(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение предоставляет способы введения фактора IX; способы введения химерных и гибридных полипептидов, содержащих фактор IX; химерные и гибридные полипептиды, содержащие фактор IX; полинуклеотиды, кодирующие такие химерные и гибридные полипептиды; клетки, содержащие такие полинуклеотиды; и способы производства таких химерных и гибридных полипептидов с использованием таких клеток.
Евразийское (21) 201291480 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K39/00 (2006.01)
2013.09.30
(22) Дата подачи заявки 2011.07.11
(54) ФАКТОР IX ПОЛИПЕПТИДЫ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
61/363,064; 61/424,555; 61/430,819; 61/438,572; 61/442,079; 61/470,951
2010.07.09; 2010.12.17; 2011.01.07; 2011.02.01; 2011.02.11; 2011.04.01
PCT/US2011/043569
WO 2012/006624 2012.01.12
2012.08.02
Заявитель:
БАЙОДЖЕН АЙДЕК ХЕМОФИЛИЯ ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Пирс Гленн, Трюкс Саманта, Питерс Роберт Т., Цзян Хайянь (US)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU) (57) Настоящее изобретение предоставляет способы введения фактора IX; способы введения химерных и гибридных полипептидов, содержащих фактор IX; химерные и гибридные полипептиды, содержащие фактор IX; полинуклеотиды, кодирующие такие химерные и гибридные полипептиды; клетки, содержащие такие полинуклеотиды; и способы производства таких химерных и гибридных полипептидов с использованием таких клеток.
ФАКТОР IX ПОЛИПЕПТИДЫ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
Уровень техники изобретения Область изобретения
[01] Настоящее изобретение относится в целом к области терапии гемостатических болезней.
Уровень техники
[02] Гемофилия В (также известная как болезнь Кристмаса) - одна из наиболее распространенных наследуемых болезней крови в мире. Она приводит к уменьшению in vivo и in vitro свертываемости крови и требует постоянного медицинского наблюдения в течение жизни больного. Если отсутствуют внешние повреждения, больные подвержены спонтанному кровотечению в суставах, которое приводит к сильной боли и вредному для здоровья отсутствию подвижности; кровотечению в мышцах, приводящему к аккумуляции крови в этих тканях; спонтанному кровотечению в горле и шее, которое может стать причиной асфиксии при отсутствии немедленного лечения; почечному кровотечению; распространены также тяжелые кровотечения после хирургического вмешательства, незначительных случайных повреждений или удаления зубов.
[03] Нормальная коагуляция крови in vivo требует как минимум сериновых протеаз Факторов II (протромбин), VII, IX, X и XI (растворимых белков плазмы); кофакторов, включающих трансмембранный белковый тканевой фактор и плазматические белковые Факторы V и VIII; фибриноген, трансглютаминазу Фактор XIII, фосфолипид (включая активированные тромбоциты) и кальций. Дополнительные белки, включающие калликреин, кининоген высокого молекулярного веса и Фактор XII требуются в некоторых из тестов свертываемости in vitro, и могут играть роль in vivo при патологических нарушениях.
[04] При гемофилии свертывание крови нарушается из-за отсутствия определенных плазматических факторов свертывания крови. Причиной гемофилии В является дефицит Фактора IX, что может быть результатом как уменьшения синтеза белка Фактора IX, так и дефективной молекулой со сниженной активностью. Лечение гемофилии производится путем замещения отсутствующего фактора свертывания экзогенными концентратами фактора, высоко обогащенными Фактором IX. Однако производство такого концентрата из крови связано с множеством технических трудностей, как описано ниже.
[05] При очистке Фактора IX из плазмы (полученный из плазмы Фактор IX; pdFIX) почти исключительно получается активный Фактор IX. Однако такая очистка фактора IX из плазмы очень трудна, поскольку Фактор IX представлен в плазме только в низкой концентрации (5 мкг/мл. Andersson, Thrombosis Research 7: 451 459 (1975). Кроме того, очистка из крови требует удаления или инактивации инфекционных агентов, таких как ВИЧ и вирус гепатита С. Более того, pdFIX имеет короткий период полувыведения и, следовательно, требует частого дозирования. Рекомбинантный фактор IX (rFIX) также доступен, но имеет такой же короткий период полувыведения и требует такого же частого дозирования (например, 2-3 раза в неделю для профилактики), как и pdFIX. rFIX также обладает более низким увеличением концентрации (К значением) по сравнению с pdFIX, что делает необходимым использование более высоких доз rFIX, чем в случае pdFIX.
[06] Снижение смертности, предотвращение повреждения суставов и улучшенное качество жизни стали важным достижением вследствие разработки полученного из плазмы и рекомбинантного Фактора IX. Пролонгированная защита от кровотечения станет другим значительным прогрессом в лечении пациентов с гемофилией В. Однако на настоящее время не разработано продуктов, которые давали бы пролонгированную защиту. Следовательно, остается потребность в усовершенствованных способах лечения гемофилии, возникшей вследствие недостатка Фактора IX, которые были бы более переносимы и более эффективны, чем существующие терапевтические способы.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[07] Настоящее изобретение предоставляет способы введения Фактора IX с использованием химерных полипептидов, содержащих Фактор IX, и гибридов таких химерных полипептидов; полинуклеотидов. кодирующих такие химерные и гибридные полипептиды; клеток, содержащих такие полинуклеотиды; и способы производства таких химерных и гибридных полипептидов с использованием таких клеток. В некоторых вариантах воплощения Фактор IX химерный полипептид представляет собой Фактор IX FcRn связывающий партнер (BP) химерный полипептид, такой как Фактор IX Fc химерный полипептид. В других вариантах воплощения Фактор IX химерный полипептид представляет собой Фактор IX-XTEN полипептид.
[08] Настоящее изобретение предоставляет способ введения Фактора IX нуждающемуся в этом пациенту, включая введение пациенту дозы не менее, чем около 10, не
менее, чем около 20, или не менее, чем около 25 МЕ/кг Фактора IX FcRn BP химерного полипептида, например, Фактора IX-Fc химерного полипептида или Фактора IX-XTEN химерного полипептида, с интервалом дозирования примерно один раз в неделю или реже.
[09] В некоторых вариантах воплощения концентрация в плазме крови химерного полипептида достигает среднего минимального значения не менее, чем около 1 МЕ/дл после не менее, чем около 6 дней у не менее, чем около 70%, не менее, чем около 80%, не менее, чем около 90%, или около 100% популяции пациентов, или достигает у пациента минимального значения не менее, чем около 1, 2, 3, 4 или 5 МЕ/дл после не менее, чем около 6 дней. В некоторых вариантах воплощения уровень в плазме вышеупомянутого химерного полипептида достигает среднего минимального значения около 1-5 или 1-3 МЕ/дл. Такое минимальное или среднее минимальное значение может быть достигнуто после около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 дней.
[010] В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид имеет сильно редуцированную фосфорилизацию и сульфатацию по сравнению с полученным из плазмы Фактором IX. В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид менее, чем на 25% фосфорилирован и менее, чем на 25% сульфатирован, например, менее, чем на 25% полностью полностью фосфорилирован и сульфатирован. В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид менее, чем на около 10% фосфорилирован и менее, чем на около 9% сульфатирован. В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид имеет паттерн / распределение гамма карбоксилирования, содержание гамма карбоксилирования, паттерн / распределение сиалирования, и / или содержание сиалирования, сходное (то есть в пределах 10%) или равное тому же у Фактора IX Fc химерного полипептида в Примерах 5-6.
[011] В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид имеет увеличение концентрации более, чем 0,7 или более, чем 0,75 мкг/мл (антиген). В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид имеет среднее увеличение концентрации (К-значение) (активность; наблюдаемое) не менее, чем около 0,8, не менее, чем около 0,9, или не менее, чем около 1 МЕ/дл на МЕ/кг.
[012] В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид демонстрирует один или более фармакокинетических параметров, у указанной популяции пациентов или у указанного пациента, выбранного из группы, состоящей из:
[013] (а) средний клиренс (CL) (активность) у указанной популяции пациентов около 3,36 ± 0,93 мл/час/кг; средний клиренс (CL) (активность) у указанной популяции пациентов около 3,0-3,72, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, или 3,72 мл/час/кг; средний клиренс (CL) (активность) у указанной популяции пациентов который в около 2,5 раза ниже, чем клиренс полипептида, содержащего указанный Фактор IX без указанного FcRn BP; клиренс (CL) (активность) у указанного пациента около 1,84 - 4,58 мл/час/кг.
[014] (Ь) среднее среднее время удержания (MRT) (активность) у указанной популяции пациентов не менее, чем около 68,05 ± 11,16 часов; среднее MRT (активность) у указанной популяции пациентов около 60-78, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78 часов; среднее MRT (активность) у указанной популяции пациентов, которое в около 3 раз длиннее, чем среднее MRT полипептида, содержащего указанный Фактор IX без указанного FcRn BP; среднее время удержания (MRT) (активность) у указанного пациента около 53,1 - 85,8 часов; среднее время удержания (MRT) (активность) у указанного пациента не менее, чем около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, или около 90 часов;
[015] (с) среднее ^дбега (активность) у указанной популяции пациентов около 52,5 ± 9,2 часов; среднее tj^eera (активность) у указанной популяции пациентов, которое составляет около 47 - 60 часов, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60 часов; среднее tj/гбета (активность) у указанной популяции пациентов, которое около 3 раз длиннее, чем среднее ti/гбета полипептида, содержащего указанный Фактор IX без указанного FcRn BP; tj/гбета (активность) у указанного пациента около 40 - 67,4, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70 или около 75 часов;
[016] (d) среднее увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемое) у указанной популяции пациентов около 0,93 ± 0,18 МЕ/дл на МЕ/кг; среднее увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемое) у указанной популяции пациентов около 0,85 - 1,0, около 0,85, около 0,86, около 0,87, около 0,88, около 0,89, около 0,90, около 0,91, около 0,92, около 0,93, около 0,94, около 0,95, около 0,96, около 0,97, около 0,98, около 0,99, около 1,0, около 1,05, около 1,10 или около 1,15 МЕ/дл на МЕ/кг; среднее увеличение концентрации (К
значение) (активность; наблюдаемое) у указанной популяции пациентов, которое на около 24% лучше, чем среднее увеличение концентрации полипептида, содержащего указанный Фактор IX без указанного FcRn BP; увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемое) у указанного пациента около 0,62 - 1,17 МЕ/дл на МЕ/кг;
[017] (е) средняя Vss (активность) у указанной популяции пациентов около 226 ± 67,76 (скорректированное до 69,8) мл/кг; средняя Vss (активность) у указанной популяции пациентов около 200 - 300, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290 или около 300 мл/кг; Vss (активность) у указанного пациента около 145 - 365 мл/кг;
[018] (f) средняя AUC/доза (активность) у указанной популяции пациентов около 32,44 ± 10,75 МЕ*ч/дл на МЕ/кг; средняя AUC/доза (активность) у указанной популяции пациентов около 26 - 40, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 МЕ*ч/дл на МЕ/кг; AUC/доза у указанного пациента около 21,80 - 54,30 МЕ*ч/дл на МЕ/кг.
[019] В некоторых вариантах воплощения доза химерного полипептида содержит значительно более низкую (в 10-100 раз) концентрацию (0,01-0,001%) активированного FIX (FIXa), чем в производимых в настоящее время продуктах Фактора IX, таких как MONONINE(tm) (pdFIX; CSL Behring)) или BENEFIX(tm) (Wyeth; rFIX) (0,1%). Такая концентрация может быть в 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз ниже, чем производимых в настоящее время продуктов, или 0,01, 0,05, 0,0033, 0,0025, 0,002, 0,00167, 0,00142, 0,00125, 0,00111 или 0,001%.
[020] В некоторых вариантах воплощения интервал дозирования составляет 6 - 18, 6 - 10, 9 - 18, не менее, чем 6, не менее, чем 7, не менее, чем 8, не менее, чем 9, не менее, чем 10, не менее, чем 11, не менее, чем 12, не менее, чем 13, не менее, чем 14, не менее, чем 15, не менее, чем 16, не менее, чем 17, или не менее, чем 18 дней, еженедельно, два раза в месяц, или один раз в месяц. Интервал дозирования может быть профилактическим интервалом дозирования, фиксированным профилактическим интервалом дозирования или индивидуализированным профилактическим интервалом дозирования.
[021] Способы изобретения применяются к пациенту, нуждающемуся в контроле или предотвращении кровотечения или эпизодов кровотечения, нуждающемуся в интермиттирующей терапии, нуждающемуся в профилактическом лечении или нуждающемуся в лечении при необходимости.
[022] Терапевтические дозы, которые могут быть использованы в способах изобретения, составляют около 25-180, около 20-180, около 20-50, около 20-100, около 10-180, около 10-50, около 10-30 или около 50-100 МЕ/кг. Доза может быть фиксированной дозой или индивидуализированной дозой.
[023] В некоторых вариантах воплощения химерный полипептид вводится внутривенно или подкожно.
[024] Пациентом в способах изобретения может быть человек или не являющееся человеком млекопитающее. Не являющиеся людьми млекопитающие включают мышей, собак, приматов, обезьян, кошек, лошадей, коров, свиней и других домашних животных и маленьких животных.
[025] Химерный полипептид может быть в форме гибрида, содержащего второй полипептид в соединении с указанным химерным полипептидом, при этом указанный второй полипептид содержит или состоит преимущественно из FcRn BP, например, Fc. Химерный полипептид может быть не менее, чем на 90%, не менее, чем на 95% или 100% идентичен последовательности Фактора IX, последовательности Fc или как последовательности Фактора IX, так и последовательности Fc в Таблицах 2А (SEQ ID N0:2) и/или 2В (SEQ ID N0:4), с или без сигнальной последовательностью (ями) и полипептидом.
[026] Химерный полипептид или гибрид может вводиться как часть фармацевтического состава, содержащего не менее чем одно вспомогательное вещество.
[027] Изобретение также предоставляет сами вышеописанные химерные и гибридные полипептиды, полинуклеотиды, их кодирующие, культивируемые человеческие эмбриональные клетки, содержащие полинуклеотиды, и способы производства таких химерных и гибридных полипептидов, и полипептиды, производимые такими способами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ/ФИГУР
[028] ФИГ. 1. Схема одного типа Фактора IX химерного полипептида, Фактора IX-Fc гибрида.
[029] ФИГ. 2. Групповая средняя концентрация FIXFc по сравнению с временными
профилями; сравнение номинальной дозы. [030] ФИГ. 3. Групповая средняя активность FIXFc по сравнению с временными
профилями; сравнение номинальной дозы. [031] ФИГ. 4. Дерево решений вычитания базового уровня.
[032] ФИГ. 5. Дозопропорциональное возрастание Стах и AUC для FIX активности.
[033] ФИГ. 6. Оцененная терапевтическая продолжительность rFIXFc при 50 (А) и 100 (В) МЕ/кг.
[034] ФИГ. 7. Дозопропорциональное возрастание Стах и AUC для FIX антигена.
[035] ФИГ. 8. Фармакокинетические оценки для rFIXFc антигена при 50 (А) и 100 (В) МЕ/кг номинальных дозах.
[036] ФИГ. 9. Точная корреляция между rFIXFc активностью и уровнями антигена. Следует заметить, что вследствие перерасчета РК активности, как обсуждается в Примере 11, R2 = 0,946.
[037] ФИГ. 10. rFIX-Fc доменная структура и пострансляционные модификации. PRO: Пропептид, расщепленный процессирующим ферментом. GLA: содержит 12 у-карбоксилированных остатков глутаминовой кислоты (Gla). ACT PEP: активационный пептид расщепляется для получения активной протеазы. Другие модификации: N- и О- гликозилирование, Asp(64) Р-гидроксилирование, Туг сульфатация, Ser фосфорилирование.
[038] ФИГ. 11. SDS-PAGE гель очистки промежуточных продуктов и очищенного FIXFc мономера. Пробы с различных этапов очистки FIXFc анализировалась с помощью невосстановительного SDS-PAGE. Дорожка 1: Маркеры SeeBlue плюс молекулярного веса (Invitrogen). Дорожка 2: пустая дорожка. Дорожка 3: Белок А загружен. Дорожка 4: Белок А элюат. Дорожка 5: Фрактогель DEAE элюат. Дорожка 6: Q Seph FF элюат. Дорожка 7: конечный объем FIXFc. Дорожка 8: пустая дорожка. Дорожка 9: конечный объем редуцированного FIXFc.
[039] ФИГ. 12. Функциональная активность FIXFc у дефицитных по FIX мышей. Дефицитным по FIX мышам была введена внутривенно доза 219 МЕ/кг FIXFc (3 или 4 на группу, 6 групп, п = 23) или 200 МЕ/кг rFIX (3 или 4 на группу, 5 групп, п = 23) на времени = 0. Пробы крови были собраны в различное время после дозировки (от 0,25 ч до 96 ч) и проанализированы на активность свертывания с использованием анализа FIX активности. * rFIX активность не определялась у всех мышей на временных точках после 48 ч после дозирования.
[040] ФИГ. 13. Время свертывания цельной крови FIXFc по сравнению с рекомбинантным FIX у дефицитных по FIX мышей. Дефицитные по FIX мыши (6 на группу) получили внутривенно дозу 50 МЕ/кг FIXFc или 50 МЕ/кг rFIX. Пробы крови были собраны перед дозированием и на различных временах после дозирования. Пробы крови инкубировались при 37°С и визуально проверялись на присутствие сгустков крови один раз в минуту. Время, необходимое для формирования сгустков крови, отмечалось, и когда активность свертывания
возвращалась к базовому уровню (то есть сгустки не формировались), дополнительные пробы не получали (пробы собирались от 15 мин до 144 ч для FIXFc или от 15 мин до 72 ч для rFIX).
[041] ФИГ. 14. Фармакодинамика FIXFc у дефицитных по FIX мышей. Дефицитным по FIX мышам была введена доза 219 МЕ/кг FIXFc (5 на группу, 6 групп, п = 30) или 200 МЕ/кг rFIX (4 или 5 на группу, 6 групп, п = 28) на День 0, 4 и 8. Пробы плазмы крови были собраны путем пункции сердца на 15 мин и 96 ч после каждой дозы и активность свертывания измерялась с использованием анализа FIX активности. Плазма была также собрана из крови хвоста на 8, 24, 48 и 72 ч после каждой дозы. Уровни FIXFc были подсчитаны во всех пробах с использованием ELISA, специфичного на FIXFc. (А) Измеренная v. Рассчитанная активность. Активность свертывания для FIXFc рассчитывалась с использованием анализа FIX активности на 15 мин и 96 ч после трех доз. Было определено, что активность свертывания in vitro для FIXFc составляла 43,8 ± 5,4 МЕ/мг. Основываясь на этой активности (МЕ/мг) и измеренных уровнях белка, рассчитанный уровень активности свертывания был определен на временных точках 15 мин, 8, 24, 48, 72 и 96 ч после каждой дозы. (В) У дефицитных по FIX мышей, обработанных тремя дозами 200 МЕ/кг rFIX, уровни FIX были рассчитаны с использованием FIX-специфичного ELISA. С использованием измеренных специфичных активностей FIXFc и rFIX, стало возможно сравнить рассчитанную активность свертывания для всех проб, анализированных с помощью ELISA.
[042] ФИГ. 15. Фармакокинетика и фармако динамика FIXFc у дефицитных по FIX собаках. Двум собакам с гемофилией В внутривенно влили 140 МЕ/кг FIXFc. Пробы крови были собраны на 5, 15 и 30 мин, и на 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 27, 30, 48, 51, 54, 72, 80, 96, 126, 144 и 168 ч. (А) Метод сэндвича ELISA с использованием FIX иммобилизированного антитела и Fc-HRP идентифицирующего антитела был использован для измерения концентрации интактного FIXFc в пробах крови собак с гемофилией В. (В) FIX активность свертывания измерялась на всех временных точках по отношению к стандартной кривой, сделанной с FIXFc. (С) Кровь, собранная у животных, немедленно анализировалась на время свертывания цельной крови. Пробы крови инкубировались при 28°С и визуально проверялись на присутствие сгустков крови один раз в минуту, и отмечалось время, за которое формировался сгусток.
[043] ФИГ. 16. Фармакокинетика FIXFc у яванских макак. Макакам была введена однократная доза (0,5, 2 и 10 мг/кг, соответствующая приблизительно 25, 100 или
500 МЕ/кг) FIXFc (n = 2, 3 и 3, соответственно). Пробы крови были собраны на 0,25, 0,5, 1, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144 и 168 ч после дозы и плазма была подготовлена для анализа концентрации белка с помощью FIXFc-специфичного ELISA.
[044] ФИГ. 17. rFIXFc и BENEFIX(tm) показывают сравнимую активность и дозозависимую реакцию в цельной крови из НетВ мышей. (A) ROTEM(r) Параметры. rFIX или BENEFIX(tm) были впрыснуты в кровь НетВ мышей и параметры свертывания измерялись по ROTEM(r). (B)-(D) Дозозависимый ответ, измерение (В) СТ, (С) CFT и (D) Альфа-угол.
[045] ФИГ. 18. Определение эффективности в неотложных случаях в модели отсечения хвоста у мышей с гемофилией.
[046] ФИГ. 19. (А) Потеря крови после отрезания хвоста у отдельных НетВ мышей, обработанных rFIXFc или BENEFIX(tm). (В) Дозозависимая реакция на rFIXFc и BENEFIX(tm) по медианной потере крови после отрезания хвоста у НетВ мышей.
[047] ФИГ. 20. Модель кровотечения при рассечении хвостовой вены (TVT) у НетВ мышей: модель для характеристики венозного кровотечения у пациентов с тяжелой гемофилией.
[048] ФИГ. 21. Пролонгированная активность rFIXFc по сравнению с BENEFIX(tm) в опытных НетВ мышах по цельной крови ROTEM(r). (А) СТ, (В) CFT, (С) Альфа-угол, и (D) частичная корреляция между активностью свертывания цельной крови (СТ) по ROTEM(r) по сравнению с плазматической активность по аРТТ.
[049] ФИГ. 22. Пролонгированная эффективность FIXFc по сравнению с BENEFIX(tm) в модели кровотечения при рассечении хвостовой вены (TVT) у НетВ мышей. (А) Выживаемость: Степени выживаемости сравнивались у мышей, получавших BENEFIX(tm) за 24 часа перед TVT, и у мышей, получавших rFIXFc за 72 часа перед TVT, и (В) Остановка кровотечения: Степени кровотечения сравнивались у мышей, получавших BENEFIX(tm) за 24 часа перед TVT, и у мышей, получавших rFIXFc за 72 часа перед TVT.
[050] ФИГ. 23. Корреляция между повышением концентрации активного rFIXFc по отношению к весу тела у 12 пациентов, которые получали однократную дозу 12,5 -100 МЕ/кг rFIXFc.
[051] ФИГ. 24. Моделирование по методу Монте-Карло с использованием структурной РК модели rFIXFc активности для создания профилей активность-время для достижения минимального уровня 1 МЕ/дл выше базового уровня после еженедельного (А), каждые 10 дней (В) или каждые две недели режима
дозирования (С). Медианные РК параметры популяции и релевантные вариации между пациентами и у одного пациента были взяты из Фазы 1/2а клинического исследования. 1000 пациентов вошли в моделирование на дозовый режим с 14-16 точками взятия проб для каждого пациента, и среднее ± SD профилей активность-время 1000 пациентов было сконструировано графически для различных дозовых режимов.
[052] ФИГ. 25. Моделирование по методу Монте-Карло для rFIXFc доз для достижения минимального уровня 1 МЕ/дл (1%), основанное на пересчитанных фармакокинетических данных. (А) один раз в неделю, (В) каждые 10 дней, и (С) каждые две недели.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[053] Настоящее изобретение предоставляет способ лечения недостатка Фактора IX, например, гемофилии В, Фактором IX, с использованием более длинного интервала дозирования и / или улучшенных фармакокинетических параметров, чем это возможно с известными в настоящее время продуктами с Фактором IX. Настоящее изобретение также предоставляет улучшенные Фактор IX химерные полипептиды, Фактор IX химерные полинуклеотиды и способы производства.
[054] "Введение" при использовании здесь, означает дать фармацевтически приемлемый Фактор IX полипептид изобретения пациенту фармацевтически приемлемым способом. Предпочитаемые способы введения являются внутривенными, например, внутривенная инъекция и внутривенное вливание, например, посредством центрального венозного доступа. Дополнительные способы введения включают подкожное, внутримышечное, пероральное, назальное и пульмонарное введение, предпочтительно подкожное. Фактор IX химерные полипептиды и гибридные белки могут быть введены как часть фармацевтического состава, содержащего не менее, чем одно вспомогательное вещество. Преимущества настоящего изобретения включают: улучшенное соблюдение режима; снижение повреждений из-за кровотечения; повышенную защиту суставов от кровотечений; профилактику повреждения суставов; сниженную болезненность; сниженную смертность; пролонгированную защиту от кровотечения; снижение тромботических случаев; и улучшенное качество жизни.
[055] "Химерный полипептид" при использовании здесь, означает полипептид, который включает в себя не менее чем два полипептида (или их части, такие как субпоследовательности или пептиды) из различных источников. Химерные
полипептиды могут включать два, три, четыре, пять, шесть, семь или более полипептидов или их частей из различных источников, таких как различные гены, различные кДНК или различные животные или другие виды. Химерные полипептиды могут включать один или более линкеров, связывающих различные полипептиды или их части. Таким образом, полипептиды или их части могут быть соединены прямо или они могут быть соединены непрямо, посредством линкеров, или обоими способами, с одним химерным полипептидом. Химерные полипептиды могут включать дополнительные пептиды, такие как сигнальные последовательности и такие последовательности как 6His и FLAG, что способствует очистке или детекции белка. Кроме того, химерные полипептиды могут иметь аминокислотные или пептидные добавки на N- и/или С-конце. Примерами химерных полипептидов изобретения являются Фактор IX-FcRn BP химерные полипептиды, например, Фактор IX-Fc химерные полипептиды, такие как FIXFc на Фигуре 1, SEQ ID N0:2 (Таблица 2) и Примеров 1-4, с или без своей сигнальной последовательности и пропептида. Другие примеры химерных полипептидов изобретения включают, не ограничиваясь тем самым, Фактор IX-XTEN химерные полипептиды. Фактор IX может быть гибридизирован или с N-концом, или с С-концом XTEN. [056] Химерный полипептид может содержать последовательность, не менее чем на 90% или не менее чем на 95% или 100% идентичную Фактору IX и FcRn BP, например, Fc аминокислотную последовательность, показанную в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептидной последовательности (аминокислоты с 1 по 642 из SEQ ID N0:2), или альтернативно, с пропептидной последовательностью, или альтернативно с сигнальной последовательностью и пропептидной последовательностью.
[057] "Культура", "культивировать" и "культивирование" при использовании здесь, означает инкубировать клетки в условиях in vitro, которые дают клеткам возможность расти или делиться или поддерживают клетки в живом состоянии. "Культивируемые клетки" при использовании здесь означает клетки, которые размножаются in vitro.
[058] "Фактор IX" и "FIX" при использовании здесь означает функциональный Фактор IX полипептид в своей нормальной роли в коагуляции, если не указано иное. Таким образом, термин Фактор IX включает различные полипептиды, которые являются функциональными, и полинуклеотиды, которые кодируют такие функциональные варианты полипептидов. Предпочитаемые Фактор IX полипептиды представляют
собой человеческие, бычьи, свиные, собачьи, кошачьи и мышиные Фактор IX полипептиды. Известны полной длины полипептид и полинуклеотидные последовательности Фактора IX, а также многие функциональные варианты, например, фрагменты, мутанты и модифицированные версии. Фактор IX полипептиды включают полной длины Фактор IX, полной длины Фактор IX без Met на N-конце, полной длины Фактор IX без сигнальной последовательности, зрелый Фактор IX (без сигнальной последовательности и пропептида), и зрелый Фактор IX с добавочным Met на N-конце. Фактор IX предпочтительно производится рекомбинантными методами ("рекомбинантный Фактор IX" или "rFIX"), то есть он не является природным или полученным из плазмы крови. [059] Известно очень много функциональных вариантов Фактора IX. Международная публикация номер WO 02/040544 A3, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает мутанты, которые демонстрируют повышенную устойчивость к ингибированию гепарином, на странице 4, строчки 930, и на странице 15, строчки 6-31. Международная публикация номер WO 03/020764 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает мутанты Фактора IX с редуцированной иммуногенностью Т-клеток в Таблицах 2 и 3 (на страницах 14-24), и на странице 12, строчки 1-27. Международная публикация номер WO 2007/149406 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает функциональный мутант Фактора IX молекул, который демонстрирует повышенную белковую стабильность, повышенный период полувыведения in vivo и in vitro и повышенную устойчивость к протеазам от страницы 4, строчка 1 до страницы 19, строчка 11. WO 2007/149406 А2 также раскрывает химерный и другой вариант Фактора IX молекул от страницы 19, строчка 12 до страницы 20, строчка 9. Международная публикация номер WO 08/118507 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает мутанты Фактора IX, которые демонстрируют повышенную активность свертывания крови, от страницы 5, строчка 14 до страницы 6, строчка 5. Международная публикация номер WO 09/051717 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает мутанты Фактора IX, имеющие повышенное число N-связанных и/или О-связанных сайтов гликозилирования, которое приводит к возросшему периоду полувыведения и/или удержания от страницы 9, строчка 11 до страницы 20, строчка 2. Международная публикация номер WO 09/137254 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, также
раскрывает мутанты Фактора IX с повышенным числом сайтов гликозилирования от страницы 2, параграф [006] до страницы 5, параграф [011] и от страницы 16, параграф [044] до страницы 24, параграф [057]. Международная публикация номер WO 09/130198 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает функциональный мутант Фактора IX молекул, который имеет повышенное число сайтов гликозилирования, что приводит к возрастанию периода полувыведения, от страницы 4, строчка 26, до страницы 12, строчка 6. Международная публикация номер WO 09/140015 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, раскрывает функциональные Фактор IX мутанты, которые имеют повышенное количество Cys остатков, что может быть использовано для полимерной (например, PEG) конъюгации, от страницы 11, параграф [0043] до страницы 13, параграф [0053].
