[**]

Изобретение относится к приборам с картриджами, содержащими электродные чипы (Э-чип), применяемые в способах и устройствах, использующих электрохемилюминесценцию (ЭХЛ), индуцированную горячими электронами, и электролюминесценцию (ЭЛ) в целях электрического возбуждения молекулярных маркеров и последующего измерения люминесценции для количественного анализа концентраций веществ при исследовании их биологических свойств, в особенности, вне центральных лабораторий, а также при быстрых скриннинг-тестах.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к приборам с картриджами, содержащими электродные чипы (Э-чип), применяемые в способах и устройствах, использующих электрохемилюминесценцию (ЭХЛ), индуцированную горячими электронами, и электролюминесценцию (ЭЛ) в целях электрического возбуждения молекулярных маркеров и последующего измерения люминесценции для количественного анализа концентраций веществ при исследовании их биологических свойств, в особенности, вне центральных лабораторий, а также при быстрых скриннинг-тестах.

---

Евразийское (21) 201300008 (13) А1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. G01N21/76 (2006.01)
2013.09.30 G01N 21/66 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2011.06.10
(54) НЕДОРОГИЕ ЭЛЕКТРОДНЫЕ ЧИПЫ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБЫ
МНОГОКОМПОНЕНТНОГО АНАЛИЗА И ОЦЕНКИ НА ОСНОВЕ КАТОДНОЙ ЭЛЕКТРОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
20100260;20100246;20100251; 20100253
2010.06.11; 2010.06.11; 2010.06.15;
2010.06.16
PCT/FI2011/000033
WO 2011/154591 2011.12.15
Заявитель:
ЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ
ОБЩЕСТВО "НАУЧНЫЕ ПРИБОРЫ" (RU)
Изобретатель:
Кулмала Сакари, Нисканен Антти, Кулмала Аия, Лоикас Кари, Пуса Матти (FI)
Представитель: Коробчук О.В. (RU)
(57) Изобретение относится к приборам с картриджами, содержащими электродные чипы (Э-чип), применяемые в способах и устройствах, использующих электрохемилюминесценцию (ЭХЛ), индуцированную горячими электронами, и электролюминесценцию (ЭЛ) в целях электрического возбуждения молекулярных маркеров и последующего измерения люминесценции для количественного анализа концентраций веществ при исследовании их биологических свойств, в особенности, вне центральных лабораторий, а также при быстрых скриннинг-тестах.
МПК G01N21/76, G01N21/66
НЕДОРОГИЕ ЭЛЕКТРОДНЫЕ ЧИПЫ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБЫ МНОГОКОМПОНЕНТНОГО АНАЛИЗА И ОЦЕНКИ НА ОСНОВЕ КАТОДНОЙ
ЭЛЕКТРОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к аналитическим способам и устройствам, использующим явление электрохемилюминесценции. Изобретение особенно пригодно для проведения нужных видов анализов, таких как конкретные анализы, и с другой стороны,и для быстрых скриннинг-тестов. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время существует настоятельная необходимость в быстрых, чувствительных и количественных технологиях диагностики. Такие технологии широко применимы в рыночных условиях, включая здравоохранение, исследования, сельское хозяйство, охрану окружающей среды, ветеринарную медицину и отдельные отрасли промышленного производства. Повышение чувствительности, скорости, надежности, стабильности и снижение стоимости анализов являются факторами, которые после реализации их в диагностических технологиях могут найти применение в совершенно новых областях.
Очень высокая чувствительность может быть получена при использовании ряда диагностических приборов, но они слишком дороги. С другой стороны, ряд способов может быть достаточно малозатратным, например, иммунохроматография, однако они не применимы к ряду запросов рынка. Любая технология, которая отвечает таким требованиям, будет иметь важное место в диагностике в будущем и большой рыночный потенциал.
Существует большое число различных принципов анализа, используемых в практике диагностики, например, радиоактивные методы исследования, иммуносорбентный анализ с ферментной меткой (ELISA), колориметрический анализ, и исследования, основанные на флуоресценции и хемилюминесценции, включая электролюминесценцию (ЭЛ). Здесь ЭЛ считается эквивалентной любой, электрически индуцированной люминесценции. Таким образом, считается, что электролюминесценция включает как анодную, так и электрохемилюминесценцию (ЭХЛ), индуцированную горячими электронами (катодную). Индуцированная горячими электронами ЭХЛ (КЭХЛ) детально описана в патенте US
6251690 (Kulmala S., et al). Каждый из этих методов играет свою роль в отношении совокупности таких характеристик, как чувствительность, надежность, стабильность, скорость и стоимость. Различия между технологиями отражают зависимость от физических ограничений или преимуществ методик. К примеру, недостаток приложений с использованием радиоактивных составов заключается в снижении уровня радиоактивности со временем и слишком высокой стоимостью радиоактивных отходов с точки зрения и безопасности и влияния на окружающую среду. Приложение наиболее чувствительных исследований к диагностике ограничивается сложной природой тестов и приборов, и только специалисты могут выполнять исследования. Сложность исследования обычно прямо пропорциональна стоимости прибора и/или теста. В контексте сложности приборов можно упомянуть технологию анодной электрохемилюминесценции, которая приобретает растущую популярность: прибор представляет собой сложный лабораторный робот, обращение с которым требует знания дела, а процесс измерений включает многократные промывания и подготовительные этапы. Это факторы, которые увеличивают стоимость исследования, а также приводят к росту объема отходов и, следовательно, делают этот метод недоступным для нужд малых лабораторий, врачебных кабинетов и т.д. (обследование лежачих больных или в пунктах оказания помощи).
Коммерчески выгодные способы основаны на том принципе, что подлежащее анализу вещество идентифицируют и измеряют в смесях с использованием так называемых веществ-маркеров. В измерениях, основанных на уникальных свойствах биологических молекул, например, в иммунохимических исследованиях, измеряемый аналит (X) может быть селективно извлечен из смеси молекул на связанные с ним антитела в твердой фазе, а затем связанные молекулы измеряются с помощью другого маркированного антитела, селективно связывающегося с (X). Веществами-маркерами могут быть радиоактивные изотопы, ферменты, молекулы, поглощающие свет, флуоресцирующие или фосфоресцирующие, хелаты некоторых металлов и т.д., которые ковалентными связами соединяются с антителом. И наоборот, очищенный (X) можно маркировать, а объем неизвестного немаркированного образца (X) можно исследовать путем реакции сравнения. Исследования ДНК и РНК также могут быть основаны на селективном связывании (биологическое свойство). На основе таких же принципов могут быть проведены многие другие химические и биохимические исследования. Для снижения стоимости и/или увеличения точности измерений в настоящее время имеет место тенденция одновременного измерения в образце нескольких различных параметров. Одной из возможностей является использование маркеров, проявляющих свойства флуоресценции или фосфоресценции на различных длинах волн, или имеющих различное
время высвечивания люминесценции. Различные принципы и методики измерений, которые могут быть использованы в иммунодиагностике, были описаны в книге "Руководство по иммунному анализу" (" The Immunoassay Handbook)), ed. David Wild, Stockton Press Ltd., New York, 1994, 618 c).
