(57) Реферат / Формула:
Изобретение раскрывает выполнение нового устройства с электродами для возбуждения электрохемилюминесценции и новые свойства устройства для получения люминесценции в водных растворах электролитов путем электрического возбуждения с помощью катодных или биполярных импульсов. Такие устройства позволяют значительно улучшить конструкцию недорогих и надежных средств диагностики, в особенности, в целях индивидуального обследования состояния здоровья.
Евразийское (21) 201300010 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. G01N21/76 (2006.01)
2013.09.30 G01N 21/66 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2011.06.10
(54) СПОСОБЫ И УСТРОЙСТВА ДЛЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В
ИНТЕГРИРОВАННЫХ ЭЛЕКТРОДНЫХ ЧИПАХ С ПОМОЩЬЮ КАТОДНЫХ И БИПОЛЯРНЫХ ИМПУЛЬСОВ
(31) 20100246
(32) 2010.06.11
(33) FI
(86) PCT/FI2011/000030
(87) WO 2011/154588 2011.12.15
(71) Заявитель:
ЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ
ОБЩЕСТВО "НАУЧНЫЕ ПРИБОРЫ" (RU)
(72) Изобретатель:
Кулмала Сакари, Лааксонен Теппо Тапани, Корпела Тимо Калеви, Ескола Яркко Уолеви (FI)
(74) Представитель:
Коробчук О.В. (RU) (57) Изобретение раскрывает выполнение нового устройства с электродами для возбуждения элек-трохемилюминесценции и новые свойства устройства для получения люминесценции в водных растворах электролитов путем электрического возбуждения с помощью катодных или биполярных импульсов. Такие устройства позволяют значительно улучшить конструкцию недорогих и надежных средств диагностики, в особенности, в целях индивидуального обследования состояния здоровья.
WO 2011/154588
PCT/FI2011/000030
МПК G01N21/76, G01N21/66
СПОСОБЫ И УСТРОЙСТВА ДЛЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В' ИНТЕГРИРОВАННЫХ ЭЛЕКТРОДНЫХ ЧИПАХ С ПОМОЩЬЮ КАТОДНЫХ И
БИПОЛЯРНЫХ ИМПУЛЬСОВ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к способам измерения количества люминесцирующих молекул в водных растворах при крайне малых концентрациях. Областью использования изобретения является измерение биологических молекул в пробах, взятых от людей или животных при обследовании состояния здоровья. Изобретение описывает новые усовершенствованные способы изготовления и использования тестирующих устройств для такого исследования. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время существует настоятельная необходимость в быстрых, чувствительных и количественных технологиях диагностики. Такие технологии широко применимы в хозяйственном использовании, включая здравоохранение, исследования, сельское хозяйство, охрану окружающей среды, ветеринарную медицину и отдельные отрасли промышленного производства. Повышение чувствительности, скорости, надежности, стабильности и снижение стоимости анализов являются факторами, которые после реализации их в диагностических технологиях могут найти применение в совершенно новых областях.
Весьма высокая чувствительность может быть получена при использовании ряда диагностических приборов, но они достаточно дороги. С другой стороны некоторые способы могут быть достаточно дешевыми, например, иммунохроматография, однако они не применимы к исключительно количественным приложениям для запросов рынка.. Любая технология, в которой удовлетворительно решены такие требования, в будущем будет иметь важное место в области диагностики и большой рыночный потенциал.
Существует большое число различных принципов анализа, используемых в практике диагностики, например, радиоактивные методы исследования, иммуносорбентный анализ с ферментной меткой (ELISA ), колориметрический анализ, и исследования, основанные на флуоресценции и хемилюминесценции, включая как анодную электрохемилюминесценцию (ЭХЛ), так и катодную электрохемилюминесценцию (КЭХЛ), индуцированную горячими электронами. Индуцированная горячими электронами ЭХЛ детально описана в патенте US 6251690
(Kulmala S., et al). Каждый из этих методов играет свою роль в отношении совокупности таких характеристик, как чувствительность, надежность, стабильность, скорость и стоимость. Различия между методами отражают зависимость от физических ограничений или преимуществ способов. К примеру, недостаток приложений, основанных на радиоактивных соединениях, состоит в распаде радиоактивной метки со временем и слишком высокой стоимостью радиоактивных отходов с точки зрения и безопасности и влияния на окружающую среду. Приложение наиболее чувствительных исследований в диагностике ограничивается сложной природой тестов и приборов, и только специалисты могут выполнять исследования. Сложность исследования обычно прямо пропорциональна стоимости прибора и/или теста. В контексте сложности приборов можно упомянуть методы анодной электрохемилюминесценции, которая приобретает растущую популярность: прибор представляет собой сложный лабораторный робот, обращение с которым требует знания дела, а процесс измерений включает неоднократные промывания и подготовительные этапы. Это факторы, которые увеличивают стоимость исследования, а также приводят к росту объема отходов и, следовательно, делают этот метод невозможным для нужд малых лабораторий, врачебных кабинетов и т.д. (исследования для лежачих больных или в пунктах оказания помощи).
Коммерчески выгодные способы основаны на принципах идентификации и измерения анализируемого вещества в смесях с так называемыми веществами-маркерами. В измерениях, основанных на уникальных свойствах биологических молекул, например, в иммунохимических исследованиях, искомое вещество - аналит (X) может быть селективно извлечен из смеси молекул на связывающие антитела в твердой фазе, а затем связанные молекулы измеряют с помощью другого маркированного антитела, селективно связывающегося с (X). Веществами-маркерами могут быть радиоактивные изотопы, ферменты, молекулы, поглощающие свет, флуоресцирующие или фосфоресцирующие, хелаты некоторых металлов и т.д., которые ковалентными связами соединяются с антителом. И наоборот, можно маркировать очищенный (X), а объем неизвестного немаркированного образца (X) можно измерить путем реакции сравнения. Исследования ДНК и РНК также могут быть основаны на селективном связывании (биологическое сродство). На основе таких же принципов могут быть проведены многие другие химические и биохимические исследования. Для снижения стоимости и/или увеличения точности измерений в настоящее время имеет место тенденция одновременного измерения в образце нескольких различных параметров. Одной из возможностей является использование маркеров, флуоресцирующих или фосфоресцирующих (светящихся) на различных длинах волн, или имеющих различное
время высвечивания флуоресценции. Различные принципы и методики измерений, которые могут быть использованы в иммунодиагностике, описаны в книге "Руководство по иммунному анализу" (" The Immunoassay Handbook". ed. David Wild, Stockton Press Ltd., New York, 1994, c. 1-618).
