[0056] Фигуры 19A-19D изображают матрицы, демонстрирующие два активированных (> 2 кратно), связанных с раком гена, выявленных в нейтрофилах у мышей С57/В1-носителей опухоли B16F10 (метастатическая меланома мышей). (А) Опухоль B16F10.
(В) Нейтрофилы, полученные у мышей С57/В1-носителей опухолей B16F10 (NT) . (С) Т-клетки, полученные у мышей С57/В1-носителей опухолей B16F10 (ТТ). (D) Нейтрофилы, полученные у мышей С57/В1, не носителей опухолей (NN) . Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в нейтрофилах мышей-носителей опухоли (В), и минимально экспрессированные в нейтрофилах мышей, не носителей опухолей
(D) , и в нефагоцитарных Т-клетках (С) . Экспрессия в NT была ^2 кратна экспрессии в NN и ТТ.
[0057] Фигуры 20A-20D изображают матрицы, демонстрирующие один активированный (> 2 кратно), связанный с раком ген, выявленный в макрофагах у мышей С57/В1-носителей опухоли B16F10
(метастатическая меланома мышей). (А) Опухоль B16F10. (В) Макрофаги, полученные у мышей С57/В1-носителей опухолей B16F10
(МТ) . (С) Т-клетки, полученные у мышей С57/В1-носителей опухолей B16F10 (ТТ). (D) Макрофаги, полученные у мышей С57/В1, не носителей опухолей (MN). Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в опухолевых клетках (А) и в макрофагах мышей-носителей опухоли (В) , и минимально экспрессированные в макрофагах мышей, не носителей опухолей (D), ив нефагоцитарных
Т-клетках (С). Экспрессия в МТ была ^2 кратна экспрессии в MN и ТТ.
[0058] Фигуры 21A-21D изображают матрицы, демонстрирующие пять активированных (> 2 кратно), связанных с раком генов, выявленных в нейтрофилах пациента с раком головы и шеи (плоскоклеточная карцинома). (А) Биопсия нормальной ткани (кожи). (В) Биопсия опухолевой ткани. (С) Нейтрофилы, полученные из крови пациента (NT) . (D) Т-клетки, полученные из крови пациента (ТТ). Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в опухолевых клетках (В) и в нейтрофилах крови пациента (С), и минимально экспрессированные или не экспрессированные в нормальной коже (А) или нефагоцитарные Т-клетки (D) . Экспрессия в NT была ^2 кратна экспрессии в ТТ и коже.
[0059] Фигуры 22А-22В изображают матрицы, демонстрирующие 23 активированных (> 2 кратно), связанных с раком гена, выявленных в макрофагах пациента с раком яичников (аденокарцинома). (А) Макрофаги, полученные из крови пациента (МТ) . (В) Т-клетки, полученные из крови пациента (ТТ) . Кружками обведены сигнатуры, экспрессированные в макрофагах пациента (А) и минимально экспрессированные в нефагоцитарных Т-клетках (В) . Экспрессия в МТ была ^2 кратна экспрессии в ТТ.
[0060] Фигура 23 отображает способ, используемый для идентификации сигнатур опухолей в фагоцитарных клетках. В данном примере количественно определяли интенсивность экспрессии ассоциированных с раком генов в макрофагах у животных-носителей опухолей (МТ) в сравнении с интенсивностью экспрессии у Т-клеток у тех же животных (ТТ), и идентифицировали гены, сверхэкспрессируемые ^2 кратно. Далее, количественно определяли интенсивность всех экспрессируемых генов в МТ и по сравнению с интенсивностью всех экспрессируемых генов в макрофагах, полученных у животных, не носителей опухоли (MNT), и идентифицировали гены, сверхэкспрессируемые ^2 кратно. Выбирали гены, общие для обоих списков, и сравнивали с генами, экспрессируемыми той же самой опухолью (заштрихованная область).
[0061] Фигуры 24А-24В изображают сравнения интенсивности экспрессии генов в (А) макрофагах, полученных от бестимусных мышей-носителей LNCaP опухоли предстательной железы человека (MLNCaP), и Т-клетках от тех же животных (Т cellsLNCaP), (В) MLNCaP и макрофагах, полученных у мышей, не являющихся носителями опухолей (М без опухоли), (С) нейтрофилах, полученных у бестимусных мышей-носителей LNCaP опухоли предстательной железы человека (NLNCaP) и Т-клетках от тех же животных (Т cellsLNCaP), и (D) NLNCaP и макрофагах, полученных у мышей, не являющихся носителями опухолей (N без опухоли). Гены в красном имели > 2 кратную сверхэкспрессию; гены в зеленом имели > 2 кратную пониженную экспрессию.
[00 62] На Фигуре 2 5 перечислена экспрессия связанных с раком генов в фагоцитарных нейтрофилах (N) и макрофагах (М).
[00 63] На Фигуре 2 6 перечислены связанные с раком гены, имеющие повышающую регуляцию (> 2 кратно) в фагоцитарных макрофагах пациента с раком яичников по сравнению с нефагоцитарными Т-клетками.
[0064] Фигура 27 изображает электрофорез в (10%) геле в присутствии додецилсульфата натрия образца белка (5,9 мкг), полученного из мышиных БКК.
[00 65] Фигура 2 8 изображает анализ с помощью Вестерн блоттинга экспрессии опухолево-ассоциированного гликопротеина TAG-72 и простатоспецифического антигена PSA в Т-клетках и моноцитах/макрофагах (М/М), полученных у мышей-носителей опухоли, иллюстрирующий присутствие сигнатур только в фагоцитарных клетках.
Подробное описание изобретения
[0066] До тех пор, пока в данной заявке не определено иное, научные и технические термины, используемые в данной заявке, будут иметь значения, которые являются общепринятыми для рядовых специалистов в данной области. В общем, методики и терминология, используемая в связи с культурой клеток и тканей, молекулярной биологией, биологией клетки и рака, нейробиологией, нейрохимией, вирусологией, иммунологией, микробиологией, фармакологией, генетикой и химией белков и
нуклеиновых кислот, описанные в данной заявке, представляют собой методики и терминологию, хорошо известные и широко используемые в данной области.
[00 67] Все приведенные выше и любые другие публикации, патенты и опубликованные патентные заявки, на которые в данной заявке делается ссылка, специально включены в данную заявку посредством ссылки. В случае конфликта, представленное описание, включая его конкретные определения, будет иметь преимущественную силу.
[0068] Во всем данном описании слово "содержать" или варианты, такие как "содержит" или "содержащая" следует понимать в значении включения постулированного числа (или составных элементов) или группы чисел (или составных элементов), но не исключение какого-либо другого числа (или составных элементов) или группы чисел (или составных элементов).
[00 69] Единственные формы включают множества, до тех пор, пока контекст ясно не диктует иное.
[0070] Термин "включающий" используется для обозначения "включающий, но без ограничения". "Включающий" и "включающий, но без ограничения" используются взаимозаменяемо.
[0071] "Пациент", "больной" или "индивид" используются взаимозаменяемо и обозначают либо человека, либо животное, не являющееся человеком. Данные термины включают млекопитающих, таких как люди, приматы, домашний скот (например, жвачные животные, свиньи), домашние животные (например, собаки, кошки) и грызуны (например, мыши и крысы).
[0072] Как используется в данной заявке, контрольный пациент относится к любому индивиду, у которого не было диагностировано наличие анализируемого заболевания или патологического состояния. Термины "нормальный контроль", "здоровый контроль" и "непораженные клетки" аналогичным образом обозначают образец (например, клетки, сыворотку, ткань), взятый из источника (например, у пациента, контрольного пациента, клеточной линии), который не имеет анализируемого патологического состояния или заболевания и, вследствие этого,
может быть использован для определения базового показателя для измеряемого патологического состояния или расстройства. Также следует понимать, что контрольный пациент, нормальный контроль и здоровый контроль включают данные, полученные и используемые в качестве стандарта, т.е. они могут быть использованы еще и еще раз для множества различных пациентов. Другими словами, например, при сравнении образца пациента с контрольным образцом данные от контрольного образца могли быть получены в другой группе экспериментов, например, это может быть среднее, полученное у ряда здоровых пациентов, а не полученное фактически в то время, когда получали данные для пациента.
[0073] Термин "диагностика", как используется в данной заявке, относится к способам, с помощью которых специалист в данной области может оценить и/или определить, страдает или не пациент от данного заболевания или патологического состояния. Специалист в данной области часто осуществляет диагностику на основании одного или более диагностических индикаторов, например, маркера, присутствие, отсутствие, количество или изменение в количестве которого является показателем присутствия, тяжести или отсутствия патологического состояния.
[0074] Термин "прогнозирование", как используется в данной заявке, относится и используется в данной заявке для обозначения вероятности прогрессирования заболевания или патологического состояния, включая повторное проявление заболевания или патологического состояния.
[0075] Раскрытие международной заявки PCT/US2009/03139 включено в данную заявку посредством ссылки для всех целей.
[0076] Описание способов изобретения
[0077] Представленное изобретение предоставляет способы диагностирования или помощи при диагностировании заболевания или патологического состояния посредством сравнения профилей (например, профилей экспрессии гена/белка/липида/углевода, генотипов, количества копий гена, доз гена, метилирования ДНК и т.д.) маркеров, ассоциированных с заболеванием или патологическим состоянием (например, нуклеиновых кислот, белков, липидов, углеводов, метаболитов) между бесклеточными
текучими средами организма и нефагоцитарными клетками, взятыми от одного индивида, или между бесклеточными текучими средами организма и фагоцитарными клетками, которые еще не фагоцитировали клетки или клеточные компоненты из крови, т.е. фагоцитарными клетками, имеющими содержание ДНК, равное 2п, взятыми от одного индивида.
[0078] Данное изобретение также предоставляет способы оценки риска развития заболевания или патологического состояния, прогнозирования указанного заболевания, мониторинга прогрессирования или регрессии указанного заболевания, оценки эффективности лечения или идентификации соединения, способного улучшать течение или лечить указанное заболевание или патологическое состояние.
[0079] Подобное сравнение специфического для пациента профиля исключает зависимость от выведенного для популяции среднего профиля для конкретного заболевания или патологического состояния, которое может привнести ошибку в выявление или диагностирование конкретного заболевания или патологического состояния у пациента. Способы по данному изобретению предоставляют вероятность персонализации выявления, диагностирования и лечения для индивида.
[008 0] Способы по данному изобретению (i) имеют высокую специфичность, чувствительность и точность и способны выявлять маркеры, специфические для заболевания или патологического состояния, присутствующие в образце текучей среды организма, клетках или тканях; и (ii) устраняют "изменчивость базового показателя", которая, как известно, встречается среди индивидов вследствие врожденных (например, возраст, пол, национальная принадлежность, состояние здоровья и тому подобное) и преходящих колебаний в экспрессии маркера. Соответственно, в некоторых аспектах изобретение предоставляет неинвазивные анализы для раннего определения заболеваний или патологических состояний, т.е. Перед тем, как заболевание может быть распознано посредством общепризнанных диагностических методик, например, методов визуализации, и, вследствие этого, обеспечивают основу для улучшения принятия решения в отношении
необходимости и стратегий для вмешательства, предотвращения и лечения индивидов с подобным заболеванием или патологическим состоянием.
[0081] Способы по данному изобретению могут быть использованы вместе с какими-либо известными способами диагностирования, такими как физическое обследование, визуальный осмотр, биопсия, сцинтиграфия, гистология, рентгенологическое исследование, визуализация, ультразвуковое исследование, применение коммерческого набора, генетическое тестирование, иммунологическое тестирование, анализ текучих сред организма или мониторинг нейронной активности.
[0082] В некоторых вариантах осуществления фагоцитарными клетками являются профессиональные фагоцитарные клетки, такие как нейтрофилы, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, ксантомные клетки, тучные клетки или эозинофилы. В некоторых вариантах осуществления фагоцитарными клетками являются непрофессиональные фагоцитарные клетки, такие как эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты или мезенхимальные клетки. В других вариантах осуществления фагоцитарные клетки могут представлять собой смесь различных типовых фагоцитарных клеток. Нефагоцитарные клетки, которые могут быть использованы в данном изобретении, включают, но без ограничения, Т-клетки, В-клетки, нулевые клетки, базофилы или их смеси.
[0083] Как используется в данной заявке, "фагоцитарные клетки =2п" относится к фагоцитарным клеткам, которые имеют содержание ДНК, равное 2п. Согласно представленному изобретению, некоторые фагоцитарные клетки не поглощают фагоцитированные живые/умирающие/мертвые пораженные клетки или фрагменты и/или бесклеточные специфические для заболевания нуклеиновые кислоты, белки, липиды, и/или углеводы, присутствующие в текучих средах организма. Содержание ДНК данной группы фагоцитарных клеток остается 2п.
[0084] Как используется в данной заявке, "профиль" маркера заболевания или патологического состояния может широко относиться к любой информации, касающейся маркера. Данная информация может быть либо качественной (например, присутствие
или отсутствие), либо количественной (например, уровни, число копий или дозы). В некоторых вариантах осуществления профиль маркера может показывать отсутствие данного маркера. Профилем может быть профиль нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), белковый профиль, липидный профиль, углеводный профиль, профиль метаболита или их комбинации. "Маркер", как используется в данной заявке, обычно относится к аналиту, который дифференциально выявляется в фагоцитах и является показателем наличия заболевания или патологического состояния. Аналит является дифференциально выявляемым, если его можно количественно или качественно распознать в фагоцитах.
[0085] Способы по данному изобретению могут быть применены к различным заболеваниям или патологическим состояниям.
[008 6] Способы по данному изобретению могут быть применены
при различных заболеваниях или патологических состояниях.
Примером заболеваний или патологических состояний являются
сердечно-сосудистое заболевание или патологическое состояние,
связанное с почками заболевание или патологическое состояние,
заболевание или патологическое состояние, связанное с
беременностью и пренатальным периодом, неврологическое или
психоневрологическое заболевание или патологическое состояние,
аутоиммунное или иммунопатологическое заболевание или
патологическое состояние, рак, инфекционное заболевание или
патологическое состояние, нарушение со стороны митохондрий,
заболевание или патологическое состояние желудочно-кишечного
тракта и дыхательных путей, заболевание или патологическое
состояние репродуктивной системы, офтальмологическое
заболевание или патологическое состояние, опорно-двигательное заболевание или патологическое состояние или кожное заболевание или патологическое состояние.
[0087] Как используется в данной заявке, термин "сердечно-
сосудистое заболевание или патологическое состояние" относится
к любому состоянию, которое наносит ущерб системе сердца или
кровеносных сосудов (артерий и вен) . Примерами сердечно-
сосудистых заболеваний являются, но без ограничения, инфаркт
миокарда, ишемическая болезнь сердца, чрескожная
транслюминальная коронарная ангиопластика (РТСА), аорто-
коронарное шунтирование (CABG), рестеноз, болезнь
периферических артерий, инсульт, аневризма брюшной аорты, внутричерепная аневризма, атеротромботический инсульт на фоне поражения крупных артерий, кардиогенный инсульт, ранние проявления инфаркта миокарда, сердечная недостаточность, тромбоэмболия легочной артерии, острый коронарный синдром (ACS), стенокардия, гипертрофия сердца, артериосклероз, миокардит, панкардит, эндокардит, гипертензия, застойная сердечная недостаточность, атеросклероз, нарушение мозгового кровообращения, ухудшение состояния здоровья сердца, ишемическая болезнь сердца, перикардит, кардиогенный шок, алкогольная кардиомиопатия, врожденный порок сердца, ишемическая кардиомиопатия, гипертензивная кардиомиопатия, клапанная кардиомиопатия, воспалительная кардиомиопатия, кардиомиопатия на фоне системного метаболического заболевания, дилятационная кардиомиопатия, гипертрофическая кардиомиопатия, аритмогенная правожелудочковая кардиомиопатия, рестриктивная кардиомиопатия, некомпактная кардиомиопатия, заболевание клапанов сердца, гипертензивная болезнь сердца, миокардиальный ишемический приступ, нестабильная стенокардия, разрыв миокарда, кардиогенный шок, эмболия, тромбоз глубоких вен, аритмия, аритмогенная правожелудочковая кардиомиопатия, диабетическая кардиомиопатия, митральная регургитация, пролапс митрального клапана, заболевание периферических кровеносных сосудов, заболевание артерий, заболевание сонных артерий, тромбоз глубоких вен, заболевания вен, нарушение мозгового кровообращения, артериальная аневризма, гипертрофия левого желудочка, гипертензивное заболевание почек, гипертензивное заболевание сетчатки, васкулит, поражение левой главной коронарной артерии, заболевание артериальных сосудов, заболевание венозных сосудов, тромбоз микроциркуляторного русла, преходящее нарушение мозгового кровообращения, ишемия конечностей, аневризма, тромбоз, тромбоз поверхностных вен и тромбоз глубоких вен.
[0088] Как используется в данной заявке, термин
"заболевание или патологическое состояние, связанное с почками"
относится к любому заболеванию или патологическое состояние,
который наносить ущербэ почкам или почечной системе. Примеры
заболевания, связанного с почками, включают, но без
ограничения, хронические заболевания почек, первичные
заболевания почек, недиабетические заболевания почек,
гломерулонефрит, интерстициальный нефрит, диабетические
заболевания почек, диабетическую нефропатию, гломерулосклероз,
быстропрогрессирующий гломерулонефрит, фиброз почек, синдром
Альпорта, нефрит на фоне инсулинзависимого сахарного диабета,
мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит, мембранозно-
пролиферативный гломерулонефрит, серповидный гломерулонефрит,
интерстициальный фиброз почек, фокальный сегментарный
гломерулосклероз, мембранозную нефропатию, болезнь минимальных
изменений, малоиммунный быстропрогрессирующий гломерулонефрит,
IgA-нефропатию, поликистозную болезнь почек, болезнь Дента,
поликистоз почек, нефрит Хеймана, аутосомную доминантную
поликистозную болезнь почек (взрослых), аутосомную рецессивную
поликистозную болезнь почек (у детей), острое повреждение
почек, нефротический синдром, ишемию почек, заболевания или
расстройства подоцитов, протеинурию, гломерулярные заболевания,
мембранозный гломерулонефрит, фокальный сегментарный
гломерулонефрит, преэклампсию, эклампсию, повреждения почек,
коллагенозы, доброкачественную ортостатическую (постуральную)
протеинурию, IgM-нефропатию, мембранозную нефропатию,
саркоидоз, сахарный диабет, лекарственное поражение почек, болезнь Фабри, аминоацидурию, синдром Фанкони, гипертензивный нефросклероз, интерстициальный нефрит, серповидно-клеточную анемию, гемоглобинурию, миоглобинурию, гранулематоз Вегенера, болезнь фон Гирке, хроническую болезнь почек, хроническую почечную недостаточность, низкую скорость клубочковой фильтрации (GFR), нефроангиосклероз, волчаночный нефрит, ANCA-положительный малоиммунный серповидный гломерулонефрит, хроническую нефропатию аллотрансплантата, нефротоксичность, почечную токсичность, некроз почек, поражение почек, повреждение гломерулярного и тубулярного аппаратов, дисфункцию
почек, нефритический синдром, острую почечную недостаточность,
хроническую почечную недостаточность, проксимальную почечно-
тубулярную дисфункцию, острое отторжение почечного
трансплантата, хроническое отторжение почечного трансплантата,
мезангиопролиферативный гломерулонефрит, не связанный с IgA,
постинфекционный гломерулонефрит, васкулиты с поражением почек
любого типа, любое наследственное заболевание почек, любой
интерстициальный нефрит, недостаточность почечного
трансплантата, рак почки, болезнь почек, ассоциированная с
другими состояниями (например, гипертензией, диабетом и
аутоиммунным заболеванием), болезнь Дента, поликистоз почек,
нефрит Хеймана, первичная болезнь почек, склерозирующую
гломерулопатию, болезнь плотного осадка, гломерулонефрит,
ассоциированный с криоглобулинемией, болезнь Шенляйн-Геноха,
постинфекционный гломерулонефрит, бактериальный эндокардит,
микроскопический полиангиит, синдром Чарджа-Стросса, анти-БМК-
антителоопосредованный гломерулонефрит, амилоидоз, болезнь
отложения моноклонального иммуноглобулина, фибриллярный
гломерулонефрит, иммунотактоидную гломерулопатию, ишемическое
тубулярное повреждение, лекарственно-индуцированный тубуло-
интерстициальный нефрит, токсический тубуло-интерстициальный
нефрит, инфекционный тубуло-интерстициальное нефрит,
бактериальный пиелонефрит, вирусный инфекционный тубуло-
интерстициальный нефрит в результате полиомавирусной инфекции
или ВИЧ-инфекции, обменидуцированное тубуло-интерстициальное
заболевание, смешанное поражение соединительной ткани,
канальцевую нефропатию, дисметаболическую нефропатию, которая
может являться результатом отложения солей, индуцированного
уратами, или оксалатами, или лекарственными препаратами, острое
клеточное тубуло-интерстициальное отторжение аллотрансплантата,
опухолевое инфильтративное заболевание вследствие лимфомы или
посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание,
обструктивное заболевание почек, сосудистое заболевание,
тромботическую микроангиопатию, нефроангиосклероз,
атероэмболическую болезнь, смешанное поражение соединительной ткани, узелковый полиартериит, сосудистое заболевание,
индуцированное ингибитором кальциневрина, острое клеточное сосудистое отторжение аллотрансплантата, острое гуморальное отторжение аллотрансплантата, раннее ухудшение почечной функции (ERSD), конечную стадию заболевания почек (ESRD), тромбоз почечных вен, острый тубулярный некроз, острый интерстициальный нефрит, установленное хроническое заболевание почек, стеноз почечных артерий, ишемическую нефропатию, уремию, лекарственно-индуцированный и токсин-индуцированный хронический тубуло-интерстициальный нефрит, рефлюкс-нефропатию, конкременты почек, синдром Гудпасчера и гидронефроз.
[0089] Как используется в данной заявке, термин "связанное с беременностью и перинатальным периодом заболевание или патологическое состояние" относится к любому заболеванию, расстройству или состоянию, отрицательно сказывающемуся на беременной женщине, эмбрионе или плоде. Связанные с беременностью и перинатальным периодом патологические состояния могут также относиться к любому заболеванию, расстройству или состоянию, которое связано или возникает, либо непосредственно, либо опосредованно, в результате беременности. Данные заболевания или патологические состояния могут включать любые и все врожденные дефекты, врожденные патологические состояния или наследственные заболевания или патологические состояния. Примеры связанных с беременностью и перинатальным периодом заболеваний включают, но без ограничения, резусную болезнь, гемолитическую болезнь новорожденных, бета-талассемию, детерминацию пола, детерминацию беременности, наследственное менделевское генетическое расстройство, хромосомные аберрации, фетальную хромосомную анэуплоидию, фетальную хромосомную трисомию, фетальную хромосомную моносомию, трисомию 8, трисомию 13 (синдром Патау), трисомию 16, трисомию 18 (синдром Эдвардса), трисомию 21 (синдром Дауна), нарушения, связанные с Х-хромосомой, трисомию X (ХХХ-синдром), моносомию X (синдром Тернера), XXY-синдром, XYY-синдром, XYY-синдром, XXXY-синдром, XXYY-синдром, XYYY-синдром, ХХХХХ-синдром, XXXXY-синдром, XXXYY-синдром, XXYYY-синдром, синдром хрупкой Х-хромосомы, замедленный рост плода, муковисцидоз, гемоглобинопатию, гибель
плода, фетальный алкогольный синдром, серповидноклеточную
анемию, гемофилию, синдром Клайнфельтера, dup(17)(pll,2pl,2)-
синдром, эндометриоз, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера,
dup(22)(qll,2qll,2)-синдром, синдром кошачьего глаза, синдром
кошачьего крика, синдром Вольфа-Хиршхорна, синдром Вильямса-
Бюрена, амиотрофию Шарко-Мари-Тута, невропатию со склонностью к
параличам от сдавления, синдром Смита-Магениса,
нейрофиброматоз, синдром Алажиля, вело-кардио-фациальный
синдром, синдром ДиДжорджи, дефицит стероидной сульфатазы,
синдром Прадера-Вилли, синдром Калльмана, микрофтальмию с
линейными кожными дефектами, гипоплазию надпочечников,
недостаток глицеринкиназы, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, фактор
развития семенников, локализованный на Y-хромосоме, азооспермию
(фактор а) , азооспермию (фактор Ь) , азооспермию (фактор с) ,
делецию 1рЗб, фенилкетонурию, болезнь Тея-Сакса, гиперплазию
надпочечников, анемию Фанкони, спинальную мышечную атрофию,
псевдогипертрофическую миопатию Дюшенна, болезнь Хантингтона,
миотоническую дистрофию, робертсоновскую транслокацию,
синдромом Ангельмана, туберозный склероз, атаксию
телеангиэктазию, открытую spina bifida, дефекты нервной трубки,
дефекты вентральной стенки, низкую массу для данного
гестационного возраста, врожденную цитомегаловирусную инфекцию,
ахондроплазию, синдром Марфана, врожденный гипотиреоз,
врожденный токсоплазмоз, недостаточность биотинидазы,
галактоземию, болезнь мочи с запахом кленового сиропа,
гомоцистеинурию, недостаточность среднецепочечной ацил-Со-А
дегидрогеназы, структурные врожденные пороки, пороки сердца,
патологические конечности, косолапость, анэнцефалию,
аринэнцефалию/голопрозэнцефалию, гидроцефалию, анофтальм/микрофтальм, анотию/микротию, транспозицию крупных сосудов, тетраду Фалло, синдром гипоплазии левых отделов сердца, коарктацию аорты, расщелину твердого неба без расщелины верхней губы, расщелину верхней губы с расщелиной твердого неба или без расщелины твердого неба, атрезию/стеноз пищевода со свищем или без свища, небольшую атрезию/стеноз кишечника, аноректальную атрезию/стеноз, гипоспадии, недетерминированный
пол, агенезию почек, кистозную почку, преаксиальную полидактилию, дефекты уменьшения конечностей, диафрагмальную грыжу, слепоту, катаракты, проблемы со зрением, потерю слуха, глухоту, адренолейкодистрофию, сцепленную с Х-хромосомой, синдром Ретта, нарушения со стороны лизосом, церебральный паралич, аутизм, аглоссию, альбинизм, глазной альбинизм, окулокутанный альбинизм, гестационный диабет, мальформацию Арнольда-Киари, CHARGE синдром, врожденную диафрагмальную грыжу, брохидактилию, аниридию, расщепленную стопу и кисть, гетерофтальм, Dwarnian ear, синдром Элерса-Данлоса, буллезный эпидермоз, болезнь Горхема, синдром Хашимото, отечный синдром новорожденных, гипотонию, синдром Клиппеля-Фейля, мышечную дистрофию, несовершенный остеогенез, прогерию, синдром Смита-Лемли-Опитца, chromatelopsia, лимфопролиферативное заболевание, сцепленное с Х-хромосомой, омфалоцеле, гастрошизис, преэклампсию, эклампсию, преждевременные роды, ранние роды, выкидыш, задержку внутриутробного развития, эктопическую беременность, рвоту беременных, утреннюю тошноту беременных и вероятность успешного возбуждения родовой деятельности.