Из уровня техники известно, что органические вещества и хелаты металлов могут успешно выступать как вещества-маркеры, могут возбуждаться под действием света и, в некоторых случаях, при электрохимическом воздействии и люминесцировать соответственно специфике маркера. Эти способы особенно чувствительны и хорошо подходят для многих типов исследований биологических свойств. Тем не менее, из-за предельно малых измеряемых концентраций существуют трудности, зависящие от случая; так, использование флуоресценции может быть осложнено тиндалевским, релеевским и рамановским рассеянием. При анализе биологических материалов после подачи импульса возбуждения возникает, почти без исключения, быстроразрядная флуоресценция с высокого уровня. Фосфоресценция в фазе раствора может быть использована, преимущественно, только при наличии хелатов ионов лантанидов со специально синтезированными органическими молекулами. Недостатком методов возбуждения с использованием фотолюминесцентных маркеров является сложность приборов и высокая стоимость чувствительных оптических компонент.
В общем случае, преимуществом ЭХЛ является низкая стоимость компонент оборудования для электрического возбуждения и более простая оптика. В сравнении с фотолюминесценцией, можно избежать некоторых недостатков. Традиционная анодная электрохемилюминесценция с электродами из инертного металла может быть получена с использованием органических люминофоров в неводных растворителях и относительно простыми приборами. Тем не менее, в исследованиях биологических свойств, на которых сконцентрированы наибольшие коммерческие ожидания, применяются водные растворы. Биологические образцы вводятся почти всегда в неорганические растворы, поэтому измерительная система должна работать в водных или, в крайнем случае, в мицеллярных водных растворах. Только весьма ограниченное число хелатов металлов переходной группы работают в водных или мицеллярных растворах как ЭХЛ- маркеры в анодной ЭХЛ.
Поэтому наиболее важным коммерчески приложением анодной ЭХЛ в аналитической химии является способ, использующий производные рутений Ru(bpy)32+ - хелатов, в котором определение маркера происходит в мицеллярной фазе. Как известно из литературы, мицеллярные смеси всегда подвержены различным возмущениям вследствие неконтролируемой сложности мицеллярного равновесия. Подобные системы могут быть
также использованы в весьма малых ячейках детектирования в капиллярных системах электрофореза (A.Aurora et al. Anal.Comm.34 (1997), 303-395).
КЭХЛ, которая не зависит от мицелл, имеет много существенных преимуществ перед анодной ЭХЛ. Она может быть применена и к способам иммунодиагностики и к способам гибридизации ДНК (Blackburn, G., et al., 1991, Clin.Chem. 37: 1534-1539; Kenten, J., et al. Clin.Chem. 33: 837-879). В иммунологических исследованиях и применениях ДНК- и РНК-зондов, проведенных фирмой Roche Diagnostics Ltd., использованы магнитные частицы, с помощью которых вещество-маркер наносят на золотой рабочий электрод (Massey; Richard J/ et al/ US 5746974; Leland; Jonathan K., et al. US 5705402). Тем не менее, воспроизводимость обработки магнитолатексных частиц во многом трудна, поэтому данный способ пригоден только для дорогостоящих лабораторных роботов (т.е. Elecsys 1010 и 2010), обладающих сложной и точной системой обработки жидкости. Кроме того, стационарно установленный массивный золотой электрод нуждается в длительной очистке и предварительной обработке между последовательными анализами (Руководство по обслуживанию Elecsys, с.70).
Хотя КЭХЛ во многих отношениях оказывается превосходным методом, его недостаток в исследованиях биологических свойств состоит в необходимости длительного времени инкубирования для приведения взаимодействующих молекул в равновесное состояние, которое необходимо для получения оптимальной точности анализа. Позднее было установлено, что значительное улучшение результатов может быть достигнуто, если на рабочем электроде разместить тонкую пористую пленку (проводяще-изолирующая пористая пленка - Conductor/Insulator/Porous Film), и путем изготовления CIPF- устройства (US2009178924 (Al), Ala-Kleme et al.).
В традиционной электрохимии электроды иногда устанавливают на одной плоскости, но теоретически это не будет работать в электрохимии горячих электронов, т.к. КЭХЛ излучается только с внешних краев рабочего электрода (катода), ближайшего к электроду ' противоположного знака (противоположному электроду). Однако при проведении испытаний было обнаружено, что по ряду причин в электролитической ячейке с достаточно большим объемом раствора электролита КЭХЛ излучается равномерно со всей рабочей поверхности электрода, даже если противоположные электроды размещены на одной плоскости в электродном чипе (интегрированные электродные чипы, ИЭ-чип), обычно изготавливаемом из изолирующего материала, такого как стекло, керамика или органические полимеры.
Фирма Labmaster Ltd. (Турку, Финляндия) работала со своими диагностическими полосками почти десять лет, и полученное ими решение представляет собой достаточно
простой прибор, содержащий единственный кусок силикона, покрытого оксидом, помещенного в пластик, и многоцелевую мембрану для введения образцов и реагентов для исследований биологических свойств (US20091789246 , Ala-Kleme et al.) Основной недостаток этих полосок состоит в том, что все измерения проводятся в инструментальной ячейке, которая должна быть тщательно вымыта и вычищена перед каждым измерением для того, чтобы избежать наложения результатов, проблематичной является также порча противоположного электрода, встроенного в прибор.
Недавно нами были раскрыты средства для создания одноразовых картриджей с исключительно точными и воспроизводимыми электродами, которые, естественно, также обеспечивают высокую точность результатов в практических анализах (FI 20100246, S.Kumala et al.,FI 20100251, S.Kumala et al, FI 20100253, S.Kumala et al.). Основой этих изобретений служит либо использование Чипов с Интегрированными Электродами (ИЭ чипы), содержащие анод и катод, сгруппированные на одной плоскости для использования при детектировании КЭХЛ, либо Электрод/Электрод-чипы (ЭЭ-чипы), включающие пару электродов какой-либо полярности, выполненных из углеродной пасты, которые используют для возбуждения электролюминесценции (ЭЛ) маркеров из хелатов лантанидов. ИЭ чипы и ЭЭ- чипы используются, в основном, в одноразовых картриджах для биологических исследований, таких как картриджи для иммуннологического анализа или ДНК-зонды. Далее, ИЭ-чипы и ЭЭ-чипы будут называться одинаково как электродный чип - Э-чип.
Совсем недавно было обнаружено, что если оптически прозрачный рабочий электрод, а также оптически прозрачный противоположный электрод используются в КЭХЛ (M.Hakansson et al., Anal.Chim.Acta 541 (2005) 137-141), то могут быть определены два аналита. Однако включение двух счетчиков фотонов для детектирования в один прибор оказывается затратной мерой, гораздо лучшим решением может быть создание электролитической ячейки, которая позволяет использовать только одно устройство детектирования света. Задача недавних изобретений состояла в том, чтобы с помощью единственного детектора оптического излучения можно было определить только один аналит (FI 20100246, S.Kumala et al.,FI 20100251, S.Kumala et al.) или два аналита (FI 20100253, S.Kumala et al.).. Настоящее изобретение раскрывает, как можно изготовить новые многоцелевые Э-чипы и использовать их в анализе как при определении множества аналитов, так и одного аналита, с использованием внутренних стандартов или стандартных добавок или других методов оценивания (FI 20100248, S.Kumala et al). Испрашиваемый приоритет основан на патентных заявках FI 20100248, S.Kumala et al., FI
20100246, S.Kumala et al., FI 20100251, S.Kumala et al., или FI 20100253, S.Kumala et al. и любое из них считается подтверждением новизны заявляемого изобретения.
В соответствии с настоящим изобретением можно изготовить Э-чип для многоцелевого использования, что является существенным расширением использования CIPF-устройств (US2009178924 Al, Ala-Kleme et al.) за счет установки одноразовых КЭХЛ и ЭЛ картриджей, содержащих упомянутые Э-чипы, в соответствии с пп.1-10 формулы изобретения. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ.
