[**]

В заявке описано антитело, которое связывается с TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR3H вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 8, 16 или 24, которое можно применять для лечения рака или аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.

(57) Реферат / Формула:

В заявке описано антитело, которое связывается с TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR3H вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 8, 16 или 24, которое можно применять для лечения рака или аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.

---

Евразийское (21) 201300418 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/24 (2006.01)
2013.09.30
(22) Дата подачи заявки
2011.09.30
(54) АНТИТЕЛА К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ TWEAK И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
10186536.8 2010.10.05 EP
PCT/EP2011/067070
WO 2012/045671 2012.04.12
Заявитель:
Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH)
Изобретатель:
Бенер Моника, Кнётген Хендрик, Нивёнер Йенс (DE)
Представитель:
Веселицкая И.А., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Белоусов Ю.В., Куликов А.В., Кузнецова Е.В. (RU)
(57) В заявке описано антитело, которое связывается с TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR3H вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO: 8, 16 или 24, которое можно применять для лечения рака или аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориа-тического артрита, заболеваний мышц, например мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
116516
15 Заявка №201300418
Заявитель Ф.Хоффманн-Ля Рош АГ, СН
АНТИТЕЛА К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ TWEAK И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
20 Настоящее изобретение относится к антителам к человеческому TWEAK
(анти-TWEAK антитела), способам их получения, фармацевтическим композициям, которые содержат указанные антитела, и вариантам их применения.
Предпосылки создания изобретения
25 Человеческий TWEAK (UniProtKB 043508, TNF-подобный слабый
индуктор апоптоза; SEQ ID NO: 60) представляет собой ассоциированный с клеточной поверхностью трансмембранный белок типа II. TWEAK описан у Chicheportiche Y. и др., J. Biol. Chem. 272, 1997, сс. 32401-32410; Marsters S.A. и др., Curr. Biol. 8, 1998, сс. 525-528; Lynch C.N. и др., J. Biol. Chem. 274, 1999, cc.
30 8455-8459. Активная форма TWEAK представляет собой растворимый
гомотример. Установлено, что последовательности связывающихся с рецептором доменов человеческого и мышиного TWEAK идентичны на 93%. TWEAK-рецептор Fnl4 (индуцируемый фактором роста фибробластов белок, 14 кДа)
представляет собой состоящий из 129 аминокислот (ак) трансмембранный белок типа I, лигандсвязывающий домен которого состоит из одного индивидуального богатого цистеином домена в. Передача сигналов TWEAK происходит посредством активации пути NF-KB. мРНК TWEAK экспрессируется в различных тканях, и она обнаружена в большинстве основных органов типа сердца, головного мозга, скелетной мышцы и поджелудочной железы, в тканях, связанных с иммунной системой, типа селезенки, лимфатических узлов и тимуса. мРНК Fnl4 обнаружена в сердце, головном мозге, легком, плаценте, эпителиальных клетках (ЭК) сосудов и гладкомышечных клетках. Мыши, у которых "выключен" TWEAK (TWEAK-нуль) и Fnl4 (Рп14-нуль), являются жизнеспособными, здоровыми и фертильными, у них выше содержание естественных клеток-киллеров и для них характерен повышенный врожденный воспалительный ответ. TWEAK принимает участие в апоптозе, пролиферации, ангиогенезе, он присутствует в области "ишемической полутени", обнаружен при церебральном отеке, рассеянном склерозе.
Антитела к TWEAK упоминаются в WO 1998/005783, WO 2000/042073, WO 2003/086311, WO 2006/130429, WO 2006/130374, WO 2006/122187, WO 2006/089095, WO 2006/088890, WO 2006/052926.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к антителу, связывающемуся с человеческим TWEAK, отличающемуся тем, что содержит CDR3-участок вариабельной области тяжелой цепи (CDR3H), выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 16 или 24.
Изобретение относится к химерному, гуманизированному или с истощенным Т-клеточным эпитопом варианту антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 1, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 5, антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 9, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 13, или антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 17 и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 21.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело отличается тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 6, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 7, и CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 8.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело 5 отличается тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 14, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 15, и CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 16.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело
отличается тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 22, CDR2H,
имеющий SEQ ID NO: 23, и CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 24.
10 Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело
отличается тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 6, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 7, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 8, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 2, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 3, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 4.
15 Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело
отличается тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 14, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 15, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 16, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 10, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 11, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 12.
20 Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело
отличается тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 22, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 23, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 24, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 18, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 19, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 20.
25 Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело
отличается тем, что содержит в качестве последовательности вариабельной области легкой цепи последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 56 или 58. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело
30 отличается тем, что содержит в качестве последовательности вариабельной
области тяжелой цепи последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 57 или 59.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело отличается тем, что содержит в качестве последовательности вариабельной области легкой цепи последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36, и в качестве 5 последовательности вариабельной области тяжелой цепи последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48.
Предпочтительной является комбинация вариабельных областей легких и тяжелых цепей, выбранная из группы, состоящей из: 1/5, 9/13, 17/21, 25/37,
10 26/38, 27/39, 28/40, 29/41, 30/42, 31/43, 32/44; 33/45, 34/46, 35/47; 36/48, 56/57, 58/59 (где, например, 17/21 обозначает антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 17, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 21).
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело,
15 которое связывается с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 6, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 7, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 8, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 2, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 3, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 4.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело,
20 которое связывается с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 14, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 15, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 16, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 10, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 11, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 12.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело,
25 которое связывается с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 22, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 23, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 24, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 18, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 19, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 20.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело,
30 которое связывается с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит а) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 27, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 41,6) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 27, и вариабельную область тяжёлой
цепи, имеющую SEQ ID NO: 44, в) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 27, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 45, г) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 26, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 47, д), 5 вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 29, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 44, е) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 31, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 45, или ж) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 29, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 10 41.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, которое связывается с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит а) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 27, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 41,6) вариабельную
15 область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 27, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 44, в) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 27, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 45, г) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 26, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 47, д) вариабельную
20 область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 29, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 44, е) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 31, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 45, ж) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 29, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 41, или з)
25 вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 29, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 39.
Антитело
SEQ ID No:
29, 41
29, 39
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, которое связывается с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит а) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 27, и 5 вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 41,6) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 27, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 45, в) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 29, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 44, г) вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 29, и
10 вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 41, или д)
вариабельную область легкой цепи, имеющую SEQ ID NO: 29, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую SEQ ID NO: 39.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, которое связывается с TWEAK и отличается тем, что содержит указанные выше
15 аминокислотные последовательности и фрагменты аминокислотных
последовательностей, представляет собой человеческое антитело изотипа IgGl, которое в одном из вариантов осуществления изобретения имеет мутации L234A + L235A. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, которое связывается с TWEAK и отличается тем, что содержит указанные выше
20 аминокислотные последовательности и фрагменты аминокислотных
последовательностей, представляет собой человеческое антитело изотипа IgG4, предпочтительно с мутациями S228P и L235E.
Антитело, предлагаемое в изобретении, специфически связывается с человеческим TWEAK и предпочтительно характеризуется по данным Biacore-
25 анализа временем полужизни комплекса, образованного растворимым мышиным TWEAK (аминокислоты 81-225 SEQ ID NO: 61) и антителом, составляющим 15 мин или более при 25°С, и связывается с мышиным TWEAK и ингибирует взаимодействие между мышиным TWEAK и Fnl4, что характеризуется величиной IC50, составляющей 4,9 нг/мл или менее.
