[**]

Изобретение относится к улучшенным вариантам единичного вариабельного домена DOM7h-14-10 иммуноглобулина против сывороточного альбумина, а также к лигандам и конъюгатам лекарственных средств, содержащим такие варианты, композициям, нуклеиновым кислотам, векторам и хозяевам.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к улучшенным вариантам единичного вариабельного домена DOM7h-14-10 иммуноглобулина против сывороточного альбумина, а также к лигандам и конъюгатам лекарственных средств, содержащим такие варианты, композициям, нуклеиновым кислотам, векторам и хозяевам.

---

Евразийское (21) 201390116 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/18 (2006.01)
2013.09.30 C12N15/13 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2011.08.12
(54) УЛУЧШЕННЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ ВАРИАНТЫ ПРОТИВ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА
(31) (32)
61/375,328
2010.08.20
(33) US
(86) PCT/EP2011/064000
(87) WO 2012/022703 2012.02.23
(88) 2012.04.26
(71) Заявитель: ГЛАКСОСМИТКЛАЙН ИНТЕЛЛЕКЧУАЛ ПРОПЕРТИ ДИВЕЛОПМЕНТ ЛИМИТЕД (GB)
(72) Изобретатель:
Де Анджелис Елена, Иневер Кэролин, Лю Хайцюнь, Пупека-Свидер Малгожата, Шон Оливер (GB)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(57) Изобретение относится к улучшенным вариантам единичного вариабельного домена DOM7h-14-10 иммуноглобулина против сывороточного альбумина, а также к лигандам и конъ-югатам лекарственных средств, содержащим такие варианты, композициям, нуклеиновым кислотам, векторам и хозяевам.
РСТ/ЕР2011/064000 МПК: С07К 16/18 (2006.01) C12N 15/13 (2006.01)
УЛУЧШЕННЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ ВАРИАНТЫ ПРОТИВ СЫВОРОТОЧНОГО
АЛЬБУМИНА
Изобретение относится к улучшенным вариантам единичного вариабельного домена DOM7h-14 иммуноглобулина против сывороточного альбумина, а также к лигандам и конъюгатам лекарственных средств, содержащим такие варианты, композициям, нуклеиновым кислотам, векторам и хозяевам.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В WO04003019 и WO2008/096158 раскрыты связывающие группировки против сывороточного альбумина (SA), такие как единичные вариабельные домены (dAb) иммуноглобулина против SA, которые имеют терапевтически полезные периоды полувыведения. В данных документах раскрыты мономерные dAb против SA, а также мультиспецифичные лиганды, содержащие такие dAb, например, лиганды, содержащие dAb против SA и dAb, которое специфично связывается с антигеном-мишенью, таким как TNFR1 (рецептор фактора некроза опухоли 1). Раскрыты связывающие группировки, которые специфично связываются с сывороточными альбуминами более чем одного вида, например, dAb против SA, перекрестно реагирующие с SA человека/мыши.
В WO05118642 и WO2006/059106 раскрыта идея конъюгирования или ассоциации связывающей группировки против SA, такой как единичный вариабельный домен иммуноглобулина против SA, с лекарственным средством для того, чтобы увеличить период полувыведения лекарственного средства. Раскрыты и приведены в качестве примеров белковые, пептидные лекарственные средства и лекарственные средства на основе NCE (новое химическое соединение). В WO2006/059106 раскрыто применение данной идеи для увеличения периода полувыведения инсулинотропных агентов, например, инкретиновых гормонов, таких как глюкагоноподобный пептид (GLP)-1.
Также делается ссылка на Holt et al, "Anti-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short-lived drugs", Protein Engineering, Design & Selection, vol. 21, no 5, pp283-288, 2008.
В WO2008/096158 раскрыт DOM7h-14, который представляет собой хороший dAb против SA. Было бы желательно предложить улучшенные dAb,
которые представляют собой варианты DOM7h-14 и которые специфично связываются с сывороточным альбумином, предпочтительно с альбуминами от человека и видов, не являющихся человеком, которые принесли бы пользу в животных моделях заболевания, а также для терапии и/или диагностики человека. Также было бы желательно предоставить выбор между связывающими группировками (dAb) против SA с относительно умеренной и высокой аффинностью. Такие группировки можно было бы связать с лекарственными средствами, причем связывающая группировка против SA была бы выбрана согласно рассматриваемому конечному применению. Это обеспечило бы лучшее приспособление лекарственного средства для лечения и/или предупреждения хронических или острых показаний, в зависимости от выбора связывающей группировки против SA. Для некоторых применений было бы желательным предложение dAb против SA, которые являются мономерными или по существу мономерными в растворе. Это было бы особенно полезным при связывании dAb против SA со связывающей группировкой, например, dAb, которое специфично связывается с рецептором поверхности клетки, таким как TNFR1, с целью антагонистического влияния на рецептор. Мономерное состояние dAb против SA является полезным для снижения вероятности перекрестного сшивания рецепторов, так как мультимеры, которые могли бы связываться и поперечно связывать рецепторы (например, TNFR1) на поверхности клетки, образуются с меньшей вероятностью, таким образом, увеличивая вероятность агонизма рецептора и вредной сигнализации от рецептора.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Улучшенные dAb против SA описаны в РСТ/ЕР2010/052008 и РСТ/ЕР2010/052007.
В одном аспекте согласно изобретению предложен единичный вариабельный домен иммуноглобулина против сывороточного альбумина (SA), выбранный из DOM7h-14-56 (SEQ ID NO: 72), DOM7h-14-65 (SEQ ID NO: 73), DOM7h-14-74 (SEQ ID NO: 74), DOM7h-14-76 (SEQ ID NO: 75), DOM7h-14-82 (SEQ ID NO: 76), DOM7h-14-100 (SEQ ID NO: 77), DOM7h-14-101 (SEQ ID NO: 78), DOM7h-14-109 (SEQ ID NO: 79), DOM7h-14-115 (SEQ ID NO: 80), DOM7h-14-116 (SEQ ID NO: 81), DOM7h-14-119 (SEQ ID NO: 82), DOM7h-14-120 (SEQ ID NO: 83), DOM7h-14-121 (SEQ ID NO: 84), DOM7h-14-122 (SEQ ID NO: 85) и
DOM7h-14-123 (SEQ ID NO: 86). В одном воплощении предложен вариант единичного вариабельного домена, который является идентичным указанному выбранному домену за исключением одного, двух, трех, четырех или пяти различий аминокислот.
В воплощениях любого аспекта изобретения предложены варианты DOM7h-14 с хорошими аффинностями против сывороточного альбумина. Выбор варианта может обеспечивать приспособление периода полувыведения согласно желательному терапевтическому и/или профилактическому назначению. Например, в одном воплощении аффинность варианта в отношении сывороточного альбумина является относительно высокой, так что вариант был бы полезным для включения в продукты, которые находят применение в лечении и/или предупреждении хронических или стойких заболеваний, состояний, токсичности или других хронических показаний. В одном воплощении аффинность варианта в отношении сывороточного альбумина является относительно умеренной, так что вариант был бы полезным для включения в продукты, которые находят применение в лечении и/или предупреждении острых заболеваний, состояний, токсичности или других острых показаний. В одном воплощении аффинность варианта в отношении сывороточного альбумина является промежуточной, так что вариант был бы полезным для включения в продукты, которые находят применение в лечении и/или предупреждении острых или хронических заболеваний, состояний, токсичности или других острых или хронических показаний.
Понятно, что молекула с подходяще высокой аффинностью и специфичностью в отношении сывороточного альбумина оставалась бы в системе кровообращения достаточно долго для того, чтобы оказать желательное терапевтическое действие (Tomlinson, Nature Biotechnology 22, 521 - 522 (2004)). Здесь высокоаффинный вариант против SA оставался бы в сыворотке системы кровообращения в течение периода времени, соответствующего таковому сывороточного альбумина для данного вида (WO2008096158). При попадании в систему кровообращения любой терапевтический агент, слитый с вариантом AlbudAb(tm) (AlbudAb представляет собой dAb против сывороточного альбумина или единичный вариабельный домен иммуноглобулина), будь это NCE, пептид или белок, впоследствии был бы способен дольше действовать на свою мишень и демонстрировать более
продолжительный терапевтический эффект. Это позволило бы оказывать направленное воздействие на хронические или стойкие заболевания без необходимости частой дозировки.
Вариант с умеренной аффинностью (но специфичный к SA) оставался бы в сыворотке системы кровообращения в течение лишь короткого времени (например, в течение нескольких часов или нескольких суток), обеспечивая специфичную адресную доставку терапевтических агентов, участвующих в (лечении) острых заболеваний посредством слитого терапевтического агента.
Таким образом, возможно приспособить продукт, содержащий (группировку) против SA, к применению в терапии заболевания путем выбора варианта против SA с подходящей аффинностью связывания альбумина и/или периодом полувыведения из сыворотки.
Одним из свойств доменных антител является то, что они могут существовать и связываться с мишенью в мономерной или димерной формах. В других воплощениях любого аспекта изобретения предложены варианты, которые являются мономерными или ди-, или мультимерными. Мономерное dAb может быть предпочтительным в отношении определенных мишеней или показаний, когда оно является полезным для предупреждения поперечного связывания мишени (например, когда мишень представляет собой рецептор поверхности клетки, такой как рецепторная тирозинкиназа, например, TNFR1). В некоторых случаях связывание в виде димера или мультимера могло бы вызвать поперечное связывание рецепторов на поверхности клетки, увеличивая, таким образом, вероятность агонизма рецептора и вредной сигнализации от рецептора. В качестве альтернативы, dAb, которое образует димер, может быть предпочтительным для обеспечения поперечного связывания мишени или для улучшенного связывания посредством, например, эффекта авидности, стабильности или растворимости.
Для определенных подходов по адресной доставке, включающих мультидоменную конструкцию, может быть предпочтительным применение мономерного dAb, например, когда следует получить молекулу с адресованием к двум мишеням, такую как dAb-AlbudAb(tm), где AlbudAb связывается с сывороточным альбумином, как описано выше, так как димеризация dAb может, например, приводить к образованию белковых агрегатов с высокой молекулярной массой.
Согласно одному аспекту изобретения предложен мультиспецифичный лиганд, содержащий любой вариант против SA, как описано выше, и связывающую группировку, которая специфично связывается с антигеном-мишенью, отличным от SA.
Согласно одному аспекту изобретения предложен слитый продукт, например, слитый белок или слияние с пептидным лекарственным средством или лекарственным средством на основе NCE (новое химическое соединение), включающий полипептидное, белковое, пептидное лекарственное средство или лекарственное средство на основе NCE, слитое или конъюгированное (для NCE) с любым вариантом, как описано выше. Подходящим образом, при слиянии или конъюгировании с партнером наблюдается лишь умеренное падение аффинности варианта в отношении его партнера связывания, делая его полезным в слитых продуктах. В одном воплощении согласно изобретению предложен слитый белок, содержащий полипептидное или пептидное лекарственное средство, слитое с единичным вариабельным доменом согласно изобретению, возможно, где вариант или группировка представляет собой DOM7h-14-100 (SEQ ID NO: 77). В другом воплощении согласно изобретению предложен единичный вариабельный домен против SA по изобретению, где вариабельный домен конъюгирован с лекарственным средством (возможно с лекарственным средством на основе NCE), возможно, где вариабельный домен или группировка представляет собой DOM7h-14-100 (SEQ ID NO: 77).
Согласно одному аспекту изобретения предложена композиция, содержащая вариант, слитый продукт, белок или лиганд по любому предшествующему аспекту и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, эксципиент или наполнитель.
Согласно одному аспекту изобретения предложен слитый полипептид или конъюгат, содержащий dAb против сывороточного альбумина, как раскрыто здесь, и инкретин или инсулинотропный агент, например, эксендин-4, GLP-1(7-37), GLP-1(6-36) или любой инкретин или инсулинотропный агент, раскрытый в WO06/059106, причем данные агенты прямо включены сюда посредством ссылки, как если бы они были включены в настоящее изобретение и приведенную ниже формулу изобретения.
В другом аспекте согласно изобретению предложен мультиспецифичный лиганд, содержащий единичный вариабельный домен против SA по указанному
другому аспекту и связывающую группировку, которая специфично связывается с антигеном-мишенью, отличным от SA.
Согласно изобретению предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую единичный вариабельный домен, мультиспецифичный лиганд или слитый белок, как описано согласно любому аспекту изобретения.
Согласно изобретению предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 87-101, или нуклеотидную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной указанной выбранной последовательности. Согласно изобретению предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, или выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор.
Согласно одному аспекту изобретения предложен способ лечения или предупреждения заболевания или расстройства у пациента, включающий введение указанному пациенту по меньшей мере одной дозы варианта, лиганда, слитого продукта, белка или композиции согласно любому аспекту или воплощению изобретения. Согласно другому аспекту предложен вариант, лиганд, мультиспецифичный лиганд, слитый продукт, слитый белок, белок или композиция согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1: выравнивание аминокислотных последовательностей вариантов dAb DOM7h-14, описанных в РСТ/ЕР2010/052007. Символ "." в конкретном положении указывает такую же аминокислоту, которая находится в этом положении у DOM7h-14. CDR обозначены подчеркиванием и текстом, набранным жирным шрифтом (первая подчеркнутая последовательность представляет собой CDR1, вторая подчеркнутая последовательность представляет собой CDR2, и третья подчеркнутая последовательность представляет собой CDR3).
Фиг. 2: кинетические параметры вариантов DOM7h-14. Единицы KD выражены в нМ; единицы Kd выражены в с"1; единицы Ка выражены в М"1 с"1. Обозначение А е-В означает А х 10"в, и С е D означает С х 10°. Указаны общие кинетические интервалы у разных видов, как подтверждается примерами, приведенными ниже. Также приведены возможные интервалы для применения
в конкретных тепаревтических ситуациях (острые или хронические показания, состояния или заболевания и "промежуточные" для применения как в хронических, так и в острых ситуациях). Высокоаффинные dAb и содержащие их продукты являются полезными для хронических ситуаций. dAb средней аффинности и содержащие их продукты являются полезными для промежуточных ситуаций. dAb с низкой аффинностью и содержащие их продукты являются полезными для острых ситуаций. Аффинность в этом отношении представляет собой аффинность в отношении сывороточного альбумина. Перечислены различные примеры dAb против сывороточного альбумина и слитых белков, и это поддерживает раскрытые интервалы. Многие из примеров имеют благоприятную кинетику у человека и одного или более чем одного животного, не являющегося человеком (напимер, у человека и яванского макака и/или мыши). Выбор dAb или содержащего его продукта можно приспособить, согласно изобретению, в зависимости от ситуации (например, хроническая или острая), подлежащей терапевтическому лечению.
Фиг. 3: выравнивание аминокислотных последовательностей для вариантов dAb DOM7h-14-10, описанных здесь.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В пределах данного описания изобретение было описано со ссылкой на воплощения таким способом, который обеспечивает написание ясного и краткого описания. Подразумевается и следует понимать, что воплощения можно комбинировать или разделять разными способами без отступления от изобретения.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, употребляемые здесь, имеют то же самое значение, которое обычно понятно специалисту в данной области (например, в области клеточных культур, молекулярной генетики, химии нуклеиновых кислот, методиках гибридизации и биохимии). Стандартные методики используются для молекулярных, генетических и биохимических способов (см., в общем, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. и Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc., которые включены сюда посредством ссылки) и химических способов.
"Пациент" представляет собой любое животное, например, млекопитающее, например, примата, не являющегося человеком (такого как павиан, макак-резус или яванский макак), мышь, человека, кролика, крысу, собаку, кошку или свинью. В одном воплощении пациентом является человек.
Употребляемый здесь термин "антитело" относится к IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или фрагменту (такому как Fab, Fab', F(ab')2, Fv, связанный дисульфидной связью Fv, scFv, мультиспецифичное антитело с закрытой конформацией, связанный дисульфидной связью scFv, диатело), независимо от того, происходит ли оно от любого вида, продуцирующего антитело в природе, или создано по технологии рекомбинантной ДНК; выделено ли оно из сыворотки, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий.
