[**]

Настоящее изобретение относится к нитевидным грибам, экспрессирующим комбинацию гетерологичных и гомологичных полипептидов, к полипептидным смесям, включающим комбинацию гетерологичных и гомологичных полипептидов, и к способам получения полипептидных смесей.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к нитевидным грибам, экспрессирующим комбинацию гетерологичных и гомологичных полипептидов, к полипептидным смесям, включающим комбинацию гетерологичных и гомологичных полипептидов, и к способам получения полипептидных смесей.

---

Евразийское (21) 201300048 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.09.30
(22) Дата подачи заявки 2008.06.05
(51) Int. Cl.
C12N 9/24 (2006.01) C12N15/56 (2006.01) C12N15/80 (2006.01)
C12N 1/15 (2006.01)
(54) СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ И ГОМОЛОГИЧНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗ
(31) 60/933,894
(32) 2007.06.08
(33) US
(62) 200971142; 2008.06.05
(71) Заявитель: ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН (US)
(72) Изобретатель:
Бауэр Бенджамин С., Ларенас Эдмунд
А. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к нитевидным грибам, экспрессирующим комбинацию гете-рологичных и гомологичных полипептидов, к полипептидным смесям, включающим комбинацию гетерологичных и гомологичных полипептидов, и к способам получения полипептидных смесей.
2420-192888ЕА/052 СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ И ГОМОЛОГИЧНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗ
1. Перекрестная ссылка на родственную заявку
По настоящей заявке испрашивается приоритет
предварительной заявки на патент США № US 60/933894, поданной 8 июня 2007 г., которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.
2. Заявление о финансировании научной работы на
федеральном уровне
Некоторые части данной научной работы финансировались Национальной лабораторией возобновляемой энергии по субдоговору № ZC0-0-30017-01 на основании основного договора № DE-AC36-99G010337, заключенного с Министерством энергетики США. Таким образом, правительство США может иметь определенные права на изобретение.
3. Введение
Целлюлоза и гемицеллюлоза являются наиболее
распространенными растительными веществами, образующимися в результате фотосинтеза. Указанные вещества могут расщепляться и использоваться в качестве источника энергии многими микроорганизмами, включая бактерии, дрожжи и грибы, которые продуцируют внеклеточные ферменты, способные гидролизовать полимерные субстраты в мономерные сахара.
Целлюлазы являются ферментами, которые гидролизуют целлюлозу (бета-1,4-глюкановые или бета-Э-гликозидные связи) с образованием глюкозы, целлобиозы, целлоолигосахаридов и тому подобных. Целлюлазы традиционно разделены на три основных класса: эндоглюканазы (ЕС 3.2.1.4) ("EG"), экзоглюканазы или целлобиогидролазы (ЕС 3.2.1.91) ("СВН") и бета-глюкозидазы ([бета]-D-глюкозид-глюкогидролаза; ЕС 3.2.1.21) ("BG"). Эндоглюканазы действуют в основном в аморфных частях целлюлозного волокна, в то время как целлобиогидролазы способны также расщеплять кристаллическую целлюлозу. Для эффективного превращения кристаллической целлюлозы в глюкозу необходима
полная система целлюлаз, включающая компоненты СВН, EG и BG, так как отдельно выделенные компоненты менее эффективно гидролизуют кристаллическую целлюлозу (Filho et al., Сап. J. Microbiol. 42:1-5, 1996). Весьма перспективной является экспрессия указанных многокомпонентных систем целлюлаз в нитевидных грибах для промышленного производства целлюлаз. 4. Сущность изобретения
Таким образом, настоящее изобретение относится к нитевидным грибам, экспрессирующим комбинацию гетерологичных и гомологичных полипептидов, к полипептидным смесям, включающим комбинацию гетерологичных и гомологичных полипептидов, и к способам получения полипептидных смесей.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения
относятся к нитевидному грибу, включающему два или более
полинуклеотидов, кодирующих два или более гетерологичных
полипептидов, и полинуклеотид, кодирующий гомологичный
полипептид. Нитевидный гриб может экспрессировать
гетерологичные и гомологичные полипептиды, которые вместе образуют функционально активную смесь.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к культуральной среде, включающей популяцию нитевидного гриба по настоящему изобретению.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к полипептидной смеси, включающей два или более гетерологичных полипептидов и гомологичный полипептид. Полипептидная смесь может быть получена из нитевидных грибов по настоящему изобретению.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения
относятся к способу получения смеси целлюлаз. Указанный способ
включает получение полипептидной смеси, содержащей два или
более гетерологичных полипептидов и гомологичный полипептид, из
нитевидного гриба по настоящему изобретению. В некоторых
вариантах осуществления изобретения гетерологичные полипептиды
являются экзоцеллобиогидролазой и эндоглюканазой, и
гомологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой.
Гетерологичная экзоцеллобиогидролаза и гомологичная
экзоцеллобиогидролаза могут быть, но не обязательно являются одинаковыми экзоцеллобиогидролазами.
Ниже представлены вышеуказанные и другие признаки настоящего изобретения.
5. Краткое описание чертежей
Специалисту должно быть понятно, что чертежи приведены только в иллюстративных целях. Представленные чертежи никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.
На фигуре 1 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID N0:1) слитой конструкции гетерологичной целлюлазы, включающая 2656 оснований.
На фигуре 2 показана аминокислотная последователность (SEQ ID N0:2) слитого белка целлюлазы, прогнозируемая на основе последовательности нуклеиновой кислоты, изображенной на фигуре 1.
На фигурах 3A-F показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID N0:14) вектора рТгех4, содержащего каталитический домен Е1.
На фигуре 4 показана плазмидная карта экспрессирующего вектора рТгехЗд T.reesei.
На фигуре 5А показан экспрессирующий вектор рТгехЗд-
Hgrisea-cbhl, используемый для получения типичного
трехкомпонентного штамма.
На фигурах 5В-Е показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID N0:7) экспрессирующего вектора, изображенного на фигуре 5А.
На фигуре б показаны три ДНК-экспрессирующих фрагмента, трансфицированные в штамм с делецией cbhl для создания четырехкомпонентного штамма.
На фигуре 7А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID N0:8) от инициирующего кодона до терминирующего кодона полинуклеотида, экспрессирующего генетически созданный белок CBHI.
На фигуре 7В показана последовательность генетически созданного белка CBHI (SEQ ID N0:9). Сигнальная последовательность CBHI подчеркнута.
На фигуре 8А показан cbhl-экспрессирующий вектор рТгехЗд-
cbhl.
На фигурах 8B-F показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID N0:10) экспрессирующего вектора рТгехЗд-cbhl.
На фигуре 9А показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID N0:11) от инициирующего кодона до терминирующего кодона полинуклеотида, экспрессирующего генетически созданный белок CBHI.
На фигуре 9В показана аминокислотная последовательность генетически созданного белка CBHII (SEQ ID N0:12). Сигнальная последовательность подчеркнута.
На фигуре 10А показан cbhll-экспрессирующий вектор рЕхр-cbhll.
На фигурах 10B-G показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID N0:13) экспрессирующего вектора pExp-cbhll.
б. Подробное описание различных вариантов осуществления изобретения
Ниже будет дано подробное описание изобретения с использованием нижеследующих определений терминов и примеров. За исключением особо оговоренных случаев все технические и научные термины, использованные в настоящем описании изобретения, имеют общепринятые значения, известные специалисту в научной области, к которой относится данное изобретение. Числовые интервалы охватывают все числа, указанные в данном интервале. Заголовки, приведенные в настоящем описании изобретения, не ограничивают разные объекты и варианты осуществления изобретения и могут рассматриваться как относящиеся к описанию изобретения в целом. Таким образом, приведенные ниже термины имеют более полное определение, относящееся ко всему описанию изобретения.
Термин "полипептид", используемый в настоящем описании, означает соединение, состоящее из одной цепи аминокислотных остатков, связанных пептидными связями. Термин "белок", используемый в настоящем описании, имеет взаимозаменяемое значение с термином "полипептид".
Термин "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" имеют
взаимозаменяемые значения и означают одноцепочечную или двухцепочечную ДНК, РНК, кДНК и их химические модификации. Так как генетический код является вырожденным, для кодирования определенной аминокислоты может быть использовано несколько кодонов, и в объем настоящего изобретения входят все полинуклеотиды, кодирующие определенную аминокислотную последовательность.
Термин "рекомбинантный", используемый применительно к
клетке, нуклеиновой кислоте, белку или вектору, означает, что
указанная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор
модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой
кислоты или белка либо изменения нативной нуклеиновой кислоты
или белка, что данная клетка получена из модифицированной таким
образом клетки или что белок экспрессирован в ненативной или
генетически модифицированной среде, например, в экспрессирующем
векторе для прокариотической или эукариотической системы. Таким
образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют
нуклеиновые кислоты или полипептиды, не встречающиеся в
естественной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют
нативные гены, которые в противном случае были бы анормально
экспрессированы, недостаточно экспрессированы,
сверхэкспрессированы или вообще не экспрессированы.
Термин "гетерологичный" применительно к полинуклеотиду или полипептиду означает полинуклеотид или полипептид, имеющий последовательность, которая в естественных условиях отсутствует в клетке-хозяине. В одних вариантах осуществления изобретения полипептид является коммерчески важным промышленным белком, и в других вариантах осуществления изобретения гетерологичный полипептид является терапевтическим белком. Предполагается, что в определение данного термина входят белки, кодированные природными генами, мутированными генами и/или синтезированными генами.
Термин "гомологичный" применительно к полинуклеотиду или полипептиду означает полинуклеотид или полипептид, имеющий последовательность, которая естественно присутствует в клетке-хозяине .
В используемом в данном случае значении термин "слитая нуклеиновая кислота" означает две или большее число нуклеиновых кислот, функционально связанных друг с другом. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, геномной ДНК и кДНК, РНК или гибридом РНК и ДНК. В конструкции последовательностей слитой нуклеиновой кислоты может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая всю или часть последовательности полипептида. В одних вариантах осуществления изобретения использована нуклеиновая кислота, кодирующая непроцессированные полипептиды. В других вариантах осуществления изобретения может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая часть полипептида.
Термин "слитый полипептид" означает белок, включающий по меньшей мере две отдельные и различные области, которые могут быть получены из одного и того же белка или из разных белков. Например, слитым полипептидом или слитым белком может считаться белок, в котором сигнальный пептид, связанный с представляющим интерес белком, обычно не ассоциирован с указанным представляющим интерес белком.
Термины "выделенный" и "отделенный" имеют взаимозаменяемые значения и означают белок, клетку, нуклеиновую кислоту, аминокислоту и т.д., удаленные по меньшей мере из одного компонента, с которым они ассоциированы в естественных условиях.
В используемом в данном случае значении термин "ген" означает полинуклеотид (например, сегмент ДНК), участвующий в образовании полипептидной цепи, которая может включать или не включать области, предшествующие или следующие за кодирующей областью, например, 5'-концевые нетранслированные (5'UTR) или "лидерные" последовательности и 3'UTR или "трейлерные" последовательности, а также вставочные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).
В используемом в данном случае значении термин "промотор" означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию гена нижней области. Промотор обычно должен соответствовать клетке-хозяину, в которой экспрессирован ген-мишень. Промотор вместе с другими последовательностями
нуклеиновой кислоты, регулирующими транскрипцию и трансляцию, (именуемыми также "регуляторными последовательностями") необходим для экспрессии данного гена. Как правило, последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию, включают, не ограничиваясь ими, промоторные последовательности, сайты связывания рибосом, последовательности, инициирующие и терминирующие транскрипцию, последовательности, инициирующие и терминирующие трансляцию, энхансерные или активаторные последовательности.
В используемом в данном случае значении термин
"функционально связанный" означает, что нуклеиновая кислота,
регулирующая транскрипцию, находится по отношению к кодирующим
последовательностям в положении, обеспечивающем инициацию
транскрипции. Как правило, это означает, что промотор и
последовательности, инициирующие транскрипцию, расположены в 5'
направлении относительно кодирующей области. Нуклеиновая
кислота, регулирующая транскрипцию, обычно должна
соответствовать клетке-хозяину, используемой для экспрессии
указанного белка. В данной области известны соответствующие
экспрессирующие векторы и приемлемые регуляторные
последовательности многих типов для разных клеток-хозяев.
В используемом в данном случае значении термин "экспрессия" означает процесс образования полипептида на основании последовательности нуклеиновой кислоты гена. Указанный процесс включает транскрипцию и трансляцию.
В используемом в данном случае значении термин "вектор" означает полинуклеотидную конструкцию, созданную для введения нуклеиновых кислот в клетки одного или нескольких типов. Векторы включают клонирующие векторы, экспрессирующие векторы, шаттл-векторы, плазмиды, кластеры и тому подобные.
В используемом в данном случае значении термин
"экспрессирующий вектор" означает вектор, способный включать и
экспрессировать фрагменты гетерологичной ДНК в чужеродной
клетке. Многие прокариотические и эукариотические
экспрессирующие векторы являются коммерчески доступными.
В используемом в данном случае значении термины "векторная
ДНК", "трансформирующая ДНК" и "экспрессирующий вектор" имеют
взаимозаменяемые значения и относятся к ДНК, используемой для
введения последовательностей в клетку-хозяина или организм.
Указанная ДНК может быть создана in vitro при помощи
полимеразной цепной реакции (ПЦР) или любых других приемлемых
методов, известных в данной области, например, при помощи
стандартных методов молекулярной биологии, описанных в
публикации Sambrook et al. Кроме того, ДНК экспрессирующей
конструкции может быть синтезирована искусственно, например,
химическим путем. Векторная ДНК, трансформирующая ДНК или
рекомбинантный экспрессирующий кластер может быть введен в
плазмиду, хромосому, внехромосомный элемент, митохондриальную
ДНК, плазмидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты.
Рекомбинантный экспрессирующий кластер экспрессирующего
вектора, векторной ДНК или трансформирующей ДНК обычно включает
наряду с другими последовательностями транскрибируемую
последовательность нуклеиновой кислоты и промотор. В
предпочтительных вариантах осуществления изобретения
экспрессирующие векторы способны вводить и экспрессировать фрагменты гетерологичной ДНК в клетке-хозяине.
Термин "введенный" применительно к введению
последовательности нуклеиновой кислоты в клетку означает "трансфекцию", "трансформацию" или "трансдукцию" и относится к введению последовательности нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, в которой данная последовательность нуклеиновой кислоты может быть встроена в геном клетки (например, в хромосому, внехромосомный элемент, плазмиду, пластиду или митохондриальную ДНК), превращена в автономный репликон или временно экспрессирована (например, трансфицированная мРНК).
Термин "клетка-хозяин" означает клетку, которая содержит вектор и поддерживает репликацию и/или транскрипцию и трансляцию (экспрессию) экспрессирующей конструкции.
В используемом в данном случае значении термин "культивирование" означает выращивание популяции клеток в приемлемых условиях в жидкой, полутвердой или плотной среде.
В используемом в данном случае значении термины "замещенный" и "модифицированный" имеют взаимозаменяемые значения и относятся к последовательности, такой как аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты, которая включает делецию, инсерцию, замену или прерывание природной последовательности. Часто в контексте настоящего изобретения замещенная последовательность включает замену природного остатка.
В используемом в данном случае значении термин "модифицированный фермент" означает фермент, который включает делецию, инсерцию, замену или прерывание природной последовательности.
Термин "вариант" означает область белка, содержащую одну или несколько других аминокислот по сравнению с исходным белком, например, природным белком или белком дикого типа.
Термин "целлюлаза" означает категорию ферментов, способных гидролизовать полимеры целлюлозы (бета-1,4-глюкановые или бета-D-глюкозидные связи) с образованием более коротких целлоолигосахаридных олигомеров, целлобиозы и/или глюкозы.
Термин "экзоцеллобиогидролаза" (СВН) означает группу целлюлазных ферментов, классифицируемых как ЕС 3.2.1.91, и/или ферментов в определенных семействах GH, которые включают, не ограничиваясь ими, ферменты в семействах GH 5, 6, 7, 9 или 48. Указанные ферменты известны также как экзоглюканазы или целлобиогидролазы. Ферменты СВН гидролизуют целлобиозу из восстанавливающегося или невосстанавливающегося конца целлюлозы. Как правило, фермент типа CBHI предпочтительно гидролизует целлобиозу из восстанавливающегося конца целлюлозы, и фермент типа CBHII предпочтительно гидролизует невосстанавливающийся конец целлюлозы.
Термин "активность целлобиогидролазы" в используемом в данном случае значении означает активность 1,4-D-глюканцеллобиогидролазы, которая катализирует гидролиз 1,4-бета-О-глюкозидных связей в целлюлозе, целлотетриозе или любом полимере, содержащей бета-1,4-связанную глюкозу, отщепляя целлобиозу от концов цепи. В используемом в данном случае
значении активность целлобиогидролазы определяется
высвобождением из целлюлозы водорастворимого
восстанавливающегося сахара, измеряемым методом РНВАН, описанным в публикации Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47:273-27 9. Различие между воздействием экзоглюканазы, целлобиогидролазы и эндоглюканазы определяют аналогичным образом на основании высвобождения восстанавливающегося сахара из замещенной целлюлозы, такой как карбоксиметилцеллюлоза или гидроксиэтилцеллюлоза (Ghose, 1987, Pure & Appl. Chem. 59:257268). Истинная целлобиогидролаза характеризуется очень высоким уровнем активности в отношении незамещенной целлюлозы по сравнению с замещенной целлюлозой (Bailey et al., 1993, Biotechnol. Appl. Biochem. 17:65-76).
Термин "эндоглюканаза" (EG) означает группу целлюлазных
ферментов, классифицируемых как ЕС 3.2.1.4, и/или ферментов в
определенных семействах GH, которые включают, не ограничиваясь
ими, ферменты в семействах GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17, 31, 44,
45, 48, 51, 61, 64, 74 или 81. Фермент EG гидролизует
внутренние бета-1,4-глюкозидные связи целлюлозы. Термин
"эндоглюканаза" в используемом в данном случае значении
означает эндо-1,4-(1,3;1,4)-бета-0-глюкан-4-глюканогидролазу,
которая катализирует эндогидролиз 1,4-бета-0-глюкозидных связей
в целлюлозе, производных целлюлозы (например,
карбоксиметилцеллюлозе), лихенине, бета-1,4-связи в смешанных бета-1,3-глюканах, таких как бета-О-глюканы или ксилоглюканы злаков, и в других растениях, содержащих -целлюлозные компоненты. В используемом в данном случае значении активность эндоглюканазы определяют путем гидролиза карбоксиметилцеллюлозы (CMC) методом, описанным в публикации Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59:257-268.
Термин "бета-глюкозидаза" в используемом в данном случае
значении означает бета-Э-глюкозид-глюкогидролазу,
классифицируемую как ЕС 3.2.1.21, и/или ферменты в определенных семействах GH, которые включают, не ограничиваясь ими, ферменты в семействах GH 1, 3, 9 или 48, катализирующие гидролиз целлобиозы с высвобождением бета-И-глюкозы. В используемом в
данном случае значении активность бета-глкжозидазы может быть измерена методами, известными в данной области, например, ВЭЖХ.
Термин "разлагающая целлюлозу активность" означает активность экзоглюканазы, активность эндоглюканазы или активность ферментов обоих типов, а также активность бета-глюкозидазы.
Термины "термически устойчивый" и "термостойкий" относятся к полипептидам или ферментам по настоящему изобретению, которые в определенной степени сохраняют биологическую, например, ферментативную активность после воздействия повышенной температуры, то есть температуры выше комнатной. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептид или фермент считается термостойким при сохранении более 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% биологической активности после воздействия определенной температуры, например, 40°С, 45°С, 50°С, 55°С, 60°С, 65°С, 70°С, 75°С или 80°С, в течение 2, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или 60 минут при рН, равном, например, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или 8.
Термин "нитевидные грибы" означает любые, а также все
нитевидные грибы, известные специалистам в данной области. Как
правило, нитевидные грибы являются эукариотическими
микроорганизмами и включают все нитевидные формы подотдела
Eumycotina. Указанные грибы характеризуются наличием
вегетативного мицелия, клеточная оболочка которого состоит из
хитина, бета-глюкана и других сложных полисахаридов. В
некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидные грибы
по настоящему изобретению в морфологическом, физиологическом и
генетическом отношении отличаются от дрожжей. В некоторых
вариантах осуществления изобретения нитевидные грибы включают,
не ограничиваясь ими, следующие роды: Aspergillus, Acremonium,
Aureobasidium, Beauveria, Cephalosporium, Ceriporiopsis,
Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus,
Cryptococcus, Cyathus, Endothia, Endotia mucor, Fusarium,
Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Myceliophthora,
Myrothecium, Mucor, Neurospora, Phanerochaete, Podospora,
Paecilomyces, Penicillium, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus,
Schizophylum, Stagonospora, Talaromyces, Trichoderma,
Thermomyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium,
Trichophyton и Trametes pleurotus. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидные грибы включают, не ограничиваясь ими, следующие виды: A. nidulans, A. niger, А. awomari, например, NRRL 3112, АТСС 22342 (NRRL 3112), АТСС 44733, АТСС 14331 и штамм UVK 143f, A. oryzae, например, АТСС 11490, N. crassa, Trichoderma reesei, например, NRRL 15709, АТСС 13631, 56764, 56765, 56466, 56767, и Trichoderma viride, например, АТСС 32098 и 32086.
Термин "Trichoderma" или "вид Trichoderma" в используемом здесь значении означает любые грибы, которые ранее были классифицированы как вид или штамм Trichoderma и которые в настоящее время классифицированы как вид или штамм Trichoderma или как вид или штамм Нуросгеа. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный вид включает Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride или Нуросгеа jecorina. В качестве исходного штамма могут быть также использованы штаммы, сверхпродуцирующие целлюлазу, такие как Т. longibrachiatum/reesei RL-P37 (Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984) pp. 46-53; Montenecourt B.S., Can., 1-20, 1987), и штамм Rut-СЗО. В некоторых вариантах осуществления изобретения продуцирование целлюлаз в видах, предназначенных для улучшения, строго регулируется и является чувствительным к разным окружающим условиям.
Настоящее изобретение относится к нитевидному грибу, включающему два или более полинуклеотидов, кодирующих два или более гетерологичных полипептидов, и полинуклеотид, кодирующий гомологичный полипептид. Нитевидный гриб может экспрессировать гетерологичные и гомологичные полипептиды, образующие функционально активную смесь. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб содержит первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, кодирующие соответственно первый гетерологичный полипептид и второй гетерологичный полипептид, а также третий полинуклеотид, кодирующий
гомологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб содержит дополнительный полинуклеотид, четвертый полинуклеотид, кодирующий третий гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб содержит четыре или более полинуклеотидов, кодирующих четыре или более гетерологичных полипептидов, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих один или несколько гомологичных полипептидов.
В соответствии с настоящим изобретением функционально активная смесь включает любую смесь полипептидов при условии, что такая смесь выполняет по меньшей мере одну функцию, биологическую или какую-либо еще, которая является следствием активности по меньшей мере двух или трех полипептидов в смеси. Другими словами, по меньшей мере два или три полипептида в указанной смеси обеспечивают активность полипептидной смеси на детектируемом уровне. В некоторых вариантах осуществления изобретения функционально активная смесь включает по меньшей мере три полипептида и обладает функциональной активностью, обеспечиваемой по меньшей мере двумя или тремя полипептидами в указанной смеси. В некоторых других вариантах осуществления изобретения функционально активная смесь включает по меньшей мере три полипептида и выполняет ферментативную функцию, осуществляемую по меньшей мере двумя или тремя полипептидами в указанной смеси. В некоторых вариантах осуществления изобретения функционально активная смесь включает по меньшей мере три полипептида и выполняет функцию целлюлазы, обеспечиваемую по меньшей мере двумя или тремя полипептидами в указанной смеси. В некоторых вариантах осуществления изобретения функционально активная смесь включает четыре полипептида и выполняет функцию, обеспечиваемую двумя, тремя или четырьмя полипептидами в указанной смеси.
В некоторых вариантах осуществления изобретения функционально активная смесь выполняет функцию, соответствующую улучшению любой активности, например, активности секретируемого белка, включающей без каких-либо ограничений активность целлюлазы, активность осахаривания или термостойкость, и
ассоциированной с нитевидным грибом или обеспечиваемой
указанным грибом. В некоторых вариантах осуществления
изобретения функционально активная смесь выполняет функцию,
обеспечиваемую активностью экзоцеллобиогидролазами,
эндоглюканазами, бета-глюкозидазами или любой их комбинацией. В некоторых вариантах осуществления изобретения функционально активная смесь не содержит никакого бактериального фермента в комбинации с белком-носителм нитевидного гриба. В некоторых вариантах осуществления изобретения функционально активная смесь не образует никакого антитела или функционально активных фрагментов антитела, таких как Fab, одноцепочечное антитело и т.д.
В некоторых вариантах осуществления изобретения
полинуклеотиды, кодирующие гетерологичные или гомологичные
полипептиды, функционально связаны с одним или несколькими
промоторами. Промотор может быть любым приемлемым промотором,
который известен в данной области в настоящее время или будет
открыт в будущем. В некоторых вариантах осуществления
изобретения полинуклеотиды экспрессированы под воздействием
промотора, нативного для нитевидного гриба. В некоторых
вариантах осуществления изобретения полинуклеотиды
экспрессированы под воздействием гетерологичного промотора. В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотиды экспрессированы под воздействием конститутивного или индуцибельного промотора. Примеры приемлемых промоторов включают, не ограничиваясь ими, промотор целлюлазы, промотор ксиланазы, промотор 1818 (который ранее был иднтифицирован как высокоэкспрессированный белок при картировании EST Trichoderma). В некоторых вариантах осуществления изобретения промотор является промотором целлюлазы нитевидного гриба. В некоторых вариантах осуществления изобретения промотор является промотором экзоцеллобиогидролазы, эндоглюканазы или бета-глюкозидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения промотор является промотором целлобиогидролазы I (cbhl). Неограничивающие примеры промоторов включают промоторы cbhl, cbh2, egll, egl2, egl3, egl4, egl5, pkil, gpdl, xynl и xyn2.
Кроме того, два или более полинуклеотидов, кодирующих гетерологичные или гомологичные полипептиды или их части, могут быть слиты друг с другом с образованием слитого полинуклеотида. Слитый полинуклеотид может быть функционально связан с любым вышеописанным приемлемым промотором.
В некоторых вариантах осуществления изобретения первый полинуклеотид, кодирующий первый гетерологичный полипептид, функционально связан с первым промотором. Первый промотор может отличаться, хотя и не обязательно, от одного или нескольких промоторов, с которыми функционально связан второй или третий полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый полинуклеотид функционально связан с промотором гена, кодирующего гомологичный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления изобретения
полинуклеотид, например, второй полинуклеотид, кодирующий
второй гетерологичный полипептид, слит с другим
полинуклеотидом, например, с третьим полинуклеотидом, кодирующим гомологичный полипептид, с образованием слитого полинуклеотида. Слитый полинуклеотид может быть функционально связан с любым приемлемым промотором, который включает, не ограничиваясь им, промотор гена, кодирующего гомологичный полипептид. Слитый полинуклеотид кодирует слитый полипептид или слитый белок, который включает два полипептида, домена или их части. Части или домены полипептидов могут представлять собой любую часть или домен полипептидов, которые выполняют по меньшей мере одну функцию, биологическую или какую-либо еще, или становятся функционально активными при образовании слитого полипептида или объединении с другими полипептидами функционально активной смеси. В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок включает второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый полинуклеотид кодирует слитый белок, включающий два полипептида, например, второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид, разделенные линкером или линкерной областью. Линкер может быть любым приемлемым линкером,
используемым для связывания двух полипептидов. Линкерная область обычно образует удлиненный полужесткий спейсер между доменами пептидов с независимо уложенной цепью. Линкерная область между полипептидами слитого белка является более предпочтительной, делая возможной независимую укладку цепи полипептидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер получают из глюкоамилазы вида Aspergillus и линкеров CBHI вида Tricoderma. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер может быть, хотя и не обязательно, частью полипептидов, образующих слитый белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды слитого белка представляют собой второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид.
В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый
полинуклеотид кодирует слитый белок, включающий два
полипептида, разделенных линкером или линкерной областью, и
сайт расщепления. В некоторых вариантах осуществления
изобретения полипептиды слитого белка представляют собой второй
гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид. Как
правило, сайт расщепления расположен в линкерной области и
разделяет последовательности, граничащие с сайтом расщепления.
Сайт расщепления может включать любую последовательность,
которая может быть расщеплена любым способом, который известен
в настоящее время или будет открыт в будущем и включает, не
ограничиваясь им, расщепление протеазой или под воздействием
определенных химических веществ. Примеры таких
последовательностей включают, не ограничиваясь ими, сайт расщепления кексином, например, сайт узнавания КЕХ2, содержащий кодоны для аминокислот Lys и Arg, сайты узнавания Lys и Arg протеазы трипсина и сайт узнавания и расщепления Lys-C эндопротеиназы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб по настоящему изобретению далее включает полинуклеотид, кодирующий селектируемый маркер. Указанный маркер может быть любым приемлемым маркером, позволяющим производить отбор трансформированных клеток-хозяев. Селектируемый маркер обычно
является геном, экспрессируемым в клетке-хозяине, который облегчает отбор указанных клеток-хозяев, содержащих вектор. В используемом здесь значении указанный термин обычно относится к генам, показывающим, что клетка-хозяин поглотила представляющую интерес ДНК или произошла какая-либо другая реакция. Селектируемые маркеры обычно являются генами, сообщающими бактериальную устойчивость или метаболическое преимущество клетке-хозяину, что позволяет отличить клетки, содержащие экзогенную ДНК, от клеток, которые не получили экзогенную последовательность в процессе трансформации. Примеры таких селектируемых маркеров включают, не ограничиваясь ими, антибактериальные средства (например, канамицин, эритромицин, актиномицин, хлорамфеникол и тетрациклин). Дополнительные примеры маркеров включают, не ограничиваясь ими, ген руг-4 Т. reesei, ацетолактат-синтазу, ген hyg Streptomyces, ген amdS Aspergillus nidulans и ген pyrG Aspergillus niger.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб по настоящему изобретению далее включает и может экспрессировать четвертый полинуклеотид, кодирующий третий гетерологичный полипептид. Гетерологичные или гомологичные полипептиды могут быть природными полипептидами или их вариантами. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько гетерологичных полипептидов могут быть вариантами гомологичных полипептидов. Например, первый гетерологичный полипептид может быть модифицированным гомологичным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй гетерологичные полипептиды являются модифицированными гомологичными полипептидами. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй гетерологичные полипептиды являются модифицированными гомологичными полипептидами, и нитевидный гриб содержит четвертый полинуклеотид, кодирующий третий гетерологичный полипептид. Третий гетерологичный полипептид может быть или не быть модифицированным гомологичным полипептидом.