Предпочтительно антитело, предлагаемое в изобретении, характеризуется по данным Biacore-анализа временем полужизни комплекса, образованного растворимым человеческим TWEAK (аминокислоты 99-249 SEQ ID NO: 60) и антителом, составляющим 100 мин или более, предпочтительно ПО мин или 5 более при 25°С. Антитела к TWEAK, характеризующиеся указанным временем полужизни, являются наиболее предпочтительными для применения при лечении аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например, мышечной дистрофии., рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации 10 костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
Предпочтительно антитело, предлагаемое в изобретении, ингибирует взаимодействие между человеческим TWEAK и Fnl4, что характеризуется величиной IC50 3,5 нг/мл или менее, предпочтительно 2,5 нг/мл или менее. В 15 контексте настоящего описания IC50 означает количество антитела, которое блокирует на 50% взаимодействие между человеческим TWEAK и Fnl4.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой человеческое антитело изотипа IgGl, в одном из вариантов осуществления изобретения с мутациями L234A + L235A. В одном из вариантов осуществления 20 изобретения антитело представляет собой человеческое антитело изотипа IgG4, предпочтительно с мутациями S228P и L235E. Предпочтительно антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело.
Следующим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая антитело, предлагаемое в 25 изобретении.
Следующим вариантом осуществления изобретения является применение антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления фармацевтической композиции.
Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело, 30 предлагаемое в изобретении, предназначенное для приготовления
лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических
заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело, 5 предлагаемое в изобретении, предназначенное для приготовления лекарственного средства для лечения аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации костной ткани при множественной 10 миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
Следующим вариантом осуществления изобретения является антитело, предлагаемое в изобретении, предназначенное для приготовления лекарственного средства для лечения рака ободочной кишки, легкого или 15 поджелудочной железы.
Следующим вариантом осуществления изобретения является применение антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например, 20 мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
Следующим вариантом осуществления изобретения является применение 25 антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации костной ткани при множественной 30 миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
Следующим вариантом осуществления изобретения является применение антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного
средства, предназначенного для лечения рака ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы.
Следующим вариантом осуществления изобретения является нуклеиновая
кислота, которая кодирует антитело, предлагаемое в изобретении.
5 Следующим вариантом осуществления изобретения является нуклеиновая
кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, предлагаемого в изобретении.
Изобретение относится также к экспрессионным векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, которые обладают
10 способностью экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в
прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, и к клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы, которые предназначены для получения с помощью методов рекомбинации указанного антитела.
Изобретение относится также к прокариотической или эукариотической
15 клетке-хозяину, содержащей вектор, предлагаемый в изобретении.
Изобретение относится также к способу получения рекомбинантного человеческого или гуманизированного антитела, предлагаемого в изобретении, отличающемуся тем, что экспрессируют нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и
20 выделяют указанное антитело из указанной клетки или супернатанта клеточной культуры. Изобретение относится также к антителу, которое можно получать с помощью указанного метода рекомбинации.
Установлено, что антитела, предлагаемые в изобретении, оказывают благоприятное действие на пациентов, нуждающихся в направленной на TWEAK
25 терапии. Антитела, предлагаемые в изобретении, обладают новыми и
обладающими признаками изобретения свойствами, оказывая благоприятное действие на пациента, страдающего раковым заболеванием, прежде всего страдающего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим
30 артритом, заболеваниями мышц, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, заболеваниями костей, например, дегенерацией костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением.
Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, заболеваниями мышц, например, мышечной 5 дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, заболеваниями костей, например, дегенерацией костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением, заключающемуся в том, что вводят пациенту, у которого диагностировано указанное заболевание (и который, следовательно,
10 нуждается в такой терапии) в эффективном количестве предлагаемое в изобретении антитело, которое связывается с TWEAK. Антитело вводят предпочтительно в фармацевтической композиции.
Следующим вариантом осуществления изобретения является способ лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки,
15 легкого или поджелудочной железы, или аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, заболеваниями мышц, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, заболеваниями костей, например, дегенерацией костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным
20 нефритом и сосудистым повреждением, отличающийся тем, что вводят пациенту антитело, предлагаемое в изобретении.
Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или аутоиммунными
25 заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом,
заболеваниями мышц, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, заболеваниями костей, например, дегенерацией костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением, и для
30 приготовления фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении.
Кроме того, изобретение относится к способу приготовления фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, которая
содержит антитело, предлагаемое в изобретении, необязательно в сочетании с
буфером и/или адъювантом, которые можно применять для приготовления
препаративных форм антител для фармацевтических целей.
5 Изобретение относится также к фармацевтической композиции, которая
содержит антитело, предлагаемое в изобретении, в фармацевтически
приемлемом носителе. В одном из вариантов осуществления изобретения
фармацевтическая композиция может быть включена в изделие или набор.
Краткое описание чертежа
10 На чертеже показано:
на фиг. 1 - данные об ингибировании индуцированного коллагеном
артрита, представляющего собой мышиную модель ревматоидного артрита
(mCIA), с помощью антител, предлагаемых в изобретении.
Подробное описание изобретения
15 Понятие "антитело" относится к различным формам структур антител,
включая (но, не ограничиваясь ими) полные антитела, биспецифические антитела и фрагменты антител. Антитело, предлагаемое в изобретении, предпочтительно представляет собой гуманизированное антитело, химерное антитело или также созданное с помощью генной инженерии антитело, если оно 20 сохраняет отличительные признаки, предлагаемые в изобретении.
Понятие "фрагменты антитела" относится к части полноразмерного антитела, предпочтительно к его вариабельной области или по меньшей мере к его антигенсвязывающему центру. Примерами фрагментов антител являются димерные антитела (диабоди), молекулы одноцепочечных антител и 25 мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Антитела формата scFv описаны, например, у Houston J.S., Methods in Enzymol. 203, 1991, сс. 46-88. Кроме того, фрагменты антитела представляют собой одноцепочечные полипептиды, связывающиеся с TWEAK, которые имеют характеристики Ун-области, а именно, обладают способностью объединяться с Уь-областью, или 30 VL-области, а именно, обладают способностью объединяться с Ун-областью с образованием функционального антигенсвязывающего центра.
Понятия "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" в контексте настоящего описания относятся к препарату,
содержащему молекулы антитела, которые имеют одинаковый состав аминокислот.
Понятие "гуманизированное антитело" относится к антителам, в которых каркасный участок или "гипервариабельные участки" (CDR) модифицированы 5 таким образом, что они содержат CDR иммуноглобулина из других видов по сравнению с родительским иммуноглобулином. В предпочтительном варианте осуществления изобретения кроличий CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела, получая "гуманизированное антитело" (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс. 323-327; и Neuberger M.S. и
10 др., Nature 314, 1985, сс. 268-270).
Понятие "химерное антитело" относится к моноклональному антителу, содержащему мышиную вариабельную область, т.е. связывающую область, и по меньшей мере одну часть константной области из другого источника или других видов, как правило, полученному с помощью методов рекомбинантной ДНК.
15 Химерные антитела содержат, например, мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Такие мышиные/человеческие химерные антитела представляют собой продукт экспрессированных генов иммуноглобулина, которые содержат ДНК-сегменты, кодирующие вариабельные области крысиного иммуноглобулина, и ДНК-сегменты, кодирующие
20 константные области человеческого иммуноглобулина. Другие формы "химерных антител", подпадающие под объем настоящего изобретения, представляют собой такие формы, в которых класс или подкласс модифицирован или заменен относительно исходного антитела. Такие "химерные" антитела обозначают также как "антитела переключенного класса". Методы получения
25 химерных антител включают общепринятые методы, основанные на применении рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые в настоящее время хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855; US №№ 5202238 и 5204244).
