EA201370030A1 20130628 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2013/PDF/201370030 Полный текст описания [**] EA201370030 20110810 Регистрационный номер и дата заявки US61/372,432 20100810 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2011/047289 Номер международной заявки (PCT) WO2012/021648 20120216 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [pdf] eaa21306 Номер бюллетеня [**] БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ IN VITRO СВЯЗЫВАНИЯ МИШЕНИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ К АНТИТЕЛАМ-МИШЕНЯМ Название документа [8] G01N 33/53, [8] G01N 33/564, [8] G01N 33/68 Индексы МПК [US] Чень Синуй Синтия, [US] Сиволи Франческа, [US] Гупта Шалини Сведения об авторах [US] АМГЕН ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201370030a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[**]

Описывается способ количественного анализа in vitro. Данный неклеточный бифункциональный количественный анализ связывания мишени полезен для обнаружения как антитела-мишени IgG, такого как биологический препарат, в биологическом образце (например, образце сыворотки), так и присутствия нейтрализующих антител (NAb) к антителу-мишени IgG.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Описывается способ количественного анализа in vitro. Данный неклеточный бифункциональный количественный анализ связывания мишени полезен для обнаружения как антитела-мишени IgG, такого как биологический препарат, в биологическом образце (например, образце сыворотки), так и присутствия нейтрализующих антител (NAb) к антителу-мишени IgG.


Евразийское (21) 201370030 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.06.28
(22) Дата подачи заявки
2011.08.10
(51) Int. Cl.
G01N 33/53 (2006.01) G01N33/564 (2006.01) G01N33/68 (2006.01)
(54) БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ IN VITRO СВЯЗЫВАНИЯ МИШЕНИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ К АНТИТЕЛАМ-МИШЕНЯМ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
61/372,432
2010.08.10
PCT/US2011/047289
WO 2012/021648 2012.02.16
Заявитель:
АМГЕН ИНК. (US)
Изобретатель:
Чень Синуй Синтия, Сиволи Франческа, Гупта Шалини (US)
Представитель: Соболев А.Ю. (RU)
(57) Описывается способ количественного анализа in vitro. Данный неклеточный бифункциональный количественный анализ связывания мишени полезен для обнаружения как антитела-мишени IgG, такого как биологический препарат, в биологическом образце (например, образце сыворотки), так и присутствия нейтрализующих антител (NAb) к антителу-мишени IgG.
БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ IN VITRO СВЯЗЫВАНИЯ МИШЕНИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ К АНТИТЕЛАМ-МИШЕНЯМ
Рассматриваемая заявка содержит соответствующий перечень последовательностей в текстовом формате представленного ASCII., поданный при помощи EFS-WEB от 10 августа 2010 и который служит одновременно в читаемой на компьютере форме (ЧКФ), так и на бумажном носителе , требуемых статьями 1.821 (с) и 1.821(e) 37 C.F.R (Свода федеральных правил), и включается в настоящее описание по ссылке в полном объеме. Наименование текстового файла, созданного 10 августа 2010 г.: A-1586-US -PSP-SeqList081010_ST25.txt, его размер - 25 кб.
По всей настоящей заявке в круглых или квадратных скобках даются ссылки на различные публикации. Текст этих публикаций в полном объеме включается по ссылке в настоящую заявку с целью более полного описания уровня техники, которого касается настоящее изобретение.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники
Настоящее изобретение касается области терапевтических антител. Уровень техники
Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ) является одним из механизмов гуморального иммунного ответа. При ответе АЗКЦ клетка-эффектор иммунной системы, которым обычно является естественная клетка-киллер (NK-клетка), активно лизирует клетку-мишень, связанную специфическими антителами, которые связались с белком-мишенью на поверхности клетки-мишени. Нейтрофилы и эозинофилы также могут опосредовать АЗКЦ. Например, эозинофилы при помощи АЗКЦ могут убивать определенных паразитических червей, известных как гельминты. Сообщалось, что антитела различных изотипов IgG обладают некоторой активностью АЗКЦ, однако обычно изотипы IgGl и IgG3 характеризуют как обладающие значительной антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью (АЗКЦ). В одном исследовании сообщалось, что антитела IgGl и IgG3 одинаково эффективны в опосредовании моноцитарного или активированного клетками U937 АЗКЦ; IgGl проявлял большую активность, чем IgG3 в АЗКЦ, опосредованной NK-клетками. (Rozsnyay et al., Distinctive role of IgGl and IgG3 isotypes in Fc gamma R-mediated functions, Immunology
66(4): 491-498 (1989)). Сенсибилизированные IgG3 эритроциты, согласно сообщениям, ингибировали индуцированный IgGl лизис, что дает основание полагать, что каждый подкласс задействует один и тот же Fc-raMMa-R-рецептор, однако такой лизис требует дополнительного "сигнала", который молекула IgG3 выдать не может. (Rozsnyay et al., там же). Было установлено, что подходящим рецептором для эффекторной функции АЗКЦ является FcyRIIIa (CD 16а).
Исследования показали, что удаление фукозы из олигосахаридов человеческих антител IgGl дает в результате существенное повышение антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) за счет улучшенного связывания IgGl с FcyRIIIa и может снизить плотность антигенов, требуемую для индукции АЗКЦ, за счет эффективного привлечения и активации NK-клеток. (Niwa et al., Enhanced Natural Killer Cell Binding и Activation by Low-Fucose IgGl Antibody Results in Potent Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Induction at Lower Antigen Density, Clinical Cancer Research 11: 2327 (2005); Satoh et al., Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies, Expert Opinion on Biological Therapy 6(11): 1161-1173 (2006)). Это явление может быть особенно полезным в терапевтическом антителе. Терапевтические моноклональные антитела, такие как ритуксимаб (Rituxan(r)) и трастузумаб (Herceptin(r)) широко используются в лечении новообразований и/или аутоиммунных заболеваний. (Stavenhagen et al., Fc Optimization of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability to Kill Tumor Cells In vitro and Controls Tumor Expansion In vivo via Low-Affinity Activating Fey Receptors, Cancer Research 67(18):8882-90 (2007); Clynes, RA et al., Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets, Nat Med 6 (4): 443-46 (2000); Hauser et al., B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis, NEJM 358:676-88 (2008)). Проводится разработка KW-0761 (также известного как "могамулизумаб" или "AMG 761") для лечения пациентов с кожной Т-клеточной лимфомой (КТКЛ) или узловой Т-клеточной лимфомой (УТКЛ). KW-0761 - это гуманизированное моноклональное антитело иммуноглобулина G, подкласса 1 (IgGl) изотипа каппа, нацеленное на клетки, экспрессирующие СС рецептор хемокина 4 (CCR4), которое показало способность снижать Т-лимфоциты, экспрессирующие CCR4 при помощи АЗКЦ. KW-0761 повышал активность АЗКЦ за счет дефукосиляции из олигосахарида комплексного типа в константном участке (Fc). (Ishii et al., Defucosylated Humanized Anti-CCR4 Monoclonal Antibody KW-0761 as a Novel Immunotherapeutic Agent for Adult T-cell Leukemia/Lymphoma, Clinical Cancer Research 16: 1520-31 (2010); Shitara et al., Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof, патент США 7504104).
Нейтрализующее антитело, или NAb, - это молекула иммуноглобулина, вступающая в реакцию со специфическим антигеном, который обычно индуцировал его синтез in vivo, и с подобными молекулами. Нейтрализующие антитела в зависимости от механизма действия подразделяют на агглютинин, бактериолизин, гемолизин, опсонин или преципитин. Антитела синтезируются В-лимфоцитами, активированными путем связывания антигена с рецептором на поверхности клетки, а нейтрализующие антитела могут устранять или "нейтрализовать" биологический эффект антигена, который может быть, например, на поверхности патогенного организма. К сожалению, терапевтические антитела также могут иногда индуцировать производство нейтрализующих антител у некоторых пациентов, поэтому для клинической безопасности важно иметь возможность контролировать появление нейтрализующих антител, направленных против терапевтического антитела, в сыворотке крови пациента, принимающего лекарственный препарат с терапевтическим антителом.
Желательным преимуществом, обеспечиваемым настоящим изобретением, является не основанный на клетках, способ количественного анализа in vitro для обнаружения указанных терапевтических антител IgG, которые могут индуцировать АЗКЦ, а также для обнаружения нейтрализующих антител против указанных терапевтических антител в сыворотке пациента.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение направлено на создание бифункционального количественного анализа in vitro связывания мишени, полезного для обнаружения как антитела-мишени IgG, такого как биологический препарат, в биологическом образце (например, образце сыворотки), так и присутствия нейтрализующих антител (NAb) к антителу-мишени IgG. В одном варианте воплощения изобретения способ количественного анализа in vitro по настоящему изобретению включает обнаружение в покрытой авидином лунке путем измерения сигнала в присутствии свежего объема буфера, позволяющего провести обнаружение в физиологических условиях, любого антитела, специфически связывающего полигистидин, который связан с меченым полигистидином рекомбинантным человеческим полипептидом CD 16а, причем покрытую авидином лунку предварительно блокировали, а затем предварительно инкубированную реакционную смесь инкубировали в блокированной покрытой авидином лунке в физиологических условиях, причем предварительно инкубированную реакционную смесь суспендировали во время ее предварительной инкубации в содержащем сыворотку водном буфере для количественного анализа, а предварительно инкубированная реакционная смесь включала:
(i) связывающий антиген-мишень белок, включающий Fc-домен с центром связывания CD 16а; и
(ii) биотинилированную часть полипептида представляющего интерес белка-мишени, с которым специфически связывается полипептидная часть связывающего антиген-мишень белка; и
причем после инкубации предварительно инкубированной реакционной смеси в покрытой авидином лунке проводили инкубацию в физиологических условиях меченого полигистидином рекомбинантного человеческого полипептида CD 16а, суспендированного в свежем объеме буфера для количественного анализа, вместе с любым связывающим антиген-мишень белком, который был связан с биотинилированной частью полипептида, которая была связана с авидином покрытой авидином лунки; и причем до обнаружения сигнала путем измерения антитело, специфически связывающееся с полигистидином, суспендированное в свежем объеме буфера для количественного анализа, инкубировали в лунке в физиологических условиях вместе с любым меченым полигистидином рекомбинантным человеческим полипептидом CD 16а, который был связан со связывающим антиген-мишень белком.
Некоторые варианты воплощения способа дополнительно включают до обнаружения антитела, которое специфически связывает полигистидин, шаг инкубации в лунке в физиологических условиях антитела, которое включает конъюгированную вырабатывающую сигнал метку, суспендированного в свежем объеме буфера для количественного анализа, причем антитело специфически связывает антитело, которое специфически связывает полигистидин.
В конкретном варианте воплощения способ количественного анализа in vitro по настоящему изобретению включает следующие шаги:
(а) инкубация в блокированной покрытой авидином лунке в физиологических
условиях предварительно инкубированной реакционной смеси, суспендированной в
водном буфере для количественного анализа, содержащем сыворотку, причем
предварительно инкубированная реакционная смесь включает:
(i) антитело-мишень IgG, включающее Fc-домен с центром связывания CD 16а; и
(ii) биотинилированную часть полипептида представляющего интерес белка-мишени, с которым специфически связывается полипептидная часть антитела-мишени IgG;
(б) инкубация в лунке в физиологических условиях меченого полигистидином
рекомбинантного человеческого полипептида CD 16а, суспендированного в свежем объеме
буфера для количественного анализа, вместе с любым антителом-мишенью IgG, которое
было связано с биотинилированной частью полипептида, которая была связана с авидином
по пункту (а);
(в) инкубация в лунке в физиологических условиях антитела, которое специфически
связывает полигистидин, причем указанное антитело суспендировано в свежем объеме
буфера для количественного анализа, вместе с любым меченым полигистидином
рекомбинантным человеческим полипептидом CD 16а, который был связан с антителом-
мишенью IgG по пункту (б); и
(г) обнаружение в лунке в присутствии свежего объема буфера, позволяющего
выполнить обнаружение в физиологических условиях, любого антитела, которое
специфически связывает полигистидин, который был связан с меченым полигистидином
рекомбинантным человеческим полипептидом CD 16а по пункту (в) путем измерения
сигнала.
В некоторых вариантах воплощения изобретения способ дополнительно включает до шага (г) шаг инкубации в лунке в физиологических условиях антитела, которое включает конъюгированную вырабатывающую сигнал метку, суспендированного в свежем объеме
буфера для количественного анализа, причем указанное антитело специфически связывает антитело, которое специфически связывает полигистидин по пункту (в). В другом полезном варианте воплощения способ количественного анализа in vitro включает следующие шаги:
(а) инкубация в блокированной покрытой авидином лунке в физиологических
условиях предварительно инкубированной реакционной смеси, суспендированной в
водном буфере для количественного анализа, содержащем сыворотку, причем
предварительно инкубированная реакционная смесь включает:
антитело-мишень IgG к человеческому CCR4, включающее Fc-домен с центром связывания CD 16а;
образец сыворотки, предназначенный для анализа на присутствие нейтрализующих антител; и
биотинилированная часть полипептида человеческого CCR4, с которой специфически связывается полипептидная часть антитела-мишени IgG;
(б) инкубация в лунке в физиологических условиях меченого полигистидином
рекомбинантного человеческого полипептида CD 16а, суспендированного в свежем объеме
буфера для количественного анализа, вместе с любым антителом-мишенью IgG,
связанным с биотинилированной частью полипептида человеческого CCR4, связанного с
авидином по пункту (а);
(в) инкубация в лунке в физиологических условиях антитела, которое специфически
связывает полигистидин, причем указанное антитело суспендировано в свежем объеме
буфера для количественного анализа вместе с любым меченым полигистидином
рекомбинантным человеческим полипептидом CD 16а, связанным с антителом-мишенью
IgG по пункту (б);
(г) инкубация в лунке в физиологических условиях антитела, которое включает
конъюгированную вырабатывающую сигнал метку, суспендированного в свежем объеме
буфера для количественного анализа, причем указанное антитело специфически связывает
антитело, которое специфически связывает полигистидин по пункту (в); и
(е) обнаружение в лунке в присутствии свежего объема буфера, позволяющего провести обнаружение в физиологических условиях, любого выработанного сигнала. В различных вариантах воплощения изобретения сигнал может быть выработан чувствительной электрохемилюминесцентной (ЭХЛ) системой мечения, при этом полезными вариантами воплощения могут быть также системы мечения на основе флуоресцентных меток (например, флуоресцеина, фикоэритрина, фикоцианина,
аллофикоцианина, зеленого флуоресцентного белка [GFP], улучшенного зеленого флуоресцентного белка[еОБР], желтого флуоресцентного белка [YFP], голубого
125 14 13 35 3 2
флуоресцентного белка [CFP] и т.п.), изотопных меток (например, LL% "С, "С, S, JH, ZH,
13 15 18 IT
"N, iJN, i00, и т.п.) или иммуноферментные системы мечения (например, на основе пероксидазы хрена, бета-галактозидазы или люциферазы). Сигнал обнаруживают с использованием подходящего инструмента.
Если биологический образец содержит нейтрализующие антитела к антителу-мишени IgGl, антитело-мишень не сможет связаться с представляющим интерес биотинилированным пептидом-мишенью, захваченным на твердой подложке, покрытой авидином. Поэтому в присутствии нейтрализующих антител генерируется низкий сигнал (например, ЭХЛ). При отсутствии нейтрализующих антител генерируется высокий сигнал (например, ЭХЛ), потому что антитело-мишень IgGl способно создать мостик между биотинилированным пептидом-мишенью и меченым полигистидином рекомбинантным человеческим FCyRIIIa (CD 16а).
Многочисленные дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны после рассмотрения фигур и подробного описания изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 показано схематическое представление варианта воплощения бифункционального количественного анализа по изобретению, скомплектованного для обнаружения антитела-мишени IgGl (например, KW-0761, также известного как "могамулизумаб" или "AMG 761"), которое специфически связывает представляющий интерес биотинилированный ("В") белок-мишень (например, CCR4), а также для обнаружения нейтрализующих антител в образце сыворотки. В этом варианте воплощения покрытый авидином планшет представляет собой "планшет MSD 6000" (Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, Мэриленд), покрытый стрептавидином ("СА"), а для обнаружения используется система электрохемилюминесцентного (ЭХЛ) мечения на основе белкового конъюгата SULFO-TAG(tm) (Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, Мэриленд). При обнаружении использовался планшет-ридер SECTOR(r) Imager 6000 ("MSD 6000"). На фигуре 2 показана блок-схема шагов варианта воплощения количественного анализа in vitro по настоящему изобретению для обнаружения нейтрализующих антител к антителу-мишени IgGl.
На фигуре 3 показан репрезентативный ответ на дозу для KW-0761 (также известный как "могамулизумаб" или "AMG 761") в количественном анализе по настоящему изобретению в присутствии буфера для количественного анализа (0% сведенной в пул сыворотки (PHS)) или сведенной в пул сыворотки ("PHS": 5% PHS или 20% PHS; (об./об.)).
На фигуре 4 продемонстрировано, что связывание KW-0761 (также известного как "могамулизумаб" или "AMG 761") с биотинилированным пептидом CCR4 ингибируется присутствием поликлональных нейтрализующих антител к KW-0761 в зависимости от дозы.
На фигуре 5 продемонстрировано, что ритуксимаб связывается с биотинилированными пептидами CD20 в зависимости от дозы в том же формате количественного анализа, который схематически представлен на фигуре 1 и фигуре 2, описанного и модифицированного в примере 3. "МВТ4736" обозначает SEQ ID N0:7; "МВТ4737" обозначает SEQ ID N0:8.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Используемые в настоящем описании заголовки разделов предназначены только для организационных целей, и их не следует рассматривать в качестве ограничения описанного предмета изобретения. Определения
Если в настоящем описании не приведено иного определения, научно-технические термины, используемые в связи с настоящей заявкой, имеют значения, которые обычно понимаются под этими терминами специалистами в данной области. Кроме того, если контекстом не требуется иного, термины в единственном числе включают множественное число, а термины во множественном числе включают единственное число. Так, используемые в настоящем описании и прилагаемых пунктах формулы изобретения формы в единственном числе включают соответствующие формы во множественном числе, если контекстом четко не указано иное. Например, ссылка на "белок" включает множество белков, ссылка на "клетку" включает популяции множества клеток. Термины "полипептид" и "белок" используются в настоящем описании взаимозаменяемо и включают молекулярную цепь двух или более аминокислот, связанных ковалентно через пептидные связи. Эти термины не обозначают конкретную длину продукта. Так, "пептиды" и "олигопептиды" входят в определение полипептида. Эти термины включают посттрансляционные модификации полипептида, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Кроме того, в определение полипептида входят фрагменты, аналоги белков, мутировавшие или вариантные белки, гибридные белки и т.п. Эти термины также включают молекулы, в которые входят один или более аминокислотных аналогов или неканонических либо неестественных аминокислот, которые могут быть выражены рекомбинантно с использованием известных способов белковой инженерии. Кроме того, гибридные белки могут быть дериватизированы согласно настоящему описанию с использованием хорошо известных способов органической химии.