Гетерологичные и гомологичные полипептиды по настоящему изобретению могут быть любыми требуемыми полипептидами, которые
при смешивании с другими полипептидами по настоящему изобретению образуют функционально активную смесь, которая выполняет по меньшей мере одну функцию, биологическую или какую-либо еще, обеспечиваемую по меньшей мере двумя или тремя полипептидами в смеси. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь гетерологичных и гомологичных полипептидов позволяет функционально активной смеси лучше выполнять функцию, соответствующую активности нитевидного гриба или обеспечиваемую указанным грибом. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные активности включают, не ограничиваясь ими, лучшую активность секретируемого белка, лучшую активность осахаривания или термостойкость, то есть устойчивость при более высоких температурах или при измененных значениях рН, и/или стабильную активность в течение более продолжительных периодов времени при постоянной температуре.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные или гомологичные полипептиды не включают никакого бактериального фермента в комбинации с белком-носителем нитевидного гриба. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные или гомологичные полипептиды не образуют никакого антитела или функционально активных фрагментов антитела, таких как Fab, одноцепочечное антитело и т.д.
В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько полипептидов из первого или второго гетерологичного полипептида или гомологичного полипептида являются ферментом или его частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый или второй гетерологичный полипептид или гомологичный полипептид является целлюлазой, гемицеллюлазой, ксиналазой, маннаназой, их доменом или частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый или второй гетерологичный полипептид или гомологичный полипептид является целлюлазой или ее частью. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй гетерологичные полипептиды и гомологичный полипептид вместе образуют функционально активную смесь целлюлаз.
В некоторых вариантах осуществления изобретения первый или второй гетерологичный полипептид или гомологичный полипептид является целлюлазой, выбираемой из группы, включающей экзоцеллобиогидролазы, эндоглюканазы, бета-глюкозидазы или их части. Первый или второй гетерологичный полипептид, гомологичный полипептид и, в случае его наличия, третий гетерологичный полипептид без каких-либо ограничений могут быть выбраны из группы, включающей экзоцеллобиогидролазы, эндоглюканазы, бета-глюкозидазы или их домены. В некоторых вариантах осуществления изобретения несколько гетерологичных или гомологичных полипептидов могут относиться к одному и тому же классу или группе целлюлаз. Например, два или более полипептидов могут относиться к классу экзоцеллобиогидролаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения один из гетерологичных полипептидов относится к тому же классу целлюлаз, что и гомологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные и гомологичные полипептиды являются одинаковыми членами одного класса, но имеют последовательности разного происхождения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб по настоящему изобретению содержит первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, кодирующие соответственно первый гетерологичный полипептид и второй гетерологичный полипептид, при этом первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой и второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, классифицируемой как ЕС 3.2.1.91, и второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой, классифицируемой как ЕС 3.2.1.4. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, выбираемой из группы, состоящей из семейства GH 5, 6, 7, 9, 48, и второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой, выбираемой из группы, состоящей из семейства GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17, 31, 44, 45, 48, 51, 61, 64, 74 и 81.
Как было указано выше, гетерологичные и гомологичные
полипептиды по настоящему изобретению без каких-либо
ограничений могут быть выбраны из классов целлюлазных
ферментов. В настоящем описании изобретения приведены типичные
комбинации ферментов. В некоторых вариантах осуществления
изобретения первый гетерологичный полипептид является
экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид
является эндоглюканазой и гомологичный полипептид является
экзоцеллобиогидролазой. В некоторых вариантах осуществления
изобретения первый гетерологичный полипептид является первой
экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид
является эндоглюканазой, гомологичный полипептид является
второй экзоцеллобиогидролазой, при этом первая
экзоцеллобиогидролаза и вторая экзоцеллобиогидролаза являются одинаковыми целлобиогидролазами, например, первая и вторая экзоцеллобиогидролазы являются CBHI или обе являются CBHII.
Нитевидные грибы по настоящему изобретению могут быть
любыми нитевидными грибами, известными специалистам в данной
области. В некоторых вариантах осуществления изобретения
нитевидные грибы включают, не ограничиваясь ими, следующие
роды: Aspergillus, Acremonium, Aureobasidium, Beauveria,
Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces,
Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Cryptococcus, Cyathus,
Endothia, Endotia mucor, Fusarium, Gilocladium, Humicola,
Magnaporthe, Myceliophthora, Myrothecium, Mucor, Neurospora,
Phanerochaete, Podospora, Paecilomyces, Penicillium,
Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophylum, Stagonospora, Talaromyces, Trichoderma, Thermomyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichophyton и Trametes pleurotus. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидные грибы включают, не ограничиваясь ими, следующие виды: A. nidulans, A. niger, А. awomari, например, NRRL 3112, АТСС 22342 (NRRL 3112), АТСС 44733, АТСС 14331 и штамм UVK 143f, A. oryzae, например, АТСС 11490, N. crassa, Trichoderma reesei, например, NRRL 15709, АТСС 13631, 56764, 56765, 56466, 56767, и Trichoderma viride, например, АТСС 32098 и 32086.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб по настоящему изобретению является Trichoderma. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб по настоящему изобретению является Trichoderma reesei. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные полипептиды могут быть выбраны из группы, включающей Humicola grisea, Acidothermus cellulolyticus, Thermobifida fusca или Penicillium funiculosum. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные полипептиды выбраны из Humicola grisea, Acidothermus cellulolyticus, Thermobifida, например, Thermobifida fusca, или Penicillium funiculosum, и гомологичный полипептид выбран из Trichoderma reesei.
В настоящем описании изобретения приведены типичные комбинации гетерологичных и гомологичных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные и гомологичные полипептиды функционально активной смеси могут быть выбраны из группы, состоящей из EGI, EGII, EGIII Т. reesei (соответственно CEL7B, 5А, 12А) , вариантов CEL12A, EGIII Н. grisea, Е5 и ЕЗ Т. fusca и El и GH74 A. cellulolyticus. В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные полипептиды функционально активной смеси могут представлять собой слитую конструкцию из экзо- и эндоцеллюлаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения слитый белок обладает разлагающей целлюлозу активностью благодаря наличию каталитического домена, выделенного из экзоцеллобиогидролазы грибов, и каталитического домена, выделенного из эндоглюканазы. Неограничивающие примеры приведены в публикации заявки на патент США № 20060057672.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные полипептиды функционально активной смеси могут быть вариантами CBHI Н. jecorina, фермента Се17. В некоторых вариантах осуществления изобретения целлобиогидролазы, которые включают, не ограничиваясь ими, целлобиогидролазы, описанные в публикациях заявок на патент США №№ 20050277172 и 20050054039, могут характеризоваться улучшенной термостойкостью и реверсивностью.
В некоторых вариантах осуществления изобретения гетерологичные полипептиды функционально активной смеси могут быть вариантами СВН2 Н. jecorina, фермента Се17. В некоторых вариантах осуществления изобретения целлобиогидролазы, которые включают, не ограничиваясь ими, целлобиогидролазы, описанные в публикации заявки на патент США № 20060205042, могут характеризоваться улучшенной термостойкостью и реверсивностью.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб является Т. reesei, первый гетерологичный полипептид является CBHI Humicola grisea, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой 1 Acidothermus cellulolyticus и гомологичный полипептид является CBHI Trichoderma reesei. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб является Т. reesei, первый гетерологичный полипептид или второй гетерологичный полипептид выбирают из группы, состоящей из целлобиогидролазы CBHI Penicillium funiculosum, зндоглюканаз ЕЗ Thermobifida, зндоглюканаз Е5 Thermobifida, GH74-core и GH48 Acidorhermus cellulolyticus.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб включает четвертый полинуклеотид, кодирующий третий гетерологичный полипептид. В данном случае первый полипептид является модифицированной CBHI Т. reesei, второй гетерологичный полипептид является модифицированной CBHII Т. reesei, третий гетерологичный полипептид является эндоглюканазой 1 Acidothermus cellulolyticus, и гомологичный полипептид является CBHI Т. reesei.
Настоящее изобретение относится также к функционально активным смесям с улучшенными свойствами и/или активностями. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой, и гомологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой. В данном случае первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид образуют смесь термостойких целлюлаз.
В некоторых вариантах осуществления изобретения
полинуклеотиды, кодирующие гетерологичные и гомологичные полипептиды, могут быть внехромосомными, то есть могут находиться в векторе или плазмиде, либо полинуклеотиды могут быть встроены в хромосомы нитевидного гриба-хозяина. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб-хозяин содержит по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий первый, второй или третий гетерологичный полипептид или гомологичный полипептид, встроенный в его геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб-хозяин содержит по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий первый, второй или третий гетерологичный полипептид или гомологичный полипептид, встроенный в его геном, и по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий гетерологичный или гомологичный полипептид, в устойчивом векторе, трансфицированном в гриб-хозяин .
В некоторых вариантах осуществления изобретения хозяином
является Т. reesei, содержащий по меньшей мере один
полинуклеотид, кодирующий первый или второй гетерологичный
полипептид или гомологичный полипептид, встроенный в его геном.
В некоторых вариантах осуществления изобретения хозяином
является Т. reesei, содержащий два полинуклеотида, встроенных в
его геном. Указанные полинуклеотиды кодируют первый, второй
или, в случае его наличия, третий гетерологичный полипептид или
гомологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления
изобретения один или несколько полинуклеотидов, экспрессирующих
гетерологичную или гомологичную экзоцеллобиогидролазу, встроены
в геном хозяина, являющегося Т. reesei. В некоторых вариантах
осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий
гетерологичную эндоглюканазу, встроен в геном хозяина,
являющегося Т. reesei. В некоторых вариантах осуществления
изобретения полинуклеотид, кодирующий гетерологичную
эндоглюканазу, и полинуклеотид, кодирующий гетерологичную или гомологичную экзоцеллобиогидролазу, встроены в геном хозяина, являющегося Т. reesei. Очевидно, что, когда только один или два из трех или четырех полинуклеотидов, кодирующих полипептиды функционально активной смеси, встроены в геном хозяина,
остальные полинуклеотиды трансфицированы в хозяина и присутствуют в векторе или плазмиде. В некоторых вариантах осуществления изобретения нитевидный гриб содержит первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, кодирующие соответственно первый гетерологичный полипептид и второй гетерологичный полипептид, и третий полинуклеотид, кодирующий гомологичный полипептид, при этом все три полинуклеотида являются внехромосомными.
Настоящее изобретение относится также к культуральной среде, содержащей популяцию вышеописанных нитевидных грибов. Культуральная среда может быть плотной, полутвердой или жидкой, причем среду выбирают в зависимости от хозяина, а также от экспрессируемых полипептидов.
Настоящее изобретение относится также к полипептидной смеси, включающей первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид, полученные из нитевидных грибов, рассмотренных в настоящем описании изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидная смесь является смесью ферментов или их доменов. В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептидная смесь является смесью целлюлаз, гемицеллюлаз, ксиланаз, маннаназ или их доменов.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения смеси полипептидов, который включает получение полипептидной смеси из нитевидных грибов по настоящему изобретению. Полипептидная смесь содержит первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь полипептидов содержит третий гетерологичный полипептид. Как было указано выше, смесь полипептидов является функционально активной смесью. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь полипептидов является смесью ферментов или их доменов. В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь полипептидов является смесью целлюлаз, гемицеллюлаз, ксиланаз, маннаназ или их доменов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения смесь
полипептидов является смесью целлюлаз, включающей первый
гетерологичный полипептид, который . является
экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид,
который является эндоглюканазой, и гомологичный полипептид,
который является экзоцеллобиогидролазой. В некоторых вариантах
осуществления изобретения смесь целлюлаз содержит первый
гетерологичный полипептид, который является первой
экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид, который является эндоглюканазой, и гомологичный полипептид, который является второй экзоцеллобиогидролазой. В данном случае первая экзоцеллобиогидролаза и вторая экзоцеллобиогидролаза являются одинаковыми целлобиогидролазами. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая и вторая экзоцеллобиогидролазы являются CBHI. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая и вторая экзоцеллобиогидролазы являются CBHII.
Как должно быть очевидно специалисту в данной области, в нитевидных грибах по настоящему изобретению может быть экспрессировано несколько других комбинаций гетерологичных и гомологичных полипептидов. Другая типичная смесь целлюлаз включает первый гетерологичный полипептид, который является CBHI Humicola grisea, второй гетерологичный полипептид, который является эндоглюканазой 1 Acidothermus cellulolyticus, и гомологичный полипептид, который является CBHI Trichoderma reesei.
Объекты настоящего изобретения могут быть лучше поняты при ознакомлении с приведенными ниже примерами, которые не ограничивают объем настоящего изобретения. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что в пределах объема настоящего изобретения могут быть использованы многочисленные модификации как материалов, так и способов.
7. Примеры
7.1. Пример 1. Создание трехкомпонентного штамма Трехкомпонентный штамм состоит из следующих трех частей: (i) штамма, продуцирующего целлюлазу Т. reesei; (ii) нуклеиновой кислоты, включающей ген cbhl Humicola grisea в указанном штамме; и (iii) гибрида экзо- и эндонуклеаз гена cbhl
Т. reesei с эндоглюканазой 1 Acidothermus cellulolyticus. Создание слитого вектора СВН1-Е1
Слитая конструкция СВН1-Е1 включала промотор гена cbhl Т.
reesei; последовательность гена cbhl Т. reesei от инициирующего
кодона до конца линкера cbhl и 12 дополнительных оснований от
5'-конца ДНК до начала кодирующей последовательности
эндоглюканазы, кодирующую последовательность эндоглюканазы,
терминирующий кодон и терминатор cbhl Т. reesei. Нуклеотидная
последовательность (SEQ ID N0:1) слитой конструкции
гетерологичной целлюлазы состоит из 2656 оснований (см. фигуру
1) и включает сигнальную последовательность cbhl Т. reesei;
каталитический домен cbhl Т. reesei; линкерную
последовательность cbhl Т. reesei; сайт расщепления кексином,
включающий кодоны для аминокислот SKR, и последовательность,
кодирующую каталитический домен GH5A-E1 Acidothermus
cellulolyticus. Прогнозируемая аминокислотная
последовательность (SEQ ID N0:2) слитого белка целлюлазы, созданная на основе последовательности нуклеиновой кислоты, показанной на фигуре 1, представлена на фигуре 2. 12 дополнительных оснований ДНК, ACTAGTAAGCGG (нуклеотиды 15651576 SEQ ID N0:1) кодируют рестрикционную эндонуклеазу Spel и аминокислоты Thr, Ser, Lys и Arg.
Плазмида El-pUC19, содержащая открытую рамку считывания для локуса гена Е1, была использована в качестве матричной ДНК при выполнении ПЦР. (Эквивалентные плазмиды описаны в патенте США № 5536655, в котором также рассмотрено клонирование гена Е1 из актиномицета Acidothermus cellulolyticus АТСС 43068, Mohagheghi A. et al., 1986). Стандартные методы работы с плазмидной ДНК и амплификации ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) описаны в публикации Sambrook, et al., 2001.
Приведенные ниже две затравки были использованы для амплификации кодирующей области каталитического домена эндоглюканазы Е1. Верхняя затравка 1=EL-316 (содержащая сайт Spel): GCTTATACTAGTAAGCGCGCGGGCGGCGGCTATTGGCACAC (SEQ ID N0:3); нижняя затравка 2=EL-317 (содержащая сайт AscI и комплекс
терминирующего кодона и нижнего комплемента):
GCTTATGGCGCGCCTTAGACAGGATCGAAAATCGACGAC (SEQ ID N0:4).
Обработку производили в нижеследующих условиях реакции с использованием материалов из набора ДНК-полимераз PLATINUM Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA) : 1 мкл основной смеси dNTP (конечная концентрация 0,2 мМ) ; 1 мкл затравки 1 (конечная концентрация 0,5 мкМ); 1 мкл затравки 2 (конечная концентрация 0,5 мкМ); 2 мкл матричной ДНК (конечная концентрация 50-200 нг) ; 1 мкл 50 мМ MgS04 (конечная концентрация 1 мМ); 5 мкл 10-кратного количества буфера для амплификации Pfx; 5 мкл 10-кратного количества раствора усилителя ПЦР; 1 мкл ДНК-полимеразы Platinum Pfx (всего 2,5 ед.); 33 мкл воды до достижения общего объема реакционной смеси, равного 50 мкл.
Параметры амплификации были следующими: стадия 1: 94°С в течение 2 минут (1-ый цикл служит только для денатурации антителосвязанной полимеразы); стадия 2: 94°С в течение 45 секунд; стадия 3: 60°С в течение 30 секунд; стадия 4: 68°С в течение 2 минут; стадия 5: повторное выполнении стадии 2 на протяжении 24 циклов; и стадия 6: 68°С в течение 4 минут.
Продукт ПЦР соответствующей величины клонировали в вектор
ТОРО Zero Blunt и трансфицировали в химически компетентные
клетки ToplO Е. coli (Invitrogen Corp., Carlsbad, Calif.),
высевали на соответствующую избирательную среду (среда LA,
содержащая 50 частей на миллион канамицина) и выращивали в
течение ночи при 37°С. Из среды собирали несколько колоний и
выращивали их в течение ночи при 37°С в избирательной среде
(среда LB, содержащая 50 частей на миллион канамицина) в виде 5
мл культур, из которых получали плазмидные минипрепараты.
Плазмидную ДНК из нескольких клонов расщепляли рестрикционными
ферментами для подтверждения правильной величины вставки.
Правильность последовательности подтверждали путем
секвенирования ДНК. После проверки последовательности из вектора ТОРО вырезали каталитический домен Е1, расщепляя рестрикционными ферментами Spel и Ascl. Указанный фрагмент лигировали в вектор рТгех4, который был расщеплен
рестрикционными ферментами Spel и AscI, как показано на фигуре 3.
Цитированную смесь трансфицировали в компетентные клетки ММ2 94 Е. coli, которые высевали на соответствующую избирательную среду (среда LA, содержащая 50 частей на миллион карбенициллина) и выращивали в течение ночи при 37°С. Из среды собирали несколько колоний и выращивали их в течение ночи при 37°С в избирательной среде (среда LB, содержащая 50 частей на миллион карбенициллина) в виде 5 мл культур, из которых получали плазмидные минипрепараты. Правильность лигирования векторов, содержащих слитый белок СВН1-Е1, подтверждали путем расщепления рестрикционными ферментами.
Создание вектора, экспрессирующего cbhl Н. grisea
Конструкция, экспрессирующая cbhl Н. grisea, включала промотор cbhl R. reesei; последовательность гена cbhl Н. grisea, терминатор cbhl Т. reesei и селектируемый маркер amdS A. nidulans. Указанные последовательности могут быть собраны рядом способов, известных специалистам в данной области, один из которых описан ниже.
Геномную ДНК экстрагировали из образца мицелия Humicola grisea var. thermoidea (CBS 225.63). Геномная ДНК может быть выделена любым методом, известным в данной области. Может быть выполнена следующая процедура.
Клетки выращивали при 4 5°С в 20 мл декстрозокартофельного бульона (PDB) в течение 24 часов. Клетки разводили в отношении 1:20 в свежей среде PDB и выращивали в течение ночи. Два миллилитра клеток центрифугировали и клеточный дебрис промывали в 1 мл КС (60 г КС1, 2 г лимонной кислоты на один литр, рН доводили до 6,2, добавляя 1 М раствор КОН). Клеточный дебрис ресуспендировали в 900 мкл КС. Добавляли 100 мкл (20 мг/мл) новозима, осторожно перемешивали и при 37°С под микроскопом следили за образованием протопластов, пока не было образовано более 90% протопластов в течение максимум 2 часов. Клетки центрифугировали со скоростью 1500 оборотов/мин (4600xG) в течение 10 минут. Добавляли 200 мкл TES/SDS (10 мМ трис, 50 мМ
EDTA, 150 мМ NaCl, 1% SDS), смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. ДНК выделяли, используя набор для выделения минипрепаратов Qiagen (Qiagen). Колонку элюировали 100 мкл воды milli-Q и собирали ДНК.
Альтернативным методом является метод FastPrep, служащий для выделения геномной ДНК из вида Н.grisea var thermoidea, выращиваемого на планшетах PDA при 4 5°С. Указанная система состоит из устройства FastPrep и набора FastPrep для выделения нуклеиновой кислоты. (Систему FastPrep можно приобрести в компании Qbiogene, MP Biomedicals, United States, 29525 Fountain Pkwy., Solon, OH 44139).
Затравки для амплификации гена cbhl Н. grisea методом ПЦР
были созданы на основе NCBI, номер доступа D63515. Указанные
затравки были предназначены для амплификации гена cbhl Н.
grisea от инициирующего кодона до терминатора.
Последовательность верхней затравки включала 4 нуклеотида САСС для облегчения клонирования в вектор pENTR ТОРО с целью использования системы клонирования Gateway (Invitrogen).
Верхняя затравка: 5' CACCATGCGTACCGCCAAGTTCGC 3' (SEQ ID N0:5).
Нижняя затравка: 5' TTACAGGCACTGAGAGTACCAG 3' (SEQ ID N0:6).
Условия выполнения ПЦР
Продукт ПЦР клонировали в вектор pENTR/D в соответствии с процедурой для системы Gateway компании Invitrogen. Затем вектор трансфицировали в химически компетентные клетки ТорЮ E.coli (Invitrogen), производя отбор клеток канамицином. Плазмидную ДНК из нескольких клонов расщепляли рестрикционными ферментами для подтверждения правильной величины вставки и затем секвенировали для подтверждения правильности последовательности. Плазмидную ДНК из одного клона добавляли к реакционную среду LR, содержащую клоназу (система Gateway компании Invitrogen) с ДНК целенаправленного вектора рТгехЗд/amdS.
Создание вектора рТгехЗд
В данном разделе описано создание основного вектора, используемого для экспрессии представляющих интерес генов. Вектор рТгехЗд был описан ранее; см. , например, публикацию заявки на патент США № 20070015266. Указанный вектор создан на основе вектора pSL1180 Е. coli (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA), который является вектором на основе фагомида pUC118 (Brosius, J. (1989) DNA 8:759) с удлиненным сайтом множественного клонирования, содержащим 64 шестичленные последовательности, узнаваемые рестрикционными ферментами. Созданный вектор является целенаправленным вектором системы Gateway (Hartley, J.L. et al., (2000) Genome Research 10: 17881795), который при помощи метода Gateway (Invitrogen) позволяет вставлять любую требуемую открытую рамку считывания между промоторной и терминирующей областями гена cbhl R. reesei. Ген amdS Aspergillus nidulans был вставлен для использования в качестве селектируемого маркера в процессе трансформации. Промотор и терминатор были расположены с возможностью экспрессии представляющего интерес гена.
Подробное описание вектора рТгехЗд
Указанный вектор имеет длину, равную 10,3 т.п.о. В полилинкерную область вектора pSL1180 вставлены следующие сегменты ДНК: (i) сегмент ДНК длиной 2,2 п. о. из промоторной области гена cbhl Т. reesei; (ii) кластер рамки считывания А Gateway длиной 1,7 т.п.о. компании Invitrogen, который включает сайты рекомбинации attRl и attR2 у конца, фланкирующего ген устойчивости к хлорамфениколу (CmR) и ген ccdB; (iii) сегмент ДНК длиной 33 6 п. о. из терминирующей области гена cbhl Т. reesei; и (iv) фрагмент ДНК длиной 2,7 т.п.о., содержащий ген amdS Aspergillus nidulans с нативными промоторной и терминирующей областями. На фигуре 4 показана плазмидная карта экспрессирующего вектора рТгехЗд Т. reesei.
Клон гена cbhl Н. grisea в вышеописанном векторе pENTR использовали для рекомбинации целенаправленного вектора рТгехЗд выполняемой в реакционной среде LR, содержащей клоназу, в соответствии с инструкциями изготовителя (Invitrogen). Гены CmR
и ccdB целенаправленного вектора рТгехЗд были заменены геном cbhl Н. grisea из вектора pENTR/D. В результате рекомбинации ген cbhl Н. grisea был вставлен непосредственно между промотором cbhl Т. reesei и терминатором cbhl Т. reesei целенаправленного вектора. В результате рекомбинации были получены последовательности AttB длиной 25 п.о., фланкирующие ген cbhl Н. grisea вверху и внизу. Аликвоту реакционной среды LR, содержащей клоназу, трансфицировали в . химически компетентные клетки TopiО Е. coli (Invitrogen), которые выращивали в течение ночи, производя отбор карбенициллином. Плазмидную ДНК из нескольких клонов расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами для подтверждения правильной величины вставки и затем секвенировали для подтверждения правильности последовательности. Чтобы получить ДНК для трансформации, плазмидную ДНК из правильного клона расщепляли эндонуклеазой Xbal для высвобождения экспрессирующего фрагмента, включающего промотор cbhl Т. reesei:reH cbhl Н. grisea:терминатор cbhl Т. reesei:ген amdS A. nidulans. Указанный фрагмент длиной 6,2 т.п.о. выделяли из ДНК Е. coli путем экстракции в агарозном геле при помощи стандартных методов и трансфицировали в штамм Т. reesei, полученный из общедоступного штамма QM6a в соответствии с приведенным ниже описанием. Экспрессирующий вектор, включающий два сайта Xbal, схематически изображен на фигуре 5А, и нуклеотидная последовательность (SEQ ID N0:7) экспрессирующего вектора показана на фигуре 5В.
Котрансформация и ферментация Trichoderma reesei В качестве штамма-хозяина для трансформации конструкциями по настоящему изобретению использовали производный штамм-хозяин RL-P37 Т. reesei (Sheir-Neiss, et al., 1984), который был подвергнут целому ряду стадий мутагенеза для увеличения продуцирования целлюлазы, включая делецию нативного гена cbhl (Suominen, P.L. et al., 1993, Mol. Gen. Genet. 241:523-30).
Биолитическую трансформацию Т. reesei при помощи конструкции, экспрессирующей cbhl Н. grisea, и слитой конструкции cbhl Т. reesei и El A. cellulolyticus выполняли
нижеописанным способом.
Получали взвесь спор (примерно 3,5*108 спор/мл) из штамма Т. reesei, являющегося производным Р-37. Примерно 100-200 мкл указанной взвеси пор распределяли в центре планшетов с ацетамидной средой ММ. Ацетамидная среда ММ имеет следующий состав: 0,6 г/л ацетамида; 1,68 г/л CsCl; 20 г/л глюкозы; 20 г/л КН2Р04; 0,6 г/л СаС12.2Н20; 1 мл/л 1000-кратного раствора следовых элементов; 20 г/л нобль-агара; рН 5,5. 1000-кратный раствор следовых элементов содержал 5,0 г/л FeS04.7H20, 1,6 г/л MnS04.H20, 1,4 г/л ZnS04.7H20 и 1,0 г/л СоС12.6Н20. Взвесь пор оставляли сохнуть на поверхности ацетамидной среды ММ в стерильном вытяжном шкафу.
Т. reesei трансформировали при помощи системы доставки частиц Biolistic(r) PDS-1000/Не компании Bio-Rad (Hercules, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя (Lorito, М. et al., 1993, Curr. Genet. 24:349-56). В микроцентрифужную пробирку вводили 60 мг частиц вольфрама М10. Добавляли 1 мл этанола, смесь интенсивно перемешивали в течение короткого периода времени и оставляли выстаиваться в течение 15 минут. Частицы центрифугировали со скоростью 15000 оборотов/мин в течение 15 минут. Этанол удаляли и частицы трижды промывали стерильной деионизированной Н20, после чего добавляли 1 мл 50% (об./об.) стерильного глицерина. Смесь интенсивно перемешивали в течение десяти секунд для суспендирования вольфрама, удаляли 25 мкл суспензии частиц вольфрама в глицерине и вводили в микроцентрифужную пробирку.
При непрерывном интенсивном перемешивании 25 мкл суспензии частиц вольфрама в глицерине добавляли нижеследующие вещества в указанном порядке и инкубировали смесь между добавлениями в течение 5 минут: 2 мкл (100-300 нг/мкл) вектора, экспрессирующего cbhl. Н. grisea (фрагмент, вырезанный Xbal), 2 мкл (100-300 нг/мкл) экспрессирующего вектора cbhl-El (фрагмент, вырезанный Xbal), 25 мкл 2,5М раствора СаС12 и 10 мкл 0,1М раствора спермидина. После добавления спермидина частицы инкубировали в течение 5 минут и центрифугировали в
течение 3 секунд. Супернатант удаляли, частицы промывали 200 мкл 70% (об. /об.) этанола и центрифугировали в течение 3 секунд. Супернатант удаляли, частицы промывали 200 мкл 100% этанола и центрифугировали в течение 3 секунд. Супернатант удаляли, добавляли 24 мкл 100% этанола и смешивали пипетированием. Пробирку помещали в ванну для ультразвуковой очистки примерно на 15 секунд для ресуспендирования частиц в этаноле. Во время нахождения пробирки в ванне для ультразвуковой очистки удаляли 8 мкл аликвоты суспендированных частиц и помещали в центр дисков макроносителя, которые устанавливали в сушильный шкаф.
Раствор вольфрама/ДНК после высушивания на макроносителе (примерно 15 минут) помещали в бомбардировочную камеру. Рядом помещали планшет с ацетамидной средой ММ со спорами, и производили бомбардировку, используя разрывные мембраны, находящиеся под давлением 77 атм (1100 фунтов/кв.дюйм), в соответствии с инструкциями изготовителя. После бомбардировки культивируемых спор частицами вольфрама/ДНК планшеты инкубировали при 28°С. Большие трансформированные колонии через 5 дней переносили на свежие вторичные планшеты с ацетамидной средой MM (Penttila et al., (1987) Gene 61:155-164) и инкубировали еще 3 дня при 28°С. Колонии, которые характеризовались плотным, непрозрачным ростом на вторичных планшетах, переносили на отдельные планшеты с ацетамидной средой ММ. Указанные колонии выращивали еще три дня, переносили на планшеты с декстрозокартофельным агаром (PDA) и инкубировали
в течение 7-10 дней при 28°С для споруляции.
Экспрессию ферментов трансформантами оценивали в двухкамерных встряхиваемых колбах. Трансформанты сначала выращивали во встряхиваемой колбе для инокулята, содержащей следующую среду: 22,5 г/л Proflo, 30 г/л а-лактозы.Н20, 6,5 г/л (NH4)2S04, 2 г/л КН2Р04, 0,3 г/л MgS04.7H20, 0,26 г/л СаС12.2Н20, 0,72 г/л СаСОз, 2 мл 10% твина 80, 1 мл 1000-кратного количества следовых солей TRI (1000-кратное количество следовых солей TRI состоит из: 5 г/л FeS04.7H20, 1,6 г/л MnS04.H20, 1,4
г/л ZnS04.7H20). Условия выращивания были следующими: 50 мл среды в 250-мл встряхиваемой колбе с 4 перегородками (Bellco Biotechnology, 340 Edrudo Road, Vineland, NJ 08360, USA), инкубация при 28°C, скорость встряхивания 225 оборотов/мин с диаметром вращения 2,5 см). Трансформанты инокулировали во встряхиваемых колбах для инокулята, перенося кусочки PDA размером 4 см2, содержащие мицелий и споры трансформанта.