[060] Кроме того, сотни нефункциональных мутаций по Фактору IX идентифицированы у пациентов с гемофилией, многие из которых раскрыты в Таблице 1, на страницах 11-14 Международной публикации номер WO 09/137254 А2, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Такие нефункциональные мутации не включены в изобретение, но предоставляют дополнительное руководством к тому, какие мутации с большей или меньшей вероятностью приведут к получению функционального Фактор IX полипептида.
[061] Фактор IX (или Фактор IX часть химерного полипептида) может быть не менее, чем на 90% или не менее, чем на 95% или не менее, чем на 100% идентичен Фактора IX аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептидной последовательности (аминокислоты с 1 по 415 из SEQ ID N0:2), или альтернативно, с пропептидной последовательностью, или с пропептидной и сигнальной последовательностью (полной длины Фактор IX).
[062] Фактора IX коагуляционная активностью выражается в Международных Единицах (ME). Одна ME активности Фактора IX соответствует приблизительно количеству Фактора IX в одном миллилитре нормальной плазмы крови человека. Несколько исследований подходят для измерения активности Фактора IX, включая одностадийное исследование свертываемости крови (активированное частичное тромбопластиновое время; аРТТ), время образования тромбина (TGA) и ротационная тромбоэластография (ROTEM(r)). См., например, Пример 3.
[063] "FcRn связывающий партнер" или "FcRn BP" при использовании здесь, означает связывающие партнеры функционального неонатального Fc рецептора (FcRn), если
не указано другое. FcRn связывающий партнер является любой молекулой, которая может специфично связываться с FcRn рецептором с последующим активным транспортом FcRn рецептором FcRn связывающего партнера. Таким образом, термин FcRn BP включает любые варианты IgG Fc, которые являются функциональными. Например, область Fc части IgG, которая связывается с FcRn рецептором, описана на основе рентгеноструктурной кристаллографии (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379, включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки). Главный контактный участок Fc с FcRn находится рядом с соединением СН2 и СНЗ доменов. Fc-FcRn контакты все находятся внутри одной Ig тяжелой цепи. FcRn BPs включает целый IgG, Fc фрагмент IgG, и другие фрагменты IgG, которые включают полный связывающий регион FcRn. Главные контактные сайты включают аминокислотные остатки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 СН2 домена и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433436 СНЗ домена. Все упоминания аминокислотной нумерации иммуноглобулинов или фрагментов иммуноглобулинов, или участков, основаны на Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda; MD, включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. (FcRn рецептор выделен из нескольких видов млекопитающих, включая человека. Известны последовательности человеческих FcRn, крысиных FcRn и мышиных FcRn (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180: 2377), включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.) FcRn BP может содержать СН2 и СНЗ домены иммуноглобулинов, имеющие или не имеющие петлевые участки иммуноглобулина. Приведенные в качестве примера FcRn BP варианты предоставлены в WO 2004/101740 и WO 2006/074199, которые включены в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. [064] FcRn BP также включает альбумин и его фрагменты, которые связываются с FcRn. Предпочтительно альбумин представляет собой альбумин человека. Фактор IX может быть соединен или с N-концом альбумина или с С-концом альбумина, при условии, что Фактора IX компонент Фактор ГХ-альбумин гибридного белка может процессироваться ферментативно активной пропротеинконвертазой для получения процессированного Фактор ГХ-содержащего полипептида. Примеры альбумина, например, его фрагменты, которые можно использовать в настоящем изобретении, известны, например, Патент США No. 7,592,010; Патент США No. 6,686,179; и Schulte, Thrombosis Res. 124 Suppl. 2:S6-S8 (2009), каждый из которых включен в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
[065] FcRn BP (или участок FcRn BP в химерном полипептиде) может содержать одну или более мутаций, и комбинаций мутаций.
[066] FcRn BP ((или участок FcRn BP в химерном полипептиде) может содержать мутации, дающие увеличенный период полураспада, такие как M252Y, S254T, Т256Е и их комбинации, как раскрыто у Oganesyan et al., Mol. Immunol. 46:1750 (2009), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; Н433К, N434F и их комбинации, как раскрыто у Vaccaro et al., Nat. Biotechnol. 23:1283 (2005), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; мутанты раскрыты на страницах 1-2, параграф [0012], и в Примерах 9 и 10 США 2009/0264627 А1, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; и мутанты раскрыты на странице 2, параграфы с [0014] по [0021] из США 20090163699 А1, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
[067] FcRn BP (или участок FcRn BP в химерном полипептиде) также может включать следующие мутации: Fc регион IgG может быть модифицирован в соответствии с хорошо известными процедурами, такими как сайт-направленный мутагенез и тому подобными для получения модифицированных IgG или Fc фрагментов или их частей, которые будут связываться с FcRn. Такие модификации включают модификации, далекие от контактирующих с FcRn сайтов, а также модификации внутри контактирующих сайтов, которые сохраняют или даже усиливают связывание с FcRn. Например, следующие одиночные аминокислотные остатки в человеческом IgGl Fc (Fcyl) могут быть замещены без значительной потери Fc связывающей аффинности к FcRn: Р238А, S239A, К246А, К248А, D249A, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, D265A, S267A, Н268А, Е269А, D270A, Е272А, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, Е283А, Н285А, N286A, Т289А, К290А, R292A, Е293А, Е294А, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, Т307А, L309A, Q311A, D312A, N315A, К317А, Е318А, К320А, К322А, S324A, К326А, A327Q, Р329А, A330Q, A330S, Р331А, P331S, ЕЗЗЗА, К334А, Т335А, S337A, К338А, К340А, Q342A, R344A, Е345А, Q347A, R355A, Е356А, М358А, Т359А, К360А, N361A, Q362A, Y373A, S375A D376A, A378Q, Е380А, Е382А, S383A, N384A, Q386A, Е388А, N389A, N390A, Y391F, К392А, L398A, S400A, D401A, D413A, К414А, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, Е430А, N434A, Т437А, Q438A, К439А, S440A, S444A и К447А, где например Р238А представляет дикий тип пролина, замещенный аланином в позиции номер 238. В добавление к аланину, другие аминокислоты могут быть замещены диким типом
аминокислот в позициях, обозначенных выше. Мутации могут быть внедрены однократно в Fc, давая начало более, чем одной сотне FcRn связывающих партнеров, отличающихся от нативного Fc. Кроме того, комбинации двух, трех или более из этих индивидуальных мутаций могут быть введены вместе, давая начало еще сотням FcRn связывающих партнеров. Некоторые из этих мутаций могут давать новую функциональность относительно FcRn связывающего партнера. Например, один вариант воплощения включает N297A, удаляя высококонсервативный сайт N-гликозилирования. Действие этой мутации уменьшает иммуногенность, тем самым усиливая циркулирующий полупериод FcRn связывающего партнера, и возмещая неспособность FcRn связывающего партнера связываться с FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB и FcyRIIIA, без мешающей аффинности к FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки). Кроме того, не менее, чем три человеческих Fc гамма рецептора, по-видимому, распознают сайт связывания IgG внутри нижнего петлевого участка, обычно аминокислоты 234-237. Следовательно, другой пример новой функциональности и потенциально сниженной иммуногенности может стать результатом мутаций в этом участке, как, например, путем замещения аминокислот 233-236 человеческого IgGl "ELLG" на соответствующую последовательность из IgG2 "PVA" (с одной аминокислотной делецией). Показано, что FcyRI, FcyRII и FcyRIII, которые опосредуют различные эффекторные функции, не будут связываться с IgGl, если интродуцированы такие мутации. (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки; и Armour et al.1999, Eur. J. Immunol. 29:2613, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки). Как дальнейший пример новой функциональности, возникающей вследствие мутаций, описанных выше, аффинность к FcRn может быть повышена более, чем у дикого типа в некоторых случаях. Эта повышенная аффинность может отражать повышенную степень "включения", сниженную степень "выключения" или как повышенную степень "включения", так и пониженную степень "выключения". Считается, что мутации придают повышенную аффинность FcRn, включая Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et
al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки).
[068] The FcRn BP (или участок FcRn BP в химерном полипептиде) может быть не менее, чем на 90% или не менее, чем на 95% или на 100% идентичен Fc аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А или В без сигнальной последовательности (аминокислоты от 1 до 227 из SEQ ID N0:2), или альтернативно, с сигнальной последовательностью.
[069] "Гибридные" полипептиды и белки, при использовании здесь, означает комбинацию химерного полипептида со вторым полипептидом. Химерный полипептид и второй полипептид в гибриде могут быть связаны друг с другом посредством нековалентных взаимодействий белок-белок, таких как цепь-цепь или гидрофобные взаимодействия. Химерный полипептид и второй полипептид в гибриде могут быть связаны друг с другом через ковалентную связь(и), такие как дисульфидные связи. Химерный полипептид и второй полипептид в гибриде могут быть связаны друг с другом посредством более, чем одного типа связи, таких как нековалентные и дисульфидные связи. Гибриды описаны в WO 2004/101740, WO2005/001025, US Pat. No. 7,404,956, US Pat. No. 7,348,004 и WO 2006/074199, каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Второй полипептид может быть второй копией того же химерного полипептида или может быть неидентичным химерным полипептидом. В предпочитаемых вариантах воплощения второй полипептид представляет собой полипептид, содержащий FcRn BP, например, Fc. В предпочитаемых вариантах воплощения химерный полипептид представляет собой Фактор IX-FcRn BP, например, Фактор IX-Fc химерный полипептид, а второй полипептид состоит полностью из Fc. См., например, Фигуру 1, Примеры 1-3 и Таблицу 2 (SEQ ID NOs:2 и 4). См., например, US 7404956, которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
[070] Второй полипептид в гибриде содержит или полностью состоит из последовательности, не менее, чем на 90% или не менее, чем на 95% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В без сигнальной последовательности (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID N0:4), или альтернативно, с сигнальной последовательностью.
[071] Полипептид настоящего изобретения также включает Фактор IX, гибридизированный с одним или более XTEN полипептидами. Schellenburger et al., Nat. Biotech. 27:1186-90 (2009), которая включена в настоящую заявку во всей
полноте посредством ссылки. Фактор IX может быть гибридизирован или с N-концом XTEN полипептида, или с С-концом XTEN полипептида. XTEN полипептиды включают, но не ограничиваясь тем самым, полипептиды, раскрытые в WO 2009/023270, WO 2010/091122, WO 2007/103515, US 2010/0189682, и US 2009/0092582, каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
[072] "Интервал дозирования" при использовании здесь означает количество времени, которое проходит между повторными дозами, вводимыми пациенту. Интервал дозирования в способах изобретения, использующих химерный FIX-FcRn BP, например, химерный FIX-Fc, может быть не менее, чем от полутора до восьми раз длиннее, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентного количества (в МЕ/кг) указанного Фактора IX без FcRn BP, например, Fc части (то есть полипептида, состоящего из указанного FIX). Интервал дозирования при введении, например, Фактора IX-Fc химерного полипептида (или гибрида) изобретения может быть не менее, чем в полтора раза длиннее, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентного количества указанного Фактора IX без FcRn BP, например, Fc, portion (то есть полипептида, состоящего из указанного Фактора IX). Интервал дозирования может быть не менее чем от полутора до восьми раз длиннее, чем интервал дозирования, требуемый для эквивалентного количества указанного Фактора IX без, например, Fc части (или полипептида, состоящего из указанного Фактора IX).
[073] В некоторых вариантах воплощения интервал дозирования составляет 6-18, 6-10, 918, не менее, чем 6, не менее, чем 7, не менее чем 8, не менее, чем 9, не менее, чем 10, не менее, чем 11, не менее, чем 12, не менее, чем 13, не менее, чем 14, не менее, чем 15, не менее, чем 16, не менее, чем 17 или не менее, чем 18 дней. Интервал дозирования может быть не менее, чем около одного раза в неделю, и может составлять 6-10 дней, например, около 7-10, около 7-9, около 7-8, около 8-10, около 9-10, около 6-7, около 8-9, около 6, около 7, около 8, около 9, или около 10 дней.
[074] Интервал дозирования может составлять 9-18 дней, например, около 9-17, около 916, около 9-15, около 9-14, около 9-13, около 9-12, около 9-11, около 9-10 дней, около 10-18, около 11-18, около 12-18, около 13-18, около 14-18, около 15-18, около 16-18, около 17-18 дней, около 10-11, около 11-12, около 12-13, около 13-14, около 14-15, около 15-16, и около 16-17 дней, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, или около 18 дней. Интервал дозирования может составлять около 10-14 дней. Интервал дозирования может
составлять примерно каждые две недели или два раза в месяц. Интервал дозирования может составлять более, чем 18 дней, например, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39, или около 40 дней. Интервал дозирования может быть фиксированным интервалом, например, 7 дней для 25-50 МЕ/кг, 10-13 дней для 50-100 МЕ/кг или 14 дней для 100-150 МЕ/кг. Фиксированный интервал и доза определяются так, что комбинация интервала и дозы будут приводить к минимальному уровню не менее, чем около 1-5 или не менее, чем около 1-3, или не менее, чем около 1, не менее, чем около 2, или не менее, чем около 3 МЕ/дл FIX активности в популяции пациентов или у отдельного пациента. Фиксированный интервал дозирования может также составлять 7 дней для 20-50 МЕ/кг, 10-14 дней для 50-100 МЕ/кг, 14-16 дней для 100-150 МЕ/кг, 7 дней для 10-50 МЕ/кг, 10-13 дней для 15-100 МЕ/кг, или 14-15 дней для 50-150 МЕ/кг. Фиксированный интервал дозирования может также составлять 7 дней для 10-30 МЕ/кг, 10 дней для 15-50 МЕ/кг, 11 дней для 20-70 МЕ/кг, 12 дней для 25-85 МЕ/кг, 13 дней для от 30 до 100 МЕ/кг, 14 дней для от 40 до 125 МЕ/кг и 15 дней для 50-150 МЕ/кг.
[075] В предпочитаемых вариантах воплощения интервал дозирования составляет 20 МЕ/кг один раз в неделю, 40 МЕ/кг каждые 10 дней или 100 МЕ/кг каждые две недели (два раза в месяц).
[076] Интервал дозирования может, альтернативно, быть индивидуализированным интервалом, который определен для каждого пациента на основании фармакокинетических данных или другой информации об этом пациенте. Комбинация индивидуализированной дозы/интервала дозирования может быть такой же, как для заданных интервальных режимов в предшествующих параграфах, или может отличаться, как проиллюстрировано в Примерах. Режим может первоначально быть с фиксированным интервалом дозирования, и потом может измениться на индивидуализированный интервал дозирования.
[077] "Лечение по необходимости" при использовании здесь означает лечение,
которое предназначено для применения в течение короткого времени и соответствует существующему состоянию, такому как эпизод кровотечения, или выявленная кратковременная необходимость, такая как планируемое хирургическое вмешательство. Состояния, которые могут требовать лечения по необходимости, включают эпизод кровотечения, гемартроз, мышечное кровотечение, ротовое кровотечение, геморрагию, кровоизлияние в мышцу,
ротовое кровоизлияние, травму, травму головы, желудочно-кишечное кровотечение, внутричерепное кровоизлияние, внутрибрюшинное кровоизлияние, внутригрудное кровоизлияние, перелом кости, кровотечение центральной нервной системы, кровотечение в заглоточном пространстве, кровотечение в забрюшинном пространстве или кровотечение во влагалище подвздошно-поясничной мышцы. Прочие эпизоды кровотечения также включены. Пациент может нуждаться в оперативной профилактике, периоперативном уходе или подготовке к операции. Такие операции включают малое хирургическое вмешательство, большое хирургическое вмешательство, удаление зуба, тонзиллэктомию, другие стоматологические/грудные и лицевые операции, сечение паховой грыжи, синовэктомию, полную замену коленного сустава, замену других суставов, краниотомию, остеосинтез, травматическую хирургию, внутричерепные операции, внутрибрюшные операции, внутригрудные операции. Прочие операции также включены. Дополнительные состояния, которые могут требовать лечения по необходимости, включают перечисленные в Таблице 26. [078] Дополнительные состояния, которые могут требовать лечения по необходимости, включают малое кровоизлияние, гемартроз, поверхностное мышечное кровоизлияние, кровоизлияние в мягкие ткани, среднее кровоизлияние, внутримышечное кровоизлияние или кровоизлияние в мягкие ткани с расслоением, кровоизлияние в слизистые, гематурию, сильное кровоизлияние, глоточное кровоизлияние, заглоточное кровоизлияние, забрюшинное кровоизлияние, кровоизлияние центральной нервной системы, ушибы, порезы, царапины, суставное кровоизлияние, носовое кровотечение, ротовое кровотечение, кровотечение из десен, внутричерепное кровотечение, внутрибрюшинное кровотечение, малое спонтанное кровоизлияние, кровотечение после серьезной травмы, средний кожный кровоподтек или спонтанное кровоизлияние в суставы, мышцы, внутренние органы либо в мозг. Дополнительные причины для лечения по необходимости включают необходимость в периоперативном уходе при хирургическом вмешательстве или удалении зуба, большое хирургическое вмешательство, обширные операции в полости рта, урологические операции, операции на грыже, ортопедические операции, такие как замена коленного, тазобедренного или любого другого основного сустава.
[079] Аббревиатуры:
AUCINF Площадь под кривой концентрация-время от нуля до бесконечности
AUCa Площадь под кривой концентрация-время над фазой распределения
AUCP Площадь под кривой концентрация-время над фазой выведения
Альфа HL Полупериод фазы распределения
Бета HL Полупериод фазы выведения; также обозначается как tm
С168 Оцененная FIXFc активность выше базовой через примерно 168 ч
после дозы
Стах Максимальная концентрация, присутствующая на Ттах
CV% Процент коэффициента вариации
О Клиренс
IVR in vivo увеличение концентрации (%)
К-значение Увеличение концентрации
MRT Среднее время удержания
N Номер
NC Не рассчитывалось
NR Не сообщалось
SD Стандартное отклонение
SE Стандартная ошибка
TBLP1 Модель-прогнозированное время после дозы, когда FIXFc активность
уменьшается до примерно 1 МЕ/дл выше базового уровня
TBLP3 Модель-прогнозированное время после дозы, когда FIXFc активность
уменьшается до примерно 3 МЕ/дл выше базового уровня
TBLP5 Модель-прогнозированное время после дозы, когда FIXFc активность
уменьшается до примерно 5 МЕ/дл выше базового уровня
Vss Объем распределения на стационарной фазе
Vi Объем распределения в центральном компартменте
[080] Фармакокинетические (РК) параметры включают вышеуказанные термины
и следующие термины, которые имеют свое обычное значение в данной области техники, если не указано иное. Некоторые из терминов более детально объясняются в Примерах. РК параметры могут основываться на уровне FIX антигена (часто обозначенном в настоящей заявке в скобках как "антиген") или уровень FIX активности (часто обозначенном в настоящей заявке в скобках как "активность"). В литературе РК параметры часто основываются на уровне FIX активности из-за присутствия в плазме некоторых пациентов эндогенных
неактивных FIX, которые служат помехой возможности оценить введенный (т.е. экзогенный) FIX, используя антитело к FIX. Однако когда FIX вводится как часть гибридного белка, содержащего гетерологичный пептид, такой как FcRn BP, вводимый (то есть экзогенный) FIX антиген может быть точно измерен с использованием антитела к гетерологичному полипептиду. Кроме того, определенные РК параметры могут быть основаны на прогнозируемых данных (часто обозначамых в настоящей заявке в скобках как "модель-прогнозируемые") или на наблюдаемых данных (часто обозначаемых в настоящей заявке в скобках как "наблюдаемое"), и предпочтительно основанные на наблюдаемых данных.
[081] "Базовый" при использовании здесь означает самый низкий подсчитанный уровень Фактора IX в плазме крови у пациента перед введением дозы. В впервые проведенном на человеке исследовании, описанном в Примере 1, уровни Фактора IX в плазме были подсчитаны на двух временных точках перед дозированием: на скрининговом визите и непосредственно перед дозированием. Предозовые времена рассматривались как ноль (базовый уровень) для целей вычислений, то есть для получения данных "с вычетом базового уровня". См., например, Фигуру 4. Альтернативно, (а) базовый уровень у пациентов, чья FIX активность <1%, которые не имеют детектируемый FIX антиген и имеют нонсенс генотипы, определяется как 0%, (Ь) базовый уровень у пациентов с FIX активностью перед лечением <1%, которые имеют детектируемый FIX антиген, установлен на 0,5%, (с) базовый уровень у пациентов, чья FIX активность перед лечением между 1 - 2% - Cmin (самая низая активность в ходе РК исследования), и (d) базовый уровень у пациентов, чья FIX активность перед лечением > 2% - 2%. Активность выше базового уровня перед дозированием рассматривается как остаточное лекарство от предыдущего лечения и сводится к базовому уровню и вычитается из РК данных после rFIXFc дозирования. См. Пример 11.
[082] "Площадь под кривой плазматическая концентрация по отношению к времени" ("AUC"), которая, при использовании здесь, основывается на скорости и протяженности элиминации Фактора IX после введения. AUC определяется на определенном временном периоде, таком как 12, 18, 24, 36, 48 или 72 часов, или для бесконечности с использованием экстраполяции, основанной на угле наклона кривой. Если здесь не указано иное, AUC определяется для бесконечности (AUCINF)- AUC также может быть подсчитано на основании дозы. Как со многими другими РК параметрами, определение AUC может быть проведено на одном пациенте или на популяции пациентов, по которой подсчитано среднее. В Примере
-231 среднее AUC/доза в популяции пациентов было 32,44 МЕ*ч/дл на МЕ/кг и диапазон для отдельных пациентов составлял 21,80-54,30 МЕ*ч/дл на МЕ/кг. (См. Таблицу 13 для средней AUC/доза, основанной на активности.) Следовательно, среднее AUC/доза в популяции пациентов может быть около 26-40, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 МЕ*ч/для МЕ/кг. См. Таблицу 14 для AUC/дозы и других AUC параметров, основанных на антигене.
[083] "In vivo увеличение концентрации" ("IVR") представлено нарастающим увеличением концентрации (К-значение), которое означает наблюдаемый пик активности минус предозовый уровень, разделенные на дозу. IVR также может быть рассчитано на основе процентов, как описано в Примерах. Для ясности, в настоящей заявке используются единицы (К-значение или МЕ/дл на МЕ/кг по отношению к %). Среднее IVR можно определить в популяции пациентов, или индивидуальное IVR можно определить у отдельного пациента. FIXFc, использованное в впервые проведенном на человеке исследовании, описанном в Примере 1, выражало среднее IVR около 0,93 МЕ/дл на МЕ/кг в популяции пациентов; и IVR у каждого пациента, которое варьировало от 0,62 до 1,17 МЕ/дл на МЕ/кг (Таблица 13). Следовательно, химерный полипептид изобретения выражает среднее IVR в популяции пациентов 0,85-1,15 (например, около 0,85, около 0,86, около 0,87, около 0,88, около 0,89, около 0,90, около 0,91, около 0,92, около 0,93, около 0,94, около 0,95, около 0,96, около 0,97, около 0,98, около 0,99, около 1,0, около 1,05, около 1,10, около 1,15) и IVR у пациента не менее чем около 0,6, около 0,7, 0,8, около 0,9, около 1,0, около 1,1, или около 1,2 МЕ/дл на МЕ/кг.
[084] "Скорость клиренса" ("CL") при использовании здесь означает оценку способности организма элиминировать лекарство, и выражается как объем плазмы, свободной от лекарства, по прошествии времени. FIXFc, использованный в исследовании, описанном в Примере 1, демонстрировал средний CL около 3,36 мл/час/кг (см. Таблицу 13), который в около 2,5 раза ниже, чем CL (8,2 мл/час/кг) полипептида, состоящего из Фактора IX (BENEFIX(tm)); диапазон CL значений у отдельных пациентов составлял 1,84-4,58 мл/ч/кг. Следовательно, химерный полипептид изобретения демонстрирует средний CL в популяции 3,0-3,72, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7 или 3,72 мл/час/кг Для CL, основанного на антигене, см. Таблицу 14.
[085] "Среднее время выведения" ("MRT") при использовании здесь означает измерение среднего времени существования лекарственных молекул в организме. FIXFc, использованный в исследовании, описанном в Примере 1, демонстрировал средний
MRT около 68,05 часов (см. Таблицу 13); диапазон MRT значений составлял 53,185,8 часов у отдельных пациентов. Следовательно, химерный полипептид изобретения демонстрирует среднее MRT в популяции 60-78, около 60, около 62, около 64, около 66, около 68, около 70, около 72, около 74, около 76, или около 78 часов и MRT у пациента не менее чем около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, или около 90 часов. Для MRT, основанной на антигене, см. Таблицу 14. [086] 'Чугр" или tj/2 beta" или "Beta HL," при использовании здесь, означает полупериод, связанный с фазой элиминации, 1!/2р=(1п2)/константа скорости элиминации, связанная с терминальной фазой. В исследовании, описанном в Примере 1, использованный FIXFc показывал среднее tj/2Z в популяции пациентов, которое составляло около 52,5 часов (см. Таблицу 13) и диапазон tj/гр значений у отдельных пациентов составлял 47-60 часов. Следовательно, химерный полипептид изобретения выражает среднее t1/2p более чем около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59 или около 60 часов. Для ti/гр основанного на антигене, см. Таблицу 14.
[087] "Минимальный уровень" при использовании здесь означает самый низкий уровень активности Фактора IX в плазме, достигнутый после введения дозы химерного полипептида изобретения или другой молекулы Фактора IX и до введения следующей дозы, если оно будет. Минимальный уровень в настоящей заявке используется взаимозаменяемо с "пороговой величиной". Базовые уровни Фактора IX вычитаются из измеренных уровней Фактора IX для расчета минимального уровня. В некоторых вариантах воплощения минимальный уровень составляет 1-5 или 1-3 МЕ/дл после около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13 или около 14 дней. В некоторых вариантах воплощения уровень химерного полипептида в плазме достигает среднего минимального уровня не менее, чем около 1 МЕ/дл после не менее, чем около 6 дней у не менее, чем около 70%, не менее, чем около 80%, не менее, чем около 90%, или около 100% популяции пациентов или достигает минимального уровня не менее, чем около 1, 2, 3, 4, или 5 МЕ/дл после не менее, чем около 6 дней у пациента. В некоторых вариантах воплощения уровень вышеупомянутого химерного полипептида в плазме достигает среднего минимального уровня около 1-5 или 1-3 МЕ/дл. Такой минимальный уровень или средний минимальный уровень может быть достигнут после около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13,
около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19, около 20, около 21, около 22, около 23, около 24, около 25, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39, или около 40 дней.
[088] "Объем распределения на стационарной фазе (Vss)" при использовании здесь обозначает видимое пространство (объем), в котором распределяется лекарство. Vss = количество лекарства в теле разделенное на концентрацию в плазме на стационарной фазе. В Примере 1 средний Vss, обнаруженный в популяции, составлял около 226 мл/кг, и диапазон у пациентов составлял около 145-365 мл/кг. (См. Таблицу 13.) Таким образом, средний Vss у популяци пациентов может составлять 200-300, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290 или около 300 мл/кг. Vss у отдельных пациентов может составлять около 145, около 150, около 160, около 170, около 180, около 190, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290, около 300, около 310, около 320, около 330, около 340, около 350, около 360 или около 370 мл/кг. Vss, основанный на антигене, см. в Таблице 14.
[089] "Полипептид", "пептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к полимерному соединению, содержащему ковалентно связанные аминокислотные остатки.
[090] "Полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются взаимозаменяемо и относятся к полимерному соединению, содержащему ковалентно связанные нуклеотидные остатки. Полинуклеотиды могут быть ДНК, кДНК, РНК, однонитевыми или двунитевыми. векторами, плазмидами, фагами или вирусами. Полинуклеотиды включают указанные в Таблице 1, которые кодируют полипептиды Таблицы 2 (см. Таблицу 1). Полинуклеотиды также включают фрагменты полинуклеотидов Таблицы 1, например, те, которые кодируют фрагменты полипептидов из Таблицы 2, такие как Фактор IX, Fc, сигнальную последовательность, пропептид, 6His и другие фрагменты полипептидов Таблицы 2.
[091] "Профилактическое лечение" при использовании здесь означает введение Фактора IX полипептида в многократных дозах пациенту временными курсами для повышения уровня активности Фактора IX в плазме крови пациента. Предпочтительно, возросший уровень достаточен для снижения частоты случаев спонтанного кровотечения или предотвращения кровотечения в случае
неожиданного повреждения. Профилактическое лечение уменьшает или предотвращает эпизоды кровотечения, например, те, которые описаны ниже при лечении по необходимости. Профилактическое лечение может быть заданным или может быть индивидуализированным, как обсуждается ниже при "интервале дозирования", например, для компенсации вариабельности между пациентами.
