[**]

Описаны электрокинетически измененные жидкости (например, электрокинетически измененные и обогащенные газом жидкости и растворы), включающие ионный водный раствор кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом в количестве, достаточном для лечения воспалительного нейродегенеративного состояния или заболевания (например, таупатии) или по меньшей мере одного его симптома. Электрокинетически измененные жидкости или терапевтические композиции и способы включают электрокинетически измененные ионные водные жидкости, в некоторых случаях, в комбинации с другими терапевтическими агентами. Отдельные аспекты изобретения описывают модуляцию (например, снижение) фосфорилирования и/или агрегации тау-белка. Отдельные аспекты описывают регуляцию или модуляцию внутриклеточной передачи сигнала, связанной с указанными воспалительными ответами, путем модуляции по меньшей мере одного потенциала клеточной мембраны и/или проводимости, мембранных белков, таких как мембранные рецепторы, включая, но не ограничиваясь этим, сопряженные с G-белком рецепторы (GPCR) и межклеточные контакты (например, плотные контакты, щелевые контакты, опоясывающие контакты и десмосомы). Другие варианты воплощения изобретения включают отдельные пути введения или композиции для электрокинетически измененных жидкостей и терапевтических композиций.

(57) Реферат / Формула:

Описаны электрокинетически измененные жидкости (например, электрокинетически измененные и обогащенные газом жидкости и растворы), включающие ионный водный раствор кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом в количестве, достаточном для лечения воспалительного нейродегенеративного состояния или заболевания (например, таупатии) или по меньшей мере одного его симптома. Электрокинетически измененные жидкости или терапевтические композиции и способы включают электрокинетически измененные ионные водные жидкости, в некоторых случаях, в комбинации с другими терапевтическими агентами. Отдельные аспекты изобретения описывают модуляцию (например, снижение) фосфорилирования и/или агрегации тау-белка. Отдельные аспекты описывают регуляцию или модуляцию внутриклеточной передачи сигнала, связанной с указанными воспалительными ответами, путем модуляции по меньшей мере одного потенциала клеточной мембраны и/или проводимости, мембранных белков, таких как мембранные рецепторы, включая, но не ограничиваясь этим, сопряженные с G-белком рецепторы (GPCR) и межклеточные контакты (например, плотные контакты, щелевые контакты, опоясывающие контакты и десмосомы). Другие варианты воплощения изобретения включают отдельные пути введения или композиции для электрокинетически измененных жидкостей и терапевтических композиций.

---

Евразийское (21) 201300228 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.06.28
(51) Int. Cl. A61K 9/14 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки
2011.08.12
(54) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ТАУПАТИИ
(31) 61/373,223
(32) 2010.08.12
(33) US
(вв) PCT/US2011/047669
(87) WO 2012/021856 2012.02.16
(71) Заявитель:
РЕВАЛЕЗИО КОРПОРЕЙШН (US)
(72) Изобретатель:
Уотсон Ричард Л., Вуд Энтони Б., Аршамбо Грегори Дж. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Описаны электрокинетически измененные жидкости (например, электрокинетически измененные и обогащенные газом жидкости и растворы), включающие ионный водный раствор кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом в количестве, достаточном для лечения воспалительного нейродегенеративного состояния или заболевания (например, таупатии) или по меньшей мере одного его симптома. Электро-кинетически измененные жидкости или терапевтические композиции и способы включают элек-трокинетически измененные ионные водные жидкости, в некоторых случаях, в комбинации с другими терапевтическими агентами. Отдельные аспекты изобретения описывают модуляцию (например, снижение) фосфорилирования и/или агрегации тау-белка. Отдельные аспекты описывают регуляцию или модуляцию внутриклеточной передачи сигнала, связанной с указанными воспалительными ответами, путем модуляции по меньшей мере одного потенциала клеточной мембраны и/ или проводимости, мембранных белков, таких как мембранные рецепторы, включая, но не ограничиваясь этим, сопряженные с G-белком рецепторы (GPCR) и межклеточные контакты (например, плотные контакты, щелевые контакты, опоясывающие контакты и десмосомы). Другие варианты воплощения изобретения включают отдельные пути введения или композиции для электрокинетически измененных жидкостей и терапевтических композиций.
[5 -тубулин (Ф)-тау DAPI погружение
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ТАУПАТИИ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
5 Отдельные аспекты относятся в целом к воспалительным
нейродегенеративным заболеваниям (например, множественному склерозу, амиотрофическому боковому склерозу, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, инсульту/ишемии головного мозга, травме головы, травме спинного мозга, болезни Хантингтона, мигрени, церебральной амилоидной ангиопатии,
10 воспалительному нейродегенеративному состоянию, связанному со СПИДом, старческому снижению когнитивных способностей; таупатии, незначительного когнитивного нарушения и прионных заболеваний у млекопитающих), и в более специфических аспектах таупатии (например, болезни Альцгеймера, аргирофильной зернистости, лобно-височной деменции, прогрессирующего
15 надъядерного паралича, кортико-базальной дегенерации, лобно-височной лобарной дегенерации (болезни Пика) и Dementia pugilistica (DP) (известной также как деменция боксеров, хроническая энцефалопатия боксеров)), и регуляции или модуляции нейровоспаления, и, в частности, к композициям и способам лечения или профилактики таупатии или, по меньшей мере, одного симптома таупатии у
20 субъекта путем введения терапевтической композиции, включающей, по меньшей мере, одну полученную электрокинетически жидкость (например, электрокинетически полученные и обогащенные газом жидкости), как это описано в данной заявке, включая обогащенные газом (например, обогащенные кислородом) электрокинетически полученные жидкости, как это описано в данной
25 заявке. Дополнительные аспекты описывают комбинированную терапию.
ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Нейродегенеративные заболевания являются группой заболеваний, для которых типично ухудшение нейронов или их миелиновой оболочки. Такое 30 разрушение нейронов в конце концов приводит к дисфункции и недееспособности. Часто воспаление является компонентом нейродегенеративных заболеваний и вносит свой вклад в патогенез нейродегенерации (Minagar, et al. (2002) J. Neurological Sci. 202:13-23; Antel and Owens (1999) J. Neuroimmunol. 100: 181-189; Elliott (2001) Mol. Brain. Res. 95:172-178; Nakamura (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:94535 953; Whitton PS. (2007) Br J Pharmacol. 150:963-76). В целом, эти заболевания
DWT 17972687v2 0083535-032WO0
включают известные в науке воспалительные нейродегенеративные заболевания. Нейровоспаление может возникнуть за несколько лет до какой-либо значительной потери нейронов при определенных нейродегенеративных нарушениях (Tansey et. al., Fron Bioscience 13:709-717, 2008). Множество различных типов иммунных 5 клеток, включая макрофаги, нейтрофилы, Т-клетки, астроциты и клетки микроглии могут способствовать патологии иммуносвязанных заболеваний, таких как множественный склероз (МС), болезнь Паркинсона, амилоидоз (например, болезнь Альцгеймера), амиотрофический боковой склероз (АБС), прионные заболевания и ВИЧ-ассоциированная деменция. Более специфически, группами
10 исследователей было выявлено, что при МС повреждение миелина опосредуется воспалительным ответом (Ruffini et. al. (2004) Am J Pathol 164:1519-1522), и патогенез МС ухудшается при инфильтрации лейкоцитов в ЦНС (Dos Santos et. al. (2008) J Neuroinflammation 5:49). Одной группой исследователей были разработаны генетические модели для исследования воспаления ЦНС и его
15 эффектов на МС (с использованием экспериментальной животной модели аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ)). Кроме того, было выявлено, что провоспалительные цитокины (в частности, ФНО-альфа) были повышены при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и амиотрофическом боковом склерозе (АБС). (Greig et al (2006) Ann NY Acad of Sci 1035:290-315). Таким образом, такие
20 воспалительные нейродегенеративные заболевания могут быть подвергнуты эффективному лечению противовоспалительными препаратами.
Воспалительные нейродегенеративные заболевания включают, но не ограничиваются ими, следующие: множественный склероз (МС), болезнь Паркинсона, амилоидоз (например, болезнь Альцгеймера), амиотрифический
25 боковой склероз (АБС), ВИЧ-ассоциированная деменция, инсульт/церебральная ишемия, травма головы, поражение спинного мозга, болезнь Хантингтона, мигрень, амилоидная ангиопатия головного мозга, СПИД, связанное с возрастом снижение когнитивных способностей; незначительное нарушение когнитивной функции и прионные заболевания у млекопитающих.
30 Множественный склероз (МС) является хроническим воспалительным
нейродегенеративным заболеванием центральной нервной системы (ЦНС), которое встречается примерно у 1 100 000 людей по всеми миру, в частности, оно встречается у молодежи (Pugliatti et al. (2002) Clin. Neurol. Neuros. 104:182-191). МС характеризуется патологически димиелинизированием ткани нейрона, что
35 клинически приводит к возникновению одной или нескольких форм заболевания,
варьируя от доброкачественного новообразования до хронически-прогрессирующих форм состояния заболевания. Более специфически, описано пять основных форм множественного склероза: 1) доброкачественный множественный склероз; 2) рецидивирующе-ремиттирующий множественный 5 склероз (РРМС); 3) вторичный прогрессирующий множественный склероз (ВПМС); 4) первичный прогрессирующий множественный склероз (ППМС); и 5) прогрессирующе-рецидивирующий множественный склероз (ПРМС). Хронический прогрессирующий множественный склероз является термином, используемым для собирательного обозначения ВПМС, ППМС и ПРМС. Рецидивирующие формы
10 множественного склероза представлены ВПМС с накладывающимися обострениями, РРМС и ПРМС.
В течение курса заболевания отмечается прогрессивная деструкция миелиновой оболочки окружающих аксонов. Поскольку интактный миелин важен для сохранения целостности аксонов (Dubois-Dalcq et al., Neuron. 48, 9-12 (2005)),
15 систематическая деструкция приводит, в конце концов, клинически к различным нейрологическим дисфункциям, включая онемение и боль, проблемы с координацией и равновесием, слепоте и общему нарушению когнитивной функции. Интересен тот факт, что прогрессирование МС может по существу отличаться у пациентов с определенной недееспособностью легкой степени
20 тяжести спустя несколько десятилетий жизни с заболеванием, в то время как другие пациенты становятся зависимыми от инвалидной коляски в течение всего нескольких лет после постановки диагноза.
В настоящее время этиология МС неизвестна, но проводятся исследования, изучающие генетические доказательства, молекулярную основу и
25 иммунологические факторы для выяснения течения заболевания и механизма возникновения демиелинизации. В ходе генетических анализов некоторые отчеты выявили, что связанные индивидуумы имеют большую частоту возникновения МС при сравнении со здоровой популяцией (0,1% превалирование МС): однояйцевый близнец имеет 30% вероятность развития заболевания, если у другого близнеца
30 имеется МС, и у разнояйцевых близнецов и сибсов вероятность возникновения составляет 1-2%, если у другого сибса имеется МС. Использовали несколько групп для установления связи и ассоциации для открытия генов, ответственных за такую наследственность, при этом было выявлено, что относительный риск поражения МС в 3-4 раза выше у носителей аллеля класса II главного комплекса
35 гистосовместимости (ГКГС) лейкоцитарного антигена человека ((HLA)-DR2
аллеля). Были выявлены и другие гены, которые связаны с МС, но
обуславливают пониженный риск. Связь между восприимчивостью к МС и ГКГС
класса II наводит на мысль о роли CD4+ Т-клеток в патогенезе МС (Oksenberg et
al., JAMA 270:2363-2369 (1993); Olerup et al., Tissue Antigens 38:1-3 (1991)).
5 Кроме того, были предприняты попытки идентификации генов, которые
дифференциально экспрессируются у пациентов, страдающих МС, в сравнении со здоровыми индивидуумами. Генетические микроанализы использовали для 1) исследования транскрипции типов бляшек МС (острый в сравнении с хроническим) и участков образования бляшек (активные в сравнении с
10 неактивными) (Lock and Heller (2003)); 2) сравнения мононуклеоцитов периферической крови (МКПК) у пациентов с РРМС в сравнении с контролем, у пациентов с и без лечения интерфероном-В (Sturzebecher et al. (2003)); и 3) исследования клеток ЦНС на стадиях экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) у мышей, животной модели МС (Lock et al. (2002)).
15 Многое из того, что эти эксперименты выявили, было ожидаемым, включая тот факт, что противовоспалительные, антиапоптозные гены подвергаются подавлению, и провоспалительные, пролиферирующие гены активируются. Сюрпризом является и факт идентификации потенциальных новых мишеней для терапевтического применения, таких как остеопонтин (Chabas et al. 2001) и TRAIL
20 (Wandinger et al. 2003)). Однако большое число генов, имеющих дифференциальное регулирование при сравнении экспрессии у пациентов с МС со здоровыми индивидуумами, обладают невыясненной значимостью в развитии МС, поскольку любые гены, которые могут влиять на восприимчивость к МС и/или прогрессированию, все еще неизвестны.
25 Дополнительное исследование определило, что воспалительные ответы,
инициируемые аутореактивными CD4+ Т-клетками, могут опосредовать повреждение миелина (Bruck et al., J. Neurol. Sci. 206:181-185 (2003)). В целом считается, что большая часть такого повреждения, возникшего в миелиновых оболочках и аксонах во время эпизода МС, случается в ходе аутореактивного Т-
30 клеточного ответа, который продуцирует воспалительный ответ, включая секрецию провоспалительных (например, Th1 и Тп17) цитокинов (Prat et al., J. Rehabil. Res. Dev. 39:187-199 (2002); Hemmer et al., Nat. Rev. Neurosci. 3:291-301 (2002)).
Имеющееся в настоящее время лечение МС включает глатирамера ацетат, 35 интерферон-6, натализумаб и митоксантрон. В целом, такие препараты
супрессируют иммунную систему неспецифическим образом и только в
небольшой степени ограничивают общее прогрессирование заболевания.
(Lubetzki et al. (2005), Curr. Opin. Neurol. 18:237-244). Таким образом, существует
необходимость в разработке терапевтических стратегий для лучшего лечения МС.
5 Глатирамера ацетат состоит из глутаминовой кислоты, лизина, аланина и
тирозина, как неупорядоченного полимера. Глатирамера ацетат обладает ограниченной эффективностью и побочными эффектами по существу, например, образование опухания в месте инъекции, озноб, лихорадка, боль, одышка, учащенное сердцебиение и беспокойство. В важном клиническом исследовании с
10 использованием 943 пациентов с первичным прогрессирующим МС глатирамера ацетат не смог остановить прогрессирование недееспособности и заболевания (Wolinsky, et al (2007) Ann Neurol 61:13-24).
Интерферон-В является встречающимся в природе белком, вырабатываемым фибробластами, и является частью естественного иммунного
15 ответа. Как препарат для МС, интерферон-В примерно на 18-38% эффективнее в снижении частоты эпизодов МС. Побочные эффекты включают легкие гриппоподобные симптомы и реакции в месте введения и более серьезные (например, депрессия, припадки и проблемы с печенью).
Митоксантрон является препаратом для лечения МС. Он был разработан в
20 качестве препарата химиотерапии для использования в лечении рака, действуя путем интерференции с восстановлением и синтезом ДНК и не являясь специфическим для раковых клеток. Побочные эффекты митоксантрона могут быть достаточно тяжелыми и включать тошноту, рвоту, выпадение волос, поражение сердца и иммуносупрессию.
25 Натализумаб является гуманизированным моноклональным антителом,
которое направлено на альфа4-интегрен, являющийся клеточной адгезивной молекулой. Считается, что натализумаб функционирует путем удержания иммунных клеток, вызывающих воспаление, от пересечения гематоэнцефалитического барьера (ГЭБ). Побочные эффекты включают
30 утомляемость, головную боль, тошноту, простуду и аллергические реакции.
Болезнь Паркинсона, другое воспалительное нейродегенеративное заболевание, характеризуется нарушением движения, включая мышечную ригидность и медленные физические движения. Недавнее исследование болезни Паркинсона показало, что, благодаря повышенной экспрессии цитокинов и
антигенов HLA-DR, вероятно, что иммунный ответ способствует повреждению нейронов (Czlonkowska et. al. (2002) Med Sci Monit 8:RA165-77).
Амилоидоз развивается, когда определенные белки имеют измененную структуру и стремятся связываться в отдельной ткани и блокировать нормальное 5 функционирование ткани. Такие белки с измененной структурой называются амилоидами. Часто амилоидоз подразделяют на две категории: первичный или вторичный. Первичный амилоидоз возникает в результате заболевания при неправильном функционировании иммунных клеток. Вторичный амилоидоз обычно возникает в результате осложнения некоторых других хронических 10 инфекций или воспалительных заболеваний. Такие примеры включают болезнь Альцгеймера и ревматоидный артрит. Поскольку нижележащая проблема при вторичном амилоидозе является воспалением, преимущественным будет лечение воспаления.
Болезнь Альцгеймера является другим типом воспалительного
15 нейродегенеративного заболевания. Она выражается увеличением нарушения запоминания и памяти, однако само по себе заболевание может проявляться другими путями с изменением когнитивной функции. В течение заболевания прогрессирующая потеря нейронов и синапсов в коре головного мозга ведет к ухудшающейся атрофии нейральной ткани. Несмотря на то, что причина болезни
20 Альцгеймера неизвестна, многие считают, что воспаление играет важную роль, и клинические исследования показали, что воспаление по существу вносит свой вклад в патогенез заболевания (Akiyama, et. al. (2000) Neurobiol Aging. 21:383-421).
При амиотрофическом боковом склерозе была предположена взаимосвязь между воспалением и заболеванием (Centonze, et. al. (2007) Trends Pharm Sci
25 28:180-7). Кроме того, было выявлено, что в спинном мозге в модели трансгенной мыши с амиотрофическим боковым склерозом экспрессируется мРНК ФНО-альфа. Интересно, что транскрипт был обнаружен еще до возникновения трудностей в передвижении до момента смерти, вызванной АБС (Elliot (2001) Brain Res Mol Brain Res 95:172-8).
30 Таупатия. Таупатии представляют собой класс нейродегенеративных
заболеваний, возникших в результате патологической агрегации тау-белка в нейрофибриллярных клубках (НФК) в мозге человека. Тау-белки участвуют в стабилизации микротрубочек и преимущественно расположены в нейронах центральной нервной системы. В случае дефективности тау-белков,
35 микротрубочки более не стабилизируются надлежащим образом, что может
привести к слабоумию, такому как болезнь Альцгеймера, аргирофильная зернистость, лобно-височное слабоумие, прогрессирующий надъядерный паралич, кортико-базальная дегенерация, лобно-височная лобарная дегенерация (болезнь Пика) и Dementia pugilistica (DP) (известная также как деменция 5 боксеров, хроническая энцефалопатия боксеров, поражение, по меньшей мере, нейрофибриллярных клубков при DP). Таупатии, не относящиеся к болезни Альцгеймера, перечисленные выше, иногда группируют вместе в виде "комплекса Пика".
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
10 Отдельные аспекты описывают способ лечения таупатии или, по меньшей
мере, одного ее симптома, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества электрокинетически измененной водной жидкости, включающей ионный водный раствор кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом, которые имеют по существу
15 средний диаметр менее, чем примерно 100 нанометров и стабильно конфигурированы в ионной водной жидкости в количестве, достаточном для модуляции фосфорилирования тау-белка для обеспечения лечения таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, у субъекта. В определенных аспектах изобретения содержащие кислород наноструктуры со стабилизированным
20 зарядом стабильно конфигурированы в ионные жидкости на водной основе в количестве, достаточном для обеспечения, при контакте живой клетки с жидкостью, модуляции, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны. В отдельных вариантах воплощения изобретения содержащие кислород наноструктуры со
25 стабилизированным зарядом являются основными видами содержащих газ наноструктур со стабилизированным зарядом в жидкости. В определенных аспектах изобретения процент растворенных молекул кислорода, присутствующих в жидкости в виде содержащих кислород наноструктур со стабилизированным зарядом представлен процентом, выбираемым из группы, состоящей из более,
30 чем: 0,01%, 0,1%, 1%, 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; и 95%. В отдельных аспектах изобретения общий растворенный кислород по существу присутствует в содержащих кислород наноструктурах со стабилизированным зарядом. В отдельных вариантах воплощения изобретения содержащие кислород наноструктуры со
35 стабилизированным зарядом по существу имеют средний диаметр менее, чем
размер, выбираемый из группы, состоящей из: 90 нм; 80 нм; 70 нм; 60 нм; 50 нм; 40 нм; 30 нм; 20 нм; 10 нм; и менее, чем 5 нм.
В отдельных аспектах изобретения ионный водный раствор включает
физиологический раствор.
5 В отдельных аспектах изобретения жидкость супероксигенизирована.
В отдельных аспектах изобретения жидкость включает форму сольватированных электронов.
В отдельных вариантах воплощения изобретения изменение электрокинетически измененной водной жидкости включает воздействие на
10 жидкость гидродинамически-индуцированными, локализированными
электрокинетическими эффектами. В определенных аспектах изобретения воздействие локализированными электрокинетическими эффектами включает воздействие, по меньшей мере, импульса напряжения или импульса тока. В отдельных аспектах изобретения воздействие на жидкость гидродинамически-
15 индуцированными, локализированными электрокинетическими эффектами включает воздействие на жидкость электрокинетическими эффект-индуцирующими структурными параметрами устройства, используемого для получения жидкости.
В определенных аспектах изобретения таупатия включает, по меньшей
20 мере, заболевание, выбираемое из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, аргирофильной зернистости, лобно-височной деменции, прогрессирующего надъядерного паралича, кортико-базальной дегенерации, лобно-височной лобарной дегенерации (болезни Пика) и Dementia pugilistica (DP) (известной также как деменция боксеров, хроническая энцефалопатия боксеров).
25 Преимущественно, таупатия включает, по меньшей мере, одно заболевание аргирофильной зернистости, лобно-височной деменции, прогрессирующего надъядерного паралича, кортико-базальной дегенерации, лобно-височной лобарной дегенерации (болезни Пика). В отдельных вариантах воплощения изобретения таупатия включает лобно-височную деменцию.
30 В определенных аспектах изобретения, по меньшей мере, один симптом
относится, по меньшей мере, к одному состоянию, выбираемому из группы, состоящей из хронического воспаления в центральной нервной системе и мозге, и острого воспаления в центральной нервной системе и мозге.
В отдельных вариантах воплощения изобретения электрокинетически
35 измененная водная жидкость модулирует локализованные или клеточные уровни
оксида азота. В определенных аспектах изобретения электрокинетически
измененная водная жидкость способствует локализированному снижению в месте
введения, по меньшей мере, одного цитокина, выбираемого из группы, состоящей
из: ИЛ-1бета, ИЛ-8, ФНО-альфа и ФНО-бета.
5 Отдельный способ аспектов дополнительно включает синергическое или
несинергическое ингибирование или снижение воспаления путем одновременного или адъюнктивного лечения субъекта другим противовоспалительным агентом. В отдельных вариантах воплощения изобретения указанный противовоспалительный агент включает стероид или глюкокортикоидный стероид 10 (например, глюкокортикоидный стероид, включающий будесонид или его активное производное).
Отдельный способ аспектов дополнительно включает комбинированную терапию, при этом пациенту вводят, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент. В определенных аспектах изобретения, по меньшей мере,
15 один дополнительный терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из: глатирамера ацетата, интерферона-В, митоксантрона, натализумаба, ингибиторов ММР, включая ингибитор ММР-9 и ММР-2, краткодействующиеВ 2-агонисты, В 2-агонисты продолжительного действия, антихолинергические препараты, кортикостероиды, системные кортикостероиды, стабилизаторы тучных клеток,
20 модификаторы лейкотриенов, метилксантрны, 2-агонисты, альбутерол, левальбутерол, пирбутерол, артформотерол, формотерол, сальметерол, антихолинергические препараты, включая ипратропиум и тиотропиум; кортикостероиды, включая беклометазон, будесонид, флунисолид, флутиказон, мометазон, триамцинолон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон;
25 модификаторы лейкотриенов, включая монтелукаст, зафирлукаст и зилеутон; стабилизаторы тучных клеток, включая кромолин и недокромил; метилксантины, включая теофиллин; комбинированные препараты, включая ипратропиум и альбутерол, флутиказон и сальметерол, будесонид и формотерол; антигистамины, включая гидроксизин, дифенгидрамин, лоратадин, цетиризин и
30 гидрокортизон; препараты-модуляторы иммунной системы, включая такролимус и пимекролимус; циклоспорин; азатиоприн; микофенолата мофетил; и их комбинации.
В отдельных вариантах воплощения изобретения, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент представлен TSLP и/или антагонистом 35 TSLPR (например, TSLP и/или антагонист TSLPR выбирают из группы, состоящей
из нейтрализующих антител, специфических относительно TSLP и рецептора
TSLP, растворимых молекул рецептора TSLP и белков слияния рецептора TSLP,
включая молекулы TSLPR-иммуноглобулин Fc или полипептиды, кодирующие
компоненты более, чем одной цепи рецептора).
5 В определенных аспектах изобретения модуляция, по меньшей мере,
одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны, включает модуляцию, по меньшей мере, одной структуры клеточной мембраны или функции, включающей модуляцию, по меньшей мере, одной конформации, лиганд-связущей активности или каталитической активности связанного с
10 мембраной белка. В определенных аспектах изобретения мембран-ассоциированный белок включает, по меньшей мере, один белок, выбираемый из группы, состоящей из рецепторов, трансмембранных рецепторов, белков ионных канальцев, внутриклеточных присоединенных белков, белков клеточной адгезии и интегринов. В отдельных вариантах воплощения изобретения трансмембранный
15 рецептор включает сопряженный с G-белком рецептор (GPCR). В определенных аспектах изобретения сопряженный с G-белком рецептор (GPCR) взаимодействует са -субъединицей G-белка (например, еслиа -субъединица G-белка включает, по меньшей мере, субъединицу, выбираемую из группы, состоящей из Gas, Gcij, Gaq и Gai2).
20 В отдельных вариантах воплощения изобретения модуляция проводимости
клеточной мембраны включает модуляцию проводимости всей клетки. В определенных аспектах изобретения модуляция проводимости всей клетки включает модуляцию, по меньшей мере, одного потенциал-зависимого фактора проводимости всей клетки.
25 В отдельных аспектах изобретения модуляция, по меньшей мере, одного
потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны включает модуляцию внутриклеточной передачи сигнала, включающую, по меньшей мере, одно из следующего: модуляция кальций-зависимых клеточных путей или системы передачи сигнала; модуляция внутриклеточной передачи сигнала,
30 включающая модуляцию активности фосфолипазы С; модуляция внутриклеточной передачи сигнала, включающая модуляцию активности аденилатциклазы (АЦ); и модуляция внутриклеточной передачи сигнала, связанная, по меньшей мере, с одним состоянием или симптомом, выбираемым из группы, состоящей из: хронического воспаления центральной нервной системы и головного мозга, и
35 острого воспаления центральной нервной системы и головного мозга.
Определенные аспекты включают введение в сеть клеток или слой клеток и дополнительно включают модуляцию межклеточного соединения. В отдельных вариантах воплощения изобретения внутриклеточный контакт включает, по меньшей мере, один контакт, выбираемый из группы, состоящей из плотных 5 контактов, щелевых контактов, опоясывающих контактов и десмосом. В определенных аспектах изобретения система клеток или слоев включает, по меньшей мере, таковые, выбираемые из группы, состоящей из эндотелиальных клеток и плотных контактов эндотелия и астроцитов в сосудах ЦНС, плотных контактов крови-спинномозговой жидкости или барьера, контактов по типу
10 легочного эпителия, контактов по типу бронхиального эпителия и контактов по типу кишечного эпителия.
В отдельных вариантах воплощения изобретения электрокинетически измененная водная жидкость оксигенирована, и при этом кислород в жидкости присутствует в количестве, по меньшей мере, 8 промилле, по меньшей мере, 15
15 промилле, по меньшей мере, 25 промилле, по меньшей мере, 30 промилле, по меньшей мере, 40 промилле, по меньшей мере, 50 промилле, или, по меньшей мере, 60 промилле кислорода при атмосферном давлении. В определенных аспектах изобретения количество кислорода, присутствующего в кислородсодержащих наноструктурах со стабилизированным зарядом в
20 электрокинетически измененной жидкости составляет, по меньшей мере, 8 промилле, по меньшей мере, 15 промилле, по меньшей мере, 20 промилле, по меньшей мере, 25 промилле, по меньшей мере, 30 промилле, по меньшей мере, 40 промилле, по меньшей мере, 50 промилле или, по меньшей мере, 60 промилле кислорода при атмосферном давлении.
25 В определенных аспектах изобретения электрокинетически измененная
водная жидкость включает, по меньшей мере, одну из форм сольватированных электронов и электрокинетически модифицированные или заряженные виды кислорода. В отдельных вариантах воплощения изобретения форма сольватированных электронов или электрокинетически модифицированных или
30 заряженных видов кислорода присутствует в количестве, по меньшей мере, 0,01 промилле, по меньшей мере, 0,1 промилле, по меньшей мере, 0,5 промилле, по меньшей мере, 1 промилле, по меньшей мере, 3 промилле, по меньшей мере, 5 промилле, по меньшей мере, 7 промилле, по меньшей мере, 10 промилле, по меньшей мере, 15 промилле или, по меньшей мере, 20 промилле. В
35 определенных аспектах изобретения электрокинетически измененная
оксигенированная водная жидкость включает сольватирвоанные электроны, стабилизированные, по меньшей мере, частично, молекулярным кислородом.
В определенных аспектах изобретения способность модулировать, по меньшей мере, один потенциал клеточной мембраны и проводимость клеточной 5 мембраны сохраняется в течение, по меньшей мере, двух, по меньшей мере, трех, по меньшей мере, четырех, по меньшей мере, пяти, по меньшей мере, 6, по меньшей мере, 12 месяцев или более длительных периодов в закрытом газонепроницаемом контейнере.
В отдельных вариантах воплощения изобретения связанный с мембраной
10 белок включает CCR3.
В определенных аспектах изобретения лечение таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, включает модуляцию внутриклеточной экспрессии и/или активности NF-KB.
Дополнительные аспекты изобретения описывают способ получения
15 композиции терапевтического агента, подходящей для использования в лечении таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, включающий: получение терапевтического агента, подходящего для использования в лечении таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, у субъекта; и комбинацию терапевтического агента с количеством электрокинетически измененной водной
20 жидкости, включающей ионный водный раствор кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом, имеющих по существу средний диаметр менее, чем примерно 100 нанометров и стабильно конфигурированных в ионную водную жидкость в количестве, достаточном для лечения таупатии, или, по меньшей мере, одного ее симптома, при этом описан способ получения
25 композиции терапевтического агента, подходящего для лечения таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома. В определенных аспектах изобретения содержащие кислород наноструктуры со стабилизированным зарядом стабильно конфигурированы в ионные жидкости на водной основе в количестве, достаточном для обеспечения, при контакте живой клетки с жидкостью, модуляции, по меньшей
30 мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны.
Дополнительные аспекты описывают фармацевтическую композицию, включающую: терапевтический агент, подходящий для использования в лечении таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, у субъекта; и количество 35 электрокинетически измененной водной жидкости, включающей ионный водный
раствор содержащих кислород наноструктур со стабилизированным зарядом по
существу со средним диаметром менее, чем примерно 100 нанометров и
стабильно конфигурированных в ионной водной жидкости в количестве,
достаточном для лечения таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома.
5 Дополнительные аспекты описывают фармацевтическую композицию,
получаемую с использованием описанных здесь способов.
В определенных аспектах изобретения лечение включает введение, по меньшей мере, местным путем, ингаляцией, интраназальным, пероральным, внутривенным (в/в) и интраперитонеальным (и/п) путем.
10 В отдельных аспектах изобретения кислородсодержащие наноструктуры со
стабилизированным зарядом электрокинетически измененной жидкости включают, по меньшей мере, одну соль или ион из представленных здесь в Таблицах 1 и 2.
В отдельных аспектах изобретения субъект представлен млекопитающим, преимущественно, человеком.
15 В отдельных аспектах изобретения лечение включает модуляцию
фосфорилирования тау-белка.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ Фигура 1 отображает профиль цитокинов в ходе митогенного анализа в 20 присутствии обогащенной газом жидкости и деионизированной контрольной жидкости.
Фигура 2 отображает результаты контакта спленоцитов с МОГ в присутствии оксигенированной жидкости, находящейся в камере под давлением (1), обогащенной газом жидкости по изобретению (2) или контрольной 25 деионизированной жидкости (3).
Фигуры 3 А-С отображают результаты серий экспериментов фиксации потенциала, которые оценивали эффекты электрокинетически полученной жидкости (например, RNS-60 и Solas) на полярность мембраны эпителиальных клеток и активность ионных каналов в двух временных точках (15 минут (слева) и 30 2 часа (справа)) при разных протоколах напряжения.
Фигуры 4 А-С отображают, относительно экспериментов, указанных на Фигурах 3 А-С, графики, полученные в результате вычитания данных тока Solas от данных тока RNS-60 при трех протоколах напряжения (А. от нуля мВ; В. От -60 мВ; С. От -120 мВ) и двух временных точках (15 минут (светлые кружки) и 2 часа 35 (черные кружки)).
Фигуры 5 A-D отображают результаты серий экспериментов фиксации потенциала, которые оценивали эффекты электрокинетически полученной жидкости (например, Solas (фигуры А. и В.) и RNS-60 (фигуры С. и D.)) на полярность мембраны эпителиальных клеток и активность ионных каналов с 5 использованием различных внешних солевых растворов при разных протоколах напряжения (фигуры А. и С. отображают повышение от 0 мВ; фигуры В. и D. повышение от -120 мВ).
Фигуры 6 A-D отображают, относительно экспериментов, представленных на Фигурах 5 A-D, графики, полученные от вычитания данных тока CsCI 10 (отображены на Фигуре 5) от данных тока 20 мМ CaCI2 (ромбы) и 40 мМ CaCI2 (черные квадраты) при двух протоколах напряжения (фигуры А. и С. повышение от нуля мВ; В. и D. повышение от -120 мВ) для Solas (фигуры А. и В.) и Revera 60 (фигуры С. и D.).
Фигура 7 отображает по существу эффективность электрокинетической 15 жидкости по изобретению (RNS-60) в известной в науке крысиной модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) множественного склероза (МС).
Фигура 8 отображает схематическую индукцию ЭАЭ и режимы лечения,
используемые в эксперименте, представленном на Фигуре 7.
20 Фигура 9А является графическим представлением массы тела (в граммах)
животных, подвергнутых режиму лечения ЭАЭ, используемому в эксперименте, представленном на Фигурах 7 и 8. Фигура 9В отображает рассчитанное изменение массы тела (в процентах) животных, подвергнутых режиму лечения ЭАЭ.
25 Фигуры 10 A-D отображают факт того, что электрокинетическая жидкость по
изобретению (RNS-60) незначительно влияла на уровень общих белых кровяных клеток (лейкоцитов (Л)), нейтрофилов и лимфоцитов при сравнении с контролем носителем во время режима лечения ЭАЭ, который использовали в экспериментах, представленных на Фигурах 7 и 8. Фигуры А, В, С и D отображают
30 результаты на дни исследования 0, 7, 14 и 21, соответственно.
Фигуры 11 А-Н (A-D) отображают эффект электрокинетической жидкости по изобретению (RNS-60) на уровни цитокинов спустя 7 дней (A-D) и 18 дней (Е-Н) после режима лечения ЭАЭ, который использовали в экспериментах, представленных на Фигурах 7 и 8. Фигуры А и Е отображают уровни ИЛ-17 после
35 лечения. Фигуры В и F отображают уровни ИЛ-1а после лечения. Фигуры С и G
отображают уровни ИЛ-13 после лечения. Фигуры D и Н отображают уровни ИЛ-4 после лечения.
Фигура 12 отображает факт того, что электрокинетическая жидкость по изобретению (RNS-60), а не контрольный физиологический раствор (ФР), 5 ослабевает МРР+-индуцируемую экспрессию индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) и интерлейкина-1р (ИЛ-13) в микроглиальных клетках мыши (BV-2 микроглиальные клетки).
Фигура 13 отображает тот факт, что RNS60, в отличие от нормального физиологического раствора (ФР), супрессирует фибриллярны$1 А -42)-
10 опосредованный апоптоз нейронных клеток SHSY5Y человека. После дифференциации клетки SHSY5Y были инкубированы с разными концентрациями RNS60 или ФР в течение 1 часа с последующим повреждением 1 мкМ фибриллярными $(1 -42) пептидами. Спустя 18 ч обработки, апоптоз был подвергнут мониторингу с использованием TUNEL (Calbiochem). Пептиды ЩА2 -
15 1) также были инкубированы в качестве контроля. Результаты представляют три независимых эксперимента.
Фигура 14 отображает тот факт, что RNS60, в отличие от контрольного носителя (Носитель), является по существу эффективным в супрессии клинического показателя дозозависимым образом в известной в науке мышиной
20 модели МОГ экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) множественного склероза (МС). Терапевтическое ежедневное введение высокой и низкой дозы RNS-60, а также введение высокой дозы RNS-60 каждые три дня (введение RNS-60 во всех случаях начинается примерно с первыми клиническими признаками), показало значительное снижение клинического показателя (светлые
25 ромбы = контроль Носителя; светлые квадраты = положительный контроль дексаметазона; светлые "х" = ежедневное введение низкой дозы (0,09 мл RNS60) при возникновении клинических признаков; темные "х" = введение высокой дозы (0,2 мл RNS60) каждые три дня при возникновении клинических признаков; и светлые треугольники = ежедневное введение высокой дозы (0,2 мл RNS60) при
30 возникновении клинических признаков).
Фигуры 15 А-В отображают результаты анализа сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS), при этом уровни экспрессии рецептора клеточной поверхности, CD193 (CCR3), на белых кровяных клетках было сопоставимо с использованием нормального физиологического раствора
или RNS-60. Ось X представляет log флуоресценции образца, а ось Y представляет явления флуоресценции, происходящие в образце.
Фигуры 16 А-С отображают результаты анализа сортировки
флуоресцентно-активированных клеток (FACS), при этом уровни экспрессии
5 рецептора клеточной поверхности, CD154 (CD40L) (фигура A); CD11B (фигура В);
и CD3 (фигура С), на белых кровяных клетках было сопоставимо с
использованием нормального физиологического раствора или RNS-60. Ось X
представляет log флуоресценции образца, а ось Y представляет явления
флуоресценции, происходящие в образце.
10 Фигуры 17 А-С представляют результаты двух экспериментов смещения в
геле (фигуры А и В) и анализа активности люциферазы (ген-репортер) (фигура С), которые исследовали эффекты RNS60 на активацию NFKB В МВР-примированных Т-клетках.