Фиг. 1(a). Э-чип, образованный из круглого основания, выполненного из изолирующего материала, и электроды, выполненные на нем. (1) Круглое основание. (2) Противоположный электрод. (3) Рабочий электрод. (4) Гидрофобная область или адгезивная лента, охватывающая область ячейки. (5) (б) Э-чип, разделенный на кусочки прямоугольной формы из диска большего размера или пластины (нумерация соответствует вышеприведенной), (в) Э- чип, в котором контактные накладки собраны на только на одном конце, нумерация сохранена (иногда полезно иметь достаточно длинный Э-чип, требующий значительно более длинных проводящих пленок к электронным контактным накладкам измерительного инструмента, чем те, что показаны на фиг. 1(B).) (г) Э-чип с зеркалом вогнутой формы для электродных областей, (д) Э-чип с зеркалом вогнутой формы с точечными электродами, электронные контакты которых проходят через Э-чип (сеть электронных контактов на нижней поверхности чипа), (е) Э- чип с набором электродов, контактирующих через чип, крышка которого служит собирающей оптической линзой для направления света в центр фоточувствительной области детектора. (1) Основание, (2) Рабочие электроды, проходящие через чип, (3) Противоположный электрод в середине чипа, (4) Крышка из ПДМС, имеющая форму линзы, (5) Детектор оптического излучения, такой как лавинный фотодиод или труба фотоумножителя.
Фиг.2. Метод стандартных примесей в исследованиях hTSH на Э-чипе.
Фиг.З. Двойной иммуноферментный анализ на Э-чипе с рабочим электродом из силикона.
Фиг.4. Двойной иммуноферментный анализ на Э-чипе с рабочим электродом из силикона.
Фиг. 5. 20-позиционный Э-чип для целей скрининга, (а) вид сбоку, (б) вид сверху. (1) Изолирующее или проводящее основание, (2) Пленка алюминия, полученная вакуумным испарением или напылением, или алюминиевая фольга, наклеенная на основание сверху, (3) Изолирующая пленка (толщиной более 300 нм), образованная печатным способом или адгезией изолирующей ленты, имеющая отверстия в соответствующих местах, (4)
Электроды, выполненные из углеродной пасты на поверхности серебристой краски, нанесенной на толстую изолирующую пленку вокруг полостей рабочих электродов, с контактными накладками по сторонам чипа. (5) Толстый полимерный слой, определяющий окончательный размер полости для образца, оставляющий открытыми рабочий электрод и противоположный электрод вокруг рабочего электрода, например, вторая адгезивная лента, печатный слой полимера или ПДМС-чип, укрепленный на верхней части Э-чипа.
Фиг.6. Иммуноферментный анализ с использованием 20-позиционного Э-чипа на основе рабочих электродов из алюминиевой фольги.
Фиг.7. 4-позиционный картридж Э-чипов на основе силикона с ПДМС-камерой, заполняемой капиллярно. (1) Чип из силикона, (2) Толстый защитный слой оксида (все серые области), (3) Сверхтонкая 4-нм пленка оксида на областях рабочих электродов (все светлосерые области), (4) Противоположные электроды с контактными накладками на верхней части защитного слоя оксида (черным цветом), (5) ПДМС-крышка, оставляющая открытыми углы чипа для электрических контактов с отдельными противоположными электродами, (6) Микроканалы впуска в камеру образца с (по одному на каждую камеру образца), (7) Микроканалы выпуска воздуха (изображен только один из трех).
Фиг.8. Метод стандартных добавок с использованием 4-позиционного картриджа Э-чипов на основе силикона. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением различные анализы могут быть выполнены как с помощью простых и недорогих устройств, так и с помощью более сложных устройств, проводится ли иммунологический анализ или ДНК-гибридизация либо непосредственно, либо с использованием пористой пленки на поверхности Э-чипов. Таким образом, более ранние устройства могут быть значительно усовершенствованы, а несколько аналитов могут быть выявлены в ходе единственного исследования, а в противном случае, могут быть применены внутренние стандарты или специальные стандартные добавки. Измерительный прибор и измерительный картридж пока достаточно дешевы для индивидуальных анализов и могут быть сделаны полностью одноразовыми. Тогда не будет происходить пересечения между анализами, а изготовление одноразовых картриджей для исследований станет более легким, когда не нужно будет вводить в картридж отдельно рабочие и противоположные электроды, как делалось раньше.
В настоящем изобретении предложено несколько альтернативных конструкций для изготовления. Во-первых, все электроды могут быть изготовлены в один этап, например,
вакуумным испарением или напылением, используя маску на большом изолирующем основании из материала, такого как пластик, стекло, керамика и т.д., а в конце электрод, выбранный в качестве анода, покрывается углеродной пастой, например, путем трафаретной печати или струйной печати, а на конечной стадии материал делят на чипы. В ином случае, можно провести, например, двухстадийное или трехстадийное вакуумное испарение или напыление. Для некоторых материалов удобно выполнять на первой стадии начальный слой из хрома в качестве адгезивного слоя, а затем на хром поместить выбранный материал для рабочего электрода или противоположного электрода. Для некоторых целей хром может быть непосредственно использован в качестве противоположного электрода. В этих случаях наиболее удобно то, что в вакуумных камерах существует возможность введения других масок без повышения давления до нормального атмосферного, однако, если длительность нахождения там не слишком важна, вторую маску для покрытия областей противоположного электрода (но не для покрытия областей рабочего электрода) вводят вручную, и на области рабочего электрода добавляют алюминий или высоко примесный кремний. Таким образом, в результате получают пленки рабочего электрода из силикона или алюминия и противоположные электроды из хрома. Если же хром не рассматривать как достаточно хороший материал для противоположного электрода, то хром может быть покрыт тонкой пленкой углеродной пасты. В качестве альтернативы используют третью стадию изготовления, в которой маски замещают третьей маской, оставляющей открытыми только области противоположного электрода, и добавляют тонкую пленку платины. В этом случае получают рабочие электроды из алюминия или силикона и противоположный электрод/электроды из платины.
Использование электродов из алюминия наиболее удобно, т.к. достаточно обеспечить их окисление в атмосфере кислорода или даже в атмосферном воздухе, и Э-чип подготовлен к покрытию гидрофобным материалом, чтобы обеспечить гидрофобную оболочку областей ячейки для покрытия биоматериалами или прямого ввода в картридж, выполненный, например, из пластика/полимеров.
В случае рабочих электродов из силикона, их поверхности сначала должны быть окислены либо непродолжительным воздействием плазмы, либо химически, или, что более неудобно, путем анодного окисления, используя изготовленный анод (в окончательном виде) в качестве катода во время анодирования силикона. Альтернативно силикон окисляется анодированием in situ, во время измерения КЭХЛ при подаче анодных импульсов.
Иногда лучшим (после изготовления пленки хрома на основании) решением является покрытие из алюминия или высоко примесного кремния на всех выбранных электродных областях, и в заключение добавить слой углеродной пасты путем струйной печати или трафаретной печати на выбранные области противоположного электрода (анодные области). Хорошим выбором в случае, когда краску из углеродной пасты выбирают в качестве финишного слоя на всех электродах, является использование только алюминия или только хрома в качестве первого слоя с высокой проводимостью под слоем углеродной пасты. Электроды из алюминия /углеродной пасты выгодно использовать и в том случае, когда углеродная паста вытекает через отверстия или пустоты, т.к. алюминий сам по себе может служить электродом. Хром, однако, не может вызывать КЭХЛ или ЭЛ хелатов лантанидов, даже имея окисленную поверхность и достаточно тонкую оксидную пленку.