Из уровня техники известно, что органические вещества и хелаты металлов успешно используются как вещества-маркеры, они могут возбуждаться под действием света или электрохимически для получения люминесценции соответственно специфике маркера. Эти способы осуществимы и особенно чувствительны. Однако, из-за предельно малых измеряемых концентраций, существуют также трудности, зависящие от случая; использование флуоресценции может быть осложнено, среди прочего, тиндалевским, рэлеевским и рамановским рассеянием. При анализе веществ биологического происхождения после подачи импульса возбуждения возникает, почти без исключения, быстроразрядная флуоресценция с высокого уровня. Фосфоресценция в фазе раствора может быть использована, преимущественно, только при наличии хелатов ионов лантанидов и специально синтезированных органических молекул. Недостатком методов возбуждения с использованием фотолюминесцентных маркеров является сложность приборов и высокая стоимость чувствительных оптических компонент.
В общем случае, преимуществом ЭХЛ является малая стоимость электрических компонент возбуждения и более простая оптика. Так, в сравнении с фотолюминесценцией, можно избежать некоторых недостатков. Традиционная анодная электрохемилюминесценция с электродами из инертных металлов может быть осуществлена с органическими люминофорами в неводных растворах с использованием относительно простого устройства. Однако в исследованиях биологического сродства, на чем сосредоточены наибольшие коммерческие ожидания, применяются водные растворы. Почти всегда биологические образцы помещены в неорганические растворы, поэтому измерительная система должна работать с водными или, по крайней мере, с мицеллярными водными растворами. Лишь очень ограниченное число хелатов металлов переходной группы работает в качестве ЭХЛ-маркеров в воде или мицеллярных растворах при анодной ЭХЛ
Поэтому коммерчески наиболее важным приложением анодной ЭХЛ в аналитической химии является способ использования производных Ru (Ьру)з < > - хелата, если детектирование маркера происходит в мицеллярной фазе. Как известно из литературы, мицеллярные смеси всегда чувствительны к различным возмущающим воздействиям из-за неконтролируемой сложности достижения мицеллярного равновесия. Тогда ЭХЛ, индуцированная горячими электронами, которая не зависит от мицелл, имеет много
значимых преимуществ перед анодной ЭХЛ. Она может быть применена и к способам иммунодиагностики и к способам ДНК-гибридизации (см. Blackburn, G., et al., 1991, Clin.Chem. 37, 1534-1539; Kenten, J., et al. 1992, Clin.Chem. 33, 873-879). В приложениях к иммунологическим исследованиям и ДНК- или РНК- зондам, выполненных Roche Diagnostics Ltd., использованы магнитные частицы, с помощью которых вещества-маркеры помещали на рабочий электрод из золота (Massey, Richard J., et al. US 5746974$ Leland, Jonathan K., et al. US 5705402). Однако по многим причинам повторная обработка магнито-латексных частиц трудна, поэтому данный метод используется только в дорогих лабораторных роботах (например, Elecsys 1010 b 2010), которые имеют сложную и точную систему обработки жидкости. Кроме того, стационарный массивный рабочий электрод из золота нуждается в длительной очистке и подготовке к каждому анализу (Руководство по обслуживанию Elecsys, с.70).
Было обнаружено, что значительного улучшения в работе можно добиться размещением тонкой пористой пленки на рабочем электроде и изготовлением CIPF-устройств (CIPF - аббревиатура от Conductor/InsulatorA'orous Film) (см. патент.Ш 2009178924, Ala-Kleme et.al.). Однако и этот вид CIPFnpn6opoB имеет серьезный недостаток, так как в измерительном устройстве нужны раздельные противоположные электроды и тщательная промывка между анализами, а одна и та же электролитическая ячейка, содержащая противоположный электрод, должна использоваться неоднократно.
В рабочем электроде для КЭХЛ, как считают, горячие электроны туннелируют из самых близких частей электрода, из противоположного электрода, т.е. с краев электрода в случае плоских электродов, находящихся на одной плоскости, т.к. туннелирование , электронов происходит из областей с самой высокой вероятностью туннелирования (cM.Kulmala S., Suomi J. Analitica Chimica Acta 500 (2003), 21-69). Если туннелирование с таких краев и даже регистрируемая люминесценция будут иметь место, то такая локальная люминесценция не будет использована, т.к. рабочий электрод в настоящем изобретении предназначен для диагностических целей, а такая люминесценция не будет зависеть от концентрации вещества-маркера, связанного с поверхностью электрода, или по крайней мере, связь будет ненадежной. Поэтому специалист не стал бы и пытаться строить электроды так, что рабочий и противоположный электроды будут выполнены примерно на одном уровне на плоской поверхности, если используется КЭХЛ. Если же электроны туннелируют с острых концов, то крайне сложно управлять процессом изготовления для получения воспроизводимых характеристик различных электродов, что совершенно необходимо для диагностических чипов.
В настоящем изобретении установлено, что возможно создать полностью плоские интегрированные рабочий и противоположные электроды, которые имеют очень высокие рабочие характеристики в исследованиях биологических свойств. Это явилось результатом использованных в электродах материалов и соответствующей толщины слоя раствора электролита над электродами, а также геометрической формы самих электродов. Это привело также к совершенно новому свойству электродов, которое послужило дальнейшему улучшению в работе электродов по сравнению с современным уровнем. Было установлено, что описанная конструкция с электродами из некоторых материалов позволяет использовать биполярные импульсы для возбуждения люминесценции, т.е. катод и анод могут меняться своим положением, занимая его поочередно или после некоторой последовательности импульсов. Это позволяет использовать поверхность обоих электродов в целях диагностики. Например, импульсы света с одного электрода можно сравнивать с таковыми с другого электрода, а такая система служит как внутренний стандарт или для одновременного измерения двух аналитов.