Упоминаемый в настоящем описании термин "изолированный белок" означает, что рассматриваемый белок (1) не содержит, по меньшей мере, некоторых других белков, с которым он обычно встречается в природе, (2) в основном не содержит других белков из того же источника, например, от того же вида, (3) экспрессируется рекомбинантно клеткой гетерологического вида или рода, (4) был отделен по меньшей мере от примерно 50 процентов полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, с которыми он
связан в природе, (5) функционально связан (путем ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе, и/или (6) не встречается в природе. Обычно "изолированный белок" составляет по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 25% или по меньшей мере примерно 50% данного образца. Такой изолированный белок может кодироваться геномным ДНК, кДНК, мРНК или другой РНК синтетического происхождения или любой их комбинацией. Предпочтительно, чтобы изолированный белок в основном не содержал белков или полипептидов либо других примесей, которые встречаются в его природной среде, которые могли бы помешать его терапевтическому, диагностическому, профилактическому, исследовательскому или иному применению. В дальнейшем описании любых полипептидов или белков, а также вариантов часто применяется система однобуквенных сокращений для обозначения двадцати остатков "канонических" аминокислот, которые обычно входят в состав пептидов и белков, встречающихся в природе (таблица 1). Эти однобуквенные сокращения полностью взаимозаменяемы в значении с трехбуквенными сокращениями или несокращенными названиями аминокислот.
Таблица 1. Однобуквенные сокращения канонических аминокислот. Трехбуквенные сокращения приведены в скобках.
Алании (Ala) А
Глутамин (Gin) Q
Лейцин (Leu) L
Серии (Ser) S
Аргинин (Arg) R
Глутаминовая кислота (Glu) Е
Лизин (Lys) К
Треонин (Thr) Аспарагин (Asn) Глицин (Gly) Метионин (Met) Триптофан (Тгр) Аспарагиновая кислота (Asp) Гистидин (His)
Фенилаланин (Phe)
Тирозин (Туг) Цистеин (Cys) Изолейцин (Не) Пролин (Pro) Валин (Val)
Аминокислотное замещение в аминокислотной последовательности обычно в настоящем описании обозначается однобуквенным сокращением для аминокислотного остатка в определенном положении, после чего указывается числовое аминокислотное положение по отношению к первоначальной представляющей интерес последовательности, а затем следует однобуквенный символ для замещенного аминокислотного остатка. Например, "T30D" обозначает замещение остатка треонина остатком аспартата в аминокислотном положении 30 по отношению к первоначальной представляющей интерес последовательности. Другой пример, "W101F", обозначает замещение остатка триптофана остатком фенилаланина в аминокислотном положении 101 по отношению к первоначальной представляющей интерес последовательности. В рамках настоящего изобретения в пептид могут включаться остатки неканонических аминокислот путем применения известных способов белкового инжиниринга, в которых используются рекомбинантно экспрессирующие клетки (см., например, Link et al., Non-canonical amino acids in protein engineering, Current Opinion in Biotechnology, 14(6):603-609 (2003)). Термин "остаток неканонической аминокислоты" обозначает аминокислотные остатки D- или L-формы, которые не относятся к 20 каноническим аминокислотам, обычно входящим в белки, встречающиеся в природе, например, Р-аминокислоты, гомоаминокислоты, циклические аминокислоты и аминокислоты с дериватизированными боковыми цепями. К примерам относятся (в L-форме или в D-форме) Р-аланин, Р-аминопропионовая кислота, пиперидиновая кислота, аминокапроновая кислота, аминогептановая кислота, аминопимелиновая кислота, десмозин, диаминопимелиновая кислота, №-этилглицин, №-этиласпаргин, гидроксилизин, алло-гидроксилизин, изодесмозин, алло-изолейцин, ю-метиларгинин, №-метилглицин, №-метилизолейцин, №-метилвалин, у-карбоксиглутамат, s-N,N,N-TpHMeTnruiroHH, s-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, №-ацетилсерин, №-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин и другие подобные аминокислоты, а также перечисленные в таблице 2 ниже, и дериватизированные формы любого из них
согласно настоящему описанию. В таблице 2 содержатся некоторые примеры остатков неканонических аминокислот, которые полезны согласно настоящему изобретению, и соответствующие сокращения, обычно используемые в настоящем описании, хотя опытный специалист-практик поймет, что разные сокращения и номенклатуры могут касаться одного и того же вещества и использоваться в настоящем описании взаимозаменяемо.
(3-гомолизин
bhomoK
(3-гомо Tic
BhTic
(3-гомофенилаланин
BhPhe
(3-гомопролин
BhPro
(3-гомотриптофан
BhTrp
4,4'-бифенилаланин
Bip
(3, (3-дифенил-аланин
BiPhA
(3-фенилаланин
BPhe
/> -карбоксил-фенилаланин
Cpa
цитруллин
Cit
цик логе кси лаланин
Cha
цик логе кси лглицин
Chg
циклопентилглицин
Cpg
2-амино-З-гуанидинопропио новая кислота
3G-Dpr
а, у-диаминомасляная кислота
Dab
2,4-диаминомасляная кислота
Dbu
диаминопропионовая кислота
Dap
а, (3-диаминопропионовая кислота (или 2,3-диаминопропионовая кислота)
Dpr
3,3 -д ифенилаланин
Dip
4-гуанидинфенилаланин
Guf
4-гуанидинпролин
4GuaPr
гомоаргинин
hArg; hR
гомоцитруллин
hCit
гомоглутамин
гемолизин
hLys; hK; homoLys
гомофенилаланин
hPhe; homoPhe
4-гидроксипролин (или гидроксипролин)
Hyp
2-инданилглицин (или инданилглицин)
Igl
индолин-2-карбоновая кислота
Idc
йодотирозин
I-Tyr
Lys \|/(СН2КН)-восстановленная
rLys
амидная связь
метиониноксид
Met[0]
метионинсульфон
Met[0]2
А^-метиларгинин
NMeR
Na-[(CH2)3NHCH(NH)NH2] замещенный глицин
N-Arg
А^-метилцитруллин
NMeCit
N "-мети лг лу тамин
NMeQ
А^-метилгомоцитруллин
N"-MeHoCit
N "-мети лго мо лизин
NMeHoK
А^-метиллейцин
N"-MeL; NMeL; NMeLeu; NMe-Leu
А^-метиллизин
NMe-Lys
TVe-метил-лизин
N-eMe-K
TVe-этил-лизин
N-eEt-K
TVe-изопропил-лизин
N-eIPr-K
А^-метилнорлейцин
NMeNle; NMe-Nle
А^-метилорнитин
Na-MeOrn; NMeOrn
А^-метилфенилаланин
NMe-Phe
4-метил-фенилаланин
MePhe
а-метилфенилаланин
AMeF
А^-метилтреонин
NMe-Thr; NMeThr
А^-метилвалин
NMeVal; NMe-Val
7Ve-(0-(aMHH03THn)-0'-(2-nponaHofin)-ундекаэтиленгликоль)-лизин
K(NPegll)
7Ve-(0-(aMHH03THn)-0'-(2-nponaHofin)-(этиленгликоль)27-лизин
K(NPeg27)
3-( 1 -нафтил)аланин
1-Nal; INal
3-(2-нафтил)аланин
2-Nal; 2Nal
нипекотиновая кислота
Nip
нитрофенилаланин
nitrophe
норлейцин
Nle
норвалин
Nva или Nvl
О-метилтирозин
Ome-Tyr
октагидроиндол-2-карбоновая кислота
Oic
орнитин
Orn
Orn \|/(СН2КН)-восстановленная амидная связь
rOrn
4-пиперидинилаланин
4PipA
4-пиридинилаланин
4Pal
3 -пиридинилаланин
3Pal
2-пиридинилаланин
2Pal
пара-аминофенилаланин
4AmP; 4-Amino-Phe
пара-йодофенилаланин (или 4-йодофенилаланин)
pl-Phe
фенилглицин
Phg
4-фенил-фенилаланин (или бифенилаланин)
4Bip
4,4'-бифенил аланин
Bip
пипеколиновая кислота
Pip
4-амино-1 -пиперидин-4-карбоновая кислота
4Pip
саркозин
Sar
1,2,3,4-тетрагидроизохинолин
Tic
1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-1-карбоновая кислота
Tiq
1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-гидрокси-3-карбоновая кислота
Hydroxyl-Tic
1,2,3,4-тетрагидроноргарман-З-карбоновая кислота
Tpi
тиазолидин-4-карбоновая кислота
Thz
3 -тие нилаланин
Номенклатура и символы аминокислот и пептидов Объединенной комиссии по биохимической номенклатуре (JCBN) Международного союза общей и прикладной химии (ШРАС) и Международного союза биохимиков (IUB) были опубликованы в следующих документах: Biochem. I, 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; 1993, 213, 2; Internat. J. Pept. Prot. Res., 1984, 24, following p 84; J. Biol. Chem., 1985, 260, 14-42; Pure Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; Amino Acids and Peptides, 1985, 16, 387-410;
Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, pages 39-69.
"Вариант" полипептида (например, антигенсвязывающий белок или антитело) включает аминокислотную последовательность, в которую вставляется, из которой удаляется один или более аминокислотных остатков, и/или замещается в аминокислотной последовательности по отношению к другой полипептидной последовательности. Варианты включают гибридные белки.
Термин "гибридный белок" указывает на то, что белок является химерой, включающей полипептидные компоненты, производные из более чем одного родительского белка или полипептида, или из того же белка, однако расположенные в пределах одной гибридной молекулы в другом порядке, чем тот, который встречается в природе вместе в одной и той же молекуле белка. Обычно гибридный белок экспрессируется из гибридного гена, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептидную последовательность из одного белка, добавляется внутри рамки считывания к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидную последовательность от другого белка, и необязательно отсоединяется линкером от нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидную последовательность от другого белка. Затем гибридный ген может быть экспрессирован рекомбинантной клеткой-хозяином как один белок.
"Секретируемый" белок обозначает те белки, которые могут быть направлены в эндоплазматическую сеть (ЭС), секреторные пузырьки или внеклеточное пространство под действием секреторной сигнальной пептидной последовательности, а также те белки, которые выделяются во внеклеточное пространство и не обязательно содержат сигнальную последовательность. Если секретируемый белок выделяется во внеклеточное пространство, секретируемый белок может подвергаться внеклеточному процессингу для создания "зрелого" белка. Выделение во внеклеточное пространство может происходить под действием множества механизмов, в том числе экзоцитоза и протеолитического расщепления. В некоторых других вариантах воплощения состава по настоящему изобретению полипептид может быть синтезирован клеткой-хозяином в виде секретируемого белка, который затем может быть дополнительно очищен из внеклеточного пространства и/или среды.
В некоторых шагах способа количественного анализа in vitro по настоящему изобретению молекула или смесь молекул "суспендируется" в водной жидкости, например, в содержащем сыворотку буфере для количественного анализа или в свежем объеме буфера
для количественного анализа. Термин "суспендированный" означает, что молекула или смесь растворена в жидкости, рассеяна, плавает, перемещается в ней или смешивается с ней.
Используемый в настоящем описании термин "растворимый", когда он касается белка, производимого по технологии рекомбинантного ДНК в клетке-хозяине, - это белок, существующий в водном растворе; если белок содержит твин-аргинин сигнальную аминокислотную последовательность, растворимый белок экспортируется в периплазматическое пространство в грамм-негативных бактериях-хозяевах, или секретируется в среду культивирования эукариотическими клетками-хозяевами, способными к секретированию, или бактериями-хозяевами, обладающими соответствующими генами (например, kil-ген). Таким образом, растворимый белок - это белок, который отсутствует во включении внутри клетки-хозяина. В качестве альтернативы в зависимости от контекста растворимый белок - это белок, который не интегрирован в клеточные мембраны или in vitro растворен или может быть растворен в водном буфере в физиологических условиях без образования значительных количеств нерастворимых агрегатов (т.е. формирует агрегаты в количестве менее 10%, а обычно менее примерно 5% общего белка), когда он суспендируется без других белков в представляющем интерес водном буфере в физиологических условиях, причем такой буфер не содержит детергента или разобщающего агента, такого как мочевина, гуанидиния гидрохлорид или перхлорат лития. В противоположность этому нерастворимый белок - это белок, существующий в денатурированной форме внутри цитоплазматических гранул (которые называются включением) в клетке-хозяине, или, опять-таки в зависимости от контекста, нерастворимый белок - это белок, присутствующий в клеточных мембранах, в том числе, без ограничения, цитоплазматических мембранах, митохондриальных мембранах, хлоропластных мембранах, мембранах эндоплазматической сетки и т.п., либо в водном буфере in vitro в физиологических условиях формирует значительные количества нерастворимых агрегатов (т.е. формирует агрегаты в количестве примерно 10% общего белка или более), когда он суспендируется без других белков (при физиологически совместимой температуре) в представляющем интерес водном буфере в физиологических условиях, причем такой буфер не содержит детергента или разобщающего агента, такого как мочевина, гуанидиния гидрохлорид или перхлорат лития.
Термин "рекомбинантный" указывает на то, что материал (например, нуклеиновая кислота или полипептид) был искусственно или синтетически (т.е. неестественным образом)
изменен путем вмешательства человека. Изменение может быть выполнено на материале в пределах природной среды или состояния или на материале, удаленном из природной среды или состояния. Например, "рекомбинантная нуклеиновая кислота" - это кислота, полученная путем рекомбинации нуклеиновых кислот, например, во время клонирования, перестановки в ДНК или других хорошо известных молекулярных биологических процедур. Примеры таких молекулярных биологических процедур можно найти в публикации Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y(1982). "Рекомбинантная молекула ДНК" состоит из сегментов ДНК, соединенных вместе при помощи указанных способов молекулярной биологии. Используемый в данном описании термин "рекомбинантный белок" или "рекомбинантный полипептид" обозначает молекулу белка, которая экспрессируется с использованием рекомбинантной молекулы ДНК. "Рекомбинантная клетка-хозяин" - это клетка, которая содержит и/или экспрессирует рекомбинантную нуклеиновую кислоту. Термин "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота" включает как однонитевые, так и двунитевые нуклеотидные полимеры, содержащие два или более нуклеотидных остатков. Нуклеотидными остатками, включающими полинуклеотид, могут быть рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды либо модифицированная форма любого типа нуклеотида. Указанные модификации включают основные модификации, такие как производные бромоуридина и инозина, рибозные модификации, такие как 2',3'-дидеоксирибоза, и модификации межнуклеотидного сцепления, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат и фосфороамидат.
Термин "олигону клеотид" означает полинуклеотид, содержащий 200 или менее нуклеотидных остатков. В некоторых вариантах воплощения олигонуклеотиды имеют 1060 оснований в длину. В других вариантах воплощения олигонуклеотиды имеют 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-40 нуклеотидов в длину. Олигонуклеотиды могут быть однонитевыми или двунитевыми, например, для использования в построении мутантного гена. Олигонуклеотиды могут быть смысловыми или антисмысловыми олигонуклеотидами. Олигону клеотид может включать метку, в том числе изотопную метку (например, i4C, i3C, S, 3Н, ZH, i3N, i3N, I80, иО и т.п.), для упрощения квантификации или обнаружения, флуоресцентную метку, гаптеновую или антигенную метку, для количественных анализов на обнаружение. Олигонуклеотиды могут использоваться, например, в качестве праймеров для ПЦР, праймеров клонирования или гибридизационных зондов.
Используемые в настоящем описании взаимозаменяемые термины "полинуклеотидная последовательность" или "нуклеотидная последовательность", или "последовательность нуклеиновых кислот" - это основная последовательность нуклеотидных остатков в полинуклеотиде, в том числе олигонуклеотиде, ДНК и РНК, нуклеиновой кислоте, или строка символов, предоставляющих собой основную последовательность нуклеотидных остатков, в зависимости от контекста. Из любой указанной полинуклеотид ной последовательности можно определить либо заданную нуклеиновую кислоту, либо комплементарную полинуклеотидную последовательность. Сюда входят ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть однонитевыми или двунитевыми и представлять смысловую или антисмысловую нить. Если не указано иного, левый конец любой рассматриваемой здесь однонитевой полинуклеотидной последовательности является 5'-концом; а направление влево двунитевой полинуклеотидной последовательности называется 5'-направлением. 5'-направление к добавлению 3' возникающих транскриптов РНК называется направлением транскрипции; причем участки последовательности на нити ДНК, имеющие такую же последовательность, что и транскрипт РНК, т.е. 5' к 5'-концу транскрипта РНК, называются "последовательности против хода транскрипции"; участки последовательности на нити ДНК, имеющие ту же последовательность, что и транскрипт РНК, т.е. 3' к 3'-концу транскрипта РНК, называются "последовательностями по ходу транскрипции".
Используемый в настоящем описании термин "изолированная молекула нуклеиновой кислоты" или "изолированная последовательность нуклеиновой кислоты" - это молекула нуклеиновой кислоты, которая либо (1) идентифицируется и отделяется по меньшей мере от одной контаминантной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты, либо (2) клонируется, усиливается, помечается или иначе различается от фоновых нуклеиновых кислот, чтобы можно было определить последовательность представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты представлена в форме и в условиях, в которых она не встречается в природе. Однако изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют полипептид (например, олигопептид или антитело), где, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в хромосомном месте, отличном от того, которое характерно для природных клеток.
Используемые в настоящем описании термины "кодирующая молекула нуклеиновой кислоты", "последовательность кодирующей ДНК" и "кодирующая ДНК" обозначают порядок или последовательность дезоксирибонуклеотидов вдоль нити дезоксирибонуклеиновой кислоты. Порядок этих дезоксирибонуклеотидов определяет порядок рибонуклеотидов вдоль цепи мРНК, а также определяет порядок аминокислот вдоль полипептидной (белковой) цепи. Таким образом, последовательность ДНК выполняет кодирование для последовательности РНК и для аминокислотной последовательности.
Термин "ген" широко используется для обозначения любой нуклеиновой кислоты, связанной с биологической функцией. Гены обычно включают кодирующие последовательности и/или регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии таких кодирующих последовательностей. Термин "ген" касается специфической геномной или рекомбинантной последовательности, а также кДНК или мРНК, кодированные такой последовательностью. "Гибридный ген" содержит кодирующий участок, который кодирует полипептид с участками от различных белков, которые не встречаются вместе в природе или не встречаются вместе в природе в той же последовательности, которая имеется в кодированном гибридном белке (т.е. химерном белке). Гены также включают неэкспрессированные сегменты нуклеиновых кислот, которые, например, формируют распознающие последовательности для других белков. Неэкспрессированные регуляторные последовательности, включают элементы транскрипционного контроля, с которыми регуляторные белки, такие как факторы транскрипции, связываются, что приводит к транскрипции прилегающих или расположенных рядом последовательностей.
