[**]

Настоящее изобретение относится к соединениям и их композициям, которые являются ингибиторами протеинтирозинкиназ. Соединения применяют для лечения глазных заболеваний, расстройств и состояний. Указанные соединения имеют формулы (I), (II) или (III), где R=(IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI) или (XII).

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к соединениям и их композициям, которые являются ингибиторами протеинтирозинкиназ. Соединения применяют для лечения глазных заболеваний, расстройств и состояний. Указанные соединения имеют формулы (I), (II) или (III), где R=(IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI) или (XII).

---

Евразийское (21) 201291055 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.09.30
(22) Дата подачи заявки 2011.04.08
(51) Int. Cl.
C07D 495/04 (2006.01) A61K31/4365 (2006.01) A61K 31/444 (2006.01) A61K 31/496 (2006.01) A61K 31/5377 (2006.01) A61P27/02 (2006.01)
(54) ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНТИРОЗИНКИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
(31) 61/324,803
(32) 2010.04.16
(33) US
(вв) PCT/CA2011/000390
(87) WO 2011/127565 2011.10.20
(71) Заявитель: МЕТИЛДЖЕН ИНК. (CA)
(72) Изобретатель:
Раппель Стефан, Чжань Лицзе, Кларидж Стефен Уилльям, Раппель Фрэнк, Годетт Фредерик, Вайсбург Аркадий (CA)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к соединениям и их композициям, которые являются ингибиторами протеинтирозинкиназ. Соединения применяют для лечения глазных заболеваний, расстройств и состояний. Указанные соединения имеют формулы (I), (II) или (III), где R=(IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI) или (XII).
~со Jx^Hxb Чо^^Н-0
"°°-\ Н> ие°^0^Н._ /N_\ " М' (Vll>
(iv)^v_Q_ M^-Q- M_Q_ Г)
2420-190287ЕА/061
ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНТИРОЗИНКИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ Родственная заявка
По настоящей заявке испрашивается приоритет
предварительной заявки США серийный номер 61/324803, поданной 16 апреля 2 010 года. Все содержание вышеуказанной заявки включено в настоящее описание во всей своей полноте с помощью ссылки.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение Настоящее изобретение относится к соединениям, которые ингибируют протеинтирозинкиназную активность. В частности настоящее изобретение относится к соединениям, которые ингибируют протеинтирозинкиназную активность рецепторов факторов роста, что приводит к ингибированию рецепторной передачи сигнала, например, ингибированию VEGF рецепторной передачи сигнала и HGF рецепторной передачи сигнала. Более конкретно настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам лечения глазных заболеваний, расстройств или состояний.
Краткое изложение родственного уровня техники
Тирозинкиназы можно классифицировать как киназы рецептора
фактора роста (например, EGFR, PDGFR, FGFR и егЬВ2) или
нерецепторные (например, c-src и Ьсг-аЫ) киназы. Тирозинкиназы
рецепторного типа образуют приблизительно 2 0 различных
подсемейств. Тирозинкиназы нерецепторного типа образуют
множество подсемейств. Данные тирозинкиназы обладают различной
биологической активностью. Рецепторные тирозинкиназы
представляют собой большие ферменты, которые встроены в клеточную мембрану и содержат внеклеточный связывающий домен для факторов роста, трансмембранный домен и внутриклеточную часть, которая функционируют как киназа, фосфорилируя конкретные остатки тирозина в белках и, следовательно, влияя на клеточную пролиферацию. Аномальная или неадекватная
протеинкиназная активность может способствовать возникновению заболевания, связанного с данной аномальной киназной активностью.
Например, тирозинкиназы способствуют патологии глазных заболеваний, расстройств и состояний, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и диабетическая ретинопатия (DR). Слепота вследствие данных заболеваний связана с нарушениями ретинальной неоваскуляризации. Ангиогенез является важным компонентом определенных нормальных физиологических процессов, таких как эмбриогенез и заживление ран, но нарушение ангиогенеза способствует некоторым заболеваниям. Образование новых кровеносных сосудов регулируется факторами роста, такими как VEGF и HGF, которые активируют рецепторные тирозинкиназы, приводя в результате к запуску сигнальных путей, приводящих к утечке плазмы в макулу, вызывая потерю зрения. Таким образом, киназы представляют собой важные мишени для лечения заболеваний глаз, включая неоваскуляризацию.
Таким образом, существует необходимость в разработке стратегии для контроля неоваскуляризации глаза и в разработке стратегии для лечения глазных заболеваний.
В настоящем изобретении описываются низкомолекулярные соединения, которые являются эффективными ингибиторами протеинтирозинкиназной активности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым соединениям и их
композициям. Настоящее изобретение также относится к способам
лечения глазных заболеваний, расстройств или состояния данными
соединениями или их композициями. Соединения настоящего
изобретения являются ингибиторами киназной активности, такой
как протеинтирозинкиназная активность, например,
протеинтирозинкиназная активность рецепторов фактора роста, или, например, передачи сигнала с помощью тирозинкиназы рецепторного типа.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям, имеющим структуру
и их гидратам, сольватам, фармацевтически приемлемым солям, пролекарствам и их комплексам, и рацемическим и скалемическим смесям, диастереомерам и энантиомерам.
Во втором аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим соединение согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения глазного заболевания, расстройства или состояния, причем способ включает введение нуждающемуся в лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению или терапевтически эффективного количества композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта заболевание вызвано хориоидальным ангиогенезом. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта заболевание
представляет собой возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию или отек сетчатки. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта пациент представляет собой млекопитающее, например, примата, например, человека.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения глазного заболевания, расстройства или состояния. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта глазное заболевание, расстройство или состояние вызвано хориоидальным ангиогенезом. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию или отек сетчатки.
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения согласно настоящему изобретению или его композиции для лечения глазного заболевания, расстройства или состояния. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта глазное заболевание, расстройство или состояние вызвано хориоидальным ангиогенезом. В некоторых вариантах осуществления данного аспекта заболевание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию или отек сетчатки.
Вышеуказанное просто обобщает некоторые аспекты настоящего изобретения и не предполагается как ограничивающее по характеру. Данные аспекты и другие аспекты и варианты осуществления описаны более подробно ниже.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение относится к новым соединениям и их композициям. Настоящее изобретение также относится к способам лечения глазного заболевания, расстройства или состояния данными соединениями или их композициями. Патентная и научная литература, относящаяся к настоящему изобретению, отражает уровень знания, который является доступным для специалистов в данной области техники. Выданные патенты, опубликованные патентные заявки и ссылочные материалы, на которые ссылаются в настоящем изобретении, включены в настоящее изобретение с
помощью ссылки в той же степени, как если бы для каждой было конкретно и отдельно указано, что она вводится с помощью ссылки. В случае несоответствий настоящее описание будет иметь большую силу.
Термины "ингибитор киназы" и "ингибитор киназной активности" и подобные применяют для определения соединения, которое способно взаимодействовать с киназой и ингибировать ее ферментативную активность.
Термин "ингибирование киназной ферментативной активности" и подобные применяют для обозначения снижения способности киназы переносить фосфатную группу с донорной молекулы, такой как АТФ, на конкретную молекулу, являющуюся мишенью (субстрат). Например, ингибирование киназной активности может составлять по меньшей мере приблизительно 10%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данное снижение киназной активности составляет по меньшей мере приблизительно 25%, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 50%, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 75% и, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 90%. В других вариантах осуществления киназная активность снижается по меньшей мере на 95% и, альтернативно, по меньшей мере на 99%. Величина IC50 представляет собой концентрацию ингибитора киназы, которая снижает активность киназы до 50% неингибированного фермента.
Термины "ингибитор VEGF рецепторной передачи сигнала" применяют для определения соединения, имеющего структуру, как определено в настоящем изобретении, которое способно взаимодействовать с VEGF рецептором и ингибировать активность VEGF рецептора. В некоторых вариантах осуществления данное снижение активности составляет по меньшей мере приблизительно 50%, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 75% и, альтернативно, по меньшей мере приблизительно 90%. В некоторых вариантах осуществления активность снижается по меньшей мере на 95% и, альтернативно, по меньшей мере на 99%.
Предполагается, что термин "ингибирующее эффективное количество" обозначает дозу, достаточную для того, чтобы
вызвать ингибирование киназной активности. Количество соединения настоящего изобретения, которое образует "ингибирующее эффективное количество", будет изменяться в зависимости от соединения, киназы и подобных. Ингибирующее эффективное количество может быть определено по стандартной методике специалистом в данной области техники. Киназа может находиться в клетке, которая, в свою очередь, может находиться в многоклеточном организме. Многоклеточный организм может представлять собой, например, животное, например, млекопитающее и, например, человека.