В соответствии с настоящим изобретением достигнуто заметное количественное и качественное улучшение электродов, используемых для ЭХЛ, что иллюстрируют пункты патентных притязаний 1-10. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Схематическая диаграмма электродного чипа (Э-чип), в составе: изолирующее основание (1), на котором выполнен рабочий электрод (2), покрытый тонкой изолирующей пленкой, например, путем вакуумного испарения или напыления и/или нанесением слоя атомов, и противоположный электрод (3), выполненный также путем вакуумного испарения или напыления, и пленка изолирующего полимера (толщиной порядка 100 нм и более) или адгезивная лента, которая защищает части противоположного электрода за исключением области, предназначенной стать частью электролитической ячейки, вступающей в контакт с Э-чипом, когда он погружен в раствор электролита до уровня (5), требуемого при измерениях КЭХЛ.
Фиг.2. Схематическая диаграмма большого Э-чипа в составе: силиконовая или алюминиевая полоса (1), которую вначале полностью покрыли оксидной пленкой толщиной 4 нм, а затем покрыли толстой пленкой полимера путем печати (толщина порядка 100 нм и более) или адгезивной лентой (2) все области, за исключением областей рабочего электрода (3), тем самым оставив открытыми области рабочего электрода с 4-нм-оксидным покрытием (отмечено серым цветом). На толстой изолирующей пленке (2) размещен противоположный электрод (4), который выполнен либо путем печати проводящей краской, такой как углеродная паста, или серебристая краска или проводящий
полимер, либо путем вакуумного испарения или напыления металла. Окончательный уровень раствора электролита отмечен позицией (5). Электронный контакт к рабочему электроду расположен позади образца, а к противоположному электроду - через контактную накладку (6).
Фиг.З. Калибровочные кривые для хелата тербия ТЬ(Ш). Хелат ТЬ(Ш) (ТЬ-2,6-6HC[N,N-) бис(карбоксиметил)аминометил]-4-бензоилфенол) был использован в качестве модели хелатов ТЬ(Ш) (см.пример 1). (а) Кривые, полученные при использовании Э-чипа, представленного на фиг.1, в котором области рабочего электрода и противоположного электрода вначале выполнены вакуумным испарением алюминия через маску. Затем электроды окислены в воздухе и поверх областей противоположного электрода нанесена серебристая паста путем окраски через маску или трафаретной печатью. Результаты изображены сплошными кружками, (б) Кривая, полученная с использованием Э-чипа, как в (а), и дополнительно слой углеродной пасты нанесен или напечатан поверх слоя серебристой краски, результаты изображены пустыми кружками, (в) Кривая, полученная с использованием Э-чипа как на фиг.2, в котором большой силиконовый чип сначала покрыли пленкой термически полученного оксида толщиной 4 нм, затем приклеили на электрод адгезивную ленту с тремя отверстиями для области рабочего электрода и выполнили противоположный электрод вначале нанесением серебристой краски через маску, а затем дополнительно слоя углеродной пасты, результаты изображены сплошными треугольниками, (г) Кривая, полученная с использованием Э-чипа как на фиг.1, в котором области рабочего и противоположного электродов вначале изготовили вакуумным испарением алюминия через маску, затем электроды оксидировали в атмосфере кислорода при комнатной температуре и нанесли сверхтонкий слой полимера поверх областей электродов путем струйной печати или, как в данном случае, погружая в растворенный органический полимер, такой как растворенный в толуоле полистирол; результаты изображены прямоугольниками.
Фиг. 4. Калибровочная кривая для иммуноферментного анализа гетерогенного тиреотропного гормона hTSH со стандартными образцами (а) (квадраты) и образцами цельной крови (б) (кружки). hTSH-стандарты приготовлены на образце гепаринизированной цельной крови. Измерения проведены с использованием мембраны стандартного прибора Labmaster CIPF (Labmaster Ltd., Turku,, Финляндия), содержащей все требуемые для иммуноферментного анализа реагенты в сухом виде поверх областей рабочего электрода и противоположного электрода в Э-чипе как на фиг. 1 (см. пример 2).
Фиг. 5 . Исследование вирусной РНК. Измерения проведены с использованием мембраны стандартного прибора Labmaster CIPF (Labmaster Ltd., Turku,, Финляндия),
содержащей все требуемые для гибридизации реагенты в сухом виде поверх областей рабочего электрода и противоположного электрода в Э-чипе как на фиг.2 (см. пример 3).
Фиг. 6. Калибровочная кривая для иммуноферментного анализа гетерогенного тиреотропного гормона hTSH со стандартными образцами . Электроды Э-чипа выполнены из алюминия и покрыты тонкой пленкой полистирола. Для возбуждения применены биполярные импульсы (см. пример 4).
Фиг. 7. Картридж одноразового Э-чипа, составленный из ПДМС-крышки и Э-чипа. (1) Опорное основание Э-чипа (например, стекло, пластик или силикон (2) Рабочий электрод (например, оксидированный алюминий с каким-либо дополнительным слоем (по выбору) или под этой областью размещают оксидированный силикон с соблюдением толщины изолирующего слоя. (3) Противоположный электрод (в случае алюминия или силикона предпочтительно покрытие углеродной пастой), (4) ПДМС-крышка, (5) Камера для инкубирования и измерения в ПДМС-крышке, (6) Камера для добавления реагента и образца (открывается вверх), (7) Микроканалы, питающие камеру для инкубирования и измерения, (8) Микроканалы выпуска воздуха.