Термин "экспрессия гена" или "экспрессия нуклеиновой кислоты" означает транскрипцию ДНК в РНК (необязательно включающую модификацию РНК, например, сплайсинг), транляцию РНК в полипептид (что, возможно, включает последующую посттрансляционную модификацию полипептида), или как транскрипцию, так и трансляцию, как следует из контекста.
Термин "кодирующий участок" или "кодирующая последовательность", используемый в настоящем описании в отношении структурного гена, обозначает нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислоты, которые можно найти в возникающем полипептиде в результате трансляции молекулы мРНК. Кодирующий участок связывается у эукариотов на стороне 5' нуклеотидным триплетом "ATG", который кодирует
инициаторный метионин, а на стороне 3' - одним из трех триплетов, которые определяют стоп-кодоны (т.е. ТАА, TAG, TGA).
Термин "контрольная последовательность" или "контрольный сигнал" обозначает полинуклеотидную последовательность, которая может в конкретной клетке-хозяине повлиять на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми она сшита. Характер таких контрольных последовательностей может зависеть от организма-хозяина. В конкретных вариантах воплощения контрольные последовательности для прокариотов могут включать промотор, сайт связывания рибосом и терминатор транскрипции. Контрольные последовательности для эукариотов могут включать промоторы, состоящие из одного или нескольких сайтов распознавания для факторов транскрипции, последовательности или элементы энхансеров транскрипции, сайты полиаденилирования и терминаторы транскрипции. Контрольные последовательности могут включать лидерные последовательности и/или последовательности сливающихся клеток. Промоторы и энхансеры состоят из коротких наборов ДНК, которые специфически взаимодействуют с клеточными белками, участвующими в транскрипции (Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)). Элементы промоторов и энхансеров были изолированы из различных эукариотических источников, включая гены в клетках дрожжей, насекомых и млекопитающих и вирусах (аналогичные контрольные элементы, т.е. промоторы, также встречаются у прокариотов). Выбор конкретного промотора и энхансера зависит от того, какой тип клетки нужно использовать для экспрессирования представляющего интерес белка. Некоторые промоторы и энхансеры эукариотов имеют широкий диапазон хозяев, тогда как другие являются функциональными в ограниченном подмножестве типов клеток (обзор см. в публикациях Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986) and Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)).
Термин "вектор" означает любую молекулу или единицу (например, нуклеиновую кислоту, плазмид, бактериофаг или вирус), которая используется для переноса кодирующей белок информации в клетку-хозяина.
Используемый в настоящем описании термин "экспрессионный вектор" или "экспрессионная конструкция" обозначает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую желаемую кодирующую последовательность и соответствующие контрольные последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенной клетке-хозяине. Экспрессионный вектор может включать, без ограничения, последовательности, которые оказывают влияние или осуществляют управление транскрипцией, трансляцией, а при
наличии интронов - влияют на сплайсинг РНК кодирующего участка, связанной с ним функционально. Последовательности нуклеиновых кислот, необходимые для экспрессии у прокариотов, включают промотор, необязательно операторную последовательность, сайт связывания рибосом и, возможно, другие последовательности. Известно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры, и сигналы терминации и полиаденилирования. Секреторная сигнальная пептидная последовательность может также необязательно кодироваться экспрессионным вектором, быть функционально связанной с представляющей интерес кодирующей последовательностью, так что экспрессированный полипептид может секретироваться рекомбинантной клеткой-хозяином для более простого изолирования представляющего интерес полипептида от клетки, если необходимо. Такие способы хорошо известны в данной области техники, (например, Goodey, Andrew R.; et al., Peptide и DNA sequences, патент США № 5302697; Weiner et al., Compositions and methods for protein secretion, патент США № 6022952 and патент США № 6335178; Uemura et al., Protein expression vector and utilization thereof, патент США № 7029909; Ruben et al., 27 human secreted proteins, US 2003/0104400 Al). Используемые в настоящем описании термины "в функциональной комбинации", "в функциональном порядке" и "функционально связанные" обозначают сцепление последовательностей нуклеиновых кислот таким образом, что создается молекула нуклеиновой кислоты, способная направлять транскрипцию данного гена и/или синтез молекулы желаемого белка. Этот термин также обозначает сцепление аминокислотных последовательностей таким образом, что создается функциональный белок. Например, контрольная последовательность в векторе, который "функционально связан" с кодирующей белок последовательностью, пришита к ней так, что достигается экспрессия кодирующей белок последовательности в условиях, совместимых с транскрипционной активностью контрольных последовательностей.
Термин "клетка-хозяин" означает клетку, которая была трансформирована или может быть трансформирована нуклеиновой кислотой и тем самым экспрессирует представляющий интерес ген. Этот термин включает потомство родительской клетки, независимо от того, является ли потомство идентичным по морфологии или генетической конструкции с оригинальной родительской клеткой, пока присутствует представляющий интерес ген. В практике настоящего изобретения может использоваться любая из большого количества имеющихся и хорошо известных клеток-хозяев. Выбор конкретной клетки-хозяина зависит от ряда факторов, признанных в данной области техники. Сюда относятся, например, совместимость с выбранным экспрессионным вектором, токсичность
пептидов, кодируемых молекулой ДНК, скорость трансформации, простота восстановления пептидов, характеристики экспрессии, биобезопасность и расходы. Результатом взаимодействия этих факторов является понимание того , что не все клетки-хозяева могут быть одинаково эффективны для экспрессии определенной последовательности ДНК. В рамках этих общих рекомендаций полезными микробными клетками-хозяевами в культуре могут быть бактерии (такие как Escherichia coli), дрожжи (такие как Saccharomyces) и клетки других грибков, клетки насекомых, клетки растений, клетки млекопитающих (в том числе человека), например, клетки яичника китайского хомячка и клетки НЕК-293. Модификации можно сделать также на уровне ДНК. Кодирующая пептид последовательность ДНК может быть изменена на кодоны, более совместимые с выбранной клеткой-хозяином. Для Е. coli оптимизированные кодоны известны в данной области техники. Кодоны могут быть заменены для устранения сайтов рестрикции или для включения молчащих сайтов рестрикции, что может помочь выполнить процессинг ДНК в выбранной клетке-хозяине. Затем трансформированную клетку-хозяина культивируют и очищают. Клетки-хозяева можно культивировать в традиционных условиях ферментации, чтобы экспрессировать желаемые соединения. Такие условия ферментации хорошо известны в данной области техники. Термин "трансфекция" означает поглощение чужеродной или экзогенной ДНК клеткой, а клетка считается "трансфицированной", когда экзогенная ДНК вводится внутрь клеточной мембраны. В данной области техники хорошо известен ряд способов трансфекции, которые приводятся в настоящем описании. См., например, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197. Такие способы могут использоваться для введения одного или более экзогенных фрагментов ДНК в подходящие клетки-хозяева.
Термин "трансформация" обозначает изменение генетических характеристик клетки, а клетка считается трансформированной, если после модификации она содержит новую ДНК или РНК. Например, клетка трансформируется, если она генетически модифицируется со своего нативного состояния путем введения нового генетического материала путем трансфекции, трансдукции или других способов. После трансфекции или трансдукции, трансформирующая ДНК может рекомбинироваться с ДНК клетки путем физической интеграции в хромосому клетки, или может временно поддерживаться как эписомальный элемент без репликации, или может реплицироваться независимо как
плазмид. Клетка считается "стабильно трансформированной", когда трансформирующая ДНК реплицируется с делением клетки.
Термин "домен" или "участок" (которые используются в настоящем описании взаимозаменяемо) белка - это любая часть всего белка, вплоть до полного белка и включая его, которая, однако, обычно включает менее чем полный белок. Домен может, но необязательно, складываться независимо от остальной части белковой цепи и/или коррелироваться с определенной биологической, биохимической или структурной функцией или локализацией (например, лиганд-связывающий домен или цитозольный, трансмембранный или внеклеточный домен).
"Млекопитающее" для целей лечения обозначает любое животное, относящееся к млекопитающим, в том числе человека, домашних и сельскохозяйственных животных, животных зоопарка, спортивных или домашних животных, таких как собаки, лошади, коты, коровы, крысы, мыши, обезьяны и т.п.
Использующийся по всему настоящему описанию термин "встречающийся в природе" в связи с биологическими материалами, такими как полипептиды, нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева и т.п., обозначает материалы, встречающиеся в природе. Термин "антитело" или термин "АЬ", с которым он используется взаимозаменяемо, используется в самом широком смысле и включает полностью собранные антитела, моноклональные антитела (в том числе человеческие, гуманизированные или химерные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), а также фрагменты антител, которые могут связывать антиген (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, одноцепочечные антитела, диатела), включающие определяющие комплементарность участки (ОКУ) вышеуказанного, пока они демонстрируют желаемую биологическую активность. Предполагаются мультимеры или агрегаты интактных молекул и/или фрагментов, в том числе химически дериватизированные антитела. Предполагаются антитела любого класса или подкласса изотопов, в том числе IgG, IgM, IgD, IgA, а также IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2, или любого аллотипа. Различные изотипы имеют различные эффекторные функции; например, изотипы IgGl и IgG3 обладают антителозависимой клеточной цитотоксической (АЗКЦ) активностью. Так, в некоторых вариантах воплощения способа количественного анализа in vitro по настоящему изобретению, антителом-мишенью IgG является IgGl (например, KW-0761 (также известный как "могамулизумаб" или "AMG 761"), ритуксимаб или трастузумаб) или антитело IgG3.
Термин "антигенсвязывающий белок" (АСБ) включает антитела или фрагменты антител, которые определены выше, а также рекомбинантные пептиды или другие соединения, содержащие последовательности, производные от ОКУ, обладающие желаемыми антигенсвязывающими свойствами.
Реакции антитело-антиген можно охарактеризовать константой скорости ассоциации в М" V1 (ка) или константой скорости диссоциации в с"1 (kd), или, в качестве альтернативы, константой равновесия диссоциации в М (KD). В целом, антигенсвязывающий белок, такой как антитело или фрагмент антитела, "специфически связывается" с антигеном, когда он имеет значительно более высокую аффинность связывания к такому антигену, и следовательно способен отличить его по сравнению с его аффинностью к другим несвязанным белкам при подобных условиях количественного анализа связывания. Желаемыми являются такие характеристики как аффинность связывания, измеряемая константой KD (константа равновесия диссоциации) величиной 10"9 М или ниже, величиной до 10"12 М или ниже (чем меньше величина, тем выше аффинность связывания), или авидность, измеряемая константой kd (константа скорости диссоциации) величиной 10"4 с"1 или ниже, или величиной до 10"10 с"1 или ниже. Обычно говорят, что антигенсвязывающий белок (например, антитело или фрагмент антитела) "специфически связывает" свой антиген-мишень, когда константа равновесия диссоциации (KD) < 10"8 М. Антигенсвязывающий белок (например, антитело или фрагмент антитела) специфически связывает антиген с "высокой аффинностью", когда KD < 5 Х 10"9 М, И С "очень высокой аффинностью", когда KD < 5 Х 10"10 М. В одном варианте воплощения изобретения антигенсвязывающий белок (например, антитела) связывают с Ко в диапазоне примерно
8 10
от 10" М до 10" М, а в еще одном варианте воплощения антитела связывают с Ко < 5 х 10"9 М. Константы скорости ассоциации, константы скорости диссоциации или константы равновесия диссоциации могут быть легко определены с использованием способов кинетического анализа, таких как поверхностный плазмонный резонанс (BIAcore(r); например, Fischer et al., A peptide-immunoglobulin-conjugate, WO 2007/045463 Al, Example 10, который включается в настоящее описание по ссылке в полном объеме), или KinExA с использованием общих процедур, описанных производителем, или других способов, известных в данной области техники. Кинетические данные, полученные BIAcore(r) или KinExA, можно проанализировать способами, описанными производителем. "Антигенсвязывающий участок" или "антигенсвязывающий сайт" означает часть антигенсвязывающего белка (например, белок-антитело или фрагмент антитела), которая специфически связывает специфический антиген. Например, та часть антитела, которая
содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу его специфичность и аффинность к антигену, называются "антигенсвязывающим участком". Антигенсвязывающий участок обычно включает один или более "определяющих комплементарность участков" ("ОКУ"). Некоторые антигенсвязывающие участки также включают один или более "каркасных" участков ("КУ"). "ОКУ" - это аминокислотная последовательность, способствующая антигенсвязывающей специфичности и аффинности. "Каркасные" участки могут помочь сохранить должную конформацию ОКУ для способствования связыванию антигенсвязывающего участка и антигена.
"Изолированное" антитело - это антитело, которое было идентифицировано и отделено от одного или более компонентов его природной среды или питательной среды, в которой оно было секретировано производящей клеткой. "Контаминантные" компоненты его природной среды или питательной среды - это материалы, которые оказывают влияние на диагностическое или терапевтическое использование антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковоподобные или небелковоподобные растворенные вещества. В некоторых вариантах воплощения антитело очищается (1) до более чем 95 вес. % антитела, а наиболее предпочтительно - более 99 вес. %, или (2) до однородности при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях, необязательно с использованием штамма, например, Coomassie blue или silver. К изолированным встречающимся в природе антителам относится антитело in situ в рекомбинантных клетках, потому что по меньшей мере один компонент природной среды антитела отсутствует. Тем не менее, обычно изолированное антитело производят с применением по меньшей мере одного шага очистки.
Используемый в настоящем описании термин "моноклональное антитело" обозначает антитело, произведенное из популяции в основном однородных антител, т.е. отдельные антитела, содержащие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, направляются против конкретного антигенного сайта или эпитопа, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат различные антитела, направленные против различных эпитопов. К неограничивающим примерам моноклональных антител относятся мышиные, кроличьи, крысиные, куриные, химерные, гуманизированные или человеческие антитела, полностью собранные антитела, полиспецифические антитела (в том числе
биспецифические антитела), фрагменты антител, которые могут связывать антиген (в том числе Fab, Fab', F(ab')2, Fv, одноцепочечные антитела, диатела), макситела, нанотела и рекомбинантные пептиды, включающие ОКУ вышеперечисленного, если они демонстрируют желаемую биологическую активность, или их варианты либо производные.
Модификатор "моноклональные" указывает на характер антитела, получаемого из в основном однородной популяции антител, причем не следует считать, что устанавливается требование к производству антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые должны использоваться согласно настоящему изобретению, могут быть произведены гибридомным способом, впервые описанным в работе Kohler et al., Nature, 256:495 [1975], или могут быть произведены способами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США № 4 816 567). "Моноклональные антитела" также могут быть изолированы из библиотек фаговых антител с использованием способов, описанных в публикациях Clackson et al., Nature,352:624-628[1991] и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), в качестве примера. Термин "иммуноглобулин" охватывает полные антитела, включающие две димеризованные тяжелые цепи (ТЦ), каждая из которых ковалентно связана с легкой цепью (ЛЦ); одну недимеризованную иммуноглобулиновую тяжелую цепь и ковалентно связанную легкую цепь (ТЦ + ЛЦ), или (легкоцепочечный + тяжелоцепочечный)-Рс гетеротример химерного иммуноглобулина (так называемое "гемитело"). "Антитело" является тетрамерным гликопротеином. Во встречающемся в природе антителе каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну "легкую" цепь примерно из 220 аминокислот (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь примерно из 440 аминокислот (около 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает "вариабельный" ("V") участок из примерно 100-110 или более аминокислот, в основном отвечающих за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константный участок, в основном отвечающий за эффекторную функцию. Вариабельный участок отличается у разных антител. Константный участок один и тот же у разных антител. В пределах вариабельного участка каждой тяжелой или легкой цепи есть три гипервариабельных субучастка, которые помогают определить специфичность антитела к антигену. Остатки вариабельного домена между гипервариабельными участками называются каркасными остатками и в основном в некоторой степени гомологичны в разных антителах. Иммуноглобулины можно отнести к разным классам в зависимости от аминокислотной
последовательности константного домена их тяжелых цепей. Человеческие легкие цепи классифицируются как каппа (к) и лямбда (X) легкие цепи. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные участки соединяются "1"-участком из 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает "В"-участок примерно из 10 и более аминокислот. Общее описание см. в публикации Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). В рамках настоящего изобретения термин "антитело" также охватывает рекомбинантно производимое антитело, а также антитела, в которых отсутствует гликозилирование.
Термин "легкая цепь" или "легкая цепь иммуноглобулина" включает полноразмерную легкую цепь и ее фрагменты, имеющие достаточную последовательность вариабельного участка для придания связывающей специфичности. Полноразмерная легкая цепь включает домен вариабельного участка VL И домен константного участка CL. Домен вариабельного участка легкой цепи - это аминоконец полипептида. Легкие цепи включают каппа-цепи и лямбда-цепи.
Термин "тяжелая цепь" или "тяжелая цепь иммуноглобулина" включает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты, имеющие достаточную последовательность вариабельного участка для придания связывающей специфичности. Полноразмерная тяжелая цепь включает домен вариабельного участка VH И три домена константного участка Сн1, Сн2 и СнЗ. Домен VH - это аминоконец полипептида, а домены Сн находятся на карбоксилконце, причем СнЗ лежит ближе всего к карбоксиконцу полипептида. Тяжелые цепи классифицируются как мю (ц), дельта (А), гамма (у), альфа (а) и эпсилон (s), и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. В отдельных вариантах воплощения изобретения тяжелые цепи могут быть любого изотипа, в том числе IgG (включая подтипы IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4), IgA (включая подтипы IgAl и IgA2), IgM и IgE. Некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы или изотипы, например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2. Различные изотипы IgG могут иметь разные эффекторные функции (опосредованные Fc-участком), такие как антителозависимая цитотоксичность (АЗКЦ) и комплементзависимая цитотоксичность (КЗЦ). В АЗКЦ Fc-участок антитела связывается с Fc-рецепторами (FcyRs) на поверхности иммунных эффекторных клеток, таких как естественные киллеры и макрофаги, приводящие к фагоцитозу или лизису клеток-мишеней. В КЗЦ антитела убивают клетки-мишени путем запуска каскада реакций комплемента на поверхности клеток. Термин "Fc-участок" или взаимозаменяемо используемый в настоящем описании термин "Fc-домен" или "Fc-домен иммуноглобулина" содержит два фрагмента тяжелой цепи,
которые в полном антителе включают домены Сн1 и Сн2 антитела. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе двумя или более дисульфидными связями и гидрофобными взаимодействиями доменов СнЗ.
Термин "связывающий рецептор реутилизации эпитоп" обозначает эпитоп Fc-участка молекулы IgG (например, IgGi, IgG2, L3G3 или IgG4), отвечающий за увеличение периода полувыведения из сыворотки in vivo молекулы IgG.