[0090] Как используется в данной заявке, термин
"неврологическое или психоневрологическое заболевание или
патологическое состояние" относится к любому заболеванию или
патологическому состоянию, отрицательно сказывающемуся на
нервной системе. Примеры неврологического или
психоневрологического заболевания или патологического состояния
включают, но без ограничения, травму головы, инсульт, инсульт,
ишемический инсульт, геморрагический инсульт, субарахноидальное
кровоизлияние, внутричерепное кровоизлияние, транзиторную
ишемическую атаку, сосудистую деменцию, кортикобазальную
ганглиозную дегенерацию, энцефалит, эпилепсию, синдром Ландау-
Клефнера, гидроцефалию, идиопатическую внутричерепную
гипертензию, заболевания таламуса, менингит, миелит, двигательные расстройства, эссенциальный тремор, заболевания спинного мозга, сирингомиелию, болезнь Альцгеймера (раннее проявление), болезнь Альцгеймера (позднее проявление), мультиинфарктную деменцию, болезнь Пика, хорею Хантингтона,
болезнь Паркинсона, синдромы Паркинсона, деменцию, лобно-
височную деменцию, кортикобазальную дегенерацию, множественную
системную атрофию, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь
телец Леви, болезнь Крейтцфельда-Якоба, синдром Денди-Уокера,
семейную атаксию Фридрейха, болезнь Мачадо-Джозефа, мигрень,
шизофрению, расстройства настроения и депрессию, деменцию с
тельцами Леви (DLB), лобно-височную деменцию (FTD), различные
формы сосудистой деменции (VD), подкорковую сосудистую деменцию
(болезнь Бинсвангера), аутизм, задержки развития, заболевания
двигательного нейрона, боковой амиотрофический склероз (ALS),
повреждение нейронов или мозга, гипоксию мозга, церебральный
паралич (CP), расстройства памяти, двигательные расстройства,
кортикобазальную ганглиозную дегенерацию, формы множественной
системной атрофии, расстройства, связанные с инсультом, острое
нарушение мозгового кровообращения, пострадиационную
энцефалопатию с припадками, сосудистый паркинсонизм,
таламическое острое нарушение мозгового кровообращения,
хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию,
алкогольную деменцию, семантическую деменцию, атаксию,
атипичный паркинсонизм, дистонию, прогрессирующий надъядерный
паралич, эссенциальный тремор, умеренное когнитивное нарушение,
боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз,
нейропатии, болезнь Пика, конгофильную амилоидную ангиопатию,
болезнь Крейтцфельда-Якоба, умственное расстройство при СПИДе,
депрессию, тревожное расстройство, фобию, паралич Белла,
эпилепсию, энцефалит, нейромышечные расстройства,
нейроонкологические расстройства, опухоли мозга,
нейрососудистые расстройства, нейроиммунные расстройства,
нейроотологическое заболевание, нейротравму, включая
повреждение спинного мозга, боль, включая нейропатическую боль,
педиатрические неврологические и психоневрологические
расстройства, расстройства сна, синдром Туретта,
кортикобазальную ганглиозную дегенерацию, алкогольную деменцию, семантическую деменцию, болезнь Альцгеймера в сочетании с мультиинфарктной деменцией, болезнь Альцгеймера в сочетании с деменцией с тельцами Леви, болезнь Паркинсона в сочетании с
деменцией с тельцами Леви, болезнь Альцгеймера и Паркинсона в сочетании с деменцией с тельцами Леви, лобно-височную деменцию в сочетании с хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатией, синдром гиперактивности с дефицитом внимания, шизофрению, обсессивно-компульсивное расстройство, задержку психического развития, расстройства аутистического спектра, приступы синдрома опсоклонус-миоклонус (OMS), расстройство артикуляции, неспособность к обучению (т.е. чтению или счету), дефицит вербальных и исполнительных способностей, расстройство дефицита внимания, амилоидные заболевания, прионовые заболевания, тауопатии, альфа-синуклеинопатии, состояния зависимости, такие как вызванные по меньшей мере одним из: кокаина, никотина, алкоголя, пищи, сильнодействующего синтетического наркотика на основе амфетамина, каты съедобной, кофеина, опия, героина, марихуаны, амфетамина, метамфетамина или азартных игр и болезнь Фабри.
[0091] Как используется в данной заявке, термин "аутоиммунное или иммунное заболевание или патологическое состояние" относится к любому заболеванию или патологическому состоянию, отрицательно сказывающемуся на иммунной системе. Примеры аутоиммунных или иммунных заболеваний или патологических состояний включают, но без ограничения, антифосфолипидный синдром, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, аутоиммунный васкулит, глютеновую болезнь, аутоиммунный тиреоидит, посттрансфузионную иммунизацию, иммунологическую несовместимость между матерью и плодом, посттрансфузионные реакции, иммунологическую недостаточность, такую как недостаточность IgA, вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит, лекарственно-индуцированную волчанку, сахарный диабет, диабет I типа, диабет II типа, ювенильный диабет, ювенильный ревматоидный артрит, псориатический артрит, рассеянный склероз, иммунодефицит, аллергию, астму, псориаз, атопический дерматит, аллергический контактный дерматит, хронические кожные заболевания, боковой амиотрофический склероз, повреждение, индуцированное химиотерапией, болезнь трансплантат против хозяина, отторжение костномозгового
трансплантата, анкилозирующий спондилоартрит, атопическую
экзему, пузырчатку, болезнь Бехчета, синдром хронической
усталости и фибромиалгии, повреждение, индуцированное
химиотерапией, миастению беременных, гломерулонефрит,
аллергический ретинит, системный склероз, подострую кожную
красную волчанку, кожную красную волчанку, включая ознобленную
красную волчанку, синдром Шегрена, аутоиммунный нефрит,
аутоиммунный васкулит, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный
кардит, аутоиммунный энцефалит, аутоиммунно опосредованные
гематологические заболевания, lc-SSc (ограниченную кожную форму
склеродермии), dc-SSc (диффузную кожную форму склеродермии),
аутоиммунный тиреоидит (AT), базедову болезнь (GD), миастению
беременных, рассеянный склероз (MS), анкилозирующий
спондилоартрит, отторжение трансплантата, старение иммунной
системы, ревматические/аутоиммунные заболевания, смешанное
поражение соединительной ткани, спондиллоартропатию, псориаз,
псориатический артрит, миозит, склеродермию, дерматомиозит,
аутоиммунный васкулит, смешанное поражение соединительной
ткани, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, болезнь
Крона, адъювантогенный синдром человека, остеоартрит,
ювенильный хронический артрит, спондиллоартропатию,
идиопатическую воспалительную миопатию, системный васкулит,
саркоидоз, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную
тромбоцитопению, тиреоидит, иммуноопосредованное заболевание
почек, демиелинизирующее заболевание центральной или
периферической нервной системы, идиопатическую
демиелинизирующую полинейропатию, синдром Гийена-Барре,
хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию,
заболевание гепатобилиарной зоны, инфекционный или аутоиммунный
хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз,
гранулематозный гепатит, склерозирующий холангит,
воспалительные заболевания кишечника, глютензависимую
энтеропатию, болезнь Уиппла, аутоиммунное или
иммуноопосредованное заболевание кожи, буллезное заболевание кожи, полиморфную эритему, аллергический ринит, атопический дерматит, пищевую аллергию, крапивницу, иммунное заболевание
легких, эозинофильные пневмонии, идиопатический фиброз легких,
пневмонит гиперчувствительности, заболевание, связанное с
трансплантацией отторжение трансплантата или болезнь
трансплантат против хозяина, псориатический артрит, псориаз,
дерматит, полимиозит/дерматомиозит, токсический эпидермальный
некролиз, системную склеродермию и склероз, реакции, связанные
с воспалительным заболеванием кишечника, болезнь Крона,
язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, респираторный
дистресс-синдром взрослых (ARDS), менингит, энцефалит, увеит,
колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзему, астму,
состояния, связанные с инфильтрацией Т-клетками и хронические
воспалительные реакции, атеросклероз, аутоиммунный миокардит,
недостаточность адгезии лейкоцитов, аллергический
энцефаломиелит, иммунные реакции, связанные с острой
гиперчувствительностью и гиперчувствительностью замедленного
типа, опосредованные цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез,
саркоидоз, гранулематоз, включая гранулематоз Вегенера,
агранулоцитоз, васкулит (включая ANCA), апластическую анемию,
анемию Даймонда-Блэкфана, иммунную гемолитическую анемию,
включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), пернициозную
анемию, истинную эритроцитарную аплазию (PRCA), дефицит VIII
фактора, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению, панцитопению,
лейкопению, заболевания, связанные с диапедезом лейкоцитов,
воспалительные нарушения центральной нервной системы (CNS),
синдром мультиорганного поражения, миастению беременных,
заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело,
антигломерулярную болезнь базальных мембран, антифосфолипидный
синдром, аллергический неврит, болезнь Бехчета, болезнь
Кастлемена, синдром Гудпасчера, миастенический синдром
Ламберта-Итона, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром
Стивенса-Джонсона, буллезный пемфигоид, пузырчатку,
аутоиммунные полиэндокринопатии, болезнь Рейтера, синдром
мышечной скованности, гигантоклеточный артериит,
иммунокомплексный нефрит, IgA-нефропатию, IgM-полинейропатии
или IgM-опосредованную нейропатию, идиопатическую
тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), тромботическую
тромбоцитопеническую пурпуру (ТТР), аутоиммунную
тромбоцитопению, аутоиммунное заболевание мужских и женских
гонад, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный
гипотиреоз, аутоиммунные эндокринные заболевания, включая
аутоиммунный тиреоидит, хронический тиреоидит (тиреоидит
Хашимото), подострый тиреоидит, идиопатический гипотиреоз,
болезнь Аддисона, болезнь Грейвса, аутоиммунные
полигландулярные синдромы (или полигландулярные
эндокринопатические синдромы), синдром Шихана, аутоиммунный
гепатит, лимфоидный интерстициальный пневмонит (ВИЧ),
облитерирующий бронхиолит (нетрансплантационный) vs
неспецифическая интерстициальная пневмония, синдром Гийена-
Барре, васкулит крупных сосудов (включая ревматическую
полимиалгию и гигантоклеточный (Такаясу) артериит), васкулит
сосудов среднего калибра (включая болезнь Кавасаки и узелковый
периартериит), анкилозирующий спондилоартрит, болезнь Бергера
(IgA-нефропатию), быстропрогрессирующий гломерулонефрит,
первичный билиарный цирроз, целиакию-спру (глютеновую энтеропатию), криоглобулинемию и боковой амиотрофический склероз (ALS).
[0092] Как используется в данной заявке, термин "рак" относится к различным типам злокачественных новообразований, большинство из которых могут поражать окружающие ткани и могут метастазировать в различные области (см., например, PDR Medical Dictionary, 1st edition (1995), включенный в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей). Термины "новообразование" и "опухоль" относится к патологической ткани, которая растет посредством пролиферации клеток более быстро, чем нормальная, и продолжает расти после того, как стимулы, которые инициировали пролиферацию, были удалены. Id. Яодобная патологическая ткань демонстрирует частичную или полную потерю структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью, которая может быть либо доброкачественной (т.е. доброкачественная опухоль), либо злокачественной (т.е. злокачественная опухоль). Примеры общей категорий рака включают, но без ограничения, карциномы
(т.е. злокачественные опухоли, производные эпителиальных
клеток, такие как, например, частые формы рака молочной железы,
предстательной железы, легкого и толстой кишки), саркомы (т.е.
Злокачественные опухоли, производные соединительной ткани или
мезенхимальных клеток), лимфомы (т.е. злокачественные опухоли,
производные гемопоэтических клеток), лейкозы (т.е.
злокачественные опухоли, производные гемопоэтических клеток),
эмбрионально-клеточные опухоли (т.е. опухоли, производные
тотипотентных клеток). У взрослых наиболее часто обнаруживают в
мужских и женских гонадах; у плодов, младенцев и детей раннего
возраста наиболее часто обнаруживают на срединной линии тела, в
частности на верхушке копчиковой кости), бластомы (т.е., как
правило, злокачественная опухоль, которая имеет сходство с
незрелой или эмбриональной тканью) и тому подобное. Примеры
типов новообразований, предназначенных для охвата
представленным изобретением, включают, но без ограничения, те новообразования, которые ассоциированы с раковыми опухолями нервной ткани, кроветворной ткани, молочной железы, кожи, кости, простаты, яичников, матки, шейки матки, печени, легкого, мозга, гортани, желчного пузыря, поджелудочной железы, прямой кишки, паращитовидных желез, щитовидной железы, надпочечников, иммунной системы, головы и шеи, толстой кишки, желудка, бронхов и/или почек.
[0093] Как используется в данной заявке, термин "инфекционный агент" включает, но без ограничения, патогенные микроорганизмы, такие как вирусы, бактерии, грибы, паразиты, инфекционные белки и тому подобное.
[0094] Вирусы включают, но без ограничения, ДНК- или РНК-вирусы животных. Как используется в данной заявке, РНК-вирусы включают, но без ограничения, семейства вирусов, такие как пикорнавирусы (например, полиовирусы), реовирусы (например, ротавирусы), тогавирусы (например, вирусы энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус краснухи), ортомиксовирусы (например, вирусы гриппа), парамиксовирусы (например, респираторно-синцитиальный вирус, вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус парагриппа), рабдовирусы (например, вирус бешенства),
коронавирусы, буньявирусы, флавивирусы, филовирусы,
аренавирусы, буньявирусы и ретровирусы (например, лимфотропные
Т-клеточные вирусы человека (HTLV), вирусы иммунодефицита
человека (ВИЧ)). Как используется в данной заявке, ДНК-вирусы
включают, но без ограничения, семейства вирусов, такие как
паповавирусы (например, папилломавирусы), аденовирусы
(например, аденовирус), герпесвирусы (например, вирусы herpes simplex) и поксвирусы (например, вирусы натуральной оспы).
[0095] Бактерии включают, но без ограничения, грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, кислотоустойчивые бактерии и тому подобное.
[0096] Как используется в данной заявке, грамположительные бактерии включают, но без ограничения, Actinomedurae, Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Nocardia, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epiderm, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae и тому подобное.
[0097] Как используется в данной заявке, грамотрицательные бактерии включают, но без ограничения, Afipia felis, Bacteriodes, Bartonella bacilliformis, Bortadella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter, Escherichia coli, Francisella tularensis, Gardnerella vaginalis, Haemophilius aegyptius, Haemophilius ducreyi, Haemophilius influenziae, Heliobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Neisseria meningitidia, Porphyromonas gingivalis, Providencia sturti, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteridis, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella boydii, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis и тому подобное.
[0098] Как используется в данной заявке, кислотоустойчивые бактерии включают, но без ограничения, Myobacterium avium, Myobacterium leprae, Myobacterium tuberculosis и тому подобное.
[0099] Как используется в данной заявке, другие бактерии, не попавшие в другие три категории, включают, но без ограничения, Bartonella henselae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia akari, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia tsutsugamushi, Rickettsia typhi, Ureaplasma urealyticum, Diplococcus pneumoniae, Ehrlichia chafensis, Enterococcus faecium, Meningococci и тому подобное.
[0100] Как используется в данной заявке, грибы включают, но без ограничения, Aspergilli, Candidae, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococci и их комбинации.
[0101] Как используется в данной заявке, паразитические
микроорганизмы включают, но без ограничения, Balantidium coli,
Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayatanensis,
Encephalitozoa, Entamoeba histolytica, Enterocytozoon bieneusi, Giardia lamblia, Leishmaniae, Plasmodii, Toxoplasma gondii, Trypanosomae, trapezoidal amoeba и тому подобное.
[0102] Как используется в данной заявке, паразиты включают червей (например, гельминты), в частности паразитических червей, включая, но без ограничения, Nematoda (круглые черви, например, власоглавы, анкилостомы, острицы, аскариды, филярии и тому подобное), цестоды (например, ленточные черви)
[0103] Как используется в данной заявке, "лечение" заболевания или патологического состояния относится к предпринятым мерам для получения благотворных или желательных результатов, включая клинические результаты. Благотворные или желательные клинические результаты включают, но без ограничения, облегчение или улучшение одного или более симптомов, связанных с заболеваниями или патологическими состояниями.
[0104] Как используется в данной заявке, "введение" или
"введение" соединения или агента пациенту может выполняться с
использованием одного из разнообразных способов, известных
квалифицированным специалистам в данной области. Например,
соединение или агент может быть введено внутривенно,
внутриартериально, внутрикожно, внутримышечно,
интраперитонеально, внутривенно, подкожно, окулярно,
сублингвально, перорально (посредством проглатывания),
интраназально (посредством ингаляции), интраспинально,
внутрицеребрально и чрескожно (посредством всасывания,
например, через кожный тракт). Соединение или агент также могут
быть введены подходящим образом посредством перезаряжаемых или
биоразрушаемых полимерных устройств или других устройств,
например, пластырей и насосов или готовых форм, которые
предусматривают пролонгированное, медленное или управляемое
высвобождение соединения или агента. Введение также может быть
выполнено, например, один раз, много раз и/или на протяжении
одного или более пролонгированных периодов. В некоторых
аспектах введение включает как прямое введение, включая
самовведение, так и непрямое введение, включая действие
выписывания лекарственного средства. Например, как используется
в данной заявке, врач, который дает указание пациенту по
самовведению лекарственного средства или введению
лекарственного средства другим человеком, и/или который предоставляет пациенту рецепт лекарственного средства, вводит лекарственное средство пациенту. В некоторых вариантах осуществления соединение или агент вводится перорально, например, пациенту посредством проглатывания или внутривенно, например, пациенту посредством инъекции. В некоторых вариантах осуществления перорально вводимое соединение или агент является готовой формой пролонгированного высвобождения или медленного высвобождения или вводится с использованием устройства для подобного медленного или пролонгированного высвобождения.
[0105] В некоторых вариантах осуществления маркеры, используемые в способах по изобретению, повышающе регулируются или активируются в бесклеточных текучих средах организма по сравнению с нефагоцитарными клетками. В некоторых вариантах осуществления маркеры, используемые в способах по изобретению, понижающе регулируются или ингибируются в бесклеточных текучих средах организма по сравнению с нефагоцитарными клетками. В некоторых вариантах осуществления маркеры, используемые в способах по изобретению, повышающе регулируются или
активируются в бесклеточных текучих средах организма по
сравнению с фагоцитарными клетками =2п. В некоторых вариантах
осуществления маркеры, используемые в способах по изобретению,
понижающе регулируются или ингибируются в бесклеточных текучих
средах организма по сравнению с фагоцитарными клетками =2п.
Различные заболевания или патологические состояния могут быть
связаны либо с повышающей регуляцией (или активацией) или
понижающей регуляцией (или ингибированием) различных маркеров.
Как используется в данной заявке, "повышающая регуляция или
повышающе регулированный" могут относиться к повышению уровней
экспрессии (например, экспрессии гена или экспрессии белка),
количеству копий генов, доз генов и другому качественному или
количественному выявляемому состоянию маркеров. Аналогичным
образом, "понижающая регуляция или понижающе регулированный"
могут относиться к повышению уровней экспрессии, количеству
копий генов, доз генов и другому качественному или
количественному выявляемому состоянию маркеров. Как
используется в данной заявке, "активация или активированный"
может относиться к активному состоянию маркера, например,
состоянию фосфорилирования, состоянию метилирования ДНК или
состоянию ацетилирования ДНК. Аналогичным образом,
"ингибирование или ингибированный" может относиться к
подавленному состоянию или инактивированному состоянию маркера,
например, состоянию дефосфорилирования, состоянию
убиквитинилирования, состоянию деметилирования ДНК.
[0106] В некоторых вариантах осуществления способы по данному изобретению могут также включать выделение или обогащение маркеров из бесклеточных текучих сред организма. В данной заявке могут быть использованы любые известные способы выделения и обогащения. В некоторых вариантах осуществления способы по данному изобретению также включают по меньшей мере одну из следующих стадий перед определением различных профилей: i) лизирование нефагоцитарных или фагоцитарных клеток =2n; ii) выделение клеточного содержимого из лизированных нефагоцитарных или фагоцитарных клеток =2п. В данной заявке могут быть использованы любые известные способы лизирования и выделения
клеток. В некоторых вариантах осуществления бесклеточные текучие среды организма включают различные типы материалов, которые они поглотили, такие как жизнеспособные пораженные клетки, мертвые пораженные клетки, апоптотические пораженные клетки, циркулирующие в крови опухолевые клетки, инфекционные агенты, фетальные клетки, трофобласты или их фрагменты. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один или более маркеров заболевания или патологического состояния присутствуют в бесклеточных текучих средах организма. В некоторых вариантах осуществления в клеточном содержимом нефагоцитарных клеток или фагоцитарных клеток =2п маркеры не присутствуют.
[0107] В некоторых вариантах осуществления способы по
данному изобретению дополнительно включают сравнение
идентифицированного различия маркеров, специфических для
заболевания или патологического состояния, с информационным
архивом по меньшей мере одного из маркеров, известных в данной
области. Подобное сравнение может дополнительно подтвердить
присутствие заболевания или патологического состояния. В
некоторых вариантах осуществления информационный архив
известных маркеров может быть получен посредством сбора данных.
Термин "сбор данных", как используется в данной заявке,
относится к процессу обнаружения новых комбинаций данных,
взаимосвязей или корреляций, получаемых от известных данных из
баз данных и извлечение имеющей практическое значение
информации в будущем. Как правило, система на основе компьютера
может быть обучена на данных для выполнения сбора данных,
например, для классификации входных данных, а затем в
дальнейшем для использования с новыми входными данными, чтобы
делать заключения на основании данных режима обучения. Данные
системы включают, но без ограничения, экспертные системы,
нечеткую логику, нелинейный регрессионный анализ,
многофакторный анализ, классификаторы в виде дерева принятия решений и Байесовские сети доверия.
[0108] В некоторых вариантах осуществления бесклеточная текучая среда организма поступает из образца текучей среды
организма. Иллюстративным образцом текучей среды организма может быть цельная кровь, моча, кал, слюна, лимфатическая жидкость, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, содержимое кисты, асцит, плевральный выпот, текучая среда, полученная у беременной женщины в первом триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины во втором триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины в третьем триместре, материнская кровь, околоплодная жидкость, проба ворсинчатого хориона, текучая среда предимплантационного эмбриона, материнская моча, материнская слюна, плацентарная проба, фетальная кровь, промывная жидкость и текучая среда из шейки матки, интерстициальная жидкость или внутриглазная жидкость. В некоторых вариантах осуществления бесклеточные текучие среды организма получают посредством отделения клеток из образца текучей среды организма с помощью способов, известных в данной области, таких как экстрагирование, центрифугирование и фильтрование.
[0109] В некоторых вариантах осуществления фагоцитарные клетки =2п или нефагоцитарные клетки отделяют от белых кровяных клеток. В некоторых вариантах осуществления фагоцитарные клетки =2п отделяют от популяции фагоцитарных клеток.
[ОНО] В некоторых вариантах осуществления образцы тканей или текучих сред, включая клетки, имеющие содержание ДНК, равное 2п, получают после отделения (например, посредством центрифугирования) неклеточной фракции текучих сред, получаемых посредством прокола вены или артерии с последующим взятием крови, биопсии ткани, бронхоальвеолярных выделений, промывания носовой полости, промывания глаза, промывания брюшной полости, промывания влагалища, промывания мочевого пузыря, промывания прямой кишки, тонкоигольной пункционно-аспирационной биопсии спинномозговой жидкости, отсасывания синовиальной жидкости и тому подобного. Бесклеточные текучие среды организма получают после разделения (например, посредством центрифугирования) клеточной фракции текучих сред, полученных посредством прокола вены или артерии с последующим взятием крови, биопсии ткани, бронхоальвеолярных выделений, промывания носовой полости,
промывания глаза, промывания брюшной полости, промывания влагалища, промывания мочевого пузыря, промывания прямой кишки, тонкоигольной пункционно-аспирационной биопсии спинномозговой жидкости, отсасывания синовиальной жидкости и тому подобного.
[0111] В способах по данному изобретению, способы отделения/выделения/очистки клеток используются для выделения популяций клеток из образца текучей среды, клеток или тканей организма пациента. Квалифицированный работник может применять любые известные методики отделения/выделения/очистки клеток для выделения фагоцитарных клеток =2п или нефагоцитарных клеток из текучих сред организма. Иллюстративные методики для экстрагирования/отделения/выделения клеток включают, но без ограничения, использование антител, проточной цитометрии, сортировки флуоресцентно-активированных клеток, фильтрования, градиентного центрифугирования, элюирования, микрофлюидики, методики разделения в магнитном поле, методики флуоресцентного разделения в магнитном поле, наноструктуры, точечных квантовых приборов, высокопроизводительной платформы на основе микроскопа или их комбинаций.