Употребляемый здесь термин "формат антитела" относится к любой подходящей полипептидной структуре, в которую может быть включен один или более чем один вариабельный домен антитела так, чтобы придать структуре специфичность связывания в отношении антигена. В данной области известен целый ряд подходящих форматов антител, таких как химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифичные антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей, антигенсвязывающие фрагменты любого из вышеупомянутых (например, фрагмент Fv (например, одноцепочечный Fv (scFv), связанный дисульфидной связью Fv), фрагмент Fab, фрагмент Fab', фрагмент F(ab')2), единичный вариабельный домен антитела (например, dAb, VH, VHH, VL) И модифицированные версии любого из вышеупомянутых (например, модифицированные ковалентным присоединением полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера или гуманизированного VHH)-
Фраза "единичный вариабельный домен иммуноглобулина" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL), который специфично связывается с антигеном или эпитопом, независимо от других V областей или доменов. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина может быть представлен в формате (например, гомо- или гетеромультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, когда другие области или домены не требуются для связывания антигена единичным вариабельным доменом иммуноглобулина (т.е. когда единичный вариабельный
домен иммуноглобулина связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). "Доменное антитело" или "dAb" представляет собой то же самое, что и термин "единичный вариабельный домен иммуноглобулина", употребляемый здесь. "Единичный вариабельный домен иммуноглобулина" представляет собой то же самое, что и термин "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен", употребляемый здесь. "Единичный вариабельный домен антитела" или "антительный единичный вариабельный домен" представляет собой то же самое, что и термин "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен" употребляемый здесь. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина в одном воплощении представляет собой вариабельный домен человеческого антитела, но также включает единичные вариабельные домены антитела из других видов, таких как грызуны (например, как раскрыто в WO 00/29004, содержание которой включено сюда посредством ссылки во всей ее полноте), акула-нянька и VHH dAb верблюдовых. VHH верблюдовых представляют собой полипептиды единичного вариабельного домена иммуноглобулина, которые происходят от видов, включающих верблюда, ламу, альпака, одногорбого верблюда и гуанако, которые продуцируют антитела из тяжелых цепей, естественным образом лишенные легких цепей. VHH могут быть гуманизированы.
"Домен" представляет собой свернутую белковую структуру, которая имеет третичную структуру, независимо от остальной части белка. Обычно домены ответственны за дискретные функциональные свойства белков и, во многих случаях, могут быть добавлены, удалены или перенесены на другие белки без потери функции остальной части белка и/или домена. "Единичный вариабельный домен антитела" представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности, характерные для вариабельных доменов антитела. Он, следовательно, включает полные вариабельные домены антитела и модифицированные вариабельные домены, например, в которых одна или более чем одна петля была заменена последовательностями, которые не являются характерными для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые были укорочены или содержат N- или С-концевые удлинения, а также свернутые фрагменты
вариабельных доменов, которые сохраняют по меньшей мере активность связывания и специфичность полноразмерного домена.
В настоящей заявке термин "предупреждение" и "предупредительный" включает введение защитной композиции перед индукцией заболевания или состояния. "Лечение" и "лечащий" включает введение защитной композиции после проявления симптомов заболевания или состояния. "Подавление" или "подавляющий" относится к введению композиции после индуктивного события, но до клинического проявления заболевания или состояния.
Термин "доза", употребляемый здесь, относится к количеству лиганда, введенного субъекту целиком в одно время (единичная доза) или за два или более чем два введения на протяжении определенного интервала времени. Например, "доза" может относиться к количеству лиганда (например, лиганд, содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, который связывается с антигеном-мишенью), введенного субъекту в течение одних суток (24 часа) (ежесуточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более чем одного месяца (например, посредством одного введения или двух или более чем двух введений). Интервалом между дозами может быть любое желательное количество времени. Термин "фармацевтически эффективный", когда он относится к дозе, означает достаточное количество лиганда, домена или фармацевтически активного агента для обеспечения желательного эффекта. Количество, которое является "эффективным", будет варьировать от субъекта к субъекту, в зависимости от возраста и общего состояния индивидуума, конкретного лекарственного средства или фармацевтически активного агента и тому подобного. Таким образом, не всегда возможно установить точное "эффективное" количество, применимое для всех пациентов. Однако подходящая "эффективная" доза в любом индивидуальном случае может быть определена специалистом в данной области общепринятым экспериментированием.
Способы фармакокинетического анализа и определения периода полувыведения лиганда (например, единичного вариабельного домена, слитого белка или мультиспецифичного лиганда) будут знакомы специалистам в данной области. Подробности можно найти в Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists и в Peters et al, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Также делается ссылка на
"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, опубликованную Marcel Dekker, 2 Rev. ex edition (1982), в которой описаны фармакокинетические параметры, такие как периоды полувыведения t альфа и t бета и площадь под кривой (AUC). Возможно, все фармакокинетические параметры и значения, процитированные здесь, следует читать как значения у человека. Возможно, все фармакокинетические параметры и значения, процитированные здесь, следует читать как значения у мыши или крысы или яванского макака.
Периоды полувыведения (t% альфа и t% бета) и AUC можно определять из кривой концентрации лиганда в сыворотке относительно времени. Для моделирования кривой можно использовать, например, пакет программ для анализа WinNonlin, например, версию 5.1 (доступную от Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, США). При использовании двухкомпартментного моделирования, в первой фазе (альфа фаза) лиганд претерпевает главным образом распределение в организме пациента с некоторым выведением. Вторая фаза (бета фаза) представляет собой фазу, когда лиганд был распределен, и концентрация в сыворотке снижается по мере того, как лиганд выводится из организма пациента. Период полувыведения t альфа представляет собой период полувыведения первой фазы, и период полувыведения t бета представляет собой период полувыведения второй фазы. Таким образом, в одном воплощении в контексте настоящего изобретения вариабельный домен, слитый белок или лиганд имеет период полувыведения ta в интервале (или примерно) 15 минут или более. В одном воплощении нижней границей интервала является (или является примерно) 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 10 часов, 11 часов или 12 часов. Кроме того, или альтернативно, вариабельный домен, слитый белок или лиганд согласно изобретению будут иметь период полувыведения ta в интервале вплоть до и включая 12 часов (или примерно 12 часов). В одном воплощении верхней границей интервала является (или является примерно) 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 часов. Примером подходящего интервала является (или является примерно) от 1 до 6 часов, от 2 до 5 часов или от 3 до 4 часов.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен вариабельный домен, слитый белок или лиганд согласно изобретению, который имеет период полувыведения t(3 в интервале (или примерно) 2,5 часов или
более. В одном воплощении нижней границей интервала является (или является примерно) 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 10 часов, 11 часов или 12 часов. Кроме того, или альтернативно, период полувыведения t(3 составляет (или составляет примерно) вплоть до и включая 21 или 25 суток. В одном воплощении верхней границей интервала является (или является примерно) 12 часов, 24 часа, 2 суток, 3 суток, 5 суток, 10 суток, 15 суток, 19 суток, 20 суток, 21 сутки или 22 дня. Например, вариабельный домен, слитый белок или лиганд согласно изобретению будет иметь период полувыведения t(3 в интервале от 12 до 60 часов (или примерно от 12 до 60 часов). В другом воплощении он будет находиться в интервале от 12 до 48 часов (или примерно от 12 до 48 часов). В другом воплощении он будет находиться в интервале от 12 до 26 часов (или примерно от 12 до 26 часов).
В качестве альтернативы применению двухкомпартментного моделирования, специалист будет знаком с применением некомпартментного моделирования, которое можно применять для определения конечных периодов полувыведения (в данном отношении употребляемый здесь термин "конечный период полувыведения" означает конечный период полувыведения, определенный посредством некомпартментного моделирования). Для моделирования кривой этим способом можно использовать, например, программное обеспечение для анализа WinNonlin, например, версию 5.1 (доступную от Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, США). В данном случае в одном воплощении единичный вариабельный домен, слитый белок или лиганд имеет конечный период полувыведения по меньшей мере (или по меньшей мере примерно) 8 часов, 10 часов, 12 часов, 15 часов, 28 часов, 20 часов, 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 7 суток, 14 суток, 15 суток, 16 суток, 17 суток, 18 суток, 19 суток, 20 суток, 21 сутки, 22 дня, 23 дня, 24 дня или 25 суток. В одном воплощении верхняя граница данного интервала составляет (или составляет примерно) 24 часа, 48 часов, 60 часов или 72 часа, или 120 часов. Например, конечный период полувыведения составляет (или составляет примерно) от 8 часов до 60 часов, или от 8 часов до 48 часов, или от 12 до 120 часов, например, у человека.
Кроме того или альтернативно приведенным выше критериям, вариабельный домен, слитый белок или лиганд согласно изобретению имеет значение AUC (площадь под кривой) в интервале (или примерно) 1 мг.мин/мл
или более. В одном воплощении нижняя граница интервала составляет (или составляет примерно) 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 или 300 мг.мин/мл. Кроме того или альтернативно, вариабельный домен, слитый белок или лиганд согласно изобретению имеет AUC в интервале (или примерно) вплоть до 600 мг.мин/мл. В одном воплощении верхняя граница интервала составляет (или составляет примерно) 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 или 50 мг.мин/мл. Преимущественно вариабельный домен, слитый белок или лиганд будут иметь AUC в (или примерно в) интервале, выбранном из группы, состоящей из следующих: от 15 до 150 мг.мин/мл, от 15 до 100 мг.мин/мл, от 15 до 75 мг.мин/мл и от 15 до 50 мг.мин/мл.
"Поверхностный плазмонный резонанс": конкурентные анализы можно использовать для определения того, конкурирует ли специфичный антиген или эпитоп, такой как человеческий сывороточный альбумин, с другим антигеном или эпитопом, таким как сывороточный альбумин яванского макака, за связывание с описанным здесь лигандом, связывающим сывороточный альбумин, таким как специфичное dAb. Аналогично конкурентные анализы можно использовать для определения того, конкурирует ли первый лиганд, такой как dAb, со вторым лигандом, таким как dAb, за связывание с антигеном-или эпитопом-мишенью. Термин "конкурирует", употребляемый здесь, относится к веществу, такому как молекула, соединению, предпочтительно белку, которое способно препятствовать, в любой степени, специфичному связывающему взаимодействию между двумя или более чем двумя молекулами. Фраза "не ингибирует конкурентно" означает, что вещество, такое как молекула, соединение, предпочтительно белок, не препятствует в какой-либо измеримой или значительной степени специфичному связывающему взаимодействию между двумя или более чем двумя молекулами. Специфичное связывающее взаимодействие между двумя или более чем двумя молекулами предпочтительно включает специфичное связывающее взаимодействие между единичным вариабельным доменом и его штатным партнером или мишенью. Препятствующая или конкурирующая молекула может быть другим единичным вариабельным доменом, или она может быть молекулой, которая структурно и/или функционально аналогична когнатному партнеру или мишени.
Термин "связывающая группировка" относится к домену, который специфично связывает антиген или эпитоп, независимо от другого домена,
связывающего эпитоп или антиген. Связывающая группировка может быть доменным антителом (dAb) или может быть доменом, который является производным неиммуноглобулинового белкового каркаса, например, каркаса, выбранного из группы, состоящей из: CTLA-4 (антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов), липокалина, SpA (стромозащитный антигенный комплекс), аффитела, авимера, GroEl, трансферрина, GroES и фибронектина, которая связывается с лигандом, отличным от природного лиганда (в случае настоящего изобретения группировка связывается с сывороточным альбумином). См. WO2008/096158, в котором раскрыты примеры белковых каркасов и способы отбора антиген- или эпитоп-специфичных связывающих доменов из репертуаров (смотрите Примеры 17-25). Эти конкретные описания WO2008/096158 специально включены сюда посредством ссылки, как если бы они были детально описаны здесь, для применения в настоящем изобретении, и имеется в виду, что любая часть такого описания может быть включена здесь в один или более чем один пункт формулы изобретения.
В одном воплощении вариант или связывающая группировка согласно любому аспекту или воплощению изобретения имеет одну или более чем одну из следующих кинетических характеристик:
(а) вариант или группировка содержит сайт связывания, который
специфично связывает человеческий SA с константой диссоциации (KD) от (или
от примерно) 0,1 до (или до примерно) 10000 нМ, возможно от (или от
примерно) 1 до (или до примерно) 6000 нМ при определении поверхностным
плазмонным резонансом;
(б) вариант или группировка содержит сайт связывания, который
специфично связывает человеческий SA с константой скорости диссоциации
(Kd) от (или от примерно) 1,5 х 10"4 до (или до примерно) 0,1 с"1, возможно от
(или от примерно) 3 х 10"4 до (или до примерно) 0,1 с"1 при определении
поверхностным плазмонным резонансом;
(в) вариант или группировка содержит сайт связывания, который
специфично связывает человеческий SA с константой скорости ассоциации (Ка)
от (или от примерно) 2 х 106 до (или до примерно) 1 х 104 М"1с"1, возможно от
(или от примерно) 1 х 106 до (или до примерно) 2 х 104 М"1с"1 при определении
поверхностным плазмонным резонансом;
(г) вариант или группировка содержит сайт связывания, который
специфично связывает SA яванского макака с константой диссоциации (KD) от
(или от примерно) 0,1 до (или до примерно) 10000 нМ, возможно от (или от
примерно) 1 до (или до примерно) 6000 нМ при определении поверхностным
плазмонным резонансом;
(д) вариант или группировка по любому из предшествующих пунктов, где
вариант содержит сайт связывания, который специфично связывает SA
яванского макака с константой скорости диссоциации (Kd) от (или от примерно)
1,5 х 10"4 до (или до примерно) 0,1 с"1, возможно от (или от примерно) 3 х 10"4 до
(или до примерно) 0,1 с"1 при определении поверхностным плазмонным
резонансом;
(е) вариант или группировка по любому из предшествующих пунктов, где
вариант содержит сайт связывания, который специфично связывает SA
яванского макака с константой скорости ассоциации (Ка) от (или от примерно) 2
х 106 до (или до примерно) 1 х 104 М"1с"1, возможно от (или от примерно) 1 х 106
до (или до примерно) 5 х 103 М"1с"1 при определении поверхностным
плазмонным резонансом;
(ж) вариант или группировка содержит сайт связывания, который
специфично связывает крысиный SA с константой диссоциации (KD) от (или от
примерно) 1 до (или до примерно) 10000 нМ, возможно от (или от примерно) 20
до (или до примерно) 6000 нМ при определении поверхностным плазмонным
резонансом;
(з) вариант или группировка содержит сайт связывания, который
специфично связывает крысиный SA с константой скорости диссоциации (Kd) от
(или от примерно) 2 х 10"3 до (или до примерно) 0,15 с"1, возможно от (или от
примерно) 9 х 10"3 до (или до примерно) 0,14 с"1 при определении
поверхностным плазмонным резонансом;
(и) вариант или группировка содержит сайт связывания, который
специфично связывает крысиный SA с константой скорости ассоциации (Ка) от
(или от примерно) 2 х 106 до (или до примерно) 1 х 104 М"1с"1, возможно от (или
от примерно) 1 х 106 до (или до примерно) 3 х 104 М"1с"1 при определении
поверхностным плазмонным резонансом;
(й) вариант или группировка содержит сайт связывания, который специфично связывает мышиный SA с константой диссоциации (KD) от (или от
примерно) 1 до (или до примерно) 10000 нМ при определении поверхностным плазмонным резонансом;
(к) вариант или группировка содержит сайт связывания, который специфично связывает мышиный SA с константой скорости диссоциации (Kd) от (или от примерно) 2 х 10"3 до (или до примерно) 0,15 с"1 при определении поверхностным плазмонным резонансом; и/или
(л) вариант или группировка содержит сайт связывания, который специфично связывает мышиный SA с константой скорости ассоциации (Ка) от (или от примерно) 2 х 106 до (или до примерно) 1 х 104 М"1с"1, возможно от (или от примерно) 2 х 106 до (или до примерно) 1,5 х 104 М"1с"1 при определении поверхностным плазмонным резонансом;
Возможно, вариант или группировка имеет
I: KD согласно (а) и (г), Kd согласно (б) и (д) и Ка согласно (в) и (е); или II: KD согласно (а) и (ж), Kd согласно (б) и (з) и Ка согласно (в) и (и); или III: KD согласно (а) и (й), Kd согласно (б) и (к) и Ка согласно (в) и (л); или IV: кинетику согласно I и II; или V: кинетику согласно I и III; или VI: кинетику согласно I, II и III.
Согласно изобретению также предложен лиганд, содержащий вариант или группировку по любому предшествующему аспекту или воплощению изобретения. Например, лигандом может быть лиганд с двойной специфичностью (см. WO04003019 для примеров лигандов с двойной специфичностью). В одном аспекте согласно изобретению предложен мультиспецифичный лиганд, содержащий вариант против SA или группировку по любому предшествующему аспекту или воплощению изобретения и дополнительную связывающую группировку, которая специфично связывается с антигеном-мишенью, отличным от SA. Одна или каждая связывающая группировка может представлять собой любую связывающую группировку, которая специфично связывается с мишенью, например, группировка представляет собой антитело, фрагмент антитела, scFv, Fab, dAb или связывающую группировку, содержащую неиммуноглобулиновый белковый каркас. Такие группировки подробно раскрыты в WO2008/096158 (см. примеры 17-25, причем данное описание включено сюда посредством ссылки).
