EA201300481A1 20140130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2014\PDF/201300481 Полный текст описания [**] EA201300481 20041105 Регистрационный номер и дата заявки US60/517,096 20031105 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EAA1 Код вида документа [pdf] eaa21401 Номер бюллетеня [**] АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ Название документа [8] C07K 16/28, [8] C12N 15/13, [8] C12N 15/63, [8] C12N 5/10, [8] A61K 39/395, [8] A61P 35/00, [8] A61P 37/00 Индексы МПК [CH] Умана Пабло, [CH] Брюнкер Петер, [CH] Феррара Клаудиа, [CH] Зутер Тобиас, [CH] Пюнтенер Урсула, [CH] Мёсснер Эккехард Сведения об авторах [CH] ГЛИКАРТ БИОТЕХНОЛОГИ АГ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201300481a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[**]

В заявке описаны гуманизированные антитела, специфические в отношении человеческого CD20, способы получения таких антител и способы их применения для уничтожения CD20-экспрессирующих клеток лимфомы и ингибирования роста клеток опухоли человека.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

В заявке описаны гуманизированные антитела, специфические в отношении человеческого CD20, способы получения таких антител и способы их применения для уничтожения CD20-экспрессирующих клеток лимфомы и ингибирования роста клеток опухоли человека.


Евразийское (21) 201300481 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2014.01.30
(22) Дата подачи заявки 2004.11.05
(51) Int. Cl.
C07K16/28 (2006.01) C12N15/13 (2006.01) C12N15/63 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) A61K39/395 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) A61P37/00 (2006.01)
(54) АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
(31) 60/517,096
(32) 2003.11.05
(33) US
(62) 201100128; 2004.11.05
(71) Заявитель:
ГЛИКАРТ БИОТЕХНОЛОГИ АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Умана Пабло, Брюнкер Петер, Феррара Клаудиа, Зутер Тобиас, Пюнтенер Урсула, Мёсснер Эккехард
(CH)
(74) Представитель:
Веселицкая И.А., Веселицкий М.Б., Кузенкова Н.В., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В. (RU)
(57) В заявке описаны гуманизированные антитела, специфические в отношении человеческого CD20, способы получения таких антител и способы их применения для уничтожения CD20-3M;-прессирующих клеток лимфомы и ингибирования роста клеток опухоли человека.
116853
15 Заявка №
Заявитель ГликАрт Биотехнологи АГ, СН
АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ К
20 СВЯЗЫВАНИЮ С Fc-РЕЦЕПТОРОМ И ЭФФЕКТОРНОЙ ФУНКЦИЕЙ
Предпосылки создания изобретения Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам 25 (АСМ). Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к рекомбинантным моноклональным антителам, включая химерные, приматизированные или гуманизированные антитела, обладающие специфичностью в отношении человеческого CD20. Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют 30 такие АСМ, и векторам и клеткам-хозяевам, содержащим такие молекулы
нуклеиновых кислот. Изобретение относится также к способам получения АСМ, предлагаемых в изобретении, и к способам применения таких АСМ для лечения заболевания. Кроме того, настоящее изобретение относится к АСМ с
модифицированным гликозилированием, которые обладают улучшенными
терапевтическими свойствами, включая антитела с повышенной способностью к
связыванию с Fc-рецептором и повышенной эффекторной функцией.
Известный уровень техники
5 Иммунная система и антитела к CD20
Иммунная система позвоночных, включая человека, состоит из многих органов и типов клеток, которые участвуют в точном и специфическом распознавании, связывании и разрушении проникших чужеродных микроорганизмов ("антигенов"). Решающее значение для правильного
10 функционирования иммунной системы играют лимфоциты. Эти клетки продуцируются в тимусе, селезенке и костном мозге (взрослых особей) и составляют примерно 30% от общего количества лейкоцитов, присутствующих в кровеносной системе взрослого человека. Существует две основные субпопуляции лимфоцитов: Т-клетки и В-клетки. Т-клетки ответственны за
15 опосредуемый клетками иммунитет, в то время как В-клетки ответственны за производство антител (гуморальный иммунитет). Однако при создании типичного иммунного ответа Т-клетки и В-клетки функционируют независимо: Т-клетки активируются, когда Т-клеточный рецептор связывается с фрагментами антигена, которые связаны с гликопротеинами главного комплекса
20 гистосовместимости ("ГКГ") на поверхности антигенпрезентирующей клетки; такая активация приводит к высвобождению биологических медиаторов ("интерлейкинов"), которые стимулируют В-клетки к дифференцировке и продуцированию антител ("иммуноглобулинов") к антигену.
Каждая В-клетка в организме-хозяине экспрессирует антитело одного
25 конкретного типа и специфичности, а различные В-клетки экспрессируют антитела, специфические в отношении различных антигенов. В-клеточная пролиферация и продуцирование антител выступают в качестве реакции на чужеродный антиген, и то и другое, как правило, прекращается (или существенно уменьшается) после того как чужеродный антиген нейтрализован.
30 Однако иногда пролиферация конкретной В-клетки может продолжаться без ограничения; такая пролиферация может приводить к раку, который называют "В-клеточной лимфомой").
Как Т-клетки, так и В-клетки содержат белки клеточной поверхности, которые можно использовать в качестве "маркеров" для дифференцировки и идентификации. Одним из таких маркеров человеческих В-клеток является связанный только с человеческими В-лимфоцитами дифференцировочный 5 антиген Вр35, который называют "CD20". CD20 экспрессируется на ранней стадии развития пре-В-клеток и сохраняется до дифференцировки плазматических клеток. В частности, молекула CD20 необходима для регулирования стадии процесса активации, которая требуется для инициации клеточного цикла и дифференцировки, и, как правило, на неопластических
10 ("опухолевых") В-клетках имеет место высокий уровень ее экспрессии. Поскольку высокие уровни CD20 присутствуют на "злокачественных" В-клетках, т.е. на тех В-клетках, неограниченная пролиферация которых может приводить к В-клеточной лимфоме, то поверхностный антиген CD20 может являться кандидатом в качестве "мишени для распознавания" В-клеточных
15 лимфом.
По существу процесс "распознавания мишени" можно обобщить следующим образом: антитела, специфические в отношении поверхностного антигена CD20 на В-клетках, вводят пациенту, например, путем инъекции. Эти антитела к CD20 специфически связываются с клеточным поверхностным
20 антигеном CD20 (очевидно) как на здоровых, так и на злокачественных В-
клетках; антитело к CD20, связанное с поверхностным антигеном CD20, может приводить к разрушению и истощению неопластических В-клеток. Кроме того, с антителом к CD20 можно конъюгировать химические агенты или радиоактивные метки, обладающие способностью разрушать опухоль, так чтобы осуществлять
25 специфический "перенос" агента, например к неопластическим В-клеткам. Независимо от подхода основной целью является разрушение опухоли: конкретный подход может определяться выбором конкретного применяемого антитела к CD20 и, таким образом, пригодные подходы для распознавания в качестве мишени антигена CD20 могут широко варьироваться.
30 Неконъюгированные моноклональные антитела (МАт) можно применять в
качестве лекарственных средств для лечения рака, о чем свидетельствует разрешение Департамента по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (US Food and Drug Administration)
применения ритуксимаба (Rituxan(tm); фирма IDEC Pharmaceuticals, Сан-Диего, шт. Калифорния, и фирма Genetech Inc., Сан-Франциско, шт. Калифорния) для лечения СБ20-позитивной В-клеточной, низкозлокачественной или фолликулярной неходжкинской лимфомы, трастузумаба (Herpceptin(tm), фирма 5 Genetech Inc.) для лечения развитого рака молочной железы (Grillo-Lopez A.-J и др., Semin. Oncol., 26, 1999, сс. 66-73; Goldenberg М.М., Clin. Ther., 21, 1999, cc. 309-318), гемтузумаба (Mylotarg(tm), фирма Gentech/Wyeth-Ayerst) для лечения рецидива острого миелоидного лейкоза и алемтузумаба (САМРАТН(tm), фирма Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) для лечения В-клеточного хронического
10 лимфолейкоза. Успешное применение этих продуктов обусловлено не только их эффективностью, но и их очень хорошими профилями безопасности (Grillo-Lopez A.-J и др., Semin. Oncol., 26, 1999, сс. 66-73; Goldenberg М.М., Clin. Ther., 21, 1999, сс. 309-318). В свете успехов, связанных с этими лекарственными средствами, в настоящее время существует большая потребность в достижении
15 более высокой специфической активности антител по сравнению с той, которая, как правило, обеспечивается при лечении с использованием неконъюгированного МАт. Другим антителом, обладающим специфичностью в отношении человеческого CD20, является мышиное моноклональное антитело В-Lyl (Poppema S. и Visser L., Biotest Bulletin, 3, 1987, cc. 131-139).
20 Результаты многочисленных исследований позволяют предположить, что
зависящие от Fc-рецептора механизмы оказывают существенное влияние на действие цитотоксичных антител на опухоли и указывают на то, что оптимальное антитело, действующее на опухоли, должно связываться предпочтительно с Fc-рецепторами-активаторами и в минимальной степени с
25 партнером-ингибитором FcyRIIB (Clynes R.A. и др., Nature Medicine, 6(4), 2000, сс. 443-446; Kalergis A.M. и Ravetch J.V., J. Exp. Med., 195(12), июнь 2002, cc. 1653-1659. Например, результаты по меньшей мере одного исследования позволяют, в частности, предположить, что FcyRIIIa-рецептор имеет большое значение для эффективности терапии с использованием антител (Cartron G. и
30 др., Blood, 99(3), февраль 202, сс. 754-757). В этом исследовании установлено, что пациенты, гомозиготные по FcyRIIIa, дают лучшую реакцию на ритуксимаб, чем гетерозиготные пациенты. Авторы сделали вывод о том, что более высокая реакция обусловлена лучшим связыванием антитела с FcyRIIIa in vivo, что
приводит к более высокой антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (ADCC-активности) в отношении клеток лимфомы (Cartron G. и др., Blood, 99(3), февраль 202, сс. 754-757).
Известны многочисленные попытки использовать в качестве мишени 5 поверхностный антиген CD20. Опубликованы данные о том, что мышиное (мышь) моноклональное антитело 1F5 (антитело к CD20) вводили путем внутривенной непрерывной инфузии пациентам с В-клеточной лимфомой. Было указано, что для истощения опухолевых клеток, присутствующих в кровотоке, необходимы очень высокие уровни (> 2 г) 1F5 и отмечено, что результаты
10 оказывались "кратковременными" (Press и др., Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas, Blood, 69/2, 1987, cc. 584-591). Потенциальной проблемой, связанной с этим подходом, является то, что у моноклональных антител из организма кроме человека (например у мышиных моноклональных антител), как правило, отсутствует человеческая эффекторная
15 функция, т.е. они неспособны среди прочего опосредовать
комплементзависимый лизис или лизировать человеческие клетки-мишени с помощью антитело-обусловленной клеточнозависимой токсичности или путем опосредованного Fc-рецептором фагоцитоза. Кроме того, моноклональные антитела из организма кроме человека могут распознаваться человеческим
20 организмом-хозяином как чужеродный белок; поэтому повторные инъекции
таких чужеродных антител могут индуцировать иммунные ответы, приводящие к вредным реакциям гиперчувствительности. Для моноклональных антител, выведенных из организма мыши, это явление часто называют человеческим антимышиным гуморальным иммунным ответом или "НАМА"-ответом. Кроме
25 того, эти "чужеродные" антитела могут быть атакованы иммунной системой
хозяина, в результате чего они фактически оказываются нейтрализованными до того, как достигнут своей области-мишени.
Другой известный из литературы подход к усилению способности мышиных моноклональных антител оказывать действие при лечении связанных
30 с В-клетками заболеваний заключался в осуществлении конъюгации
радиоактивной метки или токсина с антителом так, чтобы метка или токсин оказались локализованными в области опухоли. Например, опубликованы данные о том, что указанное выше антитело 1F5 "метили" с помощью йода-131
(" I") и оценивали его биораспределение в организме двух пациентов (см. Еагу J.F. и др., Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma, J. Nuc. Med. 31/8, 1990, cc. 1257-1268; см. также Press O.W. и др., Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody, J. Clin. One, 7/8, 1980, 5 cc. 1027-1038 (указано, что у одного подвергавшегося лечению меченым с
131
помощью IIF-5 пациента был достигнут "частичный ответ"); Goldenberg D.M.
и др., Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with
Iodine-131 -Labelled LL2 Monoclonal Antibody, J. Clin. One, 9/4, 199К 548-564
(указано, что у трех из восьми пациентов, которым делали несколько инъекций,
10 развился НАМА-ответ); Appelbaum F.R., Radiolabelled Monoclonal Antibodies in
the treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Hem./One. Clinics of N.A., 5/5, 1991,
cc. 1013-1025 (обзорная статья); Press O.W. и др., Radiolabelled-Antibody Therapy
of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support, New England J. Med.,
329/17, 1993, cc. 1219-12223 (меченные с помощью йода-131 антитела IF5 и В1 к
1 з 1
15 CD20); Kaminski M.G. и др., Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with I Anti-Bl (Anti-CG20) Antibody, New England J. Med., 329/7, 1993 (меченное с помощью йода-131 антитело В1 к CD20; ниже цитируется как "Kaminski"). Имеются данные о том, что осуществляли также конъюгацию токсинов (т.е. химиотерапевтических агентов, таких как доксорубицин или митомицин С) с
20 антителами (см., например опубликованную заявку РСТ WO 92/07466 (опубликованную 14 мая 1992)).
В качестве альтернативы "конъюгированным" антителам были разработаны химерные антитела, содержащие фрагменты антител из двух или большего количества различных видов (например, из организма мыши и человека).
25 Например, у Lie A.Y. и др., Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal
Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity, J. Immunol., 139/10, 1987, cc. 3521-3526, описано химерное мышиное/человеческое антитело к антигену CD20 (см. также публикацию РСТ WO 88/04936). Для лечения неходжкинской лимфомы был разрешен, например ритуксимаб (RITUXAN(r)),
30 представляющий собой химерное антитело к CD20.
Поскольку при В-клеточных лимфомах происходит экспрессия CD20, то этот антиген может служить в качестве "мишени для распознавания" таких лимфом. По существу процесс "распознавания мишени" можно обобщить
следующим образом: антитела, специфические в отношении поверхностного антигена CD20 на В-клетках, вводят пациенту. Эти антитела к CD20 специфически связываются с антигеном CD20 (очевидно) как на здоровых, так и на злокачественных В-клетках, и антитело к CD20, связанное с поверхностным 5 антигеном CD20, может приводить к разрушению и истощению онкогенных В-клеток. Кроме того, с антителом к CD20 можно непосредственно или косвенным образом связывать химические агенты, цитотоксины или радиоактивные агенты, так что осуществляется избирательный "перенос" агента к В-клеткам, экспрессирующим антиген CD20. В обоих указанных подходах основной целью
10 является разрушение опухоли. Конкретный подход может определяться выбором конкретного применяемого антитела к CD20. Таким образом, очевидно, что пригодные подходы для распознавания в качестве мишени антигена CD20 могут широко варьироваться.
Антитело ритуксимаб (RITUXAN(r)) представляет собой созданное с
15 помощью генной инженерии химерное моноклональное антитело к
человеческому антигену CD20, содержащее человеческую гамма 1-типа и мышиную константную область. Это химерное антитело содержит человеческие константные области гамма 1-типа и в патенте US 5736137 (на имя Andersen и др.), выданном 17 апреля 1998 г., переуступленном IDEC Pharmaceuticals
20 Corporation, обозначено как "С2В8". RITUXAN(r) разрешен для применения при лечении пациентов с СО20-позитивной В-клеточной рецидивной или рефрактерной низкозлокачественной или фолликулярной неходжкинской лимфомы. Исследования механизма действия in vitro позволили установить, что RITUXAN(r) обладает человеческой комплементзависимой цитотоксичностью
25 (CDC) (Reff и др., Blood, 83(2), 1994, сс. 435-445). Кроме того, было
установлено, что он обладает выраженной активностью в анализах по оценке антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC). Было установлено, что RITUXAN(r) обладает антипролиферативной активностью в анализах с использованием включения тимидина и ограниченной способностью
30 непосредственно индуцировать апоптоз, в то время как антитела к CD20 не обладают такими свойствами (Maloney и др., Blood, 88(10), 1996, 637а) Гликозилирование антител
Компонент, представляющий собой олигосахарид, может оказывать существенное влияние на свойства, касающиеся эффективности гликопротеина, включая физическую стабильность, устойчивость к воздействию протеаз, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетические характеристики и 5 специфическую биологическую активность. Такие свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия олигосахаридов, но также и от их конкретных структур. Можно сделать некоторые общие выводы о связи структуры олигосахаридов и функцией гликопротеина. Например, некоторые олигосахаридные структуры опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из
10 кровотока в результате взаимодействий со специфическими связывающими углеводы белками, в то время как другие могут быть связаны с антителами и стимулировать нежелательные иммунные ответы (Jenkins и др., Nature Biotechnol., 14, 1996, сс. 975-981).
Клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для
15 производства имеющих терапевтическое значение гликопротеинов благодаря их способности гликозилировать белки с получением формы, наиболее совместимой с организмом человека (Cumming и др., Glycobiology, 1,1991, сс. 115-130; Jenkins и др., Nature Biotechnol., 14, 1996, сс. 975-981). Бактерии очень редко гликозилируют белки и подобно другим типам обычно применяемых
20 хозяев, таких как дрожжи, гифомицеты, клетки насекомых и растений, создают схемы гликозилирования, приводящие к быстрому клиренсу из кровотока, нежелательным иммунным взаимодействиям и в некоторых конкретных случаях к пониженной биологической активности. Среди клеток млекопитающих в последние двадцать лет наиболее часто используют клетки яичника китайского
25 хомячка (СНО). Помимо пригодной схемы гликозилирования эти клетки
позволяют постоянно получать генетически стабильные высокопродуктивные клоны клеточных линий. Их можно культивировать до достижения высоких плотностей в простых биореакторах с использованием бессывороточных сред и их использование позволяет разрабатывать безопасные и воспроизводимые
30 биологические процессы. К другим обычно применяемым клеткам животных относятся клетки почки детеныша хомячка (ВНК), клетки мышиной миеломы линий NS0 и SP2/0. В последние годы изучали методы производства с
использованием трансгенных животных (Jenkins и др., Nature Biotechnol., 14,
1996, сс. 975-981).
Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях в константных областях тяжелых цепей, причем каждый изотип 5 несет различный набор N-связанных углеводных структур, которые различным образом влияют на сборку белка, его секрецию или функциональную активность (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechn., 15, 1997, сс. 26-32). Структура присоединенных N-связанных углеводов в значительной степени варьируется в зависимости от уровня процессинга и может включать имеющие высокое 10 содержание маннозы, многократно разветвленные, а также биантенные
комплексные олигосахариды (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechn., 15,
1997, сс. 26-32). Как правило, имеет место гетерогенный процессинг коровых олигосахаридных структур, присоединенных в конкретном сайте гликозилирования, в результате чего даже моноклональные антитела обладают
15 множеством гликоформ. Аналогично этому было установлено, что основные
различия в гликозилировании антител имеют место между клеточными линиями и даже для данной клеточной линии, выращенной в различных условиях культивирования, можно обнаружить небольшие различия (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5(8), 1995, сс. 813-822).
20 Одним из путей достижения значительного повышения эффективности при
сохранении простого процесса производства и возможности избежать значительных нежелательных побочных действий является усиление природных опосредуемых клеткой эффекторных функций моноклональных антител путем конструирования олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у
25 Umana Р. и др., Nature Biotechnol., 17, 1999, сс. 176-180 и в патенте US 6602684, полное содержание которых включены в настоящее описание в качестве ссылки. Антитела IgG 1-типа, представляющие собой антитела, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования в положении
30 Asn297 в каждом СН2-домене. Два комплексных биантенных олигосахарида, которые присоединены к Asn297, размещаются между СН2-доменами, образуя обширные контакты с каркасом полипептида и их наличие является существенным для способности антитела опосредовать эффекторные функции,
такие как антителозависимая клеточно-обусловленная цитотоксичность (ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 1995, сс. 813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 1998, сс. 59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 1997, сс. 26-32).
5 Ранее авторы настоящего изобретения установили, что сверхэкспрессия в
клетках яичника китайского хомячка (СНО) P(l,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III ("GnTIII"), гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает ADCC-активность in vitro антинейробластомного химерного
10 моноклонального антитела (chCE7), продуцируемого сконструированными клетками СНО (Umafia Р. и др., Nature Biotechnol., 17, 1999, сс. 176-180; и публикацию международной заявки на патент WO 99/54342, полные содержания которых включены в настоящее описание в качестве ссылки). Антитело chCE7 относится к большому классу неконъюгированных МАт, которые обладают
15 высокой аффинностью и специфичностью в отношении опухоли, но имеют слишком малую эффективность для клинического применения при их продуцировании в стандартных клеточных линиях, в которых отсутствует фермент GnTIII (Umana Р. и др., Nature Biotechnol., 17, 1999, сс. 176-180). Это исследование было первым, в котором установлено, что существенные
20 повышения ADCC-активности могут быть достигнуты путем конструирования
продуцирующих антитело клеток, экспрессирующих GnTIII, что приводит также к увеличению содержания связанных с константной областью (Fc) бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные нефукозилированные олигосахариды, превышающему уровни, присутствующие во встречающихся в
25 естественных условиях антителах.
Таким образом, сохраняется необходимость разработки улучшенных терапевтических подходов к использованию в качестве мишени для распознавания антигена CD20 для лечения В-клеточных лимфом у приматов, включая человека (но не ограничиваясь им).
30 Краткое изложение сущности изобретения
Принимая во внимание чрезвычайно большой терапевтический потенциал антигенсвязывающих молекул (АСМ), которые обладают специфичностью связывания, присущей мышиному антителу B-Lyl, и у которых с помощью
генной инженерии сконструирована схема гликозилирования с целью повышения аффинности к связыванию с Fc-рецептором и повышения эффекторной функции, при создании настоящего изобретения был разработан способ получения таких АСМ. Этот способ среди прочего позволяет получать 5 рекомбинантные химерные антитела или их химерные фрагменты.
Эффективность этих АСМ дополнительно повышают путем конструирования профиля гликозилирования Fc-области антитела. Таким образом, данное изобретение относится к гуманизированному, подвергнутому гликоинжинерингу антителу типа II к CD20, обладающему, в
10 результате этого гликоинжинеринга, повышенной ADCC, и обладающему
повышенной способностью индуцировать апоптоз клеток мишени в результате указанной гуманизации, где это антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, включающую область, определяющую комплементарность (CDRs) B-Lyl антитела мыши, где
15 (a) CDR1 тяжелой цепи является SEQ ID N0:16;
(b) CDR2 тяжелой цепи является SEQ ID N0:26; и
(c) CDR3 тяжелой цепи является SEQ ID N0:28;
причем области рамки считывания (FRs) FR1, FR2 и FR3 вариабельных областей тяжелой цепи указанного антитела являются FR последовательностями человека, 20 которые кодируются последовательностью VH110 зародышевой линии человека, а вариабельная область FR4 тяжелой цепи указанного антитела кодируется последовательностью JH4 зародышевой линии человека и
(d) CDR1 легкой цепи является SEQ ID N0:18;
(e) CDR2 легкой цепи является SEQ ID N0:19; и 25 (f) CDR3 легкой цепи является SEQ ID N0:20;
причем FR1, FR2 и FR3 вариабельных областей легкой цепи указанного антитела являются FR последовательностями человека, которые кодируются последовательностью VK 2 40 зародышевой линии человека, а вариабельная область FR4 легкой цепи указанного антитела кодируется последовательностью 30 JK4 зародышевой линии человека.
Причем в предпочтительном варианте осуществления данного изобретения указанное антитело включает Fc область человека, которая была подвергнута
гликоинжинерингу для снижения количества остатков фукозы в N-связанном олигосахариде указанной Fc области.
Кроме того, объектом данного изобретения является также гуманизированное антитело типа II к CD20, включающее 5 (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую B-Lyl CDR1 тяжелой цепи SEQ ID N0:16; B-Lyl CDR2 тяжелой цепи SEQ ID N0:26 или SEQ ID N0:27 и B-Lyl CDR3 тяжелой цепи SEQ ID N0:28; области рамки считывания (FRs) FR1, FR2 и FR3, которые кодируются последовательностью VH110 зародышевой линии человека и FR4 тяжелой цепи, которая кодируется
10 последовательностью JH4 зародышевой линии человека и
(П) вариабельную область легкой цепи, включающую B-Lyl CDR1, CDR2, CDR3 легкой цепи, представленные в SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19 и SEQ ID N0:20 соответственно; FR1, FR2 и FR3 легкой цепи, которые кодируются последовательностью VH2 40 зародышевой линии человека и FR4 легкой цепи,
15 которая кодируется последовательностью JK4 зародышевой линии, человека, где
где указанное антитело индуцирует высокие уровни апоптоза при инкубации с СО20-позитивными клетками человека по сравнению с контролем в идентичных условиях с использованием С2В8 химерного IgGl антитела с
20 последовательностью идентичной ритуксимабу.
Другим объектом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая описанные выше антитела и фармацевтически приемлемый носитель, а также способ получения этих антител, который включает
а) культивирование клетки-хозяина, включающей по меньшей мере один
25 полинуклеотид, кодирующий это антитело, в условиях позволяющих экспрессию указанного антитела;
б) выделение антитела.
Описанные в заявке антитела также пригодны для уничтожения CD20-экспрессирующих клеток лимфомы, причем этот способ включает введение в эти 30 клетки антитела или фармацевтической композиции в количестве достаточном для уничтожения указанных СО20-экспрессирющих клеток лимфомы, и для ингибирования роста клеток опухоли человека, путем введения в указанные
клетки антитела или фармацевтической композиции в количестве достаточном для ингибирования роста указанных клеток опухоли человека.
Краткое описание чертежей
5 На чертежах показано:
на фиг. 1 - нуклеотидная (SEQ ID N0:3) и аминокислотная (SEQ ID N0:1) последовательности Ун-области мышиного B-Lyl;
на фиг.2 - нуклеотидная (SEQ ID NO:4) и аминокислотная (SEQ ID N0:2)
последовательности VL-области мышиного B-Lyl;
10 на фиг. 3 - связывание Rituximab(r) (О) и ch-B_Lyl (Д) с CD20 на клетках В-
лимфомы линии Raji;
на фиг. 4 - В-клеточное истощение, вызываемое Rituximab(r) (О) и ch-B_Lyl (А) в цельной крови трех различных классов генотипа FcyRIIIa-158V/F: (А) цельная кровь, полученная от F/F-донора, гомозиготная по рецептору с низкой 15 аффинностью; (Б) цельная кровь, полученная от F/V-донора, гетерозиготная по обладающему аффинностью рецептору; (В) цельная кровь, полученная от V/V-донора, гомозиготная по рецептору с высокой аффинностью;
на фиг.5 - нуклеотидная (SEQ ID N0:11) и аминокислотная (SEQ ID N0:13)
последовательности тяжелой цепи химерного антитела к CD20;
20 на фиг.6 - нуклеотидная (SEQ ID N0:12) и аминокислотная (SEQ ID N0:14)
последовательности легкой цепи химерного антитела к CD20;
на фиг.7 - нуклеотидная и аминокислотная последовательности CDR
мышиного антитела B-Lyl; (А) - предсказанные CDR Ун-области, (Б) -
предсказанные CDR VL-области;
25 на фиг. 8 - MALDI-TOF-профиль химерного антитела B-Lyl, имеющего
сконструированную схему гликозилирования; (А) - таблица, в которой представлены процентные содержания специфических пиков; (Б) - спектр химерного B-Lyl, имеющего сконструированную схему гликозилирования; (В) -спектр химерного B-Lyl, имеющего сконструированную схему 30 гликозилирования, после обработки Endo-H;
на фиг. 9 - данные о связывании различных гуманизированных антител к CD20 с В-клетками линии Raji. Различия между конструкцией В-НН2 и конструкциями B-HL8 и B-HL11 сосредоточены в каркасных участках 1 и 2,
причем все три CDR являются идентичными. B-HL8 и B-HL11 имеют последовательности FR1 и FR2, выведенные из человеческой вариабельной области тяжелой цепи VH3, в то время как полный каркасный участок В-НН2 выведен из человеческой VH1. B-HL11 представляет собой производное B-HL8, 5 имеющее одну мутацию GlulGln, где Gin представляет собой аминокислотный остаток в конструкции В-НН2. Это означает, что замена GlulGln не изменяет аффинность или интенсивность к связыванию. В-НН2 и B-HL8 различаются также 14 остатками FR, из которых один или несколько могут оказывать влияние на антигенсвязывающую способность рассматриваемого антитела;
10 на фиг. 10 - данные о связывании гуманизированного антитела к CD20
BHL4-KV1 с клетками-мишенями линии Raji. Конструкция BHL4 получена из антитела В-НН2 путем замены FR1 В-НН2 соответствующим участком последовательности VH145 человеческой зародышевой линии. Эта конструкция характеризуется существенно более низкой антигенсвязывающей способностью
15 несмотря на то, что она имеет отличные от исходной последовательности аминокислоты только в трех положениях в FR1. Эти остатки находятся в положениях 2, 14 и 30 (согласно нумерации Кэбота). Среди них наиболее сильное влияние, по-видимому, оказывает положение 30, поскольку оно является частью CDR1 согласно определению Хотиа (Chotia);
20 на фиг. 11 - сравнительные данные о связывающей способности В-НН1, В-
НН2, В-ННЗ и родительского антитела B-Lyl. Из представленных данных видно, что все Ат характеризуются близкими значениями ЕС50, но конструкция В-НН1 связывается с более низкой интенсивностью/стехиометрией, чем варианты В-НН2 и В-ННЗ. В-НН1 отличается от В-НН2 и В-ННЗ своими частично
25 человеческими участками CDR1 и CDR2 (согласно определению Кэбота), а
также полиморфизмом Ala/Thr в положении 28 (согласно нумерации Кэбота). Это указывает на то, что положение 28, полный CDR1 и/или полный CDR2 важны для взаимодействия антитело/антиген;
на фиг. 12 - сравнительные данные для B-HL1, В-НН1 и родительского
30 антитела B-Lyl. Данные свидетельствуют о том, что конструкция B-HL1 совсем не обладает связывающей активностью, а связывающая
интенсивность/стехиометрия В-НН1 примерно в два раза меньше, чем B-Lyl. Как B-HL1, так и В-НН1 сконструированы на основе акцепторных каркасов,
выведенных из вариабельных областей человеческой тяжелой цепи VH1-класса.