Понятие "антитело с "истощенным" (элиминированным) Т-клеточным
30 эпитопом относится к антителам, которые были модифицированы с целью устранения или снижения иммуногенности путем удаления человеческих Т-клеточных эпитопов (пептидные последовательности в белках, которые обладают способностью связываться с молекулами ГКГ класса II). С помощью
этого метода идентифицируют взаимодействия между боковыми цепями аминокислот пептида и специфических "карманов", которые связываются со связывающим желобком молекул ГКГ класса П. Идентифицированные иммуногенные области подвергают мутациям для элиминации иммуногенности. 5 Такие методы в целом описаны, например, в WO 98/52976.
Понятия "антитело к TWEAK" и "антитело, которое специфически связывается с TWEAK" согласно изобретению относятся к антителу, которое обладает способностью связываться с TWEAK с достаточной аффинностью, что позволяет применять антитело в качестве предлагаемого в изобретении 10 терапевтического агента для направленного воздействия на TWEAK. Антитело, которое специфически с TWEAK, характеризуется константой диссоциации (Kd)
-9 -9-13
10 М или менее, например, от 10 М до 10 М.
Понятие "вариабельная область (вариабельный домен)" (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)) В контексте
15 настоящего описания в каждом случае обозначает каждую из пары областей легких и тяжелых цепей, которые непосредственно принимают участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные области легких и тяжелых цепей имеют некоторую общую структуру, и каждая область содержит 4 каркасных участка (FR), последовательности которых являются
20 высококонсервативными, связанных тремя "гипервариабельными участками" (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки принимают р-складчатую конформацию, а CDR-участки могут формировать петли, соединяющие Р-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживаются в виде трехмерной структуры с помощью каркасных участков и
25 формируют с CDR-участками другой цепи антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепи антитела играют очень важную роль в специфичности связывания/аффинности антител, предлагаемых в изобретении, и вследствие этого являются дополнительным объектом изобретения.
Понятие "антигенсвязывающий участок (центр) антитела" в контексте
30 настоящего описания относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Антигенсвязывающий участок антитела содержит аминокислотные остатки из "гипервариабельных участков" или "CDR". "Каркасные" или "FR"-y4acTKH представляют собой участки
вариабельных областей, остатки которых отличны от остатков гипервариабельного участка, как они определены в настоящем описании. Таким образом, вариабельные области легких и тяжелых цепей антитела содержат в направлении от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. 5 CDR3 тяжелой цепи представляет собой основной участок, который главным образом обеспечивает связывание с антигеном и определяет свойства антитела. К CDR- и FR-участкам относятся участки, которые определяют согласно стандартной нумерации Кэбота и др. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health,
10 Bethesda, MD, 1991) и/или остатки из "гипервариабельной петли".
Понятие "CDR1H" относится к CDR1-участку вариабельной области тяжелой цепи, определенному согласно нумерации Кэбота. CDR2L, CDR3H и т.д. означают соответствующие участки тяжелой (Н) или легкой (L) цепи. Например, антитело, отличающееся тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ
15 ID NO: 6, означает, что антитело содержит эту аминокислотную
последовательность в качестве CDR1-участка вариабельной области тяжелой цепи в своей вариабельной области тяжелой цепи. Например, антитело, отличающееся тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 6, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 7, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 8, означает, что
20 антитело содержит в его тяжелой цепи в качестве последовательности CDR1
SEQ ID NO: 6, в качестве последовательности CDR2 SEQ ID NO: 7 и в качестве последовательности CDR3 SEQ ID NO: 8.
Понятия "нуклеиновая кислота" или "молекула нуклеиновой кислоты" в контексте настоящего описания относятся к молекулам ДНК и молекулам РНК.
25 Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или
двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.
Понятие "аминокислота" в контексте настоящего описания обозначает группу встречающихся в естественных условиях карбокси-ос-аминокислот, таких как аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R),
30 аспарагин (asn, N), аспарагиновая кислота (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gin, Q), глутаминовая кислота (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, К), метионин (met, М),
фенилаланин (phe, F), пролин (pro, P), серии (ser, S), треонин (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
Нуклеиновая кислота "функционально связана", когда она находится в функциональной связи с другой нуклеиновой кислотой. Например, ДНК 5 предпоследовательности или лидерной секреторной последовательности
функционально связана с ДНК полипептида, если при ее экспрессии образуется предбелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; или сайт связывания
10 рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что облегчает трансляцию. Как правило, понятие "функционально связан" означает, что последовательности ДНК, будучи связаны, являются коллинеарными, а в случае лидерной секреторной последовательности, смежными в рамке считывания. Однако не является
15 необходимым, чтобы энхансеры были смежными. Связывание осуществляют встраиванием путем лигирования в соответствующие сайты рестрикции. Если такие сайты не существуют, то в соответствии с принятой практикой применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
В контексте настоящего описания понятия "клетка", "клеточная линия" и
20 "клеточная культура" используются взаимозаменяемо, и все такие определения включают потомство. Так, понятия "трансформанты" и "трансформированные клетки" относятся к первичной рассматриваемой клетке и полученным из нее культурам безотносительно к количеству пересевов. Следует понимать также, что все потомство может не быть полностью идентичным по составу ДНК из-за
25 преднамеренных или случайных мутаций. Под объем изобретения подпадает вариант потомства, имеющий такую же функцию или биологическую активность, которая обнаружена у исходной трансформированной клетки.
"Fc-фрагмент (-участок)" антитела не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные
30 функции. "Fc-фрагмент антитела" представляет собой понятие, хорошо
известное специалисту в данной области, и этот фрагмент определяют на основе расщепления антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей антитела или
иммуноглобулины разделяют на следующие классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы; понятия "изотип" или "подкласс" в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо), например, IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4, IgAl и IgA2. На основе строения константных областей тяжелых цепей различные классы иммуноглобулинов обозначают как а, 8, s, у и ц соответственно. Fc-фрагмент антител непосредственно участвует в ADCC (антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность) и CDC (комплементзависимая цитотоксичность), основанной на активации комплемента, связывании Clq и связывании Fc-рецептора. Активация комплемента (CDC) инициируется связыванием фактора системы комплемента Clq с Fc-фрагментом большинства антител подклассов IgG. Хотя влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с Clq обусловлено определенными сайтами связывания в Fc-фрагменте. Такие сайты связывания известны в данной области и описаны, например, у Boakle R.J. и др., Nature 282, 1979, сс. 742-743; Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, сс. 2555-2560; Brunhouse R. и Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, сс. 907-917; Burton D.R. и др., Nature 288, 1980, сс. 338344; Thommesen J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, cc. 995-1004; Idusogie E.E. и др., J. Immunol. 164, 2000, cc. 4178-4184; Hezareh M. И др., J. Virology 75, 2001, cc. 12161-12168; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, cc. 319-324; EP 0307434. Указанные сайты связывания представляют собой, например, L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация согласно EU-нумерации Кэбота, см. ниже). Антитела подклассов IgGl, IgG2 и IgG3, как правило, обусловливают активацию комплемента и связывание Clq и СЗ, в то время как IgG4 не активирует систему комплемента, не связывается с Clq и СЗ.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, содержит Fc-фрагмент человеческого происхождения и предпочтительно все остальные участки человеческих константных областей. В контексте настоящего описания понятие "Fc-фрагмент, человеческого происхождения" означает Fc-фрагмент, который представляет собой Fc-фрагмент человеческого антитела подкласса IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно Fc-фрагмент из человеческого подкласса IgGl, мутантный Fc-фрагмент человеческого подкласса IgGl (предпочтительно с
мутацией L234A + L235A), Fc-фрагмент из человеческого подкласса IgG4 или мутантный Fc-фрагмент из человеческого подкласса IgG4 (предпочтительно с мутацией S228P и L235E). Наиболее предпочтительными являются человеческие константные области тяжелой цепи, имеющие SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52 5 (человеческий подкласс IgGl), SEQ ID NO: 53 (человеческий подкласс IgGl с мутациями L234A и L235A), SEQ ID NO: 54 (человеческий подкласс IgG4) или SEQ ID NO: 55 (человеческий подкласс IgG4 с мутациями S228P и L235E).
