EA201291444A1 20130628 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2013/PDF/201291444 Полный текст описания [**] EA201291444 20110531 Регистрационный номер и дата заявки DKPA201070243 20100603 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок DK2011/050186 Номер международной заявки (PCT) WO2011/150933 20111208 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [pdf] eaa21306 Номер бюллетеня [**] ЭНЕРГОСБЕРЕГАЮЩИЙ СПОСОБ ВАРКИ Название документа [8] A01H 5/10, [8] C12C 1/18, [8] C12C 7/00, [8] C12C 12/00, [8] C12N 9/10, [8] C12N 15/82 Индексы МПК [DK] Кнудсен Серен, [DK] Риис Пребен, [DK] Скадхауге Биргитте, [DK] Бек Лене Мельскоу, [DK] Ольсен Оле Сведения об авторах [DK] КАРЛСБЕРГ БРЮИРИЗ А/С, [NL] ХЕЙНЕКЕН СЕПЛАЙ ЧЕЙН Б.В. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201291444a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[**]

Напитки на основе ячменя получают в больших количествах, применяя высокоэнергоемкие способы, например, на солодовых и пивоваренных заводах для процессов печной сушки и варки сусла соответственно. Изобретение относится к энергосберегающим способам получения напитков на основе ячменя, а также к растениям ячменя, пригодным в таких способах. В частности, изобретение относится к растениям ячменя с комбинированными признаками отсутствия липоксигеназы-1 (без LOX-1), отсутствия липоксигеназы-2 (без LOX-2) и отсутствия S-аденозилметионин:метионин-S-метилтрансферазы в одном растении, которое особенно пригодно для энергосберегающих способов получения напитков на основе ячменя, таких как пиво.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Напитки на основе ячменя получают в больших количествах, применяя высокоэнергоемкие способы, например, на солодовых и пивоваренных заводах для процессов печной сушки и варки сусла соответственно. Изобретение относится к энергосберегающим способам получения напитков на основе ячменя, а также к растениям ячменя, пригодным в таких способах. В частности, изобретение относится к растениям ячменя с комбинированными признаками отсутствия липоксигеназы-1 (без LOX-1), отсутствия липоксигеназы-2 (без LOX-2) и отсутствия S-аденозилметионин:метионин-S-метилтрансферазы в одном растении, которое особенно пригодно для энергосберегающих способов получения напитков на основе ячменя, таких как пиво.


Евразийское (21) 201291444 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A01H5/10 (2006.01)
2013.06.28 C12C1/18 (2006.01)
C12C 7/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки C12C12/00 (2006.01)
2011.05.31 C12N 9/10 (2006.01)
C12N15/82 (2006.01)
(54) ЭНЕРГОСБЕРЕГАЮЩИЙ СПОСОБ ВАРКИ
(31) PA201070243
(32) 2010.06.03
(33) DK
(86) PCT/DK2011/050186
(87) WO 2011/150933 2011.12.08
(88) 2012.06.07
(71) Заявитель:
КАРЛСБЕРГ БРЮИРИЗ А/С (DK); ХЕЙНЕКЕН СЕПЛАЙ ЧЕЙН Б.В. (NL)
(72) Изобретатель:
Кнудсен Серен, Риис Пребен, Скадхауге Биргитте, Бек Лене Мельскоу, Ольсен Оле (DK)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Напитки на основе ячменя получают в больших количествах, применяя высокоэнергоемкие способы, например, на солодовых и пивоваренных заводах для процессов печной сушки и варки сусла соответственно. Изобретение относится к энергосберегающим способам получения напитков на основе ячменя, а также к растениям ячменя, пригодным в таких способах. В частности, изобретение относится к растениям ячменя с комбинированными признаками отсутствия липоксигеназы-1 (без LOX-1), отсутствия липоксигеназы-2 (без LOX-2) и отсутствия 8-аденозилметионин:метионин-8-ме-тилтрансферазы в одном растении, которое особенно пригодно для энергосберегающих способов получения напитков на основе ячменя, таких как пиво.
2420-191651ЕА/072 ЭНЕРГОСБЕРЕГАЮЩИЙ СПОСОБ ВАРКИ
Все патентные и непатентные ссылки, цитируемые в заявке, включены, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к энергосберегающим
способам получения напитков на основе ячменя, например,
напитков на основе солода, таких как пиво. Кроме того,
изобретение относится к растениям ячменя, пригодным в
описываемых способах. В частности, изобретение относится к
растениям ячменя с комбинированными признаками отсутствия
липоксигеназы 1 (без L0X-1), отсутствия липоксигеназы 2 (без
L0X-2) и отсутствия S-аденозилметионин:метионин S-
метилтрансферазы (также обозначаемой без S-метионин (Met)-S-метилтрансферазы или без ММТ) в одном растении, т.е. растение ячменя без LOX-1-без LOX-2-без ММТ (также взаимозаменяемо обозначаемое в настоящем документе без двух LOX-без ММТ), которые особенно пригодны в энергосберегающих способах для получения напитков на основе ячменя, описываемых в настоящем документе.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Солодовый завод и варочный цех
Ячмень - Hordeum vulgare, L. - представляет собой диплоидный злак, который широко выращивают в различных климатических условиях для получения продуктов питания и напитков. Напитки на основе указанного растения получают в больших количествах с использованием способов с высоким потреблением энергии, например, на солодовых и пивоваренных заводах для процедур печной сушки и варки сусла, соответственно.
Как правило, соложение, включает замачивание зерен ячменя для стимуляции проращивания, с последующей печной сушкой при повышенных температурах, что делает процесс особенно энергоемким. Ключевые задачи печной сушки включают: (i) завершение проращивания; (ii) сушку проросших зерен ячменя; (iii) денатурацию ферментов, особенно ферментов липазы и LOX в
ячмене дикого типа и (iv) преобразование предшественников диметилсульфидов (DMS) (DMSP), преимущественно состоящих из S-метил-Met (SMM), в легкоиспаряющиеся DMS [после печной сушки нормального светлого солода содержание DMSP в среднем составляет 4 м.д. в сухой массе (см. Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin, pp. 158-162)]. Определенные виды ферментативной активности при печной сушке сохраняются
(например, амилазная, протеазная, и т.д.).
В варочном цехе в основном потребляется приблизительно половина энергии процесса варки, соответствующая энергетической нагрузке в диапазоне 48000-83000 кДж/гл (Modern brewhouse technology, Brauwelt International 2004, p. 410-412). Большинство энергии потребляется в процессе варки сусла, целью которого в основном является обеспечение: (i) коагуляции белка;
(ii) инактивации ферментов; (iii) стерилизации сусла; (iv) экстракции хмелевых соединений; (v) изомеризации а-кислот и
(vi) выпаривания нежелательных легкоиспаряющихся соединений, например, веществ с неприятным серным и затхлым привкусами DMS и транс-2-ноненаля (T2N), соответственно.
Сусло традиционно варят по меньшей мере в течение 50-60 мин для обеспечения общего выпаривания по меньшей мере 10-15%
(см. Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin, Chapter 11), но в настоящее время посредством технологических способов часто улучшают до 6-8%. Также предпринимались попытки снизить энергопотребление даже больше, например, минимизируя выпаривание до 3-4%, комбинируя с процессом отгонки, в ходе которого в нагнетаемый пар экстрагируют нежелательные легкоиспаряющиеся соединения (см. например, Bonacchelli et al., 2007). Полагают, что уровни содержания нежелательных, легкоиспаряющихся соединений в сусле делают трудным дальнейшее уменьшение или даже исключают выпаривание. T2N
T2N - легкоиспаряющийся Сэ-алкеналь с точкой кипения 8 8 °С охарактеризован в 197 0 году как молекула, придающая пиву привкус картона (Jamieson and Gheluwe, 1970). Поскольку уровень порога вкусового ощущения в отношении T2N у людей является
крайне низким, определенным ранее на уровне приблизительно 0,7 нМ или 0,1 млрд.д. (Meilgaard, 1975), продукты даже с незначительными уровнями альдегида воспринимаются как передержанное. Однако, как правило, уровни T2N в свежем пиве являются очень низкими (Lermusieau et al., 1999), что свидетельствует о том, что процессы в ходе старения способствуют высвобождению из соответствующих аддуктов свободного T2N (Nyborg et al., 1999). Последующие наблюдения выявили зависимость между потенциалом T2N сусла и образуемым свободным T2N после хранения продукта (Kuroda et al., 2005).
Печная сушка и варка сусла представляют собой отдельные этапы обработки, которые могут являться мишенями для манипуляции для достижения сниженных уровней T2N в напитках на основе ячменя. Хотя печная сушка при высоких температурах обеспечивает инактивацию ферментов вовлеченных в формирование T2N, таких как липазы и LOX (см. например, Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin, p. 162), свободный T2N также можно удалять посредством варки сусла.
Зерно ячменя содержит три фермента LOX, известных как LOX-
1, LOX-2 и LOX-3 (van Mechelen et al., 1999). Основная
активность LOX-1 катализирует образование 9-
гидропероксиоктадекадиеновой кислоты (9-HPODE; см. фиг. 1А в отношении частичного обзора LOX-пути) - предшественника как T2N, так и тригидроксиоктадеценовых кислот (сокращенно ТНА) из линолевой кислоты. LOX-2 в основном катализирует преобразование линолевой кислоты в 13-HPODE, которая дополнительно метаболизируется в гексаналь, Сб-альдегид с высоким порогом вкусового ощущения "0,4 м.д. (Meilgaard, выше). Учитывая очень низкую активность LOX-2 в формировании 9-HPODE, в нескольких публикациях указано, что T2N образуется посредством биохимического пути, включающего преобразование линолевой кислоты в 9-HPODE, исходно катализируемое LOX-1, с последующим расщеплением 9-HPODE под действием 9-гидропероксидлиазы (см., например, Kuroda et al. , 2 0 03, 2005; Noodermeer et al., 2001) .
Принимая во внимание указанные выше свойства LOX-1,
указанный фермент является пригодной мишенью для инактивации в попытках снижения уровней содержания T2N в продуктах на основе ячменя, что фактически подтверждается следующими двумя наблюдениями: (i) Kuroda et al. (2 005) предположили корреляцию между активностью LOX-1 и потенциалом T2N сусла, преимущественно вследствие того, что LOX-2 рассматривается не соответствующей относительно формирования потенциала T2N в указанном сусле. Однако по-видимому корреляция между общей активностью LOX в солоде и потенциалом T2N сусла отсутствует; (ii) описаны способы получения сниженной активности L0X-1 в ячмене.
Получены несколько различных растений ячменя с общим свойством частично или полностью сниженной активностью LOX-1. Например, зерна ячменя и растения ячменя с низкой активностью LOX-1 описаны в заявке РСТ WO 02/053721 Douma, А. С. et al. , тогда как WO 2005/087934 Breddam, К. et al. описаны два различных мутанта ячменя с дефицитом активности LOX-1 - мутант по участку сплайсинга и мутант с преждевременным стоп-кодоном трансляции. Кроме того, в ЕР 1609866 Hirota, N. et al. описано растение ячменя без активности LOX-1, идентифицированное скринингом коллекции местных сортов ячменя.
DMS
В напитках на основе ячменя, а также во многих овощах и продуктах питания, включая чай, какао, молоко, вина, спиртные напитки (например, ром), сладкую кукурузу и многие приготовленные овощи, DMS добавляет продукту отчетливые ноты запаха и вкуса. В зависимости от типа пива, уровни DMS, как правило, могут достигать 150 млрд.д. (150 мкг/л), с частым внесением указанным соединением вклада в нежелательные запахи "вареных овощей" или "подобный запаху капусты". В этом отношении важно не только то, что порог чувствительности находится около 30-45 мкг/л (Meilgaard, 1982), но также то, что возникающий вследствие DMS запах остается незамеченным на уровнях <10 млрд.д.
Указанные выше этапы обработки печной сушки и варки сусла при получении пива влияют на уровни DMS в напитках на основе
ячменя преимущественно потому, что оба указанных процесса могут индуцировать химическое преобразование SMM в DMS (см. например, Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin, p. 160). Вследствие того, что точка кипения последнего соединения составляет только 37-38°С, большая часть DMS просто выпаривается в атмосферу. Однако когда длительность или энергичность варки сусла являются недостаточными для преобразования остаточного SMM, DMS может продолжать формироваться по мере охлаждения сусла с высокой вероятностью перехода в пиво.
SMM представляет почти весь, возможно весь пул DMSP в прорастающих зернах ячменя, синтезируемый под действием функциональных компонентов цикла SMM (фиг. 1В). В нем ММТ катализирует перенос метильной группы с З-аденозил-Met (AdoMet) на Met, с образованием SMM. Последнее соединение, в свою очередь, может служить донором метила для синтеза Met из гомоцистеина (Нсу), причем данная реакция катализируется ферментом Hcy-S-метилтрансферазой (НМТ).
В научной литературе, рассматривается потенциал регуляции синтеза SMM с использованием, например, технологии антисмысловых последовательностей (McElroy и Jacobsen, 1995). Однако не было предоставлено указаний, на какие соответствующие гены-мишени следует направить антисмысловые последовательности. Несмотря на это ожидалось, что вероятность положительного исхода находится под вопросом, поскольку значительное снижение уровня SMM может быть вредным для роста и развития ячменя. Альтернативные решения для получения более низких концентраций SMM McElroy и Jacobsen не обсуждались (выше). Также, как подробно обсуждается ниже в настоящем документе, технологии антисмысловых последовательностей не были успешно применены в ячмене для полного блокирования генной экспрессии.
Разработаны технологические способы снижения уровня DMS в пиве. Таким образом, в AU 3 8 578/93 описан способ снижения уровней DMS в солоде, включающих обработку указанного солода паром. В патентной заявке US 2006/0057684 Bisgaard-Frantzen, Н.
et al. описаны способы пивоварения, включающие тепловую обработку сусла при > 70°С. И в патенте США № 5242694 Reuther, Н. указаны способы получения пива с низким содержанием углеводов, где способы включают интенсивное кипячение сусла с последующим промыванием указанного сусла диоксидом углерода (СОг) • Однако известно, что все указанные выше способы обработки потребляют энергию на высоком уровне, возможно изменяя характеристики солода или сусла. Мутантные растения ячменя
К сожалению, доступных способов получения трансгенных растений ячменя, которые полностью лишены экспрессии этого белка, не существует. В основном, в случае ячменя, применение способов антисмысловых последовательностей приводит к трансгенным растениям, все еще экспрессирующим некоторые количества интересующего белка (см., например, Robbins et al. 1998; Stahl et al., 2004; Hansen et al., 2007). Также не разработано эффективных способов получения специфических мутаций с использованием химерных РНК/ДНК или сайт-специфического мутагенеза для применения в растениях ячменя. В соответствии с этим и несмотря на интенсивные усилия в этом направлении, авторам настоящей заявки остается не известно о каком-либо опубликованном примере успешного, обусловленного олигонуклеотидом направленного действия на ген ячменя. Хотя и не в отношении ячменя, Iida и Terada (2005) указывают, что обусловленное олигонуклеотидом направленное действие на гены тестировали в кукурузе, табаке и рисе, но во всех случаях с геном устойчивости к гербицидам ацетолактатсинтазы (ALS) в качестве мишени. Согласно выводам Iida и Terada (выше), остается установить, может ли применяться указанная выше стратегия с подходящими модификациями к генам, отличающимся от генов, которые непосредственно приводят к прямому отбору, таких как гены ALS. Хотя и не доказано, направленный мутагенез с использованием нуклеаз с цинковыми пальцами предоставляет собой другой инструмент, который потенциально может обеспечить дальнейшие исследования в фундаментальной биологии растений или
модификации сельскохозяйственных культур (Durai et al. , 2005; Tzfira и White, 2005; Kumar et al., 2006). Однако в этом случае мутагенез также не был осуществлен или успешно применен на ячмене.
Тем не менее, мутанты ячменя можно получать посредством случайного мутагенеза с использованием облучения или химической обработки, такой как инкубация зерен в течение срока от 12 часов до в течение ночи с раствором азида натрия (ИаИз) . Пример относится к зернам ячменя, подвергнутым мутагенезу посредством использования ИаИз, а затем скринингу на высокие уровни свободного фосфата с целью скрининга на наличие мутантов с низким уровнем фитата (Rasmussen and Hatzack, 1998); всего из 2 000 подвергнутых скринингу зерен идентифицировано 10 мутантов. Хотя это далеко не всегда возможно, нахождение конкретного мутанта после обработки NaN3 зависит от его жизнеспособности и эффективного способа скрининга.
Рациональное и экологичное природопользование
В мировых поисках решения энергетических, экологических и пищевых проблем, одним из центров внимания общества является ограничение или снижение концентраций СОг в атмосфере, особенно с концентрацией на выбросе СОг промышленных систем. Главной причиной является то, что увеличение концентрации парникового газа вызывает изменение энергетического баланса Земли, где наибольший единичный вклад вносит СОг. Как следствие широко распространенного беспокойства об изменении климата, а также на основе экономических обоснований и ограничений, пивоваренные заводы могут играть активную роль, используя энергию так эффективно, как возможно, и более эффективно снижая выбросы парникового газа при эксплуатации. До настоящего времени, фокус был сосредоточен на технологических способах решения указанных выше задач рационального и экологичного природопользования.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Описаны способы тепловой обработки для снижения активности LOX и уровней DMS. Как правило, указанную обработку предпринимали при соложении и/или получении сусла, что означает, что до проведения тепловой обработки в ячмене
позволяли накапливаться продуктам активности LOX. Анализ ячменя выявил, что значительные количества продуктов активности LOX присутствовали в ячмене даже перед соложением (Wackerbauer and Meyna, 2002). Очевидно, что способы тепловой обработки являются высокоэнергоемкими.
Настоящее изобретение относится к способам получения напитка на основе зерен с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников (исключительно низкими уровнями DMS и T2N и их предшественников) , где способ включает сниженное потребление энергии, где способ включает этапы:
(i) предоставления зернового растения или его частей, где
указанное зерновое растение несет:
(a) первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности LOX-1; и
(b) вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности LOX-2; и
(c) третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ;
(ii) необязательного соложения по меньшей мере части указанного зернового растения, таким образом, получая осоложенное зерновое растение;
(iii) заваривания указанного зернового растения и/или осоложенного зернового растения и необязательно дополнительных добавок, таким образом, получая сусло;
(iv) нагревания указанного сусла необязательно в присутствии дополнительного ингредиента(ов), где выпаривается самое большое 4% объема сусла, таким образом, получая нагретое сусло;
(v) переработки указанного нагретого сусла в напиток;
таким образом, получая получаемый из зернового растения
напиток с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников.
В частности изобретение относится к способам получения напитка на основе ячменя с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников
(исключительно низкими уровнями DMS и T2N и их предшественников), где способ включает сниженное потребление энергии, где способ включает этапы:
(i) предоставления растения ячменя или его частей, где
указанное растение ячменя несет:
(a) первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1; и
(b) вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2; и
(c) третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ;
(ii) необязательно соложения по меньшей мере части указанного ячменя, таким образом, получая осоложенный ячмень;
(iii) заваривания указанного ячменя и/или осоложенного ячменя и необязательно дополнительных добавок, таким образом, получая сусло;
(iv) нагревание указанного сусла необязательно в присутствии дополнительного ингредиента(ов), где выпаривается самое большое 4% объема сусла, таким образом, получая нагретое сусло;
(v) переработки указанного нагретого сусла в напиток;
таким образом, получая получаемый из ячменя напиток с
низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников.
Также целью настоящего изобретения является предоставление растения ячменя, пригодного для использования в описываемых способах. Таким образом, целью изобретения является предоставление агрономически пригодного растения ячменя, включающего все три различных признака, т.е. растение ячменя без LOX-1-без LOX-2-без ММТ (в настоящем документе также обозначаемое "без двух LOX-без ММТ"). Отбор пригодного растения ячменя относится не только к жизнеспособности растения, но также и к комбинированному отсутствию ферментативной активности LOX-1, L0X-2 и ММТ при использовании биохимических анализов, как подробно описано в настоящем документе ниже. Растения ячменя по настоящему изобретению можно вводить в любую
подходящую схему селекции, такую как самоопыление, возвратное скрещивание, скрещивание по популяциям и т.п.
Путь ускорения процесса разведения растений включает исходное размножение полученных мутантов путем применения способов культуры ткани и регенерации. Как описано в примере 3 и схематически представлено на фиг. 3, для получения растения ячменя с признаком без двух LOX-без ММТ из растения ячменя без двух LOX и растения без ММТ использовали традиционную схему селекции ячменя. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения относится к предоставлению клеток, которые при росте и дифференцировке дают растения ячменя с признаком без двух LOX-без ММТ. Например, селекция может включать традиционные скрещивания, получение растений, происходящих из фертильных пыльников, двойные гаплоидные растения с использованием культур тканей, таких как культура пыльников или культура микроспор.
В настоящем изобретении описано, что сниженное потребление энергии при печной сушке достижимо при использовании зерен без LOX вследствие отсутствия необходимости инактивации эндогенного фермента LOX. Для получения сырья с отсутствием соответствующей ферментативной активности можно использовать мутант без двух LOX-без ММТ, описываемый в настоящем изобретении, получая интересующий мутант для достижения более низкого энергопотребления при печной сушке на солодовом заводе, а также на пивоваренном заводе вследствие сниженного расхода тепла при варке сусла.
С точки зрения качества пива или напитка также существует необходимость в сырье без двух LOX-без ММТ для функционального устранения или существенного снижения уровней T2N и DMS в продуктах.
В дополнение к указанным выше потенциальным свойствам солода без двух LOX-без ММТ соответствующий ячмень можно использовать для получения ячменного пива с низким содержанием веществ с неприятным привкусом, определяемого в настоящем документе как пиво, получаемое с пропуском процесса соложения, но вместо этого предоставляя сусло, содержащее многочисленные
внешние ферменты (например, смесь ферментов Ondea Pro, получаемую в Novozymes). Как рассматривается в настоящем документе ниже, в примере 7, авторы настоящего изобретения неожиданно выявили, что сусло, получаемое посредством заваривания неосоложенного сырья ячменя без двух LOX-без ММТ, содержало очень низкие уровни веществ с неприятным привкусом T2N и DMS, тогда как сырье из ячменя дикого типа содержало неожиданно высокие уровни DMS, несмотря на то, что зерна ячменя не подвергали проращиванию. Таким образом, некоторые предшественники DMS (DMSP) должны присутствовать в сухом созревшем зерне ячменя - новое, еще неописанное свойство, которое исследовано в пивных продуктах по настоящей заявке. Таким образом, зерна без двух LOX-без ММТ пригодны для получения сваренного из ячменя сусла и пива для минимизации уровней T2N и DMS в свежих и передержанных пивных продуктах. ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг. 1 предоставлен упрощенный обзор биохимических путей ячменя приводящих к формированию T2N (А) и SMM (В) . Ферменты, отсутствующие в тройном нуль-мутанте ячменя выделены черными прямоугольниками. Сокращения ферментом являются такими, как определено в настоящей заявке. На фиг. 1В представлены выбранные компоненты цикла SMM, в котором SMM синтезируется путем переноса метила с S-аденозилметионина (SAM) на метионин (Met), катализируемого ферментом Met-S-метилтрансферазой (ММТ). SMM, в свою очередь, может служить донором метила для синтеза Met из гомоцистеина (Нсу) в реакции, катализируемой ферментом Hcy-S-метилтрансферазой (НМТ). Иллюстрация демонстрирует, как связаны, по существу, необратимые реакции. Каждый оборот цикла является бесполезным, поскольку он потребляет и затем регенерирует два Met, преобразуя АТФ в аденозин, PPi и Pi (не показано).
На фиг. 2 представлены результаты экспериментов ВЭЖХ для подтверждения фенотипа мутанта 8063 и мутанта 14018 без ММТ.
(А) Пример основанного на ВЭЖХ разделения экстракта проростков сорта Prestige с показанной элюцией аспарагиновой кислоты
(Asp), глутаминовой кислоты (Glu), аспарагина (Asn), серина
(Ser) и SMM. Флуоресценцию дериватизированных ОРА экстрактов проростков ячменя возбуждали при 34 0 нм, а испускание измеряли при 450 нм. (В) Основанное на ВЭЖХ разделение экстрактов из указанных мутантов и сорта дикого типа Sebastian. Разделение компонентов в мутантном экстракте обеспечивало хроматограмму без специфичных для SMM пиков.
На фиг. 3 проиллюстрирован рабочий процесс скрещивания растений ячменя без LOX-1-без LOX-2 (без двух LOX) и без ММТ с получением тройного нуль-мутанта ячменя.
На фиг. 4 представлена активность LOX в образцах, получаемых из указанных растений. Результаты определения общей активности LOX в зрелых зернах ячменя представлены серыми столбцами, тогда как черные столбцы представляют активность LOX-2 в прорастающих зародышах. Очень низкую активность LOX наблюдали в обоих растениях без LOX-1-без LOX-2 и тройном-нулевом.
На фиг. 5 показано, что проросшие растения тройных нуль-мутантов не могут синтезировать SMM (верхняя панель, на которой на хроматограмме СЭЖХ соответствующий пик отсутствует СЭЖХ), тогда как в экстракте из прорастающего ячменя дикого типа, сорт Quench, указанное соединение легко детектируется в виде соответствующего пика хроматограммы (нижняя панель). Указаны положения при элюции выбранных аминокислот.
На фиг. б графически представлены подробности рабочего
процесса микросоложения и микрозаваривания (А) , в дополнение к
подробностям пробного соложения, заваривания и пивоварения
зерен из ячменя дикого типа (В) и тройного нуль-мутанта (С) .
Переход отдельных образцов (обозначенных серыми
прямоугольниками) проиллюстрирован стрелками. Начало,
промежуточные продукты и конечные продукты обозначены полужирным шрифтом на верху листа; процессы обозначены курсивом. На (А) , номера курсивом ниже листа процесса обозначают точки забора образцов для определения уровней свободного T2N и его предшественников (2 и 4) и DMSP и DMS (1, 2, 3), где точка измерения 4 представляет охлажденное нагретое сусло. Для микрозаваривания ячменной муки образцы измеряли в
точках забора образцов 2, 3 и 4. На (В) и (С) уровни DMSP, DMS, предшественника T2N и свободного T2N определяли во всех точках забора образцов.
На фиг. 7 показано, что пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, дает приблизительно в четыре раза больше пивной пены, чем у пива, сваренного на солоде сорта дикого типа Quench - вне зависимости от варки сусла под давлением или нормальной варки сусла.
На фиг. 8 предоставлен один из примеров того, как можно выращивать зерна ячменя, подвергнутые мутагенезу посредством ЫаЫз. Зерна поколения МО вырастали в растения, которые давали зерна поколения Ml. Их можно посеять с получением растений Ml, которые дают новые зерна поколения М2. Затем растения М2 растут и дают зерна поколения МЗ. Зернам поколения МЗ можно дать прорасти, например, для анализа колеоптилей проросших растений МЗ. Кроме того, цветы, получаемые от зерен растений МЗ, можно использовать в скрещиваниях с линиями или сортами ячменя с получением растений поколения М4. Подобная фигура представлена в виде фиг. 1А в патентной заявке РСТ W0 2005/087934 Breddam, К. et al.
На фиг. 9 представлен упрощенный, схематичный обзор предпочтительного способа получения пива, включающего в себя замачивание зерен ячменя (1), проращивание (2), печную сушку
(3), помол сухого солода (4), заваривание (5), фильтрацию (б), варку сусла в присутствии добавленного хмеля (7), ферментацию в присутствии дрожжей (8), созревание пива (9), фильтрацию пива
(10), упаковку, такую как упаковку в бутылки, банки и тому подобное (11) и нанесение этикетки (12) . Отдельные процессы могут группироваться в секции, включающие в себя получение солода (1-3), получение сусла (4-7), ферментацию (8-9) и получение конечного пива (10-12). Хотя проиллюстрирован предпочтительный способ, можно рассматривать другие способы, в которых пропущены некоторые из представленных стадий (например, можно пропускать фильтрацию или можно не добавлять хмель), или в которые можно добавлять дополнительные этапы, такие как добавление добавок, Сахаров, сиропов или карбоната.
На фиг. 10 проиллюстрировано, как идентифицировать фрагменты ДНК, получаемые из растений без LOX-1, в пиве (смесь, содержащая 50% без LOX-1) и в образцах сусла (тройной нуль-мутант) , получаемых с использованием сырья из растений без LOX-1, но не в пиве, получаемом с использованием муки из смеси нормального солода и ячменя дикого типа (Tuborg). Объем матрицы в завершающей амплификации ПЦР указан.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
В описании, фигурах и таблицах, которые представлены ниже, используется ряд терминов. Для предоставления описания и формулы изобретения, включая объем, в котором даны такие термины, предоставлены следующие определения.
Как применяют в настоящем документе, единственное число, в зависимости от контекста, в котором его используют, может означать один или несколько.
Термин "агрономический признак" описывает фенотипический или генетический признак растения, который вносит вклад в функциональность или экономическую ценность указанного растения. Такие признаки включают в себя устойчивость к заболеваниям, устойчивость к насекомым, устойчивость к вирусам, устойчивость к нематодам, засухоустойчивость, устойчивость к высокой степени засоленности, урожайность, высоту растения, число дней до созревания, профиль зерен (т.е. фракционирование зерен по размеру), содержание азота в зернах и т.п.
Термин "ячмень" по отношению к способу получения напитков на основе ячменя, таких как пиво, в частности, при использовании для описания способа соложения, означает зерна ячменя. Во всех других случаях, если не указано иначе, "ячмень" означает растение ячменя (Hordeum vulgare, L.), включая любые селекционную линию, или сорт, или разновидность, в то время как часть растения ячменя может быть любой частью растения ячменя, например, любой тканью или клетками.
В процессе "сбраживания ячменя", сусло получают посредством инкубации экстракта неосоложенного ячменя со смесью ферментов, которая гидролизует компоненты ячменя. Сусло,
получаемое посредством сбраживание ячменя, можно обозначать как "ячменное сусло" или сусло "из сброженного ячменя".
Под "устойчивостью к заболеваниям" подразумевают, что у растений отсутствуют признаки заболеваний, которые являются результатом взаимодействия с патогенами растений. Таким образом, предотвращается вызов патогенами заболеваний растений и ассоциированных с заболеваниями признаков. Альтернативно, признаки заболеваний, вызываемых патогенами, минимизированы или снижены или даже предотвращены.
Как применяют в настоящем документе, "DMSP" представляет собой аббревиатуру для предшественника DMS или потенциального DMS, т.е. для молекул, которые могут преобразовываться в DMS при получении напитков. Основную часть DMSP, если не весь, представляет собой SMM. Уровень DMSP определен в настоящем документе, как количество DMS, которое можно получить из DMSP в конкретном растительном материале или его продукте посредством кипячения в щелочных условиях в течение 1 часа. Как определено в настоящем документе, 1 млрд.д. DMSP может преобразовываться в 1 млрд.д. DMS.
Как применяют в настоящем документе термин "без двух LOX" относится к первой мутации, приводящей к полной потере функциональности L0X-1, и второй мутации, приводящей к полной потере функциональности L0X-2. Таким образом, "растение ячменя без двух LOX" представляет собой растение ячменя, несущее первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1, и вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2. Подобным образом "зерна без двух LOX" представляют собой зерна, несущие первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1, и вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2.
Термин "без двух LOX-без ММТ" относится к первой мутации, приводящей к полной потере функциональности L0X-1, и ко второй мутации, приводящей к полной потере функциональности L0X-2, и к третьей мутации, приводящей к полной потере функциональности ММТ. Таким образом, "растение ячменя без двух LOX-без ММТ" представляет собой растение ячменя, несущее первую мутацию,
приводящую к полной потере функциональности L0X-1, и вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2, и третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ. Подобным образом, "зерна без двух LOX-без ММТ зерна" представляют собой зерна, несущие первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1, и вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2, и третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ. Подходящий пример без двух LOX-без ММТ обозначен как "тройной нуль-мутант" и описан в примерах ниже в настоящем документе.
Как определено в настоящем документе, "зерновое" растение представляет собой представитель семейства растений Graminae, выращиваемых преимущественно из-за их содержащих крахмал семян или зерен. Зерновые растения в качестве неограничивающих примеров включают ячмень (Hordeum), пшеницу (Triticum) , рис
{Oryza), кукурузу {Zea), рожь {Secale), овес {Avena) , сорго
{Sorghum) и тритикале, гибрид ржи-пшеницы.
Под "кодированием" или "кодированным" в отношении конкретной нуклеиновой кислоты подразумевается содержание информации для трансляции в конкретный белок. Нуклеиновая кислота или полинуклеотид, кодирующие белок, может включать в себя нетранслируемые последовательности, например, интроны, в транслируемых областях нуклеиновой кислоты, или может быть лишены таких промежуточных нетранслируемых последовательностей
(например, в кДНК). Информация, посредством которой белок кодируется, определяется применением кодонов.
Как применяют в настоящем документе, "экспрессию" в отношении нуклеиновых кислот следует понимать как транскрипцию и накопление смысловой мРНК или антисмысловой РНК, происходящей из фрагмента нуклеиновой кислоты. "Экспрессия", используемая в отношении белков, относится к трансляции мРНК в полипептид.
Термин "ген" означает участок ДНК, вовлеченный в продукцию полипептидной цепи; он включает в себя области, предшествующую и следующую после кодирующей области (промотор и терминатор). Кроме того, гены растений, как правило, состоят из экзонов, прерывающихся интронами. После транскрипции в РНК интроны
удаляются путем сплайсинга с образованием зрелой матричной РНК (мРНК). "Участки сплайсинга" между экзонами и интронами, как правило, определяются консенсусными последовательностями, действующими в качестве сигналов сплайсинга для процесса сплайсинга, состоящего из делеции интрона из первичного РНК-транскрипта и соединения или слияния концов оставшейся РНК на каждой стороне вырезанного интрона. В некоторых случаях, альтернативные или различные варианты сплайсинга могут приводить к продукции с одного и того же участка ДНК различных белков. Природный ген можно обозначать как "эндогенный ген".
Как применяют в настоящем документе, "гетерологичная" по отношению к нуклеиновой кислоте представляет собой нуклеиновую кислоту, происходящую из другого вида, или, если из этого же вида, в значительной степени модифицированную относительно ее природной формы в композиции и/или геномном локусе посредством преднамеренного вмешательства человека.
Как применяют в настоящем документе термин "проращивание" означает начало или продолжение роста зерна ячменя в различных композициях, таких как нормальная почва, находящаяся в природе. Таким образом, прорастающий зародыш представляет собой зародыш, претерпевающий проращивание. Проращивание также может происходить в почве горшков, помещенных в вегетационные камеры и тому подобное, или может происходить, например, на влажной фильтровальной бумаге, помещенной в стандартные лабораторные чашки Петри, или во время соложения (например, в замочных танках или ящиках для проращивания на солодовом заводе). Как правило, подразумевают, что проращивание включает в себя гидратацию зерен, набухание зерен и рост зародыша. Факторы внешней среды, влияющие на проращивание, включают в себя влажность, температуру и концентрацию кислорода. Наблюдается развитие корня и побега.
Термин "зерно" определен как включающий в себя злаковую зерновку, также называемую внутренним семенем, нижнюю и верхнюю цветковую чешую. В большинстве разновидностей ячменя нижняя и верхняя цветковые чешуи прилегают к зерновке и являются частью зерна после молотьбы. Однако также существуют разновидности
голого ячменя. В них зерновка свободна от нижней и верхней цветковых чешуй и отмолачивается свободной, как пшеничная. Термины "зерно" и "семя" используют в настоящем документе взаимозаменяемо.
"Развитие зерен" относится к периоду, начиная от оплодотворения яйцеклетки клеткой пыльцы. При оплодотворении метаболические запасы, например, сахара, олигосахариды, крахмал, фенольные полимеры, аминокислоты и белки откладываются, с направлением в вакуоли и без него, в различных тканях зерна (семени), например, в эндосперме, семенной оболочке, алейроне и щитке, таким образом, приводя к увеличению зерна (семени) , наполнению зерна (семени) и заканчивая усыханием зерна (семени).
Термин "полная потеря функциональности ..." относится к
отсутствию данной ферментативной активности. Таким образом,
растение ячменя с "полной потерей функциональности L0X-1 и LOX-
2" представляет собой растение ячменя с отсутствием
детектируемой активности L0X-1 и L0X-2. В контексте настоящего
изобретения активность L0X-1 и L0X-2 определяют посредством
процедуры анализа, определяющей формирование 9-HP0DE и 13-HP0DE
из линолевой кислоты, даже несмотря на то, что ферменты L0X-1 и
L0X-2 имеют другую активность. Формирование 9-HP0DE и 13-HP0DE
из линолевой кислоты предпочтительно определяют, как описано в
примере 4 международного патента PCT/DK2009/050355. Активность
следует определять с использованием белковых экстрактов
проросших зародышей. В контексте настоящего изобретения
образование пика на хроматограмме при использовании анализа,
описанного в примере 4 международного патента
PCT/DK2009/050355, соответствующего менее чем 5%,
предпочтительно менее чем 3% пика 9-HP0DE стандарта, представленного на фиг. 5А международного патента PCT/DK2009/050355, и/или пика, соответствующего менее чем 5%, предпочтительно менее чем 3% пика 13-HP0DE стандарта, представленного на фиг. 5А международного патента PCT/DK2009/050355, при использовании линолевой кислоты в качестве субстрата, рассматривают как отсутствие детектируемой
активности LOX-1 и LOX-2. Молекулярные подходы для получения полной потери функциональности LOX включают получение мутаций, которые вызывают полное отсутствие транскриптов указанного фермента, полное отсутствие соответствующего кодируемого фермента, или мутаций, которые полностью инактивируют кодируемый фермент. Подобным образом, растение ячменя с "полной потерей функциональности ММТ" относится к отсутствию ферментативной активности ММТ, т.е. к растению ячменя без детектируемой активности ММТ при использовании анализа, описанного в примере 2 ниже в настоящем документе. Альтернативно, активность ММТ растения ячменя определяют посредством выделения кДНК ММТ из указанного ячменя и определения способности белка, кодируемого указанной кДНК катализировать перенос метильной группы с SAM на Met, таким образом, формируя SMM.
Термин "активность L0X-1" относится к ферментативной активности фермента L0X-1 ячменя. В частности, в контексте настоящего изобретения "активность L0X-1" представляет собой катализируемую ферментом диоксигенацию линолевой кислоты до 9-HPODE и в значительно меньшей степени до 13-HP0DE. Даже несмотря на то, что фермент L0X-1 способен катализировать другие реакции, с целью определения активности L0X-1 по настоящему изобретению следует рассматривать только активность формирования 9- и 13-HP0DE. На фиг. 1А приведен биохимический путь, где линолевая кислота преобразуется в 9-HP0DE.
Термин "активность L0X-2" относится к ферментативной активности фермента L0X-2 ячменя. В частности, в контексте настоящего изобретения "активность L0X-2" представляет собой катализируемую ферментом диоксигенацию линолевой кислоты до 13-HPODE и в значительно меньшей степени до 9-HP0DE. Даже несмотря на то, что фермент L0X-2 способен катализировать другие реакции, с целью определения активности L0X-2 по настоящему изобретению следует рассматривать только активность формирования 13- и 9-HP0DE. На фиг. 1А приведен биохимический путь, где линолевая кислота преобразуется в 13-HP0DE.
Термин "солодовый напиток" относится к напиткам,
полученным с использованием солода, необязательно в смеси с другими ингредиентами, например, с использованием смесей осоложенного и несоложенного ячменя, предпочтительно, к напиткам, полученным способом, включающим в себя инкубацию солода с горячей водой. Солодовый напиток может, например, представлять собой виды пива или виды безалкогольных напитков на основе солода, типа мальтина.
Термин "солодовый напиток" и термин "напиток на основе солода" относятся к напиткам, получаемым с использованием солода, предпочтительно к напиткам, получаемым способом, включающим этап инкубации солода с горячей водой. Термины в настоящем документе используют взаимозаменяемо. Солодовые напитки могут представлять собой, например, пиво или мальтин. Пиво по настоящей заявке также можно получать с использованием "сбраживания ячменя" (см. указанное выше определение).
Термин "ферментированный солодовый напиток" относится к солодовым напиткам, которые были ферментированы, например, инкубированы с дрожжами.
"Соложение" представляет собой особую форму проращивания зерен ячменя, имеющую место в контролируемых условиях окружающей среды, включающих в качестве неограничивающих примеров замочные танки и ящики для проращивания солодового завода. В соответствии со способом по настоящему изобретению, соложение начинает происходить во время и/или после замачивания зерен ячменя. Процесс соложения можно останавливать путем сушки зерен ячменя, например, в процессе печной сушки. Печную сушку, как правило, проводят при повышенных температурах, но преимущество настоящего изобретения состоит в том, что печную сушку можно проводить при более низких температурах. В случае, когда солод не высушивают в печах, его обозначают как "зеленый солод". Подразумевают, что композиция солода, полученная из ячменя без двух LOX-без ММТ, содержит солод без двух LOX-без ММТ, например, чистый солод без двух LOX-без ММТ или любую смесь солодов, содержащую солод без двух LOX-без ММТ. Предпочтительно, указанную композицию получают только из солода без двух LOX-без ММТ. Солод можно обрабатывать, например, путем
помола, в случае чего его также можно обозначать как "молотый солод" или "мука".
"Заваривание" представляет собой инкубацию молотого солода в воде. Заваривание предпочтительно проводят при конкретной температуре и в конкретном объеме воды. Температура и объем воды являются важными параметрами, поскольку они влияют на скорость снижения ферментативной активности, происходящей из солода, и, таким образом, в особенности, на интенсивность гидролиза крахмала, который может происходить; также важным является действие протеаз. Заваривание может происходить в присутствии добавок, которые, как подразумевается, содержат любой источник углеводов, отличный от солода, в качестве неограничивающих примеров такой как ячмень (включая, например, ячмень без двух LOX-без ММТ), ячменные сиропы или кукурузу или рис, в виде целых зерен или обработанных продуктов, таких как крупа, сиропы или крахмал. Все указанные выше добавки можно использовать преимущественно в качестве дополнительного источника экстракта (сиропы, как правило, дозируют во время нагревания сусла). Требования к обработке добавки в пивоварении зависят от состояния и типа используемой добавки и, в частности, от температуры желатинирования или плавления крахмала. Если температура желатинирования выше нормальной температуры засахаривания солода, тогда крахмал желатинируют и расплавляют до добавления в сусло.
Термин "активность ММТ" относится к ферментативной активности фермента метионин-Б-метилтрансферазы ячменя. В контексте настоящего изобретения "активность ММТ" представляет собой катализируемое ММТ метилирование атома серы Met с получением SMM. Даже несмотря на то, что фермент ММТ может катализировать другие реакции, с целью определения активности ММТ по настоящему изобретению следует рассматривать только активность формирования SMM. На фиг. 1В приведены биохимические реакции, в которых Met преобразуется в SMM путем метилирования.
"Мутации" включают делеции, вставки, замены, трансверсии и точечные мутации в кодирующих и некодирующих областях гена. Делеции могут представлять собой делеции целого гена или только
части гена, где некодирующая область предпочтительно, представляет собой промоторную область, область терминатора, или интроны. Точечные мутации могут затрагивать изменения одного основания или одной пары оснований и могут приводить к образованию стоп-кодонов, мутаций со сдвигом рамки считывания или к заменам аминокислот. Со ссылкой на фиг. 8 настоящего документа, в которой приведен обзор того, как зерна мутантного ячменя могут размножаться по программе селекции, зерна поколения МЗ и непосредственно размноженные из них зерна, или зерна любого из последующих поколений, включая полученные из них растения, могут обозначаться как "исходные мутанты". Далее, также со ссылкой на фиг. 8 настоящего документа, термин "селекционная линия" относится к зернам поколения М4 и любого последующего поколения, включая полученные из них растения, которые могут быть результатом скрещивания с сортовым растением или результатом скрещивания с другой селекционной линией с конкретным отдельным признаком.
Термин "без LOX" относится к наличию мутации в кодирующем LOX гене, вызывающий полную потерю функции кодируемого фермента LOX (L0X-1 или L0X-2 или и L0X-1, и L0X-2). Мутации, приводящие к образованию кодонов преждевременной терминации (нонсенс-кодонов) в гене, кодирующем LOX, представляют собой только один из механизмов, посредством которого можно обеспечивать полную потерю функциональности LOX. Молекулярные подходы для обеспечения полной потери функциональности LOX включают получение мутаций, вызывающих полное отсутствие транскриптов указанного фермента, или мутации вызывающие полную инактивацию кодируемого фермента. "Без LOX" по отношению к растению относится к растению, несущему мутацию, приводящую к полной потере функциональности фермента LOX.
Как применяют в настоящем документе, термин "без ММТ" относится к полной потере функциональности фермента S-аденозилметионин:метионин-Б-метилтрансферазы (также обозначаемого как фермент метионин-Б-метилтрансфераза). Таким образом, "растение ячменя без ММТ" представляет собой растение ячменя, несущее мутацию в гене, кодирующем ММТ, которая
приводит к полной потере функциональности ММТ. Сходным образом, "зерна без ММТ" являются зернами, несущими мутацию в гене, кодирующем ММТ, что приводит к полной потере функциональности ММТ.
"Функционально связанный" представляет собой термин,
используемый для обозначения ассоциации двух или более
фрагментов нуклеиновых кислот в одном полинуклеотиде так, что
функционирование одного зависит от другого. Например, промотор
функционально связан с кодирующей последовательностью, когда он
способен влиять на экспрессию этой кодирующей
последовательности, т.е. эта кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора. Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.
"ПНР" или "полимеразная цепная реакция" хорошо известна специалистам в данной области как способ, используемый для амплификации конкретных участков ДНК (патенты США №№ 4683195 и 4800159 Mullis, К.В. et al.).
"Растение" или "растительный материал" включает растительные клетки, протопласты растений и тканевые культуры растительных клеток, из которых можно регенерировать растения ячменя, включая каллюсы растений и растительные клетки, которые являются интактными в растениях, или части растений, такие как зародыши, пыльцу, семязачатки, цветы, зерна, листья, корни, корневые кончики, пыльники или любая часть или продукт растения. Растительный материал в одном из вариантов осуществления может представлять собой растительные клетки, из которых растения ячменя регенерировать нельзя.
Под термином "растительный продукт" подразумевают продукт, получаемый в результате обработки растения или растительного материала. Таким образом, указанный растительный продукт может представлять собой, например, солод, сусло, ферментированный или неферментированный напиток, пищу или пищевой продукт.
Как применяют в настоящем документе, "рекомбинантный" по отношению к белку представляет собой белок, происходящий из
чужеродного вида, или, если из того же вида, является в значительной степени модифицированной формой относительно его природной формы в композиции посредством преднамеренного вмешательства человека.
"Комиссия дегустаторов пива" в рамках значения настоящей заявки представляет собой комиссию специалистов, интенсивно тренированных в определении вкуса и описании вкусов пива, с особым вниманием к альдегидам, вкусу картона, затхлому вкусу, сложным эфирам, высшим спиртам, жирным кислотам, компонентам, содержащим серу. Хотя для оценки компонентов вкуса имеется набор аналитических инструментов, относительную значимость активных в отношении вкуса компонентов трудно оценить аналитически. Однако такие сложные свойства могут оценивать дегустаторы. Их длительные тренировки включают в себя оценку вкуса и оценку стандартных образцов пива.
Под термином "участок сплайсинга" подразумевают границы между экзонами и интронами в гене. Таким образом, участок сплайсинга может представлять собой границу перехода экзона в интрон (называемую "донорный участок") или границу отделения интрона от экзона (называемую "акцепторный" участок). Участок сплайсинга в растениях, как правило, содержит консенсусные последовательности. 5'-конец интрона, в основном, состоит из консервативного динуклеотида GT (GU в мРНК), а 3'-конец интрона обычно состоит из консервативного динуклеотида AG. Таким образом, 5'-участок сплайсинга интрона, содержит 5'-конец интрона, а 3'-участок сплайсинга содержит 3'-конец интрона. Предпочтительно, в контексте настоящего изобретения участок сплайсинга интрона представляет собой 5'-участок сплайсинга, состоящий из наиболее 5'-концевого динуклеотида интрона
(который, в основном, представляет собой GT) , или 3'-участок сплайсинга, состоящий из наиболее 3'-концевого динуклеотида интрона (который, в основном, представляет собой AG).
Если не указано иначе, "T2N" означает транс-2-ноненаль
(T2N) в свободной форме. T2N иногда также обозначают как 2-Е-ноненаль.
Под термином "потенциал T2N" описаны химические вещества,
которые способны высвобождать T2N или преобразовываться в T2N в одной или нескольких реакциях. В контексте настоящего изобретения потенциал T2N определяют как концентрацию T2N, высвобождаемого в раствор, например, сусло или пиво, при инкубации в течение 2 часов при 100°С, рН 4,0. Практически, определяют начальную концентрацию T2N, после чего этот раствор инкубируют в течение 2 часов при 100°С, рН 4,0, с последующим определением концентрации T2N. Различие между начальной и конечной концентрацией T2N называют потенциалом T2N. Тепловая, кислотная обработка вызывает высвобождение T2N из потенциала T2N, например, из "аддуктов T2N", где последний термин используют для описания T2N, конъюгированного с одним или несколькими веществами, в качестве неограничивающих примеров белок(и), сульфит, клеточный дебрис, клеточные стенки или т.п. В основном аддукты T2N сами по себе не воспринимаются людьми в качестве неприятных привкусов. Однако T2N, высвобождаемый из указанных аддуктов T2N, может приводить к появлению неприятного привкуса.
"Тканевая культура" обозначает композицию, содержащую выделенные клетки одного и того же или разных типов, или коллекцию таких клеток, организованных в части растения, включая, например, протопласты, каллюсы, зародыши, пыльцу, пыльники и т.п.