Примерами неиммуноглобулиновых каркасов являются CTLA-4, липокалин, стафилококковый белок A (spA), Affibody(tm), Avimers(tm), GroEL и фибронектин.
В одном воплощении предложен линкер между связывающей группировкой против мишени и одним вариантом или группировкой против SA, указанный линкер содержит аминокислотную последовательность AST, возможно, ASTSGPS, например, когда используются dAb против SA и против мишени. Альтернативные линкеры описаны в WO2007085814 (включенном сюда посредством ссылки) и WO2008/096158 (см. отрывок на странице 135, строка 12, до страницы 140, строка 14, причем данное описание и все последовательности линкеров специально включены сюда посредством ссылки, как если бы они были детально описаны здесь, для применения в настоящем изобретении, и имеется в виду, что любая часть такого описания может быть включена здесь в один или более чем один пункт формулы изобретения) и WO2009/068649.
В одном воплощении мультиспецифичного лиганда антиген-мишень может быть или является частью полипептидов, белков или нуклеиновых кислот, которые могут быть встречающимися в природе или синтетическими. В данном отношении лиганд по изобретению может связываться с антигеном-мишенью и действовать как антагонист или агонист (например, агонист рецептора ЕРО (эритропоэтин)). Специалист в данной области поймет, что выбор является большим и разнообразным. Они могут представлять собой, например, человеческие или животные белки, цитокины или факторы роста, цитокиновые рецепторы или рецепторы факторов роста, где цитокиновые рецепторы включают рецепторы цитокинов, ферменты, кофакторы ферментов или ДНК-связывающие белки. Употребляемый здесь термин "антагонист рецептора 1 фактора некроза опухолей (TNFR1)" или "антагонист против TNFR1" или тому подобное, относится к агенту (например, молекуле, соединению), которая связывается с TNFR1 и может ингибировать (т.е. одну или более чем одну) функцию TNFR1. Например, антагонист TNFR1 может ингибировать связывание TNF альфа с TNFR1 и/или ингибировать трансдукцию сигнала, опосредованную через TNFR1. Соответственно, процессы и клеточные ответы, опосредованные TNFR1 (например, гибель клеток, индуцированная TNF альфа, в стандартном анализе цитотоксичности L929), могут ингибироваться антагонистом TNFR1.
В одном воплощении мультиспецифичный лиганд содержит вариант dAb или группировку против SA по изобретению и связывающую группировку против TNFR1, например, dAb против TNFR1. Возможно, лиганд имеет только одну связывающую группировку против TNFR1 (например, dAb) для снижения вероятности поперечного связывания рецептора. dAb против TNFR1 описаны, например, в WO2006/038027, WO2007/049017, WO2008149148 и WO2010/081787 (аминокислотные последовательности которых и нуклеотидные последовательности которых, как раскрыто в данных заявках РСТ, специально включены сюда посредством ссылки, как если бы они были детально описаны здесь, для применения в настоящем изобретении, и имеется в виду, что любая часть такого описания может быть включена здесь в один или более чем один пункт формулы изобретения).
В одном воплощении лиганд по изобретению представляет собой слитый белок, содержащий вариант или группировку по изобретению, слитую прямо или не прямо с одним или более чем одним полипептидом. Например, слитым белком может быть "слитое лекарственное средство", как раскрыто в WO2005/118642 (описание которого включено сюда посредством ссылки), содержащее вариант или группировку по изобретению и полипептидное лекарственное средство, как определено в данной заявке РСТ.
Употребляемый здесь термин "лекарственное средство" относится к любому соединению (например, маленькой органической молекуле, нуклеиновой кислоте, полипептиду), которое можно вводить индивидууму для получения полезного терапевтического или диагностического эффекта через связывание с биологической молекулой-мишенью и/или изменение функции биологической молекулы-мишени у индивидуума. Молекула-мишень может быть эндогенной молекулой-мишенью, кодируемой геномом индивидуума (например, фермент, рецептор, фактор роста, цитокин, кодируемый геномом индивидуума), или экзогенной молекулой-мишенью, кодируемой геномом патогена (например, фермент, кодируемый геномом вируса, бактерии, грибка, нематоды или другого патогена). Подходящие лекарственные средства для применения в слитых белках и конъюгатах, содержащих вариант dAb против SA по изобретению, раскрыты в WO2005/118642 и WO2006/059106 (полные описания которых включены сюда посредством ссылки, включая полный список конкретных лекарственных средств, как если бы данный список был детально
описан здесь, и имеется ввиду, что такое включение предоставляет описание конкретных лекарственных средств для включения в формулу изобретения). Например, лекарственное средство может быть глюкагоноподобным пептидом 1 (GLP-1) или вариантом, интерфероном альфа 2Ь или вариантом, или эксендином-4 или вариантом.
В одном воплощении согласно изобретению предложен конъюгат лекарственного средства, как определено и раскрыто в WO2005/118642 и WO2006/059106, где конъюгат содержит вариант или группировку по изобретению. В одном примере лекарственное средство ковалентно связано с вариантом или группировкой (например, вариант или группировка и лекарственное средство экспрессируются как часть одного полипептида). В качестве альтернативы, в одном примере лекарственное средство связано или ассоциировано с вариантом или группировкой не ковалентно. Лекарственное средство может быть ковалентно или не ковалентно связанным с вариантом или группировкой, прямо или не прямо (например, через подходящий линкер и/или нековалентное связывание партнеров комплементарного связывания (например, биотин и авидин)). При использовании партнеров комплементарного связывания, один из партнеров связывания может быть ковалентно связан с лекарственным средством непосредственно либо через группировку подходящего линкера, и партнер комплементарного связывания может быть ковалентно связанным с вариантом или группировкой прямо либо через группировку подходящего линкера. Когда лекарственное средство является полипептидом или пептидом, композиция лекарственного средства может представлять собой слитый белок, где полипептидное или пептидное лекарственное средство и полипептидная связывающая группировка представляют собой дискретные части (группировки) непрерывной полипептидной цепи. Как описано здесь, полипептидные связывающие группировки и полипептидные лекарственные группировки могут быть непосредственно связаны друг с другом через пептидную связь или связаны через подходящий аминокислотный или пептидный, или полипептидный линкер.
Лиганд, который содержит один вариант единичного вариабельного домена (мономера) или группировку по изобретению или более чем один единичный вариабельный домен или группировку (мультимер, слитый белок,
конъюгат и лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), который специфично связывается с сывороточным альбумином, может дополнительно содержать одно или более чем одно соединение, выбранное из, но предпочтительно без ограничения, маркера, метки, дополнительного единичного вариабельного домена, dAb, антитела, фрагмента антитела, маркера и лекарственного средства. Одно или более чем одно из этих соединений может находиться либо на СООН-конце, либо на N-конце, либо как на N-конце, так и на СООН-конце лиганда, содержащего единичный вариабельный домен или группировку (или иммуноглобулин, или неиммуноглобулиновый единичный вариабельный домен). Одно или более чем одно из этих соединений может быть локализовано либо на СООН конце, либо на N-конце, либо как на N-конце, так и на СООН-конце единичного вариабельного домена или группировки, которая специфично связывается с сывороточным альбумином лиганда, который содержит один единичный вариабельный домен (мономер) или группировку или более чем один единичный вариабельный домен или группировку (мультимер, слитый белок, конъюгат и лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь). Неограничивающие примеры меток, которые можно размещать на одном или на обоих из этих концов, включают НА (гемагглютинин), His или туе метку. С лигандом могут быть связаны соединения, включающие одну или более чем одну метку и лекарственные средства, которые содержат один единичный вариабельный домен (мономер) или более чем один единичный вариабельный домен или группировку (мультимер, слитый белок, конъюгат и лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), которые связываются с сывороточным альбумином, либо непосредственно, либо через линкеры, как описано выше.
В объем изобретения также включена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая любой из вариантов, группировок, слитых белков, конъюгатов или лигандов, описанных здесь, например, лиганд, который содержит один вариант единичного вариабельного домена (мономер) по изобретению или более чем один вариант единичного вариабельного домена (например, мультимер, слитый белок, конъюгат и лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), который специфично связывается с сывороточным альбумином, или который специфично связывается и с человеческим сывороточным альбумином, и по меньшей мере с одним сывороточным альбумином, не являющимся
человеческим, или их функционально активные фрагменты. В объем изобретения также включены вектор и/или экспрессионный вектор, клетка-хозяин, содержащая вектор, например, растительная или животная клетка и/или линия клеток, трансформированная вектором, способ экспрессии и/или получения одного или более чем одного варианта, группировки, слитого белка или лиганда, которые содержат один вариант единичного вариабельного домена (мономер) или группировку, или более чем один вариант единичного вариабельного домена или группировки (например, мультимер, слитый белок, конъюгат и лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), который специфично связывается с сывороточным альбумином, или его фрагмент(ты), кодируемый(е) указанными векторами, включая в некоторых случаях культивирование клетки-хозяина так, чтобы экспрессировался один или более чем один вариант, группировка, слитый белок или лиганд, или их фрагменты, и возможно выделение лиганда, который содержит один единичный вариабельный домен или группировку (мономер) или более чем один единичный вариабельный домен или группировку (например, мультимер, слитый белок, конъюгат и лиганд с двойной специфичностью, как определено здесь), который специфично связывается с сывороточным альбумином, из культуральной среды клетки-хозяина. В объем изобретения также включены способы приведения в контакт описанного здесь лиганда с сывороточным альбумином, включая (человеческий) сывороточный альбумин и/или сывороточный(ые) альбумин(ы), не являющийся(щееся) человеческим, и/или одной или более чем одной мишенью, отличной от сывороточного альбумина, где мишени включают биологически активные молекулы и включают животные белки, цитокины, как перечислено выше, и включают способы, когда приведение в контакт осуществляется in vitro, а также введение любого из описанных здесь вариантов, группировок, слитых белков или лигандов индивидуальному животному-хозяину или в клетку in vivo и/или ex vivo. Предпочтительно введение описанных здесь лигандов, которые содержат единичный вариабельный домен (иммуноглобулиновый или неиммуноглобулиновый), направленный на сывороточный альбумин и/или сывороточный(ые) альбумин(ы), не являющийся(щееся) человеческими, и один или более чем один домен, направленный на одну или более чем одну мишень, отличную от сывороточного альбумина, будет увеличивать период
полувыведения, включая Т бета и/или конечный период полувыведения лиганда против мишени. Здесь рассмативаются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие варианты, слитые белки или лиганды, содержащие единичный домен, или их фрагменты, включающие их функциональные фрагменты. Здесь рассматриваются векторы, кодирующие молекулы нуклеиновой кислоты, включающие, но предпочтительно без ограничения, экспрессионные векторы, а также клетки-хозяева из линии клеток или организма, содержащего один или более чем один из данных экспрессионных векторов. Также рассматриваются способы получения любого варианта, слитого белка или лиганда, включающего, но предпочтительно не ограничивающегося любой из вышеупомянутых нуклеиновых кислот, векторов и клеток-хозяев.
Согласно одному аспекту изобретения предложена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант согласно изобретению или мультиспецифичный лиганд по изобретению, или слитый белок по изобретению;
или нуклеотидную последовательность, которая является по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичной указанной выбранной последовательности.
Согласно одному аспекту изобретения предложен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по изобретению. Согласно одному аспекту изобретения предложена выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор.
Делается ссылка на WO2008/096158 относительно подробностей систем библиотек векторов, объединения единичных вариабельных доменов, характеристики лигандов с двойной специфичностью, структуры лигандов с двойной специфичностью, каркасов для применения в конструировании лигандов с двойной специфичностью, применений dAb против сывороточного альбумина и мультиспецифичных лигандов и лигандов, увеличивающих период полувыведения, и композиций и препаратов, содержащих dAb против сывороточного альбумина. Данные описания включены сюда посредством ссылки для предложения руководства для применения в настоящем изобретении, включая варианты, группировки, лиганды, слитые белки, конъюгаты, нуклеиновые кислоты, векторы, хозяев и композиции по настоящему изобретению.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
Таблица 1: аминокислотные последовательности вариантов dAb DOM7h-14
DOM7h-14-10 (SEQ ID NO: 1)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTiTCRASQWiGSQLSVWQQKPGKAPKLLiMWRSSLQSG VP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKR DOM7h-l4-18 (SEQ ID N0:2 )
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQISWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSG
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLMKPMTFGQGTKVEIKR DOM7b-14-19 (SEQ ID NO. 3)
DIQ MTQSPSSLSASVGDRVTiSCRASQWIGSQLSWYQQKPGE APKLLIMWRSSLQSG
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR DOM7h-14-28 (SEQ ID NO" 4)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLiMWRSSLQSG VP
SRFSGSGSGTDFTLTiSSLQPEDFATYYCAQGAALPKTFGQGTKVEIKR
DOM7h-14-36 (SEQ ID NO" 5)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSG
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGFKKPRTFGQGTKVEIKR
Таблица 2: нуклеотидные последовательности вариантов dAb DOM7h-14
DOM7h-l4-10 (SEQ ID NO. 6)
GACATCCAGA TGACGCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCG TGTCAGC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG TCTCAGTTAT CTTGGTA
CCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCATGTGG GGTTCCTCGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTC ACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTAGGTACTA CTGTGCT CAG GGTTTGAGGC ATCCTAAGAC GTTCGGCCAA GGGACGAAGG TGGAAATCAA AGGG
DOM7h-14-18 (SEQ ID NO. 7)
GACATCCAGA TGACGCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCG TGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG TCTCAGTTAT CTTGGTA CCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCATGTGG CGTTCCTCGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTC ACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTAGGTACTA CTGTGCT CAG GGTCTTATGA AGCCTATGAC GTTCGGCCAA GGGACGAAGG TGGAAATCAA ACGG
DOM7h-l4-19 (SEQ ID NO: 8J
GACATCCAGA TGACGCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCG TGTCACC ATCTCTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG TCTCAGTTAT CTTGGTA CCA GCAGAAACCA GGGGAAGCCC CTAAGCTCCT GATCATGTGG CGTTCCTCGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTC ACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTAGGTACTA CTGTGCT CAG GGTGCGGCGT TGCCTAGGAC GTTCGGCCAA GGGACGAAGG TGGAAATCA A ACGG
DQM7h-14-28 (SEQ ID NO" 9)
GACATCCAGA TGACGCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCG TGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG TCTCAGTTAT CTTGGTA CCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCATGTGG CGTTCCTCGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTC ACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACATACTA CTGTGCT CAG GGTGCGGCGT TGCCTAAGAC GTTCGGCCAA GGGACGAAGG TGGAAATCA A ACGG
DOM7b-14-36 (SEQ ID NO: 10)
GACATCCAGA TGACGCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCG TGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG TCTCAGTTAT CTTGGTA
CCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCATGTGG CGTTCCTCGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTC ACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTAGGTACTA CTGTGCT CAG GGTTTTAAGA AGCCTCGGAC GTTCGGCCAA GGGACGAAGG TGGAAATCAA
ACGG
Таблица 3: слияния dAb (DOM7h) против сывороточного альбумина
(применяли в исследованиях на крысах):
Слияние ООМ7п-14/эксендин-4 номер DMS 7138
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 11)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQG.AALPRTFGQGTKVEIKR
Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 12)
CATGGTGAAGGAACATTTAGCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAG
TGGGGTTATTTATTGAGTGGGTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCAGGTCG
GCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTGAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGT
CGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATGCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACGG
TGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACC
AGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTGCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCA
AAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTGC
GGCGTTGCCTAGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Слияние ООМ7п-14-10/эксендин-4 номер DMS 7139
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 13)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKR
Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 14)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAG
TGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCC
GCCATGGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGT
CGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCG
TGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACC
AGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCA
AAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTC
ACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTT
GAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Слияние ООМ7п-14-18/эксендин-4 номер DMS 7140
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 15)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGS DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSVVYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLMKPMTFGQGTKVEIKR
Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 16)
CATG GTG AAGG AAC ATTT ACC AG TGACTTGTCAAAAC AG ATG G AAGAG G AG GC A G
TGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCC
GCCATCGGGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGT
CGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCG
TGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACC
AGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCA
AAG T GG G GTC CCATCACG TT TC A G T GG CAGTGG АТС T GG G AC AG AT T T С ACTCT С
ACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTCT
TATGAAGCCTATGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
Слияние ООМ7п-14-19/эксендин-4 номер DMS 7141
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 17)
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGGGGGSGGGGSGGGGS
DIG MTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQWIGSQLSWYQQKPGEAPKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGAALPRTFGQGTKVEIKR
Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 18)
CATGGTGAAGGAACATTTACCAGTGAGTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAG
TGCGGTTATTTATTGAGTGGGTTAAGAACGGAGGAGCAAGTAGCGGGGCAGCTCC
GCGATCGGGTGGTGGAGGCGGTTGAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGT
CGGACATCGAGATGACCCAGTCTCCATGCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCG
TGTGACCATCTCTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACC
AGCAGAAACCAGGGGAAGCCCCTAA.GCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCA
AAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATGTGGGACAGATTTCACTCTC
ACCATGAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTGC
GGCGTTGCCTAGGACGTTCGGCCAAG GG ACC AAG GT G G AAATCAAA CG G
Слияние DOM7h-14-10/G4SC-NCE
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 19), кодирующая DOM7h14-10/G4SC
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTiTC RASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLiMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKRGGGGSC
С-концевой цистеин может быть связан с новым химическим соединением (фармацевтическое химическое соединение, NCE), например, с использованием малеимидного связывания.
Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 20), кодирующая
DOM7h14-10/G4SC
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTG
TCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCA
GCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAA
AGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA
CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTG
AGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGGGTGGC
GGAGGGGGTTCCTGT
Слияние DOM7h14-10/TVAAPSC
Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 21)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKRTVAAPSC
С-концевой цистеин может быть связан с новым химическим соединением (фармацевтическое химическое соединение, NCE), например, с использованием малеимидного связывания.
Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 22)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTG TCACCATCAGTTGGCGGGGAAGTCAGTGGATTGGGTGTCAGTTATCTTGGTACCA G С AG AA ACC AG GG AA AG CC CCT AAGCTCCTG АТС ATGTG G CGTTCCT CGTTGCAA AGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA
CCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTG AGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGGACCGTC OCTGOT"CO АТС TTGT
Если в данной таблице указана молекула, меченная туе, эта версия
молекулы была использованна в РК (фармакокинетических) исследованиях в
примерах. Если последовательности, меченные туе, не приводятся, это
означает, что РК исследования в примерах не проводили с веществом,
меченным туе, т.е. исследования проводили с показанными немечеными
конструкциями.
ПРИМЕРЫ
Вся нумерация в экспериментальном разделе осуществляется согласно Kabat (Kabat, Е.А. National Institutes of Health (US) & Columbia University. Sequences of proteins of immunological interest, edn 5 (US Dept. Of Health and Human Services Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)).
ПРИМЕР 1: созревание аффинности Vk Селекции:
Антигены HSA (человеческий сывороточный альбумин) и RSA (крысиный сывороточный альбумин) приобретали у Sigma (по существу не содержащие жирных кислот, ~99% (электрофорез в агарозном геле), лиофилизированный порошок Кат. № А3782 и А6414 соответственно).
Биотинилированные продукты приведенных выше двух антигенов получали с использованием сульфо^Н8-88-биотина EZ-link (Pierce, Кат. № 21331). Несвязавшийся биотиновый реактив удаляли посредством пропускания образцов два раза через обессоливающую колонку PD10 с последующим диализом в течение ночи против ЮООх избыточного объема PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) при 4°С. Образующийся продукт тестировали масс-спектрометрией, и наблюдали 1-2 биотина на молекулу.
Библиотеки созревшей аффинности:
И библиотеку подверженную ошибкам, и библиотеку CDR создавали с использованием исходных dAb DOM7h-14 (см. WO2008/096158 относительно последовательностей DOM7h-14). Библиотеки CDR генерировали в векторе
pD0M4, и библиотеки подверженные ошибкам генерировали в векторе pDOM33 (для обеспечения селекции с или без обработки протеазой). Вектор pDOM4 представляет собой производное вектора на основе фага Fd, в котором последовательность сигнального пептида гена III заменена сигнальным пептидом дрожжевого поверхностного белка, заякоренного гликолипидом (GAS). Он также содержит метку с-тус между лидерной последовательностью и геном III, что ставит ген III обратно в рамку считывания. Данная лидерная последовательность хорошо функционирует как в векторах фагового дисплея, так и в других прокариотических экспрессионных векторах, и может использоваться повсеместно. pDOM33 представляет собой модифицированную версию вектора pDOM4, в котором была удалена метка с-тус, что делает слияние dAb-фаг устойчивым к протеазе трипсину. Это позволяет применять трипсин в селекции фагов для отбора на dAb, которые являются более стабильными в отношении протеазы (см. WO2008149143).
Для библиотек созревшей аффинности, подверженных ошибкам, плазмидную ДНК, кодирующую dAb, подлежащее созреванию, амплифицировали посредством ПЦР, применяя GENEMORPH(r) II RANDOM MUTAGENESIS KIT (набор для случайного уникального мутагенеза, Stratagene). Продукт расщепляли Sa/I и Not\ и использовали в реакции лигирования с разрезанным фаговым вектором pDOM33.
Для библиотек CDR проводили ПЦР-реакции с использованием вырожденных олигнуклеотидов, содержащих кодоны NNK или NNS для диверсификации требующихся положений в dAb, подлежащем созреванию аффинности. Затем применяли полимеразную циклическую сборку (assembly PCR) для получения полноразмерной диверсифицированной вставки. Вставку расщепляли Sa/I и Not\ и использовали в реакции лигирования с pDOM4 для мутагенеза многих остатков и с pDOM5 для мутагенеза одиночных остатков. Вектор pDOM5 представляет собой экспрессионный вектор на основе pUC119, в котором экспрессия белка управляется промотором LacZ. Лидерная последовательность GAS1 (см. WO 2005/093074) обеспечивает секрецию выделенных растворимых dAb в периплазму и супернатант культуры Е. coli. dAb клонировали Sal\/Not\ в данный вектор, который добавляет метку туе на С-конец dAb. Данный протокол с использованием Sa/I и Not\ приводит к включению аминокислотной последовательности ST на N-конец.
Продукт лигирования, полученный любым из двух способов, затем использовали для трансформации штамма Е. coli ТВ1 электропорацией, и трансформированные клетки высеивали на чашки Петри с 2xTY агаром, содержащим 15 мкг/мл тетрациклина, что давало размеры библиотек более 5x107 клонов.
Библиотеки подверженные ошибкам имели следующую частоту мутаций и размер: DOM7h-14 (2,9 мутации на dAb), размер: 5,4 х 108.
Каждая библиотека CDR имеет разнообразие по четырем аминокислотам. Для каждой из CDR 1 и 3 были получены две библиотеки и одна библиотека - для CDR2. Положения, подвергнутые диверсификации в каждой библиотеке, являются следующими (аминокислоты на основе VK модели DPK9 (VK dummy DPK9) последовательности):
Размер библиотеки
DOM7h-14
1 -Q27, S28, S30, S31 (CDR1)
2 - S30, S31, Y32, N34 (CDR1)
3 - Y49, А50, А51, S53 (CDR2)
4 - Q89, S91, Y92, S93 (CDR3)
5 - Y92, Y93, Т94, N96 (CDR3)
5,8 х 107
4.2 х 108
2.4 х 108
2.5 х 108
3.3 х 108
Пример 2: стратегии селекции:
Для созревания аффинности VK AlbudAb(tm) (dAb против сывороточного альбумина) применяли три стратегии отбора фагов: 1) Селекции относительно только HSA:
Проводили три цикла селекции против HSA. Библиотеки подверженные ошибкам и каждую библиотеку CDR отбирали во всех циклах в виде индивидуального пула. Первый цикл селекции проводили в отношении HSA в концентрации 1 мг/мл, которым была пассивно покрыта иммунопробирка. Цикл 2 проводили относительно 100 нМ HSA, и цикл 3 - относительно 10 нМ (селекции CDR) или 20, или 100 нМ (селекции подверженных ошибкам) HSA, оба в виде селекций в растворимом состоянии, с последующим четвертым циклом селекции с библиотеками подверженными ошибкам относительно 1,5 нМ HSA в виде селекции в растворимом состоянии. Библиотеки подверженные ошибкам элюировали 0,1 М глицином, рН 2,0, перед нейтрализацией 1 М Tris, рН 8,0, и библиотеки CDR элюировали 1 мг/мл трипсином перед инфекцией
клеток TG1 в логарифмической фазе. Продукты третьего цикла каждой селекции субклонировали в pDOM5 для скрининга. При селекциях в растворимом состоянии использовали биотинилированный HSA.
2) Селекции с трипсином относительно HSA:
Для того чтобы отобрать dAb с повышенной устойчивостью к протеазе по сравнению с исходным клоном и с потенциально улучшенными биофизическими свойствами, в селекциях фагов применяли трипсин (см. WO2008149143). Проводили четыре цикла селекции относительно HSA. Первый цикл селекции библиотек подверженных ошибкам проводили относительно HSA в концентрации 1 мг/мл, пассивно покрывающего поверхность, без трипсина; второй цикл - относительно HSA в концентрации 1 мг/мл, пассивно покрывающего поверхность, с 20 мкг/мл трипсина в течение 1 часа при 37°С; третий цикл селекции проводили посредством селекции в растворимом состоянии с использованием биотинилированного HSA относительно 100 нМ HSA с 20 мкг/мл или 100 мкг/мл трипсином в течение 1 часа при 37°С. Конечный цикл селекции проводили посредством селекции в растворимом состоянии с использованием биотинилированного HSA относительно 100 нМ HSA с 100 мкг/мл трипсином в течение ночи при 37°С.
3) Перекрестные селекции относительно HSA (цикл 1) и RSA (циклы 2-4): Первый цикл селекции проводили относительно 1 мг/мл HSA, пассивно
покрывающего поверхность, или 1 мкМ HSA (селекция в растворимом состоянии), с последующими дополнительными тремя циклами селекции в растворимом состоянии относительно биотинилированного RSA в концентрациях 1 мкМ для цикла 1, 100 нМ для цикла 2 и 20 нМ, 10 нМ или 1 нМ для цикла 3.
Стратегия скрининга и определение аффинности:
В каждом случае после селекции подготавливают пул фаговой ДНК из подходящего цикла селекции, применяя набор QIAfilter midiprep (Qiagen), ДНК расщепляют рестрикционными ферментами Sail и Not1, и обогащенные гены V лигируют в соответствующие сайты в растворимом экспрессионном векторе pDOM5, который экспрессирует dAb с меткой туе (см. РСТ/ЕР2008/067789). Лигированную ДНК используют для электротрансформации клеток Е. coli НВ 2151, которые затем выращивают в течение ночи на чашках с агаром, содержащих антибиотик карбенициллин. Образующиеся колонии
индивидуально оценивают на связывание антигена. В каждом случае тестировали по меньшей мере 96 клонов на связывание с HSA, CSA (сывороточный альбумин яванского макака), MSA (мышиный сывороточный альбумин) и RSA посредством BIAcore(tm) (поверхностный плазмонный резонанс). Антиген MSA приобретали у Sigma (по существу не содержащий жирных кислот, ~99% (электрофорез в агарозном геле), лиофилизированный порошок Кат. № А3559), и CSA очищали из сывороточного альбумина яванского макака с использованием смолы Prometic Blue (Amersham). Растворимые фрагменты dAb продуцировались в бактериальной культуре в культуральной среде ONEX (Novagen) в течение ночи при 37°С в 96-луночных планшетах. Супернатант культуры, содержащий растворимые dAb, центрифугировали и анализировали посредством BIAcore в отношении связывания с чипами СМ5 с HSA, CSA, MSA и RSA в высокой плотности. Посредством скрининга скорости диссоциации обнаружили клоны, которые связываются со всеми этими видами сывороточного альбумина. Данные клоны секвенировали, выявляя уникальные последовательности dAb.
Минимальная идентичность отобранных клонов по отношению к исходным (на аминокислотном уровне) составляла 96,3% (DOM7h-14-10: 96,3%, DOM7h-14-18: 96,3%, DOM7h-14-19: 98,2%, DOM7h-14-28: 99,1%, DOM7h-14-36: 97,2%).
Уникальные dAb экспрессировались в виде бактериальных супернатантов во встряхиваемых колбах в 2,5 л среды Опех при 30°С в течение 48 ч при 250 об./мин. dAb очищали из культуральной среды путем абсорбции с белком L в агарозе с последующей элюцией 10 мМ глицином, рН 2.0. Связывание с HSA, CSA, MSA и RSA подтверждали посредством BIAcore, применяя очищенный белок в 3 концентрациях: 1 мкМ, 500 нМ и 50 нМ. Для определения аффинности связывания (KD) AlbudAb с каждым сывороточным альбумином очищенные dAb анализировали посредством BIAcore в диапазоне концентраций альбумина от 5000 нМ до 39 нМ (5000 нМ, 2500 нМ, 1250 нМ, 625 нМ, 312 нМ, 156 нМ, 78 нМ, 39 нМ).
(поверхностный плазмонный резонанс) эксперимента.
Все варианты, полученные из DOM7h-14, являются перекрестно реагирующими с мышиным, крысиным, человеческим сывороточным альбумином и сывороточным альбумином яванского макака. DOM7h-14-10 имеет улучшенную аффинность к крысиному сывороточному альбумину, сывороточному альбумину яванского макака и человеческому сывороточному альбумину по сравнению с исходным dAb. DOM7h-14-28 имеет улучшенную аффинность к RSA. DOM7h-14-36 имеет улучшенную аффинность к RSA, CSA и MS А.
Пример 3: происхождение ключевых клонов линии DOM7h-14
DOM7h-14-19: от созревания аффинности, проведенного против HSA с использованием библиотеки подверженной ошибкам, результаты цикла 3 (100 нМ, HSA) с 100 мкг/мл трипсина.
DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-28, DOM7h-14-36: от созревания аффинности, проведенного против HSA с использованием библиотеки CDR3 (Y92, Y93, Т94, N96), результат цикла 3.
Определяли установившийся уровень бактериальной экспрессии после культивирования во встряхиваемых колбах в 2,5 л среды Опех при 30°С в течение 48 ч при 250 об./мин. Биофизические характеристики определяли посредством SEC MALLS (гель-фильтрация с детекцией рассеяния света лазера под многими углами) и DSC (дифференциальная сканирующая калориметрия).
SEC MALLS (гель-фильтрация с детекцией рассеяния света лазера под многими углами) представляет собой неинвазивную методику для характеристики макромолекул в растворе. Вкратце, белки (в концентрации 1 мг/мл в буфере PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) по Дульбекко) разделяли посредством гель-фильтрации при скорости элюции 0,5 мл/мин согласно их гидродинамическим свойствам (колонка: TSK3000 от TOSOH Biosciences; S200 от Pharmacia). После разделения измеряли склонность белка рассеивать свет с использованием детектора рассеяния света лазера под многими углами (MALLS). Интенсивность рассеянного света при прохождении белка через детектор измеряется как функция угла. Это измерение, взятое наряду с концентрацией белка, определенной с использованием детектора показателя преломления (RI), позволяет рассчитать молярную массу, применяя подходящие уравнения (интегральная часть программного обеспечения для анализа Astra v.5.3.4.12).
DSC (дифференциальная сканирующая калориметрия): вкратце, белок (в концентрации 1 мг/мл в PBS) нагревают с постоянной скоростью 180°С/ч, и измеряют детектируемое изменение тепла, ассоциированное с тепловой денатурацией. Определяют среднюю точку перехода (аррТт), которая описывается как температура, при которой 50% белка находится в его нативной конформации, а другие 50% денатурированы. Здесь посредством DSC определяли кажущуюся среднюю точку перехода (аррТт), так как большинство исследованных белков не подвергались полному обратному сворачиванию. Чем выше Тт, тем более стабильной является молекула. Кривые
* в другом испытании посредством SEC MALLS преимущественно наблюдали мономер, хотя и в содержании меньшем, чем 95%.
Авторы изобретения наблюдали, что уровни экспрессии для всех клонов в Таблице 6 находятся в интервале от 15 до 119 мг/л в Е. coli.
Для вариантов DOM7h-14 на протяжении созревания аффинности поддерживались благоприятные биофизические параметры (мономерные в растворе при определении посредством SEC MALLS и аррТт более 55°С при определении посредством DSC) и уровни экспрессии. Мономерное состояние имеет преимущества, так как при нем избегается димеризация и риск образования продуктов, которые могут поперечно связывать мишени, такие как рецепторы поверхности клеток.
Пример 5: определение периода полувыведения в сыворотке у крыс, мышей и яванских макаков
AlbudAb DOM7h-14-10, DOM7h-14-18 и DOM7h-14-19 клонировали в вектор pDOM5. Для каждого AlbudAb(tm) в Е. coli экспрессировались количества 20-50 мг, и их очищали из супернатанта бактериальной культуры с использованием аффинной смолы на основе белка L, и элюировали 100 мМ глицином, рН 2. Белки концентрировали до концентрации, превышающей 1 мг/мл, осуществляли замену буфера на PBS и уменьшали содержание эндотоксина, применяя колонки Q spin (Vivascience). Для анализа фармакокинетики (РК) у крыс AlbudAb дозировали в виде однократных в.в. (внутривенная) инъекций в дозировке 2,5 мг/кг с использованием 3 крыс на
соединение. Образцы сыворотки отбирали в 0,16; 1; 4; 12; 24; 48; 72; 120; 168 ч. Анализ сывороточных уровней осуществляли посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) против туе согласно способу, описанному ниже.