"Аллотипы" - это вариации в последовательности антител, часто в константном участке, которые могут быть иммуногенными и кодируются специфическими аллелями у людей. Аллотипы идентифицируются по пяти человеческим генам IGHC, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHA2 и IGHE, и обозначаются соответственно аллотипа Glm, G2m, G3m, A2m и Em, соответственно. Известно по меньшей мере 18 Gm аллотипов: nGlm(l), nGlm(2), Glm (1, 2, 3, 17) или Glm (а, х, f, z), G2m (23) или G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или G3m (bl, сЗ, Ь5, ЬО, ЬЗ, b4, s, t, gl, c5, u, v, g5). Есть два аллотипа A2m -А2т(1)и A2m(2).
Подробное описание структуры и генерирования антител приведено в публикации Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998), которая включается в настоящее описание по ссылке в полном объеме. Если говорить коротко, процесс генерирования ДНК, кодирующей тяжелые и легкие цепи иммуноглобулиновых последовательностей, происходит в первую очередь при разработке В-клеток. Перед перестройкой и соединением различных генных сегментов иммуноглобулинов генные сегменты V, D, J и константные (С) генные сегменты находятся в целом относительно близко на одной хромосоме. Во время дифференциации В-клеток один из каждого соответствующего члена семейства генных сегментов V, D, J (или только V и J в случае легкоцепочечных генов) рекомбинируют для формирования функционально перестроенных вариабельных участков тяжелых и легких иммуноглобулиновых генов. Этот процесс перестройки генных сегментов оказывается последовательным. Сначала образуются соединения D с J тяжелых цепей, затем соединения V с DJ тяжелых цепей и соединения V с J легких цепей. В дополнение к перестройке сегментов V, D и J, дополнительное различие генерируется в основном репертуаре тяжелых и легких цепей иммуноглобулина путем вариабельной рекомбинации в локализациях, в которых соединяются сегменты V и J легкой цепи и соединяются сегменты D и J тяжелой цепи. Такая вариация в легкой цепи обычно происходит в пределах последнего кодона генного сегмента V и первого кодона сегмента J. Подобная неточность соединения происходит на хромосоме тяжелой цепи между сегментами D и JH и может распространяться на целых 10 нуклеотидов. Кроме того,
несколько нуклеотидов могут вставляться между генными сегментами D и JH и между VH и D, которые не кодируются геномной ДНК. Добавление этих нуклеотидов известно как N-концевая вариабельность. Результирующим эффектом таких перестроек в генных сегментах вариабельного участка и вариабельной рекомбинации, которая может происходить во время такого соединения, является производство репертуара основных антител.
Термин "гипервариабельный" участок обозначает аминокислотные остатки антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельный участок включает аминокислотные остатки от определяющего комплементарность участка, или ОКУ [т.е. остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (HI), 50-65 (Н2) и 95-102 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи, как описано в работе Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Даже один ОКУ может распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем весь антигенсвязывающий сайт, содержащий все ОКУ. В типичном антителе ОКУ заключены в каркасе в вариабельном участке тяжелой и легкой цепи, где они представляют собой участки, отвечающие за связывание и распознавание антигенов. Вариабельный участок включает по меньшей мере три ОКУ тяжелой и легкой цепи, см. выше (Kabat et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; см. также Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al, 1989, Nature 342: 877-883), в пределах каркасного участка (обозначенные каркасные участки 1-4, FR1, FR2, FR3 и FR4 в работе Kabat et al, 1991, см. выше; см. также Chothia and Lesk, 1987, см. выше). Альтернативное определение остатков из гипервариабельной "петли" описано в работе Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987) как остатки 26-32 (LI), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (HI), 53-55 (Н2) и 96-101 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи.
"Каркасные" остатки или "FR"-ocraTKH - это остатки вариабельного участка, которые не являются остатками гипервариабельного участка.
"Фрагменты антител" включают часть интактного полноразмерного антитела, предпочтительно антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела. Примерами фрагментов антител являются фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела (Zapata et al., Protein Eng.,8(10): 1057-1062 (1995)); одноцепочечные молекулы антител и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Усвоение папаина антител создает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых "РаЬ"-фрагментами, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий сайт, и остаточный "Рс"-фрагмент, который содержит константный участок. Fab-фрагмент содержит весь вариабельный домен, а также константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fc-фрагмент показывает углеводы и отвечает за многие эффекторные функции антитела (такие как связывающий комплемент и клеточные рецепторы), которые отличают один класс антител от другого.
Обработка пепсином создает Р(аЬ')2-фрагмент, который имеет два "одноцепочечных Fv" или "scFv" фрагмента антител, включающие домены "VH и VL антитела, в которых эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Fab-фрагменты отличаются от Fab'-фрагментов включением нескольких дополнительных остатков на карбоксиконце домена СН1 тяжелой цепи, включающих один или более цистеинов из шарнирного участка антитела. Предпочтительно, Fv-полипептид дополнительно включает полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет Fv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Обзор scFv приведен в публикации Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
"Fab-фрагмент" состоит из одной легкой цепи и Сн1, а также вариабельных участков одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь Fab-молекулы не может образовывать дисульфидную связь с другой тяжелоцепочечной молекулой.
"Fab'-фрагмент" содержит одну легкую цепь и часть одной тяжелой цепи, которая содержит домен VH И домен Сн1, а также участок между доменами Сн1 и Сн2, так что между двумя тяжелыми цепями двух Fab'-фрагментов может образоваться межцепочечная дисульфидная связь для образования Р(аЬ')2-молекулы.
"Р(аЬ')2-фрагмент" содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константного участка между доменами Сн1 и Сн2, так что между двумя тяжелыми цепями образуется межцепочечная дисульфидная связь. Таким образом, Р(аЬ')2-фрагмент состоит из двух Fab'-фрагментов, которые удерживаются вместе дисульфидной связью между двумя тяжелыми цепями.
"Fv" является минимальным фрагментом антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Этот участок состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной, нековалентной ассоциации. Именно в этой конфигурации три ОКУ каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий сайт на поверхности димера VH VL.
Один вариабельный домен (или половина Fv, включающего только три ОКУ, специфичные для антигена) способен распознавать и связывать антиген, хотя с меньшей аффинностью, чем весь связывающий сайт.
"Одноцепочечные антитела" являются Fv-молекулы, в которых вариабельные участки тяжелых и легких цепей соединены гибким линкером, образуя одну полипептидную цепь, которая формирует антигенсвязывающий участок. Одноцепочечные антитела детально описываются в публикации международной заявки на патент № WO 88/01649 и патентах США № 4 946 778 и № 5 260 203, описания которых включаются в настоящее описание по ссылке в полном объеме.
"Одноцепочечные Ру"-фрагменты или "зсРу"-фрагменты антител включают домены VH И VL антитела, причем эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи, и необязательно включают полипептидный линкер между доменами VH И VL, который позволяет Fv формировать желаемую структуру для связывания антигена (Bird et al., Science 242:423-426, 1988, и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). <^"-фрагмент состоит из доменов VH И CHI.
Термин "диатела" обозначает малые фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем эти фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH VL). При помощи линкера, который слишком короткий, чтобы допустить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела более полно описываются, например, в публикациях ЕР 404,097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). "Доменное антитело" является иммунологически функциональным фрагментом иммуноглобулина, содержащим только вариабельный участок тяжелой цепи или вариабельный участок легкой цепи. В некоторых случаях два или более VH-участков ковалентно соединены с пептидным линкером, создавая бивалентное доменное антитело. Два VH-участка бивалентного доменного антитела могут быть направлены против одного и того же или разных антигенов.
Термин "антиген" обозначает молекулу или часть молекулы, которая может быть связана селективно связывающим агентом, таким как антигенсвязывающий белок (в том числе, например, антитело или его иммунологически функциональный фрагмент), и дополнительно может использоваться в животном для производства антител, способных связываться с таким антигеном. Антиген может иметь один или более эпитопов,
способных взаимодействовать с разными антигенсвязывающими белками, например, антителами.
Термин "эпитоп" - это часть молекулы, которая связывается антигенсвязывающим белком (например, антителом). Этот термин включает любой детерминант, который может специфически связываться с антигенсвязывающим белком, например, антителом. Эпитопы могут быть смежными или несмежными (например, в одноцепочечном полипептиде) аминокислотными остатками, которые не являются смежными друг к другу в полипептидной последовательности, но которые, однако, в рамках молекулы связаны антителом. В определенных вариантах воплощения эпитопы могут быть миметическими в том, что они содержат трехмерную структуру, подобную эпитопу, который используется для генерирования антигенсвязывающего белка (например, антитела), и при этом не содержат ни одного или содержат только некоторые из аминокислотных остатков, которые имеются в этом эпитопе, используемом для генерирования антигенсвязывающего белка. Чаще всего эпитопы располагаются на белках, однако в некоторых случаях они могут находиться на других видах молекул, таких как нуклеиновые кислоты. Детерминанты эпитопа могут включать химически активные поверхностные группы молекул, такие как аминокислоты, сахарные цепи, фосфорильные или сульфонильные группы, и могут обладать специфичными характеристиками трехмерной структуры и/или специфичными характеристиками заряда. В целом, антитела, специфичные для конкретного антигена-мишени, предпочтительно распознают эпитоп на антигене-мишени в сложной смеси белков и/или макромолекул.
Термин "идентичность" обозначает связь между последовательностями двух или более молекул полипептида или двух или более молекул нуклеиновых кислот, которая определяется путем выравнивания и сравнения последовательностей. "Процентная идентичность" означает процент идентичных остатков между аминокислотами или нуклеотидами в сравниваемых молекулах и рассчитывается исходя из размера наименьшей из сравниваемых молекул. Для проведения этих расчетов делеции в выравниваниях (если таковые имеются) необходимо перекрывать при помощи специальной математической модели или компьютерной программы (т.е. "алгоритма"). К способам, которые могут использоваться для расчета идентичности выровненных нуклеиновых кислот или полипептидов относятся способы, описанные в публикациях Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G.,
eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; и Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073. Например, идентичность последовательностей может быть определена стандартными способами, которые обычно используются для сравнения сходства в положении аминокислот двух полипептидов. При помощи компьютерной программы, такой как BLAST или FASTA проводят выравнивание двух полипептидов или двух полинуклеотидных последовательностей для оптимального сопоставления их соответствующих остатков (или вдоль всей длины одной или обеих последовательностей, или вдоль предопределенной части одной или обеих последовательностей). Эти программы предусматривают штраф по умолчанию за открытие и штраф по умолчанию за делецию, а вместе с компьютерной программой может использоваться матрица замен, такая как РАМ 250 [стандартная матрица замен; см. Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)]. Например, затем может быть рассчитана процентная идентичность как общее количество идентичных сопоставлений, умноженное на 100, а затем разделенное на сумму длин более длинной последовательности в пределах сопоставленной области и количество делеций, введенных в более длинные последовательности для выравнивания двух последовательностей. При расчете процентной идентичности выравниваются сравниваемые последовательности так, чтобы обеспечить максимальное сопоставление между последовательностями. Пакет программ GCG - это компьютерная программа, которая может использоваться для определения процентной идентичности, причем этот пакет включает GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). Компьютерный алгоритм GAP используется для выравнивания двух полипептидов или двух полинуклеотидов, для которых должна быть определена процентная идентичность последовательности. Последовательности выравнивают для оптимального сопоставления их соответствующих аминокислот или нуклеотидов ("сопоставляемая область", определяемая алгоритмом). В алгоритме используются штраф за открытие делеции (который рассчитывается как 3-кратная средняя диагональ, где "средняя диагональ" - это средняя величина диагонали используемой матрицы сравнения; а "диагональ" - это оценка или номер, присваиваемый каждому идеальному сопоставлению аминокислот конкретной матрицей сравнения), штраф за продление делеции (который обычно составляет 1/10 штрафа за открытие делеции), а также матрица сравнения, такая как РАМ 250 или BLOSUM 62. В некоторых вариантах воплощения алгоритм также
использует стандартную матрицу сравнения (матрицу сравнения BLOSUM 62 см. в
работах Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the РАМ
250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919).
К рекомендуемым параметрам для определения процентной идентичности полипептидов
или нуклеотидных последовательностей при помощи программы GAP относятся:
Алгоритм: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;
Матрица сравнения: BLOSUM 62 from Henikoff et al., 1992, см. выше;
Штраф за делецию: 12 (без штрафа за концевые делеции)
Штраф за удлинение делеции: 4
Порог подобия: 0
Некоторые схемы выравнивания для выравнивания двух аминокислотных последовательностей могут привести к сопоставлению только короткого участка двух последовательностей, и этот маленький выровненный участок может иметь очень высокую идентичность последовательности, даже если отсутствует существенное отношение между двумя полноразмерными последовательностями. Следовательно, выбранный способ выравнивания (программа GAP), при желании, может быть настроена так, чтобы выравнивание распространялось по меньшей мере на 50 смежных аминокислот целевого полипептида.
Термин "модификация" при использовании в связи с полипептидами включает, без ограничения, одно или более изменений аминокислот (в том числе субституции, инсерции или делеции), химические модификации, ковалентную модификацию путем конъюгации с терапевтическими или диагностическими агентами, метки (например, флуоресцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, радионуклидную или другую изотопную метку, или различные ферменты); ковалентное присоединение полимера, такое как пегилирование (дериватизация с полиэтиленгликолем), а также инсерция или субституция путем химического синтеза ненатуральных аминокислот. Модифицированные полипептиды должны сохранить связывающие свойства немодифицированных молекул, используемых в способе по настоящему изобретению.
"Конъюгированный" означает, что по меньшей мере две химические части ковалентно соединены или связаны друг с другом либо напрямую, либо, необязательно, через пептидильную или непептидильную линкерную часть, которая в свою очередь ковалентно связана с обеими частями. Например, ковалентное сцепление может происходить через аминокислотный остаток пептида или белок, в том числе через альфааминовую группу, или через боковую цепь.
"В физиологических условиях" в отношении инкубационных буферов или реагентов способа количественного анализа по настоящему изобретению означает инкубацию в таких условиях температуры, рН и ионной силы, чтобы могла произойти биохимическая реакция, такая как реакция нековалентной связи. При этом типичными условиями являются комнатная температура или температура окружающей среды примерно до 37 °С, рН = 6,5-7,5.
"Блокированный" означает предварительно инкубированный буфером для количественного анализа, например, с целью минимизации неспецифического связывания с поверхностью лунок компонентами реакционной смеси при более позднем добавлении реакционной смеси.
"Реакционная смесь" - это водная смесь, содержащая все необходимые реагенты и факторы, которые в физиологических условиях инкубации позволяют провести представляющую интерес биохимическую реакцию in vitro, такую как реакция нековалентного связывания.
"Авидин" - это тетрамерный биотин-связывающий белок, вырабатываемый в природе в яйцеводах птиц, рептилий и амфибий и обычно оседающий в белках их яиц, либо же его производимая синтетически или рекомбинантно версия, и/или его мономерная или мультимерная форма (например, димерная, тримерная и т.д.). В своей тетрамерной, гликозилированной форме авидин по оценкам имеет размер 66-69 кДа и может связывать до четырех молекул биотина одновременно с высокой степенью аффинности и специфичности. (Korpela, J., Avidin, a high affinity biotin-binding protein as a tool and subject of biological research. Med. Bio. 62:5-26 (1984)). Для целей настоящего изобретения "авидин" может быть гликозилированным, дегликозилированным или негликозилированным, дериватизированным или модифицированным, пока авидин сохраняет высокую аффинность к биотину (константа равновесия диссоциации KD порядка 10 14 М - 10"16 М). Значение "авидин" включает нейтравидин (или NeutrAvidin) и стрептавидин. "Стрептавидин", который в природе вырабатывается бактерией Streptomyces avidinii в виде тетрамерного биотин-связывающего белка размером 52 800 Да, и включает очищенную либо его синтетически или рекомбинантно произведенную версию, и/или его мономерную или мультимерную (например, димерную, тримерную и т.д.) форму. Произведенные рекомбинантно с помощью генной инженерии моновалентные или мультивалентные формы авидина (или стрептавидина) также входят в определение "авидина". (Например, Laitinen et al. Genetically engineered avidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006); Howarth et al., A monovalent streptavidin with a
single femtomolar biotin binding site, Nat Methods 3(4):267-73 (2006)). "Покрытый авидином" означает, что твердая поверхность, например, луночная поверхность полистирольного планшета, конъюгируется с частями авидина так, что части авидина все еще могут связывать биотин нековалентно с высокой аффинностью в физиологических условиях, например, с константой равновесия диссоциации KD порядка 10 14 М - 10"16 М. В некоторых вариантах воплощения покрытой авидином лунки в количественном анализе in vitro по настоящему изобретению применяемым авидином является стрептавидин или нейтравидин.
"Лунка" - это камера, которая через покрываемое отверстие может принимать и удерживать водянистую жидкость. Например, каждая отдельная ячейка титрационного микропланшета (например, 96- или 3 84-лункового титрационного микропланшета) является "лункой"; однокамерная емкость, такая как планшет для культивирования, чашка Петри, пробирка, коническая пробирка или углубление предметного стекла также является "лункой". Отверстия лунок могут быть непокрытыми или покрываться отдельно съемными отдельными крышками или вместе одной съемной крышкой. "Биотин" - это водорастворимый витамин В-комплекса, т.е. витамин В7, который состоит из уреидо (тетрагидроимидизалон) кольца, слитого с тетрагидротиофеновым кольцом (см. формулу I). Формула I:
Заместитель валериановой кислоты присоединяется к одному из атомов углерода тетрагидротиофенового кольца. В природе биотин является коферментом в метаболизме жирных кислот и лейцина, и играет определенную роль in vivo в глюконеогенезе. Биотин очень тесно связывается с тетрамерным белком авидином (например, куриным авидином, бактериальным стрептавидином и нейтравидином), с константой равновесия диссоциации KD порядка 10 14 М - 10"16 М, что является одним из самых сильных из известных взаимодействий белок-лиганд, приближающимся по силе к ковалентной связи. (Laitinen et al. Genetically engineeredavidins andstreptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006)). Нековалентное взаимодействие биотин-авидин часто используется в различных
биотехнологических приложениях, (см. Laitinen et al., Genetically engineeredavidins and streptavidins, Cell Mol Life Sci. 63 (24): 2992-30177 (2006)).
"Биотинилированный" означает, что вещество конъюгировано с одной или более частей биотина. Биотинилированные пептиды, полезные в практическом осуществлении изобретения, можно приобрести на рынке (например, Midwest Bio-Tech Inc.) или же синтезировать и биотинилировать. Биотинилирование соединений, таких как пептиды, можно выполнить любым известным химическим способом. Сюда относятся биотинилирование первичного амина, биотинилирование сульфгидрила и биотинилирование карбоксила. Например, аминные группы на пептиде, присутствующие в виде эпсилон-аминов и N-концевых-а-аминов цепи на стороне лизина, являются обычными мишенями для биотинилирования первичного амина. Аминореактивные реагенты для биотинилирования можно разделить на две группы в зависимости от растворимости в воде.