[092] "Пациент" при использовании здесь означает человека или не являющееся человеком млекопитающее. Не являющиеся человеком млекопитающие включают мышей, собак, приматов, обезьян, кошек, лошадей, коров, свиней и других домашних животных и мелких животных. Пациенты также включают педиатрических пациентов, являющихся людьми. Педиатрические пациенты, являющиеся людьми, имеют возраст до 20 лет, предпочтительно до 18 лет, до 16 лет, до 15 лет, до 12 лет, до 11 лет, до 6 лет, до 5 лет, до 2 лет, и от 2 до 11 лет.
[093] Способы изобретения могут практиковаться на пациенте, нуждающемся в контроле или предотвращении кровотечения или эпизодов кровотечения. Такие пациенты включают тех, которые нуждаются в контроле или предотвращении кровотечения при малом кровоизлиянии, гемартрозе, поверхностном мышечном кровоизлиянии, среднем кровоизлиянии, внутримышечном кровоизлиянии или кровоизлиянии в мягкие ткани с расслоением, кровоизлиянии в слизистые, гематурии, сильном кровоизлиянии, глоточном кровоизлиянии, заглоточном кровоизлиянии, забрюшинном кровоизлиянии, кровоизлиянии центральной нервной системы, ушибах, порезах, царапинах, суставном кровоизлиянии, носовом кровотечении, ротовом кровотечении, кровотечении из десен, внутричерепном кровотечении, внутрибрюшинном кровотечении, малом спонтанном кровоизлиянии, кровотечении после серьезной травмы, среднем кожном кровоподтеке или спонтанном кровоизлиянии в суставы, мышцы, внутренние органы либо в мозг. Такие пациенты также включают тех, которые нуждаются в периоперативном уходе, таком как уход при кровотечении, связанном с хирургической операцией или удалением зуба.
[094] "Терапевтическая доза" при использовании здесь означает дозу, посредством которой достигается терапевтическая цель, как описано здесь. Расчет требуемой дозировки полученного из плазмы крови Фактора IX (pdFIX) основывается на эмпирических наблюдениях, что, в среднем, 1 ME pdFIX на кг веса тела повышает активность плазматического Фактора IX приблизительно на 1 МЕ/дл (1%). На этой основе требуемая дозировка определяется с использованием следующей формулы:
Требуемые единицы = вес тела (кг) х желаемое повышение Фактора IX (МЕ/дл или % от нормы) х 1 (МЕ/кг на МЕ/дл)
[095] Поскольку FIXFc, например, как описано в Примерах и на Фигуре 1, имеет повышение концентрации такое же, как у pdFIX (отличающееся от такового у BENEFIX(tm)), требуемая доза определяется по формуле выше, или слегка подгоняется. См. также в Таблице 26 особые рекомендованные дозы для различных вариантов лечения по требованию. Для педиатрических пациентов, использующих pdFIX, руководство по дозировке такое же, как для взрослых. Однако педиатрические пациенты могут иметь более долгое повышение концентрации, и следовательно дозировку может быть необходимо в соответствии с этим изменять.
[096] Терапевтические дозы, которые могут быть использованы в способах изобретения, составляют 10-180, 20-180 или 25-180 МЕ/кг, более определенно, предпочитаемые дозы для 6-10 дневного интервала дозирования являются следующими: около 25110, около 30-110, около 40-110, около 50-110, около 60-110, около 70-110, около 80-110, около 90-110 и около 100-110; около 30-100, около 30-90, около 30-80, около 30-70, около 30-60, около 30-50, около 30-40 МЕ/кг; около 40-110, около 50100, около 60-90 и около 70-80 МЕ/кг; около 40-50, около 50-60, около 60-70, около 70-80, около 80-90, около 90-100 и около 100-110 МЕ/кг; около 25, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 105 и около ПО МЕ/кг. 610 дневный интервал дозирования включает недельный интервал дозирования. Дополнительные терапевтические дозы для 6-10 дневного, например, недельного интервала дозирования, включают 20-50, 20-100 и 20-180 МЕ/кг, более определенно, предпочитаемые дозы для 6-10 дневного, например, недельного интервала дозирования являются следующими: около 20-110, около 20-100, около 20-90, около 20-80, около 20-70, около 20-60, около 20-50, около 20-40, около 2030, около 20-40 и около 20 МЕ/кг. См. также Примеры 10 и 11. Дозы могут быть ниже, чем 20 МЕ/кг, если это эффективно для данного пациента, например, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18 или около 19 МЕ/кг.
[097] Предпочитаемые терапевтические дозы для 9-18 дневного, например, два раза в месяц, интервала дозирования являются следующими: около 50-180, около 60-180, около 70-180, около 80-180, около 90-180, около 100-180, около 110-180, около 120-
-28180, около 130-180, около 140-180, около 150-180, около 160-180 и около 170-180 МЕ/кг; около 90-170, около 90-160, около 90-150, около 90-140, около 90-130, около 90-120, около 90-110 и около 90-100 МЕ/кг; около 100-170, около 110-160, около 120-150, и около 130-140 МЕ/кг; около 90-100, около 100-110, около 110-120, около 120-130, около 130-140, около 140-150, около 150-160 и около 160-170 МЕ/кг; около 60, около 70, около 80, около 90, около 95, около 100, около 105, около ПО, около 115, около 120, около 125, около 130, около 135, около 140, около 145, около 150, около 155, около 160, около 165, около 170, около 175 и около 180 МЕ/кг. См. также Примеры 10 и П.
[098] Предпочитаемые терапевтические дозы составляют 10-50, 15-100, 20-100, 20-50, 50-100, 10, 20, 40, 50 и 100 МЕ/кг.
[099] Терапевтическая доза может составлять около 20-50, около 20-100, около 20-180, 25-110, около 30-110, около 40-110, около 50-110, около 60-110, около 70-110, около 80-110, около 90-110, около 100-110, около 30-100, около 30-90, около 30-80, около 30-70, около 30-60, около 30-50, около 30-40 МЕ/кг, около 40-110, около 50100, около 60-90, около 70-80 МЕ/кг, около 40-50, около 50-60, около 60-70, около 70-80, около 80-90, около 90-100, около 100-110 МЕ/кг, около 20, около 25, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 105 и около ПО МЕ/кг. Такие дозы предпочтительны для интервалов дозирования около 6-10, около 7-10, около 7-9, около 7-8, около 8-10, около 9-10, около 6-7, около 8-9, около 6, около 7, около 8, около 9 и около 10 дней, и один раз в неделю.
[0100] Терапевтическая доза может составлять около 90-180, около 100-180, около 110180, около 120-180, около 130-180, около 140-180, около 150-180, около 160-180 и около 170-180 МЕ/кг. Доза может составлять около 90-170, около 90-160, около 90150, около 90-140, около 90-130, около 90-120, около 90-110 и около 90-100 МЕ/кг. Доза может составлять около 100-170, около 110-160, около 120-150 и около 130140 МЕ/кг. Доза может составлять около 90-100, около 100-110, около 110-120, около 120-130, около 130-140, около 140-150, около 150-160 и около 160-170 МЕ/кг. Доза может составлять около 90, около 95, около 100, около 105, около ПО, около 115, около 120, около 125, около 130, около 135, около 140, около 145, около 150, около 155, около 160, около 165, около 170, около 175 и около 180 МЕ/кг. Такие дозы предпочтительны для интервала дозирования около 9-18, около 9-17, около 9-16, около 9-15, около 9-14, около 9-13, около 9-12, около 9-11, около 9-10, около 10-18, около 11-18, около 12-18, около 13-18, около 14-18, около 15-18, около
-2916-18, около 17-18, около 10-11, около 11-12, около 12-13, около 13-14, около 1415, около 15-16 и около 16-17 дней, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17 и около 18 дней, один раз в месяц и два раза в месяц (каждые две недели). [0101] Предпочитаемая терапевтическая доза и интервалы дозирования являются следующими: 20 МЕ/кг один раз в неделю, 40 МЕ/кг каждые 10 дней, и 100 МЕ/кг каждые две недели (дважды в месяц). Дополнительные комбинации дозы и дозового интервала включают: дозу не менее, чем около 50 МЕ/кг и интервал дозирования не менее, чем около 7 дней, дозу не менее, чем около 100 МЕ/кг и интервал дозирования не менее, чем около 9 дней, дозу не менее, чем около 100 МЕ/кг и интервал дозирования не менее, чем около 12 дней, дозу не менее, чем около 150 МЕ/кг и интервал дозирования не менее, чем около 14 дней, 20-50 или 20-100 МЕ/кг и указанный интервал дозирования представляет собой один раз в неделю, доза 20-50 МЕ/кг и интервал дозирования 7 дней, доза 50-100 МЕ/кг и интервал дозирования 10-14 дней, или доза 100-150 МЕ/кг и интервал дозирования 14-16 дней. Предпочитаемые комбинации интервала дозирования и дозы также включают 10-50 МЕ/кг для 7 дней, 15-100 МЕ/кг для 10-13 дней, 50-150 МЕ/кг для 14-15 дней, 10-30 МЕ/кг для 7 дней, 15-50 МЕ/кг для 10 дней, 20-70 МЕ/кг для 11 дней, 25-85 МЕ/кг для 12 дней, от 30 до 100 МЕ/кг для 13 дней, от 40 до 125 МЕ/кг для 14 дней, и 50-150 МЕ/кг для 15 дней.
[0102] "Вариант" при использовании здесь означает полинуклеотид или полипептид, отличный от исходного полинуклеотида или полипептида, но сохраняющий его основные свойства, например, коагулирующую активность Фактора IX или Fc (FcRn-связывающую) активность. Обычно варианты в целом сходны и на многих участках идентичны исходным полинуклеотидам или полипептидам. Варианты включают фрагменты полинуклеотидов и полипептидов, делеции, вставки и модифицированные версии исходных полипептидов.
[0103] Вариантные полинуклеотиды могут содержать или же, альтернативно, состоять из последовательности нуклеотидов, не менее, чем на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной, например, кодирующей последовательности нуклеотидов в SEQ ID N0:1 или 3 (участок Фактора IX, участок Fc, по отдельности или вместе) или соответствующей ей комплементарной нити, последовательности нуклеотидов, кодирующей известные мутантные и рекомбинантные Фактор IX или Fc, как то раскрытые в процитированных здесь публикациях и патентах, или
соответствующей ей комплементарной нити, последовательности нуклеотидов, кодирующей полипептид SEQ ID N0:2 или 4 (участок Фактора IX, участок Fc, по отдельности или вместе), и/или полинуклеотидным фрагментам любой из этих нуклеиновых кислот (например, их фрагментам, описанным здесь). Полинуклеотиды, которые гибридизируются с этими молекулами нуклеиновых кислот при строгих условиях гибридизации или в менее строгих условиях, также включаются как варианты, равно как и полипептиды, кодируемые этими полинуклеотидами в случае их функциональности.
[0104] Вариантные полипептиды могут содержать, или, альтернативно, состоять из последовательности аминокислот, не менее чем на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной, например, последовательности полипептидов, показанной в SEQ ID N0:2 или 4 (участок Фактора IX, участок Fc, по отдельности или вместе), и/или полипептидным фрагментам любого из этих полипептидов (например, описанным здесь фрагментам).
[0105] Под нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеотидов, " идентичную" эталонной последовательности нуклеотидов не менее чем, например, на 95%, подразумевается, что последовательность нуклеотидов в нуклеиновой кислоте идентична эталонной последовательности, за тем исключением, что эта последовательность нуклеотидов может включать до пяти точковых мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной последовательности нуклеотидов. Другими словами, чтобы получить нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеотидов, не менее, чем на 95% идентичную эталонной последовательности нуклеотидов, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть удалены или заменены другими нуклеотидами, либо нуклеотиды в количестве до 5% от общего числа нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть вставлены в эталонную последовательность. Запрашиваемой последовательностью может быть, например, целая последовательность, показанная в SEQ ID N0:1 или 3, ORF (открытая рамка считывания) или любой фрагмент, определенный как описанный здесь.
[0106] На практике, является ли любая конкретная молекула нуклеиновой кислоты или полипептида не менее чем на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности нуклеотидов или полипептиду настоящего изобретения, можно установить конвенциональным путем с использованием известных компьютерных программ. Предпочтительный способ установления лучшего общего совпадения между запрашиваемой последовательностью (эталонной или
исходной последовательностью) и исследуемой последовательностью, также известный как глобальное выравнивание последовательностей, может быть выбран при помощи компьютерной программы FASTDB, основанной на алгоритме Brutlag et al. (Сотр. Арр. Biosci. (1990) 6:237-245), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. В выравнивании последовательностей как запрашиваемая, так и исследуемая последовательности являются последовательностями ДНК. Последовательность РНК может быть сравнена путем конвертации U в Т. Результат вышеозначенного глобального выравнивания последовательностей дается в процентном соотношении. Предпочтительные параметры, применяемые в выравнивании последовательностей ДНК при помощи FASTDB для вычисления процентного соотношения: Матрица=Единичная, к-кратный=4, Поправочный коэффициент за несогласованней, Поправочный коэффициент за сшивание = 30, Длина группы рандомизации=0, Порог=1, Поправочный коэффициент за гэп = 5, Поправочный коэффициент размера гэпа 0,05, Размер окна = 500 либо длине исследуемой последовательности нуклеотидов, если она короче.
[0107] Если исследуемая последовательность короче запрашиваемой последовательности вследствие делеций 5' или 3', но не вследствие внутренних делеций, результаты должны быть откорректированы вручную. Это потому, что программа FASTDB не учитывает усечения 5' и 3' исследуемой последовательности при вычислении процентного соотношения. Для исследуемых последовательностей, усеченных на окончаниях 5' или 3' относительно запрашиваемой последовательности, процентное соотношение корректируется путем вычисления количества оснований в запрашиваемой последовательности, которые являются 5' и 3' в исследуемой последовательности, и которые не совпадают / выровнены, в процентах от общего числа оснований в запрашиваемой последовательности. Совпадает / выровнен ли нуклеотид, определяется по результатам выравнивания последовательностей FASTDB. Этот процент затем вычитается из процентного соотношения, вычисленного вышеупомянутой программой FASTDB с использованием установленных параметров, для получения итогового значения процентного соотношения. Это откорректированное значение и используется для целей настоящего изобретения. Только основания, расположенные вне оснований 5' и 3' исследуемой последовательности, согласно показаниям выравнивания FASTD, которые не совпадают / выровнены с запрашиваемой последовательностью, учитываются в целях ручной правки значения процентного соотношения.
[0108] Например, исследуемая последовательность из 90 оснований выровнена с запрашиваемой последовательностью из 100 оснований для определения процентного соотношения. Делеций присутствуют на окончании 5' исследуемой последовательности, и следовательно, выравнивание FASTDB не показывает совпадения / выравнивания первых 10 оснований на окончании 5'. Эти 10 непарных оснований представляют собой 10% последовательности (число несовпавших оснований на окончаниях 5' и 3' / общее число оснований в запрашиваемой последовательности), следовательно, 10% вычитаются из значения процентного соотношения, вычисленного программой FASTDB. Если остальные 90 оснований совпадают идеально, итоговое процентное соотношение будет 90%. В другом примере исследуемая последовательность из 90 оснований сравнивается с запрашиваемой последовательностью из 100 оснований. На этот раз делеций являются внутренними делециями, так что отсутствуют основания на 5' или 3' исследуемой последовательности, которые не совпадают / выровнены с запрашиваемой. В таком случае, процентное соотношение, вычисленное FASTDB, вручную не корректируется. Только для оснований 5' и 3' исследуемой последовательности, которые не совпадают / выровнены с запрашиваемой последовательностью, выполняется ручная коррекция. Никакие другие ручные коррекции не требуются для целей настоящего изобретения.
[0109] Под полипептидом, содержащим последовательность аминокислот, "идентичную" запрашиваемой последовательности аминокислот настоящего изобретения не менее чем, например, на 95%, подразумевается, что последовательность аминокислот исследуемого полипептида идентична запрашиваемой последовательности, за тем исключением, что исследуемая последовательность полипептидов может включать до пяти изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот запрашиваемой последовательности аминокислот. Другими словами, чтобы получить полипептид, содержащий последовательность аминокислот, не менее чем на 95% идентичную запрашиваемой последовательности аминокислот, до 5% аминокислотных остатков в исследуемой последовательности могут быть вставлены, удалены или заменены другими аминокислотами. Такие изменения в эталонной последовательности могут присутствовать на амино- или карбокси-терминальных позициях эталонной последовательности аминокислот либо где угодно между этими терминальными позициями, поодиночке среди остатков в эталонной последовательности или в виде одной или более слитных групп в пределах эталонной последовательности.
[0110] На практике, является ли любой конкретный полипептид не менее, чем на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным, например, последовательности аминокислот в SEQ ID N0:2 (участок Фактора IX, участок Fc, по отдельности или вместе) или 4, либо известной полипептидной последовательности Фактора IX или Fc, можно установить конвенциональным путем с использованием известных компьютерных программ. Предпочтительный способ установления лучшего общего совпадения между запрашиваемой последовательностью (эталонной или исходной последовательностью) и исследуемой последовательностью, также известный как глобальное выравнивание последовательностей, может быть выбран при помощи компьютерной программы FASTDB, основанной на алгоритме Brutlag et al. (Сотр. Арр. Biosci. (1990) 6:237-245), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. В выравнивании последовательностей как запрашиваемая, так и исследуемая последовательности являются последовательностями нуклеотидов, либо как запрашиваемая, так и исследуемая последовательности являются последовательностями аминокислот. Результат вышеозначенного глобального выравнивания последовательностей дается в процентном соотношении. Предпочтительные параметры, применяемые в выравнивании аминокислот при помощи FASTDB для вычисления процентного соотношения: Матрица=РАМ 0, к-кратный=2, Поправочный коэффициент за несогласованней, Поправочный коэффициент за сшивание = 20, Длина группы рандомизации=0, Порог=1, Размер окна=длина последовательности, Поправочный коэффициент за гэп = 5, Поправочный коэффициент размера гэпа 0,05, Размер окна = 500 либо длине исследуемой последовательности нуклеотидов, если она короче.
[0111] Если исследуемая последовательность короче запрашиваемой последовательности вследствие N- или С-концевых делеций, но не вследствие внутренних делеций, результаты должны быть откорректированы вручную. Это потому, что программа FASTDB не учитывает N- и С-концевые усечения исследуемой последовательности при вычислении итогового процентного соотношения. Для исследуемых последовательностей, усеченных на N- и С-концах относительно запрашиваемой последовательности, процентное соотношение корректируется путем вычисления количества остатков в запрашиваемой последовательности, которые являются N- и С-концевыми в исследуемой последовательности, и которые не совпадают / выровнены с соответствующими исследуемыми остатками, в процентах от общего числа оснований в запрашиваемой последовательности. Совпадает / выровнен ли остаток, определяется по результатам выравнивания последовательностей
FASTDB. Этот процент затем вычитается из процентного соотношения, вычисленного вышеупомянутой программой FASTDB с использованием установленных параметров, для получения итогового значения процентного соотношения. Это откорректированное значение и используется для целей настоящего изобретения. Только остатки на N- и С-концах исследуемой последовательности, которые не совпадают/выровнены с запрашиваемой последовательностью, учитываются в целях ручной правки значения процентного соотношения. Иными словами, только позиции остатков в запрашиваемой последовательности, расположенные за пределами наиболее удаленных N- и С-терминальных остатков исследуемой последовательности.
[0112] Например, исследуемая последовательность из 90 аминокислотных остатков выровнена с запрашиваемой последовательностью из 100 аминокислотных остатков для определения процентного соотношения. Делеций присутствуют на N-конце исследуемой последовательности, и следовательно, выравнивание FASTDB не показывает совпадения/выравнивания первых 10 остатков на N-конце. Эти 10 непарных остатков представляют собой 10% последовательности (число не совпавших остатков на N- и С-концах / общее число остатков в запрашиваемой последовательности), следовательно, 10% вычитаются из значения процентного соотношения, вычисленного программой FASTDB. Если остальные 90 остатков совпадают идеально, итоговое процентное соотношение будет 90%. В другом примере, исследуемая последовательность из 90 остатков сравнивается с запрашиваемой последовательностью из 100 остатков. На этот раз делеций являются внутренними делециями, так что отсутствуют основания на N- и С-концах исследуемой последовательности, которые не совпадают / выровнены с запрашиваемой. В таком случае, процентное соотношение, вычисленное FASTDB, вручную не корректируется. Только для позиций остатков, расположенных за пределами N- и С-концов исследуемой последовательности, согласно показаниям выравнивания FASTDB, которые не совпадают / выровнены с запрашиваемой последовательностью, выполняется ручная коррекция. Никакие другие ручные коррекции не требуются для целей настоящего изобретения.
[0113] Варианты полинуклеотида могут содержать изменения в кодирующих участках, некодирующих участках, или и там, и там. Наиболее предпочтительны варианты полинуклеотида, содержащие изменения, которые производят молчащие замены, вставки или делеций, но не изменяют свойства и активность кодируемого
полипептида. Предпочтительны варианты нуклеотида, произведенные посредством молчащей замены вследствие дегенерации генетического кода. Помимо того, предпочтительны варианты, в которых 5-10, 1-5, или 1-2 аминокислоты заменены, удалены или вставлены в любом сочетании. Варианты полинуклеотида могут быть произведены с различными целями, например, для оптимизации экспрессии кодонов в конкретном носителе (заменить кодоны в человеческой иРНК на предпочтительные для бактериального носителя, такого как Е. coli). [0114] Природные варианты называются "аллельные варианты" и относятся к одной из нескольких различных форм гена, занимающих данный локус на хромосоме организма (Genes II, Lewin, В., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Эти аллельные варианты могут различаться на уровне полинуклеотидов и/или на уровне полипептидов и включаются в настоящее изобретение. Альтернативно, неприродные варианты могут быть произведены при помощи техник мутагенеза или прямым синтезом.
[0115] Используя известные способы белковой инженерии и рекомбинантной ДНК-технологии, можно производить варианты с целью улучшить или изменить характеристики полипептидов. Например, одна или более аминокислот могут быть удалены с N-конца или С-конца выделенного белка без значительных потерь в биологической функции. Авторы Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки, отмечали, что варианты белка KGF сохраняли гепарин-связывающую активность даже после удаления 3, 8, или 27 аминотерминальных аминокислотных остатков. Подобным же образом, гамма интерферон демонстрировал повышенную до 10 раз активность после удаления 8-10 аминокислотных остатков с карбокси-конца этого белка. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.)
[0116] Более того, существует достаточное количество данных, которые демонстрируют, что варианты нередко сохраняют биологическую активность, подобную активности природного белка. Например, Gayle и сотрудники (J. Biol. Chem. 268:22105-22111 (1993), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки) провели расширенный мутационный анализ человеческого цитокина IL-1а. Они использовали неспецифический мутагенез для генерации более 3,500 независимых мутантов IL-la, которые в среднем содержали по 2,5 изменения аминокислот на вариант по всей длине молекулы. Множественные мутации были рассмотрены на каждой из возможных аминокислотных позиций. Исследователи
обнаружили, что "большая часть молекулы может быть изменена без особого
влияния на связывающую или биологическую активность") (См. Abstract.) В
действительности, только 23 уникальные последовательности аминокислот из
более 3,500 исследованных последовательностей нуклеотидов производили белок,
значительно отличавшийся по своей активности от дикого типа.
[0117] Как указано выше, варианты полипептидов включают модифицированные
полипептиды. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-
рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина,
ковалентное присоединение гемовой группы, ковалентное присоединение
нуклеотида или производной нуклеотида, ковалентное присоединение липида или
производной липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола,
перекрёстное сшивание, циклизацию, формирование дисульфидных связей,
деметилирование, формирование ковалентных сшивок, формирование цистеина,
формирование пироглютамата, формилирование, гамма- карбоксилирование,
гликозилирование, формирование гликозилфосфатидилинозитола,
гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристиолирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, тРНК-опосредованная вставка аминокислот в белки, как то аргинилирование, и убиквитинирование.
[0118] Термин "около" применяется здесь в значении "приблизительно", "округленно", "примерно" или "в районе". Когда термин "около" используется в сочетании с областью числовых значений, он модифицирует эту область путем расширения ее пределов выше и ниже указанных числовых значений. В целом, термин "около" используется здесь для модификации числового значения на величину в 10%, как вверх, так и вниз (больше или меньше).
[0119] Теперь, когда мы описали настоящее изобретение детально, все то же можно полнее уяснить посредством отсылки к нижеследующим примерам, которые включены сюда только в целях иллюстрации и не ограничивают это изобретение. Все приведенные здесь патенты и публикации включены полностью посредством ссылки.
[0120] Исследование, впервые поставленное на человеке, было открытым, с эскалацией дозы, Фаза 1/2 исследованием для определения безопасности, переносимости и фармакокинетических (ФК) параметров FIXFc (рекомбинантный гибридный белок
человеческого коагуляции фактора IX). FIXFc представляет собой рекомбинантный гибридный белок, содержащий человеческий свертывания фактор IX, соединенный с Fc доменом из человеческого IgGl. Гибридный белок экспрессируется в человеческих эмбриональных почечных клетках (НЕК 293). См. Пример 3.
[0121] FIXFc разработан для контроля и предотвращения геморрагических случаев у пациентов с гемофилией В (врожденный дефицит фактора IX или болезнь Кристмаса), включая контроль и предотвращение кровотечения при хирургических вмешательствах.
[0122] FIXFc представляет собой рекомбинантный гибридный белок, содержащий коагуляции Фактора IX (FIX) и Fc домена человеческого антитела (IgGl изотип). Молекула FIXFc представляет собой гетеродимер с одной цепью FIXFc (FIXFc-sc) и одной цепью Fc (Fc-sc), связанными вместе посредством двух дисульфидных связей в петлевом участке Fc. См. Фигуру 1 и Таблицу 2.
[0123] rFIXFc лекарственный продукт представляет собой прозрачный бесцветный раствор, предназначенный для внутривенного (ВВ) введения. rFIXFc поставляется как 1000 ME на объем 5 мл в 10 мл ампуле одноразового использования. Лекарственный Продукт упаковывается в USP тип I стеклянные ампулы с бромбутиловыми пробками и отрывными простыми алюминиевыми дополнительными укупорочными средствами. rFIXFc лекарственный продукт содержит 200 МЕ/мл в ЮмМ натрий-фосфатном буфере рН 7.0 с добавлением 145 мМ NaCl и 0.1% полисорбата 20. Раствор rFIXFc не следует растворять.
[0124] Дизайн Исследования. Пациенты общим числом 14, ранее подвергавшиеся лечению, с тяжелой гемофилией В, были включены в исследование и обработаны FIXFc путем внутривенного (ВВ) вливания в течение приблизительно 10 минут. В исследовании оценивалось шесть дозовых уровней, 1; 5; 12,5; 25; 50 и 100 МЕ/кг. Один пациент на дозовый уровень был включен в исследование дозовых уровней 1; 5; 12,5 и 25 МЕ/кг, и по меньшей мере три подлежащих оценке пациента на дозовый уровень были включены в исследование 50 и 100 МЕ/кг.
[0125] После скрининга (назначенного в течение 14 дней FIXFc дозы) начался период лечения пациентов. Период лечения для каждого дозового уровня включал одну дозу FIXFc (День 1) до завершения 72-часового периода наблюдения безопасности (3 дня) для дозовых уровней 1 и 5 МЕ/кг или до момента взятия последней пробы РК для пациентов в случае дозовых уровней от 12,5 до 100 МЕ/кг (приблизительно 10 дней). Пациенты, обработанные 1; 5; 12,5 или 25 МЕ/кг были включены в
исследование и обработаны последовательным образом начиная с 1 МЕ/кг. Пациенты, получившие 50 МЕ/кг, не получали больше лечения в тот же день, и по меньшей мере один день разделял дозирование. После лечения пациентов 50 МЕ/кг, начиналось лечение пациентов 100 МЕ/кг.
[0126] Период после лечения был 30-дневным периодом наблюдения за безопасностью, начинавшимся со дня, когда пациент получал дозу FIXFc, и частично совпадавшим с периодом лечения с того момента, когда пациенты подвергались требуемым оценочным исследованиям, таким как взятие проб РК, в течение этого времени.
[0127] У пациентов, которым были назначены дозовые уровни от 12,5 до 100 МЕ/кг, брались образцы крови для оценки FIX активности и FIXFc концентрации. Образцы крови брались непосредственно перед введением FIXFc; через 15 минут после конца вливания; и на 1, 3, 6, 9, 24, 48, 72, 96, 120, 168 и 240 часах после конца вливания или до того как были достигнуты базовые уровни FIX. Если у пациента продолжали наблюдаться уровни FIX выше базового на 240-часовой временной точке (День 11 Исследования), образцы брались на 288 часах (День 13 Исследования) и снова на 336 часах (День 15 Исследования), если уровень FIX был выше базового на День 13 Исследования.
[0128] Пациент 10 получил BENEFIX(tm) лечение кровотечения перед назначенным взятием FIXFc образца на 216 часов после дозирования. Следовательно, FIXFc активность и данные по антигену на 216 ч и на последующих временных точках были исключены из анализа. Не произошло дополнительных отклонений, которые, как считается, повлияли бы на предварительные результаты анализа в этом исследовании.