В примерном варианте осуществления данное ингибирование является специфическим, т.е. ингибитор киназы снижает способность киназы переносить фосфатную группу с молекулы донора, такой как АТФ, на конкретную молекулу-мишень (субстрат) при концентрации, которая является меньшей, чем концентрация ингибитора, которая требуется для оказания другого, несвязанного биологического эффекта. Например, концентрация ингибитора, требуемая для ингибирующей киназу активности, является по меньшей мере в 2 раза меньшей, альтернативно, по меньшей мере в 5 раз меньшей, альтернативно, по меньшей мере в 10 раз меньшей и, альтернативно, по меньшей мере в 20 раз меньшей, чем концентрация, требуемая для оказания несвязанного с ней биологического эффекта.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу ингибирования киназной ферментативной активности, включающему контакт киназы с ингибирующим эффективным количеством соединения или композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления киназа находится в организме. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу ингибирования киназной ферментативной активности в организме, включающему введение в организм ингибирующего эффективного количества соединения или композиции согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления организм представляет собой млекопитающее, например, одомашненное млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления организм представляет собой человека.
Термин "терапевтически эффективное количество", как применяют в настоящем изобретении, представляет собой количество соединения настоящего изобретения, которое при введении пациенту, вызывает требуемый терапевтический эффект. Терапевтический эффект зависит от заболевания, которое подвергается лечению, и требуемых результатов. Как таковой терапевтический эффект может представлять собой лечение заболевания. Кроме того, терапевтический эффект может представлять собой ингибирование киназной активности. Количество соединения настоящего изобретения, которое образует "терапевтически эффективное количество", будет изменяться в зависимости от соединения, заболевания и его тяжести, возраста пациента, которого подвергают лечению, и подобных. Терапевтически эффективное количество может быть определено по стандартной методике специалистом в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления "терапевтический эффект" представляет собой лечение глазного заболевания, расстройства или состояния. Предполагается, что фраза "лечение глазного заболевания, расстройства или состояния" обозначает способность соединения согласно настоящему изобретению лечить (а) заболевание, расстройство или состояние, вызванное хориоидальным ангиогенезом, включая, без ограничения, возрастную макулярную дегенерацию, или (Ь) диабетическую ретинопатию или отек сетчатки. В некоторых вариантах осуществления предполагается, что фраза "лечение глазного заболевания, расстройства или состояния" обозначает способность соединения согласно настоящему изобретению лечить экссудативное и/или воспалительное глазное заболевание, расстройство или состояние, заболевание, связанное с нарушенной проницаемостью и/или целостностью сосудов сетчатки, заболевание, связанное с разрывом микрососудов сетчатки, приводящим к кровоизлиянию, заболевание задней части глаза, заболевание сетчатки или заболевание передней части глаза, или другое глазное заболевание, расстройство или состояние.
В некоторых вариантах осуществления глазное заболевание, расстройство или состояние включает, но не ограничивается,
возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), экссудативную макулярную дегенерацию (также известную как "влажная" или неоваскулярная возрастная макулярная дегенерация (влажная AMD), отек макулы, возрастную дисковидную макулярную дегенерацию, кистоподобный отек макулы, отек век, отек сетчатки, диабетическую ретинопатию, острую макулярную нейроретинопатию, центральную серозную хориоретинопатию, хориоретинопатию, хориоидальную неоваскуляризацию, неоваскулярную макулопатию, неоваскулярную глаукому, обструктивную артериальную и венозную ретинопатию (например, закупорка вены сетчатки или закупорка артерии сетчатки), окклюзию центральной вены сетчатки, ДВС коагулопатию, окклюзию ветки вены сетчатки, гипертонические изменения глазного дна, глазной ишемический синдром, артериальная микроаневризм сетчатки, болезнь Коатса, парафовеолярную телеангиэктазию, гемиретинальную окклюзию ветвей центральной вены сетчатки, папиллофлебит, окклюзию центральной артерии сетчатки, окклюзию ветки артерии сетчатки, заболевание сонных артерий (CAD), ангиит матовой ветви, серповидно-клеточную ретинопатию и другие гемоглобинопатии, ангиоидные полосы сетчатки, отек макулы, возникающий в результате этиологии, такой как болезнь (например, диабетический макулярный отек), травмы глаза или глазной хирургии, ишемию сетчатки или дегенерацию, вызванную, например повреждением, травмой, увеитом, иритом, ангиит сетчатки, эндофтальмит, панофтальмит, метастатическую офтальмию, хориоидит, воспаления пигментного эпителия сетчатки, конъюнктивит, циклит, склерит, эписклерит, неврит зрительного нерва, ретробульбарный неврит зрительного нерва, кератит, блефарит, экссудативную отслойку сетчатки, язву роговицы, коньюнктивальную язву, хронический монетовидный кератит, кератит Тайджесона, прогрессирующую разъедающую язву роговицы, глазной воспалительное заболевание, вызванное бактериальной или вирусной инфекцией или офтальмологической операцией, глазное воспалительное заболевание, вызванное физической травмой глаза, и симптом, вызванный глазным воспалительным заболеванием, включая зуд, воспалительную гиперемию, отек и язву, эритему,
экссудативную многоформную эритему, узловатую эритему, кольцевидную эритему, отечную склеродермию, дерматит, ангионевротический отек, отек гортани, отек языка, подсвязочный ларингит, бронхит, ринит, фарингит, синусит, ларингит или отит.
В некоторых вариантах осуществления глазное заболевание, расстройство или состояние представляет собой (а) заболевание, расстройство или состояние, вызванное хориоидальным ангиогенезом, включая, без ограничений, возрастную макулярную дегенерацию, или (Ь) диабетическую ретинопатию или отек сетчатки.
В некоторых вариантах осуществления глазное заболевание, расстройство или состояние включает, но не ограничивается, возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию, отек сетчатки, окклюзию вены сетчатки, неоваскулярную глаукому, ретинопатию недоношенных, пигментную дегенерацию сетчатки, увеит, неоваскуляризацию роговицы или пролиферативную витреоретинопатию.
В некоторых вариантах осуществления глазное заболевание, расстройство или состояние представляет собой возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию или отек сетчатки.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения глазного заболевания, расстройства или состояния у животного, включающему введение нуждающемуся в лечении млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения или композиции настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления животное представляет собой млекопитающее, например, одомашненное млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления животное представляет собой человека.
В некоторых вариантах осуществления терапевтический эффект представляет собой ингибирование неоваскуляризации сетчатки. Предполагается, что фраза "ингибирование неоваскуляризации сетчатки" обозначает способность соединения согласно настоящему изобретению замедлять рост кровеносных сосудов в глазу, например, новых кровеносных сосудов, образующихся из вен
сетчатки, например, замедлять рост новых кровеносных сосудов, образующихся из вен сетчатки и прорастающих вдоль внутренней (витреальной) поверхности сетчатки.
В примерном варианте осуществления неоваскуляризация сетчатки замедляется по меньшей мере на 25% по сравнению с неоваскуляризацией сетчатки необработанных кровеносных сосудов, альтернативно, по меньшей мере на 50%, альтернативно, по меньшей мере на 75%, альтернативно, по меньшей мере на 90%, альтернативно, по меньшей мере на 95% и, альтернативно, по меньшей мере на 99%. Альтернативно, неоваскуляризация сетчатки ингибируется на 100% (т.е. кровеносные сосуды не увеличиваются в размере, и их число не увеличивается). В некоторых вариантах осуществления фраза "ингибирование неоваскуляризации сетчатки" включает возвращение к исходным величинам размера и количества кровеносных сосудов, по сравнению с необработанными кровеносными сосудами. Таким образом, соединение согласно настоящему изобретению, которое ингибирует неоваскуляризацию сетчатки, может вызывать замедление роста кровеносных сосудов, остановку роста кровеносных сосудов или вызывать регрессию роста кровеносных сосудов.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу ингибирования неоваскуляризации сетчатки у животного, включающему введение нуждающемуся в лечении животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления животное представляет собой млекопитающее, например, одомашненное млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления животное представляет собой человека.
Термин "пациент", как применяют в настоящем изобретении для целей настоящего изобретения, включает людей и других животных, например, млекопитающих. Таким образом, соединения, композиции и способы настоящего изобретения являются применимыми и для терапии человека, и для ветеринарных применений. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой млекопитающего, например, человека.