Предпочтительно антитело, предлагаемое в изобретении, относится к человеческому подклассу IgGl или человеческому подклассу IgG4. Согласно
10 одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в
изобретении, относится к человеческому подклассу IgGl. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, относится к человеческому подклассу IgG4.
Антитело, предлагаемое в изобретении, предпочтительно отличается тем,
15 что константные области цепи получают из человеческих антител. Такие константные области цепи хорошо известны в данной области, например, описаны у Кэбота (см., например, Johnson G. и Wu Т.Т., Nucleic Acids Res. 28, 2000, cc. 214-218). Например, применяемая человеческая константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51
20 или 28. Например, применяемая человеческая константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи SEQ ID NO: 49. Предпочтительно также антитело имеет происхождение из кроличьего антитела, и оно содержит последовательность вариабельной области из кроличьего антитела согласно номенклатуре Кэбота
25 (см., например, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat E.A. и др., 5-ое. изд., изд-во DIANE Publishing, 1992).
Изобретение относится к способу лечения пациента, который нуждается в терапии, отличающемуся тем, что вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении.
30 Изобретение относится к применению антитела, предлагаемого в
изобретении, в терапии.
Изобретение относится к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для
лечения рака, прежде всего рака ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или для лечения аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
Изобретение относится к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для лечения рака или воспалительных заболеваний, предпочтительно для лечения рака ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или для лечения аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
Следующим вариантом осуществления изобретения является способ получения антитела к TWEAK, отличающийся тем, что встраивают последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь антитела, предлагаемого в изобретении, и нуклеиновой кислоты, которая кодирует легкую цепь указанного антитела, в один или два экспрессионный(ых) вектор(а), указанный(ые) векторы(ы) встраивают в эукариотическую клетку-хозяина, экспрессируют кодируемое антитело и выделяют из клетки-хозяина или супернатанта.
Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно получают методами рекомбинации. Такие методы широко известны в данной области и представляют собой экспрессию белков в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и, как правило, очистку до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессионные векторы стандартными методами. Экспрессию осуществляют в пригодных прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, таких как СНО-клетки, NSO-клетки, 8Р2/0-клетки, НЕК293-клетки,
COS-клетки, клетки дрожжей или клетки E.coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса).
Получение антител методами рекомбинации хорошо известно в данной области и описано, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. 5 Purif. 17, 1999, cc. 183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif. 8, 1996, cc. 271282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, cc. 151-161; Werner R.G. и др., Arzneimittelforschung (Drug Res.), 48, 1998, cc. 870-880.
Антитела могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически чистой форме. Очистку осуществляют для
10 удаления других клеточных компонентов или других загрязнителей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, которые включают хроматографию на колонках и другие методы, хорошо известные в данной области (см. в Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F. и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York,
15 1987).
Экспрессия в NSO-клетках описана, например, у Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, сс. 109-123; и Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс. 261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с. Е9. Клонирование вариабельных областей
20 описано у Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc. 3833-3837;
Carter P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc. 4285-4289; Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, cc. 77-87. Предпочтительная система кратковременной экспрессии (НЕК 293) описана у Schlaeger E.-J. и Christensen К., в Cytotechnology 30, 1999, сс. 71-83 и у Schlaeger E.-J. в J. Immunol. Methods
25 194, 1996, cc. 191-199.
Моноклональные антитела можно отделять от культуральной среды с помощью общепринятых методов очистки иммуноглобулинов, таких, например, как хроматография на белок А-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, диализ или аффинная хроматография. ДНК и РНК, которые кодируют
30 моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью
общепринятых методов. Клетки гибридом могут служить источником таких ДНК и РНК. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки НЕК 293,
СНО-клетки или клетки миеломы, которые иначе не могут продуцировать белок иммуноглобулина, для синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотных 5 последовательностей антитела к TWEAK, получают с помощью различных известных в данной области методов. Эти методы включают (но, не ограничиваясь только ими) выделение из естественного источника (в случае встречающихся в естественных условиях вариантов аминокислотных последовательностей) или получение путем опосредуемого олигонуклеотидом
10 (или сайтнаправленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученной вариантной или невариантной версии гуманизированного антитела к TWEAK.
Вариабельные области тяжелой и легкой цепи, предлагаемые в изобретении, объединяют с последовательностями промотора, сайта инициации
15 трансляции, константной области, З'-нетранслируемой области,
последовательностями полиаденилирования и терминации транскрипции с получением конструкций экспрессионных векторов. Конструкции для экспрессии тяжелой и легкой цепи можно объединять в одном векторе, их можно применять для котрансфекции, серийной трансфекции или раздельной
20 трансфекции клеток-хозяев, которые затем можно сливать с получением индивидуальной клетки-хозяина, которая экспрессирует обе цепи.
Следующим объектом настоящего изобретения является композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая одно или комбинацию моноклональных антител или их антигенсвязывающих участков, предлагаемых в
25 настоящем изобретении, приготовленная в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
В контексте настоящего описания понятие "фармацевтически приемлемый носитель" относится к любому и ко всем растворителям, диспергирующим средам, покрытиям, антибактериальным и противогрибковым агентам,
30 регулирующим изотоничность и замедляющим абсорбцию/ресорбцию агентам и подобным веществам, которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель должен быть пригоден для инъекции или инфузии. Композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить
различными методами, известными в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или механизм введения должен варьироваться в зависимости от требуемых результатов.
Фармацевтически приемлемые носители представляют собой стерильные 5 водные растворы или дисперсии и стерильные порошки, предназначенные для приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение указанных сред и агентов для фармацевтических действующих веществ известно в данной области. Помимо воды носитель может представлять собой, например, изотонический забуференный физиологический раствор.
10 Вне зависимости от выбранного пути введения соединения, предлагаемые в
настоящем изобретении, которые можно применять в приемлемой гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, приготавливают в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм с помощью общепринятых методов, известных
15 специалистам в данной области.
Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, могут варьироваться так, чтобы получать количество действующего вещества, которое является эффективным для получения требуемого терапевтического ответа у конкретного
20 пациента при использовании конкретной композиции и пути введения, не являясь при этом токсичными для пациента (эффективное количество). Выбранный уровень доз должен зависеть от разнообразных
фармакокинетических факторов, таких как активность конкретных применяемых композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, или их сложных эфиров,
25 солей или амидов, путь введения, продолжительность введения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в сочетании с конкретными композициями, возраст, пол, вес, общее состояние здоровья и предыдущая история болезни пациента, подлежащего лечению, и подобных
30 факторов, которые хорошо известны в медицине.