[0129] Для Фактора IX антигена фармакокинетические анализы были проведены на отдельном пациенте, наблюдалась концентрация FIXFc в соответствии с временными данными после ВВ вливания FIXFc. Первичный анализ был проведен с использованием модель-зависимой методологии. Данные по концентрации FIXFc были компьютерным образом обработаны для двухкомпартментной открытой модели с элиминацией из центрального компартмента с использованием определенных пользователем оценок первичного параметра для расчета значений исходного параметра. WinNonlin оцененные константы микроскопической степени были выработаны и данные по FIXFc концентрации были оценены по функции l/(Y"hat * Y" hat). Наблюдаемые данные для двух пациентов (например, пациенты 5 и 6) были недостаточно описаны двухкомпартментой моделью. Поэтому для этих двух пациентов был проведен модель-независимый анализ с использованием WinNonlin
некомпарментного анализа ВВ-вливания модели входа (линейное правило трапеций для AUC расчета). Для некомпарментного анализа полупериод был рассчитан по бета фазе с использованием точек данных, которые описывают терминальное логарифмически-линейное снижение регрессии. Минимум три точки использовались для описания фазы элиминации. Это произошло приблизительно между 4 и 14 днями. Для РК анализа антигена были использованы "мг/кг" дозовые эквиваленты. Эти значения были определены на основе специфической активности FIXFc 60,2 МЕ/мг. Фактические временные точки взятия проб, дозы и продолжительности вливания были использованы для расчетов. Номинальные временные точки взятия проб и дозы были использованы для создания таблиц и фигур концентрация-время. Представлены индивидуальные и средние РК параметры и описательная статистика. Формальный статистический анализ не был проведен, поскольку дозовый диапазон и число пациентов в каждой когорте были слишком маленькими для пердметного анализа.
[0130] Для активности Фактора IX способ вычитания базового уровня был примерен к активности по сравнению с временным профилем в соответствии с деревом решений вычитания базового уровня (Фигура 4). Значения активности < 1% были определены при 1 МЕ/дл для затухания к базовому уровню. Предозовые временные точки считались нулем для целей расчетов. Кроме того, скорректированные по базовому уровню данные активности были округлены по временным точкам, что представляло возвращение к базовым уровням. Фармакокинетический анализ был проведен на FIX-активности с вычетом базового уровня по сравнению с временными точками, полученными после введения FIXFc путем ВВ вливания. Модель-зависимая оценка была использована для анализа ВВ-вливания дозовых групп. Данные с вычетом базового уровня были компьютерным образом обработаны для двухкомпартментной открытой модели с элиминацией из центрального компартмента с использованием WinNonlin-определенных границ параметров для расчета значений исходного параметра. WinNonlin оцененные константы микроскопической степени были выработаны, и данные по FIXFc концентрации были оценены по функции l/(Y"hat * Y"hat). Фактические временные точки взятия проб, дозы и продолжительности вливания были использованы для расчетов. Номинальные временные точки взятия проб и дозы были использованы для создания таблиц и фигур концентрация-время.
[0131] Если не имелось фактических данных по ним, активность на 168 ч после дозирования (С168) и время при 1 МЕ/дл выше базового уровня (TBLP1) rFIXFc
были получены с использованием WinNonlin произведенных констант микроскопической степени для моделирования уровня активности FIXFc по сравнению с временными данными. Индивидуальные и средние РК параметры и описательная статистика представлены в этом Примере. Формальный статистический анализ не был проведен, поскольку дозовый диапазон и число пациентов в каждой когорте были слишком маленькими для предметного анализа.
[0132] Результаты фармакокинетики FIXFc антигена показали, что концентрации FIXFc в плазме крови резко возрастали после быстрого ВВ вливания FIXFc, со средними (+SD) Стах значениями 1670 (п=1), 2730 (п=1), 7510 ± 2480 и 15400 ± 3960 нг/мл для 12,5; 25; 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и были достигнуты в течение первого получаса для всех пациентов. Все FIXFc-обработанные пациенты имели дозозависимое возрастание системного FIXFc экспонирования в плазме (как оценивалось по Стах и AUCINF)- ХОТЯ И ограниченное одним оцененным пациентом при 12,5 и 25 МЕ/кг номинальной дозе, наблюдаемое увеличение как Стах, так и AUCINF было достаточно пропорционально дозе в оцененном дозовом диапазоне. (Таблица 3 показывает среднюю FIXFc антигена концентрацию для отдельных пациентов и групп в сопоставлении с временными данными; рассортировано по номинальной дозе, фактической дозе, длительности вливания и номеру пациента. Таблица 4 показывает средние FIXFc антигена РК суммарные данные, отдельных пациентов и групповые, рассортированные по номинальной дозе, фактической дозе, "мг/кг" эквивалентной дозе и номеру пациента, показывает средние FIXFc антигена РК суммарные данные, отдельных пациентов и групповые, рассортированные по номинальной дозе, фактической дозе, "мг/кг" эквивалентной дозе и номеру пациента, и см. Таблицу 11.)
[0133] Концентрации FIXFc в плазме крови снижались по биэкспоненте после короткого ВВ вливания. Периоды полувыведения как значений распределения (альфа), так и элиминации (бета), по видимости, являлись дозонезависимыми в интервале доз, оцененных по периодам полувыведения альфа и бета у отдельного пациента в интервале от 9,79 до 21,2 часов и от 71,0 до 140 часов, соответственно. Средние периоды полувыведения альфа (+SD) для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 13,1 ± 4,77 и 12,1 ± 2,33 часа, соответственно. Средние периоды полувыведения бета (+SD) для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли ПО ± 26,5 и 95,8 ± 11,1 часов, соответственно. Кроме того, были определены первичные значения параметра РК для CI, Vss, и MRT и, в целом, все, по видимости, являлись дозонезависимыми в интервале получивших оценку
доз. Как показано, эта оценка ограничена данными по одному пациенту на 12,5 и 25 МЕ/кг номинальных дозовых уровней (Таблица 12 и Фигуры 2, 7 и 8.)
[0134] Кроме того, средние С1 значения составляли 2,28 ± 0,374 и 2,11 ± 0,464 мл/ч/кг для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно. Средние Vss значения составляли 259 ± 78,5 и 238 ± 52,2 мл/кг для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно. Кроме того, средние MRT значения составляли 112 ± 21,5 и 114 ± 17,1 ч для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней.
[0135] Результаты для скорректированной по базовому уровню фармакокинетической активности FIXFc показали, что FIXFc активность резко возросла после короткого ВВ вливания FIXFc, со средними (+SD) модель-прогнозируемыми Стах значениями 11,9 (п=1), 19,9 (п=1), 41,6 ± 8,97 и 98,2 ± 8,21 МЕ/дл для 12,5, 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и была достигнута в течение первого получаса для всех пациентов. (В Таблице 5 показана средняя скорректированная по базовому уровню FIXFc активность в сопоставлении с временными данными; распределены по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности вливания и номеру пациента. В Таблице 6 показаны РК суммарные данные средней FIXFc активности отдельных пациентов и группы; распределены по номинальной дозе, фактической дозе, "мг/кг" эквивалентной дозе и номеру пациента.)
[0136] Все FIXFc-обработанные пациенты имели дозозависимое возрастание FIX активности (по сравнению с базовым ответом перед дозой). Хотя ограниченное тем, что оценивался только один пациент на номинальных дозовых уровнях 12,5 и 25 МЕ/кг, наблюдаемое возрастание как Стах, так и AUCINF было достаточно пропорционально дозе внутри оцениваемого дозового диапазона. (Таблицы 6, 9 и 13 и Фигуры 3 и 5.)
[0137] После окончания вливания снижение скорректированной по базовому уровню FIX активности демонстрировало биэкспоненциальный спад; характеризовалось быстрой фазой распределения (альфа), за которой следовала линейная логарифмическая фаза элиминации (бета). Во время альфа-фазы степень уменьшения FIXFc активности варьировала со значениями полупериода альфа у отдельных пациентов от 0,140 до 16,6 часов. Видимое дозозависимое возрастание средних значений полупериода альфа было сбито у одного пациента при 12,5 и 25 МЕ/кг номинальных дозовых уровнях. Напротив, значения полупериода элиминации (бета), по-видимому, являются дозонезависимыми при дозовом диапазоне со значениями бета полупериода у отдельных пациентов в диапазоне от
-4242,1 до 67,4 часов при дозовом диапазоне от 25 до 100 МЕ/кг. Хотя получивший оценку и описанный, полупериод элиминации у пациента 1, получившего лечение 12,5 МЕ/кг rFIXFc, не вошел в суммарную оценку из-за того, что уровни FIX у этого пациента детектировались только в течение периода до 96 часов из-за укороченной терминальной фазы и способствовали недооценке терминального полупериода элиминации. Средние периоды полувыведения бета (+SD) для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 52,1 ± 10,4 и 52,5 ± 10,1 часов, соответственно, и 52,5 ± 9,2 (диапазон 40-67,4) часов для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. (Таблицы 6, 8 и 13). [0138] Кроме того, были определены первичные значения параметра РК для CI, Vi, Vss и MRT и, в целом, все, по-видимому, были дозонезависимыми в оцененном диапазоне доз.
[0139] Кроме того, средние значения О составляли 3,77 ± 1,12 и 2,89 ± 0,615 мл/ч/кг для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и 3,36 ±0,928 мл/ч/кг для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. (Таблицы 6, 8 и 13.)
[0140] Средние значения Vss составляли 264 ± 77,6 и 179 ± 31,1 мл/кг для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и 226 ± 69,8 мл/кг для комбинированных 25, 50, и 100 МЕ/кг номинальных доз. (Таблицы 6, 8 и 13). Кроме того, средние значения MRT составляли 71,7 ± 13,0 и 62,8 ± 8,82 ч для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней, соответственно, и 68,05 ± 11,16 ч для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. (Таблицы 6, 8 и 13.)
[0141] В дополнение к первичным РК параметрам, вторичные РК параметры (например, С168, К-значения, IVR и т.д.) были определены для оценки FIXFc продолжительности эффекта. Как ожидалось, наблюдалось дозозависимое возрастание С168, TBLP1, TBLP3 и TBLP5 значений. Напротив, К-значения и IVR значения, по видимости, были дозонезависимыми в оцененном диапазоне доз. В полном дозовом диапазоне модель-прогнозируемые и наблюдаемые К-значения отдельных пациентов находились в диапазоне от 0,61 до 1,02 и от 0,62 до 1,17 МЕ/дл на МЕ/кг, соответственно. Средние модель-прогнозируемые К-значения для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 0,76 и 0,90 МЕ/дл на МЕ/кг, соответственно, и 0,821 ± 0,1387 (диапазон 0,61-1,02) МЕ/дл на 1 МЕ/кг для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. Средние модель-прогнозируемые IVR значения для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 34,5 и 35,1%, соответственно. Средние наблюдаемые К-значения для 50
и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 0,86 и 1,02 МЕ/дл на МЕ/кг, соответственно, и 0,926 ± 0,1787 (диапазон 0,97-1,17) МЕ/дл на 1 МЕ/кг для комбинированных 25, 50 и 100 МЕ/кг номинальных доз. Средние наблюдаемые IVR значения для 50 и 100 МЕ/кг номинальных дозовых уровней составляли 39,2 и 39,8%, соответственно. (Таблицы 6, 7, 8 и 13.) Таблица 7А-7В шоу7 показывает вторичные РК суммарные данные активности FIXFc у отдельных пациентов и групповое среднее; сортировано по номинальной дозе, фактической дозе и номеру пациента.
[0142] Каждый 1 МЕ/кг влитого rFIXFc повышал активность FIX в плазме крови на 0,93 ± 0,18 МЕ/дл в среднем, и это увеличение концентрации (К значение) показывало слабую положительную корреляцию с весом тела (R2=0,336, р=0,048) (Фигура 23).
[0143] Фармакокинетические оценки FIXFc активности согласовывались с оценками
rFIXFc антигена (например, сравните Таблицы 13 и 14). Кроме того, наблюдалась
превосходная корреляция между активностью rFIXFc и уровнями антигена,
показывающая сохранение активности rFIXFc in vivo. (Фигура 9.) Кроме того, по
сравнению с накопленными данными по BENEFIX(tm) (Wyeth), rFIXFc
демонстрировал (Таблица 8) следующее:
Дозовая линейность от 25-100 МЕ/кг 3-кратное возрастание t^beta
3-кратное возрастание среднего времени удержания 24% повышенное увеличение концентрации в 2,5 раза пониженный клиренс
[0144] FIXFc представляет собой рекомбинантный гибридный белок, состоящий из FIX, прикрепленного к Fc домену человеческого IgGl. FIXFc разработан как версия FIX с продленным действием. Доклинические исследования с FIXFc показали удлинение периода полувыведения активности FIX по сравнению с BENEFIX(tm), имеющимся в продаже рекомбинантным FIX продуктом. Обоснованием для этого исследования была оценка безопасности и РК FIXFc у пациентов с тяжелой гемофилией В. Для этого исследования 12 подлежащих оценке пациентов в возрасте от 18 до 76 лет подходили для оценки РК. Каждый пациент получил одно введение FIXFc в номинальной дозе 12,5, 25, 50 или 100 МЕ/кг веса тела путем внутривенного вливания в течение примерно 10 минут. Образцы плазмы крови для оценки РК как на активность FIXFc, так и на концентрации антигена, наблюдались перед вливанием, а также на протяжении периода времени до 14 дней после дозировки. РК как FIXFc антигена, так и активности были независимо
охарактеризованы в этом исследовании с использованием модель-зависимых и модель-независимых способов.
[0145] FIXFc хорошо переносился после введения единичных ВВ доз 12,5; 25; 50 и 100 МЕ/кг веса тела. В этом исследовании не было доказательств серьезных лекарственно зависимых побочных эффектов. Ни у одного пациента не определялись нейтрализующие или связывающие антитела к rFIXFc.
[0146] Аппроксимированное дозопропорциональное возрастание Стах и AUCINF наблюдалось как для FIXFc антигена, так и для активности после введения доз от 12,5 до 100 МЕ/кг, но V и С1 были одинаковыми при всех дозах. Эти результаты показывают, что FIXFc антиген и активность демонстрировали линейный РК на протяжении оцененного дозового диапазона. Сравнительно маленькие значения V параметра могут показывать, что FIXFc входит во внутритканевую жидкость, но не проникает через клеточную мембрану во внутриклеточные жидкости.
[0147] Пиковые концентрации в плазме крови FIXFc антигена и активности наблюдались в течение 0,5 ч после окончания вливания и оставались детектируемыми в течение нескольких дней после дозирования. Свидетельства сниженного клиренса и пролонгированного периода полувыведения наблюдались как для FIXFc антигена, так и для активности.
[0148] Средний клиренс и конечные значения полупериода элиминации, связанные с концентрациями FIXFc антигена в дозовых уровнях 50 и 100 МЕ/кг, составляли 2,28 и 2,11 мл/ч/кг и ПО и 95,8 часов, соответственно. Подобным образом, средний клиренс и конечные значения полупериода элиминации, связанные с уровнями активности FIXFc в том же дозовом диапазоне, составляли 3,77 и 2,89 мл/ч/кг и 52,1 и 52,5 часов, соответственно. Сравнение РК результатов FIXFc активности, наблюдаемых в настоящем исследовании, с сообщенными РК для BENEFIX(tm) активности (Summary of Product Characteristics of BENEFIX(tm); 18 ноября, 2009) показало приблизительно 3-кратное уменьшение FIXFc клиренса и приблизительно 3-кратное увеличение как FIXFc полупериода конечной элиминации, так и среднего времени нахождения в организме по сравнению с BENEFIX(tm).
[0149] С наблюдаемыми улучшениями РК, FIXFc предоставит пролонгированную защиту от кровотечений, позволяя снизить частоту инъекций индивидуумам с Гемофилией В. Основываясь на результатах этого иследования, rFIXFc может дозироваться каждые две недели или дважды в месяц с использованием доз 100 МЕ/кг и по меньшей мере раз в неделю с использованием более низких доз. Такой режим требует более редких инъекций. Кроме того, использование rFIXFc будет иметь
другие потенциальные клинические влияния, такие как: доступ к центральным венам; улучшенную схему приема лекарства; снижение повреждений из-за кровотечений; и повышенную защиту суставов от кровотечений.
Пример 2. В-ПРОТЯЖЕННАЯ Фаза 1/2/3 исследования
[0150] Это будет открытое, мультицентровое исследование безопасности, фармакокинетики и эффективности рекомбинантного, долгодействующего коагулянта Фактора IX Fc гибрида (rFIXFc) в профилактике и лечении кровотечения у ранее подвергавшихся лечению пациентов с тяжелой гемофилией В. Лечение FIX продуктами, имеющимися в настоящее время в продаже, требует дозировки 2-3 раза в неделю. Продукт с продотированным периодом полувыведения, у которого требуемый интервал дозирования продлен до одного раза в неделю или более, медицинское сообщество сочло бы значимым улучшением в лечении пациентов с тяжелой гемофилией.
[0151] Дозовые уровни широко варьируют в клинических профилактических исследованиях rFIX продуктов: сообщаемые дозы варьируют от 10 до 171 МЕ/кг (Roth et al, Blood 98:3600 (2001)) или от 40 до 100 МЕ/кг (MASAC Recommendation 177, National Hemophilia Foundation (Oct. 2006)). Кроме того, минимальные уровни FIX активности во время профилактического лечения у пациентов без клиничеких признаков кровотечения прогнозируются в диапазоне между 0,2 и 3,8 МЕ/дл (Carlsson et al., Hemophilia 4:83 (1998)). Принимая во внимание индивидуальную вариабельность у пациента, индивидуализированные дозовые режимы на основании клинического статуса пациента являются общепринятой практикой.
[0152] Результаты Фазы 1/2а исследования (Пример 1), оценивающей безопасность и фармакокинетику однократной дозы замороженной липидной лекарственной формы rFIXFc продемонстрировали, что лекарство хорошо переносимо в дозах в диапазоне от 1 до 100 МЕ/кг и характеризация РК подверждает несколько преимуществ по сравнению с доступными в настоящее время способами лечения, а именно период полувыведения и MRT в 3 раза длиннее, чем те, о которых ранее сообщалось для BENEFIX(tm) (61 час по сравнению с 19 часами). Целью этого исследования было определить параметр РК дальнейшей оценки лиофилизированного rFIXFc у людей, сравнить его с BENEFIX(tm) РК параметром оценок у людей, и продемонстрировать эффективность лиофилизированного rFIXFc для предотвращения и лечения кровотечения и безопасности его
повторяющегося дозирования у предварительно подвергавшихся лечению пациентов с тяжелой гемофилией В.
[0153] В исследование вошло четыре группы: низкодозовый профилактический режим лечения (п=25), высокодозовый профилактический режим лечения (п=25), режим лечения по необходимости (п=20) и режим лечения при серьезных хирургических вмешательствах (п=5). Группа низкодозового режима включила РК подгруппу (п=16), получившую дозу BENEFIX(tm), после чего последовало лечение rFIXFc.
[0154] Первостепенные цели исследования следующие: оценить безопасность и переносимость rFIXFc во всех лечебных группах; оценить эффективность rFIXFc во всех лечебных группах; и оценить эффективность профилактики при терапии по необходимости (сравнение годового числа эпизодов кровотечения между Группами 1 и 2 по отношению к режиму по требованию Группы 3).
[0155] Второстепенные цели исследования следующие: сравнить оценки параметра РК у rFIXFc и BENEFIX(tm); оценить эффективность rFIXFc в группе лечения по необходимости и хирургической группе; оценить и сравнить оценки параметра РК у rFIXFc базовые и на Неделе 26 (± 1 неделя) в подгруппе РК; оценить реакцию пациентов на лечение во всех группах; и оценить потребление rFIXFc во всех группах.
Основные критерии включения:
Мужской пол, 12 лет и старше, вес по меньшей мере 40 кг
Диагностирована гемофилия В (базовый уровень Фактора IX менее чем или эквивалентен 2%)
В анамнезе по меньшей мере 100 дней воздействия любым продуктом с Фактором IX
Число тромбоцитов > 100000 клеток/мкл
INR (международное нормализованное соотношение) < 1,40 как определено по тестируемому лабораторному нормальному диапазону CD4 число > 200 клеток/мкл
Основные критерии исключения:
Ингибиторы Фактора IX в анамнезе Дисфункция почек или печени
Диагностирован другой дефект коагуляции, отличный от гемофилии В
В анамнезе были случаи анафилаксии, связанной с каким-либо ВВ ведением
FIX или иммуноглобулина
Прием системных иммуносупрессорных лекарств (например, системные кортикостероиды; однако, HAART (высокоактивная антиретровирусная терапия) разрешена)
Пример 3. FIXFc производство в НЕК293 клетках
[0156] FIXFc был произведен в стабильно трансфицированных НЕК293 клетках, содержащих экспрессионную кассету для FIXFc (нативный FIX, соединенный прямо с Fc участком) и экспрессионную кассету для одного Fc. В клетки также была трансфицирована экспрессионная кассета РС5, которая представляет собой процессирующийся энзим, который дает возможность полному процессингу FIX пропептида. Трансфицированные клетки росли в бессывороточной суспензионной среде, содержащей витамин К, и они секретировали три белка: FIXFc димер, FIXFc мономер (одна цепь FIXFc и одна цепь Fc), и Fc димер. FIXFc мономер ("FIXFc") был очищен путем колоночной хроматографии (Белок А, Фрактогель DEAE, и Q Сефароза псевдоаффинное элюирование с низкой ионной силой СаСЬ), и вирус был инактивирован и профильтрован для введения пациентам, являющимся людьми. Также см. Peters et al., Blood. 2010 Mar ll;115(10):2057-64 (Epub 2010 Jan 7); и Патент США No. 7566565; каждый из которых включен в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
[0157] Коагулирующая активность FIXFc была оценена путем подсчета его способности восстанавливать активность свертывания дефицитной по FIX плазмы крови с использованием MLA Electra 1600С (Medical Laboratory Automation/Instrument Labs, Pleasantville, NY). Результаты сравнивались с калибровочной кривой, сгенерированной с использованием серийных разведений FIX стандарта Всемирной Организации Здравоохранения.
[0158] Предполагают, что фосфорилирование серина и сульфатация тирозина Фактора IX важны для возрастания концентрации in vivo. Сообщалось, что MONONINE(tm) (очищенный из плазмы Фактор IX (pdFIX), продающийся CSL Berhing) обладает лучшим возрастанием концентрации in vivo, чем BENEFIX(tm) (рекомбинантный FIX (rFIX), продающийся Wyeth) из-за более высокого уровня фосфорилирования/сульфатации MONONINE(tm) (> 90%/> 90% в сравнении с <10%/5%). Однако FIXFc, вырабатываемый в НЕК293 клетках, почти не имеет фосфорилирования/сульфатации ( <10%/4%, что очень сходно с BENEFIX(tm)), и показывает лучший IVR (1.0 МЕ/дл на МЕ/кг), чем BENEFIX(tm) (0,7).
[0159] Кроме того, FIXFc, произведенный, как описано выше, имел значительно более низкий (в 10-100 раз) уровень (0,01-0,001%) активированного FIX (FIXa), связанной с продуктом примеси, чем MONONINE(tm) (pdFIX) или BENEFIX(tm) (rFIX) (0,1%). Получившийся в результате FIXFc будет реже давать
нежелательные случаи тромбообразования после введения, чем MONONINE(tm) или BENEFIX(tm).
Пример 4. Педиатрические исследования: экстраполяция и взаимосвязь между разработкой у взрослой и педиатрической выборок
[0160] Характеристики пациентов, которые показывают взаимосвязь с FIX фармакокинетикой, включают возраст-зависимые физиологические изменения (Bjorkman and Berntorp, Clin. Pharmacokinetics 40:815-32 (2001); and Bjorkman, Hemophilia 9(suppl 1): 101-10 (2003)) и размер и сложение тела (Shapiro, Hemophilia 11:571-82 (2005)). Таким образом, обычно обнаруживалось, что приведенный в соответствие с весом клиренс (CL) FIX уменьшается с возрастом и и/или весом тела во время роста от младенческого периода к взрослому состоянию, с соответствующим повышением терминального полупериода (ti/г). Для rFIX продукта (BENEFIX(tm)) CL и объем распределения в стационарной фазе (Vss) возрастают у детей и затем остаются постоянными во взрослом состоянии; таким образом, эти параметры будут тщательно мониториться в педиатрических исследованиях.
[0161] Пиковые уровни FIX прокоагулянтной активности (FIX:C) зависят от первичного объема распределения FIX:C после однократных и/или повторных доз FIX. Первоначальное распределение FIX быстрое. Однако показано, что in vivo возрастание концентрации (среднее нарастающее возрастание концентрации) для BENEFIX(tm) было обычно на 30% ниже, чем у фактора коагуляции, полученного из плазмы и очищенного моноклональным антителом (pdFIX) (Roth et al., Blood 98:3600-3606 (2001)). Кроме того, исследования с pdFIX показали, что пациенты в возрасте 15 лет и моложе имеют значительно более низкое возрастание концентрации, чем пациенты более старшего возраста (White et al., Thromb. Haemost. 73:779-84 (1995)). Поэтому в педиатрических исследованиях будет также проводиться мониторинг минимальных и пиковых уровней.
[0162] Поскольку исследования показали, что дети могут реагировать по-другому по сравнению со взрослыми, фармакокинетические оценки при базовом уровне 50 МЕ/кг rFIXFc будут проведены на детях с сокращенным фармакокинетическим взятием проб.
[0163] Фаза 1/2а исследования (SYN-FIXFc-07-OOl), оценивающая безопасность и фармакокинетический профиль однократного внутривенного введения rFIXFc в PTPs в возрасте 18 лет и старше с серьезной гемофилией В, была завершена
недавно. Предварительные результаты этого первичного исследования на людях демонстрируют приблизительно 3-кратное повышение фармакокинетических параметров (средний терминальный полупериод, MRT и AUC) rFIXFc в сравнении с тем, что сообщалось в литературе для BENEFIX(tm) (см. выше). Кроме того, rFIXFc хорошо переносился и не было признаков реакций в месте инъекции, а также не вырабатывались ингибиторы. Взятые вместе, эти результаты по безопасности и фармакокинетике говорят в пользу начала Фазы 1/2/3 регистрационного исследования (998НВ102 Исследование (B-LONG), см. выше), оценивающего безопасность, фармакокинетику и эффективность rFIXFc в предотвращении и лечении кровотечения у 104 PTPs (с по меньшей мере 100 лечебных EDs предыдущих продуктов) 12 лет и старше с тяжелой гемофилией В ( <2%). Когда достаточное количество данных по безопасности будет доступно после регистрационного исследования, будет начата педиатрическая программа для дальнейшего исследования безопасности и эффективности rFIXFc у детей. Демонстрация прологнированного полупериода rFIX у взрослых будет означать, что для профилактики и лечения кровотечений у индивидуумов с гемофилией В будут требоваться более редкие инъекции.
Фаза 2/3 Педиатрическое PTPs исследование ранее подвергавшихся лечению детей (возраст < 12 лет)
[0164] Когда будут доступны даныне по 10 PTPs (> 12 лет) для 26 EDs из регистрационного исследования (Исследование 998НВ 102), будет начато Педиатрическое Исследование, фаза 3. Эта Фаза 2/3 педиатрического исследования, относительно PTPs, которые имели по меньшей мере 50 EDs к FIX продуктам до включения в исследование, будет проведена глобально примерно по 25 клиническим сайтам. Приблизительно 25 PTPs (для того чтобы гарантировать 20 подходящих для оценки пациентов), в возрасте 2-11 лет с тяжелой гемофилией В ( <2 МЕ/дл [ <2%] эндогенный FIX), будут скринированы и отобраны в соответствии с определенными заранее критериями. Все получившие оценку пациенты войдут в фармакокинетическую часть исследования (РК с предисследуемым FIX продуктом и затем РК с rFIXFc) и будут получать еженедельно дозу rFIXFc на протяжении 52 недель. В этом исследовании будет фиксироваться постепенное повышение концентрации, период полувыведения in vivo, AUC, и клиренс rFIXFc. Все пациенты подвергнутся фармакокинетической оценке базового уровня с FIX и rFIXFc перед исследованием, и продолжительность исследования для каждого
пациента будет приблизительно составлять 69 недель, включая скрининг и последующее наблюдение.
[0165] Каждый пациент получит 50 МЕ/кг rFIXFc при первом визите для фармакокинетической оценки, после чего последуют повторяющиеся еженедельные дозы 50-60 МЕ/кг rFIXFc. С учетом соблюдения режима пациентом, фармакокинетические пробы для пред-исследования продукта и для rFIXFc будут браться по сокращенной программе, а именно: перед дозой, конец инъекции, 30 + 10 минут, 3 ± 1 часа, 24 + 3 (День 1), 72 + 3 (День 3), 120 + 3 (День 5) и 168 + 3 часа (День 7) после окончания инъекции. Для того чтобы исследовать иммуногенность, все пациенты получат rFIXFc еженедельно минимум 50 EDs. Параметры безопасности будут включены для немедленной оценки безопасности и переносимости, такие как: (а) основные показатели состояния организма (пульс, давление крови, частота дыхания, температура) перед инъекцией rFIXFc и через 30 минут после инъекции; (Ь) параметры гематологии и коагуляции; (с) клиническая химия; (d) частые определения FIX ингибитора с использованием модифицированного по Неймегену Бетезда-анализа (непосредственно перед первым воздействием, ED4 [Неделя 4], ED12, ED24, ED36 и ED50); и (е) нежелательные явления.