Термины "лечить", "лечение" или подобные, как применяют в
настоящем изобретении, включают лечение заболевания в организме, и включают по меньшей мере одни из: (i) предотвращения возникновения заболевания, в частности, когда данное животное предрасположено к заболеванию, но ему еще не поставлен диагноз наличия данного заболевания; (ii) ингибирования заболевания, т.е. частичной или полной остановки его развития; (iii) ослабления заболевания, т.е. вызывания регресса симптомов заболевания или облегчения симптома заболевания; и (iv) обращения или регресса заболевания, такого как устранение или излечение заболевания. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения организм представляет собой животное, например, млекопитающее, например, примата, например, человека. Как известно в данной области техники, могут быть необходимы поправки на выбор системной или локализованной доставки, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, рацион, временя введения, взаимодействие лекарственных средств, тяжесть заболевания и т.д., и они будут проверяться стандартными экспериментами специалистом в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления термины "лечить", "лечение" или подобные, как применяют в настоящем изобретении, включают лечение заболевания организма и включают по меньшей мере одно из (ii), (iii) и (iv) выше.
Примеры путей введения включают, но не ограничиваются, системную, периокулярную, ретробульбарную, внутриканальцевую, интравитреальную инъекцию, местную (например, глазные капли), субконъюнктивальную инъекцию, субтеноновую, транссклеральную, субретинальную, электропорацию, и имплантат с замедленным высвобождением. Другие пути введения, другие места введения или другие формы введения для офтальмических случаев будут известны или предусмотрены специалистом в данной области техники и предполагается, что они включены в объем настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пути введения включают местное введение, инъекцию, интравитреальную инъекцию или другие глазные пути введения, системно, или другие способы, известные специалисту в данной
области техники, пациенту после глазной хирургической операции.
В некоторых других вариантах осуществления настоящего
изобретения пути введения включают местное, интравитреальное,
транссклеральное, периокулярное, конъюнктивальное,
субтеноновое, внутрикамерное, субретинальное,
субконъюнктивальное, ретробульбарное или внутриканальцевое введение.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пути введения включают местное введение (например, глазные капли), системное введение (например, пероральное или внутривенное), субконъюнктивальное инъекцию, периокулярную инъекцию, интравитреальную инъекцию и хирургический имплантат для местной доставки.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пути введения включают интравитреальную инъекцию, периокулярную инъекцию и имплантат с замедленным высвобождением для местной доставки.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения внутриглазное введение может осуществляться в стекловидное тело (интравитреально), под конъюнктиву (субконъюнктивально), сзади глаза (ретробулярно), в склеру, под капсулу Тенона (субтеноново), или может быть в депо-форме.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения введение является локальным, включая, без ограничений, местное, интравитреальное, периорбитальное, внутриглазное и другие локальные способы введения в глаз, в глазные и/или периокулярные ткани и места, включая, без ограничений, через устройство для доставки.
Соединения настоящего изобретения образуют соли, которые включены в объем настоящего изобретения.
Термин "соль (соли)", как применяют в настоящем изобретении, обозначают кислые соли, образованные с неорганическими и/или органическими кислотами. Фармацевтически приемлемые (т.е. нетоксичные (обладающие минимальными или не обладающие нежелательными токсикологическими эффектами), физиологически приемлемые) соли являются предпочтительными,
хотя другие соли также являются приемлемыми, например, на стадии выделения или очистки, которые можно применять в процессе получения. Соли соединений настоящего изобретения можно получить, например, обработкой соединения настоящего изобретения определенным количеством кислоты, таким как эквивалентное количество, в среде, такой как среда, в которой соли выпадают, или в водной среде, с последующей лиофилизацией.
Соединения настоящего изобретения, которые содержат
основный фрагмент, амин или пиридиновое, пиразольное или
имидазольное кольцо, могут образовывать соли с рядом
органических и неорганических кислот. Примеры солей
присоединения кислоты включают ацетаты (такие как ацетаты,
образованные с уксусной кислотой или тригалогенуксусной
кислотой, например, трифторуксусной кислотой), адипаты,
альгинаты, аскорбаты, аспартаты, бензоаты, бензолсульфонаты,
бисульфаты, бораты, бутираты, цитраты, камфораты,
камфорсульфонаты, циклопентанпропионаты, диглюконаты,
додецилсульфаты, этансульфонаты, фумараты, глюкогептаноаты,
глицерофосфаты, гемисульфаты, гептаноаты, гексаноаты,
гидрохлориды, гидробромиды, гидройодиды, гидроксиэтансульфонаты
(например, 2-гидроксиэтансульфонаты), лактаты, малеаты,
метансульфонаты, нафталинсульфонаты (например, 2-
нафталинсульфонаты), никотинаты, нитраты, оксалаты, пектинаты, персульфаты, фенилпропионаты (например, 3-фенилпропионаты), фосфаты, пикраты, пивалаты, пропионаты, салицилаты, сукцинаты, сульфаты (такие как сульфаты, образованные с серной кислотой), сульфонаты, тартраты, тиоцианаты, толуолсульфонаты, такие как тозилаты, ундеканоаты и подобные.
Как применяют в настоящем изобретении, предполагается, что термин "фармацевтически приемлемые соли" обозначает соли, которые сохраняют требуемую биологическую активность вышеуказанных соединений и обладают минимальными или не обладают нежелательными токсикологическими эффектами. Примеры данных солей включают, но не ограничиваются, соли, образованные неорганическими кислотами (например, хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой,
фосфорной кислотой, азотной кислотой и подобными), и соли,
образованные с органическими кислотами, такими как уксусная
кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота,
яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота,
дигалловая кислота, пальмовая кислота, альгиновая кислота,
полиглутаминовая кислоты, нафталинсульфокислота,
нафталиндисульфокислота, метансульфокислота, п-
толуолсульфокислота и полигалактуроновая кислота. Другие соли включают фармацевтически приемлемые четвертичные соли, известные специалистам в данной области техники, которые конкретно включают четвертичные аммониевые соли формулы -NR+Z-, где R представляет собой водород, алкил или бензил, и Z представляет собой противоион, включая хлорид, бромид, йодид, -О-алкил, толуолсульфонат, метилсульфонат, сульфонат, фосфат или карбоксилат (например, бензоат, сукцинат, ацетат, гликолят, малеат, малат, цитрат, тартрат, аскорбат, бензоат, циннамат, манделат, бензилат и дифенилацетат).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения соли соединений настоящего изобретения можно получить с хиральными или рацемическими кислотами или их диастереомерами. Хиральные центры данных кислот могут иметь S- или R-конфигурацию. Рацемические формы можно разделять физическими способами, такими как, например, фракционная кристаллизация, разделение или кристаллизация диастереомерных производных или разделение хиральной колоночной хроматографией. Отдельные оптические изомеры можно получить или исходя из хиральных исходных веществ/промежуточных соединений, или из рацематов любым подходящим способом, включая, без ограничений, общепринятые способы, такие как, например, образование соли с оптически активной кислотой, с последующей кристаллизацией. Настоящее изобретение также включает все таутомерные формы соединений, описанных в настоящем изобретении.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композициям, содержащим соединение согласно настоящему изобретению. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит соединение или N
оксид, гидрат, сольват, фармацевтически приемлемую соль, комплекс или пролекарство соединения согласно настоящему изобретению, присутствующее по меньшей мере приблизительно в 30% энантиомерном или диастереомерном избытке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения соединение, N-оксид, гидрат, сольват, фармацевтически приемлемая соль, комплекс или пролекарство присутствует по меньшей мере приблизительно в 50%, по меньшей мере приблизительно в 80% или даже по меньшей мере приблизительно в 90% энантиомерном или диастереомерном избытке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения соединение, N-оксид, гидрат, сольват, фармацевтически приемлемая соль, комплекс или пролекарство присутствует по меньшей мере приблизительно в 95%, альтернативно, по меньшей мере приблизительно в 98% и, альтернативно, по меньшей мере приблизительно в 99% энантиомерном или диастереомерном избытке. В других вариантах осуществления настоящего изобретения соединение, N-оксид, гидрат, сольват, фармацевтически приемлемая соль, комплекс или пролекарство присутствует в виде практически рацемической смеси.