[0112] В некоторых аспектах способов, описанных в данной заявке, аналиты, профиль которых должен быть получен, включают нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы, метаболиты или любые их комбинации. В некоторых аспектах способов, описанных в данной заявке, маркеры включают нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы, метаболиты или любые их комбинации. Как используется в данной заявке, термин "нуклеиновая кислота" предполагает включение молекул ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), молекул РНК (например, мРНК), гибридов ДНК-РНК и аналогов ДНК или РНК, созданных с использованием нуклеотидных аналогов. Молекулой нуклеиновой кислоты может быть нуклеотид, олигонуклеотид, двухцепочечная ДНК, одноцепочечная ДНК, многоцепочечная ДНК, комплементарная ДНК, геномная ДНК, некодирующая ДНК, информационная РНК (мРНК) , микроРНК (miPHK), малая ядрышковая РНК (snoPHK), рибосомная РНК (рРНК), транспортная РНК (тРНК) , малая интерферирующая РНК (siPHK), гетерогенная ядерная РНК (hnPHK) или малая шпилечная РНК
(shPHK).
[0113] Как используется в данной заявке, термин
"аминокислота" включает органические соединения, содержащие как
базовую аминогруппу, так и кислую карбоксильную группу. В
данный термин включены естественные аминокислоты (например, L-
аминокислоты), модифицированные и необычные аминокислоты
(например, D-аминокислоты и р-аминокислоты), а также
аминокислоты, про которые известно, что они встречаются в
природе в свободной или комбинированной форме, но, как правило,
не встречаются в белках. Встречающиеся в естественных белках
аминокислоты включают аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую
кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин,
гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин,
серии, треонин, тирозин, триптофан, пролин и валин.
Естественные небелковые аминокислоты включают аргиноянтарную
кислоту, цитруллин, цистеин, серную кислоту, 3,4-
дигидроксифенилаланин, гомоцистеин, гомосерин, орнитин, 3-
монойодотирозин, 3,5-дийодотриозин, 3,5,-трийодотиронин и
3,3',5,5'-тетрайодотиронин. Модифицированные или необычные
аминокислоты включают D-аминокислоты, гидроксилизин, 4-
гидроксипролин, N-Cbz-защищенные аминокислоты, 2,4-
диаминомасляную кислоту, гомоаргинин, норлейцин, За-
метил аминомасляную кислоту, нафтилаланин, фенилглицин, альфа-
фенилпролин, терт-лейцин, 4-аминоциклогексилаланин, N-метил-
норлейцин, 3,4-дегидропролин, N,N-диметиламиноглицин, За-
метил амино глицин, 4-аминопиперидин-4-карбоновую кислоту, б-
аминокапроновую кислоту, транс-4-(аминометил)-
циклогексанкарбоновую кислоту, 2-, 3- и 4-(аминометил)-бензойную кислоту, 1-аминоциклопентанкарбоновую кислоту, 1-аминоциклопропанкарбоновую кислоту и 2-бензил-5-аминопентановую кислоту.
[0114] Как используется в данной заявке, термин "пептид" включает соединения, которые состоят из двух или более аминокислот, которые связаны посредством пептидной связи. Пептиды могут иметь молекулярную массу менее чем 10000 Дальтон, менее чем 5000 Дальтон или менее чем 2500 Дальтон. Термин
"пептид" также включает соединения, содержащие как пептидные, так и непептидные компоненты, такие как псевдопептидный или пептидомиметические остатки или другие неаминокислотные компоненты. Подобные соединения, содержащие как пептидные, так и непептидные компоненты, могут также называться "пептидный аналог".
[0115] Как используется в данной заявке, термин "белок" включает соединения, которые состоят из аминокислот, расположенных в линейной цепи и соединенных вместе пептидными связями между карбоксильной и аминогруппами соседних аминокислотных остатков. Белки, используемые в способах по изобретению, включают, но без ограничения, аминокислоты, пептиды, антитела, фрагменты антител, цитокины, липопротеины или гликопротеины.
[0116] Как используется в данной заявке, термин "антитело" включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (включая непроцессированные антитела, которые имеют Fc-область иммуноглобулина) , композиции антител с полиэпитопной специфичностью, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, диабоди и одноцепочечные молекулы, и фрагменты антител (например, Fab или F(ab')2 и Fv). Структуру и свойства различных классов антител см., например, Basic and clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. 1994, page 71 and Chapter 6.
[0117] Как используется в данной заявке, термин "цитокин" относится к секретируемому белку или его активному фрагменту или мутанту, который модулирует активность клеток иммунной системы. Примеры цитокинов включают, без ограничения, интерлейкины, интерфероны, хемокины, факторы некроза опухоли, колониестимулирующие факторы для прекурсоров иммунных клеток и тому подобное.
[0118] Как используется в данной заявке, термин "липопротеин" включает отрицательно заряженные композиции, которые содержат ядро из гидрофобных холестериловых эфиров и триглицерид, окруженный поверхностным слоем амфипатических
фосфолипидов, с которым связаны свободной холестерин и аполипопротеины. Липопротеины могут характеризоваться своей плотностью (например, липопротеин очень низкой плотности (VLDL), липопротеин низкой плотности (LDL) и липопротеин высокой плотности (HDL)), которую определяют по их размеру, относительным количествам липида и белка. Липопротеины также могут характеризоваться наличием или отсутствием особых модификаций (например, окисление, ацетилирование или гликирование).
[0119] Как используется в данной заявке, термин
"гликопротеин" включает гликозиды, которые имеют один или более
олиго- или полисахаридов, ковалентно связанных с пептидом или
белком. Иллюстративные гликопротеины могут включать, без
ограничения, иммуноглобулины, элементы главного комплекса
гистосовместимости, коллагены, муцины, гликопротеин lib/II1а,
гликопротеин-41 (др41) и гликопротеин-120 (др12),
фолликулостимулирующий гормон, альфа-фетопротеин, эритропоэтин, трансферрины, щелочную фосфатазу и лектины.
[0120] [0102] Как используется в данной заявке, термин
"липид" включает синтетические или встречающиеся в природе
соединения, которые обычно являются амфипатическими и
биосовместимыми. Липиды, как правило, содержат гидрофильный
компонент и гидрофобный компонент. Иллюстративные липиды
включают, но без ограничения, жирные кислоты, нейтральные жиры,
фосфатиды, холестерин, сложные эфиры холестерина, триглицериды,
гликолипиды, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды,
стерол липиды, пренол липиды, сахаролипиды, поликетиды, холин
глицерофосфолипид, этаноламин глицерофосфолипид,
фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидилсерин,
лизохолин глицерофосфолипид, лизоэтаноламин глицерофосфолипид,
фосфатидная кислота, лизофосфатидная кислота, сфингомиелин,
галактозилцерамид, глюкозилцерамид, сульфатид, свободные жирные
кислоты, простагландины, триацилглицерин, диацилглицерин,
моноацилглицерин, ацил-КоА, ацилкарнитин, оксистерол, церамид,
кардиолипин, сфингооснование-1-фосфат, сфингозин,
лизосфингомиелин, ганглиозиды, плазмалоген, сульфатид, церамид,
липопротеины низкой плотности (LDL), липопротеины очень низкой плотности (VLDL), липопротеины высокой плотности (HDL), сфингооснование-1-фосфаты или их производные.
[0121] Как используется в данной заявке, термин "углевод" включает, но без ограничения, соединения, которые содержат атомы кислорода, водорода и углерода, как правило, (СН20)п, где п является целым числом. Иллюстративные углеводы включают, но без ограничения, моносахариды, дисахариды, полисахариды или олигосахариды.
[0122] Как используется в данной заявке, термин
"метаболит" включает любую молекулу, используемую в
метаболизме. Метаболитами могут быть продукты, субстраты или
промежуточные продукты в метаболических процессах. В данном
термине заключены первичные метаболиты, вторичные метаболиты,
органические метаболиты или неорганические метаболиты.
Метаболиты включают, без ограничения, аминокислоты, пептиды,
ацилкарнитины, моносахариды, липиды и фосфолипиды,
простагландины, гидроксиэйкозатетраеновые кислоты,
гидроксиоктадекадиеновые кислоты, стероиды, желчные кислоты, и
гликолипиды и фосфолипиды. Иллюстративными метаболитами могут
быть сфинголипиды, гликосфинголипиды, сфингозин, церамид,
сфингомиелин, сфингозилфосфорилхолин, дигидросфингозин,
фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин,
лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилинозитол,
лизофосфатидилсерии, плазменилфосфатидилхолин,
плазманилфосфатидилхолин, протеиногенные аминокислоты, Алании,
Аспарагиновую кислоту, Глутаминовую кислоту, Фенилаланин,
Глицин, Гистидин, Лейцин, изолейцин, Лизин, Метионин, Пролин,
Аргинин, серии, Треонин, Валин, Триптофан, Тирозин,
асимметричный диметиларгинин, симметричный диметиларгинин,
Глутамин, Аспарагин, Нитротирозин, Гидроксипролин, Кинуренин,
3-гидроксикинуренин, непротеиногенные аминокислоты, Орнитин,
Цитруллин, ацилкарнитины, карнитин, свободный карнитин,
ацилкарнитин, гидроксилацилкарнитин, дикарбоксилацилкарнитины,
восстанавливающие моносахариды, гексоза, пентоза,
деоксигексоза, креатинин, креатин, спермидин спермин,
путресцин, допамин, серотонин, простагландины,
гидроксиэйкозатетраеновая кислота, гидроксиоктадекадиеновая кислота, лейкатриены, тромбоксаны, желчные кислоты, стеролы, холестерины, витамины и кофакторы, лекарственные средства и метаболиты лекарственных средств.
[0123] В некоторых вариантах осуществления изобретения
сравнивают профили по меньшей мере одного или более маркеров
заболевания или патологического состояния. Данное сравнение
может быть количественным или качественным. Количественные
измерения можно проводить, используя любой из анализов,
описанных в данной заявке. Например, секвенирование, прямое
секвенирование, случайное секвенирование методом "выстрела из
дробового ружья", дидезокси секвенирование с терминацией цепи
по Сенгеру, секвенирование полного генома, секвенирование
посредством гибридизации, пиросеквенирование, капиллярный
электрофорез, гель-электрофорез, двойное секвенирование,
циклическое секвенирование, секвенирование с удлинением цепи на
одно основание, твердофазное секвенирование,
высокопроизводительное секвенирование, массивно-параллельное
опознавательное секвенирование, эмульсионная PC, секвенирование
с помощью обратимого красящего терминатора, парноконцевое
секвенирование, near-term секвенирование, экзонуклеазное
секвенирование, секвенирование посредством лигирования,
секвенирование с короткими ридами, одномолекулярное
секвенирование, секвенирование посредством синтеза,
секвенирование в реальном времени, секвенирование с помощью обратимого терминатора, нанопоровое секвенирование, 454-секвенирование, секвенирование с помощью Solexa Genome Analyzer, секвенирование с помощью Solid(r), секвенирование MS-PET, масс-спектрометрию, времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную масс-спектрометрию с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольную времяпролетную (Q-TOF) масс-спектрометрию, масс-спектрометрию с фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс
спектрометрию с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-
спектрометрию с ионизацией лазерной десорбцией с использованием
матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-
преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионную масс-
спектрометрию (SIMS), анализ с помощью полимеразной цепной
реакции (ПЦР), количественную ПЦР, ПЦР в режиме реального
времени, флуоресцентный анализ, колориметрический анализ,
хемилюминесцентный анализ или их комбинации.
[0124] Количественные сравнения могут включать
статистические анализы, такие как критерий Стьюдента, дисперсионный анализ, критерий Краскела-Уоллиса, Уилкоксона, Манна-Уитни и коэффициент несогласия. Количественные различия могут включать различия в уровнях маркеров между профилями или различия в количествах маркеров, имеющиеся между профилями, и их комбинации. Примерами уровней маркеров могут быть, без ограничения, уровни экспрессии генов, уровни нуклеиновых кислот, уровни белков, уровни липидов и тому подобное. Качественные различия могут включать, но без ограничения, активацию и инактивацию, разрушение белков, разрушение нуклеиновых кислот и ковалентные модификации.
[0125] [0107] В некоторых вариантах осуществления изобретения, профилем является профиль нуклеиновых кислот, белковый профиль, липидный профиль, углеводный профиль, профиль метаболита или их комбинации. Профиль может быть определен качественно или количественно.
[0126] Профилем нуклеиновых кислот может быть, без ограничения, генотипический профиль, профиль однонуклеотидного полиморфизма, профиль мутации гена, профиль числа копий гена, профиль метилирования ДНК, профиль ацетилирования ДНК, профиль дозы хромосом, профиль экспрессии гена или их комбинации.
[0127] Профиль нуклеиновых кислот может быть определен с помощью любых способов, известных в данной области для выявления генотипов, однонуклеотидных полиморфизмов, генных мутаций, количеств копий генов, состояний метилирования ДНК, состояний ацетилирования ДНК, доз хромосом. Иллюстративные способы включают, но без ограничения, анализ с помощью
полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализ секвенирования,
анализ с помощью электрофореза, анализ полиморфизма длины
фрагментов рестрикции (RFLP), Нозерн-блоттинг, количественную
ПЦР, анализ с помощью ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR),
гибридизационный анализ методом аллель-специфических
олигонуклеотидов, сравнительную геномную гибридизацию, анализ
подвижности гетеродуплексов (НМА), анализ одноцепочного
конформационного полиморфизма (SSCP), денатурирующий
градиентный гель-электрофорез (DGGE), РНКазный анализ
несовпадений, масс-спектрометрию, тандемную масс-спектрометрию,
времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и
десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрию с
ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную масс-
спектрометрию с усиленной поверхностью лазерной
десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольную времяпролетную
(Q-TOF) масс-спектрометрию, масс-спектрометрию с фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-спектрометрию с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-спектрометрию с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (MALDI-FT-ICR) , вторично-ионную масс-спектрометрию (SIMS), поверхностный плазмонный резонанс, Саузерн-блоттинг, гибридизацию in situ, флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), хромогенную гибридизацию in situ (CISH), иммуногистохимическое исследование
(IHC), микроматричный анализ, сравнительную геномную
гибридизацию, кариотипирование, мультиплексную амплификацию
лигазно-зависимых зондов (MLPA), количественную мультиплексную
ПЦР коротких флуоресцентных фрагментов (QMPSF), микроскопию,
анализ с помощью специфической к метилированию ПЦР (MSP),
анализ обогащения HTF-островков с помощью опосредованной
лигированием ПЦР (HELP), анализы мечения радиоактивным
ацетатом, колориметрический анализ ацетилирования ДНК,
иммунопреципитацию хроматина, объединенную с микроматричным
анализом (иммунопреципитацию хроматина на микрочипе),
рестрикционно-ориентированное геномное сканирование,
иммунопреципитацию метилированной ДНК (MeDIP), анализ светового
молекулярного разрыва для активности ДНК-аденин-
метилтрансферазы, хроматографическое разделение, чувствительный к метилированию рестрикционный анализ, бисульфитную конверсию неметилированного цитозина в урацил, анализ с помощью метил-связывающей ПЦР или их комбинации.
[0128] Как используется в данной заявке, термин
"секвенирование" используется в широком смысле и относится к
любой методике, известной в данной области, которая
предоставляет возможность идентификации порядка по меньшей мере
некоторых следующих друг за другом нуклеотидов по меньшей мере
в части нуклеиновой кислоты, включая без ограничения вставку по
меньшей мере части удлиняющего сегмента или вектора.
Иллюстративные методики секвенирования включают прямое
секвенирование, случайное секвенирование методом "выстрела из
дробового ружья", дидезокси секвенирование с терминацией цепи
по Сенгеру, секвенирование полного генома, секвенирование
посредством гибридизации, пиросеквенирование, капиллярный
электрофорез, гель-электрофорез, двойное секвенирование,
циклическое секвенирование, секвенирование с удлинением цепи на
одно основание, твердофазное секвенирование,
высокопроизводительное секвенирование, массивно-параллельное
опознавательное секвенирование, эмульсионную ПЦР,
секвенирование с помощью обратимого красящего терминатора,
парноконцевое секвенирование, near-term секвенирование,
экзонуклеазное секвенирование, секвенирование посредством
лигирования, секвенирование с короткими ридами,
одномолекулярное секвенирование, секвенирование посредством синтеза, секвенирование в реальном времени, секвенирование с помощью обратимого терминатора, нанопоровое секвенирование, 454-секвенирование, секвенирование с помощью Solexa Genome Analyzer, секвенирование с помощью Solid(r), секвенирование MS-PET, масс-спектрометрию и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления секвенирование включает выявление продукта секвенирования с использованием инструмента, например, но без ограничения, ABI PRISM(r) 377 DNA Sequencer, ABI PRISM(r) 310, 3100, 3100-Avant, 3730 или 3730x1 Genetic Analyzer, ABI PRISM(r)
3700 DNA Analyzer или Applied Biosystems SOLiD(tm) System (все от Applied Biosystems), Genome Sequencer Systems (Roche Applied Science) или масс-спектрометр. В некоторых вариантах осуществления секвенирование включает эмульсионную ПЦР. В некоторых вариантах осуществления секвенирование включает методику высокопроизводительного секвенирования, например, но без ограничения, массивно-параллельное опознавательное секвенирование (MPSS).
[0129] В дополнительных вариантах осуществления изобретения белковым профилем может быть профиль экспрессирования белков, профиль активации белков или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления профиль активации белков может включать определение состояния фосфорилирования, состояния убиквитинилирования, состояния миристоилирования или конформационного состояния белка.
[0130] Белковый профиль может быть выявлен с помощью любых
способов, известных в данной области, для выявления уровней
экспрессии белков, состояния фосфорилирования белков, состояния
убиквитинилирования белков, состояния миристоилирования белков
или конформационного состояния белков. В некоторых вариантах
осуществления белковый профиль может быть определен посредством
иммуногистохимического исследования, энзим-связанного
иммуносорбентного метода исследования (ELISA), гибридизации in situ, хроматографии, жидкостной хроматографии, гель-проникающей хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), газовой хроматографии, масс-спектрометрии, тандемной масс-спектрометрии, времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетной масс-спектрометрии с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольной времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье
преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-
спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований, микроскопии, исследований на основе микрожидкостного чипа, поверхностного плазмонного резонанса, секвенирования, исследования вестерн-блоттинга или их комбинаций.
[0131] В некоторых вариантах осуществления изобретения
липидный профиль может быть определен посредством
хроматографии, жидкостной хроматографии, гель-проникающей
хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии
(HPLC), газовой хроматографии, масс-спектрометрии, тандемной
масс-спектрометрии, времяпролетной масс-спектрометрии с
лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF),
масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI),
времяпролетной масс-спектрометрии с усиленной поверхностью
лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольной
времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с
фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-
спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-
спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием
матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-
преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-
спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований,
анализа с использованием микрожидкостного чипа, выявления
флуоресценции, выявления хемилюминесценции или их комбинаций. В
данной области известны дополнительные способы анализа
липидного содержимого в биологическом образце (см., например,
Kang et al. (1992) Biochim. Biophys. Acta. 1128:267; Weylandt
et al. (1996) Lipids 31:977; J. Schiller et al. (1999) Anal.
Biochem. 267:46; Kang et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
98:4050; Schiller et al. (2004) Prog. Lipid Res. 43:499). Один
иллюстративный способ анализа липидов состоит в экстрагировании
липидов из биологического образца (например, используя
хлороформ-метанол (2:1, объем/объем), содержащего 0,005%
бутилированный гидрокситолуол (ВНТ, в качестве антиоксиданта)),
получении сложных метиловых эфиров жирных кислот (например,
используя 14% реагент BFS-метанол) и количественном определении
сложных метиловых эфиров жирных кислот (например, посредством HPLC, тонкослойной хроматографии, посредством газовой хроматографии - масс-спектроскопии с использованием коммерчески доступных газовых хроматографов, масс-спектрометров и/или комбинации газовых хроматографов/масс-спектрометров). Массу жирных кислот определяют посредством сравнения площадей различных анализируемых жирных кислот с площадями внутреннего стандарта с фиксированной концентрацией.
[0132] В некоторых вариантах осуществления изобретения углеводный профиль может быть определен посредством хроматографии, жидкостной хроматографии, гель-проникающей хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии
(HPLC), газовой хроматографии, масс-спектрометрии, тандемной
масс-спектрометрии, времяпролетной масс-спектрометрии с
лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) ,
масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI),
времяпролетной масс-спектрометрии с усиленной поверхностью
лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольной
времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с
фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-
спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-
спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием
матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-
преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-
спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований,
анализа с использованием микрожидкостного чипа, выявления
флуоресценции, выявления хемилюминесценции или их комбинаций.
[0133] В некоторых вариантах осуществления изобретения профиль метаболита может быть определен посредством хроматографии, жидкостной хроматографии, гель-проникающей хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии
(HPLC), газовой хроматографии, масс-спектрометрии, тандемной масс-спектрометрии, времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетной масс-спектрометрии с усиленной поверхностью
лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольной
времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с
фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-
спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-
спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием
матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-
преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-
спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований,
анализа с использованием микрожидкостного чипа, выявления
флуоресценции, выявления хемилюминесценции или их комбинаций.
[0134] [0116] Как используется в данной заявке, "различие" между различными профилями, выявляемое с помощью способов по данному изобретению, может относиться к различным количествам копий генов, различным уровням экспрессии ДНК, РНК, белков, липидов или углеводов, различным состояниям метилирования ДНК, различным состояниям ацетилирования ДНК и различным состояниям модификации белков. Различием может быть различие больше чем 1-кратное. В некоторых вариантах осуществления различием является 1,05-кратное, 1,1-кратное, 1,2-кратное, 1,3-кратное, 1,4-кратное, 1,5-кратное, 2-кратное, 2,5-кратное, 3-кратное, 4-кратное, 5-кратное, б-кратное, 7-кратное, 8-кратное, 9-кратное или 10-кратное различие. В некоторых вариантах осуществления различием является различие любой кратности между кратностями 1-10, 2-10, 5-10, 10-20 или 10-100.
[0135] Общий принцип анализов для выявления маркеров включает подготовку образца или реакционной смеси, которая может содержать маркер (например, один или более из ДНК, РНК, белка, полипептида, углевода, липида, метаболита и тому подобное), и зонда в подходящих условиях и на протяжении времени, достаточного, чтобы обеспечить возможность взаимодействия и связывания маркера и зонда, образуя таким образом комплекс, который может быть извлечен и/или выявлен в реакционной смеси. Данные анализы можно проводить множеством способов.
[0136] Например, один способ проведения подобного анализа должен включать фиксацию маркера или зонда на твердофазной
подложке, упоминаемой также как субстрат, и выявление комплексов маркер-мишень/зонд, зафиксированных на твердой фазе в конце реакции. В одном варианте осуществления подобного способа, образец от пациента, который должен быть проанализирован на присутствие и/или концентрацию маркера, может быть зафиксирован на носителе или твердофазной подложке. В еще одном варианте осуществления возможна обратная ситуация, в которой зонд может быть зафиксирован в твердой фазе, а образцу пациента может быть предоставлена возможность реакции в виде незафиксированного компонента анализа.
[0137] Имеется множество установленных способов фиксации компонентов анализа в твердой фазе. Они включают без ограничения молекулы маркера или зонда, которые иммобилизуют посредством конъюгирования биотина и стрептавидина. Подобные биотинилированные компоненты для анализа могут быть получены из биотин-NHS(N-гидрокси-сукцинимида) с использованием методик, известных в данной области (например, набора для биотинилирования, Pierce Chemicals, Rockford, IL), и иммобилизированы в лунках, покрытых стрептавидином, 9б-луночных планшетах (Pierce Chemical). В некоторых вариантах осуществления поверхности с иммобилизированными компонентами анализа могут быть получены заблаговременно и сохранены.
[0138] Другие подходящие носители или твердофазные подложки для подобных анализов включают любой материал, способный связывать класс молекул, к которому относится маркер или зонд. Хорошо известные подложки или носители включают, но без ограничения, стекло, полистирол, нейлон, полипропилен, нейлон, полиэтилен, декстран, амилазы, естественные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит.
[0139] Для того чтобы проводить анализы с упомянутыми выше подходами, к твердой фазе, на которой зафиксирован второй компонент, добавляют неиммобилизированный компонент. После завершения реакции несвязанные компоненты могут быть удалены (например, посредством промывания) в таких условиях, чтобы любые образованные комплексы оставались иммобилизированными на твердой фазе. Выявление комплексов маркер/зонд, зафиксированных
на твердой фазе, может быть выполнено с помощью ряда способов, перечисленных в данной заявке.
[014 0] В некоторых иллюстративных вариантах осуществления зонд, когда он представляет собой незафиксированный компонент для анализа, может быть мечен с целью выявления и считывания анализа, либо непосредственно, либо опосредованно, обнаруживаемыми метками, обсуждающимися в данной заявке, и которые хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области.
[0141] Также возможно непосредственное выявление образования комплекса маркер/зонд без дополнительного манипулирования или мечения каждого компонента (маркера или зонда), например, посредством использования методики переноса энергии флуоресценции (см., например, патенты США №№ 5631169 и 4 8 68103). Флуорофоровую метку на первой молекуле 'доноре' выбирают таким образом, чтобы при возбуждении падающим светом с подходящей длиной волны ее излучаемая энергия флуоресценции поглощалась флуоресцентной меткой на второй молекуле 'акцепторе', которая, в свою очередь, способна флуоресцировать благодаря поглощенной энергии. С другой стороны, молекула белка 'донора' может просто использовать естественную энергию флуоресценции триптофановых остатков. Выбирают метки, которые испускают волны с различной длиной света, таким образом, чтобы метку молекулы 'акцептора' можно было отличить от метки 'донора'. Поскольку эффективность переноса энергии между метками связана с расстоянием, разделяющим молекулы, могут быть оценены пространственные отношения между молекулами. В ситуации, в которой между молекулами происходит связывание, флуоресцентное излучение метки молекулы 'акцептора' в анализе должно быть максимальным. Явление FET связывания можно удобно измерять посредством стандартного флуорометрического средства детектирования, хорошо известного в данной области (например, с использованием флуориметра).