После выращивания в колбе для инокулята в течение 2 дней 5 мл переносили во встряхиваемую колбу для экспрессии, содержащую 50 мл следующей среды: 5 г/л (NH4)2S04, 33 г/л буфера PIPPS, 9 г/л кислот Bacto Casamino, 4,5 г/л КН2Р04, 1,32 г/л СаС12.2Н20, 1 г/л MgS04.7H20, 5 мл антивспенивателя Mazu DF204, 2,5 мл 400-кратного количества следовых солей Т. reesei (400-кратное количество следовых солей Т. reesei состоит из: 175 г/л лимонной кислоты (безводной), 200 г/л FeS04.7H20, 16 г/л ZnS04.7H20, 3,2 г/л CuS04.5H20, 1,4 г/л MnS04.H20, 0,8 г/л Н3В03, добавляемых в указанном порядке), рН доводили до 5,5, среду стерилизовали, производили постстерилизацию и добавляли 4 0 мл 40% лактозы. Культуру выращивали во встряхиваемой колбе для экспрессии в следующих условиях: 250-мл встряхиваемая колба с 4 перегородками, инкубация при 28°С, скорость встряхивания 225 оборотов/мин. Образец удаляли через 5 дней, супернатант анализировали на белковых гелях для SDS-PAGE и окрашивали кумасси.
7.2. Пример 2. Создание четырехкомпонентного штамма Был создан штамм, включающий четыре части: (i) штамм-хозяин, состоящий из продуцирующего штамма с делецией гена cbhl; (ii) последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессии слитого гена cbhl-El; (iii) последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессии термостойкого гена cbhl Т. reesei генетически созданного белка и (iv) последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессии термостойкого гена cbhll Т. reesei генетически созданного белка. ДНК всех трех экспрессирующих фрагментов котрансфицировали в продуцирующий штамм с делецией гена cbhl, как показано на фигуре 6.
Трансформанты Т. reesei исследовали в присутствии всех трех экспрессирующих фрагментов, встроенных в геном. Были созданы пары затравок для ПЦР, предназначенные для амплификации каждого из трех экспрессирующх фрагментов. Для ферментации во встряхиваемых колбах были выбраны 32 трансформанта, которые по результатам ПЦР характеризовались наличием всех трех экспрессирующих фрагментов. Культуры во встряхиваемых колбах выращивали в течение трех дней, брали образцы супернатанта и исследовали в 8% трис-глициновых гелях NuPAGE (Invitrogen) (1 мм) в разделяющем буфере для трис-глицинового геля с додецилсульфатом натрия (SDS). Образцы инкубировали при 100°С в течение 7 минут, затем на льду в течение 5 минут и загружали в количестве 20 мкл/полосу за исключением особо оговоренных случаев (8 мкл супернатанта + 2 мкл восстановителя + 10 мкл 2-кратного количества буфера для трис-глицинового геля с SDS). Некоторые из 32 образцов характеризовались высоким уровнем экспрессированных генов, о чем свидетельствуют полосы белка.
ДНК, кодирующую вариант аминокислотной последовательности
генов cbhl и cbhll Т. reesei, можно получить разными методами,
известными в данной области. Такие методы включают, не
ограничиваясь ими, синтез генов, сайтнаправленный мутагенез
(или сайтнаправленный мутагенез с использованием
олигонуклеотидов), мутагенез методом ПЦР и кластерный мутагенез ранее полученной ДНК, кодирующей последовательность кДНК Т. reesei.
Вектор был создан на основе вектора рТгехЗд, экспрессирующего ген cbhl Т. reesei генетически созданного фермента, кодирующий генетически созданный белок со следующими мутациями в зрелой аминокислотной последовательности: S8P+T41I+N4 9S+A68T+N8 9D+S92T+
S113N+S196T+P22 7L+D2 4 9K+T2 55P+S27 8P+E295K+T2 96P+T322Y+V4 03D+S41 1F. Последовательность ДНК от инициирующего кодона до терминирующего кодона имела 1545 оснований (SEQ ID N0:8), как показано на фигуре 7А. Последовательность генетически созданного белка CBHI (SEQ ID N0:9) показана на фигуре 7В
(сигнальная последовательность CBHI подчеркнута). cbhl-Экспрессирующий вектор рТгехЗд-cbhl схематически изображен на фигуре 8А. Последовательность ДНК экспрессирующего вектора рТгехЗд-cbhl имела 10145 оснований (SEQ ID N0:10), как показано на фигуре 8В.
Был создан вектор для экспрессии белка CBHII генетически созданного фермента. Указанный вектор включал промотор cbhll, генетически созданный ген cbhll, терминатор cbhll, ацетамидазу A. nidulans (amdS) в качестве селектируемого маркера и дополнительную 3'-концевую фланкирующую последовательность терминатора cbhll. Данный вектор был создан с использованием шаттл-вектора pCR-XL-TOPO (Invitrogen) . Экспрессирующая часть вектора была вырезана из шаттл-вектора путем расщепления плазмиды специальными рестрикционными эндонуклеазами NotI и Srfl, образующими фрагмент длиной примерно 10,68 т.п.о., который был использован для трансформации Т. reesei.
Указанный вектор экспрессировал ген cbhll Т. reesei, кодирующий генетически созданный белок со следующими мутациями в аминокислотной последовательности: P98L, M134V, Т154А, I212V, S316P и S413Y. Последовательность ДНК от инициирующего кодона до терминирующего кодона имела 1416 оснований (SEQ ID N0:11), как показано на фигуре 9А. Аминокислотная последовательность (SEQ ID N0:12) показана на фигуре 9В (сигнальная последовательность подчеркнута). Вектор, экспрессирующий cbhll, схематически изображен на фигуре 10А. Последовательность ДНК всего cbhll-экспрессирующего вектора pExp-cbhll имела 14158 оснований (SEQ ID N0:11), как показано на фигуре 10В.
Котрансформацию штамма Т. reesei с делецией cbhl выполняли, используя три фрагмента ДНК.
Генетически созданный cbhll-экспрессирующий фрагмент был вырезан из плазмиды pExp-cbhll ферментами NotI и Srfl.
Генетически созданный ген cbhl в экспрессирующем векторе рТгехЗд использовали в качестве матрицы для ПЦР с целью создания линейного фрагмента только промотора cbhl, генетически созданного гена cbhl и терминатора cbhl (без маркера amdS). Слитый фрагмент cbhl-El, описанный в предыдущем примере, был
использован в качестве матрицы для ПЦР с целью создания линейного фрагмента, состоящего из промотора cbhl, слитого гена cbhl-El и терминатора cbhl (без маркера amdS). Три указанных фрагмента были использованы для покрытия частиц вольфрама в процессе биолитической котрансформации. Указанную процедуру выполняли в соответствии с описанием, приведенным в предыдущем примере. В процессе котрансформации каждый из трех фрагментов 1, 2 и 3 добавляли к частицам вольфрама в объеме 1,5 мкл (концентрация ДНК 100-300 нг/мкл). Отбор трансформантов производили в ацетамидной среде ММ в соответствии с приведенным описанием.
7.3. Пример 3. Анализ разлагающей целлюлозу активности трансформированных клонов Trichoderma reesei
Разлагающую целлюлозу активность слитого белка CBHI-EI определяли при помощи нижеследующих анализов с использованием указанных субстратов. Штаммы Tr-А и Tr-D Trichoderma reesei были получены из RL-P37 путем мутагенеза.
Предварительная обработка кукурузной соломы (PCS): кукурузную солому предварительно обрабатывали 2% масс./масс. H2SO4 в соответствии с описанием, приведенным в публикации Schell, D. et al., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 105:69-86 (2003), и затем несколько раз промывали деионизированной водой до достижения рН, равного 4,5. Добавляли ацетат натрия до конечной концентрации, равной 50 мМ, и титровали до рН 5,0.
Измерение общего белка: концентрации белка измеряли методом на основе бицинхониновой кислоты, используя бычий сывороточный альбумин в качестве эталона (Smith, Р.К., et al. (1985) Anal. Buiochem. 150:76-85).
Конверсию целлюлозы (определение растворимого сахара) оценивали при помощи ВЭЖХ методами, описанными в публикации Baker et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72:395-403 (1998).
При выполнении экспериментов использовали стандартный анализ конверсии целлюлозы. В данном анализе фермент и забуференный субстрат помещали в контейнеры и инкубировали при определенной температуре в течение определенного периода времени. Реакцию гасили 100 мМ глицина, рН 11,0, с целью
доведения значения рН реакционной смеси по меньшей мере до рН 10. После того как реакция была погашена, аликвоту реакционной смеси фильтровали через 0,2-микронную фильтрующую мембрану для удаления твердых веществ. Фильтрованный раствор анализировали в отношении растворимых Сахаров вышеописанным методом ВЭЖХ. Концентрация целлюлозы в реакционной смеси была равна примерно 7%. Фермент или смеси ферментов вводили в количестве 1-60 мг общего белка на грамм целлюлозы.
В приведенной ниже таблице 1 суммированы данные, свидетельствующие о более высокой удельной производительности четырехкомпонентного штамма по сравнению с модифицированным штаммом Tr-D.
мг/г Четырехкомпонентный штамм Модифицированный штамм Tr-D
10 9,5 5,1
20 14,2 8,1
PCS (13%), SSC, 20 часов, 65°С
В приведенной ниже таблице 2 суммированы данные,
свидетельствующие о более высокой удельной производительности
трехкомпонентного штамма по сравнению со штаммом Тг-А.
мг/г Трехкомпонентный штамм Штамм Тг-А
15 61 45
10 45 31
PCS (13%), SSC, 72 часа, 59°С
Все ссылки и публикации, приведенные в настоящем описании изобретения, полностью включены в описание изобретения в качестве ссылки. Следует отметить, что существуют альтернативные способы осуществления настоящего изобретения. Таким образом, приведенные варианты осуществления изобретения следует рассматривать как иллюстративные и не ограничивающие объем изобретения, поэтому настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами и может быть модифицировано в пределах объема и эквивалентов прилагаемой формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Danisco US Inc., Genencor Div. Bowers, Benjamin S. Larenas, Edmund A.
<120> Система экспрессии гетерологичных и гомологичных целлюлаз
<130> 30984WO
<150> US 60/933,894 <151> 2007-06-08
<160> 14
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 2656
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> смесь Trichoderma reesei, Acidothermus cellulolyticus и
синтетических последовательностей
<400> 1 atgtatcgga
agttggccgt
catctcggcc
ttcttggcca
cagctcgtgc
tcagtcggcc
tgcactctcc
aatcggagac
tcacccgcct
ctgacatggc
agaaatgctc
gtctggtggc
120
acttgcactc
aacagacagg
ctccgtggtc
atcgacgcca
actggcgctg
gactcacgct
180
acgaacagca
gcacgaactg
ctacgatggc
aacacttgga
gctcgaccct
atgtcctgac
240
aacgagacct
gcgcgaagaa
ctgctgtctg
gacggtgccg
cctacgcgtc
cacgtacgga
300
gttaccacga
gcggtaacag
cctctccatt
ggctttgtca
cccagtctgc
gcagaagaac
360
gttggcgctc
gcctttacct
tatggcgagc
gacacgacct
accaggaatt
caccctgctt
420
ggcaacgagt
tctctttcga
tgttgatgtt
tcgcagctgc
cgtaagtgac
ttaccatgaa
480
cccctgacgt
atcttcttgt
gggctcccag
ctgactggcc
aatttaaggt
gcggcttgaa
540
cggagctctc
tacttcgtgt
ccatggacgc
ggatggtggc
gtgagcaagt
atcccaccaa
600
caccgctggc
gccaagtacg
gcacggggta
ctgtgacagc
cagtgtcccc
gcgatctgaa
660
gttcatcaat
ggccaggcca
acgttgaggg
ctgggagccg
tcatccaaca
acgcaaacac
720
gggcattgga
ggacacggaa
gctgctgctc
tgagatggat
atctgggagg
ccaactccat
780
ctccgaggct
cttacccccc
acccttgcac
gactgtcggc
caggagatct
gcgagggtga
840
tgggtgcggc
ggaacttact
ccgataacag
atatggcggc
acttgcgatc
ccgatggctg
900
cgactggaac
ccataccgcc
tgggcaacac
cagcttctac
ggccctggct
caagctttac
960
cctcgatacc
accaagaaat
tgaccgttgt
cacccagttc
gagacgtcgg
gtgccatcaa
1020
ccgatactat
gtccagaatg
gcgtcacttt
ccagcagccc
aacgccgagc
ttggtagtta
1080
ctctggcaac
gagctcaacg
atgattactg
cacagctgag
gaggcagaat
tcggcggatc
1140
ctctttctca
gacaagggcg
gcctgactca
gttcaagaag
gctacctctg
gcggcatggt
1200
tctggtcatg
agtctgtggg
atgatgtgag
tttgatggac
aaacatgcgc
gttgacaaag
1260
agtcaagcag
ctgactgaga
tgttacagta
ctacgccaac
atgctgtggc
tggactccac
1320
ctacccgaca
aacgagacct
cctccacacc
cggtgccgtg
cgcggaagct
gctccaccag
1380
ctccggtgtc
cctgctcagg
tcgaatctca
gtctcccaac
gccaaggtca
ccttctccaa
1440
catcaagttc
ggacccattg
gcagcaccgg
caaccctagc
ggcggcaacc
ctcccggcgg
1500
aaacccgcct
ggcaccacca
ccacccgccg
cccagccact
accactggaa
gctctcccgg
1560
acctactagt
aagcgggcgg
gcggcggcta
ttggcacacg
agcggccggg
agatcctgga
1620
cgcgaacaac
gtgccggtac
ggatcgccgg
catcaactgg
tttgggttcg
aaacctgcaa
1680
ttacgtcgtg
cacggtctct
ggtcacgcga
ctaccgcagc
atgctcgacc
agataaagtc
1740
gctcggctac
aacacaatcc
ggctgccgta
ctctgacgac
attctcaagc
cgggcaccat
1800
gccgaacagc
atcaattttt
accagatgaa
tcaggacctg
cagggtctga
cgtccttgca
1860
ggtcatggac
aaaatcgtcg
cgtacgccgg
tcagatcggc
ctgcgcatca
ttcttgaccg
1920
ccaccgaccg
gattgcagcg
ggcagtcggc
gctgtggtac
acgagcagcg
tctcggaggc
1980
tacgtggatt
tccgacctgc
aagcgctggc
gcagcgctac
aagggaaacc
cgacggtcgt
2040
cggctttgac
ttgcacaacg
agccgcatga
cccggcctgc
tggggctgcg
gcgatccgag
2100
catcgactgg
cgattggccg
ccgagcgggc
cggaaacgcc
gtgctctcgg
tgaatccgaa
2160
cctgctcatt
ttcgtcgaag
gtgtgcagag
ctacaacgga
gactcctact
ggtggggcgg
2220
caacctgcaa
ggagccggcc
agtacccggt
cgtgctgaac
gtgccgaacc
gcctggtgta
2280
ctcggcgcac
gactacgcga
cgagcgtcta
cccgcagacg
tggttcagcg
atccgacctt
2340
ccccaacaac
atgcccggca
tctggaacaa
gaactgggga
tacctcttca
atcagaacat
2400
tgcaccggta
tggctgggcg
aattcggtac
gacactgcaa
tccacgaccg
accagacgtg
2460
gctgaagacg
ctcgtccagt
acctacggcc
gaccgcgcaa
tacggtgcgg
acagcttcca
2520
gtggaccttc
tggtcctgga
accccgattc
cggcgacaca
ggaggaattc
tcaaggatga
2580
ctggcagacg
gtcgacacag
taaaagacgg
ctatctcgcg
ccgatcaagt
cgtcgatttt
2640
cgatcctgtc
ggctaa
2656
<210> 2
<211> 841
<212> белок
<213> Искусственная
<220>
<223> смесь Trichoderma reesei, Acidothermus cellulolyticus и синтетических последовательностей
<220>
<221> сигнальная последовательность <222> (1) . . (17)
<400> 2
Met Туг Arg Lys Leu Ala Val He Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
15 10 15
Ala Gin Ser Ala Cys Thr Leu Gin Ser Glu Thr His Pro Pro Leu Thr
20 25 30
Trp Gin Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gin Gin Thr Gly Ser
35 4 0 4 5
Val Val He Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Ala Thr Asn Ser Ser
50 55 60
Thr Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp
65 70 75 80
Asn Glu Thr Cys Ala Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala
85 90 95
Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Ser He Gly Phe
100 105 110
Val Thr Gin Ser Ala Gin Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
115 120 125
Ala Ser Asp Thr Thr Tyr Gin Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
130 135 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gin Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gin
180 185 190
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe He Asn Gly Gin Ala Asn Val Glu Gly
195 200 205
Trp Glu Pro Ser Ser Asn Asn Ala Asn Thr Gly He Gly Gly His Gly
210 215 220
Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp He Trp Glu Ala Asn Ser He Ser Glu
225 230 235 240
Ala Leu Thr Pro His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gin Glu He Cys Glu
245 250 255
Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Asp Asn Arg Tyr Gly Gly Thr
260 265 270
Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
275 280 285
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys
290 295 300
Leu Thr Val Val Thr Gin Phe Glu Thr Ser Gly Ala He Asn Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Val Gin Asn Gly Val Thr Phe Gin Gin Pro Asn Ala Glu Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu
340 345 350
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gin
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
370 375 380
Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
385 390 395 400
Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr
405 410 415
Ser Ser Gly Val Pro Ala Gin Val Glu Ser Gin Ser Pro Asn Ala Lys
420 425 430
Val Thr Phe Ser Asn He Lys Phe Gly Pro He Gly Ser Thr Gly Asn
4 35 4 40 445
Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr
450 455 460
Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Ser
465 470 475 480
Lys Arg Ala Gly Gly Gly Tyr Trp His Thr Ser Gly Arg Glu He Leu
485 490 495
Asp Ala Asn Asn Val Pro Val Arg He Ala Gly He Asn Trp Phe Gly
500 505 510
Phe Glu Thr Cys Asn Tyr Val Val His Gly Leu Trp Ser Arg Asp Tyr
515 520 525
Arg Ser Met Leu Asp Gin He Lys Ser Leu Gly Tyr Asn Thr He Arg
530 535 540
Leu Pro Tyr Ser Asp Asp He Leu Lys Pro Gly Thr Met Pro Asn Ser
545 550 555 560
He Asn Phe Tyr Gin Met Asn Gin Asp Leu Gin Gly Leu Thr Ser Leu
565 570 575
Gin Val Met Asp Lys He Val Ala Tyr Ala Gly Gin He Gly Leu Arg
580 585 590
He He Leu Asp Arg His Arg Pro Asp Cys Ser Gly Gin Ser Ala Leu
595 600 605
Trp Tyr Thr Ser Ser Val Ser Glu Ala Thr Trp He Ser Asp Leu Gin
610 615 620
Ala Leu Ala Gin Arg Tyr Lys Gly Asn Pro Thr Val Val Gly Phe Asp
625 630 635 640
Leu His Asn Glu Pro His Asp Pro Ala Cys Trp Gly Cys Gly Asp Pro
645 650 655
Ser He Asp Trp Arg Leu Ala Ala Glu Arg Ala Gly Asn Ala Val Leu
660 665 670
Ser Val Asn Pro Asn Leu Leu He Phe Val Glu Gly Val Gin Ser Tyr
675 680 685
Asn Gly Asp Ser Tyr Trp Trp Gly Gly Asn Leu Gin Gly Ala Gly Gin
690 695 700
Tyr Pro Val Val Leu Asn Val Pro Asn Arg Leu Val Tyr Ser Ala His
705 710 715 720
Asp Tyr Ala Thr Ser Val Tyr Pro Gin Thr Trp Phe Ser Asp Pro Thr
725 730 735
Phe Pro Asn Asn Met Pro Gly He Trp Asn Lys Asn Trp Gly Tyr Leu
740 745 750
Phe Asn Gin Asn He Ala Pro Val Trp Leu Gly Glu Phe Gly Thr Thr
755 760 765
Leu Gin Ser Thr Thr Asp Gin Thr Trp Leu Lys Thr Leu Val Gin Tyr
770 775 780
Leu Arg Pro Thr Ala Gin Tyr Gly Ala Asp Ser Phe Gin Trp Thr Phe
785 790 795 800
Trp Ser Trp Asn Pro Asp Ser Gly Asp Thr Gly Gly He Leu Lys Asp
805 810 815
Asp Trp Gin Thr Val Asp Thr Val Lys Asp Gly Tyr Leu Ala Pro He
820 825 830
Lys Ser Ser He Phe Asp Pro Val Gly
8 35 84 0
<210> 3
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> верхняя затравка для ПЦР
<400> 3
gcttatacta gtaagcgcgc gggcggcggc tattggcaca с 41
<210> 4
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> нижняя затравка для ПЦР
<400> 4
gcttatggcg cgccttagac aggatcgaaa atcgacgac
<210> 5
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> верхняя затравка для ПЦР
<400> 5
caccatgcgt accgccaagt tcgc 24
<210> <211>
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> нижняя затравка для ПЦР
<400> 6
ttacaggcac tgagagtacc ag 22
<210> 7
<211> 10232
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> экспрессирующий вектор pTrex3g-Hgrisea-cbhl
<400> 7 aagcttacta
gtacttctcg
agctctgtac
atgtccggtc
gcgacgtacg
cgtatcgatg
gcgccagctg
caggcggccg
cctgcagcca
cttgcagtcc
cgtggaattc
tcacggtgaa
120
tgtaggcctt
ttgtagggta
ggaattgtca
ctcaagcacc
cccaacctcc
attacgcctc
180
ccccatagag
ttcccaatca
gtgagtcatg
gcactgttct
caaatagatt
ggggagaagt
240
tgacttccgc
ccagagctga
aggtcgcaca
accgcatgat
atagggtcgg
caacggcaaa
300
aaagcacgtg
gctcaccgaa
aagcaagatg
tttgcgatct
aacatccagg
aacctggata
360
catccatcat
cacgcacgac
cactttgatc
tgctggtaaa
ctcgtattcg
ccctaaaccg
420
aagtgcgtgg
taaatctaca
cgtgggcccc
tttcggtata
ctgcgtgtgt
cttctctagg
480
tgccattctt
ttcccttcct
ctagtgttga
attgtttgtg
ttggagtccg
agctgtaact
540
acctctgaat
ctctggagaa
tggtggacta
acgactaccg
tgcacctgca
tcatgtatat
600
aatagtgatc
ctgagaaggg
gggtttggag
caatgtggga
ctttgatggt
catcaaacaa
660
agaacgaaga
cgcctctttt
gcaaagtttt
gtttcggcta
cggtgaagaa
ctggatactt
720
gttgtgtctt
ctgtgtattt
ttgtggcaac
aagaggccag
agacaatcta
ttcaaacacc
780
aagcttgctc
ttttgagcta
caagaacctg
tggggtatat
atctagagtt
gtgaagtcgg
840
taatcccgct
gtatagtaat
acgagtcgca
tctaaatact
ccgaagctgc
tgcgaacccg
900
gagaatcgag
atgtgctgga
aagcttctag
cgagcggcta
aattagcatg
aaaggctatg
960
agaaattctg
gagacggctt
gttgaatcat
ggcgttccat
tcttcgacaa
gcaaagcgtt
1020
ccgtcgcagt
agcaggcact
cattcccgaa
aaaactcgga
gattcctaag
tagcgatgga
1080
accggaataa
tataataggc
aatacattga
gttgcctcga
cggttgcaat
gcaggggtac
1140
tgagcttgga
cataactgtt
ccgtacccca
cctcttctca
acctttggcg
tttccctgat
1200
tcagcgtacc
cgtacaagtc
gtaatcacta
ttaacccaga
ctgaccggac
gtgttttgcc
1260
cttcatttgg
agaaataatg
tcattgcgat
gtgtaatttg
cctgcttgac
cgactggggc
1320
tgttcgaagc
ccgaatgtag
gattgttatc
cgaactctgc
tcgtagaggc
atgttgtgaa
1380
tctgtgtcgg
gcaggacacg
cctcgaaggt
tcacggcaag
ggaaaccacc
gatagcagtg
1440
tctagtagca
acctgtaaag
ccgcaatgca
gcatcactgg
aaaatacaaa
ccaatggcta
1500
aaagtacata
agttaatgcc
taaagaagtc
atataccagc
ggctaataat
tgtacaatca
1560
agtggctaaa
cgtaccgtaa
tttgccaacg
gcttgtgggg
ttgcagaagc
aacggcaaag
1620
ccccacttcc
ccacgtttgt
ttcttcactc
agtccaatct
cagctggtga
tcccccaatt
1680
gggtcgcttg
tttgttccgg
tgaagtgaaa
gaagacagag
gtaagaatgt
ctgactcgga
1740
gcgttttgca
tacaaccaag
ggcagtgatg
gaagacagtg
aaatgttgac
attcaaggag
1800
tatttagcca
gggatgcttg
agtgtatcgt
gtaaggaggt
ttgtctgccg
atacgacgaa
1860
tactgtatag
tcacttctga
tgaagtggtc
catattgaaa
tgtaaagtcg
gcactgaaca
1920
ggcaaaagat
tgagttgaaa
ctgcctaaga
tctcgggccc
tcgggccttc
ggcctttggg
1980
tgtacatgtt
tgtgctccgg
gcaaatgcaa
agtgtggtag
gatcgaacac
actgctgcct
2040
ttaccaagca
gctgagggta
tgtgataggc
aaatgttcag
gggccactgc
atggtttcga
2100
atagaaagag
aagcttagcc
aagaacaata
gccgataaag
atagcctcat
taaacggaat
2160
gagctagtag
gcaaagtcag
cgaatgtgta
tatataaagg
ttcgaggtcc
gtgcctccct
2220
catgctctcc
ccatctactc
atcaactcag
atcctccagg
agacttgtac
accatctttt
2280
gaggcacaga
aacccaatag
tcaaccatca
caagtttgta
caaaaaagca
ggctatgcgt
2340
accgccaagt
tcgccaccct
cgccgccctt
gtggcctcgg
ccgccgccca
gcaggcgtgc
2400
agtctcacca
ccgagaggca
cccttccctc
tcttggaaga
agtgcaccgc
cggcggccag
2460
tgccagaccg
tccaggcttc
catcactctc
gactccaact
ggcgctggac
tcaccaggtg
2520
tctggctcca
ccaactgcta
cacgggcaac
aagtgggata
ctagcatctg
cactgatgcc
2580
aagtcgtgcg
ctcagaactg
ctgcgtcgat
ggtgccgact
acaccagcac
ctatggcatc
2640
accaccaacg
gtgattccct
gagcctcaag
ttcgtcacca
agggccagca
ctcgaccaac
2700
gtcggctcgc
gtacctacct
gatggacggc
gaggacaagt
atcagagtac
gttctatctt
2760
cagccttctc
gcgccttgaa
tcctggctaa
cgtttacact
tcacagcctt
cgagctcctc
2820
ggcaacgagt
tcaccttcga
tgtcgatgtc
tccaacatcg
gctgcggtct
caacggcgcc
2880
ctgtacttcg
tctccatgga
cgccgatggt
ggtctcagcc
gctatcctgg
caacaaggct
2940
ggtgccaagt
acggtaccgg
ctactgcgat
gctcagtgcc
cccgtgacat
caagttcatc
3000
aacggcgagg
ccaacattga
gggctggacc
ggctccacca
acgaccccaa
cgccggcgcg