Для РК у мышей dAb дозировали в виде однократных в.в. инъекций в дозировке 2,5 мг/кг на группу дозировки из 3 субъектов, и образцы сыворотки отбирали в 10 мин; 1 ч; 8 ч; 24 ч; 48 ч; 72 ч; 96 ч. Анализ сывороточных уровней осуществляли посредством ELISA против туе согласно способу, описанному ниже.
Для РК у яванского макака DOM7h-14-10 дозировали в виде однократных в.в. инъекций в дозировке 2,5 мг/кг 3 самкам яванского макака на группу дозировки, и образцы сыворотки отбирали в 0,083; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 24; 48; 96; 144; 192; 288; 336; 504 ч. Анализ сывороточных уровней осуществляли посредством ELISA против туе согласно способу, описанному ниже.
Способ ELISA против туе
Концентрацию AlbudAb в сыворотке измеряли посредством ELISA против туе. Вкратце, 96-луночные планшеты Maxisorp от Nunc покрывали поликлональным антителом козы против туе (1:500, Abeam, каталожный номер аЬ9132) в течение ночи и блокировали 5% BSA (бычий сывороточный альбумин)/РВ8 + 1% Tween. Образцы сыворотки добавляли в интервале разведений рядом со стандартом в известных концентрациях. Затем детектировали связавшиеся AlbudAb, меченные туе, применяя кроличьи поликлональные антитела против Vk (1:1000; реактив собственного производства, отобранную кровь объединяли, и белок А очищали перед применением), с последующим антителом против кроличьего IgG, конъюгированным с HRP (пероксидаза хрена) (1:10000; Sigma, каталожный номер А2074). Между каждым этапом анализа планшеты промывали 3 раза PBS+0,1% Tween20, с последующей 3-кратной промывкой PBS. После последней промывки добавляли ТМВ (тетраметилбензидин) (SureBlue ТМВ 1-компонентный пероксидазный субстрат для микролунок, KPL, каталожный номер 52-00-00) и давали развиться окраске. Реакцию останавливали 1 М HCI, и затем измеряли сигнал с использованием поглощения при 450 нм.
Из необработанных данных, полученных посредством ELISA, устанавливали концентрацию в неизвестных образцах путем интерполяции
относительно стандартной кривой, принимая во внимание коэффициент разведения. Результат в виде средней концентрации в каждый момент времени определяли из значений повторностей и вводили в пакет программ для анализа WinNonLin (например, версия 5.1, доступная от Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, США). Данные подгоняли с использованием некомпартментной модели, где параметры РК оценивались программным обеспечением с получением конечных периодов полувыведения. Информацию по дозировке и моменты времени выбирали так, чтобы они отражали конечную фазу каждого РК профиля.
Фармакокинетические параметры, полученные из исследований на крысах, мышах и яванских макаках, подгоняли с использованием некомпартментной модели. Легенда: AUC: площадь под кривой от времени дозировки, экстраполированная до бесконечности; CL: клиренс; t1/2: представляет собой время, на протяжении которого концентрация в крови уменьшается в два раза; Vz: объем распределения, основанный на конечной фазе.
Пример 6: слияния AlbudAb(tm) IFN
Клонирование и экспрессия
Vk AlbudAb с созревшей аффинностью, также как и одиночные AlbudAb связывали с интерфероном альфа 2b (IFNa2b) для определения того, сохранялась ли полезная РК AlbudAb в виде слитого белка.
Аминокислотная последовательность интерферона альфа 2Ь: CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHE MIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSIL AVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE (SEQ ID N0:44)
Нуклеотидная последовательность интерферона альфа 2Ь:
TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGG
CACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGA
TTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCC
TCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCT
GCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAA
TGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGAT
GAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATC
TGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCAT
GAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA (SEQ
ID N0:45)
IFNa2b связывали с AlbudAb через линкерную область TVAAPS (см. WO2007085814). Конструкции клонировали посредством ПЦР с SOE (одним перекрывающимся удлинением) согласно способу Horton et al. Gene, 77, p61 (1989)). ПЦР амплификацию последовательностей AlbudAb и IFN проводили раздельно с использованием праймеров с перекрытием ~ 15 пар оснований в области линкера TVAAPS. Использовали следующие праймеры: 5'-фрагмент GCCCGGATCCACCGGCTGTGATCTG (SEQ ID N0:46) SOE IFNa2b
З'-фрагмент GGAGGATGGAGAGTGGGTGATCTGGATGTC (SEQ ID N0:47) SOE IFNa2b
5'-фрагмент GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCC (SEQ ID N0:48) SOE Vk
З'-фрагмент GCGCAAGCTTTTATTAATTCAGATCCTCTTC
SOE Vk также TGAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCCCGT
для введения TTGATTTCCACCTTGGTCCC (SEQ ID N0:49) метки myc
Фрагменты раздельно очищали и затем собирали в реакции SOE (удлинение ПЦР посредством одного перекрывающегося удлинения), с использованием только фланкирующих праймеров:
5'-фрагмент SOE GCCCGGATCCACCGGCTGTGATCTG (SEQ ID N0:50) IFNa2b
З'-фрагмент SOE Vk GCGCAAGCTTTTATTAATTCAGATCCTCTTC
также для введения TGAGATGAGT ТП TGTTCTGCGGCCGCCCGT
метки myc TTGATTTCCACCTTGGTCCC (SEQ ID NO:51)
Собранный ПЦР-продукт расщепляли рестрикционными ферментами BamHI и Hind III, и ген лигировали в соответствующие сайты в pDOM50, экспрессионный вектор млекопитающих, который представляет собой производное рТТ5 с N-концевой секреторной лидерной последовательностью мышиного IgG V-J2-C для облегчения экспрессии в клеточной среде.
Лидерная последовательность (аминокислотная): METDTLLLVWLLLWVPGSTG (SEQ ID N0:52) Лидерная последовательность (нуклеотидная):
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGATCC ACCGGGC (SEQ ID N0:53)
Плазмидную ДНК получали, применяя QIAfilter megaprep (Qiagen). 1 мкг ДНК/мл с 293-Fectin трансфицировали в клетки НЕК293Е (эмбриональные клетки почек человека) и выращивали в бессывороточной среде. Белок экспрессировали в культуре в течение 5 суток и очищали из супернатанта культуры, применяя аффинную смолу на основе белка L, и элюировали 100 мМ глицином, рН 2. Белки концентрировали до концентрации, превышающей 1 мг/мл, осуществляли замену буфера на PBS и уменьшали содержание эндотоксина, применяя колонки Q spin (Vivascience).
Таблица 8: последовательности интерферона альфа 2b-AlbudAb с и без метки myc (в виде аминокислотной и нуклеотидной последовательности)
Интерферон альфа 2b находится ближе к N-концу относительно AlbudAb в следующих слияниях:
ак + myc
нт + myc
ак без метки
нт без метки
DMS7321
CDLPQTHSLGSRRTL
TGCGACTTGCCA
CDLPQTHSLGS
TGCGACTTGCCA
(IFNa2b-
MLLAQMRRISLFSCL
CAGACACATAGT
RRTLMLLAQM
CAGACACATAGT
DOM7h-
KDRHDFGFPQEEFG
TTGGGATCAAGA
RRISLFSCLKD
TTGGGATCAAGA
14)
NQFQKAETIPVLHEMI
AGAACATTGATG
RHDFGFPQEE
AGAACATTGATG
QQIFNLFSTKDSSAA
TTATTAGCACAAA
FGNQFQKAETI
TTATTAGCACAA
WDETLLDKFYTELYQ
TGCGTAGAATTT
PVLHEMIQQIF
ATGCGTAGAATT
QLNDLEACVIQGVGV
CTTTGTTCTCTTG
NLFSTKDSSAA
TCTTTGTTCTCTT
TETPLMKEDSILAVRK
TCTAAAGGACCG
WDETLLDKFYT
GTCTAAAGGACC
YFQRITLYLKEKKYSP
TCACGACTTCGG
ELYQQLNDLEA
GTCACGACTTCG
CAWE WRAEIM RSFS
ATTCCCTCAGGA
CVIQGVGVTET
GATTCCCTCAGG
LSTNLQESLRSKETV
AGAGTTTGGAAA
PLMKEDSILAV
AAGAGTTTGGAA
AAPSDIQMTQSPSSL
CCAATTCCAAAA
RKYFQRITLYLK
ACCAATTCCAAA
S AS VG D RVTITCRAS
AG CAGAAACTAT
EKKYSPCAWE
AAGCAGAAACTA
QWIGSQ LSWYQQKP
TCCTGTCTTGCA
WRAEI MRSFS
TTCCTGTCTTGC
GKAPKLLIMWRSSLQ
CGAAATGATCCA
LSTNLQESLRS
ACGAAATGATCC
SGVPSRFSGSGSGT
GCAAATATTCAAT
KETVAAPSDIQ
AGCAAATATTCA
DFTLTISSLQPEDFAT
TTGTTTTCTACAA
MTQSPSSLSAS
ATTTGTTTTCTAC
YYCAQGAALPRTFGQ
AG GACTCATCAG
VG DRVTITCRA
AAAGGACTCATC
GTKVEIKR
CCGCTTGGGATG
SQWIGSQLSW
AGCCGCTTGGGA
AAAEQKLISEEDLN*
AAACTCTGTTAG
YQQKPGKAPK
TGAAACTCTGTT
(SEQ ID N0:54)
ATAAATTCTACAC
LLI MWRSSLQS
AGATAAATTCTA
TGAACTATATCAA
GVPSRFSGSG
CACTGAACTATA
CAACTGAACGAT
SGTDFTLTISSL
TCAACAACTGAA
CTAGAGGCTTGC
QPEDFATYYCA
CGATCTAGAGGC
GTTATTCAGGGT
QGAALPRTFG
TTGCGTTATTCA
GTAGGAGTTACT
QGTKVEIKR
GGGTGTAGGAGT
GAAACTCCCCTA
(SEQ ID N0:56)
TACTGAAACTCC
AT GAAAGAAGAT
CCTAATGAAAGA
TCAATTCTAGCC
AGATTCAATTCTA
GTTAGAAAATACT
GCCGTTAGAAAA
TTCAGCGTATCA
TACTTTCAGCGT
CATTGTATTTAAA
ATCACATTGTATT
G GAAAAGAAAT A
TAAAGGAAAAGA
CTCCCCATGTGC
AATACTCCCCAT
ATGGGAGGTGGT
TAGAGCAGAAAT
TATGAGGTCCTT
CTCTCTTTCTACG
AATTTGCAAGAAT
CTTTGAGATCTAA
GGAAACCGTCG С
TGCTCCATCTGA
CATCCAGATGAC
CCAGTCTCCATC
CTCCGTGTGTGC
ATCTGTAG GAGA
CCGTGTCACCAT
GAGTTGCCGGGC
AAGTCAGTGGAT
TGGGTCTCAGTT
ATCTTGGTACCA
GCAGAAAGGAG G
GAAAGGGCGTAA
GCTCCTGATCAT
GTGGCGTTCCTC
GTTGCAAAGTGG
GGTGGGATCACG
TTTGAGTGGCAG
TGGATCTGGGAC
AGATTTCACTCTC
AGGATCAGCAGT
CTGCAACGTGAA
GATTTTGCTACG
TACTACTGTGCT
CAGGGTGCGGC
GTTGCCTAGGAG
GTTCGGCCAAGG
GACCAAGGTGGA
AATCAAACGGGC
GGCCGCAGAAC
AAAAACTCATCT
GTGCATGGGAG GTGGTTAGAGCA GAAATTATGAGG TCCTTCTCTCTTT
CTACG AATTTG С
AAGAATCTTTGA
GATCTAAGG.AAA
CCGTCGCTGGTC
CATCTGACATCC
AGATGACCCAGT
CTCGATCGTGCC
TGTCTGCATCTG
TAGGAGACCGTG
TGACGATCACTT
GGCGGGGAAGT
CAGTGGATTGGG
TCTCAGTTATCTT
GGTACGAGCAGA
AAGCAGGGAAAG
CCCCTAAGGTCG
TGATCATGTGGC
GTTGCTCGTTGG
AAAGTGGGGTCC
CATCACGTTTCA
GTGGCAGTGGAT
CTGGGACAGATT
TCACTCTCACCA
TCAG GAGTCTGG
AACCTGAAGATT
TTGCTACGTACT
ACTGTGCTCAGG
GTGGGGCGTTG
CCTAGGACGTTC
GGCCAAGGGAC
CAAGGTGGAAAT
CAAACGG (SEQ
ID N0:57)
CAGAAGAGGAT CTGAATTAA
(SEQ ID N0:55)
DMS732
CDLPQTHSLGSRRTL
TGCGACTTGCCA
CDLPQTHSLGS
TGCGACTTGCCA
(IFNa2b-
MLLAQMRRISLFSCL
CAGACACATAGT
RRTLMLLAQM
CAGACACATAGT
D0M7h-
KDRHDFGFPQEEFG
TTGGGATCAAGA
RRISLFSCLKD
TTGGGATCAAGA
14-10)
NQFQKAETIPVLHEMI
AGAACATTGATG
RHDFGFPQEE
AGAACATTGATG
QQIFNLFSTKDSSAA
TTATTAGCACAAA
FGNQFQKAETI
TTATTAGCACAA
WDETLLDKFYTELYQ
TGCGTAGAATTT
PVLHEMIQQIF
ATGCGTAGAATT
QLNDLEACVIQGVGV
CTTTGTTCTCTTG
NLFSTKDSSAA
TCTTTGTTCTCTT
TETPLMKEDSILAVRK
TCTAAAGGACCG
WDETLLDKFYT
GTCTAAAGGACC
YFQRITLYLKEKKYSP
TCACGACTTCGG
ELYQQLNDLEA
GTCACGACTTCG
CAWEWRAEIMRSFS
ATTCCCTCAGGA
CVIQGVGVTET
GATTCCCTCAGG
LSTNLQESLRSKETV
AGAGTTTGGAAA
PLMKEDSILAV
AAGAGTTTGGAA
AAPSDIQMTQSPSSL
CCAATTCCAAAA
RKYFQRITLYLK
ACCAATTCCAAA
SASVGDRVTITCRAS
AG CAG AAACTAT
EKKYSPCAWE
AAGCAGAAACTA
QWIGSQLSWYQQKP