Как применяют в настоящем документе, "трансгенная" включает указание на клетку, модифицированную введением гетерологичной нуклеиновой кислоты, или на клетку, которая получена из модифицированной таким образом клетки. Таким образом, например, трансгенные клетки экспрессируют гены, которые не обнаруживаются в идентичной форме в природной форме клетки, или экспрессируют природные гены, которые в противном случае экспрессируются аномально, недостаточно экспрессируются или вообще не экспрессируются, в результате преднамеренного вмешательства человека. Как применяют в настоящем документе термин "трансгенные" по отношению к растениям, в частности растениям ячменя, не включает изменение клетки способами
традиционной селекции растений, например, посредством мутагенеза на основе ЫаЫз или в результате происходящих в природе событий без преднамеренного вмешательства человека.
"Дикий ячмень", Hordeum vulgare подвида spontaneum, рассматривают в качестве прародителя современных культивируемых форм ячменя. Полагают, что преобразование ячменя из дикого в культивируемое состояние соответствует окультуриванию этого растения в "местные сорта ячменя". Они являются генетически более близкородственными с современными сортами, чем с диким ячменем.
Термин ячмень "дикого типа" относится к традиционно получаемому растению ячменя. Предпочтительно, термин относится к растениям ячменя, из которых происходят растения ячменя по настоящему изобретению, т.е. к родительским растениям. Как правило, зерна ячменя дикого типа доступны, например, в производящих семена сельскохозяйственных хозяйств в виде "сортов" или "разновидностей", т.е. генетически сходных зерен, которые находятся в списке национальных организаций по селекции растений. Несмотря на доступность нескольких сортов ячменя без L0X-1 (например, сортов Chamonix и Charmay), с целью лучшего понимания настоящего изобретения, все растения без L0X-1, без L0X-2 и без двух LOX-без ММ в настоящем документе считают мутантными растениями, а не растениями дикого типа. Обозначения "сорт" и "разновидность" используют в настоящем документе взаимозаменяемо.
Под термином "сусло" подразумевают жидкий экстракт солода, такого как молотый солод, или зеленый солод, или молотый зеленый солод. При сбраживании ячменя сусло также можно получать посредством инкубации экстракта неосоложенного ячменя со смесью ферментов, которая гидролизует компоненты ячменя. Кроме указанных полученных из солода или ячменя экстрактов, жидкий экстракт можно получать из солода и дополнительных компонентов, таких как дополнительный крахмалсодержащий материал, частично преобразованный в ферментируемые сахара. Сусло в основном получают посредством заваривания, необязательно с последующим "промыванием пивной дробины" в
процессе экстракции остаточных Сахаров и других соединений из пивной дробины после заваривания горячей водой. Промывание пивной дробины, как правило, проводят в фильтрационном чане, заторном фильтре или другом устройстве, обеспечивающем разделение экстрагируемой воды от пивной дробины. Сусло, получаемое после заваривания, как правило, обозначают как "первое сусло", тогда как сусло, получаемое после промывания пивной дробины, обычно обозначают как "второе сусло". Если не указано, термин "сусло" может представлять собой первое сусло, второе сусло или комбинацию обоих. При общепринятом получении пива сусло варят вместе с хмелем, однако настоящее изобретение относится к способам уменьшения варки или устранению варки сусла. Таким образом, сусло без хмеля, также можно обозначать как "сладкое сусло", тогда как сусло, которое варили/нагревали с хмелем можно обозначать как "вареное сусло".
Способы получения напитка на основе ячменя
Настоящее изобретение относится к способам получения напитка на основе ячменя с низкими уровнями веществ с неприятным привкусом и их предшественников, где способы включают сниженное потребление энергии. Вещества с неприятным привкусом являются такими, как описано ниже в настоящем документе, но предпочтительно вещества с неприятным привкусом представляют собой T2N и DMS. Способы включают использование растения ячменя, которое предпочтительно представляет собой растение ячменя без двух LOX-без ММТ. Такие растения ячменя более подробно описаны ниже в настоящем документе.
По настоящему изобретению способ в основном включает этап соложения, указанного растения ячменя без двух LOX-без ММТ, хотя в некоторых вариантах осуществления изобретения напиток на основе ячменя получают с использованием неосоложенного ячменя. Соложение более подробно описано в разделе "Соложение" ниже в настоящем документе.
Кроме того, способ включает этап получения сусла посредством заваривания ячменя без двух LOX-без ММТ или солода без двух LOX-без ММТ или их смеси, необязательно в присутствии дополнительных добавок. Заваривание более подробно описано в
разделе "Заваривание" ниже в настоящем документе.
Способ также включает этап нагревания указанного сусла, необязательно в присутствии дополнительного ингредиента(ов), где выпаривается самое большое 4%, например, самое большое 2% от объема сусла, таким образом, получая нагретое сусло. Этот этап более подробно описан в настоящем документе в разделе "Нагретое сусло".
Наконец способ включает переработку нагретого сусла в напиток. Эта часть способа более подробно описана в разделе "Получение напитков" ниже в настоящем документе.
Соложение
Под термином "соложение" следует понимать проращивание замоченных зерен ячменя в процессе, проводимом в условиях контролируемого окружения, например, как проиллюстрировано этапами 2 и 3 на фиг. 9, с последующим этапом сушки. Указанный этап сушки предпочтительно может представлять собой печную сушку проросших зерен при повышенных температурах.
Перед сушкой, замоченные и проросшие зерна ячменя обозначают как "зеленый солод", который также может представлять собой растительный продукт по настоящему изобретению. Эти события указанной выше последовательности соложения являются важными для синтеза многочисленных ферментов, которые вызывают модификацию зерен, процессы, которой в первую очередь деполимеризуют клеточные стенки погибшего эндосперма с мобилизацией питательных веществ зерен и активируют другие деполимеразы. В последующем процессе сушки, получают вкус и цвет вследствие химических реакций оксидирования.
Соложение представляет собой высокоэнергоемкий процесс. Вследствие необходимости высоких температур в частности печная сушка также является энергоемким процессом. Существует несколько задач печной сушки, в частности включающих: (i) сушку проросших зерен ячменя; (ii) остановку проращивания; (iii) денатурацию липоксигеназ для снижения уровней T2N и потенциала T2N и (iv) получение DMS из предшественников и удаление DMS для снижения уровней потенциала DMS и DMS.
По настоящему изобретению печную сушку можно проводить при низкой температуре и все еще выполнять указанные выше задачи. При применении растения ячменя с потерей функциональности L0X-1 и L0X-2 отсутствует необходимость в денатурации липоксигеназы. При применении растения ячменя с потерей функциональности ММТ отсутствует необходимость в снижении уровней DMS и потенциала DMS, так как указанные уровни в таких растениях ячменя являются минимальными. Таким образом, зерна ячменя можно сушить и проращивание можно останавливать даже при низких температурах.
Таким образом, соложение по настоящему изобретению предпочтительно включает этапы:
(a) замачивания ячменя без двух LOX-без ММТ;
(b) проращивания указанного ячменя; и
(c) сушки, предпочтительно посредством печной сушки,
указанного ячменя.
Замачивание можно проводить любым общепринятым способом, известным специалисту. Один неограничивающий пример включает замачивание при температуре в диапазоне от 10 до 2 5°С с изменением сухих и влажных условий. Например, при замачивании ячмень можно инкубировать во влажных условиях в течение периода в диапазоне от 3 0 мин до 3 часов с последующей инкубацией в сухих условиях в течение периода в диапазоне от 3 0 мин до 3 часов и необязательно с повторением указанной схемы инкубации в диапазоне от 2 до 5 раз. Конечное содержание воды после замачивание, может находиться, например, в диапазоне от 40 до 50%.
Проращивание можно проводить любым общепринятым способом, известным специалисту. Один неограничивающий пример включает проращивание при температуре в диапазоне 10 до 25°С, необязательно с изменением температуры в диапазоне от 1 до 4 часов.
Неограничивающий пример подходящей схемы замачивания и проращивания приведен в примере 9 ниже в настоящем документе.
Печную сушку можно проводить при общепринятых температурах, таких как по меньшей мере 75°С, например, в
диапазоне от 80 до 90°С, таком как в диапазоне от 80 до 85°С. Таким образом, солод можно получать, например, любыми способами, описанными в Briggs et al. (1981) и в Hough et al. (1982) . Однако также по настоящему изобретению можно использовать любой другой подходящий способ получения солода, такой как способы получения специализированных солодов, включая в качестве неограничивающих примеров, способы жарки солода. Неограничивающие примеры описаны в примерах б, и 8, и 9.
Однако предпочтительно проводить указанную печную сушку при низкой температуре, более предпочтительно при температуре ниже 80°С, еще более предпочтительно при температуре ниже 75°С, так как при температуре ниже 7 0°С, например, при температуре ниже 65°С, так как при температуре ниже 60°С, например, при температуре ниже 55°С, так как при температуре ниже 50 °С, например, при температуре ниже 4 5°С, так как при температуре ниже 41°С. Таким образом, предпочтительно, чтобы температура не превышала приблизительно 8 0°С, предпочтительно не превышала приблизительно 7 5°С в любой момент в течение печной сушки.
Для успешной сушки проросших зерен ячменя, если указанную сушку проводят при низкой температуре, продолжительность печной сушки можно увеличивать. Предпочтительно печную сушку проводят в течение периода времени, достаточного для уменьшения содержания воды в проросших зернах до менее чем 10%, предпочтительно до менее чем 8%, более предпочтительно до менее чем б%. Таким образом, при общепринятой печной сушке с температурой 8 5°С продолжительность печной сушки может находиться в диапазоне от 1 до 3 часов, тогда как печная сушка при температуре в диапазоне от 7 0 до 8 0°С может потребовать продолжительности печной сушки в диапазоне от 1 до 10 часов; печная сушка при температуре в диапазоне от 50 до 7 0°С может потребовать продолжительности печной сушки в диапазоне от 3 до 50 часов, тогда как печная сушка при температуре ниже 50°С,
например, в диапазоне от 40 до 50°С, может потребовать продолжительности печной сушки более 4 0 часов, так как в
диапазоне от 40 до 60 часов, например, в диапазоне от 45 до 52 часов, например, 48 часов.
В одном из аспектов изобретение также относится к композиции солода, получаемой из зерен ячменя без двух LOX-без ММТ посредством соложения, предпочтительно посредством соложения, как описано в настоящем документе непосредственно ниже.
Указанные композиции солода содержат низкие уровни T2N и потенциала T2N даже при получении при низких температурах печной сушки, как описано выше. В частности указанные композиции солода содержат низкие уровни потенциала T2N (и предшественников T2N).
Описано, что активность LOX в зернах ячменя можно снижать посредством процесса замачивания, где ячмень можно подвергать обработке высокими температурами и/или молочной кислотой. Однако такие процессы замачивания также являются энергоемкими. Кроме того, такая обработка может оказывать неблагоприятные воздействия, такие как снижение желательной ферментативной активности, например, фитазной активности. Кроме того, такая обработка снижает активность LOX только с той точки, когда проводят тепловую обработку и, таким образом, без воздействия на предыдущее накопление продуктов, получаемых вследствие активности LOX.
В одном из вариантов осуществления изобретения растительные продукты получают способом, где зерна ячменя не подвергают замачиванию при температуре по меньшей мере 7 0°С. Также предпочтительно, чтобы растительные продукты по изобретению получали способом, где зерна ячменя не подвергают
замачиванию при температуре по меньшей мере 57°С в присутствии молочной кислоты.
Предпочтительно, чтобы указанные композиции солода содержали менее 60%, предпочтительно менее 50%, более предпочтительно менее 4 0%, даже более предпочтительно менее 3 0%, например, менее 2 0% T2N по сравнению с композицией солода, получаемой таким же образом из ячменя дикого типа,
предпочтительно из сорта Power, или из сорта Quench, или из сорта Rosalina.
Кроме того, предпочтительно, чтобы указанные композиции солода, даже когда их подвергают печной сушке при температуре в диапазоне от 7 0 до 8 0°С, содержали менее 60%, предпочтительно менее 50%, более предпочтительно менее 40%, даже более предпочтительно менее 30%, более предпочтительно менее 20% T2N по сравнению с композицией солода, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или из сорта Quench, или из сорта Rosalina.
Кроме того, предпочтительно, чтобы указанные композиции солода, даже когда их подвергают печной сушке при температуре в диапазоне от 50 до 70°С, содержали менее 60%, предпочтительно менее 50%, более предпочтительно менее 40%, даже более предпочтительно менее 30%, более предпочтительно менее 20% T2N по сравнению с композицией солода, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или из сорта Quench, или из сорта Rosalina.
Кроме того, предпочтительно, чтобы указанные композиции солода, даже когда их подвергают печной сушке при температуре в диапазоне от 40 до 50°С, содержали менее 60%, предпочтительно менее 50%, более предпочтительно менее 40%, даже более предпочтительно менее 30%, более предпочтительно менее 20% T2N по сравнению с композицией солода, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или сорта Quench, или из сорта Rosalina.
В дополнение к низким уровням T2N и потенциалу T2N солод по изобретению также содержит низкие уровни DMS и предшественников DMS, даже когда его выпаривают при низких температурах печной сушки, описанных выше.
Представляет интерес, что DMS представляет собой в значительной степени легкоиспаряющееся соединение с точкой кипения 37°С-38°С (Imashuku, выше) и при получении солода, например, при печной сушке, композицию, как правило, подвергают нагреванию так, что значительные количества DMS выпариваются.
Однако при охлаждении нормальной композиции солода могут
образовываться дополнительные количества DMS из
предшественников DMS (DMSP). Одним из основных преимуществ настоящего изобретения является то, что в композиции солода не образуются или образуются очень небольшие количества DMSP (в частности SMM).
Способы снижения концентрации DMS в солоде описаны. Многие из этих способов основаны на высокоэнергоемкой тепловой обработке солода. Указанная тепловая обработка может представлять собой простое нагревание солода, например, при печной сушке, или может включать в себя удаление летучих соединений и/или удаление свободных DMS посредством применения пара. Таким образом, обработка солода паром может снижать уровни свободных DMS в солоде, но она снова представляет собой процесс с высоким энергопотреблением. Кроме того, эти способы в основном снижают уровень свободного DMS в солоде, причем с очень небольшим воздействием на уровень SMM. В одном из вариантов осуществления изобретения композиции солода по изобретению подвергали только очень ограниченной обработке, включающей удаление летучих соединений и удаление свободных DMS паром, или, альтернативно, не подвергали обработке, включающей удаление летучих соединений и удаление свободных DMS с использованием пара при печной сушке.
В одном из вариантов осуществления изобретения предпочтительно, чтобы солод по изобретению не обрабатывали броматом, таким как бромат калия или бромат кальция.
Композиции солода по изобретению предпочтительно содержат самое большое 3, предпочтительно самое большое 2, более предпочтительно самое большое 1, даже более предпочтительно самое большое 0,5, например, самое большое 0,2 мкг/г свободных DMS. Кроме того, предпочтительно, чтобы композиции солода по изобретению предпочтительно содержали самое большое 2, предпочтительно самое большое 1, более предпочтительно самое большое 0,5 мкг/г, даже более предпочтительно самое большое 0,2 мкг/г DMSP. Концентрация DMSP, которые предпочтительно могут представлять собой SMM, в данном разделе и в любом другом
разделе настоящего документа указана как концентрация DMS, которые могут высвобождаться из указанных DMSP.
Кроме того, предпочтительно, чтобы указанные композиции солода, даже когда их подвергают печной сушке при температуре в диапазоне от 7 0 до 8 0°С, содержали самое большое 2, предпочтительно самое большое 1, более предпочтительно самое большое 0,5 мкг/г, даже более предпочтительно самое большое 0,2 мкг/г DMSP (предпочтительно SMM).
Кроме того, предпочтительно, чтобы указанные композиции солода, даже когда их подвергают печной сушке при температуре в диапазоне от 50 до 7 0°С, содержали самое большое 2, предпочтительно самое большое 1, более предпочтительно самое большое 0,5 мкг/г, даже более предпочтительно самое большое 0,2 мкг/г DMSP (предпочтительно SMM).
Кроме того, предпочтительно, чтобы указанные композиции солода, даже когда их подвергают печной сушке при температуре в диапазоне от 4 0 до 50°С, содержали самое большое 2, предпочтительно самое большое 1, более предпочтительно самое большое 0,5 мкг/г, даже более предпочтительно самое большое 0,2 мкг/г DMSP (предпочтительно SMM).
В другом аспекте изобретение относится к композициям зеленого солода, содержащим самое большое 5000, более предпочтительно самое большое 2500, еще более предпочтительно самое большое 1000, даже более предпочтительно самое большое 500, еще более предпочтительно самое большое 250, например, самое большое 150 млрд.д. DMSP. Также предпочтительно, чтобы указанные композиции зеленого солода содержали самое большое 200, предпочтительно самое большое 150, более предпочтительно самое большое 100, даже более предпочтительно самое большое 50, например, самое большое 2 5 млрд.д. свободных DMS.
Хотя первичным применением солода является применение для получения напитков, его также используют в других производственных процессах, например, в качестве источника ферментов в хлебопекарной промышленности или в пищевой промышленности в качестве ароматизатора и красителя, например,
в форме солода или солодовой муки или косвенно в виде солодового сиропа и т.д. Таким образом, растительный продукт по изобретению может представлять собой любой из указанных выше продуктов.
В другом аспекте растительные продукты по изобретению содержат или даже состоят из сиропа, такого как ячменный сироп или сироп из ячменного солода. Растительный продукт также может представлять собой экстракт ячменя или солода.
Солод можно обрабатывать дополнительно, например, посредством помола. Таким образом, растительный продукт по изобретению может представлять собой солод любого типа, такой как необработанный солод или молотый солод, такой как мука. Молотый солод и его мука содержат химические компоненты солода и погибшие клетки, у которых отсутствует способность к проращиванию.
Предпочтительно помол проводят в сухом состоянии, т.е. солод молят сухим. Таким образом, предпочтительно, чтобы солод не мололи во влажном состоянии.
Заваривание
Способ по изобретению включает этап получения сусла посредством заваривания ячменя и/или солода без двух LOX-без ММТ и необязательно дополнительных добавок. Также указанный этап заваривания необязательно может включать промывание пивной дробины, и, таким образом, указанный этап заваривания может представлять собой этап заваривания, включающий этап промывания пивной дробины, или этап заваривания без этапа промывания пивной дробины.
В основном получение сусла начинают помолом солода без двух LOX-без ММТ и/или ячменя без двух LOX-без ММТ. Если добавляют дополнительные добавки, их также можно молоть в зависимости от их природы. Если добавка представляет собой зерновое растение, его можно, например, молоть, тогда как сиропы, сахара и т.п., как правило, не перемалывают. Перемалывание облегчается доступом воды к частицам зерен на этапе заваривания. При заваривании можно продолжать ферментативную деполимеризацию субстратов, инициированную при
соложении.
На фиг. 9, этапы 4-6 иллюстрируют общий способ получения сусла из солода. В основном сусло получают, комбинируя и инкубируя молотый солод и воду, т.е. в процессе заваривания. При заваривании солод/жидкую композицию можно дополнять дополнительными углеводсодержащими добавочными композициями, например, добавками из молотого ячменя, кукурузы или риса. Добавки из неосоложенных зерновых растений, как правило, содержат небольшое количество или не содержат активных ферментов, делая их важными для дополнения солодом или экзогенными ферментами для обеспечения ферментами, необходимыми для деполимеризации полисахаридов и т.д.
При заваривании, молотый солод без двух LOX-без ММТ и/или молотый ячмень без двух LOX-без ММТ и необязательно дополнительные добавки инкубируют с жидкой фракцией, такой как вода. Температура инкубации в основном или оставляют постоянной
(изотермическое заваривание), или постепенно повышают, например, последовательно повышают. В любом случае, в указанную жидкую фракцию высвобождаются растворимые вещества в солоде/ячмене/добавках. Последующая фильтрация обеспечивает разделение сусла и остаточных твердых частиц, где последние также называют "пивная дробина". Полученное таким образом сусло также можно обозначить как "первое сусло". В процессе, также обозначаемом как промывание пивной дробины, в пивную дробину можно добавлять дополнительную жидкость, такую как вода. После промывания пивной дробины и фильтрации можно получать "второе сусло". Дополнительное сусло можно получать, повторяя процедуру. Неограничивающие примеры подходящих способов получения сусла описаны в Briggs et al. (выше) и Hough et al.
(выше).
Описано, что активность LOX можно снижать тепловой обработкой ферментов, и что уровни DMS можно снижать тепловой обработкой. Также описано, что для снижения активности LOX и снижения уровней DMS сусло можно подвергать тепловой обработке и/или что для выполнения тех же задач можно проводить заваривание при высоких температурах. Однако тепловая обработка
может оказывать неблагоприятные воздействия, такие как снижение другой ферментативной активности, а тепловая обработка, кроме того, является энергоемкой. Кроме того, тепловая обработка снижает только липоксигеназную активность и уровни DMS с того момента, когда применили тепловую обработку, и, таким образом, она не влияет на предыдущее накопление образуемых вследствие активности LOX продуктов и предшественников DMS.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения сусло получают способом, где исходная температура заваривания не превосходит 7 0°С, предпочтительно не превосходит 69°С, таким образом, например, исходная температура заваривания может находиться в диапазоне от 30°С до 69°С, так как в диапазоне от 35°С до 69°С, например, в диапазоне от 35°С до 65°С, так как в диапазоне от 35°С до 55°, например, в диапазоне от 35°С до 45°С, например, приблизительно 4 0°С. Также предпочтительно, чтобы сусло по изобретению не подвергали воздействию температур 7 0°С или выше в течение более 2 5 мин, предпочтительно в течение не более 2 0 мин, и чтобы сусло не подвергали воздействию температур 7 8°С или выше в течение более 2 0 мин, предпочтительно в течение не более 15 мин, более предпочтительно в течение не более 10 мин в течение заваривания. Если температуры заваривания являются слишком высокими, это свойство будет воздействовать на ферментативную активность в сусле и может снизить или даже ликвидировать желательную ферментативную активность, что в результате приведет к изменению качества сусла. Кроме того, предпочтительно, чтобы сусло по изобретению не подвергали воздействию температур 65°С или выше в течение более 100 мин, предпочтительно в течение не более 90 мин, более предпочтительно в течение не более 8 0 мин, еще более предпочтительно в течение не более 7 0 мин в течение заваривания.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения температура при заваривании не превосходит 8 0°С,
предпочтительно не превосходит 7 8°С.
Один из неограничивающих примеров подходящего заваривания представляет собой:
(1) заваривание при температуре в диапазоне 35-45°С, такой как приблизительно 40°С, в диапазоне от 10 до 30 мин, например, приблизительно 2 0 мин;
(2) нагревание до температуры в диапазоне от 60 до 7 0°С, предпочтительно в диапазоне от 60 до 65°С, например, приблизительно 65°С, в диапазоне от 30 до 90 мин, предпочтительно в диапазоне от 45 до 75 мин, например, приблизительно 60 мин;
(3) нагревание до температуры в диапазоне от 7 0 до 8 0°С, предпочтительно в диапазоне от 75 до 78°С, например, приблизительно 78°С, в диапазоне от 5 до 15 мин, например, приблизительно 10 мин.
Другой неограничивающий пример подходящего заваривания представляет собой:
(4) заваривание при температуре в диапазоне 55-65°С, например, приблизительно 60°С, в диапазоне от 10 до 30 мин, например, приблизительно 2 0 мин;
(5) нагревание до температуры в диапазоне от 60 до 7 0°С, предпочтительно в диапазоне от 60 до 65°С, например, приблизительно 65°С, в диапазоне от 30 до 90 мин, предпочтительно в диапазоне от 45 до 75 мин, например, приблизительно 60 мин;
(6) нагревание до температуры в диапазоне от 7 0 до 8 0°С, предпочтительно в диапазоне от 75 до 78°С, например, приблизительно 78°С, в диапазоне от 5 до 15 мин, например, приблизительно 10 мин.
Как указано выше, композицию сусла можно получать завариванием растений ячменя без двух LOX-без ММТ или их частей, таких как неосоложенные зерна без двух LOX-без ММТ, в частности молотые, неосоложенные зерна без двух LOX-без ММТ или
их части. В неосоложенных зернах ячменя отсутствуют или они
содержат только ограниченное количество ферментов полезных для
получения сусла, таких как ферменты, способные к разрушению
клеточной стенки, или ферменты, способные к деполимеризации
крахмала в сахара. Таким образом, в вариантах осуществления
изобретения, где для заваривания используют неосоложенные части
без двух LOX-без ММТ, предпочтительно, чтобы в сусло добавляли
один или несколько подходящих внешних ферментов пивоварения.
Подходящие ферменты могут представлять собой липазы, ферменты,
разрушающие крахмал (например, амилазы), глюканазы
[предпочтительно (1-4)- и/или (1-3,1-4)-р-глюканаза], и/или ксиланазы (такие как арабиноксиланаза), и/или протеазы, или ферментные смеси, содержащие один или несколько из указанных выше ферментов, например, Cereflo, Ultraflo или Ondea Pro (Novozymes). Способ получения напитка из сусла, получаемого из неосоложенного ячменя, также можно обозначать как "сбраживание ячменя", а композицию его сусла как "ячменное сусло" или сусло "из сброженного ячменя".
Композицию сусла также можно получать с использованием смеси осоложенных и неосоложенных растений ячменя без двух LOX-без ММТ или их частей, в случае чего при получении можно добавлять один или несколько подходящих ферментов. Более конкретно, ячмень по изобретению для заваривания можно использовать совместно с солодом в любой комбинации, с внешними ферментами или без них, в качестве неограничивающих примеров, в такой как пропорции ячменя:солода = приблизительно 100:0, или приблизительно 75:25, или приблизительно 50:50, или приблизительно 2 5:75.
В других вариантах осуществления изобретения предпочтительно, чтобы перед завариванием или во время него внешних ферментов не добавляли, в частности, чтобы не добавляли внешней протеазы, и/или внешней целлюлазы и/или внешней а-амилазы и/или внешней р-амилазы и/или внешней мальтогенной а-амилазы.
Сусло, получаемое после заваривания также можно обозначать как "сладкое сусло". В общепринятых способах сладкое сусло
варят с хмелем или без него, где после этого его можно обозначать как вареное сусло.
Как применяют в настоящем документе термин "приблизительно" означает ±10%, предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±2%.
Нагревание сусла
Способ получения напитка на основе ячменя по настоящему изобретению включает этап нагревания сусла, получаемого после этапа заваривания, описываемого в настоящем документе выше в разделе "Заваривание".
Преимуществом настоящего изобретения является то, что напитки на основе ячменя с низкими уровнями веществ с неприятным привкусом и их предшественников, в частности T2N и DMS и их предшественников, можно получать без необходимости интенсивного нагревания сусла.
В общепринятом пивоварении сусло, как правило, варят в течение продолжительного периода времени. Варка сусла преследует несколько задач, в частности: (i) инактивацию ферментов; (ii) коагуляцию белка; (iii) стерилизацию сусла; (iv) экстракцию хмелевых соединений; (v) изомеризацию а-кислот; (vi) преобразование DMSP в DMS и (vii) выпаривание DMS и T2N.
Некоторые из этих задач можно выполнять без интенсивной варки. Таким образом, для стерилизации необходимо только кратковременное кипячение или нагревание. Экстракцию хмелевых соединений также можно проводить при кратковременном кипячении или нагревании. Предварительно изомеризованные а-кислоты являются коммерчески доступными и их можно добавлять в сусло.
С применением растений ячменя с потерей функциональности LOX-1 и LOX-2 отпадает необходимость в денатурации LOX. Кроме того, при использовании растений с потерей функциональности LOX-1 и LOX-2 также отпадает необходимость в снижении уровней T2N. При использовании растения ячменя с потерей функциональности ММТ также отпадает необходимость в снижении уровней DMS и потенциала DMS, так как указанные уровни в таких растениях ячменя являются минимальными. Кроме того, зерна ячменя можно сушить и проращивание можно останавливать даже при
низких температурах.
Предпринимались попытки различными способами снизить энергопотребление во время варки сусла, например, посредством снижения выпаривания всего до 3% в комбинации с процессом отгонки с экстракцией нежелательных легкоиспаряющихся соединений в пар. Однако получение пара также является энергоемким процессом.
Также предпринимались попытки получать сусло без классической варки сусла. Однако в этих способах при заваривании в основном применяют высокие температуры до 95°С, а также отгонку сусла паром, что, таким образом, предусматривает высокоэнергоемкие процессы.
Настоящий способ обеспечивает возможность для уменьшенного выпаривания, а предпочтительно даже отсутствия процесса отгонки. Таким образом, способами по настоящему изобретению сусло нагревают таким способом, что выпаривается предпочтительно самое большое 4%, даже предпочтительно самое большое 3%, даже более предпочтительно самое большое 2%, даже более предпочтительно самое большое 1,5%, еще более предпочтительно самое большое 1%, даже более предпочтительно самое большое 0,5%, даже более предпочтительно самое большое 0,1%, например, самое большое 0,01% объема сусла. Даже более предпочтительно указанное выше уменьшенное выпаривание проводят в отсутствии обработки сусла паром. Также предпочтительно, чтобы указанное выше уменьшенное выпаривание проводили в отсутствии отгонки сусла, например, паром.
Уменьшенное выпаривание можно проводить нагреванием сусла по существу в закрытом контейнере или предпочтительно в закрытом контейнере.
Кроме того, предпочтительно, чтобы на любом из других этапов способа интенсивное выпаривание жидкости не проводилось. Таким образом, предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам получения напитков на основе ячменя с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников (предпочтительно T2N и DMS и их предшественников) , где способ
включает сниженное потребление энергии, где способ включает этапы:
(i) предоставления растения ячменя или его части, где
указанное растение ячменя несет:
(a) первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1; и
(b) вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2; и
(c) третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ;
(ii) необязательно соложения по меньшей мере части указанного ячменя, таким образом, получая осоложенный ячмень;
(iii) заваривания указанного ячменя и/или осоложенного ячменя и необязательно дополнительных добавок, таким образом, получая сусло;
(iv) нагревания указанного сусла необязательно в присутствии дополнительного ингредиента(ов);
(v) переработки указанного нагретого сусла в напиток;
где в ходе способа после завершения этапа (ii) или даже завершения этапа (iv) выше выпаривается самое большое 4%, например, самое большое 3%, так как самое большое 2%, например, самое большое 1,5%, например, самое большое 1% объема жидкости, таким образом, получая получаемый из ячменя напиток с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников.
Предпочтительно, чтобы этап (iv) выше в этом способе, проводили с суслом по существу в закрытом контейнере, например, в закрытом контейнере.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к способам получения напитков на основе ячменя с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников (предпочтительно T2N и DMS и их предшественников), где способ включает сниженное потребление энергии, где способ включает этапы:
(i) предоставления растения ячменя или его части, где указанное растение ячменя несет:
(a) первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1; и
(b) вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2; и
(c) третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ;
(ii) необязательно соложения по меньшей мере части указанного ячменя, таким образом, получая осоложенный ячмень;
(iii) заваривания указанного ячменя и/или осоложенного ячменя и необязательно дополнительных добавок, таким образом, получая сусло;
(iv) нагревания указанного сусла необязательно в присутствии дополнительного ингредиента(ов);
(v) переработки указанного нагретого сусла в напиток;
где жидкость/сусло/напиток нагревают до температуры выше 80°С в течение самое большое 30 мин, более предпочтительно в течение самое большое 2 0 мин, таким образом, получая получаемый из ячменя напиток с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников.
Предпочтительно, указанные жидкость/сусло/напиток в течение указанного способа нагревают до температуры в диапазоне от 80 до 99, 8°С, предпочтительно до температуры в диапазоне от 80 до 99,5°С, так как до температуры от 80 до 99°С, еще более предпочтительно до температуры в диапазоне от 90 до 99°С, еще более предпочтительно до температуры в диапазоне от 95 до 99°С в течение самое большое 30 мин, предпочтительно самое большое 20 мин, так как в течение диапазона от 10 до 30 мин, например, в течение диапазона от 10 до 2 0 мин.
Первое, второе и дальнейшее сусла можно комбинировать, а затем подвергать нагреванию или нагревать можно каждые отдельные вид или сусло. Способами по изобретению сусло не обязательно варить. Невареное сусло, чистое первое сусло или комбинированное сусло, также обозначают как "сладкое сусло"; после варки его можно обозначать как "вареное сусло". Если сусло необходимо использовать при получении пива, часто до
варки добавляют хмель.
В традиционных способах пивоварения сусло варят в течение длительного периода времени, в основном в диапазоне от 60 минут 120 минут, для выпаривания по меньшей мере 5% и иногда даже до 25% объема сусла. Однако длительная варка нежелательно по ряду других причин, например, потому, что длительная варка требует больших энергоресурсов.
По настоящему изобретению сусло с низкими уровнями T2N, потенциалом T2N, DMS и DMSP можно получать из ячменя без двух LOX-без ММТ даже без длительной варки. Таким образом, сусло по предпочтительному варианту осуществления изобретения варят в течение самое большое 30 мин, более предпочтительно в течение самое большое 15 мин, даже более предпочтительно в течение самое большое 10 мин, еще более предпочтительно в течение самое большое 5 мин, даже более предпочтительно в течение самое большое 1 мин, еще более предпочтительно сусло не варят совсем. Кроме того, предпочтительно, чтобы после завершения этапа ii) способ по изобретению жидкость/сусло/напиток варили в течение самое большое 30 мин, более предпочтительно в течение самое большое 15 мин, даже более предпочтительно в течение самое большое 10 мин, еще более предпочтительно в течение самое большое 5 мин, даже более предпочтительно в течение самое большое 1 мин, еще более предпочтительно жидкость/сусло/напиток не варят совсем. Предпочтительно нагревание сусла проводят по существу в закрытом контейнере, предпочтительно в закрытом контейнере.
В этом контексте термин, "варка" означает доведение жидкости, или сусла, или напитка до температуры, при которой вода превращается в пар. Таким образом, при нормальном давлении варка означает доведение водной жидкости, такой как сусло, до 100°С или немного выше.
Таким образом, также предпочтительно, чтобы сусло по варианту осуществления изобретения выдерживали при температуре
по меньшей мере 100°С в течение самое большое 30 мин, более предпочтительно в течение самое большое 15 мин, даже более
предпочтительно в течение самое большое 10 мин, еще более
предпочтительно в течение самое большое 5 мин, даже более
предпочтительно в течение самое большое 1 мин, еще более
предпочтительно сусло не нагревают до температуры по меньшей
мере 100°С совсем. Кроме того, предпочтительно, чтобы после
завершения этапа (11) способа по изобретению
жидкость/сусло/напиток выдерживали при температуре по меньшей
мере 100°С в течение самое большое самое большое 30 мин, более предпочтительно в течение самое большое 15 мин, даже более предпочтительно в течение самое большое 10 мин, еще более предпочтительно в течение самое большое 5 мин, даже более предпочтительно в течение самое большое 1 мин, еще более предпочтительно жидкость/сусло/напиток совсем не нагревают до температуры по меньшей мере 10 0°С.
Также предпочтительно, чтобы весь способ получения напитков на основе ячменя по изобретению вообще не включал нагревание до температуры более 99,8°С, предпочтительно 99,5°С, еще более предпочтительно 99°С.
Предпочтительно способ может включать этап нагревания сусла до температуры самое большое 99,8°С, например, самое большое 99,5°С, например, самое большое 99°С, например, самое большое 98°С в течение ограниченного периода времени. Указанный ограниченный период времени предпочтительно составляет самое большое 30 мин, более предпочтительно самое большое 15 мин, даже более предпочтительно самое большое 10 мин.
Таким образом, предпочтительно, чтобы сусло нагревали до
температуры выше 8 0°С, предпочтительно в диапазоне от 8 0 до 99, 8°С, так как в диапазоне от 80 до 99,5°С, например, в диапазоне от 80 до 99°С, еще более предпочтительно до температуры в диапазоне от 90 до 99°С, еще более предпочтительно до температуры в диапазоне от 95 до 99°С в течение самое большое 30 мин, предпочтительно самое большое 20 мин, например, в течение диапазона от 10 до 30 мин, например, в течение диапазона от 10 до 2 0 мин.
В дополнительном варианте осуществления изобретения предпочтительно, чтобы сусло не подвергали (например, отмывка СОг) последующей варке сусла и до ферментации.
Сусло
В другом аспекте изобретение относится к типам растительных продуктов, которые представляют собой композиции сусла. Указанные композиции сусла предпочтительно получают из композиций солода, получаемых из зерен без двух LOX-без ММТ. Указанный солод можно получать только из зерен без двух LOX-без ММТ или смеси, также содержащей другие зерна. Изобретение также относится к композиции сусла, получаемой с использованием ячменя без двух LOX-без ММТ, или его частей, таких как зеленый солод, отдельно или смешанный с другими компонентами.
Композиции сусла по изобретению предпочтительно получают посредством заваривания, как описано выше в настоящем документе в разделе "Заваривание". Кроме того, композиции сусла можно нагревать, как описано выше в настоящем документе в разделе "Нагревание сусла".
Предпочтительно, чтобы указанные композиции сусла предпочтительно содержали менее 60%, более предпочтительно менее 50%, даже более предпочтительно менее 40% потенциала T2N по сравнению с композицией сусла, получаемой таким же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power или сорта Rosalina.
Указанное сусло может быть первым, и/или вторым, и/или дальнейшим суслом и/или их смесями. Композиция сусла может представлять собой сладкое сусло, нагретое сусло или их смесь. Нагретое сусло предпочтительно нагревают, как описано в разделе "Нагревание сусла" выше в настоящем документе. Композиция сусла также может представлять собой ячменное сусло. В основном, в композиции сусла присутствует высокое содержание азота в виде аминогрупп и ферментируемых углеводов, где последние в основном представляют собой мальтозу.
В одном из вариантов осуществления сусло может представлять собой сладкое сусло, т.е. сусло, которое не подвергали тепловой обработке. Указанное сладкое сусло
предпочтительно содержит менее 60%, более предпочтительно менее 50% потенциала T2N по сравнению с композицией сусла, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power или сорта Rosalina. Если указанное сусло получали из солода, который подвергали печной сушке при низких температурах, оно даже может обладать меньшим потенциалом T2N. Таким образом, в вариантах осуществления изобретения, где указанное сладкое сусло получали из солода, который подвергали печной сушке при температуре в диапазоне от 50 до 7 0°С, указанное сладкое сусло предпочтительно может содержать менее 50%, даже более предпочтительно менее 45%, например, менее 40% потенциала T2N по сравнению с композицией сусла, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power. В вариантах осуществления изобретения, где указанное сладкое сусло получали из солода, который подвергали печной сушке при температуре в диапазоне от 40 до 50°С, указанное сладкое сусло предпочтительно может содержать менее 50%, даже более предпочтительно менее 4 0%, еще более предпочтительно менее 30% потенциала T2N по сравнению с композицией сусла, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench или сорта Rosalina.
Также указанное сладкое сусло предпочтительно содержит низкие уровни DMSP, предпочтительно менее 150 мкг/л, более предпочтительно менее 100 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 2 0 мкг/л, еще более предпочтительно менее 15 мкг/л DMSP (предпочтительно SMM) . Даже если указанное сусло получали из солода, который подвергали печной сушке при низких температурах, оно все еще содержит низкие уровни DMSP. Таким образом, в вариантах осуществления изобретения, где указанное сладкое сусло получали из солода, который подвергали печной сушке при температуре в диапазоне от 50 до 7 0°С, указанное сладкое сусло предпочтительно может содержать менее 150 мкг/л, более предпочтительно менее 100 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее
30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 20 мкг/л, еще более предпочтительно менее 15 мкг/л DMSP. В вариантах осуществления изобретения, где указанное сладкое сусло получали из солода, который подвергали печной сушке при температуре в диапазоне от
4 0 до 50°С, указанное сладкое сусло предпочтительно может содержать менее 150 мкг/л, более предпочтительно менее 100 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 20 мкг/л, еще более предпочтительно менее 15 мкг/л DMSP.
Предпочтительно, указанное сладкое сусло также содержит низкие уровни DMS, предпочтительно менее 90 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 20 мкг/л DMS.
Сусло также может представлять собой сусло, которое подвергали тепловой обработке только в течение короткого периода времени, например, при температуре в диапазоне от 95 до 99,8°С или в диапазоне от 95 до 99°С в течение диапазона времени от 10 до 30 мин. В этом случае указанное сусло предпочтительно содержит самое большое 60%, более предпочтительно самое большое 50%, даже более предпочтительно самое большое 45%, более предпочтительно самое большое 4 0% потенциала T2N по сравнению с композицией сусла, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power или сорта Rosalina. Указанное сусло также предпочтительно содержит самое большое 150 мкг/л, более предпочтительно менее 100 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 20 мкг/л, еще более предпочтительно менее 15 мкг/л DMSP. Указанное сусло также предпочтительно содержит самое большое 150 мкг/л, более предпочтительно менее 100 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 2 0 мкг/л DMS.
Сусло также может представлять собой нагретое сусло (предпочтительно нагретое, как описано выше в настоящем документе в разделе "Нагревание сусла"), в случае чего сусло
предпочтительно содержит самое большое 60%, более предпочтительно самое большое 50%, еще более предпочтительно самое большое 4 0% потенциал T2N по сравнению с композицией сусла, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power.
Также указанное нагретое сусло предпочтительно содержит низкие уровни DMSP, предпочтительно менее 150 мкг/л, более предпочтительно менее 100 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 2 0 мкг/л, еще более предпочтительно менее 15 мкг/л DMSP. В вариантах осуществления изобретения, где указанное охлажденное сусло получали из солода, который подвергали печной сушке при температуре в диапазоне от 50 до 7 0°С, указанное сладкое сусло предпочтительно может содержать менее 150 мкг/л, более предпочтительно менее 100 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 20 мкг/л, еще более предпочтительно менее 15 мкг/л DMSP. Кроме того, в вариантах осуществления изобретения, где указанное охлажденное сусло получали из солода, который подвергали печной сушке при температуре в диапазоне от 4 0 до 50°С, указанное сладкое сусло предпочтительно может содержать менее 150 мкг/л, более предпочтительно менее 100 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 2 0 мкг/л, еще более предпочтительно менее 15 мкг/л DMSP. Также указанное нагретое сусло предпочтительно содержит низкие уровни DMS, предпочтительно менее 30 мкг/л, более предпочтительно менее 20 мкг/л DMSP.
Сусло также может представлять собой нагретое сусло (предпочтительно нагретое, как описано выше в настоящем документе в разделе "Нагревание сусла"), которое затем охлаждали (в настоящем документе также обозначаемое как охлажденное сусло), в случае чего сусло предпочтительно содержит самое большое 60%, более предпочтительно самое большое 50%, еще более предпочтительно самое большое 4 0% потенциал T2N
по сравнению с композицией сусла, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power или сорта Rosalina. В вариантах осуществления изобретения, где указанное охлажденное сусло получали из солода, который подвергали печной сушке при температуре в диапазоне от 40 до 50°С, указанное сладкое сусло предпочтительно может содержать менее 50%, даже более предпочтительно менее 4 0%, еще более предпочтительно менее 30% потенциала T2N по сравнению с композицией сусла, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power или сорта Rosalina.
Также указанное охлажденное сусло предпочтительно содержит низкие уровни DMSP, предпочтительно менее 90 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 20 мкг/л, еще более предпочтительно менее 15 мкг/л DMSP. Также указанное охлажденное сусло предпочтительно содержит низкие уровни DMS, предпочтительно менее 90 мкг/л, даже более предпочтительно менее 50 мкг/л, еще более предпочтительно менее 30 мкг/л, даже более предпочтительно менее 2 0 мкг/л DMS.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения композиция сусла по настоящему изобретению представляет собой ячменное сусло, такое как нагретое ячменное сусло, т.е. сусло, получаемое инкубацией неосоложенного водой (и предпочтительно молотого) зерна без двух LOX-без ММТ, предпочтительно посредством заваривания и промывания пивной дробины. Такое ячменное сусло характеризуется предельно низкими уровнями T2N и потенциала T2N. Предпочтительно, чтобы указанное ячменное сусло содержало менее 50%, более предпочтительно менее 4 0%, даже более предпочтительно менее 30% потенциала T2N по сравнению с композицией ячменного сусла, получаемой тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power. Также предпочтительно, чтобы указанное ячменное сусло предпочтительно содержало менее 50%, более предпочтительно менее 4 0%, даже более предпочтительно менее 30% предшественника T2N по сравнению с композицией ячменного сусла, получаемой тем же
способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или сорта Quench, или сорта Rosalina. Напитки
В предпочтительном аспекте, настоящее изобретение относится к напиткам, более предпочтительно к напиткам на основе ячменя, получаемым из ячменя без двух LOX-без ММТ. Указанные напитки в одном предпочтительном варианте осуществления могут представлять собой солодовые напитки, даже более предпочтительно ферментированные напитки, такие как ферментированные солодовые напитки, предпочтительно алкогольные напитки, такие как пиво, где указанный напиток получают с использованием ячменя без двух LOX-без ММТ или его частей. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения напиток предпочтительно получают посредством ферментации ячменя без двух LOX-без ММТ или его частей или их экстрактов, например, посредством ферментации сусла из солода без двух LOX-без ММТ отдельно или в комбинации с другими ингредиентами.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный выше напиток получают способом, включающим этапы:
(i) предоставления растения ячменя или его части, где
указанное растение ячменя несет:
(a) первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1; и
(b) вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2; и
(c) третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ;
(ii) необязательно соложения по меньшей мере части указанного ячменя, таким образом, получая осоложенный ячмень;
(iii) заваривания указанного ячменя и/или осоложенного ячменя и необязательно дополнительных добавок, таким образом, получая сусло;
(iv) нагревания указанного сусла необязательно в присутствии дополнительного ингредиента(ов), где выпаривается самое большое 4% объема сусла, таким образом, получая нагретое
(ii)
сусло;
(v) переработки указанного нагретого сусла в напиток.
Однако в других вариантах осуществления изобретение относится к любому напитку на основе ячменя, получаемому из ячменя без двух LOX-без ММТ. Таким образом, изобретение также относится к напиткам на основе ячменя, получаемым из ячменя без двух LOX-без ММТ общепринятыми способами, такими как общепринятые способы пивоварения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения напиток представляет собой неферментированный напиток, например, сусло, предпочтительно сусло, получаемое из солода без двух LOX-без ММТ.
Также в настоящее изобретение входит, что указанный напиток можно получать из неосоложенных растений ячменя, предпочтительно неосоложенных растений ячменя без двух LOX-без ММТ или их частей, например, посредством сбраживания ячменя.
Напиток может представлять собой неалкогольный напиток, такой как неалкогольное пиво или другие виды неалкогольных напитков, такие как неалкогольные солодовые напитки, такие как мальтина.
Однако предпочтительно указанный напиток получают из композиции солода, получаемой из зерен ячменя без двух LOX-без ММТ. Более предпочтительно, указанный напиток представляет собой пиво. Оно может представлять собой пиво любого сорта, известного специалисту в данной области. В одном из вариантов осуществления пиво, например, представляет собой светлое пиво. Пиво предпочтительно варят с использованием композиции солода, содержащей проросший ячмень без двух LOX-без ММТ, более предпочтительно указанное пиво варят с использованием композиции солода, получаемой исключительно из проросшего ячменя без двух LOX-без ММТ. Однако композиция солода также может содержать другие компоненты, например, другие проросшие или непроросшие злаки, такие как ячмень дикого типа, ячмень без двух LOX-без ММТ, пшеницу и/или рожь, или непроросшее сырье, содержащее сахара, или композиции, получаемые из осоложенного или неосоложенного сырья, включая композиции сиропов. Однако
предпочтительно весь ячмень, такой как весь осоложенный и/или неосоложенный ячмень и/или проросший и/или непроросший ячмень, используемый для получения указанного пива, предпочтительно представляет собой ячмень без двух LOX-без ММТ.
Таким образом, изобретение также относится к способам получения напитка, включающим этапы:
(i) предоставления композиции солода, содержащей проросшие
зерна без двух LOX-без ММТ;
(ii) переработку указанной композиция солода в напиток.
В предпочтительном варианте осуществления напиток по изобретению представляет собой пиво, которое получают из сусла, получаемого из высушенного солода (предпочтительно получаемого, как описано выше в настоящем документе в разделе "Соложение"), более предпочтительно посредством заваривания указанного высушенного солода (предпочтительно, как описано выше в настоящем документе в разделе "Заваривание"), где указанное заваривание также может необязательно содержать этап промывания пивной дробины. Кроме того, указанное сусло предпочтительно нагревают, предпочтительно, как описано выше в настоящем документе в разделе "Нагревание сусла", хотя в определенных вариантах осуществления сусло можно нагревать общепринятым способом посредством варки. Получаемое таким образом пиво также может быть обозначено в настоящем документе как "осоложенное". Однако напиток по изобретению также может представлять собой пиво, получаемое из ячменного сусла. Такое пиво также обозначают как "ячменное пиво".
В основном алкогольные напитки, такие как пиво, можно получать из осоложенных и/или неосоложенных зерен ячменя. Солод, в дополнение к хмелю и дрожжам, вносит вклад во вкус и цвет пива. Кроме того, солод функционирует как источник ферментируемого сахара и ферментов. Схематическое представление общего процесса получения пива представлено на фиг. 9, тогда как подробные описания примеров подходящих способов соложения и пивоварения можно найти, например, в публикациях Briggs et al. (1981) и Hough et al. (1982) . Многочисленные, регулярно обновляемые способы анализа ячменя, солода и пивных продуктов в
качестве неограничивающих примеров доступны в American Association of Cereal Chemists (1995), American Society of Brewing Chemists (1992), European Brewery Convention (1998) и Institute of Brewing (1997). Установлено, что на каждой конкретной пивоварне используют множество особых процедур с наиболее значимыми вариациями, относящимися к предпочтениям местных потребителей. По настоящему изобретению можно использовать любой такой способ производства пива.
Первый этап получения пива из сусла предпочтительно включает нагревание указанного сусла, как описано выше в настоящем документе, с последующим этапом охлаждения сусла и необязательно перемешивания остатка. После охлаждения сусло переносят в ферментационные чаны, содержащие дрожжи. Предпочтительно указанные дрожжи представляет собой пивные дрожжи, Saccharomyces carlsbergensis. Сусло ферментируют в течение любого подходящего периода времени, в основном в диапазоне от 1 до 100 суток. В течение процесса ферментации длительностью несколько суток, сахар преобразуется в спирт и СОг параллельно с накоплением некоторых вкусоароматических веществ.