3060
ggccgctatg
gtacctgctg
ctctgagatg
gatatctggg
aagccaacaa
catggctact
3120
gccttcactc
ctcacccttg
caccatcatt
ggccagagcc
gctgcgaggg
cgactcgtgc
3180
ggtggcacct
acagcaacga
gcgctacgcc
ggcgtctgcg
accccgatgg
ctgcgacttc
3240
aactcgtacc
gccagggcaa
caagaccttc
tacggcaagg
gcatgaccgt
cgacaccacc
3300
aagaagatca ctgtcgtcac ccagttcctc aaggatgcca acggcgatct cggcgagatc 3360
aagcgcttct acgtccagga tggcaagatc atccccaact ccgagtccac catccccggc 3420
gtcgagggca attccatcac ccaggactgg tgcgaccgcc agaaggttgc ctttggcgac 3480
attgacgact tcaaccgcaa gggcggcatg aagcagatgg gcaaggccct cgccggcccc 3540
atggtcctgg tcatgtccat ctgggatgac cacgcctcca acatgctctg gctcgactcg 3600
accttccctg tcgatgccgc tggcaagccc ggcgccgagc gcggtgcctg cccgaccacc 3660
tcgggtgtcc ctgctgaggt tgaggccgag gcccccaaca gcaacgtcgt cttctccaac 3720
atccgcttcg gccccatcgg ctcgaccgtt gctggtctcc ccggcgcggg caacggcggc 3780
aacaacggcg gcaacccccc gccccccacc accaccacct cctcggctcc ggccaccacc 3840
accaccgcca gcgctggccc caaggctggc cgctggcagc agtgcggcgg catcggcttc 3900
actggcccga cccagtgcga ggagccctac acttgcacca agctcaacga ctggtactct 3960
cagtgcctgt aaacccagct ttcttgtaca aagtggtgat cgcgccagct ccgtgcgaaa 4020
gcctgacgca ccggtagatt cttggtgagc ccgtatcatg acggcggcgg gagctacatg 4080
gccccgggtg atttattttt tttgtatcta cttctgaccc ttttcaaata tacggtcaac 4140
tcatctttca ctggagatgc ggcctgcttg gtattgcgat gttgtcagct tggcaaattg 4200
tggctttcga aaacacaaaa cgattcctta gtagccatgc attttaagat aacggaatag 4260
aagaaagagg aaattaaaaa aaaaaaaaaa acaaacatcc cgttcataac ccgtagaatc 4320
gccgctcttc gtgtatccca gtaccagttt attttgaata gctcgcccgc tggagagcat 4380
cctgaatgca agtaacaacc gtagaggctg acacggcagg tgttgctagg gagcgtcgtg 4440
ttctacaagg ccagacgtct tcgcggttga tatatatgta tgtttgactg caggctgctc 4500
agcgacgaca gtcaagttcg ccctcgctgc ttgtgcaata atcgcagtgg ggaagccaca 4560
ccgtgactcc catctttcag taaagctctg ttggtgttta tcagcaatac acgtaattta 4620
aactcgttag catggggctg atagcttaat taccgtttac cagtgccatg gttctgcagc 4680
tttccttggc ccgtaaaatt cggcgaagcc agccaatcac cagctaggca ccagctaaac 4740
cctataatta gtctcttatc aacaccatcc gctcccccgg gatcaatgag gagaatgagg 4800
gggatgcggg gctaaagaag cctacataac cctcatgcca actcccagtt tacactcgtc 4860
gagccaacat cctgactata agctaacaca gaatgcctca atcctgggaa gaactggccg 4920
ctgataagcg cgcccgcctc gcaaaaacca tccctgatga atggaaagtc cagacgctgc 4980
ctgcggaaga cagcgttatt gatttcccaa agaaatcggg gatcctttca gaggccgaac 5040
tgaagatcac agaggcctcc gctgcagatc ttgtgtccaa gctggcggcc ggagagttga 5100
cctcggtgga agttacgcta gcattctgta aacgggcagc aatcgcccag cagttagtag 5160
ggtcccctct acctctcagg gagatgtaac aacgccacct tatgggacta tcaagctgac 5220
gctggcttct gtgcagacaa actgcgccca cgagttcttc cctgacgccg ctctcgcgca 5280
ggcaagggaa ctcgatgaat actacgcaaa gcacaagaga cccgttggtc cactccatgg 5340
cctccccatc tctctcaaag accagcttcg agtcaaggta caccgttgcc cctaagtcgt 5400
tagatgtccc tttttgtcag ctaacatatg ccaccagggc tacgaaacat caatgggcta 5460
catctcatgg ctaaacaagt acgacgaagg ggactcggtt ctgacaacca tgctccgcaa 5520
agccggtgcc gtcttctacg tcaagacctc tgtcccgcag accctgatgg tctgcgagac 5580
agtcaacaac atcatcgggc gcaccgtcaa cccacgcaac aagaactggt cgtgcggcgg 5640
cagttctggt ggtgagggtg cgatcgttgg gattcgtggt ggcgtcatcg gtgtaggaac 5700
ggatatcggt ggctcgattc gagtgccggc cgcgttcaac ttcctgtacg gtctaaggcc 5760
gagtcatggg cggctgccgt atgcaaagat ggcgaacagc atggagggtc aggagacggt 5820
gcacagcgtt gtcgggccga ttacgcactc tgttgagggt gagtccttcg cctcttcctt 5880
cttttcctgc tctataccag gcctccactg tcctcctttc ttgcttttta tactatatac 5940
gagaccggca gtcactgatg aagtatgtta gacctccgcc tcttcaccaa atccgtcctc 6000
ggtcaggagc catggaaata cgactccaag gtcatcccca tgccctggcg ccagtccgag 6060
tcggacatta ttgcctccaa gatcaagaac ggcgggctca atatcggcta ctacaacttc 6120
gacggcaatg tccttccaca ccctcctatc ctgcgcggcg tggaaaccac cgtcgccgca 6180
ctcgccaaag ccggtcacac cgtgaccccg tggacgccat acaagcacga tttcggccac 6240
gatctcatct cccatatcta cgcggctgac ggcagcgccg acgtaatgcg cgatatcagt 6300
gcatccggcg agccggcgat tccaaatatc aaagacctac tgaacccgaa catcaaagct 6360
gttaacatga acgagctctg ggacacgcat ctccagaagt ggaattacca gatggagtac 6420
cttgagaaat ggcgggaggc tgaagaaaag gccgggaagg aactggacgc catcatcgcg 6480
ccgattacgc ctaccgctgc ggtacggcat gaccagttcc ggtactatgg gtatgcctct 6540
gtgatcaacc tgctggattt cacgagcgtg gttgttccgg ttacctttgc ggataagaac 6600
atcgataaga agaatgagag tttcaaggcg gttagtgagc ttgatgccct cgtgcaggaa 6660
gagtatgatc cggaggcgta ccatggggca ccggttgcag tgcaggttat cggacggaga 6720
ctcagtgaag agaggacgtt ggcgattgca gaggaagtgg ggaagttgct gggaaatgtg 6780
gtgactccat agctaataag tgtcagatag caatttgcac aagaaatcaa taccagcaac 6840
tgtaaataag cgctgaagtg accatgccat gctacgaaag agcagaaaaa aacctgccgt 6900
agaaccgaag agatatgaca cgcttccatc tctcaaagga agaatccctt cagggttgcg 6960
tttccagtct agacacgtat aacggcacaa gtgtctctca ccaaatgggt tatatctcaa 7020
atgtgatcta aggatggaaa gcccagaata tcgatcgcgc gcagatccat atatagggcc 7080
cgggttataa ttacctcagg tcgacgtccc atggccattc gaattcgtaa tcatggtcat 7140
agctgtttcc
tgtgtgaaat
tgttatccgc
tcacaattcc
acacaacata
cgagccggaa
7200
gcataaagtg
taaagcctgg
ggtgcctaat
gagtgagcta
actcacatta
attgcgttgc
7260
gctcactgcc
cgctttccag
tcgggaaacc
tgtcgtgcca
gctgcattaa
tgaatcggcc
7320
aacgcgcggg
gagaggcggt
ttgcgtattg
ggcgctcttc
cgcttcctcg
ctcactgact
7380
cgctgcgctc
ggtcgttcgg
ctgcggcgag
cggtatcagc
tcactcaaag
gcggtaatac
7440
ggttatccac
agaatcaggg
gataacgcag
gaaagaacat
gtgagcaaaa
ggccagcaaa
7500
aggccaggaa
ccgtaaaaag
gccgcgttgc
tggcgttttt
ccataggctc
cgcccccctg
7560
acgagcatca
caaaaatcga
cgctcaagtc
agaggtggcg
aaacccgaca
ggactataaa
7620
gataccaggc
gtttccccct
ggaagctccc
tcgtgcgctc
tcctgttccg
accctgccgc
7680
ttaccggata
cctgtccgcc
tttctccctt
cgggaagcgt
ggcgctt tct
catagctcac
7740
gctgtaggta
tctcagttcg
gtgtaggtcg
ttcgctccaa
gctgggctgt
gtgcacgaac
7800
cccccgttca
gcccgaccgc
tgcgccttat
ccggtaacta
tcgtcttgag
tccaacccgg
7860
taagacacga
cttatcgcca
ctggcagcag
ccactggtaa
caggattagc
agagcgaggt
7920
atgtaggcgg
tgctacagag
ttcttgaagt
ggtggcctaa
ctacggctac
actagaagaa
7980
cagtatttgg
tatctgcgct
ctgctgaagc
cagttacctt
cggaaaaaga
gttggtagct
8040
cttgatccgg
caaacaaacc
accgctggta
gcggtggttt
ttttgtttgc
aagcagcaga
8100
ttacgcgcag
aaaaaaagga
tctcaagaag
atcctttgat
cttttctacg
gggtctgacg
8160
ctcagtggaa
cgaaaactca
cgttaaggga
ttttggtcat
gagattatca
aaaaggatct
8220
tcacctagat
ccttttaaat
taaaaatgaa
gttttaaatc
aatctaaagt
atatatgagt
8280
aaacttggtc
tgacagttac
caatgcttaa
tcagtgaggc
acctatctca
gcgatctgtc
8340
tatttcgttc
atccatagtt
gcctgactcc
ccgtcgtgta
gataactacg
atacgggagg
8400
gcttaccatc
tggccccagt
gctgcaatga
taccgcgaga
cccacgctca
ccggctccag
8460
atttatcagc
aataaaccag
ccagccggaa
gggccgagcg
cagaagtggt
cctgcaactt
8520
tatccgcctc
catccagtct
attaattgtt
gccgggaagc
tagagtaagt
agttcgccag
8580
ttaatagttt
gcgcaacgtt
gttgccattg
ctacaggcat
cgtggtgtca
cgctcgtcgt
8640
ttggtatggc
ttcattcagc
tccggttccc
aacgatcaag
gcgagttaca
tgatccccca
8700
tgttgtgcaa
aaaagcggtt
agctccttcg
gtcctccgat
cgttgtcaga
agtaagttgg
8760
ccgcagtgtt
atcactcatg
gttatggcag
cactgcataa
ttctcttact
gtcatgccat
8820
ccgtaagatg
cttttctgtg
actggtgagt
actcaaccaa
gtcattctga
gaatagtgta
8880
tgcggcgacc
gagttgctct
tgcccggcgt
caatacggga
taataccgcg
ccacatagca
8940
gaactttaaa
agtgctcatc
attggaaaac
gttcttcggg
gcgaaaactc
tcaaggatct
9000
taccgctgtt
gagatccagt
tcgatgtaac
ccactcgtgc
acccaactga
tcttcagcat
9060
cttttacttt
caccagcgtt
tctgggtgag
caaaaacagg
aaggcaaaat
gccgcaaaaa
9120
agggaataag
ggcgacacgg
aaatgttgaa
tactcatact
cttccttttt
caatattatt
9180
gaagcattta
tcagggttat
tgtctcatga
gcggatacat
atttgaatgt
atttagaaaa
9240
ataaacaaat
aggggttccg
cgcacatttc
cccgaaaagt
gccacctgac
gtctaagaaa
9300
ccattattat
catgacatta
acctataaaa
ataggcgtat
cacgaggccc
tttcgtctcg
9360
cgcgtttcgg
tgatgacggt
gaaaacctct
gacacatgca
gctcccggag
acggtcacag
9420
cttgtctgta
agcggatgcc
gggagcagac
aagcccgtca
gggcgcgtca
gcgggtgttg
9480
gcgggtgtcg
gggctggctt
aactatgcgg
catcagagca
gattgtactg
agagtgcacc
9540
ataaaattgt
aaacgttaat
attttgttaa
aattcgcgtt
aaatttttgt
taaatcagct
9600
cattttttaa
ccaataggcc
gaaatcggca
aaatccctta
taaatcaaaa
gaatagcccg
9660
agatagggtt
gagtgttgtt
ccagtttgga
acaagagtcc
actattaaag
aacgtggact
9720
ccaacgtcaa
agggcgaaaa
accgtctatc
agggcgatgg
cccactacgt
gaaccatcac
9780
ccaaatcaag
ttttttgggg
tcgaggtgcc
gtaaagcact
aaatcggaac
cctaaaggga
9840
gcccccgatt
tagagcttga
cggggaaagc
cggcgaacgt
ggcgagaaag
gaagggaaga
9900
aagcgaaagg
agcgggcgct
agggcgctgg
caagtgtagc
ggtcacgctg
cgcgtaacca
9960
ccacacccgc
cgcgcttaat
gcgccgctac
agggcgcgta
ctatggttgc
tttgacgtat
10020
gcggtgtgaa
ataccgcaca
gatgcgtaag
gagaaaatac
cgcatcaggc
gccattcgcc
10080
attcaggctg
cgcaactgtt
gggaagggcg
atcggtgcgg
gcctcttcgc
tattacgcca
10140
gctggcgaaa
gggggatgtg
ctgcaaggcg
attaagttgg
gtaacgccag
ggttttccca
10200
gtcacgacgt
tgtaaaacga
cggccagtgc
10232
<210> 8 <211> 1545 <212> ДНК
<213> Искусственная <220>
<223> генетически созданная последовательность на основе Т. reesei <400> 8
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc 60 tgcactcttc aaccggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc 120 acgtgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gattcacgct 180 acgaacagca gcacgagctg ctacgatggc aacacttgga gctcgaccct atgtcctgac 240 aacgagacct gcacgaagaa ctgctgtctg gacggtgccg cctacgcgtc cacgtacgga 300 gttaccacga gcggtgacag cctcaccatt ggctttgtca cccagtctgc gcagaagaac 360 gttggcgctc gcctttacct tatggcgaac gacacgacct accaggaatt caccctgctt 420
ggcaacgagt
tctctttcga
tgttgatgtt
tcgcagctgc
cgtgcggctt
gaacggagct
480
ctctacttcg
tgtccatgga
cgcggatggt
ggcgtgagca
agtatcccac
caacaccgct
540
ggcgccaagt
acggcacggg
gtactgtgac
agccagtgtc
cccgcgatct
gaagttcatc
600
aatggccagg
ccaacgttga
gggctgggag
ccgtcaacca
acaacgcgaa
cacgggcatt
660
ggaggacacg
gaagctgctg
ctctgagatg
gatatctggg
aggccaactc
tatctccgag
720
gctcttaccc
tccacccttg
cacgactgtc
ggccaggaga
tctgcgaggg
tgatgggtgc
780
ggcggaactt
actccaagaa
cagatatggc
ggcccttgcg
atcccgatgg
ctgcgactgg
840
aacccatacc
gcctgggcaa
caccagcttc
tacggccctg
gcccaagctt
taccctcgat
900
accaccaaga
aattgaccgt
tgtcacccag
ttcaagccgt
cgggtgccat
caaccgatac
960
tatgtccaga
atggcgtcac
tttccagcag
cccaacgccg
agcttggtag
ttactctggc
1020
aacgagctca
acgatgatta
ctgctacgct
gaggaggcag
aattcggcgg
atcctctttc
1080
tcagacaagg
gcggcctgac
tcagttcaag
aaggctacct
ctggcggcat
ggttctggtc
1140
atgagtctgt
gggatgatta
ctacgccaac
atgctgtggc
tggactccac
ctacccgaca
1200
aacgagacct
cctccacacc
cggtgccgtg
cgcggaagct
gctccaccag
ctccggtgac
1260
cctgctcagg
tcgaatctca
gtttcccaac
gccaaggtca
ccttctccaa
catcaagttc
1320
ggacccattg
gcagcaccgg
caaccctagc
ggcggcaacc
ctcccggcgg
aaacccgcct
1380
ggcaccacca
ccacccgccg
cccagccact
accactggaa
gctctcccgg
acctacccag
1440
tctcactacg
gccagtgcgg
cggtattggc
tacagcggcc
ccacggtctg
cgccagcggc
1500
acaacttgcc
aggtcctgaa
cccttactac
tctcagtgcc
tgtaa
1545
<210> 9
<211> 514
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> генетически созданная последовательность на основе Т. reesei <400> 9
Met Туг Arg Lys Leu Ala Val He Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
15 10 15
Ala Gin Ser Ala Cys Thr Leu Gin Pro Glu Thr His Pro Pro Leu Thr
20 25 30
Trp Gin Lys Cys Ser Ser Gly Gly Thr Cys Thr Gin Gin Thr Gly Ser
35 40 45
Val Val He Asp Ala Asn Trp Arg Trp He His Ala Thr Asn Ser Ser
50 55 60
Thr Ser Cys Tyr Asp Gly Asn Thr Trp Ser Ser Thr Leu Cys Pro Asp
65 70 75 80
Asn Glu Thr Cys Thr Lys Asn Cys Cys Leu Asp Gly Ala Ala Tyr Ala
85 90 95
Ser Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asp Ser Leu Thr He Gly Phe
100 105 110
Val Thr Gin Ser Ala Gin Lys Asn Val Gly Ala Arg Leu Tyr Leu Met
115 120 125
Ala Asn Asp Thr Thr Tyr Gin Glu Phe Thr Leu Leu Gly Asn Glu Phe
130 135 140
Ser Phe Asp Val Asp Val Ser Gin Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala
145 150 155 160
Leu Tyr Phe Val Ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Val Ser Lys Tyr Pro
165 170 175
Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gin
180 185 190
Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe He Asn Gly Gin Ala Asn Val Glu Gly
195 200 205
Trp Glu Pro Ser Thr Asn Asn Ala Asn Thr Gly He Gly Gly His Gly
210 215 220
Ser Cys Cys Ser Glu Met Asp He Trp Glu Ala Asn Ser He Ser Glu
225 230 235 240
Ala Leu Thr Leu His Pro Cys Thr Thr Val Gly Gin Glu He Cys Glu
245 250 255
Gly Asp Gly Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Lys Asn Arg Tyr Gly Gly Pro
260 265 270
Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Trp Asn Pro Tyr Arg Leu Gly Asn Thr
275 280 285
Ser Phe Tyr Gly Pro Gly Pro Ser Phe Thr Leu Asp Thr Thr Lys Lys
290 295 300
Leu Thr Val Val Thr Gin Phe Lys Pro Ser Gly Ala He Asn Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Val Gin Asn Gly Val Thr Phe Gin Gin Pro Asn Ala Glu Leu Gly
325 330 335
Ser Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Tyr Ala Glu Glu
340 345 350
Ala Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gin
355 360 365
Phe Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
370 375 380
Asp Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr
385 390 395 400
Asn Glu Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Val Arg Gly Ser Cys Ser Thr
405 410 415
Ser Ser Gly Asp Pro Ala Gin Val Glu Ser Gin Phe Pro Asn Ala Lys
420 425 430
Val Thr Phe Ser Asn He Lys Phe Gly Pro He Gly Ser Thr Gly Asn
435 440 445
Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr
450 455 460
Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gin
465 470 475 480
Ser His Tyr Gly Gin Cys Gly Gly He Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val
485 490 495
Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gin Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gin
500 505 510
Cys Leu
<210> 10
<211> 10145
<212> ДНК
<213> Искусственная <220>
<223> экспрессирующий вектор рТгехЗд-cbhl
<400> 10
aagcttacta gtacttctcg agctctgtac atgtccggtc gcgacgtacg cgtatcgatg 60
gcgccagctg caggcggccg cctgcagcca cttgcagtcc cgtggaattc tcacggtgaa 120
tgtaggcctt ttgtagggta ggaattgtca ctcaagcacc cccaacctcc attacgcctc 180
ccccatagag ttcccaatca gtgagtcatg gcactgttct caaatagatt ggggagaagt 240
tgacttccgc ccagagctga aggtcgcaca accgcatgat atagggtcgg caacggcaaa 300
aaagcacgtg gctcaccgaa aagcaagatg tttgcgatct aacatccagg aacctggata 360
catccatcat cacgcacgac cactttgatc tgctggtaaa ctcgtattcg ccctaaaccg 420
aagtgcgtgg taaatctaca cgtgggcccc tttcggtata ctgcgtgtgt cttctctagg 480
tgccattctt ttcccttcct ctagtgttga attgtttgtg ttggagtccg agctgtaact 540
acctctgaat ctctggagaa tggtggacta acgactaccg tgcacctgca tcatgtatat 600
aatagtgatc ctgagaaggg gggtttggag caatgtggga ctttgatggt catcaaacaa 660
agaacgaaga cgcctctttt gcaaagtttt gtttcggcta cggtgaagaa ctggatactt 720
gttgtgtctt ctgtgtattt ttgtggcaac aagaggccag agacaatcta ttcaaacacc 780
aagcttgctc ttttgagcta caagaacctg tggggtatat atctagagtt gtgaagtcgg 840
taatcccgct gtatagtaat acgagtcgca tctaaatact ccgaagctgc tgcgaacccg 900
gagaatcgag atgtgctgga aagcttctag cgagcggcta aattagcatg aaaggctatg 960
agaaattctg gagacggctt gttgaatcat ggcgttccat tcttcgacaa gcaaagcgtt 1020
ccgtcgcagt agcaggcact cattcccgaa aaaactcgga gattcctaag tagcgatgga 1080
accggaataa tataataggc aatacattga gttgcctcga cggttgcaat gcaggggtac 1140
tgagcttgga cataactgtt ccgtacccca cctcttctca acctttggcg tttccctgat 1200
tcagcgtacc cgtacaagtc gtaatcacta ttaacccaga ctgaccggac gtgttttgcc 1260
cttcatttgg agaaataatg tcattgcgat gtgtaatttg cctgcttgac cgactggggc 1320
tgttcgaagc ccgaatgtag gattgttatc cgaactctgc tcgtagaggc atgttgtgaa 1380
tctgtgtcgg gcaggacacg cctcgaaggt tcacggcaag ggaaaccacc gatagcagtg 1440
tctagtagca acctgtaaag ccgcaatgca gcatcactgg aaaatacaaa ccaatggcta 1500
aaagtacata agttaatgcc taaagaagtc atataccagc ggctaataat tgtacaatca 1560
agtggctaaa cgtaccgtaa tttgccaacg gcttgtgggg ttgcagaagc aacggcaaag 1620
ccccacttcc ccacgtttgt ttcttcactc agtccaatct cagctggtga tcccccaatt 1680
gggtcgcttg tttgttccgg tgaagtgaaa gaagacagag gtaagaatgt ctgactcgga 1740
gcgttttgca tacaaccaag ggcagtgatg gaagacagtg aaatgttgac attcaaggag 1800
tatttagcca gggatgcttg agtgtatcgt gtaaggaggt ttgtctgccg atacgacgaa 1860
tactgtatag tcacttctga tgaagtggtc catattgaaa tgtaaagtcg gcactgaaca 1920
ggcaaaagat tgagttgaaa ctgcctaaga tctcgggccc tcgggccttc ggcctttggg 1980
tgtacatgtt tgtgctccgg gcaaatgcaa agtgtggtag gatcgaacac actgctgcct 2040
ttaccaagca
gctgagggta
tgtgataggc
aaatgttcag
gggccactgc
atggtttcga
2100
atagaaagag
aagcttagcc
aagaacaata
gccgataaag
atagcctcat
taaacggaat
2160
gagctagtag
gcaaagtcag
cgaatgtgta
tatataaagg
ttcgaggtcc
gtgcctccct
2220
catgctctcc
ccatctactc
atcaactcag
atcctccagg
agacttgtac
accatctttt
2280
gaggcacaga
aacccaatag
tcaaccatca
caagtttgta
caaaaaacag
gctatgtatc
2340
ggaagttggc
cgtcatctcg
gccttcttgg
ccacagctcg
tgctcagtcg
gcctgcactc
2400
ttcaaccgga
gactcacccg
cctctgacat
ggcagaaatg
ctcgtctggt
ggcacgtgca
2460
ctcaacagac
aggctccgtg
gtcatcgacg
ccaactggcg
ctggattcac
gctacgaaca
2520
gcagcacgag
ctgctacgat
ggcaacactt
ggagctcgac
cctatgtcct
gacaacgaga
2580
cctgcacgaa
gaactgctgt
ctggacggtg
ccgcctacgc
gtccacgtac
ggagttacca
2640
cgagcggtga
cagcctcacc
attggctttg
tcacccagtc
tgcgcagaag
aacgttggcg
2700
ctcgccttta
ccttatggcg
aacgacacga
cctaccagga
attcaccctg
cttggcaacg
2760
agttctcttt
cgatgttgat
gtttcgcagc
tgccgtgcgg
cttgaacgga
gctctctact
2820
tcgtgtccat
ggacgcggat
ggtggcgtga
gcaagtatcc
caccaacacc
gctggcgcca
2880
agtacggcac
ggggtactgt
gacagccagt
gtccccgcga
tctgaagttc
atcaatggcc
2940
aggccaacgt
tgagggctgg
gagccgtcaa
ccaacaacgc
gaacacgggc
attggaggac
3000
acggaagctg
ctgctctgag
atggatatct
gggaggccaa
ctctatctcc
gaggctctta
3060
ccctccaccc
ttgcacgact
gtcggccagg
agatctgcga
gggtgatggg
tgcggcggaa
3120
cttactccaa
gaacagatat
ggcggccctt
gcgatcccga
tggctgcgac
tggaacccat
3180
accgcctggg
caacaccagc
ttctacggcc
ctggcccaag
ctttaccctc
gataccacca
3240
agaaattgac
cgttgtcacc
cagttcaagc
cgtcgggtgc
catcaaccga
tactatgtcc
3300
agaatggcgt
cactttccag
cagcccaacg
ccgagcttgg
tagttactct
ggcaacgagc
3360
tcaacgatga
ttactgctac
gctgaggagg
cagaattcgg
cggatcctct
ttctcagaca
3420
agggcggcct
gactcagttc
aagaaggcta
cctctggcgg
catggttctg
gtcatgagtc
3480
tgtgggatga
ttactacgcc
aacatgctgt
ggctggactc
cacctacccg
acaaacgaga
3540
cctcctccac
acccggtgcc
gtgcgcggaa
gctgctccac
cagctccggt
gaccctgctc
3600
aggtcgaatc
tcagtttccc
aacgccaagg
tcaccttctc
caacatcaag
ttcggaccca
3660
ttggcagcac
cggcaaccct
agcggcggca
accctcccgg
cggaaacccg
cctggcacca
3720
ccaccacccg
ccgcccagcc
actaccactg
gaagctctcc
cggacctacc
cagtctcact
3780
acggccagtg
cggcggtatt
ggctacagcg
gccccacggt
ctgcgccagc
ggcacaactt
3840
gccaggtcct
gaacccttac
tactctcagt
gcctgtaaac
ccagctttct
tgtacaaagt
3900
ggtgatcgcg
ccgcgcgcca
gctccgtgcg
aaagcctgac
gcaccggtag
attcttggtg
3960
agcccgtatc
atgacggcgg
cgggagctac
atggccccgg
gtgatttatt
ttttttgtat
4020
ctacttctga
cccttttcaa
atatacggtc
aactcatctt
tcactggaga
tgcggcctgc
4080
ttggtattgc
gatgttgtca
gcttggcaaa
ttgtggcttt
cgaaaacaca
aaacgattcc
4140
ttagtagcca
tgcattttaa
gataacggaa
tagaagaaag
aggaaattaa
aaaaaaaaaa
4200
aaaacaaaca
tcccgttcat
aacccgtaga
atcgccgctc
ttcgtgtatc
ccagtaccag
4260
tttattttga
atagctcgcc
cgctggagag
catcctgaat
gcaagtaaca
accgtagagg
4320
ctgacacggc
aggtgttgct
agggagcgtc
gtgttctaca
aggccagacg
tcttcgcggt
4380
tgatatatat
gtatgtttga
ctgcaggctg
ctcagcgacg
acagtcaagt
tcgccctcgc
4440
tgcttgtgca
ataatcgcag
tggggaagcc
acaccgtgac
tcccatcttt
cagtaaagct
4500
ctgttggtgt
ttatcagcaa
tacacgtaat
ttaaactcgt
tagcatgggg
ctgatagctt
4560
aattaccgtt
taccagtgcc
atggttctgc
agctttcctt
ggcccgtaaa
attcggcgaa
4620
gccagccaat
caccagctag
gcaccagcta
aaccctataa
ttagtctctt
atcaacacca
4680
tccgctcccc
cgggatcaat
gaggagaatg
agggggatgc
ggggctaaag
aagcctacat
4740
aaccctcatg
ccaactccca
gtttacactc
gtcgagccaa
catcctgact
ataagctaac
4800
acagaatgcc
tcaatcctgg
gaagaactgg
ccgctgataa
gcgcgcccgc
ctcgcaaaaa
4860
ccatccctga
tgaatggaaa
gtccagacgc
tgcctgcgga
agacagcgtt
attgatttcc
4920
caaagaaatc
ggggatcctt
tcagaggccg
aactgaagat
cacagaggcc
tccgctgcag
4980
atcttgtgtc
caagctggcg
gccggagagt
tgacctcggt
ggaagttacg
ctagcattct
5040
gtaaacgggc
agcaatcgcc
cagcagttag
tagggtcccc
tctacctctc
agggagatgt
5100
aacaacgcca
ccttatggga
ctatcaagct
gacgctggct
tctgtgcaga
caaactgcgc
5160
ccacgagttc
ttccctgacg
ccgctctcgc
gcaggcaagg
gaactcgatg
aatactacgc
5220
aaagcacaag
agacccgttg
gtccactcca
tggcctcccc
atctctctca
aagaccagct
5280
tcgagtcaag
gtacaccgtt
gcccctaagt
cgttagatgt
ccctttttgt
cagctaacat
5340
atgccaccag
ggctacgaaa
catcaatggg
ctacatctca
tggctaaaca
agtacgacga
5400
aggggactcg
gttctgacaa
ccatgctccg
caaagccggt
gccgtcttct
acgtcaagac
5460
ctctgtcccg
cagaccctga
tggtctgcga
gacagtcaac
aacatcatcg
ggcgcaccgt
5520
caacccacgc
aacaagaact
ggtcgtgcgg
cggcagttct
ggtggtgagg
gtgcgatcgt
5580
tgggattcgt
ggtggcgtca
tcggtgtagg
aacggatatc
ggtggctcga
ttcgagtgcc
5640
ggccgcgttc
aacttcctgt
acggtctaag
gccgagtcat
gggcggctgc
cgtatgcaaa
5700
gatggcgaac
agcatggagg
gtcaggagac
ggtgcacagc
gttgtcgggc
cgattacgca
5760
ctctgttgag
ggtgagtcct
tcgcctcttc
cttcttttcc
tgctctatac
caggcctcca
5820
ctgtcctcct
ttcttgcttt
ttatactata
tacgagaccg
gcagtcactg
atgaagtatg
5880
ttagacctcc
gcctcttcac
caaatccgtc
ctcggtcagg
agccatggaa
atacgactcc
5940
aaggtcatcc
ccatgccctg
gcgccagtcc
gagtcggaca
ttattgcctc
caagatcaag
6000
aacggcgggc
tcaatatcgg
ctactacaac
ttcgacggca
atgtccttcc
acaccctcct
6060
atcctgcgcg
gcgtggaaac
caccgtcgcc
gcactcgcca
aagccggtca
caccgtgacc
6120
ccgtggacgc
catacaagca
cgatttcggc
cacgatctca
tctcccatat
ctacgcggct
6180
gacggcagcg
ccgacgtaat
gcgcgatatc
agtgcatccg
gcgagccggc
gattccaaat
6240
atcaaagacc
tactgaaccc
gaacatcaaa
gctgttaaca
tgaacgagct
ctgggacacg
6300
catctccaga
agtggaatta
ccagatggag
taccttgaga
aatggcggga
ggctgaagaa
6360
aaggccggga
aggaactgga
cgccatcatc
gcgccgatta
cgcctaccgc
tgcggtacgg
6420
catgaccagt
tccggtacta
tgggtatgcc
tctgtgatca
acctgctgga
tttcacgagc
6480
gtggttgttc
cggttacctt
tgcggataag
aacatcgata
agaagaatga
gagtttcaag
6540
gcggttagtg
agcttgatgc
cctcgtgcag
gaagagtatg
atccggaggc
gtaccatggg
6600
gcaccggttg
cagtgcaggt
tatcggacgg
agactcagtg
aagagaggac
gttggcgatt
6660
gcagaggaag
tggggaagtt
gctgggaaat
gtggtgactc
catagctaat
aagtgtcaga
6720
tagcaatttg