Фиг. 8. Иммуноферментный анализ гомогенного hTSH с растворами стандартного образца (см. пример 5). (а) Рабочий электрод из алюминия, покрытого оксидом, кружки, (б) Рабочий электрод из силикона, покрытого оксидом, квадраты). ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Определения
Рабочий электрод - (здесь) электрод, возбуждающий люминесценцию при туннельном распространении электронов через изолирующую пленку на проводящем материале (обычно катод),
Противоположный электрод - другой электрод в КЭХЛ ячейке. Для КЭХЛ как правило, изготавливается из проводящего материала, обычно из металла. В настоящем изобретении материал с более высоким удельным сопротивлением, как углеродная паста, может также покрывать металлическую основу. Изобретение привносит новые свойства в систему КЭХЛ.
Э-чип - здесь, ЭХЛ-электрод, в котором анод и катод расположены оба на одном материале основания, связанном с анодом и катодом в одно целое.
Планарный Э-чип - анод и катод размещены практически на одном уровне близко друг от друга.
Катодный импульс - электрический импульс, сообщающий рабочему электроду электролитической ячейки отрицательную полярность.
Анодный импульс - электрический импульс, сообщающий рабочему электроду электролитической ячейки положительную полярность.
Последовательность биполярных импульсов (биполярная пульсация) - возможна только в КЭХЛ с использованием выбранных электродов по настоящему изобретению. Биполярная пульсация означает, что полярность рабочего электрода и противоположного электрода меняется либо после каждого импульса, либо после серии импульсов.
CIPF - рабочий электрод, покрытый тонкой пористой пленкой, используемой для ускорения биологической реакции на электроде.
В соответствии с настоящим изобретением различные анализы могут быть выполнены с использованием простых и дешевых устройств также хорошо, как и с более сложными устройствами, когда бы ни проводился реальный иммунохимический анализ или гибридизация ДНК с пористыми пленками на поверхности Э-чипа (устройство CIPF-Э-чип). Таким образом, достигнуто значительное усовершенствование более ранних CIPF-устройств, измерительное устройство и измерительный картридж достаточно дешевы для отдельных анализов и могут быть изготовлены полностью одноразовыми. Поэтому не может произойти никакого пересечения анализов и изготовление картриджей CIPF-Э-чипов станет более легким, если в картридж не нужно вводить отдельно рабочие электроды и противоположные электроды. Хотя лучшие характеристики получены с пористой пленкой на электродах, настоящее изобретение не ограничивается использованием пленки. Без пленки может только увеличиться время, необходимое для биологической реакции.
Обычные материалы рабочего электрода для КЭХЛ, силикон и алюминий, образуют оксидную пленку на анодах, и поэтому не могут быть использованы как аноды в КЭХЛ-ячейках. Для этого есть две причины. Во-первых, анодное окисление очень быстро прекращает ток в ячейке после нескольких импульсов возбуждения. Во-вторых, анодное окисление вызывает сильную электролюминесценцию, также известную ранее из литературы как гальванолюминесценция (S.Ikonopisov, Electrochimica Acta, 20 (1975) 783-793).
Было установлено, что можно избежать указанной проблемы, если анод, изготовленный из алюминия или силикона, покрыть углеродной пастой. Таким образом, упрощение изготовления дешевых Э-чипов состоит в изготовлении электродов путем вакуумного испарения алюминия или силикона на изолирующую подложку, такую как стекло или полосы пластика, после чего анодную часть системы электродов выполняют печатью или рисунком под окончательное покрытие краской на основе углеродной пасты.
Во-вторых, менее предпочтительным способом стало изготовление верхнего слоя из серебристой краски. Серебро испаряется на аноде, но обычно можно поддерживать анодный ток в течение требуемого времени для измерений, если пленка серебра имеет достаточную толщину.
Третий установленный в эксперименте осуществимый путь решения проблемы состоит в покрытии частей и анода и катода в Э-чипе органическим полимером, который дает сплошную пленку. Это очень важное изобретение, потому что такой тип электродов возбуждает ЭХЛ в хелатах лантанидов, а возможно, и в других люминофорах. Тем не менее, о точном механизме люминесценции можно только рассуждать, потому что на аноде вообще невозможно туннелирование горячих электронов.
При осуществлении настоящего изобретения, во-первых, изготавливают электрод обычными методами, принятыми для КЭХЛ, или из силикона, или из алюминия (либо из пачки пленок), толстую (более 100 нм) изолирующую пленку изготавливают путем печати или нанесением изолирующей краски поверх выбранных областей анода. Затем, поверх изолирующей пленки выполняют аноды печатным способом с использованием проводящей краски или нанесением углеродной пасты, серебристой или другой металлической краски или проводящего полимера.
Настоящее изобретение раскрывает различные варианты CIPF-Э-чипа. Чипы можно использовать вместе с пористой пленкой CIPF или без нее, как простую разновидность полосок или палочек. Однако эти примеры иллюстрируют только основные принципы настоящего изобретения. Примеры демонстрируют то, что простую конструкцию можно включить в более сложные устройства в качестве рабочего люминесцентного блока. Такие картриджи можно производить разными путями, они могут включать емкости, каналы и полости. Многие известные конструкции картриджей могут прямо подходить для электродов с КЭХЛ по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение вносит значительные улучшения в уровень техники, т.к. устройства и способы предназначены в основном для применения в необходимых случаях за счет доступности изготовления удобных, дешевых полосок и картриджей для быстрых количественных тестов. Э-чипы, описанные в настоящем изобретении, были изначально спроектированы для использования с люминесцентным ридером Labmaster Piiall (www.Labmaster.fi) с извлекаемым электродом (обычные полоски Piiall используют противоположный электрод, расположенный внутри устройства Piiall). Миниатюрные варианты представленных Э-чипов могут быть легко объединены в картриджи, сделанные из пластика, ПДМС и др., которые позволяют использовать мембраны CIPF-устройств ,
когда необходимо, но также легко можно представить картриджи других типов на основе конструкции и материалов, рекомендуемых в настоящем изобретении.