Настоящее изобретение также включает пролекарства
соединений настоящего изобретения. Предполагается, что термин
"пролекарство" представляет соединение, ковалентно соединенное
с носителем, где пролекарство способно высвобождать активный
ингредиент при введении пролекарства субъекту, являющемуся
млекопитающим. Высвобождение активных ингредиентов
осуществляется in vivo. Пролекарства можно получить способами,
известными специалистам в данной области техники. Данные
способы обычно модифицируют подходящие функциональные группы в
указанном соединении. Однако данные модифицированные
функциональные группы регенерируют первоначальные
функциональные группы стандартными манипуляциями или in vivo. Пролекарства соединений настоящего изобретения включают соединения, где модифицированы гидрокси, амино, карбокси или аналогичная группа. Примеры пролекарства включают, но не ограничиваются, сложные эфиры (например, ацетатные, формиатные
и бензоатные производные), карбаматы (например, N,N-диметиламинокарбонил) гидрокси- или аминофункциональных групп в соединениях настоящего изобретения, амиды (например, трифторацетиламино, ацетиламино и подобные) и подобные.
Соединения настоящего изобретения можно вводить, например,
как есть или в виде пролекарства, например, в форме in vivo
гидролизуемого эфира или in vivo гидролизуемого амида. In vivo
гидролизуемый сложный эфир соединения настоящего изобретения,
содержащий карбокси или гидроксигруппу, представляет собой,
например, фармацевтически приемлемый сложный эфир, который
гидролизуется в теле человека или животного, давая исходные
кислоту или спирт. Подходящие фармацевтически приемлемые
сложные эфиры для карбоксигруппы включают сложные Ci-
Сбалкоксиметиловые эфиры (например, метоксиметил), сложные Ci-
Сбалканоилоксиметиловые эфиры (например, пивалоилоксиметил),
сложные фталидиловые эфиры, сложные Сз-
С8Циклоалкокикарбонилокси-С1-Сбалкиловые эфиры (например, 1-
циклогексилкарбонилоксиэтил); сложные 1, З-диоксолен-2-
онилметиловые эфиры (например, 5-метил-1,З-диоксолен-2-онилметил; и сложные Ci-Сбалкокикарбонилоксиэтиловые эфиры
(например, 1-метоксикарбонилоксиэтил), и они могут
образовываться при любой подходящей карбоксигруппе в соединениях настоящего изобретения.
In vivo гидролизуемый сложный эфир соединения настоящего изобретения, содержащий гидроксигруппу, включает неорганические сложные эфиры и а-ацилоксиалкиловые эфиры и родственные соединения, которые в результате гидролиза in vivo сложного эфира, распадаются, давая исходную гидроксигруппу. Примеры а-ацилоксиалкиловых эфиров включают ацетоксиметокси и 2,2-диметилпропионилоксиметокси. Выбор группы, образующей in vivo гидролизуемый сложный эфир, включает алканоил, бензоил, фенилацетил и замещенный бензоил и фенилацетил, алкокикарбонил
(для получения сложный алкилкарбонатных эфиров),
диалкилкарбамоил и N-(N,N-диалкиламиноэтил)-N-алкилкарбамоил
(для получения карбаматов), N,N-диалкиламиноацетил и карбоксиацетил. Примеры заместителей в бензоиле включают
морфолино и пиперазино, соединенные через кольцевой атом азота через метиленовую группу с 3- или 4-положением бензоильного кольца. Подходящие варианты для in vivo гидролизуемого амида соединения настоящего изобретения, содержащего карбоксигруппу, представляют собой, например, N-Ci-Сбалкил или N,N-flM-Ci-Сбалкиламид, такой как N-метил, N-этил, N-пропил, Ы,Ы-диметил, Ы-этил-Ы-метил или N,N-диэтиламид.
После введения субъекту пролекарство подвергается химическому превращению метаболическими или химическими способами, давая соединение настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к сольватам и гидратам соединений настоящего изобретения. Термин "сольват" относится к молекулярному комплексу соединения с одной или более молекулами растворителя в стехиометрическом или нестехиометрическом отношении. Молекулярный комплекс соединения или фрагмента соединения и растворителя может быть стабилизирован нековалентными внутримолекулярными силами, силами Ван-дер-Ваальса или водородными связями. Специалистам в области органической химии ясно, что многие органические соединения могут образовывать данные комплексы с растворителями, в которых их получают или синтезируют, или в которых они осаждаются или кристаллизуются. Термин "гидрат" относится к комплексу, в котором одна или более молекул растворителя являются молекулами воды, и он включает моногидраты, гемигидраты, дигидраты, гексагидраты и подобные. Значения слов "сольват" и "гидрат" являются хорошо известными специалисту в данной области техники. Способы получения сольватов являются хорошо разработанными в данной области техники (смотрите, например, Brittain, Polymorphism in Pharmaceutical solids. Marcel Dekker, New York, 1999; Hilfiker, Polymorphism in the Pharmaceutical Industry, Wiley, Weinheim, Germany, 2006).
В некоторых вариантах осуществления данного аспекта растворитель представляет собой неорганический растворитель (например, воду). В некоторых вариантах осуществления данного аспекта растворитель представляет собой органической
растворитель (такой как, но не ограничиваясь, спирты, такие как, без ограничений, метанол, этанол, изопропанол и подобные, уксусную кислоту, кетоны, сложные эфиры и подобные). В определенных вариантах осуществления растворитель представляет собой растворитель, обычно применяемый в фармацевтической области техники, и известно, что он является безопасным для реципиента, которому вводят данный сольват (например, воду, этанол и подобные), и в предпочтительных вариантах осуществления он не препятствует биологической активности растворенного вещества. Соединения
Настоящее изобретение относится к соединениям, имеющим структуру
и их гидратам, сольватам, фармацевтически приемлемым солям, пролекарствам и комплексам, и рацемическим и
скалемическим смесям, их диастереомерам и энантиомерам.
Соединения настоящего изобретения можно обычно получить согласно следующим схемам. Таутомеры и сольваты (например, гидраты) соединений вышеуказанных формул также включены в объем настоящего изобретения. Способы сольватации обычно являются известными в данной области техники. Соответственно, соединения настоящего изобретения могут быть в свободной, гидратной или солевой форме, и их можно получить способами, приведенными на следующих схемах ниже.
Следующие примеры и способы получения описывают способы получения и применения настоящего изобретения и являются иллюстративными, а не ограничивающими. Должно быть ясно, что могут быть другие варианты осуществления, которые включены в сущность и объем настоящего изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.
Соединения называли, применяя Chemdraw Ultra (версии 10.0, 10.0.4 или версию 8.0.3), которые являются доступными через Cambridgesoft (www.Cambridgesoft.com, 100 Cambridge Park Drive, Cambridge, MA 0214 0, или выводили оттуда.
Данные, представленные в настоящем изобретении, демонстрируют ингибирующие эффекты ингибиторов киназы настоящего изобретения. Эти данные привели изобретателей к обоснованному ожиданию, что соединения настоящего изобретения являются пригодными не только для ингибирования киназной активности, протеинтирозинкиназной активности или их вариантов осуществления, таких как, VEGF рецепторная передача сигнала, но также в качестве терапевтических агентов для лечения глазных заболеваний, расстройств и состояний.
Схемы получения и экспериментальные способы
Соединения настоящего изобретения можно получить согласно реакционным схемам или примерам, показанным ниже, применяя способы, известные специалистам в данной области техники. Данные схемы служат для описания некоторых способов, которые можно применять для получения соединений настоящего изобретения. Специалисту в данной области техники ясно, что можно применять другие общие способы получения. Соединения
настоящего изобретения можно получить из исходных компонентов, которые являются имеющимися в продаже. Любой вид замены можно осуществлять относительно исходных компонентов для получения соединений настоящего изобретения согласно способам, которые являются хорошо известными специалисту в данной области техники.
Все реагенты и растворители получали из коммерческих источников и применяли в виде, в котором они были получены. 1Н-ЯМР-спектры регистрировали на устройстве Mercury Plus Varian 4 00 МГц в указанных растворителях. Масс-спектры низкого разрешения (LRMS) получали на устройстве Agilent MSD. Аналитическую ВЭЖХ проводили на устройстве Agilent 1100, применяя Zorbax 3 мкм, XDB-C8, колонку 2,1x50 мм; элюируя смесью метанол/вода, содержащей 0,1% муравьиную кислоту, с градиентом 5-95% метанол в течение 15 минут. Автоматическую колоночную хроматографию проводили на устройстве Biotage SP1 или Biotage SP4, применяя картриджи Biotage(r) SNAP, SiliaSep(tm) или SiliaFlash(r). Колоночную флэш-хроматографию проводили, применяя силикагель (SiliaFlash F60, 40-63 мкМ, размер пор 60 A, SiliCycle(r)). Препаративную колоночную хроматографию проводили на устройстве Gilson 215, применяя Phenomenex Luna 15 мкм С 18(2) 100А, колонку 250x21 мм, элюируя смесью метанол/вода, содержащей 0,05% муравьиной кислоты, с градиентом 0-95% метанола в течение 60 минут.