Фигуры 18 А-В представляют результаты эксперимента, исследующего 15 эффекты RNS60 на фибриллярное АВ(1-42)-опосредованное фосфорилирование тау-белка в первичных нейронах. Фосфорилирование тау-белка было опосредовано двухмаркерной иммунофлуоресценцией с использованием антител к В-тубулину и фосфо-тау. Бета-тубулин использовали как маркер для нейронов, и окрашивание DAPI использовали для визуализации ядер клеток.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Определенные представленные здесь варианты воплощения изобретения описывают композиции и способы лечения, по меньшей мере, одного симптома воспалительного нейродегенеративного заболевания, включая, но не
25 ограничиваясь этим, таупатию (например, болезнь Альцгеймера, аргирофильное заболевание, лобно-височную деменцию, прогрессирующий надъядерный паралич, кортико-базальную дегенерацию, лобно-височную лобарную дегенерацию (болезнь Пика) и Dementia pugilistica (DP) (известную также как деменцию боксеров, хроническую энцефалопатию боксеров)), путем локального
30 контакта или введения субъекту (например, млекопитающему или человеку) терапевтической композиции, включающей новейшую электрокинетически полученную жидкость. В определенных специфических вариантах воплощения изобретения электрокинетически полученные жидкости включают обогащенную газом электрокинетически полученную жидкость, включающую обогащенную
35 кислородом воду.
Таупатии представляют собой класс нейродегенеративных заболеваний, возникших в результате патологической агрегации тау-белка в нейрофибриллярных клубках (НФК) в мозге человека. Тау-белки участвуют в стабилизации микротрубочек и преимущественно расположены в нейронах 5 центральной нервной системы. В случае дефективности тау-белков, микротрубочки более не стабилизируются надлежащим образом, что может привести к слабоумию, такому как болезнь Альцгеймера, аргирофильная зернистость, лобно-височное слабоумие, прогрессирующий надъядерный паралич, кортико-базальная дегенерация, лобно-височная лобарная дегенерация
10 (болезнь Пика) и Dementia pugilistica (DP) (известная также как деменция боксеров, хроническая энцефалопатия боксеров, поражение, по меньшей мере, нейрофибриллярных клубков при DP). Таупатии, не относящиеся к болезни Альцгеймера, перечисленные выше, группируют вместе в виде "комплекса Пика". Согласно отдельным аспектам, описанные электрокинетически полученные
15 жидкости используют по существу для лечения таупатий, не относящихся к болезни Альцгеймера или комплексу Пика (например, заболевание аргирофильной зернистости, лобно-височная деменция, прогрессирующий надъядерный паралич, кортико-базальная дегенерация, лобно-височная лобарная дегенерация (болезнь Пика), DP и т.д.).
20 Болезнь аргирофильной зернистости (БАЗ; также называется болезнью
Браака) является спорадической поздней формой деменции, характеризующейся нейродегенеративным процессом, который преимущественно поражает лимбические структуры (например, миндалину, гиппокамп и медиобазальную височную/энторинальную область коры) (см. Tolnay М et al. Argyrophilic grain
25 disease: widespread hyperphosphorylation of tau protein in limbic neurons. Acta Neuropathol 1997; 93:477-84, включенный сюда во всей своей полноте и, в частности, для объяснения гиперфосфорилирования вовлечения тау-белка в БАЗ). Заболевание названо после окрашивания серебром (аргирофильным) зерен или спиральных телец, находящихся в цитоплазме нейронов, которые
30 состоят преимущественно из аномально фосфорилированных изоформ тау-белков с четырьмя повторами связанных микротрубочек (4-R tau) (Togo Т et al. Argyrophilic grain disease is a sporadic 4-repeat tauopathy. J Neuropathol Exp Neurol. 2002; 61:547-56; Togo T et al. Argyrophilic grain disease: neuropathology, frequency in a dementia brain bank and lack of relationship with apolipoprotein E. Brain Pathol.
35 2002; 12:45-52, включено сюда во всей своей полноте и, в частности, для
объяснения вовлечения тау-белка в БАЗ). Симптомы БАЗ включают: снижение краткосрочной памяти, трудности с подбором слова, трудности чтения и письма, дезориентация, изменения в поведении (личностные изменения, эмоциональные изменения с агрессией и раздражением). Эти симптомы могут предшествовать 5 или следовать провалам памяти. Возраст возникновения составляет примерно 70 лет, и продолжительность заболевания составляет от 4 до 8 лет. Дегенерация нейронов обычно ассоциируется с дисфункцией тау-белка. Интересен тот факт, что БАЗ может со-существовать с другими таупатиями, такими как прогрессирующий надъядерный паралич и кортико-базальная дегенерация
10 (Dickson, Neuropathology of Non-Alzheimer Degenerative Disorders. Int J Clin Exp Pathol. 2010; 3(1): 1-23; включено сюда во всей своей полноте, в частности, для пояснения нейропатологии дегенеративных нарушений, не являющихся болезнью Альцгеймера). В настоящее время лечение БАЗ включает лечение, используемое при болезни Альцгеймера.
15 Лобно-височная деменция (ЛВД) является клиническим синдромом,
вызванным дегенерацией лобной доли головного мозга, которая может распространяться на височную долю. Он является одним из трех синдромов, вызванных лобно-височной дегенерацией, и вторым наиболее частым ранним возникновением деменции после болезни Альцгеймера (Haberland, С (2010).
20 "Frontotemporal dementia or frontotemporal lobar degeneration-overview of a group of proteinopathies". Ideggyogyaszati szemle 63 (3-4): 87-93; включено сюда во всей своей полноте и, в частности для пояснения нейропатологии лобно-височной деменции). Симптомы могут быть классифицированы (приблизительно) на две группы, которые лежат в основе функций лобной доли: поведенческие симптомы
25 (и/или личностные изменения) и симптомы, относящиеся к проблемам исполнительной функции. Поведенческие симптомы включают летаргию и аспонтанность или, наоборот, растормаживание. Исполнительная функция представлена когнитивным умением планировать и организовывать и, таким образом, пациенты становятся неспособными выполнять действия, требующие
30 комплексного планирования и последовательных действий. Кроме того, существуют специфические клинические проявления ЛВД, включая: первичную прогрессирующую афазию (ППА) и семантическую деменцию (СД). Возраст возникновения составляет примерно от 40 до 50 лет, и медиана времени выживаемости составляет семь лет. Лечение ЛВД отсутствует.
Прогрессирующий надъядерный паралич (также обозначаемый как синдром Стила-Ричардсона-Ольшевского) является нарушением, вызванным повреждением определенных нервных клеток в головном мозге, характеризующимся прогрессирующей потерей координации, ригидности затылка 5 и туловища, затруднении в движении глаз, медленных движениях, когнитивной дисфункции и трудностей при ходьбе, которые могут привести к падению. ПНП принадлежит к таупатиям 4R (агрегация изоформ тау-белка с 4 повторениями) (Sergeant N., Wattez A. and Delacourte А. (1999) Neurofibrillary degeneration in progressive supranuclear palsy and corticobasal degeneration: tau pathologies with
10 exclusively exon 10 isoforms. J Neurochem 72, 1243-1249; включено сюда во всей своей полноте посредством ссылки). ПНП является крайне индивидуальным заболеванием, которое поражает различных людей различным образом при разных скоростях прогрессирования. Ранние симптомы "классических" случаев ПСП включают тенденцию к неожиданному падению, обычно назад. Другие общие
15 симптомы включают ригидность и изгибание шеи назад, а также - как основной диагностический признак - надъядерный паралич. Это заключается в трудности "самовольного" взгляда вверх и взгляда вниз, т.е. способности пациента произвольно передвигать глазами вверх и вниз при поддержании головы в одном положении. Походка пациента с ПНП немного нестабильна и широкая. ПНП
20 является нарушением, характеризующимся симптомами, подобными болезни Паркинсона (включая нестабильную походку, затруднения в передвижении и незначительную деменцию). ПНП на ранних стадиях может быть неправильно диагностирован как болезнь Паркинсона. Крошечный, сжатый почерк и некоторые личностные изменения часто являются другими признаками заболевания.
25 Когнитивные симптомы включают пониженную беглость речи, дефицит внимания, дисфункцию исполнительной функции, замедление обработки информации и проблемы с комплексным и абстрактным мышлением. Тем не менее, пациент все еще отдает себе отчет в происходящем. Поведенческие изменения включают эмоциональную нестабильность и вспышки гнева. Вначале появляются
30 двигательные симптомы, которые всегда предшествуют когнитивным изменениям. Прогрессирование заболевания медленное в течение от 5 до 10 лет. Возраст возникновения обычно составляет старше 50 лет, и продолжительность заболевания составляет 7 лет. Лечение направлено на контроль симптомов. Известного лечения прогрессирующего надъядерного паралича не существует.
Леводопа и антихолинергические препараты могут временно уменьшить симптомы.
Кортико-базальная дегенерация (КБД) или кортико-базальная ганглиозная дегенерация (КБГД) является редким прогрессирующим нейродегенеративным 5 заболеванием, поражающим кору головного мозга и базальные ганглии. Оно характеризуется существенными нарушениями движения и когнитивной дисфункцией. Клиническая диагностика затруднена, так как симптомы КБД часто похожи на другие заболевания, такие как болезнь Паркинсона (БП) и прогрессирующий надъядерный паралич (ПНП). КБД по существу спорадическая.
10 Дегенерация поражает много субкортикальных ядер и распространяется в неокору лобной и теменных зон с накоплением тау-белка в пораженных зонах в нейронах и астроцитах. Генетический фактор риска представлен Н1Н1 в гене тау-белка. Принадлежит к таупатиям 4R (агрегация изоформ тау-белка с 4 повторениями) (Sergeant N., Wattez A. and Delacourte А. (1999) Neurofibrillary degeneration in
15 progressive supranuclear palsy and corticobasal degeneration: tau pathologies with exclusively exon 10 isoforms. J Neurochem 72, 1243-1249; включено сюда во всей своей полноте посредством ссылки). Симптомы включают признаки паркинсонизма, такие как плохая координация, акинезия (отсутствие движений), ригидность (устойчивость к вынужденным движениям) и отсутствие равновесия
20 (нарушение равновесия); а также дистонию конечностей (аномальные мышечные позы). Могут также возникнуть и другие симптомы, такие как нарушение когнитивной функции и визуально-пространственные нарушения, апраксия (потеря способности сделать знакомые, целенаправленные движения), колеблющаяся и прерывающаяся речь, миоклонус и дисфагия (затруднение при
25 глотании). КБД является прогрессирующим заболеванием, и в течение курса от одного до нескольких лет состояние большинства людей с КБД постепенно ухудшается, при этом симптомы прогрессируют и поражают конечности сверху вниз и другие участки тела. Возраст возникновения составляет примерно 60 лет. Продолжительность заболевания составляет от 5 до 10 лет. В настоящее время
30 не существует каких-либо препаратов или других терапий, которые могут замедлить прогресс заболевания, и лишь некоторые предлагают снижение симптомов. Тремор и миоклонус может быть контролирован в некоторой степени такими препаратами, как клоназепам. Боклофен может помочь снизить в некоторой степени ригидность. Леводопа и другие допаминергические препараты,
используемые для лечения болезни Паркинсона, редко, но могут помочь некоторым пациентам с КБД.
Лобно-височная лобарная дегенерация (ЛВЛД) является названием для группы клинических, патологических и генетически гетерогенных нарушений, 5 связанных с атрофией лобной доли и височной доли головного мозга, с распространением на затылочную и теменную доли. В возрасте старше 65 лет ЛВЛД, вероятно, является четвертой наиболее частой причиной деменции после болезни Альцгеймера, деменции с тельцами Леви и васкулярной деменции. В группе младше 65 лет она является второй наиболее частой причиной после
10 болезни Альцгеймера. У некоторых пациентов симптомы ЛВЛД и болезни Альцгеймера могут перекрываться. Патологические процессы, ответственные за клинический профиль ЛВЛД, являются гетерогенными и преимущественно относятся к различным дисфункциям гена тау-белка или тау-протеина (мутации, агрегация, аномальная выработка). Такие различные аномальные процессы тау-
15 белка проявляются различными типами поражений головного мозга, которые приводят к накоплению в коре пациентов и, более специфически, в лобно-височных долях (тела Пика, нейрофибриллярные клубки, астроцитарные бляшки).
Dementia pugilistica (DP) является типом нейродегенеративного заболевания или деменции, которая может поражать боксеров-любителей или
20 профессионалов, а также атлетов из других видов спорта с сотрясениями мозга. Она также называется хронической энцефалопатией боксеров, травматической энцефалопатией боксеров, деменцией боксеров, хроническим травматическим поражением мозга, связанным с боксом (CTBI-B), и синдромом сотрясения мозга (состояние "не в себе"), а также формой варианта, хронической травматической
25 энцефалопатией. Симптомы и признаки DP развиваются прогрессивно в течение длительного латентного периода, иногда достигающего десятилетий, со средним временем возникновения примерно 12-16 лет после начала карьеры в боксе. Считается, что состояние поражает примерно 15-20% профессиональных боксеров. Состояние, возникающее у боксеров, испытавших на себе повторные
30 удары в голову, проявляется как деменция или снижение умственных способностей, проблемы с памятью и паркинсонизм, или тремор и потеря координации. Оно также может вызвать проблемы с речью и неустойчивую походку. Пациенты с DP могут быть склонны к несоответствующему или вспыльчивому поведению и могут выражать патологическую ревность или
35 паранойю. Индивидуумы с такими симптомами также могут характеризоваться как
"заторможенные", т.е. другим термином, обозначающим человека, страдающего
от DP. Головной мозг пациентов с DP атрофируется и теряет нейроны, например,
в мозжечке. Пациенты могут быть подвергнуты лечению препаратами,
используемыми для лечения болезни Альцгеймера и паркинсонизма.
5 В дополнительных вариантах воплощения изобретения описаны
терапевтические композиции и способы лечения для профилактики или снижения степени тяжести осложнений, связанных с таупатиями, включая снижение симптомов когнитивного нарушения, например.
10 Электрокинетически полученные жидкости:
В контексте данного изобретения термин "электрокинетически полученная жидкость" обозначает электрокинетически полученные жидкости по изобретению, полученные Заявителями в целях проведения описанных здесь Примеров, путем использования устройства для смешивания, описанного подробно в тексте данной
15 заявки (см. также US200802190088 и WO2008/052143, которые включены сюда во всей своей полноте посредством ссылки). Электрокинетические жидкости, как это показано описанными и представленными здесь данными, представляют собой новейшие и фундаментально отличающиеся жидкости относительно известных ранее в науке неэлектрокинетических жидкостей, включая известные ранее в
20 науке оксигенированные неэлектрокинетические жидкости (например, оксигенированные жидкости в контейнере под давлением и т.п.). Как это описано в различных аспектах в тексте данной заявки, электрокинетически полученные жидкости обладают уникальными и новейшими физическими и биологическими свойствами, включая, но не ограничиваясь этим, следующие:
25 В отдельных аспектах электрокинетически измененная жидкость включает
ионный водный раствор кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом, по существу имеющих средний диаметр менее, чем примерно 100 нанометров и стабильно конфигурированных в ионной водной жидкости в количестве, достаточном для обеспечения, при контакте живой клетки
30 с жидкостью, модуляции, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны.
В отдельных аспектах электрокинетически полученные жидкости относятся к жидкостям, полученным в присутствии гидродинамически индуцированных, локализированных (например, неоднородно относительно общего объема
35 жидкости) электрокинетических эффектов (например, импульсов
напряжения/тока), таких как локализированные эффекты устройства, как это описано в тексте данной заявки. В отдельных аспектах указанные гидродинамически индуцированные, локализированные электрокинетические эффекты находятся в комбинации с поверхностным двойным слоем и/или 5 эффектами мембранного тока, как это описано и обсуждается в тексте данной заявки.
В отдельных аспектах вводимые электрокинетически измененные жидкости по изобретению включают кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом в количестве, эффективном для обеспечения
10 модуляции, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны. В определенных вариантах воплощения изобретения электрокинетически измененные жидкости являются супероксигенированными (например, RNS-20, RNS-40 и RNS-60, включающие 20 промилле, 40 промилле и 60 промилле растворенного кислорода, соответственно,
15 в стандартном физиологическом растворе). В отдельных вариантах воплощения изобретения электрокинетически измененные жидкости не являются супероксигенированными (например, RNS-10 или Solas, включающие 10 промилле (например, примерно фоновые уровни растворенного кислорода в стандартном физиологическом растворе)). В определенных аспектах минерализация,
20 стерильность, рН и т.д. электрокинетически измененных жидкостей по изобретению устанавливают во время электрокинетического получения жидкости, и стерильные жидкости вводят соответствующим путем. С другой стороны, по меньшей мере, один из показателей минерализации, стерильности, рН и т.д. жидкостей корректируют соответствующим образом (например, с использованием
25 стерильного физиологического раствора или соответствующих растворителей), чтобы быть физиологически совместимыми с путем введения перед введением жидкости. Преимущественно, растворители и/или физиологические растворы и/или композиции буфера, используемые для корректировки, по меньшей мере, одного из показателей минерализации, стерильности, рН и т.д. жидкостей,
30 являются также электрокинетическими жидкостями, или они совместимы иным образом.
В отдельных аспектах электрокинетически измененные жидкости по изобретению включают физиологический раствор (например, одна или несколько растворенных солей; например, соли щелочных металлов (Li+, Na+, К+, Rb+, Cs+ 35 и т.д.), соли щелочно-земельных металлов (например, Мд++, Са++) и т.д., или
положительные ионы переходных металлов (например, Cr, Fe, Со, Ni, Си, Zn и т.д.), в каждом случае вместе с подходящим анионным компонентом, включая, но не ограничиваясь этим, F-, CI-, Br-, I-, Р04-, S04- и анионы на основе азота. Отдельные аспекты включают электрокинетические жидкости на основе 5 смешанной соли (например, Na+, К+, Са++, Мд++, иона (-ов) переходных металлов и т.д.) в различных комбинациях и концентрациях, и в некоторых случаях смешанных с противоионами. В отдельных аспектах электрокинетически измененные жидкости по изобретению включают стандартный физиологический раствор (например, приблизительно 0,9% NaCI, или примерно 0,15 М NaCI). В
10 отдельных аспектах электрокинетически измененные жидкости по изобретению включают физиологический раствор в концентрации, по меньшей мере, 0,0002 М, по меньшей мере, 0,0003 М, по меньшей мере, 0,001 М, по меньшей мере, 0,005 М, по меньшей мере, 0,01 М, по меньшей мере, 0,015 М, по меньшей мере, 0,1 М, по меньшей мере, 0,15 М, или, по меньшей мере, 0,2 М. В отдельных аспектах
15 проводимость электрокинетически измененных жидкостей по изобретению составляет, по меньшей мере, 10 мкСм/см, по меньшей мере, 40 мкСм/см, по меньшей мере, 80 мкСм/см, по меньшей мере, 100мкСм/см, по меньшей мере, 150 мкСм/см, по меньшей мере, 200 мкСм/см, по меньшей мере, 300 мкСм/см, или, по меньшей мере, 500 мкСм/см, по меньшей мере, 1 мСм/см, по меньшей
20 мере, 5 мСм/см, 10 мСм/см, по меньшей мере, 40 мСм/см, по меньшей мере, 80 мСм/см, по меньшей мере, 100 мСм/см, по меньшей мере, 150 мСм/см, по меньшей мере, 200 мСм/см, по меньшей мере, 300 мСм/см, или, по меньшей мере, 500 мСм/см. В отдельных аспектах может использоваться любая соль в получении электрокинетически измененных жидкостей по изобретению при
25 условии, что они обеспечивают образование биологически активных соле-стабилизированных наноструктур (например, соле-стабилизированных кислородсодержащих наноструктур), как это описано в тексте данной заявки.
Согласно отдельным аспектам, биологические эффекты композиций жидкости по изобретению, включающей газосодержащие наноструктуры со
30 стабилизированным зарядом, могут быть модулированы (например, повышены, понижены, скорректированы и т.д.) путем изменения ионных компонентов жидкостей и/или изменением компонента-газа в жидкости.
Согласно отдельным аспектам, биологические эффекты композиций жидкости по изобретению, включающей газосодержащие наноструктуры со
35 стабилизированным зарядом, могут быть модулированы (например, повышены,
понижены, скорректированы и т.д.) путем изменения компонента-газа в жидкости. В преимущественных аспектах кислород используют в получении электрокинетических жидкостей по изобретению. В дополнительных аспектах смеси кислорода и, по меньшей мере, одного другого газа, выбирают из азота, 5 кислорода, аргона, диоксида углерода, неона, гелия, криптона, водорода и ксенона. Как это описано выше, ионы также могут варьировать, включая варьирующую (-ие) составляющую (-ие) газа.
Принимая во внимание понятия и системы анализа, описанные в тексте данной заявки (например, анализы клеточных цитокинов, анализы фиксации 10 потенциала и т.д.), специалист в данной области сможет с легкостью выбрать соответствующие соли и их концентрации для достижения описанной здесь биологической активности.
ТАБЛИЦА 1. Типичные катионы и анионы. 15 Общие катионы:
Название Формула Другое (-ие) название (-я)
Алюминий АГ3
Аммоний NH4+
Барий Ва+2
Кальций Са+2
Хром (II) Сг+2 Хромистый
Хром (III) Сг+3 Хромовый
Медь (I) Си+ Меднозакисный
Медь(И) Си+2 Медный
Железо (II) Fe+2 Железистый
Железо (III) Fe+3 Железный
Водород Н+
Ион водорода Н30+
Свинец (II) РЬ+2
Литий Li+
Магний Мд+2
Марганец (II) Мп+2 Марганцоватистый
Марганец (III) Мп+3 Марганцевый
Ртуть (I) Нд2+2 Ртутный
Ртуть (II) Нд+2 Содержащий двухвалентную ртуть
Нитроний N02+
Калий К+
Серебро Ад+
Натрий Na+
Стронций Sr+2
Олово (II) Sn+2 Содержащий двухвалентное олово
Олово (IV) Sn+4 Содержащий четырехвалентное олово
Цинк Zn+2
Общие анионы: Простые ионы:
Гидрид Н" Оксид О2"
Фторид F" Сульфид S2"
Хлорид СГ Нитрид N3"
Бромид Вг"
Йодид Г
Оксоанионы:
Арсенат As043" Фосфат Р043"
Арсенит As033" Гидрогенфосфат НР042"
Дигидрогенфосфат Н2Р04"
Сульфат S042" Нитрат N03"
Гидрогенсульфат HS04" Нитрит N02"
Тиосульфат S2032"
Сульфит S032"
Перхлорат Хлорат Хлорит Гипохлорит
Карбонат
Гидрогенкарбонат или бикарбонат
Анионы из органических кислот: Ацетат
Прочие:
Цианид
Цианат
Тиоцианат
Гидроксид
СЮ4" Йодат Юз'
СЮз" Бромат BrGy
СЮ2"
ОСГ Гипобромит ОВг"
С032" Хромат СЮ42"
НС03" Дихромат Сг20 72"
СНзСОО" формиат НСОО"
CN" Амид NH2"
OCN" Пероксид 022"
SCN" Оксалат С2 042"
ОН" Перманганат Мп04"
Sr2+
Ион стронция
Ba2+
Ион бария
Zn2+
Ион цинка
Cd2+
Ион кадмия
Al3+
Ион алюминия
Многоатомные катионы
Формула
[Заряд
Название
NH4+
Ион аммония
H30+
Ион гидрония
Sn4+
Ион олова (IV) или ион четырехвалентного олова
Pb2+
Ион свинца (И) или ион двухвалентного свинца
Pb4+
Ион свинца (IV) или ион четырехвалентного свинца
N03"
Нитрат-ион
Mn042"
Перманганат-ион
СОз2"
Карбонат-ион
c2o42"
Оксалат-ион
Сг042"
Хромат-ион
Сг2072"
Дихромат-ион
S032"
Сульфит-ион
S042"
Сульфат-ион
РО33"
Фосфит-ион
Р043"
Фосфат-ион
Данное изобретение описывает новейшие обогащенные газом жидкости, включая, но не ограничиваясь этим, обогащенные газом водные ионные растворы, физиологические растворы на водной основе (например, стандартные 5 физиологические растворы на водной основе и другие физиологические растворы, как это обсуждается в тексте данной заявки и известно в науке, включая любые физиологически совместимые физиологические растворы), питательную среду для клеток (например, минимальную среду и другие питательные среды), используемые в лечении диабета или связанных с диабетом
10 нарушений. Среду или среды обозначают "минимальными", если они содержат только питательные вещества, необходимые для роста. Для прокариотических клеток-хозяев минимальная среда обычно включает источник углерода, азота, фосфора, магния и следовые количества железа и кальция. (Gunsalus and Stanter, The Bacteria, V. 1, Ch. 1 Acad. Press Inc., N.Y. (1960)). Большинство
15 минимальных сред используют в качестве источника углерода глюкозу, в качестве источника азота аммоний, и в качестве источника фосфора - ортофосфат (например, Р04). Компоненты среды могут варьировать или быть дополнены в соответствии с ростом специфического прокариотического или эукариотического организма (-ов) для обеспечения оптимального роста без ингибирования
20 выработки требуемого белка. (Thompson et al., Biotech, and Bioeng. 27: 818-824 (1985)).
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости подходят для модуляции ширины спектральной линии 13С-ЯМР растворенных в ней репортеров (например, трегалозы). Показатели ширины спектральной линии ЯМР являются непрямым способом измерения, например, "падения" 5 растворенного вещества в исследуемой жидкости, как это описано в отдельных рабочих Примерах в тексте данной заявки.
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости характеризуют, по меньшей мере, одним из следующих параметров: отличительные различия пика прямоугольного импульса при любом из значений -
10 0,14 В, -0,47 В, -1,02 В и -1,36 В; полярографические пики при -0,9 Вольт; и отсутствие полярографических пиков при -0,19 и -0,3 Вольт, что является уникальным для полученных электрокинетически жидкостей, как это описано в отдельных рабочих Примерах в тексте данной заявки.
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости
15 подходят для изменения проводимости клеточной мембраны (например, потенциалозависимого вклада в проводимость всей клетки как показателя измерения в описанных здесь исследованиях фиксации потенциала).
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости оксигенированы, при этом кислород в жидкости присутствует в количестве, по
20 меньшей мере, 15 промилле, по меньшей мере, 25 промилле, по меньшей мере, 30 промилле, по меньшей мере, 40 промилле, по меньшей мере, 50 промилле, или, по меньшей мере, 60 промилле растворенного кислорода при атмосферном давлении. В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости имеют менее, чем 15 промилле, менее, чем 10 промилле растворенного
25 кислорода при атмосферном давлении, или уровни, приближенные к содержанию кислорода в окружающей атмосфере.
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости оксигенированы, при этом кислород в жидкости присутствует в количестве от примерно 8 промилле до примерно 15 промилле, и в этом случае в тексте данной
30 заявки такие жидкости обозначают как "Solas".
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости включают, по меньшей мере, сольватированные электроны (например, стабилизированные молекулярным кислородом) и электрокинетически модифицированные и/или заряженные виды кислорода, и при этом в некоторых
35 вариантах воплощения изобретения сольватированные электроны и/или
электрокинетически модифицированные или заряженные виды кислорода присутствуют в количестве, по меньшей мере, 0,01 промилле, по меньшей мере, 0,1 промилле, по меньшей мере, 0,5 промилле, по меньшей мере, 1 промилле, по меньшей мере, 3 промилле, по меньшей мере, 5 промилле, по меньшей мере, 7 5 промилле, по меньшей мере, 10 промилле, по меньшей мере, 15 промилле, или, по меньшей мере, 20 промилле.
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости характеризуют по дифференциальной (например, повышенной или пониженной) диэлектрической проницаемости относительно контрольных, не измененных
10 электрокинетически жидкостей. В преимущественных аспектах
электрокинетически измененные водные жидкости характеризуют по дифференциальной повышенной диэлектрической проницаемости относительно контрольных, не измененных электрокинетически жидкостей. Диэлектрическая проницаемость (е) (фарад на метр) является мерой способности материала быть
15 поляризированным в электрическом поле и, следовательно, снижать общее электрическое поле внутри материала. Таким образом, диэлектрическая проницаемость обозначает способность материала передавать (или "пропускать") электрическое поле. Электрическая емкость (С) (фарад; кулон на Вольт) является близким свойством и мерой способности материала удерживать
20 заряд при применении напряжения относительно материала (например, лучше всего моделируется слоем диэлектрика между двумя проводящими параллельными пластинами). Если напряжение V подается на материал-конденсатор с емкостью С, тогда заряд Q, который он может удерживать, прямо пропорционален применимому напряжению V, при этом емкость С будет
25 выступать константой пропорциональности. Следовательно, Q = CV или С = Q/V. Емкость конденсатора зависит от диэлектрической проницаемости диэлектрического слоя, а также площади А конденсатора и расстоянию d между двумя проводящими пластинами. Диэлектрический слой и емкость математически можно выразить следующим образом:^ С(А &1).Если
30 диэлектрик используют в вакууме, тогда емкость Coo=(A/d),npH этомео
является диэлектрической проницаемостью в вакууме (8,85 х 10~12 Ф/м). Диэлектрическая константа (к), или относительная диэлектрическая проницаемость материала, является соотношением его диэлектрической проницаемости ? к диэлектрической проницаемости в вакуумво, т.е. к =Е/ео
35 (диэлектрическая константа в вакууме составляет 1). Низкое значение к
диэлектрика характерно для диэлектрика с низкой диэлектрической проницаемостью или низкой способностью поляризировать и удерживать заряд. Высокое значение к диэлектрика, с другой стороны, характерно для высокой диэлектрической проницаемости. Принимая во внимание тот факт, что 5 диэлектрики с высоким значением к хорошо удерживают заряд, они являются преимущественными диэлектриками для конденсатора. Диэлектрики с высоким к также используют в клетках памяти, которые хранят цифровые данные в форме заряда.
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости 10 подходят для изменения структуры клеточной мембраны или функции (например, изменения конформации, активности связывания лиганда или каталитической активности мембран-ассоциированного белка), достаточной для модуляции внутриклеточной передачи сигнала, при этом в отдельных аспектах мембран-ассоциированный белок включает, по меньшей мере, один белок, выбираемый из 15 группы, состоящей из рецепторов, трансмембранных рецепторов (например, сопряженный с G-белком рецептор (GPCR), рецептор TSLP, бета-2 адренергический рецептор, рецептор брадикинина и т.д.), белки ионных каналов, белки для внутриклеточного присоединения, белки клеточной адгезии и интегрины. В определенных аспектах указанный сопряженный с G-белком 20 рецептор (GPCR) взаимодействует сп субъединицей G -белка (например, G> s , Gdi , Gdq и Gai2).
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости подходят для модуляции внутриклеточной передачи сигнала, включающей модуляцию кальций-зависимого клеточного пути или системы передачи сигнала
25 (например, модуляцию активности фосфолипазы С или модуляцию активности аденилатциклазы (АЦ)).
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости характеризуют по различной биологической активности (например, регуляции цитокинов, рецепторов, ферментов и других белков и путей внутриклеточной
30 передачи сигналов), описанной в рабочих Примерах и в любом месте данной заявки.
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости характеризуются синергией с глатирамер ацетатом, интерфероном-В, митоксантроном и/или натализумабом. В отдельных аспектах электрокинетически 35 измененные водные жидкости снижают DEP-индуцированную экспрессию
рецептора TSLP в эпителиальных клетках бронхов (ЭКБ), как это показано в рабочих Примерах в тексте данной заявки.
В отдельных аспектах электрокинетически измененные водные жидкости ингибируют DEP-индуцированные уровни ММР9, связанные с поверхностью в 5 эпителиальных клетках бронхов (ЭКБ), как это показано в рабочих Примерах в тексте данной заявки.
В отдельных аспектах биологические эффекты электрокинетически измененных водных жидкостей ингибируются дифтерийным токсином, указывая на то, что бета-блокада, блокада GPCR и блокада Са канала влияет на 10 активность электрокинетически измененных водных жидкостей (например, на регуляторную функцию Т-клеток), как это показано в рабочих Примерах в тексте данной заявки.
В отдельных аспектах физические и биологические эффекты (например, способность изменять структуру или функцию клеточной мембраны, достаточную
15 для обеспечения модуляции внутриклеточной передачи сигнала) электрокинетически измененных водных жидкостей сохраняется в течение, по меньшей мере, двух, по меньшей мере, трех, по меньшей мере, четырех, по меньшей мере, пяти, по меньшей мере, 6 месяцев или в течение более длительных периодов в закрытом контейнере (например, закрытом
20 газонепроницаемом контейнере).
Таким образом, дополнительные аспекты описывают указанные полученные электрокинетическим образом растворы и способы получения электрокинетически измененной оксигенированной водной жидкости или раствора, включающие: обеспечение тока жидкого материала между двумя
25 расположенными на расстоянии поверхностями в относительном движении и определение объема смешивания между ними, при этом время задержки одного пробега текущего жидкого материала внутри и через смешиваемый объем более, чем 0,06 секунд или более, чем 0,1 секунд; и вводимый кислород (Ог) в текущий жидкий материал в объеме смешивания в условиях, подходящих для
30 растворения, по меньшей мере, 20 промилле, по меньшей мере, 25 промилле, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 40, по меньшей мере, 50 или, по меньшей мере, 60 промилле кислорода в материал, и электрокинетическое изменение жидкости или раствора. В определенных аспектах кислород вводят в материал за время менее, чем 100 миллисекунд, менее, чем 200 миллисекунд, менее, чем 300
35 миллисекунд, или менее, чем 400 миллисекунд. В отдельных вариантах
воплощения изобретения соотношение площади поверхности к объему составляет, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 40 или, по меньшей мере, 50.
Тем не менее, другие аспекты описывают способ получения 5 электрокинетически измененной оксигенированной водной жидкости или раствора, включающий: обеспечение тока жидкого материала между двумя находящимися на расстоянии поверхностями, определяющими объем смешивания между ними; введение кислорода в текущий материал в объеме смешивания в условиях, подходящих для введения, по меньшей мере, 20
10 промилле, по меньшей мере, 25 промилле, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 40, по меньшей мере, 50, или, по меньшей мере, 60 промилле кислорода в материал за менее, чем 100 миллисекунд, менее, чем 200 миллисекунд, менее, чем 300 миллисекунд, или менее, чем 400 миллисекунд. В определенных аспектах время задержки текущего материала в объеме смешивания более, чем
15 0,06 секунд или более, чем 0,1 секунд. В отдельных вариантах воплощения изобретения соотношение площади поверхности к объему составляет, по меньшей мере, 12, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 30, по меньшей мере, 40 или, по меньшей мере, 50.
Дополнительные варианты воплощения изобретения описывают способ
20 получения электрокинетически измененной оксигенированной водной жидкости или раствора, включающий использование смешивающего устройства для создания смеси на выходе путем смешивания первого материала и второго материала, и такое устройство включает: первую камеру, сконфигурированную для получения первого материала из источника первого материала; статор; ротор
25 с осью вращения, при этом ротор расположен внутри статора и сконфигурирован для вращения вокруг собственной оси вращения, по меньшей мере, один ротор и статор с множеством сквозных отверстий; камеру смешивания, находящуюся между ротором и статором, при этом камера смешивания сообщается жидкостью с первой камерой и сконфигурирована для получения из нее первого материала, и
30 второй материал вводят в камеру смешивания через множество сквозных отверстий в роторе и статоре; вторую камеру, сообщающуюся жидкостью с камерой смешивания и сконфигурированную для получения из нее материала на выходе; и первый внутренний насос, расположенный внутри первой камеры, и такой первый внутренний насос сконфигурирован для нагнетания первого
35 материала из первой камеры в камеру смешивания. В определенных аспектах
первый внутренний насос сконфигурирован для создания тангенциальной скорости первому материалу перед тем, как он попадет в камеру смешивания.
Дополнительные варианты воплощения изобретения описывают способ получения электрокинетически измененной оксигенированной водной жидкости 5 или раствора, включающий использование устройства для смешивания для создания смеси на выходе путем смешивания первого материала и второго материала, и такое устройство включает: статор; ротор с осью вращения, при этом ротор расположен внутри статора и сконфигурирован для вращения вокруг своей оси вращения; камеру смешивания, находящуюся между ротором и
10 статором, при этом камера смешивания имеет первое открытое отверстие, через которое первый материал попадает в камеру смешивания, и второе открытое отверстие, через которое материал на выходе выходит из камеры смешивания, и второй материал попадает в камеру смешивания через, по меньшей мере, один ротор или статор; первую камеру, сообщающуюся, по меньшей мере, с большей
15 частью открытого первого отверстия камеры смешивания; и вторую камеру, сообщающуюся с вторым отверстием камеры смешивания.
Дополнительные аспекты описывают электрокинетически измененную оксигенированную водную жидкость или раствор, получаемые в соответствии с любым описанным способом. В отдельных аспектах вводимые
20 электрокинетически измененные жидкости по изобретению включают кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом в количестве, эффективном для обеспечения модуляции, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны. В определенных вариантах воплощения изобретения электрокинетически
25 измененные жидкости являются супероксигенированными (например, RNS-20, RNS-40 и RNS-60, включающие 20 промилле, 40 промилле и 60 промилле растворенного кислорода, соответственно, в стандартном физиологическом растворе). В отдельных вариантах воплощения изобретения электрокинетически измененные жидкости не являются супероксигенированными (например, RNS-10
30 или Solas, включающие 10 промилле (например, примерно фоновые уровни растворенного кислорода в стандартном физиологическом растворе)). В определенных аспектах минерализация, стерильность, рН и т.д. электрокинетически измененных жидкостей по изобретению устанавливают во время электрокинетического получения жидкости, и стерильные жидкости вводят
35 соответствующим путем. С другой стороны, по меньшей мере, один из
показателей минерализации, стерильности, рН и т.д. жидкостей корректируют соответствующим образом (например, с использованием стерильного физиологического раствора или соответствующих растворителей), чтобы быть физиологически совместимыми с путем введения перед введением жидкости. 5 Преимущественно, растворители и/или физиологические растворы и/или композиции буфера, используемые для корректировки, по меньшей мере, одного из показателей минерализации, стерильности, рН и т.д. жидкостей, являются также электрокинетическими жидкостями, или они совместимы иным образом.
Данное изобретение описывает новейшие обогащенные газом жидкости,
10 включая, но не ограничиваясь этим, обогащенные газом водные ионные растворы, физиологические растворы на водной основе (например, стандартные физиологические растворы на водной основе и другие физиологические растворы, как это обсуждается в тексте данной заявки и известно в науке, включая любые физиологически совместимые физиологические растворы),
15 питательную среду для клеток (например, минимальную среду и другие питательные среды для клеток).
Воспаление
Воспаление может возникнуть как защитная реакция на инвазию субъекта
20 инородным материалом, в частности, бактериального происхождения. Кроме того, механическая травма, токсины и неоплазия могут индуцировать воспалительные реакции. Накопление и последующая активация лейкоцитов являются центральными явлениями в патогенезе большинства форм воспаления. Недостатки воспаления могут поставить хозяина под угрозу, делая его
25 восприимчивым к ухудшению инфекции или травмы. Избыточное воспаление, такое как продолжительные воспалительные реакции, может привести к воспалительным заболеваниям, включая, но не ограничиваясь этим, диабет, артериосклероз, катаракту, хронические заболевания кожи, реперфузионное поражение и рак, а также постинфекционным синдромам, такими как
30 инфекционный менингит, ревматическая лихорадка, и ревматическим заболеваниям, таким как системная красная волчанка и ревматоидный артрит. Эти заболевания поражают миллионы людей по всему миру каждый год и ведут к повышенной заболеваемости и смертности. Общность воспалительного ответа при таких различных болезненных процессах делает его регуляцию основным
35 элементом в профилактике или лечении заболевания у человека.