[0166] Эффективность будет оцениваться по оценке числа эпизодов кровотечения, интервалов между кровотечениями и числу лечений и потребления FIX в оцениваемый год и на случай, требующий лечения. Фаза 2/3 Педиатрическое PUPs исследование ранее не получавших лечение детей (возраст 0-11 лет)
[0167] Когда данные по 10 ранее получившим лечение детям (2-11 лет) с полной фармакокинетикой и 50 EDs будут доступны в предшествующем исследовании, будет начата Фаза 2/3 педиатрического PUPs исследования. Это исследование будет проведено глобально примерно на 60 клинических сайтах. До 30 PUPs (для обеспечения 20 пригодных для оценки пациентов) в возрасте 0 лет и старше с серьезной гемофилией В ( <2 МЕ/дл [ <2%] эндогенный FIX) будут скринированы и отобраны в соответствии с предварительно определенными критериями.
[0168] Участие в исследовании будет варьировать, поскольку при начале лечения может использоваться rFIXFc как модифицированный профилактический режим. Ожидается, что участие пациента в исследовании будет продолжаться примерно четыре года, включая скрининг и наблюдение за отдаленными результатами. Ожидается, что в течение этого времени большинство пациентов достигнут 50 EDs
до rFIXFc. Для того чтобы исследовать иммуногенность, все пациенты будут подвергнуты лечению приблизительно 50 EDs rFIXFc или в течение периода времени до 4 лет. Параметры безопасности будут включены для немедленной оценки безопасности и переносимости: (а) частые определения FIX ингибитора с использованием модифицированного по Неймегену Бетезда-анализа; и (Ь) нежелательные явления. [0169] Эффективность будет оцениваться по оценке числа эпизодов кровотечения, интервалов между кровотечениями и числа лечений и потребления FIX на анализируемый год и на случай, требующий лечения.
Пример 5. Биохимическая характеристика, активность и анализ РК у животных, не
являющихся человеком
[0170] rFIXFc, произведенный в Примере 3, был охарактеризован по своей посттрансляционной модификации, и были получены следующие результаты (см. Таблицу 15 и Фигуру 11). Пропептид rFIXFc был должным образом процессирован во время производства. Паттерн rFIXFc's гамма-карбоксилирования был подобен паттерну rFIX. Кроме того, общее Gla/молекула (11,2 ± 0,7) rFIXFc было сравнимо с rFIX. Поскольку гамма-карбоксилирование определенных остатков необходимо для активности FIX, эти результаты являются важными. Кроме того, Ser 158 фосфорилирование и Туг 155 сульфатирование rFIXFc были сравнимы с rFIX. N-связанные гликаны в FIX не полностью сиалированны, так же как у rFIX. rFIXFc О-связанное гликозилирование первого EGF домена было таким же, как у FIX, хотя и в различных сравнительных соотношениях. Asp 64 из rFIXFc имел более высокую степень бета-гидроксилирования, чем rFIX или полученный из плазмы FIX (pdFIX). Активированный FIX присутствовал в намного более низкой концентрации в препарате rFIXFc, чем в rFIX или pdFIX препаратах, как описано детально в Примере 3.
[0171] Кроме того, rFIXFc был введен различным видам животных для определения его активности и параметров РК. Результаты показаны в Таблице 16 и на Фигурах 1216.
Пример 6. Гамма-карбоксилирование
[0172] Целями этого исследования было проанализировать и охарактеризовать у-карбоксилирование глутаминовых кислот (Gla) в доклинической партии FIXFc материала и имеющихся в продаже FIX продуктах, охарактеризовать содержание
Gla в обогащенной "пиковой" фракции и высокосолевого элюирования "стрип" фракции, первоначально полученной на этапе псевдоаффинной ион-обменной хроматографии, и в дальнейшем разделить на обогащенную "пиковую" и на высокосолевого элюирования "стрип" фракцию путем анион-обменной ВЭЖХ, а затем охарактеризовать различные образцы.
[0173] Для достижения этих целей, было разработано множество дополнительных аналитических способов. Они включают аминокислотный анализ (AAA) с использованием щелочного гидролиза для определения (общего) содержания Gla, пептидную карту (LC/MS) с использованием Lys-C пептидов для определения распределения Gla, аналитическую анионобменную ВЭЖХ интактных молекул для разделения изоформ, и активированное частичное тромбопластиновое время (аРТТ) для определения биологической активности.
[0174] Два Gla (Е) содержащих пептида представляют собой:
-К1К2: YNSGKL7E8EFVQGNL15ER17M:M20E21EK
•[М+Н]+6 Gla = 2953,9 •[М+Н]+5 Gla = 2909,9
-кз: CSF26E27EAR30EVF33ENT36ERTT40Ј:FWK
•[М+Н]+6 Gla = 2959,9 •[М+Н]+5 Gla = 2915,9 •[М+Н]+4 Gla = 2871,9
[0175] Тридцать микрограмм образца (полученного из обогащенной пиковой фракции, высокосолевой стрип-фракции, и каждый образец из аналитической анионобменной ВЭЖХ) был денатурирован, восстановлен, алкилирован и обработан Lys-C (1:20, E:S). Реакция была остановлена 2% TFA, и обработанный продукт был введен в Jupiter С18 (2,0 х 250 мм) Phenomenex колонку. Разделение было осуществлено Agilent 1100 системой. Колонка была установлена на 25° С и пептиды были элюированы по многоступенчатому ацетоннитриловому градиенту. Масс-спектрометрия (Thermo-Fisher LCQ) была проведена по "Triple Play" способу.
[0176] Для анализа и характеристики содержания Gla и распределения доклинического rFIXFc материала были разработаны дополнительные способы. у-карбоксилирование доли глутаминовых кислот (Gla) и распределение доклинической партии rFIXFc (обогащенная пиковая фракция) было проведено и сравнено с имеющимися в продаже продуктами. Анализ продемонстрировал такое же содержание и распределение Gla, как и у имеющихся в продаже продуктов. Высокосолевого элюирования "стрип" фракция была проанализирована и сравнена
с обогащенной пиковой фракцией. Анализ показал пониженный уровень у-карбоксилирования.
[0177] FIXFc (Обогащенная Пиковая Фракция) была выделена на ион-обменном этапе псевдоаффинной хроматографии и затем разделена на 3 изоформы путем аналитической анионобменной ВЭЖХ. Загруженные в АЕХ колонку и разделенные образцы были высоко у-карбоксилированы. (Загрузка АЕХ колонки представляет собой стрип фракцию, собранную во время этапа высокосолевого элюирования из этапа псевдоаффинной ион-обменной хроматографии.) Загруженные в АЕХ колонку и разделенные образцы были биологически активными. Содержание и распределение Gla было подобно rFIX. Пептидная карта показала распределение 4/5/6 Gla's у КЗ пептида. Пептидная карта показывает высокое количество 6 Gla's в К1К2 пептиде и следовые количества 5 Gla's.
[0178] FIXFc (Стрип Пиковая Фракция) была выделена на ионобменном этапе псевдоаффинной хроматографии и затем разделена на 2 изоформы путем аналитической анионобменной ВЭЖХ. Загруженные в АЕХ колонку и разделенные образцы имели сниженный уровень у-карбоксилирования. Наблюдалось уменьшенное содержание Gla по сравнению с обогащенной FIXFc пиковой фракцией. Наблюдался пониженный уровень биологической активности. Пептидная карта показывает повышенное количество 5 Gla's в К1К2 по сравнению с обогащенной пиковой фракцией, что может подтверждать влияние биологической активности.
[0179] Ссылки (каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки): Dumont JA, et al., Monomeric Fc Fusion Molecules in Therapeutic Abs-From Bench to Clinic, Ch. 33 p779-795; Gillis S, et al., Protein Science (1997) 6:185; White GC, et al., J. Thrombosis and Haemostasis (1997) 78:261; Hansson K, and Stenflo J, Journal Thrombosis and Haemostasis (2005) 3:2633; and Peters RT, et al., Blood (2010) 115:2057.
Пример 7. Оценка rFIXFc про-коагулянтной активности в моделях кровотечений у НетВ
мышей
Сравнительный потенциал rFIXFc и BENEFIX(tm) был продемонстрирован у НетВ мышей по анализу цельной крови ROTEM in vitro и у НетВ мышей модели кровотечения при отсечении хвоста in vivo.
[0180] Способность rFIXFc формировать прочные и стабильные сгустки была оценена по Ротационной Тромбоэластометрии (ROTEM(r), Pentapharm GmbH, Munich, Germany)
с хлоридом кальция как активатором (NATEM). Совокупная цельная кровь, собранная из полой вены НетВ мышей, была разделена на семь аликвот, в которые был впрыснут rFIXFc до конечной концентрации 7,4%, 0,74% и 0,074% нормальной плазматической FIX активности, или BENEFIX(tm) до 10%, 1%, 0,1% от нормы. В качестве негативного контроля, в пробу крови был впрыснут буфер FIX состава. Пулы общим числом 10 от 5 НетВ мышей были созданы для завершения исследования. Реакция NATEM была инициирована добавлением СаСЬ.. Исследовались параметры коагуляции, включая Время Свертывания (СТ), Время Формирования Сгустков (CFT) и Альфа Угол. Среднее и SD от СТ, CFT и альфа угол суммированы в Таблице 17. Дозовые ответы для трех параметров нанесены на график на Фигуре 17. Все три параметра сравнивались между rFIXFc и BENEFIX(tm) в тестируемом дозовом диапазоне (р> 0,05 по однофакторному ANOVA (Крускал-Уоллис) анализу).
[0181] Эффективность в неотложном случае rFIXFc была также оценена в модели кровотечения при отсечении хвоста у НетВ мышей. (Фигура 18.) Самцы НетВ мышей были стратифицированы для эквивалентной презентации веса тела и возраста в различных экспериментальных группах. Перед отсечением хвоста мыши были анестезированы смесью 50мг/кг Кетамина и 0,5 мг/кг Дексмедетомидина и помещены на подогреваемую подушку для подержания температуры тела. Хвосты мышей были затем погружены в 37°С воду на 10 минут для расширения латеральной вены. После расширения латеральной вены rFIXFc, BENEFIX(tm) или раствор-наполнитель были введены путем инъекции в хвостовую вену и через 5 минут дистальные 4 мм хвоста были отсечены с использованием #11 скальпеля с прямым лезвием. Изливавшаяся кровь собиралась в 13 мл теплого солевого раствора в течение 30 минут и потеря крови была подсчитана гравиметрически. Тестировались шесть rFIXFc экспериментальных групп (720, 360, 240, 120, 80, 40 МЕ/кг, п=15) и три BENEFIX(tm) экспериментальные группы (360, 120, 40 МЕ/кг, п=15). Объем потери крови отдельного животного и кривая дозового ответа медианной потери крови показаны на Фигуре 19(A), и медианный объем потери крови каждой экспериментальной группы суммирован в Таблице 18. Дозовые ответы по медианному объему потери крови для rFIXFc и BENEFIX(tm) сравнимы (р = 0,9315 по непарному t критерию с коррекцией Уэлча).
[0182] Для определения того, является ли трехкратное увеличение продолжительности периода полувыведения rFIXFc по сравнению с BENEFIX(tm) результатом пролонгированной эффективности rFIXFc, изобретатели настоящего изобретения
оценили эффективность rFIXFc и BENEFIX(tm) как в ex-vivo ROTEM(r) анализе, так и в модели кровотечения при рассечении хвостовой вены (TVT) у НетВ мышей. Фигура 20.
[0183] Для ex vivo ROTEM(r), самцы НетВ мышей получили 50 МЕ/кг rFIXFc или 100 МЕ/кг BENEFIX(tm) путем внутривенной инъекции. Цельная кровь была собрана из полой вены обработанных животных на 5 мин, 24, 72, 96, 120, 168 и 216 часах после rFIXFc дозирования (п=8 мышей на каждую временную точку) или на 5 мин, 24, 48, 72 и 96 часах после BENEFIX(tm) дозирования (п=4 мыши/временная точка). Пробы крови анализировались с помощью NATEM. Среднее и SD для СТ, CFT и альфа угол показаны в Таблице 19, и СТ, CFT и альфа угол по сравнению с временными кривыми показаны на Фигуре 21. В сравнении с BENEFIX(tm), rFIXFc показал сравнимый СТ, CFT и альфа угол на 5 мин, но достоверно повышенный СТ, CFT и альфа угол после 72 ч несмотря на дозу в 2 раза ниже по сравнению с BENEFIX(tm).
[0184] Для оценки профилактической эффективности rFIXFc и BENEFIX(tm), самцы НетВ мышей были стратифицированы для эквивалентной репрезентации веса тела и возраста в 9 различных опытных группах. rFIXFc был введен путем вв инъекции в дозе 4 МЕ/кг, 13 МЕ/кг, 40 МЕ/кг и 120 МЕ/кг на 72 часах перед рассечением хвостовой вены, тогда как те же дозы BENEFIX(tm) были введены на 24 часах перед травмой. Перед рассечением хвостовой вены мыши были анестезированы смесью 50 мг/кг Кетамин/0,125 мг/кг Дексмедетомидин/ 0,1 мг/кг Бупренекс. Для того чтобы дать возможность мышам поддерживать нормальную активность после рассечения хвостовой вены, 1 мг/кг раствора Атипамезола было дано для того чтобы обратить действие Дексмедетомидина, за чем немедленно последовало рассечение латеральной хвостовой вены хирургическим скальпелем номер 11с плоским лезвием в области, где диаметр хвоста приблизительно равняется 3 мм. Льющаяся кровь смывалась теплым солевым раствором для обеспечения четкой видимости раны, и мышь была затем помещена отдельно в чистую клетку с белой бумажной подкладкой на следующие 24 часа. Остановка кровотечения и физическая активность налюдались и фиксировались ежечасно в течении периода времени до 12 часов после травмы. Умирающие мыши были немедленно подвергнуты эфтаназии после идентификации, и полный осмотр для завершения исследования был проведен через 24 часа после травмы. Кривая Каплана-Мейера для времени эвтаназии и карта степеней выживаемости через 24 часа после TVT показаны на Фигуре 22. Логарифмический ранговый критерий определил, что все
экспериментальные группы с дозой выше чем 4 МЕ/кг достоверно лучше, чем группа, обработанная раствором-наполнителем (р <0,001). Кроме того, выживаемость сравнивалась между мышами, которые получили одинаковую дозу rFIXFc на 72 ч перед травмой и BENEFIX(tm) на 24 ч перед травмой (р= 0,4886; 0,9268; 0,7279 и 0,5209 для 4, 13, 40 и 120 МЕ/кг дозовых групп соответственно). Степени выживаемости на 24 часах после TVT были нанесены на график и ED50 значение для каждой молекулы было экстраполировано из кривой, ED50 для двух обработок одинаковы при 17,8 МЕ/кг для rFIXFc и 15,4 МЕ/кг для rFIX. Следовательно, rFIXFc предоставлял в 3 раза большую продолжительность защиты у НетВ мышей по сравнению со сравнимой дозой BENEFIX(tm), как оценивалось по выживаемости и повторному кровотечению после травмы рассечения хвостовой вены. Следовательно, rFIXFc предоставлял в 3 раза большую продолжительность защиты у НетВ мышей по сравнению со сравнимой дозой BENEFIX(tm), как оценивалось по выживаемости и повторному кровотечению после травмы рассечения хвостовой вены.
[0185] В заключение, как показывают данные, несмотря на то, что 15,4 МЕ/кг BENEFIX(tm) приводило к 50% выживаемости НетВ мышей при рассечении хвостовой вены на 24 ч после дозирования, 50% выживаемости у животных, получивших 17,8 МЕ/кг rFIXFc было достигнуто при травме на 72 ч после дозирования. Следовательно, rFIXFc демонстрирует в 3 раза более длительную профилактическую эффективность в корреляции с продлением его периода полувыведения в сравнении с BENEFIX(tm). Результаты мо моделям кровотечения в дальнейшем были подтверждены ex vivo ROTEM(r) анализом цельной крови из НетВ мышей, обработанных или 100 МЕ/кг BENEFIX(tm), или 50 МЕ/кг rFIXFc. На 5 мин после дозирования, сравнимые улучшения в образовании сгустка наблюдались в обеих экспериментальных группах. Однако большинство ROTEM(r) параметров, таких как время свертывания, время образования сгустка и альфа-угол были достоверно лучше у rFIXFc-обработанных мышей от 72 до 216 ч после дозирования, несмотря на в 2 раза более низкую дозу rFIXFc по сравнению с BENEFIX(tm).
[0186] Подводя итог, потенциал rFIXFc в неотложном случае сравним с таковым у BENEFIX(tm), как показано и на ROTEM(r) цельной крови in vitro, и на модели кровотечения при отсечении хвоста у НетВ мышей. Пролонгированная профилактическая эффективность rFIXFc была показана на ex vivo ROTEM(r) цельной крови у обработанных НетВ мышей и была определена как
приблизительно в 3 раза более длинная в сравнении с BENEFIX(tm) в модели кровотечения при рассечении хвостовой вены у НетВ мышей. Пролонгированная эффективность rFIXFc хорошо коррелирует с в 3 раза более длинным Тш rFIXFc по сравнению с BENEFIX(tm) , ранее демонстрировавшимся в фармакокинетическом исследовании у НетВ мышей. Следовательно, rFIXFc полностью активен для лечения по требованию, поскольку достигается достоверно пролонгированная профилактическая защита с потенциалом уменьшения частоты дозирования, что является объектом изучения в фазе 3 исследования.
Пример 8. Анализ фармакокинетики и фаркакодинамики rFIXFc и BENEFIX(tm) после однократной подкожной дозы дефицитным по FIX мышам
[0187] Фармакокинетические (РК) и фармакодинамические (PD) профили рекомбинантного Фактора IX-Fc (rFIXFc) и BENEFIX(tm) (rFIX) были определены после однократной внутривенной или подкожной инъекции 200 или 400 МЕ/кг у дефицитных по FIX мышей. Цельная кровь была собрана из полой вены (п=4 мыши/временная точка/обработка). Концентрации rFIXFc и BENEFIX(tm) в плазме крови были определены с использованием специфичного на человеческий FIX анализа ИФА. Активность rFIXFc и BENEFIX(tm) определялась с использованием анализа активированого частичного времени тромбопластина. РК анализы были проведены с использованием модель-зависимой методологии, использующей WinNonLin. Результаты показаны в Таблицах 22 и 23.
[0188] Для FIXFc, биодоступность у дефицитных по FIX мышей составляла 38% для дозы 200 МЕ/кг и 38-46% для комбинированной дозы (антиген ИФА) и 29% для дозы 200 МЕ/кг и 29-39% для комбинированной дозы (исследование аРТТ активности) по сравнению с rFIX, 23% и 19%, соответственно. rFIXFc имел в 1,5-1,7 раза (доза 200 МЕ/кг) и в 1,5-2,5 раза (комбинированные дозы) повышенную биодоступность по сравнению с BENEFIX(tm).
[0189] Для rFIXFc терминальный полупериод (антиген ИФА) составлял 62 ч для дозы 200 МЕ/кг и 51-62 ч для комбинированных доз и терминальный полупериод (исследование аРТТ активности) составлял 42 ч для дозы 200 МЕ/кг и 40-42 ч для комбинированных доз , тогда как для BENEFIX(tm) терминальный полупериод составлял 24 ч (антиген ИФА) для дозы 200 МЕ/кг и 17 ч (исследование аРТТ активности) для дозы 200 МЕ/кг. Это указывает на 2,5-2,6 кратное (доза 200 МЕ/кг и комбинированная доза) повышение полупериода с rFIXFc.
[0190] Кроме того, как показано в Таблицах 22 и 23, rFIXFc имел 4,5-5,6 кратное возрастание AUC/доза и 1,9-3,7 кратное возрастание Cmax/доза по сравнению с BENEFIX(tm).
[0191] Рекомбинантный фактор IX Fc гибридный (rFIXFc) белок является долгодействующей формой рекомбинантного FIX (rFIX), что даст возможность менее частого дозирования rFIX при лечении гемофилии В. У мышей и нечеловекообразных приматов и пациентов с гемофилией В rFIXFc имеет приблизительно в 3 раза более длинный период полувыведения по сравнению с rFIX (BENEFIX(tm)). Для профилактического лечения внутривенное введение rFIX остается сложным способом доставки, особенно у детей и пациентов с трудно доступными венами. Подкожное введение rFIX представляется более привлекательным путем доставки, менее травматичным и с менее частым дозированием. Таким образом, подкожное введение rFIXFc причинит меньше боли и дискомфорта чем внутривенное введение, и приведет к улучшенному соблюдению режима лечения, поскольку введение более легкое и занимает меньше времени, чем в случае внутривенного введения. Профилактический режим также улучшит качество жизни, и клинические последствия будут включать сниженные случаи кровотечения.
[0192] Концентрация rFIXFc в плазме мышей была подсчитана с использованием FIX-специфичного человеческого ИФА, по которому оценивалась FIX часть молекулы и мг/кг номинальная доза использовалась в анализе. Суммарные РК параметры для rFIXFc и BENEFIX(tm) показаны в Таблице 20 (антиген ИФА) и Таблице 21 (исследование активности аРТТ) для п=4/группа. Оба анализа антигена и активности показали, что Стах и AUC в случае rFIXFc были достоверно улучшены по сравнению с BENEFIX(tm). При использовании антигена ИФА, биодоступность (F %) составляла 38% для rFIXFc по сравнению с 23% для BENEFIX(tm). Подобным образом, при использовании исследования активности аРТТ биодоступность составляла 29% для rFIXFc по сравнению с 19% для BENEFIX(tm). Таким образом, rFIXFc по сравнению с BENEFIX(tm) демонстрировал повышение биодоступности в 1,5-1,6 раза. Оценки полупериода элиминации показали, что rFIXFc заметно повышал полупериод, как было подсчитано по анализам антигена (rFIXFc 62 ч по сравнению с BENEFIX(tm) 24 ч) или активности (rFIXFc 42 ч по сравнению с BENEFIX(tm) 17 ч). Эти данные показывают, что rFIXFc имел полупериод, удлиненный по сравнению с BENEFIX(tm) в 2,6-2,5 раза.
[0193] rFIXFc, даваемый подкожно дефицитным по FIX мышам, демонстрировал РК и PD профиль с возрастаниями в Стах и AUC для rFIXFc по сравнению с BENEFIX(tm). В целом, биодоступность для rFIXFc находилась в диапазоне от 29% (активность) до 38% (антиген) с полупериодом от 42 ч (активность) до 62 ч (антиген) по сравнению с BENEFIX(tm), который имел биодоступность от 19-23% и полупериод от 17-24%, соответственно. Таким образом, полупериод для rFIXFc, введенного подкожно дефицитным по FIX мышам, продемонстрировал возрастание в от около 2,2 (антиген) раза до 3,3 (активность) раза по сравнению с имеющимися в продаже rFIX продуктами, даваемыми внутривенно. В целом, эти данные подтверждают, что замечание, что rFIXFc, доставляемый подкожно, будет иметь клиническое преимущство для профилактического лечения пациентов с гемофилией В.
Пример 9. Фармакокинетический анализ rFIXFc после однократной подкожной дозы
яванским макакам
[0194] Фармакокинетический профиль (РК) рекомбинантного Фактора IX-Fc (rFIXFc) был исследован после однократной подкожной дозы 50 МЕ/кг, 100 МЕ/кг или 200 МЕ/кг яванским макакам. Концентрация rFIXFc в плазме крови была подсчитана с использованием FIX-специфчного ИФА. Первичный анализ был проведен с использованием модель-зависимой методологии с использованием WinNonLin. См. Таблицы 22-25.
[0195] Фармакокинетический анализ концентрации в плазме по сравнению с временными данными (подсчитан по FIX-специфичной ИФА) продемонстрировал, что биодоступность и терминальный полупериод были одинаковыми при различных дозах. Биодоступность rFIXFc составляла 40% (50 МЕ/кг), 34% (100 МЕ/кг), 36% (200 МЕ/кг) и 36-45% (комбинированные дозы). Терминальные полупериоды для rFIXFc составляли 61 ч (50 МЕ/кг), 45 ч (100 МЕ/кг), 49 ч (200 МЕ/кг) и 44-58 ч (комбинированные дозы).
[0196] Концентрация rFIXFc в плазме крови обезьян была подсчитана с использованием FIX-специфичного ИФА, который измерял FIX часть молекулы, и мг/кг номинальная доза была использована в анализе. Анализы выброса и повышения концентрации продемонстрировали точность этого FIX-специфичного ИФА анализа для детекции rFIXFc в диапазоне оцениваемых плазматических концентраций. Сводки РК параметров для rFIXFc показаны в Таблице 22 (50 МЕ/кг), Таблице 23 (100 МЕ/кг) и Таблице 24 (200 МЕ/кг) для п=3/группа. Для rFIXFc SC геометрические средние и CV% геометрического среднего для Стах
составляли 860 + 22 (50 МЕ/кг), 1630 + 97 (100 МЕ/кг) и 3,750 + 26 (200 МЕ/кг), соответственно указывая на дозозависимое возрастание. Подобные возрастания наблюдались для AUC. Геометрические средние для биодоступности (F %) составляли 40 + 16 (50 МЕ/кг), 30 + 75 (100 МЕ/кг) и 36 + 27 (200 МЕ/кг), демонстрируя, что биодоступность была одинакова при разных дозах. Измерения терминального полупериода показали, что полупериод был одинаков в диапазоне доз 58 + 39 ч (50 МЕ/кг), 45 + 13 ч (100 МЕ/кг) и 46 + 44 ч (200 МЕ/кг). [0197] rFIXFc, даваемый подкожно яванским макакам, демонстрировал РК профиль с дозозависимым возрастанием Стах и AUC. В целом, биоактивность находилась в диапазоне 30-40% с полупериодом 45-58 ч. Таким образом, полупериод для rFIXFc, введенного подкожно макакам, демонстрировал примерно 2,8-кратное возрастание по сравнению с имеющимися в продаже rFIX продуктами, даваемыми внутривенно. В целом, эти данные поддерживают представление, что rFIXFc, вводимый подкожно, будет имет клиническое преимущество для профилактического лечения пациентов с гемофилией В.
Пример 10. Рекомендуемые профилактические дозовые режимы
[0198] По сравнению со стандартными рекомендованными дозовыми режимами от 25 до 40 МЕ/кг FIX дважды или три раза в неделю, медианная rFIXFc активность РК, полученная в ходе Фазы 1/2а исследования, описанного выше, подтверждает, что дозирование rFIXFc около одного раза в неделю около 22,5 МЕ/кг, или примерно каждые 10 дней около 45 МЕ/кг, или примерно каждые 2 недели около 120 МЕ/кг достаточно для поддержания минимального уровня 1% выше базового уровня (Фигура 24). Эти модель-симулированные оценки валидированы по доступным данным из Фазы 1/2а исследования, которое полностью попадает в 95% доверительный интервал моделированной кривой "активность по отношению ко времени". Эти режимы часто будут служить для начала терапии. Принимая во внимание гетерогенность сообщаемых клинических случаев прорывного кровотечения по отношению к минимальному уровню плазматической FIX активности, поддерживающие дозы необходимо будет рассчитывать индивидуально.
[0199] После перерасчета РК результатов Фазы 1/2 исследования (см. Пример 11), новый расчетный дозовый режим, например, для профилактики, составляет 20 МЕ/кг один раз в неделю, 40 МЕ/кг каждые 10 дней или 100 МЕ/кг каждые две недели (два раза в месяц). См. также Таблицу 27 и Фигуру 25.
Пример 11. Перерасчет фармакокинетических данных впервые проведенного на человеке
(FiH) исследования (Пример 1)
[0200] Пациенты с различными генотипами гемофилии В, такими как стоп кодон/нонсенс и мисенс-мутациями, были включены в FiH исследование, обсуждаемое в Примере 1. Несколько пациентов имели заметно сниженные эндогенные уровни FIX антигена, что коррелировало с заметно сниженной FIX активностью, тогда как у нескольких пациентов с миссенс-генотипами было больше антигена, чем подсчитанной активности, что указывает на дисфункциональный циркулирующий белок. FIX активность до лечения у 2 пациентов превышала 2 МЕ/дл, вероятно, вследствие неполного вымывания после последнего вливания FIX концентрата на основе тестирования в анамнезе и фенотипа болезни. Основываясь на этой информации, РК данные из Примера 1 были перерасчитаны без вычитания базового уровня, как детально описано ниже. См. Таблицу 27.
[0201] В отличие от РК расчетов (на основании активности) в Примере 1, если rFIXFc активность РК моделировалась без вычитания базового уровня, как недавно сообщалось для РК анализа гликопегилированного rFIX (Negrier et al., Blood DOI 10.1182/blood 2011 02 335596 (2011), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки), получившиеся в результате оценки полупериода элиминации и MRT намного длиннее, чем оценки в Примере 1, на 82,2 ± 21,6 и 96,8 + 22,0 часах (среднее + SD), соответственно. Однако, зная, что не все пациенты с тяжелой гемофилией В имеют 0% эндогенной FIX активности, и принимая во внимание генотип пациента и эндогенный уровень FIX антигена, изобретатели настоящего изобретения адаптировали способ анализа с вычитанием базового уровня в своем РК моделировании. Более точно, (а) базовый уровень у двух пациентов был определен как 0%, поскольку их FIX активность перед лечением составляла <1%, они не имели определяемого FIX антигена и имели нонсенс-генотипы, (Ь) базовый уровень у трех пациентов был установлен как 0,5%, поскольку их FIX активность перед лечением была <1% и они имели детектируемый FIX антиген, (с) для пациентов, чья FIX активность перед лечением была между 1 - 2%, Cmin (самая низкая активность в ходе РК исследования) определялась как базовый уровень, и (d) для пациентов, чья FIX активность перед лечением была > 2%, 2% (что было выше пограничного значения для вхождения в исследование) было базовым уровнем. Активность выше базового уровня перед дозой рассматривалась как остаточное действие лекарства от предыдущего
лечения, и была сведена к базовому уровню и вычтена из РК данных после rFIXFc дозирования.