Затем пиво можно дополнительно перерабатывать, например, охлаждать. Его также можно фильтровать и/или осветлять, способом, в котором развивается приятный аромат и менее дрожжевой вкус. Также можно добавлять добавки. Кроме того, можно добавлять СОг. В заключение пиво перед упаковкой (например, бутилированием или герметизированием) можно пастеризовать и/или фильтровать.
В предпочтительном варианте осуществления напиток по изобретению содержит менее 7 0%, предпочтительно менее 60%, более предпочтительно менее 50% потенциала T2N по сравнению с потенциалом T2N напитка, получаемого тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или сорта Quench, или сорта Rosalina. Также предпочтительно, чтобы напитки по изобретению содержали самое большое 2 млрд.д., более предпочтительно самое большое 1,5 млрд.д. потенциала T2N, если °Р в исходном экстракте на котором основан напиток доведен до
величины в диапазоне от 10 до 12°Р, более предпочтительно до 11 °Р.
В предпочтительном варианте осуществления напиток по изобретению содержит менее 7 0%, предпочтительно менее 60%, более предпочтительно менее 50% предшественников T2N по сравнению с предшественниками T2N напитка, получаемого тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или сорта Quench, или сорта Rosalina. Также предпочтительно, чтобы напитки по изобретению содержали самое большое 2 млрд.д., более предпочтительно самое большое 1,5 млрд.д. предшественник T2N, если °Р в исходном экстракте на котором основан напиток доведен до величины в диапазоне от 10 до 12 °Р, более предпочтительно до 11°Р.
Указанный напиток, предпочтительно пиво, также предпочтительно содержит самое большое 60 млрд.д., более предпочтительно менее 50 млрд.д., даже более предпочтительно менее 4 0 млрд.д., еще более предпочтительно менее 3 0 млрд.д., даже более предпочтительно менее 2 0 млрд.д., еще более предпочтительно менее 10 млрд.д. DMS.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения напиток представляет собой ячменное пиво, которое содержит менее 60%, предпочтительно менее 50% потенциала T2N по сравнению с потенциалом T2N ячменного пива, получаемого тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сортов Power или Quench.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения напиток, предпочтительно пиво, получают из нагретого сусла, которое подвергали тепловой обработке только в течение короткого периода времени, например, при температуре в диапазоне от 95 до 99, 8°С или в диапазоне от 95 до 99°С в течение диапазона от 10 до 30 мин. Предпочтительно, указанное нагретое сусло нагревали, как описано выше в настоящем документе в разделе "Нагревание сусла". В вариантах осуществления изобретения, где напиток, предпочтительно пиво, получают из такого нагретого сусла, указанный напиток,
предпочтительно пиво, содержит менее 60%, предпочтительно менее 50%, более предпочтительно менее 45% потенциала T2N по сравнению с потенциалом T2N пива, получаемого тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или сорта Quench, или сорта Rosalina. В этом варианте осуществления также предпочтительно, чтобы указанный напиток, предпочтительно пиво, содержал менее 60%, предпочтительно менее 50%, более предпочтительно менее 45% предшественника T2N по сравнению с предшественниками T2N напитка, предпочтительно пива, получаемого тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или сорта Quench, или сорта Rosalina. В этом варианте осуществления также предпочтительно, чтобы пиво по изобретению содержало самое большое 2 млрд.д., более предпочтительно самое большое 1,5 млрд.д. потенциала T2N. Кроме того, в этом варианте осуществления предпочтительно, чтобы пиво по изобретению содержало самое большое 2 млрд.д., более предпочтительно самое большое 1,5 млрд.д. предшественника T2N, если °Р в исходном экстракте на котором основан напиток, доведен до величины в диапазоне от 10 до 12°Р, более предпочтительно до 11°Р. Указанный напиток, предпочтительно пиво, также предпочтительно содержит самое большое 60 млрд.д., более предпочтительно менее 50 млрд.д., даже более предпочтительно менее 4 0 млрд.д., еще более предпочтительно менее 30 млрд.д., даже более предпочтительно менее 20 млрд.д., еще более предпочтительно менее 10 млрд.д. DMS.
"Органолептические качества" означает качества, вызывающие обонятельные и вкусовые ощущения у человека. Указанные качества анализируют, например, в комиссии дегустаторов пива. Предпочтительно указанную комиссию тренируют на дегустацию и описание вкусоароматических свойств пива, с особым вниманием к альдегидам, вкусу картона, затхлому вкусу, сложным эфирам, высшим спиртам, жирным кислотам, компонентам, содержащим серу.
В основном, дегустационную комиссию составляют участники в диапазоне от 3 до 30 участников, например, в диапазоне от 5 до 15 участников, предпочтительно в диапазоне от 8 до 12
участников. Дегустационная комиссия может оценивать присутствие различных вкусоароматов, таких привкус картона, привкус окисленного продукта, затхлый привкус и хлебный привкус, а также вкусоароматы сложных эфиров, высших спиртов, содержащих серу компонентов и тары пива. По настоящему изобретению предпочтительно, чтобы вкусы картона и/или затхлости в частности были снижены, тогда как такие вкусоароматы, как ароматический вкус, эфирный аромат, вкус алкоголя/растворителя, цветочный аромат и/или хмелевой вкус можно предпочтительно увеличивать по сравнению с напитком, получаемым из ячменя дикого типа с использованием идентичного способа. Способ определения "органолептических качеств" напитка описан в примере б международной патентной заявки W0 2005/087934. Другой способ определения "органолептических качеств" напитка описан в примерах 8 и 9 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355. Еще один пример описан ниже в настоящем документе в примере 9. В предпочтительных вариантах осуществления стабильные органолептические качества, по меньшей мере частично, являются результатом низких уровней T2N или потенциала T2N. Ароматический вкус, эфирный аромат, вкус алкоголя/растворителя, цветочный аромат и/или хмелевой вкус предпочтительно можно определять, как описано в примере 7 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315. В одном предпочтительном варианте осуществления напитки по изобретению обладают показателем ароматического вкуса, эфирного аромата, вкуса алкоголя/растворителя, цветочного аромата и/или хмелевого вкуса, как описано в международной патентной заявке PCT/DK2009/050315 со стр. 41, строки 15 до стр. 44, строки 9.
Предпочтительно, чтобы напитки по настоящему изобретению после хранения в течение по меньшей мере 1 недели в диапазоне от 30 до 40°С, например, приблизительно 37°С характеризовались меньшим вкусом картона по сравнению со сходным напитком, получаемым тем же способом из растения ячменя дикого типа (предпочтительно сорта Quench или сорта Rosalina). Предпочтительно указанный вкус картона составляет менее 90%,
более предпочтительно менее 8 0%, например, менее 7 0%, как выявляет тренированная дегустационная комиссия.
Также предпочтительно, чтобы напитки по настоящему изобретению обладали сниженным вкусом картона по сравнению со сходными напитками, получаемыми из ячменя дикого типа после хранения при повышенных температурах. Когда тренированная специальная дегустационная комиссия определяет свойство "вкус картона" (как описано выше) и оценивает его по шкале от 0 до 5, на которой 0 представляет собой отсутствие, а 5 означает максимум, предпочтительно, чтобы напитки по изобретению имели один, или предпочтительно оба, из следующих показателей для вкуса картона:
(i) показатель для вкуса картона по меньшей мере на 0,5, предпочтительно по меньшей мере на 0,7 ниже, чем показатель для вкуса картона напитка, получаемого тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench или сорта Rosalina после инкубации при 37°С в течение одной недели;
(ii) показатель для вкуса картона по меньшей мере на 0,5, предпочтительно по меньшей мере на 0,7, более предпочтительно по меньшей мере на 0,8, по меньшей мере на 1 ниже, чем показатель для вкуса картона напитка, получаемого тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power или сорта Rosalina после инкубация при 37°С в течение двух недель.
Примечательно, что в настоящем изобретении описано, что общий показатель вкуса напитка, получаемого по настоящему изобретению, является лучшим по сравнению с напитками, получаемыми из ячменя дикого типа. Это частично является следствием выявления того, что DMS может маскировать определенные желательные вкусы.
Таким образом, предпочтительно, чтобы напитки по настоящему изобретению имели общий показатель вкуса, который по меньшей мере на 1, предпочтительно по меньшей мере на 1,5, более предпочтительно по меньшей мере на 2 превосходит показатель вкуса напитка, получаемого тем же способом из ячменя
дикого типа, предпочтительно из сорта Quench или сорта Rosalina, когда указанный напиток получали без варки соответствующего сусла, предпочтительно с использованием нагревания под давлением. Указанный показатель вкуса должен оцениваться по шкале от 1 до 9, где 9 представляет собой лучший показатель, присваиваемый комиссией дегустаторов пива.
Напиток указывают как обладающий "стабильными органолептическими качествами", когда указанный напиток содержит очень низкие уровни свободного T2N, даже после хранения. Таким образом, задачей настоящего изобретения является предоставление напитков (таких как пиво со стабильными органолептическими качествами), получаемых с использованием ячменя без двух LOX-без ММТ.
Таким образом, предпочтительно, чтобы напитки по настоящему изобретению содержали менее 8 0%, предпочтительно менее 70%, более предпочтительно менее 65%, даже более предпочтительно менее 60%, даже более предпочтительно менее 55% свободного T2N по сравнению с напитком, получаемым тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench или сорта Rosalina, после хранения в течение по меньшей мере 1 недели, предпочтительно по меньшей мере 2 недель, более предпочтительно по меньшей мере 3 недель, даже более предпочтительно в течение по меньшей мере 4 недель при температуре в диапазоне от 30 до 4 0°С, предпочтительно при 37°С. Также предпочтительно, чтобы напитки по изобретению содержали менее 0,025 млрд.д. свободного T2N после хранения в течение 2 недель при 37°С.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения напиток, предпочтительно пиво, получают из нагретого сусла, которое подвергали обработке только в течение короткого периода времени, например, при температуре в диапазоне от 95 до 99°С в течение диапазона от 10 до 30 мин. Предпочтительно указанное нагретое сусло нагревали, как описано выше в настоящем документе в разделе "Нагревание сусла". В вариантах осуществления изобретения, где напиток, предпочтительно пиво,
получают из такого нагретого сусла, указанный напиток, предпочтительно пиво, содержит менее 80%, предпочтительно менее 70%, более предпочтительно менее 65% свободного T2N по сравнению с напитком, получаемым тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench или сорта Rosalina, после хранения в течение по меньшей мере 1 недели, предпочтительно по меньшей мере 2 недели, более предпочтительно по меньшей мере 3 недель, даже более предпочтительно в течение по меньшей мере 4 недель при температуре в диапазоне от 3 0 до 40°С, предпочтительно при 37°С.
В частности, предпочтительно, чтобы такие напитки, предпочтительно пиво, получаемые из указанного нагретого сусла, содержали очень низкие уровни T2N, предпочтительно менее 8 0%, предпочтительно менее 7 0%, более предпочтительно менее 65% свободного T2N по сравнению с напитком, получаемым тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench или сорта Rosalina, после хранения в течение 2 недель при температуре в диапазоне от 30 до 40°С, предпочтительно при 37°С в присутствии уровня сульфита не превосходящего 10 м.д., предпочтительно уровня сульфита в диапазоне от 1 до 10 м.д., более предпочтительно в диапазоне от 1 до 8 м.д., более предпочтительно в диапазоне от 2 до б м.д., еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до б м.д. сульфита.
Также особенно предпочтительно напитки по изобретению, такие как пиво, например, ячменное пиво, содержат очень низкие уровни T2N, предпочтительно менее 8 0%, предпочтительно менее 70%, более предпочтительно менее 60%, даже более предпочтительно менее 5% свободного T2N, по сравнению с напитком, получаемым тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench или сорта Rosalina, после хранения в течение 8 недель при 37°С.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к напиткам, таким как пиво, с низкими уровнями определенных тригидроксиоктадеценовых кислот (также обозначаемых ТНА) , в частности к напиткам с низкими уровнями 9,12,13-ТНА и 9,10,13-
THA. THA характеризуются горьким вкусом (Baur and Grosch, 1977; Baur et al., 1977), делая указанные соединения нежелательными в напитках.
Таким образом, предпочтительно, чтобы уровень 9,12,13-ТНА и 9,10,13-ТНА являлся настолько низким, насколько возможно, например, менее 1,3 м.д., например, менее 1 м.д. Таким образом, предпочтительно, чтобы уровень 9,12,13-ТНА являлся настолько низким, насколько возможно, например, менее 1,3 м.д., например, менее 1 м.д. Также предпочтительно, чтобы уровень 9,10,13-ТНА являлся настолько низким, насколько возможно, например, менее 1,3 м.д., например, менее 1 м.д. Однако общая концентрация 9,12,13-ТНА и 9,10,13-ТНА в получаемом из солода напитке, таком как пиво, также зависит от количества солода, используемого для получения указанного конкретного напитка. Таким образом, в основном, а крепкое пиво содержит больше 9,12,13-ТНА и 9,10,13-ТНА, чем легкое пиво, что делает более высокий уровень 9,12,13-ТНА и 9,10,13-ТНА приемлемым в более крепком пиве. Таким образом, предпочтительно, чтобы напиток по изобретению содержал более низкий уровень 9,12,13-ТНА и 9,10,13-ТНА, чем напиток, получаемый тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power или из сорта Quench или сорта Rosalina. В частности, напиток по изобретению предпочтительно содержит уровень 9,12,13 ТНА, который составляет самое большое 50%, предпочтительно самое большое 4 0%, более предпочтительно самое большое 30% по сравнению с уровнем в напитке, получаемым тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power или сорта Rosalina. Кроме того, предпочтительно, чтобы напиток по изобретению содержал уровень 9,10,13-ТНА, который составляет самое большое 7 0%, предпочтительно самое большое 60%, так как самое большое 50%, например, самое большое 40% по сравнению с уровнем в напитке, получаемом тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или сорта Quench, или сорта Rosalina. Такие напитки можно получать с использованием ячменя без двух LOX-без ММТ.
В одном из вариантов осуществления изобретения напитки, получаемые из ячменя без двух LOX-без ММТ, обладают улучшенным
качеством пены. В частности это важно, когда напиток представляет собой пиво. Таким образом, целью изобретения является предоставление напитков, таких как пиво, с повышенным качеством пены. Предпочтительно, напитки по изобретению дают по меньшей мере в 1,5 раза больше, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза больше, еще более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза больше пены в течение от 60 до 8 0 мин, предпочтительно в течение 8 0 мин по сравнению с напитком, получаемым тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench. Указанное образование пены определяют, как описано в примере 8 ниже в настоящем документе. Растительные продукты
Целью настоящего изобретения является предоставление растительных продуктов, предпочтительно растительных продуктов из ячменя, характеризуемых низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом. В частности, целью изобретения является предоставление растительных продуктов, предпочтительно растительных продуктов из ячменя, с низкими уровнями T2N, DMS и их соответствующих предшественников. Как описано в изобретении, такие растительные продукты предпочтительно можно получать из ячменя без двух LOX-без ММТ. Указанный растительный продукт может представлять собой солод, предпочтительно любые из солодов, описываемых выше в настоящем документе в разделе "Соложение". Продукт может представлять собой сусло, предпочтительно любое из видов сусла, описываемых выше в настоящем документе в разделе "Сусло"; он также может представлять собой напиток, предпочтительно любые из напитков, описываемых выше в настоящем документе в разделе "Напиток". Однако растительный продукт также может представлять собой другие растительные продукты, характеризуемые низкими уровнями T2N, потенциала T2N, DMS и DMSP, получаемые из растений ячменя без двух LOX-без ММТ или их частей.
Таким образом, настоящее изобретение относится к растительным продуктам, которые могут представлять собой композиции, содержащие растения ячменя, описываемые ниже в настоящем документе или их части, или композиции, получаемые из
указанных растений ячменя или их частей, такие как растительные продукты, получаемые из указанных растений ячменя или их частей. Так как в указанных растениях ячменя отсутствует активность LOX-1, L0X-2 и ММТ, композиции в основном содержат очень низкие уровни веществ с неприятным привкусом и их молекул-предшественников, и в частности T2N, потенциал T2N, DMS и DMSP. Примеры подходящих растительных продуктов, содержащих растения ячменя с первой мутацией, приводящей к полной потере функциональности L0X-1, второй мутацией, приводящей к полной потере функциональности L0X-2, и третьей мутацией, приводящей к полной потере функциональности ММТ или получаемых из него, описаны в настоящем документе.
Предпочтительно, чтобы указанные растительные продукты содержали один или несколько из следующего, предпочтительно по меньшей мере два из следующего, даже более предпочтительно все из следующего:
(i) менее 60%, даже более предпочтительно менее 50%, еще более предпочтительно менее 40%, например, менее 30%, предпочтительно менее 2 0%, более предпочтительно менее 10% свободного T2N;
(ii) менее 60%, даже более предпочтительно менее 50%, еще более предпочтительно менее 40%, например, менее 30%, предпочтительно менее 25% потенциала T2N;
(iii) менее 30%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 15%, даже более предпочтительно менее 10% DMS;
(iv) менее 30%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 15%, даже более предпочтительно менее 10%, например, менее 5%, например, менее 2% SMM;
(v) менее 30%, предпочтительно менее 20%, более
предпочтительно менее 15%, даже более предпочтительно менее 10%
DMSP;
по сравнению со сходным растительным продуктом, таким же способом получаемым из растений ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Power, или сорта Quench, или сорта Rosalina.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к зернам ячменя с первой мутацией, приводящей к полной потере функциональности L0X-1, второй мутацией, приводящей к полной потере функциональности L0X-2 и третьей мутацией, приводящей к полной потере функциональности ММТ. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей указанные зерна, и к композиции, получаемой из указанных зерен, а также к растительным продуктам, получаемым из указанных зерен.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к растительным продуктам, которые могут представлять собой пищевые композиции, кормовые композиции и композиции сырья для ароматических веществ, которые содержат растения ячменя без двух LOX-без ММТ или их части. Например, пищевые композиции в качестве неограничивающих примеров могут представлять собой осоложенные и неосоложенные зерна ячменя, молотый ячмень, ячменную муку, хлеб, кашу, смеси зерновых растений, содержащие ячмень, лечебные средства, такие как напитки, содержащие ячмень, ячменные сиропы и хлопьевидные, молотые, тонкоизмельченные или экструдированные композиции ячменя. Например, кормовые композиции включают композиции, содержащие зерна и/или муку ячменя. Кормовые композиции могут представлять собой, например, сусло. Композиции сырья для ароматических веществ описаны ниже в настоящем документе.
Изобретение также относится к смеси различных растительных продуктов по изобретению. Например, в одном из аспектов изобретение относится к композиции получаемой смешиванием:
(i) композиции, содержащей растение ячменя или его часть, несущее первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1, вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2 и третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ; и
(ii) композиции солода, получаемой из зерен без двух LOX-без ММТ.
Существуют различные способы определения того, получают ли растение ячменя или растительный продукт из ячменя из растения ячменя, несущего мутации в генах LOX-1, L0X-2 и ММТ, вызывающих
полную потерю функциональности L0X-1, полную потерю функциональности L0X-2 и полную потерю функциональности ММТ, соответственно. Растительные продукты в основном содержат по меньшей мере часть геномной ДНК растения, используемого для их получения. Таким образом, солод содержит большие количества геномной ДНК, но даже экстракты ячменя или солода, такие как сусло, могут содержать геномную ДНК или ее фрагменты из указанного ячменя или солода. Напитки на основе ячменя, такие как пиво, также могут содержать геномную ДНК или ее фрагменты из указанного растения. Посредством анализа ДНК в растительном продукте можно установить несет ли растение, из которого получен растительный продукт, мутации в генах LOX-1, L0X-2 и ММТ, вызывающих полную потерю функциональности L0X-1, полную потерю функциональности L0X-2 и полную потерю функциональности ММТ. Например, указанные мутации могут представлять собой любые из мутаций в генах L0X-1 и L0X-2, описываемых ниже в настоящем документе в разделе "Потеря функциональности LOX". Например, указанная мутация в гене ММТ может представлять собой любую из мутаций в гене ММТ, описываемую ниже в настоящем документе в разделе "Потеря функциональности ММТ". Геномную ДНК можно анализировать любым пригодным способом, таким как секвенирование или способами на основе амплификации, включая способы на основе ПЦР. Если в гене L0X-1, и/или гене L0X-2, и/или гене ММТ предполагают наличие конкретных мутаций, тогда можно применять анализ полиморфизма, например, анализ SNP. В отношении определения мутации в гене L0X-1 и/или гене L0X-2 неограничивающий пример подходящего анализа SNP описан в международной патентной заявке PCT/DK2009/050355 в примере 10. В отношении определения мутации в гене ММТ неограничивающий пример подходящего анализа SNP описан в международной патентной заявке PCT/DK2009/050315 в примерах 13 и 17. Специалист может адаптировать конкретный анализ SNP, описанный в этих примерах для использования с другими мутациями или с другим исходным материалом.
Если указанные выше растительные продукты получают только из растений ячменя, которые представляют собой растения без
двух LOX-без ММТ, тогда присутствие в отличие от отсутствия мРНК L0X-1, мРНК L0X-2 и мРНК ММТ ячменя и/или белка L0X-1, белка L0X-2 и белка ММТ ячменя также может свидетельствовать о том, получают ли указанный растительный продукт из растения ячменя без двух LOX-без ММТ. Проверку растительного продукта также можно проводить посредством анализа вестерн-блоттингом или посредством другого анализа белка, или посредством ОТ-ПЦР, или посредством анализа нозерн-блоттингом, или посредством другого анализа мРНК. Такие анализы особенно пригодны, когда растительный продукт представляет собой солод. Растение ячменя
Изобретение относится к напитку на основе зерен. Например, злаки можно выбирать из группы, состоящей из ячменя, пшеницы, ржи, овса, кукурузы, риса, сорго, просо, тритикале, гречихи, фонио и киноа. Более предпочтительно, зерновое растение выбрано из группы, состоящей из ячменя, пшеницы, ржи, овса, кукурузы и риса, более предпочтительно зерновое растение представляет собой ячмень.
Таким образом, предпочтительно изобретение относится к напиткам на основе ячменя и растениям ячменя, пригодным для получения напитков по изобретению.
Ячмень представляет собой семейство растений. Прародителем современных культивируемых форм ячменя считается "дикий ячмень", Hordeum vulgare подвида spontaneum. Полагают, что переход ячменя из дикого в культивируемое состояние, соответствует коренному изменению частот аллелей в многих локусах. Редкие аллели и новые события мутаций положительно отбирали земледельцы, которые быстро определяли новые признаки в популяциях одомашненных растений, обозначаемых "местные сорта ячменя". Они являются генетически более близкородственными к современным сортам, чем дикий ячмень. До конца 19 столетия, местные сорта ячменя существовали в виде высокогетерогенных смесей инбредных линий и гибридных сегрегатов, включая несколько растений, происходящих вследствие случайных скрещиваний в более ранних поколениях. Большинство местных сортов в передовых сельских хозяйствах заменены на сорта чистых
линий. Оставшиеся местные сорта характеризуются промежуточными и высокими уровнями генетического разнообразия. Исходно, сорта "современного ячменя" представляли собой результат отбора из местных сортов. Затем их получали на основе последовательных циклов скрещиваний из полученных чистых линий, таких как линии из различных географических источников. В конечном счете, результатом явилось заметное сужение генетической основы во многих, вероятно во всех передовых сельских хозяйствах. По сравнению с местными сортами современные сорта ячменя обладают многими улучшенными свойствами (Nevo, 1992; von Bothmer et al., 1992), например, в качестве неограничивающих примеров, одним или несколькими из следующего: (i) покрытые и голые зерна; (ii) покой семян; (iii) устойчивость к заболеваниям; (iv) устойчивость к факторам окружающей среды (например, к засухе или рН почвы); (v) доля лизина и других аминокислот; (vi) содержание белка; (vii) содержание азота; (viii) состав углеводов; (ix) содержание и состав хордеинов; (х) состав (13,1-4)-р-глюканов и арабиноксиланов; (xi) урожайность; (xii) жесткость соломы и (xiii) высота растения.
В настоящем изобретении термин "растение ячменя" включает любое растение ячменя, такое как местные сорта ячменя или современные сорта ячменя. Таким образом, изобретение относится к любому растению ячменя, несущему первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1, и вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2 и третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ. Пример такого растения ячменя описан в примерах ниже в настоящем документе и обозначен как "тройной нуль-мутант" или "ячмень с тройной нуль-мутацией".
Однако предпочтительные растения ячменя для применения в настоящем изобретении представляют собой современные сорта ячменя или чистые линии. Например, сорт ячменя для применения в настоящем изобретение можно выбирать из группы, состоящей из Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi,
Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Века, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin - choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett, Rosalina и Jersey, предпочтительно из группы, состоящей из Haruna Nijo, Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda и Power, предпочтительно из группы, состоящей из Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Века, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin - choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett и Jersey, предпочтительно из группы, состоящей из Haruna Nijo, Sebastian, Tangent, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Power, Quench, NFC Tipple, Barke, Class и Vintage.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения растение ячменя представляет собой современный сорт ячменя (предпочтительно сорт, выбранный из группы сортов ячменя, перечисленных выше в настоящем документе), несущих первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-1, и вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональной активности L0X-2, и третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ. Таким образом, в этом варианте осуществления предпочтительно, чтобы растение ячменя не являлось местным сортом ячменя.
Растение ячменя могут находиться в любой подходящей форме. Например, растение ячменя по изобретению может представлять собой жизнеспособное растение ячменя, высушенное растение, гомогенизированное растение или молотое зерно ячменя. Растение может представлять собой зрелое растение, зародыш, проросшее зерно, осоложенное зерно, молотое осоложенное зерно, молотое зерно или т.п.
Части растений ячменя могут представлять собой любую подходящую часть растения, такую как зерна, зародыши, листья, стебли, корни, цветы или их части. Например, часть может представлять собой часть зерна, зародыша, листа, стебля, корня или цветка. Части растений ячменя также могут представлять собой фракцию гомогената или фракцию молотого растения ячменя или зерна.
В одном из вариантов осуществления изобретения, части растений ячменя могут представлять собой клетки указанного растения ячменя, такие как жизнеспособные клетки, которые можно выращивать в тканевых культурах in vitro. Однако в других вариантах осуществления, части растений ячменя могут представлять собой жизнеспособные клетки, которые не способны к созреванию в целое растение ячменя, т.е. клетки, которые не являются репродуктивным материалом.
Потеря функциональности LOX
Настоящее изобретение относится к растениям ячменя, или их частям, или их растительным продуктам, несущим первую мутацию, вторую мутацию и третью мутацию, где первая мутация приводит к полной потере функциональности L0X-1, а вторая мутация приводит к полной потере функциональности L0X-2. Третья мутация приводит к полной потере функциональности ММТ, как более подробно описано в разделе "Потеря функциональности ММТ" ниже в настоящем документе.
Полная потеря функциональности L0X-1 и полная потеря функциональности L0X-2 могут независимо основываться на различных механизмах. Например, полная потеря функциональности одной или обеих видов активности L0X-1 и L0X-2 может вызываться нефункционирующими белками в растении ячменя, т.е. нефункционирующим белком L0X-1 и/или белком L0X-2, таким как мутантный белок L0X-1 с отсутствием детектируемой активности формирования 9-HP0DE (где 9-HP0DE предпочтительно можно определять, как описано в примере 4 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355), и/или мутантный белок L0X-2 с отсутствием детектируемой активности формирования 13-HP0DE (где 13-HP0DE предпочтительно можно определять, как описано в
примере 4 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355).
Полная потеря функциональности LOX-1 и/или LOX-2 может вызываться отсутствием белка LOX-1 и/или белка LOX-2. Очевидно, что отсутствие белка LOX-1 приводит к потере функциональности LOX-1, и что отсутствие белка LOX-2 приводит к полной потере функциональности LOX-2. Таким образом, растение ячменя предпочтительно может не содержать или содержать очень мало, более предпочтительно недетектируемые количества белка LOX-1 и/или белка LOX-2. Белок LOX-1 и/или белок LOX-2 можно детектировать любыми подходящими способами, известными специалисту в данной области. Однако предпочтительно белок(ки) детектируют способами, где белок LOX-1 детектируют специфическими антителами к LOX-1 и LOX-2, такими как поликлональные антитела к LOX-1 и LOX-2. Например, указанные способы могут представлять собой вестерн-блоттинг или ELISA. Указанные антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Однако предпочтительно указанные антитела являются поликлональными, распознающими несколько различных эпитопов на белке LOX-1 и белке LOX-2, соответственно. Белок LOX-1 и/или белок LOX-2 также можно детектировать опосредованно, например, способами определения активности LOX-1 или способами определения активности LOX-2. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения белок LOX-1 детектируют способами, описанными в примере 4 международной патентной заявки WO 2005/087934. Белок LOX-2 можно детектировать сходным образом, используя антитела, связывающиеся с LOX-2 ячменя.
Полная потеря функциональности одной или обоих видов активности LOX-1 и LOX-2 также может представлять собой результат отсутствия или очень небольшой, предпочтительно отсутствия экспрессии транскрипта LOX-1 и/или транскрипта LOX-2. Специалист понимает, что отсутствие транскрипта LOX-1 и/или транскрипта LOX-2 также приводит к отсутствию транслируемого белка LOX-1 и/или белка LOX-2, соответственно. Альтернативно, полная потеря функциональности LOX-1 и функциональности LOX-2 также может представлять собой результат экспрессии
аберрантного транскрипта LOX-1 и/или аберрантного транскрипта L0X-2. Аберрантные транскрипт L0X-1 и/или транскрипт L0X-2 могут вызывать аберрантный сплайсинг транскрипта, например, вследствие мутации в участке сплайсинга. Таким образом, растения ячменя по изобретению могут нести мутацию в участке сплайсинга, таком как 5'-участок сплайсинга или 3'-участок сплайсинга, например, в одном или двух наиболее 5'-концевых нуклеотидов интрона, или в одном из большинства 3'-нуклеотидов интрона. Пример мутанта с аберрантным сплайсингом транскрипта L0X-1 описан как мутант А618 в W0 2005/087934. Экспрессия транскриптов, кодирующих LOX-1 или LOX-2 можно детектировать, например, посредством нозерн-блоттинга или эксперименты ОТ-ПЦР.
Мутации вызывают полную потерю функциональности ферментов LOX-1 и LOX-2 растений ячменя по настоящему изобретению. Таким образом, растения ячменя по настоящему изобретению в основном несут мутацию в гене LOX-1. Указанная мутация может находиться в регуляторных областях, например, в промоторе или в интронах, или указанная мутация может находиться в кодирующей области. Мутация также может представлять собой делецию гена LOX-1 или его части, например, делецию всей кодирующей области. Подобным образом растения ячменя по настоящему изобретению в основном несут мутацию в гене LOX-2. Указанная мутация может находиться в регуляторных областях, например, в промоторе или интронах, или указанная мутация может находиться в кодирующей области. Мутация также может представлять собой делецию гена LOX-2 или его части, например, делецию всей кодирующей области. Таким образом, причину полной потери функциональности ферментов LOX-1 и/или LOX-2 также можно детектировать посредством идентификации мутаций в гене, кодирующем LOX-1, или в гене, кодирующем LOX-2. Мутации в генах, кодирующих LOX-1 и LOX-2 можно детектировать, например, посредством секвенирования указанных генов. Предпочтительно после идентификации мутации полную потерю функциональности подтверждают посредством тестирования активности LOX-1 и/или LOX-2.
Термин "белок LOX-1" предназначен для обозначения полноразмерного белка LOX-1 ячменя, как приведено в SEQ ID N0:3
(соответствующей SEQ ID N0:3 WO 2005/087934) или в SEQ ID N0:7 WO 2005/087934, или его функционального гомолога. Активный центр LOX-1 расположен в С-концевой части фермента. В частности полагают, что для активности LOX-1 существенна область, захватывающая аминокислотные остатки 52 0-8 62 или ее часть
(предпочтительно вся область из положений аминокислот 520-862). Таким образом, в одном из вариантов осуществления ячмень без LOX-1 предпочтительно содержит ген, кодирующий мутантную форму LOX-1, в которой отсутствуют некоторые или все аминокислоты 520-862 LOX-1. В указанном мутантном LOX-1 также могут отсутствовать другие аминокислотные остатки, которые присутствуют в LOX-1 дикого типа.
Таким образом, ячмень без двух LOX по изобретению может содержать укороченную форму LOX-1, которая является нефункциональной, например, укороченную на N- или С-конце форму. Предпочтительно, указанная укороченная форма содержит не более 800, более предпочтительно не более 750, даже более предпочтительно не более 700, еще более предпочтительно не более 690, даже более предпочтительно не более 680, еще более предпочтительно не более 67 0 последовательных аминокислот LOX-1, например, не более 665, например, не более 650, например, не более 600, например, не более 550, например, не более 500, например, не более 4 50, например, не более 42 5, например, не более 399 последовательных аминокислот LOX-1 SEQ ID N0:3
(соответствующей SEQ ID N0:3 WO 2005/087934). Предпочтительно указанная укороченная форма содержит только N-концевой фрагмент LOX-1, предпочтительно самое большое 800, более предпочтительно самое большое 750, даже более предпочтительно самое большое 700, еще более предпочтительно самое большое 690, даже более предпочтительно самое большое 68 0, еще более предпочтительно самое большое 670, даже более предпочтительно самое большое 665 N-концевых аминокислот SEQ ID N0:3 (соответствующей SEQ ID N0:3 WO 2005/087934), например, не более 665, например, не более 650, например, не более 600, например, самое большое 550, например, самое большое 50 0, например, самое большое 4 50, например, самое большое 42 5, например, самое большое 3 99 N
концевых аминокислот SEQ ID N0:3 (соответствующей SEQ ID N0:3 WO 2005/087934). В дополнение к фрагменту LOX-1 указанная укороченная форма необязательно может содержать дополнительные С-концевые последовательности, не представленные в LOX-1 дикого типа. В частности это может представлять собой случай, когда укороченная форма образуется вследствие аберрантного сплайсинга. Предпочтительно указанные дополнительные С-концевые последовательности состоят самое большое из 50, более предпочтительно самое большое из 30, даже более предпочтительно самое большое из 10, еще более предпочтительно самое большое из 4 или самое большое из 1 аминокислоты.
В одном очень предпочтительном варианте осуществления, укороченная форма может состоять из аминокислот 1-665 SEQ ID N0:3 (соответствующей SEQ ID N0:3 WO 2005/087934).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение ячменя содержит ген, кодирующий L0X-1, который транскрибируется в мРНК, содержащую нонсенс-кодон или стоп-кодон выше стоп-кодона мРНК L0X-1 дикого типа. Такой нонсенс-кодон в настоящем документе обозначают как преждевременный нонсенс-кодон. Предпочтительно все кодирующие L0X-1 гены, транскрибируемые в мРНК указанного растения, содержат преждевременный нонсенс-кодон или стоп-кодон. Нонсенс-кодон или стоп-кодон предпочтительно расположены самое большое на 800, более предпочтительно самое большое на 750, даже более предпочтительно самое большое на 700, еще более предпочтительно самое большое на 690, даже более предпочтительно самое большое на 680, еще более предпочтительно самое большое на 670, даже более предпочтительно самое большое на 665 кодонов ниже стартового кодона. Последовательность геномной ДНК дикого типа, кодирующая LOX-1 приведена в SEQ ID N0:1 (соответствующей SEQ ID N0:1 WO 2005/087934) или SEQ ID N0:5 WO 2005/087934.
В одном предпочтительном варианте осуществления растение ячменя по изобретению содержит ген, кодирующий LOX-1, где соответствующая пре-мРНК, транскрибируемая с указанного гена, содержит последовательность, соответствующую SEQ ID N0:2 WO 2005/087934.
В очень предпочтительном варианте осуществления изобретения ген, кодирующий мутантный L0X-1 растения ячменя без двух LOX по изобретению, несет нонсенс-мутацию, где указанная мутация соответствует замене G^A в положении 3574 SEQ ID N0:1 WO 2005/087934.
Термин "белок LOX-2" предназначен для обозначения полноразмерного белка LOX-2 ячменя, как приведено в SEQ ID N0:7 (соответствующей SEQ ID N0:5 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355) или его функционального гомолога. Активный центр L0X-2 расположен в С-концевой части L0X-2. В частности полагают, что для активности L0X-2 существенна область, захватывающая аминокислотные остатки 515-717 или ее часть. На основе исследования кристаллической структуры L0X-1 сои, предполагаемые участки последовательности щели активного центра фермента L0X-2 ячменя представлены аминокислотными остатками 515-525 и 707-717. Транслируемый мутантный белок L0X-2, т.е. укороченная на С-конце форма L0X-2 мутанта ячменя без двух L0X, А689, содержит максимально 684 остатков, и таким образом, в ней отсутствует второй участок последовательности щели активного центра, что делает ее неактивной. По одному из вариантов осуществления изобретения ячмень без двух L0X по изобретению предпочтительно содержит ген, кодирующий мутантную форму L0X-2, в которой отсутствуют некоторые, или все аминокислоты 515-717 L0X-2, предпочтительно отсутствуют некоторые или все аминокислоты 707-717, даже более предпочтительно отсутствуют все аминокислоты 707-717. У указанного L0X-2 также могут отсутствовать другие аминокислотные остатки, представленные в L0X-2 дикого типа.
Таким образом, ячмень без двух L0X может содержать укороченную форму L0X-2, которая является нефункциональной, например, укороченную на N-конце или на С-конце форму. Предпочтительно указанная укороченная форма содержит не более 800, более предпочтительно не более 750, даже более предпочтительно не более 725, еще более предпочтительно не более 700, даже более предпочтительно не более 690, еще более предпочтительно не более 684 последовательных аминокислот LOX-2
SEQ ID N0:7 (соответствующей SEQ ID N0:5 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355). Предпочтительно указанная укороченная форма содержит только N-концевой фрагмент L0X-2. Таким образом, предпочтительно указанная укороченная форма содержит самое большое 800, более предпочтительно самое большое 750, даже более предпочтительно самое большое 725, еще более предпочтительно самое большое 700, даже более предпочтительно самое большое 690, еще более предпочтительно самое большое 684 N-концевых аминокислот SEQ ID N0:7 (соответствующей SEQ ID N0:5 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355). В дополнение к фрагменту L0X-12, указанная укороченная форма необязательно может содержать дополнительные С-концевые последовательности, не представленные в L0X-2 дикого типа. В частности, это может происходить в случае, если укороченная форма образуется вследствие аберрантного сплайсинга. Предпочтительно указанные дополнительные С-концевые последовательности состоят самое большое из 50, более предпочтительно самое большое из 30, даже более предпочтительно самое большое из 10, еще более предпочтительно самое большое из 4 или самое большое из 1 аминокислоты.
В одном очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма может состоять из аминокислот 1-684 SEQ ID N0: 7 (соответствующей SEQ ID N0:5 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение ячменя содержит ген, транскрибируемый в мРНК L0X-2, где указанная мРНК содержит нонсенс-кодон или стоп-кодон выше стоп-кодона мРНК L0X-2 дикого типа. Такой нонсенс-кодон в настоящем документе обозначают как преждевременный нонсенс-кодон. Предпочтительно все гены, транскрибируемые в мРНК, кодирующую L0X-2 указанного растения, содержат преждевременные нонсенс-кодон или стоп-кодон. Нонсенс-кодон или стоп-кодон предпочтительно расположены самое большое на 8 00, более предпочтительно самое большое на 750, даже более предпочтительно самое большое на 725, еще более предпочтительно самое большое на 700, даже более предпочтительно самое большое
на 690, еще более предпочтительно самое большое на 684 кодонов ниже стартового кодона. Последовательность дикого типа геномной ДНК, кодирующей LOX-2, приведена в SEQ ID NO: 5
(соответствующей SEQ ID N0:1 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355).
В очень предпочтительном варианте осуществления изобретения ген, кодирующий мутантный L0X-2 растения ячменя без двух L0X, содержит нонсенс-мутацию, где указанная мутация соответствует замене G^A в положении 2 68 9 SEQ ID N0: 5
(соответствующей SEQ ID N0:1 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355).
Растение ячменя по изобретению можно получать любым подходящим способом, известным специалисту в данной области, предпочтительно одним из способов, описанных ниже в настоящем документе в разделе "Получение ячменя без двух LOX-без ММТ". Потеря функциональности ММТ
Настоящее изобретение относится к растениям ячменя, или их частям, или их растительным продуктам, несущим первую мутацию, вторую мутацию и третью мутацию, где первая мутация приводит к полной потере функциональности L0X-1, а вторая мутация приводит к полной потере функциональности L0X-2, обе описаны выше в настоящем документе более подробно в разделе "Потеря функциональности L0X". Третья мутация приводит к полной потере функциональности ММТ.
Полная потеря функциональности ММТ может основываться на различных механизмах. Например, полная потеря функциональности ММТ может являться результатом нефункционирующего в указанном растении белка, т.е. нефункционирующего фермента ММТ, такого как мутантный белок ММТ с отсутствием детектируемой активности. Например, белок ММТ мутанта может представлять собой укороченный белок. Подобным образом потеря активности ММТ может быть основана на различных механизмах, например, может быть вызвана нефункционирующим белком ММТ.
Предпочтительно, активность мутантного белка ММТ определяют по его способности катализировать перенос метильной группы с SAM на Met, таким образом, формируя SMM. Это можно
проводить, например, как описано в примере 4 международной
патентной заявки PCT/DK2009/050315. Предпочтительно
аминокислотную последовательность мутантной ММТ получают, определяя транслируемую последовательность соответствующей выделенной кДНК ячменя. Это можно проводить по существу, как описано в примере 8 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315. Альтернативно мутантную ММТ растения ячменя по изобретению получают посредством гетерологической экспрессии в бактериальной клеточной культуре, как описано в примере 11 и примере 12 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, с последующим подтверждением того, что рекомбинантный белок является неактивным в качестве фермента ММТ.
Полную потерю функциональности ММТ можно обеспечить отсутствием белка ММТ. Отсутствие белка ММТ приводит к потере функции ММТ. Таким образом, растение ячменя может не содержать или содержать очень мало, предпочтительно недетектируемое количество белка ММТ. Присутствие или отсутствие белка ММТ можно детектировать любыми подходящими способами, известными специалисту в данной области. Однако белок(ки) предпочтительно анализируют способами, где белок ММТ детектируют специфическими антителами, распознающими ММТ. Указанные способы могут представлять собой, например, вестерн-блоттинг или твердофазный иммуноферментный анализ, а указанные специфические антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Однако предпочтительно указанные антитела являются поликлональными, распознающими несколько различных эпитопов на белке ММТ. Его также можно детектировать опосредованно, например, способами определения активности ММТ. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения считают, что растение ячменя несет мутацию в гене, кодирующем ММТ, таким образом вызывая полную потерю активности ММТ, когда в указанном растении белок ММТ не детектируют. В частности, это происходит в случае, когда в указанном растении, предпочтительно в зернах указанного растения ячменя, не детектируют белка ММТ с массой приблизительно 120 кДа ±10%, как анализируют посредством вестерн-блоттинга.
Полная потеря функциональности ММТ также может представлять собой результат отсутствия или очень небольшой, предпочтительно отсутствия, транскрипции мРНК ММТ. Специалисту очевидно, что отсутствие транскрипта ММТ также приводит к отсутствию белка ММТ.
Однако предпочтительно полная потеря функциональности ММТ является результатом экспрессии аберрантного транскрипта ММТ. Указанный транскрипт предпочтительно может являться результатом события аберрантного сплайсинга первичного транскрипта, например, вследствие мутации в участке сплайсинга. Экспрессию транскриптов, кодирующих ММТ можно детектировать, например, посредством нозерн-блоттинга или способами ОТ-ПЦР.
Полная потеря функциональности ММТ в растениях ячменя по
настоящему изобретению вызвана одной или несколькими мутациями.
Таким образом, растения ячменя по настоящему изобретению в
основном несут по меньшей мере одну мутацию в гене ММТ.
Указанная мутация(и) могут находиться в регуляторных областях,
например, в промоторе или интронах, или указанная мутация(и)
могут находиться в кодирующей белок области. Мутация также
может представлять собой делецию гена ММТ или его части,
например, делецию кодирующей области гена ММТ. Таким образом,
потерю функциональности ММТ также можно детектировать
посредством анализа мутаций в гене, кодирующем ММТ. Мутации в
кодирующем ММТ гене можно детектировать, например, посредством
секвенирования указанного гена, с последующим его сравнением с
последовательностью дикого типа, предпочтительно с
последовательностью дикого типа сорта Prestige, приведенной в SEQ ID N0:9 (соответствующей последовательности, приведенной в международной патентной заявке PCT/DK2009/050315 как SEQ ID N0:3), или с последовательностью сорта Sebastian (SEQ ID N0:11 соответствующая SEQ ID N0:16 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315). Предпочтительно после идентификации мутации потерю функциональности подтверждают посредством тестирования активности ММТ, например, как описано в примере 2 или примере 4 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315.
Термин "белок ММТ" предназначен для обозначения
полноразмерного белка ММТ ячменя как приведено в SEQ ID N0:13 (соответствующей SEQ ID N0:6 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315) или его функционального гомолога. В этом контексте функциональный гомолог представляет собой белок ММТ с тем же уровнем активности ММТ ±25%, как уровень активности белка ММТ ячменя как приведено в SEQ ID N0:13, где активность ММТ определяют, как описано в примере 2 или примере 4 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315.
Растение ячменя, несущее третью мутацию, вызывающую полную
потерю активности ММТ, может содержать нефункциональную
укороченную форму ММТ, например, укороченную на N-конце или на
С-конце форму. Растение ячменя может содержать более одной
укороченной формы ММТ, например, 2, или, например, 3, или,
например, более 3 различных укороченных форм ММТ, что может
являться результатом аберрантного сплайсинга транскриптов.
Указанные укороченные формы содержат только N-концевой фрагмент
ММТ. В дополнение к N-концевому фрагменту ММТ дикого типа,
указанные укороченные формы ММТ могут содержать дополнительные
С-концевые последовательности, не присутствующие в ММТ дикого
типа. Например, указанные дополнительные С-концевые
последовательности могут представлять собой транслированные
интронные последовательности, такие как интронные
последовательности, содержащиеся в мутантной мРНК вследствие аберрантного сплайсинга. Предпочтительно указанные укороченные формы ММТ содержат самое большое 500, более предпочтительно самое большое 450, даже более предпочтительно самое большое 400, еще более предпочтительно самое большое 350, даже более предпочтительно самое большое 32 0, еще более предпочтительно самое большое 311 или самое большое 288 N-концевых аминокислотных остатков SEQ ID N0:13 (соответствующей SEQ ID N0:6 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315). В частности это происходит в случае, когда у указанного растения ячменя происходит полная потеря активности ММТ. Однако ММТ также может содержать менее, например, не более 300, например, не более 250, например, не более 200, например, самое большое 150, например, не более 147 или не более 133 N-концевых
аминокислот SEQ ID N0:13 (соответствующей SEQ ID N0:6 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315).
В одном очень предпочтительном варианте осуществления, укороченная форма ММТ может состоять из аминокислот 1-311 или аминокислот 1-288 SEQ ID N0:13 (соответствующей SEQ ID N0:6 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315) и необязательно дополнительной С-концевой последовательности, не представленной в ММТ дикого типа. Предпочтительно указанная дополнительная С-концевая последовательности состоит самое большое из 50, более предпочтительно самое большое из 30, даже более предпочтительно самое большое из 10, еще более предпочтительно самое большое из 4 или самое большое из 1 аминокислоты. В очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма ММТ может представлять собой белок в соответствии с SEQ ID N0:11 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, или SEQ ID N0:13 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, или SEQ ID N0:15 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315. Ни один из белков SEQ ID N0:11, или SEQ ID N0:13, или SEQ ID N0:15 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315 не представляет собой функционального фермента ММТ.
В другом очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма ММТ может состоять из аминокислот 1-147 или аминокислот 1-133 SEQ ID N0: 14 (соответствующей SEQ ID N0:18 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315) и необязательно дополнительной С-концевой последовательности, не представленной в ММТ дикого типа. Предпочтительно указанные дополнительные С-концевые последовательности состоят самое большое из 50, более предпочтительно самое большое из 40, даже более предпочтительно самое большое из 39, или самое большое из 33, или самое большое из 30 аминокислот. В очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма ММТ может представлять собой белок, соответствующий SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16 или SEQ ID N0:17 (соответствующей SEQ ID N0:22, или SEQ ID N0:24, или SEQ ID N0:26 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, соответственно). Ни один из белков
SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16 или SEQ ID N0:17 (соответствующих SEQ ID N0:22, или SEQ ID N0:24, или SEQ ID N0:26 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, соответственно) не являются функциональными ферментами ММТ.
Указанные выше укороченные формы ММТ могут быть представлены, например, в растениях ячменя, несущих мутацию в гене ММТ, где указанная мутация вносит преждевременный стоп-кодон, образующийся в гене, кодирующем указанную выше укороченную форму ММТ.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение ячменя содержит ген ММТ, транскрибируемый в мРНК, которая содержит часть, но не весь, ген ММТ дикого типа, сплайсируемую без прерывания (интрон-экзонная структура гена ММТ дикого типа ячменя представлена на фиг. 9 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315). Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительно, чтобы мРНК ММТ растения ячменя по изобретению содержала самое большое экзоны 1, 2, 3, 4 и 5, сплайсированные вместе без прерывания, или, например, самое большое экзоны 1 и 2, сплайсированные вместе без прерывания. В дополнение к указанным сплайсированным вместе экзонам мРНК ММТ растения ячменя по изобретению может содержать дополнительные 3'-концевые последовательности, происходящие из интронов и/или экзонов дикого типа, где интроны разделяют последовательности экзонов. Предпочтительные примеры аберрантной мРНК ММТ растений ячменя по изобретению, как определено посредством ОТ-ПЦР и, таким образом, с длинами фрагментов в п.н., проиллюстрированы на фиг. 12 и фиг. 16 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315. Более предпочтительно аберрантные мРНК растений ячменя по изобретению являются мРНК, проиллюстрированные на фиг. 12 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, дополнительно содержащая экзоны 1 и 2 на 5'-конце, или мРНК, проиллюстрированная на фиг. 16 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, дополнительно содержащая экзон 1 на 5'-конце.