Изобретение относится также к применению антител, предлагаемых в изобретении, для лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или аутоиммунными
заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, заболеваниями мышц, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, заболеваниями костей, например, дегенерацией костной ткани при множественной миеломе, системной красной 5 волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением.
Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего указанным заболеванием.
В изобретении предложен также способ приготовления фармацевтической композиции, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, в 10 эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым
носителем, и применение антитела, предлагаемого в изобретении, в таком способе.
Настоящее изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, в эффективном количестве для приготовления
15 фармацевтического агента, предпочтительно в сочетании с фармацевтически
приемлемым носителем, предназначенного для лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, заболеваниями мышц, например, мышечной
20 дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, заболеваниями костей, например, дегенерацией костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением.
Настоящее изобретение относится также к применению антитела,
25 предлагаемого в изобретении, в эффективном количестве для приготовления фармацевтического агента, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, предназначенного для лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом,
30 псориатическим артритом, заболеваниями мышц, например, мышечной
дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, заболеваниями костей, например, дегенерацией костной ткани при
множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением.
Описание последовательностей
Приведенные ниже примеры и перечень последовательностей даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, истинный объем которого 10 представлен в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что в
изложенные процессы можно вносить модификации без отклонения от сущности изобретения. Пример 1
Описание иммунизации
5 Иммунизация кроликов человеческим/мышиным TWEAK
Новозеландских белых кроликов (Oryctolagus cuniculus) иммунизировали путем введения 400 мкг рекомбинантного человеческого TWEAK в полном адъюванте Фрейнда в день 0, 200 мкг человеческого TWEAK в дни 21, 43 и 65 в неполном адъюванте Фрейнда и 200 мкг мышиного TWEAK в день 85 в 10 неполном адъюванте Фрейнда. Все иммунизации осуществляли подкожно в несколько точек. Сыворотку для определения титров получали в дни 77 и 98. Конечную ревакцинацию осуществляли путем внутривенной инъекции 200 мкг человеческого и 200 мкг мышиного растворимого TWEAK и антитела отбирали на основе их способности связываться с человеческим или мышиным TWEAK 15 (пример 2), способности нейтрализовать взаимодействие человеческих и
мышиных TWEAK/Fnl4 (примеры 4 и 5) и способности ингибировать секрецию IL8 (пример 6). Кроме того, определяли время полужизни комплекса антитело-TWEAK (пример 3). Противоопухолевую эффективность антитела тестировали с использованием моделей ксенотрансплантатов B16BL6 (мышиная меланома; 20 метастатическая легочная сублиния В16), SJSA (остеосаркома, АТСС CRL-2098) и НСТ-116 (ободочная кишка, АТСС CCL-247). Пример 2
Связывание с человеческим и мышиным TWEAK (ELISA) Связывание антител к TWEAK с человеческим и мышиным TWEAK
25 оценивали с помощью ELISA. Человеческий или мышиный рекомбинантный TWEAK иммобилизовали на 384-луночном планшете Maxisorp (фирма Nunc) в дозе 1 мкг/мл, 25 мкл/лунку в 0,5М карбонатном буфере для сенсибилизации, рН 9,5, путем инкубации в течение ночи при 2-8°С. После блокады планшета с помощью ЗФР/1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре осуществляли
30 две стадии отмывки (0,1% Tween(r) 20 в ЗФР) и инкубацию с антителами к TWEAK в различных концентрациях в блокирующем буфере или с супернатантами гибридомы антител в течение 1 ч при комнатной температуре. После еще четырех отмывок антитела идентифицировали с помощью
конъюгированного с HRP антикроличьего антитела, разведенного в соотношении 1:5000 в блокирующем буфере, в течение 1 ч при комнатной температуре. Сигнал обнаруживали путем добавления ABTS(r) (фирма Roche Diagnostics GmbH) в течение 10-30 мин после еще четырех стадий отмывки. Абсорбцию 5 считывали при 405 нм. Пример 3
Определение времени полжизни комплексов антитело-TWEAK с помощью Biacore-анализа
Применяли устройство Biacore 2000 с использованием
10 сенсибилизированного стрептавидином (SA) Biacore-сенсора, входящего в
систему. Использовали входящий в систему буфер HBS-ET (ЮмМ HEPES, рН 7,4, 150мМ NaCl, 1мМ ЭДТК, 0,05% Tween(r) 20) со скоростью потока 100 мкл/мин. Буфер для образца представлял собой входящий в систему буфер. Биотинилированный человеческий растворимый TWEAK (аминокислоты 99-249
15 SEQ ID NO: 60) и биотинилированный мышиный растворимый TWEAK (аминокислоты 81-225 SEQ ID NO: 61) иммобилизовали на различных проточных ячейках на SA-сенсоре, каждый из расчета 150 RU. Проточную ячейку FC1 использовали в качестве контрольной референс-ячейки. Каждое антитело инъецировали в систему в виде анализируемого вещества в
20 концентрации ЮОнМ со скоростью 100 мкл/мин в течение 2 мин для оценки времени ассоциации. Мониторинг диссоциации иммунокомплексов осуществляли в течение 5 мин. Поверхность сенсора отмывали HBS-ET в течение 10 с и регенерировали, осуществляя 2> <2 мин инъекции ЮмМ глицина, рН 2,25. Эту процедуру осуществляли при 25°С. Имеющую наименьшую
25 кинетическую скорость стадию фазы диссоциации комплексов в интервале [240 с-300 с] использовали для расчета скорости реакции диссоциации kd [1/с] (программа Biacore Evaluation Software 4.0). Исходя из уравнения tl/2 дисс. = 1п(2) / (60 х kd) рассчитывали время полужизни (полудиссоциации) иммунокомплексов в мин. Результаты представлены в таблицах 5а и 56 и в
30 таблице 66.