Среди других различий наиболее значительным является различие в положении
71 (согласно нумерации Кэбота) конструкции B-HL1, что свидетельствует о его
возможном важном значении для связывания с антигеном;
5 на фиг. 13 - флуороцитометрический анализ антигенсвязывающей
способности антитела к CD20. Данные свидетельствуют о том, что конструкции B-HL2 и B-HL3 не обладают CD-20-связывающей активностью;
на фиг. 14 - данные об апоптозе моноклональных клеток (MCL) линии Z-138, индуцируемом антителом к CD20;
10 на фиг. 15 - данные об апоптозе, индуцируемом антителом к CD20. Детали
анализа: высевали 5 х 105 клеток/лунку в 24-луночные планшеты (5 х 105 клеток/мл) в культуральную среду. В лунки добавляли 10 мг соответствующего Ат, ЗФР в качестве негативного контроля или 5мМ камптотецин (СРТ) в качестве позитивного контроля. Образцы инкубировали в течение ночи (16 ч),
15 окрашивали с помощью AnnV-ФИТЦ и анализировали с помощью FACS. Анализ осуществляли в 3-х повторностях. (*): вычитали сигнал, соответствующий только ЗФР (применение только ЗФР приводило к появлению 8% и 2% AnnV+ для PR-1- и Z-138-клеток соответственно). Использовали следующие антитела: С2В8 (химерное, не имеющее сконструированную схему гликозилирования;
20 BHH2-KV1 (гуманизированное, не имеющее сконструированную схему
гликозилирования). Примечание: в этом анализе не применяли какие-либо дополнительные эффекторные клетки, а только клетки-мишени плюс антитело или контроли;
на фиг. 16 -данные об уничтожении клетки-мишени антителами к CD20 с 25 помощью иммунокомпетентных эффекторных клеток. Детали анализа: В-
клеточное "истощение" в цельной крови здоровых доноров осуществляли путем инкубации в течение ночи и анализировали в отношении CD19+/CD3+ с помощью FACS. ADCC оценивали с использованием РВМС в качестве эффекторов, инкубация в течение 4 ч, соотношение эффектора: мишени 25:1, 30 уничтожение клеток-мишеней оценивали по удерживанию кальцеина по
сравнению с лизисом с помощью детергента (100%) и с лизисом без Ат (0%). Применяемые антитела: С2В8 (химерная, не имеющая сконструированную схему гликозилирования форма); BHH2-KVl-wt (гуманизированная, не имеющая
сконструированную схему гликозилирования форма BHH2-KV1); BHH2-KV1-GE (гуманизированная, имеющая сконструированную схему гликозилирования форма антитела BHH2-KV1);
на фиг. 17 - MALDI/TOF-MC-профиль выделившихся после обработки 5 PNGa3oftF Fc-олигосахаридов (олигосахаридов из Fc-области) немодифицированного, не имеющего сконструированную схему гликозилирования гуманизированного IgGl B-lyl антитела к человеческому CD20, BHH2-KV1;
на фиг. 18 - MALDI/TOF-MC-профиль выделившихся после обработки 10 PNGa3oftF Fc-олигосахаридов имеющего сконструированную схему
гликозилирования гуманизированного IgGl B-lyl антитела к человеческому CD20, BHH2-KVlgl. Конструирование схемы гликозилирования осуществляли путем совместной экспрессии в клетках-хозяевах генов антител и гена, кодирующего фермент с каталитической активностью P-l,4-N-15 ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnT-III);
на фиг. 19 - MALDI/TOF-MC-профиль выделившихся после обработки PNGa3oftF Fc-олигосахаридов имеющего сконструированную схему гликозилирования гуманизированного IgGl B-lyl антитела к человеческому CD20, BHH2-KVlg2. Конструирование схемы гликозилирования осуществляли 20 путем совместной экспрессии в клетках-хозяевах генов антител и генов, кодирующих фермент с каталитической активностью P-1,4-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnT-III) и кодирующих фермент с каталитической активностью а-маннозидазы II комплекса Гольджи;
на фиг. 20 - данные о связывании не имеющих сконструированную схему 25 гликозилирования и имеющих сконструированную схему гликозилирования антител к человеческому FcyIIIa-рецептору, находящемуся на поверхности рекомбинантных СНО-С016-клеток;
на фиг. 21- данные об апоптозе не имеющих сконструированную Fc-область и имеющих сконструированную Fc-область антител к CD20 на моноклональных 30 клетках линии Z-138. Детали анализа: высевали 5 * 105 клеток/лунку в 24-луночные планшеты (5 х 105 клеток/мл) в культуральной среде. В лунки добавляли 10 мг соответствующего Ат, ЗФР в качестве негативного контроля. Образцы инкубировали в течение ночи (16 ч), окрашивали с помощью AnnV-
ФИТЦ и анализировали с помощью FACS. Анализ осуществляли в 3 повторностях. Применяемые Ат: С2В8 = ритуксимаб (химерная не имеющая сконструированную схему гликозилирования форма, аналогичная поступающей в продажу форме; BHH2-KV1 (гуманизированное не имеющее 5 сконструированную схему гликозилирования (см. на фиг. 6 профиль гликозилирования); BHH2-KVlgl (гуманизированное имеющее сконструированную схему гликозилирования (см. на фиг. 7 профиль гликозилирования); BHH2-KVlg2 (гуманизированное не имеющее сконструированную схему гликозилирования (см. на фиг. 8 профиль 10 гликозилирования). Примечание: в этом анализе не применяли какие-либо
дополнительные эффекторные клетки, а только клетки-мишени плюс антитело или контроли. (*): Вычитали сигнал, соответствующий только ЗФР. Подробное описание изобретения
Понятия, применяемые в контексте настоящего описания, соответствуют 15 общепринятым в данной области, если не указано иное.
В контексте настоящего описания понятие "антитело" относится к полным молекулам антител, включая моноклональные, поликлональные и мультиспецифические (например биспецифические) антитела, а также фрагменты антител, которые имеют Fc-область и сохраняют специфичность 20 связывания, и к слитым белкам, которые включают область, эквивалентную Fc-области иммуноглобулина и которые сохраняют специфичность связывания. Под понятие подпадают гуманизированные, приматизированные и химерные антитела.
В контексте настоящего описания понятие "Fc-область" относится к С-25 концевой области тяжелой цепи IgG. Хотя примыкающие к Fc-области участки тяжелой цепи IgG могут слегка различаться, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG, как правило, представляет собой участок цепи от аминокислоты Cys226 до карбоксильного конца.
В контексте настоящего описания понятие "область, эквивалентная Fc-30 области иммуноглобулина" относится к встречающимся в естественных условиях аллельным вариантам Fc-области иммуноглобулина, а также вариантам, имеющим изменения, которые получают в результате замен, добавлений или делеций, но которые не снижают в значительной степени
способность иммуноглобулина опосредовать эффекторные функции (такие как антителозависимая клеточно-обусловленная цитотоксичность). Например, одну или несколько аминокислот можно изымать путем делеции из N-конца или С-конца Fc-области иммуноглобулина без существенного снижения биологической 5 функции. Такие варианты можно отбирать согласно общим правилам, которые известны в данной области, так, чтобы оказывать минимальное воздействие на активность (см., например, Bowie J. U. и др., Science 247, 1990, сс. 1306-1310).
В контексте настоящего описания понятие "антигенсвязывающая молекула" в наиболее широком смысле относится к молекуле, которая
10 специфически связывает антигенную детерминанту. Более конкретно понятие
"антигенсвязывающая молекула, которая связывает CD20" обозначает молекулу, которая специфически связывается с находящемся на клеточной поверхности негликозилированным фосфопротеином с молекулярной массой 35000 Да, который обычно называют консервативным дифференцировочным антигеном
15 человеческих В-лимфоцитов Вр35, который, как правило, называют CD20. Понятие "специфически связывается" означает, что связывание является избирательным в отношении антигена и его можно отличать от нежелательных или неспецифических взаимодействий.
В контексте настоящего описания понятия "слитый" и "химерный"
20 касательно полипептидов, таких как АСМ относится к полипептидам, которые содержат аминокислотные последовательности, выведенные из двух или большего количества гетерологичных полипептидов, таких как фрагменты антител из различных видов. Для химерных АСМ, например, несвязывающие антиген компоненты можно получать из широкого разнообразия видов, включая
25 приматов, таких как шимпанзе и люди. Константная область химерной АСМ наиболее предпочтительно является практически идентичной константной области встречающего в естественных условиях человеческого антитела; вариабельная область химерного антитела наиболее предпочтительно практически идентична вариабельной области рекомбинантного антитела к CD-
30 20, которое имеет аминокислотную последовательность вариабельной области мышиного антитела B-Lyl. Гуманизированные антитела являются наиболее предпочтительной формой слитого или химерного антитела.
В контексте настоящего описания понятие "полипептид, обладающий "GnTIII-активностью" относится к полипептидам, которые обладают способностью катализировать добавление остатка N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) в P-l-4-связи к Р-связанному маннозиду триманнозильного ядра N-5 связанных олигосахаридов. Понятие относится к слитым полипептидам, которые обладают ферментативной активностью подобной, но не обязательно идентичной, активности Р(1,4)-№-ацетилглюкозаминилтрансферазы III, также известной под названием р-1,4-маннозил-гликопротеин-4-бета-Ы-ацетилглюкозаминилтрансфераза (КФ 2.4.1.144) согласно номенклатуре
10 Комитета Международного союза по биохимии и молекулярной биологии
(Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)), при оценке с помощью конкретного биологического анализа как в случае зависимости от дозы, так и без зависимости от дозы. В случае, когда существует зависимость от дозы, фермент не обязательно должен быть
15 идентичен GnTIII, а скорее должен быть практически подобен в отношении
зависимости данной активности от дозы по сравнению с GnTIII (т.е. полипептид-"кандидат" должен обладать более высокой активностью или не более чем при мерно в 25 раз пониженной активностью, предпочтительно не более чем примерно в 10 раз пониженной активностью, и еще более предпочтительно не
20 более чем примерно в 3 раза пониженной активностью по сравнению с GnTIII.) В контексте настоящего описания понятие "вариант" (или "аналог") относится к полипептиду, который отличается от конкретного указанного полипептида, предлагаемого в изобретении, наличием аминокислотных инсерций, делеций и замен, созданных например, с помощью метода
25 рекомбинантной ДНК. Варианты АСМ, предлагаемые в настоящем изобретении, включают химерные, приматизированные или гуманизированные антигенсвязывающие молекулы, в которых один или несколько аминокислотных остатков модифицированы путем замены, добавления и/или делеций таким образом, что это не оказывает существенного воздействие на аффинность
30 связывания с антигеном (например CD20). Для решения вопроса о том, какие аминокислотные остатки можно заменять, добавлять или удалять без снижения представляющих интерес видов активности, можно осуществлять сравнение последовательности конкретного полипептида с последовательностью
гомологичных пептидов, и минимизируя количество замен в аминокислотной последовательности в областях высокой гомологии (консервативные области), или путем замены аминокислот консенсусной последовательностью.
В другом случае рекомбинантные варианты, кодирующие эти же или 5 подобные полипептиды, можно синтезировать или отбирать на основе
"избыточности" генетического кода. Различные замены кодонов, такие как "молчащие" замены, которые приводят к получению различных сайтов рестрикции, можно интродуцировать с целью оптимизации клонирования в плазмидном или вирусном векторе или экспрессии в конкретной
10 прокариотической или эукариотической системе. Мутации в полинуклеотидной последовательности могут проявляться в полипептиде или доменах других пептидов, добавленных к полипептиду для модификации свойств любого фрагмента полипептида с целью изменения характеристик, таких как аффинность к связыванию лиганда, внутрицепочечная аффинность или скорость
15 расщепления/обновления.
Предпочтительно аминокислотные "замены" являются результатом замены одной аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет сходные структурные и/или химические свойства, т.е. консервативные аминокислотные замены. "Консервативные" аминокислотные замены можно создавать на основе
20 сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы участвующих в этом остатков. Например, к неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; к полярным нейтральным аминокислотам относятся глицин, серии, треонин, цистеин,
25 тирозин, аспарагин и глутамин; к положительно заряженным (основным) аминокислотам относятся аргинин, лизин и гистидин; и к отрицательно заряженным (кислотным) аминокислотам относятся аспарагинованя кислота и глутаминовая кислота. "Инсерции" или "делеций" предпочтительно затрагивают примерно 1-20 аминокислот, более предпочтительно 1-10 аминокислот.
30 Приемлемую вариацию можно определять экспериментально, создавая
систематически инсерции, делеций или замены аминокислот в полипептидной молекуле с помощью методов рекомбинантной ДНК и анализируя активность полученных рекомбинантных вариантов.
В контексте настоящего описания понятие "гуманизированный" относится к антигенсвязывающей молекуле, полученной из антигенсвязывающей молекулы из организма кроме человека, например, к мышиному антителу, которая сохраняет или практически сохраняет антигенсвязывающие свойства 5 родительской молекулы, но которая является менее иммуногенной для людей. Это можно достигать с различных методов, которые включают (а) трансплантацию полных нечеловеческих вариабельных областей в человеческие константные области с получением химерных антител, (б) трансплантацию нечеловеческих CDR в человеческие каркасные и константные области с
10 сохранением имеющих решающее значение остатков каркасного участка
(например остатков, важных для сохранения хорошей аффинности к связыванию антигена или функций антитела) или без их сохранения, или (в) трансплантацию полных нечеловеческих вариабельных областей, но с их "маскировкой" участком, напоминающим человеческий, путем замены находящихся на
15 поверхности остатков. Такие методы описаны у Jones и др., Morrison и др., Ргос. Natl. Acad. Sci., 81, 1984, сс. 6851-6855; Morrison и Oi, Adv. Immunol., 44, 1988, cc. 65-92; Verhoeyen и др., Science, 239, 1988, cc. 1534-1536; Padlan, Molec. Immun., 28, 1991, cc. 489-498; Padlan, Molec. Immun., 31(3), 1994, cc. 169-217, все указанные публикации полностью включены в настоящее описание в качестве
20 ссылки. В каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела присутствует 3 гипервариабельных участка или CDR (CDR1, CDR2 и CDR3), которые фланкированы четырьмя каркасными подобластями (участками) (т.е., FR1, FR2, FR3 и FR4) в каждой из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи антитела: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Обсуждение
25 гуманизированных антител представлено среди прочего в U.S. 6632927, и в опубликованной заявке на патент США №. 2003/0175269, оба документа полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Аналогично этому, в контексте настоящего описания понятие "приматизированный" относится к антигенсвязывающей молекуле, полученной
30 из антигенсвязывающей молекулы организма кроме примата, например, мышиному антителу, которая сохраняет или практически сохраняет антигенсвязывающие свойства родительской молекулы, но которая является менее иммуногенной для приматов.
В случае, когда в данной области применяют и/или являются приемлемыми два или более определений понятия, то в контексте настоящего описания подразумевается, что применяемое определение включает все такие значения, если специально не указано иное. Конкретным примером является применение 5 понятия "гипервариабельный участок" ("CDR") для описания не
соприкасающихся антигенсвязывающих центров, присутствующих в полипептидах вариабельной области как тяжелой, так и легкой цепи. Этот конкретный участок описан у Kabat и др., "Sequences Proteins of Immunological Interest", изд-во U.S. Dept. of Health and Human Services, (1983) и Chothia и др., J.
10 Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917, публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки, причем, эти определения относятся к перекрывающимся аминокислотным остаткам или поднаборам аминокислотных остатков, при их сравнении друг с другом. Однако в контексте настоящего описания подразумевается возможность применения любого определения к CDR антитела
15 или его вариантов. Соответствующие аминокислотные остатки, из которых
состоят CDR, как они определены в каждой из процитированных выше ссылок, представлены в сравнении ниже в таблице I. Точные номера остатков, которые образуют конкретный CDR, должны варьироваться в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области легко могут
20 определить, какие остатки входят в конкретный CDR, на основе данных о аминокислотной последовательности вариабельной области антитела.
Нумерация всех входящих в CDR остатков в таблице 1 дана в соответствии 25 с нумерацией, предложенной Кэботом и др. (см. ниже).
Кэбот и др. предложили также систему нумерации последовательностей вариабельных областей, которую можно применять для любого антитела.
Обычный специалист в данной области может однозначно применять эту систему "нумерации по Кэботу" для последовательности любой вариабельной области, не имея никаких экспериментальных данных, кроме сведений о самой последовательности. В контексте настоящего описания понятие "нумерация по 5 Кэботу" относится к системе нумерации, описанной у Kabat и др., "Sequence of Proteins of Immunological Interest)), изд-во U.S. Dept. of Health and Human Services, 1983. Если не указано иное, то ссылки на нумерацию положений конкретных аминокислотных остатков в АСМ даны в соответствии с системой нумерации по Кэботу. Нумерация в последовательностях, представленных в
10 перечне последовательностей (т.е. SEQ ID NO:l-SEQ ID N0:78) не соответствует системе нумерации по Кэботу.
В контексте настоящего описания понятие "нуклеиновая кислота или полинуклеотид, имеющие нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% "идентичную" нуклеотидной последовательности,
15 предлагаемой в настоящем изобретении, с которой проводят сравнение
(референс-последовательность)" означает, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать до пяти точковых мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-
20 последовательности. Другими словами для получения полинуклеотида,
имеющего нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% нуклеотидной референс-последовательности, можно изымать путем делеций или заменять другими нуклеотидами вплоть до 5% нуклеотидов референс-последовательности или вплоть до 5% от общего количества нуклеотидов в
25 референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эталонная последовательность может представлять собой полную последовательность, представленную на фиг. 24 или фиг. 25.
С практической точки зрения определять являются ли любая конкретная молекула нуклеиновой кислоты или полипептид по меньшей мере на 80%, 85%,
30 90%, 95%), 96%, 97%, 98% или 99% идентичными нуклеотидной
последовательности или полипептидной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, можно с помощью известных широко используемых компьютерных программ. В качестве предпочтительного метода для
определения наилучшего общего совпадения эталонной последовательности (последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении) и анализируемой последовательности, который также обозначают как метод глобального сравнительного анализа последовательности, можно использовать 5 компьютерную программу FASTDB, основанную на алгоритме Brutlag и др., Сотр. Арр. Biosci. 6, 1990, сс. 237-245. При сравнительном анализе последовательностей как эталонная, так и анализируемая последовательности обе представляют собой последовательности ДНК. Последовательности РНК можно сравнивать путем замены остатков U на Т. Результатом указанного
10 глобального сравнительного анализа последовательностей является процент идентичности. Предпочтительными параметрами для расчета процента идентичности, используемыми в программе FASTDB сравнительного анализа последовательностей ДНК являются: матрица=унитарная, k-запись в базе данных=4, штраф за несовпадение^, штраф за присоединение =30, длина
15 рандомизированной группы =0, балл за срезание=1, штраф за брешь=5, штраф за размер бреши 0,05, размер окна=500 или длина анализируемой нуклеотидной последовательности, если она короче.
Если анализируемая последовательность короче эталонной последовательности вследствие наличия делеций на 5'- или 3'-конце, но не
20 вследствие внутренних делеций, то результаты можно скорректировать вручную. Это обусловлено тем, что программа FASTDB не учитывает укорочения на 5'- и З'-конце анализируемой последовательности при расчете процента идентичности. Для анализируемых последовательностей, укороченных на 5'- или З'-концах по отношению к эталонной последовательности процент идентичности
25 корректируют путем вычисления количества оснований эталонной
последовательности, расположенных за 5'- и З'-концами анализируемой последовательности, которые не совпали/не проанализированы, в виде процента от общего количества оснований эталонной последовательности. Совпадают ли/проанализированы ли нуклеотиды, определяется результатами
30 сравнительного анализа последовательностей с помощью программы FASTDB. Затем этот процент вычитают из процента идентичности, рассчитанного с помощью указанной выше программы FASTDB с использованием указанных заданных параметров, в результате чего получают окончательную оценку
процента идентичности. Эту скорректированную оценку используют для целей настоящего изобретения. Для целей ручной коррекции оценки процента идентичности рассчитывают только основания, расположенные за 5'- и 3'-концами анализируемой последовательности, выявленные с помощью 5 сравнительного анализа с использованием программы FASTDB, которые не совпадали/не проанализированы с эталонной последовательностью.
Например, для определения процента идентичности анализируемую последовательность длиной 90 оснований сравнивают с эталонной последовательностью длиной 100 оснований. На 5'-конце анализируемой
10 последовательности имеются делеций и поэтому сравнительный анализ с
помощью FASTDB не позволяет устанавливать совпадения/анализировать 10 первых оснований на 5'-конце. 10 неспаренных оснований представляют собой 10% последовательности (количество несовпавших оснований на 5'- и 3'-концах/общее количество оснований в эталонной последовательности), таким
15 образом, 10% вычитают из оценки процента идентичности, рассчитанного с помощью программы FASTDB. Если остальные 90 оснований идеально совпадают, то окончательный процент идентичности составляет 90%. В другом примере анализируемую последовательность длиной 90 оснований сравнивают с эталонной последовательностью длиной 100 оснований. В данном случае
20 делеций представляют собой внутренние делеций, так что на 5'- или З'-конце анализируемой последовательности не имеется оснований, которые не совпадали/не проанализированы с эталоном. В этом случае процент идентичности, рассчитанный с помощью программы FASTDB, не корректируют вручную. Еще раз следует подчеркнуть, что вручную осуществляют коррекцию
25 только для оснований, которые не совпали/не проанализированы на 5'- и 3'-
концах анализируемой последовательности. Для целей настоящего изобретения не проводят никаких других коррекций.
Подразумевается, что у полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% "идентичную"
30 эталонной аминокислотной последовательности, предлагаемой в настоящем изобретении, аминокислотная последовательность идентична эталонной последовательности за исключением того, что анализируемая последовательность полипептида может иметь вплоть до пяти аминокислотных
изменений на каждые 100 аминокислот эталонной последовательности. Другими словами для того, чтобы получить полипептид, аминокислотная последовательность которого, по меньшей мере на 95% идентична эталонной аминокислотной последовательности, можно встраивать, изымать путем делеций 5 или заменять другой аминокислотой вплоть до 5% аминокислотных остатков анализируемой последовательности. Эти изменения по сравнению с референс-последовательностью могут иметь место в N- или С-концевых положениях эталонной аминокислотной последовательности или в любом положении между этими концами, в виде изменений, либо распределенных индивидуально между
10 остатками референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких непрерывных групп в референс-последовательности.
С практической точки зрения определять является ли любой конкретный полипептид по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным референс-полипептиду, можно с помощью известных широко
15 используемых компьютерных программ. В качестве предпочтительного метода для определения наилучшего общего совпадения эталонной последовательности (последовательность, предлагаемая в настоящем изобретении) и анализируемой последовательности, который также обозначают как метод глобального сравнительного анализа последовательности, можно использовать
20 компьютерную программу FASTDB, основанную на алгоритме Brutlag и др., Сотр. Арр. Biosci. 6, 1990, сс. 237-245. При сравнительном анализе последовательностей как эталонная, так и анализируемая последовательности либо обе представляют собой нуклеотидные последовательности, либо обе представляют собой аминокислотные последовательности. Результатом
25 указанного глобального сравнительного анализа последовательностей является процент идентичности. Предпочтительными параметрами, используемыми в программе FASTDB сравнительного анализа аминокислотных последовательностей для расчета процента идентичности являются: матрица=РАМ 0, k-запись в базе данных=2, штраф за несовпадение^, штраф за
30 присоединение =20, длина рандомизированной группы =0, балл за срезание=1, размер окна=длина последовательности, штраф за брешь=5, штраф за размер бреши 0,05, размер окна=500 или длина анализируемой аминокислотной последовательности, если она короче.
Если анализируемая последовательность короче эталонной последовательности вследствие наличия делеций на N'- или С'-конце, но не вследствие внутренних делеций, то результаты можно скорректировать вручную. Это обусловлено тем, что программа FASTDB не учитывает укорочения на N'- и 5 С'-конце при расчете процента идентичности. Для анализируемых
последовательностей, укороченных на N'- или С'-концах по отношению к эталонной последовательности процент идентичности корректируют путем вычисления количества остатков эталонной последовательности, выступающих за N'- и С'-концы анализируемой последовательности, которые не совпали/не
10 проанализированы, в виде процента от общего количества оснований эталонной последовательности. Совпадают ли остатки при сравнительном анализе, определяется результатами сравнительного анализа последовательностей с помощью программы FASTDB. Затем этот процент вычитают из процента идентичности, рассчитанного с помощью указанной выше программы FASTDB с
15 использованием указанных параметров, в результате чего получают
окончательную оценку процента идентичности. Эту скорректированную оценку используют для целей настоящего изобретения. Для целей ручной коррекции оценки процента идентичности рассчитывают только остатки, расположенные за N'- и С'-концами анализируемой последовательности, выявленные с помощью
20 сравнительного анализа с использованием программы FASTDB, которые не
совпадают при сравнительном анализе с эталонной последовательностью. Т.е. учитывают только положения эталонных остатков вне наиболее удаленных N- и С- концевых остатков анализируемой последовательности.
Например, для определения процента идентичности анализируемую
25 аминокислотную последовательность, содержащую 90 остатков, сравнивают с эталонной последовательностью, содержащей 100 остатков. На N'-конце анализируемой последовательности имеются делеций и поэтому сравнительный анализ с помощью FASTDB не позволяет устанавливать совпадения при сравнительном анализе для 10 первых остатков на N'-конце. 10 несовпавших
30 остатков представляют собой 10% последовательности (количество несовпавших остатков на N'- и С'-концах/общее количество остатков в эталонной последовательности), таким образом, 10% вычитают из оценки процента идентичности, рассчитанного с помощью программы FASTDB. Если остальные
90 остатков идеально совпадают, то окончательный процент идентичности составляет 90%. В другом примереанализимруемую последовательность, содержащую 90 остатков, сравнивают с эталонной последовательностью, содержащей 100 остатков. В данном случае делеций представляют собой 5 внутренние делеций, так что на N'- или С'-конце анализируемой
последовательности не имеется остатков, которые не совпадают при сравнительной анализе с эталоном. В этом случае процент идентичности, рассчитанный с помощью программы FASTDB, не корректируют вручную. Еще раз следует подчеркнуть, что вручную осуществляют коррекцию только для 10 несовпавших/не проанализированных остатков на N'- и С'-концах анализируемой последовательности. Для целей настоящего изобретения не проводят никаких других коррекций.
В контексте настоящего описания понятие "нуклеиновая кислота, которая "гибридизуется в строгих условиях" с нуклеотидной последовательностью,
15 предлагаемой в изобретении, относится к полинуклеотиду, который
гибридизуется при инкубации в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамида, 5> 20 лосося, с последующей отмывкой фильтров в 0,1> В контексте настоящего описания понятие "домен локализации в комплексе Гольджи" относится к аминокислотной последовательности расположенного в комплексе Гольджи полипептида, который ответствен за "заякоривание" полипептида в области внутри комплекса Гольджи. Как правило, домены
25 локализации содержат аминоконцевые "хвосты" фермента.
В контексте настоящего описания понятие "эффекторная функция" относится к видам биологической активности, присущим Fc-области (нативная последовательность Fc-области или аминокислотная последовательность варианта Fc-области) антитела. Примерами эффекторных функций антитела
30 являются (но не ограничиваясь ими) аффинность к связыванию с Fc-рецептором, антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP), секреция цитокинов, опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена
антигенпрезентирующими клетками, понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности и т.д.
В контексте настоящего описания понятие "конструкция", "сконструированный (созданный)", "конструирование (создание)" и 5 "сконструированная схема гликозилирования" относятся к любой манипуляции, которой подвергают схему гликозилирования встречающегося в естественных условиях или рекомбинантного полипептида или его фрагмента. Конструирование схемы гликозилирования включает метаболическое конструирование механизма гликозилирования клетки, в том числе генетические
10 манипуляции, касающиеся путей олигосахаридного синтеза, с целью получения измененного гликозилирования гликопротеинов, экспрессируемых в клетках. Кроме того, конструирование схемы гликозилирования включает воздействия мутаций и клеточного окружения на гликозилирование.
В контексте настоящего описания понятие "клетка-хозяин" относится к
15 любой клеточной системе, которую можно сконструировать для производства полипептидов и антигенсвязывающих молекул, предлагаемых в настоящем изобретении. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения клетку-хозяина конструируют так, чтобы с ее помощью получать антигенсвязывающую молекулу с модифицированными гликоформами. В предпочтительном варианте
20 осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело, фрагмент антитела или слитый белок. В конкретных вариантах осуществления изобретения клетки-хозяева подвергали дополнительным манипуляциям для экспрессии повышенных уровней одного или нескольких полипептидов, обладающих GnTIII-активностью. Клетки-хозяева представляют
25 собой культивируемые клетки, например, культивируемые клетки
млекопитающих, такие как СНО-клетки, ВНК-клетки, NSO-клетки, 8Р2/0-клетки, клетки миеломы линии YO, клетки мышиной миеломы линии РЗХ63, PER-клетки, РЕК.Сб-клетки или клетки гибридомы, клетки дрожжей, клетки насекомых и растительные клетки, а также клетки, находящиеся в организме
30 трансгенного животного, трансгенного растения или культивируемой растительной или животной ткани.