[0202] Получившийся в результате средний терминальный полупериод (56,7 ± 10,9 часов,
диапазон 42,4-74,5 часа) и MRT (71,8 + 10 часов, диапазон 53,2 - 85,9 часа)
rFIXFc приблизительно в 3 раза длиннее, чем сообщаемые для rFIX. Сообщаемый
терминальный полупериод rFIX составляет 19,3 + 4,97 часов (диапазон
11,1 - 36,4 часов) и MRT 26,0 + 6,07 часов (диапазон 15,8 - 46,1 часов). Roth et al.,
Blood 98:3600-3606 (2001); и Summary of Product Characteristics for BENEFIX(tm),
Electronic Medicines Compendium (2010)
(http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/20376/SPC/BENEFIX(tm)/#PHARMACOD YNAMIC_PROPS), каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Таким образом, диапазоны для rFIXFc не перекрывают диапазоны для rFIX. Подобным образом, среднее CL rFIXFc активности (3,18 + 0,78 мл/ч/кг, диапазон 2,05 - 4,18 мл/ч/кг) приблизительно в 2,6 раза меньше, чем сообщаемое для rFIX (8,40 + 2,01 мл/ч/кг, диапазон 4,66 -13,64 мл/ч/кг), тогда как Vss обоих белков сравнимы при 4-5 кратном объеме плазмы.
[0203] Хотя та же тенденция улучшения показателей наблюдалась при rFIXFc антигене РК, и ТшОС, и ТшР rFIXFc антигена были достоверно длиннее, чем исходит из подсчетов FIX активности. Туга, оцененный для rFIXFc антигена, определенно отклоняется от того, который в норме связан с FIX (2-3 часа). Кроме того, возможное недостаточное вымывание от заместительной терапии до исследования перед вливанием rFIXFc иногда приводило к более высокому базовому значению, которое в свою очередь могло приводить к недооценке rFIXFc Ту2р\ как подсчитано по FIX активности. Многие пациенты имели аРТТ активность до 3 МЕ/дл, что значительно превышает предельное количество (1 МЕ/дл) для аРТТ анализа, на последних временных точках 336 часов (14 дней) после дозы. Однако эти временные точки были исключены из оценки терминального полупериода, поскольку эти значения или находились на базовых уровнях, или были лишь слегка выше их, что рассматривалось как возвращение к базовому уровню. Напротив, низкие но детектируемые терминальные уровни rFIXFc могут быть обнаружены путем специфичного и высокочувствительного rFIXFc антиген ИФА, который детектирует 0,1 МЕ/дл, в сравнении с самым нижним лимитом для аРТТ в 1,0 МЕ/дл.
[0204] Оставшиеся РК параметры (активность) изменялись незначительно в соответствии с полупериодом элиминации и MRT. См. Таблицу 27(B). Дозопропорциональное линейное повышение FIX активности наблюдалось на основе Стах , возникающего сразу же после вливания и AUCINF (Таблица 4). FIX активность демонстрировала биэкспоненциальное затухание после вливания rFIXFc и характеризовалась быстрой фазой распределения (альфа), за которой следовала линейно-логарифмическая фаза элиминации (бета). Средний полупериод распределения (Тшос) был высоко вариабелен у отдельных пациентов (среднее 3,4 и 10,3 часов для двух групп с более высокими дозами) (Таблица 27(B)). Средний полупериод элиминации (ТшР) был дозонезависимым в тестируемом терапевтическом дозовом диапазоне, то есть, 53,5 часов, 57,5 ± 8,2 часов и 56,5+ 14,1 часов при 25 МЕ/кг, 50 МЕ/кг и 100 МЕ/кг, соответственно. Время 1% (1 МЕ/дл) выше базовой линии, при оценке rFIXFc активности, показало дозопропорциональное возрастание. Это составляло 7,3; 10,1 + 1,5 и 12,3 + 2,5 дней для доз 25, 50 и 100 МЕ/кг, соответственно. На 168 часах (1 неделя) после дозы плазматическая FIX активность установилась как 1,1 МЕ/дл, 2,5 +0,9 МЕ/дл и 4,6 + 1,7 МЕ/дл выше базового уровня для 25, 50 и 100 МЕ/кг дозовых групп, соответственно. Также дозонезависимыми были MRT, CL и Vss в пределах дозового диапазона от 25 до 100 МЕ/кг. Кроме того, каждый 1 МЕ/кг влитого rFIXFc поднимал плазматическую FIX активность в среднем на 0,93 + 0,18 МЕ/дл (Таблица 27(B)), и это увеличение концентрации (К) показало слабую позитивную корреляцию с весом тела (R2=0,336, р=0,048)
[0205] Долговременный эмпирический клинический опыт подтверждает, что постоянной активности фактора в плазме на уровне 1-2 МЕ/дл будет достаточно для предотвращения спонтанных случаев кровотечения у пациентов с тяжелой гемофилией А и В, (Nilsson et al., J. Intern. Med. 232:25-32 (1992), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки), и учащенные случаи кровотечения связаны с количеством времени ниже 1% от нормальной FVIII активности. Collins et al, Thromb Haemost 7:413-420 (2009), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Таким образом, РК анализы предоставляют средства для оптимизации профилактического лечения с индивидуализированным моделированием дозы для достижения постоянных минимальных уровней выше 1% (1 МЕ/дл ) от базового уровня, уменьшения вариабельности пик/минимум и улучшения соотношения стоимость/эффективность лечения. Carlsson et al., Haemophilia 4:83-88 (1998); Kisker et al,Haemophilia 9:279-
-64284 (2003), каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.
[0206] Для создания профилей концентрация-время, соответствующих различным режимам дозирования, был проведено моделирование по способу Монте-Карло с использованием популяционной РК модели rFIXFc. Средние оценки параметров модели (CL, объем распределения, внутри-компартментый клиренс и объем второго компартмента) в тестируемой популяции, вариабельность между отдельными индивидуумами, и остаточная вариабельность были адаптированы для этой Фазы 1/2а исследования. Wang et al., J. Clin. Pharmacol. 49:1012-1024 (2009), которая включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Одна тысяча пациентов была смоделирована на дозовый режим с 14-16 точками взятия проб для каждого пациента. Было 14 точек взятия проб для еженедельного дозирования, 15 для дозирования каждые 10 дней, и 16 для дозирования раз в 2 недели. Вес тела (BW) был смоделирован в соответствии с опубликованным способом, Wang et al. (2009), то есть на основестепенного уравнения Z=BW-0,5. Медианный BW у 1000 пациентов был предположен как 75 кг. На основе моделированных профилей концентрация-время, среднее ± стандартное отклонение (SD) лекарственных профилей концентрация-время у 1000 пациентов было сконструировано графически для различных режимов дозирования. Фигура 25.
[0207] В сравнении со стандартным рекомендованным дозовым режимом от 25 до 40 МЕ/кг FIX дважды в неделю, моделирующие результаты медианной rFIXFc активности РК из этого исследования показывают, что дозирование один раз в неделю rFIXFc при 20 МЕ/кг, или каждые 10 дней при 40 МЕ/кг, или каждые 2 недели при 100 МЕ/кг достаточно для поддержания минимального уровня 1% выше базового уровня. Фигура 25. Эти модель-прогнозируемые оценки подтверждены доступными данными этой Фазы 1/2а исследования, которые полностью попадают в 95% доверительный интервал моделированной кривой "активность по отношению ко времени". Однако, принимая во внимание гетерогенность сообщаемых клинических случаев прорывного кровотечения по отношению к минимальному уровню плазматической FIX активности (Bjorkman, Haemophilia, 9:101-110 (2003); Ahnstrom et al Haemophilia, 10:689-697 (2004), каждая из которых включена в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки), поддерживающая доза скорее всего будет требовать индивидуального подбора.
Таблицы
Таблица 1: Полинуклеотидные последовательности: FIX-Fc
A. FIX-Fc цепи ДНК последовательность (SEQ ID N0:1, которая кодирует SEQ ID N0:2)
pSYN-FIX-030 Нуклеотидная последовательность (nt 1 до 7583):
FIX экзон 1 (сигнальный пептид, 1-я аминокислота пропептида): nt 690-777 FIX мини интрон: nt 778-1076
FIX пропептидная последовательность : nt 1077-1126 Зрелая FIX последовательность : nt 1127-2371 Fc : nt 2372-3052
gcgcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatg gagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactg cccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcc tggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattac catggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccacc ccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcccca ttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccac tgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagcttcgcgacgtacggccgccaccatgc agcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaa tgtacaggtttgtttccttttttaaaatacattgagtatgcttgccttttagatatagaaatatctgatgctgtctt cttcactaaattttgattacatgatttgacagcaatattgaagagtctaacagccagcacgcaggttggtaagtact gtgggaacatcacagattttggctccatgccctaaagagaaattggctttcagattatttggattaaaaacaaagac tttcttaagagatgtaaaattttcatgatgttttcttttttgctaaaactaaagaattattcttttacatttcagtt tttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgt tcaagggaatctagagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactg aaagaacaactgaattttggaagcagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagt tgcaaggatgacattaattcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaac atgtaacattaagaatggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactg agggatatcgacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttca caaacttctaagctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccat tttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgggttgttggtggagaagatgccaaaccag gtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatgg attgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgaggagac agaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagctattaataagtaca accatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacacctatttgcattgctgac aaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctggggaagagtcttccacaaagggag atcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacatgtcttcgatctacaaagttcaeca tctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccat gttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaata tggaatatataccaaggtgtcccggtatgtcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactgacaaaactcacacat gcccaccgtgcccagctccggaactcctgggcggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactg gtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtgg tcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctc ccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatc ccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtgg agtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttc ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggc tctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagaattcagacatgataagatacatt gatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgcttt atttgtaaccattataagctgcaataaacaagttggggtgggcgaagaactccagcatgagatccccgcgctggagg atcatccagccggcgtcccggaaaacgattccgaagcccaacctttcatagaaggcggcggtggaatcgaaatctcg tagcacgtgtcagtcctgctcctcggccacgaagtgcacgcagttgccggccgggtcgcgcagggcgaactcccgcc
cccacggctgctcgccgatctcggtcatggccggcccggaggcgtcccggaagttcgtggacacgacctccgaccac tcggcgtacagctcgtccaggccgcgcacccacacccaggccagggtgttgtccggcaccacctggtcctggaccgc gctgatgaacagggtcacgtcgtcccggaccacaccggcgaagtcgtcctccacgaagtcccgggagaacccgagcc ggtcggtccagaactcgaccgctccggcgacgtcgcgcgcggtgagcaccggaacggcactggtcaacttggccatg gtttagttcctcaccttgtcgtattatactatgccgatatactatgccgatgattaattgtcaacacgtgctgatca gatccgaaaatggatatacaagctcccgggagctttttgcaaaagcctaggcctccaaaaaagcctcctcactactt ctggaatagctcagaggcagaggcggcctcggcctctgcataaataaaaaaaattagtcagccatggggcggagaat gggcggaactgggcggagttaggggcgggatgggcggagttaggggcgggactatggttgctgactaattgagatgc atgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgct ttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacaccctcgtcgagctagcttcgtgaggctccggtgcc cgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgccta gagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaac cgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtg tgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctccagta cgtgattcttgatcccgagctggagccaggggcgggccttgcgctttaggagccccttcgcctcgtgcttgagttga ggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagt ctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccag gatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggc gaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctg gcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaaga tggccgcttcccggccctgctccagggggctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacc cacacaaaggaaaggggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggc acctcgattagttctggagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccc cacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttga gtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaacac gtggtcgcggccgcgccgccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttcc actggtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggaggaccgtcagtcttcctcttccc cccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaag accctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcag tacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtg caaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccac aggtgtacaccctgcccccatcccgcgatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttc tatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgtt ggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttct catgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgactc gagagatctggccggctgggcccgtttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgta ccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatct gttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgagga aattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggatt gggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagtggcggtaat acggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgta aaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcag aggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctagaagctccctcgtgcgctctcctgttcc gaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgta ggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgc gccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaa caggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaa gaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaa caaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaaga tcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgacattaa cctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatg cagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcggg tgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtg tgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttggg aagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgcca
B. Fc ДНК последовательность (мышиный IgK сигнальный пептид подчеркнут) (SEP ID N0:3, которая кодирует SEQ Ш N0:4) Это Fc кассета из pSYN-FIX-030. Кроме того, существует раздельная Fc экспрессионная кассета, которая трансфицируется в клеточную линию в плазмидную pSYN-Fc-015, которая кодирует ту же самую аминокислотную последовательность, но содержит несколько некодирующих цепей. Вторая копия Fc кодирующей последовательности запускает в работу больший мономер: димер соотношение.
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacaaaactcacacatgcc
caccgtgcccagcacctgaactcctgggaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatga
tctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtac
gtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc
agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccc
agcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcc
cgcgatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtgga
gtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttcc
tctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggct
ctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
Таблица 2: Полипептидные последовательности
FIX-Fc Мономер гибрид: создан коэкспрессией FIX-Fc и Fc цепей.
A. FIX-Fc цепь (SEQ ID N0:2):
(28-аминокислотная сигнальная последовательность подчеркнута, 18-аминокислотный пропептид подчеркнут двойной линией, Fc участок выделен курсивом.) С-терминальный лизин не представлен ни в одной субъединице; этот процессинг часто наблюдается в рекомбинантных белках, вырабатываемых в культуре клеток млекопитающих, а также в белках, полученных из плазмы крови.
FIXFC-SC СУБЪЕДИНИЦА:
FIX Сигнальный пептид : -46 MQRVNMIMAE SPGLITICLL GYLLSAEC
FIX Пропептид : -18 TVFLDHENAN KILNRPKR
1 YNSGKLEEFV QGNLERECME EKCSFEEARE VFENTERTTE FWKQYVDGDQ 51 CESNPCLNGG SCKDDINSYE CWCPFGFEGK NCELDVTCNI KNGRCEQFCK 101 NSADNKWCS CTEGYRLAEN QKSCEPAVPF PCGRVSVSQT SKLTRAETVF 151 PDVDYVNSTE AETILDNITQ STQSFNDFTR WGGEDAKPG QFPWQWLNG 201 KVDAFCGGSI VNEKWIVTAA HCVETGVKIT WAGEHNIEE TEHTEQKRNV 251 IRIIPHHNYN AAINKYNHDI ALLELDEPLV LNSYVTPICI ADICEYTNIFL 301 KFGSGYVSGW GRVFHKGRSA LVLQYLRVPL VDRATCLRST ICFTIYNNMFC 351 AGFHEGGRDS CQGDSGGPHV TEVEGTSFLT GIISWGEECA MKGKYGIYTK 401 VSRYVNWIICE KTKLTDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR 451 TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSV 501 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR 551 DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF 601 LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
20-аминокислотный сигнальный пептид легкой цепи гетерологичного мышиного IgK (подчеркнуто):
-20 METDTLLLWV LLLWVPGSTG
Зрелая Fc последовательность (в соответствии с нумерацией человеческого IgGl аминокислот с 221 по 447, нумерация EU)
1 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED
51 PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK
101 CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK
151 GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG
201 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
Фактическ
Концентраци
Фактическ
Концентра]
ое время
я (нг/мл)
ое время
я (нг/мл)
(ч)
(ч)
Пациент 1
Пациент 2
-0,50
0,0
-1,23
0,0
0,17
2325,3
0,17
3352,1
0,42
1632,4
0,40
3017,3
1Д7
1497,7
1,15
2280,7
3,18
1466,4
3,15
2077,5
6,13
1268,2
6,15
2054,7
9,12
1100,7
9,15
1700,4
24,12
805,0
24,23
1417,3
48,03
544,5
48,40
766,0
72,23
377,7
70,73
719,0
96,75
215,3
92,57
480,2
120,13
192,6
119,98
326,3
141,95
128,6
141,10
241,1
169,45
112,4
167,98
194,6
192,37
93,6
192,85
160,1
216,28
76,1
216,98
149,0
237,30
76,4
238,65
125,7
-Й-
Фактичес
Результа
Скорректирован ный по базовому
Фактичес
Результа
Скорректирован ный по базовому
Фактиче ское время (ч)
Результат (МЕ/дл)
Скорректирован ный по базовому
кое время (ч)
(МЕ/дл)
уровню результат (МЕ/дл)
кое время (ч)
(МЕ/дл)
уровню результат (МЕ/дл)
уровню результат (МЕ/дл)
Пациент 4
Пациент 5
Пациент 6
-285,52
-104,18
< 1,0
-503,20
-0,18
<1,0
0,0
-0,18
< 1,0
0,0
-0,07
0,0
0,17
58,0
0,17
34,0
0,17
0,0
0,42
44,0
0,43
29,0
0,42
61,0
1Д7
39,0
1,20
24,0
1,17
54,1
3,17
29,0
3,15
20,0
3,17
51,3
6,18
25,0
6,23
18,0
6,17
39,6
9,17
21,0
9,20
9,17
40,9
24,17
13,0
24,17
12,0
24,17
24,0
48,20
8,0
48,15
8,0
48,17
15,0
72,17
7,0
72,15
6,0
72,17
11,0
96,17
4,0
96,03
4,0
96,17
8,0
120,13
3,0
120,13
3,0
120,17
7,0
144,18
3,0
144,03
2,0
168,17
4,0
168,22
2,0
168,17
1,0
240,17
2,0
192,20
2,0
192,12
1,0
288,17
1,0
216,23
1,0
216,15
1,0
336,17
2,0
240,23
1,0
240,07
1,0
504,17
1,0
720,73
<1,0
0,0
547,07
<1,0
0,0
Номинал ьная доза (МЕ/кг)
Фактическая доза (МЕ/кг)
Пациен т
Сщах
(МЕ/д л)
AUCINF (ч*МЕ/дл
AUCa
(%)
AUCp
(%)
AUC/Доза (МЕ*ч/дл на МЕ/кг)
(мл/ч/кг)
(мл/кг)
Vss (мл/кг)
MRT
(ч)
Альф а HL
(ч)
Бета HL
(ч)
12,5
13,714
11,9
418
0,231
99,8
30,5
3,28
102
157
48,0
0,140
33,3
27,25
19,9
753
2,50
97,8
27,6
3,62
134
275
76,0
1,20
54,0
54,5
34,5
1280
5,7
94,5
23,5
4,26
155
365
85,8
2,32
62,9
54,5
48,5
1450
12,4
87,7
26,6
3,76
111
282
75,1
3,64
58,9
54,5
33,0
1190
1,5
98,3
21,8
4,58
160
274
59,9
0,840
42,1
54,513
53,5
2960
1,0
99,1
54,3
1,84
100
149
81,1
1,07
56,7
55,878
38,6
1270
2,2
97,9
22,7
4,41
141
248
56,4
1,07
40,0
Среднее
41,6
1630
4,56
95,5
29,8
3,77
133
264
71,7
1,79
52,1
8,97а
750
4,75
4,70
13,8
1,12
26,7
77,6
13,0
1,19
10,4
4,01
335
2,13
2,10
6,18
0,501
11,9
34,7
5,79
0,531
4,65
Среднее геометрическое
40,9
1530
2,98
95,4
27,9
3,59
131
254
70,7
1,52
51,3
CV% среднее геометрическое
21,4
39,1
136,5
5,0
39,4
39,4
21,1
33,8
18,8
68,6
21,0
109
98,9
3330
18,5
81,3
30,6
3,28
109
216
65,9
6,53
54,6
109
111
4580
28,9
71,1
42,0
2,38
98,0
145
61,1
13,2
54,2
109
92,1
3540
17,0
82,9
32,5
3,08
118
163
53,1
9,43
42,4d
109,176
99,1
5150
28,6
71,3
47,2
2,12
110
162
76,2
16,6
67,4
100
109,441
89,9
3060
9,2
90,8
28,0
3,58
121
207
57,9
4,19
43,8
Среднее
98,2
3930
20,4
79,5
36,1
2,89
111
179
62,8
9,99
52,5
8,21ь
893е
8,37
8,37
8,17
0,615
8,98
31,1
8,82
4,99
10,1
3,67
399
3,74
3,74
3,65
0,275
4,02
13,9
3,95
2,23
4,51
Среднее
97,9
3860
18,9
79,1
35,4
2,83
111
177
62,4
8,92
51,7
CV% среднее
геометрическо е
60,0
21,2
24,1
28,6
21,5
25,4
10,2
14,4
С168 = Оцененная FIX активность выше базового уровня приблизительно 168 ч после дозы. Значение, выделенное курсивом, было оценено по стимуляции, осуществленной с использованием однокомпартментной модели и констант микроскопической степени пациента. TBLP1 = Модель-прогнозируемое время после дозы, когда FIX активность уменьшается до приблизительно 1 МЕ/дл выше базового уровня. Значения, выделенные курсивом, были оценены по стимуляции, проведенной с использованием однокомпартментной модели и констант микроскопической степени пациента.
TBLP3 = Модель-прогнозируемое время после дозы, когда FIX активность уменьшается до приблизительно 3 МЕ/дл выше базового уровня. TBLP5 = Модель-прогнозируемое время после дозы, когда FIX активность уменьшается до приблизительно 5 МЕ/дл выше базового уровня. К-значение было рассчитано с использованием модель-прогнозируемого Сгаах значения, сгенерированного по результатом с вычетом исходных вычтенных результатов, разделенных на дозу.
К-значение было рассчитано с использованием наблюдаемого максимального после дозы результата пробы; К-значение = (с вычетом базового уровня Сгаах наблюдаемый)/Доза).
In-vivo повышение концентрации = 100 х (модель-прогнозируемое Сгаах из данных с вычетом базового уровня/Доза) х объем плазмы (да)/ Доза в ME; где объем плазмы в мл = (23,7 х Ht в см) + (9,0 х Wt в кг) - 1709.
In-vivo Recovery = 100 х (с вычетом базового уровня наблюдаемый Сгаах) х объем плазмы (дл)/Доза в ME; где объем плазмы в мл = (23,7 х Ht in cm) + х Wt в кг) - 1709.
Номинал ьная
доза (МЕ/кг)
Фактиче екая доза (МЕ/кг)
Пациен т
С168а
(МЕ/дл)
TBLPlb (День)
TBLP3C (День)
TBLP5d (День)
значение6 (МЕ/дл на МЕ/кг)
значение]
(МЕ/дл на МЕ/кг)
In Vivo повышен ие
концентр аци^
(%)
In Vivo повышени
концентра цииь
(%)
100
4,08
11,6
8,01
6,34
0,91
1,08
43,4
51,8
109
4,88
12,1
8,57
6,92
1,02
1Д7
28,7
33,1
109
3,09
9,87
7,07
5,78
0,84
0,89
39,7
41,8
109,176
6,77
14,7
10,3
8,21
0,91
0,99
27,8
30,3
109,441
3,09
9,96
7,07
5,72
0,82
0,97
35,8
42,2
Среднее
4,38
11,6
8,20
6,59
0,90
1,02
35,1
39,8
1,53
1,97
1,34
1,03
0,0784
0,11
6,8
8,5
0,685
0,881
0,597
0,459
0,0351
0,0482
3,0
3,8
Среднее геометрическое
4,19
11,5
8,12
6,53
0,90
1,02
34,5
39,1
CV% среднее геометрическое
34,1
16,5
15,7
15,0
8,6
10,5
19,8
21,6
* Оценки по 2-компартментному анализу FIX активности при номинальных дозах 25, 50 и 100 МЕ/кг (п=11)
f Суммарные характеристики продукта BENEFIX(tm) (18 ноября, 2009); Медиана и вариационный размах (п=56)
а. Диапазон, скорректированный из-за округления или других ошибок как 0,63 - 1,18. По сравнению с данными в анамнезе по BENEFIX(tm), rFIX-Fc демонстрировал:
- Зх разовое возрастание периода полувыведения и среднего времени удержания
- 24% улучшенное сравнительное постепенное повышение концентрации
- 2,5х уменьшенный клиренс
Таблица 9. Фаза 1/2а исследования: дозопропорциональное возрастание Стах и AUC rFIXFc (активность)
Доза # пациентов Стах (МЕ/дл) AUC (ч*МЕ/дл)
(МЕ/кг) [CpeflHee±SD (min - [CpeflHee±SD (min -
max)] max)]
25 1 19,9 753
50 5 41,6 ±8,97 (33,0- 1630 ±750 (1190 - 2960)
53,5)
100 5 98,2 ±8,21 (89,9- 3930 ±893 (3060 - 5150)
111,0)
Также см. Фигуру 5.
Стах
AUCINF
AUCa
AUCb
AUC/Доза (МЕ*ч/дл
VSS
MRT
tl/2a
tl/2p
(МЕ/дл)
(ч*МЕ/дл )
(%)
(%)
на МЕ/кг)
(мл/кг)
(мл/ч/кг)
(мл/кг)
(ч)
(ч)
(ч)
Средне е
65,364
2596,636
11,591
88,427
32,436
3,555
123,364
226,000
68,045
5,463
52,455
Ст,
32,9708
1497,1234
10,4490
10,5210
10,7506
0,9257
21,2804
69,7582
11,1637
9,1674
откл
5,4197
%CV
50,4420
57,6563
90,1479
11,8980
33,1435
27,5890
17,2501
30,8664
16,4063
17,4768
99,2128
Медиа на
53,500
2960,000
9,200
90,800
28,000
3,580
118,000
216,000
65,900
3,640
54,200
Миним
19,90
753,00
1,00
71,10
21,80
1,84
98,00
145,00
53,10
0,84
40,00
Макси
111,00
5150,00
28,90
99,10
54,30
4,58
160,00
365,00
85,80
16,60
67,40
мум
Геом.
56,951
2181,294
6,781
87,826
31,020
3,226
121,767
216,533
67,218
3,326
51,715
средне е
С168 [1]
TBLP1 [2]
TBLP3 [3]
TBLP5 [4]
Постепенное
Постепенное
In Vivo
In Vivo
(МЕ/дл)
(День)
(День)
(День)
повышение концентраци
повышение концентр ац
повышение концентр ац
повышение концентрац
и [5]
(МЕ/дл на МЕ/кг)
ИИ [6]
(МЕ/дл на МЕ/кг)
ии [7]
(%)
ии [8]
(%)
Среднее
3,106
10,177
6,727
5,115
0,821
0,926
34,518
38,991
Ст, откл
1,8231
2,3315
2,0089
1,8975
0,1387
0,1787
4,9250
6,6636
%CV
58,6897
22,9088
29,8623
37,0944
16,8921
19,2940
14,2678
17,0900
Медиана
3,090
9,870
7,070
5,720
0,840
0,970
33,600
40,200
Минимум
1,09
7,28
3,72
2,06
0,61
0,62
27,80
30,30
Максиму м
6,77
14,70
10,30
8,21
1,02
1,17
43,40
51,80
Геом, среднее
2,621
9,938
6,447
4,761
0,810
0,910
34,202
38,486
Сноски:
Примечание: Значения РК параметра были определены по 2-компартментному способу.
Геом. Среднее = Геометрическое Среднее [1] С168 = FIX активность выше базового уровня на 168 ч после дозы.
[2] TBLP1 = Оцененное время после дозы, когда FIX активность уменьшилась до 1 МЕ/дл выше базового уровня. [3] TBLP3 = Оцененное время после дозы, когда FIX активность уменьшилась до 3 МЕ/дл выше базового уровня. [4] TBLP5 = Оцененное время после дозы, когда FIX активность уменьшилась до 5 МЕ/дл выше базового уровня.
[5] Нарастающее повышение концентрации было рассчитано с использованием модель-прогнозируемого Стах значения, сгенерированного из исходноых
вычтенных результатов, разделенных на дозу. [6] Нарастающее повышение концентрации было рассчитано с использованием наблюдаемого максимального результата последозовой пробы;
Повышение концентрации = (с вычетом базового уровня наблюдаемое Стах )/Доза. [7] In-vivo повышение концентрации = 100 х (Модель-прогнозируемое Стах из с вычетом базового уровня данных/Доза) х Объем плазмы (дл)/Доза в ME;
где объем плазмы в мл = (23,7 х Ht в cm) + (9,0 х Wt в кг) - 1709.
In-vivo повышение концентрации = 100 х (С вычетом базового уровня наблюдаемое Стах) х Объем плазмы (дл)/Доза в ME; где объем плазмы в = (23,7 х Ht в см) + (9,0 х Wt в кг) - 1709.