[0142] В еще одном варианте осуществления определение способности зонда распознать маркер может быть осуществлено без мечения каждого компонента для анализа (зонда или маркера)
посредством использования такой технологии, как анализ биомолекулярных взаимодействий (BIA) в реальном времени (см., например, Sjolander, S. and Urbaniczky, С, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 и Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). Как используется в данной заявке, "В1А" или "поверхностный плазмонный резонанс" представляет собой технологию для изучения биоспецифических взаимодействий в реальном времени, без мечения какого-либо из взаимодействующих объектов (например, BIAcore). Изменения массы на поверхности связывания (являющееся показателем явления связывания) приводят к изменениям коэффициента преломления света около поверхности (оптическое явление поверхностного плазмонного резонанса (SPR)), результатом чего является выявляемый сигнал, который может быть использован в качестве показателя реакций в реальном времени между биологическими молекулами.
[0143] В качестве альтернативы, в еще одном варианте
осуществления, аналогичные диагностические и прогностические
анализы можно проводить с маркером и зондом в качестве
растворенных веществ в жидкой фазе. В подобном анализе,
связанные маркер и зонд отделяют от несвязанных компонентов
посредством любой из множества стандартных методик, включая, но
без ограничения: дифференциальное центрифугирование,
хроматографию, электрофорез и иммунопреципитацию. В дифференциальном центрифугировании комплексы маркер/зонд могут быть отделены от несвязанных компонентов для анализа посредством серии стадий центрифугирования, благодаря различным седиментационным равновесиям комплексов, основанных на их различных размерах и плотностях (см., например, Rivas and Minton (1993) Trends Biochem. Sci. 18:284) . Стандартные хроматографические методики также могут быть использованы для отделения связанных молекул от несвязанных. Например, гель-фильтрационная хроматография разделяет молекулы на основе размера и посредством использования подходящей смолы для гель-фильтрования в формате колонки, например, относительно больший комплекс может быть отделен от относительно меньших несвязанных компонентов. Аналогичным образом, относительно разные свойства
заряда комплекса маркер/зонд по сравнению с несвязанными компонентами может быть использован для отличения комплекса от несвязанных компонентов, например, посредством использования ионообменных смол для хроматографии. Подобные смолы и хроматографические методики хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области (см., например, Heegaard (1998) J. Mol. Recognit. 11:141; Hage and Tweed (1997) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 12:499). Для отделения связанных компонентов для анализа от несвязанных компонентов также может быть использован гель-электрофорез (см., например, Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 1999). В данной методике комплексы белков или нуклеиновых кислот разделяют на основании, например, размера или заряда. Для того чтобы сохранять связывающее взаимодействие во время электрофоретического процесса, в отсутствие восстанавливающего агента, как правило, предпочтительными являются материалы и условия, не денатурирующие гель-матрицу. Подходящие условия для конкретного анализа и его компоненты должны быть хорошо известны квалифицированному специалисту в данной области.
[0144] В некоторых иллюстративных вариантах осуществления уровень мРНК, соответствующий маркеру, может быть определен либо с помощью форматов in situ и/или in vitro в биологическом образце с использованием способов, известных в данной области. Многие способы выявления экспрессии используют выделенную РНК. Для способов in vitro для очистки РНК от кровяных клеток может быть использована любая методика выделения РНК, которая не производит отбор вопреки выделению мРНК (см., например, Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987 1999) . Дополнительно, большие количества клеток и/или образцов легко могут быть обработаны с использованием методик, хорошо известных квалифицированным специалистам в данной области, таких как, например, одностадийный процесс выделения РНК по Chomczynski (1989, патент США № 4843155).
[0145] Выделенная мРНК может быть использована в
гибридизационных или амплификационных анализах, которые включают, но без ограничения, Саузерн или Нозерн анализы, анализы с помощью полимеразной цепной реакции и матрицы зондов. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления диагностический способ выявления уровней мРНК включает введение в контакт выделенной мРНК с молекулой нуклеиновой кислоты (зондом), которая может гибридизироваться с мРНК, кодируемой выявляемым геном. Зондом нуклеиновой кислоты может быть, например, первичная кДНК или ее часть, такая как олигонуклеотид по меньшей мере из 7, 15, 50, 100, 250 или 500 нуклеотидов в длину и достаточный для специфической гибридизации в жестких условиях с мРНК или геномной ДНК, кодирующей маркер по представленному изобретению. В данной заявке описаны другие подходящие зонды для использования в диагностических анализах по изобретению. Гибридизация мРНК с зондом показывает, что интересующий маркер экспрессирован.
[014 6] В одном формате мРНК иммобилизируют на твердой поверхности и вводят в контакт с зондом, например, посредством помещения выделенной мРНК на агарозном геле и переноса мРНК из геля в мембрану, такую как нитроцеллюлоза. В альтернативном формате зонд (зонды) иммобилизируют на твердой поверхности и мРНК вводят в контакт с зондом (зондами), например, в генной матрице-решетке. Специалист в данной области легко может адаптировать известные способы выявления мРНК для применения при выявлении уровня мРНК, кодируемой маркерами по представленному изобретению.
[0147] Альтернативный способ определения уровня мРНК,
соответствующего маркеру по представленному изобретению в
образце, включает процесс амплификации нуклеиновой кислоты,
например, посредством RT-PCR (экспериментального варианта
осуществления, изложенного в патентах США №№ 4683195 и
4683202), COLD-PCR (Li et al. (2008) Nat. Med. 14:579),
лигазной цепной реакции (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 88:189), самоподдерживающейся репликации
последовательностей (Guatelli et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874), транскрипционной амплификационной системы
(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173), Q-бета
Репликазы (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197),
репликации по типу "катящегося кольца" (патент США № 5854033)
или любого другого способа амплификации нуклеиновых кислот, с
последующим выявлением амплифицированных молекул с
использованием методик, хорошо известных квалифицированным
специалистам в данной области. Данные схемы выявления особенно
полезны для выявления молекул нуклеиновых кислот, если подобные
молекулы присутствуют в очень низких количествах. Как
используется в данной заявке, амплификационные праймеры
определяются, как пара молекул нуклеиновых кислот, которые
могут ренатурировать 5' или 3' области гена (плюс и минус нити,
соответственно, или наоборот) и содержат короткую область между
ними. В целом, амплификационные праймеры составляют
приблизительно от 10 до 3 0 нуклеотидов в длину и фланкируют
область приблизительно от 50 до 200 нуклеотидов в длину. В
подходящих условиях и с подходящими реагентами, подобные
праймеры обеспечивают амплификацию молекулы нуклеиновой
кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность,
фланкированную праймерами.
[0148] Для способов in situ нет необходимости выделения мРНК из образца (например, текучей среды организма (например, кровяных клеток)) перед выявлением. В подобных способах образец клеток или тканей получают/процессируют, используя известные гистологические способы. Затем образец иммобилизируют на подложке, как правило, стеклянной пластине, а затем вводят в контакт с зондом, который может гибридизировать с мРНК, которая кодирует маркер.
[0149] В качестве альтернативы проведению определений на
основе абсолютного уровня экспрессии маркера, определения могут
быть основаны на нормализованном уровне экспрессии маркера.
Уровни экспрессии нормализуют за счет корректировки абсолютного
уровня экспрессии маркера посредством сравнения его экспрессии
с экспрессией гена, который не является маркером, например,
гена "домашнего хозяйства", который конститутивно
экспрессируется. Подходящие гены для нормализации включают гены
"домашнего хозяйства", такие как ген актина или гены, специфические для эпителиальных клеток. Данная нормализация предоставляет возможность сравнения уровня экспрессии в образце пациента из одного источника с образцом пациента из другого источника, например, для сравнения фагоцитарных кровяных клеток индивида с нефагоцитарными кровяными клетками этого индивида.
[0150] В одном варианте осуществления данного изобретения выявляют белок или полипептид, соответствующий маркеру. В некоторых вариантах осуществления агентом для выявления белка или полипептида может быть антитело, способное к связыванию с полипептидом, такое как антитело с обнаруживаемой меткой. Как используется в данной заявке, термин "меченый" в отношении зонда или антитела, предполагает включение прямого мечения зонда или антитела посредством присоединения (т.е. физического связывания) обнаруживаемого вещества к зонду или антителу, а также непрямого мечения зонда или антитела за счет способности реагировать с еще одним реагентом, который непосредственно помечен. Примеры непрямого мечения включают выявление первичного антитела, используя флуоресцентно меченное вторичное антитело и концевое мечение зонда ДНК биотином таким образом, чтобы он мог быть выявлен флуоресцентно меченным стрептавидином. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Может быть использовано интактное антитело или его фрагмент (например, Fab или F(ab')2) • В одном формате антитела или фрагменты антител, могут быть использованы в таких способах, как Вестерн-блоттинги или иммунофлуоресцентные методики, для выявления экспрессированных белков. В подобных вариантах использования обычно предпочтительно иммобилизовать либо антитело, либо белки на твердой подложке. Подходящие твердофазные подложки или носители включают любую подложку, способную к связыванию антигена или антитела. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, естественные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро, магнетит и тому подобное.
[0151] Для определения, содержит ли образец белок, который
связывается с заданным антителом, может быть использовано
множество форматов. Примеры подобных форматов включают, но без
ограничения, конкурентный и неконкурентный иммуноанализ,
иммуноферментный анализ (EIA), радиоиммунологическое
исследование (RIA), методы "антигенной ловушки", сэндвич-анализы для двух антител, анализ с помощью Вестерн-блоттинга, энзим-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), планарную матрицу, колориметрический анализ, хемилюминесцентный анализ, флуоресцентное исследование и тому подобное. В способах по представленному изобретению используются иммуноанализы, включая радиоиммуноанализы и иммуноферментные анализы. Специалист в данной области может легко адаптировать известные способы выявления белков/антител для применения в определении, экспрессируют ли клетки (например, клетки текучих сред организма, такие как кровяные клетки) маркер по представленному изобретению.
[0152] Квалифицированный специалист в данной области должен знать множество других подходящих носителей для связывания антитела или антигена и будет способен адаптировать подобную подложку для использования с представленным изобретением. Например, белок, выделенный из клеток (например, клеток текучих сред организма, таких как кровяные клетки), может быть подвергнут полиакриламидному гель-электрофорезу и иммобилизирован на твердофазной подложке, такой как нитроцеллюлоза. Затем подложка может быть промыта подходящими буферами с последующей обработкой подлежащим обнаружению меченым антителом. Затем твердофазная подложка может быть промыта буфером второй раз для удаления несвязанного антитела. Затем с помощью общепринятого средства может быть выявлено количество связанной метки на твердой подложке.
[0153] В некоторых иллюстративных вариантах осуществления предоставлены анализы для диагностирования, прогнозирования, оценки риска развития заболевания, оценки эффективности лечения, мониторинга прогрессирования или регрессии заболевания и идентификации соединения, способного улучшать течение или лечить заболевание. Иллюстративный способ для данных способов
включает получение образца текучей среды организма обследуемого пациента и введение образца текучей среды организма в контакт с соединением или агентом, способным выявлять один или более маркеров заболевания или патологического состояния, например, маркерную нуклеиновую кислоту (например, мРНК, геномную ДНК) , маркерный пептид (например, полипептид или белок), маркерный липид (например, холестерин) или маркерный метаболит (например, креатинин), таким образом, чтобы присутствие маркера выявлялось в биологическом образце. В одном варианте осуществления агентом для выявления маркерной мРНК или геномной ДНК является меченый зонд нуклеиновой кислоты, способный к гибридизации с маркерной мРНК или геномной ДНК. Зондом нуклеиновой кислоты может быть, например, первичная маркерная нуклеиновая кислота или ее часть. В данной заявке описаны другие подходящие зонды для применения в диагностических анализах изобретения.
[0154] Как используется в данной заявке, соединение, способное улучшать течение или лечить заболевание или патологическое состояние, может включать без ограничений любое вещество, которое может улучшать симптомы или прогнозирование, предотвращать прогрессирование заболевания или патологического состояния, способствовать регрессии заболевания или патологического состояния или устранять заболевание или патологическое состояние.
[0155] Способы по изобретению также могут быть использованы для выявления генетических изменений в маркерном гене, определяя посредством этого, существует ли у пациента с измененным геном риск развития заболевания и/или расстройства, связанного с раковым и/или инфекционным агентом, и/или одного или более других расстройств, описанных в данной заявке, характеризующихся неправильным регулированием активности маркерного белка или экспрессии нуклеиновой кислоты, таких как рак. В некоторых вариантах осуществления способы включают выявление, в бесклеточном образце текучей среды организма пациента, присутствия или отсутствия генетического изменения, характеризующегося изменением, отрицательно сказывающимся на целостность гена, кодирующего маркерный пептид и/или маркерный
ген. Например, подобные генетические изменения могут быть выявлены посредством установления существования по меньшей мере одного из: 1) делеции одного или более нуклеотидов из одного или более маркерных генов; 2) добавления одного или более нуклеотидов в один или более маркерных генов; 3) замещения одного или более нуклеотидов одного или более маркерных генов, 4) хромосомной перестройки одного или более маркерных генов; 5) изменения уровня транскрипта информационной РНК одного или более маркерных генов; 6) аберрантной модификации одного или более маркерных генов, такой как характер метилирования геномной ДНК; 7) наличия не относящегося к дикому типу характера сплайсинга транскрипта информационной РНК одного или более маркерных генов; 8) не относящегося к дикому типу уровня одного или более маркерных белков; 9) аллельной потери одного или более маркерных генов; и 10) неподходящей посттрансляционной модификации одного или более маркерных белков. Как описано в данной заявке, имеется большое количество анализов, известных в данной области, которые могут быть использованы для выявления изменений в одном или более маркерных генов.
[0156] В некоторых вариантах осуществления выявление изменения включает использование зонда/праймера в полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см., например, патенты США №№ 4683195, 4683202 и 5854033), такой как ПЦР в режиме реального времени, COLD-ПЦР (Li et al. (2008) Nat. Med. 14:579), якорная ПЦР, рекурсивная ПЦР или ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК, или, в качестве альтернативы, в лигазной цепной реакции (LCR) (см., например, Landegran et al. (1988) Science 241:1077; Prodromou and Pearl (1992) Protein Eng. 5:827; и Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360), причем последняя может быть особенно полезна для выявления точечных мутаций в маркерном гене (см. Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675) . Данный способ может включать стадии сбора образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, выделения нуклеиновой кислоты (например, геномной, мРНК или и той, и другой) из образца, введения в контакт образца нуклеиновой
кислоты с одним или более праймерами, которые специфически гибридизируют с маркерным геном в таких условиях, чтобы возникала гибридизация и амплификация маркерного гена (если имеется), и выявления присутствия или отсутствия продукта амплификации или выявления размера продукта амплификации и сравнения длины с контрольным образцом. Предусматривается, что может быть необходимо использовать ПЦР и/или ЛЦР в качестве предварительной стадии амплификации в сочетании с любой из методик, используемых для выявления мутаций, описанных в данной заявке.
[0157] Альтернативные способы амплификации включают: самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Guatelli et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874), транскрипционную амплификационную систему (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173), Q-бета Репликазу (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197) или любой другой способ амплификации нуклеиновых кислот, с последующим выявлением амплифицированных молекул с использованием методик, хорошо известных квалифицированным специалистам в данной области. Данные схемы выявления особенно полезны для выявления молекул нуклеиновых кислот, если подобные молекулы присутствуют в очень низких количествах.
[0158] В альтернативном варианте осуществления мутации в одном или более маркерных генах из образца могут быть идентифицированы посредством изменений в характере расщепления рестрикционного фермента. Например, образец и контрольную ДНК выделяют, необязательно амплифицируют, расщепляют одной или более рестрикционными эндонуклеазами, и размеры длины фрагментов определяют с помощью гель-электрофореза и сравнивают. Различия в размерах длины фрагментов между образцом и контрольной ДНК являются показателем мутаций в образце ДНК. Более того, применение специфических к последовательностям рибозимов (см., например, патент США № 5498531) может быть использовано для оценки присутствия специфических мутаций за счет развития или потери сайта рибосомного расщепления.
[0159] В других вариантах осуществления генетические
мутации в одном или более маркеров, описанных в данной заявке, могут быть идентифицированы с помощью гибридизации образца и контрольных нуклеиновых кислот, например, ДНК или РНК, на высокоплотных матрицах, содержащих сотни или тысячи олигонуклеотидных зондов (Cronin et al. (1996) Human Mutation 7: 244; Kozal et al. (1996) Nature Medicine 2:753). Например, генетические мутации в маркерной нуклеиновой кислоте могут быть идентифицированы в двумерных матрицах, содержащих светогенерируемые ДНК-зонды, как описано у Cronin, М. Т. et al., выше. Кратко, сперва гибридизационную матрицу зондов можно использовать для сканирования длинных удлинений ДНК в образце и в контроле для идентификации изменений оснований между последовательностями с помощью создания линейных матриц последовательно наложенных зондов. Данная стадия предоставляет возможность идентификации точечных мутаций. За данной стадией следует вторая гибридизационная матрица, которая предоставляет возможность получения характеристик конкретных мутаций посредством использования меньших, специализированных матриц зондов, комплементарных ко всем вариантам или выявленным мутациям. Каждая мутационная матрица состоит из параллельных наборов зондов, одного, комплементарного гену дикого типа, и другого, комплементарного мутантному гену.
[132] В еще одном варианте осуществления любая из
множества реакций секвенирования, известных в данной области,
может быть использована для непосредственного секвенирования
маркерного гена и выявления мутаций посредством сравнения
последовательности маркерного гена образца с
последовательностью соответствующего дикого типа (контроля). Примеры реакций секвенирования включают реакции секвенирования, основанные на методиках, разработанных Maxam and Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560) или Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463) . Также предусматривается, что при выполнении диагностических анализов может быть использована любая из множества методик автоматического секвенирования ((1995) Biotechniques 19:448), включая секвенирование с помощью масс-спектрометрии (см., например,
[0160] Другие способы выявления мутаций в маркерном гене включают способы, в которых для выявления ошибочно спаренных оснований используется защита от расщепляющих агентов в гетеродуплексах РНК/РНК или РНК/ДНК (Myers et al. (1985) Science 230:1242) . В целом, технология предыдущего уровня техники "расщепления ошибочных нуклеотидов" начинается предоставлением гетеродуплексов, образованных с помощью гибридизации (мечения) РНК или ДНК, содержащей маркерную последовательность дикого типа с потенциально мутантной РНК или ДНК, полученной из образца ткани. Двухцепочечные дуплексы обрабатывают агентом, который расщепляет одноцепочечные области дуплекса, например, которые возникнут вследствие ошибочного спаривания пары оснований между нитями контроля и образца. Например, РНК/ДНК дуплексы могут быть обработаны с РНКазой, а ДНК/ДНК гибриды обработаны S1 нуклеазой для ферментного расщепления ошибочно спаренных областей. В других вариантах осуществления либо ДНК/ДНК, либо РНК/ДНК дуплексы могут быть обработаны гидроксиламином или осмий тетраоксидом и пиперидином для того, чтобы расщепить ошибочно спаренные области. После расщепления ошибочно спаренных областей, полученный в результате материал отделяют по размеру на денатурирующих полиакриламидных гелях для выявления сайта мутации. См., например, Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286. В одном варианте осуществления для выявления можно пометить контрольные ДНК или РНК.
[0161] В еще одном варианте осуществления в реакции расщепления ошибочно спаренных оснований задействованы один или более белков, которые распознают пары ошибочно спаренных оснований в двухцепочечной ДНК (так называемые ферменты "репарации ошибочно спаренных оснований ДНК"), в определенных системах для выявления и картирования точечных мутаций в маркерных кДНК, полученных из образцов клеток. Например,
фермент mutY Е. coli расщепляет А в ошибочно спаренных основаниях G/A, а тимидин ДНК гликозилаза из клеток HeLa расщепляет Т в ошибочно спаренных основаниях G/T (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657). Согласно иллюстративному варианту осуществления, зонд, на основании маркерной последовательности, например, маркерной последовательности дикого типа, гибридизируют с кДНК или другим ДНК-продуктом из тестовой клетки (клеток). Дуплекс обрабатывают ферментом репарации ошибочно спаренных оснований ДНК, и продукты расщепления, если имеются, могут быть выявлены из протоколов электрофореза и тому подобное. См., например, патент США № 5459039.
[0162] В других вариантах осуществления для идентификации мутаций в маркерных генах будут использоваться изменения электрофоретической подвижности. Например, для выявления различий в электрофоретической подвижности между нуклеиновыми кислотами мутантными и дикого типа может быть использован одноцепочный конформационный полиморфизм (SSCP) (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766, см. также Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125; и Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73). Фрагменты одноцепочечной ДНК маркерных нуклеиновых кислот образца и контроля будут денатурироваться и получать возможность ренатурации. Вторичная структура одноцепочечных нуклеиновых кислот варьирует согласно последовательности, полученное в результате изменение электрофоретической подвижности позволяет выявление изменения даже единственного основания. Фрагменты ДНК можно метить или выявлять с помощью меченых зондов. Чувствительность анализа может быть улучшена посредством использования РНК (вместо ДНК), у которой вторичная структура является более чувствительной к изменению последовательности. В одном варианте осуществления в способе используется гетеродуплексный анализ для отделения молекул двунитевых гетеродуплексов на основании изменений электрофоретической подвижности (Keen et al. (1991) Trends Genet. 7:5).
[0163] В еще одном варианте осуществления анализируют
движение мутантных фрагментов или фрагментов дикого типа в полиакриламидных гелях, содержащих градиент денатурирующего средства, используя денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Когда в качестве способа анализа используется DGGE, ДНК будут модифицировать, обеспечивая, чтобы она не была полностью денатурированной, например, посредством добавления ГЦ-блока, равного приблизительно 4 0 пар оснований, богатой ГЦ ДНК с высокой точкой плавления с помощью ПЦР. В дополнительном варианте осуществления, для идентификации различий в подвижности ДНК контроля и образца, вместо денатурирующего градиента используется температурный градиент (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys. Chem. 265:12753).
[0164] Примеры других методик для выявления точечных мутаций включают, но без ограничения, избирательную олигонуклеотидную гибридизацию, избирательную амплификацию или избирательный праймер протяженности. Например, могут быть получены олигонуклеотидные праймеры, в которых в центре помещена известная мутация, и затем гибридизированы с ДНК-мишенью в условиях, которые допускают гибридизацию, только если обнаружено полное совпадение (Saiki et al. (1986) Nature 324:163; Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230). Подобные аллель-специфические олигонуклеотиды гибридизируются с ПЦР амплифицированной ДНК-мишенью или множеством различных мутаций, когда олигонуклеотиды прикрепляются к гибридизирующей мембране и гибридизируются с меченой ДНК-мишенью.
[0165] В качестве альтернативы, в сочетании с данным изобретением может быть использована технология аллель-специфической амплификации, которая зависит от избирательной ПЦР амплификации. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для конкретной амплификации, могут нести интересующую мутацию в центре молекулы (так, что амплификация зависит от дифференциальной гибридизации) (Gibbs et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17:2437) или на крайнем 3'-конце одного праймера, где, в подходящих условиях, ошибочное спаривание может предотвращать
или уменьшать протяженность полимеразы (Prossner (1993) Tibtech 11:238) . В дополнение может быть необходимо ввести новый сайт рестрикции в область мутации для создания основанного на расщеплении выявления (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1) . Предусматривается, что в некоторых вариантах осуществления амплификация также может быть выполнена с использованием лигазы Taq для амплификации (Вагапу (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189) . В подобных случаях лигирование будет происходить, только если имеется полное совпадение на 3'-конце 5'-последовательности, делая возможным выявление наличия известной мутации в конкретном сайте посредством определения наличия или отсутствия амплификации.
[0166] В одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров для заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение второго профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; определение четвертого профиля аналитов из нефагоцитарных клеток у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; с) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния.
Необязательно, данный способ дополнительно включает d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию третьего разностного множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с), присутствующих в третьем разностном множестве.
[0167] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение второго профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение четвертого профиля аналитов из нефагоцитарных клеток у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; с) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными
аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния. И необязательно, способ дополнительно включает d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию третьего разностного множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с), присутствующих в третьем разностном множестве.
[0168] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение второго профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния, посредством сбора данных; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение четвертого профиля аналитов из нефагоцитарных клеток у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния, посредством сбора данных; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; и с) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого
разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния. И необязательно, способ дополнительно включает d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, посредством сбора данных; получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, посредством сбора данных; идентификацию третьего разностного множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с), присутствующих в третьем разностном множестве.
[0169] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение второго профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение четвертого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; с) идентификацию одного или более аналитов,
присутствующих как в первом разностном множестве, так и во втором разностном множестве, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния. И необязательно, способ дополнительно включает d) определение пятого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию третьего разностного множества между первым и пятым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для первого профиля относительно пятого профиля; е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с) , присутствующих в третьем разностном множестве.
[0170] В еще одном аспекте данное изобретение предоставляет способ идентификации одного или более маркеров заболевания или патологического состояния, включающий: а) определение первого профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; определение второго профиля аналитов из фагоцитарных клеток =2п пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля; Ь) определение третьего профиля аналитов из образца бесклеточной текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; определение четвертого профиля аналитов из фагоцитарных клеток =2п у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния; идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; и с) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом
идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния. И необязательно, способ дополнительно включает: d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние; идентификацию третьего разностного множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с), присутствующих в третьем разностном множестве.
[0171] Иллюстративный способ выявления присутствия или отсутствия аналита (например, ДНК, РНК, белка, полипептида, углевода, липида и тому подобное), соответствующего маркеру изобретения в биологическом образце, включает получение образца текучей среды организма (например, крови) у обследуемого пациента и введение в контакт образца текучей среды организма с соединением или агентом, способным к выявлению одного или более маркеров. Способы выявления, описанные в данной заявке, могут быть использованы для выявления одного или более маркеров в биологическом образце in vitro, а также in vivo. Например, методики in vitro для выявления мРНК включают Нозерн-гибридизации и гибридизации in situ. Методики in vitro для выявления полипептида, соответствующего маркеру по изобретению, включают твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), Вестерн-блоттинги, иммунопреципитации и иммунофлуоресценцию. Методики in vitro для выявления геномной ДНК включают Саузерн-гибридизации. Кроме того, методики in vivo для выявления полипептида, соответствующего маркеру по изобретению, включают введение пациенту меченого антитела, направленного против полипептида. Например, антитело может быть мечено радиоактивным маркером, присутствие и расположение которого у пациента может
быть выявлено с помощью стандартных методов визуализации. Вследствие того, что каждый маркер также является аналитом, любой способ, описанный в данной заявке для выявления присутствия или отсутствия маркера, также может быть использован для выявления присутствия или отсутствия аналита.