В зависимости от схемы производства материал основы делится на чипы на соответствующем этапе. Как правило, разделение производят сразу же после размещения финишного слоя электрода на диске основы, выполненной из изолирующего материала, обычно из пластика или стекла. Тем не менее, иногда лучше добавить биоматериалы на рабочие электроды, например, используя технологии печати или струйной печати, до разделения на элементы.
Нарезанные чипы вносят в подготовленные картриджи после покрытия области рабочего электрода биологическим материалом, или сам чип может непосредственно образовать половину картриджа, как правило, его нижнюю часть, другая половина, содержащая пневмонику, камеры, впускные и выпускные каналы, помещается на верхнюю часть чипа. Все это весьма удобно выполнять из, например, полидиметилсилоксана (ПДМС)
Когда на одной пластине размещено большое количество рабочих электродов (например, в случае скриннинг-тестов), предпочтительно, чтобы верхняя часть картриджа была выполнена в форме линзы, или, альтернативно, содержала оптически прозрачное окно в форме линзы, которая собирает свет от всех отдельных рабочих электродов на оптический детектор. Это выгодно также в случае малого количества световых пятен или полос от рабочих электродов, т.к. чем меньше область светочувствительности детектора (например, область катода в трубке фотоумножителя), тем ниже уровень шума в детекторе. Поэтому такой тип линз позволяет использовать более дешевые и менее шумные оптические приборы детектирования. ПДМС является прекрасным выбором материала для недорогих линз такого типа в одноразовых картриджах, но конечно, также
хорошо могут быть использованы и многие другие оптически прозрачные полимерные материалы, такие как полистирен полиэтенетерфталат и др..
В приложениях фотолюминесценции к скриннинг-тестам, дающим в тесте множество световых пятен, построение источника света и системы детектирования, которая может достаточно точно сканировать все пятна, оказывается весьма дорогостоящей. В этом отношении Э-чипы на основе КЭХЛ и ЭЛ с множеством световых пятен или полос от рабочих электродов имеют на порядок меньшую стоимость. Кроме того, в приложениях фотолюминесценции следует выбирать пластик для картриджей оптически прозрачным в УФ-диапазоне, если излучение возбуждения должно проходить через материал картриджа. В соответствии с настоящим изобретением, вполне достаточно того, чтобы окно картриджа или крышка были оптически достаточно прозрачными в диапазоне длин волн излучения.
Альтернативным решением для эффективного фокусирования света является изготовление основания Э-чипа в форме вогнутого зеркала, что также приводит к фокусированию света на детекторе с малой светочувствительной областью, расположенной в фокусе "вогнутого зеркала", как описано в одном из примеров.
Другой путь создания Э-чипов основан на использовании чипов из высоко примесного кремния как материала основы, (i) на котором выполняют области рабочего электрода с оксидными пленками толщиной 4 нм, и (ii) другие части чипа вначале покрывают толстым защитным изолирующим слоем кремния, поверх которого (iii) выполняют противоположные электроды путем напыления, вакуумного испарения или печати серебристой краской, или краской из углеродной пасты, или комбинацией их слоев. В этом случае образуется единственный электрический контакт ко всем рабочим электродам, но отдельные контакты к каждому противоположному электроду. Недостаток состоит в том, что реальная конструкция ячейки при использовании должна предотвратить ошибочное протекание тока в область рабочего электрода. Это, естественно, требует использования оптически прозрачной крышки, которая отделяет каждую камеру рабочего электрода от остальных. Отличным выбором является использование силиконового основания в случаях скриннинг-тестов, если требуется высокая точность и повторяемость, а острия рабочих электродов покрывают биоматериалом по типу струйной печати или печатным способом, существующим в способах покрытия.
Для скриннинг-тестов хорошей альтернативой является изготовление одноадресных лунок КЭХЛ путем (i ) исходного получения толстого слоя термостойкого оксида на высоко примесном кремнии, (ii) последующего травления полостей рабочего электрода и
изготовление сверхтонкого 4-нм слоя оксида на дне лунок, ( in) установки отдельных электродов из платины или другого проводника поверх защитного слоя оксида (противоположные электроды), (iv) добавления слоя SU-8 на верхнюю часть всей пластины и вытравление SU-8 из полостей для образца (достаточной больших по сравнению с полостями рабочего электрода, так что все пары рабочий электрод -противоположный электрод остаются непокрытыми, a SU-8 в результате формирует отдельные лунки, которые могут быть использованы при электрическом возбуждении просто правильным выбором противоположного электрода.
Равным образом можно начать (i) с получения алюминиевой пленки на основании из пластика или стекла или наклеивания на основание алюминиевой фольги. Затем (ii) области рабочих электродов формируют печатным способом из изолирующего полимера, из лаковой пленки или пленкой краски, не затрагивая области выбранных рабочих электродов или добавляя адгезивную ленту с отверстиями в местах, соответствующих областям выбранных рабочих электродов. После этого, (ш) печатным способом выполняют противоположные электроды на изолирующем суб-слое, описанном выше -этап (ii). Окончательно, (iv) полости для образца формируют печатным способом с использованием другой изолирующей пленки (более толстой, чем предшествующая) для окончательного формирования полостей для образца с парами "рабочий электрод -противоположный электрод" при раздельной адресации к ним; это может быть выполнено также с использованием полосы толстой адгезивной ленты, имеющей нужные размеры отверстий для полостей при заданном расположении. Однако при массовом производстве этот метод не может быть конкурентным, но он достаточен для предварительных испытаний.
Третий путь изготовления очень прост, все области электродов выполняют в один этап печатным или струйным способом с применением углеродной пасты, имеющей достаточную проводимость. Если проводимость углеродной пасты ограничена, задачу можно решить путем печати сначала, например, слоя серебристой краски или другого слоя с высокой проводимостью, такого, как слоя проводящего полимера, а затем слоя углеродной пасты поверх чистой краски с высокой проводимостью.
Изобретение далее поясняют диаграммы и связанное с ними неограниченное число примеров и чертежей.
ПРИМЕР 1. Изготовление устройств с Э-чипами и иммуноферментный анализ гетерогенного тиреотропного гормона TSH с использованием Э-чипов.
Фиг. 1 представляет некоторые типы вариантов Э-чипов. Иногда лучше использовать круглое пластиковое основание (фиг.1. а), которое удобно тем, что позволяет разделить
область ячейки, например, на узкие сектора с электронными контактами на краях дуговых чипов. Однако обычно чипы изготавливают на основаниях в виде больших пластин или дисков, их удобнее делить на прямоугольные чипы. Чем меньше рабочий электрод, тем предпочтительнее наносить покрытия из биологического материала, такого как антитела, антигены, олигонуклеотиды и т.д. путем струйной подачи. В реальном тесте были выбраны образцы, имевшие достаточно большие острия рабочих электродов.