20 характеризующиеся указанным временем полужизни, являются особенно
предпочтительными для применения при лечении аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации костной ткани при множественной
миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения. Пример 4
Нейтрализация взаимодействия (человеческих) TWEAK-Fnl4 Блокаду взаимодействия человеческий TWEAK/человеческий Fnl4 оценивали с помощью ELISA, предназначенного для изучения взаимодействия с рецептором. 96-луночные планшеты Maxisorp(r) (фирма Nunc) сенсибилизировали, используя по 100 мкл/лунку взятого в концентрации 1 мкг/мл комплекса человеческий Fnl4:Fc (внеклеточный домен человеческого Fnl4 (аминокислоты 1-75), слитый с Fc-областью человеческого IgGl) в ЗФР, в течение 1,5 ч при комнатной температуре и блокировали с помощью 5%-ного раствора FBS в ЗФР в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании. Параллельно инкубировали меченный с помощью Flag растворимый TWEAK (аминокислоты 106-249) в концентрации 2,5 нг/мл в блокирующем растворе с антителами к TWEAK в различных концентрациях или с супернатантом гибридомы в течение 2 ч при комнатной температуре при встряхивании. После однократной отмывки сенсибилизированного Fnl4 планшета с помощью буфера для отмывки (0,1% Tween(r) 20 в ЗФР) 100 мкл раствора антитела к TWEAK переносили в каждую лунку и планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с последующими четырьмя отмывками буфером для отмывки. В лунки вносили 100 мкл идентифицирующего антитела к FLAG-HRP, разведенного в соотношении 1:5000 блокирующим буфером, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После четырех дополнительных стадий отмывки сигнал обнаруживали путем добавления 100 мкл раствора 3,3,5,5-тетраметилбензидина (ТМВ) в течение примерно 10 мин. Реакцию прекращали, добавляя 100 мкл 1н. НС1, и абсорбцию оценивали при 450 нм (референс-волна 620 нм). Результаты представлены в таблице 6. Пример 5
Нейтрализация взаимодействия (мышиных) TWEAK-Fnl4 Взаимодействие мышиный TWEAK/мышиный Fnl4 оценивали с помощью ELISA согласно принципу, аналогичному описанному для человеческих белков, но с использованием другой системы обнаружения, поскольку мышиный
растворимый TWEAK не метили. В целом, метод состоял в следующем: планшеты типа Maxisorp сенсибилизировали комплексом мышиный Fnl4:Fc (внеклеточный домен мышиного Fnl4 (аминокислоты 1-75), слитый с Fc-областью человеческого IgGl) согласно методу, описанному для человеческого 5 комплекса Fnl4:Fc, с последующей блокадой и отмывкой. Мышиный
растворимый TWEAK в концентрации 4 нг/мл предварительно инкубировали с антителами к TWEAK или супернатантом гибридомы в блокирующем буфере и 100 мкл смеси вносили в лунку сенсибилизированного Fnl4 планшета. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре и четырех отмывок
10 добавляли в течение 1 ч при комнатной температуре биотинилированное антитело к мышиному TWEAK в концентрации 125 нг/мл в блокирующем буфере, после чего осуществляли еще четыре стадии отмывки. Антитело к TWEAK выявляли инкубацией с комплексом стрептавидин-HRP, разведенным в соотношении 1:5000 в блокирующем буфере, в течение 30 мин при комнатной
15 температуре. Получали сигнал и оценивали абсорбцию согласно описанному выше методу. Результаты представлены в таблицах 6а и 66. Пример 6
Оценка секреции IL-8 с помощью ELISA
Блокаду активности TWEAK с помощью антител к TWEAK в клеточной 20 системе оценивали путем анализа секреции IL-8 с использованием клеток меланомы линии А375. По 10000 клеток линии А375 (АТСС №CRL1619) высевали в лунку 96-луночного планшета для культур клеток в 100 мкл питательной среды (среда DMEM, дополненная 4,5 г/л глюкозы, пируватом и GlutaMAX(tm)/10% FBS) и инкубировали при 37°С/5% С02 в течение 48 ч. 25 Человеческий рекомбинантный растворимый TWEAK, в концентрации 300 нг/мл предварительно инкубировали с антителами к TWEAK в различных концентрациях в питательной среде в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем 50 мкл смеси добавляли в каждую лунку планшета для клеток с последующей 48-часовой инкубацией, что обеспечивало секрецию IL-8. 30 Отбирали 20 мкл клеточного супернатанта после центрифугирования планшета в течение 5 мин при 200 х g и смешивали с 980 мкл калибровочного разбавителя RD5P, входящего в набор "CXCL8 Quantikine ELISA" (фирма R &D Systems). IL
8 выявляли с помощью ELISA согласно инструкциям производителя. Результаты представлены в таблицах 6а и 66.
Пример 7
Определение эпитопной области TW-301, TW-304, TW-305 Применяли устройство Biacore 2000 в сочетании с программным обеспечением Biacore Evaluation Software 4.0. Буфер для образца и для системы представлял собой HBS-ET, рН 7,4. Из-за сильного неспецифического связывания анализируемого вещества, т.е. TWEAK, с поверхностью сенсора эпитопное картирование индивидуальных антител невозможно было осуществлять с помощью общепринятого Biacore-эксперимента на основе перекрестной конкуренции, описанного у Johne В. и др., J. Immun. Meth. 160, 1993, сс. 191-198.
Из-за индивидуальных биохимических особенностей белка TWEAK был разработан другой метод, основанный на применении TWEAK в качестве лиганда. Биотинилированный TWEAK иммобилизовали на сенсибилизированной
стрептавидином поверхности чипа и определяли эпитопы, с которыми взаимодействуют последовательно инъецируемые антитела (антитело 1). Задачей являлось определение относительных уровней связывания вторичного антитела (антитело 2) в присутствии уже связанного первичного антитела. На основе 5 указанных относительных уровней связывания рассчитывали коэффициент (Ат2/Ат1, молярное соотношение (MR), выраженное в %, таблица 7).
Осуществляли иммобилизацию 5нМ биотинилированного TWEAK со скоростью 20 мкл/мин в течение 1 мин на сенсибилизированной стрептавидином сенсорной проточной ячейке. Первичное и вторичное МАт последовательно
10 инъецировали в системе со скоростью 10 мкл/мин в течение 4 мин, используя концентрацию каждого антитела 1 ООнМ, вплоть до достижения насыщения соответствующих эпитопов TWEAK. В качестве эталона применяли сенсибилизированную SA проточную ячейку.
Систему отмывали с помощью HBS-ET в течение 20 с со скоростью 30
15 мкл/мин, после чего осуществляли две стадии регенерации в течение 1 мин, внося со скоростью 30 мкл/мин 6М GuadHCl и ЮОмМ НС1. Эти стадии регенерации позволяли отщеплять связанные МАт от сенсорной поверхности и осуществлять необратимую денатурацию биотинилированного TWEAK. Процесс повторяли путем иммобилизации нативного биотинилированного белка TWEAK
20 (периодический процесс с подпиткой) на той же самой проточной ячейке вплоть до полного насыщения сенсибилизированной стрептавидином сенсорной поверхности биотинилированным TWEAK.
25 Эксперимент по перекрестному блокированию продемонстрировал, что
уровни доступности соответствующих антител составляли менее 10%, что находится на уровне "шума" в этом анализе. Таким образом, четко продемонстрировано, что антитела TW-301chi, TW-304chi и TW-305chi связываются с одной и той же эпитопной областью.