[0172] Маркер, который используется в способах по
изобретению, может содержать любую мутацию в любом из выше
идентифицированных маркеров. Сайты и последовательности мутаций
могут быть идентифицированы, например, с помощью баз данных или
информационных архивов подобной информации, например, баз
данных мутаций человеческих генов (www.hgmd.cf.ac.uk), баз
данных однонуклеотидных полиморфизмов (dbSNP,
www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP) и веб-сайта онлайнового каталога фенетических маркеров у человека (0MIM) (www.ncbi.nlm.nih.gov/omim).
[0173] Маркер, который используется в способах по изобретению, может включать любой маркер, о котором известно, что он связан с заболеванием или патологическим состоянием.
[0174] Согласно некоторым вариантам осуществления,
субпопуляции белых кровяных клеток (БКК) (выделенных, например,
из крови, мочи и слюны), таких как нефагоцитарные БКК,
фагоцитарные БКК, которые не имеют
фагоцитированных/интернализированных живых, умирающих или
мертвых прокариотических и эукариотических клеток и их
фрагментов, и БКК с содержанием ДНК, равным 2п, (т.е. индекс
ДНК=1) являются полезными для регистрирования и исключения
врожденного геномного, протеомического, метаболомического,
гликомического, гликопротеомического, липидомического и/или
липопротеомического профиля (профилей) оцениваемого индивида.
Подобная идентификация пациент-специфических сигнатур, которые
не связаны с заболеванием, патологией и/или патологическим
состоянием, подлежщим диагностированию, обеспечивает
идентификацию и выявление сигнатур, специфических для опухоли/другого заболевания/патологического состояния в бесклеточных текучих средах организма (таких как цельная кровь, плазма, сыворотка, моча, слюна, цереброспинальная жидкость,
околоплодная жидкость, внутриглазная жидкость, назальная
жидкость, жидкость промывания легких, жидкость брюшной полости,
кал, лимфа и тому подобное) индивида с подозрением на наличие
рака или другого заболевания или расстройства или
патологического состояния. Вследствие этого, сравнение профилей
маркеров, специфических для заболевания или патологического
состояния, присутствующих в бесклеточных текучих средах
организма (например, цельной крови, сыворотке, плазме, моче,
слюне, цереброспинальной жидкости, околоплодной жидкости,
внутриглазной жидкости, назальной жидкости, жидкости промывания
легких, жидкости брюшной полости, кале, лимфе), с профилями
маркеров в любых нефагоцитарных БКК или клетках, которые могут
быть получены неинвазивно (например, соскоблены из защечного
мешка), или в любых фагоцитарных и/или нефагоцитарных БКК или
клеток, которые могут быть получены неинвазивно (например,
соскоблены из защечного мешка), с индексом ДНК, равным 1, будет
приводить к идентификации пациент-специфических и
опухолеспецифических, специфических для заболевания или специфических для патологического состояния сигнатур, которые не экспрессируются, понижающе экспрессируются в нефагоцитарной клетке или в любых БКК и/или другой клетке организма, содержание ДНК которых равно 2 (т.е. с индексом ДНК=1), или экспрессируются в клетках не вследствие заболевания или патологического состояния, подлежащего выявлению или диагностированию, т.е. связаны с врожденными геномными, протеомическими и эпигенетическими профилями индивида, аналогичным образом, профили экспрессии белка бесклеточных текучих сред организма и нефагоцитарных БКК (содержание ДНК, равное 2п) , любых БКК, содержание ДНК которых равно 2 (т.е. с индексом ДНК=1), или любой другой клетки млекопитающего, которая может быть получена неинвазивно, с содержанием ДНК, равным 2п, будет приводить к идентификации и выявлению опухолеспецифических, специфических для заболевания или специфических для патологического состояния сигнатур белков в текучих средах, которые не экспрессируются, понижающе экспрессируются в нефагоцитарной клетке или в любых БКК и/или
другой клетке организма, содержание ДНК которых равно 2 (т.е. с индексом ДНК=1), или экспрессируются в клетках не вследствие заболевания или патологического состояния, подлежащего выявлению или диагностированию, т.е. связаны с врожденными геномными, протеомическими и эпигенетическими профилями индивида. Кроме того, липидные профили бесклеточных текучих сред организма и нефагоцитарных БКК (содержание ДНК, равное 2п), любых БКК, содержание ДНК которых равно 2 (т.е. с индексом ДНК=1), или любой другой клетки млекопитающего, которая может быть получена неинвазивно, с содержанием ДНК, равным 2п, будет приводить к идентификации и выявлению опухолеспецифических, специфических для заболевания или специфических для патологического состояния сигнатур липидов в текучих средах, которые не экспрессируются, понижающе экспрессируются в нефагоцитарной клетке или в любых БКК и/или другой клетке организма, содержание ДНК которых равно 2 (т.е. с индексом ДНК=1), или экспрессируются в клетках не вследствие заболевания или патологического состояния, подлежащего выявлению или диагностированию, т.е. связаны с врожденными геномными, протеомическими и эпигенетическими профилями индивида.
[0175] Маркер, который используется в способах по изобретению, может содержать любой маркер, о котором известно, что он связан с заболеванием или патологическим состоянием. Маркерами, которые могут быть использованы в данном изобретении, может быть любой маркер, который хорошо зарекомендовал себя в связи с конкретным заболеванием или патологическим состоянием, или любые маркеры, которые были идентифицированы с помощью способов по данному изобретению.
[017 6] В некоторых вариантах осуществления маркеры включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АКТ2, ВАК1, EGFR, ERBB2, ETS2, FOS, JUN, МАР2К1, ММР2, PDGFB, RBI, SERPINB2, SNCG и SPP1. В некоторых вариантах осуществления один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АКТ1, АКТ2, ВАК2, CDC25A, E2F1, EGFR, ERBB2, FOS, JUN, МАР2К1, ММР2, NFKB1, PDGFB, PIK3R1, PNN, RBI, SERPINB2, SERPINB5, SNCG, SPP1, TERT,
TIMP3 и ТР53. В некоторых вариантах осуществления один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из CASP8, CASP9, C0L18A1, ETS2, HTATIP2, ММР9, SRC и TWIST1. В некоторых вариантах осуществления один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АКТ1, APAFl, ATM, CDC25A, CDKN1A, ETS2, FOS, IL8, ITGA4, ITGA6, ITGAV, JUN, MAP2K1, NFKBIA, PLAU, PLAUR, RAF1, SERPINB2, SYK, TIMP1, TNF, TNFRSF1OB и TNFRSF1A. В некоторых вариантах осуществления маркеры включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АСР2, АК2, АКТЗ, ARL5B, АТР2ВЗ, BGN, BRAF, BTG2, САМКК2, CAPG, CAPN12, CPLX2, DENND5A, DNA2, FAM104A, FNIP1, GFRA4, GLUD1, GNAQ, GP1BB, HNRPLL, Н0ХА2, HPS3, INPP4A, ITGAV, KLHL23, LANCL2, LYPD6, МАРКАРКЗ, MEF2A (включает, EG:4205), MEF2C, NVL, PCYT1A, PGLYRP4, PL0D1, РРР1СВ, PRKAB2, PROS1, PTPRE, RASA4 (включает,EG:10156), RBMS2, RBPJ, STAT5B, THBS1, TRIB1, TRIM2, TSPAN6 и ZDHHC21. В некоторых вариантах осуществления маркеры включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из B4GALT5, ВОР1, CCL2, CCL3, CCL3L1, CCRL2, CD83, CLEC4G, CLIC4, CTSC, CTSO, CXCL10, FCGR3A, FPR3, НВА1, НВВ, LRMP, MAP1LC3B2, MS4A4A, MSR1, MYADML, NIDI, PF4, PION, RNF217, SAMD9L, SERPING1 и SPARC. В некоторых вариантах осуществления маркеры включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АСОТ9, AMPD2, ARHGAP15, BATF2, C3AR1, C5orf41, CCL3, CCL3L1, CD63, CHST11, CHSY1, CLEC4G, CTSZ, CXorf21, CYTH4, CYTIP, DLEU2, DNAJA1, DOCK8, DTX3L, DUSP6, EPSTI1, ERF, F2RL1, FYB, GABRB2, GBP5, GLRX, GNB4, ICAM1, IFI35, IFIH1, IFNAR2, IL1R1, IRF1, ITGA5, LAP 3, LAPTM5, LCP2, MAP1LC3B, MAP1LC3B2, MICAL2, MT1DP, MT1JP, MT1M, MT2A, MYADML, NEK6, NINJ2, NNMT, NT5C3L, NUB1, PDE4B, PLOD1, PML, PRKCB, PSMB9, RCN3, RGS4, RNASE6, RTP4, SAMD9L, SEL1L, SERPING1, SETX, SIGLEC10, SKIL, SLC7A7, SNORA21, SP100, SP110, SP140, SSFA2, STAT2, STK17B, STK3, TDRD7, TMCC1, TMPRSS11E2, TNFRSF1B, TPM1, TRIM21,TXNDC4, UBE2L6, UBE2W, USP18, VAV1, WARS, WIPF1 и WIPI1. В некоторых вариантах осуществления маркеры включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из ADAR, ADM,
ALAS 1, ANKRD22, ARHGAP2 7, B3GNT5, BCL10, C12orf35, C15orf29, C2orf59, CD177, СEACAMI, CPEB2, DDX58, F2RL1, GDPD3, GNAI3, HIST2H3A, HIST2H3D, HIST2H4A, HMGCR, HSPA6, HSPC159, IL4R, IMPA2, KPNB1, KREMEN1, KRT23, LDLR, LOCI 00130904, LTB4R, MAEA, MARK2, MBOAT2, MPZL3, N4BP1, NBEAL2, NMI, NPEPPS, PARP14, PGM2, PPIF, PXN, RALBP1, ROD1, RPS6KA1, SI OOP, SERTAD2, SLC9A1, SLPI, SP110, SPINT1, ST14, TBC1D3, TNFRSF9, TRIM21, UPP1, VPS24, ZBTB34 и ZNF256.
[0177] В некоторых вариантах осуществления маркер, который используется в способах по изобретению для предродовых или связанных с беременностью заболеваний или патологических состояний, включает маркеры, раскрытые, например, в патентах Соединенных Штатов Америки 7655399, 7651838, 6660477, 6172198, 5594637, 5514598, 6258540, 6664056, 7235359 и 7645576, публикациях патентных заявок Соединенных Штатов Америки
20060019278, 20020192642, 20060252071, 20090061425, 20060019278, 20070141625, 20090162842, 20100120076, и
публикациях патентных заявок WO/2006/026020, WO/2002/068685, WO/2005/111626, WO/2009/055487, WO/2009/001392, и WO/2008/014516.
[0178] В некоторых вариантах осуществления маркер, который
используется в способах по изобретению для неврологических или
невропсихиатрических заболеваний или патологических состояний,
включает маркеры, раскрытые, например, в патентах Соединенных
Штатов Америки 7723117, 6867236, публикациях патентных заявок
Соединенных Штатов Америки 20060115854, 20060115855,
20060166283, 20060234301, 20060259990, 20060259991,
20070162983, 20070264197, 20080026405, 20080038730,
20080051334, 20080152589, 20080220013, 20080261226,
20080269103, 20080286263, 20090041862, 20090239241,
20090275046,
20090318354,
20090324611,
20100009352,
20100021929,
20100028356,
20100055722,
20100062463,
20100075891,
20100105623,
20100124756,
20100159486,
20100167937,
20100169988,
20100167320,
20100112587,
20100098705,
20100068705,
20100009356,
20090305265,
20100124746,
20100092983,
20070148661,
20070141625,
20100120050,
20090155230,
20090274709,
международных
публикациях патентных заявок
WO/2004/040016,
WO/2004/071269,
WO/2005/033341,
WO/2005/052592,
WO/2005/103712,
WO/2005/114222,
WO/2006/020269,
WO/2006/048778,
WO/2006/050475,
WO/2006/061609,
WO/2006/105907,
WO/2006/133423,
WO/2006/134390,
WO/2007/098585,
WO/2007/119179,
WO/2008/010660,
WO/2008/014314,
WO/2008/028257,
WO/2008/046509,
WO/2008/046510,
WO/2008/046511,
WO/2008/046512,
WO/2008/063369,
WO/2008/085035,
WO/2008/095261,
WO/2008/100596,
WO/2008/120684,
WO/2008/125651,
WO/2008/127317,
WO/2008/132464,
WO/2009/000520,
WO/2009/001392,
WO/2009/068591,
WO/2009/074331,
WO/2009/100131,
WO/2010/005750,
WO/2010/011506,
WO/2010/019553,
WO/2010/059242,
WO/2010/061283,
WO/2010/063009,
WO/2010/066000,
WO/2009/121152,
WO/2009/121951,
WO/2009/097450,
WO/2009/092382,
WO/2009/075579,
WO/2009/058168,
WO/2009/053523,
WO/2009/034470,
WO/2009/032722,
WO/2009/014639,
WO/2009/003142,
WO/2010/041046,
WO/2007/131345,
WO/2008/003826
и WO/2009/07556.
[0179] В некоторых вариантах осуществления маркер, который
используется в способах по изобретению для сердечно-сосудистых
заболеваний или патологических состояний, включает маркеры,
раскрытые, например, в патентах Соединенных Штатов Америки
7670769, 7445886, 7432107, 7157235 и 7009038, публикациях
патентных заявок Соединенных Штатов Америки 20100167 32 0,
20100112587, 20100098705, 20100068705, 20100009356,
20090305265, 20100124746, 20100092983, 20070148661,
20070141625, 20100120050, 20090155230, и 20090274709, и международных публикациях патентных заявок WO/2009/121152, WO/2009/121951, WO/2009/097450, WO/2009/092382, WO/2009/075579, WO/2009/058168, WO/2009/053523, WO/2009/034470, WO/2 0 0 9/032 722, WO/2009/014639, WO/2009/003142, WO/2010/041046, WO/2007/131345, WO/2008/003826, и WO/2009/075566.
WO/2008/089936, WO/2008/084331, WO/2005/012907, WO/2004/024098,
[0180] В некоторых вариантах осуществления маркер, который используется в способах по изобретению для связанных с почками заболеваний или патологических состояний, включает маркеры, раскрытые, например, в патентах Соединенных Штатов Америки 7488584, 7459280, 7294465 и 7662578, публикациях патентных заявок Соединенных Штатов Америки 20100143951, 20100124746, 20100120056, 20100120041, 20100081142, 20090155230 и 20090239242, международных публикациях патентных заявок WO/2010/059996, WO/2010/054389, WO/2010/048347, WO/2010/048497, WO/2010/054167, WO/2010/048346, WO/2 010/04 6137, WO/2 010/02 54 34, WO/2010/018185, WO/2010/012306, WO/2009/122387, WO/2009/083950, WO/2009/080780, WO/2009/060035, WO/2009/059259, WO/2008/154238,
WO/2008/042012, WO/2007/131345, WO/2003/019193, WO/2007/112999, WO/2007/082733, WO/2006/073941, WO/2010/068686, WO/2010/022210, и WO/2009/127644.
20070141625, 20100105086, 20020119118, 20090318392, 20080039402, 20060210562, 20090130683, 20080274118,
20100075891, 20090176217, 20100137393, 20090023166, 20070224638, 20050164233, 20090054321,
20090263474, 20100131286, 20090258025, 20090196927, 20080026378, 20050266432, 20090110667, и международных WO/2010/053587,
[0181] В некоторых вариантах осуществления маркер, который используется в способах по изобретению для аутоиммунного или иммунопатологического заболевания или патологического состояния, включает маркеры, раскрытые, например, в 7604948, 7670764, 6986995 и 6631330, публикациях патентных заявок Соединенных Штатов Америки
20090202469, 20100120629, 20080227709, 20070218519, 20050130245, 20090023166,
публикациях патентных заявок WO/2009/043848,
20100104579,
WO/2010/046503, WO/2010/039714, WO/2 0 0 9/10 0342, WO/2 0 0 9/053537,
WO/2009/017444, WO/2008/156867, WO/2008/147938, WO/2008/129296,
WO/2008/137835, WO/2008/082519, WO/2008/064336, WO/2008/043782,
WO/2008/043725, WO/2 0 07/04 7 907, WO/2006/125117, WO/2006/114661,
WO/2006/020899, WO/2 0 05/114222, WO/2005/007836, WO/2004/076639,
WO/2004/050704 и WO/2001/014881.
[0182] Представленное изобретение также предоставляет наборы, которые включают выявляющие маркеры агенты, которые выявляют по меньшей мере один или более маркеров, идентифицированных с помощью способов по данному изобретению. Данное представленное изобретение также предоставляет способы лечения или профилактики заболевания или патологического состояния пациента, включающие введение указанному пациенту агента, который модулирует активность или экспрессирование по меньшей мере одного или более маркеров, идентифицированных с помощью способов по данному изобретению.
[0183] Должно быть понятно, что варианты осуществления представленного изобретения, которые были описаны, являются просто иллюстрацией некоторых из вариантов применения принципов представленного изобретения. Квалифицированные специалисты в данной области могут сделать множество модификаций на основе идей, представленных в данной заявке, без выхода за пределы истинной сущности и объема правовых притязаний изобретения.
[0184] Следующие примеры изложены в качестве типичной иллюстрации представленного изобретения. Данные примеры не следует истолковывать в качестве ограничения объема правовых притязаний изобретения, так как данные и другие эквивалентные варианты осуществления будут очевидны, принимая во внимание представленное раскрытие, фигуры и сопровождающую формулу изобретения.
ПРИМЕР 1
Типичный Способ I отделения фагоцитарных клеток с содержанием ДНК, равным 2п, от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии
[0185] 1. Разделить образец крови на плазму и лейкоцитарную пленку, содержащую образец БКК. Покрыть пластины авидином для приема образца БКК.
[0186] 2. Добавить биотинилированное антитело к нефагоцитарной кровяной клетке (например, Т-клеткам) в лунки, инкубировать в течение 3 0 мин при RT, промыть лунки.
[0187] 3. Добавить магнитные микроносители.
[0188] 4. Добавить образец крови с БКК.
[0189] 5. Инкубировать при 37°С (30 минут-1 час).
[0190] б. Вслед за фагоцитозом микроносителей
фагоцитарными клетками и связыванием авидин-биотинового
антитела с нефагоцитарными клетками, поместить пластину сверху
магнита и промыть (фагоцитарные клетки, которые
интернализировали магнитные микроносители, и нефагоцитарные клетки, связанные с антителом, останутся; все другие клетки вымоются).
[0191] 7. Удалить магнит и собрать фагоцитарные клетки и разделить на фагоцитарные клетки с ДНК, равной 2п, и ДНК больше чем 2п. Нефагоциты и фагоциты, имеющие ДНК, равную 2п, называются клетками, имеющими ДНК, равную 2п.
[0192] 8. Выделить РНК из плазмы, выделить РНК из
фагоцитарных клеток с ДНК, равной 2п, и из нефагоцитарных
клеток, получить кДНК, кРНК и использовать для дифференцировки
генетического профиля (профилей) (например, цельных
генетических матриц и/или раковых генетических матриц) плазмы против генетического профиля (профилей) фагоцитарных и/или нефагоцитарных клеток.
0193] 9. Выделить ДНК из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и идентифицировать сигнатуры ДНК опухоли, избирательно находящейся в плазме (т.е. отсутствует в клетках, имеющих ДНК, равную 2п, таких как нефагоциты); сравнить профили (например, цельных генетических матриц, ДНК мутаций и/или SNP, полученных в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках).
[0194] 10. Выделить белок из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, провести Вестерн-блоттинги, используя антитела к известным белкам, сверхэкспрессируемым человеческими опухолями (например, PSA и PSMA в раке предстательной железы; СЕА в раке толстой кишки; и СА125 в раке яичников), и сравнить профили, полученные в плазме и клетках, имеющийх ДНК, равную 2п. В качестве альтернативы, для идентификации белков использовать масс-спектроскопию.
[0195] 11. Выделить липиды из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и сравнить количество и качество, используя например, HPLC.
[0196] 1. Разделить образец крови на плазму и лейкоцитарную пленку, содержащую образец БКК.
[0197] 2. Цитоспинировать БКК на предметных стеклах.
[0198] 3. Фиксировать клетки в ацетоне/метаноле (-20°С в течение 5 минут).
[0199] 4. Окрасить гематоксилиновым и эозиновым красителем и анти-Т-клеточным антителом.
[0200] 5. Выделить Т-клетки (нефагоцитарные) и макрофаги (фагоцитарные), используя лазерную захватывающую микроскопию (LCM). Разделить на фагоцитарные клетки с ДНК, равной 2п, и ДНК больше чем 2п. Нефагоциты и фагоциты, имеющие ДНК, равную 2п, называются клетками, имеющими ДНК, равную 2п.
[02 01] б. Выделить РНК из плазмы, выделить РНК из
фагоцитарных клеток с ДНК, равной 2п, и нефагоцитарных клеток,
получить кДНК, кРНК и использовать для дифференцировки
генетического профиля (профилей) (например, цельных
генетических матриц и/или раковых генетических матриц) плазмы против генетического профиля (профилей) фагоцитарных и/или нефагоцитарных клеток.
[0202] 7. Выделить ДНК из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и идентифицировать сигнатуры ДНК опухоли, избирательно присутствующей в плазме (т.е. отсутствующей в клетках, имеющих ДНК, равную 2п, таких как нефагоциты); сравнить профили (например, цельных генетических матриц, ДНК мутаций и/или SNP, полученных в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках).
[0203] 8. Выделить белок из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, провести Вестерн-блоттинги, используя антитела к известным белкам, сверхэкспрессируемым человеческими опухолями (например, PSA и PSMA в раке предстательной железы; СЕА в раке толстой кишки; и СА125 в раке яичников), и сравнить профили, полученные в плазме и клетках, имеющих ДНК, равную 2п. В качестве альтернативы, использовать масс-спектроскопию для
ПРИМЕР 3
Типичный Способ III отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии [02 05] 1. Отделить плазму от цельной крови.
[0206] 2. Использовать магнитные конъюгированные с антителом микроносители для выделения нефагоцитарных (например, Т-клеток) и фагоцитарных клеток (например, нейтрофилов и/или макрофагов и/или моноцитов) из цельной крови. Разделить на фагоцитарные клетки с ДНК, равной 2п, и ДНК больше чем 2п. Нефагоциты и фагоциты, имеющие ДНК, равную 2п, называются клетками, имеющими ДНК, равную 2п.
[02 07] 3. Выделить РНК из плазмы, выделить РНК из
фагоцитарных клеток с ДНК, равной 2п, и нефагоцитарных клеток,
получить кДНК, кРНК и использовать для дифференцировки
генетического профиля (профилей) (например, цельных
генетических матриц и/или раковых генетических матриц) плазмы против генетического профиля (профилей) фагоцитарных и/или нефагоцитарных клеток.
[0208] 4. Выделить ДНК из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и идентифицировать сигнатуры ДНК опухоли, избирательно присутствующей в плазме (т.е. отсутствующей в клетках, имеющих ДНК, равную 2п, таких как нефагоциты); сравнить профили (например, цельных генетических матриц, ДНК мутаций и/или SNP, полученных в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках).
[02 09] 5. Выделить белок из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, провести Вестерн-блоттинги, используя антитела к известным белкам, сверхэкспрессируемым человеческими опухолями (например, PSA и PSMA в раке предстательной железы; СЕА в раке толстой кишки; и СА125 в раке яичников), и сравнить профили, полученные в плазме и клетках, имеющих ДНК, равную 2п. В качестве альтернативы, использовать масс-спектроскопию для
ПРИМЕР 4
Типичный Способ IV отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии
[0211] 1. Разделить образец крови на плазму и лейкоцитарную пленку, содержащую образец БКК. Окрасить БКК флуоресцентными антителами, специфическими к конкретной клеточной субпопуляции (например, нейтрофилам, макрофагам, моноцитам, Т-клеткам и тому подобное), и ДНК красителем, (например, Hoechst 33342, йодидом пропидия).
[0212] 2. Отсортировать клетки (например, с помощью FACS).
[0213] 3. Выделить РНК из плазмы, выделить РНК из
фагоцитарных клеток с ДНК, равной 2п, и нефагоцитарных клеток,
получить кДНК, кРНК и использовать для дифференцировки
генетического профиля (профилей) (например, цельных
генетических матриц и/или раковых генетических матриц) плазмы против генетического профиля (профилей) фагоцитарных и/или нефагоцитарных клеток.
[0214] 4. Выделить ДНК из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и идентифицировать сигнатуры ДНК опухоли, избирательно присутствующей в плазме (т.е. отсутствующей в клетках, имеющих ДНК, равную 2п, таких как нефагоциты); сравнить профили (например, цельных генетических матриц, ДНК мутаций и/или SNP, полученных в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках).
[0215] 5. Выделить белок из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, провести Вестерн-блоттинги, используя антитела к известным белкам, сверхэкспрессируемым человеческими опухолями (например, PSA и PSMA в раке предстательной железы; СЕА в раке толстой кишки; и СА125 в раке яичников), и сравнить профили, полученные в плазме и клетках, имеющих ДНК, равную 2п. В качестве альтернативы, использовать масс-спектроскопию для идентификации белков.
ПРИМЕР 5
[0217] Выявление сигнатуры опухолеспецифических генов в бесклеточных текучих средах организма, полученных у мышей-носителей опухоли
[0218] Согласно вариантам осуществления представленного
изобретения, предоставлены способы дифференцировки между
сигнатурами "нормального неспецифического фона" и
"опухолеспецифическими" и/или "специфическими для заболевания" и/или "специфическими для патологического состояния" в бесклеточных текучих средах организма. Профили экспрессии генов бесклеточных текучих сред организма мышей-носителей опухоли сравнивают с профилями экспрессии генов нефагоцитарных Т-клеток тех же мышей-доноров для идентификации опухолеспецифических сигнатур в бесклеточных текучих средах организма, которые либо не экспрессируются, либо существенно дифференциально экспрессируются в нефагоцитарных клетках тех же мышей, носителей опухоли, и у животных, не являющихся носителями опухоли.