Частью данного изобретения является возможность использования биполярных пульсаций в некоторых сочетаниях конструкций и материалов представленных Э-чипов. Усовершенствование заключается в том, что объединенные области электродов (анода и катода) выполняют функции рабочего электрода на некоторых стадиях биполярных пульсаций и, таким образом, исследования биологических свойств можно проводить на поверхности всех частей сети электродов в области действующей ячейки Э-чипа. Здесь биполярная пульсация рассмотрена на примерах достаточно простых вариантов, включающих лишь несколько сочетаний конструкций электродов и материалов, но следует понимать, что те же принципы могут быть расширены логически на другие материалы и конструкции.
Далее изобретение будет иллюстрировано диаграммами и связанными с ними примерами и чертежами (без ограничения).
ПРИМЕР 1 .Изготовление различных типов Э-чипов и измерение калибровочных графиков ТЬ(Ш) - маркеров.
Э-чипы, по типу изображенных на фиг. 1, были изготовлены путем нарезания вначале полосок из полистирола размером 12,0 х 75,0 мм. Затем на втором этапе испарением нанесли слой хрома через маску на области электрода, а затем слой другого металла, алюминия, чистого на 99,99%. Алюминий оставили для окисления на 24 часа при комнатной температуре, а затем области противоположного электрода покрасили маленькой кисточкой через маску, имитируя трафаретную печать серебристой краской (Bison Electro G-22, Bison Ltd.,Нидерланды). Для очень хорошей работы соблюдали соотношение поверхностей областей электродов (рабочий/ противоположный) как 5:1, чтобы невооруженным глазом в темном помещении наблюдать очень четкую световую эмиссию от всех областей рабочего электрода при катодном возбуждении 0,0001М раствора хелата ТЬ(Ш) в 0,05 М буфере тетраборат натрия, содержащего 0,001 М пероксидисульфат. Эти типы Э-чипов были использованы для получения результатов (фиг.1 (а),данные отмечены сплошными кружками. Проблемой этого типа противоположных электродов является их медленное разрушение как анодов во время измерений.
Однако эта проблема может быть разрешена путем добавления слоя краски из углеродной пасты (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA) поверх слоя серебристой краски. Результаты на фиг.З (б), данные отмечены пустыми кружками, и на фиг.4 (а) и (б) были получены с Э-чипами этих типов. Третье решение по
предотвращению разрушения алюминиевых анодов во время измерений заключалось в погружении на очень короткое время (за исключением самых верхних областей Э-чипа) в толуол, содержащий 0,1 мг/мл полистирола с последующим испарением толуола. Если проводить слишком медленно, на части областей электрода происходило отслоение, поэтому позднее использовали стеклянное основание вместо полистирола. Результаты для Э-чипов таких типов представлены на фиг.З (в), данные изображены квадратами.
Большой Э-чип типа представленного на фиг.2 был изготовлен следующим образом. Оксидированные пластины кремния Si ( удельное сопротивление 0,01 - 0,023 Ом.см, р++1 допирован бором, ориентация (100), толщина 525 +/- 25 мкм, производство Okmetic Oyj) промыли RCA, обычно используемым в промышленности, и поместили в печь при 700° , в атмосферу из 95% азота и 5% кислорода. Температуру подняли до 850° С, увеличили парциальное давление кислорода: 90% азота и 10% кислорода, и инкубировали в течение 35 минут. Температуру понизили снова до 700° С в чистом азоте и вынули пластины из печи. Предназначенные для нарезки пластины закрепили на основании и разрезали программно-управляемой алмазной дисковой пилой на полоски Si нужного размера. После этого на верхней части Э-чипа закрепили пластиковую адгезивную ленту, оставив открытыми области трех рабочих электродов (фиг.2). Затем области противоположного электрода закрасили через маску серебристой краской Bison (Bison Electro G-22, Bison Inc.Netherlands). Далее серебристую краску покрыли через маску углеродной пастой (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA) после полного высыхания первого слоя серебра. Полученные с этими электродами результаты представлены на фиг. 3 (в), данные изображены треугольниками. Результаты на фиг. 5 получены также с Э-чипами этих типов.
ПРИМЕР 2. Иммунохимический анализ гетерогенного TSH со стандартными образцами и образцами цельной крови.
Э-чипы, использованные для иммунохимического анализа гетерогенного TSH подобны изображенным на фиг. 1.
Рабочие электроды покрыли адгезивной лентой для формирования лунки вокруг электродной области. Покрывающий раствор (300 мкл), составленный из 0,1 М MES, 0,03 М Н3ВО3, 0,5 мМ К-цитрата, 0,025% глутаральдегида, 0,05% бычьего гамма-глобулина и 10 мкг/мл антитела (MIT 0406 МОАВ anti hTSH Medix Biotech Inc. USA). После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре покрывающий раствор аспирировали и лунки были дважды промыты промывочным раствором (50.мМ Трис-НС1, рН 7,8, содержащим 0,9%. NaCl, 0,09% NaN3 и 0,05% Tween 20. Затем лунки насыщали добавлением 300 мкл насыщающего раствора (50мМ Trizma base, 0,1 % BSA, 0,1% №N3,
0,1% Tween20, pH 7,5 скорректировано H2SO4). После насыщения адгезивную ленту удалили со всей области электрода и оставили сохнуть при 30° С в течение 2,5 часов.
Маркированное антитело ( моноклональный анти-hTSH, клон 5404, 5,5 мг/мд, Medix Biohemica Оу Ab) было приготовлено путем реакции производных изотиоцианата хелата тербия Tb(III) (Tb-2,6-6Hc[N,N-6nc (карбоксиметил)аминометил1]-4-бензоилфенол хелат) в 80-кратном молярном избытке при рН 9,5 в течение ночи при комнатной температуре. Колонку диаметром 1 см наполнили на 5.5.см Сефадексом G-50, а следующие 52 см -Сефарозой 6В для отделения конъюгата белковой фракции от избытка реагента.
Иммунохимический анализ основан на использовании пористой пленки. Пористую
5 8 2
пленку (толщиной 6-11 нм, 1x10 - 6x10 пор/см , Whatman) прикрепили к ленточной рамке с отверстием для покрытия области электрода тестовой полоской. Маркированное антитело (0,5 мкл, 80 мкг/мл) в 50 мМ Трис-HCl буфера, содержащего 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5% BSA, 0,05% бычьего гамма-глобулина и 0,01% Tween 20, пипетировали на мембрану и высушивали при комнатной температуре в течение ночи.