Избыточная выработка провоспалительных цитокинов была выявлена в патогенезе многочисленных воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Секреция ФНзОлвляется преимущественным явлением в инициации воспалительного каскада (Brennan F. М., et. al. Lancet, 1989, 2:244-7; Haworth С, et. 5 al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579) и непосредственно способствует инициации и поддержании таких заболеваний. Другие цитокины также играют роль, включая интерлейкин 1В (ИЛ-13), ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12 оксид азота (N0), ИФН-Y, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г -КСФ), гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и ИЛ-10. Такие
10 определенные цитокины (например, ИЛ-8) может повышать или ухудшать воспалительный ответ, в то время как другие {например, ИЛ-10) могут снижать или уменьшать степень тяжести воспалительного ответа.
Клетки иммунной системы, в частности, макрофаги, секретируют множество таких цитокинов в ответ на активирующие стимулы. Клетки, вырабатывающие
15 цитокины, могут быть локализированы в любом компартменте тела и могут действовать посредством удаленных механизмов или действовать в качестве соседних клеток. Таким образом, цитокины могут регулировать воспаление локализированным или системным образом.
20 Металлопротеиназы
Металлопротеиназы представлены суперсемейством протеиназ (ферментов), классифицированных в семейства и подсемейства, как это описано, например, в N. М. Hooper FEBS Letters 354:1-6, 1994. Примеры металлопротеиназ включают матриксные металлопротеиназы (ММР), такие как коллагеназы (ММР1,
25 ММР8, ММР13), желатиназы (ММР2, ММР9), стромелизины (ММРЗ, ММР10, ММР II), матрилизин (ММР7), металлоэластаза (ММР12), энамелизин (ММР19), МТ-ММР (ММР14, ММР15, ММР16, ММР17); репролизин или адамализин или семейство MDC, которое включает секретазы и шеддазы, такие как ФНО-конвертирующие ферменты (ADAM10 и ТАСЕ); семейство астацинов, которое
30 включает ферменты, такие как протеиназа, катализирующая процессинг проколлагена (РСР); и другие металлопротеиназы, такие как аггреканаза, семейство эндотелин-конвертирующих ферментов и семейство ангиотензин-конвертирующих ферментов. В совокупности металлопротеиназы, как известно, расщепляют широкий диапазон субстратов матрикса, таких как коллаген,
35 протеогликан и фибронектин. Металлопротеиназы задействованы в процессинге
или секреции биологически важных медиаторов клеток, таких как фактор некроза опухоли (ФНО); и пост-трансляционном протеолитическом процессинге или шеддинге биологически важных мембранных белков, таких как низкоаффинный рецептор IgE CD23 (см, например, N. М. Hooper et al., Biochem. J. 321:265-279, 5 1997).
Таким образом, неудивительно, что металлопротеиназы считаются важными в большинстве физиологических процессов заболеваний, которые включают ремоделирование ткани (например, развитие эмбриона, образование кости, ремоделирование матки во время менструации и т.д.). Кроме того,
10 ингибирование активности одной или нескольких металлопротеиназ может оказаться преимущественным при таких заболеваниях или состояниях, как например: различные воспалительные и аллергические заболевания, такие как воспаление сустава (особенно ревматоидный артрит, остеоартрит и подагра), воспаление желудочно-кишечного тракта (в частности, воспалительная болезнь
15 кишечника, язвенный колит и гастрит), воспаление кожи (в частности, псориаз, экзема, дерматит); метастазы или инвазия в опухоль; при заболевании, связанном с неконтролируемым распадом внеклеточного матрикса, таким как остеоартрит; при резорбции кости (такой как остеопороз и болезнь Педжета); при заболеваниях, связанных с аберрантным ангиогенезом; повышенное
20 ремоделирование коллагена, связанное с диабетом, периодонтальным заболеванием (таким как гингивит), изъязвление роговицы, изъязвление кожи, послеоперационные состояния (такие как анастомоз толстого кишечника) и заживление кожных ран; демиелинизирующие заболевания центральной и периферической нервной системы (такие как множественный склероз); болезнь
25 Альцгеймера; ремоделирование межклеточного матрикса, отмечаемое при сердечнососудистых заболеваниях, таких как рестеноз и атеросклероз; астма; ринит; и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ).
ММР12, также известный как эластаза макрофагов или металлоэластаза, был первично клонирован у мыши (Shapiro et al., Journal of Biological Chemistry
30 267: 4664, 1992), а затем был клонирован у человека этой же группой ученых в 1995 г. ММР12 преимущественно экспрессируется в активированных макрофагах, и была доказана его секреция из альвеолярных макрофагов курильщиков (Shapiro et al, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268: 23824), а также пенистых клеток при атеросклеротических поражениях (Matsumoto et al, Am. J. Pathol. 153: 109, 1998).
35 Мышиная модель ХОБЛ основана на изменении мыши под действием сигаретного
дыма в течение шести месяцев, по две сигареты в день в течение шести дней в неделю. После такого воздействия у мышей дикого типа развилась легочная эмфизема. При исследовании в этой модели нокаутных мышей ММР12, у мышей не отмечалась значительная эмфизема, что указывало на то, что ММР12 5 является ключевым ферментом в патогенезе ХОБЛ. Роль ММР, таких как ММР12 при ХОБЛ (эмфизема и бронхит), обсуждается в Anderson and Shinagawa, 1999, Current Opinion in Anti-inflammatory and Immunomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29-38. Недавно было установлено, что курение повышает инфильтрацию макрофагов и экспрессию ММР-12 макрофагами в бляшках сонной артерии 10 человека (Matetzky S, Fishbein М С et al., Circulation 102:(18), 36-39 Suppl. S, Oct. 31, 2000).
ММР9-(желатиназа В; 92 кДа-тип IV коллагеназа; 92 кДа желатиназа) является секретируемым белком, который был впервые очищен, затем клонирован и секвенирован в 1989 г. (S. М. Wilhelm et al., J. Biol. Chem. 264 (29):
15 17213-17221, 1989; published erratum in J. Biol. Chem. 265 (36): 22570, 1990) (обзор детальной информации и ссылки на данную протеазу приводятся в Т. Н. Vu & Z. Werb (1998) (In: Matrix Metalloproteinases, 1998, edited by W. C. Parks & R. P. Mecham, pp. 115-148, Academic Press. ISBN 0-12-545090-7). Экспрессия MMP9, как правило, ограничена несколькими типами клеток, включая трофобласты,
20 остеокласты, нейтрофилы и макрофаги (Vu & Werb, см. выше). Однако экспрессия может быть индуцирована в этих клетках и клетках других типов несколькими медиаторами, включая воздействие на клетки факторами роста или цитокинами. Эти медиаторы часто задействованы в инициации воспалительного ответа. Как и для других секретируемых ММР, ММР9 высвобождается в виде
25 инактивного профермента, который впоследствии расщепляется для образования ферментативно активного фермента. Протеазы, требуемые для такой активации in vivo, неизвестны. Баланс активного ММР9 в сравнении с неактивным ферментом в дальнейшем регулируется in vivo взаимодействием с TIMP-1 (тканевой ингибитор металлопротеиназ-1), встречающимся в природе белком.
30 TIMP-1 связывается с С-терминальным участком ММР9, что ведет к ингибированию каталитического домена ММР9. Баланс индуцируемой экспрессии проММРЭ, расщепление про- в активный ММР9 и присутствие TIMP-1 комбинируют для определения количества каталитически активного ММР9, присутствующего в локальном сайте. Протеолитически активный ММР9 атакует
35 субстрат, включающий желатин, эластин и нативный коллаген типа IV и типа V; он
не активный относительно нативного коллагена типа I, протеогликанов или ламининов. Получают все больше данных о роли ММР9 в различных физиологических и патологических процессах. Физиологическая роль включает инвазию эмбриональных трофобластов через эпителий матки на ранних стадиях 5 имплантации эмбриона; определенную роль в росте и развитии костей; и миграцию воспалительных клеток из сосудов в ткани.
Высвобождение ММР9, измеренное с использованием иммуноферментного анализа, было по существу повышено в жидкостях и супернатантах AM, взятых у не подвергнутых лечению астматиков в сравнении с жидкостями и
10 супернатантами, взятыми у других популяций (Am. J. Resp. Cell & Mol. Biol., 5:583591, 1997). Кроме того, повышенная экспрессия ММР9 отмечалась при других определенных патологических состояниях, указывая на участие ММР9 в болезненных процессах, таких как ХОБЛ, артрит, опухолевые метастазы, болезнь Альцгеймера, множественный склероз и разрыв бляшки при атеросклерозе, что
15 ведет к острым коронарным состояниям, таким как инфаркт миокарда (см. также WO07087637A3, включенный сюда посредством ссылки).
Недавно было показано, что уровни ММР-9 по существу повышены у пациентов со стабильной астмой и даже выше у пациентов с острой формой астмы в сравнении со здоровыми контрольными субъектами. ММР-9 играет
20 критическую роль в инфильтрации воспалительных клеток дыхательных путей и индукции гиперреактивности дыхательных путей, указывая на то, что ММР-9 может играть важную роль в индуцировании и поддержании астмы (Vignola et al., Sputum metalloproteinase-9/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis, Am J Respir Crit Care Med
25 158:1945-1950, 1998; Hoshino et al., Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999; Simpson et al., Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J Respir Crit Care Med 172:559-565,2005;
30 Lee et al., A murine model of toluene diisocyanate-induced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001; и Lee et al., Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003;111:1278-1284).
Ингибиторы ММР:
Известен целый ряд ингибиторов металлопротеиназы (см., например, обзор ингибиторов ММР Beckett R. P. and Whittaker М., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents, 8(3):259-282; и Whittaker M. et al, 1999, Chemical Reviews 99(9):2735-2776). WO 5 02/074767 описывает производные гидантоина по формуле, которые используют в качестве ингибиторов ММР, в частности, как сильных ингибиторов ММР12. Публикация заявки на патент США Сер. No. 11/721590 (опубликованная как 20080032997) описывает дополнительную группу производных гидантоина, являющихся ингибиторами металлопротеиназ и представляющих отдельный
10 интерес относительно ингибирования ММР, таких как ММР12 и ММР9. Новейшие производные триазолона для ингибирования ММР, такие как ММР12 и ММР9, описаны в заявке на патент США серийный No. 10/593543 (опубликована как 20070219217). Дополнительные ингибиторы ММР12 и ММР9 описаны в 11/509490 (опубликовано как 20060287338) (см. также 10/831265 (опубликовано как
15 20040259896)).
Кроме того, было показано, что два соединения, 4-(4-
феноксифенилсульфонил)бутан-1,2-дитиол (1) и 5-(4-
феноксифенилсульфонил)пентан-1,2-дитиол (2), связываются избирательно и сильно ингибируют ММР-2 и ММР-9 (Bernardo, et. al (2002) J. Biol. Chem.
20 277:11201-11207). Эти два соединения могут обладать значительной применимостью в клинической практике для ингибирования ММР-2 и -9, и, следовательно, снижать воспаление. Кроме того, было показано, что использование определенных тетрациклиновых антибиотиков (например, миноциклина и доксициклина) при суб-антибиотических уровнях эффективно
25 ингибирует активность ММР. Определенные аспекты данного изобретения включают использование жидкостей по изобретению в комбинации с субантибиотическими уровнями, подходящими для ингибирования ММР.
Способы лечения
30 Термин "лечение" обозначает и включает обратное развитие, уменьшение
симптомов, ингибирование прогрессирования или профилактику заболевания, нарушения или состояния, или одного или нескольких их симптомов; и термины "лечение" и "терапевтический" относятся к действию лечения, как это определено в тексте данной заявки.
"Терапевтически эффективное количество" представлено любым количеством соединений, используемых в ходе выполнения описанного здесь изобретения, которого достаточно для обратного развития, уменьшения степени тяжести, ингибирования прогресса или профилактики заболевания, нарушения 5 или состояния, или одного или нескольких их симптомов.
Определенные описанные здесь варианты воплощения изобретения относятся к терапевтическим композициям и способам лечения субъекта путем предотвращения или снижения степени тяжести, по меньшей мере, одного симптома воспаления, связанного с определенными состояниями или
10 заболеваниями, такими как воспалительная нейродегенеративная болезнь. Например, терапевтические композиции и/или способы, описанные в тексте данной заявки, могут использоваться для лечения или профилактики одного или нескольких состояний или заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из множественного склероза (МС), болезни Паркинсона, амилоидоза (например,
15 болезни Альцгеймера), амиотрофического бокового склероза (АБС), прионных заболеваний и ВИЧ-ассоциированной деменции.
Большое количество состояний или заболеваний, связанных с воспалением, подвергали лечению стероидами, метотрексатом, иммуносупрессантами, включая циклофосфамид, циклоспорин, азатиоприн и
20 лефлуномид, нестероидные противовоспалительные агенты, такие как аспирин, ацетаминофен и ингибиторы СОХ-2, препараты золота и противомалярийные препараты. Такие препараты имеют целый ряд недостатков, и побочные реакции включают реакции в месте введения, сыпь, инфекции верхних дыхательных путей, аутоиммунные заболевания и повышенную восприимчивость к инфекциям. Кроме
25 того, много противовоспалительных фармацевтических препаратов требуют внутривенного (в/в) или подкожного (п/к) введения, в отличие от более удобных и подходящих для перорального или местного пути введения. В соответствии с этим существует потребность в разработке новейших препаратов и способов лечения состояний и заболеваний, относящихся в воспалению.
30 Имеющееся в настоящее время лечение МС включает глатирамера ацетат,
интерферон-В, натализумаб и ми токсантрон. Глатирамера ацетат состоит из глутаминовой кислоты, лизина, аланина и тирозина, как неупорядоченного полимера. Глатирамера ацетат обладает ограниченной эффективностью и побочными эффектами по существу, например, образование опухания в месте
35 инъекции, озноб, лихорадка, боль, одышка, учащенное сердцебиение и
беспокойство. В важном клиническом исследовании с использованием 943
пациентов с первичным прогрессирующим МС, глатирамера ацетат не смог
остановить прогрессирование недееспособности и заболевания (Wolinsky, et al
(2007) Ann Neurol 61:13-24).
5 Интерферон-В является встречающимся в природе белком,
вырабатываемым фибробластами, и является частью естественного иммунного ответа. Как препарат для МС, интерферон-р примерно на 18-38% эффективнее в снижении частоты эпизодов МС. Побочные эффекты включают легкие гриппоподобные симптомы, реакции в месте введения и более серьезные
10 эффекты (например, депрессия, припадки и проблемы с печенью).
Митоксантрон является препаратом для лечения МС. Он был разработан в качестве препарата химиотерапии для использования в лечении рака, действуя путем интерференции с восстановлением и синтезом ДНК и не являясь специфическим для раковых клеток. Побочные эффекты митоксантрона могут
15 быть достаточно тяжелыми и включать тошноту, рвоту, выпадение волос, поражение сердца и иммуносупрессию.
Натализумаб является гуманизированным моноклональным антителом, которое направлено на альфа4-интегрен, являющийся клеточной адгезивной молекулой. Считается, что натализумаб функционирует путем удержания
20 иммунных клеток, вызывающих воспаление, от пересечения гематоэнцефалитического барьера. Побочные эффекты включают утомляемость, головную боль, тошноту, простуду и аллергические реакции.
В целом, такие препараты супрессируют иммунную систему неспецифическим образом и только в небольшой степени ограничивают общее
25 прогрессирование заболевания. (Lubetzki et al. (2005), Curr. Opin. Neurol. 18:237244). Таким образом, существует необходимость в разработке терапевтических стратегий для лучшего лечения МС.
Комбинированная терапия:
30 Дополнительные аспекты описывают способы по изобретению, которые
дополнительно включают комбинированную терапию, при этом пациенту вводят, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент. В определенных аспектах, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из глатирамера ацетата, интерферона-Р,
35 митоксантрона и натализумаба и/или ингибиторов ММР.
Противовоспалительная активность электрокинетически полученных, обогащенных газом жидкостей и растворов:
Согласно определенным аспектам данного изобретения, обогащенные 5 газом жидкости и/или растворы, описанные в тексте данной заявки, обладают противовоспалительными свойствами и эффектами и могут использоваться в качестве противовоспалительных агентов для лечения субъектов, страдающих от заболеваний или нарушений, относящихся к воспалительной нейродегенерации. Фигура 1 отображает результаты экспериментов с использованием профилей 10 цитокинов в стимулированных лимфоцитах, полученных у здорового донора крови. Как это можно видеть из Фигуры 1, обогащенная кислородом жидкость (вода) по изобретению супрессировала отдельные цитокины, в частности, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-1В.
Повышенная выработка провоспалительных цитокинов была выявлена в
15 патогенезе многочисленных воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Секреция ФНОявляется преимущественным явлением в инициации воспалительного каскада (Brennan F. М., et. al. Lancet, 1989, 2:244-7; Haworth С, et. al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579) и непосредственно способствует инициации и поддержанию воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Другие
20 провоспалительные цитокины также играют роль, включая интерлейкинЗ Му\1) 1Р), ИЛ -6, ИЛ-8, ИЛ-12, оксид азота, ИФН-у и ГМ -КСФ, в то время как противовоспалительные цитокины, такие как ИЛ-10, могут снизить заболевание. Клетки иммунной системы, в частности, макрофаги, секретируют множество таких цитокинов в ответ на активирующие стимулы.
25 В воспалительном процессе участвуют различные типы клеток. Избыточная
выработка ФИО моноцитами, макрофагами и другими клетками иммунной системы является основным элементом в патогенезе множества заболеваний. В частности, макрофаги и Т-клетки играют центральную роль в инициации и поддержании иммунного ответа. После активирования патологическими или
30 иммуногенными стимулами, макрофаги отвечают высвобождением цитокинов из клетки-хозяина, включая ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-8, ИЛ-12, оксид азота (N0), ИЛ-6, ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ и другие. Т-клетки высвобождают ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-у и другие воспалительные цитокины. Такие цитокины активируют другие иммунные клетки, и некоторые также могут действовать в качестве независимых цитотоксических
35 агентов. Избыточное высвобождение воспалительных медиаторов из макрофагов
и Т-клеток может привести, в частности, к повреждению здоровых клеток и окружающих тканей.
Провоспалительные цитокины задействованы в ВИЧ-СПИД и других вирусных инфекциях, включая цитомегаловирус, вирус гриппа и вирусы семейства 5 герпес. ФНСа повышает основную активность главного проме жуточного раннего энхансера/промотора цитомегаловируса человека и может играть роль в реактивации латентной инфекции ЦМВЧ в премоноцитарных клетках (Prosch S., et. al. Virology 1995, 208:197-206).
Кроме того, целый ряд воспалительных цитокинов способствует
10 заболеваемости у пациентов, страдающих сепсисом или эндотоксическим шоком. Например, было установлено, что ФНви ИЛ -1В играет центральную роль при сепсисе, септическом шоке и эндотоксическом шоке. Повышенные уровни таких цитокинов обуславливают лихорадку, гипотензию и шок (Smith J. W. et. al. J. Clin. Oncol. 1992, 10:1141-1152; Chapman P. В., et. al. J. Clin. Oncol. 1987, 5:1942-1951)
15 вместе с индукцией экспрессии гена фосфолипазы А2 (Gronich J., et. al. J. Clin. Invest. 1994, 93:1224-1233) и NO синтазы.
Индукция NO из клеток гладкой мускулатуры опосредует пониженное среднее артериальное давление и системную резистентность сосудов во время септического шока, указывая на фундаментальную роль N0. Таким образом,
20 лечение, направленное на супрессию ИЛ-8, ИЛ-И-1Ви N0, может быть преимущественным в лечении воспалительных заболеваний или нарушений, включая сепсис, септический шок и эндотоксический шок.
Избыточная выработка ФНб)способствует возникновению клинических признаков многочисленных аутоиммунных заболеваний, таких как диабет и
25 ревматоидный артрит. Системная красная волчанка (СКВ) также провоцируется повышенными уровнями ИЛ-1В и ФНОа. У пациентов с волчанкой сывороточные уровни С-реактивного белка, ИЛ-1.бета и ФНОл были выше, чем у контрольных пациентов, что указывает на то, что повышенный воспалительный ответ играет роль в заболевании (Liou L. В. Clin. Exp. Rheumatol. 2001, 19:515-523).
30 Исследование пациентов с одной формой СКВ, нейропсихиатрической системной красной волчанкой (НСКВ), выявило, что количество мононуклеарных клеток периферической крови, экспрессирующих мРНК для ФлН(c) также уровень метаболитов N0 в спинномозговой жидкости коррелировали со степенью тяжести заболевания НСКВ (Svenungsson Е., et al. Ann. Rheum. Dis. 2001, 60:372-9).
ИЛ-1 и ФНОа играют центральную роль при различных острых и хронических ответах в животных моделях. Кроме того, ИЛ-11, ИФНа и ИФНВ могут также активировать воспалительные реакции. В другом случае, несколько цитокинов могут быть задействованы в супрессии воспалительных ответов (т.е., 5 помимо всех прочих, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13). Как это описано в Примере 1, клетки, контактировавшие с обогащенной газом жидкостью по изобретению, характеризовались повышением уровней ИФН-у с антигеном ТЗ, чем в контрольной питательной среде с антигеном ТЗ, в то время как содержание ИЛ-8 в обогащенной газом питательной среде по изобретению с антигеном ТЗ было
10 ниже, чем в контрольной питательной среде с антигеном ТЗ. Кроме того, уровни ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-а в обогащенной газом среде по изобретению с РНА были ниже, чем в контрольной среде с РНА, в то время как уровни ИЛ-1 В в обогащенной газом жидкости по изобретению с РНА были ниже, чем при сравнении с контрольной питательной средой с РНА. В обогащенной газом питательной среде
15 по изобретению уровни ИФН-у были выше, чем в контрольной среде. Эти результаты соответствуют противовоспалительной микросреде.
N0 считается медиатором и регулятором воспалительных ответов. Он обладает цитотоксическими свойствами относительно патогенов, но также может обладать губительным действием на собственные ткани субъекта. (Korhonen et
20 al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4(4): 471-9, 2005). NO реагирует с растворимой гуанилатциклазой с образованием циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), который опосредует многие эффекты NO. N0 также может взаимодействовать с молекулярным кислородом и анионом супероксида с получением реактивных видов кислорода, которые могут
25 модифицировать различные клеточные функции. Такие непрямые эффекты NO имеют важную роль в воспалении, когда N0 вырабатывается в больших количествах индуцируемой NO-синтазой (iNOS), а реакционоспособные виды кислорода синтезируются активированными воспалительными клетками.
N0 может вырабатываться кератиноцитами, фибробластами,
30 эндотелиальными клетками и, возможно, другими клетками. Некоторые действия N0 на сосуды включают расширение сосудов, ингибирование адгезии тромбоцитов к эндотелию сосудов, ингибирование адгезии лейкоцитов к эндотелию сосудов и захват супероксидов. (Shah et al., Env. Health Persp. v. 106 (5): 1139-1143.)
Кроме того, было показано, что ингибирование синтеза N0 замедляет закрытие раны, изменяет организацию коллагена и изменяют толщину неоэпидермиса. (Amadeu and Costa, J. Cutan. Pathol. 33: 465-473, 2006.) Ингибирование NO также влияет на миграцию тучных клеток и ангиогенез в ранах 5 (Id.) Не буду и связанными какой-либо отдельной теорией механизма, в определенных вариантах воплощения изобретения обогащенные газом жидкости по изобретению могут быть модулированы локализованной и/или клеточной выработкой N0 или распадом, что соответствует спектру эффектов на заживление раны, описанных в главе Примеров в тексте данной заявки. По
10 причине различных путей регуляции, в определенных вариантах воплощения изобретения обогащенная газом жидкость по изобретению может способствовать повышению выработки N0 и/или замедлению распада N0, в то время как в других вариантах воплощения изобретения обогащенная газом жидкость по изобретению может снижать выработку N0 и/или ускорять распад N0.
15 В частности, раны, подвергнутые лечению обогащенным кислородом
физиологическим раствором, характеризовались повышением заживления на дни от 4 до 11, и в период между днями от 3 до 11 новый эпидермис в ранах, подвергнутых лечению обогащенным кислородом физиологическим раствором, мигрировал от двух до четырех раз быстрее, чем эпидермис ран, подвергнутых
20 лечению нормальным физиологическим раствором, как это описано в Примере 9 в тексте данной заявки. Исследование также показало, что в период между днями 15 и 22 раны, подвергнутые лечению обогащенным кислородом физиологическим раствором, дифференцировали при большей скорости, о чем могло свидетельствовать раннее образование более зрелых эпидермальных слоев. На
25 всех стадиях утолщение, возникающее в эпидермисе и связанное с обычным заживлением, не возникало в ранах, подвергнутых лечению обогащенным кислородом физиологическим раствором.
Таким образом, в соответствии с таким спектром эффектов на заживление раны, не желая быть ограниченными какой-либо отдельной теорией, считается,
30 что обогащенный кислородом физиологический раствор может модулировать локализированные и/или клеточные уровни N0 в ранах. N0 модулирует факторы роста, депонирование коллагена, воспаление, миграцию тучных клеток, утолщение эпидермиса и неоваскуляризацию при заживлении ран. Кроме того, оксид азота вырабатывается индуцируемым ферментом, который регулируется
35 кислородом.
В случае миграции тучных клеток, для обогащенного кислородом раствора также отмечаются различия в ранней и поздней миграции. Это соответствует имеющимся в науке данным относительно ингибирования синтеза NO (Amadeu and Costa, J. Cutan Pathol 33: 465-473, 2006).
В первых двух фазах воспалительного процесса инородное тело уничтожается, например, если инородное тело представлено организмом, или ткань вокруг него ослабевает, например, если инородное тело представлено осколком. В фазе заживления воспаление начинает спадать; отдельные
10 кровеносные сосуды и сосудистая система снова становится нормальной; и начинается восстановление раны. Три основных явления в процессе восстановления представлены (1) образованием новой соединительной ткани пролиферирующими фибробластами; (2) регенерацией эпителия; и (3) разрастанием новых капилляров.
15 Даже перед снижением воспаления фибробласты начинают перемещаться
в пораженную область из окружающей здоровой ткани, в которой они обычно находятся в состоянии покоя. Они мигрируют амебоидными движениями среди цепей фибрина и распространяются по области заживления. Как только они зафиксируют свое положение в пораженной ткани, они начинают синтезировать
20 коллаген и секретируют данный белок, который прикрепляет их к волокнам. Волокна ориентируют сами себя с использованием собственных продольных осей в направлении наибольшего стресса. С ростом стойкости коллагеновых пучков, фибробласты постепенно дегенерируют и тесно присоединяются к волокнам, и пораженная область трансформируется в рубцовую ткань.
25 Одновременно с образованием рубцовой ткани, интактные эпидермальные
клетки на краю раны начинают пролиферировать и перемещаться, как на листе, по направлению к центру пораженной области. С утиханием воспаления необходимость в прямой подачи крови возрастает, и в месте раны возникает ангиогенез.
30 Воспаление является сложным процессом, в котором участвуют клетки
различных типов. Например, тучные клетки высвобождают медиаторы, которые запускают раннюю фазу расширения сосудов, что сопровождается разделением эндотелиальных клеток и воздействием на волокна коллагена в субэндотелиальном слое. Волокна в межклеточных промежутках, образующихся
35 между кровеносными сосудами, улавливают тромбоциты и запускают
высвобождение медиаторов из этих клеток.
Кроме тромбоцитов, волокна коллагена, подвергнутые воздействию, также взаимодействуют с белками плазмы, которые фильтруют через поры расширенной стенки сосудов, включая триггерный фактор каскада свертывания 5 крови, повышенное расширение сосудов, повышенную проницаемость кровеносных сосудов и хемотаксис.
Кроме того, каскад реакций комплемента может быть активирован различными стимулами: пораженными кровеносными сосудами, протеолитическими ферментами, высвобождаемыми пораженными клетками, 10 компонентами мембраны любой участвующей бактерии и комплексами антиген-антитело. Некоторые активированные компоненты комплемента действуют в качестве факторов хемотаксиса, ответственных за приток лейкоцитов в воспаленную область, в то время как другие облегчают фагоцитоз и участвуют в лизисе клеток.
15 Кроме того, считается, что обогащенные газом жидкости или растворы по
изобретению могут также регулировать, по меньшей мере, один цитокин, участвующий, по меньшей мере, в одном аспекте воспаления, и такой цитокин (-ы) включает, без ограничения, ФАМ (фактор активации макрофагов), ФИММ (фактор ингибирования миграции макрофагов), ФХМ (фактор хемотаксиса макрофагов),
20 ФИМЛ (фактор ингибирования миграции лейкоцитов), ГРФ (гистамин-рилизинг факторы), ТФ (трансферные факторы), интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15 и т.д.), ФНО-а, ФНО-В, интерфероны (ИФН -а, ИФН -В, ИФН -у, ИФН ИФН -б и т.д.), Г -КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), ГМ-КСФ (гранулоцитарный-
25 макрофагальный КСФ), М-КСФ (макрофагальный КСФ), мульти-КСФ (ИЛ-3), фактор роста фибробластов (аФРФ, ЬФРФ), ЭФР (эпидермальный фактор роста), ФРН (фактор роста нервов), ФРТ (фактор роста тромбоцитов), ФРЭС (фактор роста эндотелия сосудов), трансформирующие факторы роста (ТФР-а, ТФР-В и т.д.), НАБ-2 (нейтрофил-активирующий белок 2), ТФ-4 (тромбоцитарный фактор
30 4), тромбоглобулин, МХБ-1 (моноцитарный хемоаттрактантный белок 1), МХБ-3, МВБ-1а, МВБ -13-+ (макрофагальные воспалительные белки), RANTES (регулируемый при активации, нормальный Т-экспрессированный и преимущественно секретируемый хемокин), БТШ (белки теплового шока), РГБ (регулируемые глюкозой белки), убихитин и другие.
Таким образом, в определенных вариантах воплощения изобретения обогащенные газом жидкости и/или терапевтические композиции могут повышать выработку и/или секрецию противовоспалительных молекул или цитокинов или снижать распад противовоспалительных молекул или цитокинов, тем самым 5 улучшая или предотвращая, по меньшей мере, один симптом воспаления и/или воспалительной нейродегенерации. В других вариантах воплощения изобретения обогащенные газом жидкости и/или терапевтические композиции по данному изобретению могут повышать выработку и/или секрецию противовоспалительных молекул или цитокинов или снижать распад противовоспалительных молекул или
10 цитокинов, тем самым улучшая или предотвращая, по меньшей мере, один симптом воспаления и/или воспалительной нейродегенерации.
Проведенные ранее исследования выявили критическую роль антител к МОГ в снижении демиелинизации и ухудшении ЭАЭ (экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита), системы модели животных для аутоиммунного
15 нарушения человека - ревматоидного артрита. (Linington, et al. 1992. J. Neuroimmunol. 40:219-224). Кроме того, антитела к МОГ участвовали в патогенезе множественного склероза. (Berger et al. N. Engl. J. Med. 2003 Jul 10;349(2): 139-45).
Как это указано на Фигуре 2 и в Примере 3, обогащенная газом жидкость по данному изобретению амплифицирует ответ лимфоцитов на антиген, к которому
20 животное было примировано ранее. Как это указано на Фигуре 2, пролиферация лимфоцитов в ответ на воздействие МОГ была выше при культивации в жидкости, восстановленной обогащенной газом жидкостью по изобретению, содержащей сольватированные электроны, при сравнении с оксигенированной жидкостью под давлением (камера под давлением) или контрольной деионизированной
25 жидкостью.
Типичные релевантные молекулярные взаимодействия:
Обычно считают, что квантовые свойства характерны для элементарных 30 частиц менее, чем 10"10 метров, в то время как макроскопический мир нашей повседневной жизни называют классическим, так он ведет себя по законам движения Ньютона.
Недавно были описаны молекулы как образователи кластеров, увеличивающихся в размерах при разведении. Такие кластеры имеют несколько 35 микрометров в диаметре, и было сообщено, что они увеличиваются в размере при
разведении нелинейным образом. Было постулировано, что квантовые когерентные области размером 100 нанометров в диаметре возникают в чистой воде, и коллективные вибрации молекул воды в когерентной области со временем могут стать фазой, синхронизированной с колебаниями электромагнитного поля, 5 обеспечивая устойчивые колебания в воде, форму "памяти" в форме возбуждения долгоиграющих когерентных колебаний, специфических для растворенных в воде веществ, которые изменяют коллективную структуру воды, что, в свою очередь, может определять развивающиеся специфические когерентные колебания. В то время, как такие колебания становятся 10 стабилизированными соединением фаз магнитного поля, вода при разведении все еще может "производить" когерентные колебания. С увеличением в размерах кластерных молекул, их характерные электромагнитные признаки соответствующим образом амплифицированы, усиливая когерентные колебания, производимые водой.
15 Несмотря на различия в размере кластеров растворенных молекул и
детальной микроскопической структуре воды, тем не менее, существует специфика когерентных колебаний. Одна из моделей для анализа изменений свойств воды основана на соображениях, связанных с кристаллизацией.
Упрощенный протонированный водный кластер, образующий
20 наноструктурную решетку, представлен в предыдущей заявке на патент, представленной Заявителями: WO 2009/055729. Протонированный водный кластер обычно приобретает форму Н+(Н20)п. Некоторые протонированные водные кластеры возникают естественным путем, таким как в ионосфере. Не будучи связанными какой-либо отдельной теорией и в соответствии с отдельными
25 аспектами изобретения, возможны и другие типы водных кластеров или структур (кластеры, нанорешетки и т.д.), включая структуры, включающие кислород и стабилизированные электроны, свойственные материалам по изобретению. Атомы кислорода могут быть захвачены в полученных структурах. Химическая структура полусвязанной наноклетки позволяет кислороду и/или
30 стабилизированным электронам оставаться растворенными в течение продолжительных периодов времени. Другие атомы или молекулы, такие как лекарственные соединения, могут быть также присоединены в целях продолжительной доставки. Специфическая химическая природа материала для растворения и растворенных соединений зависит от взаимодействий таких
35 материалов.
С помощью проведенных ранее экспериментов было показано, что жидкости, обработанные в устройстве для смешивания, обладают различными структурными характеристиками, соответствующими анализу жидкости в контексте кластерной структуры. См., например, WO 2009/055729. 5 Наноструктуры со стабилизированным зарядом (например, содержащие кислород наноструктуры со стабилизированным зарядом):
Как это было описано ранее в заявке Заявителей на патент WO 2009/055729, "Double Layer Effect," "Dwell Time," "Rate of Infusion," и "Bubble size Measurements," электрокинетическое устройство для смешивания создает за
10 миллисекунды уникальное нелинейное динамическое взаимодействие в жидкости первого материала и второго материала со сложной, динамической турбулентностью, обеспечивая комплексное смешивание в контакте с эффективной огромной площадью поверхности (включая площадь поверхности устройства и исключительно малые пузырьки газа размером менее чем 100 нм),
15 что обеспечивает новейшие электрокинетические эффекты, описанные в тексте данной заявки. Кроме того, локализованные для материала электрокинетические эффекты (напряжение/ток) были показаны с использованием специально разработанного устройства для смешивания, включающего изолированный ротор и статор.
20 Как это хорошо известно в науке, перераспределение заряда и/или
сольватированных электронов крайне нестабильно в водном растворе. Согласно отдельным аспектам изобретения, выявленные Заявителями электрокинетические эффекты (например, перераспределение заряда, включая, в отдельных аспектах, сольватированные электроны) удивительным образом
25 стабилизированы в получаемом материале (например, физиологических растворах, ионных растворах). На самом деле, как это описано в тексте данной заявки, стабильность свойств и биологическая активность электрокинетических жидкостей по изобретению (например, RNS-60 или Solas) могут поддерживаться в течение месяцев в газонепроницаемом контейнере, что указывает на участие
30 растворенного газа (например, кислорода) в обеспечении получения и/или поддержания, и/или опосредования свойств и активности жидкостей по изобретению. Важным является и тот факт, что перераспределение зарядов и/или сольватированные электроны стабильно конфигурированы в электрокинетических ионных водных жидкостях по изобретению в количестве,
35 достаточном для обеспечения, при контакте живой клетки (например, клетки
млекопитающего) с жидкостью, модуляции, по меньшей мере, одного потенциала
клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны (см., например,
рабочий Пример 23, описывающий фиксацию клеточного потенциала, взятый из
WO 2009/055729 и представленный в тексте данной заявки).
5 Как это описано в тексте данной заявки в разделе "Молекулярные
взаимодействия", для учета стабильности и биологической совместимости электрокинетических жидкостей по изобретению (например, электрокинетических физиологических растворов), Заявителями были предположены взаимодействия между молекулами воды и молекулами веществ (например, кислорода),
10 растворенных в воде, изменяющих коллективную структуру воды и обеспечивающих наноструктуры, включающие кислород и/или стабилизированные электроны, свойственные выходным материалам по изобретению. Не будучи связанными каким-либо механизмом, конфигурация наноструктур в отдельных аспектах изобретения такова, что она: включает (по меньшей мере, образование
15 и/или стабильность и/или биологическую активность) растворенный газ (например, кислород); позволяет электрокинетическим жидкостям (например, физиологическим растворам RNS-60 или Solas) модулировать (например, передавать или получать) заряды и/или эффекты заряда при контакте с клеточной мембраной или ее родственными составляющими элементов; и в некоторых
20 аспектах изобретения обеспечивает стабилизацию (например, транспортировку, содержание, улавливание) сольватированных электронов биологически релевантным способом.
Согласно отдельным аспектам изобретения и как это описано в тексте данной заявки, в ионных или физиологических (например, стандартном
25 физиологическом растворе, NaCI) растворах наноструктуры по изобретению включают наноструктуры со стабилизированным зарядом (например, со средним диаметром менее чем 100 нм), которые могут включать, по меньшей мере, одну растворенную молекулу газа (например, кислорода) с гидратной оболочкой со стабилизированным зарядом. Согласно дополнительным аспектам гидратная
30 оболочка со стабилизированным зарядом может включать сетку или междоузлие, где находится, по меньшей мере, одна молекула растворенного газа (например, кислорода). Согласно дополнительным аспектам, путем обеспечения подходящих гидратных оболочек со стабилизированным зарядом, наноструктура со стабилизированным зарядом и/или содержащие кислород наноструктуры со
стабилизированным зарядом могут дополнительно включать сольватированный электрон (например, стабилизированный сольватированный электрон).
