[RU]

Настоящее изобретение относится к непрерывному периодическому способу получения органических продуктов, таких как этанол, бутанол, молочная кислота, уксусная кислота и другие основные химические продукты для перевода их в другие производные. Для ферментации используют материалы, содержащие углеводы, в присутствии культур штаммов дрожжей и бактерий. Ферментацию выполняют в условиях, которые обеспечивают минимальный рост культур штаммов дрожжей или бактерий в биореакторе, и это приводит практически к полной конверсии углеводов.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к непрерывному периодическому способу получения органических продуктов, таких как этанол, бутанол, молочная кислота, уксусная кислота и другие основные химические продукты для перевода их в другие производные. Для ферментации используют материалы, содержащие углеводы, в присутствии культур штаммов дрожжей и бактерий. Ферментацию выполняют в условиях, которые обеспечивают минимальный рост культур штаммов дрожжей или бактерий в биореакторе, и это приводит практически к полной конверсии углеводов.

---

Евразийское (21) 201301163 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C12P 7/00 (2006.01)
2014.06.30 C12P 7/06 (2006.01)
C12P 7/56 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки
2012.04.13
(54) ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ СПОСОБ ФЕРМЕНТАЦИИ
(31) 11162196.7
(32) 2011.04.13
(33) EP
(86) PCT/EP2012/056821
(87) WO 2012/140223 2012.10.18
(71) Заявитель: СПРИНГХИЛЛ С.А. (LU)
(72) Изобретатель:
Колбаков Вамбола (EE), Илушка Игорь Валерьянович, Ракитин Владимир (RU)
(74) Представитель:
Вахнин А.М. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к непрерывному периодическому способу получения органических продуктов, таких как этанол, бутанол, молочная кислота, уксусная кислота и другие основные химические продукты для перевода их в другие производные. Для ферментации используют материалы, содержащие углеводы, в присутствии культур штаммов дрожжей и бактерий. Ферментацию выполняют в условиях, которые обеспечивают минимальный рост культур штаммов дрожжей или бактерий в биореакторе, и это приводит практически к полной конверсии углеводов.
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ СПОСОБ ФЕРМЕНТАЦИИ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ [0001] Настоящее изобретение относится к технологическому способу получения продуктов ферментации, таких как этанол, бутанол, молочная кислота, уксусная кислота и других, путём новой непрерывной периодической ферментации. Углеводы из нескольких источников (зерновых культур, картофеля, маниоки, патоки и т.д.), в качестве субстратов, могут перерабатываться с очень высокой скоростью и производительностью и практически все углеводы (до 92%) превращаются в целевые продукты. Способ позволяет достигнуть конверсии углеводов близкой к вычисленному теоретическому максимуму.
[0002] Внедрение способа периодической ферментации (т.е. ступенчатого добавления субстратов и удаления продуктов) в непрерывный способ, делает культивируемые клетки более эффективными, в то время как окружающая среда вообще не является стабильной. Добавление вторичной культуры в ферментационную систему делает первичную культуру более жизнеспособной, индуцируя сигналы конкуренции.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Большинство из существующих отраслей промышленности по производству органических кислот, спиртов и других продуктов путем ферментации, главным образом, основаны на периодическом процессе, который обычно выполняют при низкой концентрации культур штаммов дрожжей или бактерий (клеток микроорганизмов) и субстратов (субстратное ингибирование) на протяжении 60-80 часов ростовых циклов.
[0004] При достижении оптимальной с технической точки зрения конверсии материалов, содержащих углеводы, ферментацию останавливают, и метаболиты удаляют из бульона.
[0005] Такие способы отличаются: низкой продуктивностью (низкой скоростью производства метаболитов) и высвобождением огромного количества сточных вод, которые содержат клетки микроорганизмов, побочные продукты, остатки субстрата и т.д. (т.е. барды).
[0006] Количество сточных вод может быть немного снижено при применении периодической ферментации с подпиткой. Периодическая ферментация с подпиткой отличается от периодической ферментации добавлением, на протяжении процессов, определенного количества свежего субстрата и последующим удалением пропорционального количества бульона. Периодическая ферментация с подпиткой отличается немного более длительным суммарным временем цикла, которое, конечно, приемлемо для производственной практики, где в настоящее время для эффективных операционных процедур используют стерилизацию после каждого рабочего цикла для предотвращения загрязнения.