TCCTGTCTTGCA
WRAEIMRSFS
TTCCTGTCTTGC
GKAPKLLIMWRSSLQ
CGAAATGATCCA
LSTNLQESLRS
ACGAAATGATCC
SGVPSRFSGSGSGT
GCAAATATTCAAT
KETVAAPSDIQ
AG CAAATATTCA
DFTLTISSLQPEDFAT
TTG I I I I CTACAA
MTQSPSSLSAS
ATTTGTTTTCTAC
YYCAQGLRHPKTFG
AGGACTCATCAG
VGDRVTITCRA
AAAGGACTCATC
QGTKVEIKR
CCGCTTGGGATG
SQWIGSQLSW
AGCCGCTTGGGA
AAAEQKLISEEDLN*
AAACTCTGTTAG
YQQKPGKAPK
TGAAACTCTGTT
(SEQ ID N0:58)
ATAAATTCTACAC
LLI MWRSSLQS
AGATAAATTCTA
TGAACTATATCAA
GVPSRFSGSG
CACTGAACTATA
CAACTGAACGAT
SGTDFTLTISSL
TCAACAACTGAA
CTAGAGGCTTGC
QPEDFATYYCA
CGATCTAGAGGC
GTTATTCAGGGT
QGLRHPKTFG
TTGCGTTATTCA
GTAGGAGTTACT
QGTKVEIKR
GGGTGTAGGAGT
GAAACTCCCCTA
(SEQ ID N0:60)
TACTGAAACTCC
ATGAAAGAAGAT
CCTAATGAAAGA
TCAATTCTAGCC
AGATTCAATTCTA
GTTAGAAAATACT
GCCGTTAGAAAA
TTCAGCGTATCA
TACTTTCAGCGT
CATTGTATTTAAA
ATCACATTGTATT
GGAAAAGAAATA
TAAAGGAAAAGA
CTCCCCATGTGC
AATACTCCCCAT
ATGGGAGGTGGT TAGAGCAGAAAT TATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACG
AATTTGCAAGAAT
CTTTGAGATCTAA
GGAAACCGTCGC
TGCTCCATCTGA
CATCCAGATGAC
CCAGTCTCCATC
GTGGGTGTGTGG
ATCTGTAG GAGA
CCGTGTCACCAT
GAGTTGGGGGGG
AAGTCAGTGGAT
TGGGTCTCAGTT
ATCTTGGTACCA
GGAGAAACCAGG
GAAAGGGCGTAA
GCTCCTGATCAT
GTGGCGTTCCTC
GTTGGAAAGTGG
GGTCCCATCACG
TTTGAGTGGCAG
TGGATCTGGGAC
AGATTTCACTCTC
ACGATCAGGAGT
CTGCAACCTGAA
GATTTTGCTACG
TACTACTGTGCT
CAGGGTTTGAGG
CATCCTAAGACG
TTCGGCCAAGGG
ACCAAGGTGGAA
ATCAAACGGGCG
GCCGCAGAACA
AAAACTCATCTC
GTGCATGGGAG
GTGGTTAGAGGA
GAAATTATGAGG
TCCTTCTCTCTTT
CTACGAATTTGC
AAGAATCTTTGA
GATCTAAGGAAA
CCGTCGCTGCTC
CATCTGACATCC
AGATGACCCAGT
CTGGATGCTCCG
TGTCTGCATCTG
TAGGAGACCGTG
TGACCATGACTT
GGCGGGGAAGT
CAGTGGATTGGG
TCTGAGTTATCTT
GGTACCAG GAGA
AACGAGGGAAAG
CCCCTAAGCTCC
TGATCATGTGGC
GTTGGTCGTTGG
AAAGTGGGGTCC
CATCACGTTTCA
GTGGCAGTGGAT
CTGGGACAGATT
TGACTCTGACCA
TCAG CAGTGTGG
AACCTGAAGATT
TTGCTACGTACT
ACTGTGCTCAGG
GTTTGAGGGATC
CTAAGACGTTCG
GCCAAGG GACC
AAGGTGGAAATC
AAACGG (SEQ ID
N0:61)
AGAAGAGGATCT
GAATTAA (SEQ
ID N0:59)
DMS7323
CDLPQTHSLGSRRTL
TGCGACTTGCCA
CDLPQTHSLGS
TGCGACTTGCCA
(IFNo2b-
MLLAQMRRISLFSCL
CAGACACATAGT
RRTLMLLAQM
CAGACACATAGT
DOM7h-
KDRHDFGFPQEEFG
TTGGGATCAAGA
RRISLFSCLKD
TTGGGATCAAGA
14-18)
NQFQKAETIPVLHEMI
AGAACATTGATG
RHDFGFPQEE
AGAACATTGATG
QQIFNLFSTKDSSAA
TTATTAGCACAAA
FGNQFQKAETI
TTATTAGCACAA
WDETLLDKFYTELYQ
TGCGTAGAATTT
PVLHEMIQQIF
ATGCGTAGAATT
GLNDLEACVIQGVGV
CTTTGTTCTCTTG
NLFSTKDSSAA
TCTTTGTTCTCTT
TETPLMKEDSILAVRK
TCTAAAGGACCG
WDETLLDKFYT
GTCTAAAGGACC
YFQRITLYLKEKKYSP
TCACGACTTCGG
ELYQQLNDLEA
GTCACGACTTCG
CAWEWRAEIMRSFS
ATTCCCTCAGGA
CVIQGVGVTET
GATTCCCTCAGG
LSTNLQESLRSKETV
AGAGTTTGGAAA
PLMKEDSILAV
AAGAGTTTGGAA
AAPSDIQMTQSPSSL
CCAATTCCAAAA
RKYFQRITLYLK
ACCAATTCCAAA
SASVGDRVTITCRAS
AG CAG AAACTAT
EKKYSPCAWE
AAGCAGAAACTA
QWIGSQLSWYQQKP
TCCTGTCTTGCA
WRAEIMRSFS
TTCCTGTCTTGC
GKAPKLLIMWRSSLQ
CGAAATGATCCA
LSTNLQESLRS
ACGAAATGATCC
SGVPSRFSGSGSGT
GCAAATATTCAAT
KETVAAPSDIQ
AG С AAAT ATTCA
DFTLTISSLQPEDFAT
TTG I II ICTACAA
MTQSPSSLSAS
ATTTG I II ICTAC
YYCAQGLMKPMTFG
AG GACTCATCAG
VGDRVTITCRA
AAAGGACTCATC
QGTKVEIKRAAAEQK
CCGCTTGGGATG
SQWIGSQLSW
AGCCGCTTGGGA
L1SEEDLN* (SEQ ID
AAACTCTGTTAG
YQQKPGKAPK
TGAAACTCTGTT
N0:62)
ATAAATTCTACAC
LLIMWRSSLQS
AGATAAATTCTA
TGAACTATATCAA
GVPSRFSGSG
CACTGAACTATA
CAACTGAACGAT
SGTDFTLTISSL
TCAACAACTGAA
CTAGAGGCTTGC
QPEDFATYYCA
CGATCTAGAGGC
GTTATTCAGGGT
QGLMKPMTFG
TTGCGTT ATTCA
GTAGGAGTTACT
QGTKVEIKR
GGGTGTAGGAGT
GAAACTCCCCTA
(SEQ ID N0:64)
TACTGAAACTCC
ATGAAAGAAGAT
CCTAATGAAAGA
TCAATTCTAGCC
AGATTCAATTCTA
GTTAGAAAATACT
GCCGTTAGAAAA
TTCAGCGTATCA
TACTTTCAGCGT
CATTGTATTTAAA
ATCACATTGTATT
GGAAAAGAAATA
TAAAGGAAAAGA
CTCCCCATGTGC
AATACTCCCCAT
ATGGGAGGTGGT TAGAGCAGAAAT TATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACG
AATTTGCAAGAAT
CTTTGAGATCTAA
GGAAACCGTCGC
TGCTCCATCTGA
CATCCAGATGAC
CCAGTCTGCATC
CTCCGTGTGTGG
ATCTGTAG GAGA
CCGTGTCACCAT
GAGTTGCGGGGC
AAGTGAGTGGAT
TGGGTCTCAGTT
ATCTTGGTACCA
GCAGAAACCAG G
GAAAGGCGGTAA
GCTCCTGATCAT
GTGGCGTTCCTC
GTTGCAAAGTGG
GGTCCCATCAGG
TTTCAGTGGGAG
TGGATCTGGGAG
AGATTTCACTCTC
ACCATCAGGAGT
CTGCAACGTGAA
GATTTTGCTACG
TACTACTGTGCT
GAGG GTGTTATG
AAGGCTATGAGG
TTCGGCCAAGGG
ACCAAGGTGGAA
ATCAAACGGGCG
GCCGCAGAACA
AAAACTCATCTC
GTGCATGGGAG
GTGGTTAGAGCA
GAAATTATGAGG
TCCTTCTCTCTTT
CTACGAATTTGC
AAGAATCTTTGA
GATCTAAG6AAA
CCGTCGCTGCTG
GATCTGACATGC
AGATGACCCAGT
CTCCATCCTCCC
T6TCTGCATCTG
TAGGAGACCGTG
TGACGATCACTT
GGGGGGGAAGT
CAGTGGATTGGG
TCTCAGTTATCTT
GGTACGAGCAGA
AAGCAGGGAAAG
CCCCTAAGCTCC
TGATCA.TGTGGC
GTTCCTCGTTGG
AAAGTGGGGTGC
CATCACGTTTCA
GTG GCAGTGGAT
CTGGGACAGATT
TCACTCTCACCA
TCAGCAGTCTGC
AACCTGAAGATT
TTGCTACGTACT
AGTGTGCTCAGG
GTCTTATGAAGC
CTATGACGTTCG
GCCAAGGGACC
AAGGTGGAAATC
AAACGG (SEQ ID
N0:65)
AGAAGAGGATCT GAATTAA (SEQ ID N0:63)
DMS7324
CDLPQTHSLGSRRTL
TGCGACTTGCCA
CDLPQTHSLGS
TGCGACTTGCCA
(IFNo2b-
MLLAQMRRISLFSCL
CAGACACATAGT
RRTLMLLAQM
CAGACACATAGT
DOM7h-
KDRHDFGFPQEEFG
TTGGGATCAAGA
RRISLFSCLKD
TTGGGATCAAGA
14-19)
NQFQKAETIPVLHEMI
AGAACATTGATG
RHDFGFPQEE
AGAACATTGATG
QQIFNLFSTKDSSAA
TTATTAGCACAAA
FGNQFQKAETI
TTATTAGCACAA
WDETLLDKFYTELYQ
TGCGTAGAATTT
PVLHEMIQQIF
ATGCGTAGAATT
GLNDLEACVIQGVGV
CTTTGTTCTCTTG
NLFSTKDSSAA
TCTTTGTTCTCTT
TETPLMKEDSILAVRK
TCTAAAGGACCG
WDETLLDKFYT
GTCTAAAGGACC
YFQRITLYLKEKKYSP
TCACGACTTCGG
ELYQQLNDLEA
GTCACGACTTCG
CAWEWRAEIMRSFS
ATTCCCTCAGGA
CVIQGVGVTET
GATTCCCTCAGG
LSTNLQESLRSKETV
AGAGTTTGGAAA
PLMKEDSILAV
AAGAGTTTGGAA
AAPSDIQMTQSPSSL
CCAATTCCAAAA
RKYFQRITLYLK
ACCAATTCCAAA
SASVGDRVTISCRAS
AG CAGAAACTAT
EKKYSPCAWE
AAGCAGAAACTA
QWIGSQLSWYQQKP
TCCTGTCTTGCA
WRAEIMRSFS
TTCCTGTCTTGC
GEAPKLLIMWRSSLQ
CGAAATGATCCA
LSTNLQESLRS
ACGAAATGATCC
SGVPSRFSGSGSGT
GCAAATATTCAAT
KETVAAPSDIQ
AG С AAAT ATTCA
DFTLTISSLQPEDFAT
TTGTTTTCTACAA
MTQSPSSLSAS
ATTTGI I IICTAC
YYCAQGAALPRTFGQ
AGGACTCATCAG
VGDRVTISCRA
AAAGGACTCATC
GTKVEIKR
CCGCTTGGGATG
SQWIGSQLSW
AGCCGCTTGGGA
AAAEQKLISEEDLN*
AAACTCTGTTAG
YQQKPGEAPK
TGAAACTCTGTT
(SEQ ID N0:66)
ATAAATTCTACAC
LLIMWRSSLQS
AGATAAATTCTA
TGAACTATATCAA
GVPSRFSGSG
CACTGAACTATA
CAACTGAACGAT
SGTDFTLTISSL
TCAACAACTGAA
CTAGAGGCTTGC
QPEDFATYYCA
CGATCTAGAGGC
GTTATTCAGGGT
QGAALPRTFG
TTGCGTT ATTCA
GTAGGAGTTACT
QGTKVEIKR
GGGTGTAGGAGT
GAAACTCCCCTA
(SEQ ID N0:68)
TACTGAAACTCC
ATGAAAGAAGAT
CCTAATGAAAGA
TCAATTCTAGCC
AGATTCAATTCTA
GTTAGAAAATACT
GCCGTTAGAAAA
TTCAGCGTATCA
TACTTTCAGCGT
CATTGTATTTAAA
ATCACATTGTATT
GGAAAAGAAATA
TAAAG GAAAAGA
CTCCCCATGTGC
AATACTCCCCAT
ATGGGAGGTGGT TAGAGCAGAAAT
TATGAGGTCCTT CTCTCTTTCTACG
AATTTGCAAGAAT
CTTTGAGATCTAA
GGAAACCGTCGC
TGCTCCATCTGA
CATCCAGATGAC
CCAGTcTCCATC
GTGGGTGTGTGG
ATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCAT
GTGTTGCGGGGC
AAGTGAGTGGAT
TGGGTCTCAGTT
ATCTTGGTACCA
GCAGAAAGGAGG
GGAAGGCGGTAA
GCTCCTGATCAT
GTGGCGTTCCTC
GTTGCAAAGTGG
GGTGGCATGAGG
TTTCAGTGGCAG
TGGATCTGGGAC
AGATTTCACTGTC
ACCATCAGCAGT
GTGCAAGCTGAA
GATTTTGCTACG
TACTACTGTGCT
CAGGGTGCGGG
GTTGGCTAGGAG
GTTCGGCCAAGG
GACCAAGGTGGA
AATCAAACGGGC
GGCCGCAGAAC
AAAAACTCATCT
GTGCATGGGAG GTGGTTAGAGCA
GAAATTATGAGG
TCCTTCTCTCTTT
CTACGAATTTGC
AAGAATCTTTGA
GATCTAAGGAAA
CCGTCGCTGCTC
CATCTGACATCC
AGATGACCCAGT
cTCCATGGTGGG
TGTCTGCATCTG
TAGGAGACCGTG
TGAGGATCTCTT
GGGGGGCAAGT
CAGTGGATTGGG
TCTCAGTTATCTT
GGTACCAG CAGA
AACCAGGGGAA
GCCCCTAAGCTC
CTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTG
CAAAGTGGGGTG
CCATCACGTTTC
AGTGGCAGTGGA
TCTG GGACAGAT
TTCACTCTCACC
ATCAGCAGTCTG
CAACCTGAAGAT
TTTGCTACGTAC
TACTGTGCTCAG
GGTGCGGCGTT
GCCTAGGACGTT
CGGCCAAGGGA
CCAAGGTG GAAA
TCAAACGG (SEQ
ID N0:69)
CAGAAGAGGAT CTGAATTAA
(SEQ ID N0:67)
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности, выделенные жирным шрифтом, представляют собой сайт клонирования и метку MYC. * представляет собой стоп-кодон на конце гена.
Определение аффинности и биофизическая характеристика: Для определения аффинности связывания (Ко) слитых белков AlbudAb-IFNa2b с каждым сывороточным альбумином очищенные слитые белки анализировали посредством BIAcore над альбумином (иммобилизованным связыванием первичных аминов на чипах СМ5; BIAcore), применяя концентрации слитых белков от 5000 нМ до 39 нМ (5000 нМ, 2500 нМ, 1250 нМ, 625 нМ, 312 нМ, 156 нМ, 78 нМ, 39 нМ) в буфере для BIAcore HBS-EP.
DOM7h-14
IFNa2b
244
2,21 E-02
9,89E+04
DOM7h-14-10
IFNa2b
6,58E-03
3,48E+05
DOM7h-14-18
IFNa2b
470
2,75E-01
6,15E+05
DOM7h-14-19
IFNa2b
350
4,19E-02
1.55E+05
При связывании IFI\
a2b с вариантами AlbudAb, аффинность связывания
AlbudAb с сывороточным альбумином во всех случаях снижается. DOM7h-14-10 сохраняет улучшенную аффинность связывания с сывороточным альбумином разных видов по сравнению с исходным dAb.
Таблица 10: биофизическая характеристика
Биофизическую характеристику выполняли посредством SEC MALLS и DSC, как описано выше для одиночных AlbudAb.
Авторы изобретения наблюдали, что экспрессия для всех клонов в Таблице 10 находится в диапазоне от 17,5 до 54 мг/л в НЕК293.
Для вариантов IFNa2b-DOM7h-14 благоприятные биофизические параметры и уровни экспрессии поддерживались на протяжении созревания аффинности.
Определение РК для слияний AlbudAb-IFNa2b
Слияния AlbudAb-IFNa2b DMS7321 (IFNa2b-DOM7h-14), DMS7322 (IFNa2b-DOM7h-14-10), DMS7323 (IFNa2b-DOM7h-14-18), DMS7324 (IFNa2b-DOM7h-14-19) экспрессировались с меткой myc в количествах 20-50 мг в клетках НЕК293, и их очищали из супернатанта культуры, применяя аффинную смолу на основе белка L, и элюировали 100 мМ глицином, рН 2. Белки концентрировали до концентрации, превышающей 1 мг/мл, осуществляли замену буфера на PBS, модифицированный по Дульбекко, и уменьшали содержание эндотоксина, применяя колонки Q spin (Vivascience).
Для РК у крыс IFN-AlbudAb дозировали в виде однократных в.в. инъекций в дозировке 2,0 мг/кг с использованием 3 крыс на соединение. Образцы сыворотки отбирали в 0,16; 1; 4; 8; 24; 48; 72; 120; 168 ч. Анализ уровней в сыворотке осуществляли посредством EASY ELISA согласно инструкциям поизводителя (GE Healthcare, каталожный номер RPN5960).
Для РК у мышей DMS7322 (IFN2b-DOM7h-14-10) с меткой myc дозировали в виде однократных в.в. инъекций в дозировке 2,0 мг/кг на группу дозировки из 3 субъектов, и образцы сыворотки отбирали в 10 мин, 1 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч. Анализ уровней в сыворотке осуществляли посредством EASY ELISA согласно инструкциям поизводителя (GE Healthcare, каталожный номер RPN5960).