При использовании электродов с очень малыми остриями (скринниг-тесты) при относительно большой площади ячейки иногда предпочтительно использовать основание, выполненное в форме вогнутого зеркала путем формования, горячего тиснения и пр., а оптический детектор размещать в фокусе воображаемого зеркала (фиг.1 д). Для данного типа устройств хорошо подходят проводящие штыри, встроенные в ПДМС, концы которых покрыты углеродной пастой. Испытали устройство такого типа, в нем пучок проводов из алюминия (30 проводов вокруг одного, немного большего, центрального провода из нержавеющей стали) (анод), ввели в форму для отливки ПДМС (диаметром 20 мм). Внутренняя поверхность "вогнутого зеркала" была затем механически отполирована, с помощью гладкой песчаной шлифовальной шкурки, и окончательно - гидросмесью оксида алюминия, для того, чтобы убедиться, что все электроды не имеют покрытия ПДМС. После этого электроды оставлены на воздухе в течение ночи для окисления. При испытаниях с 1 мкМ раствором ТЬ(Ш)-хелата исследовали работу каждого из острийных рабочих электродов, выполненных из алюминия, но CV оказался ниже на 12%, что указывает на несовершенство формы "вогнутого зеркала". Простыми средствами изготовления множества острийных электродов в ПДМС и других типах полимеров являются изготовление отверстий через чип на первом этапе и последующее заполнение отверстий проводящей краской, которые, предпочтительно, являются углеродной пастой с достаточной проводимостью, но также может быть, например, серебристая краска которую финишно покрывают углеродной краской, чтобы получить электрод из углеродной пасты на чипе с контактом к чипу из серебристой краски. Пористый керамический материал и, например, пористые фильтры из оксида алюминия позволяют изготовить множество очень маленьких острийных электродов, предназначенных для КЭХЛ, путем отливки алюминия в поры и установки контактов снизу, что, однако, не очень легко.
При исследовании биологических свойств в первых тестах были выбраны образцы устройств с рабочими электродами, имевшими весьма большие размеры острия. Э-чипы , представленные на фиг.1 (в), были выполнены на стеклянной пластине. Вначале пластину гравировали плазмой в течение короткого промежутка времени. Затем слой
хрома (99,99%, Alpha Ventron) напылили на все области электродов через маску (2 и 3 на фиг. 1(B)). Затем тонкий слой алюминия (99,99%, Alpha Ventron) напылили на пленку хрома через другую маску, которая экранировала область противоположных электродов (т.е. рабочие электроды (3 на фиг. 1(c)). На следующем шаге напылили платину через третью маску, экранировавшую области рабочих электродов (т.е. был сформированы противоположные электроды из платины, (2 на фиг.1 (в)). Затем пластина была разделена на прямоугольные части размером 20 мм ч 20 мм, чипы были отправлены в эксикатор, а алюминиевые электроды поместили на ночь в атмосферу кислорода при комнатной температуре.
Область ячейки Э-чипов (5 на фиг. 1(в) была покрыта гидрофобным кольцом, которое было выполнено из адгезивной ленты с отверстиями, ограничивающими область ячейки диаметром в 11,0 мм. Покрывающий раствор (180 микролитров) был составлен из 0,1 М MES, 0,03 М Н3ВО3, 0,5мМ К-цитрата, 0,025%) глутаральдегида, 0,05% бычьего гамма-глобулина и 10 мкг/мл антитела (MIT0406 МОАВ анти-hTSH Medix Biotech Inc. USA). После инкубирования в течение двух часов при комнатной температуре в закрытом пластиковом объеме покрывающий раствор был извлечен, а ячейки были дважды промыты моющим раствором (50 мМ Tris-HCl, рН 7,8, содержащим 0,9% NaCl, 0,09% NaN3, 0,05% Tween 20). Затем ячейки насыщали добавлением 180 мкл раствора (основа 50 мМ Trizma, 0,1% NaN3, 0,1% Tween 20, рН7,5, скорректированный H2SO4). После насыщения Э-чипы высушивали при 30° С в течение 2,5 часов.
Маркированное антитело (моноклональный анти-hTSH, клон 5404, 5,5 мг/мл Medix Biochemica Оу Ab) было приготовлено реакцией производных изотиоцианата хелата тербия ТЬ(Ш) (ТЬ-2,6-бис[Ы,М-бис(карбоксиметил)аминометил]-4-бензоилфенол хелат) в 80-кратном молярном избытке при рН 9,5 в течение ночи при комнатной температуре. Колонку диаметром 1 см заполнили на высоту 5,5 см Сефадексом G-50, а последующие 52 см - Сефарозой 6В для отделения конъюгата белковой фракции от избытка реагента.
Иммуноферментный анализ проведен с использованием пористой пленки (толщина 611 нм, 1 х 105 - 6х108 пор/см2, Whatman). Маркированное антитело (0,5 мкл, 80 мкг/мл) в 50 мМ Tris-HCl - буфера, рН 7,7, содержащего 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5% BSA, 0,05% бычьего гамма-глобулина и 0,01% Tween 20, пипетировали на мембраны размером 11x11 мм и высушивали при комнатной температуре в течение ночи.
Стандартные образцы (концентрация TSH 10,0, 30,0 и 100,0 мШ/л) были приготовлены в тестовых пробирках разбавлением стандартного раствора TSH (Wallac, комплект DELFIA hTSH, 324 мШ/мл TSH) раствором разбавителя (основа 50 mM Trizma, 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,5% BSA, 1 мМ СаС12* H20, рН 7,7, скорректированный НС1).
Для иммунологических исследований образцы мембраны, содержащие высушенное вторично маркированное антитело, были размещены на гидрофильной области электрода, выполненной для образования электролитической ячейки с каплей раствора электролита. 10 мкл образца из стандартного раствора TSH (30 гаШ/л) пипетировали в центр пористой пленки на Э-чипе. Образец растворил маркированное антитело и быстро заполнил полость между мембраной и сетью электродов. Через 8 минут иммунная реакция была достаточно близка к равновесной, а мембрану удалили пинцетом. Э-чип был дважды промыт комбинированным промывочно/измерительным раствором ( 50тМ ШгРмОу, 0,1% NaN3; 0,003%) Tween, рН 7,8, скорректированный H2SO4).
Затем добавили 120 мкл измерительного буфера и с помощью электрохемилюминометра измерили временную зависимость интенсивности КЭХЛ при подключении импульсного генератора поочередно к каждому рабочему электроду. Измерительная установка содержала управляемый счетчик фотонов SR 400 (Stanford Research Instruments), многоканальное пересчетное устройство Nucleus MCS и изготовленные разработчиком генератор статических импульсов и камеру с ячейками (пластик черного цвета), а также модуль счетчика фотонов СРМ (Perkin Elmer). Задано: амплитуда импульсов равна - 25 В, заряд в импульсе 15 мкКл/имп., частота импульсов 20 Гц, временное разрешение интенсивности КЭХЛ с интегрированием по 100 циклам возбуждения, время задержки 0,05 мс и окно измерения 6,0 мс.
Было быстро получено 5 повторных измерений одного объекта. Сигналы счетчика фотонов равнялись 875, 814, 856, 802 и 819 фотонов. Среднее значение составило 832,2 с погрешностью 3,7%. Таким образом, можно быстро получить калибровочные кривые по 5 повторным измерениям при каждой концентрации.
Когда установка острийных рабочих электродов в соответствии с фиг. 1 (д) и фиг. 1 (е) была испытана в растворе хелатов ТЬ(Ш), то было замечено, что можно получить лишь незначительное улучшение при установке электродов на вогнутое основание, по сравнению с их установкой на плоском основании. Тем не менее, несколько лучшие результаты были получены с относительно большими ПДМС линзами при установке, показанной на фиг.1(ф).
ПРИМЕР 2. Использование метода стандартных добавок.
Э-чипы были изготовлены как в примере 1, но вместо прикрепления адгезивной ленты с единственным круглым отверстием в ней на электродный чип была прикреплена наклейка из тефлона (Irpola Оу, Турку, Финляндия), толщиной 0,25 мм с пятью круглыми отверстиями, точно совпадающими по размером с размерами рабочих электродов (диаметр 3,0 мм).