Не будучи ограниченными каким-либо механизмом или отдельной теорией, после данной приоритетной даты были предположены микропузырьки со 5 стабилизированным зарядом, стабилизированные ионами в водной жидкости в равновесии с окружающим (атмосферным) газом (Bunkin et al., Journal of Experimental and Theoretical Physics, 104:486-498, 2007; включено сюда во всей своей полноте посредством ссылки). Согласно отдельным аспектам данного изобретения новейшие электрокинетические жидкости Заявителей включают
10 новейшую, биологически активную форму содержащих кислород наноструктур со стабилизированным зарядом и могут дополнительно включать новейшие матрицы, кластеры или ассоциации таких структур.
Согласно модели микропузырька со стабилизированным зарядом, молекулярный порядок структуры воды с малым радиусом действия разрушается
15 присутствием молекулы газа (например, растворенной молекулы газа, которая изначально включена в комплекс с неадсорбционным ионом, обеспечивающим дефект малого радиуса действия), при этом происходит конденсация ионных капель, а дефект окружается первой и второй координационной сферами молекул воды, которые альтернативно наполнены адсорбционными ионами (например,
20 приобретение "экранирующей оболочки" ионов Na+ с образованием двойного электрического слоя) и неадсорбционными ионами (например, ионами СГ, оккупирующими вторую координационную сферу), занимая шесть и 12 мест, соответственно, в координационных сферах. В недостаточно насыщенных ионных растворах (например, недостаточно насыщенные физиологические
25 растворы) такие гидратированные "ядра" остаются стабильными до тех пор, пока первая и вторая сферы не будут заполнены шестью адсорбционными и пятью неадсорбционными ионами, соответственно, и затем возникает кулоновский взрыв, создающий внутреннее пространство, содержащее молекулу газа, при этом адсорбционные ионы (например, ионы Na+) адсорбируются на поверхности
30 образующегося пространства (кармана), в то время как неадсорбционные ионы (или некоторые их участки) диффундируют в раствор (Bunkin et al., см. выше). В этой модели карман в наноструктуре защищен от коллапса кулоновским отталкиванием между ионами (например, ионами Na+), адсорбируемыми на поверхности. Стабильность содержащих карман наноструктур постулирована как
35 образующаяся в результате селективной адсорбции растворенных ионов с
подобными зарядами карманом/поверхностью пузырька и диффузным равновесием между растворенным газом и газом внутри пузырька, при этом отрицательное (наружное) электростатическое давление, образуемое полученным двойным электростатическим слоем, обеспечивает стабильную 5 компенсацию для поверхностного натяжения, и давление газа внутри пузырька сбалансировано давлением окружающей среды. Согласно этой модели, образование таких микропузырьков требует наличия ионного компонента, и в определенных аспектах опосредованные столкновением ассоциации между частицами могут обеспечить образование кластеров высшего порядка (матриц) 10 (Id).
Модель микропузырька со стабилизированным зарядом указывает, что частицы могут быть представлены микропузырьками газа, но предусматривает только спонтанное образование таких структур в ионном растворе в равновесии с окружающим воздухом, что не охарактеризовано, при этом неизвестно, способен
15 ли кислород образовывать такие структуры, и маловероятно, что сольватированные электроны могут быть ассоциированы и/или стабилизированы такими структурами.
Согласно отдельным аспектам изобретения электрокинетические жидкости по изобретению, включающие наноструктуры со стабилизированным зарядом
20 и/или содержащие кислород наноструктуры со стабилизированным зарядом являются новейшими и фундаментально отличаются от постулированных неэлектрокинетических атмосферных структур микропузырьков со стабилизированным зарядом согласно модели микропузырьков. Важным является и тот факт, что данное заключение неоспоримо и получено, по меньшей мере,
25 частично, на основе того факта, что контрольные физиологические растворы не обладают описанными здесь биологическими свойствами, в то время как наноструктуры со стабилизированным зарядом Заявителей обеспечивают новейшую, биологически активную форму кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом.
30 Согласно отдельным аспектам данного изобретения, новейшее
электрокинетическое устройство Заявителей и способы обеспечивают новейшие электрокинетически измененные жидкости, включающие достаточные количества наноструктур со стабилизированным зарядом больше любого количества, которое может образоваться или может не образоваться спонтанным образом в ионных
35 жидкостях в равновесии с воздухом, или в лю 6> ix жидкостях, полученных не
электрокинетическим способом. В отдельных аспектах наноструктуры со стабилизированным зарядом включают кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом. В дополнительных аспектах все, или по существу все наноструктуры со стабилизированным зарядом представлены 5 кислородсодержащими наноструктурами со стабилизированным зарядом, или кислородсодержащими наноструктурами со стабилизированным зарядом, большая часть которых представлена газосодержащими наноструктурами со стабилизированным зарядом, находящимися в электрокинетической жидкости.
Согласно дополнительным аспектам, наноструктуры со стабилизированным
10 зарядом и/или кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом могут включать или нести сольватированный электрон, тем самым являясь новейшим стабилизированным переносчиком сольватированного электрона. В отдельных аспектах наноструктуры со стабилизированным зарядом и/или кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом
15 обеспечивают новейший тип электрида (или инвертированного электрида), который, в отличие от обычных электридов раствора с одним органически координированным катионом, имеет множество катионов, стабильно расположенных вокруг кармана, или карман включает атом кислорода, при этом окружающие ионы натрия координированы гидратными оболочками воды, а не
20 органическими молекулами. Согласно отдельным аспектам, расположение сольватированного электрона может быть обусловлено гидратной оболочкой молекул воды, или преимущественно может быть обусловлено наноструктурой кармана, распространяющегося на все катионы. В определенных аспектах наноструктуры по изобретению обеспечивают новейшую структуру
25 "суперэлектрида" в растворе, не только обеспечивая распределение/стабилизацию сольватированного электрона среди множества окружающих катионов натрия, но также обеспечивая ассоциацию или частичную ассоциацию сольватированного электрона с уловленной молекулой (-амии) кислорода в кармане - сольватированный электрон распределяется по матрице
30 из атомов натрия и, по меньшей мере, одного атома кислорода. Таким образом, согласно отдельным аспектам, "сольватированные электроны", как это описано в тексте данной заявки, находящиеся в ассоциации с электрокинетическими жидкостями по изобретению, могут не быть сольватированными согласно традиционной модели, включающей прямую гидрацию молекулами воды. С
35 другой стороны, в ограниченной аналогии с сухими солями электридов,
сольватированные электроны в электрокинетических жидкостях по изобретению
могут быть распределены по множественным наноструктурам со
стабилизированным зарядом для обеспечения "решетчатого клея" для
стабилизации матриц высшего порядка в водном растворе.
5 В отдельных аспектах наноструктуры со стабилизированным зарядом по
изобретению и/или кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом по изобретению способны взаимодействовать с клеточными мембранами или их составляющими, или белками и т.д. для опосредования биологической активности. В отдельных аспектах наноструктуры со стабилизированным зарядом 10 по изобретению и/или кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом по изобретению, несущие сольватированный электрон, способны взаимодействовать с клеточными мембранами или их составляющими, или белками и т.д. для опосредования биологической активности.
15 В отдельных аспектах наноструктуры со стабилизированным зарядом по
изобретению и/или кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом по изобретению взаимодействуют с клеточными мембранами или их составляющими, или белками и т.д. в качестве донора заряда и/или донора эффекта заряда (поставки) и/или в качестве реципиента заряда и/или реципиента
20 эффекта заряда для опосредования биологической активности. В отдельных аспектах наноструктуры со стабилизированным зарядом по изобретению и/или кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом по изобретению, несущие сольватированный электрон, взаимодействуют с клеточными мембранами в качестве донора заряда и/или донора эффекта заряда
25 и/или в качестве реципиента заряда и/или реципиента эффекта заряда для опосредования биологической активности.
В отдельных аспектах наноструктуры со стабилизированным зарядом по изобретению и/или кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом по изобретению соответствуют и обуславливают наблюдаемую
30 стабильность и биологические свойства электрокинетических жидкостей по изобретению и дополнительно обеспечивают новейший электрид (или инвертированный электрид), который обеспечивает наличие стабилизированных сольватированных электронов в водных ионных растворах (например, физиологических растворах, NaCI и т.д.).
В отдельных аспектах кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом по изобретению по существу включают, приобретают форму или могут образовывать кислородсодержащие нанопузырьки со стабилизированным зарядом. В отдельных аспектах кислородсодержащие 5 кластеры со стабилизированным зарядом обеспечивают образование относительно больших матриц кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом и/или кислородсодержащих нанопузырьков со стабилизированным зарядом или их матриц. В отдельных аспектах кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом могут
10 обеспечивать образование гидрофобных нанопузырьков при контакте с гидрофобной поверхностью.
В отдельных аспектах кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом по существу включают, по меньшей мере, одну молекулу кислорода. В определенных аспектах кислородсодержащие
15 наноструктуры со стабилизированным зарядом по существу включают, по меньшей мере, 1, по меньшей мере, 2, по меньшей мере, 3, по меньшей мере, 4, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 50, по меньшей мере, 100 или более молекул кислорода. В определенных аспектах кислородсодержащие наноструктуры со
20 стабилизированным зарядом включают или способствуют образованию нанопузырьков (например, гидрофобных нанопузырьков) размером примерно 20 нм х 1,5 нм, включают примерно 12 молекул кислорода (например, на основе размера молекулы кислорода (примерно от 0,3 нм до 0,4 нм), при условии идеального газа и применении n=PV/RT, где Р=1 атм, R=0,082 057л.атм/моль.К;
25 Т=295К; V=pr2h=4,7x10'22 л, где г=10x10"9 м, h=1,5x10"9 м, и п=1,95x10'22 моль).
В отдельных аспектах изобретения процент растворенных молекул кислорода, присутствующих в жидкости в виде таких наноструктур или их матриц с конфигурацией со стабилизированным зарядом в водной ионной жидкости, представлен процентом, выбираемым из группы, состоящей из более чем: 0,1%;
30 1%; 2%; 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; и более чем 95%. Преимущественно, такой процент выше чем примерно 5%, выше чем примерно 10%, выше чем примерно 15% или выше чем примерно 20%. В дополнительных аспектах размер по существу кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом или их матриц
35 с конфигурацией со стабилизированным зарядом в водной ионной жидкости
представлен размером, выбираемым из группы, состоящей из менее, чем: 100 нм; 90 нм; 80 нм; 70 нм; 60 нм; 50 нм; 40 нм; 30 нм; 20 нм; 10 нм; 5 нм; 4 нм; 3 нм; 2 нм; и 1 нм. Преимущественно, такой размер менее, чем примерно 50 нм, менее, чем примерно 40 нм, менее, чем примерно 30 нм, менее, чем примерно 20 нм или 5 менее чем примерно 10 нм.
В отдельных аспектах электрокинетические жидкости по изобретению включают сольватированные электроны. В дополнительных аспектах электрокинетические жидкости по изобретению включают наноструктуры со стабилизированным зарядом и/или кислородсодержащие наноструктуры со
10 стабилизированным зарядом и/или их матрицы, которые включают, по меньшей мере, одно из следующего: сольватированный электрон (-ы); и уникальное распределение зарядов (полярное, симметричное, асимметричное распределение зарядов). В отдельных аспектах наноструктуры со стабилизированным зарядом и/или кислородсодержащие наноструктуры со
15 стабилизированным зарядом и/или их матрицы обладают парамагнитными свойствами.
С другой стороны, относительно электрокинетических жидкостей по изобретению, контрольные оксигенированные жидкости в контейнере под давлением (неэлектрокинетические жидкости) и подобные им жидкости не 20 включают таких полученных электрокинетически биологически активных наноструктур со стабилизированным зарядом и/или биологически активных кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом и/или их матриц, способных модулировать, по меньшей мере, один потенциал клеточной мембраны и проводимость клеточной мембраны.
Системы для получения обогащенных газом жидкостей
Системы и способы, описанные в заявке на патент WO 2009/055729, поданной Заявителями, позволяют стабильно обогащать газом (например, кислородом) при высокой концентрации с минимальной пассивной потерей.
30 Такая система и способы могут эффективно использоваться для обогащения целого ряда газов при повышенных процентных соотношениях в целом ряде жидкостей. В качестве примера: деионизированная вода при комнатной температуре, которая обычно имеет уровни растворенного кислорода примерно 2-3 промилле (частей на миллион), может достигать уровней растворенного
35 кислорода, варьирующих от, по меньшей мере, примерно 5 промилле, по
меньшей мере, примерно 10 промилле, по меньшей мере, примерно 15 промилле, по меньшей мере, примерно 20 промилле, по меньшей мере, примерно 25 промилле, по меньшей мере, примерно 30 промилле, по меньшей мере, примерно 35 промилле, по меньшей мере, примерно 40 промилле, по 5 меньшей мере, примерно 45 промилле, по меньшей мере, примерно 50 промилле, по меньшей мере, примерно 55 промилле, по меньшей мере, примерно 60 промилле, по меньшей мере, примерно 65 промилле, по меньшей мере, примерно 70 промилле, по меньшей мере, примерно 75 промилле, по меньшей мере, примерно 80 промилле, по меньшей мере, примерно 85
10 промилле, по меньшей мере, примерно 90 промилле, по меньшей мере, примерно 95 промилле, по меньшей мере, примерно 100 промилле, или любое значение, превышающее или находящееся между указанными значениями с использованием описанных систем и/или способов. В соответствии с отдельным типичным вариантом воплощения изобретения, обогащенная кислородом вода
15 может быть получена с уровнями растворенного кислорода примерно 30-60 промилле.
Таблица 3 приводит различные показатели парциального давления, взятые из заживающей раны, подвергнутой лечению обогащенным кислородом физиологическим раствором (Таблица 3), и образцов обогащенного газом и 20 обогащенного кислородом физиологического раствора по данному изобретению.
ТАБЛИЦА 3
ИЗМЕРЕНИЕ КИСЛОРОДА В ТКАНЯХ Проба Z082BO
В воздухе: 171 мм рт.ст. 23°С
Колонка Парциальное давление (мм рт.ст.)
В1 32-36
В2 169-200
ВЗ 20-180*
*минимальная глубина раны, большинство > 150, воздействие 20 сек
Пути и формы введения
25 В отдельных типичных вариантах воплощения изобретения обогащенная
газом жидкость по данному изобретению может функционировать в качестве
В4 40-60
терапевтической композиции в виде монотерапии или в комбинации с другим терапевтическим агентом, таким образом, терапевтическая композиция предотвращает или снижает, по меньшей мере, один симптом воспаления. Терапевтические композиции по данному изобретению включают композиции, 5 которые могут быть введены нуждающемуся в этом субъекту. В определенных вариантах воплощения изобретения терапевтическая композиция также может включать, по меньшей мере, один дополнительный агент, выбираемый из группы, состоящей из: носителей, адъювантов, эмульгаторов, суспендирующих агентов, подсластителей, ароматизаторов, отдушек и связующих агентов.
10 В контексте данного изобретения "фармацевтически приемлемый
носитель" и "носитель" обычно обозначает нетоксичный, инертный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательную композицию любого типа. Некоторые неограничивающие примеры материалов, которые могут служить в качестве фармацевтически
15 приемлемых носителей, представлены сахарами, такими как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалом, таким как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозой и ее производными, такими как натрий карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетатцеллюлоза; порошковой трагакантвой камедью; солодом; желатином; тальком; вспомогательными веществами, такими как масло какао и
20 воск для свечей; маслами, такими как арахисовое масло, масло семян льна; сафлоровое масло; кунжутное масло; оливковое масло; кукурузное масло и соевое масло; гликолями; такими как пропиленгликоль; эфирами, такими как этилолеат и этиллаурат; агаром; буферными агентами, такими как магния гидроксид и алюминия гидроксид; альгинатная кислота; апирогенной водой;
25 изотоническим физиологическим раствором; раствором Рингера; этиловым спиртом и фосфатными буферными растворами, а также другими нетоксичными совместимыми лубрикантами, такими как натрия лаурилсульфат и магния стеарат, а также красителями, высвобождающими агентами, агентами для покрытия, посластителями, ароматизаторами и отдушками, консервантами и
30 антиоксидантами, которые также могут присутствовать в композиции согласно решению разработчика композиции. В отдельных аспектах такие носители и вспомогательные вещества могут быть представлены обогащенными газом жидкостями или растворами по данному изобретению.
Описанные здесь фармацевтически приемлемые носители, например,
35 носители, адъюванты, вспомогательные вещества или разбавители известны
специалисту в денной области. Обычно фармацевтически приемлемый носитель является химически инертным к терапевтическим агентам и не обладает губительными побочными эффектами или токсичностью при условиях использования. Фармацевтически приемлемые носители могут включать 5 полимеры и полимерные матрицы, наночастицы, микропузырьки и т.п.
Кроме терапевтической обогащенной газом жидкости по данному изобретению, терапевтическая композиция может дополнительно включать инертные разбавители, такие как дополнительная и не обогащенная газом вода или другие растворители, солюбилизаторы и эмульгаторы, такие как этиловый
10 спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, масло зародышей, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и эфиры жирных кислот сорбитана, и их смеси. Как это
15 очевидно для специалиста в данной области, новейший и улучшенный состав отдельной терапевтической композиции, новейшая обогащенная газом терапевтическая жидкость, и новейший способ доставки новейшей обогащенной газом терапевтической жидкости может быть получен путем замены одного или нескольких инертных разбавителей обогащенной газом жидкости идентичной,
20 подобной или разной композицией. Например, обычная вода может быть заменена или дополнена обогащенной газом жидкостью, полученной смешиванием кислорода в воде или деионизированной воде для получения обогащенной газом жидкости.
В определенных вариантах воплощения изобретения обогащенная газом
25 жидкость по изобретению может быть скомбинирована с одним или несколькими терапевтическими агентами и/или использоваться без них. В отдельных вариантах воплощения изобретения введение обогащенной газом жидкости может включать замену одного или нескольких растворов, известных в науке, таких как деионизированная вода, физиологический раствор и т.п., одной или
30 несколькими обогащенными газами жидкостями с получением улучшенной терапевтической композиции для доставки субъекту.
Определенные варианты воплощения изобретения описывают терапевтические композиции, включающие обогащенную газом жидкость по данному изобретению, фармацевтическую композицию или другой
35 терапевтический агент или фармацевтически приемлемую соль или ее сольват, и,
по меньшей мере, один фармацевтический носитель или разбавитель. Такие фармацевтические композиции могут использоваться в профилактике и лечении описанных ниже заболеваний или состояний и в способах лечения, как это указано выше. Преимущественно, носитель должен быть фармацевтически 5 приемлемым и должен быть совместимым, т.е. не оказывать губительного действия, с другими ингредиентами в композиции. Носитель может быть представлен твердым или жидким веществом и преимущественно представлен в виде единицы дозы композиции, например, таблетки, которая может включать от 0,05 до 95% по весу активного действующего вещества.
10 Возможные пути введения включают пероральный, сублингвальный,
буккальный, парентеральный (например, подкожный, внутримышечный,
внутриартериальный, интраперитонеальный, интрацистернальный,
интравезикальный, интратекальный или внутривенный), ректальный, местный, включая чрескожный, интравагинальный, внутриглазной, внутриушной,
15 интраназальный, ингаляцию и инъекцию или введение имплантируемых устройств или материалов.
Пути введения
Наиболее подходящие способы введения отдельному субъекту будут
20 зависеть от природы и степени тяжести заболевания или состояния, подвергнутого лечению, или природы терапии, которая используется, а также природы терапевтической композиции или дополнительного терапевтического агента. В определенных вариантах воплощения изобретения преимущественно пероральное или местное введение.
25 Композиции, подходящие для перорального введения, могут быть
представлены в виде дискретных единиц, таких как таблетки, капсулы, саше, сиропы, эликсиры, жевательная резинка, композиции "леденцов", микроэмульсии, растворы, суспензии, леденцы или покрытые гелем ампулы, каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного соединения; в
30 виде порошков или гранул; в виде растворов или суспензий в водных или неводных жидкостях; эмульсий вода в масле или эмульсий масла в воде.
Дополнительные композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены для включения частиц мелкодисперсной пыли или тумана, которые могут быть получены с использованием различных типов
35 дозированных аэрозолей под давлением, атомизаторов, небулайзеров или
инсуффляторов. В частности, порошки или другие соединения терапевтических агентов могут быть растворены или суспендированы в обогащенной газом жидкости по данному изобретению.
Композиции, подходящие для чресслизистых способов, таких как 5 сублингвальное или буккальное введение, включают леденцы, трансдермальные системы, таблетки и т.п., включающие активное действующее вещество и, обычно, ароматизированную основу, такую как сахар, и камедь или трагакант, а также пастилки, включающие активное соединение с инертным основанием, таким как желатин и глицерин или сахарозу и камедь.
10 Композиции, подходящие для парентерального введения, обычно включают
стерильные водные растворы, содержащие предварительно определенную концентрацию активной обогащенной газом жидкости и возможно другого терапевтического агента; раствор преимущественно изотоничен с кровью предполагаемого реципиента. Дополнительные композиции, подходящие для
15 парентерального введения, включают композиции, содержащие физиологически подходящие со-растворители и/или комплексообразующие агенты, такие как сурфактанты и циклодекстрины. Эмульсии масло в воде также могут подходить для композиций для парентерального введения обогащенной газом жидкости. Несмотря на то, что такие растворы преимущественно вводят внутривенно, они
20 также могут быть введены подкожной или внутримышечной инъекцией.
Композиции, подходящие для уретрального, ректального или вагинального введения включают гели, кремы, лосьоны, водные или масляные суспензии, диспергируемые порошки или гранулы, эмульсии, растворимые твердые материалы, клизмы и т.п. Композиции преимущественно вводят в виде единиц
25 доз свечей, включающих активное действующее вещество в одном или нескольких твердых носителях, образующих основу свечей, например, масло какао. С другой стороны, композиции для промывания толстого кишечника обогащенными газом жидкостями по данному изобретению могут использоваться для введения в толстую или прямую кишку.
30 Композиции, подходящие для местного, внутриглазного, внутриушного или
интраназального введения, включают мази, крема, пасты, лосьоны, пасты, гели (такие как гидрогели), спреи, диспергируемые порошки и гранулы, эмульсии, спреи или аэрозоли с использованием летучих пропеллентов (таких как липосомальные спреи, назальные капли, назальные спреи и т.п.) и масла.
35 Подходящие носители для таких композиций включают вазелин, ланолин,
полиэтиленгликоли, спирты и их комбинации. Назальная или внутриназальная поставка может включать отмеренные дозы любых таких композиций или других композиций. Подобным образом, композиции для внутриушного или внутриглазного введения могут включать капли, мази, раздражающие жидкости и 5 т.п.
Композиции по изобретению могут быть получены любым подходящим способом, обычно однородным и тщательным перемешиванием обогащенной газом жидкости, в некоторых случаях с активным соединением, с жидкостями или мелкоизмельченными твердыми носителями или с обоими компонентами, в
10 требуемых пропорциях и затем, при необходимости, формированием полученной смеси в требуемую форму.
Например, таблетка может быть получена компрессией конечной смеси, включающей порошок или гранулы активного действующего вещества и одного или нескольких дополнительных ингредиентов, таких как связующий агент,
15 лубрикант, инертный разбавитель или поверхностно активный диспергирующий агент, или формовкой полученной смеси порошкообразного активного действующего вещества и обогащенной газом жидкости по данному изобретению.
Подходящие композиции для введения ингаляцией включают частицы мелкодисперсной пыли или тумана, которые могут быть получены с
20 использованием различных типов дозированных аэрозолей под давлением, атомизаторов, небулайзеров или инсуффляторов. В частности, порошки или другие соединения терапевтических агентов могут быть растворены или суспендированы в обогащенной газом жидкости по данному изобретению.
Для легочного введения через рот размер частиц порошка или капель
25 обычно находится в диапазоне 0,5-10 мкМ, преимущественно 1-5 мкМ, для обеспечения доставки в бронхиальное дерево. Для назального введения размер частиц находится в диапазоне 10-500 мкМ, что является преимущественным для обеспечения задержки в носовой полости.
Дозированные ингаляторы представлены находящимися под давлением
30 аэрозольными диспенсерами, обычно содержащими композицию суспензии или раствора терапевтического агента в сжиженном пропелленте. В определенных вариантах воплощения изобретения, как это описано в тексте данной заявки, обогащенные газом жидкости по данному изобретению могут использоваться в добавление или вместо стандартного сжиженного пропеллента. Во время
35 использования такие устройства дозируют композицию через клапан,
адаптированный для доставки отмеренного объема, обычно от 10 до 150 мкл, для получения спрея из мелких частиц, содержащего терапевтический агент и обогащенную газом жидкость. Подходящие пропелленты включают определенные композиции хлорфторуглерода, например, дихлордифторметан, 5 трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан и их смеси.
Композиция может дополнительно включать один или несколько со-растворителей, например, сурфактанты этанола, такие как олеиновая кислота или триолеат сорбитана, антиоксиданты и подходящие ароматизаторы. Небулайзеры являются представленными на рынке устройствами, которые трансформируют
10 растворы или суспензии активного действующего вещества в терапевтический аэрозольный туман посредством нагнетания сжатого газа (обычно воздуха или кислорода) через узкое отверстие сопла или посредством ультразвукового перемешивания. Подходящие композиции для использования в небулайзерах состоят из другого терапевтического агента в обогащенной газом жидкости и
15 включают до 40% в/в композиции, преимущественно менее, чем 20% в/в. Кроме того, могут использоваться другие носители, такие как дистиллированная вода, стерильная вода или разбавленный водный раствор спирта, который получают преимущественно изотоничным к жидкостям тела посредством добавления солей, таких как натрия хлорид. Дополнительные добавки включают консерванты, в
20 частности, если композицию получают нестерильной, и могут включать метилгидроксибензоат, антиоксиданты, ароматизаторы, летучие масла, буферные агенты и сурфактанты.
Подходящие композиции для введения способом инсуффляции включают мелкодисперсные порошки, которые могут быть доставлены с помощью
25 инсуффлятора или введены в носовую полость по типу нюхательного табака. В инсуффляторе порошок содержится в капсулах или картриджах, обычно сделанных из желатина или пластика, которые распадаются на кусочки или открываются in situ, и порошок доставляется воздухом, идущим от устройства при вдыхании или посредством работающего вручную наноса. Порошок,
30 используемый в инсуффляторе, состоит только из активного действующего вещества или смеси порошков, включающих активное действующее вещество, подходящий разбавитель для порошка, такой как лактоза, и в некоторых случаях сурфактант. Активное действующее вещество обычно составляет от 0,1 до 100 в/в композиции.
35 Кроме ингредиентов, отмеченных выше специфическим образом,
композиции по данному изобретению могут включать другие агенты, известные специалисту в данной области, относящиеся к типу рассматриваемой композиции. Например, композиции, подходящие для перорального введения, могут включать ароматизаторы, и композиции, подходящие для интраназального введения, могут 5 включать отдушки.
Терапевтические композиции по изобретению могут быть введены любым стандартным способом, имеющимся для использования в сочетании с фармацевтическими препаратами, в виде одного терапевтического агента или в комбинации терапевтических агентов.
10 Вводимая доза, конечно же, будет сильно варьировать, завися от известных
факторов, таких как фармацевтические характеристики отдельного агента и его путь и способ введения; возраст, состояние здоровья и вес реципиента; природа и степень тяжести симптомов; вид сопутствующего лечения; частота лечения; и требуемый эффект. Суточная доза активного действующего вещества, как
15 ожидается, может составлять от примерно 0,001 до 1000 миллиграмм (мг) на килограмм (кг) массы тела, преимущественная доза составляет от 0,1 до 30 мг/кг. Согласно определенным аспектам, суточная доза активного действующего вещества может составлять от 0,001 литров до 10 литров, при этом преимущественная доза составляет от примерно 0,01 литров до 1 литра.
20 Лекарственные формы (композиций, подходящих для введения) содержат
от примерно 1 мг до примерно 500 мг активного действующего вещества на единицу. В таких фармацевтических композициях активное действующее вещество обычно будет присутствовать в количестве примерно 0,5-95% по весу на основе общего веса композиции.
25 Мази, пасты, пенки, суспензии, крема и гели также могут содержать
вспомогательные вещества, такие как крахмал, трагакант, производные целлюлозы, силиконы, бентониты, кремниевую кислоту и тальк, или их смеси. Порошки и спреи также могут содержать вспомогательные вещества, такие как лактозу, тальк, кремниевую кислоту, алюминия гидроксид и кальция силикаты, или
30 смеси таких веществ. Растворы нанокристаллических антибактериальных металлов могут быть преобразованы в аэрозоли или спреи любым известным способом, который обычно используют для получения аэрозольных лекарственных препаратов. В целом, такие способы включают сжатие под давлением или обеспечение контейнера для сжатия под давления раствора,
35 обычно с использованием инертного газа-носителя, и пропуск находящегося под
давлением газа через небольшое отверстие. Спреи могут дополнительно содержать обычные пропелленты, такие как азот, диоксид углерода и другие инертные газы. Кроме того, микросферы или наночастицы могут участвовать вместе с обогащенными газами терапевтическими композициями или жидкостями 5 по данному изобретению в любом из способов, требуемых для введения терапевтических композиций субъекту.
Композиции для использования в инъекциях могут быть представлены герметичными контейнерами с однократной или многократной дозами, такими как ампулы и флаконы, и могут храниться в лиофилизированном (высушенном
10 сублимацией) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого вспомогательного вещества, или обогащенной газом жидкости непосредственно перед использованием. Растворы и суспензии для немедленных инъекций могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток. Требования к эффективным фармацевтическим носителям для инъецируемых композиций
15 известны специалисту в данной области. См., например, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. В. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, Eds., 238-250 (1982) и ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., 622-630 (1986).
Композиции, подходящие для местного введения, включают леденцы, 20 включающие обогащенную газом жидкость по изобретению и, в некоторых случаях, дополнительный терапевтический агент и вкусовые добавки, обычно сахарозу и камедь или трагакант; пастилки, включающие обогащенную газом жидкость и, в некоторых случаях, дополнительный терапевтический агент с инертной основой, такой как желатин и глицерин, или сахароза и камедь; и 25 ополаскиватели для ротовой полости или зубные эликсиры, включающие обогащенную газом жидкость и, в некоторых случаях, дополнительный терапевтический агент в подходящем жидком носителе; а также кремы, эмульсии, гели и т.п.
Кроме того, композиции, подходящие для ректального введения, могут быть 30 представлены в виде свечей путем смешивания с целым рядом оснований, таких как эмульгирующие основания или водорастворимые основания. Композиции, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пены или спрея, содержащих, кроме активного действующего вещества, такие носители, которые известны в науке как 35 подходящие.
Подходящие фармацевтические носители описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, стандартном справочном документе, используемом в данной области.
Дозы, вводимой субъекту, особенно животному, в частности, человеку, в 5 контексте данного изобретения, должно быть достаточно для вызова терапевтического ответа у животного в течение резонных временных рамок. Специалисту в данной области станет очевидно, что доза будет зависеть от целого ряда факторов, включая состояние животного, массу тела животного, а также подвергнутое лечению состояние. Подходящая доза представлена таковой,
10 которая приводит к концентрации терапевтической композиции у субъекта, которая, как известно, вызывает требуемый ответ.
Размер дозы также будет определяться путем, временем и частотой введения, а также существованием, природой и степенью тяжести любых нежелательных побочных эффектов, которые могут сопровождать введение
15 терапевтической композиции, и требуемого физиологического эффекта.
Будет очевидно, что композиции в комбинации могут быть введены: (1) одновременно комбинацией соединений в со-композиции или (2) чередованием, т.е. поставкой соединений серийно, последовательно, параллельно или одновременно в отдельных фармацевтических композициях. При чередующемся
20 лечении задержка в введении второго, и в некоторых случаях, третьего активного действующего вещества не должна приводить к потере пользы синергичного терапевтического эффекта от комбинации активных действующих ингредиентов. Согласно определенным вариантам воплощения изобретения с использованием способа введения (1) или (2), в идеальном случае комбинированную терапию
25 следует вводить для достижения более эффективных результатов. Согласно определенным вариантам воплощения изобретения с использованием способа введения (1) или (2), в идеальном случае комбинированную терапию следует вводить для достижения пиковых концентраций в плазме каждого активного действующего вещества. Режим приема одной таблетки один раз в день при
30 введении комбинации со-композиций может оказаться благоприятным для некоторых пациентов, страдающих от воспалительных нейродегенеративных заболеваний. Согласно определенным вариантам воплощения изобретения эффективные пиковые плазменные концентрации активных действующих веществ в комбинации будут находиться в диапазоне примерно от 0,001 до 100 мкМ.
35 Оптимальные пиковые плазменные концентрации могут быть достигнуты
разработкой композиции и режима приема доз для отдельного пациента. Следует также понимать, что жидкости по изобретению и глатирамера ацетат, интерферон-бета, митоксантрон и/или натализумаб или их физиологически функциональные производные, при одновременном или последовательном 5 введении, могут быть введены по-отдельности, с множественными композициями или в любой их комбинации. В целом, во время чередующейся терапии (2), эффективная доза каждого соединения вводится серийно, в то время, как в ходе терапии со-композициями (1) эффективные дозы двух или более соединений вводятся вместе.
10 Комбинации по изобретению могут быть обычно представлены в виде
фармацевтической композиции в единице однократной дозы. Подходящая однократная доза композиции содержит активные действующие вещества в любом количестве от 1 мг до 1 г каждый, например, не ограничиваясь, от 10 мг до 300 мг. Синергические эффекты жидкости по изобретению в комбинации с
15 глатирамера ацетатом, интерфероном-бета, митоксантроном и/или натализумабом могут быть реализованы в широком диапазоне, например, от 1:50 до 50:1 (жидкость по изобретению: глатирамера ацетат, интерферон-бета, митоксантрон и/или натализумаб). В одном варианте воплощения изобретения соотношение может варьировать от примерно 1:10 до 10:1. В другом варианте
20 воплощения изобретения соотношение вес/вес жидкости по изобретению к глатирамера ацетату, интерферону-бета, митоксантрону и/или натализумабу в со-разработанной комбинированной единице дозы, такой как пилюля, таблетка, драже или капсула, будет составлять примерно 1, т.е. примерно равно количеству жидкости по изобретению и глатирамера ацетата, интерферона-бета,
25 митоксантрона и/или натализумаба. В других типичных со-композициях количества жидкости по изобретению и глатирамера ацетата, интерферона-бета, митоксантрона и/или натализумаба может быть больше или меньше. В одном варианте воплощения изобретения каждое соединение будет использовано в комбинации в количестве, при котором оно имеет противовоспалительную
30 активность при сравнении его использования по-одиночке. Другие соотношения и количества соединений указанных комбинаций предусмотрены объемом данного изобретения.
Единица однократной дозы может дополнительно включать жидкость по изобретению и глатирамера ацетат, интерферон-бета, митоксантрон и/или
натализумаб, или их физиологически функциональные производные, и фармацевтически приемлемый носитель.
Для специалиста в данной области станет очевидно, что количество активных действующих веществ в комбинациях по изобретению, необходимых 5 для использования в лечении, будет варьировать в соответствии с целым рядом факторов, включая природу подвергнутого лечению состояния и возраст и состояние пациента, и будет устанавливаться на усмотрение лечащего врача или специалиста в области здравоохранения. Факторы, которые следует учитывать, включают путь введения и природу композиции, массу тела животного, возраст и 10 общее состояние и природу и степень тяжести подвергнутого лечению заболевания.
Также возможна комбинация любых двух активных действующих веществ в единице однократной дозы для последовательного или одновременного введения с третьим активным действующим веществом. Комбинация из трех активных
15 действующих веществ может вводиться одновременно или последовательно. При последовательном введении, комбинация может вводиться за два и три введения. Согласно определенным вариантам воплощения изобретения состоящая из трех частей комбинация жидкости по изобретению и глатирамера ацетата, интерферона-бета, митоксантрона и/или натализумаба может быть введена в
20 любом порядке.
Приведенные ниже примеры являются только иллюстративными и не являются ограничивающими никоим образом.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Размер микропузырька Эксперименты проводили с использованием обогащенной газом жидкости и диффузора по данному изобретению для определения предельного размера 30 микропузырьков газа. Предельный размер микропузырьков газа был установлен пропусканием обогащенной газом жидкости через фильтры 0,22 и 0,1 микрон. При проведении таких тестов объем жидкости пропускали через диффузор по данному изобретению с получением обогащенной газом жидкости. Шестьдесят миллилитров такой жидкости было отобрано в 60 мл шприц. Уровень 35 растворенного кислорода в жидкости, находящейся в шприце, был измерен с
использованием титрации по Винклеру. Жидкость в шприце была введена через фильтр 0,22 микрон Millipore Millex GP50 и в 50 мл мерный стакан. Затем был измерен показатель растворенного кислорода в материале в 50 мл мерном стакане. Эксперимент проводили трижды для получения результатов, 5 представленных в Таблице 4 ниже.
10 Как это можно видеть, уровни растворенного кислорода, которые были
измерены в шприце, и уровни растворенного кислорода в 50 мл мерном стакане не были по существу изменены пропусканием диффундированного материала через фильтр 0,22 микрон, что указывает на то, что микропузырьки растворенного газа в жидкости не более 0,22 микронов.
15 Был проведен второй тест, в ходе которого партия физиологического
раствора была обогащена с использованием диффузора по данному изобретению, и образец полученного раствора был собран в непрофильтрованном состоянии. Уровень растворенного кислорода в непрофильтрованном образце составил 44,7 промилле. Фильтр 0,1 микрон
20 использовали для фильтрации обогащенного кислородом раствора из диффузора по данному изобретению, после чего было отобрано два дополнительных образца. Для первого образца уровень растворенного кислорода составил 43,4 промилле. Для второго образца уровень растворенного кислорода составил 41,4 промилле. Наконец, фильтр был удален, и был получен финальный образец из
25 непрофильтрованного раствора. В этом случае финальный раствор имел уровень растворенного кислорода 45,4 промилле. Такие результаты соответствовали результатам, полученным при использовании фильтра Millipore 0,22 микрона.
Таким образом, большинство газовых пузырьков или микропузырьков в физиологическом растворе имели размер примерно менее, чем 0,1 микрон.
ПРИМЕР 2
5 (Определение профиля цитокинов)
Смешанные лимфоциты были получены у одного здорового донора-добровольца. Образцы лейкоцитарной пленки были промыты с соблюдением стандартных процедур для удаления тромбоцитов. Лимфоциты были помещены в чашки в концентрации 2 х 106 на чашку в среде RPMI (+ 50 мм HEPES),
10 разведенной обогащенной газом жидкостью по изобретению или дистиллированной водой (контроль). Клетки были стимулированы 1 микрограмм/мл антигена ТЗ или 1 микрограмм/мл фитогемагглютинина (РНА) лектином (активатор клеток pan-Т) или не были стимулированы (отрицательный контроль). После 24-часовой инкубации, клетки были проверены на предмет
15 жизнеспособности, и супернатанты были отобраны и заморожены.
Супернатанты были оттаяны, центрифугированы и протестированы на предмет экспрессии цитокинов с использованием облегченного протокола гранул ХМАР(r) (Luminex) и платформы.