В контексте настоящего описания понятие "Fc-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" относится к антителозависимой клеточно
опосредованной цитотоксичности и клеточнозависимой, опосредованной растворимым слитым с Fc белком, который содержит человеческую Fc-область. Это представляет собой механизм иммунитета, приводящий к лизису "меченных антителом клеток" "человеческими иммунокомпетентными эффекторными 5 клетками", где:
Понятие ""человеческие иммунокомпетентные эффекторные клетки" означает популяцию лейкоцитов, несущих на поверхности Fc-рецепторы, с помощью которых они связываются с Fc-областью антител или слитыми с Fc белками и осуществляют эффекторные функции. Такая популяция может
10 включать (но не ограничиваясь ими) периферические мононуклеарные клетки (РВМС) и/или естественные клетки-киллеры (NK).
Понятие "меченные антителом клетки" относится к клетками, которые связаны с антителами или слитыми с Fc белками. Антитела или слитые с Fc белки связываются с клетками-мишенями посредством N-концевого по
15 отношению к Fc-области фрагмента белка.
В контексте настоящего описания понятие "повышенная Fc-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" относится к любому увеличению количества "меченных антителом клеток", подвергнутых лизису в данный момент времени при данной концентрации антитела или слитого с Fc белка, в
20 среде, окружающей клетки-мишени, с помощью указанного выше механизма Fc-опосредованной клеточнозависимой цитотоксичности и/или снижению концентрации антитела или слитого с Fc белка в среде, окружающей клетки-мишени, необходимой для лизиса данного количества "меченных антителом клеток" в данный момент времени с помощью механизма Fc-опосредованной
25 клеточнозависимой цитотоксичности. Понятие "повышение уровня Fc-опосредованной клеточнозависимой цитотоксичности" оценивают относительно клеточнозависимой цитотоксичности, опосредованной одним и тем же антителом или слитым с Fc белком, продуцированным в одном и том же типе клеток-хозяев, с использованием одних и тех же стандартных методов
30 получения, очистки, приготовления композиций и хранения, которые хорошо известны специалистам в данной области, но которое не продуцировалось клеткой-хозяином, сконструированной для экспрессии гликозилтрансферазы GnTIII с помощью способов, представленных в настоящем описании.
Понятие "антитело, обладающее повышенной антителозависимой клеточно-оросредованной цитотоксичностью (ADCC)" означает антитело, как оно определено выше, которое обладает повышенной ADCC при определении с помощью любого приемлемого метода, известного обычным специалистам в 5 данной области. Один из приемлемых методов анализа in vitro ADCC заключается в том, что:
1) для анализа применяют клетки-мишени, для которых известно, что они экспрессируют антиген-мишень, распознаваемый антигенсвязывающим центром антитела;
10 2) для анализа в качестве эффекторных клеток используют человеческие
мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделенные из крови произвольно выбранных здоровых доноров;
3) анализ осуществляют с помощью следующего протокола:
I) РВМС выделяют с помощью стандартных методов центрифугирования в
15 градиенте плотности и суспендируют 5> <106 клеток/мл в RPMI-среде для
культуры клеток;
II) выращивают клетки-мишени с помощью стандартных методов культуры тканей, собирают на экспоненциальной фазе роста, когда жизнеспособность составляет более 90%, промывают в RPMI-среде для культуры клеток, меченной
20 100 мкКи 51Сг, дважды промывают с помощью среды для культуры клеток и ресуспендируют в среде для культуры клеток с плотностью 105 клеток/мл;
III) переносят по 100 мкл указанной выше конечной суспензии клеток-мишеней в каждую лунку 96-луночного титрационного микропланшета;
IV) готовят серийные разведения с концентрацией антител от 4000 до 0,04
25 нг/мл в среде для культуры клеток и добавляют 50 мкл образовавшихся
растворов антител к клеткам-мишеням в 96-луночном титрационном микропланшете, оценивая в трех повторностях различные концентрации антител во всем указанном выше диапазоне концентраций;
V) для создания контролей с максимальным высвобождением (MR)
30 используют 3 дополнительные лунки в планшете, которые содержат меченые клетки-мишени, с добавлением 50 мкл 2 об.% водного раствора неионогенного детергента (Nonidet, фирма Sigma, Сент-Луис), вместо раствора антитела (указанного в п. IV, выше);
VI) для создания контролей со спонтанным высвобождением (SR),
используют 3 дополнительные лунки в планшете, которые содержат меченые
клетки-мишени, с добавлением 50 мкл RPMI-среды для культуры клеток вместо
раствора антитела (указанного в п. IV, выше);
5 VII) затем 96-луночный титрационный микропланшет центрифугируют при
50xg в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С;
VIII) добавляют в каждую лунку по 50 мкл суспензии РВМС (указанной в п. I, выше), получая соотношение эффекторная клетка: клетка-мишень 25:1, и планшеты помещают в инкубатор в атмосферу 5% СОг и выдерживают при 37°С
10 в течение 4 ч;
IX) собирают бесклеточный супернатант из каждой лунки и количественно оценивают выделенную в процессе эксперимента радиоактивность (ER) с помощью счетчика гамма-лучей;
X) рассчитывают процент специфического лизиса для каждой
15 концентрации антитела согласно формуле (ER-MR)/(MR-SR) *100, где ER обозначает среднюю радиоактивность, рассчитанную (см. п.IX, выше) для указанной концентрации антитела, MR означает среднюю радиоактивность, рассчитанную (см. п.IX, выше) для MR-контролей (см. п. V, выше), a SR означает среднюю радиоактивность, рассчитанную (см. п. IX, выше) для SR-
20 контролей (см. п. VI. выше);
4) "повышенную ADCC" определяют либо как увеличение максимального процента специфического лизиса, обнаруженного для указанного выше диапазона концентраций антитела, и/или как снижение концентрации антитела, необходимой для достижения Уг максимального процента специфического
25 лизиса, обнаруженного для указанного выше диапазона концентраций антитела. Повышение ADCC оценивают относительно ADCC, опосредованной одним и тем же антителом, продуцированным в одном и том же типе клеток-хозяев, с использованием одних и тех же стандартных методов получения, очистки, приготовления композиций и хранения, которые хорошо известны специалистам
30 в данной области, но которое не продуцировалось клеткой-хозяином, сконструированной для сверхэкспрессии GnTIII.
Один из объектов настоящего изобретения относится к антигенсвязывающим молекулам, обладающим специфичностью связывания,
соответствующей специфичности мышиного антитела B-Lyl, и он основан на установленном при создании изобретения факте, что их эффекторные функции можно усиливать путем изменения гликозилирования. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула 5 представляет собой химерное антитело. Предпочтительным вариантом
осуществления изобретения является химерное антитело или его фрагмент, которые содержат CDR, представленные на фиг. 7. В частности, предпочтительным вариантом осуществления изобретения является выделенный полинуклеотид, который содержит: (а) последовательность, выбранную из ряда,
10 включающего SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6 и SEQ ID N0:7 (CDR VH-i); и (6)
последовательность, выбранную из группы, включающей: SEQ ID NO:21, SEQ ID N0:22 и SEQ ID N0:23 (CDR VH-2); и SEQ ID N0:24. Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является выделенный полинуклеотид, который содержит SEQ ID N0:8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10
15 (CDR VL). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения все эти полинуклеотиды кодируют слитый полипептид.
Согласно другому варианту осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула содержит Ун-область мышиного антитела B-Lyl, представленную на фиг. 1, или ее вариант; и немышиный полипептид.
20 Следующим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является антигенсвязывающая молекула, которая содержит VL-область мышиного антитела B-Lyl, представленную на фиг. 2, или ее вариант; и немышиный полипептид.
Еще одним объектом изобретения являются антигенсвязывающие 25 молекулы, которые содержат один или несколько укороченных CDR антитела BLy-1. Такие укороченные CDR должны содержать, как минимум, определяющие специфичность аминокислотные остатки данного CDR. Под "определяющим специфичность остатком" понимают остатки, которые непосредственно участвуют во взаимодействии с антигеном. В целом, только от 30 1/5 до 1/3 остатков в данном CDR принимает участие в связывании с антигеном. Определяющие специфичность остатки в каждом конкретном CDR можно идентифицировать, например, путем вычисления внутриатомных контактов на
трехмерной модели структуры и определения вариабельности
последовательности в данном положении остатков согласно методу, описанному
у Padlan и др., FASEB J. 9(1), 1995, сс. 133-139, содержание публикации
полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.
5 Таким образом, изобретение относится также к выделенному
полинуклеотиду, который содержит по меньшей мере один гипервариабельный участок мышиного антитела B-Lyl или его вариант или укороченную форму, которые содержат по меньшей мере определяющие специфичность остатки указанного гипервариабельного участка, где выделенный полинуклеотид
10 кодирует слитый полипептид. Предпочтительно указанные выделенные
полинуклеотиды кодируют слитый полипептид, который представляет собой антигенсвязывающую молекулу. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения полинуклеотид несет три гипервариабельных участка мышиного антитела B-Lyl или их варианты или укороченные формы, содержащие по
15 меньшей мере определяющие специфичность остатки каждого из трех
гипервариабельных участков. Согласно другому варианту осуществления изобретения полинуклеотид кодирует полную вариабельную область легкой или тяжелой цепи химерного (например гуманизированного) антитела. Изобретение относится также к полипептидам, кодируемым указанными полинуклеотидами.
20 Следующим вариантом осуществления изобретения является
антигенсвязывающая молекула, которая несет по меньшей мере один гипервариабельный участок мышиного антитела B-Lyl или его вариант или укороченную форму, которые содержат по меньшей мере определяющие специфичность остатки указанного гипервариабельного участка и которые
25 содержат последовательность, выведенную из гетерологичного полипептида.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула несет три гипервариабельных участка мышиного антитела B-Lyl или их варианты или укороченные формы, содержащие по меньшей мере определяющие специфичность остатки каждого из трех указанных
30 гипервариабельных участков. Согласно другому варианту осуществления
изобретения антигенсвязывающая молекула содержит вариабельную область легкой или тяжелой цепи антитела. Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающая молекула
представляет собой химерное (например гуманизированное) антитело. Изобретение относится также к способам получения таких антигенсвязывающих молекул и к их применению для лечения заболевания, включая В-клеточные лимфомы.
5 Известно несколько механизмов, которые обусловливают терапевтическую
эффективность антител к CD20, включая антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и индукцию замедления роста или апоптоза. Например, большинство экспериментальных данных свидетельствует о том, что действие
10 ритуксимаба обусловлено обычными эффекторными механизмами, которые
оценивают путем анализов CDC и ADCC. Аналогично этому было установлено, что устойчивость различных клеток лимфомы к ритуксимабу in vivo является функцией их чувствительности к CDC in vitro. В противоположность этому для механизма действия in vivo другого антитела, рекомендованного для применения
15 в терапии, такого как В1, не требуется ни комплементзависимой, ни связанной с естественными клетками-киллерами (NK) активности. В большей степени эффективность Bl in vivo является результатом его способности индуцировать выраженный апоптоз.
В целом, моноклональные антитела к CD20 подразделяются на две
20 различные категории на основе их механизма действия, обеспечивающего уничтожения клеток лимфомы. Антитела типа I к CD20 прежде всего используют комплемент для уничтожения клеток-мишеней, в то время как антитела типа II проявляют действие посредством других механизмов, прежде всего апоптоза. Ритуксимаб и 1F5 являются примерами антител типа I к CD20, а
25 В1 является примером антитела типа II (см., например, Cragg M.S. и Glennie M.J., Blood 103(7), апрель 2004, сс. 2738-2743; Teeling J.L. и др., Blood 104(6), сентябрь 2004, сс. 1793-1800), содержание публикаций полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Настоящее изобретение является первым известным примером создания
30 антитела типа II к CD20, которое обладает повышенными эффекторными
функциями, такими как ADCC, сохраняя при этом способность, индуцировать эффективный апоптоз. Таким образом, настоящее изобретение относится к сконструированному антителу типа II к CD20, которое обладает повышенной
ADCC, что является результатом указанного конструирования, и не утрачивает выраженную способность индуцировать апоптоз. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения конструировали антитела типа II к CD20, которые имели измененную схему гликозилирования в Fc-области. Согласно 5 конкретному варианту осуществления изобретения измененное
гликозилирование предусматривает повышенный уровень бисекционных комплексных остатков в Fc-области. Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения измененное гликозилирование предусматривает также и понижение уровня остатков фукозы в Fc-области (см. опубликованную
10 заявку на патент США № 20040093621 на имя фирмы Shitara и др., содержание
которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. В другом варианте осуществления изобретения антитела типа II к CD20 создают с помощью метода конструирования полипептидов, который изложен в U.S. 6737056 на имя Presta или в опубликованной заявке на патент США №
15 20040185045 (на имя Macrogenics) или в опубликованной заявке на патент США № 20040132101 (на имя Хепсог), содержание каждой из которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Изобретение относится также к способам получения таких сконструированных антител типа II и к способам применения таких антител для лечения различных В-клеточных
20 нарушений, включая В-клеточные лимфомы.
Химерные мышиные /человеческие антитела являются известными (см., например, Morrison S. L. и др., PNAS И, ноябрь 1984 г., сс. 6851-6854; опубликованный европейский патент № 173494; Boulianna G. L и др., Nature 312, декабрь 1984 г., с. 642; Neubeiger М. S. и др., Nature 314, март 1985 г., с. 268;
25 опубликованный европейский патент № 125023; Tan и др., J. Immunol. 135,
ноябрь 1985 г., с. 8564; Sun L. К и др., Hybridoma 5(1), 1986, с.517; Sahagan и др., J. Immunol. 137, 1986, сс. 1066-1074). Общие сведение приведены у Muron, Nature 312, декабрь 1984 г., с. 597; Dickson, Genetic Engineering News 5(3), март 1985 г.; Marx, Science 229, август 1985 г., с. 455; и Morrison, Science 229,
30 сентябрь 1985 г., сс. 1202-1207. Robinson с соавторами в опубликованной заявке РСТ WO/88104936 описали химерное антитело, которое несет человеческую константную область и мышиную вариабельную область, обладающее специфичностью в отношении эпитопа CD20; мышиный фрагмент химерного
антитела по данным Robinson выведен из мышиного моноклонального антитела 2Н7 (гамма 2Ь, каппа). Несмотря на то, что в указанной ссылке это химерное антитело рассматривается в качестве "основного кандидата" для лечения В-клеточных нарушений, специалисты в данной области могут рассматривать его 5 только как гипотетичное при определении того, справедливо ли оно для
конкретного антитела, прежде всего из-за того, что в ссылке отсутствуют какие-либо данные, подтверждающие утверждение о наличии терапевтической эффективности, и, что является важным, результаты, полученные с использованием высших млекопитающих, таких как приматы или люди.
10 Методологии получения химерных антител известны в данной области.
Например, легкую и тяжелую цепи можно экспрессировать по отдельности, используя, например легкую цепь иммуноглобулина и тяжелую цепь иммуноглобулина в различных плазмидных векторах или в одном (например полицистронном) векторе. Затем их можно очищать и собирать in vitro с
15 получением полных антител; методы осуществления такой сборки известны (см., например, Scharff М., Harvey Lectures 69, 1974, с. 125). Параметры реакций in vitro для получения антител в виде IgG из восстановленных выделенных легких и тяжелых цепей также описаны в литературе (см., например, Sears и др., Biochem. 16(9), 1977, сс. 2016-2025).
20 Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления
изобретения химерная АСМ, предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой гуманизированное антитело. Методы гуманизации антител, полученных из организма кроме человека, известны в данной области. Например, гуманизированные АСМ, предлагаемые в настоящем изобретении,
25 можно получать с помощью методов, описанных в U.S. 5225539 на имя Winter, U.S. 6180370 на имя Queen и др., или U.S. 6632927 на имя Adair и др., полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительно гуманизированное антитело несет один или несколько интродуцированных аминокислотных остатков из источника кроме человека.
30 Эти аминокислотные остатки из источника кроме человека часто называют "импортными" остатками, которые, как правило, получают из "импортной" вариабельной области. Гуманизацию, как правило, осуществляют с помощью метода, описанного у Winter с сотрудниками (Jones и др., Nature, 321, 1986, сс.
522-525; Riechmann и др., Nature, 332, 1988, сс. 323-327; Verhoeyen и др., Science, 239, 1988, сс. 1534-1536), путем замены последовательностей гипервариабельных участков на соответствующие последовательности человеческого антитела. Таким образом, такие "гуманизированные" антитела 5 являются химерными антителами (U.S. 4816567), в которых область,
существенно меньшая по сравнению с интактной человеческой вариабельной областью, заменена на соответствующую последовательность из видов кроме человека. На практике гуманизированные антитела представляют собой типичные человеческие антитела, в которых некоторые остатки
10 гипервариабельного участка и вероятно некоторые остатки FR-участка заменены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов. Предлагаемые в изобретении гуманизированные антитела к CD20 должны содержать константные области человеческого иммуноглобулина.
Выбор человеческих вариабельных областей как легкой, так и тяжелой
15 цепи, применяемых для создания гуманизированных антител, очень важен для снижения антигенности. Согласно так называемому методу "наилучшего подбора" последовательность вариабельной области антитела грызунов подвергают скринингу с использованием полной библиотеки известных последовательностей человеческих вариабельных областей. Затем человеческую
20 последовательность, наиболее сходную с последовательностью грызунов, отбирают в качестве человеческого каркасного участка (FR) для создания гуманизированного антитела (Sims и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2296; Chothia и др., J. Mol. Biol., 196, 1987, с. 901). Другой метод выбора последовательности человеческого каркасного участка заключается в сравнении последовательности
25 каждой индивидуальной подобласти полного каркасного участка грызунов (т.е., FR1, FR2, FR3 и FR4) или определенной комбинации индивидуальных подобластей (например FR1 и FR2) и библиотеки известных последовательностей человеческих вариабельных областей, которые соответствуют указанной каркасной подобласти (например с использованием
30 нумерации по Кэботу), и выборе человеческой последовательности для каждой подобласти или комбинации, которая является наиболее сходной с последовательностью грызунов (Leung, заявка на патент США № 2003/0040606А1, опубликованная 27 февраля 2003 г.). Еще один метод основан
на применении конкретного каркасного участка, выведенного из консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких и тяжелых цепей. Один и тот же каркасный участок можно применять для нескольких различных гуманизированных антител (Carter и др., Proc. Natl. Acad. 5 Sci. USA, 89, 1992, с. 4285; Presta и др., J. Immunol., 151, 1993, c.2623).
Также важно, чтобы антитела, будучи гуманизированными, сохраняли их высокую аффинность к антигену и другие ценные биологические свойства. Для решения этой задачи согласно предпочтительному способу гуманизированные антитела получают с помощью процесса анализа родительских
10 последовательностей и различных концептуальных (схематических) гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов доступны и хорошо известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и
15 отображают вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных в качестве перспективных ("кандидатов") последовательностей иммуноглобулинов. Оценка этих изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в проявлении функции последовательности иммуноглобулина-"кандидата", т.е. анализ остатков, которые влияют на
20 способность иммуноглобулина-"кандидата" связываться с антигеном. Таким
методом можно отбирать остатки FR-участка и объединять остатки, полученные из реципиента и "импортные" последовательности так, чтобы получать требуемые характеристики антитела, такие как повышенная аффинность к антигену(ам)-мишени(ям). В целом, остатки гиперварибельных участков
25 непосредственно и в наибольшей степени оказывают воздействие на связывание антигена.
Согласно другому варианту осуществления изобретения антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, конструируют так, чтобы они обладали повышенной аффинностью к 30 связыванию, например, с использованием методов, описанных в опубликованной заявке на патент США № 2004/0132066 на имя Balint и др., полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, конъюгируют с дополнительным фрагментом, таким как радиоактивная метка или токсин. Такие конъюгированные АСМ можно получать многочисленными 5 методами, хорошо известными в данной области.
Различные радионуклиды можно применять согласно настоящему изобретению, и специалисты в данной области могут легко определить, какой радионуклид является наиболее пригодным в различных ситуациях. Например,
131
йод представляет собой хорошо известный радионуклид, применяемый для
131
10 целенаправленной иммунотерапии. Однако клиническая применимость йода может быть ограничена несколькими факторами, которые включают: восьмидневный физический период полураспада; дегалогенизация йодированного антитело как в крови, так и в областях опухоли; и характеристики испускания (например, высокий уровень гамма-компонента), что
15 может оказаться не оптимальным для локализованного отложения дозы в
опухоли. С появлением более эффективных хелатирующих агентов возможность присоединения к белкам хелатирующих групп металлов повысила возможность
111 "90 " 90Т/Г
использования других радионуклидов, таких как индии и иттрии. Иттрии
обладает рядом преимуществ при радиоиммунотерапевтическом применении: (tm) ,. 90
20 64-часов период полураспада иттрия является достаточным для накопления
131" 90
антитела опухолью и, например, в отличие от иода, иттрии испускает только бета-лучи высокой энергии без накопления гамма-излучения при его распаде на участке ткани, диаметром 100-1000 клеток. Кроме того, минимальное количество проникающей радиации позволяет вводить антитела, меченные
25 иттрием, амбулаторным больным. Кроме того, для уничтожения клетки не требуется интернализация меченого антитела, и местное испускание ионизирующего излучения должно быть летальным для примыкающих опухолевых клеток, лишенных антигена-мишени.
Эффективные однократные дозы (т.е., терапевтически эффективные
30 количества) меченных с помощью иттрия антител к CD20 составляют от
примерно 5 и до примерно 75 мКи, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 40 мКи. Эффективные однократные неаблятивные дозы (при
использовании которых не требуется трансплантация костного мозга), меченных с помощью 131йода антител к CD20 составляют от примерно 5 и до примерно 70 мКи, более предпочтительно от примерно 5 и до примерно 40 мКи. Эффективные однократные аблятивные дозы (т.е. при применении которых 5 может потребоваться аутологичная трансплантация костного мозга) меченых с
131
помощью йода антител к CD20 составляют от примерно 30 и до примерно 600 мКи, более предпочтительно от примерно 50 и менее чем примерно 500 мКи. С учетом того, что химерное антитело к CD20 обладает более продолжительным периодом полужизни в кровотоке по сравнению с мышиными антителами, 10 эффективные однократные неаблятивные дозы (при использовании которых не
С- S 131"
требуется трансплантация костного мозга) меченных с помощью иода
химерных антител к CD20 составляют от примерно 5 и до примерно 40 мКи,
более предпочтительно менее чем примерно 30 мКи. Критерии визуализации,
111
например, в случае использования в качестве метки индия, как правило,
15 составляют менее примерно 5 мКи.
При лечении с использованием радиоактивно меченных антител к CD20 можно использовать как однократную терапевтическую обработку, так и несколько обработок. Из-за присутствия радионуклидного компонента предпочтительно, чтобы перед лечением периферические стволовые клетки
20 ("PSC") или клетки костного мозга ("ВМ") были "собраны" с целью оценки их способности к выживанию в присутствии потенциально смертельной для костного мозга токсичности радиации. ВМ и/или PSC выделяют стандартными методами и затем очищают и замораживаю для возможной реинфузии. Кроме того, наиболее предпочтительно перед лечением проводить диагностическое
25 дозиметрическое исследование пациента с помощью диагностического меченого антитела (например с помощью 11 'индия), целью которого является гарантия того, что терапевтическое меченое антитело (например с помощью 90иттрия) не концентрируется в излишнем количестве в любом здоровом органе или ткани. Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения
30 является выделенный полинуклеотид, содержащий последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая представлена ниже в таблице 3. Изобретение относится также к выделенной
нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности, которая представлена ниже в таблице 2. Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая 5 кислота, содержащая последовательность, которая кодирует полипептид,
аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%), 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в таблице 3. Под объем изобретения подпадает также выделенная нуклеиновая кислота, содержащая 10 последовательность, которая кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность любой из представленный в таблице 3 конструкций с консервативными аминокислотными заменами.
Конструкция
Нуклеотидная последовательность
SEQ ID NO
В-НН5
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTT
AAGAAGCCTGGGAGTTCAGTGAAGGTCTCCTGC
AAGGCTTCCGGATACGCGTTCAGCTATTCTTGG
ATGAGCTGGGTGCGGCAGGCGCCTGGACAAGG
GCTCGAGTGGATGGGACGGATCTTTCCCGGCGA
TGGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGG
CAGAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAG
CACAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATC
TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAA
TGTCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
В-НН6
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTT
AAGAAGCCTGGGAGTTCAGTGAAGGTCTCCTGC
AAGGCTTCCGGATACGCCTTCAGCTATTCTTGG
ATCAATTGGGTGCGGCAGGCGCCTGGACAAGGG
CTCGAGTGGATGGGACGGATCTTTCCCGGCGAT
GGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGGC
AGAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAGC
ACAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCT
GAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAAT
GTCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGCC
AGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
В-НН7
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTT
AAGAAGCCTGGGAGTTCAGTGAAGGTCTCCTGC
AAGGCTTCCGGATACGCCTTCAGCTATTCTTGG
ATCTCGTGGGTGCGGCAGGCGCCTGGACAAGGG
CTCGAGTGGATGGGACGGATCTTTCCCGGCGAT
GGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGGC
AGAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAGC
ACAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCT
GAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAAT
GTCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGCC
AGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
В-НН8
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTT
AAGAAGCCTGGCGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGC
AAGGCTTCCGGATACACCTTCACATACAGCTGG
ATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGG
GCTCGAGTGGATGGGACGGATCTTTCCCGGCGA
TGGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGG
CAGAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAG
CACAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATC
TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAA
TGTCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
Конструкция
Нуклеотидная последовательность
SEQ ID NO
В-НН9
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTT
AAGAAGCCTGGCGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGC
AAGGCTTCCGGATACACCTTCAGCTATTCTTGG
ATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGG
GCTCGAGTGGATGGGACGGATCTTTCCCGGCGA
TGGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGG
CAGAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAG
CACAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATC
TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAA
TGTCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
B-HL1
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTT
AAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGC
AAGGCTTCCGGATACACCTTCACCTATTCTTGG
ATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGG
CTCGAGTGGATGGGACGGATCTTTCCCGGCGAT
GGGGATACTGACTACGCACAGAAATTCCAAGGA
AGAGTCACAATGACACGGGACACGTCCACTTCC
ACCGTCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCT
GAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAAT
GTCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGCC
AGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
B-HL2
GAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTT
AAGAAGCCTGGGGCCACCGTGAAGATCTCCTGC
AAGGTGTCCGGATACACCTTCACCTATTCTTGG
ATGCACTGGGTGCAGCAGGCCCCTGGAAAGGG
GCTCGAGTGGATGGGACGGATCTTTCCCGGCGA
TGGGGATACTGACTACGCAGAGAAATTCCAAGG
AAGAGTCACAATCACAGCCGACACGTCCACTGA
CACCGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATC
TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACCAA
TGTCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
B-HL3
GAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTT
AAGAAGCCTGGGGCCACCGTGAAGATCTCCTGC
AAGGTGTCCGGATACACCTTCACCTATTCTTGG
ATGAACTGGGTGCAGCAGGCCCCTGGAAAGGG
GCTCGAGTGGATGGGACGGATCTTTCCCGGCGA
TGGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGG
AAGAGTCACAATCACAGCCGACACGTCCACTGA
CACCGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATC
TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACCAA
TGTCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
Конструкция
Нуклеотидная последовательность
SEQ ID NO
B-HL4
CAGATGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTT
AAGAAGACCGGGAGTTCAGTGAAGGTCTCCTGC
AAGGCTTCCGGATACACCTTCACCTATTCTTGG
ATGAGCTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGG
GCTCGAGTGGATGGGACGGATCTTTCCCGGCGA
TGGGGATACTGACTACGCACAGAAATTCCAAGG
AAGAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAG
CACAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATC
TGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAA
TGTCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
ACC
B-HL8
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTG
GTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGT
GCAGCCTCTGGATTCACATTTAGCTATTCTTGGA
TGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCC
TCGAGTGGGTGGGACGGATCTTTCCCGGCGATG
GGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGGCA
GAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAGCA
CAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTG
AGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAATG
TCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGCCA
GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
B-HL10
CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACT
GGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAG
CCACAGGAGCCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGG
AGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGT
CCCTGCGGCTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGC
ATTCAGCTATTCTTGGATGAACTGGGTGCGGCA
GGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGGACG
GATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGACTACAA
TGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTACCGC
CGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAGCT
GAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA
TTACTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTGG
CTTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC
GTCTCCTCAGCTAGCGAATTCTCGA
B-HL11
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTG
GTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGT
GCAGCCTCTGGATTCACATTTAGCTATTCTTGGA
TGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCC
TCGAGTGGGTGGGACGGATCTTTCCCGGCGATG
GGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGGCA
GAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAGCA
CAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTG
AGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAATG
TCTTTGATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGCCA
GGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
Конструкция
Нуклеотидная последовательность
SEQ ID NO
B-HL12
CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACT
GGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAG
CCACAGGAGCTCACTCCGAAGTGCAGCTCGTGG
AGTCTGGAGCAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGT
CCCTGCGGCTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATTCAC
ATTTAGCTATTCTTGGATGAACTGGGTGCGGCA
GGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGGACG
GATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGACTACAA
TGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTACCGC
CGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAGCT
GAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA
TTACTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTGG
CTTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC
GTCTCCTCAGCTAGCGAATTCTCGA
B-HL13
CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACT
GGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAG
CCACAGGAGCTCACTCCGAAGTGCAGCTCGTCG
AGTCTGGAGGAGGCGTGGTCAAGCCTGGCGGGT
CCCTGCGGCTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATTCAC
ATTTAGCTATTCTTGGATGAACTGGGTGCGGCA
GGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGGACG
GATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGACTACAA
TGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTACCGC
CGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAGCT
GAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA
TTACTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTGG
CTTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC
GTCTCCTCAGCTAGCGAATTCTCGA
B-HL14
CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACT
GGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAG
CCACAGGAGCTCACTCCGAAGTGCAGCTGGTCG
AGTCCGGAGGAGGCTTGAAGAAGCCTGGCGGG
TCCCTGCGGCTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATTCA
CATTTAGCTATTCTTGGATGAACTGGGTGCGGC
AGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGGAC
GGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGACTACA
ATGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTACCG
CCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAGC
TGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGT
ATTACTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTG
GCTTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC
CGTCTCCTCAGCTAGCGAATTCTCGA
Конструкция
Нуклеотидная последовательность
SEQ ID NO
B-HL15
CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACT
GGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAG
CCACAGGAGCCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGG
AGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCTCTT
CCCTGCGGCTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATTCAC
ATTTAGCTATTCTTGGATGAACTGGGTGCGGCA
GGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGGACG
GATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGACTACAA
TGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTACCGC
CGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAGCT
GAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA
TTACTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTGG
CTTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC
GTCTCCTCAGCTAGCGAATTCTCGA
B-HL16
CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACT
GGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAG
CCACAGGAGCCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGG
AGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGT
CCCTGCGGGTCAGCTGCGCAGCCTCTGGATTCA
CATTTAGCTATTCTTGGATGAACTGGGTGCGGC
AGGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGGAC
GGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGACTACA
ATGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTACCG
CCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAGC
TGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGT
ATTACTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTG
GCTTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC
CGTCTCCTCAGCTAGCGAATTCTCGA
B-HL17
CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACT
GGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAG
CCACAGGAGCCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGG
AGTCTGGAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGT
CCCTGCGGCTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATTCAC
ATTTAGCTATTCTTGGATGAACTGGGTGCGGCA
GGCTCCTGGAAAGGGCCTCGAGTGGGTGGGACG
GATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGACTACAA
TGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTACCGC
CGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAGCT
GAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA
TTACTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTGG
CTTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC
GTCTCCTCAGCTAGCGAATTCTCGA
Сигнальная последовательность VH
ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTG
GCAGCAGCCACAGGAGCCCACTCC
Конструкция
Нуклеотидная последовательность
SEQIDNO
B-KV1
GATATCGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTG
CCCGTCACCCCTGGAGAGCCCGCCAGCATTAGC
TGCAGGTCTAGCAAGAGCCTCTTGCACAGCAAT
GGCATCACTTATTTGTATTGGTACCTGCAAAAG
CCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATTTATCAA
ATGTCCAACCTTGTCTCTGGCGTCCCTGACCGGT
TCTCCGGATCCGGGTCAGGCACTGATTTCACAC
TGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTG
GAGTTTATTACTGCGCTCAGAATCTAGAACTTC
CTTACACCTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGA
TCAAACGTACGGTG
Сигнальная последовательность VL
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGC
CTCCTGCTGCTCTGGTTCCCAGGTGCCAGGTGT
Конструкция
Аминокислотная последовательность
SEQ ID NO
В-НН9
OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSYSWMN
WVROAPGOGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTI
TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYW
LVYWGOGTLVTVSS
B-HL1
OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYSWMH
WVROAPGOGLEWMGRIFPGDGDTDYAOKFOGRVT
MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGY
WLVYWGOGTLVTVSS
B-HL2
EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTYSWMH
WVOOAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYAEKFOGRVTI
TADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATNVFDGYW
LVYWGOGTLVTVSS
B-HL3
EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTYSWMN
WVOOAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTI
TADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATNVFDGYW
LVYWGOGTLVTVSS
B-HL4
OMOLVOSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTYSWMS
WVROAPGOGLEWMGRIFPGDGDTDYAOKFOGRVTIT
ADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLV
YWGOGTLVTVSS
B-HL8
EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMN
WVROAPGKGLEWVGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTI
TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYW
LVYWGOGTLVTVSS
B-HL10
EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSYSWMNW
VROAPGKGLEWVGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITA
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVY
WGOGTLVTVSS
B-HL11
OVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMN
WVROAPGKGLEWVGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTI
TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYW
LVYWGOGTLVTVSS
B-HL12
EVOLVESGAGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMN
WVROAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTI
TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYW
LVYWGOGTLVTVSS
B-HL13
EVOLVESGGGVVKPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMNW
VROAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITA
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVY
WGOGTLVTVSS
B-HL14
EVOLVESGGGLKKPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMNW
VROAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITA
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVY
WGOGTLVTVSS
B-HL15
EVOLVESGGGLVKPGSSLRLSCAASGFTFSYSWMNW
VROAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTIT
ADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWL
VYWGOGTLVTVSS
B-HL16
EVOLVESGGGLVKPGGSLRVSCAASGFTFSYSWMNW
VROAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITA
DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVY
WGOGTLVTVSS
Конструкция
Аминокислотная последовательность
SEQ ID NO
B-HL17
EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMN
WVROAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTI
TADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYW
LVYWGOGTLVTVSS
Сигнальная последовательность VH
MDWTWRILFLVAAATGAHS
B-KV1
DIVMTOTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLY
WYLOKPGOSPOLLIYOMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDF
TLKISRVEAEDVGVYYCAONLELPYTFGGGTKVEIKR
Сигнальная последовательность VL
MDMRVPAOLLGLLLLWFPGARC
Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, который содержит последовательность, кодирующую полипептид, который имеет аминокислотную 5 последовательность, представленную на фиг. 1 или фиг. 2. Изобретение относится также к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична нуклеотидной последовательности, представленной на фиг. 5 или фиг. 6. Следующим вариантом осуществления
10 изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, которая содержит последовательность, кодирующую полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%) или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 5 или фиг. 6. Под объем изобретения подпадает также
15 выделенная нуклеиновая кислота, которая содержит последовательность, кодирующую полипептид, аминокислотная последовательность которого представлена на одной из фиг. 1, фиг. 2, фиг. 5 или фиг. 6 с консервативными аминокислотными заменами.
Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения является
20 экспрессионный вектор и/или клетка-хозяин, которые содержат один или несколько выделенных полинуклеотидов, предлагаемых в настоящем изобретении.
Как правило, любую культивируемую клеточную линию можно применять для экспрессии АСМ, предлагаемой в настоящем изобретении. В
предпочтительном варианте осуществления изобретения СНО-клетки, ВНК-клетки, NSO-клетки, 8Р2/0-клетки, клетки миеломы линии YO, клетки мышиной миеломы линии РЗХ63, PER-клетки, РЕЯ.Сб-клетки или клетки гибридомы, другие клетки млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых или 5 растительные клетки используют в качестве основной клеточной линии для создания клеток-хозяев, предлагаемых в изобретении.
Терапевтическую эффективность АСМ, предлагаемых в настоящем изобретении, можно усиливать, получая их в клетке-хозяине, которая дополнительно экспрессирует полинуклеотид, кодирующий полипептид,
10 который обладает GnTIII-активностью. В предпочтительном варианте
осуществления изобретения полипептид, обладающий GnTIII-активностью, представляет собой слитый полипептид, который содержит домен локализации в комплексе Гольджи присущего комплексу Гольджи полипептида. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения экспрессия
15 АСМ, предлагаемых в настоящем изобретении, в клетке-хозяине, которая экспрессирует полинуклеотид, кодирующий полипептид, который обладает GnTIII-активностью, приводит к получению АСМ, которые обладают повышенной аффинностью к связыванию с Fc-рецептором и повышенной эффекторной функцией. Таким образом, одним из вариантов осуществления
20 настоящего изобретения является клетка-хозяин, содержащая (а) выделенную нуклеиновую кислоту, которая содержит последовательность, кодирующую полипептид, который обладает GnTIII-активностью; и (б) выделенный полинуклеотид, который кодирует АСМ, предлагаемую в настоящем изобретении, такую как химерное, приматизированное или гуманизированное
25 антитело, которое связывается с человеческим CD20. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид, обладающий GnTIII-активностью, представляет собой слитый полипептид, который содержит каталитический домен GnTIII, а домен локализации в комплексе Гольджи представляет собой домен локализации маннозидазы И. Методы получения
30 таких слитых полипептидов и их применение для получения антител с
повышенными эффекторными функциями описаны в предварительной заявке на патент США № 60/495142, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. Согласно другому предпочтительному варианту
осуществления изобретения химерная АСМ представляет собой химерное антитело или его фрагмент, которые обладают способностью к специфическому связыванию, свойственную мышиному антителу B-LY1. Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения химерное антитело 5 содержит человеческую Fc-область. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления антитело является приматизированным или гуманизированным.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения один или несколько полинуклеотидов, кодирующих АСМ, предлагаемые в настоящем
10 изобретении, можно экспрессировать под контролем конститутивного промотора или в другом варианте регулируемой экспрессионной системы. Приемлемые регулируемые экспрессионные системы включают (но не ограничиваясь ими) регулируемую тетрациклином экспрессионную систему, индуцируемую экдизоном экспрессионную систему, переключаемую с помощью lac
15 экспрессионную систему, индуцируемую глюкокортикоидом экспрессионную систему, систему с использованием индуцируемого температурой промотора и индуцируемую металлом металлотионеина экспрессионную систему. Если в систему клетки-хозяина входят несколько различных нуклеиновых кислот, кодирующих АСМ, предлагаемые в настоящем изобретении, то некоторые из
20 них можно экспрессировать под контролем конститутивного промотора, а другие экспрессировать под контролем регулируемого промотора. За максимальный уровень экспрессии принимают наиболее высокий возможный уровень стабильной экспрессии полипептида, который не оказывает значительного вредного воздействия на скорость клеточного роста, и его можно
25 определять с помощью обычного эксперимента. Уровни экспрессии определяют методами, хорошо известными в данной области, в том числе с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела, специфического в отношении АСМ, или антитела, специфического к пептидной метке, слитой с АСМ; и методом Нозерн-блоттинга. В другом варианте полинуклеотид может быть
30 функционально связан с репортерным геном; уровни экспрессии химерной АСМ, которая имеет аффинность связывания, практически такую же, как у мышиного антитела B-Lyl, определяют, оценивая сигнал, который коррелирует с уровнем экспрессии репортерного гена. Репортерный ген можно транскрибировать
вместе с нуклеиновой(ами) кислотой(ами), которая(ые) кодирует(ют) слитый полипептид, в виде одной молекулы мРНК; соответствующие им кодирующие последовательности могут быть слиты либо с помощью внутреннего сайта входа в рибосому (IRES) или с помощью независящего от кэпа энхансера трансляции 5 (CITE). Репортерный ген можно транслировать в сочетании с по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей химерную АСМ, которая имеет специфичность связывания, практически такую же, как у мышиного антитела В-Lyl, с образованием одной полипептидной цепи. Нуклеиновые кислоты, которые кодируют АСМ, предлагаемые в настоящем изобретении, можно функционально
10 связывать с репортерным геном под контролем одного промотора, так, чтобы нуклеиновая кислота, кодирующая слитый полипептид и репортерный ген, транскрибировалась с молекулы РНК, из которой в результате альтернативного сплайсинга образовывались две различные молекулы матричной РНК (мРНК); после трансляции одной из образовавшихся мРНК получают репортерный белок,
15 а после трансляции второй получают указанный слитый полипептид.
Для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательность АСМ, которая имеет специфичность связывания, практически такую же, как у мышиного антитела B-Lyl, наряду с соответствующими транскрипционными/трансляционными контролирующими
20 сигналами, применяют методы, хорошо известные специалистам в данной
области. Эти методы представляют собой методики in vitro рекомбинантной ДНК, методы синтеза и методы рекомбинации/генетической рекомбинации in vivo (см, например, методы, описанные у Maniatis и др., MOLECULAR CLONING А LABORATORY MANUAL, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) и
25 Ausubel и др., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ИЗД-ВО Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989).
Для экспрессии кодирующей последовательности АСМ, предлагаемой в настоящем изобретении, можно использовать различные системы экспрессионных векторов-хозяев. Предпочтительно клетки млекопитающих
30 применяют в качестве систем клеток-хозяев, трансфектированных
экспрессионными векторами в виде рекомбинантной плазмидной ДНК или рекомбинантной космидной ДНК, которые содержат кодирующую последовательность представляющего интерес белка и кодирующую
последовательность слитого полипептида. Наиболее предпочтительно в качестве системы клетки-хозяина применяют СНО-клетки, ВНК-клетки, NSO-клетки, 8Р2/0-клетки, клетки миеломы линии YO, клетки мышиной миеломы линии РЗХ63, PER-клетки, РЕЯ-Сб-клетки или клетки гибридомы, другие клетки 5 млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых и растительные клетки. Некоторые примеры экспрессионных систем и методов отбора даны в следующих публикациях и приведенных в них ссылках: Borth и др., Biotechnol. Bioen. 71(4), 2000-2001, сс. 266-273, Werner и др., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8), 1998, сс. 870-880, Andersen и Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13, 2002,
10 cc. 117-123, Chadd и Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12, 2001, cc. 188-194 и
Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12, 2001, cc. 450-454. В альтернативных вариантах осуществления изобретения можно применять другие системы на основе эукариотических клеток-хозяев, такие как клетки дрожжей, трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессионными
15 векторами, которые содержат последовательность, кодирующую АСМ, предлагаемую в настоящем изобретении; системы клеток насекомых, зараженных рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например бакуловирусными), содержащими кодирующую последовательность химерной АСМ, которая имеет специфичность связывания, практически такую
20 же, как у мышиного антитела B-Lyl; системы растительных клеток, зараженные рекомбинантными вирусными экспрессионными векторам (например вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом мозаики табака, TMV), или трансформированные рекомбинантными плазмидными экспрессионными векторами (например Ti-плазмидными), которые содержат кодирующую
25 последовательность АСМ, предлагаемой в изобретении; или системы на основе клеток животных, зараженных рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например аденовирусными, на основе вируса оспы), включая клеточные линии, сконструированные так, что они содержат множество копий ДНК, кодирующей химерную АСМ, которая имеет специфичность связывания,
30 практически такую же, как у мышиного антитела B-Lyl, где копии либо
стабильно амплифицируются (CHO/dhfr), либо нестабильно амплифицируются в двойных микрохромосомах (например мышиные клеточные линии). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения вектор, содержащий
полинуклеотид(ы), который(ые) кодирует(ют) АСМ, предлагаемую в изобретении, является полицистронным. Кроме того, согласно одному из вариантов осуществления изобретения указанная выше АСМ представляет собой антитело или его фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления 5 изобретения АСМ представляет собой гуманизированное антитело.
В способах, предлагаемых к настоящем изобретении, понятие "стабильная экспрессия", как правило, предпочтительно относится к кратковременной экспрессии, поскольку при этом обычно получают более воспроизводимые результаты, а также это больше соответствует крупномасштабному
10 производству. Помимо применения экспрессионных векторов, которые содержат вирусные сайты инициации репликации, клетки-хозяева можно трансформировать соответствующими кодирующими нуклеиновыми кислотами, которые находятся под контролем соответствующих контролирующих экспрессию элементов (например промоторные, энхансерные
15 последовательности, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т.д.), и селектируемым маркером. После интродукции чужеродной ДНК созданным клеткам можно давать расти в течение 1-2 дней в обогащенных средах, а затем переносить на селективные среды. Селектируемый маркер в рекомбинантных плазмидах придает устойчивость к селектирующему агенту и
20 позволяет отбирать клетки, в хромосомах которых присутствует стабильно интегрированная плазмида, и выращивать до образования очагов, которые в свою очередь можно клонировать и размножать с получением клеточных линий.
Можно применять многочисленные системы селекции, включая (но не ограничиваясь ими) гены тимидинкиназы герпеса простого (Wigler и др., Cell 11,
25 1977, с. 223), гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (Szybalska и Szybalski, Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 48, 1962, с. 2026), и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Lowy и др., Cell 22 1980, с. 817), которые можно применять в t"-, hgprt - или aprt -клетках соответственно. Кроме того, можно использовать устойчивость к антиметаболитам в качестве основы для отбора
30 гена dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler и др., Natl. Acad. Sci. USA 77, 1989, с. 3567; O'Hare и др., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1981, с. 1527); гена gpt, который придает устойчивость к микофенольной кислоте (Mulligan и Berg, Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 78. 1981, с. 2072); гена пео, который
придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Colberre-Garapin и др., J. Mol. Biol. 150, 1981, с. 1; и гена hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre и др., Gene 30, 1984, с. 147). В настоящее время описаны дополнительные селектируемые гены, такие как trpB, который обусловливает 5 возможность клеток утилизировать индол вместо триптофана; hisD, который обусловливает возможность клеток утилизировать гистинол вместо гистидина (Hartman и Mulligan, Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, с. 8047); система глутаминсинтазы; и ODC (орнитиндекарбоксилаза), который придает устойчивость к ингибитору орнитиндекарбоксилазы, 2-(дифторметил)-ОЬ-
10 орнитину, DFMO (McConlogue, в: Current Communications in Molecular Biology, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory (1987)).
В настоящем изобретении описан также способ модификации профиля гликозилирования АСМ, предлагаемых в настоящем изобретении, которые продуцируются клеткой-хозяином, заключающийся в том, что экспрессируют в
15 клетке-хозяине нуклеиновую кислоту, кодирующую АСМ , предлагаемую в изобретении, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который обладает GnTIII-активностью, или вектор, содержащий указанные such нуклеиновые кислоты. Предпочтительно модифицированный полипептид представляет собой IgG или его фрагмент, содержащий Fc-область. В особенно
20 предпочтительном варианте осуществления изобретения АСМ представляет собой гуманизированное антитело или его фрагмент.
Модифицированные АСМ, продуцируемые клетками-хозяевами, предлагаемыми в изобретении, в результате модификации обладают повышенной аффинностью к связыванию с Fc-рецептором и/или повышенной
25 эффекторной функцией. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения АСМ представляет собой гуманизированное антитело или его фрагмент, содержащий Fc-область. Предпочтительно повышенная аффинность к связыванию с Fc-рецептором представляет собой повышенное связывание с активирующим Fcy-рецептором, таким как FcyRIIIa-рецептор. Повышенная
30 эффекторная функция предпочтительно представляет собой повышение одной
или нескольких следующих функций: повышенная антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность, повышенный антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP), повышенная секреция цитокинов,
повышенное опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, повышенная Fc-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность, повышенное связывание с NK-клетками, повышенное связывание с макрофагами, повышенное связывание с 5 полиморфноядерными клетками (PMN), повышенное связывание с моноцитами, повышенное перекрестное связывание связанных с мишенью антител, повышенная непосредственная передача сигнала, индуцирующего апоптоз, повышенное созревание дендритных клеток и повышенное Т-клеточное примирование.
10 В настоящем изобретении предложен также способ получения АСМ,
предлагаемой в настоящем изобретении, которая имеет модифицированные олигосахариды в клетке-хозяине, заключающийся в том, что (а) культивируют клетку-хозяина, сконструированную для экспрессии по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который обладает GnTIII-
15 активностью, в условиях, которые позволяют осуществлять производство АСМ, предлагаемой в настоящем изобретении, где полипептид, обладающий GnTIII-активностью, экспрессируют в количестве, достаточном для модификации олигосахаридов в Fc-области АСМ, продуцируемой клеткой-хозяином; и (б) выделяют указанную АСМ. В предпочтительном варианте осуществления
20 изобретения полипептид, обладающий GnTIII-активностью, представляет собой слитый полипептид, который несет каталитический домен GnTIII. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения слитый полипептид содержит дополнительно домен локализации в комплексе Гольджи присущего комплексу Гольджи полипептида.
25 Предпочтительно домен локализации в комплексе Гольджи представляет
собой домен локализации маннозидазы II или GnTI. В альтернативном варианте домен локализации в комплексе Гольджи выбирают из группы, включающей: домен локализации маннозидазы I, домен локализации GnTII и домен локализации а-1-6 коровой фукозилтрансферазы. АСМ, полученные с помощью
30 способов, предлагаемых в настоящем изобретении, обладают повышенной
аффинностью к связыванию с Fc-рецептором и/или повышенной эффекторной функцией. Предпочтительно повышенная эффекторная функция представляет собой одну или несколько следующих функций: повышенная Fc-зависимая
клеточно-опосредованная цитотоксичность (включая повышенную антителозависимую клеточно-опосредованная цитотоксичность), повышенный антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP), повышенная секреция цитокинов, повышенное опосредованное иммунным комплексом 5 поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, повышенное связывание с NK-клетками, повышенное связывание с макрофагами, повышенное связывание с моноцитами, повышенное связывание с полиморфноядерными клетками, повышенная непосредственная передача сигнала, индуцирующего апоптоз, повышенное перекрестное связывание
10 связывающихся с мишенью антител, повышенное созревание дендритных клеток или повышенное Т-клеточное примирование. Повышенная аффинность к связыванию с Fc-рецептором предпочтительно представляет собой повышенное связывание с активирующими Fcy-рецепторами, таким как FcyRIHa-рецептор. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения АСМ
15 представляет собой гуманизированное антитело или его фрагмент.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является химерная АСМ, которая имеет специфичность связывания, практически такую же, как у мышиного антитела B-Lyl, полученная способами, предлагаемыми в изобретении, с повышенным содержанием бисекционных олигосахаридов в Fc-
20 области указанного полипептида. Подразумевается, что к таким АСМ относятся антитела и их фрагменты, содержащие Fc-область. В предпочтительном варианте осуществления изобретения АСМ представляет собой гуманизированное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения процент бисекционных олигосахаридов в Fc-области АСМ составляет по
25 меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%о, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90-95%) от общего содержания олигосахаридов. Согласно следующему варианту осуществления изобретения АСМ, полученная способами, предлагаемыми в изобретении, имеет повышенное
30 содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области в результате
модификации олигосахаридов с помощью способов, предлагаемых в настоящем изобретении. В одном из вариантов осуществления изобретения процент нефукозилированных олигосахаридов составляет по меньшей мере 50%,
предпочтительно по меньшей мере 60%-70%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 75%. Нефукозилированные олигосахариды могут быть гибридного или комплексного типа. Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления изобретения АСМ, полученная в клетках-хозяевах и с помощью 5 способов, предлагаемых в изобретении, обладает повышенным содержанием бисекционных нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области. Бисекционные нефукозилированные олигосахариды могут быть гибридными или комплексными. В частности, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно использовать для получения АСМ, в которых по меньшей мере 15%,
10 более предпочтительно по меньшей мере 20%, еще более предпочтительно по
меньшей мере 25%, еще более предпочтительно по меньшей мере 30%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 35% олигосахаридов Fc-области АСМ являются бисекционными нефукозилированными. Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также для получения полипептидов, в
15 которых по меньшей мере 15%, предпочтительно по меньшей мере 20%, более
предпочтительно по меньшей мере 25%, еще более предпочтительно по меньшей мере 30%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 35% олигосахаридов в Fc-области полипептида являются бисекционными гибридными нефукозилированными.
20 Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения является
химерная АСМ, которая имеет специфичность связывания, практически такую же, как у мышиного антитела B-Lyl, сконструированная таким образом, что она обладает повышенной эффекторной функцией и/или повышенной аффинностью к связыванию с Fc-рецептором, которую получают способами, предлагаемыми в
25 изобретении. Предпочтительно повышенная эффекторная функция представляет собой одну или несколько следующих функций: повышенная Fc-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (включая повышенную антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность), повышенный антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP), повышенная
30 секреция цитокинов, повышенное опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, повышенное связывание с NK-клетками, повышенное связывание с макрофагами, повышенное связывание с моноцитами, повышенное связывание с
полиморфноядерными клетками, повышенная непосредственная передача сигнала, индуцирующего апоптоз, повышенное перекрестное связывание связывающихся с мишенью антител, повышенное созревание дендритных клеток или повышенное Т-клеточное примирование. В предпочтительном варианте 5 осуществления изобретения повышенная аффинность к связыванию с Fc-рецептором означает повышенное связывание с активирующим Fc-рецептором, наиболее предпочтительно FcyRIIIa. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения АСМ представляет собой антитело, фрагмент антитела, содержащий Fc-область, или слитый белок, который включает область,
10 эквивалентную Fc-области иммуноглобулина. Согласно особенно
предпочтительному варианту осуществления изобретения АСМ представляет собой гуманизированное антитело.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим АСМ, предлагаемые в настоящем изобретении, и
15 фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение относится также к применению таких фармацевтических композиций в способе лечения рака. В частности, в настоящем изобретении предложен способ лечения рака, заключающийся в том, что вводят терапевтически эффективное количество фармацевтической
20 композиции, предлагаемой в изобретении.
Настоящее изобретение относится также к получению и применению систем клеток-хозяев для получения гликоформ АСМ, предлагаемых в настоящем изобретении, которые обладают повышенной аффинностью к связыванию с Fc-рецептором, предпочтительно повышенной аффинностью к
25 связыванию с активирующими Fc-рецепторами, и/или повышенными эффекторными функциями, включая антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность. Методы конструирования схем гликозилирования, которые можно использовать для АСМ, предлагаемых в настоящем изобретении, более подробно описаны в U.S. 6602684 и
30 предварительной заявке на патент США 60/441307 и в WO 2004/065540, полное содержание каждого из этих документов включено в настоящее описание в качестве ссылки. В другом варианте в АСМ, предлагаемых в настоящем изобретении, можно конструировать схемы гликозилирования, отличающиеся
пониженным содержанием фукозных остатков в Fc-области, с помощью методов, описанных в ЕР 1176195А1, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Получение клеточных линий для производства белков с измененной схемой 5 гликозилирования
В настоящем изобретении предложены системы экспрессии клеток-хозяев для получения АСМ, предлагаемых в настоящем изобретении, которые имеют модифицированные схемы гликозилирования. В частности в настоящем изобретении предложены системы клеток-хозяев для получения гликоформ
10 АСМ, предлагаемых в настоящем изобретении, которые имеют повышенную
терапевтическую ценность. Таким образом, в изобретении предложены системы экспрессии клеток-хозяев, выбранных или сконструированных для экспрессии полипептида, который обладает GnTIII-активностью. В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид, обладающий GnTIII-активностью,
15 представляет собой слитый полипептид, который содержит домен локализации в комплексе Гольджи гетерологичного присущего комплексу Гольджи полипептида. В частности, системы экспрессии клеток-хозяев можно создавать так, чтобы они содержали рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, обладающий GnTIII-активностью, функционально
20 связанную с конститутивной или регулируемой промоторной системой.
Одним из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения является клетка-хозяин, которую сконструировали для экспрессии по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый полипептид, который обладает GnTIII-активностью, и который содержит домен локализации в
25 комплексе Гольджи гетерологичного присущего комплексу Гольджи
полипептида. Следующим объектом изобретения является созданная клетка-хозяин, которая несет молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую по меньшей мере один ген, который кодирует слитый полипептид, обладающий GnTIII-активностью, и содержащую домен локализации в комплексе Гольджи
30 гетерологичного присущего комплексу Гольджи полипептида.
Как правило, любой тип культивируемой клеточной линии, включая перечисленные выше клеточные линии, можно применять в качестве основы для создания линий клеток-хозяев, предлагаемых в настоящем изобретении. В
предпочтительном варианте осуществления изобретения СНО-клетки, ВНК-клетки, NSO-клетки, 8Р2/0-клетки, клетки миеломы линии YO, клетки мышиной миеломы линии РЗХ63, PER-клетки, РЕИ-Сб-клетки или клетки гибридомы, другие клетки млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых или 5 растительные клетки используют в качестве основной клеточной линии для создания клеток-хозяев, предлагаемых в изобретении.
Изобретение относится к любым созданным клеткам-хозяевам, экспрессирующим полипептид, который обладает GnTIII-активностью, включая слитый полипептид, который несет домен локализации в комплексе Гольджи 10 гетерологичного присущего комплексу Гольджи полипептида, как он определен выше.
Одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, который обладает GnTIII-активностью, можно экспрессировать под контролем конститутивного промотора или в другом варианте регулируемой
15 экспрессионной системы. Такие системы хорошо известны в данной области, и они включают описанные выше системы. Если несколько различных нуклеиновых кислот, кодирующих слитые полипептиды, которые обладают GnTIII-активностью и содержат домен локализации в комплексе Гольджи гетерологичного присущего комплексу Гольджи полипептида, входят в систему
20 клетки-хозяина, то некоторые из них можно экспрессировать под контролем конститутивного промотора, а другие экспрессировать под контролем регулируемого промотора. Уровни экспрессии слитых полипептидов, которые обладают GnTIII-активностью, определяют методами, хорошо известными в данной области, включая анализ методом Вестерн-блотинга, методом Нозерн-
25 блоттинга, анализ экспрессии репортерного гена или определение GnTIII-активности. В альтернативном варианте можно применять лектин, который связывается с продуктами биосинтеза GnTIII, например Е4-РНА-лектин. В альтернативном варианте можно использовать функциональный анализ, который позволяет оценивать повышенную способность связываться с Fc-рецептором или
30 повышенную эффекторную функцию, опосредуемую антителами, которые получают путем создания клеток, несущих нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, обладающий GnTIII-активностью.
Идентификация трансфектантов или трансформантов, которые экспрессируют белок, имеющий модифицированную схему гликозилирования
Клетки-хозяева, которые содержат кодирующую последовательность химерной АСМ, которая имеет специфичность связывания, практически такую 5 же, как у мышиного антитела B-Lyl, и экспрессирует биологически активные генные продукты, можно модифицировать с помощью по меньшей мере четырех общих подходов, таких как: (а) гибридизация ДНК- ДНК или ДНК-РНК; (б) наличие или отсутствие функций "маркерных" генов; (в) оценка уровня транскрипции в качестве меры экспрессии соответствующих транскриптов мРНК
10 в клетке-хозяине; и (г) обнаружение генных продуктов с помощью иммунного анализа или по их биологической активности.
При использовании первого подхода присутствие кодирующей последовательности химерной АСМ, которая имеет специфичность связывания, практически такую же, как у мышиного антитела B-Lyl, и кодирующей
15 последовательности полипептида, который обладает GnTIII-активностью, можно определять с помощью гибридизации ДНК-ДНК или ДНК-РНК с использованием зондов, содержащих нуклеотидные последовательности, гомологичные соответствующим кодирующим последовательностям соответственно, или их фрагментам или производным.
20 При использовании второго подхода рекомбинантный экспрессионный
вектор/систему хозяина можно идентифицировать и отбирать по присутствию или отсутствию функций определенных "маркерных" генов (например тимидинкиназная активность, устойчивость к антибиотикам, устойчивость к метотрексату, трансформация фенотипа, образование включенных телец в
25 бакуловирусах и т.д.). Например, если кодирующая последовательность АСМ, предлагаемой в изобретении, или ее фрагмент и кодирующую последовательность полипептида, который обладает GnTIII-активностью, встраивают в последовательность маркерного гена вектора, то рекомбинантные содержащие соответствующие кодирующие последовательности можно
30 идентифицировать по отсутствию функции маркерного гена. В альтернативном варианте маркерный ген можно помещать в тандеме с кодирующими последовательностями под контроль одинаковых или различных промоторов, применяемых для контроля экспрессии кодирующих последовательностей.