[0219] Клетки рака простаты LNCaP человека
[022 0] Голым бестимусным мышам (п=5) инжектировали подкожно (s.c.) клетки рака простаты LNCaP человека. Спустя двадцать семь дней (размер опухоли ~0,4 см) у мышей спускали кровь с помощью пункции сердца (~1 мл/мышь) в EDTA-содержащие трубки, которые затем центрифугировали. Выделяли плазму. Выделяли и промывали лейкоцитарную пленку, и отделяли нейтрофилы, макрофаги и Т-клетки, используя, соответственно, антимышиные нейтрофил-, макрофаг- и Т-клетка-иммуномагнитные микроносители DynaBeads. Из Т-клеток выделяли РНК (Triazol(r)). Определяли качество РНК. Получали кДНК и биотинилированную кРНК (кРНК-В). Из плазмы получали биотинилированную кРНК (кРНК-В). Образец кРНК-В из плазмы и из Т-клеток раздельно инкубировали с микрочипами генов рака человека (Oligo GEArray(r) Human Cancer PathwayFinder Microarray - OHS-033-SuperArray Bioscience).
генетические сигнатуры между сигнатурами, полученными из Т-клеток и плазмы. Генетическую сигнатуру из Т-клеток вычитали из генетической сигнатуры из плазмы для предоставления одного или более маркеров, специфических для сигнатуры пациента, ассоциированных с раком предстательной железы.
[0221] Опухоли аденокарциномы LS174T толстой кишки человека
[0222] Клетки карциномы LLC1, клетки меланомы B16F10 мышей [0223] Аналогичные эксперименты проводили с плазмой и клетками, выделенными у голых бестимусных мышей (п=5), которым инжектировали подкожно клетки опухоли аденокарциномы LS17 4T толстой кишки человека (размер опухоли ~0,3 см), у мышей С57В1 (п=5), которым инжектировали подкожно клетки карциномы LLC1 легкого Льюис мышей (размер опухоли ~0, б см) , и у мышей С57В1 (п=5), которым инжектировали внутривенно 106 клеток меланомы B16F10 (когда опухолевые клетки имеют мышиное происхождение, образцы кРНК-В из плазмы и из Т-клеток гибридизировали Oligo GEArray(r) Mouse Cancer PathwayFinder Microarray - OMM-033-SuperArray Bioscience). РНК также выделяли из выращиваемых экспоненциально клеток LS174T, LLC1, B16F10 и LNCaP в культуре и из плазмы, а Т-клетки выделяли у бестимусных мышей, не являющихся носителями опухоли С57В1, и определяли профили их связанных с раком генов.
[0224] Согласно аспектам представленного изобретения, плазма, полученная у мышей, которым инжектировали клетки опухоли простаты или толстой кишки человека, и у мышей-носителей рака или меланомы мышей легкого, будет иметь различные сигнатуры связанных с раком генов, которые также могут быть обнаружены в их соответствующих опухолевых клетках. Согласно дополнительным аспектам, связанные с раком гены не экспрессируются или минимально экспрессируются (i) нефагоцитарными Т-клетками, выделенными у мышей-носителей опухоли; и (ii) фагоцитарными нейтрофилами и макрофагами,
Выявление сигнатур опухолеспецифических генов в бесклеточной текучей среде организма, полученной у онкологических больных
[0225] Согласно некоторым вариантам осуществления представленного изобретения, профили экспрессии генов бесклеточных текучих сред организма у онкологических больных сравнивали с профилями экспрессии генов нефагоцитарных Т-клеток у одних и тех же индивидов-доноров для идентификации опухолеспецифических сигнатур в бесклеточных текучих средах организма, который либо не экспрессировались, либо существенно дифференциально экспрессировались в нефагоцитарных клетках.
[022 6] Пациенты с опухолями головы и шеи
[0227] Десять миллилитров венозной крови получали (в EDTA-содержащую пробирку) у пациентов, у которых было известно наличие плоскоклеточной карциномы шеи. Вслед за центрифугированием при 2 000 об/мин в течение 5 минут при комнатной температуре, плазму удерживали, а лейкоцитарную пленку перемещали в пробирку и промывали PBS.
[022 8] Клетки отделяли, используя крысиные античеловеческие иммуномагнитные микроносители DynaBeads(r) от INVITROGEN(tm), Carlsbad, СА для Т-клеток, нейтрофилов и макрофагов/моноцитов. По существу, микроносители непрерывно добавляли в образец БКК и вслед за инкубированием в течение 30 минут при 4°С по отдельности, связанные с Т-клетками, нейтрофилами и макрофагами/моноцитами микроносители выделяли, используя магнит и промывали PBS три раза.
[0229] Затем РНК выделяли из Т-клеток (используя TRIZOL(r), INVITROGEN(tm), Carlsbad, СА) . Определяли качество и качество РНК и получали кДНК и биотинилированную кРНК (кРНК-В). Биотинилированную кРНК (кРНК-В) получали из плазмы. Каждый из образцов кРНК-В из плазмы и Т-клетки инкубировали (60°С в течение ночи) с микрочипами генов рака человека (Oligo GEArray(r) Human Cancer PathwayFinder Microarray-OMM-033-SuperArray Bioscience, Frederick, MD) . Вслед за гибридизацией мембраны
промывали и окрашивали с авидин-щелочной фосфатазой, и выявляли гены, используя хемилюминесценцию (рентгеновскую пленку). Генетические сигнатуры сравнивали между генетическими сигнатурами, полученными из Т-клеток и плазмы. Генетическую сигнатуру из Т-клеток вычитали из генетической сигнатуры из плазмы для предоставления одного или более маркеров специфической для пациента сигнатуры, ассоциированных с раком головы и шеи.
[0230] Согласно аспектам представленного изобретения, плазма, полученная у пациентов с раком головы и шеи, будет иметь различные сигнатуры связанных с раком генов, которые также обнаруживают в их соответствующих опухолевых клетках. Могут быть идентифицированы следующие гены: гомолог вирусного онкогена Е26 (ETS2), ВИЧ-1 Tat интерактивного белка (НТАТ1Р2), IL8 (нейтрофильной активации и хемотаксиса), Jun онкоген (JUN) и матричной металлопротеиназы 9 (ММР9).
[0231] Согласно дополнительному аспекту, данные связанные с раком гены не экспрессируются или минимально экспрессируются нефагоцитарными Т-клетками.
[02 32] Пациенты с раком яичников
[0233] Аналогичные эксперименты проводили с плазмой и клетками, выделенными у пациента с раком яичников. Плазма может содержать множество связанных с раком генов, которые не экспрессируются или минимально экспрессируются нефагоцитарными Т-клетками. Подобные раковые гены могут содержать один или более из АКТ1, APAFl, ATM, CDC25A, CDKN1A, ETS2, FOS, IL8, ITGA4, ITGA6, ITGAV, JUN, MAP2K1, NFKBIA, PLAU, PLAUR, RAF1, SERPINB2, SYK, TIMP1, TNF, TNFRSF10B или TNFRSF1A.
ПРИМЕР 9
Выявление сигнатур опухолеспецифических белков в бесклеточных текучих средах организма, полученных у мышей-носителей опухоли предстательной железы человека LNCaP [0234] Опухоли LS174T толстой кишки человека [0235] Набор для очистки белка (Norgen, Incorporated, Product #23500) использовали для выделения и очистки белков из БКК, Т-клетки и макрофагов мышей. Анализ очень простой и
[023 6] Образцы белка выделяют из плазмы и нефагоцитарных клеток (Т-лимфоцитов), полученных у мышей-носителей опухолей LS174T и LNCaP, поскольку первая клеточная линия экспрессирует PSA (Denmeade et al. (2001) Prostate 48:1; Lin et al. (2001) J Urol. 166:1943), а последняя демонстрирует опухолеспецифический гликопротеин (TAG-72), муцин с высокой молекулярной массой
(Colcher et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3199); Colcher et al. (1984) Cancer Res. 44:5744; Kassis et al. (1996) J. Nucl. Med. 37:343) . Анализ с помощью Вестерн-блоттинга проводили с 16 мкг образцов очищенных белков из каждого из плазмы и Т-клеток. По сути, каждый образец смешивали с двумя объемами загрузочного буфера SDS и пропускали на 10% SDS-PAGE наряду с неокрашенными прецизионными плюс белковыми стандартами
(Biorad) в трис-глициновом буфере SDS (рН 8,4) при 200 вольтах. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (в течение ночи при 4°С), используя аппарат Mini Trans-Blot (Biorad) и гибридизационный буфер, содержащий трис 25 мМ, рН 8,4, глицин 192 мМ и 20% метанол. Мембрану блокировали 5% обезжиренным сухим молоком (60 мин при комнатной температуре (RT)) и инкубировали (1 час, RT) либо с В72.3, мышиным моноклональным антителом против TAG-72 человека, либо с ER-PR8, мышиным моноклональным антителом против PSA человека. Блоты промывали, а затем инкубировали с Immun-Star Goat Anti Mouse-HRP конъюгатом (Biorad), вторичным антителом, специфическим для мышиного IgG, и проявляли с помощью инкубирования (5 мин, RT) со смесью 1:1 люминолового раствора и пероксидным буфером
(Biorad), с последующей ауторадиографией.
[0237] Согласно одному аспекту представленного
изобретения, плазма у мышей, носителей опухоли LNCaP, может
быть положительной для PSA, тогда как данный белок не
выявляется в нефагоцитарных Т-клетках у тех же животных.
Аналогичным образом, TAG-72 экспрессируется
моноцитами/макрофагами, полученными у мышей, носителей опухоли
Эксперименты по анализу профиля
[0238] Выделение фагоцитарных клеток крови
[0239] У пациента получают образец крови. Кровь (-5 мл)
необходимо перенести в 50-мл пробирку, содержащую 50 мкл 0,5 М
EDTA (итоговая концентрация EDTA ~4,8 мМ). Пробирку необходимо
мягко встряхивать и необходимо добавить 25 мл буфера для
лизирования красных кровяных телец (Norgen, Incorporated).
Пробирку снова необходимо мягко встряхивать, инкубировать при
комнатной температуре до тех пор, пока цвет раствора не
изменится до ярко-красного (3-5 мин), и центрифугировать при
2000 об/мин в течение 3 мин. Вслед за осторожной аспирацией
супернатанта, БКК необходимо промыть 4 0 мл не содержащего Са/Мд
0,1 М PBS (содержащего 2% FBS, 2 мМ EDTA и 20 мМ глюкозы), а
затем клетки (106/мл) необходимо инкубировать (30 мин, 4°С, в
темноте) с окрашивающим клетки раствором, содержащим (i) ДНК,
краситель Hoechst 33342 для проницаемых жизнеспособных клеток
(4 мкг/мл; Ет=483 нм) , (ii) моноклональное антитело к
античеловеческим моноцитам/макрофагам (Alexa Fluor(r) 647-
конъюгат; Em=668 нм) , которое распознает человеческий F4/80
антиген, экспрессируемый циркулирующими в крови
моноцитами/макрофагами, и (iii) античеловеческое нейтрофильное моноклональное антитело (RPE-конъюгат; Ет=57 8 нм), которое распознает человеческие циркулирующие в крови нейтрофилы. Затем клетки необходимо промыть и рассортировать (BD FACSAria) на нейтрофилы (Nn=2) , нейтрофилы (Nn> 2) , моноциты/макрофаги (М/Мп=2) , и моноциты/макрофаги (М/Мп> 2). Согласно аспектам представленного изобретения, содержание клеток, имеющих содержание ДНК, равное 2п, сравнивают с содержанием плазмы, полученной у того же индивида.
[0240] Анализ генетического профиля
[0241] Необходимо выполнить анализ генетического профиля полного генома человека. Для образцов РНК, полученных из человеческих опухолевых клеток или нейтрофилов (Nn=2, Nn> 2) и моноцитов/макрофагов (М/Мп=2, М/Мп> 2) , необходимо использовать
GeneChip(r) Human Genome Ul 33 Plus 2,0 Array от Affymetrix, Incorporated. Данная матрица анализирует уровень экспрессии свыше 47000 транскриптов и вариантов, включая 38500 хорошо изученных генов человека. В целом, для определения профилей экспрессии генов человека необходимо использовать экстрагированную РНК при использовании упомянутой выше матрицы. Для обеспечения воспроизводства матрицы профиль каждого образца необходимо получить в трех повторениях, а эксперимент повторить один раз. Данные микроматричного анализа необходимо отфильтровать по генам, связанным с индуцированием рака, как описано ниже, и подтвердить, используя количественную в реальном времени, полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (RT-PCR).
[0242] Повышающее регулирование/понижающее регулирование генов, связанных с индуцированием рака
[0243] РНК необходимо выделять, используя триазол (Invitrogen, Incorporated), и очищать, используя картриджи, предоставленные в наборе. Качество и количество РНК необходимо оценивать с помощью Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Incorporated, Palo Alto, СА) и программного обеспечения Degradometer версия 1.41 (Worldwide Web: dnaarrays.org). Данные экспериментальные результаты помогут при дифференциации молекулярных путей, нарушаемых в результате наличия опухолей.
[0244] Анализ экспериментов с применением биочипов
[0245] Анализ полученных данных
крупномасштабной/высокопроизводительной молекулярной экспрессии будет в большой степени зависеть от способности (i) идентифицировать гены, дифференциально экспрессируемые в фагоцитарных клетках с содержанием ДНК > 2, (ii) аннотировать идентифицированные гены и (iii) приписывать аннотированные гены к генам, специфически экспрессируемым конкретными опухолями. Статистический анализ данных микроматричного анализа может быть выполнен, например, с использованием dChip модуля, который легко приспосабливает данный тип конструирования списка генов к своему меню "Анализ/Сравнение Образцов". При использовании Affymetrix GeneChips, один или более GeneChips и
соответствующие способы необходимо применять для выяснения качества исходных данных микроматричного анализа (Gautier et al. (2004) Bioinformatics 20:307). Кроме того, необходимо использовать различные методики фоновой корректировки и нормализации для получения оптимального протокола для нормализации и аннотирования наборов зондов (для получения значений экспрессии) (Huber et al. (2002) Bioinformatics 18(Suppl. 1) :S96; Wu et al. (2004) Journal of the American Statistical Association 99:909; Seo and Hoffman (2006) BioMed Central Bioinformatics 7:395) . При подходе двухстадийного фильтрования, необходимо сравнивать генетические профили Рп=2 с генетическими профилями Рп> 2 и конструировать список экспрессируемых генов, а затем сравнивать данные гены с опухолеспецифическими генами, идентифицированными для каждой опухолевой клеточной линии - после фильтрования Рп=2 генетического профиля, как показано на фиг.5. Например, (i) кровь будет получена у пациентов с раком молочной железы; (ii) необходимо выделить нейтрофилы (п> 2 и п=2) и в трех повторениях определить их генетические профили; (iii) для каждой группы
(Nn> 2 и Nn=2) необходимо рассчитать среднее (из 3 образцов) каждого идентифицированного гена и ее соответствующую стандартную ошибку (SE); (iv) затем необходимо сравнить профили экспрессии генов из двух групп, и идентифицировать список (L-I) экспрессированных генов, на основании абсолютного > 2-кратного зарегистрированного изменения (Nn> 2 и Nn=2) согласно модифицированному Велшем двухвыборочному критерию Стьюдента;
(v) необходимо сравнить профили экспрессии генов Nn=2 и профили
экспрессии генов рака молочной железы (полученные из биопсии
опухоли и нормальной ткани молочной железы) и идентифицировать
список (L-2) экспрессированных генов; и (vi) посредством
сравнения генов в L-1 и L-2 ("анализ/Сравниваемые
Образцы/комбинированные Сравнения", dChip) необходимо
идентифицировать сигнатуры генов, специфических для рака молочной железы, которые были получены/экспрессированы Nn> 2, и отфильтровать общие гены.
[0246] Анализ белкового профиля
[0247] От пятидесяти до ста микрограмм общего белка из каждого из плазмы и Т-клеток необходимо денатурировать и редуцировать трис-(2-карбоксиэтил)фосфинтрипсином (1 мМ) и 0,02% натрийдодецилсульфатом при 60°С в течение 1 часа. Затем цистеины блокируют, а общий белок расщепляют трипсином при 37°С в течение 12-16 часов. Полученные в результате пептиды необходимо метить iTRAQ (с метками 113-119 и 121) в течение 1 часа (4-плекс или 8-плекс в зависимости от количества клеточных типов, подлежащих сравнению). Вслед за мечением, раздельно меченые образцы объединяют и инжектируют в систему Agilent 1200 Series HPLC, оборудованную колонной сильного катионного обмена (Applied Biosystems 4,6x100 Porous). Затем 96 собранных фракций объединяют в 14 фракций, и каждую фракцию инжектируют в систему LC Packings Ultimate HPLC для второго раунда фракционирования в условиях обращенной фазы (15 см> <7 мкм аналитическая колонка LC Packings). Фракции обращенной фазы наносят пятнами непосредственно на пластину-мишень, используя LC Packings Probot, и анализируют с помощью масс-спектрометрии (Applied Biosystems 4800 Plus Proteomics Analyzer). Вслед за получением данных, спектр обрабатывают, используя пакет программного обеспечения ProteinPilot (Applied Biosystems MDS Sciex), и идентифицируют индивидуальные белки в каждом из клеточных типов с их относительными уровнями экспрессии, используя программное обеспечение ProteinPilot(tm).
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ диагностирования или помощи при диагностировании заболевания или патологического состояния или оценки риска развития заболевания или патологического состояния или прогнозирования или содействия в прогнозировании заболевания или патологического состояния у пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма;
b) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток, имеющих содержание ДНК, равное 2п (фагоцитарные клетки =2п) , или популяции нефагоцитарных клеток; и
c) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем наличия указанного заболевания или патологического состояния или риска развития указанного заболевания или патологического состояния или прогнозом указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
2. Способ оценки эффективности лечения заболевания или патологического состояния или мониторинга прогрессирования или регрессии заболевания или патологического состояния или идентификации соединения, способного улучшать течение или лечить заболевание или патологическое состояние, у пациента, включающий:
а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента в первой временной точке;
определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п или популяции нефагоцитарных клеток пациента в первой временной точке;
идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных
b) определение третьего профиля одного или, или во второй временной точке или после введения соединения, соответственно более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента во второй временной точке;
определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п или популяции нефагоцитарных клеток пациента во второй временной точке;
идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и
c) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие является показателем эффективности лечения указанного заболевания или патологического состояния или прогрессирования или регрессии указанного заболевания или патологического состояния или показывает, что соединение способно улучшать течение или лечить указанное заболевание или патологическое состояние, у пациента.
3. Способ диагностирования или помощи при диагностировании
заболевания или патологического состояния пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма;
b) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток; и
c) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем наличия указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
4. Способ оценки риска развития заболевания или
патологического состояния пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров
заболевания или патологического состояния из образца
бесклеточной текучей среды организма;
b) определение второго профиля по меньшей мере одного из
одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток; и с) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем риска развития указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
5. Способ прогнозирования или помощи при прогнозировании заболевания или патологического состояния пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма;
b) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток; и
c) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом идентифицированное различие является показателем прогноза указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
6. Способ оценки эффективности лечения заболевания или патологического состояния пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента перед лечением;
определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента перед лечением;
идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров;
b) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента после лечения;
определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента после лечения;
идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных
с) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие является показателем эффективности лечения указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
7. Способ мониторинга прогрессирования или регрессии заболевания или патологического состояния пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента в первой временной точке;
определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента в первой временной точке;
идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров;
b) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента во второй временной точке;
определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента во второй временной точке;
идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и
c) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие является показателем прогрессирования или регрессии указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
8. Способ идентификации соединения, способного улучшать течение или лечить заболевание или патологическое состояние у пациента, включающий:
а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента перед введением
идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров;
b) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента после введения соединения;
определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента после введения соединения;
идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и
c) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие показывает, что соединение способно улучшать течение или лечить указанное заболевание или патологическое состояние у пациента.
9. Способ диагностирования или помощи при диагностировании
заболевания или патологического состояния пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма;
b) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток, имеющих содержание ДНК, равное 2п (фагоцитарные клетки =2п); и
c) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем наличия указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
10. Способ оценки риска развития заболевания или
патологического состояния пациента, включающий:
а) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца
b) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п; и
c) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем риска развития указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
11. Способ прогнозирования или помощи при прогнозировании заболевания или патологического состояния пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма;
b) определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п; и
c) идентификацию различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров, при этом различие является показателем прогноза указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
12. Способ оценки эффективности лечения заболевания или патологического состояния пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента перед лечением;
определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п пациента перед лечением;
идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров;
b) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента после лечения;
определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п
с) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие является показателем эффективности лечения указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
13. Способ мониторинга прогрессирования или регрессии заболевания или патологического состояния пациента, включающий:
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента в первой временной точке;
определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п пациента в первой временной точке;
идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров;
b) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента во второй временной точке;
определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п пациента во второй временной точке;
идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и
c) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие является показателем прогрессирования или регрессии указанного заболевания или патологического состояния у пациента.
14. Способ идентификации соединения, способного улучшать течение или лечить заболевание или патологическое состояние у пациента, включающий:
14.
a) определение первого профиля одного или более маркеров заболевания или патологического состояния из образца бесклеточной текучей среды организма пациента перед введением соединения пациенту;
определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п пациента перед введением соединения пациенту;
идентификацию первого различия между первым и вторым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров;
b) определение третьего профиля одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма пациента после введения соединения;
определение четвертого профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции фагоцитарных клеток =2п пациента после введения соединения;
идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров;
c) идентификацию различия между первым различием и вторым различием, при этом идентифицированное различие показывает, что соединение способно улучшать течение или лечить указанное заболевание или патологическое состояние у пациента.
15. Способ по любому из пп. 3-8, в котором по меньшей мере один из одного или более маркеров повышающе регулируется или активируется в образце бесклеточной текучей среды организма по сравнению с нефагоцитарными клетками.
16. Способ по любому из пп. 3-8, в котором по меньшей мере один из одного или более маркеров понижающе регулируется или ингибируется в образце бесклеточной текучей среды организма по сравнению с нефагоцитарными клетками.
17. Способ по любому из пп. 9-14, в котором по меньшей мере один из одного или более маркеров повышающе регулируется или активируется в образце бесклеточной текучей среды организма по сравнению с фагоцитарными клетками =2п.
18. Способ по любому из пп. 9-14, в котором по меньшей
19. Способ по любому из пп. 3-14, в котором первый профиль или второй профиль включает отсутствие по меньшей мере одного из одного или более маркеров указанного заболевания или патологического состояния.
20. Способ по любому из пп. 6-8 и 12-14, в котором третий профиль или четвертый профиль включает отсутствие по меньшей мере одного из одного или более маркеров указанного заболевания или патологического состояния.
21. Способ по любому из пп. 3-14, дополнительно включающий выделение одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма.
22. Способ по любому из пп. 3-8, дополнительно включающий лизирование нефагоцитарных клеток перед а).
23. Способ по любому из пп. 3-8 и 21, дополнительно включающий выделение клеточного содержимого из нефагоцитарных клеток перед а).
24. Способ по любому из пп. 3-14, в котором образец бесклеточной текучей среды организма включают жизнеспособные пораженные клетки, мертвые пораженные клетки, апоптотические пораженные клетки, циркулирующие в крови опухолевые клетки, инфекционные агенты, фетальные клетки, трофобласты или их фрагменты.
25. Способ по любому из пп. 3-14, в котором по меньшей мере один из одного или более маркеров указанного заболевания или патологического состояния имеется в образце бесклеточной текучей среды организма.
26. Способ по п. 23, в котором один или более маркеров указанного заболевания или патологического состояния не содержится в клеточном содержимом нефагоцитарных клеток.
27. Способ по любому из пп. 9-14, дополнительно включающий лизирование фагоцитарных клеток =2п перед а).
28. Способ по любому из пп. 9-14 и 27, дополнительно включающий выделение клеточного содержимого из фагоцитарных
19.
30. Способ по любому из пп. 3-14, дополнительно включающий сравнение идентифицированного различия с) с информационным архивом одного или более известных маркеров указанного заболевания или патологического состояния.
31. Способ по п. 30, в котором информационный архив получают посредством сбора данных.
32. Способ по любому из пп. 9-14, в котором фагоцитарными клетками являются профессиональные фагоцитарные клетки, непрофессиональные фагоцитарные клетки или их смеси.
33. Способ по п. 32, в котором профессиональными фагоцитарными клетками являются нейтрофилы, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, ксантомные клетки, тучные клетки, эозинофилы или их смеси.
34. Способ по п. 32, в котором непрофессиональными фагоцитарными клетками являются эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты, мезенхимальные клетки или их смеси.
35. Способ по любому из пп. 3-8, в котором нефагоцитарными клетками являются Т-клетки, В-клетки, нулевые клетки, базофилы или их смеси.
36. Способ по любому из пп. 3-14, в котором образец бесклеточной текучей среды организма отделяют от образца текучей среды организма.
37. Способ по п. 36, в котором образцом текучей среды организма является кровь, моча, кал, слюна, лимфатическая жидкость, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, содержимое кисты, асцит, плевральный выпот, текучая среда, полученная у беременной женщины в первом триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины во втором триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины в третьем триместре, материнская кровь, околоплодная жидкость, проба ворсинчатого хориона, текучая среда предимплантационного
35.
эмбриона, материнская моча, материнская слюна, плацентарная проба, фетальная кровь, промывная жидкость и текучая среда из шейки матки, интерстициальная жидкость или внутриглазная жидкость.