В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего
изобретения растение ячменя, несущая третью мутацию в гене ММТ, вызывающую полную потерю функциональности ММТ, несет мутацию в участке сплайсинга в гене ММТ, которая приводит к аберрантно сплайсированной мРНК. Более предпочтительно указанная мутация расположена в интроне гена ММТ, даже более предпочтительно в 5'-участке сплайсинга интрона, например, в 5'-участке сплайсинга интрона 1 (интрон, разделяющий экзоны 1 и 2), например, в 5'-участке сплайсинга интрона 2 (интрон, разделяющий экзоны 2 и 3), например, в 5'-участке сплайсинга интрона 3 (интрон, разделяющий экзоны 3 и 4), например, в 5'-участке сплайсинга интрона 4 (интрон, разделяющий экзоны 4 и 5), например, в 5'-участке сплайсинга интрона 5 (интрон, разделяющий экзоны 5 и б), например, в 5'-участке сплайсинга интрона б (интрон, разделяющий экзоны б и 7), наиболее предпочтительно в 5'-участке сплайсинга интрона 2 или интрона 5.
Предпочтительно, чтобы указанная мутация представляла собой мутацию G^A концевого 5'-основания указанных выше интронов. Таким образом, очень предпочтительной мутацией является мутация G^A концевого 5'-основания интрона 2, или мутация G^A концевого 5'-основания интрона 5.
Растение ячменя по изобретению можно получать любым подходящим способом, известным специалисту в данной области, предпочтительно способом, описанным ниже в настоящем документе в разделе "Получение ячменя без двух LOX-без ММТ".
Получение ячменя без двух LOX-без ММТ
Растение ячменя по изобретению можно получать любым подходящим способом, известным специалисту в данной области. Предпочтительно, растение ячменя по изобретению получают способом, включающим этапы мутагенеза растения ячменя или его частей, например, зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором растения ячменя, характеризующегося полной потерей функциональности L0X-1, полной потерей функциональности L0X-2 и/или полной потерей функциональности ММТ.
Растения ячменя по изобретению несет по меньшей мере 3 мутации. Таким образом, растения можно получать, получая
отдельные растения ячменя, несущие только одну из мутаций, а затем скрещивая указанные растения ячменя с получением растения ячменя со всеми 3 мутациями, или посредством последовательного введения мутаций в растение ячменя, или посредством комбинации этих способов.
Таким образом, растение ячменя по изобретению можно
получать посредством мутагенеза растения ячменя или его частей,
например, зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором
растений ячменя, характеризующихся полной потерей
функциональности L0X-1, и мутагенеза другого растения ячменя или его частей, например, зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности L0X-2, и мутагенеза еще одного растения ячменя или его частей, например, зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности ММТ. Затем отобранные растения ячменя можно скрещивать в несколько раундов с получением растений ячменя, несущих все три мутации.
Альтернативно растение ячменя по настоящему изобретению можно получать посредством мутагенеза растений ячменя или их частей, например, зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности XX. Указанные отобранные растения ячменя необязательно можно выращивать, а затем эти растения ячменя, или их части, например, зерна ячменя, можно подвергать мутагенезу с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности YY. Указанные отобранные растения ячменя или их части необязательно можно выращивать, а затем:
(i) эти растения ячменя, или их части, например, зерна
ячменя, можно подвергать мутагенезу, с последующим скринингом и
отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей
функциональности ZZ; или
(ii) эти растения ячменя можно скрещивать с растением
ячменя, характеризующимся полной потерей функциональности ZZ.
В указанных выше скрещиваниях каждый из XX, YY и ZZ
обозначает LOX-1, LOX-2 или ММТ, где XX отличается от YY, отличающегося от ZZ.
В одном предпочтительном варианте осуществления растение ячменя можно получать способом, включающим мутагенез растений ячменя или их частей, например, зерен ячменя, где указанные растения ячменя уже несут мутацию, вызывающую полную потерю функциональности фермента L0X-1, с последующим скринингом и отбором растений ячменя, дополнительно несущих мутацию, вызывающую полную потерю функциональности L0X-2 (т.е. растений без LOX-1-без L0X-2, или без двух LOX). Кроме того, этот способ включает мутагенез других растений ячменя или их частей и скрининг и отбор растений ячменя с полной потерей функциональности ММТ, а затем скрещивания этих растений ячменя с растениями ячменя без LOX-1-без L0X-2.
Подходящие растения ячменя без L0X-1 описаны, например, в международной патентной заявке W0 2005/087934.
Предпочтительно, чтобы в способе скрининга в качестве исходного материала для идентификации растений ячменя, характеризуемых полной потерей функциональности LOX-2, использовались проросшие зародыши. Примечательно, что авторы настоящего изобретения на основе скрининга 21000 зрелых зародышей, который не выявил ни одного мутанта ячменя без LOX-2, выявили, что использования в качестве исходного материала для скрининга активности LOX-2 зрелых зародышей менее предпочтительно.
Задачей настоящего изобретения является предоставление способов получения растений ячменя без двух LOX-без ММТ включающих этапы: (i) получения растения ячменя без двух LOX и (ii) получение растения ячменя без ММТ; (iii) скрещивание указанных растений ячменя без двух LOX и указанного растения ячменя без ММТ; (iv) отбор растений ячменя без двух LOX-без ММТ.
Получение указанных растений ячменя без двух LOX предпочтительно можно проводить способом, включающим этапы:
(i) предоставления растений ячменя или их частей с полной потерей функциональной активности LOX-1, например, полной
потерей функциональности фермента L0X-1; и
(ii) мутагенеза указанного растения ячменя, и/или клеток ячменя, и/или ткани ячменя, и/или зерен ячменя, и/или зародышей ячменя из указанного растения ячменя, таким образом, получая поколение МО ячменя; и
(iii) размножения указанных растений ячменя, зерен и/или зародышей, подвергнутых мутагенезу, в течение по меньшей мере 2 поколений, таким образом, получая поколение Мх растений ячменя, где х представляет собой целое число ^2; и
(iv) получения зародышей указанных растений ячменя Мх; и
(v) проращивания указанных зародышей; и
(vi) определения в указанных проросших зародышах или их
частях активности L0X-1 и L0X-2; и
(vii) отбора растений с полной потерей в проросших зародышах активности L0X-1 и активности L0X-2; и
(viii) анализа наличия мутаций в гене L0X-1 и в гене LOX-
2; и
(ix) отбора растения, несущих мутацию в гене L0X-1 и гене
L0X-2, т.е. растений без двух LOX;
таким образом, получая растение ячменя, несущее мутации в генах L0X-1 и L0X-2, вызывающие полную потерю функциональности L0X-1 и функциональности L0X-2.
Получение указанных растений ячменя без ММТ предпочтительно можно проводить способом, включающим этапы:
(i) мутагенеза растений ячменя, и/или клеток ячменя, и/или
ткани ячменя, и/или зерен ячменя, и/или зародышей ячменя, таким
образом, получая поколение МО ячменя; и
(ii) размножения, например, посредством размножения, указанных растений, зерен и/или зародышей ячменя, подвергнутых мутагенезу, в течение ^2 поколений, получая, таким образом, растения ячменя поколения Мх, где х представляет собой целое число ^2; и
(iii) получения образца указанных растений ячменя Мх; и
(iv) определения уровня SMM в указанном образце; и
(v) отбор растений, где образец содержит менее 10 млрд.д. SMM, предпочтительно менее 5 млрд.д. SMM, более предпочтительно
(iv)
не содержит детектируемого SMM; и
(vi) секвенирование по меньшей мере части гена ММТ; и
(vii) отбор растений, несущих мутации в гене ММТ. Указанное выше растение ячменя с полной потерей активности
L0X-1 может представлять, например, собой любое из растений ячменя с полной потерей активности L0X-1, описанное в W0 2005/087934, предпочтительно мутант D112 или его растения-потомки .
Этапы мутагенеза в указанных выше способах могут включать мутагенез жизнеспособного материала, выбранного из группы, состоящей из растений ячменя, клеток ячменя, ткани ячменя, зерен ячменя и зародышей ячменя, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из растений ячменя, зерен ячменя и зародышей ячменя, более предпочтительно зерен ячменя.
Мутагенез можно проводить любым подходящим способом. В одном из вариантов осуществления мутагенез проводят, инкубируя растение ячменя или его части, например, зерна ячменя или отдельные клетки ячменя, - с мутагенезирующим средством. Указанное средство известно специалисту в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров азид натрия (NaN3) , этилметансульфонат (EMS), азидоглицерин (AG, 3-азидо-1,2-пропандиол), метилнитрозомочевину (MNU) и малеиновый гидразид (МН).
В другом варианте осуществления мутагенез проводят посредством облучения, например, посредством УФ, растения ячменя или его частей, таких как зерно. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения мутагенез проводят любым из способов, описанных ниже в настоящем документе в разделе "Химический мутагенез". Неограничивающий пример подходящего протокола мутагенеза приведен в примере 2 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355.
Предпочтительно, чтобы мутагенез проводили таким образом, чтобы ожидаемая частота желаемых мутантов составляла по меньшей мере 0,5, например, в диапазоне от 0,5 до 5, например, в диапазоне от 0,9 до 2,3 на 10000 зерен при скрининге ячменя поколения МЗ. В предпочтительном варианте осуществления
мутагенез проводят на зернах ячменя. Зерна, к которым применяли мутаген, обозначают как поколение МО (также см. фиг. 8).
Активность LOX можно определять в образце, состоящем из прорастающего зародыша ячменя, предпочтительно в жидком экстракте из прорастающего зародыша ячменя. Указанный образец, такой как указанный экстракт, можно получать из любой подходящей части указанного прорастающего зародыша. В основном, перед получением экстракта указанного образца и определения активности L0X-2 образец ячменя необходимо гомогенизировать любым подходящим способом. В частности, предпочтительно, чтобы экстракт белка получали из прорастающего зародыша или его частей и чтобы активность определяли LOX с использованием указанного экстракта. Гомогенизацию можно проводить, например, с использованием механических сил, например, посредством встряхивания или перемешивания, например, посредством встряхивания в присутствии гранул, таких как стеклянные гранулы или песок.
В предпочтительном варианте осуществления прорастающий зародыш представляет собой зародыш поколения Мх, где х представляет собой целое число ^2; предпочтительно х представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 10, более предпочтительно в диапазоне от 3 до 8. В очень предпочтительном варианте осуществления активность LOX определяют в прорастающих зародышах поколения МЗ или в образце, получаемом из таких зародышей. В этом варианте осуществления предпочтительно, чтобы подвергнутые мутагенезу зерна ячменя поколения МО выращивали с получением растений ячменя, которые скрещивают с получением зерен поколения Ml. Процедуру повторяют до получения зерен поколения МЗ (также см. фиг. 8).
Определение активности LOX можно проводить с использованием любого подходящего анализа, предпочтительно одним из способов, описанных далее в настоящем документе. В частности, предпочтительно, чтобы анализ предоставлял данные об диоксигенации линолевой кислоты до 9-HPODE и 13-HPODE под действием L0X-1 и LOX-2. Таким образом, в основном, анализ включает этапы:
(i) предоставления белкового экстракта, получаемого из проросших зародышей ячменя или их частей; и
(ii) предоставления линолевой кислоты; и
(iii) инкубации указанного белкового экстракта с указанной
линолевой кислотой; и
(iv) детекции диоксигенации линолевой кислоты до 9-HP0DE и
13-HP0DE.
Этап (iv) способа предпочтительно включает определение уровня 9-HP0DE и 13-HP0DE в указанных прорастающих зародышах, предпочтительно в белковом экстракте, получаемом из указанных прорастающих зародышей. Этап может включать прямое и опосредованное определение уровней 9-HP0DE и 13-HP0DE. Можно определять общий уровень всех HPODE, в случае чего предпочтительно, чтобы проводились измерения конкретных 9-HP0DE и 13-HP0DE для подтверждения. Например, один из способов может представлять собой способ, где белковые экстракты из прорастающих зародышей инкубируют с линолевой кислотой в качестве субстрата для образования 9-HP0DE и 13-HP0DE. Затем различными способами детектируют указанные HPODE. Один из способов может включать образование детектируемого соединения, такого как краситель. Например, способ может представлять собой окислительное связывание 3-диметиламинобензойной кислоты и 3-метил-2-бензотиазолинонгидразона в присутствии гемоглобина, катализируемое образуемыми HPODE с формированием индаминового красителя, который можно измерять при А595 с использованием спектрофотометра. Пример такого способа описан в примерах 1 и 2 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355. При использовании этого анализа показатели поглощения менее 0,2 единиц А595 рассматривают как показатель отсутствия активности LOX-1 и L0X-2. Однако более точным способом определения активности LOX-1 и LOX-2 представляет собой инкубацию белкового экстракта из прорастающих зародышей с линолевой кислотой с последующим определением содержания 9-HPODE и 13-HPODE. Например, содержание 9-HPODE и 13-HPODE можно определять с использованием основанного на ВЭЖХ анализа.
Диоксигенацию линолевой кислоты до 9-HPODE и 13-HPODE
можно измерять прямо или опосредованно. По настоящему изобретению можно использовать любой подходящий способ детекции. В одном из вариантов осуществления изобретения детектируют гидропероксиды линолевой кислоты. 9-HP0DE и 13-HPODE можно детектировать прямо, например, хроматографическими способами, такими как ВЭЖХ, как описано в примере 4 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355.
В настоящем изобретении описано, что для определения активности LOX большую важность имеют определенные аспекты способа экстракции белка из прорастающего зародыша. Таким образом, предпочтительно, чтобы белок экстрагировали с использованием кислотного буфера, предпочтительно буфера с рН в диапазоне от 2 до б, более предпочтительно в диапазоне от 3 до 5, даже более предпочтительно в диапазоне от 3,5 до 5, еще более предпочтительно в диапазоне от 4 до 5, даже более предпочтительно с рН 4,5. Буфер, используемый для экстракции, предпочтительно основан на органической кислоте, более предпочтительно буфер основан на молочной кислоте. Наиболее предпочтительно белковый экстракт получают с использованием буфера 100 мМ молочной кислоты, рН 4,5.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения описаны способы детекции растений без LOX-1 и без LOX-2, которые включают реакцию 9-HPODE и 13-HP0DE с красителем, например, З-метил-2-бензотиазолинонгидразоном. Предпочтительно, указанный краситель, например, З-метил-2-бензотиазолинонгидразон, добавляют в белковый экстракт после добавления линолевой кислоты. Предпочтительно, краситель добавляют по меньшей мере через 1 мин, более предпочтительно по меньшей мере через 5 мин, даже более предпочтительно по меньшей мере через 10 мин, например, в диапазоне от 1 до 60 мин, например, в диапазоне от 5 до 30 мин, например, в диапазоне от 10 до 20 мин после контакта белкового экстракта с линолевой кислотой.
Предпочтительные способы отбора растений ячменя по изобретению подробно описаны в примере 2 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355.
Процедуру отбора можно адаптировать для процедур анализа на основе микропланшетов для титрования, или для других известных воспроизводимых, высокопроизводительных форматов анализа, обеспечивающих быстрый скрининг множества образцов. Предпочтительно, чтобы на активность LOX-1 и LOX-2 анализировали по меньшей мере 5000, например, по меньшей мере 7 500, например, по меньшей мере 10000, например, по меньшей мере 15000, например, по меньшей мере 2 0000, например, по меньшей мере 25000 подвергнутых мутагенезу растений ячменя.
Определение мутации в гене, кодирующем LOX-1 можно
проводить несколькими различными способами. Например, ген LOX-1
можно полностью или частично секвенировать, и
последовательность сравнивать с SEQ ID N0:1 (соответствующей SEQ ID N0:1 WO 2005/087934) или SEQ ID N0:5 WO 2005/087934. Если производится поиск конкретной мутации, можно использовать анализ SNP. Специалист может сконструировать подходящие праймеры для детекции данной конкретной мутации, такой как мутации, приводящей к преждевременному стоп-кодону в кодирующей последовательности LOX-1 (например, любого из преждевременных стоп-кодонов, описываемых выше в настоящем документе). Один из примеров того, как проводить анализ SNP, описан в примере 10 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355 с праймерами, пригодными для детекции мутации G^A в положении нуклеотида 34 7 4 гена LOX-1.
Определение мутации в гене, кодирующем LOX-2, можно
проводить несколькими различными способами. Например, ген LOX-2
можно полностью или частично секвенировать, и
последовательность сравнивать с SEQ ID N0:5 (соответствующей SEQ ID N0:1 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355). Если производится поиск конкретной мутации, можно использовать анализ SNP. Специалист может сконструировать подходящие праймеры для детекции данной конкретной мутации, такой как мутации, приводящей к преждевременному стоп-кодону в кодирующей последовательности LOX-2 (например, любого из преждевременных стоп-кодонов, описываемых выше в настоящем документе). Один из примеров того, как проводить анализ SNP, описан в примере 10
международной патентной заявки PCT/DK2009/050355, вместе с праймерами, подходящими для детекции мутации G^A в положении нуклеотида 2689 гена L0X-2.
Также в настоящее изобретении включено, что этапы (viii) и (ix) способа получения растение ячменя без двух LOX, как подробно описано в разделе настоящего документа выше, можно проводить до этапов (vi) и (vii), в случае чего способ включает этапы (i), (ii), (iii), (iv), (v), (viii), (ix), (vi) и (vii) в этом порядке. В частности, это может происходить в случае, поиска конкретной мутации, например, в растениях-потомках, уже идентифицированного растения ячменя без двух LOX.
Предпочтительно отбор растений ячменя с полной потерей функциональности ММТ включает получение образца из подвергнутых мутагенезу растений ячменя, предпочтительно из прорастающего подвергнутого мутагенезу растения ячменя, даже более предпочтительно из подвергаемых мутагенезу растений ячменя, которые прорастали в течение 4 суток. Предпочтительно, чтобы образец представлял собой образец из колеоптиля и/или первичного листа, предпочтительно из листа. Таким образом, образец может находиться, например, в диапазоне от 1 см 3 см ткани листа.
Образец можно экстрагировать и анализировать в соответствии с вновь разработанным многоэтапным протоколом, как описано в настоящем документе, включающим последовательное применение различных растворителей и связывающих веществ. В основном, образец можно экстрагировать, например, растворителем или смесью растворителей, предпочтительно водой и/или органическими растворителями. Органический растворитель может представлять собой, например, спирт, предпочтительно метанол, или органический растворитель может представлять собой, например, алкилгалогенид, предпочтительно хлороформ. В одном предпочтительном варианте осуществления, растворитель представляет собой смесь воды, метанола и хлороформа. Указанную экстракцию преимущественно можно проводить при смешивании, например, с использованием шейкера или мешалки. В смесь растворитель/образец можно добавлять твердую подложку,
например, гранулы, такие как стеклянные гранулы.
В предпочтительном варианте осуществления указанный выше образец листа для определения активности ММТ получают из поколения зерен Мх, где х представляет собой целое число ^2, предпочтительно в диапазоне от 2 до 10, более предпочтительно в диапазоне от 3 до 8. В очень предпочтительном варианте осуществления, уровень SMM определяют в проросших растениях МЗ или в их образцах (таких как листья). В указанном варианте осуществления предпочтительно, чтобы подвергнутые мутагенезу зерна ячменя поколения МО выращивали с получением растений ячменя, которые затем скрещивают с получением зерен поколения Ml. Процедуру повторяют до получения зерен поколения МЗ (см. фиг. 8).
Определение уровня SMM предпочтительно основано на новом способе, описанном ниже. Примечательно, что этот способ предусматривает высокопроизводительный скрининг, делая возможным идентифицировать растения ячменя, характеризующиеся полной потерей функциональности ММТ.
В основном, способ предпочтительно включает реакцию образца или, предпочтительно, экстракта указанного образца, полученного, как описано выше, с соединением, способным связывать SMM. Выявлено, что для определения уровней SMM особенно пригоден реагент ОРА (Sigma, кат. № Р7914; см. фиг. 2 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315), далее в настоящем документе просто обозначаемый как ОРА. ОРА среди других реагирует с SMM с образованием молекулы, обозначаемой как SMM-OPA (см. фиг. 2 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315). Реакция предпочтительно включает инкубацию ОРА с экстрактом образца, получаемого, как описано выше. Кроме того, предпочтительно, чтобы в реакционную смесь добавляли 3-меркаптопропионовую кислоту. Смесь предпочтительно поддерживают при щелочном рН, предпочтительно в диапазоне от рН 8 до рН 11, более предпочтительно в диапазоне от рН 9 до рН 11, даже более предпочтительно в диапазоне от рН 9,5 до рН 10,5, например, при рН 10. Инкубацию предпочтительно проводят при температуре в
диапазоне от 0°С до 10°С, предпочтительно в диапазоне от 1°С до 8°С, даже более предпочтительно в диапазоне от 2°С до б°С, еще более предпочтительно в диапазоне от 3°С до 5°С, например, при 4°С. Время инкубации предпочтительно составляет > 10 мин.
На основе наблюдения того, что SMM-OPA поглощает и испускает свет при 340 нм и 450 нм, соответственно, его детекция возможна при использовании флуоресцентной спектроскопии. Исходный процесс детекции предпочтительно включает разделение экстракта на колонке, предпочтительно на колонке 30x2 мм Gemini Зц С18 (Phenomenex, кат. № 00А-4439-80; Phenomenex, 2006) с последующей детекцией флуоресценции с использованием системы высокопроизводительной жидкостной хроматографии, предпочтительно сверхэффективной жидкостной хроматографии (система СЭЖХ, Waters), разработанной для идентификации и измерения уровня флуоресценции молекул с возбуждением при 34 0 нм и испусканием при 4 50 нм. При использовании этого способа "отсутствие детектируемого SMM" означает отсутствие детектируемых соединений, которые совместно элюируются с SMM. В этом контексте, малое "плечо" на пике на хроматограмме считают артефактным пиком. Таким образом, малое плечо справа от пика Asn/Ser, см. фиг. 2, не считают представлением пика SMM. Таким образом, в качестве примера, две верхние хроматограммы, как приведено на фиг. 2В, рассматривают, как изображающие "отсутствие детектируемого SMM", тогда как нижняя хроматограмма на указанной фигуре представляет собой разделение образца, содержащего SMM.
Детекцию SMM предпочтительно можно проводить, как описано в примере 2 или примере 4. Предпочтительный способ отбора растений ячменя по изобретению описан ниже в настоящем документе в примере 2. Образец ткани для анализа предпочтительно получают из прорастающего растения ячменя, даже более предпочтительно из растения ячменя, которое прорастало в течение 4 суток. Следует отметить, что указанный выше способ скрининга является особенно пригодным. Во-первых, этот аналитический способ является новым. Кроме того, значимым
преимуществом указанного выше способа является то, что он разработан для определения уровней SMM в прорастающих растениях ячменя, например, в листьях прорастающих растений ячменя. Временные характеристики получения образцов из прорастающих растений ячменя приводят к получению неожиданно чистых препаратов для детекции SMM на основе СЭЖХ. Другие образцы, например, образцы сусла из сходных зерен, как описано выше, являются слишком сложными по составу и, как правило, их нельзя использовать в указанном способе хроматографии для определения уровней SMM.
После идентификации растений ячменя, содержащих менее 10 млрд.д. SMM, предпочтительно, не содержащих детектируемого SMM, соответствующий ген ММТ или его часть, как правило, секвенируют для определения того, можно ли классифицировать интересующее растение ячменя как содержащее мутацию в гене ММТ. Затем отбирают растения ячменя, характеризующиеся тем, что они не содержат детектируемого SMM, и в них одно или несколько оснований кодирующего ММТ гена отличаются по сравнению с последовательностью дикого типа. В этом контексте последовательность дикого типа предпочтительно представляет собой последовательность, приведенную как SEQ ID N0:9 (соответствующую SEQ ID N0:3 в международной патентной заявке PCT/DK2009/050315). Предпочтительные мутации описаны выше в настоящем документе.
Затем отобранные мутанты ячменя можно выращивать, и растения последующих поколений можно подвергать повторному скринингу на предмет содержания SMM. После отбора подходящих растений ячменя их можно включать в программы селекции с использованием общепринятых способов, описанных в настоящем документе ниже в разделе "Селекция растений".
После идентификации растения ячменя без двух LOX-без ММТ, содержащего конкретную мутацию в гене L0X-1, и конкретную мутацию в гене L0X-2, и конкретную мутацию в гене ММТ (такие как любые из указанных выше мутаций), общепринятыми способами селекции, такими как способы, хорошо известные специалистам, можно получать дополнительные растения ячменя с идентичными
мутациями. Например, указанные растения ячменя без двух LOX можно подвергать возвратному скрещиванию с другим сортом ячменя.
После отбора подходящих растений ячменя с полной потерей функциональности LOX-1, L0X-2 и ММТ, можно необязательно проводить один или несколько дополнительных скринингов. Например, отобранные мутанты можно дополнительно выращивать и растения новых поколений можно тестировать на полную потерю функциональности LOX-1, L0X-2 и ММТ.
В одном из вариантов осуществления изобретения предпочтительно, чтобы растение ячменя без двух LOX-без ММТ по настоящему изобретению обладало физиологией роста растения и развитием зерен, сходными с ячменем дикого типа. Таким образом, предпочтительно, чтобы растение ячменя без двух LOX-1-без ММТ в отношении высоты растения, количества отростков на растение, начала цветения и/или количества зерен на колос было сходным с ячменем дикого типа (предпочтительно с сортом Power, или сортом Quench, или сортом Rosalina).
Также предпочтительно, чтобы растение ячменя без двух LOX-без ММТ по настоящему изобретению в отношении высота растения, срока образования колоса, устойчивости к заболеваниям, полегания, раскрытия колоса, времени созревания и урожайности было сходно с ячменем дикого типа, в частности сходно с сортом Power или сортом Quench. В настоящем контексте "сходно" следует понимать как такое же ±10% в случае чисел. Эти параметры можно определять, как описано в настоящем документе далее в примере 5.
В очень предпочтительном варианте осуществления изобретения растение ячменя получают скрещиванием ячменя линии А689 (АТСС Patent Deposit Designation: РТА-9640) с ячменем линии 8063 (АТСС Patent Deposit Designation: РТА-9543) и необязательно с последующим дополнительным размножением.
Семена ячменя линии А68 9 депонированы 4 декабря 2 00 8 под названием "Barley, Hordeum vulgare L. ; Line A689" в American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, United States (номер
депозита РТА-9640).
Семена ячменя линии 8 0 63 депонированы 13 октября 2 008 в American Type Culture Collection (АТСС), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, United States, и обозначены как "Barley, Hordeum vulgare; Line 8063" (ATCC Patent Deposit Designation: PTA-9543).
Химический мутагенез
Для получения растений ячменя без двух LOX-без ММТ по настоящему изобретению получают очень большое количество мутантов ячменя, как правило, в несколько раундов, любым подходящим способом мутагенеза, например, с использованием химического мутагенеза зерен ячменя. Известно, что этот способ вносит случайные мутации. Мутагенез ячменя можно проводить с использованием любого химического средства, обеспечивающего мутагенез. Однако предпочтительно проводить его, обрабатывая зерна NaN3, обеспечивая размножение выживших зерен, с последующим анализом растений-потомков. Поколение растений, вырастающее из подвергнутых мутагенезу зерен, обозначаемое как МО, содержит химерные гетерозиготы для любой данной мутации. Растения-потомки, собранные после самоопыления, обозначают как поколение Ml, в котором данная мутация сегрегирует на соответствующие гетерозиготы и гомозиготы (см. фиг. 8).
Обработка зерен NaN3 не является эквивалентом обработки одной клетки, так как зерна после обработки сохраняют некоторые немутантные клетки и ряд клеток, несущих мутации ДНК. Так как мутации в линиях клеток, не приводящих к зародышевой линии, теряются, целью является доставка мутагена к тем немногим клеткам, которые развиваются в репродуктивные ткани, участвующие в развитии поколения Ml.
Для оценки общей эффективности мутагенеза в поколениях МО и Ml можно подсчитывать химеры-альбиносы и растения-альбиносы. Оценка количества мутантов как функции от выживших растений дает расчет эффективности мутагенеза, тогда как оценка количества мутантов как функции от обработанных семян измеряет комбинацию эффективности мутагенеза и гибели зерен.
Примечательно, что клетки имеют механизмы гарантии
качества практически на каждой стадии экспрессии гена, возможно, для ослабления действия повреждающих мутаций. Один из хорошо изученных примеров у эукариот представляет собой опосредованный нонсенс-кодонами распад мРНК, обозначенный NMD, который предотвращает синтез потенциально вредных, преждевременно укороченных белков (Maquat and Carmichael, 2 001; Wu et al. , 2007) . При NMD, кодон терминации идентифицируется как преждевременный по его положению относительно расположенных ниже дестабилизирующих элементов. Мутации, которые приводят к преждевременным кодонам терминации (нонсенс-кодонам) (РТС), иногда повышают уровень транскриптов с альтернативным сплайсингом, которые пропускают повреждающие мутации, таким образом, потенциально сохраняя функцию белка (Mendell and Dietz, 2001).
Селекция растений
В одном из вариантов осуществления изобретения задачей является предоставление агрономически пригодных растений ячменя, несущих признак без двух LOX-без ММТ. Часто разработка сельскохозяйственных культур представляет собой длительный и сложный процесс, начинающийся с введения нового признака. Однако с точки зрения растениевода-селекционера этот этап почти всегда приводит к получению растения с менее желательным общим профилем агрономических признаков, чем современные коммерческие разновидности.
В дополнение к признаку без двух LOX-без ММТ существуют дополнительные факторы, которые также можно учитывать в области получения коммерческой разновидности ячменя, пригодной для соложения и/или пивоварение и/или в качестве основы для напитков, например, урожай и размер зерна и другие параметры, относящиеся к эффективности соложения или эффективности пивоварения. Так как показано, что многие, если не все, значимые признаки находятся под генетическим контролем, настоящее изобретение также относится к современным, гомозиготным, высокоурожайным осолаживаемыми сортам ячменя, которые можно получать посредством скрещивания с растениями ячменя без двух LOX-без ММТ, которые описаны в настоящей
публикации. Специалист-селекционер ячменя может отбирать и разрабатывать растения ячменя, которые после скрещивания с ячменем без двух LOX-без ММТ ячмень, приведут к высококачественным сортам. Альтернативно, селекционер ячменя может использовать растения по настоящему изобретению для дальнейшего мутагенеза с получением новых сортов, происходящих из ячменя без двух LOX-без ММТ.
Одним из способов обеспечения поддержания признака без двух LOX-без ММТ в линиях-потомках относится к анализу SNP гена L0X-1, гена L0X-2 и гена ММТ. Предпочтительно также определяют активность LOX-1, L0X-2 и ММТ.
Растения ячменя по настоящему изобретению можно вводить в любую подходящую схему селекции.
Другой задачей настоящего изобретения является предоставление агрономически элитных растений ячменя, несущих признак без двух LOX-без ММТ. Таким образом, изобретение также относится к способам получения нового растения ячменя без двух LOX-без ММТ посредством скрещивания первого родительского растения ячменя со вторым родительским растением ячменя, где первое или второе растения представляют собой ячмень без двух LOX-без ММТ. Кроме того, первое и второе родительские растения ячменя могут происходить из сорта ячменя без двух LOX-без ММТ. Таким образом, любые такие способы с использованием сорта ячменя без двух LOX-без ММТ являются частью настоящего изобретения: самоопыление, возвратное скрещивание, скрещивание по популяциям и т.п. Все растения, получаемые с использованием сорта ячменя без двух LOX-без ММТ в качестве родителя, входят в объем настоящего изобретения, включая растения, разработанные из сортов, получаемых из сорта ячменя без двух LOX-без ММТ. Ячмень без двух LOX-без ММТ также можно использовать для генетической трансформации в таких случаях, где в растение или ткань растения без двух LOX-без ММТ вводят экзогенную ДНК и экспрессируют.
В настоящем изобретении для введения в другой сорт, например, сорт Scarlett, или сорт Jersey, или сорт Quench, или сорт Rosalina, которые являются современными, высокоурожайными
осолаживаемыми сортами ячменя, признака мутантного растения ячменя без двух LOX-без ММТ, можно использовать способы возвратного скрещивания. В стандартном протоколе возвратного скрещивания исходный интересующий сорт, т.е. рекуррентное родительское растение, скрещивают со вторым сортом (нерекуррентное родительское растение), несущим интересующие мутантные гены LOX для переноса. Затем получаемые после этих скрещиваний растения-потомки без двух LOX скрещивают с рекуррентным родительским растением, с повторением процесса до получения растений ячменя, где в дополнение к признаку без двух LOX-без ММТ нерекуррентного родительского растения в получаемом растении восстановлены по существу все характеристики, определяемые рекуррентным родителем. Затем, последнее полученное подвергнутое возвратному скрещиванию растение подвергают самоопылению с получением чистого селекционного растения-потомка без двух LOX-без ММТ.
Способ ускорения процесса селекции растений включает исходное размножение получаемых мутантов посредством использования тканевой культуры и способов регенерации. Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предоставлены клетки, которые после роста и дифференцировки дают растения ячменя с признаком без двух LOX-без ММТ. Например, размножение может включать традиционное скрещивание с получением растений, происходящих из фертильных пыльников, или использование способов культивирования микроспор.
Продукты пути LOX
В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к растениям ячменя и их продуктам, содержащим низкие уровни T2N и потенциала T2N. Ферменты LOX катализируют диоксигенацию полиненасыщенных жирных кислот с цис-1,цис-4-пентадиеновой системой. В ячмене основными субстратами LOX являются С18-полиненасыщенные жирные кислоты линолевая кислота (18:2А9,12) и а-линоленовая кислота (18 : 3А9'12'15) . Липоксигеназный путь метаболизма жирных кислот ингибируется добавлением молекулярного кислорода в положение С-9 (в основном катализируемым L0X-1) или положение С-13 (в основном
катализируемым LOX-2) ацильной цепи, с получением
соответствующих 9- и 13-HPODE [9- и 13-
гидропероксиоктадекатриеновые кислоты (НРОТЕ) являются
продуктами, когда субстратом является а-линоленовая кислота, но НРОТЕ не функционируют в качестве предшественников для T2N] . В гидропероксидлиазной ветви пути LOX, 9- и 13-HPODE могут расщепляться до короткоцепочечных оксокислот и альдегидов (см. фиг. 1А) . В частности, 9-HPODE может расщепляться с формированием цис-ноненаля, который преобразуется в T2N, тогда как 13-HPODE представляет собой предшественника 2-Е-гексеналя. Таким образом, 13-HPODE, основной продукт катализируемой LOX-2 диоксигенации линолевой кислоты, не является предполагаемым предшествующим компонентом в пути, приводящем к формированию затхлого вкуса T2N.
Следует понимать, что настоящее изобретение относится к влиянию на получение последующих метаболитов катализа LOX-1 и LOX-2, которые не являются прямыми продуктами катализируемых LOX-1 или L0X-2 реакций, но являются результатом последующего каскада реакций. Они включают самопроизвольные, индуцируемые факторами или катализируемые ферментами изомеризации и преобразования. Таким образом, на образование этих последующих метаболитов можно влиять, изменяя экспрессию других компонентов пути, например, гидропероксидлиазы (HPL).
T2N и DMS и их предшественники
Настоящее изобретение относится к способам получения напитков с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников. Предпочтительно указанные вещества с неприятным привкусом представляют собой T2N и DMS, а их указанные предшественники представляют собой потенциал T2N и DMSP, соответственно.
Таким образом, одной из задач настоящего изобретения является снижение или устранение потенциала T2N. Таким образом, задачей настоящего изобретения является снижение образования предшественников T2N и альдегидных аддуктов. Хотя некоторые химические реакции, относящиеся к потере свежести пива, остаются невыясненными, образование свободного T2N из
потенциала T2N признано основной причиной образования затхлого вкуса в пивных продуктах (Kuroda et al., выше) . Таким образом, задачей настоящего изобретения является предоставление напитков с низким уровнем потенциала T2N, а также напитков с низким уровнем предшественников T2N.
Большинство потенциала T2N в готовое пиво, в котором может
высвобождаться свободный T2N, переносится из сусла (Liegeois et
al. , 2002), причем важными в этом процессе являются условия
кислотности и температуры. По настоящему изобретению потенциал
T2N определяют, как описано выше в настоящем документе в
определениях. Также доступны другие способы определения уровня
потенциала T2N. Во избежание путаницы значение "потенциал T2N"
в данном контексте является таким, как описано выше в настоящем
документе в определениях. Химические вещества, способные
высвобождать T2N или преобразовываться в T2N, в настоящем
документе обозначены как "предшественники T2N", и
предшественники T2N, определяемые или измеряемые
альтернативными способами, отличными от способа определения потенциала T2N, обозначают "предшественниками T2N". В частности, предшественники T2N можно определять обработкой образца так, что по существу все (предпочтительно все) его химические вещества, способные высвобождать T2N или преобразовываться в T2N, фактически высвобождают T2N и/или преобразуются в T2N, соответственно. После этого определяют уровень T2N.
Зерна ячменя по настоящему изобретению в дополнение к отсутствию активности ММТ не обладают активностью LOX-1 и LOX-2. Примечательно, что такие зерна ячменя содержат очень низкий потенциал T2N.
Таким образом, пиво, получаемое с использованием зерен ячменя без двух LOX-без ММТ, не только содержит очень низкий уровень T2N, но также содержит очень низкий уровень потенциала потенциал T2N. В объеме настоящего изобретения находятся зерна ячменя без двух LOX-без ММТ, позволяющие получать пивные продукты, содержащие очень низкие уровни потенциала T2N, предпочтительно менее 60%, более предпочтительно менее 50%
уровня потенциала T2N сходного пивного продукта, получаемого сходным способом из ячменя дикого типа (предпочтительно сорта Power).
Также предпочтительно, чтобы растительные продукты, получаемые из зерен ячменя без двух LOX-без ММТ, обладали очень низким уровнем предшественников T2N. В объеме настоящего изобретения находятся растительные продукты, получаемые из зерен ячменя без двух LOX-без ММТ, где указанные растительные продукты содержат менее 60%, более предпочтительно менее 50% предшественников T2N относительно сходного растительного продукта, получаемого таким же способом из ячменя дикого типа (предпочтительно сорта Power).
Следует отметить, что измеряемые величины T2N часто являются более высокими в образцах или продуктах из сырья после микросоложения, чем из сырья, получаемого в большем масштабе, например, из осоложенного образца опытного масштаба массой 30 кг. Однако относительные экспериментальные величины T2N в экспериментах в большом и малом масштабах в основном являются сходными.
Подобным образом, следует отметить, что измеряемые величины потенциала T2N и предшественников T2N часто являются более высокими в образцах или продуктах из сырья после микросоложения, чем из сырья, получаемого в большем масштабе, например, из осоложенного образца опытного масштаба массой 30 кг. Однако относительные экспериментальные величины потенциала T2N в экспериментах в большом и малом масштабах в основном являются сходными.
Также целью настоящего изобретения является снижение или устранение DMS и DMSP, где DMSP предпочтительно представляет собой SMM.
Количество SMM и DMS в растительном продукте можно определять любым подходящим способом. SMM можно определять по существу, как описано выше в настоящем документе в разделе "Получение растений ячменя без двух LOX-без ММТ", где описано определение уровней SMM в образце ячменя. Таким образом, SMM можно определять, связывая его с таким соединением, как ОРА, и
определяя флуоресценцию, например, с использованием системы СЭЖХ. Для количественного определения можно определять площадь на хроматограмме, соответствующую пику SMM.
Для более точного измерения количества DMS и DMSP (такого как SMM), где последнее соединение измеряют в виде DMS после активации, предпочтительно определяют с использованием капиллярной газовой хроматографии высокого разрешения. Общий DMS в образцах сусла или пиво по настоящему документу определяют как количественная сумма свободного DMS и форм его предшественников, обозначаемых DMSP. С использованием этого определения количество DMSP в образце сусла или пива можно определять как различие между общим DMS (измеряемым в прокипяченном образце, предпочтительно в образце, который кипятят в щелочных условиях в течение 1 часа) и свободным DMS (измеряемым в некипяченом образце). В примере 4 подробно описаны предпочтительные способы измерения уровней общего и свободного DMS.
Количество DMSP, а также SMM по настоящему документу приведено в виде концентрации DMS, которая может высвобождаться из указанных DMSP или указанного SMM при кипячении в щелочных условиях в течение 1 часа.
ПРИМЕРЫ
Примеры в настоящем документе иллюстрируют
предпочтительные варианты осуществления изобретения, и их не следует рассматривать как ограничение изобретения.
Если не указано иначе, основные молекулярно-биологические способы для манипуляций с нуклеиновыми кислотами и бактериями проводили, как описано Sambrook and Russel (2001) .
Пример 1
Скрининг на низкую активность LOX-2 в прорастающих зародышах ячменя
Материал для улучшенного скрининга. Зерна, собранные из растений ячменя без LOX-1 линии Са211901, полученной посредством скрещивания (мутанта D112 без LOX-1 х Jersey) х Sebastian, инкубировали с мутагеном NaN3 в соответствии с
подробным описанием, предоставленном в Kleinhofs et al. (1978). Мутант ячменя без LOX-1 D112 описан в WO 2005/087934 и депонирован в American Type Culture Collection (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110, USA 11 сентября 2003 года, под номером РТА-5487.
Этот способ выбирали, так как известно, что он индуцирует в геномной ДНК ячменя точечные мутации, определяющие затем замены аминокислотных остатков или укорочения в белках, кодируемых мутантной ДНК. В экспериментах с мутагенезом в данной публикации, выбирали мутантные зерна поколения Ml для размножения на полевых участках в течение двух последовательных поколений, получая затем высокую пропорцию гомозиготных растений с целью скрининга (см. фиг. 8) . В то время как зерна поколения М2 скринингу не подвергали, преимущественно потому, что ожидали относительно высокого содержания гетерозиготных точечных мутаций, в качестве материала для скрининга использовали мутантные зерна поколения МЗ, ожидая 0,9-2,3 мутации на 10000 зерен (Kleinhofs et al., выше).
Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что
анализ прорастающих зародышей обеспечивал намного более хорошие
результаты анализа по сравнению с анализом экстрактов зрелых
зародышей (как описано в примере 1 международной заявки
PCT/DK2009/050355). Таким образом, способ
высокопроизводительного скрининга проводили для измерения активности LOX-2 в прорастающих зародышах, включая их ткань щитка.
Из зрелых зерен 3512 5 колосьев ячменя выделяли по два зародыша (20977 линий поколения М4 мутанта D112 без L0X-1 и 14148 линий поколения МЗ линии Са211901 без LOX-1) и переносили в 9б-луночные планшеты для хранения (ABgene). Проращивание зародышей начинали после добавления в каждую лунку, которую покрывали влажной тканью Kimnett и пластиковой крышкой, 2 0 мкл воды. Планшеты инкубировали в пластиковых пакетах при 2 0°С в течение 4 8 часов. После инкубации экстрагировали фермент LOX-2; в каждую лунку сначала добавляли стеклянную гранулу диаметром 5
мм и 2 00 мкл буфера для экстракции (100 мМ раствор молочной кислоты, рН 4,5), с последующим размалыванием в течение 35 секунд при частоте 27 сек-1 в лабораторной мельнице ММ 300 (Retsch). Затем планшет в течение 10 минут при 4°С центрифугировали при 4000 об./мин в центрифуге Allegra 6R Centrifuge (Beckman-Coulter) для осаждения нерастворимого материала. Активность LOX-2 определяли в основном, как описано для анализа активности LOX-2 экстрактов зрелых зародышей (см. пример 1 в международной заявке PCT/DK2009/050355), с тем различием, что для одного анализа вместо 4 0 мкл использовали только 30 мкл экстракта.
Идентификация потенциальных мутантов. Как описано выше, два зерна каждой из указанных выше 3512 5 линий ячменя анализировали на активность LOX-2 с целью идентификации зерен с сильно сниженной указанной активностью по сравнению с зернами без LOX-1 и дикого типа. Всего в поколении МЗ линии Са211901 идентифицировали 7 потенциальных исходных мутантов. Их дополнительно размножали в оранжерее, собирали, а затем повторно подвергали скринингу на признак, связанный с очень низкой активностью LOX. В конечном счете, было показано, что только один мутант линии Са211901, обозначенный мутантом А689, по существу не демонстрировал активности LOX-2. Подробные измерения общей активности LOX проводили с использованием экстрактов проросших зародышей, в которых активность LOX обеспечивалась почти исключительно LOX-2 (Schmitt and van Mechelen, 1997). Для проросших зародышей зерен МЗ мутанта А689, общая активность LOX, как определено посредством колориметрического анализа LOX, составляла 0,16315,5% Ед А595/проросший зародыш, тогда как общая активность L0X для материнского сорта Са211901 без LOX-1 составляла 1,22413,8% Ед А595/проросший зародыш (соответствующая величина для исходного мутанта D112 без LOX-1 составляла 1,215±б,0% Ед А595/проросший зародыш.
Семена ячменя линии А68 9 депонированы 4 декабря 2008 г. под названием "Barley, Hordeum vulgare L.; Line A689" в
American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, United States (номер депозита РТА-9640).
Анализ на HPODE у мутанта А68 9 описан в примере 4 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355.
Свойства мутанта А68 9 описаны в примере 5 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355.
Секвенирование гена LOX-2 у мутанта ячменя А68 9 описано в примере 10 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355, а в таблице 7 в нем обобщены мутации в генах LOX-1 и LOX-2 мутанта А68 9.
Способ детекции мутанта А68 9 без двух LOX описан в примере 11 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355. Способ представляет собой основанный на SNP способ детекции мутации в LOX-1 и мутации в LOX-2.
Пример 2
Скрининг мутантов ячменя без ММТ
Зерна, собранные из растений ячменя сорта Prestige и сорта Sebastian, инкубировали раздельно с мутагеном NaN3 с последующими экспериментальными подробностями, предоставленными Kleinhofs et al. (1978). Эту процедуру выбирали, потому что известен ее потенциал в отношении индукции точечных мутаций в геномной ДНК ячменя.
В экспериментах мутантные зерна поколения Ml выращивали на полевых участках в течение двух последующих поколений с получением в итоге высокой доли гомозиготных растений поколения МЗ для цели скрининга. Мутантные зерна поколения МЗ, как ожидалось, содержали генные мутации с частотой 0,9-2,3 на 10000 зерен (Kleinhofs et al., выше) . Следует отметить, что зерна М2 скринингу не подвергали.
Представляет интерес, что в настоящем изобретении описана процедура быстрого высокопроизводительного скрининга для детекции мутантных зерен ячменя МЗ с отсутствующей активностью ММТ, при условии отсутствия детектируемого синтеза SMM при соложении. Таким образом, авторами изобретения выявлено, что SMM в основном накапливается в колеоптиле и первичном листе
прорастающего ячменя, и что детекцию SMM можно проводить посредством экстракции аминокислот из раздавленной ткани листа пророщенных зерен с возрастом 4 суток с последующей реакцией экстрагированных аминокислот с ОРА с образованием продуктов с высокой флуоресценцией (ср. фиг.2).
На практике каждый анализ проводили посредством проращивания в закрытом пластиковом контейнере с одним куском фильтровальной бумаги Whatman №1 (296x20,9 мм) с использованием двух зерен от каждого из 94 потенциальных мутантов и двух растений дикого типа. Анализ повторяли для многих потенциально мутантных зерен (см. ниже). В начале проращивания в указанный пластиковый контейнер добавляли 2 5 мл водопроводной воды, с последующим добавлением дополнительных 15 мл водопроводной воды на 2 сутки проращивания. Через 4 суток проращивания 1-3 см тканей листа переносили в планшеты для хранения (ABgene) , в которых каждая из 96 лунок объемом 1,2 мл содержала стеклянную гранулу диаметром 5 мм и 500 мкл 12:5:6 (об./об./об. ) смеси вода:метанол:хлороформ. Планшет встряхивали в течение 45 секунд с частотой 30 Гц в лабораторной мельнице ММ 300 (Retsch). Затем планшет переносили в центрифугу (Rotanta 4 60R, Hettich) и центрифугировали при 4 000 об./мин. в течение 15 мин при комнатной температуре для осаждения нерастворимого материала. 10 мкл супернатанта переносили в 9б-луночный планшет для хранения (Waters, кат. № 186002481) и смешивали с 200 мкл Н20 и 60 мкл реакционного раствора, содержащего смесь 15000:45 (об./об.) реагента ОРА (Sigma, кат. № Р7914):3-меркаптопропионовой кислоты (Aldrich, кат. № М5801). Смесь инкубировали при 4°С в течение, по меньшей мере, 10 мин с получением количественной дериватизации аминокислот образца посредством ОРА. С использованием основанной на Waters системы СЭЖХ, оборудованной флуоресцентным детектором, 2 мкл дериватизированной смеси разделяли на колонке 2,1x30 мм С18 Gemini с частицами 3 мкм (Phenomenex, кат. № 00А-4439-80) с использованием градиентной элюции посредством смешивания подвижной фазы А (40 мМ буфер NaH2P04 с рН доведенным до 7,8) и
подвижной фазы В [45:45:10 (об.:об.:об.) раствора ацетонитрил:метанол:вода, как описано (Phenomenex, 2006)]. Возбуждение элюируемых производных ОРА осуществляли при 34 0 нм, тогда как испускание измеряли при 4 50 нм. Пример хроматограммы представлен на фиг. 2 с иллюстрацией профиля элюции аспарагиновой кислоты (Asp), глутаминовой кислоты (Glu), аспарагина (Asn), серина (Ser) и SMM. Последнее соединение включали, поскольку общая цель проекта состояла в идентификации растения ячменя с отсутствием способности синтезировать SMM, т.е. растения, для которого соответствующий пик хроматограммы был очень малым или, предпочтительно, отсутствовал.