Экспрессия маркера в ответ на индукцию или селекцию свидетельствует об экспрессии кодирующей последовательности АСМ, предлагаемой в изобретении, и кодирующей последовательности полипептида, который обладает GnTIII-активностью.
5 При использовании третьего подхода транскрипционную активность
кодирующей области АСМ, предлагаемой в изобретении, или ее фрагмента и кодирующей последовательности полипептида, который обладает GnTIII-активностью, можно оценивать с помощью гибридизации. Например, РНК можно выделять и анализировать с помощью Нозерн-блоттинга с
10 использованием зонда, гомологичного кодирующим последовательностям АСМ, предлагаемым в изобретении, или их фрагментам, и кодирующей последовательности полипептида, обладающего GnTIII-активностью, или ее определенного фрагмента. В альтернативном варианте общие нуклеиновые кислоты клетки-хозяина можно экстрагировать и оценивать гибридизацию с
15 указанными зондами.
При использовании четвертого подхода экспрессию белковых продуктов можно оценивать иммунологически, например с помощью Вестерн-блоттина, таких иммунологических анализов, как радиоиммунопреципитация, ферментные иммуноанализы и т.п. Однако конечный тест, позволяющий оценить
20 эффективность системы экспрессии, включает определение биологически активных генных продуктов.
Получение и применение АСМ, которые обладают повышенной эффекторной функцией, такой как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность
25 Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения
являются гликоформы химерных АСМ, которые имеют специфичность связывания, практически такую же, как у мышиного антитела B-Lyl, и обладают повышенной эффекторной функцией, включая антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность. Ранее описано создание определенной схемы
30 гликозилирования антител (см., например, U.S. 6602684, содержание которого полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки).
Клинические опыты с использованием неконъюгированных моноклональных антител (МАт) для лечения некоторых типов рака в настоящее
время дали обнадеживающие результаты (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12, 1997, cc. 223-225; Deo и др., Immunology Today 18, 1997, c. 127). Химерный неконъюгированный IgGl одобрен для применения при слабо дифференцированной или фолликулярной В-клеточной не-ходжкинской 5 лимфоме (Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12, 1997, cc. 223-225), а при
использовании другого неконъюгированного МАт, такого как гуманизированный IgGl, мишенью которого являются плотные опухоли, также получены многообещающие результаты на фазе III клинических опытов (Deo и др., Immunology Today 18, 1997, с. 127). Антигены двух указанных МАт
10 характеризуются высоким уровнем экспрессии на соответствующих опухолевых клетках, и антитела опосредуют эффективное разрушение опухоли с помощью эффекторных клеток in vitro и in vivo. В противоположность этому многие другие неконъюгированные МАт, обладающие высокой специфичностью в отношении опухолей, не обладают способностью запускать эффекторные
15 функции такого уровня, чтобы их можно было с успехом применять в
клинических целях (Frost и др., Cancer 80, 1997, сс. 317-333; Surfus и др., J. Immunother. 19, 1996, сс. 184-191). В сочетании с такими менее эффективными МАт в настоящее время оценивали дополнительную терапию с использованием цитокинов. Добавление цитокинов может стимулировать антителозависимую
20 клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) путем повышения
активности и количества присутствующих в кровотоке лимфоцитов (Frost и др., Cancer 80, 1997, сс. 317-333); Surfus и др., J. Immunother. 19, 1996, сс. 184-191). ADCC, представляющую собой литическое воздействие на меченные антителом клетки, запускают связыванием рецепторов лейкоцитов с константной областью
25 (Fc) антител (Deo и др., Immunology Today 18, 1997, с. 127).
Другой дополняющий подход к повышению ADCC-активности неконъюгированных IgGl состоит в конструировании Fc-области антитела. Опыты по конструированию белков позволили установить, что FcyR взаимодействуют с меньшей шарнирной областью СН2-домена IgG (Lund и др.,
30 J. Immunol. 157, 1996, сс. 4963-4969). Однако для связывания FcyR также
требуется присутствие олигосахаридов, ковалентно связанных с консервативным Asn 297 в СН2-области (Lund и др., J. Immunol. 157. 1996, сс. 4963-4969; Wright и Morrison, Trends Biotech. 15, 1997, сс. 26-31), это позволяет предположить
либо, что олигосахарид и полипептид оба непосредственно принимают участие в сайте связывания, либо что для поддержания активной конформации СН2-полипептида требуется олигосахарид. Таким образом, модификацию структуры олигосахарида можно применять в качестве средства повышения аффинности 5 взаимодействия.
Молекула IgG несет два N-связанных олигосахарида в Fc-области, по одному на каждой тяжелой цепи. Как любой гликопротеин антитело получают в виде популяция гликоформ, которые имеют одинаковый полипептидный каркас, но несут различные присоединенные к сайтам гликозилирования олигосахариды.
10 Олигосахариды, которые, как правило, присутствуют в Fc-области
сывороточного IgG, представляют собой комплекс олигосахаридов биантенного типа (Wormald и др., Biochemistry 36, 1997, сс. 130-138) с низким уровнем концевой сиаловой кислоты и бисекционного N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), с различными уровнями концевого галоктозилирования и корового
15 фукозилирования. В некоторых исследования высказано предположение, что для FcyR-связывания внутри олигосахаридного ядра требуется минимальная углеводная структура (Lund и др., J. Immunol. 157, 1996, сс.4963-4969).
В мышиных или хомячковых клеточных линиях, которые применяют в промышленности и научных исследованиях для получения неконъюгированных
20 терапевтических МАт, как правило, присоединяют требуемые олигосахаридные детерминанты к Fc-сайтам. IgG, экспрессируемые этими клеточными линиями, не содержат бисекционные GlcNAc, обнаруженные в небольших количествах в сывороточных IgG (Lifely и др., Glycobiology 318, 1995, сс. 813-822 ). В противоположность этому в настоящее время установлено, что некоторых из
25 гликоформ крысиного продуцируемого миеломой гуманизированного IgGl
(САМРАТН-1Н) несут бисекционный GlcNAc (Lifely и др., Glycobiology 318, 1995, сс. 813-822). Полученное из крысиных клеток антитело достигает аналогичной максимальной ADCC-активности in vitro, что и антитела САМРАТН-1Н, полученные в стандартных клеточных линиях, но при
30 использовании существенно более низких концентраций антитела.
Антиген САМРАТН обычно присутствует в невысоких концентрациях на клетках лимфомы, а соответствующее химерное МАт обладает высокой ADCC-активностью в отсутствии бисекционного GlcNAc (Lifely и др., Glycobiology 318,
1995. сс. 813-822). В N-связанном пути гликозилирования бисекционный GlcNAc добавляют с помощью GnTIII (Schachter, Biochem. Cell Biol. 64, 1986, cc. 163181).
В проведенных ранее экспериментах использовали одну 5 антителопродуцирующую линию СНО-клеток, которая ранее была создана для экспрессии под воздействием внешней регуляции различных уровней клонированного гена фермента GnTIII (Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, сс. 176-180). Этот подход прежде всего использовали для доказательства строгой корреляции между экспрессией GnTIII и ADCC-активностью
10 модифицированного антитела. Таким образом, изобретение относится к рекомбинантному химерному антителу или его фрагменту, обладающему специфичностью связывания, практически соответствующей мышиному антителу B-Lyl, которое имеет измененную схему гликозилирования в результате повышенной GnTIII-активности. Повышенная GnTIII-активность
15 приводит к повышению процентного содержания бисекционных олигосахаридов, а также к снижению процентного содержания фукозных остатков в Fc-области АСМ. Это антитело или его фрагмент обладают повышенной аффинностью к связыванию с Fc-рецептором и повышенной эффекторной функцией. Кроме того, изобретение относится к фрагменту антитела и слитым белкам, которые
20 содержат область, эквивалентную Fc-области иммуноглобулина.
Терапевтическое применение АСМ, полученных с помощью способов, предлагаемых в изобретении
АСМ, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять индивидуально для мечения и уничтожения опухолевых клеток in vivo. АСМ
25 можно использовать также в сочетании с соответствующим терапевтическим
агентом для лечения карциномы человека. Например, АСМ можно применять в сочетании со стандартными или общепринятыми методами лечения, такими как химиотерапии, лучевая терапия, или их можно конъюгировать или связывать с терапевтическим лекарственным средством или токсином, а также с
30 лимфокином или ингибирующим рост опухоли фактором для введения
терапевтического агента в область карциномы. Наиболее важными конъюгатами АСМ, предлагаемых в настоящем изобретении, являются (1) иммунотоксины (конъюгаты АСМ и цитотоксического фрагмента) и (2) меченые (например
меченные с помощью радиоактивного изотопа, меченные с помощью фермента или меченные с помощью флуорохрома) АСМ, в которых метка является средством идентификации иммунных комплексов, включающих меченую АСМ. АСМ можно применять также для индукции лизиса посредством 5 встречающегося в естественных условиях связанного с комплементом процесса и для взаимодействия с существующей в норме антителозависимой клеточно-опосредуемой цитотоксичностью.
Цитотоксический фрагмент иммунотоксина может представлять собой цитотоксическое лекарственное средство или ферментативно активный токсин
10 бактериального или растительного происхождения, или ферментативно
активный фрагмен ("А-цепь") такого токсина. Применяемые ферментативно активные токсины и их фрагменты представляют собой А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь
15 модесцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки
Phytolacca americana (PAPI, РАРП и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин и эномицин. В другом варианте осуществления изобретения АСМ конъюгируют с небольшой молекулой противоракового
20 лекарственного средства. Конъюгаты АСМ и таких цитотоксических фрагментов получают с помощью разнообразных бифункциональных белковых связывающих агентов. Примерами таких реагентов являются SPDP, IT, бифункциональные производные сложных имидоэфиров, таких как диметиладипимидатхНС1, активные сложные эфиры, такие как дисукцинимидилсуберат, альдегиды, такие
25 как глутаровый альдегид, бисазидосоединения, такие как 6ис(пара-
азидобензоил)гександиамин, производные бисдиазония, такие как бпс(пара-диазонийбензоил)этилендиамин, диизоцианаты, такие как толилен-2,6-диизоцианат, и бисактивные соединения фтора, такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. Лизирующий фрагмент токсина можно соединять с Fab-
30 фрагментом АСМ. Дополнительные приемлемые токсины известны в данной области, например, описаны в опубликованной заявке на патент США № 2002/0128448, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
В одном из вариантов осуществления изобретения химерную АСМ с сконструированной схемой гликозилирования, которая имеет специфичность связывания, практически такую же, как у мышиного антитела B-Lyl, конъюгируют с А-цепью рицина. В наиболее предпочтительном варианте А-цепь 5 рицина дегликозилируют и получают с помощью рекомбинции.
Предпочтительный метод получения иммунооксина рицина описан у Vitetta и др., Science 238, 1987, с. 1098), публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки.
При применении для уничтожения опухолевых клеток у человека in vitro
10 для диагностических целей конъюгаты, как правило, добавляют в среду для культивирования клеток в концентрации по меньшей мере примерно ЮнМ. Препаративная форма и путь введения in vitro не имеют решающего значения. Как правило, можно использовать водные композиции, которые совместимы со средой для культивирования или перфузии. Цитотоксичность можно оценивать с
15 помощью общепринятых методов, предназначенных для определения наличия или степени развития рака.
Как указано выше, цитотоксический радиофармацевтический агент, предназначенный для лечения рака, можно приготавливать путем конъюгации радиоактивного изотопа (например, I, Y, Рг) с химерной АСМ со
20 сконструированной схемой гликозилирования, которая имеет специфичность связывания, практически такую же, как у мышиного антитела B-Lyl. Подразумевается, что понятие "цитотоксический фрагмент" в контексте настоящего описания относится также к таким изотопам.
В другом варианте осуществления изобретения в липосомы вносят
25 цитотоксическое лекарственное средство и на липосомы наносят АСМ, предлагаемые в настоящем изобретении. Поскольку на поверхности злокачественных В-клеток присутствует множество молекул CD20, этот метод позволяет осуществлять введение больших количеств лекарственного средства к клеткам требуемого (правильного) типа.
30 Методы получения конъюгатов таких указанных терапевтических агентов и
антител хорошо известны (см., например Arnon и др., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer ТЪегару" в: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, под ред. Reisfeld и др., изд-во Alan R. Liss, Inc., 1985, cc. 243-256);
Hellstrom и др., " Antibodies For Drug Delivery)), в: Controlled Drug Delivery (2-oe изд.), под ред. Robinson и др., изд-во Marcel Dekker, Inc., 1987 cc. 623-653; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, под ред. Pinchera 5 и др., 1985, cc. 475-506; и Thorpe и др., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)), Immunol. Rev., 62, 1982, cc.119-158).
Другими терапевтическими применениями ACM, предлагаемых в изобретении, является конъюгация или связывание, например с помощью рекомбинантной ДНК, с ферментом, который обладает способностью
10 превращать пролекарство в цитотоксическое лекарственное средство, и
применение конъюгата антитело-фермент в сочетании с пролекарством для превращения пролекарства в цитотоксический агент в области опухоли (см., например, Senter и др., "Anti-Тштюг Effects of Antibody-alkaline Phosphatase)), Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, cc. 4842-4846; "Enhancement of the in vitro
15 and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin С and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates)), Cancer Research 49, 1989, cc. 5789-5792; и Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy", FASEB J. 4, 1990, cc. 188-193).
20 Следующим терапевтическим применением ACM, предлагаемых в
изобретении, является применение либо в неконъюгированной форме в присутствии комплемента, либо в виде фрагмента конъюгата антитело-лекарственное средство или антитело-токсин, для удаления опухолевых клеток из костного мозга страдающих раком пациентов. При таком
25 подходе аутологичный костный мозг можно очищать ex vivo обработкой антителом и возвращать мозг путем инфузии в организм пациента [см., например, Ramsay и др., "Вопе Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies)), J. Clin. Immunol., 8(2), 1988, cc. 81-88].
Изобретение относится также к одноцепочечному иммунотоксину,
30 содержащему антигенсвязывающие центры, которые обладают практически такой же специфичностью связывания, что и мышиное антитело B-Lyl (например, полипептиды, которые содержат CDR мышиного антитела B-Lyl), и содержащему также токсичный полипептид. Одноцепочечные иммунотоксины,
предлагаемые в изобретении, можно применять для лечения человеческой саркомы in vivo.
Аналогично этому для лечения человеческой саркомы in vivo можно применять слитый белок, содержащий по меньшей мере одну 5 антигенсвязывающую область АСМ, предлагаемой в изобретении, сцепленную по меньшей мере с одной функционально активной областью второго белка, обладающего противоопухолевой активностью, например лимфокином или онкостатином.
В настоящем изобретении предложен способ избирательного уничтожения
10 опухолевых клеток, экспрессирующих CD20. Этот способ предусматривает
взаимодействие иммуноконъюгата (например иммунотоксина), предлагаемого в изобретении, с указанными опухолевыми клетками. Эти опухолевые клетки могут представлять собой клетки человеческой карциномы.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения карцином
15 (например, человеческих карцином) in vivo. Этот способ заключается в том, что пациенту вводят терапевтически эффективное количество композиции, содержащей по меньшей мере один иммуноконъюгат (например иммунтоксин), предлагаемый в изобретении.
Следующим объектом изобретения является улучшенный способ лечения
20 В-клеточных пролиферативных нарушений, включая В-клеточную лимфому, а также аутоиммунного заболевания, частично или полностью вызванного патогенными аутоантителами, основой которого является В-клеточное "истощение", заключающийся в том, что человеку, который нуждается в этом, вводят терапевтически эффективное количество АСМ, предлагаемой в
25 настоящем изобретении. В предпочтительном варианте осуществления
изобретенияе АСМ представляет собой антитело к CD20 со сконструированной схемой гликозилирования, которое обладает практически такой же специфичностью связывания, что и мышиное антитело B-Lyl. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело является
30 гуманизированным. Примеры аутоиммунных заболеваний или нарушений
включают (но не ограничиваясь ими) иммунные тромбоцитопении, такие как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, дерматомиозит, хорею
Сиденгама, волчанковый нефрит, ревматическую атаку, плюригландулярные синдромы, геморрагический васкулит (болезнь Шенлейна-Геноха), нефрит после стрептококковой инфекции, нодозную эритему, артериит Такаясу, болезнь Аддисона, многоформную эритему, нодозный полиартерит, анкилозирующий 5 спонделит, синдром Гудпасчера, тромбангиит облитерирующий, первичный билиарный цирроз, тироидит Хашимото, тиротоксикоз, хронический активный гепатит, полимиозит/дерматомиозит, полихондрит, памфигит обыкновенный (pamphigus vulgaris), гранулемотоз Вегенера, мембранную нефропатию, боковой амиотрофический склероз, сухотку спинного мозга, полимиалгии, пернициозную
10 анемию, быстро прогрессирующий гломерулонефрит и фиброзный альвеолит, воспалительные реакции, такие как воспалительные кожные заболевания, включая псориаз и дерматит (например атопический дерматит); системную склеродермию и склероз; реакции, связанные с воспалительным заболеванием кишечника (такие как болезнь Крона и неспецифический язвенный колит);
15 респираторный дистресс-синдром (включая респираторный дистресс-синдром взрослых; РДСВ); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; колит; гломерулонефрит; аллергические состояния, такие как экзема и астма, и другие состояния, связанные с Т-клеточной инфильтрацией и хроническими воспалительными реакциями; атеросклероз; недостаточность адгезии
20 лейкоцитов; ревматоидный артрит; системную красную волчанку (СКВ);
сахарный диабет (например сахарный диабет типа 1 или инсулинзависимый сахарный диабет); рассеянный склероз; синдром Рейно; аутоиммунный тиреоидит; аллергический энцефаломиелит; синдром Шегрена; юношеский диабет; и иммунные реакции, связанные с острой и замедленной
25 гиперчувствительностью, опосредуемой цитокинами и Т-лимфоцитами, что
обычно наблюдается при туберкулезе, саркоидозе, полимиозите, гранулематозе и васкулите; пернициозную анемию (болезнь Аддисона); болезни, включающие диапедез лимфоцитов; воспалительное заболевание центральной нервной системы (ЦНС); синдром поражения множества органов; гемолитическую
30 анемию (включая (но не ограничиваясь ими) криоглобинемию или анемию Куумба (Coombs positive anemia); тяжелую псевдопаралитическую хромоту; заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело; заболевание, повреждающее клубочковую базальную мембрану; антифосфолипидный
синдром; аллергический неврит; болезнь Грейвса; миастенический синдром Лэмберта-Итона; буллезный пемфигоид; пузырьчатку; аутоиммунные полиэндокринопатии; болезнь Рейтера; синдром негнущегося человека; болезнь Бехчета; гигантоклеточный артериит; иммунный комплексный нефрит; IgA-5 нефропатию; IgM-полинейропатии; иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (ITP) или аутоиммунную тромбоцитопению и т.д. Согласно одному из объектов изобретения АСМ, предлагаемые в изобретении, применяют для "истощения" находящихся в кровотоке здоровых В-клеток в течения пролонгированного периода времени.
10 Настоящее изобретение можно применять для лечения пациентов, которые
могут представлять собой человека, лошадь, свинью, быка, мышь, собаку, кошку и птиц. Другие теплокровные животные также подпадают под объем настоящего изобретения.
Объектом изобретения являются также способы ингибирования роста 15 человеческих опухолевых клеток, лечения опухоли у пациента и лечение
заболевания пролиферативного типа у пациента. Эти способы заключаются в том, что пациенту вводят эффективное количество композиции, предлагаемой в изобретении.
Таким образом, очевидно, что настоящее изобретение относится к 20 фармацевтическим композициям, комбинациям и способам лечения человеческих карцином, таких как В-клеточная лимфома. Например, изобретение относится к фармацевтическим композициям, предназначенным для применения при лечении человеческих карцином, которые содержат фармацевтически эффективное количество антитела, предлагаемого в настоящем 25 изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель.
Содержащие АСМ композиции, предлагаемые в изобретении, можно вводить общепринятыми путями, включая (но не ограничиваясь ими) внутривенное, внутрибрюшинное, оральное, внутрилимфатическое введение или введение непосредственно в опухоль. Предпочтительным является внутривенное 30 введение.
Согласно одному из объектов изобретения терапевтические композиции, которые содержат АСМ, предлагаемые в изобретении, готовят в предназначенной для хранения форме путем смешения антитела, имеющего
требуемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-ое изд., под ред. Osol А., 1980), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или 5 стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и представляют собой буферы, такие как фосфатный, цитратный буферы и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид;
10 бензалконийхлорид, бензетонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый
спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и мета-крезол); низкомолекулярные (состоящие менее чем примерно из 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные
15 полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин,
глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с
20 металлами (например комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как ТWEEN , PLURONICS или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Примеры композиций АСМ в виде антител к CD20 описаны в WO 98/56418, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки. В этой публикации описана жидкая композиция, включающая
25 несколько доз, которая содержит 40 мг/мл ритуксимаба, 25мМ ацетат, 150мМ трегалозу, 0,9% бензилового спирта, 0,02% полисорбата 20, рН 5,0, минимальный срок годности которой составляет 2 года при хранении при 2-8°С. Другая содержащая антитело к CD20 представляющая интерес композиция содержит 10 мг/мл ритуксимаба в смеси, включающей 9,0 мг/мл хлорида натрия,
30 7,35 мг/мл дигидрата цитрата натрия, 0,7 мг/мл полисорбата 80 и стерильную воду для инъекций, рН 6,5. В настоящем изобретении и вместо RITUXAN(r) применяли АСМ, предлагаемую в настоящем изобретении.
Лиофилизированные композиции, адаптированные для подкожного введения, описаны в WO 97/04801. Такие лиофилизированные композиции можно восстанавливать с помощью пригодного разбавителя с получением высокой концентрации белка и восстановленную композицию можно вводить 5 подкожно подлежащему лечению млекопитающему.
Композиции, предлагаемые в изобретении, могут содержать также более одного действующего вещества, необходимого для лечения конкретного показания, которое предпочтительно обладает дополнительными видами активности, и они не оказывают отрицательного воздействия друг на друга.
10 Например, может требоваться введение дополнительного цитотоксического агента, химиотерапевтического агента, цитокина или иммуносупрессорного агента (например оказывающего действие на Т-клетки, такого как циклоспорин или антитело, связывающееся в Т-клетками, например, связывающееся с LFA-1). Эффективное количество указанных дополнительных агентов зависит от
15 количества антагониста, присутствующего в композиции, типа заболевания или нарушения или лечения и других указанных выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием тех же путей введения, которые указаны выше, или в дозе, составляющей примерно 1-99% от применяемых доз. Действующие вещества могут быть также заключены в микрокапсулы,
20 полученные, например, методами коацервации или с помощью межфазной
полимеризации, например, в микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и поли(метилметацилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидных системах для введения лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и
25 нанокапсулы), или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-ое изд., под ред. Osol А., 1980.
Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Соответствующими примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров,
30 содержащих антагонист, эти матрицы могут представлять собой изделия,
имеющие определенную форму, например, пленок или микрокапсул. Примерами матриц в препаратах с пролонгированным высвобождением являются сложные полиэфиры, гидрогели (например поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или
поли(виниловый спирт), полилактиды (U.S. 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и у-этил-Ь-глутамата, неразложимые сополимеры этилена и винилацетата, разложимые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT(tm) (инъецируемые микрокапсулы, 5 состоящие из сополимера молочной кислоты-гликолевой кислоты и леупролидацетата) и поли-0-(-)-3-гидроксимасляная кислота.
Составы, предназначенные для применения in vivo, должны быть стерильными. Для этой цели принято использовать фильтрацию через стерильные фильтрационные мембраны.
10 Композиции, предлагаемые в изобретении, могут представлять собой
различные формы лекарственных средств, включая (но не ограничиваясь ими) жидкие растворы или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, суппозитории, полимерные микрокапсулы или микропузырьки, липосомы и вводимые путем инъекции или инфузии растворы. Предпочтительная форма зависит от пути
15 введения и терапевтического применения.
Композиции, предлагаемые в изобретении, предпочтительно включают также общепринятые фармацевтически приемлемые носители и адъюванты, известные в данной области, такие как человеческий сывороточный альбумин, ионообменники, квасцы, лецитин, буферы, такие как фосфаты, глицин,
20 сорбиновая кислота, сорбат калия и соли или электролиты, такие как сульфат протамина.
Наиболее эффективный путь введения и схема приема лекарственного средства для фармацевтических композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, зависит от серьезности и течения заболевания, состояния здоровья
25 пациента и его реакции на лечение, и их определяет лечащий врач. Такие дозы композиций должны быть подобраны для каждого пациента. Однако эффективная доза композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, как правило, составляют от примерно 0,01 до примерно 2000 мг/кг.
Представленные в настоящем описании молекулы могут входить в состав
30 различных форм лекарственных средств, включая (но не ограничиваясь ими) жидкие растворы или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, суппозитории, полимерные микрокапсулы или микропузырьки, липосомы и вводимые путем
инъекции или инфузии растворы. Предпочтительная форма зависит от пути введения и терапевтического применения.
Композиции, содержащие АСМ, предлагаемую в настоящем изобретении, можно приготавливать, дозировать и вводить путями, соответствующими 5 высокоэффективной медицинской практике. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное заболевание или нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, течение болезни или нарушения, область введения агента, метод введения, схема применения и другие факторы, 10 известные практикующим специалистам-медикам. Терапевтически эффективное количество антагониста, подлежащее введению, должно определяться этими факторами.
В соответствии с общепринятыми положениями терапевтически эффективное количество антитела на дозу при парентеральном введении должно
15 составлять примерно 0,1-20 мг/кг веса тела пациента в день, при этом обычные начальные дозы применяемого антагониста составляют примерно 2-10 мг/кг.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения АСМ представляет собой антитело, предпочтительно гуманизированное антитело. Приемлемые дозы такого неконъюгированного антитела составляют, например,
20 от примерно 20 до примерно 1000 мг/м . В одном из вариантов осуществления изобретения доза антитела отличается от дозы, рекомендованной в настоящее время для RITUXAN(r). Например, пациенту можно вводить одну или несколько
доз антитела, которые существенного ниже 375 мг/м , например, доза может
составлять от примерно 20 до примерно 250 мг/м , например, от примерно 50 до
25 примерно 200 мг/м .
Кроме того, антитело можно вводить в виде одной или нескольких начальных доз с последующим введением еще одной или нескольких доз антитела, при этом дозы антитела (в мг/м2 ) в последующих дозах превышают
начальную(ые) дозу(ы) антитела (в мг/м ). Например, начальная доза может
30 составлять от примерно 20 до примерно 250 мг/м (например от примерно 50 до
примерно 200 мг/м ), а последующие дозы могут составлять от примерно 250 до
примерно 1000 мг/м .
Однако, как отмечалось выше, эти предполагаемые количества АСМ могут в значительной степени подвергаться терапевтической корректировке. Фактор, имеющий решающее значение для выбора соответствующей дозы и схемы применения лекарственного средства, является результатом, полученным с 5 помощью описанных выше параметров. Например, относительно более высокие дозы могут требоваться, прежде всего, для лечения заболеваний на начальной стадии и острых заболеваний. Для получения наиболее эффективных результатов, в зависимости от заболевания или нарушения, антагонист вводят максимально быстро к моменту появления первого симптома, диагноза,
10 проявления или возникновения заболевания или нарушения или во время ремиссии заболевания или нарушения.
АСМ, предлагаемую в настоящем изобретении, вводят с помощью приемлемых путей, включая парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное и интраназальное введение, и, если это требуется для местного
15 иммуносупрессорного лечения, вводят в область повреждения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, антагонист можно вводить с помощью импульсной инфузии, например, используя понижающиеся дозы антагониста. Предпочтительно введение дозы осуществляют путем
20 инъекций, наиболее предпочтительно внутривенных или подкожных инъекций, в частности, в зависимости от того является ли введение кратковременным или продолжительным.
Согласно изобретению в сочетании с указанными антагонистами можно вводить другие соединения, такие как цитотоксические агенты,
25 химиотерапевтические агенты, иммуносупрессоры и/или цитокины. Комбинированное введение предусматривает совместное введение с использованием различных композиций или с использованием одной фармацевтической композиции или последовательное введение в любом порядке, при этом предпочтительно в течение периода времени, когда оба (или
30 все) действующих вещества одновременно проявляют их биологическую активность.
Должно быть очевидно, что дозу композиции, предлагаемой в изобретении, которая необходима для достижения лечебного действия, можно дополнительно снижать путем оптимизации схемы приема лекарственного средства.
При практическом воплощении изобретения фармацевтический носитель 5 может представлять собой липидный носитель. Липидный носитель может представлять собой фосфолипид. Кроме того, липидный носитель может представлять собой жирную кислоту. Липидный носитель может представлять собой также детергент. В контексте настоящего описания детергент представляет собой любое вещество, которое изменяет поверхностное натяжение 10 жидкости, как правило, снижая его.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения детергент, может представлять собой неионный детергент. Примеры неионных детергентов включают (но не ограничиваясь ими) полисорбат 80 (известный также под названием Твин 80 или полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат), Brij и Тритон 15 (например Тритон WR-1339 и Тритон А-20).
В другом варианте детергент может представлять собой ионный детергент. Примеры ионных детергентов включают (но не ограничиваясь им) алкилтриметиламмонийбромид.
Кроме того, согласно изобретению липидный носитель может представлять 20 собой липосому. В контексте настоящего описания понятие "липосома"
обозначает любой связанный с мембраной пузырек, который содержит любые молекулы, предлагаемые в изобретении, или их комбинации.