[0007] Тем не менее, такой способ, а также способ периодической ферментации, отличается низкой продуктивностью (низкой скоростью производства метаболитов), и поставляет огромные количества сточных вод, которые содержит различный осадок.
[0008] Одним из ключевых моментов увеличения скорости получения метаболитов путем ферментации является поддержание максимально возможной концентрации микроорганизмов. В то же время, одним из способов достижения высокой концентрации биомассы в ферментере и уменьшения количества сточных вод, которые содержат клетки микроорганизмов, является применение биореакторов непрерывного действия с рециркуляцией клеток (continuous cell-recycle bioreactors), в частности, мембранных биореакторов с рециркуляцией клеток.
[0009] Эти системы главным образом состоят из реакторов идеального смешения непрерывного действия или со встроенным мембранным модулем, или связанные вместе с отдельной мембранной установкой, чаще всего работающие на основе микрофильтрации или ультрафильтрации.
[0010] Однако основной проблемой данного непрерывного способа является неполная конверсия углеводов. К тому же, результатом всех попыток повышения конверсии углеводов является снижение продуктивности ферментации.
[0011] Необходимо отметить, что водный раствор метаболитов, который удаляют из ферментера, не содержит клеток микроорганизмов, однако содержит углеводы. Присутствие относительно высокого количества неферментированных углеводов на выходе из ферментера существенно усложняет способ выделения целевых продуктов и также приводит к повышению стоимости производства.
[0012] Другой серьезной проблемой мембранного биореактора являются трудности, связанные с ухудшением скорости фильтрации на протяжении длительного периода времени непрерывной ферментации из-за постоянного увеличения биомассы клеток микроорганизмов.
[0013] Для стабилизации скорости фильтрации Асакура (Asakura) предлагает удалять осадок микроорганизмов на фильтре периодическими обратными потоками образующегося в процессе ферментации газа через фильтрующие элементы. (Т. Asakura and К. Toda, "New cell recycle ethanol fermentation with periodic cleaning of filter with gas" Bioprocess Engineering 7, 1991, 83-88). Однако, такие действия перемещают способ в категорию периодических процессов и в то же самое время не позволяют достигать высокой степени конверсии углеводов.
[0014] В патентной заявке WO 2009/006909 A (NORDBIOCHEM OU) 15.09.2009, описывают сущность ферментации при минимальной скорости роста клеток с непрерывным культивированием в ферментере непрерывного действия с рециркуляцией клеток, посредством чего выход молочной кислоты составляет 50г/л/час. В сравнении с указанным выше патентом в данном изобретении применяют способ периодического
выращивания, который индуцирует микроорганизмы для достижения максимальной эффективности. Другой особенностью является добавление вторичной культуры в питательные среды для ферментации, что также повышает эффективность первичной культуры. Кроме того, данная вторичная культура индуцирует жизнеспособность первичной культуры, таким образом снижает затраты на стерилизацию ферментационной системы, и (служит) для наращивания посевного материала для начала нового производственного цикла.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0015] Целью данного изобретения является выполнение способа ферментации при таких условиях, при которых: обеспечивают высокую продуктивность и достигают практически полной конверсии углеводов.
[0016] В соответствии с настоящим изобретением достигается технический результат, заключающийся в том, что органические продукты, такие как этанол, бутанол, молочная кислота, уксусная кислота и другие продукты могут быть получены простым и недорогим способом, путем устранения недостатков рассмотренных выше способов.
[0017] Неожиданно было обнаружено, что если процесс выполняют в периодических условиях при достаточно высокой концентрации клеток и в условиях, которые обеспечивают очень низкую скорость роста клеток микроорганизмов в ферментере, возможно многократное повторное использование клеток микроорганизмов, выделенных из бульона после каждой стадии периодической ферментации, на следующей стадии ферментации для конверсии свежей партии углеводов.
[0018] Это позволяет выполнять ферментацию с высокой скоростью (высокой производительностью) и практически с полной конверсией углеводов. Данный способ существенно снижает как количество сточных вод и биомассы, удаленной из ферментера (так называемый слив клеток), так и снижает, в результате, затраты на их утилизацию.
[0019] Было выявлено, что для каждого микроорганизма существуют оптимальные условия - температура, значение рН, количество питательных веществ и бактериостатиков, подаваемых в ферментер, при которых скорость роста клеток является минимальной, но достаточной для замещения погибших клеток. В то же время скорость роста клеток может быть снижена путем повышения температуры и снижения значения рН до критических и сверхкритических значений для каждого микроорганизма, а также путем уменьшения количеств питательных веществ, подаваемых в ферментер, и с использованием таких добавок, как бактериостатики. Обычно оптимальной скорости роста клеток достигают комбинацией скоростей перемешивания и фильтрации, значений температуры и рН, а также количества необходимых количеств питательных веществ и бактериостатиков, подаваемых в ферментер.