38. Способ по п. 36, в котором образец бесклеточной
текучей среды организма разделяют посредством фильтрования,
центрифугирования, проточной цитометрии, сортировки
флуоресцентно-активированных клеток, градиентного
центрифугирования, элюирования, микрофлюидики, методики
разделения в магнитном поле, методики флуоресцентного
разделения в магнитном поле, наноструктуры, точечных квантовых
приборов, высокопроизводительных платформ на основе микроскопа
или их комбинаций.
39. Способ по п. 36, в котором образец бесклеточной текучей среды организма разделяют посредством использования вещества, присутствующего в образце.
40. Способ по п. 39, в котором вещество представляет собой продукт маркера указанного заболевания или патологического состояния.
41. Способ по п. 36, в котором бесклеточным образцом текучей среды организма является плазма или сыворотка.
42. Способ по любому из пп. 3-8, в котором нефагоцитарные клетки выделяют из образца текучей среды, тканей или клеток организма пациента.
43. Способ по п. 42, в котором образцом текучей среды организма является кровь, моча, кал, слюна, лимфатическая жидкость, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, содержимое кисты, асцит, плевральный выпот, текучая среда, полученная у беременной женщины в первом триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины во втором триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины в третьем триместре, материнская кровь, околоплодная жидкость, проба ворсинчатого хориона, текучая среда предимплантационного эмбриона, материнская моча, материнская слюна, плацентарная проба, фетальная кровь, промывная жидкость и текучая среда из шейки матки, интерстициальная жидкость или внутриглазная
38.
44. Способ по любому из пп. 42-44, в котором нефагоцитарные клетки выделяют, используя антитела.
45. Способ по любому из пп. 42-44, в котором нефагоцитарные клетки выделяют посредством проточной цитометрии, сортировки флуоресцентно-активированных клеток, фильтрования, градиентного центрифугирования, элюирования, микрофлюидики, методики разделения в магнитном поле, методики флуоресцентного разделения в магнитном поле, наноструктур, точечных квантовых приборов, высокопроизводительных платформ на основе микроскопа или их комбинаций.
47. Способ по любому из пп. 9-14, в котором фагоцитарные клетки =2п выделяют из образца текучей среды, тканей или клеток организма пациента.
48. Способ по любому из пп. 9-14, в котором фагоцитарные клетки =2п выделяют из популяции фагоцитарных клеток.
49. Способ по п. 48, в котором фагоцитарные клетки =2п выделяют из популяции фагоцитарных клеток посредством проточной цитометрии, сортировки флуоресцентно-активированных клеток, фильтрования, градиентного центрифугирования, элюирования, микрофлюидики, методики разделения в магнитном поле, методики флуоресцентного разделения в магнитном поле, наноструктур, точечных квантовых приборов, высокопроизводительной платформы на основе микроскопа или их комбинаций.
50. Способ по п. 48, в котором популяцию фагоцитарных клеток выделяют из образца текучей среды, тканей или клеток организма пациента.
51. Способ по п. 47 или 50, в котором образцом текучей среды организма является кровь, моча, кал, слюна, лимфатическая жидкость, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, содержимое кисты, асцит, плевральный выпот, текучая среда, полученная у беременной женщины в первом триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины во втором триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины в третьем
47.
триместре, материнская кровь, околоплодная жидкость, проба ворсинчатого хориона, текучая среда предимплантационного эмбриона, материнская моча, материнская слюна, плацентарная проба, фетальная кровь, промывная жидкость и текучая среда из шейки матки, интерстициальная жидкость или внутриглазная жидкость.
52. Способ по п. 47 или 50, в котором клетками являются белые кровяные клетки.
53. Способ по любому из пп. 4 8 и 50-52, в котором популяцию фагоцитарных клеток выделяют, используя антитела.
54. Способ по любому из пп. 4 8 и 50-52, в котором популяцию фагоцитарных клеток выделяют посредством проточной цитометрии, сортировки флуоресцентно-активированных клеток, фильтрования, градиентного центрифугирования, элюирования, микрофлюидики, методики разделения в магнитном поле, методики флуоресцентного разделения в магнитном поле, наноструктур, точечных квантовых приборов, высокопроизводительной платформы на основе микроскопа или их комбинаций.
55. Способ по любому из пп. 3-14, в котором одним или более маркерами являются нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы, метаболиты или их комбинации.
56. Способ по п. 54, в котором нуклеиновыми кислотами являются нуклеотиды, олигонуклеотиды, ДНК, РНК или гибриды ДНК-РНК.
57. Способ по п. 56, в котором ДНК являются двухцепочечные ДНК, одноцепочечные ДНК, многоцепочечные ДНК, комплементарные ДНК, геномные ДНК или некодирующие ДНК.
58. Способ по п. 56, в котором РНК являются информационные РНК (мРНК), микроРНК (miPHK), малые ядрышковые РНК (snoPHK), рибосомные РНК (рРНК), транспортные РНК (тРНК), малые интерферирующие РНК (siPHK), гетерогенные ядерные РНК (hnPHK) или малые шпилечные РНК (shPHK).
59. Способ по п. 54, в котором белками являются
аминокислоты, пептиды, ферменты, антигены, антитела, цитокины,
липопротеины, гликопротеины или гормоны.
60. Способ по п. 54, в котором липидами являются жирные
кислоты, нейтральные жиры, фосфатиды, холестерин, сложные эфиры холестерина, триглицериды, гликолипиды, глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, стерол липиды, пренол липиды, сахаролипиды, поликетиды, холин глицерофосфолипид, этаноламин глицерофосфолипид, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидилсерин, лизохолин глицерофосфолипид, лизоэтаноламин глицерофосфолипид, фосфатидная кислота, лизофосфатидная кислота, сфингомиелин, галактозилцерамид, глюкозилцерамид, свободные жирные кислоты, простагландины, триацилглицерин, диацилглицерин, моноацилглицерин, ацил-КоА, ацилкарнитин, оксистерол, церамид, кардиолипин, сфингооснование-1-фосфат, сфингозин, лизосфингомиелин, ганглиозиды, плазмалоген, сульфатид, липопротеины низкой плотности (LDL) , липопротеины очень низкой плотности (VLDL), липопротеины высокой плотности (HDL), сфингооснование-1-фосфаты или их производные.
61. Способ по п. 54, в котором углеводами являются моносахариды, дисахариды, полисахариды, олигосахариды или их производные.
62. Способ по п. 54, в котором метаболитами являются первичные метаболиты, вторичные метаболиты, органические метаболиты, неорганические метаболиты, простагландины, гидроксиэйкозатетраеновые кислоты, гидроксиоктадекадиеновые кислоты, стероиды, желчные кислоты, витамины или их производные.
63. Способ по любому из пп. 3-14, в котором профилем является профиль нуклеиновых кислот, белковый профиль, липидный профиль, углеводный профиль, профиль метаболита или их комбинации.
64. Способ по п. 63, в котором профиль определяют посредством качественного анализа, количественного анализа или их комбинаций.
65. Способ по п. 64, в котором в количественном анализе используется секвенирование, прямое секвенирование, случайное секвенирование методом "выстрела из дробового ружья", дидезокси секвенирование с терминацией цепи по Сенгеру, секвенирование полного генома, секвенирование посредством гибридизации,
61.
электрофорез, двойное секвенирование, циклическое
секвенирование, секвенирование с удлинением цепи на одно
основание, твердофазное секвенирование, высокопроизводительное
секвенирование, массивно-параллельное опознавательное
секвенирование, эмульсионная ПЦР, секвенирование с помощью
обратимого красящего терминатора, парноконцевое секвенирование,
near-term секвенирование, экзонуклеазное секвенирование,
секвенирование посредством лигирования, секвенирование с
короткими ридами, одномолекулярное секвенирование,
секвенирование посредством синтеза, секвенирование в реальном
времени, секвенирование с помощью обратимого терминатора,
нанопоровое секвенирование, 454-секвенирование, секвенирование
с помощью Solexa Genome Analyzer, секвенирование с помощью
Solid(r), секвенирование MS-PET, масс-спектрометрия,
времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и
десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрия с
ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетная масс-
спектрометрия с усиленной поверхностью лазерной
десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольная времяпролетная
(Q-TOF) масс-спектрометрия, масс-спектрометрия с фотоионизацией
при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-спектрометрия с Фурье-
преобразованием (FTMS), масс-спектрометрия с ионизацией
лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного
циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (MALDI-FT-ICR),
вторично-ионная масс-спектрометрия (SIMS), анализ с помощью
полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественная ПЦР, ПЦР в
режиме реального времени, флуоресцентный анализ,
колориметрический анализ, хемилюминесцентный анализ или их
комбинации.
66. Способ по п. 63, в котором профилем нуклеиновых кислот
является генотипический профиль, профиль однонуклеотидного
полиморфизма, профиль мутации гена, профиль числа копий гена,
профиль метилирования ДНК, профиль ацетилирования ДНК, профиль
дозы хромосом, профиль экспрессии гена или их комбинации.
67. Способ по п. 66, в котором профиль нуклеиновых кислот
определяют посредством анализа с помощью полимеразной цепной
реакции (ПЦР), анализа с помощью секвенирования, анализа с
помощью электрофореза, анализа полиморфизма длины фрагментов
рестрикции (RFLP), Нозерн-блоттинга, количественной ПЦР,
анализа с помощью ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR),
гибридизационного анализа методом аллель-специфических
олигонуклеотидов, сравнительной геномной гибридизации, анализа
подвижности гетеродуплексов (НМА), анализа одноцепочного
конформационного полиморфизма (SSCP), денатурирующего
градиентного гель-электрофореза (DGGE), РНКазного анализа
несовпадений, масс-спектрометрии, тандемной масс-спектрометрии,
времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и
десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрии с
ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетной масс-
спектрометрии с усиленной поверхностью лазерной
десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольной времяпролетной
(Q-TOF) масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с фотоионизацией
при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-спектрометрии с Фурье-
преобразованием (FTMS), масс-спектрометрии с ионизацией
лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного
циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (MALDI-FT-ICR),
вторично-ионной масс-спектрометрии (SIMS), поверхностного
плазмонного резонанса, Саузерн-блоттинга, гибридизации in situ,
флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), хромогенной
гибридизации in situ (CISH), иммуногистохимического
исследования (IHC), микроматричного анализа, сравнительной
геномной гибридизации, кариотипирования, мультиплексной
амплификации лигазно-зависимых зондов (MLPA), количественной
мультиплексной ПЦР коротких флуоресцентных фрагментов (QMPSF),
микроскопии, анализа с помощью специфической к метилированию
ПЦР (MSP), анализа обогащения HTF-островков с помощью
опосредованной лигированием ПЦР (HELP), анализов мечения
радиоактивным ацетатом, колориметрического анализа
ацетилирования ДНК, иммунопреципитации хроматина, объединенной
с микроматричным анализом (иммунопреципитации хроматина на
микрочипе), рестрикционно-ориентированного геномного
чувствительного к метилированию рестрикционного анализа, бисульфитной конверсии неметилированного цитозина в урацил, анализа с помощью метил-связывающей ПЦР или их комбинаций.
68. Способ по п. 66, в котором профиль нуклеиновых кислот
определяют посредством методики секвенирования, выбранной из
группы, состоящей из прямого секвенирования, случайного
секвенирования методом "выстрела из дробового ружья",
дидезокси-секвенирования с терминацией цепи по Сенгеру,
секвенирования полного генома, секвенирования посредством
гибридизации, пиросеквенирования, капиллярного электрофореза,
гель-электрофореза, двойного секвенирования, циклического
секвенирования, секвенирования с удлинением цепи на одно
основание, твердофазного секвенирования,
высокопроизводительного секвенирования, массивно-параллельного
опознавательного секвенирования, эмульсионной ПЦР,
секвенирования с помощью обратимого красящего терминатора,
парноконцевого секвенирования, near-term секвенирования,
экзонуклеазного секвенирования, секвенирования посредством
лигирования, секвенирования с короткими ридами,
одномолекулярного секвенирования, секвенирования посредством
синтеза, секвенирования в реальном времени, секвенирования с
помощью обратимого терминатора, нанопорного секвенирования,
454-секвенирования, секвенирования с помощью Solexa Genome
Analyzer, секвенирования с помощью Solid(r), секвенирования MS-
PET, масс-спектрометрии и их комбинаций.
69. Способ по п. 63, в котором белковым профилем является профиль экспрессирования белков, профиль активации белков или их комбинации.
70. Способ по п. 69, в котором белковый профиль определяют посредством иммуногистохимического исследования, энзим-связанного иммуносорбентного метода исследования (ELISA), гибридизации in situ, хроматографии, жидкостной хроматографии, гель-проникающей хроматографии, высокоэффективной жидкостной
68.
спектрометрии, тандемной масс-спектрометрии, времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетной масс-спектрометрии с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF) , квадрупольной времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований, микроскопии, исследований на основе микрожидкостного чипа, поверхностного плазмонного резонанса, секвенирования, исследования вестерн-блоттинга или их комбинаций.
71. Способ по п. 69, в котором профиль активации белков
включает определение состояния фосфорилирования, состояния
убиквитинилирования, состояния миристоилирования,
конформационного состояния или их комбинаций у одного или более
маркеров.
72. Способ по п. 63, в котором липидный профиль определяют
посредством хроматографии, жидкостной хроматографии, гель-
проникающей хроматографии, высокоэффективной жидкостной
хроматографии (HPLC), газовой хроматографии, масс-
спектрометрии, тандемной масс-спектрометрии, времяпролетной
масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой
матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрии с ионизацией
электрораспылением (ESI), времяпролетной масс-спектрометрии с
усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-
TOF) , квадрупольной времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии,
масс-спектрометрии с фотоионизацией при атмосферном давлении
(APPI-MS), масс-спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-
73. Способ по п. 63, в котором углеводный профиль
определяют посредством хроматографии, жидкостной хроматографии,
гель-проникающей хроматографии, высокоэффективной
анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим
детектированием (HPAEC-PAD), жидкостной хроматографии, газовой
хроматографии, флуоресцентного исследования, масс-
спектрометрии, тандемной масс-спектрометрии, времяпролетной
масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой
матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрии с ионизацией
электрораспылением (ESI), времяпролетной масс-спектрометрии с
усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-
TOF) , квадрупольной времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии,
масс-спектрометрии с фотоионизацией при атмосферном давлении
(APPI-MS), масс-спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-спектрометрии (SIMS), радиоиммунологического исследования, анализа с использованием микрожидкостного чипа, выявления флуоресценции, выявления хемилюминесценции или их комбинаций.
74. Способ по любому из пп. 3-14, в котором пациент имеет по меньшей мере два заболевания или патологических состояния.
75. Способ по п. 74, в котором пациент имеет по меньшей мере одно связанное с беременностью или предродовое заболевание или патологическое состояние.
76. Способ по п. 74, в котором пациент имеет по меньшей мере одно заболевание или патологическое состояние, которое не является заболеванием или патологическим состоянием.
77. Способ по любому из пп. 3-14, в котором пациентом является млекопитающее.
78. Способ по п. 77, в котором пациентом является человек.
79. Способ по любому из пп. 3-14, в котором заболеванием или патологическим состоянием является сердечно-сосудистое
74.
заболевание или патологическое состояние, связанное с почками
заболевание или патологическое состояние, связанное с
беременностью и предродовое заболевание или патологическое
состояние, неврологическое или психоневрологическое заболевание
или патологическое состояние, аутоиммунное или
иммунопатологическое заболевание или патологическое состояние, рак, инфекционное заболевание или патологическое состояние, митохондриальное расстройство, заболевание или патологическое состояние желудочно-кишечного тракта-дыхательных путей, заболевание или патологическое состояние репродуктивной системы, офтальмологическое заболевание или патологическое состояние, скелетно-мышечное заболевание или патологическое состояние или кожное заболевание или патологическое состояние.
80. Способ по любому из пп. 3-14, в котором различие больше чем 1-кратное различие.
81. Способ по п. 80, в котором различием является по меньшей мере 1,05-кратное, 1,1-кратное, 1,2-кратное, 1,3-кратное, 1,4-кратное, 1,5-кратное, 2-кратное, 2,5-кратное, 3-кратное, 4-кратное, 5-кратное, б-кратное, 7-кратное, 8-кратное, 9-кратное или 10-кратное различие.
82. Способ идентификации одного или более маркеров для заболевания или патологического состояния, включающий:
a) определение первого профиля аналитов из образца текучей
среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или
патологическое состояние;
определение второго профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля;
b) определение третьего профиля аналитов из образца
текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего
указанного заболевания или патологического состояния;
определение четвертого профиля аналитов из нефагоцитарных клеток у контрольного пациента, не имеющего указанного
идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля;
c) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния.
83. Способ по п. 82, дополнительно включающий:
d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
идентификацию третьего разностного множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и
e) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с) , присутствующих в третьем разностном множестве.
84. Способ идентификации одного или более маркеров
заболевания или патологического состояния, включающий:
а) определение первого профиля аналитов из образца текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
определение второго профиля аналитов из образца текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния;
идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является
b) определение третьего профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
определение четвертого профиля аналитов из нефагоцитарных клеток у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния;
идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля;
c) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния.
85. Способ по п. 84, дополнительно включающий:
d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
идентификацию третьего разностного множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и
e) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с) , присутствующих в третьем разностном множестве.
86. Способ идентификации одного или более маркеров
заболевания или патологического состояния, включающий:
а) определение первого профиля аналитов из образца текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или
получение второго профиля аналитов из образца текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния, посредством сбора данных;
идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля;
b) определение третьего профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
получение четвертого профиля аналитов из нефагоцитарных клеток у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния, посредством сбора данных;
идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; и
c) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния.
87. Способ по п. 8 6, дополнительно включающий:
d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, посредством сбора данных;
получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, посредством сбора данных;
идентификацию третьего разностного множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и
e) идентификацию по меньшей мере одного из одного или
88. Способ идентификации одного или более маркеров
заболевания или патологического состояния, включающий:
a) определение первого профиля аналитов из образца текучей среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
определение второго профиля аналитов из нефагоцитарных клеток пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля;
b) определение третьего профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
определение четвертого профиля аналитов из клеток или тканей, не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля;
c) идентификацию одного или более аналитов, присутствующих как в первом разностном множестве, так и во втором разностном множестве, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния.
89. Способ по п. 88, дополнительно включающий:
d) определение пятого профиля аналитов из образца текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния;
идентификацию третьего разностного множества между первым и пятым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для первого профиля относительно пятого
90. Способ идентификации одного или более маркеров
заболевания или патологического состояния, включающий:
a) определение первого профиля аналитов из образца текучей
среды организма у пациента, имеющего указанное заболевание или
патологическое состояние;
определение второго профиля аналитов из фагоцитарных клеток =2п пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
идентификацию первого разностного множества между первым и вторым профилями, при этом первое разностное множество является специфическим для первого профиля относительно второго профиля;
b) определение третьего профиля аналитов из образца
текучей среды организма у контрольного пациента, не имеющего
указанного заболевания или патологического состояния;
определение четвертого профиля аналитов из фагоцитарных клеток =2п у контрольного пациента, не имеющего указанного заболевания или патологического состояния;
идентификацию второго разностного множества между третьим и четвертым профилями, при этом второе разностное множество является специфическим для третьего профиля относительно четвертого профиля; и
c) идентификацию одного или более аналитов, специфических для первого разностного множества относительно второго разностного множества, при этом идентифицированными аналитами являются маркеры указанного заболевания или патологического состояния.
91. Способ по п. 90, дополнительно включающий:
d) получение пятого профиля аналитов из клеток или тканей, пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
получение шестого профиля аналитов из клеток или тканей,
идентификацию третьего разностного множества между пятым и шестым профилями, при этом третье разностное множество является специфическим для пятого профиля относительно шестого профиля; и
е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с) , присутствующих в третьем разностном множестве.
92. Способ по любому из пп. 82-91, дополнительно включающий выделение одного или более маркеров из образца бесклеточной текучей среды организма.
93. Способ по любому из пп. 82-89, дополнительно включающий лизирование нефагоцитарных клеток перед а).
94. Способ по любому из пп. 82-89 и 93, дополнительно включающий выделение клеточного содержимого из нефагоцитарных клеток перед а).
95. Способ по любому из пп. 82-91, в котором образец бесклеточной текучей среды организма включает жизнеспособные пораженные клетки, мертвые пораженные клетки, апоптотические пораженные клетки, циркулирующие в крови опухолевые клетки, инфекционные агенты, фетальные клетки, трофобласты или их фрагменты.
96. Способ по любому из пп. 82-91, в котором по меньшей мере один из одного или более маркеров указанного заболевания или патологического состояния имеется в образце бесклеточной текучей среды организма.
97. Способ по п. 94, в котором один или более маркеров указанного заболевания или патологического состояния не содержится в клеточном содержимом нефагоцитарных клеток.
98. Способ по любому из пп. 90-91, дополнительно включающий лизирование фагоцитарных клеток =2п перед а).
99. Способ по любому из пп. 90-91 и 98, дополнительно включающий выделение клеточного содержимого из фагоцитарных клеток =2п перед а).
98.
100. Способ по любому из пп. 82-91, дополнительно включающий сравнение идентифицированного различия с) с информационным архивом одного или более известных маркеров указанного заболевания или патологического состояния.
101. Способ по п. 101, в котором информационный архив получают посредством сбора данных.
102. Способ по любому из пп. 90-91, в котором фагоцитарными клетками являются профессиональные фагоцитарные клетки, непрофессиональные фагоцитарные клетки или их смеси.
103. Способ по п. 111, в котором профессиональными фагоцитарными клетками являются нейтрофилы, макрофаги, моноциты, дендритные клетки, ксантомные клетки, тучные клетки, эозинофилы или их смеси.
104. Способ по п. 111, в котором непрофессиональными фагоцитарными клетками являются эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты, мезенхимальные клетки или их смеси.
105. Способ по любому из пп. 82-89, в котором нефагоцитарными клетками являются Т-клетки, В-клетки, нулевые клетки, базофилы или их смеси.
106. Способ по любому из пп. 90-91, в котором образец бесклеточной текучей среды организма отделяют от образца текучей среды организма.
107. Способ по п. 107, в котором образцом текучей среды организма является кровь, моча, кал, слюна, лимфатическая жидкость, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, содержимое кисты, асцит, плевральный выпот, текучая среда, полученная у беременной женщины в первом триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины во втором триместре, текучая среда, полученная у беременной женщины в третьем триместре, материнская кровь, околоплодная жидкость, проба ворсинчатого хориона, текучая среда предимплантационного эмбриона, материнская моча, материнская слюна, плацентарная
98.
108. Способ по п. 107, в котором образец бесклеточной
текучей среды организма разделяют посредством фильтрования,
центрифугирования, проточной цитометрии, сортировки
флуоресцентно-активированных клеток, градиентного
центрифугирования, элюирования, микрофлюидики, методики
разделения в магнитном поле, методики флуоресцентного
разделения в магнитном поле, наноструктуры, точечных квантовых
приборов, высокопроизводительных платформ на основе микроскопа
или их комбинаций.
109. Способ по п. 107, в котором образец бесклеточной текучей среды организма разделяют посредством использования вещества, присутствующего в образце.
110. Способ по любому из пп. 82-91, в котором одним или более маркерами являются нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы, метаболиты или их комбинации.
111. Способ по любому из пп. 82-91, в котором аналитами являются нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы, метаболиты или их комбинации.
112. Способ по п. 111 или 112, в котором нуклеиновыми кислотами являются нуклеотиды, олигонуклеотиды, ДНК, РНК или гибриды ДНК-РНК.
114. Способ по п. 113, в котором ДНК являются двухцепочечные ДНК, одноцепочечные ДНК, многоцепочечные ДНК, комплементарные ДНК, геномные ДНК или некодирующие ДНК.
115. Способ по п. 113, в котором РНК являются информационные РНК (мРНК), микроРНК (miPHK), малые ядрышковые РНК (snoPHK), рибосомные РНК (рРНК), транспортные РНК (тРНК), малые интерферирующие РНК (siPHK), гетерогенные ядерные РНК (hnPHK) или малые шпилечные РНК (shPHK).
116. Способ по п. 111 или 112, в котором белками являются
аминокислоты, пептиды, ферменты, антигены, антитела, цитокины,
липопротеины, гликопротеины или гормоны.
117. Способ по п. 111 или 112, в котором липидами являются
жирные кислоты, нейтральные жиры, фосфатиды, холестерин,
сложные эфиры холестерина, триглицериды, гликолипиды,
глицеролипиды, глицерофосфолипиды, сфинголипиды, стерол липиды,
пренол липиды, сахаролипиды, поликетиды, холин
глицерофосфолипид, этаноламин глицерофосфолипид,
фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидилсерин,
лизохолин глицерофосфолипид, лизоэтаноламин глицерофосфолипид,
фосфатидная кислота, лизофосфатидная кислота, сфингомиелин,
галактозилцерамид, глюкозилцерамид, свободные жирные кислоты,
простагландины, триацилглицерин, диацилглицерин,
моноацилглицерин, ацил-КоА, ацилкарнитин, оксистерол, церамид,
кардиолипин, сфингооснование-1-фосфат, сфингозин,
лизосфингомиелин, ганглиозиды, плазмалоген, сульфатид, липопротеины низкой плотности (LDL), липопротеины очень низкой плотности (VLDL), липопротеины высокой плотности (HDL), сфингооснование-1-фосфаты или их производные.
118. Способ по п. 111 или 112, в котором углеводами являются моносахариды, дисахариды, полисахариды, олигосахариды или их производные.
119. Способ по п. 111 или 112, в котором метаболитами
являются первичные метаболиты, вторичные метаболиты,
органические метаболиты, неорганические метаболиты,
простагландины, гидроксиэйкозатетраеновые кислоты,
гидроксиоктадекадиеновые кислоты, стероиды, желчные кислоты,
витамины или их производные.
120. Способ по любому из пп. 82-91, в котором профилем является профиль нуклеиновых кислот, белковый профиль, липидный профиль, углеводный профиль, профиль метаболита или их комбинации.
121. Способ по п. 120, в котором профиль определяют посредством качественного анализа, количественного анализа или их комбинаций.