Пример 8
Ингибирование in vivo индуцированного коллагеном артрита (созданная на мышах модель ревматоидного артрита): антитело 305 (химерное; TW305) ингибирует индуцированный коллагеном артрит, т.е. созданную на мышах 5 модель ревматоидного артрита
Самцов мышей линии DBA1/J mice (фирма Jackson Laboratory, Бар-Харбор, Майями), возрастом 6-8 недель иммунизировали бычьим коллагеном типа II в полном адъюванте Фрейнда и еще раз через 3 недели в неполном адъюванте Фрейнда (ревакцинация, день 0). Мышам вводили химерное антитело 305
10 (=TW305, см. фиг. 1) (10 мг/кг, п=12), энбрел (10 мг/кг, п=12) или наполнитель (забуференный фосфатом физиологический раствор, п=12) через день, начиная с для, предшествующего ревакцинации. У мышей оценивали признаки артрита в дни 0, 2, 5, 7, 9, 12 и 14 после ревакцинации. Серьезность артрита оценивали в баллах на основе следующих критериев: 1 - опухание и/или покраснение одного
15 пальца; 2 - опухание двух или большего количества суставов; 3 - сильное опухание лапы, затрагивающее более двух суставов; 4 - серьезный артрит, затрагивающий всю лапу и пальцы. По сравнению с наполнителем антитело TW-305 значимо снижало клинические баллы (р <0,05, день 14) на такую же величину, что и блокатор TNF энбрел. Результаты представлены на фиг. 1.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Ф. Хоффманн-Ля Рош АГ
5 <120> Антитела к человеческому TWEAK и варианты их применения
<130> 27057 WO
<150> ЕР 10186536.8 10 <151> 2010-10-05
<160> 61
<170> Patentln, версия 3.5
<210> 1 <211> 111 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 1
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
35 Tyr Asp Ala Phe Asp Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Thr Leu Thr lie Ser Asp Leu Glu Cys
40 65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Ser Thr Asp Tyr Gly Asn Ser
85 90 95
Trp Asp Gly Asn Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Thr
100
105
110
<210> 2 <211> 11 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 2
Gin Ala Ser Gin Ser lie Tyr Ser Ser Leu Ala 15 10
15 <210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
20 <400> 3
Asp Ala Phe Asp Leu Ala Ser 1 5
<210> 4 <211> 13 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 4
Gin Ser Thr Asp Tyr Gly Asn Ser Trp Asp Gly Asn Pro 15 10
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
40 <213> Oryctolagus cuniculus
<400> 5
Gin Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
45 1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Asn Tyr
20 25 30
Trp lie Cys Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Ala Cys lie Tyr Gly Gly Gly Asn Ser Gly Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Thr Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gin Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro lie Ser Arg Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Leu 115
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 6
Phe Thr Phe Asn Ala Asn Tyr 1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 7
Tyr Gly Gly Gly Asn Ser
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 8
Gly Pro lie Ser Arg Asp Leu 1 5
<210> 9 <211> 111 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 9
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Gly Asn Asp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Arg Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Ser Val Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asp Val Gin Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Cys lie Asp Tyr Gly Asn Asn
85 90 95
Tyr Val Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 11
5 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 10
10 Gin Ala Ser Gin Ser lie Gly Asn Asp Leu Ser 15 10
<210> 11
15 <211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 11
Ser Val Ser Thr Leu Ala Ser 1 5
25 <210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
30 <400> 12
Gin Cys lie Asp Tyr Gly Asn Asn Tyr Val Gly Asn Thr 15 10
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 13
Gin Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
15 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly Cys lie Tyr Val Gly Ser Ser Gly Ala Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp
5 0 5 5 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Ala
65 70 75 80
Leu Gin Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Val Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Val His Phe Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 14
Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr 1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 15
Tyr Val Gly Ser Ser Gly 1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 16
Ser Val His Phe Gly Asp Leu 1 5
<210> 17
<211> 111
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 17
Ala lie Glu Met Thr Gin Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr lie Asn Cys Gin Ala Ser Gin Asn lie Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Glu Tyr Thr Leu Thr lie Ser Gly Val Gin Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
5 <213> Oryctolagus cuniculus
<400> 18
Gin Ala Ser Gin Asn lie Tyr Ser Asn Leu Ala
10 1 5 10
<210> 19
<211> 7
15 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 19
20 Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser 1 5
<210> 20
25 <211> 13
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 20
Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg Pro Asp Thr Val Ala 15 10
35 <210> 21 <211> 120 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus 40 <400> 21
Gin Glu Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Туг Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr lie Ser Ser Asp Asn Ala Gin Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
15 Leu Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val lie Trp Gly Pro
20 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Phe 115 120
<210> 22 <211> 7 <212> PRT 30 <213> Oryctolagus cuniculus
<400> 22
Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 35 1 5
<210> 23
<211> 6
40 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 23
45 Tyr Val Arg Gin Gly Thr 1 5
<210> 24 <211> 11 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 24
Gly Gly Туг Asn Туг Asp Asp Ala Phe Val lie 15 10
<210> 25 <211> 218 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Антитело 305, химерная легкая цепь <400> 25
Ala lie Glu Met Thr Gin Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr lie Asn Cys Gin Ala Ser Gin Asn lie Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Glu Tyr Thr Leu Thr lie Ser Gly Val Gin Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 26
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
легкой uenM(VL), 305-LC1
<400> 26
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
5 0 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 27
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
легкой uenn(VL), 305-LC2
<400> 27
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
5 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
легкой uenn(VL), 305-LC3
25 <400> 2S
Ala Не Arg Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
35 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
40 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Cys Leu Gin Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
легкой uenn(VL), 305-LC4
<400> 29
Ala Не Arg Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Cys Leu Gin Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 30
<211> 111 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области легкой цепи(\7Ъ), 305-LC5
<400> 30
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
5 0 5 5 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области легкой uenH(VL), 305-LC6
<400> 31
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
легкой u,enn(VL), 305-LC7
<400> 32
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
легкой цепи (VL), 305-LC8
<400> 33
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Asn Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 34
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
легкой цепи (VL), 305-LC9
<400> 34
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 35
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
легкой uenn(VL), 305-LC10
<400> 35
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 36 <211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области легкой uenn(VL), 305-LC11
<400> 36
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 450
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, химерная тяжелая цепь
<400>
Gin Glu Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Ser Asp Asn Ala Gin Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Phe Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu
325 330 335
Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys 450
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
тяжелой uenn(VH), 305-НС1
<400> 38
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 39
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
тяжелой uenn(VH), 305-НС2
<400> 39
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
тяжелой цепи (VH), 305-НСЗ
<400> 40
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gin He Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 41
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
тяжелой uenn(VH), 305-НС4
<400> 41
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
10 <213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области тяжелой uenn(VH), 305-НС5
<400> 42
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
30 Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
35 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 43
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
тяжелой uenH(VH), 305-НС6
<400> 43
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 44 <211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области тяжелой цепи (VH), 305-НС7
<400> 44
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 45
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области тяжелой цепи (VH), 305-НС8
<400> 45
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
тяжелой цепи (VH), 305-НС9
<400> 46
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Lys Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
тяжелой u.enn(VH), 305-НС10
<400> 47
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 48
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 305, гуманизированный вариант вариабельной области
тяжелой цепи (VH), 305-НС11
<400> 48
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Туг Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
10 Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
15 85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
35 40 45
45 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Туг Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
85 90 95
10 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 50
15 <211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
15 10 15
25 Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
30 35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
45 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 51
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 52 <211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 53
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
15 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
20 65 70 75 80
Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
35 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
40 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 54
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
<210> 55
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
<210> 56
<211> 218
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 301, химерная легкая цепь
<400> 56
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr He Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser He Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Asp Ala Phe Asp Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Thr Leu Thr He Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Ser Thr Asp Tyr Gly Asn Ser
85 90 95
Trp Asp Gly Asn Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Thr Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 57 <211> 446 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Антитело 301, химерная тяжелая цепь <400> 57
Gin Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
15 10 15
20 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ala Asn Tyr
20 25 30
Trp He Cys Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
25 35 40 45
Ala Cys He Tyr Gly Gly Gly Asn Ser Gly Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Thr Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gin Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
40 Ala Arg Gly Pro He Ser Arg Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Leu Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
45 115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
5 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser
10 165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
25 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro
30 245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
45 Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
10 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
15 370 375 380
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
30 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 58
35 <211> 218
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
40 <223> Антитело 304, химерная легкая цепь
<400> 58
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
45 1 5 10 15
Gly Thr Val Thr He Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser He Gly Asn Asp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Arg Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Ser Val Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr He Ser Asp Val Gin Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Cys He Asp Tyr Gly Asn Asn
85 90 95
Tyr Val Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 59 <211> 446 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Антитело 304, химерная тяжелая цепь <400> 59
Gin Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
15 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Cys He Tyr Val Gly Ser Ser Gly Ala Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Ala
65 70 75 80
Leu Gin Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Val Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Val His Phe Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 60
<211> 249
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Met Ala Ala Arg Arg Ser Gin Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro
15 10 15
Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu
20 25 30
Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly Ser Arg Ala
35 40 45
Ser Leu Ser Ala Gin Glu Pro Ala Gin Glu Glu Leu Val Ala Glu Glu
50 55 60
Asp Gin Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gin Thr Glu Glu Ser Gin Asp
65 70 75 80
Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala He Ala Ala His Tyr Glu
100 105 110
Val His Pro Arg Pro Gly Gin Asp Gly Ala Gin Ala Gly Val Asp Gly
115 120 125
Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg He Asn Ser Ser Ser Pro Leu
130 135 140
Arg Tyr Asn Arg Gin He Gly Glu Phe He Val Thr Arg Ala Gly Leu
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gin Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr
165 170 175
Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu
180 185 190
Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gin Leu Arg
195 200 205
Leu Cys Gin Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Arg He Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gin Val His 245
<210> 61
<211> 249
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 61
Met Ala Ala Arg Arg Ser Gin Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro
15 10 15
Gly Thr Ala Leu Leu Ala Pro Leu Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu
20 25 30
Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Ala
35 40 45
Thr Leu Ser Ala Gin Glu Pro Ser Gin Glu Glu Leu Thr Ala Glu Asp
50 55 60
Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu Asn Pro Gin Thr Glu Glu Ser Gin Asp
65 70 75 80
Val Val Pro Phe Leu Glu Gin Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Arg Ala He Ala Ala His Tyr Glu
100 105 110
Val His Pro Arg Pro Gly Gin Asp Gly Ala Gin Ala Gly Val Asp Gly
115 120 125
Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Thr Lys He Asn Ser Ser Ser Pro Leu
130 135 140
Arg Tyr Asp Arg Gin He Gly Glu Phe Thr Val He Arg Ala Gly Leu
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gin Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr
165 170 175
Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asn Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu
180 185 190
Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Pro Gly Pro Gin Leu Arg
195 200 205
Leu Cys Gin Val Ser Gly Leu Leu Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Arg He Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gin Val His 245
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело, которое связывается с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR3H вариабельной области тяжелой цепи, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 16 или 24.