FIXFc rFIX
Гамма-карбоксилирование
аа 1-23 % 6 Gla
97,8
96,9
(К1К2 пептид) % 5 Gla
2,2
3,1
% 4 Gla
аа 24-43 % 6 Gla
61,3
63,7
(КЗ пептид) % 5 Gla
26,3
30,9
% 4 Gla
12,5
5,4
Общее Gla/mol, пептидная
11,5
11,6
карта
Общее Gla/mol, AAA
11,3 + 0,3
11,5 + 0,3
Содержание пропептидов
не обнаружено
не обнаружено
cQ-гидроксилирование Asp 64
70%
49%
Сульфатация Туг 155
Фосфорилирование Ser 158
<10%
<10%
Ala 148/Thr 148
0/100%
100/0%
Активированный FIX
<0,0125%
0,109 +/-
0,00185%
FXIa активация
94,8 +/- 2,4%
96,6+/- 1,8%
99,6 0,4 0 98,9
1,1 0 12,0
(12) не обнаружено 37% (> 90%) (> 90%) 30/70% 0,21 +/- 0,010%
Не сделано
Виды
BENEFIX(tm)
FIXFc
Нормальные мыши
12,3 ч
47,2 ± 4,8 ч
Дефицитные по FIX мыши
13,2 ч
46,2 +10,1ч
FcRN КО мыши
16,5 ± 3,0 ч
16,9 ±2,1 ч
FcRN Tg32bMbium
14,2 ± 2,9 ч
53,0 ± 6,6 ч
Крысы
5,8 ч
34,8 ± 5,3 ч
Дефицитные по FIX собаки
14-18ч*
47,5 ч
Обезьяна
12,7 ч f
47,3±9,1 ч
* Brinkhous et al, Blood, 1996; 88: 2603-2610
f McCarthy et al, 2002, Thromb Haemost, 2002; 87: 824-830
Таблица 20А. РК параметры rFIXFc и BENEFIX(tm) (200 МЕ/кг) после подкожной инъекции однократной дозы дефицитным по FIX мышам (антиген ИФА)
Соединен ие
Доза нг/кг
V/F мл/кг
Tlag ч
AUGNF Ч*нг/ мл
Абсорбция
Элими нация HL4
CL/F мл/Ч/кг
Tmax Чг
Стах нг/мл
AUC/Д оза
Ч.кг/мл:
Стах/Д
оза
г/мл
BENEFI X
727273
3920
2,86
6397
1,96
23,9
114
10,6
148
0,00880
0,204
23,3
rFIXFc
327868 9
2071
0,896
14137 0
7,67
61,9
23,2
27,3
1178
0,0431
0,359
38,1
Анализ
AUC/Доза (Ч*кг/мл)
элим. полуперио Д(Ч)
CL/F
(мл/Ч/кг)/%
Tmax (Ч)
Стах/Доза (кг/мл)
F (%)
rFIXFc 200 МЕ/кг
Антиген
0,041
61,9
23,2
27,3
0,00035
38,1
BENEFIX(tm) 200 МЕ/кг
Антиген
0,0073
23,9
114
10,6
0,00017
23,3
Соотношение (rFIXFc/BENEFIX(tm))
Антиге н
5,62
2,59
0,20
2,58
2,05
1,63
rFIXFc 400 МЕ/кг
Антиген
0,042
50,9
23,7
18,3
0,00045
45,6
BENEFIX(tm) 400 МЕ/кг
Антиген
0,0089
20,2
113
8,13
0,00024
20,2
Соотношение (rFIXFc/BENEFIX(tm))
Антиге н
4,72
2,52
0,21
2,25
1,91
2,26
AUC/Доза (Ч*кг/мл)
элим. полуперио Д(Нг)
CL/F
(мл/Ч/кг)/%
Tmax
(ч)
Стах/Доза (кг/мл)
F (%)
rFIXFc 200 МЕ/кг
Активно сть
0,021
42,4
41,1
23,8
0,00024
29,1
BENEFIX(tm) 200 МЕ/кг
Активно сть
0,0047
17,2
220
16,0
0,00010
18,9
Соотношение (rFIXFc/BENEFIX(tm))
Активн ость
4,47
2,46
0,19
1,49
2,40
1,54
rFIXFc 400 МЕ/кг
Активно сть
0,028
40,3
35,6
15,9
0,00037
39,2
BENEFIX(tm) 400 МЕ/кг
Активно сть
0,0052
15,6
193
18,1
0,00010
15,5
Соотношение (rFIXFc/BENEFIX(tm))
Активн ость
5,38
2,58
0,18
0,88
3,70
2,53
rFIXFc (МЕ/кг )
AUC
(Ч*нг/мл
Абс. полупер иод (Ч)
Элим. полупер иод (Нг)
CL/F
(мл/Ч/кг
)/%
Tmax (Ч)
Стах (нг/мл)
F(%)
Геом.
среди ее
99000
7,72
57,9
8,28
25,7
860
39,7
CV%
Geo.
15,8
16,4
39,4
15,8
2,68
21,7
15,9
Геом.
100
среди ее
221959
5,71
43,8
7,38
19,2
2585
44,5
CV%
Geo.
9,89
15,5
16,5
9,70
4,78
19,8
10,0
Геом.
200
среди ее
354000
6,27
5,83
20,4
3750
35,5
CV% Геом. Ср.
26,4
67,6
44,2
58,3
25,9
26,5
Биодоступность в диапазоне от 35,5 до 44,5% для rFIXFc Полупериод элиминации в диапазоне от 43,8 до 57,9 часов для rFIXFc
Требуемая концентрация Частота
фактора IX дозировки
Тип кровотечения (%) (часы)
Слабое
Носовое кровотечение
Гемартрозы, неосложненные 20-30 48
Поверхностное мышечное 20-30 48
Поверхностное мягкой ткани 20-30 48
Среднее
Носовое кровотечение
Внутримышечное с рассечением 25-50 48
Мягкая ткань с рассечением 25-50 48
Слизистые мембраны 25-50 48
Удаление зуба 25-50 48
Гематурия 25-50 48
Гемартрозы, с ограниченной подвижностью 40-80 48
Сильное
Носовое кровотечение 50-100 24-48
Глоточное 50-100 24-48
Заглоточное 50-100 24-48
Забрюшинное 50-100 24-48
Хирургия 50-100 24-48
CNS 50-100 24-48
Пациент должен консультироваться со своим лечащим врачом, но должен принимать только 1 следующую дозу по меньшей мере через 24-часов после первой дозы.
Таблицы 27 А и 27В. Сравнение данных с использованиеа расчетов в (А) Примере 1 и (В) Примере 11. А
Доза
Параметр (среднее+SD)
(МЕ/к
^тах
AUCINF
CL (мл/ч/кг)
Vss
MRT (ч)
Т1/2а(ч)
T1/2P (ч)
Постепенное
Cl68h
Время при
(МЕ/дл)
(ч- МЕ/дл)
(мл/кг)
увеличение концентрации (МЕ/дл на МЕ/кг)*
(МЕ/дл)+
1% выше базового уровня (День)*
19,9
753
3,62
275
76,0
1,20
54,0
0,77
1,09
7,28
41,6+8,97 /8,98
1630+750
3,77+1,12
264+77,6
71,7+13,0
1,79+1,19
52,1+10,4
0,86+0,22
2,23+1,40
9,29+1,98
100
98,2+8,21 /8,23
3930+893
2,89+0,615
179+31,1
62,8+8,82
9,99+4,99
52,5+10,1
1,02+0,11
4,38+1,53
11,6+1,97
25-100
NAS
NAS
NAS
NAS
Доза
(МЕ/к
Параметр (среднее+SD) (Диапазон)
(МЕ/дл)
AUCINF (ч-МЕ/дл)
CL (мл/ч/кг)
Vss (мл/кг)
MRT (ч)
Т1/2а (ч)
T1/2P (ч)
Постепенно е
увеличение концентрац ии (МЕ/дл per МЕ/кг)
Cl68h
(МЕ/дл)*
Время при 1% выше базового уровня (День)*
20,4
766
3,56
271
76,2
0,61
53,5
0,77
1,11
7,3
47,5+12,8 (33,061,1)
1700+550 (13002660)
3,44+0,84 (2,05-4,18)
262+55,4 (163-296)
76,8+6,7 (67,9-85,9)
3,4+3,4 (0,138,72)
57,5+8,2 (47,9-67,2)
0,87+0,21 (0,63-1,12)
2,46 + 0,89 (1,63-3,92)
10,1 + 1,5 (8,4-12,3)
100
98,5+7,9 (90,8110)
4020+986 (30905130)
2,84+0,66 (2,13-3,55)
183+27,9 (162-221)
65,9+10,3 (53,2-76,5)
10,3+5,6 (3,9716,6)
56,5+14,1 (42,4-74,5)
1,02+0,11 (0,89-1,18)
4,65 + 1,73 (3,08-6,85)
12,3 +2,5 (9,9-15,0)
25-100
NAS
NAS
3,18 + 0,78 (2,05-4,18)
227 + 58,6 (162-296)
71,8+10,0 (53,2-85,9)
NAS
56,7 + 10,9 (42,4-74,5)
0,93 + 0,18 (0,63-1,18)
NAS
NAS
Представленные результаты являются средним + SD с диапазоном, указанным в скобках
Сгаах показывает максимальную концентрацию; AUCINF, область под кривой (нулевое время, экстраполированное к времени на бесконечности); CL, клиренс; Vss, объем распределения в стабильном состоянии; MRT, среднее время удержания; T1/2 а, полупериод распределения; T1/2 р\ полупериод элиминации; NA, не применимо
Повышение концентрации было рассчитано с использованием наблюдаемого CmRX с вычетом значения базового уровня перед лечением и разделенного на дозу
* Плазматическая FIX активность выше базового уровня при 168 часах (7 дней) после дозы
* Модель-прогнозируемое время после дозы, когда FIX активность уменьшается до 1 МЕ/д л выше базового уровня пациента
^ Данные не применимы, поскольку параметры не являются дозонезависимыми, таким образом среднее и SD значения не были рассчитаны по различным дозовым группам
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БАЙОДЖЕН АЙДЕК ХЕМОФИЛИЯ ИНК. Пирс, Гленн Трюкс, Саманта Питерс, Роберт Т. Цзян, Хайянь
<12 0> ФАКТОР IX ПОЛИПЕПТИДЫ И СПОСОБЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
<130> 2159.273PC06
<140> PCT/US2011/043569
<141> 2011-07-11
<150> 61/470,951
<151> 2011-04-01
<150> 61/442,079
<151> 2011-02-11
<150> 61/438,572
<151> 2011-02-01
<150> 61/430,819
<151> 2011-01-07
<150> 61/424,555
<151> 2010-12-17
<150> 61/363,064
<151> 2010-07-09
<160> 4
<170> \патентная версия 3.5
<210> 1
<211> 7583
<212> ДНК
<213> искусственный
<220>
<223> FIX-Fc цепи ДНК (pSYN-FIX-030)
<400> 1
gcgcgcgttg
acattgatta
ttgactagtt
attaatagta
atcaattacg
gggtcattag
ttcatagccc
atatatggag
ttccgcgtta
cataacttac
ggtaaatggc
ccgcctggct
120
gaccgcccaa
cgacccccgc
ccattgacgt
caataatgac
gtatgttccc
atagtaacgc
180
caatagggac
tttccattga
cgtcaatggg
tggagtattt
acggtaaact
gcccacttgg
240
cagtacatca
agtgtatcat
atgccaagta
cgccccctat
tgacgtcaat
gacggtaaat
300
ggcccgcctg
gcattatgcc
cagtacatga
ccttatggga
ctttcctact
tggcagtaca
360
tctacgtatt
agtcatcgct
attaccatgg
tgatgcggtt
ttggcagtac
atcaatgggc
420
gtggatagcg
gtttgactca
cggggatttc
caagtctcca
ccccattgac
gtcaatggga
480
gtttgttttg
gcaccaaaat
caacgggact
ttccaaaatg
tcgtaacaac
tccgccccat
540
tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 600
taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 660
cccaagcttc gcgacgtacg gccgccacca tgcagcgcgt gaacatgatc atggcagaat 720
caccaggcct catcaccatc tgccttttag gatatctact cagtgctgaa tgtacaggtt 780
tgtttccttt tttaaaatac attgagtatg cttgcctttt agatatagaa atatctgatg 840
ctgtcttctt cactaaattt tgattacatg atttgacagc aatattgaag agtctaacag 900
ccagcacgca ggttggtaag tactgtggga acatcacaga ttttggctcc atgccctaaa 960
gagaaattgg ctttcagatt atttggatta aaaacaaaga ctttcttaag agatgtaaaa 1020
ttttcatgat gttttctttt ttgctaaaac taaagaatta ttcttttaca tttcagtttt 1080
tcttgatcat gaaaacgcca acaaaattct gaatcggcca aagaggtata attcaggtaa 1140
attggaagag tttgttcaag ggaatctaga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt 1200
tgaagaagca cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta 1260
tgttgatgga gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga 1320
cattaattcc tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga 1380
tgtaacatgt aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa 1440
caaggtggtt tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga 1500
accagcagtg ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg 1560
tgctgagact gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt 1620
ggataacatc actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgggttg ttggtggaga 1680
agatgccaaa ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt 1740
ctgtggaggc tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac 1800
tggtgttaaa attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga 1860
gcaaaagcga aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa 1920
gtacaaccat gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt 1980
tacacctatt tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg 2040
ctatgtaagt ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta 2100
ccttagagtt ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta 2160
taacaacatg ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag 2220
tgggggaccc catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg 2280
gggtgaagag tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtgt cccggtatgt 2340
caactggatt aaggaaaaaa caaagctcac tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc 2400
agctccggaa ctcctgggcg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac 2460
cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga 2520
ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 2580
gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca 2640
ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc 2700
ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac 2760
cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa 2820
aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 2880
ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct 2940
caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga 3000
ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatgagaatt 3060
cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 3120
aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 3180
ataaacaagt tggggtgggc gaagaactcc agcatgagat ccccgcgctg gaggatcatc 3240
cagccggcgt cccggaaaac gattccgaag cccaaccttt catagaaggc ggcggtggaa 3300
tcgaaatctc gtagcacgtg tcagtcctgc tcctcggcca cgaagtgcac gcagttgccg 3360
gccgggtcgc gcagggcgaa ctcccgcccc cacggctgct cgccgatctc ggtcatggcc 3420
ggcccggagg cgtcccggaa gttcgtggac acgacctccg accactcggc gtacagctcg 3480
tccaggccgc gcacccacac ccaggccagg gtgttgtccg gcaccacctg gtcctggacc 3540
gcgctgatga acagggtcac gtcgtcccgg accacaccgg cgaagtcgtc ctccacgaag 3600
tcccgggaga acccgagccg gtcggtccag aactcgaccg ctccggcgac gtcgcgcgcg 3660
gtgagcaccg gaacggcact ggtcaacttg gccatggttt agttcctcac cttgtcgtat 3720
tatactatgc cgatatacta tgccgatgat taattgtcaa cacgtgctga tcagatccga 3780
aaatggatat acaagctccc gggagctttt tgcaaaagcc taggcctcca aaaaagcctc 3840
ctcactactt ctggaatagc tcagaggcag aggcggcctc ggcctctgca taaataaaaa 3900
aaattagtca gccatggggc ggagaatggg cggaactggg cggagttagg ggcgggatgg 3960
gcggagttag gggcgggact atggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc 4020
tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac acctggttgc tgactaattg agatgcatgc 4080
tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg gggactttcc acaccctcgt cgagctagct 4140
tcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 4200
ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 4260
gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 4320
agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta 4380
agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct 4440
tgaattactt ccacctggct ccagtacgtg attcttgatc ccgagctgga gccaggggcg 4500
ggccttgcgc tttaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg cctgggcgct 4560
ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct ttcgataagt 4620
ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc 4680
ttgtaaatgc gggccaggat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc gcgggcggcg 4740
acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac 4800
cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc 4860
cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag 4920
cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctc cagggggctc aaaatggagg acgcggcgct 4980
cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaagg ggcctttccg tcctcagccg 5040
tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat tagttctgga 5100
gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc 5160
acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa ttctccttgg 5220
aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa 5280
gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgaa cacgtggtcg cggccgcgcc gccaccatgg 5340
agacagacac actcctgcta tgggtactgc tgctctgggt tccaggttcc actggtgaca 5400
aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct gggaggaccg tcagtcttcc 5460
tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg 5520
tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg 5580
tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg 5640
tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca 5700
aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc 5760
agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg cgatgagctg accaagaacc 5820
aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg 5880
agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg 5940
gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg 6000
tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct 6060
ccctgtctcc gggtaaatga ctcgagagat ctggccggct gggcccgttt cgaaggtaag 6120
cctatcccta accctctcct cggtctcgat tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac 6180
cattgagttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 6240
gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 6300
taataaaatg
aggaaattgc
atcgcattgt
ctgagtaggt
gtcattctat
tctggggggt
6360
ggggtggggc
aggacagcaa
gggggaggat
tgggaagaca
atagcaggca
tgctggggat
6420
gcggtgggct
ctatggcttc
tgaggcggaa
agaaccagtg
gcggtaatac
ggttatccac
6480
agaatcaggg
gataacgcag
gaaagaacat
gtgagcaaaa
ggccagcaaa
aggccaggaa
6540
ccgtaaaaag
gccgcgttgc
tggcgttttt
ccataggctc
cgcccccctg
acgagcatca
6600
caaaaatcga
cgctcaagtc
agaggtggcg
aaacccgaca
ggactataaa
gataccaggc
6660
gtttccccct
agaagctccc
tcgtgcgctc
tcctgttccg
accctgccgc
ttaccggata
6720
cctgtccgcc
tttctccctt
cgggaagcgt
ggcgctttct
catagctcac
gctgtaggta
6780
tctcagttcg
gtgtaggtcg
ttcgctccaa
gctgggctgt
gtgcacgaac
cccccgttca
6840
gcccgaccgc
tgcgccttat
ccggtaacta
tcgtcttgag
tccaacccgg
taagacacga
6900
cttatcgcca
ctggcagcag
ccactggtaa
caggattagc
agagcgaggt
atgtaggcgg
6960
tgctacagag
ttcttgaagt
ggtggcctaa
ctacggctac
actagaagaa
cagtatttgg
7020
tatctgcgct
ctgctgaagc
cagttacctt
cggaaaaaga
gttggtagct
cttgatccgg
7080
caaacaaacc
accgctggta
gcggtggttt
ttttgtttgc
aagcagcaga
ttacgcgcag
7140
aaaaaaagga
tctcaagaag
atcctttgat
cttttctacg
gggtctgacg
ctcagtggaa
7200
cgaaaactca
cgttaaggga
ttttggtcat
gacattaacc
tataaaaata
ggcgtatcac
7260
gaggcccttt
cgtctcgcgc
gtttcggtga
tgacggtgaa
aacctctgac
acatgcagct
7320
cccggagacg
gtcacagctt
gtctgtaagc
ggatgccggg
agcagacaag
cccgtcaggg
7380
cgcgtcagcg
ggtgttggcg
ggtgtcgggg
ctggcttaac
tatgcggcat
cagagcagat
7440
tgtactgaga
gtgcaccata
tatgcggtgt
gaaataccgc
acagatgcgt
aaggagaaaa
7500
taccgcatca
ggcgccattc
gccattcagg
ctgcgcaact
gttgggaagg
gcgatcggtg
7560
cgggcctctt
cgctattacg
cca
7583
<210> 2
<211> 688
<212> белок
<213> искусственный
<220>
<223> FIX-Fc цепи
<220>
<221> СИГНАЛ <222> (1)..(28)
<220>
<221> ПРОПЕПТИД <222> (29)..(46)
<220>
<221> Зрелый пептид
<222>
(47)..(688)
<220>
<221> РАЗНОЕ
<222> (1)..(415)
<223> FIX участок
<220>
<221> РАЗНОЕ <222> (416)..(688)
<223> Fc участок
<400> 2
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
-45 -40 -35
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
-30 -25 -20 -15
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
-10 -5 -1 1
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
5 10 15
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
20 25 30
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
35 40 45 50
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
55 60 65
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
70 75 80
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
85 90 95
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
100 105 110
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
115 120 125 130
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
135 140 145
Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
150 155 160
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gin Ser Thr Gin Ser Phe Asn Asp Phe
165 170 175
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gin Phe Pro Trp
180 185 190
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
195 200 205 210
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
215 220 225
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
230 235 240
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
245 250 255
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
260 265 270
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
275 280 285 290
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
295 300 305
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
310 315 320
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
325 330 335
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
340 345 350
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
355 360 365 370
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
375 380 385
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
390 395 400
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Asp Lys Thr
405 410 415
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
420 425 430
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
435 440 445 450
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
455 460 465
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
470 475 480
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
485 490 495
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
500 505 510
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
515 520 525 530
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
535 540 545
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
550 555 560
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
565 570 575
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
580 585 590
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
595 600 605 610
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
615 620 625
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
630
635
640
<210> 4
<211> 247
<212> белок
<213> искусственный
<220>
<223> Fc цепь
<220>
<221> СИГНАЛ
<222> (1)..(20)
<223> сигнальный пептид легкой цепи гетерологичного мышиного Ig
<220>
<221> Зрелый пептид
<222> (21)..(247)
<223> Зрелая Fc последовательность
<400> 4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
-20 -15 -10 -5
Gly Ser Thr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
-1 1 5 10
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
15 20 25
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
30 35 40
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
45 50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
80 85 90
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
95 100 105
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
110 115 120
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
125 130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
160 165 170
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
175 180 185
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
190 195 200
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
205 210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ:
1. Способ введения Фактора IX являющемуся человеком пациенту, нуждающемуся
в нем, включающий введение пациенту дозы по меньшей мере около 25 МЕ/кг химерного полипептида, содержащего Фактор IX и FcRn связывающий партнер (FcRn BP) с интервалом дозирования около одного раза в неделю или более.
2. Способ введения Фактора IX являющемуся человеком пациенту, нуждающемуся
в нем, включающий введение пациенту дозы по меньшей мере около 10 или по меньшей
мере около 20 МЕ/кг химерного полипептида, содержащего Фактор IX и FcRn
связывающий партнер (FcRn BP) с интервалом дозирования около одного раза в неделю
или более.
3. Способ введения Фактора IX являющемуся человеком пациенту,
нуждающемуся в нем, включающий введение пациенту дозы по меньшей мере около 10
МЕ/кг химерного полипептида, содержащего Фактор IX и XTEN с интервалом
дозирования около одного раза в неделю или более.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что концентрация в плазме крови упомянутого химерного полипептида достигает минимального уровня по меньшей мере около 1 МЕ/дл через по меньшей мере около 6 дней у по меньшей мере около 80% популяции пациентов или достигает минимального уровня по меньшей мере около 1 МЕ/дл через по меньшей мере около 6 дней у упомянутого пациента.
5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что концентрация в плазме крови упомянутого химерного полипептида достигает
среднего минимального уровня около 1-5 МЕ/дл у популяции пациентов; или минимального уровня около 1-5 МЕ/дл у упомянутого пациента.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что менее чем 25% Фактора IX химерного полипептида в упомянутой дозе полностью фосфорилировано и менее чем 25% Фактора IX химерного полипептида в упомянутой дозе полностью сульфатировано.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что менее чем около 10% упомянутого химерного полипептида в упомянутой дозе фосфорилировано и менее чем около 9% упомянутого химерного полипептида в упомянутой дозе сульфатировано.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что упомянутая доза имеет среднее постепенное возрастание концентрации (К-значение) (активность; наблюдаемая) более чем 0,75 МЕ/дл на МЕ/кг .
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что упомянутая доза имеет среднее постепенное возрастание концентрации (К-значение) (активность; наблюдаемая) по
6.
меньшей мере около 0,8, по меньшей мере около 0,9, или по меньшей мере около 1 МЕ/дл на МЕ/кг.
10. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что упомянутый химерный полипептид демонстрирует один или более фармакокинетических параметров, у упомянутой популяции пациентов или у упомянутого пациента, выбранных из группы, состоящей из следующего:
средний клиренс (CL) (активность) у упомянутой популяции пациентов около 3,36 ± 0,93 мл/час/кг;
средний клиренс (CL) (активность) у упомянутой популяции пациентов около 3,03,72; 3,0; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7 или 3,72 мл/час/кг;
средний клиренс (CL) (активность) у упомянутой популяции пациентов, который примерно в 2,5 раза ниже, чем клиренс полипептида, содержащего упомянутый Фактор IX без упомянутого FcRn BP;
клиренс (CL) (активность) у упомянутого пациента около 1,84-4,58 мл/час/кг
среднее среднее время удержания (MRT) (активность) у упомянутой популяции пациентов по меньшей мере около 68,05 ± 11,16 часов;
среднее MRT (активность) у упомянутой популяции пациентов около 60-78, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, или 78 часов;
среднее MRT (активность) у упомянутой популяции пациентов, которое примерно в 3 раза длиннее, чем среднее MRT полипептида, содержащего упомянутый Фактор IX без упомянутого FcRn BP;
среднее время удержания (MRT) (активность) у упомянутого пациента около 53,185,8 часов;
среднее время удержания (MRT) (активность) у упомянутого пациента по меньшей мере около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, или около 90 часов;
среднее tj^beta (активность) у упомянутой популяции пациентов около 52,5 ± 9,2
часов;
среднее tj^beta (активность) у упомянутой популяции пациентов, которое составляет около 47-60 часов, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60 часов; среднее tj^beta (активность) у упомянутой популяции пациентов, которое примерно в 3 раза длинее, чем среднее tj^beta полипептида, содержащего упомянутый Фактор IX без упомянутого FcRn BP;
ti/2beta (активность) у упомянутого пациента около 40-67,4, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, или около 75 часов;
среднее постепенное увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемая) у упомянутой популяции пациентов около 0,93 ±0,18 МЕ/дл на МЕ/кг;
среднее постепенное увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемая) у упомянутой популяции пациентов около 0,85-1,15, около 0,85, около 0,86, около 0,87, около 0,88, около 0,89, около 0,90, около 0,91, около 0,92, около 0,93, около 0,94, около 0,95, около 0,96, около 0,97, около 0,98, около 0,99, около 1,0, около 1,05, около 1,10, или около 1,15 МЕ/дл на МЕ/кг;
среднее постепенное увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемая) у упомянутой популяции пациентов, которое на около 24% больше, чем среднее постепенное увеличение концентрации у полипептида, содержащего упомянутый Фактор IX без упомянутого FcRN BP;
постепенное увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемая) у упомянутого пациента около 0,62-1,17 МЕ/дл на МЕ/кг;
среднее Vss (активность) у упомянутой популяции пациентов около 226 ± 67,76
мл/кг;
среднее Vss (активность) у упомянутой популяции пациентов около 200-300, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290 или около 300 мл/кг;
Vss (активность) у упомянутого пациента около 145-365 мл/кг;
среднее AUC/доза (активность) у упомянутой популяции пациентов около 32,44 ± 10,75 МЕ*ч/дл на МЕ/кг;
среднее AUC/доза (активность) у упомянутой популяции пациентов около 26-40, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39, или около 40 МЕ*ч/дл на МЕ/кг;
AUC/доза у упомянутого пациента около 21,80-54,30 МЕ*ч/дл на МЕ/кг.
11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования составляет 6-10 дней.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 25-110, около 30-110, около 40-110, около 50-110, около 60110, около 70-110, около 80-110, около 90-110 и около 100-110 МЕ/кг.
13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 30-100, около 30-90, около 30-80, около 30-70, около 30-60, около 30-50 и около 30-40 МЕ/кг.
11.
14. Способ по п. 11, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 40-110, около 50-100, около 60-90, и около 70-80 МЕ/кг.
15. Способ по п. 11, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 40-50, около 50-60, около 60-70, около 70-80, около 80-90, около 90-100 и около 100-110 МЕ/кг.
16. Способ по п. 11, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 25, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 95, около 100, около 105, и около ПО МЕ/кг.
17. Способ по любому из пп. 11-16, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования выбирается из группы, состоящей из около 7-10, около 7-9, и около 7-8 дней.
18. Способ по любому из пп. 11-16, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования выбирается из группы, состоящей из около 8-10 и около 9-10 дней.
19. Способ по любому из пп. 11-16, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования выбирается из группы, состоящей из около 6-7 и около 8-9 дней.
20. Способ по любому из пп. 11-16, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования выбирается из группы, состоящей из около 6, около 7, около 8, около 9 и около 10 дней.
21. Способ по п. 11, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет около 3050 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет около 7 дней.
22. Способ по любому из пп. 4-21, отличающийся тем, что упомянутый минимальный уровень достигается у по меньшей мере около 90% упомянутой популяции пациентов.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что упомянутый минимальный уровень достигается у около 100% упомянутой популяции пациентов.
24. Способ по любому из пп. 1-11, 22 и 23, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет около 50 МЕ/кг, а упомянутый интервал дозирования составляет около 7 дней.
25. Способ по любому из пп. 4-11, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет около 50 МЕ/кг, упомянутый интервал дозирования составляет около 7 дней, и упомянутый минимальный уровень достигается у около 100% упомянутой популяции пациентов.
26. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования составляет 9-18 дней.
17.
- 10727. Способ по п. 26, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 90-180, около 100-180, около 110-180, около 120-180, около 130-180, около 140-180, около 150-180, около 160-180 и около 170-180 МЕ/кг.
28. Способ по п. 26, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 90-170, около 90-160, около 90-150, около 90-140, около 90130, около 90-120, около 90-110, и около 90-100 МЕ/кг.
29. Способ по п. 26, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 100-170, около 110-160, около 120-150 и около 130-140 МЕ/кг.
30. Способ по п. 26, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 90-100, около 100-110, около 110-120, около 120-130, около 130-140, около 140-150, около 150-160, и около 160-170 МЕ/кг.