cacaagaaat
caataccagc
aactgtaaat
aagcgctgaa
gtgaccatgc
6780
catgctacga
aagagcagaa
aaaaacctgc
cgtagaaccg
aagagatatg
acacgcttcc
6840
atctctcaaa
ggaagaatcc
cttcagggtt
gcgtttccag
tctagacacg
tataacggca
6900
caagtgtctc
tcaccaaatg
ggttatatct
caaatgtgat
ctaaggatgg
aaagcccaga
6960
atatcgatcg
cgcgcagatc
catatatagg
gcccgggtta
taattacctc
aggtcgacgt
7020
cccatggcca
ttcgaattcg
taatcatggt
catagctgtt
tcctgtgtga
aattgttatc
7080
cgctcacaat
tccacacaac
atacgagccg
gaagcataaa
gtgtaaagcc
tggggtgcct
7140
aatgagtgag
ctaactcaca
ttaattgcgt
tgcgctcact
gcccgctttc
cagtcgggaa
7200
acctgtcgtg
ccagctgcat
taatgaatcg
gccaacgcgc
ggggagaggc
ggtttgcgta
7260
ttgggcgctc
ttccgcttcc
tcgctcactg
actcgctgcg
ctcggtcgtt
cggctgcggc
7320
gagcggtatc
agctcactca
aaggcggtaa
tacggttatc
cacagaatca
ggggataacg
7380
caggaaagaa
catgtgagca
aaaggccagc
aaaaggccag
gaaccgtaaa
aaggccgcgt
7440
tgctggcgtt
tttccatagg
ctccgccccc
ctgacgagca
tcacaaaaat
cgacgctcaa
7500
gtcagaggtg
gcgaaacccg
acaggactat
aaagatacca
ggcgtttccc
cctggaagct
7560
ccctcgtgcg
ctctcctgtt
ccgaccctgc
cgcttaccgg
atacctgtcc
gcctttctcc
7620
cttcgggaag
cgtggcgctt
tctcatagct
cacgctgtag
gtatctcagt
tcggtgtagg
7680
tcgttcgctc
caagctgggc
tgtgtgcacg
aaccccccgt
tcagcccgac
cgctgcgcct
7740
tatccggtaa
ctatcgtctt
gagtccaacc
cggtaagaca
cgacttatcg
ccactggcag
7800
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 7860
agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 7920
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 7980
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 8040
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 8100
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 8160
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 8220
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 8280
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 8340
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 8400
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 8460
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 8520
ttgctacagg catcgtggtg tcacgcrcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 8580
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 8640
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 8700
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 8760
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 8820
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 8880
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 8940
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 9000
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 9060
gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 9120
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 9180
ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 9240
aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 9300
tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 9360
gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 9420
cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accataaaat tgtaaacgtt aatattttgt 9480
taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg 9540
gcaaaatccc ttataaatca aaagaatagc ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt 9600
ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct 9660
atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat cacccaaatc aagttttttg gggtcgaggt 9720
gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa 9780
agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc 984 0
tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc 9900
tacagggcgc gtactatggt tgctttgacg tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 9960
aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg 10020
gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag 10080
gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag 10140
tgccc 10145
<210> 11
<211> 1416
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> генетически созданная последовательность на основе Т. reesei
<400> 11 atgattgtcg
gcattctcac
cacgctggct
acgctggcca
cactcgcagc
tagtgtgcct
ctagaggagc
ggcaagcttg
ctcaagcgtc
tggggccaat
gtggtggcca
gaattggtcg
ggtccgactt
gctgtgcttc
cggaagcaca
tgcgtctact
ccaacgacta
ttactcccag
tgtcttcccg
gcgctgcaag
ctcaagctcg
tccacgcgcg
ccgcgtcgac
gacttctcga
gtatccccca
caacatcccg
gtcgagctcc
gcgacgcctc
cacctggttc
tactactacc
agagtacctc
cagtcggatc
gggaaccgct
acgtattcag
gcaacccttt
tgttggggtc
actctttggg
ccaatgcata
ttacgcctct
gaagttagca
gcctcgctat
tcctagcttg
actggagcca
tggccactgc
tgcagcagct
gtcgcaaagg
ttccctcttt
tgtgtggcta
gatactcttg
acaagacccc
tctcatggag
caaaccttgg
ccgacatccg
cgccgccaac
aagaatggcg
gtaactatgc
cggacagttt
gtggtgtatg
acttgccgga
tcgcgattgc
gctgcccttg
cctcgaatgg
cgaatactct
attgccgatg
gtggcgtcgc
caaatataag
aactatatcg
acaccattcg
tcaaattgtc
gtggaatatt
ccgatgtccg
gaccctcctg
gttattgagc
ctgactctct
tgccaacctg
gtgaccaacc
tcggtactcc
aaagtgtgcc
aatgctcagt
cagcctacct
tgagtgcatc
aactacgccg
tcacacagct
gaaccttcca
aatgttgcga
tgtatttgga
cgctggccat
gcaggatggc
ttggctggcc
ggcaaaccaa
gacccggccg
ctcagctatt
tgcaaatgtt
tacaagaatg
catcgtctcc
gagagctctt
cgcggattgg
caaccaatgt
cgccaactac
aacgggtgga
acattaccag
ccccccaccg
tacacgcaag
gcaacgctgt
ctacaacgag
aagctgtaca
tccacgctat
tggacctctt
cttgccaatc
acggctggtc
caacgccttc
ttcatcactg
atcaaggtcg
atcgggaaag
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140
cagcctaccg gacagcaaca gtggggagac tggtgcaatg tgatcggcac cggatttggt 1200
attcgcccat ccgcaaacac tggggactcg ttgctggatt cgtttgtctg ggtcaagcca 1260
ggcggcgagt gtgacggcac cagcgacagc agtgcgccac gatttgacta ccactgtgcg 1320
ctcccagatg ccttgcaacc ggcgcctcaa gctggtgctt ggttccaagc ctactttgtg 1380
cagcttctca caaacgcaaa cccatcgttc ctgtaa 1416
<210> 12
<211> 471
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная
<220>
<223> генетически созданная последовательность на основе Т. reesei <400> 12
Met Не Val Gly Не Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala
15 10 15
Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg Gin Ala Cys Ser Ser Val Trp Gly
20 25 30
Gin Cys Gly Gly Gin Asn Trp Ser Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly
35 40 45
Ser Thr Cys Val Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gin Cys Leu Pro Gly
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr Thr Ser Arg
65 70 75 80
Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro Gly
85 90 95
Ser Thr Thr Thr Arg Val Pro Pro Val Gly Ser Gly Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Ser Gly Asn Pro Phe Val Gly Val Thr Pro Trp Ala Asn Ala Tyr Tyr
115 120 125
Ala Ser Glu Val Ser Ser Leu Ala He Pro Ser Leu Thr Gly Ala Met
130 135 140
Ala Thr Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Val Pro Ser Phe Met Trp Leu
145 150 155 160
Asp Thr Leu Asp Lys Thr Pro Leu Met Glu Gin Thr Leu Ala Asp He
165 170 175
Arg Thr Ala Asn Lys Asn Gly Gly Asn Tyr Ala Gly Gin Phe Val Val
180 185 190
Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu
195 200 205
Tyr Ser He Ala Asp Gly Gly Val Ala Lys Tyr Lys Asn Tyr He Asp
210 215 220
Thr He Arg Gin He Val Val Glu Tyr Ser Asp He Arg Thr Leu Leu
225 230 235 240
Val He Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Gly Thr
245 250 255
Pro Lys Cys Ala Asn Ala Gin Ser Ala Tyr Leu Glu Cys He Asn Tyr
260 265 270
Ala Val Thr Gin Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala
275 280 285
Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Gin Asp Pro Ala Ala
290 295 300
Gin Leu Phe Ala Asn Val Tyr Lys Asn Ala Ser Ser Pro Arg Ala Leu
305 310 315 320
Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Gly Trp Asn He Thr
325 330 335
Ser Pro Pro Ser Tyr Thr Gin Gly Asn Ala Val Tyr Asn Glu Lys Leu
340 345 350
Tyr He His Ala He Gly Pro Leu Leu Ala Asn His Gly Trp Ser Asn
355 360 365
Ala Phe Phe He Thr Asp Gin Gly Arg Ser Gly Lys Gin Pro Thr Gly
370 375 380
Gin Gin Gin Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val He Gly Thr Gly Phe Gly
385 390 395 400
He Arg Pro Ser Ala Asn Thr Gly Asp Ser Leu Leu Asp Ser Phe Val
405 410 415
Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Cys Asp Gly Thr Ser Asp Ser Ser Ala
420 425 430
Pro Arg Phe Asp Ser His Cys Ala Leu Pro Asp Ala Leu Gin Pro Ala
435 440 445
Pro Gin Ala Gly Ala Trp Phe Gin Ala Tyr Phe Val Gin Leu Leu Thr
450 455 460
Asn Ala Asn Pro Ser Phe Leu
<210> 13 <211> 14158 <212> ДНК
<213> Искусственная <220>
<223> экспрессирующий вектор pExp-cbhll <400> 13
gcggccgccg gggtagacga agtgacacgt atccgaaaca gcagtggtat tatggcagct 60
cagcggcatc aaacacgaac ctgagczggc catcgctgag ctgacaagag ccccgccgag 120
cagccatcgc tgaagcgcca tccttatgag caaggaaggg agttattttc gaggatggaa 180
atcttgagtg gatgtctgat ctaggttctt tattgcccag agctgtccct tttaatactc 240
tcgacatcta aaagtttttt ctcctcagcg gtctagcccg cattagcagc agtttcgtca 300
aagcttacgg ctgcatttgc acaccgaggt cgatgtgcca agagctgggg tgctgagagc 360
tggacaatga ttctccactt cagtgttgtt atcggtttcg agcttccact tgaagttagc 420
aggtgcgagt cgctatctct gtagttgagg acgggaccat ttgtactttg ttgtatgtag 480
cctctgcagt ggttggtcct gaataatctt tgaatactcc ggccggctgt gcatttccgt 540
tctctacagc gcagcatctg actagttgta tcgaaccatt agtccgtata gtatcgcatg 600
caattgctag tcaatggtag cagatcagtc gaaggcgtga agtcaatata cgattgcatt 660
gcccgccttg ttatgacaaa cgtaccgagg aagagaagac agtgtatgcc tctatgtatc 720
aaataaggag ccaggaacct cattacccgt atgctattat cgagtggcac tacatgatct 780
ccgaaaaatt taaaaaagaa ataaaaaatt gtcgttaggt ttttacagca agctctcttg 840
ggttatcgga ggctggctgg ttggagcttg tgcagtctct ttgctgatcg agaagattag 900
catgtttctt tcacaatgca aaagaagtat tgctaggaag gttcgaaaga acacttactc 960
ttctacacag tcatttcctg gagactaaca gagctttatg tagtatatat ggagacgtga 1020
agctactgcc gggtgcatgg cttgcccatc accgcacgag ttcgagcacg ttaatattcc 1080
aattacgact caaatcaata cctttgtcaa tgggagctcg tcttgacatt aacgcatcct 1140
ttcaagtaat gcaatgcagc aatggaggaa cttgtagaga ccgagggagg aatggcgaag 1200
ggcggccgga gcttggagtc ctggtggagg ctgaaagctt cgagtttcag cgtctcccag 1260
aagttaccca acccaagtgg ctacaacgac aataagtatt ctatacctag taatattgtt 1320
cgatgcttgt atggagtaga tgctggagtc tggtgtaata ttaatggctt agttcatact 1380
acatttgaca tttccagccc gagagcgcac cgaagccaca tgccgcatat tgacaaagtg 1440
ctagattgtg taaggagggc attctctata gaggaatcag cgtttgcata tacctactac 1500
gtcattgccc taatggacag taagctagcc agctgcatta tgataagagt aacgtgagat 1560
aggtaataag tcttacaaca ctttccctta tagccactaa actacaacat cgtcctgcag 1620
ttcctatatg atacgtataa cccattgata catccaagta tccagaggtg tatggaaata 1680
tcagatcaag acctctctct tctaagaaac ctagaaccag acgctggtag tataataagc 1740
acactgtgac tcgcttaggc ccttaagctt aggccggctt gcttactatt aacctctcat 1800
aaacgctact gcaatgattg gaaacttctt atagtagaat gaggcaataa gacgcatctc 1860
aggtcacata tagtcttatg tttgaaaccc ctcactactg ccatttatct tgtggaaata 1920
tctattattt cagtctatac gtaatgaagg cacttttcag gatctcttcc ctaagcttgt 1980
ataagcaggt ttgttgccgt aaccattctg tctcctcgcc taatacctgt gaagcacaga 2040
atacgtttat tctataagag acgtcttacc ttccatcgag attgaaagct taaaccgtct 2100
acaacggatg ccctcatcat gacccgtcta actcgaacat ctgccacatt agtctcgggt 2160
aacaggagga gtaacacgac cagtgtaaca cgttaagcat acaattgaac gagaatggtg 2220
aggactgaga taaaagaatt ctgttaagga tctaaaatta tagtgcatac aaggtagatg 2280
ttagtaggtg gtttcagttt tcctttcctt tacgttggta tagagcagcg ttcaccaaat 2340
gttagcagag ttctatctat gtcgtatcca ttctgcctta tatctctcaa gggcgccgag 2400
ctcatcctac gaagctctca ggccatcgta ggaaatacag gatagacact gaattctagg 2460
ctaggtatgc gaggcacgcg gatctagggc agactgggca ttgcatagct atggtgtagt 2520
agaactcccg tcaacggcta ttctcaccta gactttcccc ttcgaactga caagttgtta 2580
tattgcctgt gtaccaagcg ctaatgtgga caggattaat gccagagttc attagcctca 2640
agtagagcct atttcctcgc cggaaagtca tctctcttat tgcatttctg cccttcccac 2700
taactcaggg tgcagcgcaa cactacacgc aacatataca ctttattagc cgtgcaacaa 2760
ggctattcta cgaaaaatgc tacactccac atgttaaagg cgcattcaac cagcttcttt 2820
attgggtaat atacagccag gcggggatga agctcattag ccgccactca aggctataca 2880
atgttgccaa ctctccgggc tttatcctgt gctcccgaat accacatcgt gatgatgctt 2940
cagcgcacgg aagtcacaga caccgcctgt ataaaagggg gactgtgacc ctgtatgagg 3000
cgcaacatgg tctcacagca gctcacctga agaggcttgt aagatcaccc taggctgtgt 3060
attgcaccat gattgtcggc attctcacca cgctggctac gctggccaca ctcgcagcta 3120
gtgtgcctct agaggagcgg caagcttgct caagcgtctg gggccaatgt ggtggccaga 3180
attggtcggg
tccgacttgc
tgtgcttccg
gaagcacatg
cgtctactcc
aacgactatt
3240
actcccagtg
tcttcccggc
gctgcaagct
caagctcgtc
cacgcgcgcc
gcgtcgacga
3300
cttctcgagt
atcccccaca
acatcccggt
cgagctccgc
gacgcctcca
cctggttcta
3360
ctactaccag
agtacctcca
gtcggatcgg
gaaccgctac
gtattcaggc
aacccttttg
3420
ttggggtcac
tctttgggcc
aatgcatatt
acgcctctga
agttagcagc
ctcgctattc
3480
ctagcttgac
tggagccatg
gccactgctg
cagcagctgt
cgcaaaggtt
ccctcttttg
3540
tgtggctaga
tactcttgac
aagacccctc
tcatggagca
aaccttggcc
gacatccgcg
3600
ccgccaacaa
gaatggcggt
aactatgccg
gacagtttgt
ggtgtatgac
ttgccggatc
3660
gcgattgcgc
tgcccttgcc
tcgaatggcg
aatactctat
tgccgatggt
ggcgtcgcca
3720
aatataagaa
ctatatcgac
accattcgtc
aaattgtcgt
ggaatattcc
gatgtccgga
3780
ccctcctggt
tattgagcct
gactctcttg
ccaacctggt
gaccaacctc
ggtactccaa
3840
agtgtgccaa
tgctcagtca
gcctaccttg
agtgcatcaa
ctacgccgtc
acacagctga
3900
accttccaaa
tgttgcgatg
tatttggacg
ctggccatgc
aggatggctt
ggctggccgg
3960
caaaccaaga
cccggccgct
cagctarttg
caaatgttta
caagaatgca
tcgtctccga
4020
gagctcttcg
cggattggca
accaatgtcg
ccaactacaa
cgggtggaac
attaccagcc
4080
ccccaccgta
cacgcaaggc
aacgctgtct
acaacgagaa
gctgtacatc
cacgctattg
4140
gacctcttct
tgccaatcac
ggctggtcca
acgccttctt
catcactgat
caaggtcgat
4200
cgggaaagca
gcctaccgga
cagcaacagt
ggggagactg
gtgcaatgtg
atcggcaccg
4260
gatttggtat
tcgcccatcc
gcaaacactg
gggactcgtt
gctggattcg
tttgtctggg
4320
tcaagccagg
cggcgagtgt
gacggcacca
gcgacagcag
tgcgccacga
tttgactacc
4380
actgtgcgct
cccagatgcc
ttgcaaccgg
cgcctcaagc
tggtgcttgg
ttccaagcct
4440
actttgtgca
gcttctcaca
aacgcaaacc
catcgttcct
gtaaggcgcg
cctaaggctt
4500
tcgtgaccgg
gcttcaaaca
atgatgtgcg
atggtgtggt
tcccggttgg
cggagtcttt
4560
gtctactttg
gttgtctgtc
gcaggtcggt
agaccgcaaa
tgagcaactg
atggattgtt
4620
gccagcgata
ctataattca
catggatggt
ctttgtcgat
cagtagctag
tgagagagag
4680
agaacatcta
tccacaatgt
cgagtgtcta
ttagacatac
tccgagaata
aagtcaactg
4740
tgtctgtgat
ctaaagatcg
attcggcagt
cgagtagcgt
ataacaactc
cgagtaccag
4800
caaaagcacg
tcgtgacagg
agcagggctt
tgccaactgc
gcaaccttaa
ttaaaatagc
4860
tcgcccgctg
gagagcatcc
tgaatgcaag
taacaaccgt
agaggctgac
acggcaggtg
4920
ttgctaggga
gcgtcgtgtt
ctacaaggcc
agacgtcttc
gcggttgata
tatatgtatg
4980
tttgactgca
ggctgctcag
cgacgacagt
caagttcgcc
ctcgctgctt
gtgcaataat
5040
cgcagtgggg
aagccacacc
gtgactccca
tctttcagta
aagctctgtt
ggtgtttatc
5100
agcaatacac
gtaatttaaa
ctcgttagca
tggggctgat
agcttaatta
ccgtttacca
5160
gtgccatggt
tctgcagctt
tccttggccc
gtaaaattcg
gcgaagccag
ccaatcacca
5220
gctaggcacc
agctaaaccc
tataattagt
ctcttatcaa
caccatccgc
tcccccggga
5280
tcaatgagga
gaatgagggg
gatgcggggc
taaagaagcc
tacataaccc
tcatgccaac
5340
tcccagttta
cactcgtcga
gccaacatcc
tgactataag
ctaacacaga
atgcctcaat
5400
cctgggaaga
actggccgct
gataagcgcg
cccgcctcgc
aaaaaccatc
cctgatgaat
5460
ggaaagtcca
gacgctgcct
gcggaagaca
gcgttattga
tttcccaaag
aaatcgggga
5520
tcctttcaga
ggccgaactg
aagatcacag
aggcctccgc
tgcagatctt
gtgtccaagc
5580
tggcggccgg
agagttgacc
tcggtggaag
ttacgctagc
attctgtaaa
cgggcagcaa
5640
tcgcccagca
gttagtaggg
tcccctctac
ctctcaggga
gatgtaacaa
cgccacctta
5700
tgggactatc
aagctgacgc
tggcttctgt
gcagacaaac
tgcgcccacg
agttcttccc
5760
tgacgccgct
ctcgcgcagg
caagggaact
cgatgaatac
tacgcaaagc
acaagagacc
5820
cgttggtcca
ctccatggcc
tccccatctc
tctcaaagac
cagcttcgag
tcaaggtaca
5880
ccgttgcccc
taagtcgtta
gatgtccctt
tttgtcagct
aacatatgcc
accagggcta
5940
cgaaacatca
atgggctaca
tctcatggct
aaacaagtac
gacgaagggg
actcggttct
6000
gacaaccatg
ctccgcaaag
ccggtgccgt
cttctacgtc
aagacctctg
tcccgcagac
6060
cctgatggtc
tgcgagacag
tcaacaacat
catcgggcgc
accgtcaacc
cacgcaacaa
6120
gaactggtcg
tgcggcggca
gttctggtgg
tgagggtgcg
atcgttggga
ttcgtggtgg
6180
cgtcatcggt
gtaggaacgg
atatcggtgg
ctcgattcga
gtgccggccg
cgttcaactt
6240
cctgtacggt
ctaaggccga
gtcatgggcg
gctgccgtat
gcaaagatgg
cgaacagcat
6300
ggagggtcag
gagacggtgc
acagcgttgt
cgggccgatt
acgcactctg
ttgagggtga
6360
gtccttcgcc
tcttccttct
tttcctgctc
tataccaggc
ctccactgtc
ctcctttctt
6420
gctttttata
ctatatacga
gaccggcagt
cactgatgaa
gtatgttaga
cctccgcctc
6480
ttcaccaaat
ccgtcctcgg
tcaggagcca
tggaaatacg
actccaaggt
catccccatg
6540
ccctggcgcc
agtccgagtc
ggacattatt
gcctccaaga
tcaagaacgg
cgggctcaat
6600
atcggctact
acaacttcga
cggcaatgtc
cttccacacc
ctcctatcct
gcgcggcgtg
6660
gaaaccaccg
tcgccgcact
cgccaaagcc
ggtcacaccg
tgaccccgtg
gacgccatac
6720
aagcacgatt
tcggccacga
tctcatctcc
catatctacg
cggctgacgg
cagcgccgac
6780
gtaatgcgcg
atatcagtgc
atccggcgag
ccggcgattc
caaatatcaa
agacctactg
6840
aacccgaaca
tcaaagctgt
taacatgaac
gagctctggg
acacgcatct
ccagaagtgg
6900
aattaccaga
tggagtacct
tgagaaatgg
cgggaggctg
aagaaaaggc
cgggaaggaa
6960
ctggacgcca
tcatcgcgcc
gattacgcct
accgctgcgg
tacggcatga
ccagttccgg
7020
tactatgggt
atgcctctgt
gatcaacctg
ctggatttca
cgagcgtggt
tgttccggtt
7080
acctttgcgg
ataagaacat
cgataagaag
aatgagagtt
tcaaggcggt
tagtgagctt
7140
gatgccctcg
tgcaggaaga
gtatgatccg
gaggcgtacc
atggggcacc
ggttgcagtg
7200
caggttatcg
gacggagact
cagtgaagag
aggacgttgg
cgattgcaga
ggaagtgggg
7260
aagttgctgg
gaaatgtggt
gactccatag
ctaataagtg
tcagatagca
atttgcacaa
7320
gaaatcaata
ccagcaactg
taaataagcg
ctgaagtgac
catgccatgc
tacgaaagag
7380
cagaaaaaaa
cctgccgtag
aaccgaagag
atatgacacg
cttccatctc
tcaaaggaag
7440
aatcccttca
gggttgcgtt
tccagtctag
acacgtataa
cggcacaagt
gtctctcacc
7500
aaatgggtta
tatctcaaat
gtgatctaag
gatggaaagc
ccagaatatc
gatcgcgcgc
7560
atttaaatca
gctgcggagc
atgagcctat
ggcgatcagt
ctggtcatgt
taaccagcct
7620
gtgctctgac
gttaatgcag
aatagaaagc
cgcggttgca
atgcaaatga
tgatgccttt
7680
gcagaaatgg
cttgctcgct
gactgatacc
agtaacaact
ttgcttggcc
gtctagcgct
7740
gttgattgta
ttcatcacaa
cctcgtctcc
ctcctttggg
ttgagctctt
tggatggctt
7800
tccaaacgtt
aatagcgcgt
ttttctccac
aaagtattcg
tatggacgcg
cttttgcgtg
7860
tattgcgtga
gctaccagca
gcccaa ttgg
cgaagtcttg
agccgcatcg
catagaataa
7920
ttgattgcgc
atttgatgcg
atttttgagc
ggctgtttca
ggcgacattt
cgcccgccct
7980
tatttgctcc
attatatcat
cgacggcatg
tccaatagcc
cggtgatagt
cttgtcgaat
8040
atggctgtcg
tggataaccc
atcggcagca
gatgataatg
attccgcagc
acaagctcgt
8100
atgtgggtag
cagaagaact
gagcgagatc
ttcgagggcg
taactctgca
tatccgattg
8160
gcctgctgcc
acatgtcatt
tgcttcggtt
tcttttctgt
tgagttcttg
tatttgggtg
8220
aaagtaacat
ggtgtatgac
gagagacatt
ggtggtaaga
aaaaatttca
cctcctctta
8280
gtgcaggact
gactctcaaa
atctatatgc
aaatgtgtcg
tgtaacaccc
ttcgcatgag
8340
cgctgaccgt
accctaccat
ttcgccccac
tcatgatagc
agaagagaca
tattaattcg
8400
gcaatgctac
gaaagtctgc
aggtatgctt
aaataaacgc
ttgccacaga
agccgacagt
8460
ttattgttac
tacttactat
actgtattat
tgttgctcac
ataaggcggt
gaaccattgg
8520
ttcaccacga
cgcctgacga
ggtaaattac
tctctcgtag
ggctgccaag
gtaggtccca
8580
accccgtatc
ctcggtcgag
ggtgcgaggt
tctttggtcc
ttccctcttt
ggtaaagccc
8640
agtagcgtgt
ttgaatcagt
tcacaatctc
tcctaaacac
agtccgacac
taggtaggta
8700
cgttgtaata
gcaactcaaa
catgtaattc
gttcaaggca
ggaacatttt
ataaacttcc
8760
ctgcgtattt
aatcaataaa
gatcctagtc
caatcgtata
ctacctacct
acctagctaa
8820
ggtaggtagg
tagttcgtgg
gaacctggtc
gctaattcac
gcaacccact
ttgcgctctt
8880
cgcctggccg
tcgttgaagg
taaagcagtt
gtacccatca
cctaactcaa
ccgacacacc
8940
gttgatctgc
tcaaggcagt
tttcgtcact
gtagaattcc
acaggttgtt
ccacgttgtc
9000
gaattggatc
cccctatatt
gggcactggc
aaacgcggtc
gtggacctgg
tacagtcgcc
9060
tggctgaaca
gtagtagttt
cgactacgac
gccgccagca
caccttccgc
cggtatagga
9120
attgaagagt
acggggttct
gtgcgaagac
agccgggcag
gcggaaagga
tatagaagag
9180
ctgtccagtc
acgttagcta
gtgaagtaac
gtaatggaag
gaaagagaaa
aggggagcag
9240
ggaggaaact
cgtcatttac
tcacaacttt
gtgcatcttg
acaaaagact
tctgatatgg
9300
caacctataa
ttcaacaaca
tgcagcgtag
taaagaatag
gtgatcttct
tgattcagtt
9360
gcttgagggc
agggagaatg
aagttccttg
gaacgattta
tatacccttc
gcagcaagag
9420
agtcggctta
aagaaaggag
actgaaagtg
tttacgggac
gaatatctat
ccgattagcg
9480
tagtatcgtc
tctacaaggc
ggggcgtaaa
ttatgttcca
aggccggaca
acgtgaacaa
9540
caaatggaaa
ttccagacgt
ttgaggagaa
tcaagctcac
ttgctcgtgg
ataccagtgg
9600
ttatgagcgc
caccgctcaa
cattgccgcc
aatcggataa
aaaaaagcct
ctagaagagg
9660
agaccagcag
ttgttttagg
caaaacaatt
gtacagagat
cggttgtcgt
ttgcgagata
9720
ggtaggtatt
tacggagtaa
cactaaatca
aagatacaaa
gttttctgcg
attattaatt
9780
ctgcgacggt
tggcgccatg
tggtcttcca
gggtgagcaa
acgttactct
tgctattgac
9840
tattgcaacg
acgccgctcg
gctgcgacac
aacaaagaga
cataaggccc
tggggaggaa
9900
cgatgtgatc
gtcagatcct
tcgtagtgaa
gatggcgcta
cttatgactg
catcaagcac
9960
actgtaccga
acgcgttaca
aaggatcctt
tactgacctt
cataccaagt
ttccaatttg
10020
ttacttgcta
aggtcgtgat
aatattcatg
gtctcctaga
ggattgttac
agatattaac
10080
agcttgaata
gtgtcgagct
tataacctgc
aaggtacagc
caagttgccc
agcaccagga
10140
tgttacctcg
cttaagttag
gcaatagttt
gcgagcctaa
tgtcgacaaa
gtatggcgca
10200
agctgagtac
tgccttgggt
gaatcctcgc
tcaatggtaa
ctttgcaagc
tcatatgctt
10260
tccaaagctt
gtgatacgtg
cggttataag
ctggcactga
cgtgtttcga
ggccagatgc
10320
ttgcgaaatc
atcaagtgta
ttgtggaaag
gtctcaggat
gaggtcctag
aatacgcgag
10380
gcaaatttgt
ctgatcgtct
ttcaataacc
tcatagtcga
gtcacaaatg
ttggaggtct
10440
ggttcaagcc
gagccaagca
atagcttggt
cgggcgcgtc
acagcatcag
gaatgctaac
10500
gcttgcacat
ctcgcggact
ttattatgcc
tggacgcaaa
tattgatacc
agaatcaagc
10560
cacaccctgt
gaagcgtaac
ttgtttttct
ctgctttctt
aaaaagctgc
gtatatcatt
10620
gctagagcgc
ccgtgaacaa
cggaactcat
tgtctcttta
tcttcttact
cgcccgggca
10680
agggcgaatt
ccagcacact
ggcggccgtt
actagtggat
ccgagctcgg
taccaagctt
10740
gatgcatagc
ttgagtattc
taacgcgtca
cctaaatagc
ttggcgtaat
catggtcata
10800
gctgtttcct
gtgtgaaatt
gttatccgct
cacaattcca
cacaacatac
gagccggaag
10860
cataaagtgt
aaagcctggg
gtgcctaatg
agtgagctaa
ctcacattaa
ttgcgttgcg
10920
ctcactgccc
gctttccagt
cgggaaacct
gtcgtgccag
ctgcattaat
gaatcggcca
10980
acgcgcgggg
agaggcggtt
tgcgtattgg
gcgctcttcc
gcttcctcgc
tcactgactc
11040
gctgcgctcg
gtcgttcggc