Фармакокинетические параметры, полученные из исследований на крысах и мышах, аппроксимировали с использованием некомпартментной модели. Легенда: AUC: площадь под кривой от времени дозирования с экстраполяцией до бесконечности; CL: клиренс; t1/2: время, на протяжении которого концентрация в крови снижается в два раза; Vz: объем распределения, основанный на конечной фазе.
IFNa2b-AlbudAb тестировали у крыс и мышей. Улучшение в t1/2 коррелирует с улучшенной in vitro KD К сывороточному альбумину. Для
вариантов IFNa2b-DOM7h-14-10 улучшение в in vitro KD к сывороточному альбумину также коррелировало с улучшением в t1/2 у крыс.
Все слитые белки IFNa2b-AlbudAb демонстрируют 5-10-кратное ослабление связывания с RSA по сравнению с одиночным AlbudAb.
Пример 7: дополнительные слияния AlbudAb с белками, пептидами
и NCE
Тестировали разные AlbudAb, слитые с другими химическими соединениями, а именно с доменными антителами (dAb), петидами и NCE. Результаты показаны в Таблице 12.
Таблица 12:
полувыведения dAb против TNFR1 in vivo (см., например, WO04003019, WO2006038027, WO2008149148). Делается ссылка на протоколы в данных заявках РСТ. В таблице, приведенной выше, DOM1 т-21-23 представляет собой dAb против мышиного TNFR1.
Для получения генетических слияний эксендина-4 либо с DOM7h-14 (либо с другим AlbudAb), которое связывается с сывороточным альбумином, последовательность 3KceHflHH-4^HHKep-AlbudAb клонировали в вектор рТТ-5 (который можно приобрести у CNRC, Канада). В каждом случае эксендин-4 находился на 5'-конце конструкции, и dAb - на З'-конце. Линкер представлял собой линкер (G4S)3. ДНК, не содержащая эндотоксин, была получена в Е. coli с применением щелочного лизиса (с использованием набора с плазмидой Giga, не содержащего эндотоксин, который можно приобрести у Qiagen СА) и использована для трансфицирования клеток НЕК293Е (которые можно приобрести у CNRC, Канада). Трансфекцию проводили в 250 мл/колбу клеток НЕК293Е в концентрации 1,75x106 клеток/мл с использованием 333 мкл 293-Fectin (Invitrogen) и 250 мкг ДНК на колбу, и экспрессию проводили при 30°С в течение 5 суток. Супернатант отбирали центрифугированием, и очистку проводили аффинной очисткой на белке L. Белок связывался сериями со смолой, которую упаковывали в колонку и промывали 10 объемами колонки PBS. Белок элюировали 50 мл 0,1 М глицина, рН 2, и нейтрализовали Tris, рН 8. Белок ожидаемого размера идентифицировали на геле SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия).
Слияния NCE Albudab:
Тестировали слияние нового химического соединения (NCE) с AlbudAb. NCE - низкомолекулярный ингибитор ADAMTS-4, синтезировали с PEG (полиэтиленгликоль) линкером (линкер PEG 4 (т.е. 4 молекулы PEG перед малеимидом) и малеимидной группой для конъюгирования с AlbudAb. Конъюгирование NCE с Albudab осуществляется через сконструированный остаток цистеина в аминокислотном положении R108C или после 5-аминокислотного (GGGGSC) или 6-аминокислотного (TVAAPSC) спейсера, сконструированного на конце AlbudAb. Вкратце, AlbudAb восстанавливали ТСЕР (Тпз-(2-карбоксиэтил)фосфин) (Pierce, каталожный номер 77720), обессоливали, применяя колонку PD10 (GE Healthcare), в 25 мМ Bis-Tris, 5 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 10% (об./об.) глицерине, рН 6,5.
Добавляли 5-кратный молярный избыток NCE, активированного малеимидом, в DMSO (диметилсульфоксид) так, чтобы не превысить 10% (об./об.) конечной концентрации. Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре и тщательно диализировали в 20 мМ Tris, рН 7,4. PEG линкер:
Последовательности: DOM7h-14 R108C:
DIQMTQSPSSLSASVGDRWITCRASQWIGSQLSVVYQQKPGKAPKLLIMWRSSLQSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQGTKVEIKC (SEQ ID
N0:70)
Нуклеотидная:
GAGATGCAGATGACCGAGTCTCCATCCTCGCTGTCTGCATCTGTAGGAGACCGTG
TCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTATCTTGGTACCA
GCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGGCGTTCCTCGTTGCAA
AGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA
GCATCAGCAGTCTGCAACGTGAAGATTTTGCTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTG
AGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAATGC (SEQ ID
N0:71)
Смотрите Таблицу 3 относительно последовательностей DOM7h-14-10/TVAAPSC и DOM7h-14-10/GGGGSC (т.е. DOM7h-14-10/G4SC).
NCE-AlbudAb DOM7h-14-10 GGGGSC и DOM7h-14-10 TVAAPSC демонстрируют 5-10-кратное снижение аффинности in vitro (KD) К RSA при
слиянии с химическим соединением, при определении посредством BIAcore. РК данные для данных молекул еще не доступны.
Слияние эксендин-4-AlbudAb: эффект слияния AlbudAb с пептидом на связывающую способность с RSA является примерно 10-кратным, в отличие от DOM7h-14-10, который показывает только 4-кратное уменьшение связывания.
Для всех приведенных выше данных Т1/2 слияния возрастал с улучшением аффинности к SA данных видов.
Авторы данного изобретения обычно классифицируют терапевтические средства на основе AlbudAb как терапевтически пригодные (для лечения и/или профилактики заболеваний, состояний или показаний), когда слияния AlbudAb-лекарственное средство показывают диапазон аффинности (Ко) от 0,1 нМ до 10 мМ в отношении связывания сывороточного альбумина.
Авторы данного изобретения определяют терапевтические интервалы AlbudAb и слияний AlbudAb (белок-AlbudAb, например, IFNa2b-DOM7h-14-10; пептид-AlbudAb, например, эксендин-4-ООМ7гИ4-10; dAb-AlbudAb, например, DOM1m21-23-DOM7h11-15; NCE-AlbudAb, например, ADAMTS-4-DOM7h-14-10) следующим образом: показаны интервалы аффинности (Ко), которые являются полезными для терапии хронических или острых состояний, заболеваний или показаний. Также показаны интервалы аффинности, обозначенные как "промежуточные". AlbudAb и слияния в данном интервале полезны для хронических или острых заболеваний, состояний или показаний. В этом случае, аффинность AlbudAb или слияния в отношении сывороточного альбумина можно приспособлять или выбирать согласно заболеванию, состоянию или показанию, подлежащему лечению. Как описано выше, согласно изобретению предложены AlbudAb с аффинностями, которые позволяют классифицировать каждое AlbudAb как имеющее "высокую аффинность", "среднюю аффинность" или "низкую аффинность", таким образом, давая возможность специалисту выбирать подходящее AlbudAb по изобретению согласно имеющейся в распоряжении терапии. См. Фиг. 2.
Пример 8: улучшенные единичные вариабельные домены
Проводили созревание аффинности DOM7h-14-10, и новые варианты отбирали на основе специфичного связывания с сывороточным альбумином от разных видов (человек, яванский макак, крыса и мышь).
Селекции:
Антигены HSA (человеческий сывороточный альбумин) и RSA (крысиный сывороточный альбумин) и биотинилированные продукты получали, как описано в Примере 1.
Библиотеки созревшей аффинности:
И библиотеки подверженные ошибкам, и библиотеки, содержащие примеси, создавали с использованием исходного dAb DOM7h-14-10 (см. SEQ ID NO: 2) в качестве матрицы с аргинином в положении 108, замещенным мутацией на триптофан (DOM7h-14-10 R108W), обеспечивая применение трипсина для селекции фагов. Библиотеки получали в векторе pDOM33.
Для библиотек, содержащих примеси CDR, первичные реакции ПЦР проводили с использованием стимулированных олигонуклеотидов, содержащих вырожденные кодоны со смещением, для диверсификации требующихся положений в dAb. Получение библиотек, содержащих примеси, описано, например, в Balint and Larrick, Gene, 137, 109-118 (1993). Конструировали праймеры для того, чтобы изменять только первые два нуклеотида из каждого вырожденного кодона так, чтобы исходные нуклеотиды присутствовали в 85% случаев, и в 5% случаев присутствовали все другие возможные нуклеотиды. В качестве мишени для одновременного мутирования были выбраны шесть кодонов на каждом CDR с 15%-ной вероятностью того, что нуклеотид в кодоне отличается от исходного нуклеотида.
Для получения полноразмерной диверсифицированной вставки затем использовали полимеразную циклическую сборку (assembly PCR). Вставки расщепляли Sa/I и Not\ и использовали в реакции лигирования с pDOM33. Продукты лигирования библиотек затем использовали для трансформации штамма ТВ1 Е. coli электропорацией, и трансформированные клетки высеивали на чашки Петри с 2xTY агаром, содержащим 15 мкг/мл тетрациклина.
1) Стратегии селекции: Селекции относительно HSA. Проводили два цикла селекции относительно HSA. Во всех циклах каждую библиотеку CDR подвергали селекции в виде индивидуального пула. Оба цикла селекций проводили в растворе относительно биотинилированного HSA в концентрации 10 нМ. Библиотеки элюировали 0,1 М глицином, рН 2,0, перед нейтрализацией 1 М Tris, рН 8,0, и перед инфекцией клеток TG1 в логарифмической фазе. Продукты второго цикла каждой селекции субклонировали в pDOM5 для скрининга. Перекрестная селекция. Проводили два цикла селекции
относительно биотинилированного HSA в растворе. Проводили два цикла селекции с HSA (10 нМ, 1 нМ) и RSA (25 нМ, 10 нМ, 1 нМ) в разных порядках, с обработкой трипсином или без нее. Во всех циклах каждую библиотеку CDR подвергали селекции в виде индивидуального пула. Библиотеки элюировали 0,1 М глицином, рН 2,0, перед нейтрализацией 1 М Tris, рН 8,0, и перед инфекцией клеток TG1 в логарифмической фазе. Продукты второго цикла каждой селекции субклонировали в pDOM5 для скрининга.
2) Стратегия скрининга и определение аффинности
В каждом случае после селекции получали пул фаговой ДНК из подходящего цикла селекции, применяя набор QIAfilter midiprep (Qiagen), ДНК расщепляли рестрикционными ферментами Sail и Not1, и обогащенные V гены лигировали в соответствующие сайты в растворимом экспрессионном векторе pDOM5, который экспрессирует dAb с меткой myc (см. РСТ/ЕР2008/067789). Лигированную ДНК используют для трансформации химически компетентных клеток НВ 2151 Е. coli, которые затем выращивают в течение ночи на чашках с агаром, содержащих антибиотик карбенициллин. Образующиеся колонии индивидуально оценивают на связывание антигена. Для результата каждой селекции 93 колонии тестировали на связывание HSA и RSA посредством BIAcore(tm) (поверхностный плазмонный резонанс). Растворимые фрагменты dAb продуцировались в бактериальной культуре в культуральной среде ONEX (Novagen) в течение ночи при 37°С в 96-луночных планшетах. Супернатант культуры, содержащий растворимые dAb, центрифугировали и анализировали посредством BIAcore в отношении связывания на чипах СМ5 с HSA и RSA в высокой плотности. Клоны, для которых посредством скрининга скорости диссоциации было обнаружено, что они связываются с сывороточным альбумином из обоих данных видов в равной степени или лучше, чем исходный клон, секвенировали, выявляя уникальные последовательности dAb.
Гомология последовательности с исходными последовательностями показана ниже в Таблице 13.
Таблица 13
DOM7
h-14-56
DOM7
h-14-
DOM7
h-14-74
DOM7
h-14-76
DOM7 h-14-
DOM7
h-14-
100
DOM7
h-14-
101
D0M7 h-14-
0.972
0.981
0.962
0.972
0 981
0.972
0.972
DOM7
h-14-
109
DOM 7
h-14-
115
DOM?
h-14-
116
DOM? ti-1! 4** 119
DOM? h-14-
120
DOM7 h-14-
121
DOM7
h-14-
122
DOM?
h-14-
123
DOM7
h-14-
0.962
0,972
0.972
0.99
0.981
0.99
0.981
0.972
значение * 100 соответствует % гомологии последовательности
Уникальные dAb экспрессировались в виде бактериальных супернатантов во встряхиваемых колбах в 0,5 л среды Опех при 30°С в течение 48 ч при 250 об./мин. dAb очищали из культуральных сред адсорбцией с током белка L с последующей элюцией со 100 мМ глицином, рН 2,0. Для определения аффинности связывания (KD) AlbudAb с человеческим, крысиным, мышиным сывороточным альбумином и сывороточным альбумином яванского макака очищенные dAb анализировали посредством BIAcore в диапазоне концентрации альбумина от 500 нМ до 3,9 нМ (500 нМ, 250 нМ, 125 нМ, 31,25 нМ, 15,625 нМ, 7,8125 нМ, 3,90625 нМ).
Антиген MSA приобретали у Sigma (по существу не содержащий жирных кислот, ~99% (электрофорез в агарозном геле), лиофилизированный порошок, кат. № А3559), и CSA очищали из сывороточного альбумина яванского макака с использованием смолы Prometic blue (Amersham).
Аффинности ключевых клонов всех протестированных видов сывороточного альбумина представлены в Таблице 14.
3) Экспрессия и биофизическая характеристика:
Бактериальную экспрессию и характеристику посредством SEC MALLS и DSC проводили, как описано выше в Примере 4.
T/D и D/M указывает равновесие между тримером и димером или
димером и мономером, соответственно, при определении посредством SEC MALLS.
Таблица 14: характеристики вариантов DOM7h-14-10
RSA
HSA
CSA
MSA
Средний
Тепловая
Состоя-
уровень
стабиль-
ние в
экспрес-
ность
растворе
сии
Tm (°С)
вторым лаборантом.
М = мономер, D = димер, Т = тример; ND = не определяется.
DOM7h-14-100 имеет KD выраженную одним целым числом, в нМ, у всех протестированных видов. DOM7h-14-100 также представляет собой мономер в растворе, что является полезным.
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности перечислены ниже. У большинства клонов аргинин в положении 108 замещен мутацией на триптофан, что было сделано для обеспечения селекции с помощью трипсина, при ее необходимости (нокаутирование сайта распознавания трипсина) - эта
мутация не имела решающего значения для связывания AlbudAb с сывороточным альбумином.
Были получены другие клоны (см. DOM7h-14-119, DOM7h-14-120, DOM7h-14-121, DOM7h-14-122, DOM7h-14-122), в которых аминокислота в положении 108 была заменена обратной мутацией на аргинин (W108R) и, возможно, аминокислота в положении 106 была заменена обратной мутацией на изолейцин. Последовательности данных клонов перечислены ниже.
Выравнивание последовательностей показано на Фиг. 3.
Таблица 15: аминокислотные последовательности вариантов DOM7h-14-10
DOM7h-14-56 (SEQ ID NO: 72).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPMLLIMW
SSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQ
GTKVEIKW
DOM7h-14-65 (SEQ ID NO: 73),
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQ
GTKVEIKW
DOM7M4-74 (SEQ ID NO: 74),
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTYGK GTKVENKW
DOM7h-14-76 (SEQ ID NO: 75).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLKHPKTYGQ GTKVEIKW
DOM7h-14-82 (SEQ ID NO: 76).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGMRHPKTFGQ GTKVEIKW
DOM7h-14-100 (SEQ ID NO: 77).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTYGQ GTKVENKW
DOM7h-14-101 (SEQ ID NO: 78).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSALQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQ GTKVEIKW
DOM7h-14-109 (SEQ ID NO: 79).
DIQMTQSPSSLFASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRKPKTFGQ GTKVKIKW
DOM7h-14-115(SEQ ID NO: 80).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTYGQ GTKVEIKW
DOM7M4-116 (SEQ ID NO: 81),
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRYPKTFGQ
GTKVEIKW
DOM7h-14-119(SEQ ID NO: 82).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTYGQ GTKVEIKR
DOM7h-14-120 (SEQ ID NO: 83).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTYGQ GTKVENKR
DOM7h-14-121 (SEQ ID NO: 84).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSALQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTFGQ GTKVEIKR
DOM7h-14-122 (SEQ ID NO: 85).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTYGK GTKVEIKR
DOM7h-14-123 (SEQ ID NO: 86).