Области рабочих электродов Э-чипов были покрыты добавлением покрывающего раствора (50 мкл), составленного из 0,1 М MES, 0,03 М Н3ВО3, 0,5 мМ К-цитрата, 0,025% глутаральдегида, 0,05% бычьего гамма-глобулина и 10 мкг/мл антитела (MIT0406 МОАВ анти- hTSH Medix Biotech Inc. USA). После инкубирования в течение одного часа при комнатной температуре в закрытом пластиковом объеме покрывающий раствор был удален, а лунки в адгезивной пленке были дважды промыты промывочным раствором (50 мМ Tris-HCl, рН 7,8, содержащим 0,9% NaCl, 0,09% NaN3 и 0,05% Tween 20). Затем лунки насыщали добавлением 50 мкл раствора (основа 50 мМ Trizma, ,0,1% NaN3, 0,1% Tween 20, рН 7,5, скорректированный H2SO4). После насыщения Э-чипы высушивали при 30° С в течение 2,5 часов.
Отобрали образец из стандартного раствора 30 мЮ/л hTSH и разделили его на пять порций по ЗОмкл в тестовые пробирки. К двум из них добавили только по 10 мкл измерительного буфера и перемешали, к следующим 30- мкл порциям добавили 3,0 мкл стандартного 324-мШ/л hTSH стандартного и 7,0 мкл измерительного буфера и перемешали, к следующим порциям были добавлены по 6 мкл 324-мШ/л hTSH стандартного и 4, 0 мкл измерительного буфера и перемешали, а к остальным - по 9 мкл 324-мШ/л hTSH стандартного и 1,0 мкл измерительного буфера и перемешали. Затем по 25 мкл образцов из каждой пробирки вместе с 1,0 мкл маркированного антитела (40 мкг/мл 50 мМ Tris-HCl буфера, рН 7,7, содержащего 0,05% NaN3, 0,9% NaCl, 0,05% BSA, 0,05% бычьего гамма-глобулина и 0,01% Tween 20) пипеткой ввели в миниатюрные лунки в адгезивной пленке. После 15 минут инкубирования чип промыли струей промывочного раствора (50мМ Tris-HCl, рН 7,8, содержащего 0,09% №N3 и 0,05% Tween 20), а ленту удалили и заменили пленкой ПДМС (толщиной 2 мм) с круглыми отверстиями через ПДМС-чип, окончательно формируя измерительную ячейку, которую присоединили к Э-чипу и добавили 200 мкл измерительного буфера (50mM Na2B407, 0,1% NaN3, 0,003%) Tween, рН 7,8, скорректированный Н2 SO4.).
Интенсивность ЭХЛ от каждого рабочего электрода была поочередно измерена с теми же параметрами измерения, что в примере 1. Результаты представлены на фиг. 2. ПРИМЕР 3. Одновременное определение TSH и CRP с помощью Э-чипа.
Одновременно определяли С-реактивный белок (hCRP) и тиреотропный гормон (hTSH). Один из рабочих электродов был покрыт обоими антителами для их выявления, два рабочих электрода были покрыты антителами к hTSH, а остальные два - антителами к hCRP. Анти- hTSH и анти- hCRP были маркированы производными изотиоцианата хелата тербия ТЬ(Ш) (ТЬ-2,6-Ыз[> 1^-бис(карбоксиметил)аминометил]-4-бензоилфенол хелат) по аналогии с примером 1.
Э-чипы типа представленных на фиг.1 (в) с силиконовыми электродами изготовлены на стеклянной пластине путем напыления, с использованием пластин кремния n-типа в качестве источника высоко примесного кремния (удельное сопротивление 0,005 - 0,018 Ом/см и ориентация (1 1 1), Okmetic Оу, Финляндия). Электроды поместили на ночь в эксикатор для окисления в атмосфере кислорода при комнатной температуре. Противоположный электрод затем покрыли вручную углеродной пастой (Creative Materials 110-04 Carbon Ink. Tyngsboro, Ma, USA) через маску на чипах и углеродная паста была оставлена на ночь для выдержки.
Покрытие первичными антителами проводили с использованием тефлоновых стакеров с образованием микролунок для этапов инкубирования как примере 2.30 мкл анти- hTSH (125 мкг в 30 мкл анти-hTSH, MIT0406 Medix Biotech Inc. USA, 0,1 M MES, 0,03 M бората, 0,5 мМ К-цитрата, 0,025% глутаральдегида, 0,05% бычьего гамма-глобулина) пипетировали в каждую выбранную микролунку и инкубировали 2 часа при комнатной температуре вместе с покрытием анти-CRP (ниже). Три микролунки были покрыты анти-hTSH, как сказано выше, а две - анти- hCRP. 30 мкл анти- hCRP (анти- hCRP, 6404, Medix Biochemica Оу, Финляндия, 100 мкг в 30 мкл, 50 мМ Tris-HCl буфера, рН 7,8, 0,05% NaN3, 0,9%) NaCl, 0,05%) бычьего гамма-глобулина) пипетировали в оставшиеся микролунки. Время инкубирования составило 2 часа, как указано выше.
Микролунки затем были дважды промыты промывочным раствором (50 мМ Tris-HCl буфера, рН 7,8, 0,09% NaN3, 0,9% NaCl, 0,05% Tween 20) и аспирированы. Затем электроды пипетировали 30 мкл насыщающего раствора (50 мМ Tris-HCl буфер, рН 7,8, 0,9%) NaCl, 0,05%о NaN3, 0,l%oBSA, 6% D-сорбитол) и инкубировали в течение 45 минут. Затем микролунки аспирировали до опустошения и оставили высыхать при 30°С в течение 2,5 часов.
Для двойного иммунохимического анализа приготовили следующий стандартный раствор: hCRP 0 нг/мл и hTSH 0 мШ/мл (чистый раствор); hTSH 10 мШ/мл; hTSH 100 мШ/мл; hCRP 10 нг/мл; hCRP 100 нг/мл.
На этапе иммунохимического анализа добавили в лунки 2-3 20 мкл стандартного раствора hTSH и 1,0 мкл маркированного анти- hTSH ( 80 мкг/мл, клон 5404, Medix Biochemica Оу Ab, 50мМ Tris-HCl буфер, рН 7,7, 0,9% NaCl, 0,05% NaN3, 0,5% BSA, 0,05%) бычьего гамма-глобулина, 0,01% Tween 20, 1мМ СаС1г*Н20).
Также в лунки 4-5 добавили 20 мкл стандартных растворов hCRP и 1,0 мкл раствора анти- hCRP, маркированного ТЬ-хелатом (74 мкг/мл, Medix Biochemica Оу Ab, анти- hCRP клон 6404, рН 7,7, 0,9%> NaCl, 0,05% NaN3, 0,5% BSA, 0,05% бычьего гамма-глобулина,
0,01% Tween 20, 1 мМ CaC12*H20). Подобным образом чистый раствор был добавлен в лунку 1.
Через 15 минут инкубирования лунки были промыты измерительным буфером (0,05 М натрия тетра борат - буфер, доведенный до рН 7,8 серной кислотой, 0,1% №N3), а исходные тефлоновые стакеры были осторожно удалены и замещены адгезивной лентой, оставляя для использования круглую ячейку диаметром 11,0 мм. Добавили 120 мкл измерительного буфера и измеряли интенсивность ЭХЛ по очереди для каждого электрода, установив те же измерительные параметры как в примере 1, за исключением того, что непосредственно перед измерениями 20 анодных импульсов - 6 В (20 мкК/имп) были поданы на рабочие электроды. Результаты представлены на фиг.З. При испытаниях Э-чипов по примеру 1 были получены несколько лучшие результаты, чем при использовании силиконовых электродов по данному примеру.