Всего скринингу на содержание SMM с целью идентификации зерен с сильно сниженным указанным содержанием по сравнению с зернами дикого типа подвергали 10248 и 3858 мутантных под действием NaN3 зерен сорта Prestige и сорта Sebastian, соответственно. Идентифицировали только 2 потенциальных мутанта поколения МЗ, а именно зерна образца № 8 0 63 (происходящего из сорта Prestige и обозначенного далее в настоящем документе как мутант 8 0 63, обозначение также использовали для зерен последующих поколений) и зерна образца № 14 018 (происходящий из сорта Sebastian и обозначенный далее в настоящем документе как мутант 14018, обозначение, также использовали для зерен последующих поколений). Зерна каждого мутанта выращивали до поколения М4, затем собирали и затем анализировали повторно. В результате подтверждали, что зерна мутанта 8063 и мутанта 14018 имели исключительно низкое содержание SMM, возможно, вообще не содержали SMM.
Анализ вестерн-блоттинга подтвердил, что у мутанта 8 0 63 и мутанта 14018 отсутствовал фермент ММТ (см. пример 3 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315).
Также измерения активности ММТ подтвердили, что у мутанта 8 0 63 отсутствует активность ММТ (см. пример 4 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315).
Секвенирование гена ММТ у мутанта ячменя 8 0 63, как описано в примере 9 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, выявило транзицию оснований G^A в первом основании интрона 5
(положение нуклеотида 3076 SEQ ID N0:10, соответствующей SEQ ID N0:8 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315). Секвенирование гена ММТ в мутанте ячменя 14 018, как описано в примере 14 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, выявило транзицию оснований G^A в донорном участке сплайсинга, непосредственно ниже экзона 2 в первом основании интрона 2, более конкретно в положении нуклеотида 14 62.
Кроме того, подтверждено, что мРНК ММТ у мутанта 8063 является укороченной (см. пример 11 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315), и что мутантный белок ММТ, кодируемый указанной укороченной мРНК не обладает активностью ММТ (см. пример 12 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315). Также подтверждено, что мРНК ММТ у мутанта 14 018 является укороченной (см. пример 15 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315), и что мутантный белок ММТ, кодируемый указанной укороченной мРНК не обладает активностью ММТ (см. пример 16 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315).
Способ детекции наличия мутации в гене ММТ мутанта 8 0 63 описан в примере 11 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, а способ детекции наличия мутации в гене ММТ мутанта 14018 описан в пример 17 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315.
Пример 3
Скрещивания ячменя
На фиг. 3 обобщены способы получения ячменя линии без двух LOX-без ММТ по настоящему изобретению посредством первого скрещивания ячменя линии А68 9 [без двух LOX см. патентную заявка РСТ № PCT/DK2009/050355] с линией 8063 [без ММТ см. патентную заявка РСТ № PCT/DK2009/050315]. С использованием стандартных способов селекции получали двойные гаплоидные линии и выращивали в теплицах. Из них, для дальнейшего размножения и анализа выбирали наиболее эффективные линии относительно агрономической продуктивности, а также отсутствия активности LOX-1 (см. пример 2 в патенте США № 7420105 Breddam, К. et al. ) , отсутствия активности LOX-2 (см. пример 2 в заявке РСТ
№PCT/DK2009/050355 и пример 1 в настоящем документе), а также отсутствия SMM и активности ММТ (примеры 2 и 4 в заявке РСТ № PCT/DK2009/050315 и пример 2 в настоящем документе). Эти линии в настоящем документе обозначены как "тройной нуль-мутант". В основном для определений активности LOX, собирали семена двойных гаплоидов с последующим анализом 12 зерен каждой линии и контрольных сортов, допуская для каждого из измерений стандартное отклонение <5% (фиг. 4). Пример 4
Определение уровней SMM
Измерение SMM проводили по существу, как описано в заявке РСТ PCT/DK2009/050315. Сначала SMM экстрагировали из срезов листьев ячменя длиной 1-3 см, которые помещали в 1,2 мл лунки микропланшетов для титрования, где каждая лунка содержала стеклянную гранулу диаметром 5 мм и 500 мкл смеси 12:5:6
(об./об./об.) вода:метанол:хлороформ. Затем планшет в течение 45 секунд инкубировали в лабораторной мельнице ММ 300 (Retsch), электронным способом доведенной до встряхивания при частоте 30 Гц. После центрифугирования 10 мкл супернатанта переносили в 9б-луночные планшеты для хранения (Waters, каталожный номер 186002481) и смешивали с 200 мкл воды и 60 мкл реакционного раствора, содержащего смесь 15000:45 (об./об.) реагента ОРА
(Sigma, каталожный номер Р7914):3-меркаптопропионовой кислоты
(Aldrich, каталожный номер М5801). Смесь инкубировали при 4°С в течение по меньшей мере 10 мин с количественной дериватизацией аминокислот образец ОРА. С использованием системы СЭЖХ
(Waters), оборудованной флуориметром, 2 мкл дериватизированной смеси разделяли на колонке 2,1x30 мм С18 Gemini с частицами 3 мкм (Phenomenex, кат. № 00А-4439-8 0) с использованием 4 0 мМ Na-фосфатного буфера, доведенного до рН 7,8 и содержащего раствор ацетонитрила:метанола:воды 45:45:10 (об.:об.:об.) в качестве подвижной фазы (Phenomenex 2 006). Возбуждение производных ОРА проводили при 34 0 нм, тогда как испускание измеряли при 450 нм. Пример хроматограммы представлен на фиг. 5 с иллюстрацией профиля элюции аспарагиновой кислоты (Asp), глутаминовой
кислоты (Glu), аспарагина (Asn), серина (Ser) и SMM дикого типа и тройного нуль-мутанта. Для тройного нуль-мутанта наблюдали заметное отсутствие способности к синтезу SMM. Пример 5
Агрономическая продуктивность
Коммерческие сорта ячменя Quench и Power, а также растения без L0X-1, без ММТ, без LOX-1-без L0X-2 (без двух LOX) , без LOX-1-без ММТ и тройного нуль-мутанта тестировали в полевых испытаниях для сравнения их агрономической продуктивности. Регулярно получали данные для высоты растений, срока образования колоса, устойчивости к заболеваниям, полегания, времени созревания и урожайности (см. таблицу 1).
Испытания проводили в соответствии со стандартными процедурами для полевых испытаний. Таким образом, высевали равные количества зерен коммерческих сортов и мутантных линий на участки 7,88 м2 в 2 местоположениях, где каждое включало 3 повторения. Больших отличий в отношении агрономических признаков между мутантами и коммерческими сортами не наблюдали. Анализ качества ячменя различных мутантных линий и сортов продемонстрировал, что все собираемые зерна обладали хорошими и приемлемыми свойствами в отношении соложения и пивоварения.
Пример 6
Микросоложение и микрозаваривание Условия эксперимента
Эксперименты по микросоложению и -завариванию проводили с приведенными ниже шестью различными линиями и сортами ячменя (фиг. 6А, которая также иллюстрирует ход эксперимента, описываемого ниже в настоящем документе): (1) тройной нуль-мутант; (2) без LOX-1-без ММТ; (3) без LOX-1-без L0X-2 (линия ячменя А689) ; (4) без ММТ (линия ячменя 8063); (5) без LOX-1 (линия ячменя D112); (6) сорт Power.
Эксперимент по микросоложению проводили с тремя образцами ячменя массой 22 5 г из каждой указанной выше линии или сорта. Замачивание и проращивание проводили следующим образом:
(i) замачивание при 1б°С: 3 часа влажными; 21 час сухими;
3 час влажными; 21 час сухими; 3 час влажными; 21 час сухими; конечное содержание воды 4 5%;
(ii) проращивание: 4 8-72 часа при 1б°С до модификация
> 95%.
После проращивания три образца подвергали различным режимам сушки (обозначаемой на фиг. 6А как печная сушка):
(i) 85°С - Сушка: 12,5 часов, начиная при 30°С и линейно увеличивая до 55°С с последующими 7,5 часами линейного увеличения до 85°С; 1,5 часа при 85°С;
(ii) 75°С - Сушка: 12,5 час, начиная при 30°С и линейно увеличивая до 55°С с последующими 7,5 часами линейного увеличения до 75°С; 1,5 час при 75°С;
(iii) 40°С - Сушка: 48 час при 40°С.
Образцы, высушенные при 8 5°С и при 4 0°С, перерабатывали непосредственно после проращивания, тогда как оставшиеся образцы замораживали на 2 суток, размораживали, а затем сушили при 7 5°С, как описано выше.
Микрозаваривание проводили, смешивая образцы молотого солода массой 90 г с 270 мл водопроводной воды с последующей инкубацией в 50 0 мл бутылках при 4 0°С в течение 2 0 мин. Температуру линейно повышали до 65°С в течение 2 5 мин с последующей паузой для засахаривания при 65°С длительностью 60 мин. Затем температуру перед фазой заваривания при 7 8°С
длительностью 10 мин линейно повышали до 7 8°С в течение 13 мин. Затем полученное сусло охлаждали на льду, разбавляли 7 00 мл ледяной водопроводной воды и фильтровали через фильтр МЫ-б^1^ (Macherey-Nagel). 400 мл сусла переносили в 500 мл бутылки, плотно закрывали и нагревали в течение 60 мин в кипящей водяной бане. Бутылки оставляли в водяной бане без дальнейшего нагревания в течение дополнительного периода времени 60 мин. Данные об уровнях DMSP
Для анализа того, как различные температуры печной сушки влияют на содержание DMSP в солоде из дикого типа и мутантов по настоящей заявке, зерна сначала подвергали микросоложению, а
затем перед печной сушкой при трех различных температурах, 40°С, 75°С и 85°С, разделяли на аликвоты.
Линии зерен ячменя, содержащие ген ММТ дикого типа, характеризовались высокими уровнями DMSP в конечном солоде. Однако после печной сушки при повышенных температурах выявляли сниженные уровни (таблица 2). В отличие от этого во всех солодах генотипов без ММТ выявляли исключительно низкие уровни DMSP.
Уровни DMSP также измеряли в сусле, получаемом из указанных выше видов солода, получая уровни DMSP, соответствующие уровням DMSP, измеряемым в солодах. Эти результаты соответствуют предыдущим результатам Dickenson and Anderson (1981), описывающим тесную корреляцию между содержанием DMSP в солоде и сусле. Для всех генотипов без ММТ в соответствующем сусле измеряли исключительно низкие уровни DMSP вне зависимости от температуры печной сушки, при которой получали солод.
Данные об уровнях предшественников T2N и свободного T2N
Для анализа того, как различные температуры печной сушки влияют на уровни свободного T2N и предшественников T2N, концентрации указанных соединений определяли в сладком сусле и охлажденном сусло, получаемым посредством микросоложения и -заваривания, как описано выше в настоящем документе. Результаты приведены в таблице 3.
Для сусла из солода дикого типа температура печной сушки оказывала заметное влияние на концентрацию T2N и предшественников T2N. При использовании солода дикого типа для устранения высокой продукции предшественников T2N высокая температура печной сушки была абсолютно необходима.
Для солода без LOX-1-без ММТ температура печной сушки оказывала меньшее влияние на образование T2N и его аддукта.
Также следует отметить, что для сусла из солода из тройного нуль-мутанта, концентрации свободного T2N и его предшественников были низкими во всех образцах вне зависимости от температуры печной сушки.
Пример 7
Микрозаваривание с неосоложенным ячменем
Микрозаваривание неосоложенного ячменя сорта Power и тройного нуль-мутанта проводили, смешивая образцы молотого ячменя массой 90 г с 270 мл водопроводной воды, а также 0,12 г ферментной смеси для сбраживания ячменя Ondea Pro (Novozymes) с последующей инкубацией в 500 мл бутылках при 54°С в течение 30 мин. Температуру линейно повышали до 64°С в течение 10 мин с последующей паузой для засахаривания при 64°С длительностью 4 5 мин. Затем за этим следовало 14 мин линейное повышение до 7 8°С перед фазой заваривания в течение 10 мин при указанной температуре. Дальнейшие процедуры охлаждения, разбавления, фильтрации и нагревание проводили, как описано для микрозаваривания солода (см. пример 4).
Уровни DMSP измеряли в сусле, получаемом из ячменной муки сорта Power и тройного нуль-мутанта (таблица 4). Было очевидно, что содержание DMSP в сусле, получаемом из ячменя с тройной нуль-мутацией, было значительно меньшим содержания DMSP в сусле из сорта Power. Это было неожиданным открытием, так как считалось, что ячмень не содержит DMSP (Yang, В. et al. : Factors involved in the formation of two precursors of dimethylsulphide during malting, J. Am. Soc. Brew. Chem. 56:8592, 1998).
Как представлено в патентной заявке РСТ № PCT/DK2009/050355 (см. фиг. 12 и пример 9 в указанной заявке), уровни предшественников T2N в варенном, получаемом из сброженного ячменя и нормальном сусле в образцах из ячменя без двух LOX были заметно ниже. Таким образом, ожидается, что подобное свойство является характеристикой ячменя с тройной нуль-мутацией, делая ячмень с тройной нуль-мутацией высококачественным сырьем для напитков из сброженного ячменя с низким содержанием веществ с неприятным привкусом T2N и DMS или их полным отсутствием.
Пример 8
Соложение и пивоварение в опытном масштабе Условия эксперимента
Анализ соложения и пивоварения с солодом из тройного нуль-мутанта и сорта Quench (эталонный солод) включал следующие этапы: (i) соложение; (ii) получение сусла; (iii) разделение сусла; (iv) варка сусла; (v) ферментация сусла дрожжами Saccharomyces carlsbergensis; (vi) осветление пива; (vii) фильтрация светлого пива и (viii) бутилирование пива (см. фиг. 6В,С) .
Эксперименты по соложению проводили с зернами тройного нуль-мутанта и сорта Quench в масштабе 20 кг, и их проводили на солодовом заводе следующим образом:
(i) замачивание при 1б°С: 1 час влажными; 1 час сухими; 1
час влажными; 1 час сухими; 1 час влажными; конечное содержание
воды 4 5%;
(ii) проращивание в течение 120 часов, начиная от 1б°С и линейно снижая до 14°С;
(iii) сушка в течение 14 час, начиная от 65°С и линейно повышая до 85°С; 3 часа при 85°С.
Для заваривания тройного нуль-мутанта и сорта Quench (последний использовали как эталон) использовали образцы солода массой 2 5 кг. После перемалывания отдельных образцов солода добавляли водопроводную воду с получением объемов 14 6 л. Заваривание проводили при 4 0°С в течение 2 0 мин, с последующим 2 5 мин линейным повышением от 4 0°С до 65°С. Пауза для засахаривания при 65°С продолжалась в течение 60 мин с последующим 13 мин фазой нагревания до 7 8°С и 10 мин заваривания при 7 8°С.
Один образец сусла сорта дикого типа Quench и один образец сусла тройного нуль-мутанта раздельно варили в течение 60 мин при 101°С (что приводило к выпариванию 6,1%), тогда как остальные два образца сусла нагревали при 98°С в течение 60 мин (что приводило к выпариванию 3,9%). Остальные этапы
пивоварения, как указано выше в данном разделе, т.е. фильтрацию, вихревое разделение, ферментацию, осветление и упаковку в зеленые стеклянные бутылки, проводили в соответствии с описаниями стандартов практики пивоварения.
Уровни DMSP и DMS измеряли по существу как описано в Hysert et al. (1980) со специфичной для серы детекцией с использованием статической газовой хроматографии в свободном объеме над продуктом на хемилюминесцентном серном детекторе 350В (Sievers). Забор образца в свободном объеме над продуктом проводили с использованием автоматического оборудования HS-4 0 (Perkin Elmer).
Общие уровни DMS, т.е. сумму свободных DMS и DMSP в сусле и экстрактах зеленого и высушенного солода, получали посредством кипячения соответствующих образцов в щелочных условиях в течение 1 часа. Затем сваренные и несваренные образцы подвергали анализу свободного объема над продуктом с определением уровней DMS. Разницу между общими DMS (измеряемыми в сваренных образцах) и свободными DMS (измеряемыми в несваренных образцах) определяли как эквивалентное количество DMSP присутствующих в образцах. Количество свободных DMS в пиве определяли по существу как количество свободных DMS в сусле (Hysert et al., выше).
Данные об уровнях DMSP/DMS и предшественников T2N/свободного T2N в образцах сусла
С использованием современного оборудования для пивоварения в норме предусмотрено выпаривание 6-10% сусла для достижения удовлетворительных уровней DMS в соответствующем готовом пиве, т.е. [DMS] <50 млрд.д., что представляет собой уровень порога вкусового ощущения неприятного привкуса человека. На основе этих фактов планировали испытания опытного пивоварения, как описано выше. Целью являлось тестирование влияния сниженного потребления энергии, такого как отсутствие варки при инкубации под давлением, на уровни DMS в сусле и в готовом пиве. Таким образом, условия эксперимента включали сравнение с варкой сусла в стандартных условиях.
При нагревании сусла из сорта Quench измеряли высокие
уровни DMSP и свободных DMS с возрастанием уровней свободных DMS, наблюдаемым с течением времени в сусле под давлением. В отличие от этого вареное выпариваемое сусло до конца варки накапливало меньше DMS, после чего свободные DMS накапливались снова. Параллельно результатам после микрозаваривания, как описано выше в настоящем документе, сусло из солода из тройного нуль-мутанта в опытном масштабе характеризовалось значительно более низкими уровнями DMSP и свободных DMS по сравнению со сходными образцами, получаемыми из сорта Quench (см. таблицу 5). Примечательно, что даже в сусле указанные уровни DMS солода из тройного нуль-мутанта были значительно ниже 50-млрд.д., уровня вкусового порога.
Концентрации предшественников T2N и свободного T2N в сусле
и пиве из солода из сорта дикого типа Quench и из солода из
тройного нуль-мутанта определяли посредством GC-MS после
дериватизации карбонилов О-(2,3,4,5,б-
пентафторбензил)гидроксиламином по существу как описано в Gronqvist et al. (1993).
При нагревании сусла из сорта Quench измеряли высокие концентрации предшественников T2N с максимумом, выявляемым в начале варки/тепловой обработки (таблица б) . Для сусла, получаемого из солода из солода из тройного нуль-мутанта, выявляли значительно более низкими уровнями предшественников T2N (приблизительно 4 0% от уровней при использовании сырья дикого типа), также с максимумом в начале варки/тепловой обработки. Режим низкоэнергетического нагревания (т.е. применение тепловой обработки под давлением) оказывал только незначительное влияние на уровни предшественников T2N для обоих типов солода. Во всех образцах сусла определяли низкие уровни свободного T2N.
Следует отметить, что положительное воздействие мутаций без LOX1 и без LOX-2 отчетливо заметно даже когда при нагревании сусла используют сниженное поступление энергии.
Данные об уровнях DMS и предшественниках T2N/свободного T2N в образцах пива
Концентрацию DMS измеряли в свежем пиве, получаемом из
солода из тройного нуль-мутанта, а также из солода из сорта дикого типа Quench с использованием двух различных режимов варки/нагревания, как описано выше в настоящем документе. Результаты обобщены в таблице 7.
Пиво, получаемое из солода из сорта Quench дикого типа с использованием стандартного режима варки, содержит 65 млрд.д. DMS, т.е. немного выше порога вкусового ощущения 50 млрд.д.. Применение энергосберегающего способа, такого как "отсутствие варки при инкубации под давлением", как описано выше в настоящем документе, для солода дикого типа приводило к очень высокой концентрации DMS (151 млрд.д.) в готовом пиве.
В отличие от этого пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, содержало очень низкие уровни DMS вне зависимости от способа нагревания.
Вне зависимости от используемого способа получения сусла, пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, содержало намного меньше предшественников T2N, (в размере снижения от 5 6 до 58%), чем пиво, получаемое из солода из сорта дикого типа Quench вне зависимости от способа варки (таблица 7).
Уровни свободного T2N в свежем пиве были низки для всех четырех тестируемых образцов пива (т.е. с использованием солода из сорта Quench или из тройного нуль-мутанта, комбинированных с получением сусла с обеспечением выпаривания или под давлением),
но после ускоренного старения в течение 2 недель при 37°С, наблюдали значительные различия. Тогда как оба типа пива, полученные из солода дикого типа со стандартной варкой или нагреванием под давлением, содержали 0,041 млрд.д. и 0,061 млрд.д. T2N, соответственно, соответствующие значения для пива, получаемого из солода из тройного нуль-мутанта, являлись более низкими, т.е. сниженными до 95% и 64%, соответственно (таблица 7) .
Данные о пивной пене
Сравнивали сваренное в опытном масштабе пиво, получаемое с выпариванием или под давлением при нагревании сусла из солода из сорта Quench (см. фиг. 6В) и из тройного нуль-мутанта (см.
фиг. 6С) . Пиво перед добавлением 50 мл Н20 в 150 мл пива отбирали в точке отбора образца 9 (см. фиг. 6В,С), дегазировали в течение 2 0 мин в ультразвуковой бане. Смесь медленно выливали в башню подачи пены, состоящую из стеклянной трубы 16 см в длину, 7 см в ширину (со стеклянным фильтром и коннектором внизу и вверху, соответственно). Через смесь снизу барботировали газообразный N2 при скорости потока 400 мл/мин для получения пивной пены. Ее пропускали через трубу и собирали в градуированный седиментационный конус, размеченный по массе.
Общую массу пены для всех четырех видов пива записывали с 5 мин интервалами до прекращения образования пены (фиг. 7) . Уровни пены являлись сходными вне зависимости от способов с выпариванием или под давлением. Однако в пиве, где в качестве сырья использовали солод из тройного нуль-мутанта, образование пены значительно улучшалось.
Дегустация пива
Получаемые четыре вида пива (т.е. с использованием солода из сорта Quench или из тройного нуль-мутанта в комбинации с получением сусла с обеспечением выпаривания или под давлением), свежеполученное пиво и пиво после ускоренного старения в течение 1 и 2 недель при 37°С, оценивала дегустационная комиссия экспертов (таблица 8).
Свежее пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, получило высший общий показатель вкуса вне зависимости от способа варки. В отличие от этого для пива, получаемого из солода дикого типа и с использованием стандартного режима варки, получали немного меньший общий показатель вкуса; его признавали "с незначительными количествами DMS". Использование способа нагревания под давлением приводило к пиву с очень низким общим показателем вкуса, и его признавали "со значительными количествами DMS".
После ускоренного старения в течение 1 или 2 недель при 37°С пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, получило значительно меньший общий показатель старения, чем пиво, получаемое из солода дикого типа, особенно вследствие
сниженного показателя для признака "привкус картона", получаемого вследствие сниженных концентраций компонента старения T2N. Пример 9
Соложение и пивоварение в опытном масштабе Условия эксперимента
Анализы соложения и пивоварения с солодом из тройного нуль-мутанта (без двух LOX-без ММТ) и сорта Rosalina (эталон дикого типа) включал следующие этапы: (i) соложение; (ii) получение сусла; (iii) разделение сусла; (iv) ферментация сусла дрожжами Saccharomyces carlsbergensis; (vi) осветление пива; (vii) фильтрация светлого пива и (viii) бутилирование пива.
Эксперименты по соложению проводили с зернами тройного нуль-мутанта и сорта Rosalina в масштабе 21 кг, и их проводили на солодовом заводе следующим образом:
(i) замачивание при 1б°С: 1 час влажными; 1 час сухими; 1
час влажными; 1 час сухими; 1 час влажными; капельное
добавление воды в течение 3 6 часов до конечного содержания воды
4 5%;
(ii) проращивание в течение 120 часов, начиная от 1б°С и
линейно снижая до 14°С;
(iii) сушку/печную сушку проросших зерен проводили при
нормальной температурной программе или при низкотемпературной
программе в опытной печной сушке;
(iv) нормальная программа сушки/печной сушки, начиная от 4 5°С с линейным повышением до 8 5°С в течение 14 часов с последующей инкубацией в течение 2 часов при 8 5°С;
(v) программа низкотемпературной сушки/печной сушки, начиная от 45°С и с линейным повышением до 75°С в течение 12 час с последующей инкубацией в течение 2 часов при 7 5°С.
Для заваривания тройного нуль-мутанта и сорта Rosalina использовали образцы солода массой 34 кг. После перемалывания отдельных образцов солода добавляли водопроводную воду с получением объемов 180 л. Заваривание проводили при 60°С в
течение 2 0 мин, с последующим 5 мин линейным повышением от 60°С до 65°С. Пауза для засахаривания при 65°С продолжалась в течение 60 мин с последующим 13 мин фазой нагревания до 78°С и 10 мин заваривания при 7 8°С.
Образец сусла сорта дикого типа Rosalina и образец сусла тройного нуль-мутанта раздельно варили в течение 60 мин при 101°С в открытом сосуде (что приводило к выпариванию 4,5%) или нагревали до 99,5°С и поддерживали при 99,5°С в течение 60 мин в закрытом сосуде (что приводило к выпариванию 0%) . Остальные этапы пивоварения, как указано выше в данном разделе, т.е. фильтрацию, вихревое разделение, ферментацию, осветление и упаковку в зеленые стеклянные бутылки, проводили в соответствии с описаниями стандартов практики пивоварения.
Получали шесть различных видов сусла с различными комбинациями сорта, условий печной сушки и условий варки (см. таблицу 9).
Остальные этапы пивоварения, как указано выше в данном разделе, т.е. фильтрацию, вихревое разделение, ферментацию, осветление, фильтрацию и упаковку в зеленые стеклянные бутылки, проводили в соответствии с описаниями стандартов практики пивоварения.
Уровни DMSP и DMS измеряли, как описано выше в настоящем документе в примере 8.
Данные об уровнях DMSP/DMS в образцах солода
При современном соложении растений в норме для снижения DMSP в солоде до низкого уровня, т.е. менее 4,5 мг/кг солода, для получения солода из которого можно получать сусло с удовлетворительным уровнем DMS, требуется сушка зерна с температурой сушки при 8 5°С в течение по меньшей мере 2 часов (см. ниже).
На основе этих фактов планировали испытания соложения в опытном масштабе, как описано выше. Целью являлось тестирование влияния сниженного потребления энергии, такого как низкотемпературная сушка, на уровни DMS в солоде, сусле и в готовом пиве. Таким образом, условия эксперимента включали
сравнение с сушкой зерна в стандартных условиях.
В солоде, получаемом из сорта Rosalina с использованием стандартной сушки при 85°С, DMSP измеряли на уровне 4,7 мг/кг солода. В солоде из сорта Rosalina, получаемом с сушкой при 75°С, DMSP измеряли на уровне 16,2 мг/кг (таблица 10). В солоде, получаемом из зерен тройного нуль-мутанта, получали экстремально низкие уровни DMSP, фактически ниже предела детекции, вне зависимости от температуры сушки.
Данные об уровнях DMSP/DMS в образцах сусла
С использованием современных способов пивоварения, для достижения удовлетворительных уровней DMS в соответствующем готовом пиве, предпочтительно [DMS] <50 млрд.д., в норме необходим по меньшей мере один час варки с выпариванием 4,5-10% сусла. На основе этих фактов планировали испытания пивоварения, как описано выше. Целью являлось тестирование влияния сниженного потребления энергии, такого как низкотемпературная сушка зерна или тепловая обработка без выпаривания в закрытом сосуде, на уровни DMS в сусле и готовом пиве. Таким образом, условия эксперимента включали сравнение с сушкой зерна и варкой сусла в стандартных условиях.
При нагревании сусла из сорта Rosalina, получаемого с нормальной сушкой, измеряли высокие уровни DMSP и свободных DMS. С течением времени в закрытом сосуде наблюдали увеличение уровней свободных DMS. В отличие от этого вареное выпариваемое сусло до конца варки накапливало меньше DMS, после чего свободные DMS накапливались снова (таблица 11). При использовании низкотемпературной сушки с сортом Rosalina уровни DMSP и DMS были намного выше, чем при нормальной сушке. Во всех трех видах сусла, получаемого из сорта Rosalina, конечное сусло содержало уровень DMS выше 50 млрд.д.
Параллельно с другими результатами, описываемыми выше в настоящем документе, сусло из солода из тройного нуль-мутанта характеризовалось экстремально низкими уровнями DMSP и свободных DMS по сравнению со сходными образцами, получаемыми из сорта Rosalina. Примечательно, что даже в сусле указанные
уровни DMS солода из тройного нуль-мутанта были значительно ниже 50-млрд.д. вне зависимости от режимов печной сушки и варки.
Данные об уровнях предшественников T2N/свободного T2N в образцах сусла
Концентрации предшественников T2N и свободного T2N в сусле
и пиве из солода из сорта дикого типа Rosalina и из солода из
тройного нуль-мутанта определяли посредством GC-MS после
дериватизации карбонилов О-(2, 3, 4, 5, б-
пентафторбензил)гидроксиламином по существу как описано в Gronqvist et al. (1993).
В сусле из сорта Rosalina измеряли высокие концентрации предшественников T2N (таблица 12) . Для сусла, получаемого из солода из тройного нуль-мутанта, выявляли более низкие уровни предшественников T2N, "4 0% от уровней предшественников T2N при использовании сырья дикого типа. Режим низкоэнергетического нагревания, т.е. низкотемпературной печной сушки или тепловой обработки сусла без выпаривания в закрытом сосуде, для обоих типов солода оказывал только небольшое влияние на уровни предшественников T2N. Во всех образцах сусла определяли низкие уровни свободного T2N.
Следует отметить, что положительное воздействие мутаций без LOX1 и без LOX-2 отчетливо заметно, даже когда используют сниженное поступление энергии.
Данные об уровнях DMS и предшественниках T2N/свободного T2N в образцах пива
Концентрации DMS измеряли в свежем пиве, получаемом из солода из тройного нуль-мутанта, а также из солода из сорта дикого типа Rosalina с использованием двух различных режимов сушки зерна и варки/нагревания, как описано выше в настоящем документе. Результаты обобщены в таблице 13.
Пиво, получаемое с использованием стандартного режима варки, из солода из сорта дикого типа Rosalina, получаемого в условиях стандартной сушки, содержало 117 млрд.д. DMS, т.е. выше 50 млрд.д.. Применение энергосберегающего способа, такого как "отсутствие выпаривания в закрытом сосуде", как описано
выше в настоящем документе, для солода дикого типа приводило к 174 млрд.д. DMS, т.е. очень высокой концентрации неприятного привкуса в готовом пиве.
В отличие от этого, пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, содержало очень низкие уровни DMS, вне зависимости от способов варки и печной сушки.
Уровни свободного T2N в свежем пиве были низки во всех тестируемых образцах пива (т.е. с использованием солода из сорта Rosalina или из тройного нуль-мутанта, комбинированных с получением сусла с обеспечением выпаривания или тепловой обработкой без выпаривания в закрытом сосуде), но после ускоренного старения в течение 2 недель при 37°С, наблюдали значительные различия. Тогда как пиво, полученное из солода дикого типа со стандартной варкой и тепловой обработкой без выпаривания в закрытом сосуде, содержало 0,055 млрд.д. и 0,035 млрд.д. T2N, соответственно, соответствующие значения для пива, получаемого из солода из тройного нуль-мутанта, являлись значительно более низкими, т.е. сниженными на 67% и 51%, соответственно, (см. таблицу 13).
Дегустация пива
Получаемые б видов пива (т.е. с использованием солода из сорта Rosalina или из тройного нуль-мутанта в комбинации с получением сусла с обеспечением выпаривания или тепловой обработкой без выпаривания в закрытом сосуде или стандартной или низкотемпературной сушкой), свежеполученное пиво и пиво после ускоренного старения в течение 2 недель при 37°С, оценивала дегустационная комиссия экспертов (таблица 14).
Свежее пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, получило высший общий показатель вкуса вне зависимости от способов печной сушки и варки. В отличие от этого для пива, получаемого из солода дикого типа, высушиваемого при 8 5°С и с использованием стандартного режима варки, получали значительно меньший общий показатель вкуса; его признавали "с заметными количествами DMS". Использование для получения сусла способа тепловой обработки без выпаривания в закрытом сосуде приводило
к пиву с еще более низким общим показателем вкуса, который признавали "со значительными количествами DMS".
После ускоренного старения в течение 2 недель при 37°С пиво, получаемое с нормальной варкой из солода из тройного нуль-мутанта, высушиваемого при 85°С получило значительно меньший общий показатель старения, чем соответствующее пиво, получаемое из солода дикого типа, особенно вследствие сниженного показателя для признака "привкус картона", получаемого вследствие сниженных концентраций компонента старения T2N.
Для пива, получаемого из солода дикого типа, оценка характеристик потери свежести была не совсем возможной преимущественно вследствие неприятного вкуса DMS от заметного до значительного.
Пример 1О
Сравнение пива из сброженного ячменя и нормального пива -
ТНА
Специфичные для пива ТНА, получаемые из линолевой кислоты, были уже описаны несколько десятилетий назад (Drost et al., 1974). С того времени в различных публикациях подтверждено, что общее содержание ТНА в пиве находится в диапазоне "5-12 м.д. (Hamberg, 1991 и ссылки в ней) . Хотя 9,12,13-ТНА в норме составляет 75-85% ТНА в пиве, 9,10,13-ТНА насчитывает 15-25%; в незначительных количествах выявлены другие изомеры.
В пиве, получаемом из сусла, получаемого из солода из ячменя тройного нуль-мутанта (см. пример 9), концентрация 9,12,13-ТНА по сравнению с контрольным пивом, получаемом из солода сорта Rosalina, снижалась на 80-87% (таблица 15) . Для изомера 9,10,13-ТНА наблюдали снижение на 65-72%. Эти измерения проводили с использованием стандартных анализов ВЭЖХ-масс-спектрометрии (Hamberg, выше).
Пример 11
Амплификация происходящей из сырья ДНК в пиве
Когда для оценки наличия или отсутствия видоспецифичных последовательностей ДНК в смесях муки из солода можно
использовать способ ПЦР, определение образцов пива становится более интересным. При производстве пива комбинированное действие происходящих из сырья нуклеаз, повышенных температур и фильтрации, обеспечивают получение пивных продуктов, которые содержат только низкие уровни интактной ДНК для амплификации фрагментов генов растений. В настоящем примере описан новый эффективный способ для комбинированных выделения и амплификации ДНК, позволяющий получать ДНК достаточного для визуализации качества.
Для определения сырья в образцах пива разработан новый протокол из четырех этапов. В нем последовательно используют реагенты и протоколы трех биомолекулярных наборов, затем обеспечивая амплификацию фрагментов ДНК для визуализации:
(i) выделение ДНК из пива посредством связывания с
магнитными бусами [в соответствии с рекомендациями в
инструкциях для набора выделения ДНК из жидких образцов DNA
Extraction Kit, Speciation (Tepnel Biosystems Ltd., каталожный
номер 901040N)];
(ii) амплификация ДНК посредством изотермического замещения цепи (набор для амплификации ДНК Illustra GenomiPhi V2, GE Healthcare, каталожный номер 25-6600-30);
(iii) ПЦР с праймерами для детекции конкретных мутаций ДНК, с использованием смеси для ПЦР REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix (Sigma, каталожный номер XNAP-1KT);
(iv) электрофорез в агарозном геле для разделения продуктов амплификации с последующим окрашиванием бромистым этидием для их визуализации.
Этап (i) выше относится к очистке ДНК из 400 мкл аликвот из следующих образцов:
(a) Tuborg Gr0n Pilsner, получаемое с использованием муки из смеси 75%:25% солода:ячменя дикого типа (Carlsberg Breweries A/S; подпись на этикетке 26.11.11 704);
(b) пиво, получаемое в опытном масштабе с использованием смеси, содержащей 50% солода без LOX-1 (Carlsberg trial identifier 2С10084);
(c) несваренное сусло, получаемое в опытном масштабе с
использованием солода, получаемого из ячменя с тройной нуль-мутацией (Carlsberg trial identifier 2С11001);
(d) вареное сусло, получаемое в опытном масштабе с использованием солода из тройного нуль-мутанта (Carlsberg trial identifier 2С11001), т.е. сусла, получаемого из сусла, описанного в (с) выше.
ДНК, очищенную из каждого из указанных выше образцов (а), (Ь) , (с) и (d) , в завершении ресуспендировали в 50 мкл 10 мМ буфера Tris-ЭДТА, рН 7,4.
На этапе (ii) выше, 1 мкл аликвот образцов, полученных из сусла или пива ДНК, очищенных, как подробно изложено в (i), подвергали амплификации. В кратком изложении ДНК подвергали тепловой денатурации, а затем охлаждали в образце буфера, содержащего случайные гексамеры, которые неспецифически связываются с ДНК. Добавляли основную смесь, содержащую ДНК-полимеразу, случайные гексамеры, нуклеотиды, соли и буферы и проводили изотермическую амплификацию при 3 0°С в течение 2,0 час с использованием конечного объема реакционной смеси 2 0 мкл. Затем полимеразу инактивировали нагреванием в течение 10 мин инкубации при 65°С.
В отношении этапа (iii) выше параметры реакции амплификации ПЦР в объеме 14 мкл, включающем 1,0 или 4,2 мкл аликвот матриц образцов, получаемых, как описано в (ii) выше, и 7 пмоль каждого из праймеров FL82 0 (SEQ ID NO: 10 WO 2010/075860) и FL823 (SEQ ID N0:11 WO 2010/075860) для детекции мутации без LOX-1; см. фиг. 18В в WO 2010/075860 Skadhauge, В. et al., являлись следующими:
(i) 1 цикл с денатурацией при 9б°С в течение 2 мин;
(ii) 3 0 циклов с:
(a) денатурацией при 95°С в течение 1 мин;
(b) отжигом при 68°С в течение 1 мин;
(c) достройкой при 72°С в течение 1 мин
(iii) конечная достройка при 72°С в течение 10 мин
(iv) хранение
Этап (iv) выше состоит из электрофоретического разделения
всей смеси ПЦР в 2% (масс./об.) агарозном геле, куда добавлен бромистый этидий. После электрофореза гель облучали УФ-светом и фотографировали (фиг. 10).
Анализ профиля полос ДНК, приведенный на фиг. 10, выявил отсутствие продукта амплификации из аликвоты пива Tuborg, ожидаемый результат, так как сырье получали из дикого типа, т.е. не получали из ячменя без LOX-1. Однако в образцах пива, сваренного из смеси, содержащей 50% солода без LOX-1, можно детектировать продукты амплификации ожидаемой длины. Подобным образом, но более отчетливо, получали окраску для несваренного сусла, получаемого из солода из тройного нуль-мутанта. В образце из вареного сусла из сырья тройного нуль-мутанта амплифицировали меньше продукта ПЦР, возможно вследствие теплового повреждения и после осаждения.
Используя продукты амплификации, описанные выше в (ii) с парой праймеров FL1034-FL1039 (SEQ ID N0:9 и SEQ ID N0:8 WO 2010/075860, соответственно; также см. фиг. 18 в WO 2010/075860 Skadhauge et al.), набором праймеров 20 (SEQ ID N0:77 и SEQ ID N0:81 WO 2010/063288) и набором праймеров 21 (SEQ ID N0:78 и SEQ ID N0:82 WO 2010/063288; также см. фиг. 15 в WO 2010/063288 А2 Knudsen et al. ) в отдельных ПЦР, но в условиях, сходных с условиями, подробно описанными выше в настоящем примере, подтверждали, получен ли образец сусла или пиво с использованием сырья из тройного нуль-мутанта.
Сравнение агрономических данных [полевые испытания в 2009 г. (в Fyn, Denmark)]
сорт Quench
сорт Power
без LOX-1
без ММТ
без LOX-1-без LOX-2
без LOX-1-
без ММТ
тройной нуль-мутант
Дата посева
4 апреля
4 апреля
4 апреля
4 апреля
4 апреля
4 апреля
4 апреля
Срок образования колоса
18 июня
15 июня
16 июня
15 июня
16 июня
16 июня
17 июня
Длина соломины при созревании (см)
Мучнистая роса
Гельминтоспориоз корней зерновых1
Листовая ржавчина1
Полегание1
Дата созревания
3 августа
31 июля
1 августа
31 июля
1 августа
1 августа
2 августа
Относительная урожайность (%)2
103
103
100
101
Масса 1000 зерен (г)
Белок (%)3
10,5
10,2
10,3
10,5
10,5
10,4
10,5
Крахмал (%)3
63, 0
62, 1
62, 5
62, 9
62, 4
63, 1
62, 7
Размер зерна
95, 7
92, 4
96, 8
94, б
99, 2
99, 1
95, 3
(%> 2,5 мм)
По шкале от 0 до 9, где 0 представляет собой отсутствие инфекции или полегания, а 9
представляет собой экстремальную инфекцию или полегание.
2 Относительная средняя урожайность трех повторов в двух различных местоположениях по сравнению с официальным смесью сортов ячменя Danish Spring смесь в 2009 году. Стандартную урожайность смеси установили как относительную урожайность 100%.
Уровни DMSP при микросоложении и -заваривании
3 Измеряли посредством спектроскопии пропускания в ближнем инфракрасном диапазоне (NIT).
Уровни T2N и предшественников T2N (npe-T2N) при микросоложении и -заваривании
Тип ячменя
Описание образца (см. фиг. 6А)
Солод
Охлажденное сусло
T2N
Пре-Т2Ы
T2N
Пре-Т2Ы
млрд.д.
Печная сушка при 4 0°С
тройной нуль-мутант
0, 0
2,3
0,1
3, 6
без LOX-1-без ММТ
0, 0
4,3
0,1
7,5
без LOX-1-без L0X-2
без ММТ
без L0X-1
Сорт дикого типа Power
0,1
8,3
0,4
15, 7
Печная сушка при 7 5°С
тройной нуль-мутант
0,1
2,3
0,2
3,3
без LOX-1-без ММТ
0,1
3,1
0,2
4, 9
без LOX-1-без L0X-2
без ММТ
без L0X-1
Сорт дикого типа Power
0,2
5, 2
0,3
8,2
Печная сушка при 8 5°С
тройной нуль-мутант
0,1
1,8
0,1
2,5
без LOX-1-без ММТ
0,1
2,1
0,1
3,1
без LOX-1-без L0X-2
0,1
1,8
0,1
2,5
без ММТ
0,4
4,2
0,4
6, 4
без L0X-1
0,1
2,2
0,1
6, б
Сорт дикого типа Power
0,2
4,8
0,1
9, 0
Уровни DMSP и DMS в двух типах заваривания в опытном масштабе
Описание образца (см. фиг. 6В,С)
2 3 4 5 6 7
Тип ячменя
Солод
Нагревание сладкого сусла с обеспечением выпаривания (мин;°С)
0; 67
22; 99
37;
101
52; 101
67; 101
82; 101
142;
мкг/г
мкг/л
Сорт дикого типа Quench DMSP
4,7
725
682
516
369
288
219
101
Уровни предшественников T2N (npe-T2N) и свободного T2N в двух типах заваривания в опытном масштабе
Тип ячменя
Описание образца (см. фиг. 6В,С)
Солод
Нагревание сладкого сусла с обеспечением выпаривания
(мин;°С)
0; 67
22; 99
37; 101
52; 101
67; 101
82; 101
142; 90
млрд.д.
Сорт дикого типа Quench
Пре-Т2Ы
3, 6
4,8
4,3
4,2
3, 9
3, 9
3,7
T2N
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0,1
тройной нуль-мутант
Пре-Т2Ы
1,7
1,9
1, 6
1,4
1,4
1,2
1,4
T2N
0,1
0,2
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Нагревание сладкого сусла под давлением (мин;°С)
0; 69
22; 99
37; 98
52; 98
67; 98
82; 98
142; 80
Сорт дикого типа Quench
Пре-Т2Ы
3, 8
4,0
3,9
3, 8
3, 8
3, 8
3,3
T2N
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
тройной нуль-мутант
Пре-Т2Ы
1, 6
1,8
1,8
1, б
1,5
1,4
1,5
T2N
0,2
0,2
0,2
0,1
0,1
0,1
0,1
Органолептическая оценка свежего и передержанного пива, получаемого из сорта дикого типа Quench и
солода из тройного нуль-мутанта
Условия инкубации пива
Свежее
1 неделя при 37°С
2 недели при 37°С
Тип ячменя
Тип варки
Показатель вкуса1
Комментарии
Показатель старения2
Показатель картонного привкуса2
Показатель старения
Показатель картонного привкуса
Сорт дикого типа Quench
Нагревание с обеспечением выпаривания сладкого сусла
4,4
Заметно прокисшее
3,1
2,4
2,4
2,1
Немного окислившееся
с незначительными DMS
с незначительными соединениями серы
с незначительными эфирами
тройной нуль-мутант
4,8
с незначительными соединениями серы
2,1
1, б
1,9
1,3
с незначительными жирными кислотами
Незначительно зернистое
о о s аз Й и БН с
з ч X CD ч
t и Ф s й
2, 8
С незначительными
3,5
2,3
3,3
2,4
эфирами
Немного передержанное
Со значительными DMS
с незначительным американским запахом
Незначительно зернистое
тройной нуль-мутант
4,8
Незначительно зернистое
2, 6
1,9
1,9
1,1
С незначительным фруктовым вкусом
Незначительно прокисшее
Немного затхлое
По шкале 1-9, где 9 является наилучшим
По шкале 0-5, где 0 означает свежее пиво, а 5 представляет собой очень передержанное пиво 3 По шкале 0-5, где 5 означает пиво с сильным привкусом картона
DMS и DMSP в образцах солода
Сушка/печная сушка
DMS
DMSP
Сорт
Программа
Температура сушки (°С)
(мг/кг)
(мг/кг)
Rosalina
Нормальная
4,1
4,7
Rosalina
Низкотемпературная
2, 8
16,2
Тройной нуль-мутант
Нормальная
Тройной нуль-мутант
Низкотемпературная
* ниже предела детекции
Уровни DMSP и DMS в двух типах варки в опытном масштабе
Нормальная сушка зерна при 85°С и нагревание с обеспечением выпаривания сусла в открытом сосуде
Описание образца (см. фиг. б)
Тип ячменя
Нагревание сладкого сусла (мин;°С)
0; 67
22; 99
37; 100
52; 100
82; 100
142; 90
мкг/л
сорт Rosalina дикого типа
DMSP
1245
1257
882
759
415
208
DMS
212
190
102
178
тройной нуль-мутант
DMSP
следы
следы
DMS
следы
следы
Уровни предшественников T2N (IIpe-T2N) и свободного T2N в сусле в опытном масштабе, получаемом с
использованием различных режимов печной сушки и варки
Тип ячменя
Тип варки *)
На старте
нагревания
Нагретое сусло
T2N
Пре-Т2Ы
T2N
Пре-Т2Ы
(млрд.д.)
(млрд.д.)
(млрд.д.)
(млрд.д.)
Нормальная сушка при 85 °С
Сорт дикого типа Rosalina
Откр. сосуд; выпар.
0,39
5, 3
0,21
4,2
тройной нуль-мутант
Откр. сосуд; выпар.
0,24
1,8
0, 08
1,8
Сорт дикого типа Rosalina
Закр. сосуд; без выпар.
0,40
5, 3
0,36
4,1
тройной нуль-мутант
Закр. сосуд; без выпар.
0,28
2,2
0, 11
1,8
Низкотемпературная сушка при
75° С
Сорт дикого типа Rosalina
Откр. сосуд; выпар.
0,21
4,4
0,27
4,7
тройной нуль-мутант
Откр. сосуд; выпар.
0,31
1,9
0, 18
1,8
*) Сокращения: Открытый сосуд (Откр. сосуд) или закрытый сосуд (Закр. сосуд); без выпаривания (без выпар.) или с обеспечением выпаривания (выпар.)
DMS и свободный T2N в свежем и передержанном пиве
Тип ячменя
Тип варки *)
DMS (млрд.д.)
Свободный T2N **) (млрд.д.)
S02 (м.д.)
Свободный T2N ***) (млрд.д.)
Нормальная сушка при 85° С
Сорт дикого типа Rosalina
Откр. сосуд; выпар.
117
0, 011
0, 055
тройной нуль-мутант
Откр. сосуд; выпар.
0, 011
0, 018
Сорт дикого типа Rosalina
Закр. сосуд; без выпар.
326
0, 011
0, 035
тройной нуль-мутант
Закр. сосуд; без выпар.
0, 012
0, 017
Низкотемпературная сушка при 75°С
Сорт дикого типа Rosalina
Откр. сосуд; выпар.
174
тройной нуль-мутант
Откр. сосуд; выпар.
*) Сокращения: Открытый сосуд (Откр. сосуд) или закрытый сосуд (Закр. сосуд); без выпаривания
(без выпар.) или с обеспечением выпаривания (выпар.) **) В свежем пиве
***) В пиве, инкубируемом в течение 2 недель при 37°С
Органолептическая оценка свежего и передержанного пива, получаемого из сорта дикого типа Rosalina и
солода из тройного нуль-мутанта
Условия инкубации пива
Свежее
2 недели при 37°С
Тип ячменя
Тип варки *)
Показатель вкуса1
Комментарии
Показатель старения2
Показатель картонного привкуса3
Нормальная сушка зерен при 85 °С
Сорт дикого типа Rosalina
Откр. сосуд; выпар.
3,4
с незначительными соединениями серы
со значительными DMS
тройной нуль-мутант
Откр. сосуд; выпар.
5,7
Незначительное горькое послевкусие
2,4
Сорт дикого типа Rosalina
Закр. сосуд; без выпар.
3,1
с незначительными DMS
тройной нуль-мутант
Закр. сосуд; без выпар.
5, 0
Незначительно прокисшее
2,7
2, 0
Незначительно хмелевое Незначительный резкий горький привкус Незначительно зернистое
Низкотемпературная сушка зерен при 75°С
Сорт дикого типа Rosalina
Откр. сосуд; выпар.
4,8
Незначительно фруктовое
с заметными DMS
тройной нуль-мутант
Откр. сосуд; выпар.
5, 2
Незначительно горькое
2,1
0,7
Незначительно кислое
*) Сокращения: Открытый сосуд (Откр. сосуд) или закрытый сосуд (Закр. сосуд); без выпаривания
(без выпар.) или с обеспечением выпаривания (выпар.)
1 По шкале 1-9, где 9 является наилучшим
2 По шкале 0-5, где 0 означает свежее пиво, а 5 представляет собой очень передержанное пиво
ТНА в пиве, получаемом из солода из сорта Rosalina и из тройного нуль-мутанта
3 По шкале 0-5, где 5 означает пиво с сильным привкусом картона
тройной нуль-мутант
Откр. сосуд; выпар.