tgcggcgagc
ggtatcagct
cactcaaagg
cggtaatacg
11100
gttatccaca
gaatcagggg
ataacgcagg
aaagaacatg
tgagcaaaag
gccagcaaaa
11160
gcccaggaac
cgtaaaaagg
ccgcgttgct
ggcgtttttc
cataggctcc
gcccccctga
11220
cgagcatcac
aaaaatcgac
gctcaagtca
gaggtggcga
aacccgacag
gactataaag
11280
ataccaggcg
tttccccctg
gaagctccct
cgtgcgctct
cctgttccga
ccctgccgct
11340
taccggatac
ctgtccgcct
ttctcccttc
gggaagcgtg
gcgctttctc
atagctcacg
11400
ctgtaggtat
ctcagttcgg
tgtaggtcgt
tcgctccaag
ctgggctgtg
tgcacgaacc
11460
ccccgttcag
cccgaccgct
gcgccttatc
cggtaactat
cgtcttgagt
ccaacccggt
11520
aagacacgac
ttatcgccac
tggcagcagc
cactggtaac
aggattagca
gagcgaggta
11580
tgtaggcggt
gctacagagt
tcttgaagtg
gtggcctaac
tacggctaca
ctagaaggac
11640
agtatttggt
atctgcgctc
tgctgaagcc
agttaccttc
ggaaaaagag
ttggtagctc
11700
ttgatccggc
aaacaaacca
ccgctggtag
cggtggtttt
tttgtttgca
agcagcagat
11760
tacgcgcaga
aaaaaaggat
ctcaagaaga
tcctttgatc
ttttctacgg
ggtctgacgc
11820
tcagtggaac
gaaaactcac
gttaagggat
tttggtcatg
agattatcaa
aaaggatctt
11880
cacctagatc
cttttaaatt
aaaaatgaag
ttttagcacg
tgtcagtcct
gctcctcggc
11940
cacgaagtgc
acgcagttgc
cggccgggtc
gcgcagggcg
aactcccgcc
cccacggctg
12000
ctcgccgatc
tcggtcatgg
ccggcccgga
ggcgtcccgg
aagttcgtgg
acacgacctc
12060
cgaccactcg
gcgtacagct
cgtccaggcc
gcgcacccac
acccaggcca
gggtgttgtc
12120
cggcaccacc
tggtcctgga
ccgcgctgat
gaacagggtc
acgtcgtccc
ggaccacacc
12180
ggcgaagtcg
tcctccacga
agtcccggga
gaacccgagc
cggtcggtcc
agaactcgac
12240
cgctccggcg
acgtcgcgcg
cggtgagcac
cggaacggca
ctggtcaact
tggccatggt
12300
ggccctcctc
acgtgctatt
attgaagcat
ttatcagggt
tattgtctca
tgagcggata
12360
catatttgaa
tgtatttaga
aaaataaaca
aataggggtt
ccgcgcacat
ttccccgaaa
12420
agtgccacct
gtatgcggtg
tgaaataccg
cacagatgcg
taaggagaaa
ataccgcatc
12480
aggaaattgt
aagcgttaat
aattcagaag
aactcgtcaa
gaaggcgata
gaaggcgatg
12540
cgctgcgaat
cgggagcggc
gataccgtaa
agcacgagga
agcggtcagc
ccattcgccg
12600
ccaagctctt
cagcaatatc
acgggtagcc
aacgctatgt
cctgatagcg
gtccgccaca
12660
cccagccggc
cacagtcgat
gaatccagaa
aagcggccat
tttccaccat
gatattcggc
12720
aagcaggcat
cgccatgggt
cacgacgaga
tcctcgccgt
cgggcatgct
cgccttgagc
12780
ctggcgaaca
gttcggctgg
cgcgagcccc
tgatgctctt
cgtccagatc
atcctgatcg
12840
acaagaccgg
cttccatccg
agtacgtgct
cgctcgatgc
gatgtttcgc
ttggtggtcg
12900
aatgggcagg
tagccggatc
aagcgtatgc
agccgccgca
ttgcatcagc
catgatggat
12960
actttctcgg
caggagcaag
gtgagatgac
aggagatcct
gccccggcac
ttcgcccaat
13020
agcagccagt
cccttcccgc
ttcagtgaca
acgtcgagca
cagctgcgca
aggaacgccc
13080
gtcgtggcca
gccacgatag
ccgcgctgcc
tcgtcttgca
gttcattcag
ggcaccggac
13140
aggtcggtct
tgacaaaaag
aaccgggcgc
ccctgcgctg
acagccggaa
cacggcggca
13200
tcagagcagc
cgattgtctg
ttgtgcccag
tcatagccga
atagcctctc
cacccaagcg
13260
gccggagaac
ctgcgtgcaa
tccatcttgt
tcaatcatgc
gaaacgatcc
tcatcctgtc
13320
tcttgatcag
agcttgatcc
cctgcgccat
cagatccttg
gcggcgagaa
agccatccag
13380
tttactttgc
agggcttccc
aaccttacca
gagggcgccc
cagctggcaa
ttccggttcg
13440
cttgctgtcc
ataaaaccgc
ccagtctagc
tatcgccatg
taagcccact
gcaagctacc
13500
tgctttctct
ttgcgcttgc
gttttccctt
gtccagatag
cccagtagct
gacattcatc
13560
cggggtcagc
accgtttctg
cggactggct
ttctacgtga
aaaggatcta
ggtgaagatc
13620
ctttttgata
atctcatgcc
tgacatttat
attccccaga
acatcaggtt
aatggcgttt
13680
ttgatgtcat
tttcgcggtg
gctgagatca
gccacttctt
ccccgataac
ggagaccggc
13740
acactggcca
tatcggtggt
catcatgcgc
cagctttcat
ccccgatatg
caccaccggg
13800
taaagttcac
gggagacttt
atctgacagc
agacgtgcac
tggccagggg
gatcaccatc
13860
cgtcgccccg
gcgtgtcaat
aatatcactc
tgtacatcca
caaacagacg
ataacggctc
13920
tctcttttat
aggtgtaaac
cttaaactgc
cgtacgtata
ggctgcgcaa
ctgttgggaa
13980
gggcgatcgg
tgcgggcctc
ttcgctatta
cgccagctgg
cgaaaggggg
atgtgctgca
14040
aggcgattaa
gttgggtaac
gccagggttt
tcccagtcac
gacgttgtaa
aacgacggcc
14100
agtgaattgt
aatacgactc
actatagggc
gaattgggcc
ctctagatgc
atgctcga
14158
<210> 14 <211> 11312 <212> ДНК
<213> Искусственная <220>
<223> экспрессирующий вектор pTrex4-CBH1-E1 <400> 14
aagcttaact agtacttctc gagctctgta catgtccggt cgcgacgtac gcgtatcgat 60 ggcgccagct gcaggcggcc gcctgcagcc acttgcagtc ccgtggaatt ctcacggtga 120 atgtaggcct tttgtagggt aggaattgtc actcaagcac ccccaacctc cattacgcct 180 cccccataga gttcccaatc agtgagtcat ggcactgttc tcaaatagat tggggagaag 240
ttgacttccg cccagagctg aaggtcgcac aaccgcatga tatagggtcg gcaacggcaa 300
aaaagcacgt ggctcaccga aaagcaagat gtttgcgatc taacatccag gaacctggat 360
acatccatca tcacgcacga ccactttgat ctgctggtaa actcgtattc gccctaaacc 420
gaagtgacgt ggtaaatcta cacgtgggcc cctttcggta tactgcgtgt gtcttctcta 480
ggtgccattc ttttcccttc ctctagtgtt gaattgtttg tgttggagtc cgagctgtaa 540
ctacctctga atctctggag aatggtggac taacgactac cgtgcacctg catcatgtat 600
ataatagtga tcctgagaag gggggtttgg agcaatgtgg gactttgatg gtcatcaaac 660
aaagaacgaa gacgcctctt ttgcaaagtt ttgtttcggc tacggtgaag aactggatac 720
ttgttgtgtc ttctgtgtat ttttgtggca acaagaggcc agagacaatc tattcaaaca 780
ccaagcttgc tcttttgagc tacaagaacc tgtggggtat atatctagag ttgtgaagtc 840
ggtaatcccg ctgtatagta atacgagtcg catctaaata ctccgaagct gctgcgaacc 900
cggagaatcg agatgtgctg gaaagcttct agcgagcggc taaattagca tgaaaggcta 960
tgagaaattc tggagacggc ttgttgaatc atggcgttcc attcttcgac aagcaaagcg 1020
ttccgtcgca gtagcaggca ctcattcccg aaaaaactcg gagattccta agtagcgatg 1080
gaaccggaat aatataatag gcaatacatt gagttgcctc gacggttgca atgcaggggt 1140
actgagcttg gacataactg ttccgtaccc cacctcttct caacctttgg cgtttccctg 1200
attcagcgta cccgtacaag tcgtaatcac tattaaccca gactgaccgg acgtgttttg 1260
cccttcattt ggagaaataa tgtcattgcg atgtgtaatt tgcctgcttg accgactggg 1320
gctgttcgaa gcccgaatgt aggattgtta tccgaactct gctcgtagag gcatgttgtg 1380
aatctgtgtc gggcaggaca cgcctcgaag gttcacggca agggaaacca ccgatagcag 1440
tgtctagtag caacctgtaa agccgcaatg cagcatcact ggaaaataca aaccaatggc 1500
taaaagtaca taagttaatg cctaaagaag tcatatacca gcggctaata attgtacaat 1560
caagtggcta aacgtaccgt aatttgccaa cggcttgtgg ggttgcagaa gcaacggcaa 1620
agccccactt ccccacgttt gtttcttcac tcagtccaat ctcagctggt gatcccccaa 1680
ttgggtcgct tgtttgttcc ggtgaagtga aagaagacag aggtaagaat gtctgactcg 1740
gagcgttttg catacaacca agggcagtga tggaagacag tgaaatgttg acattcaagg 1800
agtatttagc cagggatgct tgagtgtatc gtgtaaggag gtttgtctgc cgatacgacg 1860
aatactgtat agtcacttct gatgaagtgg tccatattga aatgtaagtc ggcactgaac 1920
aggcaaaaga ttgagttgaa actgcctaag atctcgggcc ctcgggcctt cggcctttgg 1980
gtgtacatgt ttgtgctccg ggcaaatgca aagtgtggta ggatcgaaca cactgctgcc 2040
tttaccaagc agctgagggt atgtgatagg caaatgttca ggggccactg catggtttcg 2100
aatagaaaga gaagcttagc caagaacaat agccgataaa gatagcctca ttaaacggaa 2160
tgagctagta
ggcaaagtca
gcgaatgtgt
atatataaag
gttcgaggtc
cgtgcctccc
2220
tcatgctctc
cccatctact
catcaactca
gatcctccag
gagacttgta
caccatcttt
2280
tgaggcacag
aaacccaata
gtcaaccgcg
gactgcgcat
catgtatcgg
aagttggccg
2340
tcatctcggc
cttcttggcc
acagctcgtg
ctcagtcggc
ctgcactctc
caatcggaga
2400
ctcacccgcc
tctgacatgg
cagaaatgct
cgtctggtgg
cacttgcact
caacagacag
2460
gctccgtggt
catcgacgcc
aactggcgct
ggactcacgc
tacgaacagc
agcacgaact
2520
gctacgatgg
caacacttgg
agctcgaccc
tatgtcctga
caacgagacc
tgcgcgaaga
2580
actgctgtct
ggacggtgcc
gcctacgcgt
ccacgtacgg
agttaccacg
agcggtaaca
2640
gcctctccat
tggctttgtc
acccagtctg
cgcagaagaa
cgttggcgct
cgcctttacc
2700
ttatggcgag
cgacacgacc
taccaggaat
tcaccctgct
tggcaacgag
ttctctttcg
2760
atgttgatgt
ttcgcagctg
ccgtaagtga
cttaccatga
acccctgacg
tatcttcttg
2820
tgggctccca
gctgactggc
caatttaagg
tgcggcttga
acggagctct
ctacttcgtg
2880
tccatggacg
cggatggtgg
cgtgagcaag
tatcccacca
acaccgctgg
cgccaagtac
2940
ggcacggggt
actgtgacag
ccagtgtccc
cgcgatctga
agttcatcaa
tggccaggcc
3000
aacgttgagg
gctgggagcc
gtcatccaac
aacgcaaaca
cgggcattgg
aggacacgga
3060
agctgctgct
ctgagatgga
tatctgggag
gccaactcca
tctccgaggc
tcttaccccc
3120
cacccttgca
cgactgtcgg
ccaggagatc
tgcgagggtg
atgggtgcgg
cggaacttac
3180
tccgataaca
gatatggcgg
cacttgcgat
cccgatggct
gcgactggaa
cccataccgc
3240
ctgggcaaca
ccagcttcta
cggccctggc
tcaagcttta
ccctcgatac
caccaagaaa
3300
ttgaccgttg
tcacccagtt
cgagacgtcg
ggtgccatca
accgatacta
tgtccagaat
3360
ggcgtcactt
tccagcagcc
caacgccgag
cttggtagtt
actctggcaa
cgagctcaac
3420
gatgattact
gcacagctga
ggaggcagaa
ttcggcggat
cctctttctc
agacaagggc
3480
ggcctgactc
agttcaagaa
ggctacctct
ggcggcatgg
ttctggtcat
gagtctgtgg
3540
gatgatgtga
gtttgatgga
caaacatgcg
cgttgacaaa
gagtcaagca
gctgactgag
3600
atgttacagt
actacgccaa
catgctgtgg
ctggactcca
cctacccgac
aaacgagacc
3660
tcctccacac
ccggtgccgt
gcgcggaagc
tgctccacca
gctccggtgt
ccctgctcag
3720
gtcgaatctc
agtctcccaa
cgccaaggtc
accttctcca
acatcaagtt
cggacccatt
3780
ggcagcaccg
gcaaccctag
cggcggcaac
cctcccggcg
gaaacccgcc
tggcaccacc
3840
accacccgcc
gcccagccac
taccactgga
agctctcccg
gacctactag
taagcgggcg
3900
ggcggcggct
attggcacac
gagcggccgg
gagatcctgg
acgcgaacaa
cgtgccggta
3960
cggatcgccg
gcatcaactg
gtttgggttc
gaaacctgca
attacgtcgt
gcacggtctc
4020
tggtcacgcg
actaccgcag
catgctcgac
cagataaagt
cgctcggcta
caacacaatc
4080
cggctgccgt
actctgacga
cattctcaag
ccgggcacca
tgccgaacag
catcaatttt
4140
taccagatga
atcaggacct
gcagggtctg
acgtccttgc
aggtcatgga
caaaatcgtc
4200
gcgtacgccg
gtcagatcgg
cctgcgcatc
attcttgacc
gccaccgacc
ggattgcagc
4260
gggcagtcgg
cgctgtggta
cacgagcagc
gtctcggagg
ctacgtggat
ttccgacctg
4320
caagcgctgg
cgcagcgcta
caagggaaac
ccgacggtcg
tcggctttga
cttgcacaac
4380
gagccgcatg
acccggcctg
ctggggctgc
ggcgatccga
gcatcgactg
gcgattggcc
4440
gccgagcggg
ccggaaacgc
cgtgctctcg
gtgaatccga
acctgctcat
tttcgtcgaa
4500
ggtgtgcaga
gctacaacgg
agactcctac
tggtggggcg
gcaacctgca
aggagccggc
4560
cagtacccgg
tcgtgctgaa
cgtgccgaac
cgcctggtgt
actcggcgca
cgactacgcg
4620
acgagcgtct
acccgcagac
gtggttcagc
gatccgacct
tccccaacaa
catgcccggc
4680
atctggaaca
agaactgggg
atacctcttc
aatcagaaca
ttgcaccggt
atggctgggc
4740
gaattcggta
cgacactgca
atccacgacc
gaccagacgt
ggctgaagac
gctcgtccag
4800
tacctacggc
cgaccgcgca
atacggtgcg
gacagcttcc
agtggacctt
ctggtcctgg
4860
aaccccgatt
ccggcgacac
aggaggaatt
ctcaaggatg
actggcagac
ggtcgacaca
4920
gtaaaagacg
gctatctcgc
gccgatcaag
tcgtcgattt
tcgatcctgt
ctaaggcgcg
4980
ccgcgcgcca
gctccgtgcg
aaagcctgac
gcaccggtag
attcttggtg
agcccgtatc
5040
atgacggcgg
cgggagctac
atggccccgg
gtgatttatt
ttttttgtat
ctacttctga
5100
cccttttcaa
atatacggtc
aactcatctt
tcactggaga
tgcggcctgc
ttggtattgc
5160
gatgttgtca
gcttggcaaa
ttgtggcttt
cgaaaacaca
aaacgattcc
ttagtagcca
5220
tgcattttaa
gataacggaa
tagaagaaag
aggaaattaa
aaaaaaaaaa
aaaacaaaca
5280
tcccgttcat
aacccgtaga
atcgccgctc
ttcgtgtatc
ccagtaccag
tttattttga
5340
atagctcgcc
cgctggagag
catcctgaat
gcaagtaaca
accgtagagg
ctgacacggc
5400
aggtgttgct
agggagcgtc
gtgttctaca
aggccagacg
tcttcgcggt
tgatatatat
5460
gtatgtttga
ctgcaggctg
ctcagcgacg
acagtcaagt
tcgccctcgc
tgcttgtgca
5520
ataatcgcag
tggggaagcc
acaccgtgac
tcccatcttt
cagtaaagct
ctgttggtgt
5580
ttatcagcaa
tacacgtaat
ttaaactcgt
tagcatgggg
ctgatagctt
aattaccgtt
5640
taccagtgcc
gcggttctgc
agctttcctt
ggcccgtaaa
attcggcgaa
gccagccaat
5700
caccagctag
gcaccagcta
aaccctataa
ttagtctctt
atcaacacca
tccgctcccc
5760
cgggatcaat
gaggagaatg
agggggatgc
ggggctaaag
aagcctacat
aaccctcatg
5820
ccaactccca
gtttacactc
gtcgagccaa
catcctgact
ataagctaac
acagaatgcc
5880
tcaatcctgg
gaagaactgg
ccgctgataa
gcgcgcccgc
ctcgcaaaaa
ccatccctga
5940
tgaatggaaa
gtccagacgc
tgcctgcgga
agacagcgtt
attgatttcc
caaagaaatc
6000
ggggatcctt
tcagaggccg
aactgaagat
cacagaggcc
tccgctgcag
atcttgtgtc
6060
caagctggcg
gccggagagt
tgacctcggt
ggaagttacg
ctagcattct
gtaaaeggge
6120
agcaatcgcc
cagcagttag
tagggtcccc
tctacctctc
agggagatgt
aacaacgcca
6180
ccttatggga
ctatcaagct
gacgctggct
tctgtgcaga
caaactgcgc
ccacgagttc
6240
ttccctgacg
ccgctctcgc
gcaggcaagg
gaactcgatg
aatactaege
aaagcacaag
6300
agacccgttg
gtccactcca
tggcctcccc
atctctctca
aagaccagct
tcgagtcaag
6360
gtacaccgtt
gcccctaagt
cgttagatgt
ccctttttgt
cagctaacat
atgccaccag
6420
ggctacgaaa
catcaatggg
ctacatctca
tggctaaaca
agtacgacga
aggggactcg
6480
gttctgacaa
ccatgctccg
caaagccggt
gccgtcttct
aegtcaagae
ctctgtcccg
6540
cagaccctga
tggtctgcga
gacagtcaac
aacatcatcg
ggcgcaccgt
caacccacgc
6600
aacaagaact
ggtcgtgcgg
cggcagttct
ggtggtgagg
gtgcgatcgt
tgggattcgt
6660
ggtggcgtca
tcggtgtagg
aacggatatc
ggtggctcga
ttcgagtgcc
ggccgcgttc
6720
aacttcctgt
acggtctaag
gccgagteat
gggcggctgc
cgtatgcaaa
gatggegaac
6780
agcatggagg
gtcaggagac
ggtgcacagc
gttgtcgggc
egattacgea
ctctgttgag
6840
ggtgagtcct
tcgcctcttc
cttcttttcc
tgetctatae
caggcctcca
ctgtcctcct
6900
ttcttgcttt
ttatactata
tacgagaccg
gcagtcactg
atgaagtatg
ttagacctcc
6960
gcctcttcac
caaatccgtc
cteggtcagg
agccatggaa
atacgactcc
aaggtcatcc
7020
ccatgccctg
gcgccagtcc
gagteggaca
ttattgeetc
caagatcaag
aaeggeggge
7080
tcaatatcgg
ctactacaac
ttcgaeggea
atgtccttcc
acaccctcct
atcctgcgcg
7140
gcgtggaaac
caccgtcgcc
gcactcgcca
aagceggtea
caccgtgacc
ccgtggacgc
7200
catacaagca
cgatttcggc
cacgatctca
tctcccatat
ctacgcggct
gaeggcageg
7260
ccgacgtaat
gcgcgatatc
agtgcatccg
gcgagccggc
gattccaaat
atcaaagacc
7320
tactgaaccc
gaacatcaaa
gctgttaaca
tgaacgagct
ctgggacacg
catctccaga
7380
agtggaatta
ccagatggag
taccttgaga
aatggcggga
ggctgaagaa
aaggccggga
7440
aggaactgga
cgccatcatc
gegecgatta
cgcctaccgc
tgeggtaegg
catgaccagt
7500
tccggtacta
tgggtatgcc
tctgtgatca
acctgctgga
tttcacgagc
gtggttgttc
7560
cggttacctt
tgcggataag
aacatcgata
agaagaatga
gagtttcaag
gcggttagtg
7620
agcttgatgc
cctcgtgcag
gaagagtatg
ateeggagge
gtaccatggg
gcaccggttg
7680
cagtgcaggt
tatcggacgg
agactcagtg
aagagaggac
gttggcgatt
gcagaggaag
7740
tggggaagtt
gctgggaaat
gtggtgactc
catagctaat
aagtgtcaga
tagcaatttg
7800
cacaagaaat
caataccagc
aactgtaaat
aagcgctgaa
gtgaccatgc
catgetaega
7860
aagagcagaa
aaaaacctgc
cgtagaaccg
aagagatatg
acacgcttcc
atctctcaaa
7920
ggaagaatcc cttcagggtt gcgtttccag tctagacacg tataacggca caagtgtctc 7980
tcaccaaatg ggttatatct caaatgtgat ctaaggatgg aaagcccaga atctaggcct 8040
attaatattc cggagtatac gtagccggct aacgttaaca accggtacct ctagaactat 8100
agctagcatg cgcaaattta aagcgctgat atcgatcgcg cgcagatcca tatatagggc 8160
ccgggttata attacctcag gtcgacgtcc catggccatt cgaattcgta atcatggtca 8220
tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 8280
agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 8340
cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 8400
caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 8460
tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 8520
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 8580
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 8640
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 8700
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 8760
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 8820
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 8880
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 8940
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 9000
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga 9060
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 9120
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 9180
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 9240
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 9300
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 9360
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 9420
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 9480
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 9540
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 9600
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 9660
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 9720
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 9780
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 9840
gccgcagtgt
tatcactcat
ggttatggca
gcactgcata
attctcttac
tgtcatgcca
9900
tccgtaagat
gcttttctgt
gactggtgag
tactcaacca
agtcattctg
agaatagtgt
9960
atgcggcgac
cgagttgctc
ttgcccggcg
tcaatacggg
ataataccgc
gccacatagc
10020
agaactttaa
aagtgctcat
cattggaaaa
cgttcttcgg
ggcgaaaact
ctcaaggatc
10080
ttaccgctgt
tgagatccag
ttcgatgtaa
cccactcgtg
cacccaactg
atcttcagca
10140
tcttttactt
tcaccagcgt
ttctgggtga
gcaaaaacag
gaaggcaaaa
tgccgcaaaa
10200
aagggaataa
gggcgacacg
gaaatgttga
atactcatac
tcttcctttt
tcaatattat
10260
tgaagcattt
atcagggtta
ttgtctcatg
agcggataca
tatttgaatg
tatttagaaa
10320
aataaacaaa
taggggttcc
gcgcacattt
ccccgaaaag
tgccacctga
cgtctaagaa
10380
accattatta
tcatgacatt
aacctataaa
aataggcgta
tcacgaggcc
ctttcgtctc
10440
gcgcgtttcg
gtgatgacgg
tgaaaacctc
tgacacatgc
agctcccgga
gacggtcaca
10500
gcttgtctgt
aagcggatgc
cgggagcaga
caagcccgtc
agggcgcgtc
agcgggtgtt
10560
ggcgggtgtc
ggggctggct
taactatgcg
gcatcagagc
agattgtact
gagagtgcac
10620
cataaaattg
taaacgttaa
tattttgtta
aaattcgcgt
taaatttttg
ttaaatcagc
10680
tcatttttta
accaataggc
cgaaatcggc
aaaatccctt
ataaatcaaa
agaatagccc
10740
gagatagggt
tgagtgttgt
tccagtttgg
aacaagagtc
cactattaaa
gaacgtggac
10800
tccaacgtca
aagggcgaaa
aaccgtctat
cagggcgatg
gcccactacg
tgaaccatca
10860
cccaaatcaa
gttttttggg
gtcgaggtgc
cgtaaagcac
taaatcggaa
ccctaaaggg
10920
agcccccgat
ttagagcttg
acggggaaag
ccggcgaacg
tggcgagaaa
ggaagggaag
10980
aaagcgaaag
gagcgggcgc
tagggcgctg
gcaagtgtag
cggtcacgct
gcgcgtaacc
11040
accacacccg
ccgcgcttaa
tgcgccgcta
cagggcgcgt
actatggttg
ctttgacgta
11100
tgcggtgtga
aataccgcac
agatgcgtaa
ggagaaaata
ccgcatcagg
cgccattcgc
11160
cattcaggct
gcgcaactgt
tgggaagggc
gatcggtgcg
ggcctcttcg
ctattacgcc
11220
agctggcgaa
agggggatgt
gctgcaaggc
gattaagttg
ggtaacgcca
gggttttccc
11280
agtcacgacg
ttgtaaaacg
acggccagtg
11312
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Функциональная смесь полипептидов, содержащая
первый гетерологичный полипептид, который является экзоцеллобиогидролазой, эндоглюканазой, бета-глюкозидазой или их доменом;
второй гетерологичный полипептид, ферментативная активность
которого отличается от активности первого гетерологичного
полипептида, который является экзо-целлобиогидролазой,
эндоглюканазой, бета-глюкозидазой или их доменом;
первый гомологичный полипептид, ферментативная активность
которого отличается от активности первого и второго
гетерологичных полипептидов, который является экзо-
целлобиогидролазой, эндоглюканазой, бета-глюкозидазой или их доменом;
где первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид экспрессируются нитчатым грибом;
где нитчатый гриб является представителем подотдела Eumycotina.
2. Функциональная смесь полипептидов по п.1, дополнительно содержащая третий гетерологичный пептид, где третий гетерологичный полипептид экспрессируется нитчатым грибом.
3. Функциональная смесь полипептидов по любому из пп.1-2, где функциональная смесь имеет по крайней мере одну функцию по крайней мере двух полипептидов смеси.
4. Функциональная смесь полипептидов по любому из пп.1-3, где функциональная смесь имеет целлюлазную функцию.
2.
5. Функциональная смесь полипептидов по любому из пп.1-4, где первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой и второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой.
6. Функциональная смесь полипептидов по любому из пп.1-5, где первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, выбранной из группы, состоящей из семейства GH 5, б, 7, 9 и 48, и где второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой, выбранной из группы, состоящей из семейства GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17, 31, 44, 45, 48, 51, 61, 64, 74 и 81.
7. Функциональная смесь полипептидов по любому из пп.1 и 36, в котором первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой, и где гомологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой .
8. Функциональная смесь полипептидов по любому из пп.1 и 37, в котором первый гетерологичный полипептид является первой экзо-целлобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой, гомологичный полипептид является второй экзо-целлобиогидролазой, и где первая экзо-целлобиогидролаза и вторая экзо-целлобиогидролаза соответствуют одному и тому же представителю целлобиогидролазы.
9. Функциональная смесь полипептидов по любому из пп.1 и 38, в котором первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой, а гомологичный полипептид является экзо
2.
целлобиогидролазой, и где экспрессия первого гетерологичного полипептида, второго гетерологичного полипептида и гомологичного полипептида дает смесь термостабильных целлюлаз.
10. Функциональная смесь полипептидов по любому из пп.1 и 38, в котором нитевидный гриб представляет собой Trichoderma reesei и первый гетерологичный полипептид представляет собой CBHI Humicola grisea, второй гетерологичный полипептид представляет собой эндоглюканазу 1 Acidothermus cellulolyticus, а гомологичный полипептид представляет собой CBHI Trichoderma reesei.
11. Функциональная смесь полипептидов по п.2, где первый полипептид представляет собой модифицированный CBHI Trichoderma reesei, второй гетерологичный полипептид представляет собой модифицированный CBHII Trichoderma reesei, третий гетерологичный полипептид представляет собой эндоглюканазу 1 Acidothermus cellulolyticus, а гомологичный полипептид представляет собой CBHI Trichoderma reesei.
12. Способ использования функциональной смеси,
предусматривающий приведение функциональной смеси по любому из
пп.1-11 в контакт с полимерным субстратом.
13. Способ по п.12, в котором полимерный субстрат выбран из
целлюлозы, производного целлюлозы, лихенина, бета-И-глюкана
зерновых, ксилоглюкана, целло-олигосахаридного олигомера,
целлобиозы, гемицеллюлозы, целлотетриозы, полимера, содержащего
бета-1,4-связанную глюкозу, и растительного материала,
содержащего целлюлозные компоненты.
14. Способ по п.13, где субстрат преобразуется по крайней
мере в один короткий целло-олигосахаридный олигомер, целлобиозу и мономерный сахар.
15. Способ применения функциональной смеси полипептидов, предусматривающий
получение функциональной смеси по пп.1-11;
получение функциональной смеси из нитчатых грибов; и
приведение функциональной смеси в контакт с полимерным субстратом.