2. Химерный, гуманизированный или с истощенным Т-клеточным эпитопом вариант
а) антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи SEQ ID
NO: 1, и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 5,
б) антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи SEQ ID
NO: 9, и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 13, или
в) антитела, которое содержит вариабельную область легкой цепи SEQ ID
NO: 17, и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 21.
3. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что
а) содержит CDR1H SEQ ID NO: 6, CDR2H SEQ ID NO: 7, CDR3H SEQ ID
NO: 8, и CDR1L SEQ ID NO: 2, CDR2L SEQ ID NO: 3, CDR3L SEQ ID NO: 4, или
б) содержит CDR1H SEQ ID NO: 14, CDR2H SEQ ID NO: 15, CDR3H SEQ
ID NO: 16, и CDR1L SEQ ID NO: 10, CDR2L SEQ ID NO: 11, CDR3L SEQ ID NO:
12, или
в) содержит CDR1H SEQ ID NO: 22, CDR2H SEQ ID NO: 23, CDR3H SEQ
ID NO: 24, и CDR1L SEQ ID NO: 18, CDR2L SEQ ID NO: 19, CDR3L SEQ ID NO:
20.
4. Антитело, связывающееся с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR1H SEQ ID NO: 6, CDR2H SEQ ID NO: 7, CDR3H SEQ ID NO: 8, и CDR1L SEQ ID NO: 2, CDR2L SEQ ID NO: 3, CDR3L SEQ ID NO: 4.
5. Антитело, связывающееся с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR1H SEQ ID NO: 14, CDR2H SEQ ID NO: 15, CDR3H SEQ ID NO: 16 и CDR1L SEQ ID NO: 10, CDR2L SEQ ID NO: 11, CDR3L SEQ ID NO: 12.
4.
6. Антитело, связывающееся с человеческим TWEAK, отличающееся тем, что содержит CDR1H SEQ ID NO: 22, CDR2H SEQ ID NO: 23, CDR3H SEQ ID NO: 24 и CDR1L SEQ ID NO: 18, CDR2L SEQ ID NO: 19, CDR3L SEQ ID NO: 20.
7. Антитело по n. 6, отличающееся тем, что содержит а) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 27 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 41,6) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 27 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 44, в) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 27 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 45, г) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 26 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 47, д) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 44, е) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 31 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 45, ж) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 41 или з) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 39.
8. Антитело по п. 6, отличающееся тем, что содержит а) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 27 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 41, б) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 27 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 45, в) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 44, г) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 41 или д) вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29, и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 39.
9. Антитело по п. 6, отличающееся комбинацией: последовательность вариабельной области легкой цепи /последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 5, 9/13, 17/21, 25/37, 26/38, 27/39, 28/40, 29/41, 30/42, 31/43, 32/44; 33/45, 34/46, 35/47, 36/48, 56/57, 58/59.
4.
10. Антитело по п. 6, отличающееся тем, что содержит вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы вариабельных областей тяжелой или легкой цепей: SEQ ID NO: 17, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 56, 58, 21, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,
5 46, 47, 48, 57 или 59.
11. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит антитело по п.п. 1-10.
10 12. Применение антитела по п.п. 1-10 для приготовления фармацевтической
композиции.
13. Антитело по п.п. 1-10, предназначенное для лечения рака или аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, 15 заболеваний мышц, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
20 14. Антитело по п.п. 1-10, предназначенное для лечения рака ободочной
кишки, легкого или поджелудочной железы.
15. Применение антитела по п.п. 1-10 для приготовления лекарственного
средства, предназначенного для лечения рака или аутоиммунных заболеваний,
25 ревматоидного артрита, псориатического артрита, заболеваний мышц, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костей, например, дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
16. Применение антитела по п.п. 1-10 для приготовления лекарственного
средства, предназначенного для лечения рака ободочной кишки, легкого или
поджелудочной железы.
17. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по п.п. 1-10.
18. Экспрессионные векторы, отличающиеся тем, что содержат нуклеиновую кислоту по п. 17, предназначенные для экспрессии антитела, связывающегося с TWEAK, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине.
19. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по п. 18.
20. Способ получения рекомбинантного антитела по п.п. 1-10, отличающийся тем, что экспрессируют нуклеиновую кислоту по п. 17 в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделяют указанное антитело из указанной клетки или супернатанта клеточной культуры.
21. Способ лечения пациента, страдающего раком или аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, заболеваниями мышц, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, заболеваниями костей, например, дегенерацией костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистыми повреждением, отличающийся тем, что вводят пациенту антитело по п.п. 1-10.
17.
rnCIA
1/1
- 3 -
- 6 -
- 6 -
-11 -
- 10 -
- 13 -
- 13 -
- 15 -
-16 -
- 18 -
- 18 -
- 19 -
- 19 -
- 23 -
- 23 -
- 24 -
- 24 -
- 25 -
-26-
- 28 -
- 28 -
- 29 -
-30-
- 29 -
-30-
- 32 -
- 32 -
- 33 -
- 34
- 33 -
- 34
- 33 -
- 34
- 33 -
- 34
- 33 -
- 34
- 33 -
- 34
- 35 -
- 34
- 36 -
- 36 -
- 37 -
- 37 -
- 37 -
- 37 -
- 37 -
- 37 -
- 37 -
- 37 -
- 38 -
- 38 -
-40-
-40-
-40-
-40-
-40-
-40-
42 -
42 -
- 43 -
- 43 -
- 45
- 45
-46-
-46-
- 47 -
- 47 -
-48 -
-48 -
-49-
-49-
- 50 -
- 50 -
- 52 -
- 52 -
- 53 -
- 53 -
- 59
- 58 -
- 59
- 58 -
- 59
- 60 -
- 61 -
- 61 -
65 -
65 -
- 67 -
- 67 -
- 71 -
- 70 -
- 73 -
- 73 -
- 80 -
- 80 -
- 81 -
- 81 -
- 88 -
- 88 -
- 89 -
- 90 -