Два миллиона клеток были помещены в 6 лунок 24-луночного планшета в
20 полной среде RPMI + 50 мм Hepes с обогащенной кислородом жидкостью по изобретению (вода) (лунки 1, 3 и 5) или дистиллированной водой (2, 4 и 6) (10Х RPMI, разведенная в воде для получения 1 х). Клетки были стимулированы 1 мкг/мл антигена ТЗ (лунки 1 и 2) или РНА (лунки 3 и 4). Контрольные лунки 5 и 6 не были стимулированы. Спустя 24 часа, клетки были проверены на предмет
25 жизнеспособности, и супернатанты были отобраны и заморожены. Затем супернатанты были оттаяны и подвергнуты центрифугированию при 8000д до образования гранул. Очищенные супернатанты были проанализированы на предмет присутствия цитокинов, перечисленных с использованием протокола LUMINEX BEAD LITE(tm) и платформы. Числовые данные представлены в Таблице
30 5, и соответствующие диаграммы отображены на Фигуре 1. Примечательно, что уровень ИФН-у был выше в обогащенной газом питательной среде по изобретению с антигеном ТЗ, чем в контрольной питательной среде с антигеном ТЗ, в то время как уровень ИЛ-8 был ниже в обогащенной газом питательной среде по изобретению с антигеном ТЗ, чем в контрольной питательной среде с
35 антигеном ТЗ. Кроме того, уровни ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-а в обогащенной газом среде
по изобретению с РНА были ниже, чем в контрольной среде с РНА, в то время, как уровни ИЛ-1 В в обогащенной газом жидкости по изобретению с РНА были ниже, чем при сравнении с контрольной питательной средой с РНА. В обогащенной газом питательной среде по изобретению уровни ИФН-у были выше, чем в 5 контрольной среде.
ПРИМЕР 3
10 Миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (МОП
Как это указано на Фигуре 2, лимфоцитарная пролиферация в ответ на антигенный пептид МОГ была повышена при культивации в присутствии обогащенной газом жидкости по изобретению в сравнении с находящейся под давлением оксигеннированной жидкости (контейнер под давлением) или
15 деонизированной контрольной жидкости. Таким образом, обогащенная газом жидкость по изобретению амплифицирует лимфоцитарный пролиферативный ответ на антиген, к которому клетки были примированы ранее.
Был синтезирован пептид миелин-олигодендроцитарный гликопротеин 35-55 (МОГ 35-55) (M-E-V-G-W-Y-R-S-P-F-S-R-O-V-H-L-Y-R-N-G-K)
20 (SEQ ID N0:1; см. публикацию US20080139674, включено сюда посредством ссылки, включая в целях данной последовательности SEQ ID N0:1) в соответствии с известной мышиной последовательностью. Затем было
извлечено 5 х 105 клеток селезенки из МОГ Т-клеточный рецептор трансгенных мышей, которые были ранее иммунизированы МОГ, и такие клетки были культивированы в 0,2 мл жидкости ТСМ, восстановленной обогащенной газом жидкостью оп изобретению, оксигенированной водой под давлением (водой из 5 контейнера под давлением) или контрольной деионизированной водой. Спленоциты были культивированы с МОГ р35-55 в течение 48 или 72 часов, соответственно. Культуры были возбуждены импульсом 1Ки [ЗН]-тимидина и собраны спустя 16 часов. Среднее значение числа импульсов в минуту [ЗН]-тимидина было рассчитано для всех трех культур. Результаты приводятся на 10 Фигуре 2.
ПРИМЕР 4
Экспрессия цитокинов В отдельных аспектах смешанные лимфоциты человека были
15 стимулированы ТЗ антигеном или РНА в электрокинетической жидкости по изобретению или контрольной жидкости, после чего были определены изменения в показателях ИЛ-1 В, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12(р40), ИЛ-12(р70), ИЛ-13, ИЛ-17, Эотаксина, ИФН-у, ГМ-КСФ, MIP-1B, МСР-1, Г-КСФ, ФРФЬ, ФРЭС, ФНО-а, RANTES, Лептина, ФНО-В, ТФР-В и ФРН. Как это можно видеть из
20 Фигуры 1, исследуемые провоспалительные цитокины (ИЛ-1 В, ФНО-а, ИЛ-6 и ГМ-КСФ), хемокины (ИЛ-8, М1Р-1а, RANTES и Эотаксин), воспалительные ферменты (iNOS, СОХ-2 и ММР-9), вызывающие ответ аллергены (МНС класса II, CD23, В7-1 и В7-2) и цитокины Th2 (ИЛ-4, ИЛ-13 и ИЛ-5) были снижены в исследуемой жидкости в сравнении с контрольной жидкостью. В отличие от этого,
25 исследуемые противовоспалительные цитокины (например, ИЛ1Р-а, Т1МР)были повышены в исследуемой жидкости в сравнении с контрольной жидкостью.
Для расширения таких данных, Заявители использовали известную в науке систему модели, включающую сенсибилизацию яичным альбумином, для оценки аллергических реакций гиперчувствительности. Исследуемые конечные точки
30 были представлены отдельными цитологическими и клеточными компонентами реакции, а также серологическими измерениями белка и ЛДГ. Анализ цитокинов проводили, включая анализ Эотаксина, ИЛ-1 А, ИЛ-1 В, КС, МСР-1, МСР-3, MIP-1A, RANTES, ФНО-А и VCAM.
Краткое описание: самцы крыс Brown Norway были инъецированы
35 интраперитонеально 0,5 мл яичного альбумина (OVA) степень V (A5503-1G,
Sigma) в растворе (2,0 мг/мл), содержащем алюминия гидроксид (AI (ОН)3) (200 мг/мл) каждую на дни 1, 2 и 3. Исследование было рандомизированным с факториальным распределением лечения 2 х 2 (4 группы). Спустя двухнедельный период ожидания для обеспечения возникновения иммунной 5 реакции, крысы были подвергнуты воздействию или лечению в течение недели RDC1676-00 (стерильный физиологический раствор, пропущенный через запатентованное устройство Revalesio) и RDC1676-01 (стерильный физиологический раствор, пропущенный через запатентованное устройство Revalesio с дополнительным добавлением кислорода). По завершении 1 недели
10 лечения один раз в день, 2 группы были поделены пополам, и 50% крыс в каждой группе получали физиологический раствор или OVA посредством ингаляции.
В частности, спустя четырнадцать дней с последующей первичной сенсибилизацией 12 крыс были подвергнуты RDC 1676-00 ингаляцией в течение 30 минут ежедневно в течение 7 последовательных дней. Поток воздуха через
15 систему был установлен на уровне 10 литров/минута. Всего 12 крыс были подсоединены к круговой камере с одним портом для находящегося в небулайзере материала для введения и равномерного распределения в 12 субкамерах Aeroneb.
Спустя пятнадцать дней после первичной сенсибилизации 12 крыс были 20 подвергнуты RDC 1676-01 с использованием ультразвуковой небулизации в течение 30 минут ежедневно в течение 7 последовательных дней. Поток воздуха также был установлен на уровне 10 литров/минута с использованием этого же небулайзера и камеры. Вначале через небулайзер подавали RDC 1676-00, и перед подачей через небулайзер RDC 1676-01, камера Aeroneb была тщательно 25 высушена.
Спустя примерно 2 часа после последнего лечения небулайзером, 6 крыс из группы RDC 1676-00 были подвергнуты повторному воздействию OVA (1% в физиологическом растворе), доставляемом интратрахеальным вливанием с использованием микрораспылителя Penn Century Microsprayer (модель 1А-1В).
30 Другие 6 крыс из группы RDC 1676-00 были подвергнуты повторному воздействию физиологическим раствором в качестве контрольной группы, доставляемым интратрахеальным вливанием. На следующий день процедура была повторена для группы RDC 1676-01.
Спустя двадцать четыре часа после повторного воздействия, все крысы в
35 каждой группе были подвергнуты эвтаназии с использованием избыточной дозы
натрия пентобарбитала. Образцы цельной крови были собраны из нижней полой вены и помещены в две различные пробирки для сбора крови: пробирку Qiagen PAXgene(tm) Blood RNA Tube и пробирку Qiagen PAXgene(tm) Blood DNA Tube. Легкие были обработаны с получением жидкости бронхоальвеолярного лаважа 5 (БАЛ), а легочная ткань подвергнута ОТ-ПЦР для оценки изменений в маркерах экспрессии цитокинов, которые, как известно, связаны в этой модели с легочным воспалением. Способ одностороннего отбора лаважа использовали для сохранения целостности 4 долей правой стороны легкого. С левой "большой" доли легкого был отобран лаваж, в то время, как 4 правые доли были перерезаны
10 и сразу же помещены в TRI-zol(tm), гомогенизированы и отосланы в лабораторию для дальнейшей обработки.
Анализ БАЛ. Лаваж легких был собран и центрифугирован в течение 10 минут при 4°С при 600-800 g для пеллетирования клеток. Супернатанты были перенесены в новые пробирки и заморожены при -80°С. Жидкость бронхиального
15 лаважа ("БАЛ") была разделена на две аликвоты. Первая аликвота была центрифугирована, и супернатант был быстро заморожен на колотом сухом льду, помещен в условия при -80°С и отправлен в лабораторию для дальнейшей обработки. Количество присутствующего белка и ЛДГ указывает на уровень белка сыворотки крови (белок является компонентом сыворотки, проходящем через
20 мембраны, при его использовании в эксперименте) и смерть клеток, соответственно. Соответствующая сторона теста указывает на незначительно меньшее содержание белка, чем в контроле.
Вторая аликвота жидкости бронхоальвеолярного лаважа была проанализирована на общее содержание белка и ЛДГ, а также подвергнута
25 цитологическому анализу. Было показано, что в группе лечения общее количество клеток больше, чем в контрольной группе физиологического раствора. Кроме того, отмечалось повышение содержания эозинофилов в группе лечения в сравнении с контрольной группой. Также незначительно отличалось количество полиморфноядерных клеток в группе лечения в сравнении с контрольной группой.
30 Анализ крови. Цельная кровь была проанализирована переносом 1,2-2,0
мл крови в пробирку, после чего ей дали свернуться в течение, по меньшей мере, 30 минут. Оставшийся образец крови (примерно 3,5-5,0 мл) был сохранен для экстракции РНК с использованием TRI-zol(tm) или PAXgene(tm). Затем образец свернутой крови был центрифугирован в течение 10 минут при 1200 g при
комнатной температуре. Сыворотка (супернатант) была удалена и помещена в две чистые пробирки, и сыворотка хранилась при -80°С.
Для экстракции РНК с использованием Tri-Reagent (ТВ-126, Molecular Research Center, Inc.), 0,2 мл цельной крови или плазмы было добавлено к 0,75 мл 5 реагента TRI BD, дополненного 20 мкл 5N уксусной кислоты на 0,2 мл цельной плазмы или крови. Пробирки были подвергнуты встряхиванию и хранили при -80°С. С использованием PAXgene(tm), пробирки были инкубированы в течение примерно двух часов при комнатной температуре. Затем пробирки были помещены на бок и хранили при -20°С в морозильнике в течение 24 часов, после
10 чего они были перенесены в условия при -80°С для долгосрочного хранения.
Анализ Luminex. С использованием платформы Luminex был проведен анализ микрогранул в качестве субстрата для реакции связывания антитела, показатели которой считываются в единицах светосилы и могут быть сопоставлены с определенными количественно стандартами. Каждый образец
15 крови был проанализирован в виде 2 образцов параллельно. Единицы измерения представлены единицами светосилы, и группы разделены на контроль с воздействием OVA, лечение с воздействием OVA и лечение с использованием физиологического раствора и запатентованной жидкости.
Для получения данных о генетической матрице Agilant, ткань легкого была
20 изолирована и погружена в реагент TRI (TR118, Molecular Research Center, Inc.). Краткое описание: примерно 1 мл реагента TRI было добавлено к 50-100 мг ткани в каждой пробирке. Образцы были гомогенизированы в реагенте TRI с использованием гомогенизатора glass-Teflon(tm) или Polytron(tm). Образцы хранили при -80°С.
25 Таким образом, данный стандартный анализ реакции воспаления до
известной сенсибилизации позволил получить, по меньшей мере, в образцах крови, заметные клинические и серологические изменения. Кроме того, при подвергании значительного количества контрольных животных стрессу и практически гибели в ходе процесса, ни в одной из групп лечения RDC1676-01 не
30 отмечалось подобных клинических стрессовых эффектов. Впоследствии это было отражено в циркулирующих уровнях цитокинов с примерной разницей 30% между группами лечения RDC1676-01 и RDC1676-01 в присутствии OVA. В отличие от этого, отмечались очень небольшие и практически незначительные изменения в цитокинах, клеточных и серологических профилях между группами лечения
RDC1676-01 и RDC1676-01 без воздействия OVA, что маловероятно представляет собой минимальные основные изменения в самой жидкости.
ПРИМЕР 5
(Регуляторный Т-клеточный анализ использовали для отображения эффектов 5 электрокинетически полученных жидкостей по изобретению в модуляции пролиферации Т-клеток и вовлечении цитокинов (ИЛ-10) и других белков (например, GITR, Granzyme A, XCL1, pStat5 и Foxp3)) в регуляторных Т-клеточных анализах и, например, анализе триптазы в МКПК) Способность отдельных вариантов воплощения изобретения, 10 представленных в тексте данной заявки, регулировать Т-клетки была исследована путем облучения антиген-представляющих клеток и введения антигена и Т-клеток. Обычно такие стимулированные Т-клетки пролиферируют. Однако при введении регуляторных Т-клеток супрессируется обычная пролиферация Т-клеток. Способы:
15 Краткое описание: конъюгированное с FITC антитело к CD25 (АСТ-1)
использовали в сортировке, и такое антитело было приобретено у DakoCytomation (Chicago, IL). Другие используемые антитела были представлены следующими: антитело к CD3 (HIT3a для растворимых условий), GITR (РЕ-конъюгированное), CD4 (конъюгированное с Су-5 и FITC), CD25 (конъюгированное с АРС), CD28
20 (клон CD28.2), CD127-APC, Granzyme А (конъюгированное с РЕ), FoxP3 (BioLegend), антитело к мышиному lgG1 (контрольный изотип) и XCL1. Все антитела использовали в соответствии с инструкциями производителя.
CD4+ Т-клетки были выделены из периферической цельной крови с использованием набора CD4+ Rosette Kit (Stemcell Technologies). CD4+ Т-клетки
25 были инкубированы с антителами к CD127-APC, антителами к CD25-PE и антителами к CD4-FITC. Клетки были сортированы проточной цитометрией с использованием FACS Aria в Т-клетки респондеры CD4+CD25hiCD127lo/nTreg и CD4+CD25.
Анализы супрессии проводили в круглодонных 96-луночных планшетах для 30 микротитрации. 3,75 х 103 CD4+CD25neg Т-клетки респондеры, 3,75 х 103 аутологичные Т reg клетки, 3,75 х 104 аллогенные облученные МКПК с дефицитом CD3 были добавлены в соответствии с протоколом. Во все лунки было внесено антитело к CD3 (клон HIT3a при концентрации 5,0 мкг/мл). Т-клетки были культивированы в течение 7 дней при 37°С в среде RPMI 1640, дополненной 10% 35 фетальной бычьей сывороткой. За шестнадцать часов до завершения инкубации
в каждую лунку было добавлено 1,0 мКи 3Н-тимидина. Клетки из планшетов были собраны с использованием сборщика клеток Tomtec, и введение 3Н-тимидина определяли с использованием счетчика сцинтилляции Perkin Elmer. Антиген-представляющие клетки (АПК), состоящие из мононуклеарных клеток 5 периферической крови (МКПК), обеднили Т-клетки с использованием обеднения StemSep CD3+ Т-клеток человека (StemCell Technologies) с последующим облучением 40 Гр.
Регуляторные Т-клетки были стимулированы в условиях антитела к CD3 и CD28 и затем окрашены красным красителем Live/Dead Red (Invitrogen) для
10 определения жизнеспособности и поверхностными маркерами CD4, CD25 и CD127. Клетки были фиксированы в буфере Lyze/Fix PhosFlow(tm) и пермеабилизированы в денатурирующем Permbuffer III(r). Затем клетки были окрашены антителами к каждой отдельной выбранной молекуле.
Статистический анализ проводили с использованием программного
15 обеспечения GraphPad Prism. Сравнения между группами проводили с использованием двухстороннего непарного /-критерия Стьюдента. Сравнения между тремя группами проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA. Значения Р менее, чем 0,05 считались значимыми (двухсторонний критерий). Корреляция между двумя группами была
20 определена как статистически значимая с использованием коэффициента Спирмена, если значение г было больше, чем 0,7 или менее, чем -0,7 (двухсторонний критерий).
В целом, данные указывают на снижение пролиферации в присутствии РМ и Rev относительно РМ в контрольной жидкости (без Rev и без Soils), что
25 указывает на то, что полученные электрокинетически жидкости по изобретению Rev улучшают регуляторную функцию Т-клеток, как это показано по относительно сниженной пролиферации в анализе. Кроме того, доказательство данного Примера указывает, что бета-блокада, блокада GPCR и блокада каналов Са влияет на активность функции Revera на Treg.
ПРИМЕР 6
(Анализ фиксации потенциала, проводимый на клетках Calu-З, которые перфузировали электрокинетически полученными жидкостями по изобретению (RNS-60 и Solas), выявил, что (i) воздействие на RNS-60 и Solas привело к 35 повышению проводимости всей клетки, (И) воздействие на клетки RNS-60
приводило к повышению нелинейной проводимости, что доказано при времени инкубации 15 минут, и (Ш) воздействие на клетки RNS-60 приводило к влиянию физиологического раствора RNS-60 на проницаемые для кальция каналы)
5 Обзор. В данном Примере проводились исследования фиксации
потенциала для дальнейшего подтверждения признаков, как это описано в тексте данной заявки, электрокинетически полученных физиологических жидкостей по изобретению (RNS-60 и Solas), включая свойство модуляции токов всей клетки. Проводились две группы экспериментов.
10 Обзор данных первой группы экспериментов указывает, что проводимость
всей клетки (соотношение тока к напряжению), полученная для физиологического раствора Solas, является чрезвычайно линейной для обоих периодов инкубации (15 мин, 2 ч) и для всех протоколов напряжения. Также очевидно, что более длительная инкубация (2 ч) с Solas повышала проводимость всей клетки.
15 Воздействие на клетки RNS-60 приводило к повышению нелинейной проводимости, как это показано по дельте токов (вычитание Rev-Sol), что наблюдается только при времени инкубации 15 мин. Влияние RNS-60 на такой нелинейный ток исчезает, и вместо него возникает высоколинейный ток при времени инкубации два часа. Вклад нелинейной проводимости всей клетки, как
20 это отмечалось ранее, был представлен чувствительностью к напряжению, которая присутствовала при всех протоколах напряжения.
Обзор данных второй группы экспериментов указывает на влияние физиологического раствора RNS-60 на нелинейный ток, который был очевиден при высоком содержании кальция во внешнем растворе. Влияние нелинейной
25 проводимости всей клетки при чувствительности к напряжению присутствовало при обоих протоколах напряжения и указывает на влияние физиологического раствора RNS-60 на проницаемые для кальция каналы.
Первая группа экспериментов (повышение проводимости; и активация
30 проводимости, регулируемой нелинейным напряжением)
Материалы и способы:
Линия клеток эпителия бронхов Calu-З использовалась в исследованиях фиксации потенциала. Клетки эпителия бронхов Calu-З (АТСС #НТВ-55) были выращены в смеси 1:1 сред Ham's F12 и DMEM, дополненных 10% ФБС на 35 стеклянных покровных стеклах до времени проведения экспериментов. Краткое
описание: устройство для фиксации потенциала всей клетки использовали для измерения влияния на клетки Calu-З, подвергнутые воздействию электрокинетически полученных жидкостей по изобретению (например, RNS-60; электрокинетически обработанный нормальный физиологический раствор, 5 содержащий 60 промилле растворенного кислорода; иногда обозначаются в данном Примере термином "препарат").
Способы фиксации потенциала использовали для оценки влияния исследуемого материала (RNS-60) на полярность мембраны эпителиальной клетки и активность ионных каналов. В частности, фиксация потенциала всей
10 клетки проводилась с использованием линии клеток эпителия бронхов Calu-З в промывочном растворе, состоящем из: 135 мМ NaCI, 5 мМ KCI, 1,2 мМ CaCI2, 0,8 мМ MgCI2 и 10 мМ HEPES (рН скорректирован до 7,4 с использованием N-метил D-глюкамина). Базальные токи были измерены, после чего RNS-60 был перфузирован на клетки.
15 Более специфически, пэтч-пипетки были произведены из боросиликатного
стекла (Garner Glass Со, Claremont, СА) с использованием двухстадийного вертикального пуллеря Narishige РВ-7 и затем оплавлены до резистентности примерно 6-12 МОм с использованием микрокузницы Narishige MF-9 (Narishige International USA, East Meadow, NY). Пипетки были наполнены внутриклеточным
20 раствором, содержащим (в мМ): 135 KCI, 10 NaCI, 5 EGTA, 10 Hepes, рН был скорректирован до 7,4 с использованием NMDG ^-метил-О-глюкамин).
Культивированные клетки Calu-З были помещены в камеру, содержащую следующий экстрацеллюлярный раствор (в мМ): 135 NaCI, 5 KCI, 1,2 CaCI2, 0,5 MgCI2 и 10 Hepes (несвязанная кислота), рН был скорректирован до 7,4 с
25 использованием NMDG.
Клетки были проанализированы с использованием объектива 40Х DIC микроскопа Olympus 1X71 (Olympus Inc., Tokyo, Japan). После того, как был установлен гигаомный контакт с клетками, было выполнено осторожное введение в клетку и получение конфигурации полной клетки. Непосредственно после
30 введения в клетку, напряжение в клетке было фиксировано при -120, -60, -40 и 0 мВ, и было стимулировано скачками напряжения ±100 мВ (500 мс/шаг). После сбора показаний токов всей клетки при контрольном состоянии, эта же клетка была перфузирована с использованием раствора и исследуемой жидкости, включающей такие же внеклеточные растворенные вещества и рН, что и
35 указанная выше контрольная жидкость, и токи всей клетки при различных
удерживаемых потенциалах были записаны с использованием этих же протоколов.
Электрофизиологические данные были получены с использованием амплификатора Axon Patch 200В, низкочастотной фильтрации при 10 кГц и 5 оцифровке с использованием 1400А Digidata (Axon Instruments, Union City, CA). Программное обеспечение pCLAMP 10.0 (Axon Instruments) использовали для получения и анализа данных. Соотношение тока (I) к напряжению (V) (проводимость всей клетки) было получено построением графика из фактических значений тока при примерно 400 мсек для шага и исходного потенциала (V).
10 Наклон кривой соотношения I/V представлен проводимостью всей клетки.
Препараты и химические вещества. Где это показано, клетки были стимулированы стимулирующим коктейлем сАМР, содержащем 8-Вг-сАМР (500 мМ), IBMX (изобутил-1-метилксантин, 200 мМ) и форсколин (10 мМ). Аналог сАМР 8-Вг-сАМР (Sigma Chem. Со.) использовали для 25 мМ маточного раствора в
15 растворе Н20. Форсколин (Sigma) и IBMX (Sigma) использовали в растворе ДМСО, содержащем 10 мМ форсколина и 200 мМ маточного раствора IBMX. Полученные данные выражены в качестве значения среднего ± стандартной погрешности средней величины тока всей клетки для 5-9 клеток. Результаты:
20 Фигуры 3 А-С отображает результаты серий экспериментов фиксации
потенциала, которые оценивали эффекты электрокинетически полученной жидкости (например, RNS-60 и Solas) на полярность мембраны эпителиальных клеток и активность ионных каналов в двух временных точках (15 минут (слева) и 2 часа (справа)) при разных протоколах напряжения (А, шаг от нуля мВ; В, шаг от -
25 60 мВ; и С, шаг от -120 мВ). Результаты показывают, что RNS-60 (темные кружки) обладает большим эффектом на проводимость всей клетки, чем Solas (светлые кружки). В эксперименте подобные результаты отмечались для трех протоколов напряжения и при обоих временных периодов инкубации - 15 минут и два часа. Фигуры 4 А-С отображают, относительно экспериментов, указанных на
30 Фигурах 3 А-С, графики, полученные в результаты вычитания данных тока Solas от данных тока RNS-60 при трех протоколах напряжения ("дельта токов") (А, шаг от нуля мВ; В, шаг от -60 мВ; и С, шаг от -120 мВ) и двух временных точках (15 минут (светлые кружки) и 2 часа (черные кружки)). Эти данные показывают, что при времени 15 минут с использованием RNS-60 существует нелинейный и
35 зависящий от напряжения компонент, отсутствующий при временной точке 2 часа.
Как и в предыдущих экспериментах, данные для "нормального" физиологического раствора указывают на очень соответствующую и независящую от времени проводимость, используемую в качестве эталонного значения. Данные результаты были получены при сравнении групп с физиологическим 5 раствором Solas или RNS-60, и указывают, что воздействие на клетки Calu-З физиологическим раствором RNS-60 при исходных условиях (без сАМР или любой другой стимуляции) приводило к появлению зависящих от времени эффектов, соответствующих активации регулируемой напряжением проводимостью при более коротких периодах инкубации (15 мин). Такое явление
10 не было очевидным для периода инкубации в два часа. Как это описано в тексте данной заявки, линейный компонент более очевиден, если проводимость повышается стимулированием "коктейлем" сАМР. Тем не менее, период инкубации в два часа характеризовался большей линейной проводимостью для физиологических растворов RNS-60 и Solas, и в этом случае физиологический
15 раствор RNS-60 удваивал проводимость клетки в сравнении только с Solas. Такие данные указывают, что, по меньшей мере, два свойства проводимости клеток подвергнуты воздействию физиологическим раствором RNS-60, а именно активация нелинейной и регулируемой напряжением проводимости и линейная проводимость, которая более очевидна при более длительном времени
20 инкубации.
Вторая группа экспериментов (влияние на проницаемые для кальция каналы) Способы для второй группы экспериментов:
Общие способы фиксации потенциала представлены выше. В 25 нижеописанной второй группе экспериментов проводились дополнительные исследования фиксации потенциала для дополнительного подтверждения способности электрокинетически полученных физиологических жидкостей по изобретению (RNS-60 и Solas) модулировать токи всей клетки с использованием клеток Calu-З при начальных условиях, при этом используемый в протоколах шаг 30 был представлен нулем мВ или -120 мВ исходного потенциала.
Проводимость всей клетки в каждом случае была получена на основе соотношений тока к напряжению, полученных для клеток, инкубированных в течение 15 минут с любым из указанных физиологических растворов. Для определения влияния проницаемых для кальция каналов на проводимость всей 35 клетки, а также того факта, что на такую проводимость клетки влияет инкубация с
физиологическим раствором RNS-60, потенциал клеток был фиксирован в нормальном физиологическим растворе после периода инкубации (включает высокое содержание NaCI во внешнем растворе и высокое содержание KCI во внутреннем растворе). Внешний физиологический раствор затем был заменен 5 раствором, в котором NaCI был заменен на CsCI для определения изменения в проводимости при замещении основного внешнего катиона. При таких условиях воздействию повышением концентрации кальция была подвергнута эта же самая клетка, таким образом, этап поступления кальция становится более очевидным. Результаты:
10 Фигуры 5 A-D отображают результаты серий экспериментов фиксации
потенциала, которые оценивали эффекты электрокинетически полученной жидкости (например, Solas (фигуры А и В) и RNS-60 (фигуры С и D)) на полярность мембраны эпителиальных клеток и активность ионных каналов с использованием различных внешних солевых растворов при разных протоколах
15 напряжения (фигуры А и С отображают повышение от 0 мВ; фигуры В и D повышение от -120 мВ). В таких экспериментах использовали один период 15 минут. Для Solas (фигуры А и В) результаты указывают, что: 1) использование CsCI (квадраты) вместо NaCI в качестве внешнего раствора повышало проводимость всей клетки линейным образом при сравнении с контролем
20 (ромбы); и 2) CaCI2 при концентрации 20 мМ CaCI2 (кружки) и 40 мМ CaCI2 (треугольники) повышал проводимость всей клетки нелинейным образом. Для RNS-60 (фигуры С и D) результаты показывают, что: 1) использование CsCI (квадраты) вместо NaCI в качестве внешнего раствора имело незначительный эффект на проводимость всей клетки при сравнении с контролем (ромбы); и 2)
25 CaCI2 при концентрации 40 мМ (треугольники) повышал проводимость всей клетки нелинейным образом.
Фигуры 6 A-D отображают графики, полученные от вычитания данных тока CsCI (отображены на Фигуре 5) из данных тока 20 мМ CaCI2 (ромбы) и 40 мМ CaCI2 (квадраты) при двух протоколах напряжения (фигуры А и С повышение от
30 нуля мВ; В и D повышение от -120 мВ) для Solas (фигуры А и В) и RNS-60 (фигуры С и D). Результаты указывают, что растворы Solas и RNS-60 активировали кальций-индуцируемую нелинейную проводимость всей клетки. Эффект был больше для RNS-60 (указывая на реакцию на дозу), и для RNS-60 такой эффект повышался только при более высоких концентрациях кальция.
35 Кроме того, нелинейная кальций-зависимая проводимость при более высокой
концентрации кальция также повышалась при использовании протокола напряжения.
Данные такой второй группы экспериментов дополнительно указывают на влияние физиологических растворов RNS-60 и Solas на данные проводимости 5 всей клетки, полученные для клеток Calu-З. Данные указывают, что инкубация в течение 15 мин с любым из указанных физиологических растворов приводит к различному воздействию на проводимость всей клетки, что более очевидно для RNS-60, особенно с повышением внешнего кальция, и дополнительно указывают, что физиологический раствор RNS-60 повышает кальций-зависимый нелинейный
10 компонент проводимости всей клетки.
Накопленные доказательства позволяют предположить активацию физиологическим раствором Revalesio ионных каналов, что по-разному влияет на исходную проводимость клеток.
При использовании вместе с другими полученными Заявителями данными
15 (например, данными Заявителей, представленными в других рабочих Примерах), отдельные аспекты данного изобретения описывают композиции и способы модуляции внутриклеточной передачи сигнала, включая модуляцию, по меньшей мере, одной мембранной структуры, мембранного потенциала или мембранной проводимости, мембранных белков или рецепторов, ионных каналов, липидных
20 компонентов или внутриклеточных компонентов, являющихся взаимозаменяемыми в клетке (например, пути передачи сигнала, такие как кальций-зависимые клеточные системы передачи сигнала, включающие использование электрокинетически полученных растворов по изобретению для введения электрохимических и/или конформационных изменений в мембранных
25 структурах (например, мембране и/или мембранных белках, рецепторах или других компонентах мембран), включая, но не ограничиваясь, GPCR и/или д-белки. Согласно дополнительным аспектам, такие эффекты модулируют экспрессию генов и могут сохраняться в зависимости от, например, периода полужизни отдельных компонентов передачи сигнала и т.д.
ПРИМЕР 7
{Было показано, что электрокинетическая жидкость по изобретению была по существу эффективной дозозависимым образом в известной в науке модели
острого экспериментального аллергического (аутоиммунного) энцефаломиелита (ЭАЭ) крыс МВР множественного склероза (МС))
Обзор:
В этом рабочем ПРИМЕРЕ электрокинетическая жидкость по изобретению RNS-60 была проанализирована в двух дозах при профилактическом и лечебном режиме введения с использованием известной в науке крысиной модели острого экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ), индуцированного
10 основным белком миелина (МВР). Было показано, что электрокинетическая жидкость по изобретению RNS-60 по существу эффективна дозозависимым образом. Было показано, что терапевтический (ежедневное введение RNS-60 вместе с инъекцией МВР) и профилактический (ежедневное введение RNS-60 в течение семи дней перед инъекцией МВР) режимы введения RNS-60 показали
15 заметное снижение, а также замедленное возникновение (в группах приема высокой дозы) клинических показателей. Согласно отдельным аспектам данного изобретения, электрокинетические композиции по изобретению по существу используют для лечения, включая снижение симптомов и профилактику, симптомов ЭАЭ в известной в науке крысиной модели МС человека. Согласно
20 дополнительным аспектам данного изобретения, электрокинетические композиции по изобретению по существу используют для лечения, включая снижение симптомов и профилактику, симптомов МС у пораженных млекопитающих (преимущественно, человека). В еще одних аспектах электрокинетические композиции по изобретению пересекают
25 гематоэнцефалитический барьер (ГЭБ) и, таким образом, обеспечивают новейший способ лечения воспалительных состояний центральной нервной системы.
Множественный склероз (МС). Множественный склероз (МС) является димиелинизирующим заболеванием центральной нервной системы (ЦНС) и одним
30 из наиболее часто встречающихся инвалидизирующим неврологическим заболеванием у молодежи. Основные характеристики данного заболевания представлены очаговыми областями демиелинизации и воспаления. Курс заболевания является непредсказуемым и продолжается всю жизнь, и поражает женщин чаще, чем мужчин. Этиология заболевания, как оказалось, зависит от
35 генетических факторов и факторов окружающей среды. В периферических
областях антиген связывается антиген-представляющими клетками (АПК) посредством МСН II. Клетки ThO связываются с антигеном и подвергаются активации и дифференциации. Адгезионные молекулы и металлопротеазы матрикса (ММР) помогают клеткам Тп1 связываться и проникать через 5 гематоэнцефалитический барьер (ГЭБ). При пересечении ГЭБ в ЦНС, клетки Th1 вовлекают комплексы антиген-МНС и продуцируют провоспалительные цитокины, ведущие к повреждению ЦНС. Аутоиммунная система распознает миелиновые белки в качестве инородных и начинает атаковать. Исторически, в то время как считалось, что клетки Тп1 играют доминирующую роль в патологии заболевания,
10 недавно полученные доказательства указывают, что провоспалительный каскад клеток ТЫ 7, ИЛ-6 и ФРО-8, играет критическую роль в патогенезе ЭАЭ и МС.
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ). Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), также называемый экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом, является
15 нечеловеческой животной моделью множественного склероза (МС). Не будучи МС, различные формы и стадии ЭАЭ напоминают различные формы и стадии МС, которые очень похожи в целом ряде параметров. В частности, ЭАЭ является острым или хроническим, рецидивирующим, приобретенным, воспалительным и демиелинизирующим аутоиммунным заболеванием. Животным инъецируют
20 целые или части различных белков (например, основной белок миелина (МВР), протеолипидный белок (PLP) и миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (МОГ)), составляющих миелин, изоляционную оболочку, окружающую нервные клетки (нейроны), для индуцирования аутоиммунного ответа относительно собственного миелина животного, что очень напоминает МС у человека. ЭАЭ был
25 индуцирован у целого ряда видов различных животных, включая мышей, крыс, морских свинок, кроликов, макак, макак-резус и мармозеток. По различным причинам, включая ряд иммунологических инструментов, доступность, продолжительность жизни и плодовитость животных, а также сходство индуцируемого заболевания с МС, мыши и крысы являются наиболее часто
30 используемыми видами. Крысиная модель острого ЭАЭ имеет сильный воспалительный компонент и, следовательно, является подходящей моделью для исследования терапевтического потенциала агента, который запускает иммунные явления при МС.
ЭАЭ, индуцированный МВР. МВР у крыс Lewis после введения одной дозы 35 приведет к рецидиву, характеризующемуся преимущественно параличом задних
лап. Крысам Lewis инъецируют МВР на день 0. Заболевание развивается между днями 12-16, при этом полное выздоровление от заболевания возникает между днями 18-21. Модель является самоограничивающей и не характеризуется демиелинизацией.
Материалы и способы:
Получение и характеристика исследуемой жидкости (RNS-60). Стерилизованный через фильтр RNS-60 был получен Заявителями в соответствии со способами, описанными в US2008/0219088 (опубликовано 11
10 сентября 2008 г.), US2008/0281001 (опубликовано 11 ноября 2008 г.) и WO2008/052143 (опубликовано 02 мая 2008 г.), все из которых включены сюда во всей своей полноте посредством ссылки, и, в частности, для всех аспектов, относящихся к аппарату и/или способам для получения электрокинетических жидкостей по изобретению Заявителей. Содержание растворенного кислорода
15 (DO) в используемой RNS-60 составило 59 промилле, как это определено анализом титрации по Винклеру (Y.C. Wong & СТ. Wong. New Way Chemistry for Hong Kong A-Level Volume 4, Page 248. Or Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater - 20th Edition ISBN 0-87553-235-7). Жидкость RNS-60 была помечена номером исследуемого препарата (TI), датой получения, условиями
20 хранения и датой срока годности. Условия хранения и работы с RNS-60 соответствовали установленным Заявителями для обеспечения стабильности в исследуемой лаборатории во время тестирования. Когда не использовали, жидкость хранили в холодильнике при 2-8°С. Флаконы, содержащие жидкость, использовали в качестве контейнеров однократного применения.
25 Контрольная жидкость-носитель. Контрольная жидкость-носитель была
представлена нормальным физиологическим раствором для инъекций (0,9%), предоставленным Hospira.
Дексаметазон. Дексаметазон был приобретен у Sigma (№ по каталогу D1756; № партии 096К1805). Для введения дексаметазон (белый порошок) был
30 растворен в этаноле для достижения концентрации 1 мг/мл и затем снова разведен в дистиллированной воде для достижения концентрации дозы 0,1 мг/мл. Индукционные параметры ЭАЭ:
Антигенный агент МВР. МВР был представлен основным белком миелина из морских свинок (Des-Gly-77, Des-His-78)-MBP (68-84); номер по
каталогу Н-6875; предоставлен MD Bioscience). МВР был растворен в физиологическом растворе в концентрации 2 мг/мл;
Сенсибилизирующий агент CFA. Полный адъювант Фрейнда (CFA) был предоставлен MD Biosciences Division of Morwell Diagnostics GmbH (номер no 5 каталогу IMAD-4). Суспензия CFA, содержащая убитые нагреванием Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra при концентрации 4 мг/мл использовалась в поставляемом виде; и
Эмульсия MBP/CFA (антигенные/сенсибилизирующие агенты). Перед однократными инокуляциями, проводимыми на день исследования 0, один объем 10 раствора МВР был смешан с равным объемом CFA 4 мг/мл с использованием двух шприцов, подсоединенных фиксатором Люэра, для тщательного смешивания смеси эмульсии для выравнивания общего объема дозы до 100 мкл/животное. Доза была введена в виде 2х 50 мкл подкожных (п/к) инъекций в интраплантарные участки лап.
15 Исследуемые животные; крысы. Шестьдесят (60) самок крыс Lewis (в
возрасте 6-7 недель в начале исследования) были получены у лаборатории Harlan Laboratories Israel, Ltd. Варьирование веса животных на начало лечения не должно было превышать 20% среднего веса. Состояние здоровья животных, используемых в исследовании, анализировалось при поступлении животных.