N-гидроксисукцинимид (НГС) сложные эфиры биотина обладают слабой растворимостью в водных растворах. Для вступления в реакцию в водном растворе их необходимо сначала растворить в органическом растворителе, а затем разбавить в водную реакционную смесь. К самым широко используемым органическим растворителям для этой цели относятся диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилформамид (ДМФ), которые совместимы с большинством белков при низких концентрациях.
Сульфо-НГС-сложные эфиры биотина являются более растворимыми в воде, и их растворяют в воде непосредственно перед применением, потому что они легко гидролизуются. Растворимость в воде сульфо-НГС-сложных эфиров определяется их сульфонатной группой на N-гидроксисукцинимидном кольце и устраняет необходимость растворения реагента в органическом растворителе.
Химические реакции НГС- и сульфо-НГС-сложных эфиров в основном одни и те же: формируется амидная связь, и НГС или сульфо-НГС становятся замещаемыми группами. Поскольку мишенями для сложного эфира являются депротонированные первичные амины, реакция преобладает при рН выше 7. Гидролиз НГС-сложного эфира - это основная конкурирующая реакция, а скорость гидролиза возрастает с ростом рН. НГС- и сульфо-НГС-сложные эфиры имеют период полувыведения в несколько часов при рН = 7, однако только несколько минут, когда рН = 9. К условиям конъюгирования НГС-сложных эфиров с первичными аминами пептидов относятся температура инкубации в диапазоне 4-37°С, величина рН реакции в диапазоне 7-9 и время инкубации от нескольких минут примерно до 12 часов. Буферов, содержащих амины (такие как Tris или глицин), следует
избегать, потому что они конкурируют с реакцией. Для определения величины биотинилирования можно использовать способ, основанный на использовании красителя ГАБА (2-(4-гидроксиазобензол) бензойная кислота). Если говорить коротко, краситель ГАБА связывает авидин и обеспечивает характерное поглощение. При введении биотина в форме биотинилированного белка или другой молекулы, он вытесняет краситель, что приводит к изменению поглощения на длине волны 500 нм. Изменение поглощения прямо пропорционально уровню биотина в образце.
Термин "FCyRJIIa", также известный как "CD16a" или "FCGR3", или "IGFR3", которые
взаимозаменяемо используются в настоящем описании, означает Fc-рецептор III
иммуноглобулина G. Человеческий CD 16а (GenBank Accession ААН17865) включает
следующую аминокислотную последовательность:
1 mwqlllptal lllvsagmrt edlpkavvfl epqwyrvlek dsvtlkcqga yspednstqw
61 fhneslissq assyfidaat vddsgeyrcq tnlstlsdpv qlevhigwll lqaprwvfke
edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsdfyip katlkdsgsy fcrglvgskn 181 vssetvniti tqglavstis sffppgyqvs fclvmvllfa vdtglyfsvk tnirsstrdw 241 kdhkfkwrkd pqdk// SEQ Ш NO: 11.
Однако термин "CD16a" также охватывает полиморфные последовательности CD 16а. Такие полиморфизмы включают 176V (высокосвязывающая форма) и 176F (низкосвязывающая форма). Последовательность из 254-аминокислотных остатков CD 16а (SEQ Ш N0:11) включает сигнальную последовательность из 16 остатков, внеклеточный домен (ВКД) из 191 остатка; и трансмембранный домен из 22 остатков и С-концевой цитоплазматический домен из 25 остатков. "Рекомбинантный человеческий полипептид CD 16а" - это фрагмент SEQ ID NO: 11 (или его полиморфный вариант), произведенный с использованием способов рекомбинантной ДНК, т.е. растворимый. Примером такого растворимого фрагмента является фрагмент G17-Q208 SEQ ID N0:11, который включает предполагаемый ВКД:
17 gmrt edlpkavvfl epqwyrvlek dsvtlkcqga yspednstqw
61 fhneslissq assyfidaat vddsgeyrcq tnlstlsdpv qlevhigwll lqaprwvfke
edpihlrchs wkntalhkvt ylqngkgrky fhhnsdfyip katlkdsgsy fcrglvgskn 181 vssetvniti tqglavstis sffppgyq//SEQ ID NO: 12. К другим вариантам воплощения "рекомбинантного человеческого полипептида CD 16а" относятся меньшие фрагменты SEQ ID N0:12, которые сохраняют способность связывать человеческий IgG с расчетным коэффициентом KD менее 50 нМ.
"Меченный полигистидином" означает, что рекомбинантный человеческий полипептид CD 16а конъюгирован либо синтетическим способом (например, Peterson, патент США № 5840834, Technique for joining amino acid sequences and novel composition useful in immunoassays), или способом рекомбинантного ДНК, таким как N-концевое или С-концевое расширение рекомбинантного человеческого полипептида CD 16а, включающего по меньшей мере пять, но обычно от шести ("гексагистидиновая метка" или "метка 6xHis") до 18 смежных гистидиновых остатков. Меченый полигистидином рекомбинантный человеческий полипептид CD 16а также продается на рынке (например, каталожный № R &D Systems 4325-FC). Антитела, которые специфически связывают полигистидин и способы их производства хорошо известны в данной области техники, и такие антитела продаются на рынке (например, Zentgraf et al., Antibodies active against a fusion polypeptide comprising a histidine portion, патент США № 6 790 940 и патент США № 7 713 712; продукт № Н1029 компании Sigma-Aldrich; каталожный № R &D Systems МАВ050). В некоторых вариантах воплощения способа количественного анализа in vitro по настоящему изобретению, антитело, которое специфически связывает полигистидин, или в других вариантах воплощения, антитело, которое специфически связывает антитело, которое специфически связывает полигистидин, дополнительно включает вырабатывающую сигнал метку, конъюгированную с антителом, такую как, без ограничения, флуорецентная метка, изотопная метка, электрохемилюминесцентная метка или фермент, который может катализировать реакцию, превращающую подложку в реактант, который может быть легко обнаружен спектрофотометрическими, колориметрическими, фторометрическими, люминометрическими или другими инструментами (например, системы обнаружения на основе пероксидазы хрена, бета-галактозидазы или люциферазы).
Термин "Электрохемилюминесценция" (ЭХЛ), или термин "электрогенерированная хемилюминесценция", с которым он термин используется взаимозаменяемо - это вид люминесценции, генерируемой во время электрохимических реакций в растворах. При ЭХЛ генерируемые электрохимически промежуточные вещества подвергаются высоко экзергонической реакции, приводящей к возникновению электронного возбужденного состояния, которое затем излучает свет (Forster et al., Electrogenerated Chemiluminescence, Annual Review of Analytical Chemistry 2: 359-385 (2009)). Возбуждение ЭХЛ вызывается (окислительно-восстановительными) реакциями перехода электронов высокой энергии электрогенерированных видов. Эти реакции перехода электронов достаточно экзергонические, чтобы образовать возбужденные состояния люминофоров, в том числе
полициклических ароматических углеводов и металлических комплексов, без фотовозбуждения. Например, окисление [Рид(Ьру)з]2+ в присутствии трипропиламина дает излучение света, аналогичное излучению, получаемому при фотовозбуждении. Такие комплексы рутения могут полезно использоваться в качестве хемилюминесцентных меток для целей настоящего изобретения. Например, система обнаружения ЭХЛ компании Meso Scale Discovery (MSD; Гейтерсберг, Мэриленд) Sulfo-TAG(tm) основана на электрохемилюминесцентной метке, содержащей комплекс рутения. В системе Sulfo-TAG(tm) для образования метки используется активированный N-гидроксисукцинимид сложный эфир, имеющий следующую химическую структуру (II):
Согласно инструкциям производителя (MSD Sulfo-TAG(tm) NHS-Ester, 17794-v2-2008May, (2008)), активированный N-гидроксисукцинимид сложный эфир вступает в реакцию с полипептидом, который необходимо пометить, таким как антитело. Как упоминалось ранее, химические реакции НГС- и сульфо-НГС-сложных эфиров в основном одни и те же: формируется амидная связь, и НГС или сульфо-НГС становятся замещаемыми группами. Поскольку мишенями для сложного эфира являются депротонированные первичные амины, реакция преобладает при рН выше 7. К условиям конъюгирования НГС-сложных эфиров с первичными аминами пептидов относятся температура инкубации в диапазоне 4-37°С, величина рН реакции в диапазоне 7-9 и время инкубации от нескольких минут до примерно 12 часов. Буферов, содержащих амины (такие как Tris или глицин), следует избегать, потому что они конкурируют с реакцией. Меченый полипептидный продукт реакции мечения включает электрохемилюминесцентную метку, содержащую комплекс рутения, имеющий следующую формулу (III), где линия, нарисованная от карбонильной группы, показывает присоединение к остальной молекуле:
SO"H
В некоторых вариантах воплощения способа количественного анализа in vitro по настоящему изобретению, предварительно инкубированная реакционная смесь дополнительно включает образец сыворотки, который необходимо проанализировать на наличие нейтрализующих антител. "Нейтрализующие антитела" (NAb) - это антитела, способные снизить титр в сыворотке представляющего интерес антигена, например, антитела-мишени IgG, путем специфического связывания с ним in vivo или в образце in vitro. In vivo нейтрализующие антитела блокируют биологическую активность терапевтической молекулы либо путем прямого связывания с эпитопом(ами), лежащими в пределах активного сайта терапевтической молекулы, либо путем блокирования ее активного сайта за счет стерического препятствия путем связывания с эпитопом(ами), которые могут лежать близко от активного сайта. В то время как в определенных случаях присутствие нейтрализующих антител может не дать в результате клинического эффекта, при достаточных уровнях нейтрализующих антител в других случаях может наблюдаться снижение эффективности, что может потребовать введения более высоких доз лекарственного препарата для достижения той же эффективности (см., например, Gupta et al., Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used
for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics, Journal of Immunological Methods 321(1-2): 1-18 (2007).)
В других случаях может наблюдаться снижение эффективности, что может потребовать введения более высоких доз лекарственного препарата для достижения той же эффективности.
Представляющий интерес "белок-мишень" - это любой белок, в том числе, без ограничения, человеческий белок, представляющий научный, медицинский, клинический или терапевтический интерес как специфическая мишень для антитела. Примером представляющего интерес белка-мишени является хемокиновый рецептор типа 4 (CCR4). Аминокислотная последовательность человеческого CCR4 имеет следующий вид (Genbank Accession Р51679):
1 mnptdiadtt ldesiysnyy lyesipkpct kegikafgel flpplyslvf vfgllgnsvv 61 vlvlfkykrl rsmtdvylln laisdllfvf slpfwgyyaa dqwvfglglc kmiswmylvg
fysgiffVml msidrylaiv havfslrart ltygvitsla twsvavfasl pgflfstcyt 181 ernhtycktk yslnsttwkv lssleinilg lviplgimlf cysmiirtlq hcknekknka 241 vkmifavvvl flgfwtpyni vlfletlvel evlqdctfer yldyaiqate tlafvhccln 301 piiyfflgek frkyilqlfk tcrglfvlcq ycgllqiysa dtpsssytqs tmdhdlhdal // SEQ Ш N0:1. Другим примером представляющего интерес белка-мишени является антиген В-лимфоцита CD20. Аминокислотная последовательность человеческого CD20 имеет следующий вид (Genbank Accession NP_690605): 1 mttprnsvng tfpaepmkgp iamqsgpkpl frrmsslvgp tqsffmresk tlgavqimng 61 lfhialggll mipagiyapi cvtvwyplwg gimyiisgsl laateknsrk clvkgkmimn
slslfaaisg milsimdiln ikishflkme slnfirahtp yiniyncepa npseknspst 181 qycysiqslf lgilsvmlif affqelviag ivenewkrtc srpksnivll saeekkeqti 241 keevvglt etssqpknee dieiipiqee eeeetetnfp eppqdqessp iendssp// SEQ Ш N0:2. Другим примером представляющего интерес белка-мишени является HER2. Аминокислотная последовательность человеческого HER2 (также известного как онкоген ERBB2, тирозин протеинкиназа егЬВ-2, онкоген NGL, NEU или TKR1) имеет следующий вид (Genbank Accession Р04626):
1 melaalcrwg lllallppga astqvctgtd mklrlpaspe thldmlrhly qgcqvvqgnl 61 eltylptnas lsflqdiqev qgyvliahnq vrqvplqrlr ivrgtqlfed nyalavldng
dplnnttpvt gaspgglrel qlrslteilk ggvliqrnpq lcyqdtilwk difhknnqla 181 ltlidtnrsr achpcspmck gsrcwgesse dcqsltrtvc aggcarckgp lptdccheqc 241 aagctgpkhs dclaclhfnh sgicelhcpa lvtyntdtfe smpnpegryt fgascvtacp
301 ynylstdvgs ctlvcplhnq evtaedgtqr cekcskpcar vcyglgmehl revravtsan 361 iqefagckki fgslaflpes fdgdpasnta plqpeqlqvf etleeitgyl yisawpdslp 421 dlsvfqnlqv irgrilhnga ysltlqglgi swlglrslre lgsglalihh nthlcfvhtv 481 pwdqlfrnph qallhtanф edecvgegla chqlcarghc wgpgptqcvn csqflrgqec 541 veecrvlqgl preyvnarhc lpchpecqpq ngsvtcfgpe adqcvacahy kdppfcvarc 601 psgvkpdlsy mpiwkfpdee gacqpcpinc thscvdlddk gcpaeqrasp ltsiisavvg 661 illvvvlgvv fgilikrrqq kirkytmrrl lqetelvepl tpsgampnqa qmrilketel 721 rkvkvlgsga fgtvykgiwi pdgenvkipv aikvlrents pkankeilde ayvmagvgsp 781 yvsrllgicl tstvqlvtql mpygclldhv renrgrlgsq dllnwcmqia kgmsyledvr 841 lvhrdlaarn vlvkspnhvk itdfglarll dideteyhad ggkvpikwma lesilrrrft 901 hqsdvwsygv tvwelmtfga kpydgipare ipdllekger lpqppictid vymimvkcwm 961 idsecrprfr elvsefsrma rdpqrfvviq nedlgpaspl dstfyrslle dddmgdlvda 1021 eeylvpqqgf fcpdpapgag gmvhhrhrss strsgggdlt lglepseeea prsplapseg 1081 agsdvfdgdl gmgaakglqs lpthdpsplq rysedptvpl psetdgyvap ltcspqpeyv 1141 nqpdvrpqpp spregplpaa rpagatlerp ktlspgkngv vkdvfafgga venpeyltpq 1201 ggaapqphpp pafspafdnl yywdqdpper gappstfkgt ptaenpeylg ldvpv// SEQ ID NO: 13. "Полипептидная часть" - это подмножество представляющего интерес белка-мишени, которое включает антигенную пептидильную часть белка-мишени. Обычно такая "полипептидная часть" включает по меньшей мере 5-6 смежных аминокислотных остатков и может быть размером с целый представляющий интерес белок. Более типично, когда "полипептидный участок" имеет в длину 10-40 аминокислотных остатков. "Полипептидный участок" включает аминокислотные остатки белка-мишени, с которыми специфически связывается по меньшей мере один ОКУ, или в другом варианте воплощения - по меньшей мере два ОКУ, или еще в одном варианте воплощения - по меньшей мере три ОКУ связывающего антиген-мишень белка или антитела-мишени IgG. " Связывающий антиген-мишень белок"- это антигенсвязывающий белок, который специфически связывается с полипептидной частью представляющего интерес белка-мишени, а также включает Fc-домен с сайтом связывания CD 16а. Антитело-мишень IgG -это пример "связывающего антиген-мишень белка".
"Антитело-мишень IgG" - это антитело, которое специфически связывается с полипептидной частью представляющего интерес белка-мишени, а также включает Fc-домен с сайтом связывания CD 16а. Производство антител
Поликлональные антитела. Поликлональные антитела предпочтительно выращивают в животных путем нескольких подкожных (п/к) или интраперитонеальных (и/п) инъекций
соответствующего антигена и адъюванта. В качестве альтернативы антиген может быть введен путем инъекции непосредственно в лимфатический узел животного (см. Kilpatrick et al., Hybridoma, 16:381-389, 1997). Улучшенного иммунного гуморального ответа можно добиться путем конъюгирования соответствующего антигена с белком, являющимся иммуногенным в иммунизируемом виде, например, гемонин фиссуреллы, сывороточный альбумин, бычачий тиреоглобулин или соевый ингибитор трипсина с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, сложного эфира малеимидобензойл сульфосукцинимида (конъюгирование через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида или других агентов, известных в данной области техники.
Животных иммунизируют от антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем смешивания, например, 100 мкг белка или конъюгата (для мышей) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инъекции раствора внутрикожно в нескольких местах. Через один месяц животным делают вторичную инъекцию 1/5-1/10 первоначального количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда путем подкожной инъекции в нескольких местах. На 7-14 день после второй инъекции животным делают кровопускание, а сыворотку подвергают количественному анализу на титр антител. Вторичные инъекции животным делают до тех пор, пока титр не перестает изменяться. Предпочтительно, чтобы животному делалась вторая инъекция с конъюгатом того же антигена, однако конъюгированным с другим белком и/или через другой перекрестно-связывающий реагент. Конъюгаты также могут быть сделаны в рекомбинантной культуре клеток при слиянии белков. Для улучшения иммунного ответа могут также использоваться агрегаторы, такие как алюм.
Моноклональные антитела. Моноклональные антитела можно произвести с использованием любых известных в данной области техники способов, например, путем иммортализации клеток селезенки, выращенных из трансгенного животного после завершения программы иммунизации. Клетки селезенки можно иммортализовать с использованием любого известного в данной области техники способа, например, путем слияния их с миеломными клетками для производства гибридом. Например, моноклональные антитела могут быть созданы с использованием гибридомного способа, впервые описанного в работе Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или же способами рекомбинантной ДНК (например, Cabilly et al., Methods of producing immunoglobulins, vectors and transformed host cells for use therein, патент США № 6 331 415), включая способы, такие как способ "сплит дигидрофолатредуктазы", которые облегчают в целом
эквимолярное производство легких и тяжелых цепей, с необязательным использованием линий клеток млекопитающих (например, клеток яичника китайского хомячка), которые могут гликозилировать антитело (см., например, Page, Antibody production, ЕР0481790 А2 и патент США № 5 545 403).
Моноклональный. В гибридомном способе мышь или другое подходящее млекопитающее-хозяин, такое как крыса, хомячок или макак, иммунизируют согласно приведенному здесь описанию, для извлечения лимфоцитов, которые производят или способны произвести антитела, которые будут специфически связываться с белком, используемым для иммунизации. В качестве альтернативы лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с миеломными клетками с использованием подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, образуя гибридомную клетку (Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
После приготовления гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей питательной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, родительских миеломных клеток. Например, если в родительских миеломных клетках нет фермента гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (ГТФРТ или ГФРТ), питательная среда для гибридом обычно содержит гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ-среда), которые предотвращают рост клеток без ГГФРТ.