0,75
0,29
2,5
Сорт дикого типа Rosalina
Закр. сосуд; без выпар.
3,28
0,78
4,2
тройной нуль-мутант
Закр. сосуд; без выпар.
0,51
0,23
2,2
Низкотемпературная сушка при 75°С
Сорт дикого типа Rosalina
Откр. сосуд; выпар.
3,77
0, 8
4,7
тройной нуль-мутант
0,49
0,22
2,2
*) Сокращения: Открытый сосуд (Откр. сосуд) или закрытый сосуд (Закр. сосуд); без выпаривания
(без выпар.) или с обеспечением выпаривания (выпар.)
Список последовательностей
SEQ ID N0
Соответствует
Описание
SEQ ID NO: 1
SEQ ID N0:1 международной патентной заявки WO2005/087934
гДНК ячмень сорта Barke, перекрывающая старт- и стоп-кодоны гена, кодирующего L0X-1
SEQ ID N0:2
SEQ ID N0:2 международной патентной заявки WO2005/087934
гДНК ячменя мутанта D112, перекрывающая область между старт- и стоп-кодонами соответствующего гена, кодирующего L0X-1 сорта Barke
SEQ ID N0:3
SEQ ID N0:3 международной патентной заявки WO2005/087934
Белковая последовательность полноразмерного белка L0X-1 сорта Barke
SEQ ID N0:4
SEQ ID N0:4 международной патентной заявки WO2005/087934
Белковая последовательность неактивного укороченного L0X-1 мутанта D112
SEQ ID N0:5
SEQ ID N0:1 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355, опубликованной как WO2010/075860
Последовательность геномной ДНК дикого типа, кодирующая L0X-2 из сорта Barke
SEQ ID NO: 6
SEQ ID N0:2 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355, опубликованной как WO2010/075860
Последовательность геномной ДНК мутантного L0X-2 из мутанта ячменя А68 9
SEQ ID N0:7
SEQ ID N0:5 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355, опубликованной как WO2010/075860
Последовательность полноразмерного белка L0X-2 ячменя дикого типа, сорт Barke
SEQ ID NO: 8
SEQ ID N0:6 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355, опубликованной как WO2010/075860
Последовательность белка мутанта L0X-2 без активности L0X-2 из мутанта ячменя А68 9.
SEQ ID NO: 9
SEQ ID N0:3 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288
гДНК ячменя сорта Prestige, геномная последовательность, перекрывающая старт- и стоп-кодоны гена ММТ
SEQ ID N0:10
SEQ ID N0:8 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288
гДНК ячменя мутанта 8 0 63, Геномная последовательность ММТ, перекрывающая старт- и стоп-кодоны гена ММТ
SEQ ID N0:11
SEQ ID N0:16 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288
гДНК ячменя сортов Sebastian, геномная последовательность ММТ, перекрывающая старт- и стоп-кодоны гена ММТ
SEQ ID NO: 12
SEQ ID N0:19 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288
гДНК ячменя мутанта 14 018, геномная последовательность ММТ, перекрывающая старт- и стоп-кодоны гена ММТ
SEQ ID N0:13
SEQ ID N0:6 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288
Последовательность ячмень ММТ сорта Prestige
SEQ ID N0:14
SEQ ID N0:18 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288
Последовательность ММТ ячменя сорта Sebastian
SEQ ID N0:15
SEQ ID N0:22 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288
Полная транслируемая последовательность, получаемая из неправильно сплайсированной РНК мутанта 14 018
SEQ ID N0:16
SEQ ID N0:24 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288
Полная транслируемая последовательность, получаемая из неправильно сплайсированной РНК мутанта ячменя 14 018
SEQ ID N0:17
SEQ ID N0:26 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288
Полная транслируемая последовательность, получаемая из неправильно сплайсированной РНК мутанта ячменя 14 018
ЦИТИРУЕМЫЕ ССЫЛКИ Патентные документы
Патент США № 4683195 Mullis, К.В. et al. Патент США № 4800159 Mullis, К.В. et al. патентная заявка РСТ WO 02/053721 Douma, А.С. et al. патентная заявка РСТ WO 2005/087934 Breddam, К. et al. Патент Европы № ЕР 1609866 Hirota, N. et al. PCT/DK2009/050315 Knudsen, S. et al. PCT/DK2009/050355 Skadhauge, B. et al. Другие публикации
American Association of Cereal Chemists, "Approved methods of the American Association of Cereal Chemists". ISBN 0-91325086-4 (1995).
American Society of Brewing Chemists, "Methods of analysis of the American Society of Brewing Chemists". ISBN 1-881696-014 (1992).
Baur, C. and Grosch. W., "Investigation about the taste of di-, tri- and tetrahydroxy fatty acids". Z. Lebensm. Unters. Forsch. 165: 82-84 (1977).
Baur, C. et al. , "Enzymatic oxidation of linoleic acid: Formation of bittertasting fatty acids". Z. Lebensm. Unters. Forsch. 164:171-176 (1977).
B. Bonacchelli, C. De Brackeleire and F. Harmegnies "Wort boiling - the Meura's concept with wortstripping" Proceedings of the 31st International Congress of the European Brewery Convention Venice, Italy, 6-10 May 2007, Contribution no. 58, ISBN 978-90-70143-24-4
Briggs, D.E. et al., "Malting and brewing science. Volume I Malt and sweet wort". Chapman and Hall. New York. USA. ISBN 0412165805 (1981) .
Durai, S. et al., "Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells". Nucleic Acids Res. 33:5978-5990 (2005).
European Brewery Convention. "Analytica - EBC". ISBN 3418-00759-7 (1998).
Groenqvist, A. et al. , "Carbonyl compounds during beer
production in beer". Proceedings of the 24th EBC Congress, Oslo, pp. 421-428 (1993).
Hamberg, M., "Trihydroxyoctadecenoic acids in beer: Qualitative and quantitative analysis". J. Agric. Food Chem. 39:1568-1572 (1991).
Hansen, M. et al., "Antisense-mediated suppression of C-hordein biosynthesis in the barley grain results in correlated changes in the transcriptome, protein profile, and amino acid composition". J. Exp. Bot. 58:3987-3995 (2007).
Hough, J.S. et al., "Malting and brewing science. Volume II Hopped wort and beer". Chapman and Hall, New York, USA. ISBN 0412165902 (1982).
Iida, S. and Terada, R., "Modification of endogenous natural genes by gene targeting in rice and other higher plants". Plant Mol. Biol. 59:205-219 (2005).
Institute of Brewing, "Institute of Brewing. Methods of analysis". ISBN 0-900489-10-3 (1997).
Jamieson, A.M. and van Gheluwe, J.E.A., "Identification of a compound responsible for cardboard flavor in beer". Proc. Am. Soc. Brew. Chem. 29:192-197 (1970).
Kleinhofs, A. et al., "Induction and selection of specific gene mutations in Hordeum and Pisum". Mut. Res. 51:29-35 (1978) .
Kumar, S. et al., "Gene targeting in plants: fingers on the move". Trends Plant Sci. 11:159-161 (2006).
Kuroda, H. et al., "Characterization of factors involved in the production of 2(E)-nonenal during mashing". Biosci. Biotechnol. Biochem. 67:691-697 (2003).
Kuroda, H. et al., "Characterization of 9-fatty acid hydroperoxide lyase-like activity in germinating barley seeds that transforms 9(S)-hydroperoxy-10(E).12(Z)-octadecadienoic acid into 2(E)-nonenal". Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:16611668 (2005).
Lermusieau, G. et al., "Nonoxidative mechanism for development of trans-2-nonenal in beer". J. Am. Soc. Brew. Chem. 57:29-33 (1999).
Liegeois, С. et al., "Release of deuterated (E)-2-nonenal during beer aging from labeled precursors synthesized before boiling". J. Agric. Food Chem. 50:7634-7638 (2002).
Maquat, L.E. and Carmichael, G.G., "Quality control of mRNA function". Cell 104:173-176 (2001).
Meilgaard, M.C., "Flavor chemistry of beer: Part II: Flavor and threshold of 239 aroma volatiles". Tech. Q. MBAA 12:151-167 (1975).
Mendell, J.T. and Dietz, H.C., "When the message goes awry: Disease-producing mutations that influence mRNA content and performance". Cell 107:411-414 (2002).
Nevo, E., "Resources for Breeding of Wild Barley". In: "Barley: Genetics. Biochemistry. Molecular Biology and Biotechnology". Shewry. P.R., ed., pp. 3-18. C.A.B. International. ISBN 0-85198-725-7 (1992).
Nyborg, M. et al., "Investigations of the protective mechanism of sulfite against beer staling and formation of adducts with trans-2-nonenal". J. Am. Soc. Brew. Chem. 57:24-28 (1999).
Rasmussen, S.K. and Hatzack, F., "Identification of two low-phytate barley (Hordeum vulgare L.) grain mutants by TLC and genetic analysis". Hereditas 129:107-112 (1998).
Robbins, M.P. et al., "Gene manipulation of condensed tannins in higher plants". Plant Physiol. 116:1133-1144 (1998).
Sambrook, J. and Russell. D.W., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd Ed"., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. ISBN 0-87969-577-3 (2001) .
Schmitt, N.F. and van Mechelen. J.R., "Expression of lipoxygenase isoenzymes in developing barley grains". Plant Sci. 128:141-150 (1997).
Stahl, Y. et al., "Antisense downregulation of the barley limit dextrinase inhibitor modulates starch granule sizes distribution, starch composition and amylopectin structure". Plant J. 39:599-611 (2004).
Tzfira, T. and White. C, "Towards targeted mutagenesis and gene replacement in plants". Trends Biotechnol. 23:567-569
(2005).
von Bothmer, R. et al. , "Diversity in barley (Hordeum vulgare)". In: "Diversity in Barley (Hordeum vulgare)". von Bothmer, R., van Hintum, Т., Kntipffer, H., Sato. K., eds. , pp. 129-136. ISBN 0-444-50587-7 (2003) . Также предоставленный на http://www.genres.de/.
Wackerbauer, K. and Meyna, S., "Freie und triglyceride-gebundene Hydroxyfettsauren in Gerste und Malz", Monatsschrift fur Brauwissenschaft, heft 3/4: 52-57 (2002).
Wu, J. et al. , "Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) silences the accumulation of aberrant trypsin proteinase inhibitor mRNA in Nicotiana attenuata". Plant J. 51:693-706 (2007).
atgctgctgg gagggctgat cgacaccctc acgggggcga acaagagcgc ccggctcaag 60
ggcacggtgg tgctcatgcg caagaacgtg ctggacctca acgacttcgg cgccaccatc 120
atcgacggca tcggcgagtt cctcggcaag ggcgtcacct gccagcttat cagctccacc 180
gccgtcgacc aaggtaatca ctaccctcct ccggccttct cctctgttta caagatatag 240
tatttctttc gtgtgggccg gcggccatgg atggatggat gtgtctggat cggctaaaga 300
agataggata gctagccctg gccggtcgtc tttacctgag catgggcata tgccatcgaa 360
aaaagagaca acagcatgca tgcatggtgc gcgcaccaga ccacgcagag caccggatgc 420
tcgagacaaa gcaacacaac aagcaaggac gacacgtcaa aagcaacaca acaagcaagg 480
acggcacgtc aaaagcaaca caaacctaaa ctaaagcaca aagacgtaag agcaagcaca 540
caatcagcag gctataaaca gttgtcatca aaaacaacgc tggaagagag agagaaggaa 600
ggaagtagta gccatgaaaa attaaatcac cgggcgttgc tctttgccca acaattaatc 660
aagcaggata cgtggcatgt atagttcttg taagtaaact aagcatgtga tatgagaagg 720
tacgtggtgg tgcagacaac ggcggtcgcg ggaaggtggg cgcggaggcg gagctggagc 780
agtgggtgac gagcctgccg tcgctgacga cgggggagtc caagttcggc ctcaccttcg 840
actgggaggt ggagaagctc ggggtgccgg gcgccatcgt cgtcaacaac taccacagct 900
ccgagttcct gcttaaaacc atcaccctcc acgacgtccc cggccgcagc ggcaacctca 960
ccttcgtcgc caactcatgg atctaccccg ccgccaacta ccgatacagc cgcgtcttct 1020
tcgccaacga cgtgcgtgga ttttcctcta ctttcctctc ctttcatttt caccgccttc 1080
gtcattcatg gtcgatcatt aagtcttgcc aggacaatag atgatgagct aggagtggtt 1140
accacttagc agtacgtaca ttatttattc cgtgttggta gaaaaggata tggtttggtg 1200
cagatcgaca caagattgaa tgaaagttgc accgtggcac cgtggcagcg tggtaggtga 1260
aaataactgt tgcacggatc cacccacatg attgttttca tgaataaact ttttaaggat 1320
gtgtctagcc acatctagat gcatgtcaca taattattgc ataccaaaac gattaaatta 1380
agcataaaaa gaaaaggaaa aaaatactca catatctcga cgtaagatca atgatatagt 1440
atttagatat gcaatattta tcttacatct aaacctttct tcattcctaa atataagaca 1500
tttgtaagat ttcactatgg acaacatacg aaacaaaatc agtggatctc tctatgcatt 1560
cattatgtag tctataataa aatctttaaa agatcgtata ttttgcaacg gagggagtaa 1620
aacataactt tttaatagta atgttgcacg gctccacact cgcagacgta cctgccgagc 1680
cagatgccgg cggcgctgaa gccgtaccgc gacgacgagc tccggaacct gcgtggcgac 1740
gaccagcagg gcccgtacca ggagcacgac cgcatctacc gctacgacgt ctacaacgac 1800
ctcggcgagg gccgccccat cctcggcggc aactccgacc acccttaccc gcgccgcggc I860
cgcacggagc gcaagcccaa cgccagcgac ccgagcctgg agagccggct gtcgctgctg 1920
gagcagatct acgtgccgcg ggacgagaag ttcggccacc tcaagacgtc cgacttcctg 1980
ggctactcca tcaaggccat cacgcagggc atcctgccgg ccgtgcgcac ctacgtggac 2040
accacccccg gcgagttcga ctccttccag gacatcatca acctctatga gggcggcatc 2100
aagctgccca aggtggccgc cctggaggag ctccgtaagc agttcccgct ccagctcatc 2160
aaggacctcc tccccgtcgg cggcgactcc ctgcttaagc tccccgtgcc ccacatcatc 2220
caggagaaca agcaggcgtg gaggaccgac gaggagttcg cacgggaggt gctcgccggc 2280
gtcaacccgg tcatgatcac gcgtctcacg gtgagtcagc gattatttgt tcattgtgtg 2340
tgtatggtgt ccatggtgag aaagtgcaga tcttgatttg cgttgggtcg catgcacgca 2400
tgctgcatgc atgcaggagt tcccgccaaa aagtagtctg gaccctagca agtttggtga 2460
ccacaccagc accatcacgg cggagcacat agagaagaac ctcgagggcc tcacggtgca 2520
gcaggtaatt ggtccaagcc atcgacatca actatgattt acctaggagt aattggtagc 2580
tgtagataat ttggcttcgt tgcaattaat ttgatgctgg ccgatcaagt gatcgtattg 2640
ggtttgaaat ttgcaggcgc tggaaagcaa caggctgtac atccttgatc accatgaccg 2700
gttcatgccg ttcctgatcg acgtcaacaa cctgcccggc aacttcatct acgccacgag 2760
gaccctcttc ttcctgcgcg gcgacggcag gctcacgccg ctcgccatcg agctgagcga 2820
gcccatcatc cagggcggcc ttaccacggc caagagcaag gtttacacgc cggtgcccag 2880
cggctccgtc gaaggctggg tgtgggagct cgccaaggcc tacgtcgccg tcaatgactc 2940
cgggtggcac cagctcgtca gccactggta cgttctccac ggtcgatgtg attcagtcag 3000
tcgatgcaca acaactgatc gaaatatgat tgattgaaac gcgcaggctg aacactcacg 3060
cggtgatgga gccgttcgtg atctcgacga accggcacct tagcgtgacg cacccggtgc 3120
acaagctgct gagcccgcac taccgcgaca ccatgaccat caacgcgctg gcgcggcaga 3180
cgctcatcaa cgccggcggc atcttcgaga tgacggtgtt cccgggcaag ttcgcgttgg 3240
ggatgtcggc cgtggtgtac aaggactgga agttcaccga gcagggactg ccggacgatc 3300
tcatcaagag gtacgtacct ggtaaatgtt atgaatgtgt aaaacaaatt gggcgtctcg 3360
ctcactgaca ggaacgtggt aaaaaaaatg caggggcatg gcggtggagg acccgtcgag 3420
cccgtacaag gtgcggttgc tggtgtcgga ctacccgtac gcggcggacg ggctggcgat 3480
ctggcacgcc attgagcagt acgtgagcga gtacctggcc atctactacc cgaacgacgg 3540
cgtgctgcag ggcgatacgg aggtgcaggc gtggtggaag gagacgcgcg aggtcgggca 3600
cggcgacctc aaggacgccc catggtggcc caagatgcaa agtgtgccgg agctggccaa 3660
ggcgtgcacc accatcatct ggatcgggtc ggcgctgcat gcggcagtca acttcgggca 3720
gtacccctac gcggggttcc tcccgaaccg gccgacggtg agccggcgcc gcatgccgga 3780
gcccggcacg gaggagtacg cggagctgga gcgcgacccg gagcgggcct tcatccacac 3840
catcacgagc cagatccaga ccatcatcgg cgtgtcgctg ctggaggtgc tgtcgaagca 3900
ctcctccgac gagctgtacc tcgggcagcg ggacacgccg gagtggacct cggacccaaa 3960
ggccctggag gtgttcaagc ggttcagcga ccggctggtg gagatcgaga gcaaggtggt 4020
gggcatgaac catgacccgg agctcaagaa ccgcaacggc ccggctaagt ttccctacat 4080
gctgctctac cccaacacct ccgaccacaa gggcgccgct gccgggctta ccgccaaggg 4140
catccccaac agcatctcca tctaa 4165
<210> 2 <211> 4165 <212> ДНК
<213> Hordeum vulgare мутант D112 <400> 2
atgctgctgg gagggctgat cgacaccctc acgggggcga acaagagcgc ccggctcaag 60
ggcacggtgg tgctcatgcg caagaacgtg ctggacctca acgacttcgg cgccaccatc 120
atcgacggca tcggcgagtt cctcggcaag ggcgtcacct gccagcttat cagctccacc 180
gccgtcgacc aaggtaatca ctaccctcct ccggccttct cctctgttta caagatatag 240
tatttctttc gtgtgggccg gcggccatgg atggatggat gtgtctggat cggctaaaga 300
agataggata gctagccctg gccggtcgtc tttacctgag catgggcata tgccatcgaa 360
aaaagagaca acagcatgca tgcatggtgc gcgcaccaga ccacgcagag caccggatgc 420
tcgagacaaa gcaacacaac aagcaaggac gacacgtcaa aagcaacaca acaagcaagg 480
acggcacgtc aaaagcaaca caaacctaaa ctaaagcaca aagacgtaag agcaagcaca 540
caatcagcag gctataaaca gttgtcatca aaaacaacgc tggaagagag agagaaggaa 600
ggaagtagta gccatgaaaa attaaatcac cgggcgttgc tctttgccca acaattaatc 660
aagcaggata cgtggcatgt atagttcttg taagtaaact aagcatgtga tatgagaagg 720
tacgtggtgg tgcagacaac ggcggtcgcg ggaaggtggg cgcggaggcg gagctggagc 780
agtgggtgac gagcctgccg tcgctgacga cgggggagtc caagttcggc ctcaccttcg 840
actgggaggt ggagaagctc ggggtgccgg gcgccatcgt cgtcaacaac taccacagct 900
ccgagttcct gcttaaaacc atcaccctcc acgacgtccc cggccgcagc ggcaacctca 960
ccttcgtcgc caactcatgg atctaccccg ccgccaacta ccgatacagc cgcgtcttct 1020
tcgccaacga cgtgcgtgga ttttcctcta ctttcctctc ctttcatttt caccgccttc 1080
gtcattcatg gtcgatcatt aagtcttgcc aggacaatag atgatgagct aggagtggtt 1140
accacttagc agtacgtaca ttatttattc cgtgttggta gaaaaggata tggtttggtg 1200
cagatcgaca caagattgaa tgaaagttgc accgtggcac cgtggcagcg tggtaggtga 1260
aaataactgt tgcacggatc cacccacatg attgttttca tgaataaact ttttaaggat 1320
gtgtctagcc acatctagat gcatgtcaca taattattgc ataccaaaac gattaaatta 1380
agcataaaaa gaaaaggaaa aaaatactca catatctcga cgtaagatca atgatatagt 1440
atttagatat gcaatattta tcttacatct aaacctttct tcattcctaa atataagaca 1500
tttgtaagat ttcactatgg acaacatacg aaacaaaatc agtggatctc tctatgcatt 1560
cattatgtag tctataataa aatctttaaa agatcgtata ttttgcaacg gagggagtaa 1620
aacataactt tttaatagta atgttgcacg gctccacact cgcagacgta cctgccgagc 1680
cagatgccgg cggcgctgaa gccgtaccgc gacgacgagc tccggaacct gcgtggcgac 1740
gaccagcagg gcccgtacca ggagcacgac cgcatctacc gctacgacgt ctacaacgac 1800
ctcggcgagg gccgccccat cctcggcggc aactccgacc acccttaccc gcgccgcggc I860
cgcacggagc gcaagcccaa cgccagcgac ccgagcctgg agagccggct gtcgctgctg 1920
gagcagatct acgtgccgcg ggacgagaag ttcggccacc tcaagacgtc cgacttcctg 1980
ggctactcca tcaaggccat cacgcagggc atcctgccgg ccgtgcgcac ctacgtggac 2040
accacccccg gcgagttcga ctccttccag gacatcatca acctctatga gggcggcatc 2100
aagctgccca aggtggccgc cctggaggag ctccgtaagc agttcccgct ccagctcatc 2160
aaggacctcc tccccgtcgg cggcgactcc ctgcttaagc tccccgtgcc ccacatcatc 2220
caggagaaca agcaggcgtg gaggaccgac gaggagttcg cacgggaggt gctcgccggc 2280
gtcaacccgg tcatgatcac gcgtctcacg gtgagtcagc gattatttgt tcattgtgtg 2340
tgtatggtgt ccatggtgag aaagtgcaga tcttgatttg cgttgggtcg catgcacgca 2400
tgctgcatgc atgcaggagt tcccgccaaa aagtagtctg gaccctagca agtttggtga 2460
ccacaccagc accatcacgg cggagcacat agagaagaac ctcgagggcc tcacggtgca 2520
gcaggtaatt ggtccaagcc atcgacatca actatgattt acctaggagt aattggtagc 2580
tgtagataat ttggcttcgt tgcaattaat ttgatgctgg ccgatcaagt gatcgtattg 2640
ggtttgaaat ttgcaggcgc tggaaagcaa caggctgtac atccttgatc accatgaccg 2700
gttcatgccg ttcctgatcg acgtcaacaa cctgcccggc aacttcatct acgccacgag 2760
gaccctcttc ttcctgcgcg gcgacggcag gctcacgccg ctcgccatcg agctgagcga 2820
gcccatcatc cagggcggcc ttaccacggc caagagcaag gtttacacgc cggtgcccag 2880
cggctccgtc gaaggctggg tgtgggagct cgccaaggcc tacgtcgccg tcaatgactc 2940
cgggtggcac cagctcgtca gccactggta cgttctccac ggtcgatgtg attcagtcag 3000
tcgatgcaca acaactgatc gaaatatgat tgattgaaac gcgcaggctg aacactcacg 3060
cggtgatgga gccgttcgtg atctcgacga accggcacct tagcgtgacg cacccggtgc 3120
acaagctgct gagcccgcac taccgcgaca ccatgaccat caacgcgctg gcgcggcaga 3180
cgctcatcaa cgccggcggc atcttcgaga tgacggtgtt cccgggcaag ttcgcgttgg 3240
ggatgtcggc cgtggtgtac aaggactgga agttcaccga gcagggactg ccggacgatc 3300
tcatcaagag gtacgtacct ggtaaatgtt atgaatgtgt aaaacaaatt gggcgtctcg 3360
ctcactgaca ggaacgtggt aaaaaaaatg caggggcatg gcggtggagg acccgtcgag 3420
cccgtacaag gtgcggttgc tggtgtcgga ctacccgtac gcggcggacg ggctggcgat 3480
ctggcacgcc attgagcagt acgtgagcga gtacctggcc atctactacc cgaacgacgg 3540
cgtgctgcag ggcgatacgg aggtgcaggc gtgatggaag gagacgcgcg aggtcgggca 3600
cggcgacctc aaggacgccc catggtggcc caagatgcaa agtgtgccgg agctggccaa 3660
ggcgtgcacc accatcatct ggatcgggtc ggcgctgcat gcggcagtca acttcgggca 3720
gtacccctac gcggggttcc tcccgaaccg gccgacggtg agccggcgcc gcatgccgga 3780
gcccggcacg gaggagtacg cggagctgga gcgcgacccg gagcgggcct tcatccacac 3840
catcacgagc cagatccaga ccatcatcgg cgtgtcgctg ctggaggtgc tgtcgaagca 3900
ctcctccgac gagctgtacc tcgggcagcg ggacacgccg gagtggacct cggacccaaa 3960
ggccctggag gtgttcaagc ggttcagcga ccggctggtg gagatcgaga gcaaggtggt 4020
gggcatgaac catgacccgg agctcaagaa ccgcaacggc ccggctaagt ttccctacat 4080
gctgctctac cccaacacct ccgaccacaa gggcgccgct gccgggctta ccgccaaggg 4140
catccccaac agcatctcca tctaa 4165
<210> 3 <211> 862 <212> БЕЛОК
<213> Hordeum vulgare сорт Barke <400> 3
Met Leu Leu Gly Gly Leu lie Asp Thr Leu Thr Gly Ala Asn Lys Ser
15 10 15
Ala Arg Leu Lys Gly Thr Val Val Leu Met Arg Lys Asn Val Leu Asp
20 25 30
Leu Asn Asp Phe Gly Ala Thr lie lie Asp Gly lie Gly Glu Phe Leu
35 40 45
Gly Lys Gly Val Thr Cys Gin Leu lie Ser Ser Thr Ala Val Asp Gin
50 55 60
Asp Asn Gly Gly Arg Gly Lys Val Gly Ala Glu Ala Glu Leu Glu Gin
65 70 75 80
Trp Val Thr Ser Leu Pro Ser Leu Thr Thr Gly Glu Ser Lys Phe Gly
85 90 95
Leu Thr Phe Asp Trp Glu Val Glu Lys Leu Gly Val Pro Gly Ala lie
100 105 110
Val Val Asn Asn Tyr His Ser Ser Glu Phe Leu Leu Lys Thr lie Thr
115 120 125
Leu His Asp Val Pro Gly Arg Ser Gly Asn Leu Thr Phe Val Ala Asn
130 135 140
Ser Trp lie Tyr Pro Ala Ala Asn Tyr Arg Tyr Ser Arg Val Phe Phe
145 150 155 160
Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro Ser Gin Met Pro Ala Ala Leu Lys Pro
165 170 175
Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin Gin Gly
180 185 190
Pro Tyr Gin Glu His Asp Arg lie Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr Asn Asp
195 200 205
Leu Gly Glu Gly Arg Pro lie Leu Gly Gly Asn Ser Asp His Pro Tyr
210 215 220
Pro Arg Arg Gly Arg Thr Glu Arg Lys Pro Asn Ala Ser Asp Pro Ser
225 230 235 240
Leu Glu Ser Arg Leu Ser Leu Leu Glu Gin lie Tyr Val Pro Arg Asp
245 250 255
Glu Lys Phe Gly His Leu Lys Thr Ser Asp Phe Leu Gly Tyr Ser lie
260 265 270
Lys Ala lie Thr Gin Gly lie Leu Pro Ala Val Arg Thr Tyr Val Asp
275 280 285
Thr Thr Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Gin Asp lie lie Asn Leu Tyr
290 295 300
Glu Gly Gly lie Lys Leu Pro Lys Val Ala Ala Leu Glu Glu Leu Arg
305 310 315 320
Lys Gin Phe Pro Leu Gin Leu lie Lys Asp Leu Leu Pro Val Gly Gly
325 330 335
Asp Ser Leu Leu Lys Leu Pro Val Pro His lie lie Gin Glu Asn Lys
340 345 350
Gin Ala Trp Arg Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Val Leu Ala Gly
355 360 365
Val Asn Pro Val Met lie Thr Arg Leu Thr Glu Phe Pro Pro Lys Ser
370 375 380
Ser Leu Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asp His Thr Ser Thr lie Thr Ala
385 390 395 400
Glu His lie Glu Lys Asn Leu Glu Gly Leu Thr Val Gin Gin Ala Leu
405 410 415
Glu Ser Asn Arg Leu Tyr lie Leu Asp His His Asp Arg Phe Met Pro
420 425 430
Phe Leu lie Asp Val Asn Asn Leu Pro Gly Asn Phe lie Tyr Ala Thr
435 440 445
Arg Thr Leu Phe Phe Leu Arg Gly Asp Gly Arg Leu Thr Pro Leu Ala
450 455 460
lie Glu Leu Ser Glu Pro lie lie Gin Gly Gly Leu Thr Thr Ala Lys
465 470 475 480
Ser Lys Val Tyr Thr Pro Val Pro Ser Gly Ser Val Glu Gly Trp Val
485 490 495
Trp Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Val Ala Val Asn Asp Ser Gly Trp His
500 505 510
Gin Leu Val Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Val Met Glu Pro Phe
515 520 525
Val lie Ser Thr Asn Arg His Leu Ser Val Thr His Pro Val His Lys
530 535 540
Leu Leu Ser Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Thr lie Asn Ala Leu Ala
545 550 555 560
Arg Gin Thr Leu lie Asn Ala Gly Gly lie Phe Glu Met Thr Val Phe
565 570 575
Pro Gly Lys Phe Ala Leu Gly Met Ser Ala Val Val Tyr Lys Asp Trp
580 585 590
Lys Phe Thr Glu Gin Gly Leu Pro Asp Asp Leu lie Lys Arg Gly Met
595 600 605
Ala Val Glu Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Lys Val Arg Leu Leu Val Ser
610 615 620
Asp Tyr Pro Tyr Ala Ala Asp Gly Leu Ala lie Trp His Ala lie Glu
625 630 635 640
Gin Tyr Val Ser Glu Tyr Leu Ala lie Tyr Tyr Pro Asn Asp Gly Val
645 650 655
Leu Gin Gly Asp Thr Glu Val Gin Ala Trp Trp Lys Glu Thr Arg Glu
660 665 670
Val Gly His Gly Asp Leu Lys Asp Ala Pro Trp Trp Pro Lys Met Gin
675 680 685
Ser Val Pro Glu Leu Ala Lys Ala Cys Thr Thr lie lie Trp lie Gly
690 695 700
Ser Ala Leu His Ala Ala Val Asn Phe Gly Gin Tyr Pro Tyr Ala Gly
705 710 715 720
Phe Leu Pro Asn Arg Pro Thr Val Ser Arg Arg Arg Met Pro Glu Pro
725 730 735
Gly Thr Glu Glu Tyr Ala Glu Leu Glu Arg Asp Pro Glu Arg Ala Phe
740 745 750
lie His Thr lie Thr Ser Gin lie Gin Thr lie lie Gly Val Ser Leu
755 760 765
Leu Glu Val Leu Ser Lys His Ser Ser Asp Glu Leu Tyr Leu Gly Gin
770 775 780
Arg Asp Thr Pro Glu Trp Thr Ser Asp Pro Lys Ala Leu Glu Val Phe
785 790 795 800
Lys Arg Phe Ser Asp Arg Leu Val Glu lie Glu Ser Lys Val Val Gly
805 810 815
Met Asn His Asp Pro Glu Leu Lys Asn Arg Asn Gly Pro Ala Lys Phe
820 825 830
Pro Tyr Met Leu Leu Tyr Pro Asn Thr Ser Asp His Lys Gly Ala Ala
835 840 845
Ala Gly Leu Thr Ala Lys Gly lie Pro Asn Ser lie Ser lie
850 855 860
<210> 4 <211> 665 <212> БЕЛОК
<213> Hordeum vulgare мутант D112 <400> 4
Met Leu Leu Gly Gly Leu lie Asp Thr Leu Thr Gly Ala Asn Lys Ser
15 10 15
Ala Arg Leu Lys Gly Thr Val Val Leu Met Arg Lys Asn Val Leu Asp
20 25 30
Leu Asn Asp Phe Gly Ala Thr lie lie Asp Gly lie Gly Glu Phe Leu
35 40 45
Gly Lys Gly Val Thr Cys Gin Leu lie Ser Ser Thr Ala Val Asp Gin
50 55 60
Asp Asn Gly Gly Arg Gly Lys Val Gly Ala Glu Ala Glu Leu Glu Gin
65 70 75 80
Trp Val Thr Ser Leu Pro Ser Leu Thr Thr Gly Glu Ser Lys Phe Gly
85 90 95
Leu Thr Phe Asp Trp Glu Val Glu Lys Leu Gly Val Pro Gly Ala lie
100 105 110
Val Val Asn Asn Tyr His Ser Ser Glu Phe Leu Leu Lys Thr lie Thr
115 120 125
Leu His Asp Val Pro Gly Arg Ser Gly Asn Leu Thr Phe Val Ala Asn
130 135 140
Ser Trp lie Tyr Pro Ala Ala Asn Tyr Arg Tyr Ser Arg Val Phe Phe
145 150 155 160
Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro Ser Gin Met Pro Ala Ala Leu Lys Pro
165 170 175
Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin Gin Gly
180 185 190
Pro Tyr Gin Glu His Asp Arg lie Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr Asn Asp
195 200 205
Leu Gly Glu Gly Arg Pro lie Leu Gly Gly Asn Ser Asp His Pro Tyr
210 215 220
Pro Arg Arg Gly Arg Thr Glu Arg Lys Pro Asn Ala Ser Asp Pro Ser
225 230 235 240
Leu Glu Ser Arg Leu Ser Leu Leu Glu Gin lie Tyr Val Pro Arg Asp
245 250 255
Glu Lys Phe Gly His Leu Lys Thr Ser Asp Phe Leu Gly Tyr Ser lie
260 265 270
Lys Ala lie Thr Gin Gly lie Leu Pro Ala Val Arg Thr Tyr Val Asp
275 280 285
Thr Thr Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Gin Asp lie lie Asn Leu Tyr
290 295 300
Glu Gly Gly lie Lys Leu Pro Lys Val Ala Ala Leu Glu Glu Leu Arg
305 310 315 320
Lys Gin Phe Pro Leu Gin Leu lie Lys Asp Leu Leu Pro Val Gly Gly
325 330 335
Asp Ser Leu Leu Lys Leu Pro Val Pro His lie lie Gin Glu Asn Lys
340 345 350
Gin Ala Trp Arg Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Val Leu Ala Gly
355 360 365
Val Asn Pro Val Met lie Thr Arg Leu Thr Glu Phe Pro Pro Lys Ser
370 375 380
Ser Leu Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asp His Thr Ser Thr lie Thr Ala
385 390 395 400
Glu His lie Glu Lys Asn Leu Glu Gly Leu Thr Val Gin Gin Ala Leu
405 410 415
Glu Ser Asn Arg Leu Tyr lie Leu Asp His His Asp Arg Phe Met Pro
420 425 430
Phe Leu lie Asp Val Asn Asn Leu Pro Gly Asn Phe lie Tyr Ala Thr
435 440 445
Arg Thr Leu Phe Phe Leu Arg Gly Asp Gly Arg Leu Thr Pro Leu Ala
450 455 460
lie Glu Leu Ser Glu Pro lie lie Gin Gly Gly Leu Thr Thr Ala Lys
465 470 475 480
Ser Lys Val Tyr Thr Pro Val Pro Ser Gly Ser Val Glu Gly Trp Val
485 490 495
Trp Glu Leu Ala Lys Ala Tyr Val Ala Val Asn Asp Ser Gly Trp His
500 505 510
Gin Leu Val Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Val Met Glu Pro Phe
515 520 525
Val lie Ser Thr Asn Arg His Leu Ser Val Thr His Pro Val His Lys
530 535 540
Leu Leu Ser Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Thr lie Asn Ala Leu Ala
545 550 555 560
Arg Gin Thr Leu lie Asn Ala Gly Gly lie Phe Glu Met Thr Val Phe
565 570 575
Pro Gly Lys Phe Ala Leu Gly Met Ser Ala Val Val Tyr Lys Asp Trp
580 585 590
Lys Phe Thr Glu Gin Gly Leu Pro Asp Asp Leu lie Lys Arg Gly Met
595 600 605
Ala Val Glu Asp Pro Ser Ser Pro Tyr Lys Val Arg Leu Leu Val Ser
610 615 620
Asp Tyr Pro Tyr Ala Ala Asp Gly Leu Ala lie Trp His Ala lie Glu
625 630 635 640
Gin Tyr Val Ser Glu Tyr Leu Ala lie Tyr Tyr Pro Asn Asp Gly Val
645 650 655
Leu Gin Gly Asp Thr Glu Val Gin Ala 660 665
<210> 5 <211> 3229 <212> ДНК
<213> Hordeum vulgare сорт Barke <400> 5
atgtttggcg tcggcggcat cgtgagcgac ctgacggggg gcctccgggg cgcccacctc 60
aagggctccg tcgtcctcat gcgcaagaac gcgctcgact tcaacgactt cggcgccacc 120
gtcatggacg gcgtcaccga gctcctcggc cgcggcgtca cctgccagct catcagctcc 180
accaacgtcg accacagtga gcactcactc gccactcccc gttttgtaat ccctgccact 240
gtgatacatg gaaaacggaa gcagatccgc atcctcacgc ccgaaccaag caaataatat 300
atataaagaa ctaaaatgca cgtatggtta cggatgcatg cttatgcttg agcttgagct 360
tgagcttgag agacagggac gtgcaaaaaa taacttaata atggagtaac taatgtgaga 420
catgacgcac ggaggggttt accttactac taattaattg tcgagcagac aacggtgggc 480
gcgggaaggt gggcgcggag gcgaacctgg agcagtggct cctgccgacg aacctgccgt 540
tcatcaccac cggcgagaac aagttcgccg tcaccttcga ctggtcggtg gacaagctgg 600
gggtgccggg ggccatcatc gtcaagaaca accacgcctc cgagttcttc ctcaagacca 660
tcaccctcga caacgtgccc ggccgcggca ccatcgtctt cgtcgccaac tcatgggtct 720
acccgcaggc caagtaccgc tacaaccgcg tcttcttcgc caacgacgtg agtattttat 780
acgagtacca ctccatggta gctagtacga tggatttcgc ttgctcgatg cctgactggt 840
cggttccgtt gggacatacg tgccgcagac gtacctgccg caccagatgc cggcggcgct 900
gaagccgtac cgcgacgacg agctccggaa cctgaggggc gacgaccagc aggggcccta 960
cctggaccac gaccgcgtct accgctacga cgtctacaac gacctcggcg actcccgcga 1020
cgtcctcggc ggctccaagg acctccccta cccgcgccgc tgccgcaccg gccggaagcc 1080
ctcggacagc agtgcgtgtc tcctcccttc tccttccttt cgatctcccc ataacgtgta 1140
cttggtctga caagcatgtg tggccgacgc agagcccgac cacgagagcc ggctgctgcc 1200
gctggtgcag aacgtctacg tgccgcgcga cgagctcttc ggccacctca agcagtcgga 1260
cttcctgggc tacacgctca aggcgctggt ggacgggatc ataccggcca tccgcaccta 1320
cgtcgacctc tcccccggcg agttcgactc cttcgccgac atcctcaagc tctacgaggg 1380
cggcatcaag ctgcccaaca tcccggccct cgaggaggtg cgcaagcgct tcccgctcca 1440
gctcgtcaag gacctcatcc ccaagggcgg cgacttcctc ctcaagctcc ccaagccgga 1500
gatcatcaag gtagaccaga aagcgtggat gactgacgag gagttcgcca gggagatgct 1560
cgccggcgtc aaccccatga tgatcaaacg cctcaccgtg agtgacccac tccatctacc 1620
ggccattgaa caaaatcgtc catacatgtc actaatcaat actcacaccg ttttgaccgc 1680
gtgtgcagga gttccctccc aagagcactc tggatccgag caagtacggc gaccacacca 1740
gcaccatgac cgaggagcac gtggccaaga gcctggaggg cctcaccgtg cagcaggcgc 1800
tcgccggcaa caggctctac atcgtagacc agcacgacaa cctgatgccg ttcctgatcg I860
acatcaacaa cctcgacgcc agcttcgtgt acgccacaag gacgctgctc ttcctgcgag 1920
gggacggcac gctggcgccg gtcgccatcg agctgagctc gccgctgatc cagggcgagc 1980
tgaccaccgc caagagcgcc gtgtacacgc cgcagcacgc cggcgtggag ggctggatat 2040
ggcagctcgc caaggcctac gcctccgtga acgactacgg gtggcaccag ctcatcagcc 2100
actggctcaa cacgcacgcc gtcatggagc ccttcgtcat cgccaccaac aggcagctca 2160
gcgtcaccca cccggtctac aagctcctgc acccgcacta ccgcgacacc atgaacatca 2220
acgcgcgggc gcgcgggctg ctcatcaacg ccggcggcgt catcgagatg accgtgttcc 2280
cgcacaagca cgccatgccc atgtcctcca tggtctacaa gcactggaac ttcaccgaac 2340
aagctctccc cgccgatcta atcaagaggt gcaacatgtt tacattatat aattgacgaa 2400
acggtccttg atttgatcaa aatgattaat cgatcttgat ggttgatgat gatgtagggg 2460
catggcggtg gaggacgcat cgagcccgca caaggtgcgg ctgctgatca aggactaccc 2520
gtacgcgacc gacgggctgg ccgtgtggga cgccatcgag cagtgggtgt cggactacct 2580
gaccatctac taccccaacg acggcgtgct gcagggcgac gtggagctgc aggcgtggtg 2640
gaaggaggtg agggaggtcg ggcacggcga cctcaaggac gcggcgtggt ggccaaagat 2700
gcagacggtg gcggagctga tcaaggcgtg cgccaccatc atctggaccg ggtcggcgct 2760
ccacgcggcc gtcaacttcg ggcagtaccc ctactcgggc taccacccca acaagccgtc 2820
ggcgagccgg aggccgatgc cggtgcaggg gagcgaggag tacgcggagc tggagcgaga 2880
cccggagaag gccttcatcc gcaccatcac cagccagttc catgccctgg tgggcatctc 2940
gctcatggag atcctctcca agcactcctc cgacgaggtc tacctgggcc agcacgacac 3000
gccggcgtgg acgtcggacg ccaaggcgct ggaggcgttc aagcggttcg gggcgaagct 3060
ggagggcatc gagaagcagg tggtggccat gaactcggac ccgcagctaa agaaccgcac 3120
cgggccggcc aagttcccat acatgctgct ctacccaaac acctccgacc acacgggaca 3180
ggccgagggg ctcaccgcca ggggcatccc gaacagcata tccatctga 3229
<210> 6 <211> 3229 <212> ДНК
<213> Hordeum vulgare Мутант A689 <400> 6
atgtttggcg tcggcggcat cgtgagcgac ctgacggggg gcctccgggg cgcccacctc 60 aagggctccg tcgtcctcat gcgcaagaac gcgctcgact tcaacgactt cggcgccacc 120 gtcatggacg gcgtcaccga gctcctcggc cgcggcgtca cctgccagct catcagctcc 180
accaacgtcg accacagtga gcactcactc gccactcccc gttttgtaat ccctgccact 240
gtgatacatg gaaaacggaa gcagatccgc atcctcacgc ccgaaccaag caaataatat 300
atataaagaa ctaaaatgca cgtatggtta cggatgcatg cttatgcttg agcttgagct 360
tgagcttgag agacagggac gtgcaaaaaa taacttaata atggagtaac taatgtgaga 420
catgacgcac ggaggggttt accttactac taattaattg tcgagcagac aacggtgggc 480
gcgggaaggt gggcgcggag gcgaacctgg agcagtggct cctgccgacg aacctgccgt 540
tcatcaccac cggcgagaac aagttcgccg tcaccttcga ctggtcggtg gacaagctgg 600
gggtgccggg ggccatcatc gtcaagaaca accacgcctc cgagttcttc ctcaagacca 660
tcaccctcga caacgtgccc ggccgcggca ccatcgtctt cgtcgccaac tcatgggtct 720
acccgcaggc caagtaccgc tacaaccgcg tcttcttcgc caacgacgtg agtattttat 780
acgagtacca ctccatggta gctagtacga tggatttcgc ttgctcgatg cctgactggt 840
cggttccgtt gggacatacg tgccgcagac gtacctgccg caccagatgc cggcggcgct 900
gaagccgtac cgcgacgacg agctccggaa cctgaggggc gacgaccagc aggggcccta 960
cctggaccac gaccgcgtct accgctacga cgtctacaac gacctcggcg actcccgcga 1020
cgtcctcggc ggctccaagg acctccccta cccgcgccgc tgccgcaccg gccggaagcc 1080
ctcggacagc agtgcgtgtc tcctcccttc tccttccttt cgatctcccc ataacgtgta 1140
cttggtctga caagcatgtg tggccgacgc agagcccgac cacgagagcc ggctgctgcc 1200
gctggtgcag aacgtctacg tgccgcgcga cgagctcttc ggccacctca agcagtcgga 1260
cttcctgggc tacacgctca aggcgctggt ggacgggatc ataccggcca tccgcaccta 1320
cgtcgacctc tcccccggcg agttcgactc cttcgccgac atcctcaagc tctacgaggg 1380
cggcatcaag ctgcccaaca tcccggccct cgaggaggtg cgcaagcgct tcccgctcca 1440
gctcgtcaag gacctcatcc ccaagggcgg cgacttcctc ctcaagctcc ccaagccgga 1500
gatcatcaag gtagaccaga aagcgtggat gactgacgag gagttcgcca gggagatgct 1560
cgccggcgtc aaccccatga tgatcaaacg cctcaccgtg agtgacccac tccatctacc 1620
ggccattgaa caaaatcgtc catacatgtc actaatcaat actcacaccg ttttgaccgc 1680
gtgtgcagga gttccctccc aagagcactc tggatccgag caagtacggc gaccacacca 1740
gcaccatgac cgaggagcac gtggccaaga gcctggaggg cctcaccgtg cagcaggcgc 1800
tcgccggcaa caggctctac atcgtagacc agcacgacaa cctgatgccg ttcctgatcg I860
acatcaacaa cctcgacgcc agcttcgtgt acgccacaag gacgctgctc ttcctgcgag 1920
gggacggcac gctggcgccg gtcgccatcg agctgagctc gccgctgatc cagggcgagc 1980
tgaccaccgc caagagcgcc gtgtacacgc cgcagcacgc cggcgtggag ggctggatat 2040
ggcagctcgc caaggcctac gcctccgtga acgactacgg gtggcaccag ctcatcagcc 2100
actggctcaa cacgcacgcc gtcatggagc ccttcgtcat cgccaccaac aggcagctca 2160
gcgtcaccca cccggtctac aagctcctgc acccgcacta ccgcgacacc atgaacatca 2220
acgcgcgggc gcgcgggctg ctcatcaacg ccggcggcgt catcgagatg accgtgttcc 2280
cgcacaagca cgccatgccc atgtcctcca tggtctacaa gcactggaac ttcaccgaac 2340
aagctctccc cgccgatcta atcaagaggt gcaacatgtt tacattatat aattgacgaa 2400
acggtccttg atttgatcaa aatgattaat cgatcttgat ggttgatgat gatgtagggg 2460
catggcggtg gaggacgcat cgagcccgca caaggtgcgg ctgctgatca aggactaccc 2520
gtacgcgacc gacgggctgg ccgtgtggga cgccatcgag cagtgggtgt cggactacct 2580
gaccatctac taccccaacg acggcgtgct gcagggcgac gtggagctgc aggcgtggtg 2640
gaaggaggtg agggaggtcg ggcacggcga cctcaaggac gcggcgtgat ggccaaagat 2700
gcagacggtg gcggagctga tcaaggcgtg cgccaccatc atctggaccg ggtcggcgct 2760
ccacgcggcc gtcaacttcg ggcagtaccc ctactcgggc taccacccca acaagccgtc 2820
ggcgagccgg aggccgatgc cggtgcaggg gagcgaggag tacgcggagc tggagcgaga 2880
cccggagaag gccttcatcc gcaccatcac cagccagttc catgccctgg tgggcatctc 2940
gctcatggag atcctctcca agcactcctc cgacgaggtc tacctgggcc agcacgacac 3000
gccggcgtgg acgtcggacg ccaaggcgct ggaggcgttc aagcggttcg gggcgaagct 3060
ggagggcatc gagaagcagg tggtggccat gaactcggac ccgcagctaa agaaccgcac 3120
cgggccggcc aagttcccat acatgctgct ctacccaaac acctccgacc acacgggaca 3180
ggccgagggg ctcaccgcca ggggcatccc gaacagcata tccatctga 3229
<210> 7 <211> 864 <212> БЕЛОК
<213> Hordeum vulgare сорт Barke <400> 7
Met Leu Gly Val Gly Gly lie Val Ser Asp Leu Thr Gly Gly lie Arg
Gly Ala His Leu Lys Gly Ser Val Val Leu Met Arg Lys Asn Ala Leu
20 25 30
Asp Phe Asn Asp Phe Gly Ala His Val Met Asp Gly Val Thr Glu Leu
35 40 45
Leu Gly Arg Gly Val Thr Cys Gin Leu lie Ser Ser Thr Asn Val Asp
His Asn Asn Gly Gly Arg Gly Lys Val Gly Ala Glu Ala Asn Leu Glu
65 70 75 80
Gin Trp Leu Leu Pro Thr Asn Leu Pro Phe lie Thr Thr Gly Glu Asn
85 90 95
Lys Phe Ala Val Thr Phe Asp Trp Ser Val Asp Lys Leu Gly Val Pro
100 105 110
Gly Ala lie lie Val Lys Asn Asn His Ala Ser Glu Phe Phe Leu Lys
115 120 125
Thr lie Thr Leu Asp Asn Val Pro Gly Arg Gly Thr lie Val Phe Val
130 135 140
Ala Asn Ser Trp Val Tyr Pro Gin Ala Lys Tyr Arg Tyr Asn Arg Val
145 150 155 160
Phe Phe Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro His Gin Met Pro Ala Ala Leu
165 170 175
Lys Pro Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin
180 185 190
Gin Gly Pro Tyr Leu Asp His Asp Arg Val Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr
195 200 205
Asn Asp Leu Gly Asp Ser Arg Asp Val Leu Gly Gly Ser Lys Asp Leu
210 215 220
Pro Tyr Pro Arg Arg Cys Arg Thr Gly Arg Lys Pro Ser Asp Ser Lys
225 230 235 240
Pro Asp His Glu Ser Arg Leu Leu Leu Leu Val Gin Asn Val Tyr Val
245 250 255
Leu Arg Asp Glu Leu Phe Gly His Leu Lys Gin Ser Asp Leu Leu Gly
260 265 270
Tyr Thr Leu Lys Gly Trp Leu Asp Gly lie lie Leu Ala lie Arg Thr
275 280 285
Tyr Val Asp Leu Ser Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Ala Asp lie Leu
290 295 300
Lys Leu Tyr Glu Gly Gly lie Lys Leu Pro Asn lie Pro Ala Leu Glu
305 310 315 320
Glu Val Arg Lys Arg Phe Pro Leu Gin Leu Val Lys Asp Leu lie Pro
325 330 335
Lys Gly Gly Asp Phe Leu Leu Lys Leu Pro Lys Pro Glu lie lie Lys
340 345 350
Val Asp Gin Lys Ala Trp Met Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Met
355 360 365
Leu Ala Gly Val Asn Pro Met Met lie Lys Arg Leu Thr Glu Phe Pro
370 375 380
Pro Lys Ser Thr Leu Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Asp His Thr Ser Thr
385 390 395 400
Met Thr Glu Glu His Val Ala Lys Ser Leu Glu Gly Leu Thr Val Gin
405 410 415
Gin Ala Leu Ala Gly Asn Arg Leu Tyr lie Val Asp Gin His Asp Asn
420 425 430
Leu Met Pro Phe Leu lie Asp lie Asn Asn Leu Asp Ala Ser Phe Val
435 440 445
Tyr Ala Thr Arg Thr Leu Leu Phe Leu Arg Gly Asp Gly Thr Leu Ala
450 455 460
Pro Val Ala lie Glu Leu Ser Ser Pro Leu lie Gin Gly Glu Leu Thr
465 470 475 480
Thr Ala Lys Ser Ala Val Tyr Thr Pro Gin His Ala Gly Val Glu Gly
485 490 495
Trp lie Trp Gin Leu Ala Lys Ala Tyr Ala Ser Val Asn Asp Tyr Gly
500 505 510