20 Акклиматизировали к лабораторным условиям и использовали в исследовании только животных в хорошем состоянии здоровья. Перед введением в исследование, животные были акклиматизированы в течение, по меньшей мере, 5 дней. В течение акклиматизации и всей продолжительности исследования, животные содержались в помещении для грызунов с ограниченным доступом в
25 группах максимум 5 крыс в клетках из полипропилена с твердым дном и стерильными древесными опилками в качестве подстилки. Животные содержались ad libitum с применением представленной на рынке диеты для грызунов и имели свободный доступ к питьевой воде, которая поставлялась к каждой клетке посредством полиэтиленовых бутылочек с поилками из
30 нержавеющей стали. Анализ подвергнутой питанию партии с используемой диетой в исследовании был включен в архивы вместе с данными исследования. Вода подвергалась периодическому мониторингу. Автоматически контролируемые условия окружающей среды были установлены для поддержания температуры на уровне 20-24°С с относительной влажностью (ОВ) 30-70%,
35 циклом светатемноты 12:12 и 15-30 сменами воздуха/ч в помещении для
исследования. Температура и ОВ подвергались мониторингу ежедневно. Световой цикл подвергался мониторингу по контрольным часам. Животные получили уникальную идентификацию с использованием хвостовых меток. Это значение также было указано на карте клетки, видимой на передней стороне 5 каждой клетки. Карта клетки также содержала номер исследования и группы, путь введения, пол, штамм и все другие релевантные детали, относящиеся к группе лечения.
Номер группы
Разме Р
групп ы
Исследуемы й материал
Путь введе ния
Уровень дозы (мг/кг/введен ие)
Объем дозы (мл/кг)
Режим
до окончания исследования
п=10
RNS-60
в/в
1 мл для крысы 350 г
Один раз в день, начиная на день исследования 0
п=10
RNS-60
в/в
2 мл для крысы 350 г
Один раз в день,начиная на день исследования 0
Процедуры исследования и принципы мышиной модели острого ЭАЭ.
Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) является
аутоиммунным демиелинизирующим заболеванием центральной нервной
5 системы (ЦНС), которое имитирует множество клинических и патологических
характеристик множественного склероза (МС). Крысиная модель острого
заболевания состоит из периода сенсибилизации, индуцированного однократной
подкожной (п/к) инъекцией основного белка миелина (МВР), эмульгированного в
полном адъюванте Фрейнда (CFA) на день 0 исследования.
10 Схематическое отображение индукции ЭАЭ и режимы лечения
представлены на ФИГУРЕ 8).
Индукция ЭАЭ:
MBP/CF А. Как это указано схематически на ФИГУРЕ 8), все животные были подвергнуты на день 0 исследования (начало исследования) однократному 15 введению инокулята, состоящего из гомогената эмульгированной смеси МВР и CFA (MBP/CFA энцефалитогенного эмульгированного инокулята (100 мкг МВР/200 мкг CFA), который был инъецирован при общем объеме дозы 100 мкл/животное и вводился в виде 2 х 50 мкл подкожных (п/к) билатеральных инъекций в интрапланарные участки лап).
Лечение:
Режим лечения и процедура. Все соединения готовились свежими каждый день специалистом, который не отвечал за анализ животного. Лицо, которое 5 анализировало животных, получило пробирки, промаркированные только номерами групп, и не имело информации о лечении.
Путь введения: (i) RNS-60 (в/в); (ii) контрольный носитель: (в/в); и (Hi) положительный контроль: (и/п).
Уровни дозы и объемы доз: (i) RNS-60: низкая доза 2 мл для 350 г; высокая 10 доза 4 мл для 350 г; (ii) контрольный носитель: 0; и (iii) положительный контроль (дексаметазон): 1 мг/кг.
Поддерживающая терапия. Если это не определено в течение курса исследования, при прогнозировании экспериментальных эффектов ЭАЭ и/или их наблюдении (примерно 8-12 дней после однократной энцефалитогенной 15 инокуляции), или если у животных отмечается снижение массы тела более, чем на 15% от установленного ранее значения или снижение массы тела более, чем 20% от начального значения массы тела, проводилась подходящая поддерживающая терапия для каждого отдельного случая.
Кормление и подача воды. Дополнительный источник воды, состоящий из 20 измельченных гранул или мясного корма для грызунов, пропитанного питьевой водой, помещается на дно клетки и перед ползающими/неподвижными животными.
Обезвоживание. Животные могут быть подвергнуты подкожной (п/к)
дополнительной жидкостной терапии с использованием раствора 5% декстрозы, 25 по меньшей мере, два раза в день и до 2 мл/животное/день до тех пор, пока масса
тела не возвратится до 10% от изначально определенного показателя.
Мочеиспускание. Пальпация живота животных проводится для оказания
помощи в мочеиспускании и для наблюдения за способностью животных
опорожнить свой мочевой пузырь.
30 Прочий особый уход. Перианальные области животных и задние лапы
очищались, как это требуется, с использованием увлажненного марлевого
тампона.
НАБЛЮДЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЯ:
35 Клинические признаки. В течение всего 21-дневного исследования
проводились тщательные клинические анализы, и запись проводили, по меньшей мере, один раз в день, кроме оценки клинических показателей ЭАЭ и общего анализа (см. ниже). Наблюдения включали изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, возникновение секреций и экскреций (например, диареи), и 5 автономную активность (например, слезоотделение, потоотделение, полиэрекцию, размер зрачков, необычное дыхание), походку, позу и реакцию на лечение, а также присутствие необычного поведения, тремор, судороги, сон и кому.
Масса тела. Потеря массы тела может служить первым признаком начала
10 заболевания, в то время, как внезапная заметная потеря массы тела сопровождает ремиссию симптомов ЭАЭ. Таким образом, определение массы тела у отдельных животных было проведено незадолго перед индукцией ЭАЭ на день исследования 0 (начало исследования) и впоследствии проводили ежедневно в течение всего 21-дневного периода наблюдения.
15 Клинические показатели ЭАЭ и анализы. Вначале все животные были
проанализированы на предмет признаков любого неврологического ответа и симптомов перед индукцией ЭАЭ (день исследования 0) и впоследствии были проанализированы ежедневно в течение всего 21-дневного периода наблюдения. В целях избежания погрешности экспериментов, реакции ЭАЭ определялись
20 слепым образом, насколько это было возможно, членом персонала, который не был знаком с используемым специфическим лечением. Реакции ЭАЭ были оценены и записаны в соответствии с классической, известной в науке стандартной шкалой 0-5 в возрастающем порядке степени тяжести, как это показано ниже в Таблице 7:
25 ТАБЛИЦА 7. Реакции ЭАЭ были оценены и записаны в соответствии с
классической, известной в науке стандартной шкалой 0-5 в возрастающем порядке степени тяжести.
Степень Признаки/симптомы
0 Отсутствие аномалий
0.5 Слабость дистальной половины хвоста
1 Слабость проксимальной половины хвоста
1.5 Слабость в одной задней лапе
2 Слабость в двух задних лапах
2.5 Паралич одной передней лапы
3 Паралич двух передних лап
4 Полный паралич
5 Смерть
Образцы крови. На день прекращения исследования (день 21) все животные были умерщвлены спустя 1 час после инъекции. Образцы были отобраны в дни исследования 0 (только группы с профилактикой), 7, 14 и 21. 5 Плазма была отобрана в гепаринизированные пробирки и хранилась при -20°С. Объем 300 мкл хранился для проведения анализа подсчета формулы крови, и 100 мкл хранили и использовали для дальнейшего анализа цитокинов посредством способа Luminex Technology. Определение формулы крови проводили на дни 0, 7, 14 и 21.
10 Сбор ткани. По окончании исследования животные были перфузированы с
использованием 4% ПФА. Ткань головного мозга и спинного мозга была отобрана и хранилась в 4% ПФА.
Конечные точки для использования у людей. Животные, найденные в агонистическом состоянии, и/или животные с сильной болью и тяжелыми
15 признаками сильных мучений были гуманным образом умерщвлены. СТАТИСТИКА / ОЦЕНКА ДАННЫХ:
Оценка преимущественно основывалась на относительных записанных изменениях в неврологических симптомах и массе тела, выраженных в виде абсолютных значений, процентном (%) изменении и средних групповых
20 значениях, полученных для всех групп лечения в сравнении с группой контроля носителем. Анализ данных соответствующими статистическими способами проводился для определения значимости эффектов лечения. ПОЛОЖЕНИЕ ОБ ИСПОЛЬЗОВАНИИ И ЗАБОТЕ О ЖИВОТНЫХ:
Данное исследование проводилось в соответствии с утверждением
25 аппликационной формы, представленной соответствующему Комитету по этическому поведению при заботе и использовании лабораторных животных, и данное исследование соответствовало установленным правилам и нормам. РЕЗУЛЬТАТЫ:
Результаты исследования представлены на ФИГУРЕ 7, где время (дни 30 после инъекции МВР) указано на оси X, и "клинические показатели" (см. выше в разделе "Материалы и способы") указаны на оси Y.
Фигура 7 отображает по существу эффективность электрокинетической
жидкости по изобретению (RHS-60) в известной в науке крысиной модели
экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) множественного
склероза (МС) (см. выше в разделе "Материалы и способы").
5 В частности, в сравнении с группой контроля носителем (черные ромбы) в
течение 17-дневного периода было показано, что терапевтический (ежедневное введение RNS-60 вместе с инъекцией МВР) и профилактический (ежедневное введение RNS-60 в течение семи дней перед инъекцией МВР) режимы введения RNS-60 показали заметное снижение, а также замедленное возникновение (в
10 группах приема высокой дозы) клинических показателей.
Клинический показатель группы лечения низкой дозой (одна ежедневная инъекция см3) RNS-60 составил примерно половину (1/2) от показателя группы контроля носителем, в то время как клинический показатель группы лечения высокой дозой (две ежедневных инъекций см3) RNS-60 не составил и примерно от
15 одной пятой (1/5) до одной десятой (1/10) от показателя группы контроля носителем, но также характеризовался замедленным возникновением.
Клинический показатель профилактической группы с низкой дозой (одна ежедневная инъекция см3) RNS-60 составил примерно одну треть (1/3) от показателя группы контроля носителем, в то время как клинический показатель
20 профилактической группы с высокой дозой (две ежедневных инъекций см3) RNS-60 был не только равен нулю (отсутствие определяемого клинического показателя) на день 16, что характеризовалось замедленным возникновением, но на день 17 составил менее, чем одну десятую (1/10) от показателя группы контроля носителем в этой же временной точке.
25 Согласно отдельным аспектам данного изобретения, электрокинетические
композиции по изобретению по существу используют для лечения, включая снижение симптомов и профилактику, симптомов ЭАЭ в известной в науке крысиной модели МС человека.
ПРИМЕР 8
(Было показано, что электрокинетическая жидкость по изобретению была
эффективной в поддержании веса крыс в известной в науке модели острого
экспериментального аллергического (аутоиммунного) энцефаломиелита (ЭАЭ)
35 крыс МВР множественного склероза (МС))
Обзор:
Данный рабочий ПРИМЕР описывает изменение массы тела у крыс, 5 используемых в эксперименте, описанном в Примере 7. Потеря массы тела может служить первым признаком начала заболевания, в то время как внезапная заметная потеря массы тела сопровождает ремиссию симптомов ЭАЭ. Таким образом, определение массы тела у отдельных животных было проведено незадолго перед индукцией ЭАЭ на день исследования 0 (начало исследования) и 10 впоследствии проводили ежедневно в течение 21-дневного периода наблюдения. Было показано, что влияние электрокинетической жидкости по изобретению RNS-60 было эффективным в поддержании массы тела у крыс, участвующих в крысиной модели ЭАЭ (Фигура 9). Данные массы тела:
15 Фигура 9 отображает массу тела в граммах (фигура А) и в процентах
(фигура В) на основе 100 грамм. После незначительного снижения средней массы тела у животных, подвергнутых лечению в данном Примере, среднее значение массы тела начало повышаться до прекращения исследования. После окончания исследования среднее увеличение массы тела составило 20% у
20 животных, которым вводили носитель (Группа 1F). В течение исследования в группе лечения дексаметазоном (Группа 2F), который вводили, начиная с дня исследования 0, средняя потеря массы тела составила 10%. По окончании исследования животные, подвергнутые лечению дексаметазоном, потеряли 2% средней массы тела. В группе, подвергнутой лечению профилактической низкой
25 дозой (Группа 3F), отмечалось до 4% снижение средней массы тела в дни исследования 1-3, с последующим набором 23% средней массы тела на день окончания исследования. В группе, подвергнутой лечению профилактической высокой дозой (Группа 4F), отмечалось до 5% снижение средней массы тела в дни исследования 1-3, с последующим набором 28% средней массы тела на день
30 окончания исследования. В группе, подвергнутой лечению терапевтической низкой дозой (Группа 5F), отмечалось до 4% снижение средней массы тела в дни исследования 1-3, с последующим набором 21 % средней массы тела на день окончания исследования. В группе, подвергнутой лечению терапевтической высокой дозой (Группа 6F), отмечалось до 4% снижение средней массы тела в
дни исследования 1-3, с последующим набором 19% средней массы тела на день окончания исследования.
Таким образом, было выявлено, что электрокинетическая жидкость RNS-60 по изобретению была эффективной в поддержании массы тела у крыс, 5 включенных в крысиную модель ЭАЭ.
Согласно отдельным аспектам данного изобретения, электрокинетические композиции по изобретению по существу используют для лечения, включая снижение симптомов и профилактику, симптомов ЭАЭ в известной в науке крысиной модели МС человека.
ПРИМЕР 9
(Было показано, что электрокинетическая жидкость по изобретению обладает
незначительным эффектом на уровень лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в образцах крови, отобранных у крыс, включенных в известную в 15 науке модель острого экспериментального аллергического (аутоиммунного) энцефаломиелита (ЭАЭ) крыс МВР множественного склероза (МС))
Обзор:
20 Данный рабочий ПРИМЕР описывает уровень лейкоцитов, нейтрофилов и
лимфоцитов в образцах крови, отобранных у крыс во время эксперимента, как это описано в Примере 7. Для определения того, было ли изменение уровней цитокинов вызвано общим изменением в количестве лейкоцитов, Заявителями были отобраны образцы крови в течение всего эксперимента у крыс, включенных
25 в эксперимент ЭАЭ.
Уровень лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов:
Фигуры 10 A-D отображают уровни лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в образцах крови, которые были отобраны в течение эксперимента ЭАЭ.
30 Количество лейкоцитов (Л), нейтрофилов и лимфоцитов было подсчитано
спустя один час после введения исследуемого соединения на дни исследования 0 (фигура А), 7 (фигура В), 14 (фигура С) и 21 (фигура D). Максимальное количество Л спустя один час после того, как животным был введен носитель на день исследования 7, составило 8,23±0,36 единиц. Лечение дексаметазоном по
35 существу снизило среднее количество Л в сравнении с носителем до 2,46±0,38
единиц (р <0,05). Терапевтическое лечение исследуемым соединением в низкой дозе (Группа 5F) по существу повысило среднее значение Л в сравнении с носителем до 9,59±0,46 единиц (р <0,1). Терапевтическое лечение исследуемым соединением в высокой дозе (Группа 6F) по существу повысило среднее значение 5 Л в сравнении с носителем до 10,84±0,88 единиц (р <0,05).
Максимальное количество Л спустя один час после того, как животным был введен носитель на день исследования 14, составило 6,34±0,28 единиц. Лечение дексаметазоном по существу снизило среднее количество Л в сравнении с носителем до 3,79±0,69 единиц (р <0,05). Профилактическое лечение
10 исследуемым соединением в высокой дозе (Группа 4F) по существу повысило среднее значение Л в сравнении с носителем до 7,83±0,51 единиц (р <0,05). Терапевтическое лечение исследуемым соединением в низкой дозе (Группа 5F) по существу повысило среднее значение Л в сравнении с носителем до 7,65±0,52 единиц (р <0,05). Терапевтическое лечение исследуемым соединением в высокой
15 дозе (Группа 6F) по существу повысило среднее значение Л в сравнении с носителем до 8,05±0,43 единиц (р <0,05). Максимальное количество Л спустя один час после того, как животным был введен носитель на день исследования 21, составило 9,09±0,75 единиц. Лечение дексаметазоном по существу снизило среднее количество Л в сравнении с носителем до 5,12±0,57 единиц (р <0,05).
20 Максимальное количество нейтрофилов спустя один час после того, как
животным был введен носитель на день исследования 7, составило 26,20±1,62 единиц. Лечение дексаметазоном по существу снизило среднее количество нейтрофилов в сравнении с носителем до 65,38±4,62 единиц (р <0,05). Профилактическое лечение исследуемым соединением в высокой дозе (Группа
25 4F) по существу повысило среднее значение нейтрофилов в сравнении с носителем до 31,90±0,96 единиц (р <0,05). Терапевтическое лечение исследуемым соединением в высокой дозе (Группа 6F) по существу повысило среднее значение нейтрофилов в сравнении с носителем до 33,90±2,79 единиц (р <0,05).
30 Максимальное количество нейтрофилов спустя один час после того, как
животным был введен носитель на день исследования 14, составило 33,00±2,58 единиц. Лечение дексаметазоном по существу повысило среднее количество нейтрофилов в сравнении с носителем до 73,10±3,15 единиц (р <0,05).
Максимальное количество нейтрофилов спустя один час после того, как
35 животным был введен носитель на день исследования 21, составило 41,40±2,32
единиц. Лечение дексаметазоном по существу повысило среднее количество нейтрофилов в сравнении с носителем до 89,33±1,97 единиц (р <0,05). Терапевтическое лечение исследуемым соединением в высокой дозе (Группа 6F) по существу снизило среднее значение нейтрофилов в сравнении с носителем до 5 34,60±3,08 единиц (р <0,1).
Максимальное количество лимфоцитов спустя один час после того, как животным был введен носитель на день исследования 7, составило 73,20±1,95 единиц. Лечение дексаметазоном по существу снизило среднее количество лимфоцитов в сравнении с носителем до 30,63±1,31 единиц (р <0,05).
10 Профилактическое лечение исследуемым соединением в высокой дозе (Группа 4F) по существу снизило среднее значение лимфоцитов в сравнении с носителем до 68,30±1,42 единиц (р <0,1). Терапевтическое лечение исследуемым соединением в высокой дозе (Группа 6F) по существу снизило среднее значение лимфоцитов в сравнении с носителем до 64,80±3,00 единиц (р <0,05).
15 Максимальное количество лимфоцитов спустя один час после того, как
животным был введен носитель на день исследования 14, составило 66,10±2,53 единиц. Лечение дексаметазоном по существу снизило среднее количество лимфоцитов в сравнении с носителем до 26,80±3,23 единиц (р <0,05).
Максимальное количество лимфоцитов спустя один час после того, как
20 животным был введен носитель на день исследования 21, составило 57,50±2,09 единиц. Лечение дексаметазоном по существу снизило среднее количество лимфоцитов в сравнении с носителем до 10,11 ±2,08 единиц (р <0,05). Терапевтическое лечение исследуемым соединением в высокой дозе (Группа 6F) по существу повысило среднее значение лимфоцитов в сравнении с носителем до
25 66,20±2,74 единиц (р <0,05).
Таким образом, электрокинетическая жидкость по изобретению RNS-60, вводимая профилактически и терапевтически в высокой дозе, по существу повышала количество нейтрофилов и по существу снижала количество лимфоцитов в сравнении с носителем на день исследования 7.
30 Электрокинетическая жидкость по изобретению RNS-60, вводимая профилактически в высокой дозе и терапевтически в обеих дозах, по существу повышала количество лейкоцитов (Л) в сравнении с носителем на день исследования 14. Исследуемое соединение RNS60, вводимое терапевтически при высокой дозе, по существу снижало количество нейтрофилов и повышало
35 количество лимфоцитов в сравнении с носителем на день исследования 21.
Таким образом, было выявлено, что электрокинетическая жидкость по изобретению RNS-60 обладала незначительным эффектом на общие уровни лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов.
5 ПРИМЕР 10
(Было показано, что электрокинетическая жидкость по изобретению влияет
на уровень определенных цитокинов в образцах крови, отобранных у крыс,
включенных в известную в науке модель острого экспериментального
аллергического (аутоиммунного) энцефаломиелита (ЭАЭ) крыс МВР
10 множественного склероза (МС))
Обзор:
Данный рабочий ПРИМЕР описывает уровень цитокинов, обнаруженных в
15 образцах крови, отобранных у крыс во время эксперимента, как это описано в Примере 7. Электрокинетическая жидкость по изобретению RNS-60 была проанализирована при терапевтических режимах введения, как это описано в Примере 7. Было показано, что электрокинетическая жидкость по изобретению RNS-60 влияет на уровень определенных цитокинов в образцах крови,
20 отобранных у крыс, включенных в крысиную модель ЭАЭ.
Было показано, что определенные цитокины играют роль при множественном склерозе. В частности, было показано, что интерлейкин 17 (ИЛ-17), также известный как CTLA-8 или ИЛ-17А, имел повышенные уровни в центральной нервной системе при остром и хроническом ЭАЭ (Hofstetter, Н. Н., et
25 al., Cellular Immunology (2005), 237:123-130). ИЛ-17 является провоспалительным цитокином, который стимулирует секрецию целого ряда других цитокинов из различных иммунных клеток. ИЛ-17 способен индуцировать секрецию ИЛ-6, ИЛ-8, PGE2, МСР-1 и Г-КСФ прилегающими клетками, такими как фибробласты, кератиноциты, эпителиальные и эндотелиальные клетки, и также может
30 индуцировать поверхностную экспрессию ICAM-1, пролиферацию Т-клеток и рост и дифференцировку CD34+ клеток-предшественников человека в нейтрофилы и со-культивировании в присутствии облученных фибробластов (Fossiez et al., 1998, Int.Rev.lmmunol. 16, 541-551). ИЛ-17 преимущественно вырабатывается активированными Т-клетками памяти и действует путем связывания с
35 повсеместно распространенным рецептором клеточной поверхности (IL-17R) (Yao
et al., 1997, Cytokine, 9, 794-800). Было выявлено целый ряд гомологов ИЛ-17,
которые имеют подобные и разные роли в регуляции воспалительных ответов.
Обзор цитокина/семейства рецептора ИЛ-17 представлен в Dumont, 2003, Expert
Opin. Ther. Patents, 13, 287-303.
5 ИЛ-17 может способствовать возникновению целого ряда заболеваний,
опосредованных аномальным иммунным ответом, таких как ревматоидный артрит и воспаление дыхательных путей, а также отторжение трансплантированного органа и противоопухолевый иммунитет. Ингибиторы активности ИЛ-17 также хорошо известны в науке, например, белок слияния IL-17R:Fc использовали для
10 демонстрации роли ИЛ-17 при коллаген-индуцированном артрите (Lubberts et al., J.Immunol. 2001,167, 1004-1013) и нейтрализации поликлональных антител, используемых для снижения образования перитонеальной адгезии (Chung et al., 2002, J.Exp.Med., 195, 1471-1478). Нейтрализующие моноклональные антитела представлены на рынке (R &D Systems UK).
15 Таким образом, основываясь на роли ИЛ-17 в патогенезе МС, Заявители
исследовали эффект электрокинетической жидкости RNS-60 по изобретению на уровни ИЛ-17 в образцах крови, отобранных у крыс из исследования ЭАЭ.
Данные цитокинов:
20 Уровни различных цитокинов в крови были проанализированы в течение
исследования. Краткое описание: у всех животных была отобрана кровь спустя 1 час после инъекции, и плазма была собрана в гепаринизированные пробирки. 100 мкл образцов было проанализировано на предмет различных воспалительных цитокинов с использованием способа Luminex (набора для анализа цитокинов у
25 крыс Procarta РС4127 производства Panomics), который позволяет измерить множественные цитокины в одном и том же образце одновременно. По причине негауссового распределения данных и случайных результатов ниже порога определения анализа, непараметрическая модель регрессионного анализа Кокса для усеченных данных была адаптирована для сравнения различных жидкостей.
30 Как это представлено на Фигурах 11 А-Н, уровни ИЛ1а, ИЛ1Ь и ИЛ17 были по существу более снижены при использовании обоих доз лечения (высокой и низкой) RNS60. Клинические проявления индуцированного МВР ЭАЭ начинаются примерно на день 10 с пиком примерно на день 18. Таким образом, мы рассматривали день 7 (непосредственно перед проявлением заболевания) и день
35 18 (примерно пик заболевания) как наиболее важные временные точки для
анализа цитокинов. Уровни ИЛ1а, ИТИЬ и ИЛ17 в крови, на дни 7 и 18, 10 животных/группа представлены на Фигурах 11 А-Н.
ИЛ-1 является одним из основных провоспалительных цитокинов и повышающим медиатором естественного иммунного ответа. ИЛ-1 индуцирует 5 выработку различных факторов роста и трофических факторов, медиаторов воспаления, адгезионных молекул и других цитокинов прямым и непрямым способом, а также использование цепи положительной обратной связи (A. Basu et al., The type 1 interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and the induction of multiple proinflammatory mediators in response to brain injury, J.
10 Neurosci. 22 (2002), pp. 6071-6082; P.N. Moynagh, The interleukin-1 signaling pathway in astrocytes: a key contributor to inflammation in the brain, J. Anat. 207 (2005), pp. 265-269). Они включают важные модуляторы, такие как ФРН, ICAM 1, ИЛ6, ФНОа, КСФ и т.д. Прогресс МС включает активацию ауто-антигенреактивных Т-клеток в периферических областях с последующей инвазией
15 в ЦНС. ИЛ-1 критичен в развитии МС, так как он участвует не только в миелин-специфической активации Т-клеток, но также представляет собой основной медиатор активации макрофагов в периферических областях [R. Furlan et al., HSV-1-mediated IL-1 receptor antagonist gene therapy ameliorates MOG(35-55)-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice, Gene Ther. 14 (2007),
20 pp. 93-98)). В моделях ЭАЭ для МС было показано, что ИЛ-1 а и ИЛ-16 являются медиаторами воспалительного процесса. Периферические уровни ИЛ-1 В коррелируют с клиническим курсом, при этом в течение ЭАЭ была показана реактивность ИЛ-1 В в макрофагах, инфильтрирующих ЦНС, и в присутствующих микроглиальных клетках ((С.А. Jacobs et al., Experimental autoimmune
25 encephalomyelitis is exacerbated by IL-1 alpha and suppressed by soluble IL-1 receptor, J. Immunol. 146 (1991), pp. 2983-2989)). Таким образом, ИЛ-1 является подходящим терапевтическим агентом при ЭАЭ и МС. Был доказан неселективный ингибирующий механизм ИЛ-1 в существующих терапевтических агентах для МС; они представлены интерфероном бета,
30 противовоспалительными глюкокортикоидами, иммуносупрессантами, аторвастатином и омега-3 полиненасыщенными жирными кислотами [ F.L. Sciacca er al., Induction of IL-1 receptor antagonist by interferon beta: implication for the treatment of multiple sclerosis, J. Neurovirol. 6 (Suppl. 2) (2000), pp. S33-S37. ; R. Pannu er al., Attenuation of acute inflammatory response by atorvastatin after spinal
35 cord injury in rats, J. Neurosci. Res. 79 (2005), pp. 340-350; A.P. Simopoulos, Omega
3 fatty acids in inflammation and autoimmune diseases, J. Am. Coll. Nutr. 21 (2002), pp. 495-505)). Как это показано на Фигуре 11 C-F, внутривенное введение (в/в) RNS60 эффективно снижает уровни ИЛа и ИЛ 1В в системном кровотоке. Для ИЛ 1а лечение RNS60 снижало по существу уровень в крови в сравнении с группой 5 лечения носителем, и было таким же эффективным, как и дексаметазон в данной временной точке. Однако во временной точке 18 день, лечение не имело значимого эффекта на уровень И11 крови. Уровни ИД1Й системном кровотоке также были по существу снижены спустя 7 дней внутривенного (в/в) лечения RNS60 до уровней, сопоставимых с группами лечения дексаметазоном
10 без каких-либо побочных или токсических эффектов. Несмотря на то, что такая же тенденция отмечалась во временной точке 18 день, разница не была статистически значимой при сравнении с контрольной группой. ИЛ-17 также является важным эффекторным цитокином с сильными провоспалительными свойствами. Он индуцирует экспрессию других провоспалительных цитокинов,
15 таких как фактор некроза опухоли альфа и хемокины, привлекающие нейтрофильные лейкоциты, и повышает зрелость дендритных клеток (Kolls JK, Linden A.lnterleukin-17 family members and inflammation.Immunity. 2004 Oct;21(4):467-76). Считается, что клетки, вырабатывающие ИЛ-17, являются важными воспалительными медиаторами при аутоиммунных заболеваниях, таких
20 как коллаген-индуцированный артрит, колит, псориаз и ЭАЭ. Т-хелперные 17 клетки при ЭАЭ являются CD4+ клетками и присутствуют в иммунной периферической и воспаленной центральной нервной системе при ЭАЭ. Кроме того, нейтрализация ИЛ-17 улучшает клиническое заболевание, т.е. результат, который отмечается параллельно со снижением степени тяжести ЭАЭ у животных
25 с дефицитом ИЛ-17 ((из Gold and Liihder, Interleukin-17-Extended Features of a Key Player in Multiple Sclerosis Am J Pathol. 2008 January; 172(1): 8-10.). 7-дневное в/в лечение RNS60 приводило к значительному снижению уровней ИЛ-17 в крови до уровня, подобного таковому у животных, подвергнутых лечению дексаметазоном. Такое же отмечалось спустя 18 дней лечения, однако результаты не были
30 статистически значимыми. Важно отметить, что RNS60 эффективен не только в понижении уровней ИЛ1, но и в комбинации двух основных цитокинов при ЭАЭ, ИЛ1 и ИЛ17, без каких-либо значительных токсических побочных эффектов спустя 21 день в/в инъекций.
Кроме ИЛ1 и ИЛ 17, RIS60 также модулирует целый ряд других молекул, которые играют критическую роль в воспалении нервной системы. Они включают Rantes, КС, ФРН и ICAM (данные не указаны).
Таким образом, электрокинетическая жидкость RNS-60 по изобретению 5 имела значительный эффект на уровни ИЛ-17 в образцах крови, отобранных у крыс в ходе исследования ЭАЭ. Кроме того, поскольку ИЛ-17 стимулирует секрецию ИЛ-6, ИЛ-8, PGE2, МСР-1 и Г-КСФ, вполне вероятно, что электрокинетическая жидкость RNS-60 по изобретению может иметь значительный эффект на уровень таких цитокинов в крови. Согласно отдельным 10 аспектам данного изобретения, электрокинетические композиции по изобретению по существу используют для лечения, включая снижение симптомов и профилактику, симптомов ЭАЭ в известной в науке крысиной модели МС человека.
15 ПРИМЕР 11
(В ходе анализа флуоресцентной сортировкой клеток (FACS) было показано, что RNS-60 обладает выраженным эффектом на экспрессию рецепторов клеточной поверхности: CD193 (CCR3); CD154 (CD40L); CD 11 В; и CD3)
20 Обзор. Заявители использовали анализ флуоресцентной сортировки
клеток (FACS) для сравнения уровней экспрессии рецепторов клеточной поверхности CD193 (CCR3); CD154 (CD40L); CD11B; и CD3 на лейкоцитах, инкубированных с электрокинетической жидкостью по изобретению (RNS-60) или нормальным контрольным физиологическим раствором.
25 Способы:
МКПК, разделенные фиколл-гипаком (аферез - все клетки), предварительно инкубированные 1 час в 30% растворах RNS60 и нормального физиологического раствора (ФР);
МКПК, активированные 2 мкг/мл PHA-L в течение 24 или 40 часов;
30 Клетки собраны и промыты в блокирующем буфере/буфере для
окрашивания, окрашены и фиксированы; и
Клетки были проанализированы проточной цитометрией. Результаты:
Относительно CD193 (CCR3), рецептор по существу супрессирован в 35 присутствии RNS-60 при сравнении с уровнем экспрессии рецептора в
нормальном физиологическом растворе. Такая супрессия воздействует на фосфорилирование МАРК р38 (данные не указаны), что, в свою очередь, супрессирует эотаксин (например, см. Пример 13 и Фигуру 57 опубликованной заявки на патент Заявителей WO2009/055729, опубликованной 30 апреля 2009 г.), 5 что, в свою очередь, супрессирует ИЛ-5, а также изменяет количество эозинофилов, что является одним из факторов которые, например, изменяют ответ в виде суживания бронхов.
Как это обсуждается в Примере 13 опубликованной заявки на патент Заявителей WO2009/055729, опубликованной 30 апреля 2009 г., в контексте 10 модели воздействия яичным альбумином, RNS-60 снижало уровни эотаксина в сыворотке в группах воздействия OVA при сравнении с эффектом физиологического раствора. Таким образом, согласно отдельных аспектов, RNS-60 обладает потенциалом снижать количество лиганда эотаксина и его рецептора CCR3.
15 Относительно CD154 (CD40L), рецептор супрессирован в присутствии
RNS-60 при сравнении с уровнем экспрессии рецептора в нормальном физиологическом растворе.
Относительно CD11B , рецептор супрессирован в присутствии RNS-60 при сравнении с уровнем экспрессии рецептора в нормальном физиологическом
20 растворе.
Относительно CD3 , рецептор супрессирован в присутствии RNS-60 при сравнении с уровнем экспрессии рецептора в нормальном физиологическом растворе.
25 Согласно отдельным аспектам и как это описано в любом месте рабочих
Примеров текста данной заявки, электрокинетические композиции по изобретению по существу используют в снижении воспаления. Не будучи связанными каким-либо механизмом, например, и как это обсуждается в любом месте данной заявки, IL7R димеризирует с геном рецептор-подобного фактора 2 цитокинов (CRLF2) с
30 образованием рецептора TSLP (Al Shami et al. (2004) J. Exp. Med. 200:159-168). TSLP является ИЛ7-подобным цитокином, который запускает развитие незрелых В-клеток in vitro и в миелоидных дендритных клетках может способствовать дифференциации нативных CD4+ Т-клеток в фенотип Т-хелпера типа 2 (Th2) и способствовать экспансии CD4+ Тп2 клеток памяти (Huston et al. (2006) Curr.
35 Allergy Asthma Rep. 6:372-376). Считается, что TSLP запускает опосредованные
дендритными клетками воспалительные ответы Тп2-типа и считается основным переключателем аллергического воспаления (Koyama et al. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 357:99-104), что релевантно для этиологии МС (см., например, Gregory et al. Nature Genetics, 39:1083-1091; опубликованный 29 июля 5 2007 г. и включенный сюда посредством ссылки; связь аллеля IL7Ra с МС). В дополнительных аспектах электрокинетические композиции по изобретению могут по существу использоваться для модуляции (например, понижении) матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9). При множественном склерозе (МС) активность матриксной металлопротеиназы (ММР) в тканях является результатом
10 равновесия между ММР и их тканевыми ингибиторами (TIMP). ММР-9 предоминирует в поражениях МС и ингибируется TIMP-1, в то время как ММР-2 вероятно участвует в ремоделировании внеклеточного матрикса (ВКМ), как при хроническом заболевании, и ингибируется TIMP-2 (см., например, Avolio et al., J Neurolmmunol, 136:46-53, 2003, включено сюда посредством ссылки).
15 Согласно дополнительным аспектам данного изобретения,
электрокинетические композиции по изобретению по существу используют для лечения, включая снижение симптомов и профилактику, симптомов МС у пораженных млекопитающих (преимущественно, человека).
Согласно дополнительным аспектам, электрокинетические композиции по
20 изобретению могут быть введены вместе с, по меньшей мере, одним дополнительным терапевтическим агентом для лечения МС, как это описано в любом месте данной заявки.
Согласно дополнительным аспектам данного изобретения, электрокинетические композиции по изобретению по существу используют для
25 лечения, включая снижение симптомов и профилактику, симптомов воспалительных нейродегенеративных заболеваний (например, болезни Альцгеймера, Паркинсона, нарушения по типу амилоидоза, как это описано в любом месте данной заявки) у пораженных млекопитающих (преимущественно, человека).
ПРИМЕР 12
(Было показано, что электрокинетическая жидкость по изобретению (например, RNS60) ингибирует экспрессию iNOS и ИЛ-1(3 дозозависимым образом в микроглиальных клетках)
Обзор:
Согласно отдельным аспектам, как это описано в тексте данной заявки,
электрокинетические жидкости по изобретению по существу используют в
лечении болезни Паркинсона (БП).
5 Болезнь Паркинсона (БП) является одним из самых разрушительных
нейродегенеративных нарушений у человека. БП может возникнуть в любом возрасте, но она редка у людей младше 30 лет. Клинически БП характеризуется тремором, брадикинезией, ригидностью и нестабильностью позы. Патологически она проявляется глиозом и прогрессирующей дегенерацией допаминергических
10 нейронов, ассоциированных с присутствием интрацитоплазматических включений (тельца Леви) в substantia nigra pars compacta (SNpc). В головном мозге человека с БП после смерти, мертвые нейроны, как сообщалось, имели морфологические характеристики апоптоза, включая сжатие клетки, конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК. Таким образом, развитие эффективных нейропротекторных
15 терапевтических способов замедляет прогрессирование заболевания, что является фактором первостепенной важности. Мышиная модель МРТР по существу используется для тестирования и валидации терапевтических способов для лечения БП.
Активация микроглии играет важную роль в патогенезе болезни Паркинсона
20 (БП), а также других нейродегенеративных нарушений. Отдельные характеристики БП моделируют у 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МРТР)-интоксицированных животных. Нейротоксический эффект МРТР зависит от его конверсии в МРР+. В глиальных клетках моноаминоксидаза В (МАО-В) преобразовывает МРТР в МРР+, который затем активирует глиальные клетки, и
25 недавно было показано, что МРР+ индуцирует экспрессию провоспалительных молекул в микроглии.
В данном рабочем ПРИМЕРЕ была подтверждена способность RNS60 модулировать экспрессию провоспалительных молекул в МРР+-стимулированных клетках микроглии.
30 Материалы и способы:
Краткое описание: мышиные микроглиальные клетки BV-2 были инкубированы с различными концентрациями RNS60 и нормального физиологического раствора (ФР) в течение 1 ч с последующим стимулированием 2 мкМ МРР+ при условии отсутствия сыворотки.
35 РЕЗУЛЬТАТЫ:
Как это очевидно из полуколичественного анализа ОТ-ПЦР, представленного на Фигуре 12, МРР+ индуцирует экспрессию индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) и мРНК интерлейкина-1В(ИЛ-1В) в микроглиальных клетках BV-2. Важным является тот факт, что RNS60 ингибировал экспрессию 5 iNOS и ИЛ-1 р дозозависимым образом в микроглиальных клетках (Фигура 12). В отличие от этого, при подобных экспериментальных условиях, нормальный контрольный физиологический раствор (ФР) не обладал каким-либо эффектом на экспрессию таких двух провоспалительных генов (Фигура 12), указывая на специфичность эффекта.