[0020] Необходимо отметить, что существование современных, управляемых компьютером, устройств измерения и контроля позволяет полностью автоматизировать такой сложный периодический способ.
ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ [0021] В соответствии с настоящим изобретением каждая периодическая стадия получения органических продуктов путем ферментации содержит три стадии:
1) загрузку водного раствора углеводов, питательных веществ, бактериостатиков, солей и клеток микроорганизмов в ферментер, при этом концентрацию культур штаммов дрожжей или бактерий в ферментере поддерживают приблизительно в фиксированном состоянии, между 5-100 граммами сухих клеток на литр (предпочтительно 20-100 грамм сухих клеток на литр);
2) ферментацию с образованием метаболитов (органических продуктов);
3) удаление из ферментера водного раствора метаболитов, не содержащего клеток, с повторным направлением в ферментер концентрированной на фильтровальной установке суспензии клеток микроорганизмов.
[0022] После этого в ферментер, в процесс с концентрированной суспензией клеток (оставшихся после третьей стадии), вносят свежую порцию водного раствора углеводов, и, если необходимо, питательные вещества, бактериостатики и соли, затем повторяют вышеуказанные операции (стадии 2 и 3).
[0023] Несмотря на тот факт, что описаны десять периодических стадий в нижеизложенных примерах, однако число стадий может быть более ста и все эти стадии выполняют без добавлений свежих клеток микроорганизмов. Этот факт является дополнительным мощным пунктом снижения расходов, поскольку нет никакой необходимости в периодическом культивировании инокулята (стартовая культура ферментации обычно составляет 10% объема ферментации).
[0024] Было отмечено, что несмотря на выполнение периодических стадий много раз, тем не менее имеет место небольшое повышение концентрации клеток микроорганизмов. Результатом этого является повышение вязкости бульона и снижение скорости отделения клеток от метаболитов.
[0025] Для устранения этой проблемы, периодически (приблизительно после 50-80 периодических стадий, которые были выполнены) небольшое количество концентрированной суспензии клеток микроорганизмов удаляют из ферментера для получения концентрации клеток в ферментере приблизительно равной исходной концентрации клеток (как на первой стадии ферментации).
[0026] Количество концентрированной суспензии клеток, удаленной из ферментера, является существенно меньшей по сравнению с потоком клеток при осуществлении непрерывной ферментации (так называемый "слив клеток"), не говоря уже о традиционном периодическом способе периодической ферментации.
[0027] Во время удаления суспензии клеток имеется большая часть нерастворимых метаболитов; часть продуктов лизиса клеток и т.д. также удаляется из процесса.
[0028] Для выполнения данного способа может быть использован ферментер, соединенный с устройством для рециркуляции клеток. Предпочтительно устройство для рециркуляции клеток представляет собой мембранный модуль.
[0029] Данный способ позволяет производить органические продукты с высокой производительностью (до 200 г/л/ч) и в этих условиях количество сточных вод, которые содержат клетки микроорганизмов, не превышает значения 10 грамм на 1 кг целевого продукта.
[0030] Для предупреждения резкой потери выхода продуктов ферментации после повторяющихся циклов (так называемого покоя), который зависит от используемых микроорганизмов, существует возможность добавить вторичную культуру в ферментативный бульон. Вторичную культуру добавляют приблизительно в течение 3/4 произведенных циклов, и количество добавленной культуры составляет до 5% объема ферментации. На протяжении непрерывной ферментации, основная культура подавляет добавленную культуру и добавление вторичной культуры может быть снова использовано. Описанное действие делает применение основной культуры в 5-10 раз продолжительнее и будет иметь прямой экономический эффект. Принцип феномена по настоящим публикаций состоит в следующем - в природе микроорганизм существует в виде мозаичных пленок на поверхностях. Они используют метаболизм друг друга и продукты распада подобно симбионтам. В искусственных условиях, на стадии растворения в воде монокультуры, имеют место активированные до сих пор неизвестные механизмы, предупреждающие несдерживаемый рост. Вторичная культура играет роль по компенсации искусственного давления окружающей среды.