Trp His Gin Leu lie Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Val Met Glu
515 520 525
Pro Phe Val lie Ala Thr Asn Arg Gin Leu Ser Val Thr His Pro Val
530 535 540
Tyr Lys Leu Leu His Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Asn lie Asn Ala
545 550 555 560
Arg Ala Arg Gly Leu Leu lie Asn Ala Gly Gly Val lie Glu Met Thr
565 570 575
Val Phe Pro His Lys His Ala Met Pro Met Ser Ser Met Val Tyr Lys
580 585 590
His Trp Asn Phe Thr Glu Gin Ala Leu Pro Ala Asp Leu lie Lys Arg
595 600 605
Gly Met Ala Val Glu Asp Ala Ser Ser Pro His Lys Val Arg Leu Leu
610 615 620
lie Lys Asp Tyr Pro Tyr Ala Thr Asp Gly Leu Ala Val Trp Asp Ala
625 630 635 640
lie Glu Gin Trp Val Ser Asp Tyr Leu Thr lie Tyr Tyr Pro Asn Asp
645 650 655
Gly Val Leu Gin Gly Asp Val Glu Leu Gin Ala Trp Trp Lys Glu Val
660 665 670
Arg Glu Val Gly His Gly Asp Leu Lys Asp Ala Ala Trp Trp Pro Lys
675 680 685
Met Gin Thr Val Ala Glu Leu lie Lys Ala Cys Ala Thr lie lie Trp
690 695 700
Thr Gly Ser Ala Leu His Ala Ala Val Asn Phe Gly Gin Tyr Pro Tyr
705 710 715 720
Ser Gly Tyr His Pro Asn Lys Pro Ser Ala Ser Arg Arg Pro Met Pro
725 730 735
Val Gin Gly Ser Glu Glu Tyr Ala Glu Leu Glu Arg Asp Pro Glu Lys
740 745 750
Ala Phe lie Arg Thr lie Thr Ser Gin Phe His Ala Leu Val Gly lie
755 760 765
Ser Leu Met Glu lie Leu Ser Lys His Ser Ser Asp Glu Val Tyr Leu
770 775 780
Gly Gin His Asp Thr Pro Ala Trp Thr Ser Asp Ala Lys Ala Leu Glu
785 790 795 800
Ala Phe Lys Arg Phe Gly Ala Lys Leu Glu Gly lie Glu Lys Gin Val
805 810 815
Val Ala Met Asn Ser Asp Pro Gin Leu Lys Asn Arg Thr Gly Pro Ala
820 825 830
Lys Phe Pro Tyr Met Leu Leu Tyr Pro Asn Thr Ser Asp His Thr Gly
835 840 845
Gin Ala Glu Gly Leu Thr Ala Arg Gly lie Pro Asn Ser lie Ser lie
850 855 860
<210> 8 <211> 684 <212> БЕЛОК
<213> Hordeum vulgare мутант A689 <400> 8
Met Leu Gly Val Gly Gly lie Val Ser Asp Leu Thr Gly Gly lie Arg
15 10 15
Gly Ala His Leu Lys Gly Ser Val Val Leu Met Arg Lys Asn Ala Leu
20 25 30
Asp Phe Asn Asp Phe Gly Ala His Val Met Asp Gly Val Thr Glu Leu
35 40 45
Leu Gly Arg Gly Val Thr Cys Gin Leu lie Ser Ser Thr Asn Val Asp
50 55 60
His Asn Asn Gly Gly Arg Gly Lys Val Gly Ala Glu Ala Asn Leu Glu
65 70 75 80
Gin Trp Leu Leu Pro Thr Asn Leu Pro Phe lie Thr Thr Gly Glu Asn
85 90 95
Lys Phe Ala Val Thr Phe Asp Trp Ser Val Asp Lys Leu Gly Val Pro
100 105 110
Gly Ala lie lie Val Lys Asn Asn His Ala Ser Glu Phe Phe Leu Lys
115 120 125
Thr lie Thr Leu Asp Asn Val Pro Gly Arg Gly Thr lie Val Phe Val
130 135 140
Ala Asn Ser Trp Val Tyr Pro Gin Ala Lys Tyr Arg Tyr Asn Arg Val
145 150 155 160
Phe Phe Ala Asn Asp Thr Tyr Leu Pro His Gin Met Pro Ala Ala Leu
165 170 175
Lys Pro Tyr Arg Asp Asp Glu Leu Arg Asn Leu Arg Gly Asp Asp Gin
180 185 190
Gin Gly Pro Tyr Leu Asp His Asp Arg Val Tyr Arg Tyr Asp Val Tyr
195 200 205
Asn Asp Leu Gly Asp Ser Arg Asp Val Leu Gly Gly Ser Lys Asp Leu
210 215 220
Pro Tyr Pro Arg Arg Cys Arg Thr Gly Arg Lys Pro Ser Asp Ser Lys
225 230 235 240
Pro Asp His Glu Ser Arg Leu Leu Leu Leu Val Gin Asn Val Tyr Val
245 250 255
Leu Arg Asp Glu Leu Phe Gly His Leu Lys Gin Ser Asp Leu Leu Gly
260 265 270
Tyr Thr Leu Lys Gly Trp Leu Asp Gly lie lie Leu Ala lie Arg Thr
275 280 285
Tyr Val Asp Leu Ser Pro Gly Glu Phe Asp Ser Phe Ala Asp lie Leu
290 295 300
Lys Leu Tyr Glu Gly Gly lie Lys Leu Pro Asn lie Pro Ala Leu Glu
305 310 315 320
Glu Val Arg Lys Arg Phe Pro Leu Gin Leu Val Lys Asp Leu lie Pro
325 330 335
Lys Gly Gly Asp Phe Leu Leu Lys Leu Pro Lys Pro Glu lie lie Lys
340 345 350
Val Asp Gin Lys Ala Trp Met Thr Asp Glu Glu Phe Ala Arg Glu Met
355 360 365
Leu Ala Gly Val Asn Pro Met Met lie Lys Arg Leu Thr Glu Phe Pro
370 375 380
Pro Lys Ser Thr Leu Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Asp His Thr Ser Thr
385 390 395 400
Met Thr Glu Glu His Val Ala Lys Ser Leu Glu Gly Leu Thr Val Gin
405 410 415
Gin Ala Leu Ala Gly Asn Arg Leu Tyr lie Val Asp Gin His Asp Asn
420 425 430
Leu Met Pro Phe Leu lie Asp lie Asn Asn Leu Asp Ala Ser Phe Val
435 440 445
Tyr Ala Thr Arg Thr Leu Leu Phe Leu Arg Gly Asp Gly Thr Leu Ala
450 455 460
Pro Val Ala lie Glu Leu Ser Ser Pro Leu lie Gin Gly Glu Leu Thr
465 470 475 480
Thr Ala Lys Ser Ala Val Tyr Thr Pro Gin His Ala Gly Val Glu Gly
485 490 495
Trp lie Trp Gin Leu Ala Lys Ala Tyr Ala Ser Val Asn Asp Tyr Gly
500 505 510
Trp His Gin Leu lie Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Val Met Glu
515 520 525
Pro Phe Val lie Ala Thr Asn Arg Gin Leu Ser Val Thr His Pro Val
530 535 540
Tyr Lys Leu Leu His Pro His Tyr Arg Asp Thr Met Asn lie Asn Ala
545 550 555 560
Arg Ala Arg Gly Leu Leu lie Asn Ala Gly Gly Val lie Glu Met Thr
565 570 575
Val Phe Pro His Lys His Ala Met Pro Met Ser Ser Met Val Tyr Lys
580 585 590
His Trp Asn Phe Thr Glu Gin Ala Leu Pro Ala Asp Leu lie Lys Arg
595 600 605
Gly Met Ala Val Glu Asp Ala Ser Ser Pro His Lys Val Arg Leu Leu
610 615 620
lie Lys Asp Tyr Pro Tyr Ala Thr Asp Gly Leu Ala Val Trp Asp Ala
625 630 635 640
lie Glu Gin Trp Val Ser Asp Tyr Leu Thr lie Tyr Tyr Pro Asn Asp
645 650 655
Gly Val Leu Gin Gly Asp Val Glu Leu Gin Ala Trp Trp Lys Glu Val
660 665 670
Arg Glu Val Gly His Gly Asp Leu Lys Asp Ala Ala 675 680
<210> 9
<211> 6459
<212> ДНК
<213> Ячмень сорт Prestige
<400> 9
atggctgcgg cggcggggga cgtggaggcg ttcctggcgg cgtgccaggc gtcgggcgac
gcggcgtacg gcgccgccaa ggccgtgctg gagcggctcg aggcgccggc cacgcgcgcc 120
gaggccaggc ggctcctcgg cgccgtgcga cggcgcttcg ccgccggcgg cccggccgcg 180
gggctcgagt gcttccgcac cttccacttc cgcatccacg acgtcgtcct cgacccccac 240
ctccaaggtt gcccggcccc ttccctacac acccgttgtc gacccgcatc tctttcgccg 300
atctggccgt caaaagcacg cggcttggta gaaatcaagc ctgcaatcct gatccgttta 360
tggctggcca gtcgatcagt aatttggcca taactggagt ataaccttgg tctctaatct 420
ctacctgacc atataccgag ttggttttct ttcttcttgt ttccgtattt gtgtagtttt 480
ttcttttctt tcgagcatga tgttctttga attaatgcgt accagactcc agtaattcga 540
cattttgaat tttggcgagt gttcttggaa tttataacac aacgaggctt tgatcaagtg 600
gtttatgtag aggagtgttt ttgttcttgt gcaccgtata caattctcta tttcccaaca 660
attttgatgg cctctaagca tcctgtagtc atgtctactg tgtaagctac agatttattc 720
atgtctatgt gtaagctgca aatggagaga aaagctatct atttggttgt tccagcttgt 780
tctttggcag aacaatcctg cccatcctat caccataagt ataaaagcac gacaaatgag 840
tggggcaagc atgctgccaa gctaatacac gacataagct acatattttg aggggcatgt 900
tatctttttt tttcccttct actcagtttc ttctttggga gaacaatcct actcaaccta 960
taatcataag aataaaagca agacagatga gtgctgcaga ctattggcat atataacaac 1020
taaataggac atctgtccgc tatatcttta gttaataatt gtatatagac gcagtctttg 1080
tgctggaaaa actgcaacta aatattttct tacattatat ggaatctggg tgtgatatga 1140
cttctttgtt acgttttgtg tgcataaagc attaacttct gtctttagtt ggcgcagcgg 1200
taaaaacacc cattgcttaa tattttattt gctttccgta gcttgataaa atttcaactg 1260
cttctaggat tccagcaaag aaagaagcta acaatgatgg agatacccag cattttcatt 1320
ccagaagact ggtcattcac tttctacgag ggtctcaacc ggcatccaga ttccatcttc 1380
agggataaga cagtagcaga gctgggatgt ggcaatggtt ggatatccat tgcacttgca 1440
gaaaagtggt gcccttcgaa ggttggcacc tcttgttccg tagatattta tcttatctcg 1500
tttgttgcaa acatgggacc tgcagaagtt agacatttac tcaggttact ttatatgaaa 1560
cttttaggtg tctgccagta gtctgctggt ggtctaattt tcttggtata cctgatgccg 1620
tcgagcatat tgctttcaaa ttttgggcaa ggcattacca ccacatattg tttctacaat 1680
gctgaacaat tgctctcctt tgaaaggaag aaaaacaaga atgacatgca ccttagtagt 1740
ttaagccaca aataccagcg aatcaaatta gtttgcagtc agcttggcat taccttactt 1800
gagccttggt tgttcttttg aaggtttatg gtctggatat aaacccaaga gctatcaaga I860
ttgcatggat aaacctttac ttgaatgcac tagacgacga tggtctccca atctatgatg 1920
cggaggggaa aacattgctt gacagagtcg aattctatga atctgatctt ctttcttact 1980
gtagagataa caagatagaa cttgatcgca ttgttggatg cataccacag gtacggtcag 2040
gtttttacca atttcctgtg aatggggatt atagtcgatc agaacttgat caaaatgccc 2100
ttaatatctg cctttcagat tcttaacccc aatccagagg caatgtcaaa gattgtaact 2160
gaaaattcaa gtgaggagtt cttgtactcc ttgagcaact actgtgctct ccaggtgagt 2220
tgagatctat ttaaactcaa gccattcagt ttacctgtta ctaaatggtt acccatgtca 2280
gagtctccaa atctttttct tttctcaaac agcaaagaga gaagaaaact tttaagttct 2340
atcctgaaat tgactttaca atgcttgttc ataatctgct tacgaaatat gcgtttgaac 2400
atttctcttt tccttgtagg catgtggtca gacctttata taagaaaatg aagtttttgt 2460
agaaataatg tatgctttgt acttatgaca tggttccacc agtataatca atttaagtct 2520
aggtagttag gaacctagga tggagagcac cgacagtgta taatatatat atgtcgatag 2580
ggggttagca gtccaaatcc acctcaagtt caacctattg cataactttt ggtcttacaa 2640
cctgtatgga caaatgtgat cagcacccca gtctttccta taaaaatgtc tgctggaata 2700
tggaattatt aacagcggta tttattttta ccctgtttaa ttttttcctt tgctaaaaga 2760
atgataatcc ttatgccacg aggttacatt gtattactca agtcaatatt tgttactatg 2820
gctgattgta cgattccagc ttccggttgt taattttgtt atgtttgtga actttgctgc 2880
attcagggtt ttgttgagga ccaatttggc ctcgggttga ttgctcgggc tgttgaagaa 2940
gggatatctg tgataaagcc tagtggtctt atggtattca acatgggagg ccggccagga 3000
caaggtgtct gtgagcgcct atttctacgc cgtggatttc gcatcaataa gctctggcaa 3060
acaaaaatta tgcaggtagc aattctttga gtgactagat gttaactaat cccagtgttt 3120
ttccatgcca gcaacagcat tatatcctgg ttagaggaat atgctcttca tgttgcacac 3180
caatcttcag ctgggcctag aattttcatc taccggctta catttttaca ttacagaacc 3240
aatttttgtt gaggatcatt accaactagt tgggtctttg caggctgctg acacagacat 3300
ctccgcttta gttgaaattg agaaaaatag ccgacatcgc ttcgagttct ttatggatct 3360
tgttggggat cagcctgtgt gtgcgcgcac agcatgggca tacatgaaat ctggtggccg 3420
catttcacat gctttgtctg tgtatagctg tcaacttcgc cagcccaacc aggtacctat 3480
actctctgat tagatcttta caacaataat atagtaatgt caggaataat aataatttgg 3540
agaatttcag gtgaagaaaa tatttgagtt ccttaaagac ggattccatg aagtcagcag 3600
ctccctcgat ttgtcctttg atgatgattc tgttgctgat gaaaaaattc ctttcctagc 3660
atacctagct agtttcttgc aagagaataa gtctaatcct tgtgagcctc cagctggatg 3720
tttaaatttc cggaatcttg ttgctggatt tatgaagagt taccaccaca tcccattaac 3780
tcctgatgta agacttggtg tctattgcct acaattatgt ttgcttatta gaaattcata 3840
agatcaacct atttgatgct tctcacgtat gcttcatgtg acacttcctt ttcctctggt 3900
gcaccagaat gttgttgtgt tcccatcccg tgctgttgca atcgaaaatg ctcttcggtt 3960
gttctcacct ggacttgcaa ttgttgacga acacctaacc agacacttgc ccaagcaatg 4020
gttaacatct ttagcaattg aggtactttg accgatactc ccctctttct ttctgtgttt 4080
ggaactgtgg aaaatacatg tgttctgtga agaaaaagtt atgctgacaa gaatttcgat 4140
gttattgcca ttcttctaaa tttcaggaaa gtaaccatgc taaagataca gtaactgtaa 4200
tcgaagcacc acgccaatca gatttgctga ttgagttgat caggaaactg aagcctcagg 4260
ttgttgttac tggcatggct cagtttgagg ctatcaccag tgctgctttc gtgaacttat 4320
taagtgtaac gaaagatgtt ggttcccgat tattactaga tatttcagaa catctggaat 4380
tgtctagtct gccaagctca aatggtgtat tgaaatatct tgctgggaag accctgcctt 4440
cacatgcggc tatattgtgt ggcttagtta agaatcaggt gtgtgtcaat cagcctgaac 4500
tctagttgaa ctgttgtgca tactatatag aatatcttga cttttatatg tactttagaa 4560
acactgttta aatgtactca tttctttttg cttcatttta cttgcaggtt tattctgatc 4620
tggaagttgc ttttgctatc tctgaagatc caactgttta taaggcattg tcacaaacta 4680
ttgagctatt ggaaggacat acttctgtga tcagccagca ctattatggt tgtcttttcc 4740
atgagctgct ggcatttcaa attggtgacc ggcatccaca acaagaggta aacatggctt 4800
gcctcttcca gttctccatc tcactcagtt ctgtccacaa ggtgccgaat gatctgttca 4860
agtggacact cccctcagca cgggcaagct agtccatgaa tttggattag ttccctctta 4920
gctgggtact tcgattacac cacaatgagc tcctcaacgt ggtctggttt atgtttttca 4980
tgttttccct ctaatgtttg gttgctcttt ttcagagaga acctgcagaa gtgatatcta 5040
aggagatgat agggttttca agttcagcta tgtccaccct agaaggagct gagtttttcg 5100
ttcctggttc catggaatcc ggtgtcatac atatggatct ggaccgcagc ttcttgccag 5160
taccttctgc agtaaacgcc tccattttcg aaagttttgt tcgtcagaac atcactgatt 5220
ctgaaaccga tgtccgttcc agcattcagc agctggtgaa agatagctat ggtttctcag 5280
caggcggtgc ttctgaaatt atatacggga acacctgtct cgcgctcttc aacaagcttg 5340
ttctttgctg catgcaagaa cagggcacct tgcttttccc cttgggaacc aacgggcatt 5400
acgtcaacgc agcaaagttt gtgaatgcaa ccaccttgac tattccaacg aaggcagatt 5460
caggcttcaa gatcgaacca agtgctctag ccgacacact agagaaggtg tctcagccgt 5520
gggtctatat ttctggcccc acaatcaacc ctactggctt cctgtacagt gacgacgata 5580
tagcagagct gctttctgtc tgtgcgacat acggagccag ggtggtgata gatacctcct 5640
cctctggtct ggagttccaa gccaccggct gcagccagtg gaatttggaa agatgtcttt 5700
ctaatgtcaa gtcttcaaag ccctcgttct ccgttgtcct gctcggagag ctgtcctttg 5760
agctgaccac ggctgggctt gatttcgggt ttctgattat gagcgactcg tccttggttg 5820
acacatttta cagtttccca agcttgagtc ggccacacag cacgttgaag tacacgttca 5880
ggaagctgtt gggtcttaag aaccagaagg atcagcattt ctctgatctc atccttgagc 5940
agaaggagac gttgaagaat cgtgccgacc agttgatcaa ggtatgcctt ttgggatatc 6000
ctgtgtttag gctctctgtt ttcttcccct gatcagctct ccgatcccct tacatcctta 6060
ggctaatttc agtacttcaa gtttgccacg catttctgac atattctttc ctcttgtttt 6120
attttcctgt gatgtgatga acagacgctt gagagctgcg gctgggacgc tgtgggctgc 6180
catggcggca tctcgatgct tgcaaaaccg accgcctaca ttggcaaatc gctcaaggtg 6240
gacggctttg agggcaagct ggacagccac aacatgaggg aagccctcct gaggtccacc 6300
gggctgtgca ttagcagcag cgggtggaca ggggtgccgg actactgccg cttcagcttt 6360
gctctggaga gcggcgactt cgaccgggcc atggagtgca tcgcccggtt cagggagctg 6420
gtccttggtg gcggtgctaa ggtgaatggt agcaactag 6459
<210> 10 <211> 6459 <212> ДНК
<213> Ячмень, Мутант 8063 <400> 10
atggctgcgg cggcggggga cgtggaggcg ttcctggcgg cgtgccaggc gtcgggcgac 60
gcggcgtacg gcgccgccaa ggccgtgctg gagcggctcg aggcgccggc cacgcgcgcc 120
gaggccaggc ggctcctcgg cgccgtgcga cggcgcttcg ccgccggcgg cccggccgcg 180
gggctcgagt gcttccgcac cttccacttc cgcatccacg acgtcgtcct cgacccccac 240
ctccaaggtt gcccggcccc ttccctacac acccgttgtc gacccgcatc tctttcgccg 300
atctggccgt caaaagcacg cggcttggta gaaatcaagc ctgcaatcct gatccgttta 360
tggctggcca gtcgatcagt aatttggcca taactggagt ataaccttgg tctctaatct 420
ctacctgacc atataccgag ttggttttct ttcttcttgt ttccgtattt gtgtagtttt 480
ttcttttctt tcgagcatga tgttctttga attaatgcgt accagactcc agtaattcga 540
cattttgaat tttggcgagt gttcttggaa tttataacac aacgaggctt tgatcaagtg 600
gtttatgtag aggagtgttt ttgttcttgt gcaccgtata caattctcta tttcccaaca 660
attttgatgg cctctaagca tcctgtagtc atgtctactg tgtaagctac agatttattc 720
atgtctatgt gtaagctgca aatggagaga aaagctatct atttggttgt tccagcttgt 780
tctttggcag aacaatcctg cccatcctat caccataagt ataaaagcac gacaaatgag 840
tggggcaagc atgctgccaa gctaatacac gacataagct acatattttg aggggcatgt 900
tatctttttt tttcccttct actcagtttc ttctttggga gaacaatcct actcaaccta 960
taatcataag aataaaagca agacagatga gtgctgcaga ctattggcat atataacaac 1020
taaataggac atctgtccgc tatatcttta gttaataatt gtatatagac gcagtctttg 1080
tgctggaaaa actgcaacta aatattttct tacattatat ggaatctggg tgtgatatga 1140
cttctttgtt acgttttgtg tgcataaagc attaacttct gtctttagtt ggcgcagcgg 1200
taaaaacacc cattgcttaa tattttattt gctttccgta gcttgataaa atttcaactg 1260
cttctaggat tccagcaaag aaagaagcta acaatgatgg agatacccag cattttcatt 1320
ccagaagact ggtcattcac tttctacgag ggtctcaacc ggcatccaga ttccatcttc 1380
agggataaga cagtagcaga gctgggatgt ggcaatggtt ggatatccat tgcacttgca 1440
gaaaagtggt gcccttcgaa ggttggcacc tcttgttccg tagatattta tcttatctcg 1500
tttgttgcaa acatgggacc tgcagaagtt agacatttac tcaggttact ttatatgaaa 1560
cttttaggtg tctgccagta gtctgctggt ggtctaattt tcttggtata cctgatgccg 1620
tcgagcatat tgctttcaaa ttttgggcaa ggcattacca ccacatattg tttctacaat 1680
gctgaacaat tgctctcctt tgaaaggaag aaaaacaaga atgacatgca ccttagtagt 1740
ttaagccaca aataccagcg aatcaaatta gtttgcagtc agcttggcat taccttactt 1800
gagccttggt tgttcttttg aaggtttatg gtctggatat aaacccaaga gctatcaaga I860
ttgcatggat aaacctttac ttgaatgcac tagacgacga tggtctccca atctatgatg 1920
cggaggggaa aacattgctt gacagagtcg aattctatga atctgatctt ctttcttact 1980
gtagagataa caagatagaa cttgatcgca ttgttggatg cataccacag gtacggtcag 2040
gtttttacca atttcctgtg aatggggatt atagtcgatc agaacttgat caaaatgccc 2100
ttaatatctg cctttcagat tcttaacccc aatccagagg caatgtcaaa gattgtaact 2160
gaaaattcaa gtgaggagtt cttgtactcc ttgagcaact actgtgctct ccaggtgagt 2220
tgagatctat ttaaactcaa gccattcagt ttacctgtta ctaaatggtt acccatgtca 2280
gagtctccaa atctttttct tttctcaaac agcaaagaga gaagaaaact tttaagttct 2340
atcctgaaat tgactttaca atgcttgttc ataatctgct tacgaaatat gcgtttgaac 2400
atttctcttt tccttgtagg catgtggtca gacctttata taagaaaatg aagtttttgt 2460
agaaataatg tatgctttgt acttatgaca tggttccacc agtataatca atttaagtct 2520
aggtagttag gaacctagga tggagagcac cgacagtgta taatatatat atgtcgatag 2580
ggggttagca gtccaaatcc acctcaagtt caacctattg cataactttt ggtcttacaa 2640
cctgtatgga caaatgtgat cagcacccca gtctttccta taaaaatgtc tgctggaata 2700
tggaattatt aacagcggta tttattttta ccctgtttaa ttttttcctt tgctaaaaga 2760
atgataatcc ttatgccacg aggttacatt gtattactca agtcaatatt tgttactatg 2820
gctgattgta cgattccagc ttccggttgt taattttgtt atgtttgtga actttgctgc 2880
attcagggtt ttgttgagga ccaatttggc ctcgggttga ttgctcgggc tgttgaagaa 2940
gggatatctg tgataaagcc tagtggtctt atggtattca acatgggagg ccggccagga 3000
caaggtgtct gtgagcgcct atttctacgc cgtggatttc gcatcaataa gctctggcaa 3060
acaaaaatta tgcagatagc aattctttga gtgactagat gttaactaat cccagtgttt 3120
ttccatgcca gcaacagcat tatatcctgg ttagaggaat atgctcttca tgttgcacac 3180
caatcttcag ctgggcctag aattttcatc taccggctta catttttaca ttacagaacc 3240
aatttttgtt gaggatcatt accaactagt tgggtctttg caggctgctg acacagacat 3300
ctccgcttta gttgaaattg agaaaaatag ccgacatcgc ttcgagttct ttatggatct 3360
tgttggggat cagcctgtgt gtgcgcgcac agcatgggca tacatgaaat ctggtggccg 3420
catttcacat gctttgtctg tgtatagctg tcaacttcgc cagcccaacc aggtacctat 3480
actctctgat tagatcttta caacaataat atagtaatgt caggaataat aataatttgg 3540
agaatttcag gtgaagaaaa tatttgagtt ccttaaagac ggattccatg aagtcagcag 3600
ctccctcgat ttgtcctttg atgatgattc tgttgctgat gaaaaaattc ctttcctagc 3660
atacctagct agtttcttgc aagagaataa gtctaatcct tgtgagcctc cagctggatg 3720
tttaaatttc cggaatcttg ttgctggatt tatgaagagt taccaccaca tcccattaac 3780
tcctgatgta agacttggtg tctattgcct acaattatgt ttgcttatta gaaattcata 3840
agatcaacct atttgatgct tctcacgtat gcttcatgtg acacttcctt ttcctctggt 3900
gcaccagaat gttgttgtgt tcccatcccg tgctgttgca atcgaaaatg ctcttcggtt 3960
gttctcacct ggacttgcaa ttgttgacga acacctaacc agacacttgc ccaagcaatg 4020
gttaacatct ttagcaattg aggtactttg accgatactc ccctctttct ttctgtgttt 4080
ggaactgtgg aaaatacatg tgttctgtga agaaaaagtt atgctgacaa gaatttcgat 4140
gttattgcca ttcttctaaa tttcaggaaa gtaaccatgc taaagataca gtaactgtaa 4200
tcgaagcacc acgccaatca gatttgctga ttgagttgat caggaaactg aagcctcagg 4260
ttgttgttac tggcatggct cagtttgagg ctatcaccag tgctgctttc gtgaacttat 4320
taagtgtaac gaaagatgtt ggttcccgat tattactaga tatttcagaa catctggaat 4380
tgtctagtct gccaagctca aatggtgtat tgaaatatct tgctgggaag accctgcctt 4440
cacatgcggc tatattgtgt ggcttagtta agaatcaggt gtgtgtcaat cagcctgaac 4500
tctagttgaa ctgttgtgca tactatatag aatatcttga cttttatatg tactttagaa 4560
acactgttta aatgtactca tttctttttg cttcatttta cttgcaggtt tattctgatc 4620
tggaagttgc ttttgctatc tctgaagatc caactgttta taaggcattg tcacaaacta 4680
ttgagctatt ggaaggacat acttctgtga tcagccagca ctattatggt tgtcttttcc 4740
atgagctgct ggcatttcaa attggtgacc ggcatccaca acaagaggta aacatggctt 4800
gcctcttcca gttctccatc tcactcagtt ctgtccacaa ggtgccgaat gatctgttca 4860
agtggacact cccctcagca cgggcaagct agtccatgaa tttggattag ttccctctta 4920
gctgggtact tcgattacac cacaatgagc tcctcaacgt ggtctggttt atgtttttca 4980
tgttttccct ctaatgtttg gttgctcttt ttcagagaga acctgcagaa gtgatatcta 5040
aggagatgat agggttttca agttcagcta tgtccaccct agaaggagct gagtttttcg 5100
ttcctggttc catggaatcc ggtgtcatac atatggatct ggaccgcagc ttcttgccag 5160
taccttctgc agtaaacgcc tccattttcg aaagttttgt tcgtcagaac atcactgatt 5220
ctgaaaccga tgtccgttcc agcattcagc agctggtgaa agatagctat ggtttctcag 5280
caggcggtgc ttctgaaatt atatacggga acacctgtct cgcgctcttc aacaagcttg 5340
ttctttgctg catgcaagaa cagggcacct tgcttttccc cttgggaacc aacgggcatt 5400
acgtcaacgc agcaaagttt gtgaatgcaa ccaccttgac tattccaacg aaggcagatt 5460
caggcttcaa gatcgaacca agtgctctag ccgacacact agagaaggtg tctcagccgt 5520
gggtctatat ttctggcccc acaatcaacc ctactggctt cctgtacagt gacgacgata 5580
tagcagagct gctttctgtc tgtgcgacat acggagccag ggtggtgata gatacctcct 5640
cctctggtct ggagttccaa gccaccggct gcagccagtg gaatttggaa agatgtcttt 5700
ctaatgtcaa gtcttcaaag ccctcgttct ccgttgtcct gctcggagag ctgtcctttg 5760
agctgaccac ggctgggctt gatttcgggt ttctgattat gagcgactcg tccttggttg 5820
acacatttta cagtttccca agcttgagtc ggccacacag cacgttgaag tacacgttca 5880
ggaagctgtt gggtcttaag aaccagaagg atcagcattt ctctgatctc atccttgagc 5940
agaaggagac gttgaagaat cgtgccgacc agttgatcaa ggtatgcctt ttgggatatc 6000
ctgtgtttag gctctctgtt ttcttcccct gatcagctct ccgatcccct tacatcctta 6060
ggctaatttc agtacttcaa gtttgccacg catttctgac atattctttc ctcttgtttt 6120
attttcctgt gatgtgatga acagacgctt gagagctgcg gctgggacgc tgtgggctgc 6180
catggcggca tctcgatgct tgcaaaaccg accgcctaca ttggcaaatc gctcaaggtg 6240
gacggctttg agggcaagct ggacagccac aacatgaggg aagccctcct gaggtccacc 6300
gggctgtgca ttagcagcag cgggtggaca ggggtgccgg actactgccg cttcagcttt 6360
gctctggaga gcggcgactt cgaccgggcc atggagtgca tcgcccggtt cagggagctg 6420
gtccttggtg gcggtgctaa ggtgaatggt agcaactag 6459
<210> 11 <211> 6459 <212> ДНК
<213> Ячмень сорт Sebastian <400> 11
atggctgcgg cggcggggga cgtggaggcg ttcctggcgg cgtgccaggc gtcgggcgac 60 gcggcgtacg gcgccgccaa ggccgtgctg gagcggctcg aggcgccggc cacgcgcgcc 120
gaggccaggc ggctcctcgg cgccgtgcga cggcgcttcg ccgccggcgg cccggccgcg 180
gggctcgagt gcttccgcac cttccacttc cgcatccacg acgtcgtcct cgacccccac 240
ctccaaggtt gcccggcccc ttccctacac acccgttgtc gacccgcatc tctttcgccg 300
atctggccgt caaaagcacg cggcttggta gaaatcaagc ctgcaatcct gatccgttta 360
tggctggcca gtcgatcagt aatttggcca taactggagt ataaccttgg tctctaatct 420
ctacctgacc atataccgag ttggttttct ttcttcttgt ttccgtattt gtgtagtttt 480
ttcttttctt tcgagcatga tgttctttga attaatgcgt accagactcc agtaattcga 540
cattttgaat tttggcgagt gttcttggaa tttataacac aacgaggctt tgatcaagtg 600
gtttatgtag aggagtgttt ttgttcttgt gcaccgtata caattctcta tttcccaaca 660
attttgatgg cctctaagca tcctgtagtc atgtctactg tgtaagctac agatttattc 720
atgtctatgt gtaagctgca aatggagaga aaagctatct atttggttgt tccagcttgt 780
tctttggcag aacaatcctg cccatcctat caccataagt ataaaagcac gacaaatgag 840
tggggcaagc atgctgccaa gctaatacac gacataagct acatattttg aggggcatgt 900
tatctttttt tttcccttct actcagtttc ttctttggga gaacaatcct actcaaccta 960
taatcataag aataaaagca agacagatga gtgctgcaga ctattggcat atataacaac 1020
taaataggac atctgtccgc tatatcttta gttaataatt gtatatagac gcagtctttg 1080
tgctggaaaa actgcaacta aatattttct tacattatat ggaatctggg tgtgatatga 1140
cttctttgtt acgttttgtg tgcataaagc attaacttct gtctttagtt ggcgcagcgg 1200
taaaaacacc cattgcttaa tattttattt gctttccgta gcttgataaa atttcaactg 1260
cttctaggat tccagcaaag aaagaagcta acaatgatgg agatacccag cattttcatt 1320
ccagaagact ggtcattcac tttctacgag ggtctcaacc ggcatccaga ttccatcttc 1380
agggataaga cagtagcaga gctgggatgt ggcaatggtt ggatatccat tgcacttgca 1440
gaaaagtggt gcccttcgaa ggttggcacc tcttgttccg tagatattta tcttatctcg 1500
tttgttgcaa acatgggacc tgcagaagtt agacatttac tcaggttact ttatatgaaa 1560
cttttaggtg tctgccagta gtctgctggt ggtctaattt tcttggtata cctgatgccg 1620
tcgagcatat tgctttcaaa ttttgggcaa ggcattacca ccacatattg tttctacaat 1680
gctgaacaat tgctctcctt tgaaaggaag aaaaacaaga atgacatgca ccttagtagt 1740
ttaagccaca aataccagcg aatcaaatta gtttgcagtc agcttggcat taccttactt 1800
gagccttggt tgttcttttg aaggtttatg gtctggatat aaacccaaga gctatcaaga I860
ttgcatggat aaacctttac ttgaatgcac tagacgacga tggtctccca atctatgatg 1920
cggaggggaa aacattgctt gacagagtcg aattctatga atctgatctt ctttcttact 1980
gtagagataa caagatagaa cttgatcgca ttgttggatg cataccacag gtacggtcag 2040
gtttttacca atttcctgtg aatggggatt atagtcgatc agaacttgat caaaatgccc 2100
ttaatatctg cctttcagat tcttaacccc aatccagagg caatgtcaaa gattgtaact 2160
gaaaattcaa gtgaggagtt cttgtactcc ttgagcaact actgtgctct ccaggtgagt 2220
tgagatctat ttaaactcaa gccattcagt ttacctgtta ctaaatggtt acccatgtca 2280
gagtctccaa atctttttct tttctcaaac agcaaagaga gaagaaaact tttaagttct 2340
atcctgaaat tgactttaca atgcttgttc ataatctgct tacgaaatat gcgtttgaac 2400
atttctcttt tccttgtagg catgtggtca gacctttata taagaaaatg aagtttttgt 2460
agaaataatg tatgctttgt acttatgaca tggttccacc agtataatca atttaagtct 2520
aggtagttag gaacctagga tggagagcac cgacagtgta taatatatat atgtcgatag 2580
ggggttagca gtccaaatcc acctcaagtt caacctattg cataactttt ggtcttacaa 2640
cctgtatgga caaatgtgat cagcacccca gtctttccta taaaaatgtc tgctggaata 2700
tggaattatt aacagcggta tttattttta ccctgtttaa ttttttcctt tgctaaaaga 2760
atgataatcc ttatgccacg aggttacatt gtattactca agtcaatatt tgttactatg 2820
gctgattgta cgattccagc ttccggttgt taattttgtt atgtttgtga actttgctgc 2880
attcagggtt ttgttgagga ccaatttggc ctcgggttga ttgctcgggc tgttgaagaa 2940
gggatatctg tgataaagcc tagtggtctt atggtattca acatgggagg ccggccagga 3000
caaggtgtct gtgagcgcct atttctacgc cgtggatttc gcatcaataa gctctggcaa 3060
acaaaaatta tgcaggtagc aattctttga gtgactagat gttaactaat cccagtgttt 3120
ttccatgcca gcaacagcat tatatcctgg ttagaggaat atgctcttca tgttgcacac 3180
caatcttcag ctgggcctag aattttcatc taccggctta catttttaca ttacagaacc 3240
aatttttgtt gaggatcatt accaactagt tgggtctttg caggctgctg acacagacat 3300
ctccgcttta gttgaaattg agaaaaatag ccgacatcgc ttcgagttct ttatggatct 3360
tgttggggat cagcctgtgt gtgcgcgcac agcatgggca tacatgaaat ctggtggccg 3420
catttcacat gctttgtctg tgtatagctg tcaacttcgc cagcccaacc aggtacctat 3480
actctctgat tagatcttta caacaataat atagtaatgt caggaataat aataatttgg 3540
agaatttcag gtgaagaaaa tatttgagtt ccttaaagac ggattccatg aagtcagcag 3600
ctccctcgat ttgtcctttg atgatgattc tgttgctgat gaaaaaattc ctttcctagc 3660
atacctagct agtttcttgc aagagaataa gtctaatcct tgtgagcctc cagctggatg 3720
tttaaatttc cggaatcttg ttgctggatt tatgaagagt taccaccaca tcccattaac 3780
tcctgatgta agacttggtg tctattgcct acaattatgt ttgcttatta gaaattcata 3840
agatcaacct atttgatgct tctcacgtat gcttcatgtg acacttcctt ttcctctggt 3900
gcaccagaat gttgttgtgt tcccatcccg tgctgttgca atcgaaaatg ctcttcggtt 3960
gttctcacct ggacttgcaa ttgttgacga acacctaacc agacacttgc ccaagcaatg 4020
gttaacatct ttagcaattg aggtactttg accgatactc ccctctttct ttctgtgttt 4080
ggaactgtgg aaaatacatg tgttctgtga agaaaaagtt atgctgacaa gaatttcgat 4140
gttattgcca ttcttctaaa tttcaggaaa gtaaccatgc taaagataca gtaactgtaa 4200
tcgaagcacc acgccaatca gatttgctga ttgagttgat caggaaactg aagcctcagg 4260
ttgttgttac tggcatggct cagtttgagg ctatcaccag tgctgctttc gtgaacttat 4320
taagtgtaac gaaagatgtt ggttcccgat tattactaga tatttcagaa catctggaat 4380
tgtctagtct gccaagctca aatggtgtat tgaaatatct tgctgggaag accctgcctt 4440
cacatgcggc tatattgtgt ggcttagtta agaatcaggt gtgtgtcaat cagcctgaac 4500
tctagttgaa ctgttgtgca tactatatag aatatcttga cttttatatg tactttagaa 4560
acactgttta aatgtactca tttctttttg cttcatttta cttgcaggtt tattctgatc 4620
tggaagttgc ttttgctatc tctgaagatc caactgttta taaggcattg tcacaaacta 4680
ttgagctatt ggaaggacat acttctgtga tcagccagca ctattatggt tgtcttttcc 4740
atgagctgct ggcatttcaa attggtgacc ggcatccaca acaagaggta aacatggctt 4800
gcctcttcca gttctccatc tcactcagtt ctgtccacaa ggtgccgaat gatctgttca 4860
agtggacact cccctcagca cgggcaagct agtccatgaa tttggattag ttccctctta 4920
gctgggtact tcgattacac cacaatgagc tcctcaacgt ggtctggttt atgtttttca 4980
tgttttccct ctaatgtttg gttgctcttt ttcagagaga acctgcagaa gtgatatcta 5040
aggagatgat agggttttca agttcagcta tgtccaccct agaaggagct gagtttttcg 5100
ttcctggttc catggaatcc ggtgtcatac atatggatct ggaccgcagc ttcttgccag 5160
taccttctgc agtaaacgcc tccattttcg aaagttttgt tcgtcagaac atcactgatt 5220
ctgaaaccga tgtccgttcc agcattcagc agctggtgaa agatagctat ggtttctcag 5280
caggcggtgc ttctgaaatt atatacggga acacctgtct cgcgctcttc aacaagcttg 5340
ttctttgctg catgcaagaa cagggcacct tgcttttccc cttgggaacc aacgggcatt 5400
acgtcaacgc agcaaagttt gtgaatgcaa ccaccttgac tattccaacg aaggcagatt 5460
caggcttcaa gatcgaacca agtgctctag ccgacacact agagaaggtg tctcagccgt 5520
gggtctatat ttctggcccc acaatcaacc ctactggctt cctgtacagt gacgacgata 5580
tagcagagct gctttctgtc tgtgcgacat acggagccag ggtggtgata gatacctcct 5640
cctctggtct ggagttccaa gccaccggct gcagccagtg gaatttggaa agatgtcttt 5700
ctaatgtcaa gtcttcaaag ccctcgttct ccgttgtcct gctcggagag ctgtcctttg 5760
agctgaccac ggctgggctt gatttcgggt ttctgattat gagcgactcg tccttggttg 5820
acacatttta cagtttccca agcttgagtc ggccacacag cacgttgaag tacacgttca 5880
ggaagctgtt gggtcttaag aaccagaagg atcagcattt ctctgatctc atccttgagc 5940
agaaggagac gttgaagaat cgtgccgacc agttgatcaa ggtatgcctt ttgggatatc 6000
ctgtgtttag gctctctgtt ttcttcccct gatcagctct ccgatcccct tacatcctta 6060
ggctaatttc agtacttcaa gtttgccacg catttctgac atattctttc ctcttgtttt 6120
attttcctgt gatgtgatga acagacgctt gagagctgcg gctgggacgc tgtgggctgc 6180
catggcggca tctcgatgct tgcaaaaccg accgcctaca ttggcaaatc gctcaaggtg 6240
gacggctttg agggcaagct ggacagccac aacatgaggg aagccctcct gaggtccacc 6300
gggctgtgca ttagcagcag cgggtggaca ggggtgccgg actactgccg cttcagcttt 6360
gctctggaga gcggcgactt cgaccgggcc atggagtgca tcgcccggtt cagggagctg 6420
<210> 12
<211> 6459
<212> ДНК
<213> Ячмень, Мутант 14018
<400> 12
gtccttggtg gcggtgctaa ggtgaatggt agcaactag 6459
atggctgcgg cggcggggga cgtggaggcg ttcctggcgg cgtgccaggc gtcgggcgac 60
gcggcgtacg gcgccgccaa ggccgtgctg gagcggctcg aggcgccggc cacgcgcgcc 120
gaggccaggc ggctcctcgg cgccgtgcga cggcgcttcg ccgccggcgg cccggccgcg 180
gggctcgagt gcttccgcac cttccacttc cgcatccacg acgtcgtcct cgacccccac 240
ctccaaggtt gcccggcccc ttccctacac acccgttgtc gacccgcatc tctttcgccg 300
atctggccgt caaaagcacg cggcttggta gaaatcaagc ctgcaatcct gatccgttta 360
tggctggcca gtcgatcagt aatttggcca taactggagt ataaccttgg tctctaatct 420
ctacctgacc atataccgag ttggttttct ttcttcttgt ttccgtattt gtgtagtttt 480
ttcttttctt tcgagcatga tgttctttga attaatgcgt accagactcc agtaattcga 540
cattttgaat tttggcgagt gttcttggaa tttataacac aacgaggctt tgatcaagtg 600
gtttatgtag aggagtgttt ttgttcttgt gcaccgtata caattctcta tttcccaaca 660
attttgatgg cctctaagca tcctgtagtc atgtctactg tgtaagctac agatttattc 720
atgtctatgt gtaagctgca aatggagaga aaagctatct atttggttgt tccagcttgt 780
tctttggcag aacaatcctg cccatcctat caccataagt ataaaagcac gacaaatgag 840
tggggcaagc atgctgccaa gctaatacac gacataagct acatattttg aggggcatgt 900
tatctttttt tttcccttct actcagtttc ttctttggga gaacaatcct actcaaccta 960
taatcataag aataaaagca agacagatga gtgctgcaga ctattggcat atataacaac 1020
taaataggac atctgtccgc tatatcttta gttaataatt gtatatagac gcagtctttg 1080
tgctggaaaa actgcaacta aatattttct tacattatat ggaatctggg tgtgatatga 1140
cttctttgtt acgttttgtg tgcataaagc attaacttct gtctttagtt ggcgcagcgg 1200
taaaaacacc cattgcttaa tattttattt gctttccgta gcttgataaa atttcaactg 1260
cttctaggat tccagcaaag aaagaagcta acaatgatgg agatacccag cattttcatt 1320
ccagaagact ggtcattcac tttctacgag ggtctcaacc ggcatccaga ttccatcttc 1380
agggataaga cagtagcaga gctgggatgt ggcaatggtt ggatatccat tgcacttgca 1440
gaaaagtggt gcccttcgaa gattggcacc tcttgttccg tagatattta tcttatctcg 1500
tttgttgcaa acatgggacc tgcagaagtt agacatttac tcaggttact ttatatgaaa 1560
cttttaggtg tctgccagta gtctgctggt ggtctaattt tcttggtata cctgatgccg 1620
tcgagcatat tgctttcaaa ttttgggcaa ggcattacca ccacatattg tttctacaat 1680
gctgaacaat tgctctcctt tgaaaggaag aaaaacaaga atgacatgca ccttagtagt 1740
ttaagccaca aataccagcg aatcaaatta gtttgcagtc agcttggcat taccttactt 1800
gagccttggt tgttcttttg aaggtttatg gtctggatat aaacccaaga gctatcaaga I860
ttgcatggat aaacctttac ttgaatgcac tagacgacga tggtctccca atctatgatg 1920
cggaggggaa aacattgctt gacagagtcg aattctatga atctgatctt ctttcttact 1980
gtagagataa caagatagaa cttgatcgca ttgttggatg cataccacag gtacggtcag 2040
gtttttacca atttcctgtg aatggggatt atagtcgatc agaacttgat caaaatgccc 2100
ttaatatctg cctttcagat tcttaacccc aatccagagg caatgtcaaa gattgtaact 2160
gaaaattcaa gtgaggagtt cttgtactcc ttgagcaact actgtgctct ccaggtgagt 2220
tgagatctat ttaaactcaa gccattcagt ttacctgtta ctaaatggtt acccatgtca 2280
gagtctccaa atctttttct tttctcaaac agcaaagaga gaagaaaact tttaagttct 2340
atcctgaaat tgactttaca atgcttgttc ataatctgct tacgaaatat gcgtttgaac 2400
atttctcttt tccttgtagg catgtggtca gacctttata taagaaaatg aagtttttgt 2460
agaaataatg tatgctttgt acttatgaca tggttccacc agtataatca atttaagtct 2520
aggtagttag gaacctagga tggagagcac cgacagtgta taatatatat atgtcgatag 2580
ggggttagca gtccaaatcc acctcaagtt caacctattg cataactttt ggtcttacaa 2640
cctgtatgga caaatgtgat cagcacccca gtctttccta taaaaatgtc tgctggaata 2700
tggaattatt aacagcggta tttattttta ccctgtttaa ttttttcctt tgctaaaaga 2760
atgataatcc ttatgccacg aggttacatt gtattactca agtcaatatt tgttactatg 2820
gctgattgta cgattccagc ttccggttgt taattttgtt atgtttgtga actttgctgc 2880
attcagggtt ttgttgagga ccaatttggc ctcgggttga ttgctcgggc tgttgaagaa 2940
gggatatctg tgataaagcc tagtggtctt atggtattca acatgggagg ccggccagga 3000
caaggtgtct gtgagcgcct atttctacgc cgtggatttc gcatcaataa gctctggcaa 3060
acaaaaatta tgcaggtagc aattctttga gtgactagat gttaactaat cccagtgttt 3120
ttccatgcca gcaacagcat tatatcctgg ttagaggaat atgctcttca tgttgcacac 3180
caatcttcag ctgggcctag aattttcatc taccggctta catttttaca ttacagaacc 3240
aatttttgtt gaggatcatt accaactagt tgggtctttg caggctgctg acacagacat 3300
ctccgcttta gttgaaattg agaaaaatag ccgacatcgc ttcgagttct ttatggatct 3360
tgttggggat cagcctgtgt gtgcgcgcac agcatgggca tacatgaaat ctggtggccg 3420
catttcacat gctttgtctg tgtatagctg tcaacttcgc cagcccaacc aggtacctat 3480
actctctgat tagatcttta caacaataat atagtaatgt caggaataat aataatttgg 3540
agaatttcag gtgaagaaaa tatttgagtt ccttaaagac ggattccatg aagtcagcag 3600
ctccctcgat ttgtcctttg atgatgattc tgttgctgat gaaaaaattc ctttcctagc 3660
atacctagct agtttcttgc aagagaataa gtctaatcct tgtgagcctc cagctggatg 3720
tttaaatttc cggaatcttg ttgctggatt tatgaagagt taccaccaca tcccattaac 3780
tcctgatgta agacttggtg tctattgcct acaattatgt ttgcttatta gaaattcata 3840
agatcaacct atttgatgct tctcacgtat gcttcatgtg acacttcctt ttcctctggt 3900
gcaccagaat gttgttgtgt tcccatcccg tgctgttgca atcgaaaatg ctcttcggtt 3960
gttctcacct ggacttgcaa ttgttgacga acacctaacc agacacttgc ccaagcaatg 4020
gttaacatct ttagcaattg aggtactttg accgatactc ccctctttct ttctgtgttt 4080
ggaactgtgg aaaatacatg tgttctgtga agaaaaagtt atgctgacaa gaatttcgat 4140
gttattgcca ttcttctaaa tttcaggaaa gtaaccatgc taaagataca gtaactgtaa 4200
tcgaagcacc acgccaatca gatttgctga ttgagttgat caggaaactg aagcctcagg 4260
ttgttgttac tggcatggct cagtttgagg ctatcaccag tgctgctttc gtgaacttat 4320
taagtgtaac gaaagatgtt ggttcccgat tattactaga tatttcagaa catctggaat 4380
tgtctagtct gccaagctca aatggtgtat tgaaatatct tgctgggaag accctgcctt 4440
cacatgcggc tatattgtgt ggcttagtta agaatcaggt gtgtgtcaat cagcctgaac 4500
tctagttgaa ctgttgtgca tactatatag aatatcttga cttttatatg tactttagaa 4560
acactgttta aatgtactca tttctttttg cttcatttta cttgcaggtt tattctgatc 4620
tggaagttgc ttttgctatc tctgaagatc caactgttta taaggcattg tcacaaacta 4680
ttgagctatt ggaaggacat acttctgtga tcagccagca ctattatggt tgtcttttcc 4740
atgagctgct ggcatttcaa attggtgacc ggcatccaca acaagaggta aacatggctt 4800
gcctcttcca gttctccatc tcactcagtt ctgtccacaa ggtgccgaat gatctgttca 4860
agtggacact cccctcagca cgggcaagct agtccatgaa tttggattag ttccctctta 4920
gctgggtact tcgattacac cacaatgagc tcctcaacgt ggtctggttt atgtttttca 4980
tgttttccct ctaatgtttg gttgctcttt ttcagagaga acctgcagaa gtgatatcta 5040
aggagatgat agggttttca agttcagcta tgtccaccct agaaggagct gagtttttcg 5100
ttcctggttc catggaatcc ggtgtcatac atatggatct ggaccgcagc ttcttgccag 5160
taccttctgc agtaaacgcc tccattttcg aaagttttgt tcgtcagaac atcactgatt 5220
ctgaaaccga tgtccgttcc agcattcagc agctggtgaa agatagctat ggtttctcag 5280
caggcggtgc ttctgaaatt atatacggga acacctgtct cgcgctcttc aacaagcttg 5340
ttctttgctg catgcaagaa cagggcacct tgcttttccc cttgggaacc aacgggcatt 5400
acgtcaacgc agcaaagttt gtgaatgcaa ccaccttgac tattccaacg aaggcagatt 5460
caggcttcaa gatcgaacca agtgctctag ccgacacact agagaaggtg tctcagccgt 5520
gggtctatat ttctggcccc acaatcaacc ctactggctt cctgtacagt gacgacgata 5580
tagcagagct gctttctgtc tgtgcgacat acggagccag ggtggtgata gatacctcct 5640
cctctggtct ggagttccaa gccaccggct gcagccagtg gaatttggaa agatgtcttt 5700
ctaatgtcaa gtcttcaaag ccctcgttct ccgttgtcct gctcggagag ctgtcctttg 5760
agctgaccac ggctgggctt gatttcgggt ttctgattat gagcgactcg tccttggttg 5820
acacatttta cagtttccca agcttgagtc ggccacacag cacgttgaag tacacgttca 5880
ggaagctgtt gggtcttaag aaccagaagg atcagcattt ctctgatctc atccttgagc 5940
agaaggagac gttgaagaat cgtgccgacc agttgatcaa ggtatgcctt ttgggatatc 6000
ctgtgtttag gctctctgtt ttcttcccct gatcagctct ccgatcccct tacatcctta 6060
ggctaatttc agtacttcaa gtttgccacg catttctgac atattctttc ctcttgtttt 6120
attttcctgt gatgtgatga acagacgctt gagagctgcg gctgggacgc tgtgggctgc 6180
catggcggca tctcgatgct tgcaaaaccg accgcctaca ttggcaaatc gctcaaggtg 6240
gacggctttg agggcaagct ggacagccac aacatgaggg aagccctcct gaggtccacc 6300
gggctgtgca ttagcagcag cgggtggaca ggggtgccgg actactgccg cttcagcttt 6360
gctctggaga gcggcgactt cgaccgggcc atggagtgca tcgcccggtt cagggagctg 6420
gtccttggtg gcggtgctaa ggtgaatggt agcaactag 6459
<210> 13
<211> 1088
<212> БЕЛОК
<213> Ячмень сорт Prestige
<400> 13
Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin
15 10 15
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg
20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala
35 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys
50 55 60
Phe Arg Thr Phe His Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His
65 70 75 80
Leu Gin Gly Phe Gin Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro
85 90 95
Ser lie Phe lie Pro Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu
100 105 110
Asn Arg His Pro Asp Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu
115 120 125
Gly Cys Gly Asn Gly Trp lie Ser lie Ala Leu Ala Glu Lys Trp Cys
130 135 140
Pro Ser Lys Val Tyr Gly Leu Asp lie Asn Pro Arg Ala lie Lys lie
145 150 155 160
Ala Trp lie Asn Leu Tyr Leu Asn Ala Leu Asp Asp Asp Gly Leu Pro
165 170 175
lie Tyr Asp Ala Glu Gly Lys Thr Leu Leu Asp Arg Val Glu Phe Tyr
180 185 190
Glu Ser Asp Leu Leu Ser Tyr Cys Arg Asp Asn Lys lie Glu Leu Asp
195 200 205
Arg lie Val Gly Cys lie Pro Gin lie Leu Asn Pro Asn Pro Glu Ala
210 215 220
Met Ser Lys lie Val Thr Glu Asn Ser Ser Glu Glu Phe Leu Tyr Ser
225 230 235 240
Leu Ser Asn Tyr Cys Ala Leu Gin Gly Phe Val Glu Asp Gin Phe Gly
245 250 255
Leu Gly Leu lie Ala Arg Ala Val Glu Glu Gly lie Ser Val lie Lys
260 265 270
Pro Ser Gly Leu Met Val Phe Asn Met Gly Gly Arg Pro Gly Gin Gly
275 280 285
Val Cys Glu Arg Leu Phe Leu Arg Arg Gly Phe Arg lie Asn Lys Leu
290 295 300
Trp Gin Thr Lys lie Met Gin Ala Ala Asp Thr Asp lie Ser Ala Leu
305 310 315 320