Конкретные примеры
Схема 1
Н Н
WO 2009/109035 А1
Пример 1
N- [3- ( (6-(7-(4-(3-циклопропилуреидо)-2-фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил)]-N-(1-этил)-N-[3-(2-метоксиэтил)]мочевина (2)
Раствор
1-циклопропил-З-(З-фтор-4-(2-(5-((2-
метоксиэтиламино)метил)пиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевины (1, 100 мг, 0,197 ммоль) и этилизоционата
(25 мкл, 0,315 ммоль) в ТГФ (5 мл) перемешивали (обработка ультразвуком в течение некоторого времени) при комнатной температуре в течение ночи. Полученную в результате смесь концентрировали и очищали Biotage (картридж SNAP 2 5 г; MeOH/DCM: 0/100-10/90 в течение 20 CV, затем 10/90 в течение 5 CV). Требуемые фракции собирали и концентрировали. Остаток соосаждался в AcOEt (со следами МеОН)/гексан, собирали фильтрацией, промывали гексаном, сушили на воздухе и сушили при высоком вакууме, получая заявленное в заголовке соединение 2
(63 мг, 0,11 ммоль, выход 5 6%) в виде белого рыхлого остатка.
ХН-ЯМР (400 МГц, ДМСО-о!6) 5 (м.д.): 8,73 (с, 1Н) , 8,52 (д, J=5,5 Гц, 1Н) , 8,48 (д, J=l,6 Гц, 1Н) , 8,31 (с, 1Н) , 8,24 (д, J=8,2 Гц, 1Н) , 7, 78-7, 69 (м, 2Н) , 7,38 (т, J=9,0 Гц, 1Н) , 7,247,17 (м, 1Н) , 6,64 (уш.д, J=5,4 Гц, 1Н) , 6, 62-6, 56 (м, 1Н) , 6,44 (т, J=5,4 Гц, 1Н) , 4,53 (с, 2Н) , 3, 44-3, 34 (м, 4Н) , 3,23 (с, ЗН) , 3,12-3,03 (м, 2Н) , 2, 59-2, 52 (м, 1Н) , 1,02 (т, J=7,l Гц, ЗН), 0,72-0,58 (м, 2Н), 0,50-0,36 (м, 2Н).
МС (m/z) : 579, 46 (М+Н) .
Схема 2
WO 2009/109035 А1
Пример 2
N- ( (6- (7-(4-(3-циклопропилуреидо)-2-фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил)-N-(2-метоксиэтил)формамид (6)
К раствору уксусного ангидрида (150 мкл, 1,17 ммоль) в муравьиной кислоте (2 мл) , перемешиваемому при комнатной температуре в течение 20 минут, добавляли одной порцией 1 (150 мг, 0, 2 96 ммоль) . Через 2 часа добавляли по каплям 2 00 мкл уксусного ангидрида (1,57 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, гасили добавлением МеОН и концентрировали. Остаток очищали Biotage
(картридж SNAP 25 г; MeOH/DCM: 0/100-10/90 в течение 20 CV, затем 10/90 в течение 5 CV), получая заявленное в заголовке соединение 6 (96 мг, 0,18 ммоль, выход 76%) в виде грязно-белого рыхлого остатка.
^-ЯМР (400 МГц, ДМСО-о!6) 5 (м.д): смесь ротамеров, 8,75
(с, 1Н), 8,60-8,50 (м, 2Н), 8,37 и 8,34 (2с, 1Н), 8,32-8,23 (м, 1Н), 8,15 (с, 1Н), 7,90-7,77 (м, 1Н), 7,73 (дд, J=13,5, 2,5 Гц, 1Н) , 7,38 (т, J=9,0 Гц, 1Н) , 7,20 (уш.д, J=10,2 Гц, 1Н) , 6,676,58 (м, 2Н) , 4,60 и 4,56 (2с, 2Н) , 3, 46-3, 36 (м, 4Н) , 3,21 и 3,19 (2с, ЗН) , 2,59-2,51 (м, 1Н) , 0, 70-0, 60 (м, 2Н) , 0,47-0,38
(м, 2Н).
МС (m/z) : 536, 4 (М+Н) .
Схема 3
F H H
¦ у v
МеОд
Ч TFA/t^M/комнатная ^NH температура
f Н Н
Пример 3
N- ( ( 6- (7-(4-(3-циклопропилуреидо)-2,3-дифторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил)-N-
[2-метоксиэтил)ацетамид [26]
Стадия
Трет-бутил
б - (7 - (4 - амино -2,3-
дифторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил(2-метоксиэтил)карбамат (23)
К перемешиваемому раствору 4-амино-2,3-дифторфенола (1,471 г, 10,14 ммоль) в ДМСО (11,5 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота добавляли трет-бутоксид калия (1,345 г, 11,98 ммоль). Через 30 минут добавляли трет-бутил (б-(7-хлортиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил(2-метоксиэтил)карбамат (22, 4,0 г, 9,22 ммоль), и полученную в результате смесь нагревали при 100°С в течение 2,5 часа, затем охлаждали до комнатной температуры. Полученную в результате смесь выливали в воду (90 мл) и перемешивали в течение 3 0 минут. Добавляли насыщенный водный раствор хлорида натрия, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Твердый остаток собирали фильтрацией, промывали водой, сушили
на воздухе и сушили при высоком вакууме. Неочищенный продукт очищали Biotage (картридж 40+М; AcOEt/гексан: 50/50 в течение 3 CV, 50/50-100% AcOEt в течение 6 CV, затем 100% AcOEt в течение 8 CV) , получая вещество, которое при растирании с диэтиловым эфиром давало заявленное в заголовке соединение 23 (1,94 г, 3,58 ммоль, выход 38%) в виде грязно-белого твердого остатка. МС (m/z): 543,3 (М+Н).
Стадия 2. Трет-бутил ( б-(7-(4-(3-циклопропилуреидо)-2, 3-дифторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил(2-метоксиэтил)карбамат (24)
К перемешиваемому раствору анилина 23 (500 мг, 0,92 ммоль) и DIPEA (0,8 мл, 4,61 ммоль) в ТГФ (18 мл) при -25°С в атмосфере азота добавляли по каплям раствор трифосгена (273 мг, 0, 920 ммоль) в ТГФ (2 мл) . Полученную в результате смесь перемешивали при -25°С и медленно добавляли циклопропиламин (0,32 мл, 4,61 ммоль). Полученную в результате смесь нагревали до комнатной температуры в течение 1,5 часа и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем полученную в результате смесь распределяли между AcOEt и водой. Органический слой последовательно промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония, 1 н. NaOH и солевым раствором, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали, получая заявленное в заголовке соединение 24 в виде грязно-белого твердого остатка. Неочищенное вещество применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.
МС (m/z) : 626, 6 (М+Н) .
Стадия 3_. 1-циклопропил-З- (2, З-дифтор-4- (2- (5- ( (2-
Раствор промежуточного соединения 24 (0,92 ммоль) и TFA (10 мл) в DCM (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Полученную в результате смесь концентрировали, разбавляли минимальным количеством МеОН и добавляли воду. рН доводили до приблизительно рН 12 4 н. NaOH. Тонкодисперсную суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут, собирали фильтрацией, промывали водой и сушили при высоком
метоксиэтиламино)метил)пиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (25)
вакууме, получая заявленное в заголовке соединение 2 5 (57 8 мг, 0,9 ммоль, выход 98%, TFA соль) в виде бледно-кремового твердого остатка.