[0031] Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируют в следующих примерах, которые не следует принимать как ограничивающие объем изобретения.
[0032] Примеры
[0033] Система мембранного биореактора с циклом рециркуляции состоит из ферментера (10 литрового стеклянного сосуда), оснащенного регулятором рН, регулятором температуры и перемешивания. Ферментер соединяют в конфигурацию полузамкнутой цепи с мембранным модулем (с отсечением по молекулярной массе (MW cut-off) 100 кДа, F=1,8 м2), для отделения клеток микроорганизмов от ростовой среды и продукта ферментации.
[0034] Стадия 1.
В начале в ферментер загружают 5,7 л смеси следующего состава, г/л: Углеводы 30-200 Питательные вещества 3-6
Соли К, Na, Mg и другие 10-15 Бактериостатики (необязательно) 1-6 (мг/л)
и суспензию клеток микроорганизмов для создания концентрации клеток в ферментере, равной 5-100 г/л (в расчете на сухие клетки).
[0035] Стадия 2.
Способ ферментации выполняют до практически полной конверсии углеводов (> 99.9%), автоматически контролируя температуру (температурный диапазон 37-55 °С) и рН (диапазон рН 5-7) в ферментере добавлением 6-12% NH4OH. При достижении конверсии углеводов значения 99,9% начинают процесс отделения. На указанной стадии минимальную скорость роста клеток культур дрожжевых или бактериальных штаммов в биореакторе, которая является достаточной для обеспечения возмещения гибели клеток, контролируют подбором определенной температуры, рН и количества питательных веществ, подаваемых в ферментер и применением бактериостатиков.
[0036] Стадия 3.
Способ отделения выполняют пропусканием под давлением полученного бульона через мембранный модуль, сбором свободного от продуктов клеток водного раствора и возвращением концентрированной суспензии клеток в ферментер. Способ отделения останавливают, когда в ферментере будет приблизительно 10-15 % бульона от его исходного объема. Оставшийся бульон является концентрированной суспензией клеток микроорганизмов.
[0037] Свежий раствор углеводов, содержащий, если необходимо, питательные вещества, бактериостатики и соли, добавляют в оставшийся бульон и стадии 2 и 3 повторяют.
[0038] В качестве углеводов могут быть использованы глюкоза, лактоза, фруктоза, галактоза, сахароза. В качестве питательных веществ могут быть использованы пептон, белковые экстракты и дрожжевой экстракт. В качестве соли могут быть использованы K2HP04, KH2P04, NaCI, Na ацетат, MgS04, Fe2(S04)3, ZnS04, MnS04 и другие.
[0039] Для пролонгирования ферментации (больше стадий фильтрации с одной стартовой культурой), добавляют вторичную культуру бактерий в ферментационный бульон. Добавление выполняют до потери эффективности продуцирования культур. Наилучшие результаты были получены со штаммом Lactococcus в сочетании со штаммом Leuconostoc.
[0040] Аммиак, используемый для нейтрализации окружающей среды ферментации, утилизируется бактериями в качестве источника азота. Таким образом, требуется меньше питательных веществ. Это делает продукт более дешевым и отфильтрованный раствор более прозрачным. Этот последний момент делает процесс отделения более лёгким, что означает - более дешёвым.
[0041] Способ ферментации данного изобретения может быть применен не только для производства молочной кислоты и этанола, но также для других органических кислот, спиртов и сложных эфиров, таких как уксусная кислота, муравьиная кислота, пропионовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, бутанол, этилацетат и другие.
[0042] Условия и результаты ферментации представлены в Таблицах 1, 2 и 3.
[0043] Таблица 1. Условия и результаты ферментации углеводов до молочной кислоты.
Объём ферментации (VF) - 6 литров; Конверсия углеводов > 99,9%; Т0 = 3 мин.; TS = 10 мин., VFT= 5 литров;
* - всё необходимое количество углеводов было разбито на четыре части и добавлено в ферментер на протяжении всего периода
ферментации каждые 15 минут.