Стандартные образцы (TSH в концентрациях 0,1, 1,0, 10,0 и 100 мШ/л) приготовили в тестовых пробирках путем разбавления стандартного раствора TSH (Wallac, DELFIA, hTSH kit, 324 мШ/мл TSH) раствором разбавителя (50 мМ Trizma base, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5% BSA, 1 мМ СаС12 * H20, pH 7,7 скорректирован HC1).
Для иммунохимического анализа мембрану с рамкой прикрепили к полоске удлиненной частью рамки (которая также покрыта слоем клея). Образец в объеме 3,5 мкл (стандартные образцы или образцы гепаринизированной цельной крови) пипетировали на пористую мембрану тестовой полоски. Образец растворяет маркированное антитело и быстро заполняет всю область электрода, образуя очень тонкий слой жидкости между мембраной и областью электрода. Через 5 мин иммунная реакция была проведена и мембранную рамку извлекли вручную. Тестовую полоску перенесли в промывочно/измерительную ячейку электрохемилюминометра. Ячейку 4 раза заполняли и 3 раза аспирировали комбинированным промывочно/измерительным раствором (50 мМ Na2B407, 0,1% NaN3, 0,003% Tween 20, pH 7,9 с H2SO4). После последнего заполнения измерили ЭХЛ (частота импульсов 10 Гц, заряд в импульсе 20 мкКл, длительность импульса 250 мкс, 60 импульсов, напряжение 25 В) на люминесцентном приборе, описанном в патенте US 6251690.
После измерения ячейку аспирировали и удалили Si-полоску. Кривые отклика от стандартных образцов и образцов гепаринизированой цельной крови при одинаковых концентрациях приведены на фиг. 4(a), данные отмечены кружками, и на фиг.4 (б), данные отмечены квадратами, соответственно.
ПРИМЕР 3. Исследование зонда вирусной РНК.
120-нт PCR-фрагмент был амплифицирован с использованием вирусной РНК в качестве мишени (Lonnrot et al, J.Med/Vir/ 56 (1999), 378-84).
CNS-патогены - патогены Центральной Нервной Системы. В централизованных диагностических лабораториях эта область является диагностической мишенью в рутинных анализах энтеро- и риновирусов, которые являются опасными патогенами для респираторной и центральной нервной системы.
Захватывающий зонд (С-зонд, TTA-GCC-GCA-TTC-AGG-GGG-CGA-AAA-AA-C6-NH2, MedProbe As), комплементарный к последовательности 5'- конца пикорна-РНК, был иммобилизован на силиконовом электроде с оксидным покрытием ( Э-чип, фиг.2, пример 3). В С-зонде за поли-А-хвостом следовал специфический праймер, к которому мог прикрепиться остаток денатурированной PCR. Захватывающий зонд был присоединен к силанизированной силиконовой поверхности (APTES) шестью углерод-алифатические углеводороды-углеродными группами и концевой аминогруппой через реагент диссукцинимидил суберат в соответствии с инструкциями производителя.
Зонд-детектор (NH2-X)4-GA-AAC-ACG-GAC-ACC-CAA-AGT-A) был маркирован производными изотиоцианата хелата тербия Tb(III) (Tb-2,6-6nc[N,N-6nc (карбоксиметил)аминометил1]-4-бензоилфенол хелат) путем инкубирования зонда с 80-кратным молярном избытком хелата в 0,5М буфере карбонат натрия (рН 9,5). После инкубирования в течение ночи маркированная проба была очищена на колонке Сефадекса G50 (NAP-5 column, GE Healthcare). Исследования гибридизации человеческого энтеро-и риновирусов проводили следующим образом. После RT-PCR- амплификации образец ДНК (образец PCR в разведении 1:50, 1:100 и 1:1000, 20 мкл) был денатурирован добавлением 180 мкл 50 мМ/л NaOH (5 мин при 37° С) и нейтрализован добавлением 200 мкл нейтрализующего буфера (6xSCC, 0,3% Tween20, 20мМ/л лимонной кислоты). Затем 10 мкл этого нейтрализованного образца и 10 мкл зонда, маркированного хелатом ТЬ (0,6 нг/мкл, 50 мМ/л Трис-HCl буфера, рН 7,8, 600 мМ/л NaCl, 1% Triton X 100 и 1% блокирующего реагента (Roche) внесли в новую пробирку и после перемешивания 3,5 мкл раствора нанесли на тестовую полоску. Тестовая полоска содержала мембрану с рамкой, как в примере 2. Через 5 минут при температуре окружающей среды реакция остановилась и после удаления мембраны с верхней части силиконового чипа, тестовую полоску промыли 3 раза и измерили (с временным разрешением) ЭХЛ, с использованием ридера РИА. Кривая разведения образца представлена на фиг. 5. Концентрация амплифицированного образца PCR оценена в 40 нг/мкл.
ПРИМЕР 4. Иммунохимический анализ гетерогенного TSH со стандартными образцами и электродами из алюминия с оксидным покрытием и с такими же электродами, дополнительно покрытыми тонкой пленкой полистирола.
На первом этапе Э-чипы с электродами, полученными испарением алюминия на кусочек стекла (12,0 х 75,0 мм), были изготовлены аналогично описанным в примере 1 для случая с полистироловыми полосками. Затем электроды непродолжительное время выдерживали в ультразвуковой ванне в растворе бензола(0,1 мг/мл) и медленно вынимали из раствора полистирола. При испарении бензола поверх электродов образовалась тонкая пленка полистирола. Полистироловое покрытие было удалено в группе Э-чипов, используемых в биполярных измерениях.