10 В частности, Фигура 12 отображает факт того, что электрокинетическая
жидкость по изобретению (RNS-60), в отличие от контрольного физиологического раствора (ФР), ослабевает МРР+-индуцируемую экспрессию индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) и интерлейкина-1В (ИЛ-1 В) в микроглиальных клетках мыши. Микроглиальные клетки BV-2, предварительно инкубированные с
15 различными концентрациями RNS60 и нормального физиологического раствора (ФР) в не содержащей сыворотку среде в течение 1 ч, были стимулированы МРР+ (паркинсониальный токсин). Спустя 6 ч после стимуляции, общая РНК была выделена, и экс рес сяимРНК iNOS и ИЛ-1 В была проанализирована с использованием полуколичественного ОТ-ПЦР. Результаты представляют три
20 независимых эксперимента.
Согласно отдельным аспектам и принимая во внимание, что МРР+ является токсином при болезни Паркинсона, такие результаты показывают, что RNS60 обладает защитным эффектом в известной в науке мышиной модели болезни Паркинсона, индуцируемой МРТР.
25 Согласно отдельным аспектам, электрокинетические жидкости по
изобретению по существу используют в лечении болезни Паркинсона (БП).
ПРИМЕР 13
(Было показано, что электрокинетическая жидкость по изобретению
30 (например, RNS60) защищает нейроны от токсичности амилоида-{$)
Обзор:
Согласно отдельным аспектам, как это описано в тексте данной заявки, электрокинетические жидкости по изобретению по существу используют в 35 лечении болезни Альцгеймера (БА).
Болезнь Альцгеймера (БА) является нейродегенеративным нарушением, приводящим к прогрессирующей гибели нейронов и потери памяти. Повышенное окрашивание TUNEL в головном мозге человека с БА после смерти указывает на то, что нейроны в головном мозге пациентов с БА умирают в результате апоптоза. 5 Фибриллярные амилоид-3 пептиды участвуют в патофизиологии БА. Нейропатологически заболевание характеризуется нейрофибриллярными клубками и нейритными бляшками, состоящими из агрегатов -амилоидного (А6) белка, протеолитического фрагмента из 40-43 аминокислот, полученного из белка-предшественника амилоида, и фосфорилированного тау-белка. Было выявлено,
10 что гиперэкспрессия пептидов Ар внутриклеточно у трансгенных мышей вызывает сегментацию хроматина, его конденсацию и повышение окрашивания TUNEL. Исследования клеточных культур также показали, что пептийывлФяются апоптозными и цитотоксическими относительно нейронных клеток, и также было показано, что фибриллярные пептиды $1 -42 способны индуцировать апоптоз в
15 нейронных клетках.
Кроме того, исследования направлены возрастающим образом на характеристику связи между воспалением и БА, и широко распространенная глиальная активация была выявлена вокруг бляшек и клубков.
В этом ПРИМЕРЕ влияние RNS60 на блокирование А -42)-
20 индуцированного апоптоза в нервных клетках человека SHSY5Y было подтверждено. Материалы и способы:
Фрагментированная ДНК нейронных клеток человека SHS5Y была определена in situ терминальной дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT)-
25 опосредованным связыванием З'-ОН концов фрагментов ДНК, полученных в ответ на фибриллярный А31 -42, с использованием представленного на рынке набора (TdT FragEL(tm)) компании Calbiochem. В целом, покровные стекла были обработаны 20 мкг/мл протеиназой К в течение 15 мин при комнатной температуре и промыты перед окрашиванием TdT.
30 РЕЗУЛЬТАТЫ:
Как это показано на Фигуре 13, фибриллярные пептидрПА -42 заметно снижали образование апоптозных тел в нейронных клетках. Также мы наблюдали потерю нейронного процессинга после обработки | &1 -42 (2й ряд; Фигура 13) В отличие от этого, обратные пептиды 042 -1 были неспособны индуцировать
35 апоптоз нейронов и потерю процессов (3й ряд; Фигура 13). В частности, RNS60
при разных тестированных дозах заметно блокироваЗ(1А -42)-индуцируемый апоптоз и сохранял процесс в нейронных клетках (4й, 5й и 6й ряды; Фигура 13). В отличие от этого, нормальный контрольный физиологический раствор (ФР) не обладал каким-либо эффектом на АВ(1-42)-индуцируемый апоптоз и потерю 5 процессов (7й и 8й ряды; Фигура 13).
В частности, Фигура 13 отображает тот факт, что RNS60, в отличие от
нормального физиологического раствора (ФР), супрессирует фибриллярный АВ(1 -
42)-опосредованный апоптоз нейронных клеток SHSY5Y человека. После
дифференциации клетки SHSY5Y были инкубированы с разными концентрациями
10 RNS60 или ФР в течение 1 часа с последующим повреждением 1 мкМ
фибриллярными $(1 -42) пептидами. Спустя 18 ч обработки, апоптоз был
подвергнут мониторингу с использованием TUNEL (Calbiochem). Пептиды (9(42 -
1) также были инкубированы в качестве контроля. Результаты представляют три
независимых эксперимента.
15 Такие результаты указывают, что этиологический реагент БА
(фибриллярный /(31 -42) индуцирует апоптоз в нейронах посредством RNS60-чувствительного пути.
Согласно отдельным аспектам, электрокинетические жидкости по изобретению по существу используют в лечении болезни Альцгеймера (БА).
ПРИМЕР 14
(Было показано, что электрокинетическая жидкость по изобретению по существу эффективна в супрессии клинических показателей дозозависимым образом в известной в науке мышиной МОГ модели множественного склероза 25 (МС))
Обзор:
В данном рабочем ПРИМЕРЕ электрокинетическую жидкость по 30 изобретению RNS-60 оценивали в двух дозах в терапевтических режимах введения в известной в науке мышиной модели МОГ экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) множественного склероза (МС). Материалы и способы:
Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) является 35 аутоиммунным демиелинизирующим заболеванием центральной нервной
системы (ЦНС), которое имитирует множество клинических и патологических характеристик множественного склероза (МС). Мышиная модель МОГ состоит из периода сенсибилизации, индуцированной одной подкожной (п/к) инъекцией МОГ, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда (CFA), на день исследования О 5 (200 мкг МОГ / 300 мкг CFA, инъецированный в общем объеме дозы 200 мкл/животное в виде 2 X 100 мкл подкожных билатеральных инъекций в паралюмбарном участке); с последующей интраперитонеальной (и/п) дополнительной иммуностимуляцией коклюшным токсином (КТ) в дозе 20 мкг/кг (примерно 400 нг/мышь) посредством интраперитонеальной (и/п) инъекции один
10 раз во время индукции ЭАЭ на день исследования 0 и снова, спустя 48 часов на день исследования 2 (Gilgun-Sherki Y. et al., Neurosciences Research 47:201-207, 2003J. Затем животные были подвергнуты лечению в/в инфузией RNS60, как это указано на Фигуре 14. Используемые животные были представлены самками мышей C57BL/6J, полученными от Harlan Laboratories Israel, Ltd. (10
15 животных/группа); молодыми животными; на день исследования возраст составил 8-9 недель.
Все животные были проанализированы на предмет признаков неврологического ответа и симптомов перед индукцией ЭАЭ (день исследования 0) и впоследствии были проанализированы ежедневно в течение 35-дневного 20 периода наблюдения. Реакции ЭАЭ были оценены и записаны в соответствии с известной в науке стандартной шкалой 0-15 в возрастающем порядке степени тяжести. Клинический показатель определяли суммированием бала по каждому показателю (см., например, Weaver et al., FASEB 2005; The FASEB Journal express article 10.1096/fj.04-2030fje. Published online August 4, 2005.).
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Фигура 14 отображает тот факт, что RNS60, в отличие от контрольного носителя (Носитель), является по существу эффективным в супрессии клинического показателя дозозависимым образом в известной в науке мышиной
30 модели МОГ множественного склероза (МС). Терапевтическое ежедневное введение высокой и низкой дозы RNS-60, а также введение высокой дозы RNS-60 каждые три дня (введение RNS-60 во всех случаях начинается примерно с первыми клиническими признаками), показало значительное снижение клинического показателя (светлые ромбы = контроль Носителя; светлые квадраты
35 = положительный контроль дексаметазона; светлые "х" = ежедневное введение
низкой дозы (0,09 мл RNS60) при возникновении клинических признаков; темные
"х" = введение высокой дозы (0,2 мл RNS60) каждые три дня при возникновении
клинических признаков; и светлые треугольники = ежедневное введение высокой
дозы (0,2 мл RNS60) при возникновении клинических признаков).
5 В сравнении с моделью МВР в описанном здесь Примере, такая мышиная
модель МОГ известна в науке своей способностью имитировать характерные аксонные поражения МС, которые не показывает модель МВР, и расширяет наблюдаемую терапевтическую эффективность на более длительные периоды (28-30 дней в сравнении с 21 днем в модели МВР). Согласно дополнительным
10 аспектам, RNS60, в отличие от контрольного носителя (Носитель), по существу эффективна в снижении повреждения аксона в данной мышиной модели МОГ.
Согласно отдельным аспектам данного изобретения, электрокинетические композиции по изобретению по существу используют для лечения, включая снижение симптомов и профилактику, симптомов в известной в науке мышиной
15 модели МС человека. Согласно дополнительным аспектам данного изобретения, электрокинетические композиции по изобретению по существу используют для лечения, включая снижение симптомов и профилактику, симптомов МС у пораженных млекопитающих (преимущественно, человека).
В еще одних аспектах электрокинетические композиции по изобретению
20 пересекают гематоэнцефалитический барьер (ГЭБ) и, таким образом, обеспечивают новейший способ лечения воспалительных состояний центральной нервной системы.
ПРИМЕР 15
25 (Б ходе анализа флуоресцентной сортировкой клеток (FACS) было показано, что RNS-60 обладает выраженным эффектом на экспрессию рецепторов клеточной поверхности: CD193 (CCR3); CD154 (CD40L); CD 11 В; и CD3)
Обзор. Заявители использовали анализ флуоресцентной сортировки клеток 30 (FACS) для сравнения уровней экспрессии рецепторов клеточной поверхности CD193 (CCR3); CD154 (CD40L); CD11B; и CD3 на лейкоцитах, инкубированных с электрокинетической жидкостью по изобретению (RNS-60) или нормальным контрольным физиологическим раствором. Способы:
МКПК, разделенные фиколл-гипаком (аферез - все клетки), предварительно инкубированные 1 час в 30% растворах RNS60 и нормального физиологического раствора (ФР);
МКПК, активированные 2 мкг/мл PHA-L в течение 24 или 40 часов;
5 Клетки собраны и промыты в блокирующем буфере/буфере для
окрашивания, окрашены и фиксированы; и
Клетки были проанализированы проточной цитометрией. Результаты:
Относительно CD193 (CCR3), как это показано на Фигуре 15 В, рецептор по 10 существу супрессирован в присутствии RNS-60 при сравнении с уровнем
экспрессии рецептора в контрольном нормальном физиологическом растворе.
Такая супрессия влияет на фосфорилирование МАРК р38 (данные не указаны),
что, в свою очередь, супрессирует эотаксин (например, см. Пример 4), что, в свою
очередь, регулирует ИЛ 5 (данные не указаны) и также изменяет количество 15 эозинофилов (например, см. Пример 4), являющихся одним из факторов, которые,
например, изменяют ответ в виде суживания бронхов.
Как это обсуждается выше в Примере 4, в контексте модели воздействия
яичным белком, RNS-60 снижал уровни эотаксина в сыворотке в группах
воздействия OVA при сравнении с эффектом нормального физиологического 20 раствора. Таким образом, согласно отдельных аспектов, RNS-60 обладает
потенциалом снижать количество лиганда эотаксина и его рецептора CCR3.
Относительно CD154 (CD40L), как это показано на Фигуре 16 А, рецептор
супрессирован в присутствии RNS-60 при сравнении с уровнем экспрессии
рецептора в нормальном физиологическом растворе.
25 Относительно CD11B, как это показано на Фигуре 16 В, рецептор
супрессирован в присутствии RNS-60 при сравнении с уровнем экспрессии
рецептора в нормальном физиологическом растворе.
Относительно CD3, как это показано на Фигуре 16 С, рецептор
супрессирован в присутствии RNS-60 при сравнении с уровнем экспрессии 30 рецептора в нормальном физиологическом растворе.
ПРИМЕР 16
(RNS60, в отличие от нормального физиологического раствора (ФР), ослабевал активацию NFKB в примированных МВР Т-клетках)
Обзор. NF-кВ киназа является киназой, которая хорошо известна в науке как опосредующая воспалительный ответ в вызванных воспалением состояниях и заболеваниях.
5 Данный Пример показывает, что RNS60, в отличие от нормального
физиологического раствора (ФР), ослабевал активацию NIRB в примированных МВР Т-клетках. Согласно отдельным аспектам, данные электрокинетически полученные жидкости по существу используют для лечения воспаления и опосредованных воспалением состояний и заболеваний, включая, но не
10 ограничиваясь, диабет и родственные метаболические нарушения, резистентность к инсулину, нейродегенеративные заболевания (например, МС, болезнь Паркинсона, Альцгеймера и т.д.), астму, кистозный фиброз, заболевание сосудов/коронарной артерии, дегенерацию сетчатки и/или желтого пятна, нарушения пищеварения (например, болезнь воспаленного кишечника, язвенный
15 колит, болезнь Крона и т.д.).
Способы. Для экспериментов, представленных на Фигурах 17 А и 17 В, Т-клетки, выделенные у мышей, иммунизированных МВР, были повторно примированы МВР, и спустя 24 ч в клетки были введены различные концентрации
20 RNS60 и ФР. Спус я 2 ч пос е воздействия, в ядерных экстрактах с использованием анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) отмечалась ДНК-связующая активность NF-KB.
Для экспериментов, представленных на Фигуре 17 С, Т-клетки, выделенные у мышей, иммунизированных МВР, были трансфицированы PBIIX-Luc, NF-кВ-
25 зависимой направляющей молекулой, с последующим повторным примированием МВР. Спус я 24 ч после примирования МВР, клетки были обработаны различными концентрациями RNS60 и ФР в течение 2 ч после анализа активности люциферазы в общих экстрактах клеток с использованием набора для анализа люциферазы (Promega). В других случаях, Т-клетки, примированные МВР, также
30 были стимулированы 30 нМ РМА в течение 1 ч. В таких случаях РМА добавляли спустя 1 ч после предварительной обработки RNS60 и ФР. Результаты представлены как среднее + СО трех разных экспериментов.
Результаты. Фигу рвы 17 А-С показывают, что RNS60, в отличие от нормального физиологического раствора (ФР), ослабевал активацию NF-кВ В
35 примированных МВР Т-клетках. В частности, Фигуры 17 А и 17 В показывают, что
RNS60 (см. три средние полосы на Фигурах 17 А и 124 В), в отличие от ФР (см. сторону справа на Фигурах 17 А и 17 В), снижал активацию NF-кВ в Т-клетках, примированных МВР, дозозависимым образом.
Подобным образом, диаграмма на Фигуре 17 С показывает, что RNS60 (см. 5 вторую, третью и четвертую полосы на Фигурах 17 А и 17 А), в отличие от ФР (см. пятую полосу на Фигурах 17 А и 17 В), снижали активацию NF-кВ в Т-клетках, примированных МВР, и, таким образом, также снижали активность люциферазы с использованием трансфицированной NF-кВ-зависимой направляющей молекулы (PBIIX-Luc) в полном клеточном экстракте дозозависимым образом.
10 Согласно отдельным аспектам, данные электрокинетически полученные
жидкости по существу используют для лечения воспаления и опосредованных воспалением состояний и заболеваний, включая, но не ограничиваясь, диабет и родственные метаболические нарушения, резистентность к инсулину, нейродегенеративные заболевания (например, МС, болезнь Паркинсона,
15 Альцгеймера и т.д.), астму, кистозный фиброз, заболевание сосудов/коронарной артерии, дегенерацию сетчатки и/или желтого пятна, нарушения пищеварения (например, болезнь воспаленного кишечника, язвенный колит, болезнь Крона и т.д.).
20 ПРИМЕР 17
(RNS60, в отличие от нормального физиологического раствора (ФР), снижал фосфорилирование тау-белка, индуцированное фибриллярным А/31-42 белком, в
первичных нейронах)
25 Обзор. Таупатии, как это известно в науке, характеризуются проявлением
повышенного фосфорилирования тау-белка (например, в нейронах субъекта). Таупатии включают, но не ограничиваются этим, болезнь Альцгеймера, аргирофильную зернистость, лобно-височную деменцию, прогрессирующий надъядерный паралич, кортико-базальную дегенерацию, лобно-височную
30 лобарную дегенерацию (болезнь Пика) и Dementia pugilistica (DP) (известную также как деменцию боксеров, хроническую энцефалопатию боксеров)
Отдельные аспекты данного изобретения описывают способы лечения таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, включающие введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества
35 электрокинетически измененной водной жидкости, включающей ионный водный
раствор кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом, которые имеют по существу средний диаметр менее, чем примерно 100 нанометров и стабильно конфигурированы в ионной водной жидкости в количестве, достаточном для модуляции фосфорилирования тау-белка для 5 обеспечения лечения таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, у субъекта. В определенных аспектах изобретения содержащие кислород наноструктуры со стабилизированным зарядом стабильно конфигурированы в ионные жидкости на водной основе в количестве, достаточном для обеспечения, при контакте живой клетки с жидкостью, модуляции, по меньшей мере, одного
10 потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны.
Фигуры 18 А-В представляют результаты эксперимента, исследующего эффекты RNS60 в сравнении с нормальным контрольным физиологическим раствором (ФР) на фибриллярное АВ(1-42)-опосредованное фосфорилирование тау-белка в первичных нейронах. Фосфорилирование тау-белка было
15 опосредовано двухмаркерной иммунофлуоресценцией с использованием антител к В-тубулину и фосфо-тау. Бета-тубулин использовали как маркер для нейронов, и окрашивание DAPI использовали для визуализации ядер клеток. Третья и четвертая панели от верха колонки под названием "(p)-Tau" показывают, что фосфорилирование тау-белка ингибировалось RNS60 дозозависимым образом, в
20 то время, как контрольный нормальный физиологический раствор ("ФР") не имел какого-либо эффекта, даже при высокой дозе 10% (см. нижнюю часть колонки под названием "(p)-Tau").
ПРИМЕР 18
25 (RNS60, в отличие от нормального физиологического раствора (ФР),
ингибировал экспрессию провоспалительных молекул в глиальных клетках посредством фосфатидилинозитол-3 киназа (PI-3K) типа 1А-опосредованной повышенной экспрессии 1кВа и ингибирования активации NF-KB)
30 Обзор. Нейровоспаление имеет патогенез различных
нейродегенеративных нарушений, включая таупатии. Несмотря на интенсивные исследования, в настоящее время отсутствует эффективная терапия для остановки его возникновения или замедления прогрессирования. Как это описано в тексте данной заявки, RNS60 является 0,9% физиологическим раствором,
35 содержащим наноструктуры со стабилизированным зарядом, которые были
получены подверганием нормального физиологического раствора воздействию тока Тейлора-Куэтт-Пуазейля при повышенном давлении кислорода. Данный Пример, показывает, что RNS60, в отличие от нормального физиологического раствора (ФР), ингибировал экспрессию провоспалительных молекул в глиальных 5 клетках посредством фосфатидилинозитол-3 киназа (PI-3K) типа 1А-опосредованной повышенной экспрессии 1кВа и ингибирования активации NF-KB. Вследствие этого, лечение RNS60 повышало уровень 1кВа, ингибировало активацию NF-кВ И снижало экспрессию индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) in vivo в substancia nigra pars compacta (SNpc) 1 -метил-4-фенил-1,2,3,610 тетрагидропиридин (МРТР)-интоксицированных мышей. Такие результаты соответствовали допаминергической защите нейронов, нормализовали нейропередатчики полосатого тела и улучшили двигательные функции у мышей, интоксицированных МРТР. Такие результаты, взятые вместе, указывают на новейшие противовоспалительные свойства RNS60 и предполагают 15 терапевтическую роль такого соединения при таупатиях человека и других нейродегенеративных нарушениях (например, паркинсонизме).
Способы:
Выделение первичной микроглии и астроглии мышей. Микроглия была 20 выделена из смешанных глиальных культур в соответствии с процедурой Giulian and Baker (Giulian and Baker, 1986) с описанными нами ранее модификациями (Roy et al., 2006; Jana et al., 2007). Краткое описание: на день 9 смешанные глиальные культуры были промыты трижды в модифицированной по способу Дульбекко среде Mma/F-12 с последующим встряхиванием при 240 об/мин в 25 течение 2 ч при 37°С на ротационном шейкере. Плавающие клетки были промыты, высеяны в пластиковые колбы с культурой ткани и инкубированы при 37 °С в течение 1 ч. Соединенные клетки были высеяны в новые чашки для дальнейших исследований. Было выявлено, что от девяносто до девяносто пяти процентов клеток были положительными на Мас-1. На день 11 смешанные глиальные 30 культуры были промыты и снова подвергнуты встряхиванию в ротационном шейкере при 180 об/мин в течение 18 ч. Плавающие клетки были удалены, и оставшиеся клетки были трипсинизированы и высеяны на новые чашки для экспериментов. Более, чем девяносто шесть процентов клеток были положительными на GFAP. Микроглиальные клетки BV-2 мыши (любезный
подарок от Virginia Bocchini of University of Perugia) также содержались и были индуцированы, как это указано выше.
Животные и интоксикация МРТР. Мыши C57BL/6 в возрасте от шести до восьми недель были приобретены у Harlan, Indianapolis, IN. Содержание животных 5 и эксперименты проводили в соответствии с руководствами Национального института охраны здоровья и были утверждены Комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных (IACUC), Rush University of Medical Center, Chicago, IL. Для острой интоксикации МРТР мыши получали четыре интраперитонеальных (и/п) инъекций MPTP-HCI (18 мг/кг несвязанного основания;
10 Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) в физиологическом растворе с интервалом в 2 ч (Ghosh et al., 2007; Ghosh et al., 2009). Контрольные животные получали только физиологический раствор.
Лечение RNS60. Мыши были подвергнуты лечению RNS60 и ФР (300 мл/мышь/день) со 2 дня перед интоксикацией МРТР посредством
15 интраперитонеальной (и/п) инъекции.
Анализ синтеза NO. Синтез NO определяли анализом супернатанта культуры на нитриты, стабильный продукт реакции N0 с молекулярным кислородом, с использованием реагента Грисса, как это описано ранее.
Анализ р85а-ассоциированных (тип 1А) и р101-ассоциированных (тип 1В)
20 PI 3-киназ. После стимуляции, клетки были подвергнуты лизису с использованием ледяного буфера для лизиса, содержащего 1% о/о Nonidet Р-40, ЮОмМ NaCI, 20 мМ Трис (рН 7,4), 10 мМ йодоацетамида, 10 мМ NaF, 1 мМ натрия ортованадата, 1 мМ фенилметилсульфонилхлорида, 1 мкг/мл леупептина, 1 мкг/мл антипаина, 1 мкг/мл апротинина и 1 мкг/мл пепстатина А. Лизаты были
25 инкубированы при 4 °С в течение 15 мин с последующим центрифугированием при 13000* д в течение 15 минут. Супернатант был предварительно очищен белковыми гранулами G-сефароза (Biorad) в течение 1 ч при 4 °С с последующим добавлением 1 мкг/мл моноклональных антител р85а или р101. После 2 ч инкубации при 4 °С, белковые гранулы G-сефарозы были добавлены, и
30 полученную смесь дополнительно инкубировали в течение 1 ч при 4 °С. Иммунопреципитаты были промыты дважды с использованием буфера для лизиса, один раз забуференным фосфатом физиологическим раствором, один раз 0,5 М LiCI и 100 мМ Трис (рН 7,6), один раз в воде и один раз в киназном буфере (5 мМ MgCI2, 0,25 мМ ЭДТА, 20 мМ HEPES (рН 7,4)). Активность PI 3-киназы
35 определяли, как это описано раннее, с использованием липидной смеси 100 мкл
0,1 мг/мл PI и 0,1 мг/мл фосфатидилсерина, диспергированной ультразвуком в 20 мМ HEPES (рН 7,0) и 1 мМ ЭДТА. Реакция была начата добавлением 20 мкКи [д-32Р]АТР (3000 Ки/ммоль; NEN) и 100 мкМ АТР, и прекращена спустя 15 мин после добавления 80 мкл 1 N HCI и 200 мкл хлороформа:метанола (1:1). Фосфолипиды 5 были разделены ТСХ и визуализированы при воздействии паров йода и ауторадиографии (REF). Подобно мониторингу р110а- и р110Ь-ассоциированной Pl-З киназной активности, супернатанты были иммунопреципитированы с антителами к р110а и р110Ь с последующим анализом иммунокомплекса липидной киназы, как это описано выше.
10 Экспрессия различных мутантных молекул Pl-З киназы. Клас с IA PI 3-
киназы состоит из каталитической субъединицы (р110) размером 110 кДа и регуляторной субъединицы (р85) размером 85 кДа. В доминантно-отрицательной форме р85а, 35 аминокислот в Me> K-SH2 участке от остатков 479-513 р85а дикого типа, важные для связывания субъединицы р110a/b PI 3-киназы, удалены, и две
15 другие аминокислоты (Сер-Арг) вставлены в этом удаленном положении. Разработка молекулы и описание вектора, запускающего экспрессию белков, были описаны ранее. С другой стороны, в конститутивно активном мутанте р110а/Ь (р110*), меж-8Н2 домен р85 лигирован с МН2-концом р110, в то время, как в мутанте с отсутствием киназы р11 Оа/b (р110-kd) мутирован сайт связывания
20 АТР. Микроглиальные клетки, высеянные на 12-луночных планшетах, были трансфицированы от 0,2 до 0,25 мг различных плазмид с использованием Lipofectamine-Plus (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя, как это описано ранее.
Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). Ядерные 25 экстракты были получены, и EMSA был проведен, как это было описано ранее (Ghosh et al., 2007; Saha et al., 2007; Brahmachari et al., 2009). Краткое описание: олигонуклеотиды, меченые инфракрасным красителем IRDye(tm), содержащие консенсусную связующую последовательность для NF-кВ, были приобретены у LI-COR Biosciences (Lincoln, NE). Шесть микрограмм ядерного экстракта было 30 инкубировано со связующим буфером и IR-меченым зондом в течение 20 мин. Впоследствии образцы были разделены на 6% полиакриламидном геле в 0,25х ТВЕ буфере (Трис борат-ЭДТА) и проанализированы с использованием системы инфракрасной визуализации Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences).
Транскрипционная активность NF-kB. Транскрипционную активность NF-кВ анализировали, как это было описано ранее (Ghosh et al., 2007; Saha et al., 2007; Brahmachari et al., 2009).
Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ. Вся РНК была изолирована из 5 вентрального среднего мозга с использованием реагента Ultraspec-ll RNA (Biotecx Laboratories, Inc., Houston, TX) с соблюдением протокола производителя. Для удаления любой загрязняющей геномной ДНК, вся РНК была расщеплена ДНКазой. ОТ-ПЦР проводили, как это описано ранее (Ghosh et al., 2007; Brahmachari et al., 2009; Ghosh et al., 2009) с использованием набора ОТ-ПЦР
10 (Clontech, Mountain View, СА).
Анализ ПЦР в режиме реального времени. Анализ проводили с использованием системы определения последовательности ABI-Prism7700 (Applied Biosystems, Foster City, СА), как это описано ранее (Ghosh et al., 2007; Brahmachari et al., 2009; Ghosh et al., 2009) , с использованием универсальной
15 мастер-смеси TaqMan и оптимизированных концентраций меченых FAM зондов и праймеров. Данные были обработаны с использованием программного обеспечения ABI Sequence Detection System 1.6.
Иммуногистохимия и количественная морфология. Спустя семь дней после интоксикации МРТР, мыши были умерщвлены, и их головной мозг был
20 фиксирован, погружен и обработан для окрашивания тирозингидроксилазой (ТН) и тионином, как это было описано ранее (Benner et al., 2004; Ghosh et al., 2007; Ghosh et al., 2009). Общее количество ТН-положительных нейронов в SNpc было подсчитано стереологическим способом с использованием программного обеспечения STEREO INVESTIGATOR (MicroBrightfield, Williston, VT) и оптической
25 ректификационной колонки. Количественный анализ иммуноокрашивания ТН полосатого тела проводился в соответствии с описанием (Benner et al., 2004; Ghosh et al., 2007; Ghosh et al., 2009). Измерения оптической плотности были получены с использованием анализа цифровой визуализации (Scion, Frederick, MD). Оптическая плотность ТН полосатого тела отображала допаминергическую
30 иннервацию волокон. Для иммунофлуоресцентного окрашивания свежих замороженных срезов, использовали крысиное антимышиное антитело CD11 b (1:100), антимышиное антитело козы GFAP (1:100), антитело кролика к NF-кВ р65 (1:100), антитело козы к NF-кВ р65 (1:100), антитело кролика к фосфо-р65 (1:100) и кроличье антимышиное антитело iNOS (1:250). Образцы были помещены и
контролировались с использованием конфокального микроскопа с лазерным сканированием Bio-Rad MRC1024ES.
Анализы ВЭЖХ. Уровни допамина в полосатом теле, DOPAC (3, 4-дигидрофенилуксусной кислоты) и HVA (гомованилиновой кислоты) были 5 подвергнуты количественному анализу, как это было описано ранее (Ghosh et al., 2007; Ghosh et al., 2009 ; Roy et al., 2010). Краткое описание: мыши были умерщвлены смещением шейных позвонков спустя 7 дней после интоксикации МРТР, и их полосатые тела были собраны и немедленно заморожены на сухом льду и хранили при -80С до момента проведения анализов. На день анализа,
10 ткани были подвергнуты воздействию ультразвуком в 0,2М перхлористой кислоты, содержащей изопротеренол, и полученные гомогенаты были центрифугированы при 20000 х g в течение 15 мин при 4С. После корректировки рН и фильтрации, 10 мкл супернатанта было введено в колонку Eicompak SC-30DS (полная отдельно стоящая система ВЭЖХ-ECD EiCOMHTEC-500 производства JM Science Inc.,
15 Grand Island, NY) и проанализировано с соблюдением протокола производителя.
МРР+ был измерен, как это описано ранее. Краткое описание: nigra, отобранное у мышей спустя 3 ч после последней инъекции МРТР, было гомогенизировано в 0,2 М перхлорной кислоты и обработано, как это описано выше. Затем супернатанты были проанализированы в разделительном модуле
20 Waters 2695 системы ВЭЖХ с использованием разделительной колонки Phenomenex Luna С18 (250 * 4,6VIM; 280 нм д лина волны УФ) с изократическим градиентом, состоящим из подвижной фазы А (18Лм"ода с 0,01 М Н зР04) и подвижной фазой В (ацетонитрил с 0,01 М Н3РО4) (1:4) при скорости потока 0,15 мл/мин.
25 Бихевиоральные анализы. Проводилось два типа бихевиоральных
экспериментов. Они включали эксперимент в открытом пространстве для изучения локомоторной активности и тест вращающегося стержня для изучения передвижения конечностей, как это описано ранее (Ghosh et al., 2007; Ghosh et al., 2009; Roy et al., 2010). Локомоторная активность была измерена спустя 7 дней
30 после последней дозы введения МРТР с использованием Digiscan Monitor (Omnitech Electronics, Inc., Columbus, ОН). Такой монитор Digiscan Monitor записывает стереотипию и рост, т.е. поведенческие реакции, которые напрямую контролируются полосатым телом, а также другие основные локомоторные параметры, такие как горизонтальная активность, общее пройденное расстояние,
35 количество движений, время движений, время отдыха, среднее расстояние и
среднее время. Перед любым инсультом или лечением, мыши были помещены внутри монитора инфракрасной активности Digiscan в течение 10 мин ежедневно, и на вращающийся стержень в течение 10 мин ежедневно в течение 3 последовательных дней для тестирования мышей и записи основных параметров 5 мышей. Краткое описание: животных забирали прямо из их клеток и осторожно помещали (головой вперед) в определенный угол открытого аппарата, и после высвобождения мыши записывали данные с интервалом каждые 5 минут. Программное обеспечение DIGISCAN использовали для анализа и хранения данных горизонтальной и вертикальной активности, которые проходили
10 автоматический мониторинг инфракрасными лучами. В ходе теста вращающегося стержня при различных скоростях отмечалось движение конечностей мышей. В целях избежания стресса и утомляемости, мышам давали отдых с интервалом в 5 мин. Затем спустя 7 дней после последней дозы МРТР, анализы на открытом пространстве и тест вращающегося стержня проводили дважды с интервалом в 6
15 ч для каждой мыши отдельно (Ghosh et al., 2007; Ghosh et al., 2009; Roy et al., 2010). Значения локомоторной активности были проанализированы после сравнения с исходным значением.
Статистические данные. Все значения представлены как среднее значение + стандартная погрешность средней величины. Однофакторный
20 дисперсионный анализ ANOVA был проведен для анализа дозозависимого влияния RNS60 на экспрессию мРНК iNOS, ИЛ-1Ь и IkBa в активированных микроглиальных клетках. В других случаях использовали f-критерий Стьюдента для сравнения результата между двумя группами (например, контроля в сравнении с МРТР, МРТР в сравнении с RNS60 и т.д.).
Результаты:
RNS60 уменьшает экспрессию провоспалительных молекул в активированной микроглии и астроглии мышей: известно, что активированная микроглия и астроглия вырабатывают избыточное количество NO и
30 провоспалительных цитокинов с потенциалом повреждения допаминергических нейронов. Нейротоксический эффект МРТР зависит от его конверсии в МРР+. В глиальных клетках моноаминоксидаза В преобразовывает МРТР в МРР+, что затем ведет к глиальной активации (REF). Таким образом, нами было впервые исследована способность RNS60 супрессировать МРР+-индуцированную
35 экспрессию iNOS и ИЛ-13 в микроглии. RNS60 дозозависимым образом
ингибировал экспрессию мРНК iNOS и ИЛ-1 В в микроглиальных клетках BV-2. Такой эффект был специфичен для RNS60, т.к. необработанный ФР из этой же самой партии не приводил к такому ингибирующему эффекту. Кроме МРР+, много других стимулов способны активировать глиальные клетки, включая LPS, который 5 является прототипичным индуктором различных провоспалительных молекул в различных типах клеток, включая микроглию мышей. Первичные клетки микроглии мышей, предварительно инкубированные с RNS60 и ФР в течение 2 ч, были стимулированы LPS. Как ожидалось, LPS индуцировал экспрессию белка iNOS в первичной микроглии. RNS60, в отличие от ФР, заметно супрессировал LPS-
10 индуцированную экспрессию iNOS в микроглии.
Кроме микроглии, существуют и другие глиальные клетки в ЦНС. Например, астроглия представлена основными глиальными клетками в ЦНС, и активация астроглии участвует в патогенезе тяжелых нейродегенеративных заболеваний. Ранее нами было показано, что ИЛ-1 В является сильным индуктором iNOS в
15 астроглии. Таким образом, мы исследовали эффект RNS60 на экспрессию iNOS в ИЛ-1В-стимулированной первичной астроглии. Подобно микроглии, RNS60 в этом случае заметно ингибировал ИЛ-1В-стимулированный iNOS в первичной астроглии мышей, в то время, как ФР не имел такого эффекта. Результаты (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) показывают, что
20 RNS60 был нетоксичным для микроглии или астроглии в любой из исследуемых концентраций, что позволяет предположить, что ингибирующий эффект RNS60 на глиальную экспрессию iNOS не был вызван каким-либо изменением в жизнеспособности клеток.
RNS60 ингибирует микроглиальную активацию NF-кВ: LPSI другие
25 воспалительные стимулы, включая МРР+, как это известно, индуцируют экспрессию iNOS посредством активации NF-кВ. Принимая во внимание, что RNS60 снижал экспрессию iNOS в глиальных клетках, нами был изучен эффект RNS60 на активацию NF-кВ. Активация NF-кВ контролировалась по связыванию ДНК и транскрипционной активности NF-кВ. Стимуляция микроглиальных клеток
30 BV-2 LPS приводила к индукции ДНК-связующей активности NF-кВ. Однако RNS60 ингибировал LPS-индуцированную ДНК-связующую активность NF-кВ В микроглиальных клетках. Нами был изучен эффект RNS60 на транскрипционную активность NF-кВ. Как и ожидалось, LPS индуцировал NF -кВ-зависимую транскрипцию люциферазы. Соответствуя эффекту RNS60 на ДНК-связующую
35 активность NF-кВ, RNS60 также супрессировал транскрипционную активность NF
кВ в LPS-стимулированной микроглии. Такие результаты были специфическими, поскольку ФР не обладал таким ингибирующим эффектом. Такие результаты показывают, что RNS60 снижает экспрессию iNOS супрессией активации NF-KB. RNS60 повышает экспрессиюкВа в глиальных клетках . Несмотря на 5 наличие множественных механизмов, с помощью которых противовоспалительная молекула может супрессировать активацию NF-кВ, В ПОКОЯЩИХСЯ клетках , классический гетеродимер р65:р50 фиксируется в цитоплазме действиемсВа в виде инактивного комплекса. Также было показано, что новые синтезированные белки rtBa накапливаются в цитоплаз ме, а также ядре, где они снижают
10 связывание NF-кВ. Таким образом, нами была выдвинута гипотеза, что RNS60 может повышать экспрессиноВа для супрессии активации классического гетеродимера NF-кВ. Интересно, что RNS60, в отличие от ФР, заметно повышал экспрессию белка KlBa в микроглиальных клетках в зависимости от времени. Значительное повышение белкакВа наблюдалось в течение только 30 мин
15 воздействия RNS60. Такой эффект был специфичен, поскольку RNS60 не повышал экспрессию RelA р65. Данные ПЦР в режиме реального времени выявили заметное и зависящее от времени повышение мРНК kBa под действием RNS60, в отличие от ФР. Подобным образом, RNS60 дозозависимым образом повышал экспрессию rtBa, в отличие от р65 и р50. Для подтверждения такой
20 повышенной экспрессии 1кВа с другой точки зрения, нами также была проведена двухмаркерная иммунофлуресценция. RNS60, в отличие от ФР, значительно повышал экспрессию к1Ва в CD11b -положительной первичной микроглии. Для изучения клеточной специфичности повышения RNS60 экспрессии 1кВа, мы в дальнейшем подвергнули воздействию RNS60 первичные астроциты. Подобно
25 своему эффекту в микроглии, RNS60 также повышал экспрессиюЗЬ в GFAP положительной астроглии.
Активация фосфатидилинозитол-3 (Pl-З) киназы в микроглии под действием RNS60. Затем мы исследовали механизмы, с помощью которых RNS60 может передавать сигналы для повышения экспрек€ки RNS60
30 содержит наноструктуры со стабилизированным зарядом, которые имеют потенциал взаимодействовать с мембраной клеток. Поскольку активация PI-3 киназы, двойного белка и липидной киназы, возникает в тесной взаимосвязи с мембраной клеток, мы исследовали эффект RNS60 на активацию Pl-З киназы. Класс IA Pl-З киназы, который регулируется рецептором тирозинкиназ, состоит из
35 гетеродимера с регуляторной субъединицей 85 кДа и каталитической
субъединицей 110 кДа (p85:p1tJ0B). С другой стороны, класс IB PI -3 киназы состоит из димера регуляторной субъединицы 101 кДа и каталитической субъединицы р11(у (р101/р110у).Интересно, что нами было выявлено, что RNS60, в отличие от ФР, заметно индуцировал активацию р8 & -ассоциированной 5 Pl-З киназы в течение 15 минут воздействия, о чем свидетельствует активность липидной киназы, что указывает на то, что RNS60 индуцирует активацию класса IA Pl-З киназы. Однако RNS60 не активировал р101-ассоциированную активность Pl-З киназы, указывая на то, что он не способен активировать класс IB Pl-З киназы. Затем мы пытались идентифицировать каталитическую субъединицу
10 класса IA Pl-З киназы, которая участвует в данной активности липидной киназы. Регуляторная субъединица р85а может связывать саму себя с р110а и/или р110(3. При проведении иммунокомплексного анализа липидной киназы мы отмечали, что RNSeO-индуцированная активация Pl-З киназы была вызвана р110а и р110(3.