122. Способ по п. 121, в котором в количественном анализе используется секвенирование, прямое секвенирование, случайное секвенирование методом "выстрела из дробового ружья", дидезокси-секвенирование с терминацией цепи по Сенгеру,
118.
секвенирование полного генома, секвенирование посредством
гибридизации, пиросеквенирование, капиллярный электрофорез,
гель-электрофорез, двойное секвенирование, циклическое
секвенирование, секвенирование с удлинением цепи на одно
основание, твердофазное секвенирование, высокопроизводительное
секвенирование, массивно-параллельное опознавательное
секвенирование, эмульсионная ПЦР, секвенирование с помощью
обратимого красящего терминатора, парноконцевое секвенирование,
near-term секвенирование, экзонуклеазное секвенирование,
секвенирование посредством лигирования, секвенирование с
короткими ридами, одномолекулярное секвенирование,
секвенирование посредством синтеза, секвенирование в реальном
времени, секвенирование с помощью обратимого терминатора,
нанопорное секвенирование, 454-секвенирование, секвенирование с
помощью Solexa Genome Analyzer, секвенирование с помощью
Solid(r), секвенирование MS-PET, масс-спектрометрия,
времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и
десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрия с
ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетная масс-
спектрометрия с усиленной поверхностью лазерной
десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольная времяпролетная
(Q-TOF) масс-спектрометрия, масс-спектрометрия с фотоионизацией
при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-спектрометрия с Фурье-
преобразованием (FTMS), масс-спектрометрия с ионизацией
лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного
циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (MALDI-FT-ICR),
вторично-ионная масс-спектрометрия (SIMS), анализ с помощью
полимеразной цепной реакции (ПЦР), количественная ПЦР, ПЦР в
режиме реального времени, флуоресцентный анализ,
колориметрический анализ, хемилюминесцентный анализ или их
комбинации.
12 3. Способ по п. 12 0, в котором профилем нуклеиновых
кислот является генотипический профиль, профиль
однонуклеотидного полиморфизма, профиль мутации гена, профиль числа копий гена, профиль метилирования ДНК, профиль ацетилирования ДНК, профиль дозы хромосом, профиль экспрессии
124. Способ по п. 123, в котором профиль нуклеиновых
кислот определяют посредством анализа с помощью полимеразной
цепной реакции (ПЦР), анализа с помощью секвенирования, анализа
с помощью электрофореза, анализа полиморфизма длины фрагментов
рестрикции (RFLP), Нозерн-блоттинга, анализа с помощью ПЦР с
обратной транскриптазой (RT-PCR), количественной ПЦР,
количественной RT-PCR, гибридизационного анализа методом
аллель-специфических олигонуклеотидов, сравнительной геномной
гибридизации, анализа подвижности гетеродуплексов (НМА),
анализа одноцепочного конформационного полиморфизма (SSCP),
денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE),
РНКазного анализа несовпадений, масс-спектрометрии, масс-
спектрометрии, времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной
ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), масс-
спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI),
времяпролетной масс-спектрометрии с усиленной поверхностью
лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольной
времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с
фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-
спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-
спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием
матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-
преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-
спектрометрии (SIMS), Саузерн-блоттинга, гибридизации in situ,
флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), хромогенной
гибридизации in situ (CISH), иммуногистохимического
исследования (IHC), микроматричного анализа, сравнительной
геномной гибридизации, кариотипирования, мультиплексной
амплификаци лигазно-зависимых зондов (MLPA), количественной
мультиплексной ПЦР коротких флуоресцентных фрагментов (QMPSF),
микроскопии, анализа с помощью специфической к метилированию
ПЦР (MSP), анализа обогащения HTF-островков с помощью
опосредованной лигированием ПЦР (HELP), анализов мечения
радиоактивным ацетатом, колориметрического анализа
ацетилирования ДНК, иммунопреципитации хроматина, объединенной
сканирования, иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP),
анализа светового молекулярного разрыва для активности ДНК-
аденин-метилтрансферазы, хроматографического разделения,
чувствительного к метилированию рестрикционного анализа, поверхностного плазмонного резонанса, бисульфитной конверсии неметилированного цитозина в урацил, анализа с помощью метил-связывающей ПЦР или их комбинаций.
12 5. Способ по п. 12 3, в котором профиль нуклеиновых
кислот определяют посредством методики секвенирования,
выбранной из прямого секвенирования, случайного секвенирования
методом "выстрела из дробового ружья", дидезокси-секвенирования
с терминацией цепи по Сенгеру, секвенирования полного генома,
секвенирования посредством гибридизации, пиросеквенирования,
капиллярного электрофореза, гель-электрофореза, двойного
секвенирования, циклического секвенирования, секвенирования с
удлинением цепи на одно основание, твердофазного
секвенирования, высокопроизводительного секвенирования,
массивно-параллельного опознавательного секвенирования,
эмульсионной ПЦР, секвенирования с помощью обратимого красящего
терминатора, парноконцевого секвенирования, near-term
секвенирования, экзонуклеазного секвенирования, секвенирования посредством лигирования, секвенирования с короткими ридами, одномолекулярного секвенирования, секвенирования посредством синтеза, секвенирования в реальном времени, секвенирования с помощью обратимого терминатора, нанопорового секвенирования, 454-секвенирования, секвенирования с помощью Solexa Genome Analyzer, секвенирования с помощью Solid(r), секвенирования MS-PET, масс-спектрометрии и их комбинаций.
12 6. Способ по п. 12 0, в котором белковым профилем является профиль экспрессирования белков, профиль активации белков или их комбинации.
127. Способ по п. 126, в котором профиль активации белков
включает определение состояния фосфорилирования, состояния
убиквитинилирования, состояния миристоилирования или
128. Способ по п. 126, в котором белковый профиль
определяют посредством иммуногистохимического исследования,
энзим-связанного иммуносорбентного метода исследования (ELISA),
хроматографии, жидкостной хроматографии, гель-проникающей
хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии
(HPLC), газовой хроматографии, масс-спектрометрии, тандемной
масс-спектрометрии, времяпролетной масс-спектрометрии с
лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF),
масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI),
времяпролетной масс-спектрометрии с усиленной поверхностью
лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF), квадрупольной
времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с
фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-
спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-
спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием
матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-
преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-
спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований,
поверхностного плазмонного резонанса, исследований на основе
микрожидкостного чипа, исследования вестерн-блоттинг или их
комбинаций.
12 9. Способ по п. 12 6, в котором липидный профиль
определяют посредством хроматографии, жидкостной хроматографии,
гель-проникающей хроматографии, высокоэффективной жидкостной
хроматографии (HPLC), газовой хроматографии, масс-
спектрометрии, времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), тандемной масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетной масс-спектрометрии с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-TOF) , квадрупольной времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии, масс-спектрометрии с фотоионизацией при атмосферном давлении (APPI-MS), масс-спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного циклотронного резонанса с
Фурье-преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований, исследований на основе микрожидкостного чипа, выявления флуоресценции, выявления хемилюминесценции или их комбинаций.
130. Способ по п. 12 6, в котором углеводный профиль
определяют посредством хроматографии, жидкостной хроматографии,
гель-проникающей хроматографии, высокоэффективной
анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим
детектированием (HPAEC-PAD), жидкостной хроматографии, газовой
хроматографии, флуоресцентного исследования, масс-
спектрометрии, тандемной масс-спектрометрии, времяпролетной
масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой
матрицы (MALDI-TOF), масс-спектрометрии с ионизацией
электрораспылением (ESI), времяпролетной масс-спектрометрии с
усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI-
TOF) , квадрупольной времяпролетной (Q-TOF) масс-спектрометрии,
масс-спектрометрии с фотоионизацией при атмосферном давлении
(APPI-MS), масс-спектрометрии с Фурье-преобразованием (FTMS), масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы - ионного циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (MALDI-FT-ICR), вторично-ионной масс-спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований, исследований на основе микрожидкостного чипа, выявления флуоресценции, выявления хемилюминесценции или их комбинаций.
131. Способ по любому из пп. 82-91, в котором пациентом является млекопитающее.
132. Способ по п. 131, в котором пациентом является человек.
133. Способ по любому из пп. 82-91, в котором заболеванием
или патологическим состоянием является сердечно-сосудистое
заболевание или патологическое состояние, связанное с почками
заболевание или патологическое состояние, связанное с
беременностью и предродовое заболевание или патологическое
состояние, неврологическое или психоневрологическое заболевание
или патологическое состояние, аутоиммунное или
иммунопатологическое заболевание или патологическое состояние,
131.
рак, инфекционное заболевание или патологическое состояние, митохондриальное расстройство, заболевание или патологическое состояние желудочно-кишечного тракта-дыхательных путей, заболевание или патологическое состояние репродуктивной системы, офтальмологическое заболевание или патологическое состояние, скелетно-мышечное заболевание или патологическое состояние или кожное заболевание или патологическое состояние.
134. Способ по любому из пп. 8 2-91, при этом различие больше чем 1-кратное различие.
135. Способ по п. 134, при этом различием является по меньшей мере 1,05-кратное, 1,1-кратное, 1,2-кратное, 1,3-кратное, 1,4-кратное, 1,5-кратное, 2-кратное, 2,5-кратное, 3-кратное, 4-кратное, 5-кратное, б-кратное, 7-кратное, 8-кратное, 9-кратное или 10-кратное различие.
13 6. Способ по п. 3 или 9, дополнительно включающий
определение по меньшей мере одного диагностического параметра
указанного заболевания или патологического состояния.
137. Способ по п. 136, в котором диагностический параметр определяют посредством физического осмотра, визуального осмотра, биопсии, сцинтиграфии, гистологии, рентгенологического исследования, визуализации, ультразвукового исследования, применения коммерческого набора, генетического тестирования, иммунологического тестирования, анализа текучих сред организма или мониторинга нейронной активности.
138. Способ по любому из пп. 3-14, в котором один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АКТ2, ВАК1, EGFR, ERBB2, ETS2, FOS, JU, МАР2К1, ММР2, PDGFB, RBI, SERPTNB2, SNCG и SPP1.
139. Способ по любому из пп. 3-14, в котором один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АКТ1, АКТ2, ВАК2, CDC25A, E2F1, EGFR, ERBB2, FOS, JUN, МАР2К1, ММР2, NFKB1, PDGFB, PIK3R1, PNN, RBI, SERPINB2, SERPINB5, SNCG, SPP1, TERT, TIMP3 и TP53.
14 0. Способ по любому из пп. 3-14, в котором один или
более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из
группы, состоящей из CASP8, CASP9, COL18A1, ETS2, HTATIP2,
ММР9, SRC и TWIST1.
141. Способ по любому из пп. 3-14, в котором один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АКТ1, APAFl, ATM, CDC25A, CDKNIA, ETS2, FOS, IL8, ITGA4, ITGA6, ITGAV, JUN, MAP2K1, NFKBIA, PLAU, PLAUR, RAF1, SERPINB2, SYK, TIMP1, TNF, TNFRSF1OB и TNFRSF1A.
142. Способ по любому из пп. 3-14, в котором один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АСР2, АК2, АКТЗ, ARL5B, АТР2ВЗ, BGN, BRAF, BTG2, САМКК2, CAPG, CAPN12, CPLX2, DENND5A, DNA2, FAM104A, FNIP1, GFRA4, GLUD1, GNAQ, GP1BB, HNRPLL, Н0ХА2, HPS3, INPP4A, ITGAV, KLHL23, LANCL2, LYPD6, МАРКАРКЗ, MEF2A (включает, EG:4205), MEF2C, NVL, PCYT1A, PGLYRP4, PL0D1, РРР1СВ, PRKAB2, PROS1, PTPRE, RASA4 (включает, EG:10156), RBMS2, RBPJ, STAT5B, THBS1, TRIB 1, TRIM2, TSPANб и ZDHHC21.
143. Способ по любому из пп. 3-14, в котором один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из B4GALT5, ВОР1, CCL2, CCL3, CCL3L1, CCRL2, CD83, CLEC4G, CLIC4, CTSC, CTSO, CXCL10, FCGR3A, FPR3, НВА1, НВВ, LRMP, MAP1LC3B2, MS4A4A, MSR1, MYADML, NIDI, PF4, PION, RNF217, SAMD9L, SERPING1 и SPARC.
144. Способ по любому из пп. 3-14, в котором один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из АСОТ9, AMPD2, ARHGAP15, BATF2, C3AR1, C5orf41, CCL3, CCL3L1, CD63, CHST11, CHSY1, CLEC4G, CTSZ, CXorf21, CYTH4, CYTIP, DLEU2, DNAJA1, DOCK8, DTX3L, DUSP6, EPSTI1, ERF, F2RL1, FYB, GABRB2, GBP5, GLRX, GNB4, ICAM1, IFI35, IFIH1, IFNAR2, IL1R1, IRF1, ITGA5, LAP3, LAPTM5, LCP2, MAP1LC3B, MAP1LC3B2, MICAL2, MTIDP, MTIJP, MT1M, MT2A, MYADML, NEK6, NTNJ2, NNMT, NT5C3L, NUB1, PDE4B, PLOD1, PML, PRKCB, PSMB9, RCN3, RGS4, RNASE6, RTP4, SAMD9L, SEL1L, SERPING1, SETX, SIGLEC10, SKIL, SLC7A7, SNORA21, SP100, SP110, SP140, SSFA2, STAT2, STK17B, STK3, TDRD7, TMCC1, TMPRSS11E2, TNFRSF1B, TPM1, TRIM21,TXNDC4, UBE2L6, UBE2W, USP18, VAV1, WARS, WIPF1 и WIPI1.
145. Способ по любому из пп. 3-14, в котором один или более маркеров включают по меньшей мере один ген, выбранный из
141.
группы, состоящей из ADAR, ADM, ALAS1, ANKRD22, ARHGAP2 7, B3GNT5, BCLIO, C12orf35, C15orf29, C2orf59, CD177, СЕACAMI, CPEB2, DDX58, F2RL1, GDPD3, GNAI3, HIST2H3A, HIST2H3D, HIST2H4A, HMGCR, HSPA6, HSPC159, IL4R, IMPA2, KPNB1, KREMEN1, KRT23, LDLR, LOCI 00130904, LTB4R, MAEA, MARK2, MBOAT 2, MPZL3, N4BP1, NBEAL2, NMI, NPEPPS, PARP14, PGM2, PPIF, PXN, RALBP1, ROD1, RPS6KA1, S100P, SERTAD2, SLC9A1, SLPI, SP110, SPTNT1, ST14, TBC1D3, TNFRSF9, TRIM21, UPP1, VPS24, ZBTB34 и ZNF256.
14 6. Способ по любому из пп. 3-14, в котором один или более маркеров включают по меньшей мере один или более маркеров, идентифицированных с помощью способов по любому из пп. 82-91.
147. Набор, содержащий множество выявляющих маркеры агентов, которые выявляют по меньшей мере один или более маркеров, идентифицированных с помощью способов по любому из пп. 82-91.
14 8. Способ лечения или профилактики заболевания или патологического состояния пациента, включающий введение указанному пациенту агента, который модулирует активность или экспрессирование по меньшей мере одного или более маркеров, идентифицированных с помощью способов по любому из пп. 82-91.
По доверенности
CD Ю CD 00
Взятие крови у пациента с раком яичников
Выделение плазмы и БКК
Плазма
БКК
Иммуноокрашивание субпопуляции лимфоцитов (напр., использование анти-Т-клеточного антитела)
со о
Сортировка (напр., магнитными микроносителями)
Идентификация сигнатур генов, специфических для рака яичников
Т-клетки
Выделение мкРНК
Геномика
Выделение мкРНК
Проведение анализа генетической информации
Проведение анализа генетической информации
Сортировка (напр., магнитными микроносителями)
Т-клетки
СО О
Выделение белков
Расщепление на пептиды
Идентификация протеомических сигнатур, специфических для рака легких
Выделение белков
Расщепление на пептиды
Мечение изобарическим Тад-В
Выделение плазмы и БКК
БКК
Иммуноокрашивание субпопуляции лимфоцитов (напр., использование анти-Т-клеточного антитела)
Сортировка (напр., магнитными микроносителями)
Идентификация протеомических сигнатур, специфических для рака легких
СЛ СО
Окрашивание БКК (напр., Hoechst 33342)
00 СО
Сортировка (FACS)
БКК (2п)
Выделение ДНК
Выделение плазмы и БКК
Плазма
БКК
Окрашивание БКК (напр., йодидом пропидия )
Сортировка (FACS)
Выделение белков
| Идентификация протеомических сигнатур специфических для рака яичников
БКК |2п
Выделение белков
со о
Протеомика
Расщепление] на пептиды
]Расщеплени? на пептиды
Мечение изобарическим Тад-В
Разновидность_001 -2
о со
PHK(RIN=9,2)
Фиг.Ю
70- Лэддер
686664626058565452504846444240383634323026242018-
LNCaP
РНК
LLC1
РНК
[FU]
3020100-
[FU]
250200150 10050-О-
[FU]
10050 Л
Лэддер
~i-i-i-i-i-i-i-i-i-г~ 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 [с]
LNCaP РНК
28S/18S = 1.9 RIN = 10
-1-i-i-i-i-i-i-i-i-г~ 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 [с]
LLC1 РНК
28S/18S = 2.0 RIN = 10
-\-i-i-i-i-i-i-i-i-r~ 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 [c]
со о
* Среднее каждого из > 6 клеточных препаратов
Фиг.12
Макрофаги Т-клетки
M|_NCaP ПР0ТИВ Т-КЛеТКИ|_МСаР
Группа 2 против группы 1
0.89 1.14 1.39 1.64 1.89 2.14 2.39 2.64 2.89 3.14
Лог 10 (группа 1)
MLNCaP ПР°ТИВ M без опухоли Группа 2 против группы 3
0.89 1.14 1.39 1.64 1.89 2.14 2.39 2.64 2.89 3.14
Лог 10 (группа 3)
N LNCaP ПР0ТИВ Т-КЛвТКИ
LNCaP
Группа 3 против группы 4
0.89 1.14 1.39
1.64 1.89 2.14 2.39 Лог 10 (группа 4)
2.64 2.89 3.14
NLNCaP ПР°ТИВ Мбез опухоли
Группа 3 против группы 1
0.89 1.14 1.39 1.64 1.89 2.14 2.39 2.64 2.89 3.14
Лог 10 (группа 1)
Фиг.240
* = онкоген
250 кДа >
150 кДа >
100 кДа >
75кДа >
50кДа
37 кДа
25 кДа
Образец Маркеры очищенного
MW белка
Фиг. 27
международную публикацию РСТ № WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; и Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147).
ПРИМЕР 2
Типичный Способ II для отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии
ПРИМЕР 2
Типичный Способ II для отделения фагоцитарных клеток от нефагоцитарных клеток и анализа профилей экспрессии
идентификации белков.
[02 04] 9. Выделить липиды из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и сравнить количество и качество, например, используя HPLC.
идентификации белков.
[02 04] 9. Выделить липиды из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и сравнить количество и качество, например, используя HPLC.
идентификации белков.
[0210] б. Выделить липиды из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и сравнить количество и качество, например, используя HPLC.
идентификации белков.
[0210] б. Выделить липиды из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и сравнить количество и качество, например, используя HPLC.
[0216] б. Выделить липиды из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и сравнить количество и качество, например, используя HPLC.
[0216] б. Выделить липиды из плазмы и клеток, имеющих ДНК, равную 2п, и сравнить количество и качество, например, используя HPLC.
Вслед за гибридизацией мембраны промывали и окрашивали авидин-
щелочной фосфатазой, и выявляли гены, используя
хемилюминесценцию (рентгеновскую пленку). Сравнивали
Вслед за гибридизацией мембраны промывали и окрашивали авидин-
щелочной фосфатазой, и выявляли гены, используя
хемилюминесценцию (рентгеновскую пленку). Сравнивали
полученными у мышеи, не являющихся носителями опухолей. ПРИМЕР 8
полученными у мышеи, не являющихся носителями опухолей. ПРИМЕР 8
быстрый (приблизительно 3 0 минут), и выделенные белки могут быть использованы в ряде дальнейших вариантов применения, таких как анализ SDS-PAGE и Вестерн-блоттинги.
быстрый (приблизительно 3 0 минут), и выделенные белки могут быть использованы в ряде дальнейших вариантов применения, таких как анализ SDS-PAGE и Вестерн-блоттинги.
LS174T, и не выявляется в Т-клетках у тех же животных. ПРИМЕР 10
LS174T, и не выявляется в Т-клетках у тех же животных. ПРИМЕР 10
101
102
маркеров;
104
маркеров; и
104
маркеров; и
105
соединения пациенту;
определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента перед введением соединения пациенту;
105
соединения пациенту;
определение второго профиля по меньшей мере одного из одного или более маркеров из популяции нефагоцитарных клеток пациента перед введением соединения пациенту;
106
бесклеточной текучей среды организма;
106
бесклеточной текучей среды организма;
107
пациента после лечения;
идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и
107
пациента после лечения;
идентификацию второго различия между третьим и четвертым профилями по меньшей мере одного или более из указанных маркеров; и
108
108
109
мере один из одного или более маркеров понижающе регулируется или ингибируется в образце бесклеточной текучей среды организма по сравнению с фагоцитарными клетками =2п.
109
мере один из одного или более маркеров понижающе регулируется или ингибируется в образце бесклеточной текучей среды организма по сравнению с фагоцитарными клетками =2п.
клеток =2п перед а).
29. Способ по п. 28, в котором один или более маркеров
указанного заболевания или патологического состояния не
содержится в клеточном содержимом фагоцитарных клеток =2п.
клеток =2п перед а).
29. Способ по п. 28, в котором один или более маркеров
указанного заболевания или патологического состояния не
содержится в клеточном содержимом фагоцитарных клеток =2п.
Ill
112
жидкость.
44. Способ по п. 42, в котором клетками являются белые
кровяные клетки.
115
пиросеквенирование, капиллярный электрофорез, гель-
114
117
сканирования, иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP),
анализа светового молекулярного разрыва для активности ДНК-
аденин-метилтрансферазы, хроматографического разделения,
117
сканирования, иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDIP),
анализа светового молекулярного разрыва для активности ДНК-
аденин-метилтрансферазы, хроматографического разделения,
118
хроматографии (HPLC), газовой хроматографии, масс-
118
хроматографии (HPLC), газовой хроматографии, масс-
119
спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований, анализа с использованием микрожидкостного чипа, выявления флуоресценции, выявления хемилюминесценции или их комбинаций.
119
спектрометрии (SIMS), радиоиммунологических исследований, анализа с использованием микрожидкостного чипа, выявления флуоресценции, выявления хемилюминесценции или их комбинаций.
120
120
121
заболевания или патологического состояния;
121
заболевания или патологического состояния;
122
специфическим для первого профиля относительно второго профиля;
122
специфическим для первого профиля относительно второго профиля;
123
патологическое состояние;
123
патологическое состояние;
124
более маркеров с) , присутствующих в третьем разностном множестве.
124
более маркеров с) , присутствующих в третьем разностном множестве.
125
профиля;
е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с) , присутствующих в третьем разностном множестве.
125
профиля;
е) идентификацию по меньшей мере одного из одного или более маркеров с) , присутствующих в третьем разностном множестве.
126
не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
126
не пораженных указанным заболеванием или патологическим состоянием, у пациента, имеющего указанное заболевание или патологическое состояние;
127
100. Способ по п. 99, в котором один или более маркеров
указанного заболевания или патологического состояния не
содержится в клеточном содержимом фагоцитарных клеток =2п.
127
100. Способ по п. 99, в котором один или более маркеров
указанного заболевания или патологического состояния не
содержится в клеточном содержимом фагоцитарных клеток =2п.
128
проба, фетальная кровь, промывная жидкость и текучая среда из шейки матки, интерстициальная жидкость или внутриглазная жидкость.
128
проба, фетальная кровь, промывная жидкость и текучая среда из шейки матки, интерстициальная жидкость или внутриглазная жидкость.
129
129
131
гена или их комбинации.
131
гена или их комбинации.
132
с микроматричным анализом (иммунопреципитации хроматина на
микрочипе), рестрикционно-ориентированного геномного
132
с микроматричным анализом (иммунопреципитации хроматина на
микрочипе), рестрикционно-ориентированного геномного
133
конформационного состояния одного или более маркеров.
133
конформационного состояния одного или более маркеров.
134
134
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 3
Взятие крови у пациента с раком легких
Взятие крови у пациента с раком легких
Фиг.4
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг.4
Мечение изобарическим Тад-А
Взятие крови у пациента с раком легких
Взятие крови у пациента с раком легких
Фиг.4
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг.4
Мечение изобарическим Тад-А
Взятие крови у пациента с раком легких
Взятие крови у пациента с раком легких
Фиг.4
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг.4
Мечение изобарическим Тад-А
Взятие крови у пациента с раком легких
Взятие крови у пациента с раком легких
Фиг.5
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг.5
Мечение изобарическим Тад-А
Взятие крови у пациента с раком легких
Взятие крови у пациента с раком легких
Фиг.5
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг.5
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг. 6
Фиг. 8
Фиг. 8
Взятие крови у пациента с раком яичников
Взятие крови у пациента с раком яичников
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
Взятие крови у пациента с раком яичников
Взятие крови у пациента с раком яичников
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
Взятие крови у пациента с раком яичников
Взятие крови у пациента с раком яичников
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
Взятие крови у пациента с раком яичников
Взятие крови у пациента с раком яичников
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
Взятие крови у пациента с раком яичников
Взятие крови у пациента с раком яичников
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
Фиг. 9
Мечение изобарическим Тад-А
12/30
Фиг.11
12/30
Фиг.11
12/30
Фиг.13
Фиг.14
Фиг.14
Фиг. 16
Фиг. 16
Фиг. 17
Фиг. 17
Фиг. 20
Фиг.19
Фиг. 20
Фиг.21
22/30
22/30
Фиг. 23
Фиг. 23
Фиг.24А
Фиг.24А
Фиг. 24В
Фиг. 24В
Фиг. 24С
Фиг. 24С
27/30
27/30
Фиг. 25
Фиг. 25
28/30
28/30
Фиг. 26
Фиг. 26
29/30
29/30
30/30
30/30