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQWIGSQLSWYQQKPGKAPKLLIMW RSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQGLRHPKTYGK GTKVENKR
Таблица 16: нуклеотидные последовательности вариантов DOM7h-
14-10
DOM7h-14-56 (SEQ ID NO; 87).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTATGCTCCTGATCATGTGG
AGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTG CTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAA
G GGACCAAGGTGGAAATCAAATGG
DOM7h-14-65 (SEQ ID NO: 88).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCGCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAATGG
DOM7h-14-74 (SEQ ID NO: 89).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TG G G ACAG ATTTCACT CTC ACC АТС AG CAG TCTGCAAC CTG AAG ATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTACGGCAAA
G G G AC С AAG G TG G AAAAC AAATG G
DOM7h-14-76 (SEQ ID NO; 90),
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTG CTCAGGGTTTGAAGCATCCTAAGACGTACGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAATGG
DOM7H-14-82 (SEQ ID NO: 91).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTATGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAATGG
DOM7h-14-100 (SEQ ID NO: 92),
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCAGCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGCGGCATCCTAAGACGTACGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAAACAAATGG
DOM7h-14-101 (SEQ ID NO: 93).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCGCGTTACAAAATGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAATGG
DOM7h-14-109 (SEQ ID NO: 94).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTTTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGAAACCTAAGACTTTCGGCCAA
G GGACCAAGGTGAAAATCAAATG G
DOM7h-14-115 (SEQ ID NO: 95).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCGCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAAACGTACGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAATGG
DOM7h-14-116 (SEQ ID NO: 96).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCGCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGTATCCTAAGACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAATGG
DOM7h-14-119 (SEQ ID NO: 97).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGCGGCATCCTAAGACGTACGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG DOM7h-14-120 (SEQ ID NO: 98).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGCGGCATCCTAAGACGTACGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAAACAAACGG
DOM7h-14-121 (SEQ ID NO: 99).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCGCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTGCTCAGGGTTTGAGGCATCCTAAGACGTTCGGCCAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
DOM7h-14-122 (SEQ ID NO: 100).
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACT GTG CTC AG G GTTTG AG G CATCCTAAG AC G TACG G С AAA
GGGACCAAGGTGGAAATCAAACGG
DOM7h-14-123 (SEQ ID NO: 101),
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGA
CCGTGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGTGGATTGGGTCTCAGTTAT
CTTGGTACCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCATGTGG
CGTTCCTCGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCACGTTTCAGTGGCAGTGGATC
TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTG
CTACGTACTACTGTG CTCAG GGTTTGAGGCATCCTAAGACGTAGGGCAAA
GGGACCAAGGTGGAAAACAAACGG
CDR1 DOM7h-14-36
CDR2 DOM7h-14-36
CDR3 DOM7h-14-36
Интерферон альфа 2b
Фрагмент 5' SOE IFNa2b
Фрагмент 3' SOE IFNa2b
Фрагмент 5' SOE Vk
Фрагмент 3' SOE Vk также для введения метки myc
Праймер, фланкирующий фрагмент 5' SOE IFNa2b
Праймер, фланкирующий фрагмент 3' SOE Vk, служащий также для введения метки myc
Лидерная последовательность
DMS7321 (IFNa2b-DOM7h-14) + myc
DMS7321 (IFNa2b-DOM7h-14)
DMS732 (IFNa2b-DOM7h-14-10) + myc
DMS732 (IFNa2b-DOM7h-14-10)
DMS7323 (IFNa2b-DOM7h-14-18) + myc
DMS7323 (IFNa2b-DOM7h-14-18)
DMS7324 (IFNa2b-DOM7h-14-19) + myc
DMS7323 (IFNa2b-DOM7h-14-19)
DOM7h-14 R108C
DOM7h-14-56
DOM7h-14-65
DOM7h-14-74
DOM7h-14-76
DOM7h-14-82
DOM7h-14-100
DOM7h-14-101
DOM7h-14-109
DOM7h-14-115
DOM7h-14-116
DOM7h-14-119
DOM7h-14-120
DOM7h-14-121
DOM7h-14-122
100
DOM7h-14-123
101
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Единичный вариабельный домен иммуноглобулина против
сывороточного альбумина (SA), выбранный из DOM7h-14-56 (SEQ ID NO: 72),
DOM7h-14-65 (SEQ ID NO: 73), DOM7h-14-74 (SEQ ID NO: 74), DOM7h-14-76
(SEQ ID NO: 75), DOM7h-14-82 (SEQ ID NO: 76), DOM7h-14-100 (SEQ ID NO: 77),
DOM7h-14-101 (SEQ ID NO: 78), DOM7h-14-109 (SEQ ID NO: 79), DOM7h-14-115
(SEQ ID NO: 80), DOM7h-14-116 (SEQ ID NO: 81), DOM7h-14-119 (SEQ ID NO:
82), DOM7h-14-120 (SEQ ID NO: 83), DOM7h-14-121 (SEQ ID NO: 84), DOM7h-14-
122 (SEQ ID NO: 85) и DOM7h-14-123 (SEQ ID NO: 86).
2. Мультиспецифичный лиганд, содержащий единичный вариабельный домен против SA по п. 1 и связывающую группировку, которая специфично связывается с антигеном-мишенью, отличным от SA.
3. Единичный вариабельный домен против SA по п. 1, где вариабельный домен конъюгирован с лекарственным средством (возможно лекарственным средством на основе NCE (новое химическое соединение)), возможно, где вариабельный домен или группировка представляет собой DOM7h-14-100 (SEQ ID NO: 77).
4. Слитый белок, содержащий полипептидное или пептидное
лекарственное средство, слитое с единичным вариабельным доменом по п. 1,
возможно, где вариант или группировка представляет собой DOM7h-14-100
(SEQ ID NO: 77).
5. Композиция, содержащая вариабельный домен, слитый белок или лиганд по любому из пп. 1-4 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, эксципиент или наполнитель.
6. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую единичный вариабельный домен по п. 1 или мультиспецифичный лиганд по п. 2 или слитый белок по п. 4.
7. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 87-101, или нуклеотидную последовательность, которая является по меньшей мере на 80% идентичной указанной выбранной последовательности.
8. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 6 или 7.
9. Выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор по п. 8.
10. Способ лечения или предупреждения заболевания или расстройства у пациента, включающий введение указанному пациенту по меньшей мере одной дозы вариабельного домена, лиганда, слитого белка или композиции по любому из пп. 1-5.
Остаток по Kabat
DOMT7h-14
DOM7h-14~lQ
DGM7h-14-18
DOM7h-14-19
DOM7h~14-23
DOM7h(tm)14~36
A i
D г
20 T
Остаток no Kabat
DOM7h-l4
DOM7h-14-10
DOM7h-14-lS
DOM7h-14~19
DOM7h-14-28
DOM7h-14-36
> i
т с
25 A
30 G
2 Ь s
35 ' W Y
Q Q
40 P
Остаток no Kabat
DOM7h~l4
DOM7h-14-10
DOM7h-14-lS
DOM7h-l4-19
DOM7h-14-28
DOM7h(tm)14~36
Остаток no Kabat
DOM7h-14 DOM7h-14-lO
К A
F S
45 '
К L
65 1
G S G S G
50 W
70 '
T D F
55 Q
75 I
G V P
60 s
eo p
о E и о
о я
о а " ы Е w Р 3 Е s
о р
(Г СП
и р
н Е
I о
Я Н
я я
Р и
> <5
Б со я я Е
DOM7h-14-28 DOM7h-14-19 DOM7h-14-28 DOM7h-14-36
Остаток no Kabat
DOM7h-14
DOM7h-14~10
DOM7h-14-18
DOM7h-14-19
DOM7h-14-28
DOM7b-14-36
B5 1
<
100
T Y
_¦_
Остаток no Kabat
DOM7h-14
DOM7h-l4-10
DQM7h~14-18
DOM7h-14-19
DOM7h-14-23
DOM7h-14-36
105 •
К V E I К R
о a to
Фиг. 1Б
о E w о
о ч о
о *2
о .
Е л Е
я н я я
Р 03
я я Е
человек
кинетика на основе линии DOM7h-14 и DOM7h-11 (интервалы, подтвержденные данными)
общий интервал
KD: от 1 до 10000
Kd: от 1,5е-4 до 0,1 ; Ка: от2е6 до 1е4
терапевтические интервалы
хроническое
промежуточное
острое
высокая аффинность
средняя аффинность
низкая аффинность
KD: 0,1-400
KD: 400-2000
KD: 2000-10000
Kd: от 1,5е-4 до 8е-3; Ка: от 1 еб до 5е4
Kd: от 8e-3 до 0,08; Ка: от 2е4 до 5е4
Kd: от 0,08 до 0,1; Ка: от 5е4 до 1 е4
возможные интервалы
KD: 1-200
KD: 400-1500
KD: 2000-6000
Kd: от Зе-4 до 2е-3; Ка: от 1 еб до 5е4
Kd: от 8е-3 до 0,08; Ка: от 2е4 до 6е4
Kd: от 0,08 до 0,1; Ка: от 5е4 до 2е4
Примеры
DOM7h-11-15, DOM7h-14, DOM7h-14-10, DOM7h-14-18, DOM7h-14-19, DOM7h-11-18, DOM7h-11-19, DMS7321, DMS7322; DMS7324, DMS7327
DMS7325, DMS7326; DMS7323
DOM7h-11
Яванский макак
общий интервал
KD: от 1 до 10000
Kd: от 1,5е-4 до 0,1 ; Ка: от2е6 до 1е4
терапевтические интервалы
хроническое
промежуточное
острое
высокая аффинность
средняя аффинность
низкая аффинность
KD: 0,1-400
KD: 400-2000
KD: 2000-10000
Kd: от 1,5е-4 до 8е-3; Ка: от 2е6 до 2е4
Kd: от 8e-3 до 0,08; Ка: от 2е4 до 5е4
Kd: от 0,08 до 0,1; Ка: от 5е4 до 1 е4
возможные интервалы
KD: 1-200
KD: 400-1500
KD: 2000-6000
Kd: от Зе-4 до 2е-3; Ка: от 1 еб до 1 е4
Kd: от 2е-3 до 0,05; Ка: от 2е4 до 1 е4
Kd: от 0,08 до 0,1; Ка: от 5е4 до 2е4
Примеры
DMS7327; DOM7h-11-15, DOM7h-14;
DOM7h-14-10; DOM7h-14-18;
DOM7h-14-19, DOM7h-14-28, DOM7h-14-36, DMS7321, DMS7322
DOM7h-11, DMS7326; DMS7324
DOM7h11-12, DOM7h11-18, DMS7325
Крыса
общий интервал
KD: от 1 до 10000
Kd: от 2е-3 до 0,15 ; Ка: от 2е6 до 1 е4
терапевтические интервалы
хроническое
промежуточное
острое
высокая аффинность
средняя аффинность
низкая аффинность
KD: 1-300
KD: 300-2000
KD: 2000-10000
Kd: от 2е-3 до 5е-2; Ка: от 2е6 до 2е5
Kd: от 5e-2 до 0,09; Ка: от 2е5 до 4,5е4
Kd: от 0,09 до 0,15; Ка: от 4,5е4 до 1,5е4
возможные интервалы
KD: 20-200
KD: 400-1800
KD: 2000-6000
Kd: от 9е-3 до 2е-2; Ка: от 1 еб до 1 е5
Kd: от 4е-2 до 0,09; Ка: от 1 е5 до 5е4
Kd: от 0,1 до 0,14; Ка: от 5е4 до Зе4
Примеры
DOM7h-11-15; DOM7h-11-12; DOM7h-11-18, DOM7h-11-19, DOM7h-14-28, DOM7h-14-36, DOM7h-14, DMS7327; DMS7322
DOM7h-14-18; DOM7h-14-19; DMS7321; DMS7323, DMS7324, DMS7326
DMS7325; DOM7h-11
Мышь
общий интервал
KD: от 1 до 10000
Kd: от 2е-3 до 0,15 ; Ка: от 2е6 до 1 е4
терапевтические интервалы
хроническое
промежуточное
острое
высокая аффинность
средняя аффинность
низкая аффинность
KD: 1-100
KD: 100-2000
KD: 2000-10000
Kd: от 2е-3 до 1е-2; Ка: от 2е6 до 1 е5
Kd: от 1e-2 до 0,07; Ка: от 1 е5 до Зе4
Kd: от 0,08 до 0,15; Ка: от 4е4 до 1,5е4
возможные интервалы
KD: от 1 до 80
KD: 120-2000
KD: 4000-10000
Kd: от 2е-3 до 1е-2; Ка: от 2е6 до 1,5е5
Kd: от 9е-3 до 0,07; Ка: от 1,3е5 до Зе4
Kd: от 0,1 до 0,15; Ка: от 2,5е4 до 1,5е4
Примеры
DOM7h-11-15; DOM7h-14; DOM7h-14-10, DOM7h-11-18, DOM7h-11-19, DOM7h-11-18, DOM7h-11-19, DOM7h-14-28, DOM7h-14-36, DMS7322, DMS7327
DMS7321; DMS7323; DMS7324; DOM7h-11-12; DMS7326
DMS7325; DOM7h-11
ФИГ. 3 (1/6)
Остаток по Kabat
DOM7h-
-10
DOM7h-
-100
DOM7h~
-101
DOM7h-
-103
DOM7h-
-115
DOM7h-
-116
DOM7h-
-119
DOM7h-
-120
DQM7h-
-121
DOM7h-
-122
DOM7h-
-123
DOM7h-
-56
DOM7h-
-65
DOM7h-
-74
DOM7h-
-76
DOM7h-
-82
5 T
10 S
15 V
20 T
о > а
а Я Я tr
Р и tr
О" м
I о
К Н В S Р со
ФИГ. 3 продолжение (2/6)
Остаток по
Kabat
D0M7h-
-10
DOM7h-
-100
DOM7h-
-101
D0M7h-
-109
DOM.7h-
-115
DOM7h-
-116
DOM7h-
-119
DOM7h-
-120
D0M7h-
-121
DOM7h-
-122
DOM7h-
-123
D0M7h-
-56
DOM7h-
-65
DQM7h-
-74
DQM7h-
-76
DOM7h-
-82
T с
25 A
w 30 G
s 4
35 W
Q Q
40 P
a о
о н о
л а я Л ° ТЗ
п S
0 Р
Р 5
5 Е
3* я
5 чз
1 3 я я р "
Я Я
ФИГ. 3 продолжение (3/6)
Остаток по Kabat
DOM7h-
-10
DGM7h-
-100
DOM7h-
-101
DOM7h-
-109
DOM7h-
-115
DOM7h-
-116
DOM7h-
-119
DOM7h-
-120
DOM7h-
-121
DOM7h-
-122
DOM7h-
-123
DOM7h-
-56
DOM7h-
-65
DOM7h~
-74
DOM7h-
-76
DOM7h-
-82
1 I
G К
50 W
55 1 S L Q S
60 5
о да
о E a о чз о н о л я
g < <5 я а н
Е * Е
о "2
и tr
& Я
s g
я я
ФИГ. 3 продолжение (4/6)
Остаток по Kabat
DOM7h-
-10
DOM7h-
-100
DOM7h-
-101
DOM7h-
-109
DOM7h-
-115
DOM7h-
-116
DOM7h-
-119
DOM7h-
-120
DOM7h-
-121
DOM7h-
-122
DOM7h-
-123
DOM7h-
-56
DOM7h-
-65
DOM7h-
-74
DOM7h-
T76
D0M7h-
-82
65 S
70 D
7 5
80 P
о оз "
03 О 43
о н о
Л 03
Я Р
° Т2
п К О Р
р ^
Er Е а" м
" К Р 03
а я Е
ФИГ. 3 продолжение (5/6)
Остаток по Kabat
DOM7h-
-10
DOJ47h-
-100
DOM7h-
-101
DOM7h-
-109
DOM7h-
-115
DOM7h-
-116
DOH7h-
-119
DOM7h-
-120
DOM7h-
-121
DOM7h-
-122
DOM7h-
-123
DOM7h-
-56-
DOM7h-
-65
DOM7h-
-74
DOMlh-
-76
DOM7h-
-82
85 T
90 Q
К Y
95 P
F Y
Y Y
Y Y
Y Y
100 Q
К К
о н о
Л 03
р и tr
ОХ м
I о
К н Я S
Р 03
° ё
,, и
Е * Б
CD "
Я Е
ФИГ. 3 продолжение (6/6)
Остаток по Kabat
105
DOM7h-14-10
DOM7h-14-100
DOM7h-14-101
DOM7h-14-lQ9
DOM7h-14-115
DOM7h-14-116
DOH7h-14-119
DOM7h-14-12 0
DOM7h-14-121
DOM7h-14-122'
DOM7h-14-123
DOM7b_-14-56
DOM7h-14-65
DOM7h-14-74
DOM7h-14-76
DOM7h-14-82
о w to
" *
О о
43 в
о -S
д я
о (tm)
- "
Я P
° 43
° §s и
tr E ^
.21 я Б
' < CD
§ о 5
s н 3
Я Я E
Р W CD
Фиг. 1A
Фиг. 1A
Фиг. 2А
Фиг. 2Б
Фиг. 2В
Фиг. 2Г