По доверенности
Последовательность ДНК слитой конструкции CBHI-E1 (2656 оснований)
Сигнальная последовательность cbhl Т. reesei+каталитический домен+линкер+добавленные аминокислоты SKR+каталитический домен GH5A Acidothermus cellulolyticus+терминирующий кодон
ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTC";CCTTCT
TGCTCGTCTGGTGGCACTTGCACTCAACA^
AACACTTGGAGCTCGACCCTATGTCCTGACAAC^
AACAGCCTCTCCATTGGCTTTGTCACCGAGTC
GGCAACGAGTTCTCTTTCGATGTTGATGTTTCG
AAGGTGCGGCTTGAACGGAGCTCTCTACTTCGTGTCCAT^
CTGTGACAGCCAGTGTCCCCGCGATCTGAAGTTCATC^
CGGAAGCTGCTGCTCTGAGATGGATATCTGGGAGGCCAACTCC^^
TGGGTGCGGCGGAACTTACTCCGATAACAGATATGGCGGCACTTC
TGGCTCAAGCTTTACCCTCGATACCACCAAGAAATTGACCGTTGTCACCCAGTTCGAGACGTCGGGTGCCA
CCAGCAGCCCAACGCCGAGCTTGGTAGTTACTCTGGCAACGAGCTCAACGATGATTACTGCACAGCTGAGGAGGC^
GGGCGGCCTGACTCJ^GTTCAAGAAGGCTACCTCTG <3CGGC^
AGTGAAGCAGCTGACTGAGATGTTACAGTACTACGCC^
AAGCTGCTCC &CCAGCTCCGGTGTCCCTGCT
C^CCCTAGCGGCGGCAACCCTCCCGGCGGAAACCCGCCT
GCCGGGCGGCGGCTATTGGC &CACGAGCGGCCGGGAGATC^
TTACGTCGTGCACGGTCTCTGGTCACGCGACTACCGC^
CAAGCCGGGCACCATGCCGAACAGCATCAATTTTTACCAGATGAATCAGGACCTGCAGGGTCTG
TCAGATCGGCCTGCGGATCATTCTTGACCGCCAC^
CCTGCAAGCGCTGGCGCAGCGCTACAAGGGAAACCCGACGGTC
CATCGACTGGCGATTGGCCGCCGAGCGG <3CCGGAAAC^
CTACTGGTGGGGCGGCAACCTGCAAGGAGCCGGCCAGTACCC^
CCCGCAGACGTGGTTCAGCGATCCGACCTTCCCCAAC^
GGGCGAATTCGGTACGACACTGCjyVTCCACGACCGAC
GTGGACCTTCTGGTCCTGGAACCCCGATTCCGGCGACACAGGAGGAATTCTCAAGGATGACTGGC^GACGGTCGACACAGTAA CAAGTCGTCGATTTTCGATCCTGTCGGCTAA (SEQ ID N0:1)
Аминокислотная последовательность слитой конструкции CBHI-E1 (841 аминокислота)
Сигнальная последовательность cbhl Т. reesei (подчеркнута) + каталитический домен + линкер (курсив) + добавленные аминокислоты SKR (жирный шрифт) + каталитический домен GH5A Acidothermus cellulolyticus
MYRKI^VISAFIATARAQSACTLQSETHPPLTWQ
STYGVTTSGNSLSIGFVTQSAQKNVGARLYLMASDTTYQEF
CPRDLKFINGQANVEGWEPSSNNANTGIGGHGSCCSE№IW^
SFYGPGSSFTJJ)TTKKLTVVTQFETSGAIlSrRYYVQ^
DDYYANMLV^DSTYPTOETSSTPGAVRGSCSTSSGVPAQVESQSPN^^
KRAGGGYWHTSGREILDAlTOVPWIAGINWFGFETCnsrYvVHGLWSRDYRSMLDQIKSLGYNTIRLPYSDDILK
QV^KIVAYAGQIGLRIILDRHRPDCSGQSALWYTSSVSEATW^^
SVNPNLLIFVEGVQSYNGDSYVWGGNLQGAGQYPWLNVPN^
LQSTTOQTWLKTLVQYLRPTAQYGAD^ (SEQ ID N0:2)
Фиг.ЗА
Слитый экспрессирующий вектор рТгех5:СВН1-Е1
Каталитический домен и линкер cbhl Т. reesei + каталитический домен эндоглюканазы 1 Acidothermus cellulolyticus (Е1 или GH5A)
Слитый экспрессирующий вектор рТгех4:СВН1-Е1
AAGCTTAACTAGTACTTCTCGAGCTCTGTACATGTCCGGTCGCGACGTACGCGTATCGATGGCGCCAGCTGCAGGCGGCC GCCTGCAGCCACTTGCAGTCCCGTGGAATTCTCACGGTGAATGTAGGCCTTTTGTAGGGTAGGAATTGTCACTCAAGCAC CCCCAACCTCCATTACGCCTCCCCCATAGAGTTCCCAATCAGTGAGTCATGGCACTGTTCTCAAATAGATTGGGGAGAAG TTGACTTCCGCCCAGAGCTGAAGGTCGC^CAACCGCATGATATAGGGTCGGCAACGGCAAAAAAGCACGTGGCTCACCGA AAAGCAAGATGTT^GCGATCTAAC^TCC^GGAACCTGGATACATCCATC^TCACGC^CGACCACTTTGATCTGCTGGTAA ACTCGTATTCGCCCTAAACCGAAGTGACGTGGTAAATCTACACGTGGGCCCCTTTCGGTATACTGCGTGTGTCTTCTCTA GGTGCCATTCTTTTCCCTTCCTCTAGTGTTGAATTGTTTGTGTTGGAGTCCGAGCTGTAACTACCTCTGAATCTCTGGAG AATGGTGGACTAACGACTACCGTGCACCTGCATCATGTATATAATAGTGATCCTGAGAAGGGGGGTTTGGAGCAATGTGG GACTTTGATGGTCATCAAACAAAGAACGAAGACGCCTCTTTTGCAAAGTTTTGTTTCGGCTACGGTGAAGAACTGGATAC TTCTTGTGTCTTCTGTGTATTTTTGTGGCAACAAGAGGCCAGAGACAATCTAT^
TACAAGAACCTGTGGGGTATATATCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATA CTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTA TGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCA CTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTC GACGGTTGCT^TGC^GGGGTACTCAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTG ATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAA TGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCT GCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAG TGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATG CCTAAAGAAGTCATATACC^GCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGG GGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAA TOK^TCGCTTGT^TCTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGT^TTGCATACAACCA AGGGCAGTGATXMAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAG GTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAAC AGGa\AAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCG GGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATCTGATAGGCAAATGTTCA GGGGCCACTGCATX^TTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAA TGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACT CATCAACTCAGATCCTCC^GGAGACTTGTACIACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCAT CATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCAGTCGGCCTGCACTCTCCAATCGGAGA CTCACCCGCCTCTGACATGGCAGAAATGCTCGTCTGGTGGCACTTGCACTCAACAGACAGGCTCCGTGGTCATCGACGCC
AACTCGCGCTGGACTCACGCTACGAACAGCAGCACGAACTGCTACGATGGCAACACTTGGAGCTCGACCCTATGTCCTGA CAACGAGACCTGCGCGAAGAACTX5CTX3TCTGGACGGTGCCGCCTACGCGTCCACGTACGGAGTTACCACGAGCGGTAACA GCCTCTCCATTGGCTTTGTCACCCAGTCTGCGCAGAAGAACGTTGGCGCTCGCCTTTACCTTATGGCGAGCGACACGACC TACCAGGAATTCACCCTGCTTGGCAACGAGTTCTCTTTCGATGTTGATGTTTCGCAGCTGCCGTAAGTGACTTACCATGA ACCCCTGACGTATCTTCTTGTGGGCTCCCAGCTGACTGGCCAATTTAAGGTGCGGCTTGAACGGAGCTCTCTACTTCGTG TCCATGGACGCGGATGGTGGCGTGAGCAAGTATCCCACCAACACCGCTGGCGCCAAGTACGGCACGGGGTACTGTGACAG CC^GTGTCCCCGCGATCTGAAGTTCATC^TGGCCAGGCCAA
CGGGCATTGGAGGACACGGAAGCTGCTGCTCTGAGATGGATATCTGGGAGGCCAACTCCATCTCCGAGGCTCTTACCCCC CACCCTTGCACGACTGTCGGCCAGGAGATCTGCGAGGGTGATGGGTGCGGCGGAACTTACTCCGATAACAGATATGGCGG CACTTGCGATCCCGATGGCTGCGACTGGAACCCATACCGCCTGGGCAACACCAGCTTCTACGGCCCTGGCTCAAGCTTTA CCCTCGATACCACCAAGAAATTGACCGTTGTCACCCAGTTCGAGACGTCGGGTGCCATCAACCGATACTATGTCCAGAAT GGCGTCACTTTCCAGCAGCCCAACGCCGAGCTTGGTAGTTACTCTGGCAACGAGCTCAACGATGATTACTGCACAGCTGA GGAGGCAGAATTCGGCGGATCCTCTTTCTCAGACAAGGGCGGCCTGACTCAGTTCAAGAAGGCTACCTCTGGCGGCATGG TTCTGGTCATCAGTCTGTGGGATGATGTGAGTTTGATGGACAAACATGCGCGTTGACAAAGAGTCAAGCAGCTGACTGAG ATGTTACAGTACTACGCCAACATGCTGTGGCTGGACTCCACCTACCCGACAAACGAGACCTCCTCCACACCCGGTGCCGT GCGCGGAAGCTGCTCCACCAGCTCCGGTGTCCCTGCTCAGGTCGAATCTCAGTCTCCCAACGCCAAGGTCACCTTCTCCA ACATCAAGTTCGGACCCATTGGCAGCACCGGCAACCCTAGCGGCGGCAACCCTCCCGGCGGAAACCCGCCTGGCACCACC ACCACCCGCCGCCCAGCCACTACCACTGGAAGCTCTCCCGGACCTACTAGTAAGCGGGCGGGCGGCGGCTATTGGCACAC GAGCGGCCGGGAGATCCTGGACGCGAACAACGTGCCGGTACGGATCGCCGGCATCAACTCGTTTGGGTTCGAAACCTGCA ATTACGTCGTGCACGGTCTCTGGTCACGCGACTACCGCAGCATGCTCGACCAGATAAAGTCGCTCGGCTACAACACAATC CGGCTGCCGTACTCTGACGACATTCTCAAGCCGGGCACCATGCCGAACAGCATCAATTTTTACCAGATGAATCAGGACCT GCAGGGTCTGACGTCCTTGCAGGTCATGGACAAAATCGTCGCGTACGCCGGTCAGATCGGCCTGCGCATCATTCTTGACC GCCACCGACCGGATTX3CAGCGGGCAGTCGGCGCTGTGGTACACGAGCAGCGTCTCGGAGGCTACGTGGATTTCCGACCTG CAAGCGCTGGCGCAGCGCTACAAGGGAAACCCGACGGTCGTCGGCTTTGACTTGCACAACGAGCCGCATGACCCGGCCTG CTGGGGCTGCGGCGATCCGAGCATCGACTGGCGATTGGCCGCCGAGCGGGCCGGAAACGCCGTGCTCTCGGTGAATCCGA ACCTGCTCATTTTCGTCGAAGGTGTGCAGAGCTACAACGGAGACTCCTACTGGTGGGGCGGCAACCTGCAAGGAGCCGGC CAGTACCCGGTCGTGCTGAACGTGCCGAACCGCCTGGTGTACTCGGCGCACGACTACGCGACGAGCGTCTACCCGCAGAC GTGGTTCAGCGATCCGACCTTCCCCAACAACATGCCCGGC^^
TTGCACCGGTATGGCTX^CGAATTCGGTACGACACTGCAATCCACGACCGACCAGACGTGGCTGAAGACGCTCGTCCAG TACCTACGGCCGACCGCGCAATACGGTGCGGACAGCTTCCAGTGGACCTTCTGGTCCTGGAACCCCGATTCCGGCGACAC AGGAGGAATTCTCAAGGATGACTGGCAGACGGTCGACACAGTAAAAGACGGCTATCTCGCGCCGATCAAGTCGTCGATTT TCGATCCTGTCTAAGGCGCGCCGCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATC ATX3ACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTC AACTCATCT^TCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACA
AAACGATTCCTTAGTAGCCATGCAT^TTAAGATA^
TCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCAGTTTATTTTGAATAGCTCGCCCGCTGGAGAG CATCCTGAATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACG TCTTCGCGGTTGATATATATGTATGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTCGCTGCTTGTGCA ATAATCGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGACTCCCATCTTTCAGTAAAGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAAT TTAAACTCGTTAGCATGGGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGCCGCGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAA ATTCGGCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCC CGGGATCAATGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTC GTCGAGCCAACATCCTGACTATAAGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGC CTCGCAAAAACCATCCCTGATGAATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATC GGGGATCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGT TGACCTCGGTGGAAGTTACGCTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTC AGGGAGATXSTAACAACGCCACCT^ATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTC TTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCA TGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGT CAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCG GTTCTGACTiACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGA GACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGG GTX3CGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTC AACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGAC GGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATAC CAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCC GCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCC GAGTCGGAC^TTATTGCCTCC^GATCAAGAACGGCGGGCTC^TATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCC ACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGC CATACAAGCACGATTTCGGCCACGATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATC AGTGCATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAATATCAAAGACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTTAACATGAACGAGCT CTGGGACACGCATCTCCAGAAGTGGAATTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGA AGGAACTGGACGCCATCATCGCGCCGATTACGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCC TCTGTGATCAACCTGCTGGATTTCACGAGCGTGGTTGTTCCGGTTACCTTTGCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGA GAGTTTCAAGGCGGTTAGTGAGCTTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTG CAGTGCAGGTTATCGGACGGAGACTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAAT GTGGTGACTCCATAGCTAATAAGTGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAA GTGACCATGCCATGCTACGAAAGAGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAA
GGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTCTAGACACGTATAACGGCACAAGTGTCTCTCACCAAATGGGTTATATCT CAAATGTGATCTAAGGATGGAAAGCCCAGAATCTAGGCCTATTAATATTCCGGAGTATACGTAGCCGGCTAACGTTAACA ACCGGTACCTCTAGAACTATAGCTAGCATGCGCAAATTTAAAGCGCTGATATCGATCGCGCGCAGATCCATATATAGGGC CCGGGTTATAATTACCTCAGGTCGACGTCCCATGGCCATTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAA TTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCT AACTCACATTAATTGCGTTGCGCTC^CTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGC CAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCG GCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACA TGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCT GACGAGC^TCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCC TGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCG TGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAA CCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCC ACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTA ACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGC TCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTT^TGTTTGCAAGCAGCAGAT^ACGCGCAGAAAAAAAGG ATCTCJIAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCA TGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAG TAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGT TGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAG ACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACT TTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGT TCTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTC^
GGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTG GC03CAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAG(^CTGCATAATTCTCTTACTGTCATCCCATCCGTAAGATX5CTTTTCTGT GACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGG ATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCAT^GGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATC TTACOXTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTC
TTCTGGGT^GCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAC TCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGGATTTATC
AATAAACAAATAGGGGTTCCGCGC7VCATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATT AACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC AGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTCTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTT GGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAA
Фиг.ЗР
TATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTT^GTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTT ATAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGAC TCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATC^GTTTTTTGGG GTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACG TGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACC ACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGGTTGCTTTGACGTATGCGGTGTGAAATACCGCAC AGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCG GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCC AGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCC (SEQ ID N0:14)
Полилинкер pSL1180
/Spel {8)
ЕсоШ(714б).."-
Полилинкер pSL1180' Терминатор amdS
Xbal
attBl
Промотор cbhl Т. reesei I
Терминатор attB2 cbhl T. reesei
Xbal
Щ A.nidulans amdS
AAGCTTACTAGTACTTCTCGAGCTCTGTACATGTCCGGTCGCGACGTACGCGTATCGATGGCGCCAGCTGCAGGCGGCCG
CCTGCAGCCACTTGCAGTCCCGTGGAATTCTCACGGTGAATGTAGGCCTTTTGTAGGGTAGGAATTGTCACTCAAGCACC
CCCAACCTCCATTACGCCTCCCCCATAGAGTTCCCAATCAGTGAGTCATGGCACTGTTCTCAAATAGATTGGGGAGAAGT
TGACTTCCGCCCAGAGCTGAAGGTCGCACAACCGCATGATATAGGGTCGGCAACGGCAAAAAAGCACGTGGCTCACCGAA
AAGCAAGATGTTTGCGATCTAACATCCAGGAACCTGGATACATCCATCATCACGCACGACCACTTTGATCTGCTGGTAAA
CTCGTATTCGCCCTAAACCGAAGTGCGTGGTAAATCTACACGTGGGCCCCTTTCGGTATACTGCGTGTGTCTTCTCTAGG
TGCCAT^CTT^CCCTTCCTCTAGTGTTGAATTGTTTGTGTTGGAGTCCGAGCTGTAACTACCTCTX3AATCTCTGG
TGGTGGACTAACGACTACCGTGCACCTGCATCATGTATATAATAGTCATCCTGAGAAGGGGGGTTTGGAGCAATGTGGGA
CTTTGATGGTCATCAAACAAAGAACGAAGACGCCTCTTTTO^
GTTGTGTCTTCTCTGTATTTTTGTGGCAACAAGAGGCCAGAGACAATCTATTCAAACACCAAGCTTGCTCTTTTGAGCTA CAAGAACCTGTGGGGTATATATCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACT CCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATG AGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACT CATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGA CGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGT^CCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGAT TCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATG TCATTGCGATCTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGC TCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTG TCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCC TAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGG T^GCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATT GGGTCGCT^TTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGA^
GGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGT^GACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGT TTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTC^CTTCTXSATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACA GGCAAAAGAT^GAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGG GCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAG GGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAAT GAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTC ATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTA CAAAAAAGCAGGCTATGCGTACCGCCAAGTTCGCCACCCTCGCCGCCCTTGTGGCCTCGGCCGCCGCCCAGCAGGCGTGC AGTCTCACCACCGAGAGGCACCCTTCCCTCTCTTGGAAGAAGTGCACCGCCGGCGGCCAGTGCCAGACCGTCCAGGCTTC CATCACTCTCGACTCCAACTGGCGCTGGACTCACCAGGTGTCTGGCTCCACCAACTGCTACACGGGCAACAAGTGGGATA CTAGCATCTGCACTGATGCCAAGTCGTGCGCTCAGAACTGCTGCGTCGATGGTGCCGACTACACCAGCACCTATGGCATC ACCACCAACGGTGATTCCCTGAGCCTCAAGTTCGTCACCAAGGGCCAGCACTCGACCAACGTCGGCTCGCGTACCTACCT
GATGGACGGCGAGGACAAGTATCAGAGTACGTTCTATCTTCAGCCTTCTCGCGCCTTX3AATCCTGGCTAACGTTTACACT
TCACAGCCTTCGAGCTCCTCGGCAACGAGTTCACCTTCGATGTCGATGTCTCCAACATCGGCTGCGGTCTCAACGGCGCC
CTGTACTTCGTCTCCATGGACGCCGATGGTGGTCTCAGCCGCTATCCTGGCAACAAGGCTGGTGCCAAGTACGGTACCGG
CTACTGCGATGCTCAGTGCCCCCGTGACATCAAGTTCATCAACGGCGAGGCCAACATTGAGGGCTGGACCGGCTCCACCA
ACGACCCCAACGCCGGCGCGGGCCGCTATGGTACCTGCTGCTCTGAGATGGATATCTGGGAAGCCAACAACATGGCTACT
GCCTTCACTCCTCACCCTTGCACCATCATTGGCCAGAGCCGCTGCGAGGGCGACTCGTGCGGTGGCACCTACAGCAACGA
GCGCTACGCCGGCGTCTGCGACCCCGATGGCTGCGACTTCAACTCGTACCGCCAGGGCAACAAGACCTTCTACGGCAAGG
GCATGACCGTCGACACCACCAAGAAGATCACTGTCGTCACCCAGTTCCTCAAGGATGCCAACGGCGATCTCGGCGAGATC
AAGCGCTTCTACGTCCAGGATGGCAAGATCATCCCCAACTCCGAGTCCACCATCCCCGGCGTCGAGGGCAATTCCATCAC
CCAGGACTGGTGCGACCGCCAGAAGGTTGCCTTTGGCGACATTGACGACTTCAACCGCAAGGGCGGCATGAAGCAGATGG
GCAAGGCCCTCGCCGGCCCCATGGTCCTGGTCATGTCCATCTGGGATGACCACGCCTCCAACATGCTCTGGCTCGACTCG
ACCTTCCCTGTCGATGCCGCTGGCAAGCCCGGCGCCGAGCGCGGTGCCTGCCCGACCACCTCGGGTGTCCCTGCTGAGGT
TGAGGCCGAGGCCCCCAACAGCAACGTCGTCTTCTCCAACATCCGCTTCGGCCCCATCGGCTCGACCGTTGCTGGTCTCC
CCGGCGCGGGCAACGGCGGCAACAACGGCGGCAACCCCCCGCCCCCCACCACCACCACCTCCTCGGCTCCGGCCACCACC
ACCACCGCCAGCGCTGGCCCCAAGGCTGGCCGCTGGCAGCAGTGCGGCGGCATCGGCTTCACTGGCCCGACCCAGTGCGA
GGAGCCCTACACTTGCACCAAGCTCAACGACTGGTACTCTCAGTGCCTGTAAACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGAT
CGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATG
GCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGC
GGCCTGCTTGGTATT-GCGATGTTGTCAGCTTX^CAAAT^GTGGCT^TCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGC
ATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATC
GCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCAGTTTATTTTGAATAGCTCGCCCGCTGGAGAGCATCCTGAATGCAAGTAACAACC
GTAGAGGCTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACX3TCTTCGCGGTTGATATATATGTA
TGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTCGCTGCTTGTGCAATAATCGCAGTGGGGAAGCCACA
CCGTGACTCCCATCT^CAGTAAAGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAATTTAAACTCGTTAGCATGGGGCTG
ATAGCTTAAT^ACCGTT^ACCAGTCCCATGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCAATCAC
CAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCCCGGGATCAATGAGGAGAATGAGG
GGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCAACATCCTGACTATA
AGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGCCTCGCAAAAACCATCCCTGATGA
ATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATCGGGGATCCTTTCAGAGGCCGAAC
TGAAGATCACAGAGGCCTCCX3CTCCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTACGCTA
GCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCT
TATX3GGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTCTCCAGACAAACTGCGCCCACGAGT^CTTCCCTGACGCCGCTCTC
GGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAG
ACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGC
TACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAA
AGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGC
GCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGT GGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCC GAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGA TTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTC TTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTC GGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAA GATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCG TGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGCCATACAAGCACGATTTCGGCCAC GATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATCAGTGCATCCGGCGAGCCGGCGAT TCCAAATATCAAAGACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTTAACATGAACGAGCTCTGGGACACGCATCTCCAGAAGT GGAATTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGAAGGAACTGGACGCCATCATCGCG CCGATTACGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCCTCTGTGATCAACCTGCTGGATTT CACGAGCGTGGT^GTTCCGGTTACCTT^GCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGAGAGTTTCAAGGCGGTTAGTGAGC TTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTGCAGTGCAGGTTATCGGACGGAGA CTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTX3CTGGGAAATGTGGTGACTCCATAGCTAATAAG TGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAAGTGACCATGCCATGCTACGAAAG AGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCG TTTCCAGTCTAGACACGTATAACGGCACAAGTGTCTCTCACCAAATXXMTTATATCTCAAATGTGATCTAAGGATGGAAA GCCCAGAATATCGATCGCGCGCAGATCCATATATAGGGCCCGGGTTATAATTACCTCAGGTCGACGTCCCATGGCCATTC GAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAAT^GTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAA GCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTXSCCTAATCAGTX^GCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAG TCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTC CGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATAC GGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAG GCCGCGTTX3CTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCG AAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGC TTACCGGATACCTGTCCGCCTT^CTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTA TCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGT ATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCT CTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTT TTT^TTTGCAAGCAGC^GATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACG CTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAAT TAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGC ACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGG GCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTX3CAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAG
CCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGC TAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGT TTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTT AGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAA T^CTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTA TGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATC ATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGC ACCCAACTCATCTTCAGCATCT^TACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATXSCCGCAAAAA AGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGT^GAATACTC^TACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTAT TGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGT GCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCG CGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCC GGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCA GATTGTACTGAGAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCT CATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCC
CCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGG
CCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGG
GCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCT
AGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTA
CTATGGTTGCTTTGACGTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCC
ATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTG
CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCC (SEQ ID NO
Фиг.6
кех2
Промотор cbhl
Каталитический домен + линкер нативного гена cbhl
Промотор cbhl
вариант
гена cbhl
Промотор cbh2
вариант
гена cbh2
маркер amdS
Терминатор cbhl
Терминатор cbh2
ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCAGTCGGCCTGCACTCTTCAACCGGAGAC TCACCCGCCTCTGACATGGCAGAAATGCTC^
ACTGGCGCTGGATTC^CGCTACGAACAGCAGCACGAGCTGCTACGATGGCAACACTTGGAGCTCXJACCCTATGTCCTGAC
AACGAGACCTGCACGAAGAACTX5CTGTCTGGACGGTGCCGCCTACGCGTCCACGTACGGAGTTACCACGAGCGGTGACAG
CCTCACCATTGGCTTTGTC^CCCAGTCTGCGCAGAAGAACGTTGGCGCTCGCCTTTACCTTATGGCGAACGACACGACCT
ACCAGGAATTCACCCTGCTTCGCAACGAGTTCTCTTTCGATGTTGATGTTTCGCAGCTGCCGTGCGGCTTGAACGGAGCT
CTCTACCTCGTGTCCATGGACGC"3ATGGTGGC^^
GTACTGTCACAGCCAGTCTCCCCGCGATCTGAAGTC
ACAACGCGAACACGGGCATTCGAGGACACGGAAGCTGCTX3CTCTCAGATC
GCTCTTACCCTCCACCCTTGCACGACTGTCGGCCAGGAGATCTGCGAGGGTGATGGGTGCGGCGGAACTTACTCCAAGAA CAGATATGGCGGCCCTTGCGATCCCGATCTCCTC
GCCCAAGCTTTACCCTCGATACCACO^GAAATTGACCGTTGTCACCCAGTTO^GCCGTCGGGTGCCATC^ACCGATAC TATCTCCAGAATGGCGTCACTTTCCAGC^^
CTCCTACGCTGAGGAGGCAGAATTCGGCGGATCCTCTTTCTCAGACAAGGGCGGCCTGACTCAGTTCAAGAAGGCTACCT
CTGGCGGCATGGT^CTGGTC^TX5AGTCTGTGGGATGATTACTACGCCAACATGCTGTGGCTGGACTCCACCTACCCGACA
AACGAGACCTCCTCCACACCCGGTX5CCGTGCGCGGAAGCTGCTCCACCAGCTCCGGTGACCCTGCTCAGGTCGAATCTCA
GTTTCCCAACGCCT^GGTCACCTTCTCCTACATCY^GTTCGGACCCATTGGCAGCACCGGCAACCCTAGCGGCGGCAACC
CTCCCGGCGGAAACCCGCCTGGCACCACCACCACCCGCCGCCCAGCCACTACCACTGGAAGCTCTCCCGGACCTACCCAG
TCTCACTACGGCCAGTGCGGCGGTAT^GGCTACAGCGGCCCCACGGTCTCCGCCAGCGGCACAAC
CCCTTACTACTCTCAGTGCCTGTAA (SEQ ID NO: 8)
MYRKbAVISAFLATARAQSACTLQPETCT
LDGAAYASTYGVTTSGDSLTIGFVTQSAQKNVGARLYLP^JDTTYQEFTLLGNEFSFDVDVSQLPCGLNGALYFVSMDADGGVSKYPT
NTAGAKYGTCYCDSQCPRDLKFINGQANVEGWEPST^ANTGIGGHGSCCSEMDIWEANSISEALTLHPCTTVGQEICEG
DGCGGTYSKNRYGGPCDPDGCD^PYRLGNTSFYGPGPSFTLDTTKKLTVVTQFKPSGAINRYYVQNGVTFQQPNAELGS
YSGNEI^DDYCYAEEAEFGGSSFSDKGGLTQFKKATSGGMVLVMSLVTODYYANNLWLDSTYPTNETSSTPGAVRGSCSTS
SGDPAQVESQFPNAKVTFSNIKFGPIGSTGNPSGGNPPGGNPPGTTTTRRPATTTGSSPGPTQSHYGQCGGIGYSGPTVC
ASGTTCQVLNPYYSQCL (SEQ ID N0:9)
AAGCTTACTAGTACTTCTCGAGCTCTGTACATGTCCGGTCGCGACGTACGCGTATCGATGGCGCCAGCTGCAGGCGGCCG CCTGC^GCCACTTGCAGTCCCGTGGAATTCTCACGGTC^
CCCAACCTCCATTACGCCTCCCCCATAGAGTTCCC^ATCAGTGAGTCATGGCACTGTTCTCAAATAGATTGGGGAGAAGT
TGACTTCCGCCCAGAGCTGAAGGTCGCACAACCGCATGATATAGGGTCGGCAACGGCAAAAAAGCACGTGGCTCACCGAA
AAGCAAGATGTTTGCGATCTAACATCCAGGAACCTGGATACATCCATCATCACGCACGACCACTTTGATCTGCTGGTAAA
CTCGTATTCGCCCTAAACCGAAGTGCGTGGTAAATCTACACGTGGGCCCCTTTCGGTATACTGCGTGTGTCTTCTCTAGG
TGCCATTCTTT^CCCTTCCTCTAGTGTTCAAT^GTTTGTGTTGGAGTCCGAGCTGTAACTACCTCTGAATCTCTGGAGAA
TGGTX3GACTAACGACTACCGTGCACCTGCATCATGTATATAATAGTGATCCTGAGAAGGGGGGTTTGGAGCAATGTGGGA
CT^GATGGTCATCAAACAAAGAACGAAGACGCCTCTTTTO^
GTO3TGTCrrCTGTGTATTTTTGTGGCAACAA
CAAGAACCTGTGGGGTATATATCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACT CCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATX3TGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATG AGAAATTCTCGAGACGGCTTCTTGAATCATC
CATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTC CGGTTGCAATGC^GGGGTACTGAGCTTGGACAT^
TCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATG
TCATOSCGATGTGTAATTTGCCTGCTO^
TCGTAGAGGCATGTTCTCAATCTGTXH'CGGGCAGG
TCTAGTAGC^CCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGT^
TAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTCGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGG
TTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCC^
GGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGAC^
GGCAGTCATGGAAGACAGTCAAATGTTGACATTCJ^G^
TOGTCTCCCGATACGACGAATACTCTATAGTCACT^CTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCAC
GGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATX3TTTGTGCTCCGG
GCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAG
GGGCCACTGCATGGT^TCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAAT
GAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTC
ATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACC^
CAAAAAACAGGCTATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCA(^GCTCGTGCTCAGTCGGCCTGCACTC TTCAACCGGAGACTCACCCGCCTCTGACATGGCAGAAATGCTCGTCTGGTGGCACGTGCACTCAACAGACAGGCTCCGTG GTCATCGACGCCAACTGGCGCTGGATTCAGGCTACG
CCTATGTCCTGACAACGAGACCTGCACGAAGAACTGCTGTCTGGACGGTGCCGCCTACGCGTCCACGTACGGAGTTACCA CGAGCGGTGACAGCCTCACC^TTGGCTTTGTCACCCAGTCTGCGCAGAAGAACGTTGGCGCTCGCCTTTACCTTATGGCG AACGACACGACCTACC^GGAATTCACCCTGCT^GGCAACGAGTTCTCTTTCGATGTTGATGTTTCGCAGCTGCCGTGCGG CTTGAACGGAGCTCTCTACTTCGTGTCCATGGACGCGGATGGTGGCGTGAGCAAGTATCCCACCAACACCGCTGGCGCCA AGTACGGCACGGGGTACTGTGACAGCCAGTGTCCCCGCGATCTGAAGTTCATCAATGGCCAGGCCAACGTTGAGGGCTGG GAGCCGTCAACCAACAACGCGAACACGGGCATTGGAGGACACGGAAGCTGCTGCTCTGAGATGGATATCTGGGAGGCCAA CTCTATCTCCGAGGCTCTTACCCTCCACCCTTGCACGACTGTCGGCCAGGAGATCTGCGAGGGTX3ATGGGTGCGGCGGAA CTTACTCCAAGAACAGATATGGCGGCCCTTC^GATC^
TTCTACGGCCCTGGCCCAAGCTTTACCCTCGATACCACCAAGAAATTGACCGTTCTCACCCAGTTCAAGCCGTCGGGTGC
CATCAACCGATACTATGTCCAGAATGGCGTCACnTCCAGCAGCCCAACGCCGAGCTTGGTAGTTACTCTGGO^
TC^CGATCAT^ACTXSCTACGCTGAGGAGGCAGAATTCGGCGGATCCTCTTTCTCAGACAAGGGCGGCCTGACTCAGTTC
AAGAAGGCTACCTCTGGCGGCATGGTTCTGGTCATGAGTCTGTGGGATGATTACTACGCCAACATGCTGTGGCTGGACTC
CACCTACCCGACAAACGAGACCTCCTCCACACCCGGTGCCGTGCGCGGAAGCTGCTCCACCAGCTCCGGTGACCCTGCTC
AGGTCGAATCTCAGTTTCCCJU\CGCC7y^GTC^
AGCGGCGGC^CCCTCCCGGCGGAAACCCGCCTGGCACCACCACCACCCGCCGCCCAGCCACTACCACTGGAAGCTCTCC
CGGACCTACCCAGTCTCACTACGGCC^GTGCGGCGGTATTGGCTACAGCGGCCCCACGGTCTGCGCC^GCGGCACAACTT
GCCAGGTCCTGAACCCT^ACTACTCTCAGTGCCTGTAAACCCAGCTT^CTOGTACAAAGTGGTGATCGCGCCGCGCGCCA
GCTCCGTCCGAAAGCCTCACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGG
GTGATTTATTTTTTTTX3TATCTACTTC
TTGGTAT^GCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTT^
GATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTC TTCGTCTATCCCAGTACCIAGTTTATTTTC^
CTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACGTCTTCGCGGTTGATATATATGTATGTTTGA
CTGCAGGCTCCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTC
TCCCATCTT^CAGTAAAGCTCTCTTGGTC
AATTACCGT^'TACCAGTGCCATCGTTCTCCAGCTT^'CCTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAG GC^CCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCCCGGGATCAATGAGGAGAATGAGGGGGATGC GGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCAACATCCTGACTATAAGCTAAC
ACAGAATGCCTCJUYTCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCG
GTCCAGACGCTGCCTCCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATCGGGGATCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGAT CACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTACGCTAGCATTCT GTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCT <^GGGAGATGTAACAACGCC^CCTTATGGGA CTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGG GAACTCGATXSAATACTACGCT^GCACAAGAGACCCGTTGGTCC^CTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCT TCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCT
CATCJ^TGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGC
GCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGT
CJUKICCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTC
TCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCAT GGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCA CTCTGTTGAGGGTGAGTCCTCCGCCTCTTCCTTCCTT^
TTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGG
AGCCATGGAAATACGACTCO^GGTCATCCCCATCCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCA^GATCAAG
AACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAAC
CT^CCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTC^CACCGTGACCCCGTGGACGCCATACAAGCACGATTTC^
TCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATCAGTGCATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAAT
ATC^^GACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTT^
CCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGAAGGAACTGGACGCCATCATCGCGCCGATTA
CGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGT^CCGGTACTATCGGTATGCCTCTGTGATCAACCTCCTGGATTTCACGAGC
GTGGTTOTTCCGGTTACCTTTGCGGATAAGAACATC^
CCTCGTCCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATCGGGCACCGGTTX3CAGTC
AAGAGAGGACGTTCGCGATTCCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTCGG
TAGCAAT^TGCIACAAGAAATCAATACCAGCAACTC
AAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCT^GGAAGAATCCCT^CAGGGTTGCGTTTCCAG
TCTAGACACGTATAACGGCACAAGTGTCTCTCACOU^TGGGTTATATCTCAAATGTGAT
ATATCGATCGCGCGCAGATCCATATATAGGGCCCGGGTTATAATTACCTCAGGTCGACGTCCCATGGCCAT^CGAATTCG TAATCATGGTCATAGCTGT^CCTCTGTGAAATTC^
GTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAA ACCTGTCGTXSCCAGCTGCATTAATCAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTT^GCGTATTCGGCGCTCTOCCGCTTCC
TCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATC CAC^GAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTCAGCAAAAG
TGCTCGCGTTT^TCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCG ACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGG ATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGG TCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTCCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTT GAGTCCT^CCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGG CGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGA AGCCAGTraCCTTCGGAAAAAGAGTTCGTAGCTCTTG^
TGCJ^GCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTG GAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAAT^AAAAAT GAAGTTTTAAATCTUmTTAAAGTATATATGAGTAAACT^
TCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACC
ATCTGGCCCCAGTGCTGCi^TGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATC^GCTATAAACCAGCCAGCCG
GAAGGGCCGAGCGCAGAAGTCGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTA
AGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCJ^CGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGT^
GGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATC^GGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCT
TCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC^GTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTT
ACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTT^TCTGTC^
ACCGAGT^GCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAAT
AACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCJ^GGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATCTAACCCACTCGTGCACCCAAC
TCATCT^CAGC^TCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCC
AAGGGCGAC^GGAAATGTTGAATACTCATACTCCTCCT
TGAGCGGATACATAT^TGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTXSCCACCT GACGTCTAAGAAACCATTATTATC^TCACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTT CGGTGATCACGGTCAAAACCTCTGACACATGCAGCTCC^
GAC^y^GCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTA
CTGAGAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTre
TAACCAATAGGCCGAAATCGGC^AATCCCTTAT^^
GGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAA
CGTGAACCATC^CCCAAATCAAGTTTTT^GGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCG
Oi/ir.8F
ATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGC TGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGGT TGCTTTGACGTATCCGGTGTGAAATACCX3CACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCA CTGCGCAACTGTTCGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCT
GCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCC (SEQ ID NO: 10).