^-ЯМР (400 МГц, ДМСО-о!6) 5 (м.д): 8,78-8,61 (м, 1Н) , 8,57 (д, J=l,6 Гц, 1Н) , 8,53 (д, J=5,5 Гц, 1Н) , 8,33 (с, 1Н) , 8,23 (д, J=8,2 Гц, 1Н), 8,02 (т, J=7,8 Гц, 1Н), 7,90 (дд, J=8,l, 2,1 Гц, 1Н), 7,28 (тд, J=9,0, 2,1 Гц, 1Н), 7,16-7,01 (м, 1Н), 6,75 (д, J=5,3 Гц, 1Н) , 3,78 (д, J=6,l Гц, 2Н) , 3,41 (т, J=5, 7 Гц, 2Н) , 3,24 (с, ЗН) , 2,65 (кв., J=6,0 Гц, 2Н) , 2,61-2,53 (м, 1Н) , 2,30-2,21 (м, 1Н), 0,72-0.58 (м, 2Н), 0,49-0,36 (м, 2Н). МС (m/z) : 526, 6 (М+Н) .
Стадия 4_. N- ( ( 6- (7- (4- (3-циклопропилуреидо) -2, 3-
Суспензию соединения 25 (100 мг, 0,156 ммоль, TFA соль) в уксусном ангидриде (1 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2 дней. Полученную в результате смесь гасили добавлением метанола и воды. Тонкодисперсную суспензию собирали фильтрацией, промывали последовательно водой, 1 н. NaOH, водой и сушили на воздухе. Неочищенный продукт очищали Biotage (картридж SNAP 25 г; MeOH/DCM: 0/100-10/90 в течение 20 CV, затем 10/90 в течение 5 CV) , получая заявленное в заголовке соединение 26 (34 мг, 0,06 ммоль, выход 38%) в виде белого твердого остатка.
^-ЯМР (400 МГц, ДМСО-о!6) 5 (м.д.): смесь ротамеров, 8,578,44 (м, ЗН) , 8,38 и 8,34 (2с, 1Н) , 8,30 и 8,24 (2д, J=8,2 Гц, 1Н) , 8,04 (уш.т, J=8,3 Гц, 1Н) , 7, 82-7, 75 (м, 1Н) , 7,32-7,25 (м, 1Н) , 6,87 (уш.д, J=2.7 Гц, 1Н) , 6, 79-6, 74 (м, 1Н) , 4,71 и 4,59 (2с, 2Н) , 3, 54-3, 40 (м, 4Н) , 3,24 и 3,21 (2с, ЗН) , 2,612,53 (м, 1Н) , 2,13 и 2,05 (2с, ЗН) , 0, 73-0, 58 (м, 2Н) , 0,500,36 (м, 2Н) .
МС (m/z): 568,6 (М+Н).
дифторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил)-N-(2-метоксиэтил)ацетамид (26)
BocHN~\
74^А температура Пример 4
1-циклопропил-З-(З-фтор-4-(2-(5-( (4- (2-гидроксиацетил)пиперазин-1-ил)метил)пиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (74)
Суспензию 1-циклопропил-З-(З-фтор-4-(2-(5-формилпиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевины (47,3 г, 5,90 ммоль, ацетатная соль), 1-Ьос-пиперазина (1,65 г, 8,85 ммоль) и уксусной кислоты (675 мкл, 11,80 ммоль) в NMP (50 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота обрабатывали ультразвуком в течение 3 часов, получая раствор, затем добавляли ЫаВН(ОАс)з (3,95 г, 17,70 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней, затем гасили добавлением воды. рН доводили до 12-13 4 н. NaOH, и суспензию перемешивали и обрабатывали ультразвуком в течение 1 часа. Твердый остаток собирали фильтрацией, промывали водой и сушили на воздухе. Остаток
Стадия 1. Трет-бутил 4-(( 6-( 7-(4-(3-циклопропилуреидо)-2-фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-Зил) метил)пиперазин-1-карбоксилат (48)
очищали дважды Biotage (картридж SNAP 50 г KP-Sil; MeOH/DCM: 1/99-10/90 в течение 20 CV) . Требуемые фракции собирали, концентрировали и осаждали с AcOEt со следами смеси метанол/гексан, получая соединение 48 (1,511 г, 2,44 ммоль, выход 41%) в виде белого рыхлого осадка.
1Я-ЯШ (400 МГц, ДМСО-о!6) 5 (м.д.): 8,71 (с, 1Н) , 8,56
(уш.д, J=2,0 Гц, 1Н) , 8,52 (д, J=5,5 Гц, 1Н) , 8,33 (с, 1Н) , 8,25 (д, J=8,2 Гц, 1Н), 7,87 (дд, J=8,l, 2,1 Гц, 1Н), 7,73 (дд, J=13,6, 2,4 Гц, 1Н) , 7,38 (т, J=9, 1 Гц, 1Н) , 7,20 (уш.дд, J=8,8, 1,2 Гц, 1Н) , 6,65 (д, J=5,3 Гц, 1Н) , 6,57 (уш.д, J=2,5 Гц, 1Н), 3,57 (с, 2Н), 4Н скрыты пиком воды, 2,59-2,51 (м, 1Н), 2, 42-2, 27 (м, 4Н) , 1,39 (с, 9Н) , 0, 72-0, 58 (м, 2Н) , 0,50-0,36
(м, 2Н).
МС (m/z) : 619, 4 (М+Н) .
Раствор 48 (1, 456 г, 2,35 ммоль) и TFA (15 мл) в DCM (50 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. TFA удаляли совместным упариванием с DCM, остаток разбавляли водой, и рН доводили до приблизительно 12-13 1 н. NaOH. Полученную в результате суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут. Твердый остаток собирали фильтрацией, промывали водой и сушили при высоком вакууме, получая соединение 49 (1,227 г, следы TFA) в виде грязно-белого рыхлого остатка.
^-ЯМР (400 МГц, ДМСО-о!6) 5 (м.д.): 8,76 (уш.с, 1Н) , 8,54 (д, J=l,4 Гц, 1Н) , 8,52 (д, J=5,5 Гц, 1Н) , 8,32 (с, 1Н) , 8,24 (д, J=8,2 Гц, 1Н) , 7,85 (дд, J=8,l, 2,1 Гц, 1Н) , 7,73 (дд, J=13,5, 2,3 Гц, 1Н), 7,38 (т, J=9,1 Гц, 1Н), 7,20 (уш.д, J=10,2 Гц, 1Н) , 6,64 (д, J=5,5 Гц, 1Н) , 6,62 (уш.с, 1Н) , 3, 58-3, 48 (м, 2Н) , 2, 73-2, 64 (м, 4Н) , 2, 59-2, 52 (м, 1Н) , 2, 38-2, 25 (м, 4Н) , 0,69-0,62 (м, 2Н), 0,46-0,40 (м, 2Н), один NH отсутствует. МС (m/z): 519,6 (М+Н).
Стадия 2. 1-циклопропил-З-(З-фтор-4-(2-(5-(пиперазин-1-илметил)пиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (49)
Стадия 3_. 1-циклопропил-З- (З-фтор-4- (2- (5- ( (4- (2-
гидроксиацетил)пиперазин-1-ил)метил)пиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (74)
К перемешиваемому раствору соединения 49 (122 мг, 0,235 ммоль, схема 15), гликолевой кислоты (36 мг, 0,4 7 ммоль) и DIPEA (123 мкл, 0,71 ммоль) в ДМФА (4 мл) в атмосфере азота добавляли реагент HATU (224 мг, 0,59 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем полученную в результате смесь гасили добавлением воды и 1 н. NaOH, перемешивали в течение 2 часов и экстрагировали DCM. Объединенный органический экстракт сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали дважды Biotage (картридж SNAP 2 5 г; 2% гидроксида аммония в MeOH/DCM: 0/100-10/90 в течение 20 CV; затем картридж SiliaFlash 40 г, 2% гидроксида аммония в MeOH/DCM: 0/100-10/90 в течение 20 CV, затем 10/90-15/85 в течение 20 CV), получая вещество, которое при растирании с МеОН давало заявленное в заголовке соединение 74 (53 мг, 0,09 ммоль, выход 39%) в виде белого твердого остатка.
^-ЯМР (400 МГц, ДМСО-о!6) 5 (м.д.): 8, 77-8, 69 (м, 1Н) , 8,57 (d, J=l,6 Гц, 1Н) , 8,52 (д, J=5,5 Гц, 1Н) , 8,34 (с, 1Н) , 8,26 (д, J=8,0 Гц, 1Н) , 7,88 (дд, J=8,l, 2,1 Гц, 1Н) , 7,73 (дд, J=13,5, 2,3 Гц, 1Н) , 7,38 (т, J=9,1 Гц, 1Н) , 7,20 (уш.д, J=9,2 Гц, 1Н) , 6,65 (д, J=4,9 Гц, 1Н) , 6, 63-6, 56 (м, 1Н) , 4,55 (т, J=5,5 Гц, 1Н) , 4,07 (д, J=5,5 Гц, 2Н) , 3,60 (с, 2Н) , 3,53-3,43 (м, 2Н) , 2Н скрыты, 2,59-2,51 (м, 1Н) , 2, 45-2, 33 (м, 4Н) , 0,720,58 (м, 2Н) , 0, 50-0, 36 (м, 2Н) .