31. Способ по п. 26, отличающийся тем, что упомянутая доза выбирается из группы, состоящей из около 90, около 95, около 100, около 105, около 110, около 115, около 120, около 125, около 130, около 135, около 140, около 145, около 150, около 155, около 160, около 165, около 170, около 175 и около 180 МЕ/кг.
32. Способ по любому из пп. 26-31, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования выбирается из группы, состоящей из около 9-17, около 9-16, около 9-15, около 9-14, около 9-13, около 9-12, около 9-11 и около 9-10 дней.
33. Способ по любому из пп. 26-31, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования выбирается из группы, состоящей из около 10-18, около 11-18, около 12-18, около 13-18, около 14-18, около 15-18, около 16-18 и около 17-18 дней.
34. Способ по любому из пп. 26-31, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования выбирается из группы, состоящей из около 10-11, около 11-12, около 12-13, около 13-14, около 14-15, около 15-16 и около 16-17 дней.
35. Способ по любому из пп. 26-31, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования выбирается из группы, состоящей из около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17 и около 18 дней.
36. Способ по п. 26, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет около 100 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет по меньшей мере около 12 дней.
37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что упомянутый минимальный уровень составляет по меньшей мере около 1 МЕ/дл у по меньшей мере около 70%, около 80%, или около 90% упомянутой популяции пациентов.
38. Способ по п. 26, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования составляет около 12-13 дней.
32.
- 10839. Способ по п. 26, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет около 100 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет по меньшей мере около 9 дней.
40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что минимальный уровень составляет по меньшей мере около 1 МЕ/дл у около 100% упомянутой популяции пациентов.
41. Способ по п. 26 или 39, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования составляет около 9-15 дней.
42. Способ по п. 26, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет около 150 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет по меньшей мере около 14 дней.
43. Способ по п. 42, где упомянутый минимальный уровень составляет по меньшей мере около 1 МЕ/дл у около 100% упомянутой популяции пациентов.
44. Способ по любому из пп. 1-43, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в контроле или профилактике кровотечения или эпизодов кровотечения.
45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в контроле или профилактике кровотечения при малом кровоизлиянии, гемартрозах, поверхностном мышечном кровоизлиянии, кровоизлиянии в мягкие ткани, среднем кровоизлиянии, внутримышечном кровоизлиянии или кровоизлиянии в мягкие ткани с расслоением, кровоизлиянии в слизистые, гематурии, сильном кровоизлиянии, глоточном кровоизлиянии, заглоточном кровоизлиянии, забрюшинном кровоизлиянии, кровоизлиянии в центральной нервной системе, ушибам, порезам, царапинам, суставном кровоизлиянии, носовом кровотечении, ротовом кровотечении, кровотечении из десен, внутричерепном кровотечении, внутрибрюшинном кровотечении, малом спонтанном кровоизлиянии, кровотечении после серьезной травмы, среднем кожном кровоподтеке или спонтанном кровоизлиянии в суставы, мышцы, внутренние органы либо в мозг.
46. Способ по любому из пп. 1-43, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в периоперативном уходе.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в уходе при кровотечении, связанном с хирургической операцией или удалением зуба.
48. Способ по п. 46, отличающийся тем, что упомянутый пациент будет подвергаться, подвергается или подвергался большому хирургическому вмешательству.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что упомянутое большое хирургическое вмешательство представляет собой ортопедическую операцию, расширенную операцию на ротовой полости, урологическую операцию или операцию на грыже.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что упомянутая ортопедическая операция представляет собой замену коленного, бедренного или другого крупного сустава.
47.
- 10951. Способ по любому из пп. 1-43, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в профилактическом лечении.
52. Способ по любому из пп. 1-43, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в лечении по требованию.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в лечении эпизодического кровотечения.
54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в лечении гемартроза, мышечного кровотечения, ротового кровотечения, геморрагии, кровоизлияния в мышцах, ротового кровоизлияния, травмы, травмы головы, желудочно-кишечного кровотечения, внутричерепного кровоизлияния, внутрибрюшного кровоизлияния, внутригрудного кровоизлияния, перелома кости, кровотечения центральной нервной системы, кровотечения в заглоточном пространстве, кровотечения в забрюшинном пространстве или кровотечения во влагалище подвздошно-поясничной мышцы.
55. Способ по п. 51, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в хирургической профилактике, периоперативном уходе, или в лечебной подготовке к хирургическому вмешательству.
56. Способ по п. 53, отличающийся тем, что упомянутое хирургическое
вмешательство представляет собой малое хирургическое вмешательство, большое
хирургическое вмешательство, удаление зуба, тонзиллектомию, сечение паховой грыжи,
синовэктомию, полную замену коленного сустава, краниотомию, остеосинтез,
травматическую хирургию, внутричерепные операции, внутрибрюшные операции,
внутригрудные операции или операции по замене суставов.
57. Способ по любому из пп. 1-56, отличающийся тем, что упомянутый пациент является человеком.
58. Способ по любому из пп. 1-57, отличающийся тем, что упомянутый Фактор IX в упомянутом химерном полипептиде представляет собой человеческий Фактор IX.
59. Способ по любому из пп. 1-58, отличающийся тем, что упомянутый Фактор IX в упомянутом химерном полипептиде представляет собой мутантный Фактор IX.
60. Способ по любому из пп. 1-59, отличающийся тем, что упомянутый FcRn BP в упомянутом химерном полипептиде представляет собой человеческий Fc.
61. Способ по любому из пп. 1-60, отличающийся тем, что упомянутый FcRn BP в химерном полипептиде представляет собой мутантный Fc.
62. Способ по п. 58, отличающийся тем, что упомянутый Фактор IX по меньшей мере на 90% или 95% идентичен Фактора IX аминокислотной последовательности,
57.
- 110-показанной в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептида (аминокислоты с 1 по 415 из SEQ ID N0:2).
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что упомянутый Фактор IX идентичен Фактора IX аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептида (аминокислоты с 1 по 415 из SEQ ID N0:2).
64. Способ по п. 60, отличающийся тем, что упомянутый Fc по меньшей мере на 90% или 95% идентичен Fc аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В без сигнальной последовательности (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID N0:4).
65. Способ по п. 64, отличающийся тем, что упомянутый Fc идентичен Fc аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В без сигнальной последовательности (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID N0:4).
66. Способ по любому из пп. 1-65, отличающийся тем, что упомянутый химерный полипептид представляет собой форму гибрида, содержащего второй полипептид в соединении с упомянутым химерным полипептидом, отличающийся тем, что упомянутый второй полипептид содержит FcRn BP.
67. Способ по п. 66, отличающийся тем, что упомянутый химерный полипептид содержит последовательность, по меньшей мере на 90% или 95% идентичную Фактору IX, и Fc аминокислотную последовательность, показанную в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептида (аминокислоты с 1 по 642 из SEQ ID N0:2).
68. Способ по п. 67, отличающийся тем, что упомянутый химерный полипептид содержит последовательность, идентичную Фактору IX и Fc аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептида (аминокислоты с 1 по 642 из SEQ ID N0:2).
69. Способ по любому из пп. 66-68, отличающийся тем, что упомянутый второй полипептид содержит последовательность, по меньшей мере на 90% или 95% идентичную аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В без сигнальной последовательности (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID N0:4).
70. Способ по п. 69, отличающийся тем, что упомянутый второй полипептид содержит последовательность, идентичную аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В без сигнальной последовательности (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID N0:4).
71. Способ по любому из пп. 1-70, отличающийся тем, что упомянутый пациент нуждается в долговременном лечении с интервалом дозирования еженедельно или реже.
63.
72. Способ по любому из пп. 1-71, отличающийся тем, что упомянутый химерный полипептид вводится как часть фармацевтического состава, содержащего по меньшей мере одно вспомогательное вещество.
73. Полипептид, содержащий Фактор IX, по меньшей мере на 90% или 95% идентичный Фактора IX аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептида (аминокислоты с 1 по 415 из SEQ ID N0:2), и FcRn BP.
74. Полипептид по п. 73, отличающийся тем, что упомянутый Фактор IX идентичен Фактора IX аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептида (аминокислоты с 1 по 415 из SEQ ID N0:2).
75. Полипептид, содержащий Фактор IX, по меньшей мере на 90% или 95% идентичный Фактора IX аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А с сигнальной последовательностью и пропептидом (аминокислоты -46 по 415 из SEQ ID NO:2), и FcRn BP.
76. Полипептид по п. 75, отличающийся тем, что упомянутый Фактор IX идентичен Фактора IX аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А с сигнальной последовательностью и пропептидом (аминокислоты -46 по 415 из SEQ ID N0:2).
77. Полипептид по любому из пп. 73-65, отличающийся тем, что упомянутый FcRn BP по меньшей мере на 90% или 95% идентичен Fc аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID N0:4).
78. Полипептид по п. 77, отличающийся тем, что упомянутый Fc идентичен Fc аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID N0:4).
79. Полипептид по п. 73 или 75, который содержит последовательность по меньшей мерена 90% или 95%, идентичную Фактора IX и Fc аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептида (аминокислоты с 1 по 642 из SEQ ID N0:2).
80. Полипептид по п. 79, который содержит последовательность, идентичную Фактора IX и Fc аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2А без сигнальной последовательности и пропептида (аминокислоты с 1 по 642 из SEQ ID N0:2).
81. Полипептид по любому из пп. 73-80, который находится в форме гибрида, содержащего второй полипептид, отличающийся тем, что упомянутый второй полипептид содержит FcRn BP.
82. Полипептид по п. 81, отличающийся тем, что упомянутый второй полипептид содержит последовательность, по меньшей мере на 90% или 95% идентичную
63.
аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В без сигнальной последовательности и пропептида (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID N0:4) или по меньшей мере на 90% или 95% идентичную аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В с сигнальной последовательностью (аминокислоты -20 по 227 из SEQ ID N0:4).
83. Полипептид по п. 81, отличающийся тем, что упомянутый второй полипептид содержит последовательность, идентичную аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В без сигнальной последовательности (аминокислоты с 1 по 227 из SEQ ID N0:4) или по меньшей мере на 90% или 95% идентичную аминокислотной последовательности, показанной в Таблице 2В с сигнальной последовательностью (аминокислоты -20 по 227 из SEQ ID N0:4).
84. Полипептид по любому из пп. 73-83, который имеет сильно редуцированные фосфорилирование и сульфатацию по сравнению с полученным из плазмы Фактором IX.
85. Полипептид по п. 84, который менее чем на около 10% фосфорилирован и менее чем на около 9% сульфатирован.
86. Полипептид по любому из пп. 73-85, который имеет К значение более чем 0,7 или 0,75.
87. Полипептид по п. 86, который имеет К значение по меньшей мере около 0,8, по меньшей мере около 0,9, или по меньшей мере около 1.
88. Полипептид по любому из пп. 73-87, который демонстрирует один или более фармакокинетических параметров, у упомянутой популяции пациентов или у упомянутого пациента, выбранного из группы, состоящей из следующего:
средний клиренс (CL) (активность) у упомянутой популяции пациентов около 3,36 ± 0,93 мл/час/кг;
средний клиренс (CL) (активность) у упомянутой популяции пациентов около 3,03,72; 3,0; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7, или 3,72 мл/час/кг;
средний клиренс (CL) (активность) у упомянутой популяции пациентов, который примерно в 2,5 раза ниже, чем клиренс полипептида, содержащего упомянутый Фактор IX без упомянутого FcRn BP;
клиренс (CL) (активность) у упомянутого пациента около 1,84-4,58 мл/час/кг
среднее среднее время удержания (MRT) (активность) у упомянутой популяции пациентов по меньшей мере около 68,05 ± 11,16 часов;
среднее MRT (активность) у упомянутой популяции пациентов of около 60-78, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78 часов;
среднее MRT (активность) у упомянутой популяции пациентов, которое примерно в 3 раза длиннее, чем среднее MRT полипептида, содержащего упомянутый Фактор IX без упомянутого FcRn BP;
среднее время удержания (MRT) (активность) у упомянутого пациента около 53,185,8 часов;
среднее время удержания (MRT) (активность) у упомянутого пациента по меньшей мере около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85 или около 90 часов;
среднее ^дбега (активность) у упомянутой популяции пациентов около 52,5 ± 9,2
часов;
среднее ^дбета (активность) у упомянутой популяции пациентов, которое составляет около 47-60 часов, около 47, около 48, около 49, около 50, около 51, около 52, около 53, около 54, около 55, около 56, около 57, около 58, около 59, около 60 часов; среднее ^дбега (активность) у упомянутой популяции пациентов, которое примерно в 3 раза длиннее, чем среднее tj^eera полипептида, содержащего упомянутый Фактор IX без упомянутого FcRn BP;
ti/гбета (активность) у упомянутого пациента около 40-67,4, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70 или около 75 часов;
среднее увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемая) у упомянутой популяции пациентов около 0,93 ±0,18 МЕ/дл на МЕ/кг;
среднее увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемая) у упомянутой популяции пациентов около 0,85-1,15, около 0,85, около 0,86, около 0,87, около 0,88, около 0,89, около 0,90, около 0,91, около 0,92, около 0,93, около 0,94, около 0,95, около 0,96, около 0,97, около 0,98, около 0,99, около 1,0, около 1,05, около 1,10 или около 1,15 МЕ/дл на МЕ/кг;
среднее увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемая) у упомянутой популяции пациентов, которое на около 24% больше, чем среднее увеличение концентрации полипептида, содержащего упомянутый Фактор IX без упомянутого FcRN BP;
увеличение концентрации (К значение) (активность; наблюдаемая) у упомянутого пациента около 0,62-1,17 МЕ/дл на МЕ/кг;
средняя Vss (активность) у упомянутой популяции пациентов около 226 ± 67,76
мл/кг;
средняя Vss (активность) у упомянутой популяции пациентов около 200-300, около 200, около 210, около 220, около 230, около 240, около 250, около 260, около 270, около 280, около 290 или около 300 мл/кг;
Vss (активность) у упомянутого пациента около 145-365 мл/кг;
средняя AUC/доза (активность) у упомянутой популяции пациентов около 32,44 ± 10,75 МЕ*ч/дл на МЕ/кг;
средняя AUC/доза (активность) у упомянутой популяции пациентов около 26-40, около 26, около 27, около 28, около 29, около 30, около 31, около 32, около 33, около 34, около 35, около 36, около 37, около 38, около 39 или около 40 МЕ*ч/дл на МЕ/кг;
AUC/доза у упомянутого пациента около 21,80-54,30 МЕ*ч/дл на МЕ/кг.
89. Полинуклеотид, кодирующий полипептид любого из п. 73-80.
90. Полинуклеотид, кодирующий Фактор IX-FcRn BP полипептид и второй пептид любого из п. 81-88.
91. Полинуклеотид п. 89 или 90, который представляет собой вектор, плазмиду, фаг или вирус.
92. Полинуклеотид любого из пп. 89-91, который представляет собой ДНК или
РНК.
93. Культивируемая человеческая эмбриональная клетка, содержащая
полинуклеотид любого из пп. 89-92.
94. Клетка п. 93, которая представляет собой НЕК293 клетку.
95. Способ производства Фактора IX-FcRn BP гибридного белка, содержащий: культивирование клетки п. 93 или 94 при условиях, которые позволяют экспрессию
кодируемого Фактора IX-FcRn BP химерного полипептида и кодируемого полипептида, состоящего по существу из FcRn BP; и
восстановление кодируемого Фактора IX-FcRn BP гибридного белка.
96. Гибридный белок, произведенный по способу п. 95.
97. Гибридный белок по п. 96, который имеет высокоредуцированные
фосфорилирование и сульфатацию в сравнении с полученным из плазмы Фактором IX.
98. Гибридный белок по п. 97, который менее чем на около 10% фосфорилирован и менее чем на около 9% сульфатирован.
99. Гибридный белок по любому из пп. 96-98, который имеет К-значение более чем 0,7 или 0,75.
100. Гибридный белок по п. 99, который имеет К-значение по меньшей мереп
около 8, около 9 или около 1.
101. Способ по любому из пп. 66-72, отличающийся тем, что упомянутый химерный полипептид является формой гибрида, где упомянутый гибрид состоит по существу из одной цепи упомянутого химерного полипептида и одной цепи упомянутого второго полипептида, и где упомянутые цепи связаны через (а) нековалентные взаимодействия, (Ь) две дисульфидные связи или (с) как (а), так и (Ь).
102. Полипептид по любому из пп. 81-88 и 96-100, отличающийся тем, что упомянутый химерный полипептид является формой гибрида, где упомянутый гибрид состоит по существу из одной цепи упомянутого химерного полипептида и одной цепи упомянутого второго полипептида, и где упомянутые цепи связаны через (а) нековалентные взаимодействия, (Ь) две дисульфидные связи или (с) как (а), так и (Ь).
103. Препарат рекомбинантного фактора IX (rFIX), который имеет увеличение концентрации (К-значение) у людей более чем 0,75 МЕ/дл на МЕ/кг и отличающийся тем, что менее чем 25% rFIX в препарате полностью фосфорилировано и сульфатировано.
104. rFTX препарат по п. 103, который имеет увеличение концентрации (К-значение) по меньшей мере около 0,8, по меньшей мере около 0,9 или по меньшей мере около 1 МЕ/дл на МЕ/кг.
105. rFIX препарат по п. 103, отличающийся тем, что rFIX содержит FcRn BP.
106. rFIX препарат по п. 105, который содержит FcRn связывающий участок Fc.
107. rFIX препарат по п. 105, который содержит FcRn связывающий участок альбумина.
108. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет 10-50, 10-30, 20-50, 20-100, 10 или 20 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет один раз в неделю.
109. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет 15-50 или 40 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет каждые 10 дней.
ПО. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет 100 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет каждые две недели или дважды в месяц.
111. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутый интервал дозирования составляет один раз в неделю.
112. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет 15-100 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 10-13 дней.
113. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет 50-100 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 10-14 дней,
111.
- Неупомянутая доза составляет 50-150 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 14-15 дней, или упомянутая доза составляет 100-150 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 14-16 дней.
114. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутая доза составляет 15-50 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 10 дней, упомянутая доза составляет 20-70 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 11 дней, упомянутая доза составляет 25-85 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 12 дней, упомянутая доза составляет 30-100 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 13 дней, упомянутая доза составляет 40-125 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 14 дней, или упомянутая доза составляет 50-150 МЕ/кг и упомянутый интервал дозирования составляет 15 дней.
115. Способ по любому из пп. 1-10, который состоит из одного раза в неделю профилактического интервала дозирования.
116. Способ по любому из пп. 1-10, который состоит из 10-14 дневного профилактического интервала дозирования.
117. Способ по любому из пп. 1-10, который состоит из 15-18 или 16-18 дневного профилактического интервала дозирования.
118. Способ по любому из пп. 1-10, который состоит из профилактического интервала дозирования два раза в месяц.
119. Способ по любому из пп. 1-10, который состоит из профилактического интервала дозирования один раз в месяц.
120. Способ по любому из пп. 1-10, который является фиксированной или индивидуализированной профилактической дозой и/или интервалом дозирования.
121. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что упомянутая доза вводится внутривенно или подкожно.
114.
114.
100000
FIXFc концентрация по отношению к времени Сравнение доз Легенда: Доза в МЕ/кг Планки погрешностей = Станд. ошибка
Дерево решений вычитания базового уровня (BS)
Оцененные FIX уровни на "предозовых" и "скрининговых" временных точках
BD к скринингу; BS скрининг
Предоза > 2,0%
Предоза < 2,0%
Предоза > 2,0%
| BS предоза
BD к 2,0%; BS 2,0%
Скрининг < 2,0%
Скрининг > 2,0%
BD к скринингу; BS скрининг
BD к 2,0%; BS 2,0%
BS = вычитание базового уровня
BD = сведение к базовому уровню с использованием значения периода полувыведения состава FIX (напр., 18 ч)
100 -i
Фиг. 7
Фиг. 8
Уровни rFIXFc антигена (нг/мл)
Фиг. 9
Is*
PRO
GLA
EGF-S
ЈGF-A
ACT PEP
каталитический
(л) >
5 В
ь о
f N-гликозилирование ^ О-гликозилирование |
^ Тирозин сульфатация В-гидроксилирование
=1 тэ >
Ь О
NJ СП
Фиг. 10
о н
2 Z
FIXFc Димер
4/587
8 9
FiXFc Мономер
1S8 кДа
Дорожка 1: Маркеры молекулярного веса
Дорожка 2: Пустая дорожка Дорожка 3: Загрузка белка А Дорожка 4: Элюат белка А Дорожка 5: DEAE элюат Дорожка 6: QSeph FF элюат Дорожка 7: конечный объем
сырого материала Дорожка 8: Пустая дорожка Дорожка 9: конечный объем
редуцированного материала
Фиг. 11
Ю г о FIXFc
Активность свертывания (МЕ/мл)
Время (ч)
Фиг. 12
юо т
-о о-
о FiXFc д rFIX
% мышей со свертывающейся кровью
Q L_t * 1 > 1 JAJ i t i а. t i^Tf.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Время (ч)
Фиг. 13
FIXFc в плазме (МЕ/мл)
0.1
0.01
50 100 150 200 Время (ч)
250 300
доза
доза
доза
Рассчитанная FIX активность в плазме (МЕ/мл)
О FIXFc мономер Л ГМХ
0.001
0 50 100 150 200 250 300 Время (ч)
Фиг. 14
О Собака #103 О Собака #108
FIX активность (МЕ/мл)
О 20 4G 80 80 100 120 140 160
0 20 40 60 80 100 120 140 180 Время (ч)
О 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Время (ч)
Фиг. 15
О 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Время (ч)
Фиг. 16
Параметры ROTEM 2
50 100 150 200 250 Время после дозирования (ч)
1000
800
^ 600-I
си и
К 400-
200
2500
2000
1500
си и
5 1О00-
5001
250
50 100 150 200 Время после дозирования (ч)
Частичная корреляция между активностью свертывания (СТ) цельной крови по ROTEM по сравнению с активностью плазмы по аРТТ
10 100 аРТТ (мЕд/мл)
Выживаемость
Сравнительная степень выживаемости после TVTy НетВ мышей, получивших BeneFIX на 24 часа по сравнению с rFIXc на 72 часа до травмы
Остановка кровотечения
Сравнительная степень выживаемости после TVTy НетВ мышей, получивших BeneFIX на 24 часа по сравнению с rFIXc на 72 часа до травмы
id 5 В
=1 тэ > CD
100-г
120 МЕ/кг rFIXFc, 72 ч перед TVT (п=9) 1120 МЕ/кг BeneFIX, 24 ч {fi-9)T ~°
?80-
* бон
си =г о о. а
а 40-
20'
Контроль (п=9)
6- -О
0 S 10 15 20 25
Время после ТУТ (ч)
Предварительный результат
о н
id 5 В
=1 тэ > UJ
100 150 200 Время (ч)
о о в\
Is*
О н
4 6 8 Время (дни)
6 8 10 12 14 16 Время (дни)
Фиг. 25
-1 -
-1 -
-2 -
-1 -
-1 -
-1 -
-2-
-2-
-3-
-8-
-8-
-11 -
- 10-
- 13-
- 13-
- 15-
-16-
- 18-
- 18-
-21 -
-20-
-24-
-24-
-31 -
-30-
-33-
-33-
-41 -
-41 -
-43-
-43-
-51 -
-50-
-53-
-53-
-61 -
-60-
-63-
-66-
-66-
-69-
B. Fc цепь (SEP ID N0:4)
-69-
B. Fc цепь (SEP ID N0:4)
Таблица 3. Концентрация антигена FIXFc у отдельного пациента в соответствии с временными данными; рассортировано по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности вливания и номеру пациента
Таблица 3. Концентрация антигена FIXFc у отдельного пациента в соответствии с временными данными; рассортировано по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности вливания и номеру пациента
Таблица 3. Концентрация антигена FIXFc у отдельного пациента в соответствии с временными данными; рассортировано по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности вливания и номеру пациента (продолжение)
Таблица 3. Концентрация антигена FIXFc у отдельного пациента в соответствии с временными данными; рассортировано по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности вливания и номеру пациента (продолжение)
Таблица 4. Суммарные данные по фармакокинетике FIXFc антигена - отдельные пациенты и среднее групповое значение
Таблица 4. Суммарные данные по фармакокинетике FIXFc антигена - отдельные пациенты и среднее групповое значение
анализу); и 101+20,9 (78-140), соответственно. Вследствие коррекции округления или других ошибок, (а) должно быть 207000, и (Ь) должно быть 0,468, (с) должно быть 52,1.
анализу); и 101+20,9 (78-140), соответственно. Вследствие коррекции округления или других ошибок, (а) должно быть 207000, и (Ь) должно быть 0,468, (с) должно быть 52,1.
Таблица 5. Средняя активность FIXFc у отдельных пациентов и групповая и скорректированная по базовому уровню FIXFc
активность по сравнению с временными данными; Распределено по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности введения и номеру пациента
Таблица 5. Средняя активность FIXFc у отдельных пациентов и групповая и скорректированная по базовому уровню FIXFc
активность по сравнению с временными данными; Распределено по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности введения и номеру пациента
Примечание: Данные, выделенные полужирным шрифтом, представляют возврат к базовому уровню и были исключены
Таблица 5. Средняя активность FIXFc у отдельных пациентов и групповая и скорректированная по базовому уровню FIXFc
активность по сравнению с временными данными; Распределено по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности введения и номеру пациента (продолжение)
Примечание: Данные, выделенные полужирным шрифтом, представляют возврат к базовому уровню и были исключены
Таблица 5. Средняя активность FIXFc у отдельных пациентов и групповая и скорректированная по базовому уровню FIXFc
активность по сравнению с временными данными; Распределено по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности введения и номеру пациента (продолжение)
Примечание: Данные, выделенные полужирным шрифтом, представляют возврат к базовому уровню и были исключены
Таблица 5. Средняя активность FIXFc у отдельных пациентов и групповая и скорректированная по базовому уровню FIXFc
активность по сравнению с временными данными; Распределено по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности введения и номеру пациента (продолжение)
Таблица 5. Средняя активность FIXFc у отдельных пациентов и групповая и скорректированная по базовому уровню FIXFc
активность по сравнению с временными данными; Распределено по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности введения и номеру пациента (продолжение)
Таблица 5. Средняя активность FIXFc у отдельных пациентов и групповая и скорректированная по базовому уровню FIXFc
активность по сравнению с временными данными; Распределено по номинальной дозе, фактической дозе, продолжительности введения и номеру пациента (продолжение)
Таблица 6. Фармакокинетические суммарные данные по средней активности FIXFc у отдельных пациентов и групповой;
Распределено по номинальной дозе, фактической дозе и номеру пациента
Таблица 6. Фармакокинетические суммарные данные по средней активности FIXFc у отдельных пациентов и групповой;
Распределено по номинальной дозе, фактической дозе и номеру пациента
Таблица 7В
Таблица 7В
-85-
- 84-
Таблица 13. Средние значения РК на основании активности
Таблица 13. Средние значения РК на основании активности
Таблица 14. Средние значения РК на основе уровня антигена.
Таблица 14. Средние значения РК на основе уровня антигена.
pdFIX
Таблица 15: Биохимическая характеристика Фактора IX
pdFIX
Таблица 15: Биохимическая характеристика Фактора IX
Таблица 16: Сводка терминальных полупериодов FIXFc и BENEFIX(tm) после однократной внутривенной дозы.
Таблица 16: Сводка терминальных полупериодов FIXFc и BENEFIX(tm) после однократной внутривенной дозы.
-93-
-93-
Таблица 21. РК и PD анализы rFIXFc и BENEFIX(tm) после
однократной подкожной дозы дефицитным по FIX мышам.
-94-
Таблица 21. РК и PD анализы rFIXFc и BENEFIX(tm) после
однократной подкожной дозы дефицитным по FIX мышам.
-94-
Таблица 21. РК и PD анализы rFIXFc и BENEFIX(tm) после
однократной подкожной дозы дефицитным по FIX мышам.
-96-
-97-
-97-
Таблица 25. РК анализ rFIXFc после однократной подкожной дозы яванским макакам.
Таблица 25. РК анализ rFIXFc после однократной подкожной дозы яванским макакам.
Таблица 26. Рекомендации по дозировке для rFIXFc терапии Гемофилии В
Таблица 26. Рекомендации по дозировке для rFIXFc терапии Гемофилии В
<220>
<220>
<220>
- 103-
- 103-
- 106 -
- 106 -
- Ill -
- Ill -
- 113 -
- 112-
Фиг. 1
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 4
Фиг. 4
Фиг. 4
Фиг. 4
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 5
8/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
8/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
7/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
7/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
8/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
8/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
9/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
9/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
9/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
9/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
9/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
9/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
9/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
11/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
11/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
11/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
12/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
13/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
13/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
13/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
13/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
13/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
13/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
13/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
13/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
14/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
14/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
14/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
14/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
14/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
14/24
WO 2012/006624
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Фиг. 17
Фиг. 17
Фиг. 21
Фиг. 21
Фиг. 22
Фиг. 22
Фиг. 22
Фиг. 22
Фиг. 22
Фиг. 22
Фиг. 23
Фиг. 23
Фиг. 24
Фиг. 24
WO 2012/006624
24/24
PCT/US2011/043569
WO 2012/006624
24/24
PCT/US2011/043569
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