Фиг.9А
ATGATTGTCGGC^TTCTCACCACGCTGGCTACGCTX3GCCACACTCGCAGCTAGTX3TCCCTCTAGAGGAGCGGCAAGCTTG CTGAAGCGTCTGGGGCCAATGTX3GTGGCCAGAATTC
CCAACGACTATTACTCCCAGTGTCTTCCCGGCGCTGCAAGCTCAAGCTCGTCCACGCGCGCCGCGTCGACGACTTCTCGA GTATCCCCCACAACATCCCGGTCGAGCTCCGCGACGCCTCCACCTGGTTCTACTACTACCAGAGTACCTCCAGTCGGATC GGGAACCGCTACGTATTCAGGCAACCCT^TTGTTGGGGTCACTCTTTGGGCC^TGCATATTACGCCTCTGAAGTTAGC^ GCCTCGCTATTCCTAGCTTGACTGGAGCCATGGCCACTGCTGC^GCAGCTGTCGCAAAGGTTCCCTCTTTTGTGTGGCTA GATACTCTTGACAAGACCCCTCTCATGGAGCAAACCTTGGCCGACATCCGCGCCGCCAACAAGAATGGCGGTAACTATGC CGGACAGTT^GTGGTGTATGACTTGCCGGATCGCGATTGCGCTGCCCTTGCCTCGAATGGCGAATACTCTATTGCCGATG GTGGCGTCGCCAAATATAAGAACTATATCGACACCATTCGTCAAATTGTCGTGGAATATTCCGATGTCCGGACCCTCCTG GTTATTGAGCCTGACTCTCTTGCCAACCTGGTGACCAACCTCGGTACTCCAAAGTGTGCCAATGCTCAGTCAGCCTACCT TGAGTGCATGAACTACGCCGTCACACAGCTXSAACCTTCCAAATGTTGCGATGTATCT
TTGGCTGGCCGGCAAACC^GACCCGGCCGCTCAGCTATTTGCAAATCTTTACAAGAATGCATCGTCTCCGAGAGCTCTT CGCGGATTGGCAACCAATGTCGCCAACTACAACGGGTC^
CTACAACGAGAAGCTGTACATCCACGCTATTGGACCTCT^CTTGCCAATCACGGCTGGTCCAACGCCTTCTTCATCACTG
ATCIAAGGTCGATCGGGAAAGCAGCCTACCGGACAGCAACAGTGGGGAGACTGGTX3CAATGTGATCGGCACCGGATTTGGT
ATTCGCCCATCCGC^IAACACTGGGGACTCGTTGC^
CAGCGACAGCAGTGCGCCACGATTOSACTACCACT
GGTTCCAAGCCTACTTTGTGCAGCTTCTCACAAACGCAAACCCATCGTTCCTGTAA (SEQ ID NO: 11)
MIVGILTTLATLATLAASVPLEERQACSSVWGQCGGQIWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSR VSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSI^IPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWL DTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLL VIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVT^
RGIATNVANYNGmiTSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLAmiGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFG IRPSANTGDSLLDSFVWKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL (SEQ ID NO: 12)
NotI
Терминатор cbhll
Промотор cbhll T.reesei cbhll
3,1 т.п.о.
1.4т.п.о. 0.4Т.П.0. 2.7 т.п.о рЕхр-с6Л//(14.2 т.п.о.)
Srfl
К) ON
GCGGCCGCCGX3K^TAGACGAAGTGACACGTATCCGAAACAGCAGTGGTATT^ CTGAGCTGGCCATCGCTGAGCTGACAAGAGCCCCGCCGAGCAGCCATCGCTGAAGCGCCATC AGT^AT^TTCGAGGATGGAAATCTTCAGTGGATGTCTGATCTAGGTTCTTTATTGCCCAGAG^ TCGACATCTAAAAGTTT^TCTCCTCAGCGGTCT^^
ACACOSAGGTCGATGTGCa^GAGCTGGGGTGCTGAGAGCTGGACAATGATTCTCCACTTCAGTXSTTGTTATC
AGCTTCCACTreAAGTTAGCAGGTGCGAGTCGCTATCTCTGTAGTT^^
CCTCTGCAGTGGT^GGTCCTGAATAATCTTTGA
ACTAGTTGTATCGAACCATTAGTC05TATAGTATCGCATGCAATTGCTAGTCAATGGTAGCAGATCAGTCGAAGGCGTGA AGTCAATATACGATTGCATTGCCCGCCTTGTTATGACAAACGTACCGAGGAAGAGAAGACAGTGTATGCCTCTATGTATC AAATAAGGAGCCAG <3AACCTCAT^ACCCGTATGCTATTATCGAGTGGCACTACATGATCTCCGAAAAATTTAAAAAAGAA ATAAAAAATTGTTOTTAG <5TT^T^ACAGCAAGCTCTCT^GG43TTATCGGAGGCTG <5C
TTGCTGATCGAGAAGATTAGCATGTTTCTT^CACAATGCAAAAGAAGTATTGCTAGGAAGGTTCGAAAGA^ TTCTACACAGTCATTTCCTGGAGACTAACAGAGCTTTATGTAGTATATATGGAGACGTGAAGCTACTGCCG CTTGCCCATCACCGCACGAGT^CGAGC^CX3TTAATATTCCAATTACGACTCAAATCAATACCT TCTTGACATTAACGCATCCTTTCAAGTAATC
GGCGGCCGGAGCTOSGAGTCCTGGTGGAGGCTGAAAGCTTCGAGT^
CTACAACGACAATAAGTATTCTATACCTAGTAATATTGTTCGATGCTTGTATGGAGTAGATGCTGGAGTCTGGTGTAATA T^AATGGCTTAGT^CATACTACATT^GACATT^CC^GCCCGAGAGCGCACCGAA
CTAGATTGTGTAAGGAGGGCATTCTCTATAGAGGAATCAGCGTTTGCATATACCTACTACGTCATTGCCCTAATGGACAG TAAGCTAGCCAGCTGCATTATGATAAGAGTAACGTGAG
ACTACAACATTCTCCTGCAGT^CCTATATGATACGTATAACCCATTGATACATCCAAGTATCCAGAGGTGTATGG TCAGATCAAGACCTCTCTCT^CTAAGAAACCTAGAACCAGACGCTGGTAGTATAATAAGCACACTGTGACTCGCTTAGGC CCTTAAGCT^AGGCCGGCT^GCTTACTATTAACCTCTCATAAACGCTACTGCAATGAT^GGAAACTTCTTATAGTAGAAT GAGGCAATAAGACGCATCTCAGGTCACATATAGTCTTATGT^
TCTATTATTTCAGTCTATACGTAATGAAGGCACTTTTCAGGATCTCTTCCCTAAGCTTGTATAAGCAGGTTTGTTGCCGT AACCATTCTGTCTCCTCGCCTAATACCTGTGAAGCACA^
AT^GAAAGCTTAAACCGTCTACAACGGATGCCCTCATCATGACCCGTCTAACTCGAACATCTGCCACATTAGTCTCGGGT AACAGGAGGAGTAACACGACCAGTGTAACACGTTAAGCATACAATTGAACGAGAATGGTGAGGACTGAGATAAAAGAATT СТСТЯААССАТСТААААТТАТАСТССТГО^СААСбта^
TAGAGCAGCGTTCACCAAATGTTAGCAGAGTTCTATCTATGTCGTATCCATTCTGCCTTATATCTCTCAAGGGCGCCGAG
CTCATCCTACGAAGCTCTCAGGCCATTC
GATCTAGGGCAGACTGGGCAT^GCATAGCTATGGTGTAGTAGAACTCCCGTCAACGGCTATTCTCACCTAGACTTTCCCC TTCGAACTGACAAGTTGTTATATTGCCTGTGTACCAAGCGCTAATC
AGTAGAGCCTATTTCCTCGCCGGAAAGTCATCTCTCTTAT^GCATTTCTGCCCTTCCCACTAACTCAGGGTGCAG
CACTACACGCAACATATACACTT^ATTAGCCGTCCAACAAGGCTATTCTACGAAAAATGCTACACTCCACAT^
CGCATTCAACCAGCTTCTT^ATTG ATGTTGCCAACTCTCCGGGCTTTATCCTGTGCTCCCGAATACCACATCGTGATGATGCTTCAGCGCACGGAAGTCACAGA
CACCGCCTGTATAAAAGGGGGACTGTGACCCTGTATGAGGCGCAAC^TGGTCTCACAGCAGCTCACCTGAAGAGGCTTGT
AAGATC^CCCTAGGCTGTGTATTGCACCATGATOSTC
GTCTGCCTCTAGAGGAGCGGCAAGCTTGCTCAAGCGTCTGGGGCCAATGTGGTGGCCAGAATTGGTCGGGTCCGACTTGC
TGTGCT^CCGGAAGCACATGCGTCTACTCCAACGACTATTACTCCCAGTGTCTTCCCGGCGCTGCAAGCTCAAGCTCGTC
CACGCGCGCCGCGTCGACGACTTCTCGAGTATCCCCCACAACATCCCGGTCGAGCTCCGCGACGCCTCCACCTGGTTCTA
CTACTACCAGAGTACCTCCAGTCGGATCGGG^
AATGCATATTACG <:CTCTGAAGTCAGCAGCCTC^
CGCT^GGTTCCCTCTT^TGTCTGGCTAGATACTCTTGACAAGACCCCTCTCATGGAGCAAACCRTGGCCGACATCC^
CCGCC^CAAGAATGGCGGTAACTATGCCGGACAGT^TGTGGTGTATGACTTGCCGGATCGCGATTCCGCTG
TCGAATGGCGAATACTCTATTGCCGATGGTGGCGTCGCCAAATATAAGAACTATATCGACACCATTCGTCAAATTGTCGT
GGAATATTCCGATGTCCG43ACCCTCCTGGT^ATTGAGCCTGACTCTCTTGCCAACCTGGTGACCA
AGTGTGCCAATGCTCAGTCAGCCTACCT^GAGTGCATCAACTACGCCGTCACACAGCTGAACCT^CCAAATGTTGCGATG
TATN'GGACGCTGGCCLATGCAGGATGGCTTGGC
CAAGAATGCATCGTCTCCGAGAGCTCTTCGCGGATTGGCAACC^TGTCGCCAACTACI^A^GTGGAACATTACCAGCC CCCCACCGTACACGCAAGGCAACGCTGTCTACAACGAGAAGCTC^
GGCTGGTCCAACGCCTTCTTCATCACTGATCAAGGTCGATCGGGAAAGCAGCCTACCGGACAGCAACAGTGGGGAGACTG
GTGCAATGTGATCGGCACCGGATTTGGTATTOSCCCATCCGCAAACACTCGGGACTCGTTGCTGGATTCGTTTGTCTGGG
TCAAGCCAGGCGGCGAGTGTGACGGCACCAGCGACAGCAGTGCGCCACGATTTGACTACCACTGTGCGCTCCCAGATGCC
TTGCAACCGGCGCCTCAAGCTGGTGCTTCGTTCC^GCCTACTTTGTGCAGCTTCTCACAAACGCT^CCCATCGTTCCT
GTAAGGCGCXSCCTAAGGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAACAATGATGTGCGATGGTGTGGTTCCCGGTTGGCGGAGTCTT^
GTCTACTCTGGTTGTCTGTCGCAGGTCGGTAGACCGCAAATGAGCJWVCTGATGGATTGTTGCCAGCGATACTATAATTCA
CATGGATGGTCTTTGTCGATCAGTAGCTAGTGAGAGAGAGAGAACATCTATCCACAATGTCGAGTGTCTATTAGACATAC
TCCGAGAATAAAGTCAACTGTGTCTGTGATCTAAAGATCGATTCGGCAGTCGAGTAGCGTATAACAACTCCGAGTACCAG
CAAAAGCACGTCGTGACAGGAGCAGGGCTT^GCCAACT
TGAATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGAC^CGGCA
GCGGTTGATATATATGTATGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGT^CGCCCTCGCTGCTTGTGCAATAAT CGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGACTCCCATCTTTC >AAAGCT
CTCGTTAGCATGGGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGCCATGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAAATTCG
GCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAAC^
TCjyvrGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCT
GCCAACATCCTGACTATAAGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGCCTCGC
AAAAACCATCCCTGATGAATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTAT^'GATTTCCCAAAGAAATCGGGGA
TCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACC
TCGGTGGAAGT^ACGCTAGC^TTCTCTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGC^GTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCT
GATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCIAAGCTC
TGACXJCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATAGTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCC TCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCT AACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCT GACJ^CCATGCTCCGCT^GCCGGTGCCGTCn-CTACGTCJ^GACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAG TCAA.CAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCG ATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATC^TGGCTCGATTCGAGTCCCGGCCGCGTTCAACTT CCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTAT^
ACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTCTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCT^CCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGC СТСС!АСТ6ТССТССТТЛ?СТТССТТТЯТАТАСТАТ^
TTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCC^TGGAAATACGACTCC^GGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTC
GGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACC
CTCCTATCCTGCGCGG03TGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGCCATAC
AAGCACGATT^CGGCCACGATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTXSACGGCAGCGCCGACG
ATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAATATCAAAGACC^
ACACGGATCTCCAGAAGTGGAATTACCAGATGGAGTACCTCGAGAAATC
CTGGACGCCATCATCGCGCCGATTACGCCTACCGCTGCX^TACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCCTCTGT GATCJ^CCTGCTGGAT^CACGAGCGTGGTTGTTCCXMTTACCTT^GCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGAGAGTT TaVAGGCGGTTAGTGAGCTTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTGCAGTG CAGGTTATCGGACGGAGACTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAATGTGGT GACTCCATAGCTAATAAGTGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCIAACTGTAAATA
CATGCCATGCTACGAAAGAGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAAGGAAG AATCCCTTCAGGGT^GCGTTTCCAGTCTAGACACGTATAACGGCACAAGTGTCTCTCACCAAATGGGTTATATCTCAAAT
GTGATCTAAGGATGGAAAGCCC^GAATA
CTGGTCATGTTAACCAGCCTGTGCTCTGACGT^AATGCAGAATAGAAAGCCGCGGTTGCAATGCAAATGATGATG
GCAGAAATGGCTTGCTCGCTGACTGATACCAGTAACAACT
ССТССТСТСССТССТТЛХ^ТТСАССТСТТЛ"ССАТСССТ^^
TATGGACGCGCTT^GCGTGTATTGCXSTGAGCTACCAGCAGCCCAATTGGCGAAGTCTTGAGCCGCATCGCATAGAATAA TTGATTGCGCATTTGATGCGATTTTTCAGCGGCTGTTTCAGGCGACATT^CGCCCXSCCCT
CGACGGCATGTCCTU^TAGCCCGGTGATAGTCTTGTCGAATATGGCTGTCGTCGATAACCCATCGGCAGCAGATGATAATG ATTCCGCAGCACi^GCTCGTATGTGGGTAGCAGAAGAACTGAGCGAGATCTTCraAGGGCGTAACTCTGCATATCCGATTG GCCTGCTGCCACATGTCATTTGCTTCGGTTTCTT^
GAGAGAC^T^GGTGGTAAGAAAAAATOTCACCTCCTCTTAGTGCAGGACTGACTCTCAAAATCTATATGCAAATGTGTCG TGTAACACCCTTCGCATGAGCGCTGACCGTACCCT
GCAATGCTACGAAAGTCTGCAGGTATGCTTAAATAAACGCTTGCCACAGAAGCCGACAGTTTATTGTTACTACTTACTAT ACTGTATTATCGTTGCrCACATAAGGCGGTGAACCAT^
GGCTGCCAAGX3TAGGTCCCAACCCCGTATCCTCGGTCGAG AGTAGCX3TGTTTGAATCAGTTCACAATCTCT
CATGTAAT^CGT^CAAGGCAGGAACATTTTATAAACT^
CTACCTACCTACCTAGCTAAGGTAGGTAGGTAGT^CGTGGGAACCTGGTCGCTAAT^CACGCAACCCACTTTGCGCTCTT CGCCTGGCCGTCGTTGAAGGTAAAGCAGTTGTACCCATCACCTAACTCAACCGACACACCGTTGATCTGCTCAAGGCAGT T^TCGTCACTGTAGAATTCCACAGGTTGTTCCACGnXS^
GTGXSACCTX^TACAGTCGCCTGGCTGAACAGTAGTAGTTTCGACTACGACGCCGCCAGCACACCT^
AT^GAAGAGTACGGGGTTCTGTGCGAAGACAGCCGGGCAGGCGGAAAGGATATAGAAGAGCTGTCCAGTCACGTTAGCTA
GTGAAGTAACGTAATGGAAGGAAAGAGAAAAGGGGAGO^GGGAGGAAACTCGTC^TTTACTCACAACTTTGTGCATCTTG
ACAAAAGACTTCTCATATGGC^CCTATAATTCAACAACATGCAGCGTAGTAAAGAATAGGTGATCTTCT^GATTCAGTT
GCTTGAGGGCAGGGAGAATGAAGTTCCTTGGAACGATT^ATATACCCTTCGCAGa^GAGAGTCGGCTTAAAGAAAGGAG
ACTCAAAGTGTTTACGGGACGAATATCTATCCGATTAGCGTAGTATCGTCTCTACAAGGCGGGGCGTAAATTATGTTCCA
AGGCCGGACAACGTGAACAACAAATGGAAATTCCAGACGTTTGAGGAGAATCAAGCTCACTTGCTCGTGGATACCAGTGG
TTATGAGCGCCACCGCTCAACATTGCCGCC^TCG <3ATAAAAAAAAGCCTCTAGAAGAGGAGACCAGCAGTTGTTTTAGG
CAAAACAATTGTACAGAGATCGGTTGTCGTTTGCGAGATAGGTAGGTATTTACGGAGTAACACTAAATCAAAGATACAAA
GTTTTCTGCGATTATTAAT^CTGCGACGGTTGGCGCCATGTGGTCTTCCAGGGTGAGCAAACGTTACTCTTGCTATTCA
TATTGCAACGACGCCGCTCGGCTGCGACACAACAAAGAGACATAAGGCCCTGGGGAGGAACGATGTGATCGTCAGATCCT
TCGTAGTGAAGATGGCGCTACTTATGACTGC^TCAAGCAC^CTGTACCGAACGCGTTACAAAGGATCCTTTACTGACCTT
CATACCAAGT^TCCAATTTCTOACTTGCTAAGGTCGTGATAATATTCATGGTCTCCTAGAGGATTGT^ACAGATATTAAC
AGCTTGAATAGTGTCGAGCn-ATAACCTGCAAGGTACAGCC^GTTGCCCAGCACCAGGATGTTACCTCGCrTAAG
GCAATAGTTTGCGAGCCTAATGTCGACT^GTATGGCGCAAGCTGAGTACTGCCTTGGXSTGAATCCTCGCTCAATGGTAA
CTTTGCAAGCTCATATCCTTTCCAAAGCTTGTGAT^
TTGCGAAATCATCAAGTGTAT^GTGGAAAGGTCTCAGGATGA
TTCAATAACCTCATAGTCGAGTCACAAATGTTGGAGGTCTGGTTCAAGCCGAGCCAAGCAATAGCTTGGTCGGGCGCGTC
ACAGCATCAGGAATGCTAACGCTTGCACTyrCTCGCGGACTTT^
CA <^CCCTGTGAAG0^7^ACTTGTT^TCTCTC^
CGGAACTCATTGTCTCTTTATCT^CTTACTCGCCCGGGCAAGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGAT CaSAGCTCGGTACCAAGCTTGATGCATAGCTTGAGTATTCTAACGCGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATA GCTGTT^CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGG GTGCCTAATGAGTGAGCTAACrCAGATTAATTGCGT^
CTGCAT^AATGAATCX^CCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTAT^GGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTG
GCTGCGCTCGGTCGTTCGG ATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAG^CCAGCAAAAGCCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTC
CATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTC^^GTCIAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAG
ATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCT
TTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCT^TCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAG
CTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTCCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGT
AAGACACGACTTATCGCCJ^CT^CAGCAGCC^CTGGTAACAGGAT^rAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGT
TCTTCAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGA
GGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACC^
TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCT^
GTTAAGGGATCTTOGTCATGAGATTATC!AAAAAGGATCT
TGTC^GTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTGCCGGCCGGGTCGCGCAGGGCGAACTCCCGCCCCCACGGCTG
CTCGCCGATCTCGGTCATGGCCGGCCCGGAGGCGTCCCGGAAGTTCGTGGACACGACCTCCGACCACTCGGCGTACAGCT
CGTCCAGGCCX3CGCACCCACACCCAGGCCAGGGTGTTGTCCGGCACC1ACCTGGTCCTGGACCGCGCTGATGAA
ACGTCGTCCCGGACCACACCGGCGAAGTCGTCCTCCACGAAGTCCCGGGAGAACCCGAGCCGGTCGGTCCAGAACTCGAC
CGCTCCGGCGACGTCGCGCGCGGTGAGCACCGGAACGGCACTGGTCAACTTGGCCATGGTGGCCCTCCTCACGTGCTATT
ATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTAT^TTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTT
CCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGTATGCGGTGTGAAATACCGCAC^GATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATC
AGGAAAT^GTAAGCGTTAATAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGC
GATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCAT^CGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGT
CCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGX3CCACAGTCGATGAATC
AAGCAGGCATCGCCATG4^TCACGACGAGATCCTCGCCGTCG <3GCATGCTCX3CCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGG
CGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGC GATGTT^CGCT^GGTX^TCGAATGGGCAGGTAGCCGGATC^GCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGAT ACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTT^
TTCAGTX3ACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGCA
GTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCA
TCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAA
TCCATCTTCTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCrGTCTCTTGATCAGAGCTTGATCCCCTGCGCC^TCAGATCCTTG
GCGGCGAGAAAGCCATCCAGTTTACTTTGCAGGGCTTCCCAACCTT^
CTTGCTGTCCATAJLAACCGCCCAGTCTAGCn^ATCGC
GTTCTCCCTTGTCCAGATAGCCCAGTAGCTCACATTCATCCGGGGTCAGCACCGT^TCTGCGGACTGGCTTTCTACGTGA AAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTOSATAATCTCATGC^
TTGATGTCATT^TCGCGGTGGCTGAGATCAGCCACTTCTTCCCCGATAACGGAGACCGGCACACTGGCCATATCGGTGGT CATCATGCGCCAGCTT^CATCCCCGATATGCACCACCGGGTAAAGTTCACGGGAGACTTTATCTGACAGCAGACGTGCAC TGGCCAGGGGGATCACCATCCGTCGCCCCGGCGTGTCi^TAATATCACTCTC TCTCTTTTATAGGTCTAAACCTTAAACTGCCGTACGTAT^
TTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGA
(SEQ ID NO: 13)
ОТЧЕТ О ПАТЕНТНОМ ПОИСКЕ
(статья 15(3) ЕАПК и правило 42
Номер евразийской заявки: 201300048
Дата подачи: 05 июня 2008 (05.06.2008) |Дата испрашиваемого приоритета: 08 июня 2007 (08.06.2007) Название изобретения: Система экспрессии гетерологичных и гомологичных целлюлаз
Заявитель: ДАНИСКО ЮЭС, ИНК. ДЖЕНЕКОР ДИВИЖН
I I Некоторые пункты формулы не подлежат поиску (см. раздел I дополнительного листа) I I Единство изобретения не соблюдено (см. раздел II дополнительного листа)
А. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРЕДМЕТА ИЗОБРЕТЕНИЯ: C12N 9/24 (2006.01)
C12N15/56 (2006.01) C12N15/80 (2006.01) C12N1/15 (2006.01)
Согласно Международной патентной классификации (МПК) или национальной классификации и МПК
Б. ОБЛАСТЬ ПОИСКА:
Минимум просмотренной документации (система классификации и индексы МПК)
C12N 9/24, 9/38, 9/42, 9/56, 18/80, 1/15, С07К 2/00
Другая проверенная документация в той мере, в какой она включена в область поиска:
В. ДОКУМЕНТЫ, СЧИТАЮЩИЕСЯ РЕЛЕВАНТНЫМИ
Категория*
Ссылки на документы с указанием, где это возможно, релевантных частей
Относится к пункту №
Y Y Y
WO 1996/000281 Al (CORNELL RESEARCH FOUNDATION, INC) 04.01.1996, формула
WO 2005/093073 Al (GENENCOR INTERNATIONAL, INC et al.) 06.10.2005, формула
RU 2287571 C2 (ООО НПК "ФЕРМТЕК") 20.11.2006, формула
ГРАЧЕВА И.М. и др., Технология ферментных препаратов М. "Элевар", 2000, с. 264
1-15
1-15 1-15 12-15
* Особые категории ссылочных документов: "А" документ, определяющий общий уровень техники "Е" более ранний документ, но опубликованный на дату
подачи евразийской заявки или после нее "О" документ, относящийся к устному раскрытию, экспонированию и т.д.
"Р" документ, опубликованный до даты подачи евразийской
заявки, но после даты испрашиваемого приоритета "D" документ, приведенный в евразийской заявке
"Т" более поздний документ, опубликованный после даты приоритета и приведенный для понимания изобретения "X" документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмету поиска, порочащий новизну или изобретательский уровень, взятый в отдельности
"Y" документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмету поиска, порочащий изобретательский уровень в сочетании с другими документами той же категории
" &" документ, являющийся патентом-аналогом
"L" документ, приведенный в других целях
Дата действительного завершения патентного поиска:
21 мая 2013 (21.05.2013)
Наименование и адрес Международного поискового органа: Федеральный институт промышленной собственности
РФ, 123995,Москва, Г-59, ГСП-5, Бережковская наб., д. 30-1.Факс: (499) 243-3337, телетайп: 114818 ПОДАЧА
Уполномоченное лицо
Телефон № (499) 240-25-91
О.Шанова
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
Фиг.1
Фиг.1
Фиг.2
Фиг.2
Фиг.ЗВ
Фиг.ЗВ
Фиг.ЗС
Фиг.ЗС
Фиг.ЗО
Фиг.ЗО
Фиг.ЗЕ
Фиг.ЗЕ
Фиг.4
Фиг.4
Фиг.4
Фиг.4
Фиг.бА
Фиг.бА
Фиг.5В
Фиг.5В
Фиг.бС
Фиг.бС
Фиг.50
Фиг.50
Фиг.бЕ
Фиг.бЕ
Фиг.7А
Фиг.7А
Фиг.7В
Фиг.7В
Фиг.8А
Фиг.8А
Фиг.8В
Фиг.8В
Фиг.8С
Фиг.8С
Фиг.8Р
Фиг.8Р
Фиг.8Е
Фиг.8Е
Фиг.9В
Фиг.9В
Фиг. 10A
Фиг. 10A
Фиг. 10A
Фиг. 10A
Фиг.ЮВ
Фиг.ЮВ
Фиг. ЮС
Фиг. ЮС
Фиг.КЮ
Фиг.КЮ
Фиг.ЮЕ
Фиг.ЮЕ
Фиг. 10F
Фиг. 10F
Фиг.КЮ
Фиг.КЮ