** Пример ферментации со вторичной бактериальной культурой, добавленной в количестве 10% от объёма ферментера на 85 стадии ферментации
[0044] Таблица 2. Условие и результаты ферментации (конверсии) углеводов в этанол
[0045] Таблица 3. Потребление аммиака бактериями на протяжении молочнокислого брожения
[0046] Примечания к таблицам 1, 2, 3: Т - температура ферментации, °С;
Сс1,1 - исходная концентрация клеток микроорганизмов в ферментере на первой стадии ферментации, грамм/литр (сухих клеток);
Сс1 Е - концентрация клеток микроорганизмов в ферментере после первой стадии ферментации, грамм/литр (сухих клеток);
Сс10Е - концентрация клеток микроорганизмов в ферментере после десятой стадии ферментации, грамм/литр (сухих клеток);
Сен' - исходная концентрация углеводов в ферментере на всех стадиях ферментации, грамм/литр;
С№ - концентрация питательных веществ в ферментере на первой стадии ферментации, грамм/литр;
Cs - концентрация солей в ферментере на всех стадиях ферментации, г/л;
Св - концентрация бактериостатиков в ферментере на всех стадиях ферментации, мг/л;
Cs - концентрация нейтрализатора на входе, М;
СЕ - концентрация нейтрализатора после циклов ферментации (средняя), М; т0 - продолжительность периодической загрузки субстрата, мин.; (это значение приблизительно постоянно на всех стадиях ферментации и приблизительно равно 3 мин.);
TF1 - продолжительность первой стадии ферментации, мин.; ту10 - продолжительность десятой стадии ферментации, мин.;
Ts - продолжительность разделения продуктов после ферментации, мин. (Это значение приблизительно постоянно на всех стадиях ферментации и приблизительно равно 10 ± 2 мин);
СР - концентрация продукта в фильтрате, грамм/литр, (это значение приблизительно постоянно после каждой стадии ферментации);
VFT - объем фильтрата на всех стадиях ферментации, литры; (это значение
приблизительно постоянно после каждой стадии ферментации и равно 5 л);
Gp1 - выход продукта на первой стадии ферментации, г/(л*ч.);
GP10 - выход продукта на десятой стадии ферментации, г/(л*ч.);
GpA - средний выход продукта в течение десяти стадий ферментации, г(л*ч);
РР - фосфат калия;
MS - сульфат магния;
SF - сульфат железа;
SM - соли марганца;
SC - натрия хлорид;
GP1 - (VFT * СР)/ (то + Тр' + т3)* VF
GPA = 6(VFT * СР)/ (ZT0+ ITF1 + ITS)* VF
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Высокоэффективный непрерывный периодический способ получения органических продуктов путём ферментации материалов, содержащих углеводы, содержащий последовательные стадии:
a) микробиологической ферментации материалов, содержащих углеводы, в присутствии культур штаммов дрожжей или бактерий в условиях, зависящих от штамма микроорганизма, и при параметрах для совместного культивирования, которые обеспечивают:
i) процесс одновременного осахаривания и ферментации (SSF); и) вторичную культуру, добавленную в процесс ферментации для пролонгирования непрерывного процесса;
iii) минимальную скорость роста клеток культур дрожжевых или бактериальных штаммов в биореакторе, но достаточную для обеспечения замены погибших клеток;
iv) практически полную конверсию углеводов;
v) простого и быстрого отделения клеток микроорганизмов от метаболитов;
b) отделения полученной биомассы с образованием водного раствора метаболитов, по существу не содержащего клеток, и концентрата клеток, по существу не содержащего метаболиты;
c) повторного использования концентрата клеток для выполнения способа ферментации свежей порции материалов, содержащих углеводы.
2. Способ по п. 1, где ферментацию выполняют в системе мембранного биореактора, которая содержит ферментер и мембранный модуль для разделения.
3. Способ по п. 1, где минимальную и достаточную скорость роста клеток культур дрожжевых или бактериальных штаммов обеспечивают выбором точной температуры, значением рН, количества питательных веществ, подаваемых в ферментер, и применением бактериостатиков.
4. Способ по п. 3, где температура находится в диапазоне 37-55 С°.
5. Способ по п. 3, где значение рН находится в диапазоне 5-7.
6. Способ по п. 1, где концентрацию культур штаммов дрожжей и бактерий в ферментере поддерживают приблизительно в фиксированном состоянии между 5-100 граммами сухих клеток на литр, концентрация находится в зависимости от микроорганизма-продуцента и штаммов микроорганизмов для совместного культивирования.
2.
7. Способ по п. 1, где вторичную культуру добавляют приблизительно в циклы 3/4 процесса, и количество добавленной вторичной культуры составляет вплоть до 5% объема ферментации.
8. Способ по п. 1, где по необходимости нейтрализации при получении органических кислот, используемый химический реактив представляет собой аммиак, поскольку аммиак является источником азота.