ПРИМЕР 4. Одновременное определение TSH и CRP на Э-чипах с электродами из углеродной пасты.
Недавно было отмечено, что ТЬ(Ш)-маркеры можно возбуждать при использовании электродов из углеродной пасты (FI 20100253, S.Kumala et al.), и представленные ниже измерения подтверждают, что ЭЛ с неизвестным механизмом, очевидно, имеет катодное происхождение. Мощность этих электродов и эта ЭЛ таковы, что электроды могут быть успешно использованы и как катоды и как аноды, следовательно, обе полярности могут быть использованы во время единственного измерения, если для этого есть какие-либо причины.
Чип для эксперимента был изначально изготовлен для примера 1. Электроды, уже присутствовавшие на чипе, были покрыты углеродной пастой (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA) через маску, имитируя трафаретную печать. Углеродная паста была оставлена для выдержки при комнатной температуре на 24 часа.
Сдвоенные иммунохимические измерения TSH и CRP затем провели как в примере 3, за исключением того, что был выбран измерительные буфер 0,05 М Na2B40y (рН 9,2, содержащий 2x10"4 М K2S2O8) и напряжение в импульсе - 35В. Эти результаты представлены на фиг.4. ПРИМЕР 5. Э-чип для целей скриннинга.
Простой Э-чип для скриннинг-тестов был изготовлен путем наклеивания алюминиевой фольги (Pirkka Vahva Alumiinifolio, Kesko Oyj, Финляндия) на пластиковый чип (10x36 мм). Серебристая краска (Bison electro G-22, Bison Inc., Нидерланды) была нанесена на адгезивную пленку, предназначенную для книжных обложек, через маску, так были созданы формы противоположных электродов (4, фиг.5). После выдержки
серебристой краски через ту же маску был добавлен другой слой, но теперь из углеродной пасты (Creative Materials 110-04 Carbon Ink, Tyngsboro, MA, USA). После того, как подобным образом, методом трафаретной печати, были выполнены противоположные электроды, в адгезивной ленте, покрытой противоположными электродами, были просверлены отверстия (диаметр 3,0 мм) с использованием маски как инструмента позиционирования. Затем пленка из перфорированной ленты была закреплена на алюминиевой фольге так, что подходящий край алюминиевой фольги бы оставлен непокрытым для выполнения на нем электронных контактов к рабочему электроду (фиг.5). После этого тефлоновый стикер (толщиной 0,25 мм, Irpola Оу, Турку, Финляндия) с отверстиями, выполненными 4-мм сверлом, был размещен поверх ранее выполненного адгезивного слоя. Таким образом, были созданы полости для образца, высотой 0,25 мм и диаметром 4,0 мм. На дне полости находился круглый рабочий электрод диаметром 3,0 мм, а вокруг него - круглый противоположный электрод из углеродной пасты, шириной 0,5 мм. Единственной проблемой, связанной с данным чипом, была необходимость перемещать чип в подходящее положение в оптической измерительной камере электрохемилюминометра, т.е. в одном положении можно было провести только два измерения, после чего чип снова должен был быть переустановлен в нужное положение. В реальной продукции это можно легко обеспечить с помощью шагового двигателя, который в настоящее время не очень дорог.
Такой вид раздельных электрически определенных полостей можно исходно покрывать нужным биоматериалом, или такой вид чипов может быть также хорошо использован в количественных многокомпонентных исследованиях, при использовании стандартных дополнительных измерений или получении большого количества повторных измерений единственного аналита. В нашем случае полости для образца были покрыты антителами анти- hTSH и проведены измерения hTSH как в примере 1 с использованием тех же стандартныхрастворов, но с получением двух отдельных чистых измерений, калибровочной кривой от трех стандартов при повторении измерениях и "неизвестного" образца, полученного смесью стандартов 10 мШ/л и 100 мШ/л в соотношении 1:1 (т.е. концентрация образца составила 55 мШ/л, или 55 мкШ/мл . График калибровки и измерения образца приведены на фиг.6.
ПРИМЕР 6. Э-чип с парами электродов из углеродной пасты для целей скриннинга.
Первоначально подобный чип был построен как в примере 5, с тем отличием, что поверхность алюминиевой фольги была сначала полностью покрыта той же углеродной пастой, как в предыдущем примере. Так, были созданы пары углерод-углеродных электродов в раздельных полостях, имеющие раздельную адресацию. Их
функциональность была тестирована 1,0 микромолярным раствором Tb(III)-2,6-6nc[N,N-бис (карбоксиметил)аминометил1]-4-бензоилфенол хелат (рН 9,2, 2x10-4 М K2S2O8) и напряжение в импульсе - 65В, заряд в импульсе 25 мкК/имп, частота импульсов 20 Гц, интенсивность ЭЛ интегрирована по 1000 циклов возбуждения, время задержки 0,05 мс, окно измерения 6,0 мс. Наблюдаемая CV составляла 9,2 %, что неплохо для самодельных устройств. Электроды легко выдерживали 1000 циклов возбуждения без потери исходной интенсивности ЭЛ.
ПРИМЕР 7. Исследования, моделирующие энергоперенос в КЭХЛ при методе стандартных добавок, в которых не требуется покрытия биоактивным материалом электродов в картридже Э-чипа на основе силикона.
Чип выполнен из силикона с высокой проводимостью (1, фиг.7), который окислен термическим путем для получения оксидной пленки толщиной более 300 нм на поверхности (2, фиг.7). Этот защитная пленка оксида служит электрической изоляцией между металлизацией противоположного электрода и силиконовым основанием. Проводили травление областей рабочего электрода, в которых путем термического окисления сформирован оксид с туннелями толщиной 4 нм . Области темносерого цвета на этом чертеже указывают, где сохранился защитный слой оксида.
Были изготовлены четыре противоположных электрода проводного типа путем осаждения слоя платины толщиной 200 нм и под ним слоя хрома толщиной 10 нм для активирования адгезии (4, фиг.7). Такому металлизированному слою придана форма поднятого участка для формирования противоположных электродов в областях ячейки для образца и контактных накладок на каждом углу чипа. Металлизация отображена черным цветом на чертеже.
Обратная сторона чипа травлением очищена от оксида и металлизирована алюминием для улучшения электрического контакта, пластина нарезана на чипы размером 20x20 мм. ПДМС-крышку образовали отливкой ПДМС основания при введении смеси добавок в основную форму. После отверждения крышку вынули из формы и закрепили на электродном чипе для образования камер образца (3, фиг.7), каналов ввода образца (6, фиг.7) и каналов отвода воздуха (7, фиг.7). Области, ограниченные прерывистой линией на чертеже, показывают ПДМС-крышку (5, фиг.7), которая оставляет незакрытыми контактные накладки противоположных электродов по углам чипа.
В пределах крышки ПДМС прямо контактирует с электродным чипом, исключая области каналов или камер для образца. В круглых камерах для образца (3, фиг.7) прямоугольные опоры, контактирующие с чипом, поддерживают перекрытие камеры. Объем камеры для образца составлял 15,0 мкл.
Модельным аналитом в данном эксперименте был выбран хелат TD(III)-2,6-6HC[N,N-бис (карбоксиметил)аминометил1]-4-бензоилфенол . "Неизвестная" концентрация аналита в образце составляла 100 пкМ. При испытаниях первая камера для образца была оставлена пустой, а три другие камеры пипетировали раствором ТЬ(Ш)-хелата с концентрацией 1,0 мкМ объемами 3,0, 6,0 и 9,0 мкл соответственно, а крышка была высушена, (т.е. в камеры было добавлено 3,0, 6,0 и 9,0 пкМ хелата ). Крышку установили на Э-чип на рамке, что обеспечивало достаточное давление между ПДМС-крышкой и Э-чипом для придания ему герметичности.