Ниже изобретение проиллюстрировано более подробно с помощью примеров. Приведенные ниже препараты и примеры даны для того, чтобы 25 настоящее изобретение стало более понятным специалистам в данной области и они могли осуществить его практическое воплощение. Однако приведенные в качестве примеров варианты осуществления изобретения не ограничивают его объем, они приведены только с целью иллюстрации некоторых объектов настоящего изобретения и функционально эквивалентных способов, заявляемых 30 в изобретении. Различные модификации изобретения, помимо приведенных в
настоящем описании, должны стать очевидными специалистам в данной области после ознакомления с приведенным выше описанием и прилагаемыми к нему
чертежами. Такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения. Примеры
[Примечание: Если не указано иное, то в приведенных ниже примерах 5 нумерация положений конкретных аминокислотных остатков дана согласно системе нумерации Кэбота] Пример 1
Материалы и методы
Клонирование и экспрессия рекомбинантного антитела B-Lyl
10 Клетки гибридомы, экспрессирующие B-Lyl, выращивали в среде RPMI,
содержащей 10% FBS и 4мМ L-глутамин. Собирали 6 х 106 клеток с жизнеспособностью > 90% и выделяли общую РНК с использованием набора типа Qiagen RNAeasy midi. кДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей B-Lyl амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР. ОТ-ПЦР
15 осуществляли с использованием следующих условий: 30 мин при 50°С для
синтеза первой цепи кДНК; начальная денатурация в течение 15 мин при 95°С; 30 циклов по 1 мин при 94°С, 1 мин при 45°С, 1,5 мин при 72°С; и конечная стадия удлинения в течение 10 мин при 72°С. Ожидаемый размер ПЦР-продуктов подтверждали с помощью гель-электрофореза. ПЦР-продукты
20 клонировали в пригодных для Е. coli векторах и путем секвенирования ДНК подтверждали, что были выделены гены, кодирующие вариабельную область легкой и тяжелой цепи.
Для конструирования экспрессионных векторов для химерного B-Lyl синтетические сигнальные последовательности и соответствующие сайты
25 рестрикции сливали с вариабельными областями цепей с помощью
дополнительных ПЦР. После окончательного подтверждения правильности последовательности ДНК вариабельных областей цепей их объединяли с соответствующими константными областями человеческого IgGl. После создания генов их клонировали под контролем промотора MPSV и против хода
30 транскрипции относительно синтетического сайта полиаденилирования (polyA) с использованием двух отдельных векторов, по одному для каждой цепи, в результате чего получали плазмиду pETR1808 (экспрессионный вектор для
тяжелой цепи) и pETR1813 (экспрессионный вектор для легкой цепи). Каждый вектор нес последовательность OriP EBV.
Химерное B-Lyl конструировали путем котрансфекции клеток линии HEK293-EBNA векторами pETR1808 и pETR1813 с помощью метода 5 трансфекции, основанного на использовании фосфата кальция. Клетки линии HEK293-EBNA на экспоненциальной фазе роста трансфектировали с помощью метода трансфекции, основанного на использовании фосфата кальция. Клетки выращивали в виде адгезионных монослойных культур в Т-колбах с использованием среды для культивирования DMEM, дополненной 10% FCS, и
10 осуществляли трансфекцию, когда они достигали 50-80%-ной конфлюэнтности. Для трансфекции Т75-колбы 8 миллионов клеток высевали за 24 ч до трансфекции в 14 мл среды для культивирования DMEM, дополненной FCS (в конечной концентрации 10 об.%), 250 мкг/мл неомицина, и клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг- Для каждой
15 используемой для трансфекции Т75-колбы приготавливали раствор, содержащий ДНК, СаОг и воду, путем смешения 47 мкг общей плазмидной векторной ДНК, взятой в виде равных долей экспрессионных векторов для легкой и тяжелой цепей, 235 мкг 1М раствора СаСЛг и добавления воды до конечного объема 469 ? мкл. К этому раствору добавляли 469 мкл 50мМ HEPES, 280мМ NaCl, 1,5мМ
20 раствор Na2HPC> 4, рН 7,05, сразу перемешивали в течение 10 с и давали
выстояться при комнатной температуре в течение 20 с. Суспензию разбавляли 12 мл DMEM, дополненной 2% FCS, и вносили в колбу Т75 вместо существующей среды. Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение примерно 17-20 ч, затем среду заменяли 12 мл DMEM, 10% FCS. Для продуцирования
25 немодифицированного антитела "chB-Lyl" клетки трансфектировали только экспрессионными векторами для антитела pETR1808 и pETR1813, взятыми в соотношении 1:1. Для продуцирования антитела "chB-Lyl-ge", имеющего сконструированную схему гликозилирования, клетки котрансфектировали четырьмя плазмидами, двумя для экспрессии антитела (pETR1808 и pETR1813),
30 одной для экспрессии слитого полипептида GnTIII (pETR1519) и одной для экспрессии маннозидазы II (pCLF9), взятыми в соотношении 4:4:1:1, соответственно. В день 5 после трансфекции супернатант собирали,
центрифугировали в течение 5 мин при 1200 об/мин, а затем второй раз центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об/мин и выдерживали при 4°С.
Антитела chB-Lyl и chB-Lyl-ge очищали из супернатанта культуры с помощью трех последовательных стадий хроматографии, а именно 5 хроматографии на протеине А, катионообменной хроматографии и
гельфильтрации на Superdex 200-колонке (фирма Amersham Pharmacia), заменяя
буфер на солевой фосфатный буфер и собирая полученный на этой последней
стадии пик мономерного антитела. Концентрацию антитела определяли с
помощью спектрофотометра, измеряя абсорбцию при длине волны 280 нм.
10 Анализ олигосахаридов
Олигосахариды высвобождали ферментативным путем из антитела путем расщепления PNGa3ofiF, причем антитела либо были иммобилизованы на ПВДФ (поливинилидендифторид)-мембране, либо находились в растворе.
Полученный после расщепления раствор, содержащий высвобожденные 15 олигосахариды, либо использовали непосредственно для MALDI/TOF-MC-анализа, либо осуществляли дополнительное расщепление с помощью глюкозидазы EndoH перед приготовлением образца для MALDI/TOF-MC-анализа.
Метод высвобождения олигосахаридов для антител, иммобилизованных на
20 ПВДФ-мембране
Лунки 96-луночного планшета из ПВДФ-мембраны (типа Immobilon Р, фирма Millipore, Бэдфорд, шт. Массачусетс) смачивали 100 мкл метанола и жидкость отсасывали через ПВДФ-мембрану с помощью вакуума, создаваемого в вакуумном многомембранном коллекторе (типа Millipore, Бэдфорд, шт.
25 Массачусетс). ПВДФ-мембраны трижды промывали 300 мкл воды. Затем лунки промывали 50 мкл RCM-буфера (8М мочевина, ЗбОмМ Трис, 3,2мМ ЭДТК, рН 8,6). 30-40 мкг антитела вносили в лунку, содержащую 10 мкл RCM-буфера. Жидкость в лунке отсасывали через мембрану путем создания вакуума и мембрану последовательно дважды промывали 50 мкл RCM-буфера.
30 Восстановление дисульфидных мостиков осуществляли путем добавления 50 мкл 0,1М дитиотреитола в RCM и инкубации при 37°С в течение 1 ч.
После восстановления создавали вакуум для удаления раствора дитиотреитола из лунки. Лунки трижды промывали 300 мкл воды, после чего
осуществляли карбоксиметилирование цистеиновых остатков путем добавления 50 мкл 0,1М йодуксусной кислоты в RCM-буфере и инкубации при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин.
После карбоксиметилирования жидкость из лунок отсасывали с помощью 5 вакуума и последовательно трижды промывали 300 мкл воды. Затем ПВДФ-
мембрану блокировали для предупреждения адсорбции эндоглюкозидазы путем инкубирования 100 мкл 1%-ного водного раствора поливинилпирролидона 360 при комнатной температуре в течение 1 ч. После этого блокирующий реагент удаляли с помощью слабого вакуума и последующей трехкратной промывки 300 10 мкл воды.
N-связанные олигосахариды высвобождали путем добавления 2,5 мед пептид-Т^-гликозидазы F (рекомбинантная N-гликаназа, фирма GLYKO, Новато, шт. Калифорния) и 0,1 мед сиалидазы (фирма GLYKO, Новато, шт. Калифорния) для удаления любых возможных заряженных остатков моносахаридов в 15 конечном объеме 25 мкл в 20мМ ЫаНСОз, рН 7,0). Расщепление осуществляли в течение 3 ч при 37°С.
Метод высвобождения олигосахаридов для антител, находящихся в растворе
40-50 мкг антитела смешивали с 2,5 мед PNGa3biF (фирма Glyko, США) в 20 2мМ Трис, рН 7,0 в конечном объеме 25 мкл и смесь инкубировали в течение 3 ч при 37°С.
Использование расщепления с помощью эндоглюкозидазы Н высвобожденных с помощью PNGa3biF олигосахаридов для определения соответствия структур гибридных бисекционных олигосахаридов пикам
25 нейтральных олигосахаридов, полученных методом MALDI/TOF-MC
Высвобожденные с помощью PNGa3biF олигосахариды затем расщепляли с помощью эндогликозидазы Н (КФ 3.2.1.96). Для осуществления расщепления с помощью EndoH добавляли 15 мед EndoH (фирма Roche, Швейцария) к продукту расщепления PNGa3oftF (описанный выше метод для антитела, находящегося в
30 растворе), получая конечный объем 30 мкл, и смесь инкубировали в течение 3 ч при 37°С. EndoH осуществляет расщепление между N-ацетилглюкозаминовыми остатками хитобиозного ядра N-связанных олигосахаридов. Фермент может
расщеплять только олигоманнозу и большинство гибридных типов гликанов, в то время как олигосахариды комплексного типа не гидролизуются. Приготовление образца для MALDI/TOF-MC
Продукты ферментативного расщепления, содержащие высвобожденные 5 олигосахариды, после добавления уксусной кислоты до конечной концентрации 150мМ инкубировали еще в течение 3 ч при комнатной температуре и затем пропускали через 0,6 мл катионообменной смолы (смола AG50W-X8, гидрированная форма, 100-200 меш, фирма BioRad, Швейцария) упакованной в микро-био-спиновую хроматографическую колонку (фирма BioRad, Швейцария), 10 для удаления катионов и белков. Один микролитр полученного образца
наносили на пластину-мишень из нержавеющей стали и смешивали на пластине с 1 мкл sDHB-матрицы. SDHB-матрицу получали путем растворения 2 мг 2,5-дигидроксибензойной кислоты и 0,1 мг 5-метоксисалициловой кислоты в 1 мл смеси этанол/ЮмМ водный раствор хлорида натрия 1:1 (об./об.). Образцы 15 сушили на воздухе, наносили 0,2 мкл этанола и образцам давали окончательно перекристаллизоваться на воздухе. MALDI/TOF-MC
Для получения масс-спектров применяли MALDI-TOF-масс-спектрометр типа Voyager Elite (фирма Perspective Biosystems). Прибор работал в линейной
20 конфигурации при ускоряющем напряжении 20 кВ и с временем задержки 80 наносекунд. Для определения массы ионов применяли внешнюю калибровку с использованием олигосахаридных стандартов. Для получения окончательного спектра суммировали спектры, полученные при 200 лазерных импульсах. В-клеточное истощение цельной крови
25 Аликвоты по 495 мкл гепаринизированной крови от здорового донора в 5
мл полистироловые пробирки, добавляли по 5 мкл 100-кратно концентрированных образцов антитела (конечная концентрация 1-1000 нг/мл) или только ЗФР и пробирки инкубировали при 37°. Через 24 ч 50 мкл крови переносили в свежие пробирку и окрашивали конъюгированным с флюоресцеин-
30 изотиоцианатом (FITC) антителом к CD3, конъюгированным с РЕ
(фосфатидилэтаноламин) антителом к CD 19 и конъюгированным с CyChrome (Becton-Dickinson) антителом к CD45 в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Перед анализом в пробирки добавляли по 500 мкл FACS
буфера (ЗФР, содержащий 2% FCS и 5мМ ЭДТК). Флуоресценцию CD3-FITC и CD19-PE в образцах крови анализировали с помощью проточной цитометрии, принимая за пороговое значение флуоресценцию CD45-CyChrome. В-клеточное истощение определяли на основе графика соотношения количества CD19+ В-5 клеток и количества CD3+ Т-клеток.
Связывание антител к CD20 с клетками линии Raji
500000 клеток в 180 мкл FACS-буфера (ЗФР, содержащий 2% FCS и 5мМ ЭДТК) переносили в 5 мл полистироловые пробирки, добавляли по 20 мкл 10-кратно концентрированных образцов антитела к CD20 (конечная концентрация
10 1-5000 нг/мл) или только ЗФР и пробирки инкубировали при 4°С в течение 30
мин. Затем образцы промывали дважды FACS-буфером и пеллетировали при 300 х g в течение 3 мин. Супернатант удаляли путем аспирации и клетки растворяли в 100 мкл FACS-буфера, добавляли 1 мкл Р(аЬ')2-Р1ТС-фрагментов, специфических в отношении Fc (фирма Jackson Immuno Research Laboratories,
15 США) и пробирки инкубировали при 4°С в течение 30 мин. Образцы промывали дважды FACS-буфером и растворяли в 500 мкл FACS-буфера, содержащего 0,5 мкл/мл ингибитора протеаз (PI), для анализа с помощью проточной цитометрии. Связывание оценивали путем построения графика зависимости средней геометрической величины флуоресценции от концентраций антитела.
20 Пример 2
Подход с использованием акцептора с высокой степенью гомологии Поиск каркасного участка антитела-акцептора с высокой степенью гомологии проводили на основе сравнительного анализа белковой последовательности мышиного B-lyl и коллекцией последовательностей
25 человеческой зародышевой линии и отбора той человеческой
последовательности, которая обладала наибольшей степенью идентичности последовательности. В результате этого последовательность VH110 из базы данных VBase была выбрана в качестве акцепторной каркасной последовательности тяжелой цепи, а последовательность VK 2 40 была выбрана
30 в качестве акцепторной каркасной последовательности легкой цепи. В эти два акцепторных каркаса трансплантировали (встраивали) три гипервариабельных участка (CDR) вариабельных областей мышиной тяжелой и легкой цепи. Поскольку каркасный участок 4 не являлся частью гена вариабельной области V
зародышевой линии, сравнительный анализ для этого положения проводили индивидуально. Для тяжелой цепи выбирали участок JH4, а для легкой цепи выбирали участок JK4. Молекулярное моделирование сконструированного домена иммуноглобулина позволило выявить одно положение за пределами 5 CDR, в котором потенциально возможно заменять человеческие аминокислотные остатки на мышиные. Повторная интродукция мышиных аминокислотных остатков в человеческий каркасный участок должна вызывать так называемые обратные мутации. Например, человеческий акцепторный аминокислотный остаток в положении 27 (по Кэботу) подвергали обратной мутации с заменой на
10 остаток тирозина. Конструировали варианты гуманизированного антитела, которые либо включали, либо не включали обратные мутации. Легкая цепь гуманизированного антитела не требовала наличия никаких обратных мутаций. После создания белковых последовательностей синтезировали последовательности ДНК, кодирующие эти белки, согласно описанному ниже
15 методу.
Подход, основанный на использовании смешанного каркасного участка Для того, чтобы избежать интродукции обратных мутаций в имеющие решающее значение положения аминокислотных остатков (имеющих решающее значение для сохранения высокой аффинности в отношении связывания с
20 антигеном или функций антитела) в человеческом акцепторном каркасном участке, проводили исследование того, можно ли весь каркасный участок 1 (FR1) или каркасные участки 1 (FR1) и 2 (FR2) вместе заменять последовательностями человеческого антитела, уже несущими донорные остатки, или их функциональными вариантами, в этих важных положениях
25 встречающейся в естественных условиях человеческой последовательности
зародышевой линии. Для этой цели проводили индивидуальный сравнительный анализ каркасных участков 1 и 2 последовательности VH мышиного Blyl и человеческих последовательностей зародышевой линии. В данном случае максимально высокая степень идентичности последовательностей была не важна
30 и ее не использовали при выборе акцепторных каркасных участков, предполагалось, что вместо этого более важным являлось совпадение нескольких остатков, имеющих решающее значение. К таким имеющим решающее значение остаткам относятся остатки 24, 71 и 94 (нумерация согласно
Кэботу), а также остатки в положениях 27, 28 и 30 (нумерация согласно Кэботу), которые расположены вне CDR1 согласно Кэботу, но которые часто принимают участие в связывании с антигеном. В качестве пригодной IMGT-последовательности была выбрана VH315. После создания белковых 5 последовательностей синтезировали последовательности ДНК, кодирующие эти белки, согласно описанному ниже методу. При использовании указанного подхода для сохранения высоких уровней связывания с антигеном не требовались обратные мутации ни для легкой, ни для тяжелой цепи. Синтез генов антитела
10 После создания аминокислотной последовательности V-области
гуманизированного антитела конструировали последовательность ДНК. Данные для последовательностей ДНК индивидуальных каркасных участков получали из баз данных последовательностей человеческой зародышевой линии. Последовательности ДНК CDR-участков получали из соответствующих данных
15 мышиных кДНК. С использованием этих последовательностей создавали полную виртуальную последовательность ДНК. С учетом данных о этой последовательности ДНК в виртуальную последовательность интродуцировали диагностические сайты рестрикции, создавая путем интродукции "молчащих" мутаций сайты, распознаваемые рестриктазами. Для получения физической цепи
20 ДНК осуществляли синтез гена (например, согласно методу, описанному Wheeler и др. 1995). С помощью этого метода на основе представляющих интерес генов создавали олигонуклеотиды таким образом, что одну серию олигонуклеотидов получали из кодирующей цепи, другую серию - из некодирующей цепи. 3'- и 5'-концы каждого олигонуклеотида (за исключением
25 самого первого и самого последнего в ряду) всегда имели комплементарные
последовательности для двух праймеров, полученных из другой цепи. Когда эти олигонуклеотиды помещали в реакционный буфер, пригодный для любой
термостойкой полимеразы, и добавляли Mg , дНТФ и ДНК-полимеразу, то происходило удлинение каждого олигонуклеотида на его 3'-конце. Затем новый 30 образовавшийся 3'-конец одного праймера отжигали со следующим праймером другой цепи и проводили дальнейшее удлинение его последовательности в условиях, пригодных для зависящего от матрицы удлинения цепи ДНК. Конечный продукт клонировали в пригодном векторе для размножения в Е. coli.
Производство антител
С использованием стандартных методов молекулярной биологии лидерные последовательности человеческой тяжелой и легкой цепи (для секреции) добавляли против хода транскрипции относительно указанных выше 5 последовательностей вариабельных областей и затем их присоединяли против хода транскрипции к константной области тяжелой и легкой каппа-цепи человеческого IgGl, соответственно. Полученные полные последовательности ДНК тяжелой и легкой цепи антитела субклонировали в экспрессионных векторах млекопитающих (один для легкой цепи и один для тяжелой цепи) под
10 контролем MPSV-промотора и против хода транскрипции относительно
синтетического polyA-сайта, при этом каждый вектор нес последовательность OriP EBV как описано выше в примере 1. Антитела получали согласно методу, описанному выше в примере 1, а именно, осуществляли котрансфекцию клеток HEK293-EBNA с использованием экпрессионных векторов для тяжелой и легкой
15 цепи антитела млекопитающего, собирали кондиционированную среду для
культивирования через 5-7 дней после трансфекции и очищали секретированные антитела с помощью аффинной хроматографии на протеине А, катионообменной хроматографии и гель-фильтрации на конечной стадии с выделением чистого мономерного антитела в виде IgGl. Антитела помещали в среду, содержащую
20 25мМ фосфат калия, 125мМ хлорид натрия, ЮОмМ раствор глицина, рН 6,7. Варианты гуманизированных антител со сконструированной схемой глигозилирования получали путем котрансфекции с использованием экспрессионных векторов для антител в сочетании с экспрессионными векторами для гликозилтрансферазы GnT-III или с GnT-III-экспрессионным
25 вектором и экспрессионным вектором для маннозидазы II комплекса Гольджи, как это описано выше в примере 1 для химерного антитела. Антитела со сконструированной схемой гликозилирования очищали и приготавливали для дальнейшего анализа согласно описанному выше методу создания антител, не имеющих сконструированную схему гликозилирования. Олигосахариды,
30 присоединенные к Fc-области антитела, анализировали с помощью MALDI/TOF-MC согласно описанному ниже методу. Анализ олигосахаридов
Метод высвобождения олигосахаридов для антител, находящихся в растворе
40-50 мкг антитела смешивали с 2,5 мед PNGa3biF (фирма Glyko, США) в 2мМ Трис, рН 7,0 в конечном объеме 25 мкл и смесь инкубировали в течение 3 ч 5 при 37°С.
Приготовление образцов для MALDI/TOF-MC
Продукты, полученные в результате ферментативного расщепления, которые содержали высвобожденные олигосахариды, инкубировали еще в течение 3 ч при комнатной температуре после добавления уксусной кислоты до
10 конечной концентрации 150мМ и затем пропускали через 0,6 мл
катионообменной смолы (смола AG50W-X8, гидрированная форма, 100-200 меш, фирма BioRad, Швейцария), которой заполняли микро-био-спиновую хроматографическую колонку (фирма BioRad, Швейцария), для удаления катионов и белков. Один микролитр полученного образца наносили на пластину-
15 мишень из нержавеющей стали и смешивали на пластине с 1 мкл sDHB-матрицы. sDHB-матрицу получали путем растворения 2 мг 2,5-дигидроксибензойной кислоты и 0,1 мг 5-метоксисалициловой кислоты в 1 мл смеси этанол/1 ОмМ водный раствор хлорида натрия 1:1 (об./об.). Образцы сушили на воздухе, наносили 0,2 мкл этанола и образцам давали окончательно
20 перекристаллизоваться на воздухе. MALDI/TOF-MC
Для получения масс-спектров применяли MALDI-TOF-масс-спектрометр типа Voyager Elite (фирма Perspective Biosystems). Прибор работал в линейной конфигурации при ускоряющем напряжении 20 кВ и с временем задержки 80 25 наносекунд. Для определения массы ионов применяли внешнюю калибровку с использованием олигосахаридных стандартов. Для получения окончательного спектра суммировали спектры, полученные при 200 лазерных импульсах.
Анализ связывания с антигеном
Варианты очищенного мономерного гуманизированного антитела 30 тестировали в отношении связывания с человеческим CD20 на клетках-мишенях В-клеточной лимфомы линии Raji с помощью метода анализа, основанного на использовании проточной цитометрии, согласно процедуре, описанной выше в примере 1 для химерного антитела B-lyl.
Связывание вариантов мономерного IgGl со сконструированной схемой гликозилирования с NK-клетками и линией клеток СНО, экспрессирующих FcyRIIIA.
Человеческие NK-клетки выделяли из свежевыделенных мононуклеарных 5 клеток периферической крови (РВМС), используя для обогащения
отрицательную селекцию CD 16- и С056-позитивных клеток (система MACS, фирма Miltenyi Biotec GmbH, Бергиш Гладбах, Германия). Чистота, которую оценивали по экспрессии CD56, составляла 88-95%. Свежевыделенные NK-клетки инкубировали в ЗФР без ионов кальция и магния (3 х 105 клеток/мл) в
10 течение 20 мин при 37°С для удаления связанного с NK-клетками IgG. Клетки инкубировали до концентрации 106 клеток/мл в присутствии различных концентраций антитела к CD20 (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 мкг/мл) в ЗФР, 0,1% БСА. После нескольких отмывок связывание антитела оценивали путем инкубации с конъюгированным (1:200) с FITC Р(аЬ')2-фрагментом козьи антитела,
15 специфическим в отношении F(ab')2 человеческого IgG (фирма Jackson
ImmunoReasearch, Вест Гроу, шт. Пенсильвания, США) и античеловеческим CD56-PE (фирма BD Biosciences, Алшвил, Швейцария). Добавляли F(ab')2-фрагменты антитела к FcyRIIIA 3G8 (фирма Ancell, Байпорт, шт. Миннесота, США) в концентрации 10 мкг/мл для конкурентного связывания
20 гликозилированных вариантов антитела (3 мкг/мл). Интенсивность
флуоресценции, характеризующую варианты связанного антитела, определяли для СБ56-позитивных клеток с помощью устройства FACSCalibur (фирма BD Biosciences, Алшвил, Швейцария). СНО-клетки трансфектировали путем электропорации (280 В, 950 мкФ, 0,4 см) экспрессионным вектором,
25 кодирующим а-цепь и у-цепь FcyRIIIA-Vall58. Отбор трансфектантов проводили путем добавления 6 мкг/мл пуромицина на 106 клеток и стабильные клоны анализировали с помощью FACS с использованием 10 мкл конъюгированного с FITC моноклонального антитела к FcgammaRIII 3G8 (фирма BD Biosciences, Алшвил, Швейцария). Связывание IgGl с экспрессирующими FcgammaRIII А-
30 Vail58 СНО-клетками осуществляли аналогично описанному выше связыванию с NK-клетками.
Анализ ADCC
В качестве эффекторных клеток использовали человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), которые получали с помощью Histopaque-1077 (фирма Sigma Diagnostics Inc., Сент-Луис, шт. Миссури, 63178, США) в основном согласно инструкциям производителя. В 5 целом метод состоял в следующем. У добровольцев брали с помощью
гепаринизированных шприцев образцы венозной крови. Кровь разбавляли в соотношении 1:0,75-1,3 ЗФР (не содержащим Са++ или Mg++) и наслаивали на Histopaque-1077. Осуществляли центрифугирование в градиенте плотности при 400 х g в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ) без перерывов.
10 Промежуточную фазу, содержащую РВМС, объединяли и промывали ЗФР (50 мл на клетки, полученные после двух стадий центрифугирования в градиенте плотности) и собирали центрифугированием при 300 х g в течение 10 мин при КТ. После ресуспендирования дебриса с помощью ЗФР подсчитывали количество РВМС и промывали второй раз путем центрифугирования при 200 х
15 g в течение 10 мин при КТ. Затем клетки ресуспендировали в соответствующей среде для проведения дальнейших процедур.
Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней, которое использовали для ADCC-анализов, составляло 25:1 и 10:1 для РВМС и NK-клеток соответственно. Эффекторные клетки приготавливали в среде AIM-V в
20 соответствующей концентрации и вносили по 50 мкл на лунку в круглодонные 96-луночные планшеты. Клетки-мишени, представляли собой клетки человеческой В-лимфомы (например, клетки линии Raji), выращенные в среде DMEM, содержащей 10% ФТС. Клетки-мишени промывали ЗФР, подсчитывали и ресуспендировали в среде AIM-V до концентрации 0,3 миллиона/мл из расчета
25 30000 клеток на 100 мкл. Антитела разбавляли AIM-V, добавляли 50 мкл к
предварительно высеянным клеткам-мишеням и давали связываться с мишенями в течении 10 мин при КТ. Затем добавляли эффекторные клетки и планшет инкубировали в течение 4 ч при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2. Гибель клеток-мишеней оценивали путем измерения высвобождения
30 лактатгидрогеназы (ЛДГ) из поврежденных клеток с использованием набора для определения цитотоксичности (фирма Roche Diagnostics, Роткрейц, Швейцария). После инкубации в течение 4 ч планшеты центрифугировали при 800 х g. 100 мкл супернатанта из каждой лунки переносили в новый прозрачный
плоскодонный 96-луночный планшет. В каждую лунку добавляли по 100 мкл цветного субстратного буфера из набора. Величины Vmax цветной реакции определяли с помощью ридера для ELISA при длине волны 490 нм в течение по меньшей мере 10 мин с использованием пакета программ SOFTmax PRO (фирма 5 Molecular Devices, Саннивале, шт. Калифорния, 94089, США). Спонтанное
высвобождение ЛДГ оценивали в лунках, содержащих только клетки-мишени и эффекторные клетки, но не содержащих антитела. Максимальное высвобождение определяли в лунках, содержащих только клетки-мишени и 1% Triton Х-100. Процент специфической опосредуемой антителом гибели
10 рассчитывали по следующей формуле: ((х - SR)/(MR - SR)*100, где х обозначает среднее значение Vmax при конкретной концентрации антитела, SR обозначает среднее значение Vmax при спонтанном высвобождении и MR обозначает среднее значение Vmax при максимальном высвобождении. Анализ комплементзависимой цитотоксичности
15 Клетки-мишени подсчитывали, промывали ЗФР, ресуспендировали в среде
AIM-V (фирма Invitrogen) до концентрации 1 млн клеток/мл. Высевали по 50 мкл клеток на лунку в плоскодонный 96-луночный планшет. Приготавливали разведения антитела в AIM-V и по 50 мкл добавляли к клеткам. Антителам давали связываться с клетками в течение 10 мин при комнатной температуре.
20 Свежеоттаянный комплемент человеческой сыворотки (фирма Quidel)
разбавляли тремя объемами AIM-V и вносили по 50 мкл в лунки. Кроличий комплемент (фирма Cedarlane Laboratories) приготавливали согласно инструкциям производителя, разбавляли тремя объемами AIM-V и вносили по 50 мкл в лунки. Для контроля перед внесением в среду для анализа источники
25 комплемента выдерживали в течение 30 мин при 56°С.
Планшеты для анализа инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Уничтожение клеток оценивали путем измерения высвобождения ЛДГ. В целом метод заключался в следующем. Планшеты центрифугировали при 300 х g в течение 3 мин. Переносили по 50 мкл супернатанта на лунку в новый 96-луночный
30 планшет и добавляли по 50 мкл реагента для анализа из набора для определения цитотоксичности (фирма Roche). Путем измерения кинетических характеристик с помощью ридера для ELISA определяли величину Vmax для соответствующей
концентрации ЛДГ в супернатанте. Максимальное высвобождение определяли путем инкубирования клеток в присутствии 1% Trition Х-100. Анализ В-клеточного истощения цельной крови
Стандартное В-клеточное истощение цельной крови, вызванное антителами 5 к CD20, осуществляли согласно методу, описанному выше в примере 1. Анализ апоптоза
Способность антител вызывать апоптоз анализировали путем инкубации в течение ночи (16-24 ч) антитела в концентрации 10 мкг/мл (насыщающие условия для связывания с антигеном) с клетками-мишенями (при концентрации 10 клеток-мишеней 5 х 105 клеток/мл). Образцы окрашивали AnnV-FITC и
анализировали с помощью FACS. Анализ проводили в трех повторностях.