МС (m/z): 577,5 (М+Н).
Пример 5
К перемешиваемому раствору 74 (117 мг, 0,20 ммоль), Boc-L-валина (132 мг, 0,61 ммоль) и DMAP (25 мг, 0,2 0 ммоль) в безводном ДМФА (4 мл) в атмосфере азота добавляли реагент DCC
Стадия 1. (S)-2-(4-((6-(7-(4-(3-циклопропилуреидо)-2-фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-Зил) метил)пиперазин-1-ил)-2-оксоэтил 2- (трет-бутоксикарбониламино)-3-метилбутаноат (74-А)
(251 мг, 1,22 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 4 часов. Полученную в результате смесь распределяли между AcOEt и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. После разделения органический слой последовательно промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида аммония и солевым раствором, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали Biotage (картридж Snap 25 г; MeOH/DCM: 1/9910/90 в течение 20 CV, затем 10/90 в течение 5 CV) , получая требуемый продукт 74-А (151 мг, 0,195 ммоль, выход 96%) в виде бесцветно-белой липкой пены. МС (m/z) : 776, 7 (М+Н) .
фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-З-
ил) метил) пиперазин-1-ил) -2-оксоэтил 2-амино-З-метилбутаноат
(80)
Суспензию сложного Вос-валинового эфира 74-А (151 мг, 0,195 ммоль) и раствора НС1 (0,49 мл, 1,95 ммоль, 4М в 1,4-диоксане) в безводном DCM (10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часа. Полученную в результате смесь концентрировали и разбавляли насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Водный раствор экстрагировали DCM, содержащим следы метанола. Объединенный органический слой сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали Biotage (картридж Silia Flash 12 г; 2% гидроксида аммония в MeOH/DCM: 1/99-15/85 в течение 20 CV, затем 15/85-20/80 в течение 10 CV) , получая требуемый продукт 80 (80 мг, 0,118 ммоль, выход 60%) в виде грязно-белого липкого остатка.
^-ЯМР (400 МГц, ДМСО-о!6) 5 (м.д.): смесь ротамеров, 8,73 (с, 1Н) , 8,58 (уш.д, J=l,4 Гц, 1Н) , 8,52 (д, J=5,3 Гц, 1Н) , 8,34 (с, 1Н) , 8,26 (дд, J=8,l, 0,7 Гц, 1Н) , 7,88 (дд, J=8,2, 2,2 Гц, 1Н) , 7,73 (дд, J=13,6, 2,4 Гц, 1Н) , 7,38 (т, J=9,0 Гц, 1Н) , 7,20 (дд, J=9,0, 1,4 Гц, 1Н) , 6,65 (дд, J=5,3, 0,8 Гц, 1Н) , 6,59 (уш.д, J=2,5 Гц, 1Н) , 4,84 (д, J=14,7 Гц, 1Н) , 4,77
Стадия 2_. (S) -2 - (4 - ( (6- (7 - (4 - (3-циклопропилуреидо) -2-
(д, J=14,9 Гц, 1Н), 3,63-3,58 (м, 2Н), 3,50-3,37 (м, 4Н), 3,20 (d, J=5,l Гц, 1Н), 2,59-2,51 (м, 1Н), 2,47-2,33 (м, 4Н), 2,001,60 (м, ЗН) , 0,92 (д, J=6,8 Гц, ЗН) , 0,86 (д, J=6, 8 Гц, ЗН) , 0, 72-0, 58 (м, 2Н) , 0, 50-0, 36 (м, 2Н) .
МС (m/z): 577, 6 и 676, 7 (М+Н).
Схема 5
FxxN0!
MeS
Пример 6
1-циклопропил-З-(З-фтор-4-(2-(5-((2-(метилсульфонил)этиламино)метил)пиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенилмочевина (10 0)
Стадия 1_. N- ( ( 6- (7 - (2-фтор-4-нитрофенокси) тиено [3,2-
К суспензии соединения 94 (300 мг, 0,759 ммоль) в дихлорметане (20 мл) добавляли 2-(метилтио)этиламин (141 мкл, 1,518 ммоль) и уксусную кислоту (87 мкл). После перемешивания в течение 2 0 минут при комнатной температуре, добавляли триацетоксиборгидрид натрия (4 82 мг, 2,27 6 ммоль). Полученную в
Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил)-2-(метилтио)этанамин (95)
результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Затем полученную в результате смесь разбавляли DCM, промывали 1 н. NaOH, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали Biotage (Snap 50 г; MeOH/DCM: 0/100-20/80 в течение 2 0 CV), получая заявленное в заголовке соединение 95 (357 мг, количественный выход). МС (m/z) : 471,5 (М+Н) .
Стадия 2. Трет-бутил ( 6-(7-(2-фтор-4-нитрофенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил(2-(метилтио)этил)карбамат (96)
Смесь 95 (357 мг, 0, 759 ммоль), Вос-ангидрида (414 мг, 1,8 97 ммоль), DMAP (93 мг, 0,7 59 ммоль) и триэтиламина (106 мкл, 0,61 ммоль) в DCM (20 мл) перемешивали в течение выходных при комнатной температуре. Затем полученную в результате смесь концентрировали, разбавляли этилацетатом и последовательно промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида аммония, сушили над безводном сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали Biotage (картридж SNAP 100 г; MeOH/DCM: 0/1002 0/80 в течение 20 CV) , получая заявленное в заголовке соединение 96 (220 мг, 0,386 ммоль, выход 50%).
МС (m/z): 571,6 (М+Н).
К раствору 96 (220 мг, 0,386 ммоль) в МеОН (29 мл) и воде (10 мл) добавляли Охопе(tm) (48 6 мг, 0,7 90 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали в течение ночи, концентрировали, обрабатывали раствором 1 н. NaHS03, и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Органический экстракт промывали водой, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенный 97 (232 мг, 0,385 ммоль) применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.
МС (m/z): 603,6 (М+Н).
Стадия 3. Трет-бутил (6-(7-(2-фтор-4-нитрофенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил(2-(метилсульфонил)этил)карбамат (97)
Стадия 4_. Трет-бутил (6- (7 - (4-амино-2-
фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил(2-(метилсульфонил)этил)карбамат (98)
К раствору 97 (232 мг, 0, 385 ммоль) в МеОН (17,5 мл) и воде (1,75 мл) добавляли хлорид аммония (62 мг, 1,16 ммоль) и порошок железа (215 мг, 3,85 ммоль). Полученную в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов, затем при комнатной температуре. Суспензию фильтровали через целит(tm), промывали МеОН, и фильтрат концентрировали. Остаток очищали Biotage (картридж SNAP 25 г; MeOH/DCM: 0/100-20/80 в течение 2 0 CV) , получая заявленное в заголовке соединение 98 (241 мг, количественный выход).
МС (m/z): 573,7 (М+Н).
Стадия 5. Трет-бутил (6-(7-(4-(3-циклопропилуреидо)-2-фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)пиридин-3-ил)метил(2-(метилсульфонил)этил)карбамат (99)
К раствору 98 (115 мг, 0,20 ммоль) в ТГФ (20 мл) при -25°С добавляли DIPEA (140 мкл, 0,80 ммоль) с последующим добавлением трифосгена (59,6 мг, 0,20 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали при -25°С в течение 1 часа, затем добавляли циклопропиламин (71 мкл, 1,00 ммоль), и полученную в результате смесь нагревали до комнатной температуры. После перемешивания в течение ночи, полученную в результате смесь гасили добавлением метанола, концентрировали и распределяли между EtOAc и насыщенным водным раствором хлорида аммония. Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали Biotage (Snap 2 5 г; MeOH/DCM: 0/100-20/80 в течение 20 CV) , получая заявленное в заголовке соединение 99 (120 мг, 0,18 ммоль, выход 91%).
МС (m/z) : 656, 6 (М+Н) .
Стадия б_. 1-циклопропил-З- (З-фтор-4- (2- (5- ( (2-
К раствору 99 (120 мг, 0,18 ммоль) в DCM (20 мл) добавляли TFA (5,6 мл) . Полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, концентрировали,
(метилсульфонил)этиламино)метил)пиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (10 0)
разбавляли этилацетатом, промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали Biotage (картридж SNAP 25 г; MeOH/DCM: 0/100-20/80 в течение 20 CV), получая заявленное в заголовке соединение 100 (90 мг, 0,13 ммоль, выход 72%, TFA соль) в виде грязно-белого твердого остатка.