Вначале использовали Э-чипы, выполненные без финишной полистироловой пленки, для иммунохимического анализа гетерогенного hTSH по аналогии с примером 2. Измерение провели таким образом, что полярность электродов изменялась в соответствии с переключением по схеме (подача двух полярностей на электроды, подача электрических импульсов, выход для переключения полюсов на электродах, вход в среднее положение) через каждые 10 импульсов возбуждения, всего проведено 60 циклов возбуждения. Зарегистрированная интенсивность КЭХЛ с разрешением во времени была очень низкой, но в любом случае сигнал слабо соответствовал концентрации hTSH (фиг.4 (а), результаты обозначены квадратами.
После использования Э-чипов, покрытых тонкой полистироловой пленкой, получили намного лучшие результаты (фиг. 4(6), кружки), и фоновое излучение и излучение маркеров возросли. Полагаем, что более хорошие результаты можно получить, если покрыть электроды органическим материалом, возможно даже более подходящим полимером и оптимизированной толщиной пленки.
ПРИМЕР 5. Иммунохимический анализ гетерогенного TSH с растворами стандартного образца в картридже ПДМС-Э- чипа .
ПДМС-чип с пневмоникой был изготовлен из силиконового эластомера Sylgard 184, при смешении базового и загущающего агентов в соотношении 10:1, в форме для отливки в чашке Петри. Затем влажный ПДМС был дегазирован в вакууме и выдерживался при 50° С в течение 2 часов. После выдержки ПДМС извлекли из формы, разрезали на отдельные чипы и присоединили к КЭХЛ-Э-чипам. Их соединение было улучшено за счет обработки ПДМС-чипа с пневмоникой и КЭХ.Л-Э-чипа кислородной плазмой в реакторе Techniks Plasma ТеР1а-400 в течение 30 с при скорости потока кислорода 800 м/с и мощности 800 Вт. Плазменная обработка придала поверхности ПДМС гидрофильность, обеспечив заполнение камеры образца капиллярными силами.
В ПДМС-крышке имеются слева маленькие камеры ввода (см. фиг.7), в которых находятся все необходимые реагенты в сухом состоянии перед анализом. Впускные каналы на одном конце камеры входа в чипе используются для заполнения камеры инкубирования и измерения за счет капиллярных сил и гидростатического давления, а множество выпускных каналов позволяют воздуху выходить во время заполнения комбинированной камеры для инкубирования и измерения. Маленькие опоры поддерживают ПДМС-купол камеры. В настоящем изобретении опоры равномерно распределены по камере пневмоники. Высота полости для инкубирования и измерения составила 0,35 мм. ПДМС-крышка покрывает только область электрода КЭХЛ-чипа, оставляя открытыми накладки электрических контактов. Общая толщина ПДМС-крышки составила 5,0 мм.
Вначале стеклянный чип размером 19,0 мм х 10,0 мм подвергли непродолжительному плазменному травлению, а затем путем вакуумного испарения алюминия через маску образовали на чипе слой алюминия толщиной 0,5 мм, изготовив таким образом обе электродные области (2 и 3 на фиг.7). Одна область, выбранная в качестве катода (2) была оксидирована в атмосфере кислорода при комнатной температуре, а на другую, выбранную в качестве анода (3) нанесли через маску углеродную паст у (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA,USA).
Исследования гормона TSH человека в данном примере было использовано как модельное биологическое исследование. Моноклональные первичные антитела к TSH (захватывающие антитела) специфичные к а-цепи hTSH (МОАВ, lot М-21310, номер по каталогу MIT0406, концентрация 6,87 мг/м л) был проибретен в Medix Inc, США, а вторичный моноклональный анти-hTSH, специфичный к Р-цепи hTSH (клон 5404, lot SPC099, концентрация 5,5 мг/мл) от, Medix Biohemica Оу Ab, Финляндия.
Калибровочные стандарты hTSH получены от Orion Diagnostica, Финляндия. 4-морфолинэтансульфониковая кислота (MES) и борная кислота получены от BDH Chemicals Ltd, Poole, England и Merck, соответственно. Цитрат калия, глутаральдегид (GA), бычий гамма-глобулин, Трис и бычий сывороточный альбумин (BSA) производства Sigma. ЫагВЮу * 10 Н20 и NaN3 (для анализов) также производства Merck.
После выдерживания углеродной пасты области, предназначенные для иммунного анализа, были покрыты первичным антителом следующим образом.
Окончательно подготовленную область электрода чипов покрыли первичным антителом посредством физической адсорбции, инкубируя электрод в буфере, содержащем 0,1 М MES, 0,3 М борной кислоты, 0,025% бычьего гамма-глобулина (рН 6,5) и первичного антитела (МОАВ, lot М-21310, Medix Inc., USA) 30 мкг/мл в течение 3,0
часов в микролунке, образованной адгезивной лентой с круглым отверстием в центре, немного большим, чем область электролитической ячейки. После покрытия поверхность промыли раствором буфера и выдерживали для установления равновесия в течение одного часа в 0,05 М Tpnc-H2S04 буфере, рН 7,75, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Tween 20 и 0,1% NaN3.
Затем ПДМС-крышку (размером 25 мм х 14 мм, толщиной 5 мм; поз.4 на фиг.7) установили в нужное положение относительно Э-чипа и высушили 100 нг/мл вторичного антитела в полости для первого образца в ПДМС-Э-чипе (6 на фиг.7).
Иммунные исследования проводили в 0,2 М борат - буфере, доведенном до рН 7,8 серной кислотой. Сначала смешали 25 мкл стандартного буфера и 175 мкл измерительного буфера (0,2 М/л борат-НгЗСч, рН 7,8, 0,1% NaN3, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% Tween 20 и 0,01 М NaN3) и добавили в полость образца (6, фиг.7).