Обнаружение проводили с помощью проточной цитометрии путем выявления апоптозных маркеров, таких как аннексии V и фосфатидилсерин. Образцы для отрицательного контроля (без индукции апоптоза) не содержали 15 никаких антител, а содержали только забуференный фосфатом физиологический раствор. Образцы для положительного контроля (максимальный апоптоз) содержали 5мкМ сильного индуктора апоптоза камфотецина (СРТ). Результаты и обсуждение
Сравнение связывания с человеческим антигеном CD20 вариантов антитела 20 В-НН1, В-НН2, В-ННЗ либо в комплексе с легкой цепью химерного антитела В-lyl (mVL, полученного согласно методу, описанному в примере 1), либо с легкой цепью гуманизированного B-lyl (KV1), и родительского химерного антитела chB-lyl (описанного выше в примере) позволило установить, что все антитела имели близкие значения ЕС50, но конструкция В-НН1 связывалась с 25 меньшей интенсивностью/стехиометрией, чем варианты В-НН2 и В-ННЗ (фиг. 11). В-НН1 отличался от В-НН2 и В-ННЗ своими частично гуманизированными участками CDR1 и CDR2 (определение Кэбота), а также наличием полиморфизма Ala/Thr в положении 28 (нумерация согласно Кэботу). Это свидетельствует о том, что как положение 28, так полный CDR1 и/или полный 30 CDR2 являются важными для взаимодействия антитело/антиген.
Сравнение B-HL1, В-НН1 и химерного родительского антитела chB-lyl позволило установить, что у конструкции B-HL1 отсутствовала какая-либо связывающая активность, а интенсивность связывания/стехиометрия В-НН1
была примерно в два раза меньше, чем у B-lyl (фиг. 12). Как B-HL1, так и В-НН1 были сконструированы на основе акцепторных каркасных участков, выведенных из человеческих вариабельных областей VH1 -класса. Среди других различий наиболее важным является различие в положении 71 (нумерация 5 согласно Кэботу; положение 71 по Кэботу соответствует положению 72 SEQ ID N0:48) конструкции B-HL1, что указывает на его возможную важную роль в связывании с антигеном.
Из сравнения представленных на фиг. 9-13 данных о связывании с антигеном видно, что варианты BHH2-KV1, BHL8-KV1 и BHL11-KV1 обладали
10 наиболее высокой аффинностью к связыванию с человеческим CD20 на
поверхности человеческих клеток среди различных тестированных вариантов гуманизированного антитела. Различия между В-НН2, с одной стороны, и B-HL8 и B-HL11, с другой стороны, присутствуют только в FR1- и РЯ2-участках, причем все три CDR являются идентичными (что видно, например, из сравнения
15 SEQ ID NO: 32, 56 и 60, которые не пронумерованы согласно Кэботу, но для которых обычный специалист в данной области легко может установить нумерацию согласно Кэботу). Для B-HL8 и B-HL11 последовательности FR1 и FR2 выводили из последовательностей человеческой вариабельной области VH3-класса, в то время как полный каркасный участок В-НН2 выводили из
20 человеческой VH1. B-HL11 представляет собой производное B-HL8, несущее одиночную мутацию GlulGln (положение 1 является одинаковым как в нумерации согласно Кэботу, так и в стандартной системе нумерации, использованной в перечне последовательностей), при этом в конструкции В-НН2 аминокислотный остаток представляет собой Gin. Это означает, что замена
25 GlulGln не изменяет ни аффинность, ни интенсивность связывания. Другие различия между В-НН2 и B-HL8 касаются 14 остатков каркасного участка, из которых один или несколько могут оказывать влияние на способность этого антитела связываться с антигеном.
Конструкцию B-HL4 получали из антитела В-НН2 путем замены FR1 В-
30 НН2 участком последовательности VH145 человеческой зародышевой линии. Эта конструкция обладает существенно более низкой способностью к связыванию с антигеном несмотря на то, что аминокислотные различия присутствуют только в трех положениях в FR1. Эти остатки находятся в
положениях 2, 14 и 30 (нумерация согласно Кэботу). Среди них положение 30 может являться положением, оказывающим влияние, поскольку оно является частью CDR1 согласно определению Хотиа. Общий анализ всех представленных на фиг. 9-13 кривых, характеризующих связывание, показывает, что для 5 связывания с CD20 важны следующие остатки тяжелой цепи гуманизированного B-lyl (нумерация согласно Кэботу): N35 (конец CDR1 согласно Кэботу), полный CDR1 согласно Кэботу, полный CDR2 согласно Кэботу и полный CDR3 согласно Кэботу, остатки А71 и R94 (в этом случае остаток R94 не может быть заменен на треонин) и Y27. А28 и S30 также могут оказывать влияние, но в меньшей
10 степени. Кроме того, для связывания с антигеном важны CDR3 согласно Кэботу и все канонические остатки. В гуманизированную легкую цепь, в которую трансплантировали полные CDR1-, CDR2- и CDR3-y4acTKH (согласно Кэботу), не интродуцировали никаких обратных мутаций. В отношении индукции апоптоза (фиг. 14, 15 и21) наиболее эффективным вариантом оказался
15 гуманизированный вариант B-lyl BHH2-KV1 (даже более эффективным, чем исходное chB-lyl и намного более эффективным, чем антитело, имеющее последовательность, идентичную последовательности ритуксимаба, С2В8). Другими гуманизированными вариантами (производными BHL8), которые могли вызывать усиленный апоптоз, оказались: B-HL12 - B-HL17 (см. таблицу) и ВНН8
20 (смешанные каркасные участки) и ВНН9 ("смешанные каркасные участки" с одной обратной мутацией, S30T). Положения 9 и 48 (нумерация согласно Кэботу) могут контактировать с антигеном. Варианты ВНН4 - ВНН7 представляют собой другие гуманизированные варианты B-lyl, которые не несут дополнительных отличных от человеческих последовательностей.
25 Важные свойства гуманизированного антитела B-lyl обусловлены тем, что
оно представляет собой антитело типа II к CD20 согласно определению, которое дано у Cragg M.S. и Glennie M.J., Blood 103(7), апрель 2004 г., сс. 2738-2743. Вследствие этого при связывании с CD20 оно не индуцирует какой-либо устойчивости к экстракции неионными детергентами CD20 с поверхности
30 человеческих СО20+-клеток при анализе с использованием предназначенного для этой цели метода, который описан у Polyak M.J. и Deans J.P., Blood 99(9), 2002, cc. 3256-3262. Оно действительно индуцирует существенно меньшую устойчивость к экстракции неионными детергентами CD20, чем антитело С2В8
(другое антитело к CD20, имеющее последовательность, идентичную с последовательностью ритуксимаба (см. публикацию патента США № 2003 0003097 на имя Reff). Как следует ожидать для антитела типа II к CD20, гуманизированное B-lyl не обладает какой-либо значительной опосредуемой 5 комплементом литической активностью и конечно меньшей опосредуемой
комплементом литической активностью, чем антитело KCD20 С2В8 (химерный IgGl, имеющий последовательность, идентичную последовательности ритуксимаба). Другой важной особенностью гуманизированного антитела B-lyl является то, что оно обладает очень большой активностью в анализе
10 гомотипической агрегации. В этом анализе СЭ20-позитивные человеческие клетки, клетки Дауди, инкубировали в среде для культуры клеток в течение периода времени вплоть до 24 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02, в инкубаторе для клеток млекопитающих согласно подробно описанному методу (см. Deans) с антителом в концентрации 1 мкг/мл и параллельно в концентрации
15 5 мкг/мл. Для сравнения параллельно проводили контрольную инкубацию
клеток в идентичных условиях, но с использованием антитела к CD20 С2В8. В различные моменты времени, в том числе после инкубации в течение 8 и 24 ч клетки визуально обследовали с помощью микроскопа. Было установлено, что гуманизированное антитело B-lyl приводит к сильной гомотипической
20 агрегации, причем агрегаты были существенно крупнее, чем те, которые
индуцировались при добавлении контрольного антитела С2В8. Кроме того, в соответствии с тем, что антитело является антителом типа II к CD20, оно индуцировало более высокие уровни апоптоза, когда СО20-позитивные человеческие клетки инкубировали с гуманизированным антителом B-lyl, по
25 сравнению с контрольным опытом, проводимым в идентичных условиях с использованием химерного антитела в виде IgGl, С2В8, имеющего последовательность, идентичную последовательности ритуксимаба.
Варианты гуманизированного антитела со сконструированной схемой гликозилирования получали в клетках млекопитающих путем коэкспрессии
30 гликозилтрансферазы GnTIII совместно с генами антител. Это приводило к
увеличению фракции нефукозилированных олигосахаридов, присоединенных к Fc-области антител, включая бисекционные нефукозилированные олигосахариды, как это описано в WO 2004/065540 (фиг. 17-19). Антитела со
сконструированной схемой гликозилирования обладают существенно большими уровнями связывания с человеческими FcyRIII-рецепторами (фиг. 20), а также большей ADCC-активностью (фиг. 16) по сравнению с антителом с несконструированной схемой гликозилирования и по сравнению с антителом 5 С2В8. Гуманизированное антитело B-lyl оказалось также более эффективным в отношении индукции истощения человеческих В-клеток при анализе цельной крови (фиг. 16), чем контрольное антитело С2В8. Это имело место как для антитела B-lyl с несконструированной схемой гликозилирования, так и для его версии со сконструированной схемой гликозилирования. Антитело со
10 сконструированной схемой гликозилирования оказалось примерно в 1000 раз
более эффективным в отношении В-клеточного истощения при анализе цельной крови, чем контрольное антитело к CD20 С2В8. Это сравнение имеет большое значение для гуманизированных форм антитела B-lyl, как с несконструированной схемой гликозилирования, так и со сконструированной
15 схемой гликозилирования, поскольку в анализах, объединяющих оценку
зависящих от Fc-рецептора видов активности, таких как ADCC, опосредуемого комплементом лизиса и индукции апоптоза установлено, что обе формы B-lyl существенно более эффективны, чем С2В8, хотя обе формы B-lyl обладают существенно более низкой опосредуемой комплементом литической
20 активностью. Такая более высокая активность гуманизированных вариантов антитела B-lyl включает ADCC, Fc-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность и индукцию апоптоза. Кроме того, в анализе апоптоза формы этого антитела типа II к CD20 как со сконструированной схемой гликозилирования, так и с несконструированной схемой гликозилирования,
25 оказались более эффективными, причем варианты со сконструированной Fc-областью, обладающие повышенной аффинностью к связыванию с Fcy-рецепторами, оказались даже более эффективными в отношении индукции апоптоза, чем вариант с несконструированной Fc-областью, и все варианты имели более высокую эффективность, чем контрольное антитело С2В8. Точный
30 механизм повышенной гомотипической агрегации и индукции апоптоза,
опосредуемый антителом типа II к CD20 не изучен и на это важное свойство может оказывать влияние сопутствующее связывание с другими молекулами на поверхности СО20-позитивных клеток, таких как Fcy-рецепторы. Поэтому важно
продемонстрировать, что антитела типа II к CD20, у которых сконструирована их Fc-область для повышения аффинности к связыванию с Fcy-рецепторами, включая FcyRIII, и для связанного с этим повышения ADCC-активности, все еще обладают выраженной способностью индуцировать апоптоз, даже превышающей 5 способность антител с несконструированной Fc-областью, и индуцируют гомотипическую агрегацию. Индукция апоптоза важна in vivo, поскольку в организме имеются области, в которых могут находиться СО20-позитивные клетки-мишени, но где доступ к FcgammaRIII-позитивным клеткам более затруднен, чем в крови, такими областями являются, например, лимфатические
10 узлы. В таких местах индукция апоптоза антителом к CD20 сама по себе может иметь решающее значение для хорошей эффективности терапии человека с использованием антител к CD20, как при лечении злокачественных гематологических заболеваний, таких как неходжкинские лимфомы и хронический В-клеточный лимфолейкоз, так и для лечения аутоиммунных
15 заболеваний, таких как ревматоидный артрит и волчанка, посредством В-
клеточного истощения. Повышенная аффинность к связыванию с FcyRIII и более высокая ADCC гуманизированного антитела типа II к CD20 со сконструированной Fc-областью может иметь очень большое значение для таких методов лечения. Наконец, пониженная или незначительная опосредуемая
20 комплементом литическая активность этого антитела типа II к CD20, включая гуманизированные варианты и варианты со сконструированной Fc-областью, может быть важным, поскольку более высокая активация комплемента антителом к CD20 коррелирует с более сильными нежелательными побочными действиями.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ГликАрт Биотехнологи АГ
<120> Антигенсвязывающие молекулы, обладающие повышенной аффинностью к связыванию с Fc-рецептором и эффекторной функцией
<130> 1975.029РС01
<160> 78
<170> Patentln версия 3.3
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 1
Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys He Ser Cys Lys
15 10 15
Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Leu
20 25 30
Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He Gly Arg He Phe Pro Gly Asp
35 40 45
Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
50 55 60
Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly
85 90 95
Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 2 <211> 336 <212> ДНК <213> Mus sp.
<400> 2
ggacctgaac tggtgaagcc tggggcctca gtgaagattt cctgcaaagc ttctggctac gcattcagtt actcttggat gaactgggtg aaactgaggc ctggacaggg tcttgagtgg attggacgga tttttcctgg agatggggat actgactaca atgggaaatt caagggcaag gccacactga ctgctgacaa atcctccaac acagcctaca tgcaactcac cagcctgacc tctgtggact ctgcggtcta tttatgtgca agaaatgtct ttgatggtta ctggttagtt tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgca
<210> 3
<211> 103
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 3
Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser
15 10 15
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly He Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu
20 25 30
Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Gin Met Ser Asn
35 40 45
10 Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr
50 55 60
Asp Phe Thr Leu Arg He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
15 65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
85 90 95
Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100
<210> 4 <211> 309 <212> ДНК <213> Mus sp.
<400> 4
aatccagtca ctcttggaac atcagcttcc atctcctgca ggtctagtaa gagtctccta 60
catagtaatg gcatcactta tttgtattgg tatctgcaga agccaggcca gtctcctcag 120
ctcctgattt atcagatgtc caaccttgtc tcaggagtcc cagacaggtt cagtagcagt 180
gggtcaggaa ctgatttcac actgagaatc agcagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt 240
40 tattactgtg ctcaaaatct agaacttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa 300
ataaaacgg 309
45 <210> 5
<211> 15
<212> ДНК
<213> Mus sp.
50 <400> 5
tactcttgga tgaac 15
<210> 6
55 <211> 18
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<400> 6
60 ggctacgcat tcagttac 18
<210> 7
<211> 30
65 <212> ДНК
<213> Mus sp.
<400> 7
ggctacgcat tcagttactc ttggatgaac 30
<210> 8
<211> 48
<212> ДНК
75 <213> Mus sp.
<400> 8
aggtctagta
agagtctcct
acatagtaat
ggcatcactt
atttgtat
<210> 9 <211> 21 <212> ДНК <213> Mus
sp.
<400> 9 cagatgtcca
accttgtctc
<210> 10 <211> 27 <212> ДНК <213> Mus
sp.
<400> 10 gctcaaaatc
tagaacttcc
gtacacg
<210> 11 <211> 1407 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> химерная мышиная-человеческая кДНК
<400> 11 atgggttgga
gcctcatctt
gctcttcctt
gtcgctgttg
ctacgcgtgt
cctgtccgag
gtcaagctgc
agcagtctgg
acctgaactg
gtgaagcctg
gggcctcagt
gaagatttcc
120
tgcaaagctt
ctggctacgc
attcagttac
tcttggatga
actgggtgaa
actgaggcct
180
ggacagggtc
ttgagtggat
tggacggatt
tttcctggag
atggggatac
tgactacaat
240
gggaaattca
agggcaaggc
cacactgact
gctgacaaat
cctccaacac
agcctacatg
300
caactcacca
gcctgacctc
tgtggactct
gcggtctatt
tatgtgcaag
aaatgtcttt
360
gatggttact
ggttagttta
ctggggccaa
gggactctgg
tcactgtctc
tgcagctagc
420
accaagggcc
catcggtctt
ccccctggca
ccctcctcca
agagcacctc
tgggggcaca
480
gcggccctgg
gctgcctggt
caaggactac
ttccccgaac
cggtgacggt
gtcgtggaac
540
tcaggcgccc
tgaccagcgg
cgtgcacacc
ttcccggctg
tcctacagtc
ctcaggactc
600
tactccctca
gcagcgtggt
gaccgtgccc
tccagcagct
tgggcaccca
gacctacatc
660
tgcaacgtga
atcacaagcc
cagcaacacc
aaggtggaca
agaaagcaga
gcccaaatct
720
tgtgacaaaa
ctcacacatg
cccaccgtgc
ccagcacctg
aactcctggg
gggaccgtca
780
gtcttcctct
tccccccaaa
acccaaggac
accctcatga
tctcccggac
ccctgaggtc
840
acatgcgtgg
tggtggacgt
gagccacgaa
gaccctgagg
tcaagttcaa
ctggtacgtg
900
gacggcgtgg
aggtgcataa
tgccaagaca
aagccgcggg
aggagcagta
caacagcacg
960
taccgtgtgg
tcagcgtcct
caccgtcctg
caccaggact
ggctgaatgg
caaggagtac
1020
aagtgcaagg
tctccaacaa
agccctccca
gcccccatcg
agaaaaccat
ctccaaagcc
1080
aaagggcagc
cccgagaacc
acaggtgtac
accctgcccc
catcccggga
tgagctgacc
1140
aagaaccagg
tcagcctgac
ctgcctggtc
aaaggcttct
atcccagcga
catcgccgtg
1200
gagtgggaga
gcaatgggca
gccggagaac
aactacaaga
ccacgcctcc
cgtgctggac
1260
tccgacggct
ccttcttcct
ctacagcaag
ctcaccgtgg
acaagagcag
gtggcagcag
1320
gggaacgtct agcctctccc
tctcatgctc tgtctccggg
cgtgatgcat taaatga
gaggctctgc
acaaccacta
cacgcagaag
1380 1407
<210> 12 <211> 720 <212> ДНК
<213> искусственная
последовательность
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая кДНК
<400> 12 atggattttc
aggtgcagat
tatcagcttc
ctgctaatca
gtgcttcagt
cataatgtcc
agaggagaca
ttgtgctcac
ccaaactaca
aatccagtca
ctcttggaac
atcagcttcc
120
atctcctgca
ggtctagtaa
gagtctccta
catagtaatg
gcatcactta
tttgtattgg
180
tatctgcaga
agccaggcca
gtctcctcag
ctcctgattt
atcagatgtc
caaccttgtc
240
tcaggagtcc
cagacaggtt
cagtagcagt
gggtcaggaa
ctgatttcac
actgagaatc
300
agcagagtgg
aggctgagga
tgtgggtgtt
tattactgtg
ctcaaaatct
agaacttccg
360
tacacgttcg
gaggggggac
caagctggaa
ataaaacgta
cggtggctgc
accatctgtc
420
ttcatcttcc
cgccatctga
tgagcagttg
aaatctggaa
ctgcctctgt
tgtgtgcctg
480
ctgaataact
tctatcccag
agaggccaaa
gtacagtgga
aggtggataa
cgccctccaa
540
tcgggtaact
cccaggagag
tgtcacagag
caggacagca
aggacagcac
ctacagcctc
600
agcagcaccc
tgacgctgag
caaagcagac
tacgagaaac
acaaagtcta
cgcctgcgaa
660
gtcacccatc
agggcctgag
ctcgcccgtc
acaaagagct
tcaacagggg
agagtgttag
720
<210> 13 <211> 468 <212> PRT
40 <213> искусственная последовательность <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид 45 <400> 13
Met Gly Trp Ser Leu He Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
15 10 15
Val Leu Ser Glu Val Lys Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30
55 Pro Gly Ala Ser Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Leu Arg Pro Gly Gin Gly Leu
60 50 55 60
Glu Trp He Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn
65 70 75 80
Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val
100 105 110
75 Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp
115 120 125
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys 465
<210> 14 <211> 239 <212> PRT
<213> искусственная последовательность <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 14
Met Asp Phe Gin Val Gin He He Ser Phe Leu Leu He Ser Ala Ser
15 10 15
Val He Met Ser Arg Gly Asp He Val Leu Thr Gin Thr Thr Asn Pro
20 25 30
Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser
35 40 45
Leu Leu His Ser Asn Gly He Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys
50 55 60
Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Gin Met Ser Asn Leu Val
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Arg He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp
165 170 175
Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp
180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin
210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus sp.
10 <400> 15
Tyr Ser Trp Met Asn 1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 16
Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr 1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
30 <213> Mus sp.
<400> 17
Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn
35 1 5 10
<210> 18
<211> 16
40 <212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 18
45 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly He Thr Tyr Leu Tyr
15 10 15
<210> 19
50 <211> 7
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 19
Gin Met Ser Asn Leu Val Ser 1 5
60 <210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
65 <400> 20
Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr 1 5
<210> 21
<211> 51
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<400> 21
cggatttttc ctggagatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg с 51
<210> 22
<211> 24
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<400> 22
tttcctggag atggggatac tgac 24
<210> 23
<211> 30
<212> ДНК
15 <213> Mus sp.
<400> 23
cggatttttc ctggagatgg ggatactgac 30
<210> 24
<211> 30
<212> ДНК
<213> Mus sp.
<400> 24
aatgtctttg atggttactg gttagtttac 30
30 <210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus sp.
35 <400> 25
Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
15 10 15
Gly
45 <210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus sp.
50 <400> 26
Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 27
Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
70 <213> Mus sp.
<400> 28
Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr
75 1 5 10
<210> 29
<211> 357
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 29
10 caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata caccttcagc tattcttgga tgagctgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
gcacagaaat tccaaggaag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
20 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 30
<211> 119
25 <212> PRT
<213> искусственная
<220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 30
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
45 Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Gin Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
50 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
5 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 10 115
<210> 31
<211> 357
15 <212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 31
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
30 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
35 <210> 32 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная 40 <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 32
45 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
50 20 25 30
- по -
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
5 Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
10 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
25 <210> 33
<211> 366
<212> ДНК
<213> искусственная
30 <220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 33
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
40 aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt atctgtgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagct 360
agcacc 366
<210> 34
50 <211> 119
<212> PRT
<213> искусственная
<220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид 5 <400> 34
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
15 Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
20 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
35 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 35 40 <211> 357 <212> ДНК
<213> искусственная <220>
45 <223> химерная мышиная-человеческая ДНК <400> 35
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggagcttc agtgaaggtc 60 50 tcctgcaagg tctccggata cgcgttcagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 36
10 <211> 119
<212> PRT
<213> искусственная
<220>
15 <223> химерный мышиный-человеческий полипептид
<400> 36
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
20 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
35 Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
40 85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 37 <211> 357
<212> ДНК
<213> искусственная <220>
5 <223> химерная мышиная-человеческая ДНК <400> 37
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60 10 tcctgcaagg cttccggata cgcgttcagc tattcttgga tgagctgggt gcggcaggcg 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180 aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 38 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 38
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
35 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
40 3 5 4 0 4 5
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
<210> 39
<211> 357
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 39
20 caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
30 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 40
<211> 119
35 <212> PRT
<213> искусственная
<220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 40
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp He Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
15 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
20 us
<210> 41
<211> 357
25 <212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК <400> 41
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tctcgtgggt gcggcaggcg 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
40 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
45 <210> 42
<211> 119
<212> PRT
<213> искусственная
50 <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид
<400> 42
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
15 Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
20 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
35 <210> 43
<211> 357
<212> ДНК
<213> искусственная
40 <220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 43
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggcgcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata caccttcaca tacagctgga tgaactgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
50 aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca
<210> 44 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 44
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 45
<211> 357
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК <400> 45
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggcgcctc agtgaaggtc
tcctgcaagg cttccggata caccttcagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggcc
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca
<210> 46 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 46
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 47
<211> 357
<212> ДНК
10 <213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК 15 <400> 47
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttccggata caccttcacc tattcttgga tgcactgggt gcggcaggcc 120 20 cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180 gcacagaaat tccaaggaag agtcacaatg acacgggaca cgtccacttc caccgtctat 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 48
30 <211> 119
<212> PRT
<213> искусственная
<220>
35 <223> химерный мышиный-человеческий полипептид
<400> 48
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
40 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Gin Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
15 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
20 <211> 357
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
25 <223> химерная мышиная-человеческая ДНК <400> 49
gaggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggggccac cgtgaagatc 60
30 tcctgcaagg tgtccggata caccttcacc tattcttgga tgcactgggt gcagcaggcc 120
cctggaaagg ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
gcagagaaat tccaaggaag agtcacaatc acagccgaca cgtccactga caccgcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aaccaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 50 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 50
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Thr Val Lys He Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser
20 25 30
Trp Met His Trp Val Gin Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
15 Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
20 85 90 95
Ala Thr Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 51 <211> 357 <212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК <400> 51
40 gaggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggggccac cgtgaagatc 60 tcctgcaagg tgtccggata caccttcacc tattcttgga tgaactgggt gcagcaggcc 120 cctggaaagg ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggaag agtcacaatc acagccgaca cgtccactga caccgcctat 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aaccaatgtc 300 50 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 52 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 52
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Thr Val Lys He Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Gin Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 53
<211> 366
<212> ДНК
<213> икусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 53
cagatgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaaga ccgggagttc agtgaaggtc
tcctgcaagg cttccggata caccttcacc tattcttgga tgagctgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
gcacagaaat tccaaggaag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
10 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagct 360
agcacc 366
15 <210> 54 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная 20 <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 54
25 Gin Met Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser
30 20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Gin Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
45 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
50 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 55
<211> 357
<212> ДНК
<213> искусственная
10 <220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 55
gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacatttagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggct 120 cctggaaagg gcctcgagtg ggtgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180 20 aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 56 <211> 119 <212> PRT 30 <213> искусственная
<220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид 35 <400> 56
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
45 Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
10 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 57
<211> 456
<212> ДНК
20 <213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК 25 <400> 57
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60
cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca 120
30 agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgtg cagcctctgg attcgcattc agctattctt 180
ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240
ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300
acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360
tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420
40 ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 58
<211> 119
45 <212> PRT
<213> искусственная
<220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 58
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
10 35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
25 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 30 115
<210> 59
<211> 357
35 <212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 59
caggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacatttagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggct 120
cctggaaagg gcctcgagtg ggtgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
50 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 60 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 60
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 61
<211> 456
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 61
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60
cagcagccac aggagctcac tccgaagtgc agctcgtgga gtctggagca ggcttggtca 120
agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180
ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240
10 ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300
acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360
tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420
ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 62
20 <211> 119
<212> PRT
<213> искусственная
<220>
25 <223> химерный мышиный-человеческий полипептид
<400> 62
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
30 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
45 Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
50 85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
5 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 63 10 <211> 456 <212> ДНК
<213> искусственная <220>
15 <223> химерная мышиная-человеческая ДНК <400> 63
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60 20 cagcagccac aggagctcac tccgaagtgc agctcgtcga gtctggagga ggcgtggtca 120 agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180 ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240
ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300 acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360 30 tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420 ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
35 <210> 64 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная 40 <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 64
45 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
50 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
5 Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
10 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
25 <210> 65
<211> 456
<212> ДНК
<213> искусственная
30 <220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 65
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60
cagcagccac aggagctcac tccgaagtgc agctggtcga gtccggagga ggcttgaaga 120
agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180
40 ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240
ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300
acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360
tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420
ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 66 <211> 119
<212> PRT
<213> искусственная <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 66
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Lys Lys Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 67 <211> 456 <212> ДНК
<213> искусственная <220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК <400> 67
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca
agcctggctc ttccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180
ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240
ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300
acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360
10 tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420
ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
15 <210> 68 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная 20 <220>
<22 3> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 68
25 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
30 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
45 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
50 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 69
<211> 456
<212> ДНК
<213> искусственная
10 <220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 69
cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60
cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca 120
agcctggcgg gtccctgcgg gtcagctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180
20 ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240
ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300
acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360
tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420
ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 70 <211> 119 <212> PRT
<213> искусственная <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 70
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
45 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
50 35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
5 Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
10 85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 71
<211> 456
<212> ДНК
<213> искусственная
<220>
<223> химерная мышиная-человеческая ДНК
<400> 71
30 cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60 cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca 120 agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180
ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240 ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300 40 acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360 tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420 ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456
<210> 72 <211> 119 <212> PRT 50 <213> искусственная
<220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 72
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 73
<211> 57
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 73
atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc
<210> 74
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
Met Asp Trp Thr Trp Arg He Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
15 10 15
5 Ala His Ser
<210> 75 10 <211> 345 <212> ДНК
<213> искусственная <220>
15 <223> химерная мышиная-человеческая ДНК <400> 75
gatatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 60 20 attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120 tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc 180 tctggcgtcc ctgaccggtt ctccggatcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300 tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgta cggtg 345
<210> 76 <211> 115 <212> PRT
<213> искусственная <220>
<223> химерный мышиный-человеческий полипептид <400> 76
Asp He Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 10 15
45 Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly He Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
50 35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Gin Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
Arg Thr Val 115
<210> 77
<211> 66
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 77
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc aggtgt
<210> 78
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 78
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
15 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys 20
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Гуманизированная антигенсвязывающая молекула типа II к CD20,
включающая:
5 (а) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID N0:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID N0:42, SEQ ID N0:44 и SEQ ID N0:46; и (b) вариабельную область KV1 легкой цепи SEQ ID N0:76.
2. Гуманизированная антигенсвязывающая молекула типа II к CD20,
10 включающая:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID N0:62, SEQ ID N0:64, SEQ ID N0:66, SEQ ID N0:68, SEQ ID N0:70 и SEQ ID N0:72; и
(b) вариабельную область KV1 легкой цепи SEQ ID N0:76.
15 3. Гуманизированная антигенсвязывающая молекула типа II к CD20,
включающая вариабельную область тяжелой цепи, имеющую определяющие специфичность остатки вариабельной области тяжелой цепи антигенсвязывающей молекулы по п. 1 или п. 2, где указанная антигенсвязывающая молекула индуцирует высокие уровни апоптоза при
20 инкубации с СО20-позитивными клетками человека по сравнению с контролем в идентичных условиях с использованием С2В8 химерного IgGl антитела с последовательностью идентичной ритуксимабу.