Val Glu lie Glu Lys Asn Ser Arg His Arg Phe Glu Phe Phe Met Asp
325 330 335
Leu Val Gly Asp Gin Pro Val Cys Ala Arg Thr Ala Trp Ala Tyr Met
340 345 350
Lys Ser Gly Gly Arg lie Ser His Ala Leu Ser Val Tyr Ser Cys Gin
355 360 365
Leu Arg Gin Pro Asn Gin Val Lys Lys lie Phe Glu Phe Leu Lys Asp
370 375 380
Gly Phe His Glu Val Ser Ser Ser Leu Asp Leu Ser Phe Asp Asp Asp
385 390 395 400
Ser Val Ala Asp Glu Lys lie Pro Phe Leu Ala Tyr Leu Ala Ser Phe
405 410 415
Leu Gin Glu Asn Lys Ser Asn Pro Cys Glu Pro Pro Ala Gly Cys Leu
420 425 430
Asn Phe Arg Asn Leu Val Ala Gly Phe Met Lys Ser Tyr His His lie
435 440 445
Pro Leu Thr Pro Asp Asn Val Val Val Phe Pro Ser Arg Ala Val Ala
450 455 460
lie Glu Asn Ala Leu Arg Leu Phe Ser Pro Gly Leu Ala lie Val Asp
465 470 475 480
Glu His Leu Thr Arg His Leu Pro Lys Gin Trp Leu Thr Ser Leu Ala
485 490 495
lie Glu Glu Ser Asn His Ala Lys Asp Thr Val Thr Val lie Glu Ala
500 505 510
Pro Arg Gin Ser Asp Leu Leu lie Glu Leu lie Arg Lys Leu Lys Pro
515 520 525
Gin Val Val Val Thr Gly Met Ala Gin Phe Glu Ala lie Thr Ser Ala
530 535 540
Ala Phe Val Asn Leu Leu Ser Val Thr Lys Asp Val Gly Ser Arg Leu
545 550 555 560
Leu Leu Asp lie Ser Glu His Leu Glu Leu Ser Ser Leu Pro Ser Ser
565 570 575
Asn Gly Val Leu Lys Tyr Leu Ala Gly Lys Thr Leu Pro Ser His Ala
580 585 590
Ala lie Leu Cys Gly Leu Val Lys Asn Gin Val Tyr Ser Asp Leu Glu
595 600 605
Val Ala Phe Ala lie Ser Glu Asp Pro Thr Val Tyr Lys Ala Leu Ser
610 615 620
Gin Thr lie Glu Leu Leu Glu Gly His Thr Ser Val lie Ser Gin His
625 630 635 640
Tyr Tyr Gly Cys Leu Phe His Glu Leu Leu Ala Phe Gin lie Gly Asp
645 650 655
Arg His Pro Gin Gin Glu Arg Glu Pro Ala Glu Val lie Ser Lys Glu
660 665 670
Met lie Gly Phe Ser Ser Ser Ala Met Ser Thr Leu Glu Gly Ala Glu
675 680 685
Phe Phe Val Pro Gly Ser Met Glu Ser Gly Val lie His Met Asp Leu
690 695 700
Asp Arg Ser Phe Leu Pro Val Pro Ser Ala Val Asn Ala Ser lie Phe
705 710 715 720
Glu Ser Phe Val Arg Gin Asn lie Thr Asp Ser Glu Thr Asp Val Arg
725 730 735
Ser Ser lie Gin Gin Leu Val Lys Asp Ser Tyr Gly Phe Ser Ala Gly
740 745 750
Gly Ala Ser Glu lie lie Tyr Gly Asn Thr Cys Leu Ala Leu Phe Asn
755 760 765
Lys Leu Val Leu Cys Cys Met Gin Glu Gin Gly Thr Leu Leu Phe Pro
770 775 780
Leu Gly Thr Asn Gly His Tyr Val Asn Ala Ala Lys Phe Val Asn Ala
785 790 795 800
Thr Thr Leu Thr lie Pro Thr Lys Ala Asp Ser Gly Phe Lys lie Glu
805 810 815
Pro Ser Ala Leu Ala Asp Thr Leu Glu Lys Val Ser Gin Pro Trp Val
820 825 830
Tyr lie Ser Gly Pro Thr lie Asn Pro Thr Gly Phe Leu Tyr Ser Asp
835 840 845
Asp Asp lie Ala Glu Leu Leu Ser Val Cys Ala Thr Tyr Gly Ala Arg
850 855 860
Val Val lie Asp Thr Ser Ser Ser Gly Leu Glu Phe Gin Ala Thr Gly
865 870 875 880
Cys Ser Gin Trp Asn Leu Glu Arg Cys Leu Ser Asn Val Lys Ser Ser
885 890 895
Lys Pro Ser Phe Ser Val Val Leu Leu Gly Glu Leu Ser Phe Glu Leu
900 905 910
Thr Thr Ala Gly Leu Asp Phe Gly Phe Leu lie Met Ser Asp Ser Ser
915 920 925
Leu Val Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Pro Ser Leu Ser Arg Pro His Ser
930 935 940
Thr Leu Lys Tyr Thr Phe Arg Lys Leu Leu Gly Leu Lys Asn Gin Lys
945 950 955 960
Asp Gin His Phe Ser Asp Leu lie Leu Glu Gin Lys Glu Thr Leu Lys
965 970 975
Asn Arg Ala Asp Gin Leu lie Lys Thr Leu Glu Ser Cys Gly Trp Asp
980 985 990
Ala Val Gly Cys His Gly Gly lie Ser Met Leu Ala Lys Pro Thr Ala
995 1000 1005
Tyr lie Gly Lys Ser Leu Lys Val Asp Gly Phe Glu Gly Lys Leu
1010 1015 1020
Asp Ser His Asn Met Arg Glu Ala Leu Leu Arg Ser Thr Gly Leu
1025 1030 1035
Cys lie Ser Ser Ser Gly Trp Thr Gly Val Pro Asp Tyr Cys Arg
1040 1045 1050
Phe Ser Phe Ala Leu Glu Ser Gly Asp Phe Asp Arg Ala Met Glu
1055 1060 1065
Cys lie Ala Arg Phe Arg Glu Leu Val Leu Gly Gly Gly Ala Lys
1070 1075 1080
Val Asn Gly Ser Asn 1085
<210> 14
<211> 1088
<212> БЕЛОК
<213> Ячмень сорт Sebastian
<400> 14
Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin
15 10 15
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg
20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala
35 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys
50 55 60
Phe Arg Thr Phe His Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His
65 70 75 80
Leu Gin Gly Phe Gin Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro
85 90 95
Ser lie Phe lie Pro Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu
100 105 110
Asn Arg His Pro Asp Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu
115 120 125
Gly Cys Gly Asn Gly Trp lie Ser lie Ala Leu Ala Glu Lys Trp Cys
130 135 140
Pro Ser Lys Val Tyr Gly Leu Asp lie Asn Pro Arg Pro lie Lys lie
145 150 155 160
Ala Trp lie Asn Leu Tyr Leu Asn Ala Leu Asp Asp Asp Gly Leu Pro
165 170 175
lie Tyr Asp Ala Glu Gly Lys Thr Leu Leu Asp Arg Val Glu Phe Tyr
180 185 190
Glu Ser Asp Leu Leu Ser Tyr Cys Arg Asp Asn Lys lie Glu Leu Asp
195 200 205
Arg lie Val Gly Cys lie Pro Gin lie Leu Asn Pro Asn Pro Glu Ala
210 215 220
Met Ser Lys lie Val Thr Glu Asn Ser Ser Glu Glu Phe Leu Tyr Ser
225 230 235 240
Leu Ser Asn Tyr Cys Ala Leu Gin Gly Phe Val Glu Asp Gin Phe Gly
245 250 255
Leu Gly Leu lie Ala Arg Ala Val Glu Glu Gly lie Ser Val lie Lys
260 265 270
Pro Ser Gly Leu Met Val Phe Asn Met Gly Gly Arg Pro Gly Gin Gly
275 280 285
Val Cys Glu Arg Leu Phe Leu Arg Arg Gly Phe Arg lie Asn Lys Leu
290 295 300
Trp Gin Thr Lys lie Met Gin Ala Ala Asp Thr Asp lie Ser Ala Leu
305 310 315 320
Val Glu lie Glu Lys Asn Ser Arg His Arg Phe Glu Phe Phe Met Asp
325 330 335
Leu Val Gly Asp Gin Pro Val Cys Ala Arg Thr Ala Trp Ala Tyr Met
340 345 350
Lys Ser Gly Gly Arg lie Ser His Ala Leu Ser Val Tyr Ser Cys Gin
355 360 365
Leu Arg Gin Pro Asn Gin Val Lys Lys lie Phe Glu Phe Leu Lys Asp
370 375 380
Gly Phe His Glu Val Ser Ser Ser Leu Asp Leu Ser Phe Asp Asp Asp
385 390 395 400
Ser Val Ala Asp Glu Lys lie Pro Phe Leu Ala Tyr Leu Ala Ser Phe
405 410 415
Leu Gin Glu Asn Lys Ser Asn Pro Cys Glu Pro Pro Ala Gly Cys Leu
420 425 430
Asn Phe Arg Asn Leu Val Ala Gly Phe Met Lys Ser Tyr His His lie
435 440 445
Pro Leu Thr Pro Asp Asn Val Val Val Phe Pro Ser Arg Ala Val Ala
450 455 460
lie Glu Asn Ala Leu Arg Leu Phe Ser Pro Gly Leu Ala lie Val Asp
465 470 475 480
Glu His Leu Thr Arg His Leu Pro Lys Gin Trp Leu Thr Ser Leu Ala
485 490 495
lie Glu Glu Ser Asn His Ala Lys Asp Thr Val Thr Val lie Glu Ala
500 505 510
Pro Arg Gin Ser Asp Leu Leu lie Glu Leu lie Arg Lys Leu Lys Pro
515 520 525
Gin Val Val Val Thr Gly Met Ala Gin Phe Glu Ala lie Thr Ser Ala
530 535 540
Ala Phe Val Asn Leu Leu Ser Val Thr Lys Asp Val Gly Ser Arg Leu
545 550 555 560
Leu Leu Asp lie Ser Glu His Leu Glu Leu Ser Ser Leu Pro Ser Ser
565 570 575
Asn Gly Val Leu Lys Tyr Leu Ala Gly Lys Thr Leu Pro Ser His Ala
580 585 590
Ala lie Leu Cys Gly Leu Val Lys Asn Gin Val Tyr Ser Asp Leu Glu
595 600 605
Val Ala Phe Ala lie Ser Glu Asp Pro Thr Val Tyr Lys Ala Leu Ser
610 615 620
Gin Thr lie Glu Leu Leu Glu Gly His Thr Ser Val lie Ser Gin His
625 630 635 640
Tyr Tyr Gly Cys Leu Phe His Glu Leu Leu Ala Phe Gin lie Gly Asp
645 650 655
Arg His Pro Gin Gin Glu Arg Glu Pro Ala Glu Val lie Ser Lys Glu
660 665 670
Met lie Gly Phe Ser Ser Ser Ala Met Ser Thr Leu Glu Gly Ala Glu
675 680 685
Phe Phe Val Pro Gly Ser Met Glu Ser Gly Val lie His Met Asp Leu
690 695 700
Asp Arg Ser Phe Leu Pro Val Pro Ser Ala Val Asn Ala Ser lie Phe
705 710 715 720
Glu Ser Phe Val Arg Gin Asn lie Thr Asp Ser Glu Thr Asp Val Arg
725 730 735
Ser Ser lie Gin Gin Leu Val Lys Asp Ser Tyr Gly Phe Ser Ala Gly
740 745 750
Gly Ala Ser Glu lie lie Tyr Gly Asn Thr Cys Leu Ala Leu Phe Asn
755 760 765
Lys Leu Val Leu Cys Cys Met Gin Glu Gin Gly Thr Leu Leu Phe Pro
770 775 780
Leu Gly Thr Asn Gly His Tyr Val Asn Ala Ala Lys Phe Val Asn Ala
785 790 795 800
Thr Thr Leu Thr lie Pro Thr Lys Ala Asp Ser Gly Phe Lys lie Glu
805 810 815
Pro Ser Ala Leu Ala Asp Thr Leu Glu Lys Val Ser Gin Pro Trp Val
820 825 830
Tyr lie Ser Gly Pro Thr lie Asn Pro Thr Gly Phe Leu Tyr Ser Asp
835 840 845
Asp Asp lie Ala Glu Leu Leu Ser Val Cys Ala Thr Tyr Gly Ala Arg
850 855 860
Val Val lie Asp Thr Ser Ser Ser Gly Leu Glu Phe Gin Ala Thr Gly
865 870 875 880
Cys Ser Gin Trp Asn Leu Glu Arg Cys Leu Ser Asn Val Lys Ser Ser
885 890 895
Lys Pro Ser Phe Ser Val Val Leu Leu Gly Glu Leu Ser Phe Glu Leu
900 905 910
Thr Thr Ala Gly Leu Asp Phe Gly Phe Leu lie Met Ser Asp Ser Ser
915 920 925
Leu Val Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Pro Ser Leu Ser Arg Pro His Ser
930 935 940
Thr Leu Lys Tyr Thr Phe Arg Lys Leu Leu Gly Leu Lys Asn Gin Lys
945 950 955 960
Asp Gin His Phe Ser Asp Leu lie Leu Glu Gin Lys Glu Thr Leu Lys
965 970 975
Asn Arg Ala Asp Gin Leu lie Lys Met Leu Glu Ser Cys Gly Trp Asp
980 985 990
Ala Val Gly Cys His Gly Gly lie Ser Met Leu Ala Lys Pro Thr Ala
995 1000 1005
Tyr lie Gly Lys Ser Leu Lys Val Asp Gly Phe Glu Gly Lys Leu
1010 1015 1020
Asp Ser His Asn Met Arg Glu Ala Leu Leu Arg Ser Thr Gly Leu
1025 1030 1035
Cys lie Ser Ser Ser Gly Trp Thr Gly Val Pro Asp Tyr Cys Arg
1040 1045 1050
Phe Ser Phe Ala Leu Glu Ser Gly Asp Phe Asp Arg Ala Met Glu
1055 1060 1065
Cys lie Ala Arg Phe Arg Glu Leu Val Leu Gly Gly Gly Ala Lys
1070 1075 1080
Val Asn Gly Ser Asn 1085
<210> 15
<211> 186
<212> БЕЛОК
<213> Ячмень, Мутант 1401E
<400> 15
Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin
15 10 15
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg
20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala
35 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys
50 55 60
Phe Arg Thr Phe His Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His
65 70 75 80
Leu Gin Gly Phe Gin Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro
85 90 95
Ser lie Phe lie Pro Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu
100 105 110
Asn Arg His Pro Asp Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu
115 120 125
Gly Cys Gly Asn Gly Trp lie Ser lie Ala Leu Ala Glu Lys Trp Cys
130 135 140
Pro Ser Lys lie Gly Thr Ser Cys Ser Val Asp lie Tyr Leu lie Ser
145 150 155 160
Phe Val Ala Asn Met Gly Pro Ala Glu Val Arg His Leu Leu Arg Leu
165 170 175
Leu Tyr Met Lys Leu Leu Gly Val Cys Gin 180 185
<210> 16
<211> 180
<212> БЕЛОК
<213> Ячмень, Мутант 1401E
<400> 16
Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin
15 10 15
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg
20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala
35 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys
50 55 60
Phe Arg Thr Phe His Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His
65 70 75 80
Leu Gin Gly Phe Gin Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro
85 90 95
Ser lie Phe lie Pro Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu
100 105 110
Asn Arg His Pro Asp Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu
115 120 125
Gly Cys Gly Asn Gly Trp lie Ser lie Ala Leu Ala Glu Lys Trp Cys
130 135 140
Pro Ser Lys lie Gly Thr Ser Cys Ser Val Asp lie Tyr Leu lie Ser
145 150 155 160
Phe Val Ala Asn Met Gly Pro Ala Glu Val Arg His Leu Leu Arg Phe
165 170 175
Met Val Trp lie 180
<210> 17
<211> 163
<212> БЕЛОК
<213> Ячмень, Мутант 1401E
<400> 17
Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Cys Gin
15 10 15
Ala Ser Gly Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Ala Lys Ala Val Leu Glu Arg
20 25 30
Leu Glu Ala Pro Ala Thr Arg Ala Glu Ala Arg Arg Leu Leu Gly Ala
35 40 45
Val Arg Arg Arg Phe Ala Ala Gly Gly Pro Ala Ala Gly Leu Glu Cys
50 55 60
Phe Arg Thr Phe His Phe Arg lie His Asp Val Val Leu Asp Pro His
65 70 75 80
Leu Gin Gly Phe Gin Gin Arg Lys Lys Leu Thr Met Met Glu lie Pro
85 90 95
Ser lie Phe lie Pro Glu Asp Trp Ser Phe Thr Phe Tyr Glu Gly Leu
100 105 110
Asn Arg His Pro Asp Ser lie Phe Arg Asp Lys Thr Val Ala Glu Leu
115 120 125
Gly Cys Gly Asn Gly Leu Trp Ser Gly Tyr Lys Pro Lys Ser Tyr Gin
130 135 140
Asp Cys Met Asp Lys Pro Leu Leu Glu Cys Thr Arg Arg Arg Trp Ser
145 150 155 160
Pro Asn Leu
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения напитка на основе зерен с низкими уровнями одного или нескольких вещества с неприятным привкусом и/или их предшественников, где способ включает сниженное потребление энергии, где способ включает этапы:
(i) предоставления зернового растения или его части, где
указанное зерновое растение, несет:
(a) первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности липоксигеназы (LOX)-l; и
(b) вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2; и
(c) третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности S-аденозилметионин:метионин-Б-метилтрансферазы (ММТ) ;
(ii) необязательного соложения по меньшей мере части указанного зернового растения, таким образом, получая осоложенное зерновое растение;
(iii) заваривания указанного зернового растения и/или осоложенного зернового растения и необязательно дополнительных добавок, таким образом, получая сусло;
(iv) нагревания указанного сусла необязательно в присутствии дополнительного ингредиента(ов), где выпаривается самое большое 4% объема сусла, таким образом, получая нагретое сусло;
(v) переработки указанного нагретого сусла в напиток;
таким образом, получая получаемый из зернового растения
напиток с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников.
2. Способ по п. 1, где способ представляет собой способ получения напитка на основе ячменя с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и/или их предшественников, где способ включает сниженное потребление энергии, где способ включает этапы:
(i) предоставления растения ячменя или его части, где указанное растение ячменя несет:
(а) первую мутацию, приводящую к полной потере
функциональности липоксигеназы (LOX)-l; и
(b) вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2; и
(c) третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности S-аденозилметионин:метионин-Б-метилтрансферазы (ММТ) ;
(ii) необязательного соложения по меньшей мере части указанного зернового растения, таким образом, получая осоложенное зерновое растение;
(iii) заваривания указанного зернового растения и/или осоложенного зернового растения и необязательно дополнительных добавок, таким образом, получая сусло;
(iv) нагревания указанного сусла необязательно в присутствии дополнительного ингредиента(ов), где выпаривается самое большое 4% объема сусла, таким образом, получая нагретое сусло;
(v) переработки указанного нагретого сусла в напиток;
таким образом, получая получаемый из зернового растения
напиток с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников. Способ по п. 1, где зерновое растение представляет собой растение ячменя.
3. Способ по п. 2, где этап (i) включает предоставление зерен ячменя.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где указанные вещества с неприятным привкусом представляют собой диметилсульфид (DMS) и транс-2-ноненаль (T2N).
5. Способ по п.4, где низкими уровнями DMS являются уровни DMS ниже 3 0 млрд.д., предпочтительно ниже 2 5 млрд.д., более предпочтительно ниже 20 млрд.д. и уровни T2N ниже 0,025 млрд.д., например, ниже 0,02 4 млрд.д.
6. Способ по любому из пп.1-5, где указанные
предшественники веществ с неприятным привкусом представляют
собой S-метил-метионин (SMM) и потенциал T2N.
7. Способ по п. 6, где низкими уровнями SMM и потенциала
T2N являются уровни SMM менее 50 млрд.д., предпочтительно менее
40 млрд.д., более предпочтительно менее 30 млрд.д., даже более
предпочтительно менее 2 0 млрд.д., а уровни потенциала T2N составляют менее 2, предпочтительно менее 1,5 млрд.д.
8. Способ по п. б, где низкими уровнями SMM являются уровни SMM менее 50 млрд.д., предпочтительно менее 4 0 млрд.д., более предпочтительно менее 30 млрд.д., даже более предпочтительно менее 2 0 млрд.д., а низкими уровнями потенциала T2N являются уровни потенциала T2N менее 60%, предпочтительно менее 50% от уровня потенциала T2N в напитке, получаемом тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где весь указанный предоставляемый ячмень является осоложенным.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где указанный ячмень является осоложенным способом, включающим этапы
a) замачивания указанного ячменя;
b) проращивания указанного ячменя;
c) печной сушки указанного ячменя
11. Способ по п. 10, где печную сушку указанного ячменя проводят при температуре самое большое 8 0°С, еще более предпочтительно при температуре самое большое 75°С, например, при температуре самое большое 7 0°С, например, при температуре самое большое 65°С, например, при температуре самое большое 60°С, например, при температуре самое большое 55°С, например, при температуре самое большое 50°С, например, при температуре самое большое 45°С, например, при температуре самое большое 40°С.
12. Способ по любому пп. 10-11, где температура печной сушки в любой момент печной сушки не превышает приблизительно 80°С, предпочтительно не превышает приблизительно 75°С.
13. Способ по любому из пп.2-7, где ни один из предоставляемых экземпляров ячменя не является осоложенным.
14. Способ по любому из пп.1-13, где указанный ячмень и/или указанный осоложенный ячмень до указанного заваривания размалывают.
13.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где композицию сусла получают способом, включающим этап заваривания с использованием заваривания при температуре не превосходящей 69°С.
16. Способ по любому из пп.1-15, где температура при заваривании никогда не превосходит 8 0°С, предпочтительно 7 8°С.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где на этапе (iii) добавляют дополнительную добавку(и), и указанные дополнительные добавки выбраны из группы, состоящей из кукурузы, риса и неосоложенного зернового растения, отличного от ячменя.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где на этапе (iv) добавляют дополнительный ингредиент(ы), и указанные дополнительные ингредиенты представляют собой хмель или его экстракт.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где указанное сусло нагревают до температуры самое большое 99,8°С, например, самое большое 99,5°С, например, самое большое 99°С.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где этап (iv), относящийся к нагреванию указанного сусла, проводят с суслом по существу в закрытом контейнере, предпочтительно с суслом в закрытом контейнере.
21. Способ по любому из пп. 1-20, где указанное сусло нагревают до температуры выше 8 0°С в течение самое большое 3 0 мин, предпочтительно самое большое 2 0 мин.
22. Способ по любому из пп. 1-21, где выпаривается самое большое 3%, например, самое большое 2%, например, самое большое 1%, например, самое большое 0,5%, например, самое большое 0,1%, например, самое большое 0,01% объема сусла.
23. Способ по любому из пп. 1-22, где этап v) включает охлаждение указанного нагретого сусла.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где этап v) включает ферментацию сусла.
25. Способ по любому из пп. 1-24, где способ ни на одном этапе не включает нагревания до температуры более 99°С.
26. Способ по любому из пп. 1-25, где способ не включает нагревания до температуры выше 8 0°С в течение более 30 мин,
13.
предпочтительно в течение более 2 0 мин.
27. Растение ячменя или его часть, где указанное растение ячменя несет:
a) первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности LOX-1, и
b) вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности LOX-2, и
c) третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ.
28. Растение ячменя по п. 27, где ген, кодирующий LOX-1 указанного растения, несет мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутации со сдвигом рамки, делеции, нонсенс-мутации, вставки и мутации участка сплайсинга.
29. Растение ячменя или его часть, по п. 27, где ген, кодирующий LOX-1 указанного растения, содержит преждевременный стоп-кодон.
30. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 27-29, где ген, кодирующий LOX-1 указанного растения, содержит преждевременный стоп-кодон, находящийся самое большое на 705, предпочтительно самое большое на 665 кодонов ниже стартового кодона.
31. Растение ячменя или его часть, по п. 30, где ген, кодирующий LOX-1 указанного растения, содержит нонсенс-кодон, где указанный кодон соответствует номерам оснований 3572-3574 SEQ ID N0:2.
32. Растение ячменя по любому из пп. 27-31, где ген, кодирующий L0X-2 указанного растения, содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутации со сдвигом рамки, делеции, нонсенс-мутации, вставки и мутации участка сплайсинга.
33. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 27-32, где ген, кодирующий L0X-2 указанного растения, содержит преждевременный стоп-кодон.
34. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 27-33, где ген, кодирующий L0X-2 указанного растения, содержит преждевременный стоп-кодон, находящийся самое большое на 7 07, предпочтительно самое большое на 684 кодона ниже стартового
28.
кодона.
35. Растение ячменя или его часть, по п. 34, где ген, кодирующий LOX-2 указанного растения, содержит мутацию в положении нуклеотида 2689 SEQ ID N0:5, приводящую к образованию стоп-кодона.
36. Растение ячменя по любому из пп. 27-35, где ген, кодирующий ММТ указанного растения, содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутации со сдвигом рамки, делеции, нонсенс-мутации, вставки и мутации участка сплайсинга.
37. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 27-36, где мутация в гене, кодирующем ММТ, находится в участке сплайсинга.
38. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 27-37, где мутация в гене, кодирующем ММТ, находится в участке сплайсинга интрона.
39. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 27-38, где мутация в гене, кодирующем ММТ, представляет собой мутацию в 5'-участке сплайсинга интрона, например, мутацию G^A 5'-концевого основания интрона.
40. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 27-39, где мутация в гене, кодирующем ММТ, представляет собой мутацию в 5'-участке сплайсинга интрона, выбранного из группы, состоящей из интронов 2 и 5.
41. Растение ячменя или его часть, по п. 40, где мутация в гене, кодирующем ММТ, представляет собой мутацию G^A в положении основания 307 6 SEQ ID N0:9.
42. Растение ячменя или его часть, по п. 40, где мутация, в гене, кодирующем ММТ, представляет собой мутацию G^A в положении основания 1462 SEQ ID N0:11.
43. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 27-42, где мутация происходит в гене, кодирующем укороченную форму ММТ, содержащую N-концевой фрагмент ММТ дикого типа и необязательно дополнительные С-концевые последовательности, не представленные в ММТ дикого типа, где указанный N-концевой фрагмент содержит самое большое 500, более предпочтительно самое большое 450, даже более предпочтительно самое большое
35.
400, еще более предпочтительно самое большое 350, даже более предпочтительно самое большое 32 0, еще более предпочтительно самое большое 311 или самое большое 288 N-концевых аминокислотных остатков SEQ ID N0:13.
44. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 27-43, где указанное растение представляет собой растение-потомок ячменя, обозначаемое "Barley, Hordeum vulgare: Line 8063", депонированное в АТСС 13 октября 2008 г. с обозначением РТА-9543, и растение ячменя, обозначаемое "Barley, Hordeum vulgare L.: Line A689", депонированное в ATCC с номером депозита РТА-9640.
45. Композиция солода, содержащая переработанное растение ячменя или его часть, где указанное растение ячменя представляет собой растение ячменя по любому из пп. 27-44.
46. Композиция солода по п. 45, где указанная часть указанного растения ячменя представляет собой зерно(а).
47. Композиция солода по любому из пп.4 5-4 6, где композиция солода выбрана из группы, состоящей из зеленого солода и солода, подвергнутого печной сушке.
48. Композиция солода по любому из пп. 45-47, где композиция солода представляет собой молотый солод.
49. Композиция солода по любому из пп. 4 5-4 8, где композиция солода содержит самое большое 2, предпочтительно самое большое 1, более предпочтительно самое большое 0,5 мкг/г, даже более предпочтительно самое большое 0,2 мкг/г SMM.
50. Напиток на основе ячменя, получаемый из растения ячменя или его части по любому из пп. 2 7-4 4.
51. Напиток по п. 50, где указанный напиток получают способом по любому из пп. 2-2 6.
52. Напиток по любому из пп. 50-51, где напиток представляет собой солодовый напиток.
53. Напиток по любому из пп. 50-52, где напиток представляет собой ферментированный солодовый напиток.
54. Напиток по любому из пп. 50-53, где напиток представляет собой пиво.
55. Напиток по любому из пп. 50-51 и 54, где указанный
52.
напиток представляет собой ячменное пиво.
56. Напиток по любому из пп. 50-55, где напиток
представляет собой неалкогольный солодовый напиток.
57. Напитки по любому из пп. 50-56, где указанный напиток
дает по меньшей мере в 1,5 раза больше, предпочтительно по
меньшей мере в 2 раза больше, еще более предпочтительно по
меньшей мере в 3 раза больше пены в течение периода от 60 до 8 0
мин по сравнению с напитком, получаемым тем же способом из
ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench.
По доверенности
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ, ИЗМЕНЕННАЯ ПО СТ. 34 РСТ (ДЛЯ СВЕДЕНИЯ)
1. Способ получения напитка на основе ячменя с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и/или их предшественников, где способ включает сниженное потребление энергии, где способ включает этапы:
(i) предоставления растения ячменя или его части, где
указанное растение ячменя несет:
(a) первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности липоксигеназы (LOX)-l; и
(b) вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности L0X-2; и
(c) третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности S-аденозилметионин:метионин-Б-метилтрансферазы (ММТ) ;
(ii) необязательного соложения по меньшей мере части указанного ячменя, таким образом, получая осоложенный ячмень;
(iii) заваривания указанного ячменя и/или осоложенного ячменя и необязательно дополнительных добавок, таким образом, получая сусло;
(iv) нагревания указанного сусла необязательно в присутствии дополнительного ингредиента(ов), где выпаривается самое большое 4% объема сусла, таким образом, получая нагретое сусло;
(v) переработки указанного нагретого сусла в напиток;
таким образом, получая напиток на основе ячменя с низкими
уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников.
2. Способ по п. 1, где этап (i) включает предоставление зерен ячменя.
3. Способ по любому из пп. 1-2, где указанные вещества с неприятным привкусом представляют собой диметилсульфид (DMS) и транс-2-ноненаль (T2N).
4. Способ по п. 3, где низкими уровнями DMS являются уровни DMS ниже 3 0 млрд.д., предпочтительно ниже 2 5 млрд.д., более предпочтительно ниже 20 млрд.д. и уровни T2N ниже 0,025 млрд.д., например, ниже 0,02 4 млрд.д.
2.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанные
предшественники веществ с неприятным привкусом представляют
собой S-метил-метионин (SMM) и потенциал T2N.
6. Способ по п. 5, где низкими уровнями SMM и потенциала T2N являются уровни SMM менее 50 млрд.д., предпочтительно менее 40 млрд.д., более предпочтительно менее 30 млрд.д., даже более предпочтительно менее 2 0 млрд.д., а уровни потенциала T2N составляют менее 2, предпочтительно менее 1,5 млрд.д.
7. Способ по п. 5, где низкими уровнями SMM являются уровни SMM менее 50 млрд.д., предпочтительно менее 4 0 млрд.д., более предпочтительно менее 30 млрд.д., даже более предпочтительно менее 2 0 млрд.д., а низкими уровнями потенциала T2N являются уровни потенциала T2N менее 60%, предпочтительно менее 50% от уровня потенциала T2N в напитке, получаемом тем же способом из ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где весь указанный предоставляемый ячмень является осоложенным.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где указанный ячмень является осоложенным способом, включающим этапы
a) замачивания указанного ячменя;
b) проращивания указанного ячменя;
c) печной сушки указанного ячменя
10. Способ по п. 9, где печную сушку указанного ячменя проводят при температуре самое большое 8 0°С, еще более предпочтительно при температуре самое большое 75°С, например, при температуре самое большое 7 0°С, например, при температуре самое большое 65°С, например, при температуре самое большое 60°С, например, при температуре самое большое 55°С, например, при температуре самое большое 50°С, например, при температуре самое большое 45°С, например, при температуре самое большое 40°С.
11. Способ по любому пп. 9-10, где температура печной сушки в любой момент печной сушки не превышает приблизительно
10.
80°С, предпочтительно не превышает приблизительно 75°С.
12. Способ по любому из пп. 1-6, где ни один из предоставляемых экземпляров ячменя не является осоложенным.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где указанный ячмень и/или указанный осоложенный ячмень до указанного заваривания размалывают.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где композицию сусла получают способом, включающим этап заваривания с использованием заваривания при температуре не превосходящей 69°С.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где температура при заваривании никогда не превосходит 8 0°С, предпочтительно 7 8°С.
16. Способ по любому из пп. 1-15, где на этапе (iii) добавляют дополнительную добавку(и), и указанные дополнительные добавки выбраны из группы, состоящей из кукурузы, риса и неосоложенного зернового растения, отличного от ячменя.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где на этапе (iv) добавляют дополнительный ингредиент(ы), и указанные дополнительные ингредиент представляют собой хмель или его экстракт.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где указанное сусло нагревают до температуры самое большое 99,8°С, например, самое большое 99,5°С, например, самое большое 99°С.
19. Способ по любому из пп.1-17, где указанное сусло нагревают до температуры выше 8 0°С в течение самое большое 3 0 мин, предпочтительно самое большое 2 0 мин.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где выпаривается самое большое 3%, например, самое большое 2%, например, самое большое 1%, например, самое большое 0,5%, например, самое большое 0,1%, например, самое большое 0,01% объема сусла.
21. Способ по любому из пп. 1-2 0, где этап v) включает охлаждение указанного нагретого сусла.
22. Способ по любому из пп. 1-21, где этап v) включает ферментацию сусла.
23. Способ по любому из пп. 1-22, где способ ни на одном этапе не включает нагревания до температуры более 99°С.
12.
приводящую
полной потере
приводящую
полной потере
a) первую мутацию, функциональности LOX-1, и
b) вторую мутацию, функциональности LOX-2, и
c) третью мутацию, функциональности ММТ.
26. Растение ячменя по п. 25, где ген, кодирующий LOX-1 указанного растения, несет мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутации со сдвигом рамки, делеции, нонсенс-мутации, вставки и мутации участка сплайсинга.
27. Растение ячменя или его часть, по п. 26, где ген, кодирующий LOX-1 указанного растения, содержит преждевременный стоп-кодон.
28. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 2 5-2 7, где ген, кодирующий LOX-1 указанного растения, содержит преждевременный стоп-кодон, находящийся самое большое на 705, предпочтительно самое большое на 665 кодонов ниже стартового кодона.
29. Растение ячменя или его часть, по п. 28, где ген, кодирующий LOX-1 указанного растения, содержит нонсенс-кодон, где указанный кодон соответствует номерам оснований 3572-3574 SEQ ID N0:2.
30. Растение ячменя по любому из пп. 25-29, где ген, кодирующий L0X-2 указанного растения, содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутации со сдвигом рамки, делеции, нонсенс-мутации, вставки и мутации участка сплайсинга.
31. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 25-30, где ген, кодирующий LOX-2 указанного растения, содержит преждевременный стоп-кодон.
32. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 25-31,
где ген, кодирующий L0X-2 указанного растения, содержит преждевременный стоп-кодон, находящийся самое большое на 7 07, предпочтительно самое большое на 684 кодона ниже стартового кодона.
33. Растение ячменя или его часть, по п. 32, где ген, кодирующий LOX-2 указанного растения, содержит мутацию в положении нуклеотида 2689 SEQ ID N0:5, приводящую к образованию стоп-кодона.
34. Растение ячменя по любому пп. 25-33, где ген, кодирующий ММТ указанного растения, содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутации со сдвигом рамки, делеции, нонсенс-мутации, вставки и мутации участка сплайсинга.
35. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 25-34, где мутация в гене, кодирующем ММТ, находится в участке сплайсинга.
36. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 25-35, где мутация в гене, кодирующем ММТ, находится в участке сплайсинга интрона.
37. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 25-36, где мутация в гене, кодирующем ММТ, представляет собой мутацию в 5'-участке сплайсинга интрона, например, мутацию G^A 5'-концевого основания интрона.
38. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 25-37, где мутация в гене, кодирующем ММТ, представляет собой мутацию в 5'-участке сплайсинга интрона, выбранного из группы, состоящей из интронов 2 и 5.
39. Растение ячменя или его часть, по п. 38, где мутация в гене, кодирующем ММТ, представляет собой мутацию G^A в положении основания 307 6 SEQ ID N0:9.
40. Растение ячменя или его часть, по п. 38, где мутация, в гене, кодирующем ММТ, представляет собой мутацию G^A в положении основания 1462 SEQ ID N0:11.
41. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 25-40, где мутация происходит в гене, кодирующем укороченную форму ММТ, содержащую N-концевой фрагмент ММТ дикого типа и необязательно дополнительные С-концевые последовательности, не
33.
представленные в ММТ дикого типа, где указанный N-концевой фрагмент содержит самое большое 500, более предпочтительно самое большое 450, даже более предпочтительно самое большое 400, еще более предпочтительно самое большое 350, даже более предпочтительно самое большое 32 0, еще более предпочтительно самое большое 311 или самое большое 288 N-концевых аминокислотных остатков SEQ ID N0:13.
42. Растение ячменя или его часть по любому из пп. 25-41, где указанное растение представляет собой растение-потомок ячменя, обозначаемое "Barley, Hordeum vulgare: Line 8063", депонированное в АТСС 13 октября 2008 г. с обозначением РТА-9543, и растение ячменя, обозначаемое "Barley, Hordeum vulgare L.: Line A689", депонированное в ATCC с номером депозита РТА-9640.
43. Композиция солода, содержащая переработанное растение ячменя или его часть, где указанное растение ячменя представляет собой растение ячменя по любому из пп. 25-42.
44. Композиция солода по п. 43, где указанная часть указанного растения ячменя представляет собой зерно(а).
45. Композиция солода по любому из пп. 43-44, где композиция солода выбрана из группы, состоящей из зеленого солода и солода, подвергнутого печной сушке.
46. Композиция солода по любому из пп. 43-45, где композиция солода представляет собой молотый солод.
47. Композиция солода по любому из пп. 43-4 6, где композиция солода содержит самое большое 2, предпочтительно самое большое 1, более предпочтительно самое большое 0,5 мкг/г, даже более предпочтительно самое большое 0,2 мкг/г SMM.
48. Напиток на основе ячменя, получаемый из растения ячменя или его части по любому из пп. 25-42, где указанный напиток содержит уровень диметилсульфида (DMS) ниже 10 млрд.д.
49. Напиток по п. 4 8 где указанный напиток получают способом по любому из пп. 1-24.
50. Напиток по любому из пп. 48-49, где напиток представляет собой солодовый напиток.
51. Напиток по любому из пп. 4 8-50, где напиток
50.
представляет собой ферментированный солодовый напиток.
52. Напиток по любому из пп. 48-51, где напиток представляет собой пиво.
53. Напиток по любому из пп. 48-49 и 52, где указанный напиток представляет собой ячменное пиво.
54. Напиток по любому из пп. 48-53, где напиток представляет собой неалкогольный солодовый напиток.
55. Напитки по любому из пп. 4 8-54, где указанный напиток
дает по меньшей мере в 1,5 раза больше, предпочтительно по
меньшей мере в 2 раза больше, еще более предпочтительно по
меньшей мере в 3 раза больше пены в течение периода от 60 до 8 0
мин по сравнению с напитком, получаемым тем же способом из
ячменя дикого типа, предпочтительно из сорта Quench.
По доверенности
Скрещивание без LOX-1-без LOX-2 w без ММТ
(мутант А689) (мутант А8063)
Зерна F1
Получение двойных гаплоидов
Двойные гаплоидные _ _
растения-потомки 0тбоР наиболее продуктивных линии
-Агрономические характеристики
-Отсутствие активности LOX и ММТ
Тройной нуль-мутант (без LOX-1-без LOX-2-без ММТ)
ФИГ. 3
Время удержания (мин)
го m
х° п
Ячмень Соложение "§ Печная Солод
§ о сушка
сусло
го со
го Сладкое Варка Сваренное
сусло
без LOX-1-без LOX-2-без ММТ
40°С
75° 85°С
без LOX-1-без ММТ
75°С-ф
без LOX-1-без LOX-2
без ММТ
без LOX-1
85°С"
сорт Power ; s,^^,^^^^^!
40°С-75°С < 85°С
м "-.--was
го m
1 I ^
Ячмень I 3 солод* cv(tm) Солод 3 Сладкое ВаРка ^ Вихревое |
ячмень о солод сушка сусло разделение о
сорт Quench
Ячмень
о с; о О
Зеленый солод
Печная сушка
Солод
го са
Q. ГО
со го со
Сладкое сусло
Варка
с; о
О) > ч
S ° X
Вихревое разделение
о с; о > > О
CD 00
(19)
129
Таблица 1
128
129
Таблица 1
128
131
131
133
Таблица 4
132
135
135
136
Таблица 7
136
Таблица 7
137
Таблица 8
137
Таблица 8
138
138
139
Таблица 9
139
Таблица 9
140
Таблица 11
140
Таблица 11
141
141
143
Таблица 12
143
Таблица 12
144
Таблица 13
144
Таблица 13
145
Таблица 14
145
Таблица 14
146
146
147
148
Таблица 16
150
150
151
151
155
155
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 2
ФИГ. 4
ФИГ. 5
ФИГ. 5
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 6
ФИГ. 8
ФИГ. 8
ФИГ. 9
ФИГ. 9
ФИГ. 10
ФИГ. 10