Добавленный раствор вначале растворил сухие маркеры из первой камеры, а гидростатическое давление и капиллярные силы обеспечивали заполнение области электролитической ячейки (5, фиг.7) через впускные микроканалы (7 на фиг.7), в то время, как воздух удалялся через маленькие выпускные каналы (8 на фиг. 7). После 15 минут инкубирования измерили интенсивность КЭХЛ; результаты представлены на фиг.8 (а), данные отмечены кружками. Измерительная аппаратура составлена счетчиком фотонов SR400 (Stanford Reaserch Instruments, пересчетной схемой Nucleus MSC и самодельными кулоностатическим импульсным генератором и корпусом ячейки (черный пластик), а также модулем счетчика фотонов СРМ Perkin Elmer. Амплитуда импульсов - 25 В, заряд в импульсе 15 мкКл/имп, частота импульсов 20 Гц, интенсивность КЭХЛ с разрешением во времени интегрировалась по 200 циклам возбуждения, время задержки 0,05 мс, окно наблюдения 6,0 мс.
Аналогичные измерения проведены с использованием Э-чипов, изготовленных на силиконовых чипах (10 х 19 мм), в которых поверхность полностью была сначала оксидирована термически по нашей обычной процедуре, описанной выше для получения пленки оксида толщиной 4 нм. Затем адгезивную ленту ввели в чипы, оставив открытыми области электродов. Затем через маску выполнили аноды путем нанесения углеродной пасты, использованной в других примерах. Иначе говоря, иммунные исследования были проведены в этом примере подобно описанным выше, а результаты представлены на фиг.8, данные отмечены квадратами.
Формула изобретения
1 .Устройство для исследований с использованием электрохемилюминесценции, в котором и анод и катод связаны с устройством возбуждения электролюминесценции горячими электронами (электрохемилюминесцеции) и физически связаны друг с другом посредством основания для электродов, которое выполнено из изолирующего материала или из проводящего и изолирующего материала, один электрод выполнен электропроводящими, а другой электрод покрыт сплошной пленкой изолирующего материала, или оба электрода покрыты упомянутой пленкой, при этом устройство выполнено с обеспечением измерения излучения люминесценции во время или по окончании приложения на электроды катодных или биполярных импульсов от устройства возбуждения электролюминесценции..
2. Устройство по п.1, в котором материал рабочего электрода является проводником или высоко примесным полупроводником, имеющими электроизолирующее покрытие, противоположный электрод выполнен из того же материала, что и рабочий электрод, и покрыт проводящей пленкой, рабочий электрод и противоположный электрод снабжены контактами в виде полосок к другому концу электродного чипа, посредством которых электроды связаны с электронными устройствами в составе устройства возбуждения электролюминесценции при этом рабочий электрод является катодом устройства, противоположный электрод является анодом устройства, а устройство выполнено с обеспечением измерения излучения люминесценции от образца во время или по окончании приложения на электроды импульсов возбуждения электролюминесценции, поток которой пропорционален количеству содержащегося в образце искомого аналита..
3. Устройство по п.1, в котором электроды выполнены из силикона или алюминия, поверхность электродов включает сверхтонкий слой оксида толщиной 0,5 - 50 нм, при этом в выбранных областях поверхности чипа его анодные области выполнены путем нанесения толстой изолирующей пленки толщиной 100 нм и более с последующим покрытием проводящей пленкой, полученной путем печати, струйного нанесения или окраски с использованием проводящих красок, таких как углеродная паста, серебристая краска или серебристый клей, или пленкой проводящего полимера, или путем вакуумного испарения или напыления дополнительной металлической пленки на анодные области устройства.
4. Устройство по любому из пп.1-3, в котором оба электрода выполнены из силикона или алюминия, поверхности электродов включают ультратонкий слой оксида толщиной 0,5-20
нм, покрытый дополнительно сверхтонкой изолирующей пленкой из органического материала толщиной 0,5-20 нм.
5. Устройство по любому из пп.1-4, в котором электроды выполнены из силикона или
алюминия, поверхности электродов включают слой оксида, а анодные области чипа
покрыты проводящей пленкой, выполненной путем печати, струйного нанесения или
окраски с использованием проводящей краски, такой как углеродная паста, серебристая
краска или серебристый клей, или пленкой проводящего полимера, или путем
вакуумного испарения или напыления дополнительно металлической пленки на анодные
области устройства.
6. Устройство по любому из пп.1-5, в котором электродный чип, содержащий катод и анод, заключен в пластиковый картридж, с обеспечением заполнения полостей картриджа за счет капиллярных сил, давления или всасывания, а также растворения всех необходимых реагентов при заполнении полостей чипа образцом или раствором образца по мере их продвижения от полости ввода в устройство, причем поток излучения люминесценции от образца во время или по окончании приложения импульсов возбуждения пропорционален количеству содержащегося в образце искомого аналита..
7. Устройство по любому из пп.1-6, в котором электродный чип, содержащий катод и анод, заключен в пластиковый картридж, с обеспечением заполнения полостей картриджа за счет капиллярных сил, давления или всасывания, а также растворения всех необходимых реагентов при заполнении полостей чипа образцом или раствором образца по мере их продвижения от полости ввода в устройство, полость электродного чипа промывают измерительным раствором перед возбуждением, а поток излучения люминесценции от образца во время или по окончании приложения импульсов возбуждения пропорционален количеству содержащегося в образце искомого аналита..
8. Способ исследования на основе электрохемилюминесценции, в котором любое из устройств по пп.1-7 используют для исследования биологический свойств.
9. Способ исследования на основе электрохемилюминесценции, в котором любое из устройств по п. 1-7 используют в исследовании путем приложения к электродам катодных или биполярных импульсов возбуждения или серий таких импульсов.
10. Устройство, которое выполнено любым образом с обеспечением возбуждения люминесценции биполярными импульсами в любом из электродных чипов по любому из пп.1-9.
WO 2011/154588
РСТШ2011/000030
WO 2011/154588
PCTYFI2011/000030
О О
и " м 2
rv О
о о : °
X СО
ч о
Н О О
" а
К I
Terbium (til) chelate (mol/L)_ Тербий (III)- хелат (пкМ)
Фиг. 3
Fig. 3
TSH (ull/rnL)
TSH (MKU/МЛ)
PCT/FI2011/000030
о о
я "
Я о
я -
к и К
hTSH (MKU/МЛ)
1/4
3/4
3/4
4/4
4/4