Правый и левый края ПДМС-Э-чипа поочередно погружали в раствор образца (100 пкМ раствора ТЬ(Ш)-хелата), и в четырех камерах для образца жидкость под действием капиллярных сил двигалась по впускным каналам (6, на фиг.7). Когда камеры были заполнены, воздух ушел по более тонким каналам к краю ПДМС-крышки (7, фиг.7, на чертеже приведен только один из трех каналов выпуска воздуха в каждой камере).
Таким образом, одна из камер содержала только образец, а другие - образец с добавкой стандартов. Чип инкубировали в течение 8 минут для растворения добавленных стандартов, измерили интенсивность КЭХЛ как в примере 2, за исключением того, что в данном испытании импульсное напряжение было равно -30 В, заряд имульса 20,0 мкК/пульс, а КЭХЛ интегрировали по 1000 циклов возбуждения. Области рабочего электрода в данном чипе были настолько велики, что нужно было переустанавливать чип в измерительной камере для каждого измерения. Фиг. 8 показывает график стандартных добавок в эксперименте.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 .Электрохемилюминесцентное аналитическое устройство, в котором:
- анод и набор катодов, или набор анодов и катод, или набор анодов и катодов объединены на одном несущем основании для электродов чипа, выполненном либо из изолирующего материала, либо частично из проводящего и из изолирующего материала,
-материал рабочих электродов является проводником или высоко примесным полупроводником, которые покрыты сверхтонким (0,5 - 50 нм) электроизолирующим слоем,
- противоположный электрод выполнен из металла путем распыления, или вакуумного испарения, или другой стандартной процедуры металлизации, или печатью проводящей краской, или погружением в проводящую краску,
- рабочие электроды и противоположный электрод снабжены контактными полосками к соответствующим частям чипа, таким как другой конец электродного чипа, или углы чипа, или проходящими через чип, посредством которых электроды могут быть связаны с электронными устройствами возбуждения люминесценции в составе устройства для измерения люминесценции,
- рабочие электроды являются катодом устройства,
- противоположный электрод является анодом устройства,
-во время приложения импульсов возбуждения или после его окончания анализируемый образец излучает люминесценцию со световым потоком, пропорциональным количеству исследуемого аналита.
2. Устройство по п.1, в котором рабочие электроды выполнены из кремния или
алюминия, их поверхности содержат сверхтонкий слой оксида (0,5 - 50 нм), а выделенные
анодные области чипа выполнены путем нанесения на них вначале относительно толстой
изолирующей пленки (толщиной порядка 200 нм или более) с последующим покрытием
проводящей пленкой, полученной вакуумным испарением или напылением
дополнительной металлической пленки, или нанесением проводящей пленки путем
печати, или струйным нанесением проводящей пленки на анодные области устройства.
3. Устройство по п.1, в котором все электроды изготовлены из углеродной пасты, или из серебристой краски или из любой другой проводящей краски, которые далее могут быть покрыты слоем углеродной пасты.
4. Устройство по любому из пп. 1-3, в котором
- на электродах размещена пористая пленка толщиной менее 100 мкм,
- анализируемый образец размещен на пористой пленке/мембране,
- образец и другие реагенты размещены на пористой пленке/мембране и/или на катоде с возможностью взаимодействия друг с другом,
- во время приложения импульсов возбуждения или после его окончания анализируемый образец излучает люминесценцию со световым потоком, пропорциональным количеству исследуемого аналита.
5. Устройство по любому из пп.1-4, в котором
- электродный чип, содержащий катоды, или катод и анод, или аноды, объединенные в полимерном картридже, выполнен с возможностью заполнения полостей картриджа за счет капиллярных сил, давления или всасывания,
- при заполнении полостей чипа образцом или разбавленным образцом обеспечено растворение всех необходимых реагентов, начиная от полости ввода в устройстве,
- во время приложения импульсов возбуждения или после его окончания анализируемый образец излучает люминесценцию со световым потоком, пропорциональным количеству исследуемого аналита..
6. Устройство по любому из пп.1-6, в котором
- электродный чип, содержащий катод (катоды) и анод (аноды), объединенные в пластиковом картридже, выполнен с возможностью заполнения полостей картриджа под действием капиллярных сил, давления или всасывания,
- крышка или верхняя часть картриджа выполнена в форме линзы или такая отъемная линза встроена в крышку или верхнюю часть картриджа, с возможностью объединения световых потоков от набора рабочих электродов и направления света на светочувствительные области детектора,
-при заполнении полостей чипа образцом или разбавленным образцом обеспечено растворение всех необходимых реагентов, начиная от полости ввода в устройстве, -перед возбуждением электролюминесценции полость электродного чипа однократно орошают измерительным буфером,
- во время приложения импульсов возбуждения или после его окончания анализируемый образец излучает люминесценцию со световым потоком, пропорциональным количеству исследуемого аналита.
7. Способ, в котором исследование биологических свойств, такое как исследование
зондов нуклеиновых кислот или иммуннохимический анализ,, проводят на электродах
электродного чипа, в котором области анода и катода выполнены последовательным
наложением слоев проводников, полупроводников и изоляторов на проводящие,
полупроводящие или изолирующие материалы согласно любому из пп.1-5, так что в
результате области анода и катода не имеют электрического контакта между собой и
могут быть использованы для генерирования электрохемилюминесценции, возбуждаемой горячими электронами, или электролюминесценции при раздельном выборе пар электродов в чипе, используемых в процессе электрического возбуждения.
8. Способ, в котором исследование биологических свойств, такое как исследование зондов нуклеиновых кислот или иммуннохимический анализ, проводят на электродных чипах по любому из пп.1-6, и в котором полярность электродов изменяют, по крайне мере, один раз во время возбуждения для использования обоих электродов в качестве анода и катода во время измерения.
9. Способ, в котором исследование биологических свойств, такое как исследование зондов нуклеиновых кислот или иммуннохимический анализ,, проводят на электродных чипах по любому из пп.1-6, и в котором электродный чип либо полностью введен в полимерный картридж, либо только покрыт полимерной крышкой с получением полостей для введения образцов и реагентов и проведения реакций и образованием камеры возбуждения электрохемилюминесценции горячими электронами, с целью возбуждения электрохемилюминесценции маркеров, используемых в исследовании.
10. Способ, в котором исследование биологических свойств, такое как исследование
зондов нуклеиновых кислот или иммуннохимический анализ, проводят на электродном
чипе во влагозащищенной ячейке с помощью размещенной на электродах пористой
пленки/мембраны для добавления реагентов и/или образца, удаления клеток крови и/или
ускорения биохимической реакции, или для упрощения, непосредственно во
влагозащищенной ячейке, без пористой пленки/мембраны.
CRP (нг/мл)
(а)
(б)
TSH, мкМЕ/мл Фиг. 6
WO2011/154591
PCT/FI2011/000033
WO2011/154591
PCT/FI2011/000033
' К ЕА 201300008
Заменяющий лист 24
Фиг. 1 (г)
К ЕА 201300008
Заменяющий лист 27
Фиг. 3
К ЕА 201300008
Заменяющий лист 27
Фиг. 3
К ЕА 201300008
Заменяющий лист 28
Фиг. 5
К ЕА 201300008
Заменяющий лист 28
Фиг. 5
Фиг. 7
К ЕА 201300008
Заменяющий лист 30