4. Выделенный полинуклеотид, кодирующий вариабельную область
25 тяжелой цепи по любому из п.п. 1-3.
5. Выделенный полинуклеотид, кодирующий вариабельную область
тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность по меньшей мере
на 80% идентичную вариабельной области тяжелой цепи по любому из п.п. 1-3.
6. Гуманизированная антигенсвязывающая молекула типа II к CD20,
включающая вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую нуклеиновой
кислотой по п. 5 и вариабельную область KV1 легкой SEQ ID N0:76, где
указанная антигенсвязывающая молекула индуцирует высокие уровни апоптоза при инкубации с СО20-позитивными клетками человека по сравнению с контролем в идентичных условиях с использованием С2В8 химерного IgGl антитела с последовательностью идентичной ритуксимабу.
7. Вектор экспрессии, включающий полинуклеотид по п. 4 или п. 5.
8. Выделенная клетка-хозяин, включающая вектор экспрессии по п. 7.
10 9. Способ получения гуманизированного антитела типа II к CD20 по
любому из п.п. 1-3 и 6, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 8 в условиях позволяющих экспрессию указанной антигенсвязывающей молекулы и выделение это антигенсвязывающей молекулы из этой культуры.
15 10. Гуманизированная антигенсвязывающая молекула типа II к CD20, где
антигенсвязывающая молекула производится клеткой-хозяном по п. 8.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая антигенсвязывающую молекулу по любому из п.п. 1-3, 6 и 10 или полученную с помощью способа по
20 п. 9 и фармацевтически приемлемый носитель
12. Применение антигенсвязывающей молекулы по любому из п.п. 1-3, 6 и 10 или полученной способом по п. 8, для получения лекарственного средства для лечения В-клеточных расстройств.
13. Применение по п. 12, где В-клеточным расстройством является В-клеточная лимфома.
14. Применение антигенсвязывающей молекулы по любому из п.п. 1-3, 6 и
30 10 или полученной способом по п. 8, для получения лекарственного средства для
лечения расстройств, которые можно излечить истощением В-клеток.
15. Применение по п. 14, где указанным расстройством является
злокачественная опухоль кровеносной системы или аутоиммунная болезнь.
16. Применение по п. 15, где указанной злокачественной опухолью
5 кровеносной системы является не-Ходжинская лимфома или В-клеточная
хроническая лейкоцитарная лейкемия.
17. Применение по п. 1, где указанным аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит или волчанка.
18. Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. 1-3, 6 и 10 или полученная способом по п. 9, где указанная антигенсвязывающая молекула, включает подвергнутый гликоинжинерингу Fc участок.
15 19. Антигенсвязывающая молекула по одному из п.п. 1-3, 6 и 10 или
полученная способом по п. 9, где указанная антигенсвязывающая молекула имеет во фракции повышенное количество нефукозилированных олигосахаридов, присоединенных к Fc участку.
20 20. Антигенсвязывающая молекула по п. 18, где указанная
антигенсвязывающая молекула имеет во фракции повышенное количество бисекционных нефукозилированных олигосахаридов, присоединенных к Fc участку.
25 21. Антигенсвязывающая молекула по п. 18, где указанная
антигенсявзывающая молекула имеет достаточно высокие уровни связывания с рецепторами FcgammaRIII по сравнению с антигенсвязывающей молекулой, которая не подвергнута гликоинжинерингу.
30 22. Антигенсвязывающая молекула по п. 18, где указанная
антигенсвязывающая молекула имеет достаточно высокие уровни ADCC активности по сравнению с антигенсвязывающей молекулой, которая не подвергнута гликоинжинерингу.
Линкер
GAGGTCAAGC TGCAGCAGTC T CTCCAGTTCG ACGTCGTCAG A E V К L Q Q S
Начало SEQ ID N0:1 (аминокислотная последовательность) и SEQ ID N0:2 (нуклеотидная последовательность)
GGACCTGAA CTGGTGAAGC CTGGGGCCTC AGTGAAGATT TCCTGCAAAG CTTCTGGCTA CGCATTCAGT TACTCTTGGA CCTGGACTT GACCACTTCG GACCCCGGAG TCACTTCTAA AGGACGTTTC GAAGACCGAT GCGTAAGTCA ATGAGAACCT G P E LVK PGA SVKI SCK ASG YAPS Y S W
> > B-Lyl vh.
101 TGAACTGGGT GAAACTGAGG CCTGGACAGG GTCTTGAGTG GATTGGACGG ATTTTTCCTG GAGATGGGGA TACTGACTAC AATGGGAAAT TCAAGGGCAA ACTTGACCCA CTTTGACTCC GGACCTGTCC CAGAACTCAC CTAACCTGCC TAAAAAGGAC CTCTACCCCT ATGACTGATG TTACCCTTTA AGTTCCCGTT
MNW VKLR PGQ GLE WIGR IFP GDG DTDY NGK FKG
> B-Lyl vh >
201 GGCCACACTG ACTGCTGACA AATCCTCCAA CACAGCCTAC ATGCAACTCA CCAGCCTGAC CTCTGTGGAC TCTGCGGTCT ATTTATGTGC AAGAAATGTC
CCGGTGTGAC TGACGACTGT TTAGGAGGTT GTGTCGGATG TACGTTGAGT GGTCGGACTG GAGACACCTG AGACGCCAGA TAAATACACG TTCTTTACAG
"KATL TAD KSS NTAY MQL TSL TSVD SAV YLC ARNV
> B-Lyl vh >
3 01 TTTGATGGTT ACTGGTTAGT TTACTGGGGC CAAGGGACTC TGGTCACTGT CTCTGCA
AAACTACCAA TGACCAATCA AATGACCCCG GTTCCCTGAG ACCAGTGACA GAGACGT
FDG YWL VYWG QGT LVT VSA
> B-Lyl vh "
ФИГ. 1
Линкер
HphI
1 GACATTGTGC TCACCCAAAC TACA
CTGTAACACG AGTGGGTTTG ATGT
DIV LTQ TT
> >
Начало SEQ ID NO:l (аминокислотная последовательность) и SEQ ID N0:2 (нуклеотидная последовательность) MslI
+
AATCCA GTCACTCTTG GAACATCAGC TTCCATCTCC TGCAGGTCTA GTAAGAGTCT CCTACATAGT AATGGCATCA TTAGGT CAGTGAGAAC CTTGTAGTCG AAGGTAGAGG ACGTCCAGAT CATTCTCAGA GGATGTATCA TTACCGTAGT
N P VTL GTS ASIS С R S SKS L L В S N G I
B-Lyl v.l >
BseRI
Mmel
101 CTTATTTGTA TTGGTATCTG CAGAAGCCAG GCCAGTCTCC TCAGCTCCTG ATTTATCAGA TGTCCAACCT TGTCTCAGGA GTCCCAGACA GGTTCAGTAG GAATAAACAT AACCATAGAC GTCTTCGGTC CGGTCAGAGG AbTCGAGGAC TAAATAGTCT ACAGGTTGGA ACAGAGTCCT CAGGGTCTGT CCAAGTCATC
TYL YWYL QKP GQS PQLL I Y Q MSN LVSG VPD RFS
> B-Lyl v.l >
BtsI Aflin
201 CAGTGGGTCA GGAACTGATT TCACACTGAG AATCAGCAGA GTGGAGGCTG AGGATGTGGG TGTTTATTAC TGTGCTCAAA ATCTAGAACT TCCGTACACG
GTCACCCAGT CCTTGACTAA AGTGTGACTC TTAGTCGTCT CACCTCCGAC TCCTACACCC ACAAATAATG ACACGAGTTT TAGATCTTGA AGGCATGTGC
SSGS GTD FTL RISR VSA EDV GVYY CAQ NLE LPYT
> B-Lyl v.l >
301 TTCGGAGGGG GGACCAAGCT GGAAATAAAA CGG
AAGCCTCCCC CCTGGTTCGA CCTTTATTTT GCC
FGG GTK LEIK R
> B-Lyl v.l "
1 2 3 4 5
средняя геометрическая величина флуоресценции
ФИГ. 3
ФИГ. 4
1 ATGGGTTGGA GCCTCATCTT TACCCAACCT CGGAGTAGAA
MOW S L I
> >
Sap I
GCTCTTCCTT GTCGCTGTTG CGAGAAGGAA CAGCGACAAC L L F L V A V
Mlul
CTACGCGTGT GATGCGCACA
A T R
B-Lyl
PStl
CCTGTCCGAG GTCAAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAACTG GTGAAGCCTG
GGACAGGCTC CAGTTCGACG TCGTCAGACC TGGACTTGAC CACTTCGGAC
VLSE VKL QQS GPEL VKP
h.c >
SEQ ID N0:11 (нуклеотидная последовательность) и SEQ ID N0:13 (аминокислотная последовательность)
101 GGGCCTCAGT GAAGATTTCC
CCCGGAGTCA CTTCTAAAGG
GAS V К I S
Hindlll
TGCAAAGCTT CTGGCTACGC ACGTTTCGAA GACCGATGCG С К A S G Y
ATTCAGTTAC
TAAGTCAATG
A F S Y
B-Lyl
TCTTGGATGA AGAACCTACT
S W M
h.c
StuI
ACTGGGTGAA ACTGAGGCCT GGACAGGGTC TTGAGTGGAT TGACCCACTI TGACTCCGGA CCTGTCCCAG AACTCACCTA NWV KLRP GQG LEW
201 TGGACGGATT TTTCCTGGAG
ACCTGCCTAA AAAGGACCTC
1 G R I F P G
> .
ATGGGGATAC TGACTACAAT GGGAAATTCA AGGGCAAGGC CACACTGACT GCTGACAAAT. CCTCCAACAC AGCCTACATG
TACCCCTATG ACTGATGTXA CCCTTTAAGT TCCCGTTCCG GTGTGACTGA CGACTQTTTA GGAGGTTGTG TCGGATGTAC
DGD T D Y N GKF KGK ATLT A D К SSN TAYM
B-Lyl h.C >
301 CAACTCACCA GCCTGACCTC GTTGAGTGGT CGGACTGGAG Q L T S L T
PshAI
TGTGGACTCT GCGGTCTATT TATGTGCAAG AAATGTCTTT GATGGTTACT GGTTAGTTTA CTGGGGCCAA GGGACTCTGG
ACACCTGAGA CGCCAGATAA ATACACGTTC TTTACAGAAA CTACCAATGA CCAATCAAAT GACCCCGGTT CCCTGAGACC
SVDS A V Y L С A RNVF D G У WLV YWGQ GTL
B-Lyl h.c >
Hhel
PstI
401 TCACTGTCTC TGCAGCTAGC ACCAAGGGCC CATCGGTCTT CCCCCTGGCA СССГССТССА AGAGCACCTC TGGGGGCACA GCGGCCCTGG QCTGCCTGGT AGTGACAGAG ACGTCGATCG TGGTTCCCGG GTAGCCAGAA GGGGGACCGT GGGAGGAGGT TCTCGTGGAG ACCCCCGTGT CGCCGGGACC CGACGGACCA
V T V SAAS TKG PSV FPLA PSS KST SGGT A A L GCL
> B-Lyl h.c >
501 CAAGGACTAC TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TCAGGCGCCC
GTTCCTGATG AAGGGGCTTG GCCACTGCCA CAGCACCTTG AGTCCGCGGG
VKDY PPE PVT VSWN 3 G A
> B-Lyl
601 TACTCCCTCA GCAGCGTGGT GACCGTGCCC TCCAGCAGCT TGGGCACCCA ATGAGGGAGT CGTCGCACCA CTGGCACGGG AGGTCGTCGA ACCCGTGGGT
YSL SSV VTVP SSS LGT
> B-Lyl
701 AGAAAGCAGA GCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCACACATG CCCACCGTGC
TCTTTCGTCT CGGGTTTAGA ACACTGTTTT GAGTGTGTAC GGGTGGCACG
К К A EPKS CDK THT CPPC
> ' B-Lyl
801 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACATGCGTGG
TGGGTTCCTG TGGGAGTACT AGAGGGCCTG GGGACTCCAG TGTACGCACC
KPK.D TLM ISR TPEV T С V
> B-Lyl
901 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTA CTGCCGCACC TCCACGTATT ACGGTTCTGT TTCGGCGCCC TCCTCGTCAT
DGV EVH NAKT KPR EEQ
> B-Lyl
10 01 GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGCCCTCCCA
CCGACTTACC GTTCCTCATG TTCACGTTCC AGAGGTTGTT TCGGGAGGGT
W L NT GKEY К С К VSN KALP
> B-Lyl
TGACCAGCGG CGTGCACACC TTCCCGGCTG TCCTACAGTC CTCAGGACTC
ACTGGTCGCC GCACGTGTGG AAGGGCCGAC AGGATGTCAG GAGTCCTGAG
LTS GVHT PPA'VLQ SSGL
h.c >
GACCTACATC TGCAACGTGA ATCACAAGCC CAGCAACACC AAGGTGGACA
CTGGATGTAG ACGTTGCACT TAGTGTTCGG GTCGTTGTGG TTCCACCTGT
QTYI С N V NHK PSNT KVD
h.c... >
Ahdl
CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA GGTCGTGGAC TTGAGGACCC CCCTGGCAGT CAGAAGGAGA AGGGGGGTTT
PAP ELL GGPS VFL FPP
h.c >
TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA CTGGTACGTG
ACCACCTGCA CTCGGTGCTT CTGGGACTCC AGTTCAAGTT GACCATGCAC
VVD VSHE DPS VKF NWYV
h.c >
CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT
GTTGTCGTGC ATGGCACACC AGTCGCAGGA GTGGCAGGAC GTGGTCCTGA
YUST Y R V VSV LTVL HQD
h.c >
GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC CGGGGGTAGC TCTTTTGGTA GAGGTTTCGG TTTCCCGTCG GGGCTCTTGG
API EKT ISKA KGQ PRB
h.c >
SEQ ID N0:11 (нуклеотидная последовательность) и SEQ ID N0:13 (аминокислотная последовательность)
Smal
н--
1101 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA TGAGCTGACC AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA CATCGCCGTG
TGTCCACATG TGGGACGGGG GTAGGGCCCT ACTCGACTGG TTCTTGGTCC AGTCGGACTG GACGGACCAG TTTCCGAAGA XAGG3TCGCT GTAGC3GCAC
PQVY T L P PSR DELT KNQ VSL T С L V К G F Y P S DIAV
> B-Lyl h.c >
1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC CGTGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG CTCACCCTCT CGTTACCCGT CGGCCTCTTG TTGATGTTCT GGTGCGGAGG GCACGACCTG AGGCTGCCGA GGAAGAAGGA GATGTCGTTC GAGTGGCACC
EWB SNG QPEN NYK TTP PVLD SDG S F F LYSK LTV
> ..B-Lyl h.c >
Sapl
SEQ ID NO: 11 (нуклеотидная последовательность) и SEQ ID N0:13 (аминокислотная последовательность)
1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG TGTTCTCGTC CACCGTCGTC CCCTTGCAGA AGAGTACGAG GCACTACGTA CTCCGAGACG TGTTGGTGAT GTGCGTCTTC TCGGAGAGGG ACAGAGGCCC
DKS RWQQ GNV FSC SVMH EAL HNH YTQK SLS LSP
> B-Lyl h.c > si
1401 TAAATGA ATTTACT G К -
> ....> > B-Lyl h.c.
1 ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TATCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT CATAATGTCC AGAGGAGACA TTGTGCTCAC CCAAACTACA AATCCAGTCA TACCTAAAAG TCCACGTCTA ATAGTCGAAG GACGATTAGT CACGAAGTCA GTATTACAGG TCTCCTCTGT AACACGAGTG GGTTTGATGT TTAGGTCAGT
MDF QVQ IISF LLI SAS VIMS RGD I V L TQTT NPV
> > B-Lyl l.C >
PstI PstI
+- +
101 CTCTTGGAAC ATCAGCTTCC ATCTCCTGCA GGTCTAGTAA GAGTCTCCTA CATAGTAATG GCATCACTTA TTTGTATTGG TATCTGCAGA AGCCAGGCCA GAGAACCTTG TAGTCGAAGG TAGAGGACGT CCAGATCATT CTCAGAGGAT GTATCATTAC CGTAGTGAAT AAACATAACC ATAGACGTCT TCGGTCCGGT
TLG ISAS ISC RSS KSLL HSN GIT Y L Y W YLQ KPG
> B-Lyl l.C >
2 01 GTCTCCTCAG CTCCTGATTT ATCAGATGTC CAACCTTGTC TCAGGAGTCC CAGACAGGTT CAGTAGCAGT GGGTCAGGAA CTGATTTCAC ACTGAGAATC
CAGAGGAGTC GAGGACTAAA TAGTCTACAG GTTGGAACAG AGTCCTCAGG GTCTGTCCAA GTCATCGTCA CCCAGTCCTT GACTAAAGTG TGACTCTTAG
QSPQ LLI YQM SNLV SGV PDR FSSS GSG T DF T L R I
> B-Lyl l.C >
Xbal BsiWI
-+ -+
3 01 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTGGGTGTT TATTACTGTG CTCAAAATCT AGAACTTCCG TACACGTTCG GAGGGGGGAC CAAGCTGGAA ATAAAACGTA
TCGTCTCACC TCCGACTCCT ACACCCACAA ATAATGACAC GAGTTTTAGA TCTTGAAGGC ATGTGCAAGC CTCCCCCCTG GTTCGACCTT TATTTTGCAT
SRV E A E DVGV YYC A Q N LELP YTF GGG TKLE IKR
> - B-Lyl 1-е >
XranI
+
4 01 CGGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG
GCCACCGACG TGGTAGACAG AAGTAGAAGG GCGGTAGACT ACTCGTCAAC TTTAGACCTT GACGGAGACA ACACACGGAC GACTTATTGA AGATAGGGTC
TVA APSV F1F PPS DEQL KSG TAS VVCL LNN FYP
> B-Lyl l.c . .>
5 01 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC
TCTCCGGTTT CATGTCACCT TCCACCTATT GCGGGAGGTT AGCCCATTGA GGGTCCTCTC ACAGTGTCTC GTCCTGTCGT TCCTGTCGTG GATGTCGGAG
REAR VQW X. V D 3JALQ SGN SQE SVTE QDS KDS TYSL
> B-Lyl l.c ^
SEQ ID N0:12 (нуклеотидная последовательность) и SEQ ID NO: 14 (аминокислотная последовательность)
SacI
601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT
701
TCGTCGTGGG ACTGCGACTC GTTTCGTCTG ATGCTCTTTG TGTTTCAGAT
SST L T L SKAD У E К H К V
> B-Lyl
TCAACAGGGG AGAGTGTTAG
AGTTGTCCCC TCTCACAATC
FUR G E С -
> . . . .B-Lyl l.C > >
GCGGACGCTT CAGTGGGTAG TCCCGGACTC GAGCGGGCAG TGTTTCTCGA
YACE VTH QGL SSPV TKS
l.c >
SEQ ID N0:12 (нуклеотидная последовательность) и SEQ ID N0:14 (аминокислотная последовательность)
ФИГ. 6Б
10/26
CDR1 (Кэбот):
TACTCTTGGATGAAC SEQ ГО NO: 5
TyrSerTrpMetAsn SEQ Ш NO: 15
CDR1 (Хотия):
GGCTACGCATTCAGTTAC SEQ ID NO: 6
GlyTyrAlaPheSerTyr SEQ JD NO: 16
CDRl (MAT):
GGCTACGCATTCAGTTACTCTTGGATGAAC SEQ ID NO: 7
GlyTyrAlaPheSerTyrSerTrpMetAsn SEQ ED NO: 17
CDR2 (Кэбот):
CGGATTTTTCCTGGAGATGGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGGC SEQ Ш NO: 21
AxgnePheProGlyAspGlyAspThrAspTyrAsnGlyLysPheLysGly SEQ ID NO: 25
CDR2 (Хотия):
TTTCCTGGAGATGGGGATACTGAC SEQ ID NO: 22
PheProGlyAspGlyAspThrAsp SEQ ID NO: 26
CDR2 (MAT):
ШСАТТТТТССТСаАОАТООООАТАСТОАС SEQ ID NO: 23
ArgDePheProGlyAspGlyAspThrAsp SEQ Ш NO: 27
CDR2 (Кэбот, Хотиа, ACM):
AATGTCTTTGATGGTTACTGGTTAGTTTAC SEQ ID NO: 24
АзпУа1Р11еА8р01уТугТфЬеиУа1Туг SEQ ED NO: 28
CDRl (Кэбот):
AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTACATAGTAATGGCATCACTTATTTGTAT SEQ ID NO: 8
ArgSerSerLysSerLeuLeuHisSerAsnGlylleThrTyrEveuTyr SEQ ID NO: 18
CDR2 (Кэбот):
CAGATGTCCAACCTTGrCTCA SEQ ED NO: 9
GlnMetSerAsnLeuValSer SEQ Ю NO: 19
CDR3 (Кэбот):
GCTCAAAATCTAGAACTTCCGTACACG SEQ ID NO: 10
AlaGhiAsnLeuGluLeuProTvrThr SEQ ID NO: 20
ФИГ. 7
относительные величины в процентах
ФИГ. 8A
10-
W "*" Ж " Ж aft,
Масса (m/z)
1545.6725 1546.8231
1542.6703
1720.2
1960Ј
¦ 20835030
1.8 EM
-0 2201Л
Масса (m/z)
Связывание различных гуманизированных антител к CD20 с В-клетками линии Raji
§¦ 0.01 0.1 1 10 100
концентрация Ат (мкг/мл)
0.01 0.1 1 10
концентрация Ат (мкг/мл)
Апоптоз мононуклеарных клеток Z-138, вызываемый антителами к CD20
о н
N + > й й
100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00
без
антитела
С2В8 chB-lyl
ВНН2-BKV1
BHL8-BKV1
СРТ
антитело (в концентрации 10 мкг/мл)
PR-1 (линия клеток DLBCL)
Z-138 (мононуклеарная линия клеток)
В-клеточное истощение цельной крови здоровых доноров
ADCC при использовании в качестве клеток-мишеней клеток линии Raji
концентрация Ат (нг/мл)
1009.790 1.059.163 ИЮЛЯ 1ШЛ15 1184.807 1200.375 1257.423 1282.443 1298.459 13 №.489 1339.483 136X427 1367.634 13*4.540 1444.530 1460.498 1467.512 1485334 1501551 L519.406 L546JS37 1606.571 161! .539 1629.564 1647.587 1663.590 1681.563 1Ш.633 1768.635 1783.605 1S09.640
относительная интенсивность l (1 1 о l i
4 4 J 0 3 1 0 0 4 2 1
ioo
0 7 1 1
S9 I 1 2 3 1
mlz
х104~
2.5-
2.0-
1.5-
1.0-
0.5
1200
1400
дай 2S2 "да г-~ш
3(c) гаю Л
1600
$g s
3Ј? со
2000
mfe
m/z
относительная
интенсивность
1257,631
1298.623
1442.684
1460.695
14S5.716
1501.689
152A.699
1647.725
1663,724
100
1679.695
16SS.775
1697,752
1738.663
1799.732
1809.785
1825.7S6
1841.784
1850.815
1971.847
19S7.827
2001.644
rrt/2
1257.359 1339.449 14S5.5S9 1501.551 1517.533 1542.596 1558.568 1647.641 1663.614 1679,588 1688.642 1704.6Д9 1809.630 1825,546 1850.641
относительная интенсивность
31 16 23 2
100 8 5
32 4
31 б-5 I
Связывание Ат с FcyRIII на поверхности СНО-СБ16-клеток
200
концентрация антитела (микрограммы/мл)
Апоптоз, вызываемый антителами к CD20
линия клеток лимфомы клеток мантии Z-138
+ зо ->
X 25 Н О
о 20 -| X X
й 15 -10 -5 0
1 *"
С2В8
BHH2-KV1
BHH2-KV1g1
BHH2KV1g2
ОТЧЕТ О ПАТЕНТНОМ ПОИСКЕ
(статья 15(3) ЕАПК и правило 42
Номер евразийской заявки: 201300481
Дата подачи: 05 ноября 2004 (05,11,2004) Дата испрашиваемого приоритета: 05 ноября 2003 (05.11.2003)
Название изобретения: Антитела, обладающие повышенной аффинностью к связыванию с FC-рецептором и
эффекторной функцией
Заявитель:
ГЛИКАРТ БИОТЕХНОЛОГИ АГ
I | Некоторые пункты формулы не подлежат поиску (см. раздел I дополнительного листа) | | Единство изобретения не соблюдено (см. раздел II дополнительного листа)
А. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРЕДМЕТА ИЗОБРЕТЕНИЯ:
С07К16/28 C12N15/13 C12N15/63 C12N5/10 А61К 39/395 А61Р 35/00 А61Р 37/00 (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)
Согласно Международной патентной классификации (МПК) или национальной классификации и МПК
Б. ОБЛАСТЬ ПОИСКА:
Минимум просмотренной документации (система классификации и индексы МПК)
С07К 16/18, C12N 15/13, 15/63, 5/10, А61К 39/395, А61Р 35/00, 37/00
Другая проверенная документация в той мере, в какой она включена в область поиска:
В. ДОКУМЕНТЫ, СЧИТАЮЩИЕСЯ РЕЛЕВАНТНЫМИ
Категория*
Ссылки на документы с указанием, где это возможно, релевантных частей
Относится к пункту №
WO 2003/068821 А2 (IMMUNOMEDICS, INC. et al.) 21.08.2003, реферат, с.50, 61-63, п.п. 1, 17, 35, 36, 40, 52, 75, 96 формулы
BY JAMES М. FORAN et al. European Phase II Study of Rituximab (Chimeric Anti-CD20 Monoclonal Antibody) for Patients With Newly Diagnosed Mantle-Cell Lymphoma, and Small B-Cell Lymphocytic Lymphoma, Journal of Clinical Oncology, 2000, Vol. 18, No. 2, pp. 317-324
US 2003/0175884 Al (PABLO UMANA et al.) 18.09.2003, реферат, п.п. 1, 20-28, 37 формулы
1-22
1-22
18-22
* Особые категории ссылочных документов: "А" документ, определяющий общий уровень техники "Е" более ранний документ, но опубликованный на дату
подачи евразийской заявки или после нее "О" документ, относящийся к устному раскрытию, экспонированию и т.д.
"Р" документ, опубликованный до даты подачи евразийской
заявки, но после даты испрашиваемого приоритета "D" документ, приведенный в евразийской заявке
"X'
"Y"
"L"
более поздний документ, опубликованный после даты приоритета и приведенный для понимания изобретения документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмету поиска, порочащий новизну или изобретательский уровень, взятый в отдельности
документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмету поиска, порочащий изобретательский уровень в сочетании с другими документами той же категории
документ, являющийся патентом-аналогом
документ, приведенный в других целях
Дата действительного завершения патентного поиска:
25 сентября 2013 (25.09.2013)
Наименование и адрес Международного поискового органа: Федеральный институт промышленной собственности
РФ, 123995,Москва, Г-59, ГСП-5, Бережковская наб., д. 30-1.Факс: (499) 243-3337, телетайп: 114818 ПОДАЧА
Уполномоченное лицо :
Телефон № (499) 240-25-91
О.Шанова
(1)
(19)
(19)
- 2 -
- 2 -
- 5 -
- 6 -
131
- 8 -
- 8 -
-11 -
- 10 -
- 13 -
- 13 -
- 15 -
-16 -
- 18 -
- 18 -
-45 -
- 44 -
-48 -
-48 -
- 49 -
- 49 -
- 101 -
- 100 -
- 101 -
- 102 -
- 103 -
104 -
- 103 -
104 -
- 103 -
104 -
- 103 -
104 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 107 -
- 107 -
- 107 -
- 107 -
- 107 -
- 107 -
- 107 -
- 107 -
- 107 -
- 107 -
- 108
- 108
- 108
- 108
- 109 -
- 109 -
- Ill -
- Ill -
- 112 -
- 112 -
- 113 -
- 113 -
- 113 -
- 113 -
- 114 -
- 114 -
- 114 -
- 114 -
- 114 -
- 114 -
- 115 -
- 115 -
-116 -
-116 -
- 117 -
- 117 -
-119-
-119-
- 120 -
- 120 -
- 120 -
- 120 -
- 121 -
- 122 -
- 121 -
- 122 -
- 123 -
- 122 -
- 125 -
- 125 -
- 126 -
- 126 -
- 127 -
- 127 -
- 128 -
- 128 -
- 129 -
- 130 -
- 131 -
- 130 -
- 133
- 132 -
- 133
- 132 -
- 133
- 132 -
- 133
- 134 -
- 133
- 134 -
- 135 -
- 135 -
- 136 -
- 136 -
- 136 -
- 136 -
- 136 -
- 136 -
- 137 -
- 138 -
- 137 -
- 138 -
- 140 -
- 140 -
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 5A
ФИГ. 5A
ФИГ. 5A
ФИГ. 5A
ФИГ. 5A
ФИГ. 5A
ФИГ. 5A
ФИГ. 5A
ФИГ. 5A
ФИГ. 5A
ФИГ. 5Б
ФИГ. 5Б
ФИГ. 5 В
ФИГ. 5 В
ФИГ. 6A
ФИГ. 6A
ФИГ. 8Б
ФИГ. 8Б
ФИГ. 8B
ФИГ. 8B
ФИГ. 9
ФИГ. 9
ФИГ. 14
ФИГ. 14
ФИГ. 14
ФИГ. 14
ФИГ. 14
ФИГ. 14
ФИГ. 15
ФИГ. 15
ФИГ. 15
ФИГ. 15
ФИГ. 16
ФИГ. 16
ФИГ. 16
ФИГ. 16
ФИГ. 17
ФИГ. 17
ФИГ. 17
ФИГ. 17
ФИГ. 18
ФИГ. 18
ФИГ. 19
ФИГ. 19
ФИГ. 20
ФИГ. 20
ФИГ. 21
ФИГ. 21
ФИГ. 21
ФИГ. 21
ФИГ. 21
ФИГ. 21