Предпочтительными являются миеломные клетки, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильно высокое производство антител селективными антитело-производящими клетками и чувствительны к среде. Было описано, что линии человеческих миеломных и мышино-человеческих гетеромиеломных клеток также производят человеческие моноклональные антитела (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Миеломные клетки для использования в процедурах слияния по производству гибридом предпочтительно не производят антител, обладают высокой эффективностью слияния и дефицитом ферментов, что делает их неспособными к росту в определенных селективных средах, которые поддерживают рост только желаемых слившихся клеток (гибридом). Примерами подходящих линий клеток для использования в мышиных слияниях являются Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 и S194/5XXO Bui; примерами линий клеток, используемых в крысиных слияниях, являются R210.RCY3, Y3-
Ag 1.2.3, IR983F и 4B210. Другие линии клеток, полезные для слияния клеток: U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 и UC729-6.
Питательная среда, в которой растут гибридомные клетки, подвергается количественному анализу на производство моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно, связывающая специфичность моноклональных антител, производимых гибридомными клетками, определяется иммунопреципитацией или количественным анализом связывания in vitro, таким как радиоиммунологический анализ (РИА) или твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Связывающая аффинность моноклонального антитела может быть определена, например, при помощи анализа BIAcore(r) или Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980); Fischer et al., A peptide-immunoglobulin-conjugate, WO 2007/045463 Al, Example 10, эта работа включена в настоящее описание в полном объеме).
После идентификации гибридомных клеток, которые производят антитела желаемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать с использованием процедур предельного разведения и вырастить стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Подходящей питательной средой для этого является, например, среда D-MEM или RPMI-1640. Кроме того, гибридомные клетки можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей в животном.
Гибридомы или моноклональные антитела можно подвергнуть дополнительному скринингу для выявления моноклональных антител с особыми свойствами, такими как связывающая аффинность с определенным антигеном или мишенью. Моноклональные антитела, секретированные субклонами, должным образом отделяют от питательной среды, асцитной жидкости или сыворотки с использованием традиционных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, протеин А-сефароза, гидроксилапатитная хроматография, гель-электрофорез, диализ, аффинная хроматография или любой другой подходящий способ очистки, известный в данной области техники. Рекомбинантное производство антител и других полипептидов. Изобретение предусматривает изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие любые из полипептидов, слившиеся полипептиды или антигенсвязывающие белки, такие как антитела (поликлональные и моноклональные), включая описанные фрагменты антител по настоящему изобретению, необязательно функционально связанные с контрольными последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, векторами и клетками-хозяевами, включающими нуклеиновые кислоты, а также рекомбинантные способы для
производства антител, которые могут включать культивирование клеток-хозяев так, чтобы нуклеиновая кислота экспрессировалась и необязательно восстанавливала антитело из культуры или питательной среды клетки-хозяина. Подобные материалы и способы касаются производства других полипептидов.
Подходящие аминокислотные последовательности из представляющего интерес иммуноглобулина или полипептида могут определяться прямым секвенированием белков, а подходящие последовательности кодирующего нуклеотида могут быть сконструированы согласно универсальной таблице кодонов. В качестве альтернативы геномная или кДНК, кодирующая моноклональные антитела, может быть изолирована и секвенирована из клеток, производящих такие антитела, с использованием традиционных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые могут связываться специфически с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Клонирование ДНК проводится с использованием стандартных способов (см., например, публикацию Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, которая включается в настоящее описание в полном объеме). Например, библиотека кДНК может быть построена при помощи обратной транскрипции полиА + мРНК, предпочтительно мембраноассоциированной мРНК, и подвергнута скринингу при помощи зондов, специфичных к генным последовательностям полипептидов человеческого иммуноглобулина. При этом в одном варианте воплощения изобретения для амплификации кДНК (или частей полноразмерных кДНК), кодирующей представляющий интерес сегмент гена иммуноглобулина (например, вариабельный сегмент легкой или тяжелой цепи) используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Амплифицированные последовательности могут быть легко клонированы в любой подходящий вектор, например, экспрессионные вектора, минигенные вектора или вектора фагового отображения. Следует понимать, что конкретный используемый способ клонирования не является критичным, пока можно определить последовательность некоторой части представляющего интерес полипептида иммуноглобулина. Одним источником нуклеиновых кислот антитела является гибридома, производимая путем производства В-клетки из животного, иммунизированного представляющим интерес антигеном, и слияния ее с иммортализованной клеткой. В качестве альтернативы нуклеиновая кислота может быть изолирована из В-клеток (или целой селезенки) иммунизированного животного. Еще одним источником нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, является библиотека таких нуклеиновых кислот, генерированная, например, при помощи технологии фагового отображения. Полинуклеотиды, кодирующие
представляющие интерес пептиды, например, пептиды с вариабельным участком с желаемыми характеристиками связывания, можно идентифицировать с использованием стандартных способов, таких как пэннинг.
Последовательность, кодирующую весь вариабельный участок полипептида иммуноглобулина, можно определить, однако иногда она будет подходить для секвенирования только небольшой части вариабельного участка, например, части, кодирующей ОКУ. Секвенирование проводят с использованием стандартных способов (см., например, публикации Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, и Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, которые включаются в настоящее описание по ссылке). Сравнивая последовательность клонированной нуклеиновой кислоты с опубликованными последовательностями человеческих генов иммуноглобулина и кДНК, опытный специалист в зависимости от секвенированного участка легко определит (i) использование зародышевого сегмента полипептида иммуноглобулина гибридомы (в том числе изотип тяжелой цепи) и (ii) последовательность вариабельных участков тяжелой и легкой цепи, в том числе последовательности, получаемые в результате аддиции N-участка и процесса соматической мутации. Одним из источников информации о последовательностях генов иммуноглобулинов является Национальный центр биотехнологической информации, Национальная библиотека медицины, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд.
Изолированная ДНК может быть функционально связана с контрольными последовательностями или помещена в экспрессионные вектора, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, которые иначе не производят иммуноглобулиновый белок, для управления синтезом моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Рекомбинантное производство антител хорошо известно в данной области техники.
Нуклеиновая кислота функционально связана, когда она ставится в функциональную зависимость с другой последовательностью нуклеиновых кислот. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторного лидера функционально связана с ДНК для полипептида, если она экспрессируется как белок-предшественник, участвующий в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если она влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он располагается так, что облегчает трансляцию. В целом, функционально связанный
означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторного лидера - смежными и в фазе чтения. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования в подходящих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, используются синтетические адаптеры или линкеры олигонуклеотидов, отвечающие существующему состоянию техники.
Многие векторы известны из уровня техники. Компоненты векторов могут включать один
или более из следующего: сигнальная последовательность (которая может, например,
определять секретирование антитела; например,
ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGT GCGCGCTGT// SEQ ID N0:9, которое кодирует сигнальную пептидную последовательность VK-1 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC// SEQ ID N0:10), происхождение репликации, один или более селективных маркерных генов (которые могут, например, создавать стойкость к антибиотикам или другим лекарственным средствам, дополнять ауксотрофный дефицит или поставлять важные питательные вещества, отсутствующие в среде), энхансерный элемент, промотор и терминатор транскрипции, все из которых хорошо известны в данной области техники. Клетка, линия клеток и культура клеток часто используются взаимозаменяемо, и все эти обозначения в данном описании включают потомство. Трансформанты и трансформированные клетки включают первичные испытуемые клетки и полученные из них культуры без учета количества передач. Следует также понимать, что все потомки могут не быть точно идентичными по содержанию ДНК из-за намеренных или ненамеренных мутаций. Сюда относятся мутантные потомки, имеющие ту же функцию или биологическую активность, что и подвергнутые скринингу в первоначально трансформированной клетке.
Примерами клеток-хозяев являются клетки прокариотов, дрожжей или высших эукариотов. Клетки-хозяева прокариотов включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae такие как Escherichia, например, Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacillus, такие как В. subtilis и В. licheniformis, Pseudomonas, и Streptomyces. Эукариотические микробы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии для рекомбинантных полипептидов или антител. Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи,
наиболее часто используются среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Однако по настоящему изобретению могут использоваться и полезны другие роды, виды и штаммы, такие как Pichia, например, P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, Yarrowia; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и мицелиальные грибы, такие как, например, хозяева Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, и Aspergillus, такие как A nidulans и А. niger.
Клетки-хозяева для экспрессии гликозилированных антител могут быть выведены из многоклеточных организмов. К примерам клеток беспозвоночных относятся клетки растений и насекомых. Были выявлены многочисленные бакуловирусные штаммы и варианты, а также соответствующие пермессивные клетки-хозяева насекомых из хозяев, таких как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Общедоступны различные вирусные штаммы для трансфекции таких клеток, например, вариант L-l Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombyx mori NPV.
Подходящими хозяевами также являются клетки-хозяева беспозвоночных, а рекомбинантное производство полипептидов (в том числе антигенсвязывающих белков, например, антител и фрагментов антител) из таких клеток стало рутинной процедурой. Примерами полезных линий клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка, в том числе клетки СНОК1 (АТСС CCL61), DXB-11, DG-44 и клетки яичника китайского хомячка/-дегидрофолатредуктаза (СНО, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); линия CV1 почки обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); линия первичной почки человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре [Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; клетки почки новорожденного хомячка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (СVI АТСС CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени норвежской крысы (BRL ЗА, АТСС CRL 1442); клетки легких человека (W138, АТСС CCL 75); клетки гепатомы человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мышей (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); клетки MRC 5 или клетки FS4, или клетки миеломы млекопитающих.
Клетки-хозяева трансформируют или трансфицируют описанными выше нуклеиновыми кислотами или векторами для производства полипептидов (в том числе антигенсвязывающих белков, таких как антитела) и культивируют в традиционной питательной среде, модифицированной при необходимости для индуцирования промоторов, выбора трансформантов или амплифицирования генов, кодирующих желаемые последовательности. Кроме того, для экспрессии полипептидов, таких как антитела, особенно полезны новые векторы и трансфицрованные линии клеток с несколькими копиями транскрипционных единиц, разделенных селективным маркером. Клетки-хозяева, используемые для производства полипептидов, полезных в настоящем изобретении, могут культивироваться в различных средах. Для культивирования клеток-хозяев подходят имеющиеся в продаже среды, такие как Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma). В качестве питательной среды для клеток-хозяев также могут использовать любые среды, описанные в работах Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), патенты США № 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 или 5 122 469; WO90103430; WO 87/00195; или патенте США № 30 985. Любые из этих сред могут при необходимости дополняться гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как натрия хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как лекарственное средство Гентамицин(tm)), микроэлементами (которые определяются как неорганические соединения, которые обычно присутствуют в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Могут также включаться любые другие необходимые добавки в соответствующих концентрациях, которые известны опытным специалистам в данной области техники. Условия культуры, такие как температура, рН и т.п., отвечают тем, которые ранее использовались с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидны для обычного специалиста в данной области.
После культивирования клеток-хозяев можно внутриклеточно произвести рекомбинантный полипептид в периплазматическом пространстве или прямо секретировать его в среду. Если полипептид, такой как антигенсвязывающий белок (например, антитело), производится внутриклеточно, на первом шаге остатки частиц, либо
клетки-хозяева, либо лизировавшие фрагменты, удаляют, например, при помощи центрифугирования или ультрафильтрации.
Антитело или фрагмент антитела можно очистить при помощи, например, гидроксилапатитной хроматографии, катионно- или анионнообменной хроматографии, или предпочтительно аффинной хроматографии, с использованием в качестве аффинного лиганда представляющего интерес антигена, или белка А, или белка G. Белок А может использоваться для очистки белков, включая полипептиды, основанных на человеческих тяжелых цепях yl, у2 или у4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Белок G рекомендуется для всех изотипов мышей и человеческого уЗ (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). Матрица, к которой присоединен аффинный лиганд, чаще всего является агарозой, но имеются и другие матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(стиролдивинил)бензол обеспечивают более высокую скорость потока и меньшее время процессинга, чем достигаемые с агарозой. Если белок включает домен Сн 3, для очистки целесообразно использовать смолу Bakerbond АВХ(tm) (J. Т. Baker, Филлипсбург, Нью-Джерси). Возможны и другие способы очистки белков, такие как осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и фракционирование сульфатом аммония - в зависимости от восстанавливаемого антитела.
Химерные, гуманизированные моноклональные антитела, моноклональные антитела(tm), моноклональные тела Xenomouse(r). Химерные моноклональные антитела, в которых вариабельные домены Ig моноклонального тела грызуна сливаются с человеческими константными доменами Ig, могут генерироваться с использованием стандартных процедур, известных в данной области техники (см. Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855; и Boulianne, G. L., et al, Nature 312, 643646 (1984)). Был описан ряд способов гуманизирования или модификации последовательностей антител, чтобы сделать их больше похожими на человеческие, например, путем (1) пересадки нечеловеческих определяющих комплементарность участков (ОКУ) на человеческий каркас и константный участок (процесс, называемый в данной области техники гуманизирование путем "пересадки ОКУ") или (2) трансплантации полных нечеловеческих вариабельных доменов, однако "маскировка" их человекоподобной поверхностью путем замещения поверхностных остатков (процесс,
называемый в данной области техники "облицовка") или (3) модификации выбранных нечеловеческих аминокислотных остатков, чтобы сделать их более человеческими, исходя из подобия каждого остатка в участии в связывании антигенов или структуре антител и его подобия к иммуногенности. См., например, публикации Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3): 169 217 (1994); и Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991); Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994); каждая из которых включается в настоящее описание по ссылке в полном объеме.
Был описан ряд способов гуманизирования или модификации последовательностей антител, чтобы сделать их больше похожими на человеческие, например, путем (1) пересадки нечеловеческих определяющих комплементарность участков (ОКУ) на человеческий каркас и константный участок (процесс, называемый в данной области техники гуманизирование путем "пересадки ОКУ") или (2) трансплантации полных нечеловеческих вариабельных доменов, однако "маскировка" их человекоподобной поверхностью путем замещения поверхностных остатков (процесс, называемый в данной области техники "облицовка") или (3) модификации выбранных нечеловеческих аминокислотных остатков, чтобы сделать их более человеческими, исходя из подобия каждого остатка в участии в связывании антигенов или структуре антител и его подобия к иммуногенности. См., например, публикации Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851 6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3): 169 217 (1994); и Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991); Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 29682976); Studnicka et al. Protein Engineering 7: 805-814 (1994); каждая из которых включается в настоящее описание по ссылке в полном объеме.
Антитела могут также производиться с использованием трансгенных животных, у которых нет эндогенного производства иммуноглобулинов и которые при помощи способов генной инженерии содержат локусы человеческого иммуноглобулина. (См., например, Mendez et al., Nat. Genet. 15:146-156 (1997)) Например, в патенте WO 98/24893 описываются трансгенные животные, имеющие локус человеческого Ig, причем эти животные не производят функциональных эндогенных иммуноглобулинов из-за инактивации локусов эндогенных тяжелых и легких цепей. В патенте WO 91/10741 также описываются
трансгенные хозяева-млекопитающие, не являющиеся приматами, способные повышать иммунный ответ на иммуноген, причем антитела имеют константные и/или вариабельные участки примата, а локусы, кодирующие эндогенный иммуноглобулин замещены или инактивированы. В патенте WO 96/30498 описывается использование системы Cre/Lox для модификации локуса иммуноглобулина у млекопитающего, такого как замещение всего или части константного или вариабельного участка для образования модифицированной молекулы антитела. В патенте WO 94/02602 описываются нечеловеческие хозяева-млекопитающие, имеющие инактивированные локусы эндогенного Ig и функциональные локусы человеческого Ig. В патенте США № 5 939 598 описываются способы производства трансгенных мышей, в которых у мышей отсутствуют эндогенные тяжелые цепи, и они экспрессируют экзогенные локусы иммуноглобулина, включающие один или более ксеногенных константных участков.
При помощи описанного выше трансгенного животного можно выработать иммунный ответ на выбранную антигенную молекулу, а производящие антитела клетки можно удалить из животного и использовать для производства гибридом, которые секретируют производные от человека моноклональные антитела. Протоколы иммунизации, адъюванты и т.п. известны в области техники и используются в иммунизации, например, трансгенной мыши, как описано в патенте WO 96/33735. Моноклональные антитела можно протестировать на способность ингибировать или нейтрализовать биологическую активность или физиологический эффект соответствующего белка. См. также Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Mendez et al., Nat. Genet. 15:146-156 (1997); и патент США № 5 591 669, патент США № 5 589 369, патент США № 5 545 807; и заявка на патент США № 20020199213. В заявке на патент США № 20030092125 описываются способы смещения иммунного ответа животного в сторону желаемого эпитопа. Человеческие антитела могут быть также генерированы активирванными in vitro В-клетками (см. патенты США № 5 567 610 и 5 229 275). Производство антител способами фагового отображения
Разработка технологий создания репертуаров рекомбинантных генов человеческих антител, а также отображение кодированных фрагментов антител на поверхности нитевидных бактериофагов, обеспечило дополнительные средства для генерирования производных от человека антител. Фаговое отображение описывается, например, в публикациях Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, и Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6450-6454 (1990), каждая из которых включается
в настоящее описание по ссылке в полном объеме. Антитела, производимые по фаговой технологии, обычно производятся в виде антигенсвязывающих фрагментов, например Fv-или Fab-фрагментов, в бактериях, а потому у них отсутствуют эффекторные функции. Эффекторные функции можно ввести с использованием одной из двух стратегий: фрагменты при помощи способов генной инженерии можно преобразовать либо в полные антитела для экспрессии в клетках млекопитающих, либо в биспецифические фрагменты антител со вторым сайтом связывания, способным запустить эффекторную функцию. Обычно Fd-фрагмент (VH-CH1) И легкая цепь (VL-CL) антител отдельно клонируют посредством П1 IP и случайным образом рекомбинируют в комбинаторных библиотеках фагового отображения, которые затем можно выбрать для связывания с конкретным антигеном. Фрагменты антитела экспрессируют на фаговой поверхности, а выбор Fv или Fab (а значит и фага, содержащего ДНК, кодирующую фрагмент антитела) по связыванию антигена осуществляется в несколько раундов связывания антигена и повторной амплификации (эта процедура называется пэннинг). Фрагменты антител, специфичные к антигену, обогащают и, наконец, изолируют.
Способы фагового отображения могут также использоваться в подходе для гуманизирования моноклональных антител грызунов, называемом "контролируемый выбор" (см. Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Для этого Fd-фрагмент мышиного моноклонального антитела может быть отображен в комбинации с библиотекой человеческих легких цепей, а затем можно выбрать результирующую библиотеку гибридных Fab с антигеном. Таким образом, мышиный Fd-фрагмент дает шаблон для контроля выбора. Затем выбранные человеческие легкие цепи объединяют с библиотекой человеческих Fd-фрагментов. Выбор результирующей библиотеки дает полное человеческое Fab.