Активация AM в микроглии под действием RNS60. PI 3-киназы были
15 связаны с дифференцированной группой клеточных функций, и большая часть таких функций относится к способности класса I PI 3-киназ активировать протеинкиназу В (РКВ, или Akt). Таким образом, мы изучали способность RNS60 активировать Akt в микроглии. Подобно активации Pl-З киназы, RNS60 заметно индуцировал активацию Akt при стимуляции в течение 30 и 60 мин, как это
20 доказано иммуноблоттингом фосфо-Akt, без увеличения уровня общего количества Akt. ФР не обладал подобным эффектом на фосфорилирование Akt. Анализ иммунофлуоресценции фосфо-Akt и общего содержания Akt в RNS60-обработанной микроглии также подтверждает результат того, что RNS60, в отличие от ФР, индуцирует активацию Akt в микроглии.
25 Принимая во внимание индукцию RNS60 активации пути передачи сигнала
PI-3 киназы-Akt, мы исследовали возможность RNS60 использовать в данном пути для проявления своей противовоспалительной активности. Мы исследовали эффект LY294002, ингибитора Pl-З киназы, и Aktl, ингибитора Akt, на RNS60-опосредованный противовоспалительный эффект. Как и ожидалось,
30 бактериальный LPS индуцировал выработку NO и экспрессию белка iNOS в микроглии. RNS60 также заметно ингибировал выработку NO и экспрессию белка iNOS в LPS-стимулированных клетках микроглии. Однако LY294002 и Aktl упраздняли ингибирующий эффект RNS60 на индукцию iNOS в LPS-стимулированных микроглиальных клетках, указывая на вовлечение пути PI-3
35 киназа-Akt в RNS60-oпocpeдoвaннoй супрессии iNOS. Затем мы исследовали
необходимость RNS60 для пути PI-3 киназа-Akt для повышения экспрессии 1кВа и супрессии активации NF-кВ. Подобно регуляции iNOS, LY и Aktl также упраздняли RNSeO-опосредованное повышение экспрессии 6eBiaai IMPHK И элиминировали RNSeO-опосредованное ингибирование активации NF-кВ В LPS-5 стимулированных микроглиальных клетках.
Для дополнительного подтверждения такого наблюдения, мы трансфицировали микроглиальные клетки BV-2 доминант-отрицательным мутантом р85а. Экспрессия доминант -отрицательного мутанта р85а, в котором меж-5Н2 участок, необходимый для связывания субъединицы р110а/8, разрушен,
10 приводит к ингибированию активности PI 3-киназы в различных типах клеток, включая глиальные клетки С6 и глиальные клетки BV-2, указывая, что гиперэкспрессивный доминант-отрицательный мутантный белок р85а не связан с каталитической субъединицей PI 3-киназы. Как это было доказано вестерн-блоттингом и ПЦР в режиме реального времени, RNS60 индуцировал экспрессию
15 белка кВа и мРНК в пустых, трансфицированных вектором, но не трансфицированных р85а, микроглиальных клетках. Такие результаты указывают, что RNS60 повышает экспрессию кВа и проявляет свой противовоспалительный эффект в микроглиальных клетках посредством пути передачи сигнала PI-3 киназа-Akt.
20 Затем мы исследовали тот факт, достаточно ли только активации PI-3
киназы для индуцирования экспрессмпВа! в микроглии. Сообщалось, что экспрессии р110* (конститутивно-активного мутанта р110а/В), в отличие от р110-kd (мутант с подавленной киназной активностью), достаточно для способствования транслокации Glut 4 в адипоцитах. Таким образом, для повышения активности
25 р110а/3, микроглиальные клетки мыши были трансфицированы р110*. Ранее нами было показано, что экспрессия р110*, в отличие от p110-kd, повышает активность липидной киназы PI 3-киназы в астроглиальных клетках человека. Гиперэкспрессия р110*, в отличие от пустого вектора, была способна повышать мРНК и экспрессию белка кВа. С другой стороны, p110-kd не обладал каким-либо
30 эффектом на экспрессию Ша. Эти результаты показывают, что активации PI -3 киназы достаточно для индуцирования микроглиальной экспрессии 1кВа.
Т.к. RNS60 повышал уровень противовоспалительной молекулюВа!в микроглии и астроглии in vitro, мы исследовали способность RNS60 увеличивать уровень 1кВа in vivo в nigra мышей, подвергнутых воздействию МРТР. Несмотря на
35 то, что интоксикация МРТР заметно индуцировала астроглиоз и микроглиоз in vivo
в SNpc, о чем свидетельствовало повышение GFAP и CD11Ь, мы отмечали маргинальное снижение экспрессикВЬ после воздействия МРТР. Однако, подобно своему эффекту в культивированных астроцитах и микроглии, воздействие RNS60 по существу повышало уровены4Ва в GFAP -положительной 5 астроглии и CDHb-положительной микроглии in vivo в SNpc МРТР-интоксицированных мышей.
Поскольку воздействие RNS60 повышало экспрессию 1кВа, специфического ингибитора NF-кВ, МЫ исследовали возможность супрессии воздействия RNS60 активации NF-кВ in vivoe SNpc мышей под воздействием МРТР. Показатель NF -
10 кВ отслеживали в SNpc в течение семи дней после последней инъекции МРТР.
Интоксикация МРТР привела к заметной индукции RelA р65 в SNpc в сравнении с
воздействием физиологическим раствором. Двухмаркерный
иммунофлуоресцентный анализ выявил, что р65 секретировался в основном в GFAP-положительной астроглии и CD11 b-положительной микроглии. Кроме
15 индуцированной стимулом транслокации ядра NF-кВ, было показано, что индуцированное стимулом фосфорилирование р65 играет ключевую роль в активации транскрипции после транслокации ядра. В соответствии с этим, уровень фосфо-р65 также был заметно выше в SNpc МРТР-интоксицированных мышей в сравнении с мышами, подвергнутыми воздействию физиологическим
20 раствором, что подтверждает активацию NF-кВ in visro SNpc мышей,
подвергнутых воздействию МРТР. Однако RNS60 сильно ингибировал индукцию всего р65, а также фосфо-р65 in vivo в SNpc МРТР-интоксицированных мышей. При подобных условиях, ФР не ингибировал индукцию р65 и фосфорилирование р65.
25 Воспаление играет роль в потере допаминергических нейронов при БП и ее
животной модели. Поскольку RNS60 ингибировал экспрессию iNOS в глиальных клетках и супрессировал активацию NF-кВ in Bivonigra МРТР интоксицированных мышей, мы исследовали способность RNS60 супрессировать экспрессию iNOS in vivo в SNpc мышей, подвергнутых воздействию МРТР.
30 Иммунофлуоресцентный анализ iNOS вентральных участков среднего мозга выявил, что интоксикация МРТР приводила к заметному повышению экспрессии белка nigra iNOS и со-локализации iNOS с GFAP-положительной астроглией и CD11Ь-положительной микроглией. Однако воздействие на мышей RNS60, в отличие от ФР, привело к заметной супрессии iNOS in vivo в nigra.
RNS60 защищал от МРТР-индуцированной нейродегенерации. Мышам дважды в день вводили RNS60 и ФР посредством и/п инъекции, начиная с дня 2 перед инъекцией МРТР и спустя семь дней после последней инъекции МРТР, после чего животные были подвергнуты количественной оценке на предмет 5 допаминергических клеточных телец в SNpc и наличия допаминергических волокон в striatum с использованием иммуноокрашивания ТН. Интоксикация МРТР привела примерно к 70% потере SNpc ТН-положительных нейронов и 75% снижению ТН OD полосатого тела в сравнении с контрольными животными под воздействием физиологического раствора. Однако у мышей, которым вводили
10 МРТР и RNS60, отмечалось меньшее снижение SNpc ТН-положительных нейронов и ТН OD полосатого тела. С другой стороны, такие защитные эффекты не отмечались у МРТР-интоксицированных мышей, подвергнутых воздействию ФР. Затем для определения возможности защиты RNS60 от биохимического дефицита, вызванного МРТР, мы подсчитали уровень допамина (DA) в полосатом
15 теле спустя 7 дней после воздействия МРТР. Интоксикация МРТР привела примерно к 80% снижению DA полосатого тела в сравнении с полосатым телом мышей, подвергнутых воздействию физиологическим раствором. В отличие от этого, МРТР-интоксицированные животные, получавшие RNS60, характеризовались 50% снижением допамина в полосатом теле, в то время как
20 такая защита не отмечалась в случае воздействия ФР.
RNS60 улучшал локомоторные функции у МРТР-интоксицированных мышей. Конечной терапевтической целью нейропротекции является снижение функционального нарушения. Таким образом, для исследования защиты RNS60 не только от структурного и нейропередаточного повреждения, но также и от
25 функционального недостатка, вызванного МРТР, мы проводили мониторинг локомоторной активности и активности на открытом пространстве. Инъекция МРТР вызвала заметное снижение теста координации движений, времени движения, количества движений, горизонтальной активности, общего расстояния, вертикального движения и стереотипии. С другой стороны, МРТР привело к
30 повышению времени отдыха. Однако RNS60, в отличие от ФР, по существу улучшил МРТР-индуцированную гиполокомоцию.
Нейропротекция, наблюдаемая при воздействии RNS60, также могла быть вызвана ингибированием МРТР для преобразования МРР+ в глии. Для выяснения такой возможности, мы измерили уровень МРР+ в nigra спустя 3 ч после
35 финальной инъекции МРТР. Несмотря на то, что ФР не обладал каким-либо
эффектом на уровень МРР+ в nigra, было удивительно, что RNS60 повышал
способность МРР+ в nigra в шесть раз. Вместе такие результаты указывают, что,
несмотря на заметное повышение способности МРР+ в nigra, RNS60 защищает
nigrostriatum у мышей под воздействием МРТР.
5 В заключение следует отметить, что мы доказали противовоспалительные
эффекты RNS60 посредством (класс IA Р1-ЗК-АМ)-опосредованной повышенной экспрессии кВа и ингибирования активации NF -кВ. Мы также показали, что RNS60 повышает экспрессиюВй и блокирует активацию NF -кВ в SNpc, ингибирует экспрессию iNOS в nigra, защищает от потери допаминергических
10 нейронов в nigra, сохраняет волокна ТН в полосатом теле и нейропередатчиках, и улучшает бихевиоральные функции МРТР-интоксицированных мышей. Такие результаты подчеркивают новейшие биологические свойства RNS60 и указывают, что RNS60 может использоваться для терапевтического вмешательства при таупатиях и других нейродегенеративных нарушениях в качестве первичной или
15 адъюнктивной терапии.
Включение посредством ссылки. Все указанные выше патенты США, публикации заявок на патенты США, заявки на патенты США, иностранные патенты, заявки на иностранные патенты и непатентные заявки, указанные в тексте данной заявки
20 и/или перечисленные в Инструкции по применению, включены сюда во всей своей полноте посредством ссылок.
Следует понимать, что графические материалы и представленное детальное описание предоставлены скорее в иллюстративной, а не ограничивающей форме, и не предполагают ограничивать изобретение
25 отдельными формами и представленными примерами. С другой стороны, изобретение включает любую дополнительную модификацию, изменения, перегруппирование, замены, альтернативы, проектные решения и варианты воплощения изобретения, которые очевидны для специалиста в данной области без отклонения от принципов и объема данного изобретения, как это определено
30 в представленной ниже формуле изобретения. Таким образом, предполагается, что представленная ниже формула изобретения может быть интерпретирована для включения всех таких дополнительных модификаций, изменений, перегруппировок, замен, альтернатив, проектных решений и вариантов воплощения изобретения.
Описанные выше варианты воплощения изобретения отображают различные компоненты, содержащиеся или связанные с другими различными компонентами. Следует понимать, что такие представленные структуры являются типичными, и что на деле может использоваться много других структур с 5 достижением подобной функциональности. В концептуальном понятии, любая перегруппировка компонентов для достижения подобной функциональности эффективно "ассоциирована", что позволяет достичь требуемой функциональности. Таким образом, любые два компонента скомбинированы для достижения отдельной функциональности, что может рассматриваться как
10 "ассоциированные с" друг с другом таким образом, что достигается требуемая функциональность, независимо от структуры или промежуточных компонентов. Подобным образом, любые два компонента ассоциированы и могут называться как "функционально связанные" или "функционально соединенные" друг с другом для достижения требуемой функциональности.
15 В то время, как были показаны и описаны отдельные варианты воплощения
данного изобретения, специалисту в данной области станет очевидно, что, основываясь на представленных здесь принципах, изменения и модификации могут быть внесены без отклонения от данного изобретения и его более широких аспектов и, следовательно, прилагаемая формула изобретения охватывает все
20 такие изменения и модификации, которые включены в принципы и объем данного изобретения. Кроме того, следует понимать, что изобретение определяется исключительно прилагаемой формулой изобретения. Специалисту в данной области следует понимать, что, в целом, используемые здесь термины, и, в частности, прилагаемая формула изобретения (например, пункты прилагаемой
25 формулы изобретения), обычно считаются "открытыми" терминами (например, термин "включать" следует интерпретировать как "включать, но не ограничиваться", термин "обладать" следует интерпретировать как "имеет, по меньшей мере", термин "включает" следует интерпретировать как "включает, но не ограничиваете я и т.д.). Специалис у в данной облас и с вдует в
30 дальнейшем понимать, что при указании специфического количества в заявленной формуле изобретения, данное значение будет четким образом представлено в формуле изобретения, и отсутствие такого указания данное значение не предусматривает. Например, для облегчения понимания, представленная ниже прилагаемая формула изобретения может содержать
35 использование вводных фраз "по меньшей мере, один" и "один или более" для
введения декламации формулы изобретения. Однако использование таких фраз не должно рассматриваться как подразумевание того, что такое введение в формуле изобретения под неопределенным артиклем ограничивает любую отдельную формулу изобретения, содержащую такие вводные слова, в варианты 5 воплощения изобретения, содержащие только одну из таких фраз, даже если одна и та же формула изобретения включает вводные фразы "один или более" или "по меньшей мере, один" и неопределенные артикли, такие как "а" или "ап" (например, "а" и/или "ап" следует обычно интерпретировать как обозначение "по меньшей мере, одного" или "одного или более"); тоже самое справедливо и для
10 использования определенных артиклей для введения вводных слов в формулу изобретения. Кроме того, даже если в формуле изобретения указано специфическое число четким образом, специалисту в данной области станет очевидно, что такое обозначение обычно должно интерпретироваться как обозначение, по меньшей мере, указанного числа (например, простое указание
15 "двух обозначений" без других модификаторов, обычно обозначает, по меньшей мере, два обозначения или два или более обозначений). В соответствии с этим, изобретение не ограничено, за исключением прилагаемой формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение электрокинетически измененной водной жидкости для приготовления препарата для лечения таупатии или, по меньшей мере, одного из ее симптомов, при этом жидкость включает ионный водный раствор кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом, которые преимущественно имеют средний диаметр менее, чем примерно 100 нанометров и стабильно конфигурированы в ионной водной жидкости в количестве, достаточном для модуляции фосфорилирования и/или агрегации тау-белка, преимущественно снижения фосфорилирования и/или агрегации тау-белка, для обеспечения лечения таупатии или, по меньшей мере, одного из ее симптомов у субъекта.
2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что содержащие кислород наноструктуры со стабилизированным зарядом стабильно конфигурированы в ионных водных жидкостях в количестве, достаточном для обеспечения, при контакте живой клетки с жидкостью, модуляции, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны.
3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что содержащие кислород наноструктуры со стабилизированным зарядом являются основными видами содержащих газ наноструктур со стабилизированным зарядом в жидкости.
4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что процент растворенных молекул кислорода, присутствующих в жидкости в виде содержащих кислород наноструктур со стабилизированным зарядом, является процентом, выбираемым из группы, состоящей из более, чем: 0,01%, 0,1%, 1%, 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40%; 45%; 50%; 55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; и 95%.
5. Применение по п. 1, отличающееся тем, что общий растворенный кислород по существу присутствует в содержащих кислород наноструктурах со стабилизированным зарядом.
6. Применение по п. 1, отличающееся тем, что содержащие кислород наноструктуры со стабилизированным зарядом преимущественно имеют средний диаметр менее, чем размер, выбираемый из группы, состоящей из: 90 нм; 80 нм; 70 нм; 60 нм; 50 нм; 40 нм; 30 нм; 20 нм; 10 нм; и менее, чем 5 нм.
7. Применения по п. 1, отличающееся тем, что ионный водный раствор включает физиологический раствор.
1.
8. Применение по п. 1, отличающееся тем, что жидкость супероксигенирована.
9. Применение по п. 1, отличающееся тем, что жидкость включает форму сольватированных электронов.
10. Применение по п. 1, отличающееся тем, что изменение
электрокинетически измененной водной жидкости включает воздействие на
жидкость гидродинамически-индуцированными, локализированными
электрокинетическими эффектами.
11. Применение по п. 10, отличающееся тем, что воздействие локализированными электрокинетическими эффектами включает воздействие, по меньшей мере, импульсов напряжения или импульсов тока.
12. применение по п. 10, отличающееся тем, что воздействие на
жидкость гидродинамически-индуцированными, локализированными
электрокинетическими эффектами включает воздействие на жидкость
электрокинетическими эффект-индуцирующими структурными параметрами
устройства, используемого для получения жидкости.
13. Применение по п. 1, отличающееся тем, что таупатия включает, по меньшей мере, одно заболевание, выбираемое из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, аргирофильной зернистости, лобно-височной деменции, прогрессирующего надъядерного паралича, кортико-базальной дегенерации, лобно-височной лобарной дегенерации (болезни Пика) и Dementia pugilistica (DP) (известной также как деменция боксеров, хроническая энцефалопатия боксеров).
14. Применение по п. 13, отличающееся тем, что таупатия включает, по меньшей мере, одно заболевание аргирофильной зернистости, лобно-височной деменции, прогрессирующего надъядерного паралича, кортико-базальной дегенерации, лобно-височной лобарной дегенерации (болезни Пика).
15. Применение по п. 14, отличающееся тем, что таупатия включает лобно-височную деменцию.
16. Применение по п. 1, отличающееся тем, что, по меньшей мере, один симптом относится, по меньшей мере, к одному состоянию, выбираемому из группы, состоящей из хронического воспаления в центральной нервной системе и головном мозге, и острого воспаления в центральной нервной системе и головном мозге.
1.
17. Применение по п. 1, отличающееся тем, что электрокинетически измененная водная жидкость модулирует локализированные или клеточные уровни оксида азота.
18. Применение по п. 1, отличающееся тем, что электрокинетически измененная водная жидкость способствует локализированному снижению в месте введения, по меньшей мере, одного цитокина, выбираемого из группы, состоящей из: ИЛ-1 бета, ИЛ-8, ФНО-альфа и ФНО-бета.
19. Применение по п. 1, отличающееся тем, что лечение дополнительно включает одновременное или адъюнктивное применение другого противовоспалительного агента для синергического или несинергического ингибирования или снижения воспаления.
20. Применение по п. 19, отличающееся тем, что указанный второй противовоспалительный агент включает стероид или глюкокортикоидный стероид.
21. Применение по п. 20, отличающееся тем, что глюкокортикоидный стероид включает Будесонид или его активное производное.
22. Применение по п. 1, отличающееся тем, что лечение дополнительно включает комбинированную терапию, при этом пациенту вводят, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент.
23. Применение по п. 22, отличающееся тем, что, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент выбирают из группы, состоящей из: глатирамера ацетата, интерферона-Э, митоксантрона, натализумаба, ингибиторов ММР, включая ингибитор ММР-9 и ММР-2, краткодействующие 3 2-агонисты, В 2-агонисты продолжительного действия, антихолинергические препараты, кортикостероиды, системные кортикостероиды, стабилизаторы тучных клеток, модификаторы лейкотриенов, метилксант0ны, 2-агонисты, альбутерол, левальбутерол, пирбутерол, артформотерол, формотерол, сальметерол, антихолинергические препараты, включая ипратропиум и тиотропиум; кортикостероиды, включая беклометазон, будесонид, флунисолид, флутиказон, мометазон, триамцинолон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон; модификаторы лейкотриенов, включая монтелукаст, зафирлукаст и зилеутон; стабилизаторы тучных клеток, включая кромолин и недокромил; метилксантины, включая теофиллин; комбинированные препараты, включая ипратропиум и альбутерол, флутиказон и сальметерол, будесонид и формотерол;
1.
антигистамины, включая гидроксизин, дифенгидрамин, лоратадин, цетиризин и гидрокортизон; препараты-модуляторы иммунной системы, включая такролимус и пимекролимус; циклоспорин; азатиоприн; микофенолата мофетил; и их комбинации.
24. Применение по п. 22, отличающееся тем, что, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент представлен TSLP и/или антагонистом TSLPR.
25. Применение по п. 24, отличающееся тем, что TSLP и/или антагонист TSLPR выбирают из группы, состоящей из нейтрализующих антител, специфичных к TSLP и рецептору TSLP, растворимых молекул рецептора TSLP и белков слияния рецептора TSLP, включая молекулы TSLPR-иммуноглобулин Fc или полипептиды, кодирующие компоненты более, чем одной цепи рецептора.
26. Применение по п. 2, отличающееся тем, что лечение включает модуляцию, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны, включающую модуляцию, по меньшей мере, одной структуры клеточной мембраны или функции, включающей модуляцию, по меньшей мере, одной конформации, лиганд-связущей активности или каталитической активности связанного с мембраной белка.
27. Применение по п. 26, отличающееся тем, что мембран-ассоциированный белок включает, по меньшей мере, один белок, выбираемый из группы, состоящей из рецепторов, трансмембранных рецепторов, белков ионных канальцев, внутриклеточных присоединенных белков, белков клеточной адгезии и интегринов.
28. Применение по п. 27, отличающееся тем, что трансмембранный рецептор включает сопряженный с G-белком рецептор (GPCR).
29. Применение по п. 28, отличающееся тем, что с отряженный с G-белком рецептор (GPCR) взаимодействует с а-субъединицей G-белка.
30. Применение по п. 29, отличающееся тем, что а-субъединица G-белка включает, по меньшей мере, одну субъединицу, выбираемую из группы, состоящей из Gas, Gcij, Gaq и Gai2.
31. Применение по п. 30, отличающееся тем, что, по меньшей мере, одна а-субъединица G-белка представлена Gaq.
24.
32. Применение по п. 2, отличающееся тем, что лечение включает модуляцию проводимости клеточной мембраны, включая модуляцию проводимости всей клетки.
33. Применение по п. 32, отличающееся тем, что лечение включает модуляцию проводимости всей клетки, включая модуляцию, по меньшей мере, одного потенциалозависимого сигнала проводимости всей клетки.
34. Применение по п. 2, отличающееся тем, что лечение включает модуляцию, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны, включая модуляцию внутриклеточной передачи сигнала, включая модуляцию кальций-зависимых путей или систем передачи сигналов в клетке.
35. Применение по п. 2, отличающееся тем, что лечение включает модуляцию, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны, включая модуляцию внутриклеточной передачи сигнала, включая модуляцию активности фосфолипазы С.
36. Применение по п. 2, отличающееся тем, что лечение включает модуляцию, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны, включая модуляцию внутриклеточной передачи сигнала, включая модуляцию активности аденилатциклазы (АЦ).
37. Применение по п. 2, отличающееся тем, что лечение включает модуляцию, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны, включая модуляцию внутриклеточной передачи сигнала, связанной, по меньшей мере, с одним состоянием или симптомом, выбираемым из группы, состоящей из: хронического воспаления в центральной нервной системе и головном мозге и острого воспаления в центральной нервной системе и головном мозге.
38. Применение по п. 1, отличающееся тем, что лечение включает введение в систему клеток или слой, и дополнительно включает модуляцию внутриклеточного контакта.
39. Применение по п. 38, отличающееся тем, что внутриклеточный контакт включает, по меньшей мере, контакт, выбираемый из группы, состоящей из плотных контактов, щелевых контактов, опоясывающих контактов и десмосом.
40. Применение по п. 38, отличающееся тем, что система клеток или слоев включает, по меньшей мере, одну, выбранную из группы, состоящей из
24.
эндотелиальных клеток и плотных контактов эндотелия и астроцитов в сосудах ЦНС, плотных контактов крови-спинномозговой жидкости или барьера, контактов по типу легочного эпителия, контактов по типу бронхиального эпителия и контактов по типу кишечного эпителия.
41. Применение по п. 1, отличающееся тем, что электрокинетически измененная водная жидкость оксигенирована, и при этом кислород в жидкости присутствует в количестве, по меньшей мере, 8 промилле, по меньшей мере, 15 промилле, по меньшей мере, 25 промилле, по меньшей мере, 30 промилле, по меньшей мере, 40 промилле, по меньшей мере, 50 промилле, или, по меньшей мере, 60 промилле кислорода при атмосферном давлении.
42. Применение по п. 1, отличающееся тем, что количество кислорода, присутствующего в кислородсодержащих наноструктурах со стабилизированным зарядом в электрокинетически измененной жидкости составляет, по меньшей мере, 8 промилле, по меньшей мере, 15 промилле, по меньшей мере, 20 промилле, по меньшей мере, 25 промилле, по меньшей мере, 30 промилле, по меньшей мере, 40 промилле, по меньшей мере, 50 промилле или, по меньшей мере, 60 промилле кислорода при атмосферном давлении.
43. Применение по п. 1, отличающееся тем, что электрокинетически измененная водная жидкость включает, по меньшей мере, одну из форм сольватированных электронов и электрокинетически модифицированные или заряженные виды кислорода.
44. Применение по п. 43, отличающееся тем, что форма сольватированных электронов или электрокинетически модифицированных или заряженных видов кислорода присутствуют в количестве, по меньшей мере, 0,01 промилле, по меньшей мере, 0,1 промилле, по меньшей мере, 0,5 промилле, по меньшей мере, 1 промилле, по меньшей мере, 3 промилле, по меньшей мере, 5 промилле, по меньшей мере, 7 промилле, по меньшей мере, 10 промилле, по меньшей мере, 15 промилле или, по меньшей мере, 20 промилле.
45. Применение по п. 43, отличающееся тем, что электрокинетически измененная оксигенированная водная жидкость включает сольватированные электроны, стабилизированные, по меньшей мере, частично, молекулярным кислородом.
46. Применение по п. 2, отличающееся тем, что способность модулировать, по меньшей мере, один потенциал клеточной мембраны и
41.
проводимость клеточной мембраны сохраняется в течение, по меньшей мере, двух, по меньшей мере, трех, по меньшей мере, четырех, по меньшей мере, пяти, по меньшей мере, 6, по меньшей мере, 12 месяцев или более длительных периодов в закрытом газонепроницаемом контейнере.
47. Применение по п. 26, отличающееся тем, что мембрансвязанный белок включает CCR3.
48. Применение по п. 1, отличающееся тем, что лечение таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, включает модуляцию внутриклеточной экспрессии NF-кВ И/ИЛИ активности; преимущественно, снижение экспрессии NF-кВ и/или активности.
49. Способ получения композиции терапевтического агента или комбинации, подходящей для использования в лечении таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, включающий:
получение терапевтического агента, подходящего для использования в лечении таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома у субъекта; и
комбинацию терапевтического агента с количеством электрокинетически измененной водной жидкости, включающей ионный водный раствор кислородсодержащих наноструктур со стабилизированным зарядом, которые преимущественно имеют средний диаметр менее, чем примерно 100 нанометров и стабильно конфигурированы в ионную водную жидкость в количестве, достаточном для лечения таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, при этом описан способ для создания композиции терапевтического агента или комбинации, подходящих для использования в лечении таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что содержащие кислород наноструктуры со стабилизированным зарядом стабильно конфигурированы в ионные жидкости на водной основе в количестве, достаточном для обеспечения, при контакте живой клетки с жидкостью, модуляции, по меньшей мере, одного потенциала клеточной мембраны и проводимости клеточной мембраны.
51. Фармацевтическая композиция, включающая: терапевтический агент, подходящий для использования в лечении таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома, у субъекта; и количество электрокинетически измененной водной жидкости, включающей ионный водный раствор содержащих кислород наноструктур со стабилизированным зарядом с преимущественным средним
50.
диаметром менее, чем примерно 100 нанометров и стабильно конфигурированных в ионной водной жидкости в количестве, достаточном для лечения таупатии или, по меньшей мере, одного ее симптома.
52. Фармацевтическая композиция, приготовленная согласно способу по п. 49.
53. Применение по п. 1, отличающееся тем, что лечение включает введение, по меньшей мере, местным путем, ингаляцией, интраназальным, пероральным, внутривенным (в/в) и интраперитонеальным (и/п) путем.
54. Применение по п. 1, отличающееся тем, что кислородсодержащие наноструктуры со стабилизированным зарядом электрокинетически измененной жидкости включают, по меньшей мере, одну соль или ион из представленных здесь в Таблицах 1 и 2.
55. Применение по п. 1, отличающееся тем, что субъект представлен млекопитающим, преимущественно, человеком.
56. Применение по п. 1, отличающееся тем, что лечение включает снижение фосфорилирования и/или агрегации тау-белка.
52.
400003500030000250002000015000100050000
ОИФН
шил-4
аил-Ю
?ил-5
оил-12р40
иил-б
аил-12р70
вил-8
вил-2
¦ил-fb
Т, х жидкость по '3 изобретению
]j+ Контроль
РНА о.жиДкость по Гпя изобретению
РНА + Контроль
жидкость по изобретению
контрольная вода
Фиг. 1
Фиг. ЗА
У j
Фиг. ЗС
0 mV протокол !50r I. PA
¦120 mV протокол
200г I. PA
"60 mV протокол 400г I, pA
Rev 15 мин( -120 MB
контрольный носитель (группа IF) дексаметазон (группа 2F)
исследуемый препарат (низкая доза, профилактика)
и^с^едуеМ^ьГй npenapaf (высокая доза,' " профилактика) (группа 4F) исследуемый препарат (низкая доза, лечение) ' (группа 5F) "
8 10 12 время (дни)
исследуемый препарат (высокая доза, лечение) (группа 6F)
С) ООООООО (c)ООО (c) о о о (c) о о о о о ППОПП ППЬППППППППППП П Г) о о по п п п п
-7 -6 -5 -А -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
v . . ;
время (дни)
| =МВР/СРАИНОКУ/1ЯЦИЯ
О ^профилактическое лечение (группы 3F и 4F) и введение носителя О=терапевтическое лечение (группы 5F и 6F)
8(Г
60 40 20 -О
4 контрольный носитель (группа 1F) ¦ дексаметазон (группа 2F)
д исследуемый препарат (низкая доза, профилактика) (группа 3F) ? исследуемый препарат (высокая доза, профилактика) (группа 4F) $ исследуемый препарат (низкая доза, лечение) (группа 5F) • исследуемый препарат (высокая доза, лечение) (группа 6F)
-т 22
Фиг. 9А
130т 1201 юн
100,
908070-50-
¦ контрольный носитель (группа 1F) ¦ дексаметазон (группа 2F)
дисследуемый препарат (низкая доза, профилактика) (группа 3F) П исследуемый препарат (высокая доза, профилактика) (группа 4F)
# исследуемый препарат (низкая доза, лечение) (группа 5F)
• исследуемый препарат (высокая доза, лечение) (группа 6F)
, , (
7 12 17 22
время(дни)
90.00-j 80.00 -70.0060.00 -50,0040.0030.0020.00 -10.00-
o.oo-L
формула крови на день исследования 0
исследуемый препарат (низкая доза, профилактика) (группа 3F) "
исследуемый препарат (высокая доза, профилактика) (группа 4F)
лейкоциты
(10л3)
80.00 70.00 60.0050.0040.00 30.00 н 20.0010.00 0.00
формула крови на день исследования 7
Щ контрольный носитель (группа 1F)
дексаметазон (группа 2F) Q исследуемый препарат (низкая доза, профилактика) (группа 3F) Щ исследуемый препарат (высокая доза, профилактика) (группа 4F) Щ исследуемый препарат (низкая доза, лечение) (группа 5F) 0 исследуемый препарат (высокая доза, лечение) (группа 6F)
лейкоциты ^(}л3)
Фиг. ЮС
формула крови на день исследования 21 ^контрольный носитель (группа 1F) ^дексаметазон (группа 2F)
[^исследуемый препарат (низкая доза, профилактика) (группа 3F) |Цисследуемый препарат (высокая доза, профилактика) (группа 4F)
пг/мл
ZZZZZZZZZ &
значения р
<0.01
<0.01 0.34 <0.01 0.51
~т~
дексаметазон Rev Тх Lo
лечение
1
Rev Тх Hi
Фиг. НА
ил-17
день 18
ил-ia
день 7
пг/мл
300-
200-
100-
значения р
<0.01
<0.01
0.27
<0.01 0.88
-т~
дексаметазон Rev Тх Lo
лечение
Rev Тх Hi
Фиг. НС
ил _1а
день 18
ил-1/3
день 7
пг/мл
94 876543
значения р
0.07
<0.01 0.34 <0.01 0.17
дексаметазон Rev Jx Lo
лечение
!
Rev Тх Hi
Фиг. НЕ
ил -4
день 7
ил _4
день 18
лечение
iNOS
И7Н0-
GAPDH
TUNEL
DAPI
погружение
А01-42 + RNS60 (10%)
А/И-42 + RNS60 (20%)
А/И-42 +
А/31-42 + -ФР (20%)
ФР (10%)
s ^ at к ro m
:c О с
о at о-
=; а:
+ контрольный носитель (группа IF)
it дексаметазон (группа IF)
A 0,2 мл RNS60 каждый день, начиная с первых клинических признаков (7F)
? 0,2 мл RNS60 каждые 3 дня, начиная с первых клинических признаков (8F)
3j? 0,09 мл RNS60 каждый день, начиная с первых клинических признаков (9F)
i " I " 1 " i ш ! 1 1 ! ! 1 1 1 I 1 1 1 ! I-I ! 1 ! 1 ! 1 1
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 время (дни)
го сл
Фиг. 14
PE-A
p -тубулин (Ф)-тау DAPI погружение
(19)
(19)
(19)
134
DWT 17972687v2 0083535-032WO0
134
DWT 17972687v2 0083535-032WO0
135
135
DWT 17972687v2 0083535-032WOO
DWT 17972687v2 0083535-032WOO
136
136
DWT 17972687v2 0083535-032WO0
DWT 17972687v2 0083535-032WO0
139
139
DWT I7972687v2 0083535-032WO0
DWT I7972687v2 0083535-032WO0
140
140
DWT 17972687v2 0083535-032WOO
DWT 17972687v2 0083535-032WOO
141
141
DWT 17972687v2 0083535-032WO0
DWT 17972687v2 0083535-032WO0
WO 2012/021856
2/25
PCT/US20 И/047669
WO 2012/021856
2/25
PCT/US20 И/047669
WO 2012/021856
3/25
PCT/US2011 /047669
WO 2012/021856
3/25
PCT/US2011 /047669
WO 2012/021856
4/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
5/25
РСТ/Ш2011/047669
-200
Фиг. 4С
WO 2012/021856
4/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
5/25
РСТ/Ш2011/047669
-200
Фиг. 4С
WO 2012/021856
4/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
5/25
РСТ/Ш2011/047669
-200
Фиг. 4С
WO 2012/021856
6/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
5/25
РСТ/Ш2011/047669
-200
Фиг. 4С
WO 2012/021856
7/25
PCTAJS2011/047669
WO 2012/021856
7/25
PCTAJS2011/047669
WO 2012/021856
8/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
8/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
10/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
10/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 8
Фиг. 8
WO 2012/021856
10/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
10/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 8
Фиг. 8
WO 2012/021856
11/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
11/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 9В
Фиг. 9В
WO 2012/021856
11/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
11/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 9В
Фиг. 9В
WO 2012/021856
12/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
12/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 10В
Фиг. 10В
WO 2012/021856
12/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
12/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 10В
Фиг. 10В
WO 2012/021856
12/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
12/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 10В
Фиг. 10В
WO 2012/021856
12/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
12/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 10В
Фиг. 10В
WO 2012/021856
13/25
PCT7US2011/047669
WO 2012/021856
13/25
PCT7US2011/047669
Фиг. 10D
Фиг. 10D
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
14/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
Rev Тх Hi
Фиг. 11В
WO 2012/021856
15/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
15/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11D
Rev Тх Hi
Фиг. 11D
WO 2012/021856
15/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
15/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11D
Rev Тх Hi
Фиг. 11D
WO 2012/021856
15/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
15/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11D
Rev Тх Hi
Фиг. 11D
WO 2012/021856
15/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
15/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11D
Rev Тх Hi
Фиг. 11D
WO 2012/021856
16/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
16/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11F
Rev Тх Hi
Фиг. 11F
WO 2012/021856
16/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
16/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11F
Rev Тх Hi
Фиг. 11F
WO 2012/021856
16/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
16/25
PCT/US2011/047669
Rev Тх Hi
Фиг. 11F
Rev Тх Hi
Фиг. 11F
WO 2012/021856
17/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
17/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 11Н
Фиг. 11Н
WO 2012/021856
17/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
17/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 11Н
Фиг. 11Н
WO 2012/021856
17/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
17/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 11Н
Фиг. 11Н
WO 2012/021856 18/25 PCT7US2011/047669
WO 2012/021856 18/25 PCT7US2011/047669
WO 2012/021856 18/25 PCT7US2011/047669
WO 2012/021856 18/25 PCT7US2011/047669
WO 2012/021856 19/25 PCT/US2011/047669
WO 2012/021856 19/25 PCT/US2011/047669
Фиг. 13
Фиг. 13
WO 2012/021856 19/25 PCT/US2011/047669
WO 2012/021856 19/25 PCT/US2011/047669
Фиг. 13
Фиг. 13
WO 2012/021856
21/25
РСТ/Ш2011/047669
WO 2012/021856
21/25
РСТ/Ш2011/047669
Фиг. 15В
Фиг. 15В
WO 2012/021856
22/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
22/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 17С
Фиг. 17С
WO 2012/021856
24/25
PCT/US2011/047669
WO 2012/021856
24/25
PCT/US2011/047669
Фиг. 18А
Фиг. 18А
WO 2012/021856 25/25 PCT/US2011/047669
WO 2012/021856 25/25 PCT/US2011/047669
Фиг. 18В
Фиг. 18В