Было описано множество процедур для выведения человеческих антител из библиотек фагового отображения (см., например, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991); патенты США № 5 565 332 и 5 573 905; Clackson, Т., and Wells, J. A., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). В частности, мощным инструментом стал выбор in vitro и эволюция антител, выведенных из библиотек фагового отображения (см. Burton, D. К, and Barbas III, С. F., Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); и Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); заявка на патент США № 20020004215 и WO92/01047; заявка на патент США № 20030190317, опубликованная 9 октября 2003 г., и патент США № 6 054 287; патент США № 5 877 293. В работе Watkins, "Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift," Methods in Molecular
Biology, Antibody Phage Display: Methods и Protocols 178: 187-193, и публикации заявки на патент США № 20030044772, опубликованной 6 марта 2003 г., описываются способы скрининга библиотек фагово-экспрессированных антител или других связывающих молекул способом capture lift, который включает иммобилизацию связывающих молекул-кандидатов на твердой основе.
Другие варианты воплощения антигенсвязывающих белков
Как упоминалось выше, фрагменты антител включают часть интактного полноразмерного антитела, предпочтительно антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела, а также включают линейные антитела и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. К неограничивающим примерам фрагментов антител относятся Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, доменное антитело (dAb), фрагменты определяющих комплементарность участков (ОКУ), одноцепочечные антитела (scFv), фрагменты одноцепочечных антител, макситела, диатела, триатела, тетратела, минитела, линейные антитела, хелатирующие рекомбинантные антитела, тритела или битела, интратела, нанотела, малые модульные иммунофармацевтические средства (SMIP), гибридный белок иммуноглобулин с антигенсвязывающим доменом, камелизированное антитело, антитело, содержащее VFffl (вариабельный домен тяжелой цепи), их мутеины или производные, а также полипептиды, содержащие по меньшей мере часть иммуноглобулина, достаточного для придания полипептиду специфического связывания антигена, такого как последовательность ОКУ, пока антитело сохраняет желаемую биологическую активность. Такие фрагменты антигенов могут быть произведены путем модификации целых антител или синтезированы de novo при помощи способов рекомбинантной ДНК или синтеза пептидов.
К дополнительным фрагментам антител относится фрагмент доменного антитела (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), который состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (VH).
"Линейные антитела" включают пару тандемных Fd-сегментов (VH -CH1-VH -СН1), которые образуют пару антигенсвязывающих участков. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими (Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)). "Минитело", состоящее из scFv, слившегося с СНЗ через пептидный линкер (бесшарнирно) или через IgG-шарнир, было описано в работе Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17(4):315-23.
Термин "макситело" обозначает бивалентные scFv, ковалентно связанные с Fc-участком иммуноглобулина, см., например, Fredericks et al, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106 (2004) и Powers et al., Journal of Immunological Methods, 251:123-135 (2001). Функциональные тяжелоцепочечные антитела, лишенные легких цепей, встречаются в природе у некоторых видов животных, таких как усатые акулы-няньки, ковровые акулы и вида Camelidae, таких как верблюды, дромедары, альпаки и ламы. У этих животных антигенсвязывающий сайт редуцируется до одиночного домена, вариабельного домена тяжелой цепи (VHH). Эти антитела формируют антигенсвязывающие участки с использованием только вариабельного участка тяжелой цепи, т.е. эти функциональные антитела являются гомодимерами тяжелых цепей, имеющими только структуру H2L2 (называются "тяжелоцепочечными антителами" или "НСАЬ"). Согласно сообщениям камелизированный вариабельный домен тяжелой цепи (VHH) рекомбинирует с константными участками IgG2 и IgG3, содержащими шарнир, доменами СН2 и СНЗ, и не имеет домена СН1. Классические фрагменты, содержащие только вариабельный домен тяжелой цепи (VH), тяжело произвести в растворимой форме, однако можно добиться улучшения растворимости и специфического связывания, если изменить каркасные остатки так, чтобы они были больше похожи на вариабельные домены тяжелой цепи (VHH). (См., например, Reichman, et al., J Immunol Methods 1999, 231:25-38.) Было обнаружено, что камелизированные вариабельные домены тяжелой цепи (VHH) связываются с антигеном с высокой аффинностью (Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001) и обладают высокой стабильностью в растворе (Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002). Способы генерирования антител, имеющих камелизированные тяжелые цепи, описаны, например, в публикациях патентов США № 2005/0136049 и 2005/0037421. Альтернативные остовы можно получить из человеческих подобных вариабельным доменов, которые более близко совпадают с остовом V-NAR акулы и могут обеспечить каркас для длинной проникающей петлевой структуры. Поскольку вариабельный домен тяжелоцепочечных антител - это наименьший полностью функциональный антигенсвязывающий фрагмент с молекулярной массой только 15 кДа, он называется нанотелом (Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). Библиотеку нанотел можно генерировать из иммунизированного дромедара, как описано в работе Conrath et al., (Antimicrob Agents Chemother 45: 2807-12, 2001).
Другие примеры подходящих рекомбинантных способов и примеров конструктов ДНК, полезных для рекомбинантной экспрессии вариантов воплощения антигенсвязывающих белков клетками млекопитающих, в том числе димерных Fc гибридных белков
("пептител") или гетеротримеров химерного иммуноглобулина (легкая цепь + тяжелая nenb)-Fc ("гемител"), конъюгированных аналогами фармакологически активного токсичного пептида по настоящему изобретению, можно найти, например, в работах Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, US2007/0071764 и Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, PCT/US2007/022831, опубликованных в виде WO 2008/088422, обе из которых включаются в настоящее описание по ссылке в полном объеме.
Пептиды
Пептиды или полипептидные составы для использования в настоящем изобретении могут быть изготовлены с применением способов рекомбинантной ДНК, которые были ранее были приведены в настоящем описании, или путем химического синтеза пептидов. Предпочтительным способом производства отдельных пептидов является твердофазный синтез, поскольку это наиболее экономный способ получения малых пептидов. Например, к хорошо известным способам твердофазного синтеза относится использование защитных групп, линкеров и поддержек твердой фазы, а также специфические условия реакций защиты и снятия защиты, условий дробления линкера, использование поглотителей и другие аспекты твердофазного синтеза пептидов. Подходящие способы хорошо известны в данной области техники. (Например, Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; патент США № 3 941 763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; и Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527; "Protecting Groups in Organic Synthesis,)) 3rd Edition, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog, 2000; "Synthetic Peptides, A User's Guide,)) G. A. Grant, Ed., W.H. Freeman & Company, New York, N.Y., 1992; "Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,)) W. D. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, and H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998; "Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993; "The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.," M. Bodanszky and A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994; "Protecting Groups,)) P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994; "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach,)) W. C. Chan и P. D. White, Eds., Oxford Press, 2000, G. B. Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, 1990, 77-183). Другие примеры способов синтеза и очистки, известных в данной области техники, которые применимы к созданию композиций по настоящему изобретению, приведены, например, в публикациях Sullivan et
al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, US2007/0071764 и Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, PCT/US2007/022831, опубликованных в виде WO 2008/088422 A2, обе из которых включаются в настоящее описание по ссылке в полном объеме. Линкеры
Термины "линкер" или "линкерная часть", используемые взаимозаменяемо в настоящем описании, обозначают биологически приемлемую пептидильную или непептидильную органическую группу, которая ковалентно связана с аминокислотным остатком полипептидной цепи (например, тяжелая цепь иммуноглобулина или легкая цепь иммуноглобулина, или Fc-домен иммуноглобулина), содержащимся в составе по настоящему изобретению, причем линкерная часть ковалентно соединяет или конъюгирует полипептидную цепь с другой молекулой или химической частью. В данной области техники известно много полезных пептидильных и непептидильных линкеров, и многие из них детально описаны в работе Sullivan et al., Toxin Peptide Therapeutic Agents, US 2007/0071764 Al. Присутствие любой линкерной части в компонентах или реагентах, применяемых в настоящем изобретении, является необязательным. При его наличии химическая структура линкера не является критичной, потому что он в основном выполняет роль спейсера для позиционирования, объединения, соединения или оптимизации представления либо позиционирования одной функциональной части по отношению к одной или более других функциональных частей.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые никоим образом не имеют ограничивающего характера.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Скрининг на нейтрализующие антитела к KW-0761
Разрабатываемое лекарственное средство KW-0761 (также известное как "могамулизумаб" или "AMG 761") - это гуманизированное антитело IgGl к CCR4, действующее через механизм антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) in vivo. (Ishii et al., Defucosylated Humanized Anti-CCR4 Monoclonal Antibody KW-0761 as a Novel Immunotherapeutic Agent for Adult T-cell Leukemia/Lymphoma, Clinical Cancer Research 16: 1520-31 (2010); Shitara et al., Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof, патент США № 7 504 104). Лекарство связывается с человеческим хемокиновым рецептором CCR4 на клетке-мишени и человеческим FCyRIHa (CD 16а) на эффектор ной
клетке. В результате эффекторная клетка может убить клетку-мишень. Мы разработали вариант воплощения бифункционального количественного анализа связывания мишени для обнаружения нейтрализующих антител (NAb) к KW-0761 путем применения способа обнаружения на основе электрохемилюминесценции (ЭХЛ) компании MSD. На фигуре 1 показано схематическое представление варианта воплощения количественного анализа по настоящему изобретению, структура которого настроена на обнаружение антитела-мишени IgGl (например, KW-0761), которое специфически связывает представляющий интерес биотинилированный белок-мишень (например, CCR4), и на обнаружение нейтрализующих антител в образце сыворотки.
Если говорить коротко, в данном варианте воплощения настоящего изобретения в покрытые стрептавидином лунки в планшете (например, 96-лунковом планшете, покрытом стрептавидином, каталожный № MSD L11SA-1, производитель Meso Scale Discovery [MSD], Гейтерсберг, Мэриленд) добавляли реакционную смесь, содержащую антитело-мишень IgG (лекарственное средство, например, KW-0761; Ishii et al., Defucosylated Humanized Anti-CCR4 Monoclonal Antibody KW-0761 as a Novel Immunotherapeutic Agent for Adult T-cell Leukemia/Lymphoma, Clinical Cancer Research 16: 1520-31 (2010); Shitara et al., Human CDR-grafted antibody и antibody fragment thereof, патент США № 7 504 104), анализируемый образец сыворотки и полипептидную часть белка-мишени (например, конъюгат биотин-пептид CCR4). После инкубации реакционной смеси на планшете планшет промывают перед добавлением меченого полигистидином рекомбинантного человеческого FCyRIIIa (CD 16а), после чего проводят инкубацию с мышиным моноклональным антителом к полигистидину (в случае надобности может использоваться также моноклональное антитело к полигистидину от животного другого вида). Наконец, генерируется сигнал электрохемилюминесценции (ЭХЛ) с добавлением меченого Sulfo-TAG(tm) козьего антитела к мыши (каталожный № MSD R32AC-1; в случае необходимости может использоваться также меченое антитело от животного другого вида, если это антитело специфически вступает в реакцию с используемым антителом к полигистидину) и Read Buffer Т, полученный от MSD (каталожный № MSD R92TC-1). На фигуре 2 показана блок-схема шагов способа количественного анализа в данном варианте воплощения изобретения. Если образец сыворотки содержит нейтрализующие антитела к антителу-мишени IgG, антитело-мишень IgG не сможет связываться с биотин-пептидом CCR4, который захватывается на поверхностях лунок, покрытых стрептавидином. Следовательно, в присутствии нейтрализующего антитела генерируется низкий сигнал ЭХЛ. При отсутствии нейтрализующего антитела генерируется высокий сигнал ЭХЛ,
потому что лекарство может строить мостик между биотином-пептидом CCR4 и меченым гистидином рекомбинантным человеческим FCyRIIIa (CD 16а). Если скрининговый количественный анализ показывает наличие нейтрализующих антител, рекомендуется провести подтверждающий количественный анализ, например, тот, который описан в Примере 2 настоящего описания.
Протокол скринингового количественного анализа. Был выполнен следующий детальный протокол количественного анализа:
1. Каждую из покрытых стрептавидином лунок в 96-луночном планшете (каталожный № MSD L11SA-1, Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, Мэриленд) блокировали 150 мкл буфера для количественного анализа (физиологический раствор, забуференный фосфатом Дульбекко [рН 7,1 ± 0,1; "ФРЗФД"; полученный от Invitrogen] + 1% (в/в) бычачего сывороточного альбумина ["БСА"]) для каждой лунки в течение по меньшей мере 1 часа при температуре окружающей среды, чтобы обеспечить адекватное блокирование лунок. Блокирование может продолжаться больше часа, если необходимо, если заблокированные лунки используются в количественном анализе по настоящему изобретению в тот же день. После блокирования лунки один раз промывают при помощи 200 мкл/лунку ФРЗФД. В качестве буфера для количественного анализа были выбраны отрицательные кальциевые или магниевые дикатионы, при этом считается, что они не оказывают влияния на количественный анализ по настоящему изобретению.
2. Готовили реакционную смесь (50 мкл/лунку), содержащую антитело-мишень IgG KW-0761 (20 нг/мл в конечной концентрации), образец сыворотки (10% (об./об.) в конечной концентрации) и конъюгат биотина-пептида CCR4 (80 нг/мл в конечной концентрации) в буфере для количественного анализа с объемами, доведенными до достаточного уровня для желаемого количества лунок, в которые должна быть перенесена реакционная смесь на шаге 3, продемонстрированном ниже.
(а) Образец сыворотки: 10 мкл 50% (об./об.) образца сыворотки + 30 мкл 34 нг/мл -
KW-0761, разбавленного в буфере для количественного анализа.
(б) Были также приготовлены следующие контрольные образцы:
Контрольный образец "N": 10 мкл 50% (об./об.) сведенной в пул человеческой сыворотки [от здоровых доноров] ("сведенная в пул человеческая сыворотка"; полученная от компании Bioreclamation, Inc., Лонг-Айленд, Нью-Йорк) + 30 мкл буфер для количественного анализа; или
Контрольный образец "D": 10 мкл 50% (об./об.) сведенной в пул человеческой сыворотки + 30 мкл 34 нг/мл KW-0761, разбавленного в буфере для количественного анализа; или
Контрольный образец "Р": 10 мкл 50% (об./об.) сведенной в пул человеческой сыворотки, в которую отмерено точное количество антител к KW-0761 (маточный раствор поликлональных антител кролика к KW-0761 в концентрации 1,02 мг/мл, который хранится при - 70°С) + 30 мкл 34 нг/мл KW-0761, разбавленного в буфере для количественного анализа.
Разбавление до 50% (об./об.) сведенной в пул человеческой сыворотки в этих контрольных образцах или образце сыворотки выполнялось путем смешивания с равным объемом буфера для количественного анализа. Образцы в пунктах 2(a) или 2(6) выше инкубировали в полипропиленовом планшете с U-образным или V-образным дном при умеренном встряхивании в течение 1 часа (±15 минут) при температуре окружающей среды, после чего:
(в) Конъюгат биотин-пептид CCR4 (10 мкл 400 нг/мл биотин-пептид CCR4 разбавляли в буфере для количественного анализа, приготовленном из 1 мг/мл маточного раствора, хранящегося при температуре -70°С; после оттаивания маточный раствор хранят при 4°С в течение не более 1 месяца) кратными порциями добавляли в образцы 2(a) или 2(6) выше для образования реакционной смеси. Часть биотинилированного полипептида CCR4 имела аминокислотную последовательность:
MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPK(BIOTiN)-OH// SEQ ID N0:3 (куплено у Midwest Bio-Tech Inc., каталожный № MBT3898); или в качестве альтернативы, MNPTDIADTTLDESIYSNYYLYESIPKPCTK(Biotin)-OH// SEQ ID N0:4, которая была синтезирована и биотинилирована с использованием традиционных химических способов.
3. Реакционную смесь (в том числе образец сыворотки или контрольный(е) образец(цы) из шага 2 выше переносили в каждую указанную лунку на покрытом стрептавидином планшете из шага 1 выше (каталожный № MSD L11SA-1, Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, Мэриленд). В каждую лунку добавляли по 50 мкл реакционной смеси. Затем покрытый стрептавидином планшет инкубировали при умеренном встряхивании при температуре окружающей среды в течение 1 часа (±15 минут), после чего лунки промывали три раза при помощи ФРЗФД, 200 мкл на лунку на промывание.
4. 50 мкл меченого полигистидином рекомбинантного FCyRIII концентрацией 80 нг/мл (полученного от R &D Systems, каталожный № 4325-FC), разбавленного в буфере для количественного анализа, добавляли в каждую указанную лунку на покрытом стрептавидином планшете, инкубировали при температуре окружающей среды при умеренном встряхивании в течение 1 часа (±15 минут), после чего лунки промывали три раза при помощи ФРЗФД, 200 мкл на лунку на промывание.
5. 100 мкл мышиного моноклонального антитела к полигистидину концентрацией 1
мкг/мл (полученного от R &D Systems, каталожный № МАВ050), разбавленного в буфере
для количественного анализа, добавляли в каждую указанную лунку на покрытом
стрептавидином планшете, инкубировали при температуре окружающей среды при
умеренном встряхивании в течение 45-60 минут, после чего лунки промывали три раза при
помощи ФРЗФД, 200 мкл на лунку на промывание.
6. 100 мкл козьего антитела к мыши Sulfo-TAG(tm) концентрацией 1 мкг/мл (каталожный № MSD R32AC-1), разбавленного в буфере для количественного анализа, добавляли в каждую указанную лунку на планшете MSD, инкубировали при температуре окружающей среды при умеренном встряхивании в течение 30-45 минут (во время инкубации планшет закрывали пленкой), после чего лунки промывали три раза при помощи ФРЗФД, 200 мкл на лунку на промывание.
7. 150 мкл буфера Read Buffer Т (каталожный № MSD R92TC-1; разбавленного водой до 1 от 4 маточных растворов) добавляли в каждую лунку и проводили считывание ридером SECTOR(r) Imager 6000 ("MSD 6000"; Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, Мэриленд). Репрезентативный дозозависимый эффект на KW-0761 в количественном анализе по настоящему изобретению в присутствии буфера для количественного анализа (0% сведенной в пул человеческой сыворотки) или сведенной в пул человеческой сыворотки (PHS: 5% PHS или 20% PHS; (об./об.)) показан на фигуре 3.
На фигуре 4 продемонстрировано, что связывание KW-0761 с биотинилированным пептидом CCR4 ингибируется за счет присутствия поликлональных нейтрализующих антител к KW-0761 дозозависимым способом.
Пример 2: Протокол истощения общего белка G/L для подтверждающего количественного анализа
Если скрининговый количественный анализ по настоящему изобретению, например, описанный в Примере 1 настоящего описания, указывает на присутствие нейтрализующих антител в образце сыворотки, рекомендуется провести чувствительный подтверждающий количественный анализ. В следующем протоколе подтверждающего количественного анализа используется фильтрат образца сыворотки после инкубации белка G/L в протоколе скринингового количественного анализа, описанного в Примере 1 настоящего описания.
1. Агарозную смолу белка G (каталожный № Pierce 20520) и агарозную смолу белка L (каталожный № Pierce 22851) смешивали в равных пропорциях, затем смесь смол разбавляли с физиологическим раствором, забуференным фосфатом Дульбекко (рН 7,1 ± 0,1; "ФРЗФД"; полученный от Invitrogen) для создания 50% суспензии гранул ("белок G/L"). (Можно заранее приготовить большой объем 50% суспензии гранул в качестве реагента, при условии соблюдения срока хранения 3 месяца при температуре 2-8 °С.)
2. Разбавили смолу сефарозы 6В (каталожный № Sigma 6В100) при помощи ФРЗФД для создания 50% суспензии гранул ("сефароза 6В"). (Можно заранее приготовить большой объем 50% суспензии гранул в качестве реагента, при условии соблюдения срока хранения 3 месяца при температуре 2-8 °С). Обработка сефарозой 6В проводилась в качестве контроля для каждого образца, который обрабатывается смолой белка G/L. Присутствующие в образцах сыворотки нейтрализующие антитела можно удалить путем обработки смолой белка G/L, а не обработки смолой сефарозы 6В.
3. При постоянном поддержании в суспендированном состоянии гранул смолы, в соответствующие лунки многоситового фильтрационного планшета (например, каталожный № Millipore MSHVS4510) добавляли 120 мкл белка G/L (приготовленного по пункту 1 выше) или сефарозы 6В (приготовленной по пункту 2 выше).
4. Под фильтрационным планшетом помещали приемный 96-лунковый планшет (приготовленный по пункту 3 выше), фильтрационный планшет промыли дважды (200 мкл/лунку/промывку) с использованием ФРЗФД путем центрифугирования (1000-2000 об/мин). Собирали и выбрасывали весь фильтрат, прошедший через фильтрационный планшет. Окончательное центрифугирование должно оставить сухие смоляные пеллеты в лунках.
5. Испытуемые образцы сыворотки разбавляли до 50% (об./об.) путем смешивания объема каждого образца сыворотки с равным объемом буфера для количественного анализа (физиологического раствора, забуференного фосфатом Дульбекко [рН 7,1 ±0,1; "ФРЗФД"; полученного от Invitrogen] + 1% (об./об.) бычачего сывороточного альбумина ["БСА"]).
6. Каждый разбавленный образец сыворотки добавляли в соответствующую пеллету белка G/L и пеллету сефарозы 6В. Лунки фильтрационного планшета закрывали крышкой или верхним уплотнением.
7. Под фильтрационным планшетом помещали свежий приемный 96-лунковый планшет в качестве приемного планшета, затем комбинацию приемный планшет/фильтрационный планшет энергично перемешивали при помощи планшетного шейкера или подобного устройства в течение по меньшей мере 30 минут. Через 30 минут перемешивания
центрифугировали комбинацию приемного планшета/фильтрационного планшета с частотой 1000-2000 об/мин для сбора фильтрата в приемном планшете. 8. Собранный по пункту 7 фильтрат использовали непосредственно в подтверждающем количественном анализе, шаги которого были такими же, как и в процедурах скринингового количественного анализа, описанных в Примере 1 настоящего описания. Для каждой реакционной смеси необходимо добавить 10 мкл фильтрата после обработки белком G/L (или контрольным фильтратом сефарозы 6В) в 30 мкл KW-0761 концентрацией 34 нг/мл (также известного как "могамулизумаб" или "AMG 761"), разбавленного в буфере для количественного анализа. После инкубации отфильтрованного образца сыворотки и лекарственной смеси (как в Примере 1, шаг 2(a) выше), добавляли 10 мкл биотина-ССЯ4 концентрацией 400 нг/мл для получения полной реакционной смеси (как в Примере 1, шаг 2(в) выше). Были проведены остальные шаги 3-7 Примера 1.
Пример 3: Количественный анализ связывания мишени ритуксимаба
Ритуксимаб (полученный от Genentech, члена концерна Roche Group, продукт Rituxan(r)) -это моноклональное терапевтическое антитело IgGl, которое селективно направлено против В-клеток CD20+. (Hauser et al., B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis, NEJM 358:676-88 (2008)). Одним из предлагаемых механизмов действия ритуксимаба является АЗКЦ. Формат количественного анализа связывания мишени, разработанный для KW-0761, как описано в Примере 1 настоящего описания, может быть адаптирован к ритуксимабу, имеющему сайт связывания CD 16а в Fc-домене, следующим образом: (i) путем замены KW-0761 в Примере 1 на шагах 2(а)-(б) выше подобными количествами ритуксимаба; (ii) путем замены кроличьего антитела к KW-0761 в Примере 1 на шаге 2(6) подобными количествами кроличьего антитела к ритуксимабу; и (ш) путем замены конъюгата биотинилированного пептида CCR4 в Примере 1 на шаге 2(c) выше подобными количествами конъюгата биотина-пептида CD20 (например, МВТ4736: (Biotin)-[Ahx]KGGYNCEPA NPSEKNSPST QYCYS IQSL // SEQ ID N0:7; или МВТ4737: YNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLK[Ahx] K(Biotin) NH2 // SEQ ID N0:8; оба купленные у Midwest Bio-Tech Inc.; В других вариантах воплощения вместо них использовались (Biotin)KGGYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSL// SEQ Ш N0:5 или YNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQSLKK(Biotin)// SEQ Ш N0:6, которые были синтезированы и биотинилированы традиционными химическими способами). Все другие шаги Примера 1 (3-7) могут прямо адаптироваться без существенной модификации.
Эксперимент проводился в том же формате количественного анализа, который описан в Примере 1, но отличающемся тем, что отсутствовал образец человеческой сыворотки, а любая требуемая сведенная в пул человеческая сыворотка была заменена буфером для количественного анализа (ФРЗФД [рН 7,1 ± 0,1] + 1% [об./об.] бычьего сывороточного альбумина), отсутствовал контрольный образец "N", содержащий сведенную в пул человеческую сыворотку, разбавленную в буфере для количественного анализа, отсутствовал контрольный образец "Р" с антителом к ритуксимабу, а контрольный образец "D" использовался в нескольких концентрациях ритуксимаба, чтобы провести титрацию ритуксимаба в способе количественного анализа (см. фигуру 5). Добавляли меченый полигистидином рекомбинантный человеческий FCyPvIIIa/CD16a для связывания с комплексом биотин-пептид CD20 (SEQ ID N0:7 или SEQ ID N0:8) / ритуксимаб, захваченным на покрытом стрептавидином планшете (см. шаг 1 Примера 1). Скрининговый количественный анализ по настоящему изобретению во всех остальных аспектах далее проводился так же, как в Примере 1 настоящего описания. Говоря коротко, генерировался сигнал ЭХЛ с добавлением моноклонального антитела к полигистидину, затем меченого Sulfo-TAG(tm) козьего антитела к мыши и Read Buffer Т, после чего обнаруживали сигнал при помощи ридера SECTOR(r) Imager 6000 ("MSD 6000"; Meso Scale Discovery, Гейтерсберг, Мэриленд), как описано в Примере 1. На фигуре 5 показаны репрезентативные данные эксперимента, демонстрирующие, что ритуксимаб связывался с конъюгатом биотинилированного пептида CD20 и в зависимости от дозы обнаруживался в том же формате количественного анализа, что и в Примере 1, но с изменениями, описанными в Примере 3.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ количественного анализа in vitro, включающий:
обнаружение в покрытой авидином лунке путем измерения сигнала в присутствии свежего объема буфера, позволяющего провести обнаружение в физиологических условиях, любого антитела, специфически связывающего полигистидин, который связан с меченым полигистидином рекомбинантным человеческим полипептидом CD 16а, причем покрытую авидином лунку предварительно блокировали, а затем предварительно инкубированную реакционную смесь инкубировали в блокированной покрытой авидином лунке в физиологических условиях и суспендировали во время ее предварительной инкубации в содержащем сыворотку водном буфере для количественного анализа, а предварительно инкубированная реакционная смесь включала:
(i) связывающий антиген-мишень белок, включающий Fc-домен с центром связывания CD 16а; и
(ii) биотинилированную часть полипептида представляющего интерес белка-мишени, с которым специфически связывается полипептидная часть связывающего антиген-мишень белка; и
причем после инкубации предварительно инкубированной реакционной смеси в покрытой авидином лунке проводили инкубацию в физиологических условиях меченого полигистидином рекомбинантного человеческого полипептида CD 16а, суспендированного в свежем объеме буфера для количественного анализа, вместе с любым связывающим антиген-мишень белком, который был связан с биотинилированной частью полипептида, связанной с авидином покрытой авидином лунки; и до обнаружения путем измерения сигнала антитело, специфически связывающее полигистидин, суспендированное в свежем объеме буфера для количественного анализа, инкубировали в лунке в физиологических условиях вместе с меченым полигистидином рекомбинантным человеческим полипептидом CD 16а, который был связан со связывающим антиген-мишень белком.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем что дополнительно включает до
обнаружения антитела, которое специфически связывает полигистидин, шаг инкубации в лунке в физиологических условиях антитела, которое включает конъюгированную
вырабатывающую сигнал метку, суспендированного в свежем объеме буфера для количественного анализа, при этом указанное антитело специфически связывает антитело, которое специфически связывает полигистидин.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предварительно инкубированная реакционная смесь дополнительно включает образец сыворотки, предназначенный для анализа на присутствие нейтрализующих антител.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что связывающим антиген-мишень белком является антитело IgGl или IgG3.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что представляющим интерес белком-мишенью является CCR4.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что представляющим интерес белком-мишенью является CD20.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что представляющим интерес белком-мишенью является HER2.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что авидином является стрептавидин.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело, которое специфически связывает полигистидин, дополнительно включает конъюгированную вырабатывающую сигнал метку.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что вырабатывающая сигнал метка включает флуоресцентную метку, изотопную метку, электрохемилюминесцентную метку или фермент.
11. Способ количественного анализа in vitro, включающий:
а. инкубацию в блокированной покрытой авидином лунке в физиологических условиях предварительно инкубированной реакционной смеси, суспендированной в водном буфере для количественного анализа, содержащем сыворотку, причем предварительно инкубированная реакционная смесь включает:
(ш) антитело-мишень IgG, включающее Fc-домен с центром
связывания CD 16а; и (iv) биотинилированную часть полипептида представляющего интерес белка-мишени, с которым специфически связывается полипептидная часть антитела-мишени IgG;
б. инкубацию в лунке в физиологических условиях меченого
полигистидином рекомбинантного человеческого полипептида CD 16а,
суспендированного в свежем объеме буфера для количественного
анализа, вместе с любым антителом-мишенью IgG, которое было связано
с биотинилированной частью полипептида, которая была связана с
авидином по пункту (а);
в. инкубацию в лунке в физиологических условиях антитела, которое
специфически связывает полигистидин, причем указанное антитело
суспендировано в свежем объеме буфера для количественного анализа,
вместе с любым меченым полигистидином рекомбинантным
человеческим полипептидом CD 16а, который был связан с антителом-
мишенью IgG по пункту (б); и
г. обнаружение в лунке в присутствии свежего объема буфера,
позволяющего провести обнаружение в физиологических условиях,
любого антитела, которое специфически связывает полигистидин,
который был связан с меченым полигистидином рекомбинантным
человеческим полипептидом CD 16а по пункту (в), путем измерения
сигнала.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что предварительно инкубированная реакционная смесь дополнительно содержит образец сыворотки, предназначенный для анализа на присутствие нейтрализующих антител.
13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что антителом-мишенью IgG является антитело IgGl или IgG3.
14. Способ по п. 11, отличающийся тем, что представляющим интерес белком-мишенью является CCR4.
15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что представляющим интерес белком-мишенью является CD20.
16. Способ по п. 11, отличающийся тем, что представляющим интерес белком-мишенью является HER2.
17. Способ по п 11, отличающийся тем, что авидином является стрептавидин.
18. Способ по п 11, отличающийся тем, что антитело, которое специфически связывает полигистидин, дополнительно включает конъюгированную вырабатывающую сигнал метку.
12.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что вырабатывающая сигнал метка включает флуоресцентную метку, изотопную метку, электрохемилюминесцентную метку или фермент.
20. Способ по п. 11, дополнительно включающий до шага (г) шаг инкубации в лунке в физиологических условиях антитела, которое включает конъюгированную вырабатывающую сигнал метку, суспендированного в свежем объеме буфера для количественного анализа, отличающийся тем, что указанное антитело специфически связывает антитело, которое специфически связывает полигистидин по пункту (в).
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что вырабатывающая сигнал метка включает электрохемилюминесцентную метку.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что электрохемилюминесцентная метка включает комплекс рутения.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что электрохемилюминесцентная метка формируется из N-гидроксисукцинимид сложного эфира.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что N-гидроксисукцинимид сложный эфир имеет следующую химическую структуру:
H03S -v у S03H
25. Способ по п. 22, отличающийся тем, что электрохемилюминесцентная метка
включает комплекс рутения, имеющего следующую формулу, где линия, нарисованная от карбонильной группы, показывает присоединение к остальной молекуле:
26. Способ по п. 20, отличающийся тем, что вырабатывающая сигнал метка включает флуоресцентную метку, изотопную метку или фермент.
27. Способ по п. 14, отличающийся тем, что антителом-мишенью IgG является могамулизумаб.
28. Способ по п. 15, отличающийся тем, что антителом-мишенью IgG является ритуксимаб.
29. Способ по пункту 16, отличающийся тем, что антителом-мишенью IgG является трастузумаб.
30. Способ количественного анализа in vitro, включающий:
а. инкубацию в блокированной покрытой авидином лунке в физиологических условиях предварительно инкубированной реакционной смеси, суспендированной в водном буфере для количественного анализа, содержащем сыворотку, причем предварительно инкубированная реакционная смесь включает:
(i) антитело-мишень IgG к человеческому CCR4, включающее Fc-домен с центром связывания CD 16а;
(ii) образец сыворотки, предназначенный для анализа на присутствие нейтрализующих антител; и
(ш)биотинилированную часть полипептида человеческого CCR4, с которой специфически связывается полипептидная часть антитела-мишени IgG;
б. инкубацию в лунке в физиологических условиях меченого
полигистидином рекомбинантного человеческого полипептида CD 16а,
суспендированного в свежем объеме буфера для количественного
анализа, вместе с любым антителом-мишенью IgG, которое было связано
с биотинилированной частью полипептида человеческого CCR4,
связанного с авидином по пункту (а);
в. инкубацию в лунке в физиологических условиях антитела, которое
специфически связывает полигистидин, причем указанное антитело
суспендировано в свежем объеме буфера для количественного анализа
вместе с любым меченым полигистидином рекомбинантным
человеческим полипептидом CD 16а, который был связан с антителом-
мишенью IgG по пункту (б);
г. инкубацию в лунке в физиологических условиях антитела, которое
включает конъюгированную вырабатывающую сигнал метку,
суспендированного в свежем объеме буфера для количественного
анализа, причем указанное антитело специфически связывает антитело,
которое специфически связывает полигистидин по пункту (в); и
д. обнаружение в лунке в присутствии свежего объема буфера,
позволяющего провести обнаружение в физиологических условиях,
любого выработанного сигнала.
31. Способ по пункту 30, отличающийся тем, что вырабатывающая сигнал метка включает электрохемилюминесцентную метку.
32. Способ по пункту 31, отличающийся тем, что электрохемилюминесцентная метка включает комплекс рутения.
33. Способ по пункту 32, отличающийся тем, что электрохемилюминесцентная метка формируется из N-гидроксисукцинимид сложного эфира.
34. Способ по пункту 33, отличающийся тем, что N-гидроксисукцинимид сложный эфир имеет следующую химическую структуру:
31.
H03S
S03H
* \ //
35. Способ по пункту 32, отличающийся тем, что электрохемилюминесцентная
S03H
метка включает комплекс рутения, имеющего следующую формулу, где линия, нарисованная от карбонильной группы, показывает присоединение к остальной молекуле:
36. Способ по пункту 30, отличающийся тем, что вырабатывающая сигнал метка включает флуоресцентную метку, изотопную метку или фермент.
37. Способ по пункту 30, отличающийся тем, что авидином является стрептавидин.
38. Способ по пункту 30, отличающийся тем, что антителом-мишенью IgG является могамулизумаб.
36.
1/5
Фиг. 1
Готовят реакционную смесь, содержащую антитело-мишень IgG (например, AMG 761), анализируемый образец сыворотки и конъюгат биотин-белок-мишень (например, 6HOTHH-CCR4); инкубируют антитело-мишень IgG и сыворотку в течение 1 часа
при комнатной температуре при умеренном встряхивании, затем добавляют конъюгат биотин-белок-мишень.
Блокируют покрытый авидином планшет (например, покрытый стрептавидином планшет MSD 6000) буфером для количественного анализа (физиологический раствор, забуференный фосфатом Дульбекко (ФРЗФД) + 1% бычачьего сывороточного альбумина (БСА)) в течение > 1 часа при комнатной температуре, промывают один раз при помощи ФРЗФД
Переносят реакционную смесь в каждую указанную
лунку на планшете, инкубируют при комнатной температуре при умеренном встряхивании в течение
примерно 1 часа, промывают трижды при помощи
ФРЗФ.Л
Добавляют меченый полигистидином FCyRIMa (CD16a) в каждую указанную лунку, инкубируют при комнатной температуре при умеренном встряхивании в течение 1 часа, промывают трижды при помощи ФРЗФД
NJ (Л
контакт с антителом, которое специфически связывает меченый полигистидином FCvRllla (CD16a) Пример: добавляют моноклональное антитело к полигистидину, инкубируют при комнатной температуре при умеренном встряхивании в течение 45 минут, промывают трижды при помощи ФРЗФД
Контакте вырабатывающе^игнал меткой-Пример: добавляют козье SULFO-TAG к мыши, инкубируют при комнатной температуре при умеренном встряхивании в течение 30 минут, промывают трижды при помощи ФРЗФД
Обнаружение сигнала подходящим инструментом-Пример: добавляют буфер считывания Т и считывают при помощи прибора MSD Sector(r) Imager 6000)
3/5
Фиг. 3
102 103
AMG 761 (нг/мл)
_0% сведенной в пул человеческой "сыворотки
_5% сведенной в пул человеческой сыворотки
.20% сведенной в пул человеческой сыворотки
6000л
4/5
Фиг. 4
5000
X (Т)
4000
ВМВТ4736 ? МВТ4737 ?без пептида
3000 2000 1000 0
3.33 1.11 Ритуксан (мкг/мл)
(19)
(19)
(19)
(III)