гЕ-ЯМ.Р (400 МГц, ДМСО-о!6) 5 (м.д.): 8,74 (с, 1Н) , 8,60 (с, 1Н) , 8,52 (д, J=5,2 Гц, 1Н) , 8,34 (с, 1Н) , 8,26 (д, J=8,4 Гц, 1Н) , 7,91 (д, J=8,0 Гц, 1Н) , 7,73 (дд, J=13,6, 2,4 Гц, 1Н) , 7,38 (т, J=8,8 Гц, 1Н) , 7,20 (д, J=10,0 Гц, 1Н) , 6,64 (д, J=5,2 Гц, 1Н) , 6,61 (с, 1Н) , 3,84 (с, 2Н) , 3, 35-3, 25 (м, 2Н) , 3,05
(с, ЗН) , 3, 02-2, 90 (м, 2Н) , 2,59-2,50 2Н), 0,46-0,40 (м, 2Н).
МС (m/z) : 556, 5 (М+Н) .
Схема 6
(м, 1Н) , 0, 69-0, 62 (м,
N-^OH
-N-\^OBoc [> -tjH2 H N^OBoc
отО°Сдо55°С
149 1 50 1 51: Пример 7
Пример 7
1-циклопропил-З-(З-фтор-4-(2-(1-(2-((2-гидроксиэтил)(метил)амино)этил)-1Н-пиразол-4-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (151)
К суспензии 144 (3,57 г, 8,57 ммоль) в DME (50 мл) и воде
Стадия 1: 2-(1-( (1,З-диоксолан-2-ил)метил)-1Н-пиразол-4-ил)-7-(2-фтор-4-нитрофенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин (145)
(5 мл) добавляли 1-( (1,З-диоксолан-2-ил)метил)-4-(4,4, 5, 5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)-1Н-пиразол (2 г, 7,14 ммоль), CsF (3,25 г, 21,42 ммоль), ЫаНСОз (1,7 99 г, 3 6 ммоль) и Pd(PPh3)4 (0,825 г, 0,714 ммоль), и полученную в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли EtOAc и промывали водой. Органическую фазу собирали, сушили над безводным ЫагЭ04, фильтровали и концентрировали. Полученный в результате твердый остаток растирали с Et20, получая заявленное в заголовке соединение 145 (3 г, выход 95%) в виде бежевого твердого остатка.
МС (m/z)=443,51 (М+Н).
Стадия 2_| 2- (4- (7- (2-фтор-4-нитрофенокси) тиено [3, 2-
Ь]пиридин-2-ил)-1Н-пиразол-1-ил)ацетальдегид (14 6)
К раствору 145 (900 мг, 2,034 ммоль) в ТГФ (20 мл) добавляли ЗМ НС1 (30 мл), и полученную в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 4 часов. Смесь охлаждали до комнатной температуры и концентрировали. Оставшийся водный раствор обрабатывали твердым бикарбонатом натрия, и затем экстрагировали DCM. Органическую фазу собирали, сушили над безводным ЫагЭ04, фильтровали и концентрировали. Неочищенный альдегид 14 6 (810 мг, выход 10 0%) применяли yf следующей стадии без дополнительной очистки.
МС (m/z)=399,3 (М+Н).
К раствору 146 (810 мг, 2,033 ммоль) в DCM (40 мл) добавляли НОАс (0,233 мл, 4,07 ммоль) и 2-(метиламино)этанол (305 мг, 4,07 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение часа. Добавляли триацетоксиборгидрид натрия (1,293 г, 6,10 ммоль), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Затем смесь разбавляли насыщенным раствором ЫаНСОз, затем добавляли твердый ЫаНСОз для нейтрализации кислоты. Слой DCM собирали, сушили над безводным ЫагЭ04, фильтровали и концентрировали, получая заявленное в заголовке соединение 147
Стадия 3: 2-( (2-(4-(7-(2-фтор-4-нитрофенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)-1Н-пиразол-1-ил)этил(метил)амино)этанол (147)
(930 мг, выход 100%), которое применяли непосредственно yf следующей стадии без дополнительной очистки. МС (m/z)=458,50 (М+Н).
Стадия 4j Трет-бутил 2- ( (2- (4- (7- (2-фтор-4-
нитрофенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)-1Н-пиразол-1-ил)этил)(метил)амино)этилкарбонат (148)
К раствору 147 (930 мг, 2,033 ммоль) в DCM (40 мл) добавляли Вос20 (1, 331 г, 6,10 ммоль) и DMAP (49,7 мг, 0,407 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Полученную в результате смесь концентрировали и очищали колоночной хроматографией (элюент EtOAc - 20% МеОН в EtOAc), получая заявленное в заголовке соединение 148 (420 мг, выход 37%) в виде коричневого масла.
МС (m/z)=558, 49 (М+Н) .
Стадия 5: 2-( (2-(4-(7-(4-амино-2-фторфенокси)тиено[3, 2-
Ь]пиридин-2-ил)-1Н-пиразол-1-ил)этил(метил)амино)этил трет-
бутилкарбонат (14 9)
К раствору 148 (420 мг, 0, 753 ммоль) в МеОН (20 мл) добавляли хлорид аммония (81 мг, 1,50 6 ммоль) в воде (5 мл) и порошок цинка (197 мг, 3,01 ммоль), и полученную в результате смесь кипятили с обратным холодильником в течение 3 часов. Смесь охлаждали до комнатной температуры, затем фильтровали, и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток растворяли в DCM и промывали водой. Органическую фазу собирали, сушили над безводным ЫагЭ04, фильтровали и концентрировали, получая заявленное в заголовке соединение 149 (397 мг, выход 100%), которое применяли непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.
МС (m/z)=528,49 (М+Н).
К перемешиваемому раствору 14 9 (0,3 97 мг, 0,7 52 ммоль) и пиридина (0,183 мл, 2, 2 57 ммоль) в ДМФА (20 мл) при 0°С в атмосфере азота добавляли фенилхлорформиат (295 мг, 1,881
Стадия 6: Трет-бутил 2-((2-(4-(7-(4-(3-циклопропилуреидо)-2-фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)-1Н-пиразол-1-ил)этил)(метил)амино)этилкарбонат (150)
ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали при 0°С в течение 2 часов. Добавляли циклопропиламин (215 мг, 3,7 6 ммоль), и полученную в результате смесь нагревали при 55°С в течение 5 часов. Полученную в результате смесь распределяли между EtOAc и насыщенным раствором бикарбоната натрия, затем промывали насыщенным раствором хлорида аммония и солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (EtOAc - 30% МеОН в EtOAc), получая заявленное в заголовке соединение 150 (150 мг, 33% выход) в виде белого твердого остатка.
МС (m/z)=611,70 (М+Н).
Стадия 7j 1-циклопропил-З- (З-фтор-4- (2- (1- (2- ( (2-
К раствору 150 (150 мг, 0,246 ммоль) в DCM (10 мл) добавляли НС1 в диоксане (0,307 мл, 1,118 ммоль), и белый осадок перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Смесь разбавляли насыщенным ЫаНСОз раствором и перемешивали в течение 10 минут перед разделением слоев. Органическую фазу собирали, сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией (элюент EtOAc - 30% МеОН в EtOAc), получая заявленное в заголовке соединение 151 (100 мг, выход 80%) в виде белого твердого остатка.
гЕ-ЯМ.Р (400 МГц, ДМСО-de) 5 (м.д.): 8,43 (д, J=5,48 Гц, 1Н) , 7,84 (с, 1Н) , 7,77 (с, 1Н) , 7,63 (м, 1Н) , 7,47 (с, 1Н) , 7,17 (м, 2Н) , 7,03 (с, 1Н) , 6,45 (д, J=5,48 Гц, 1Н) , 4,92 (с, 1Н), 4,27 (т, J=6,26 Гц, 2Н), 3,56 (т, J=5,08 Гц, 2Н), 2,95 (т, J=6,26 Гц, 2Н) , 2,60 (м, ЗН) , 2,34 (с, ЗН) , 0,91 (м, 2Н) , 0,72 (м, 2Н).
МС (m/z)=51 1,60 (М+Н).
гидроксиэтил)(метил)амино)этил)-1Н-пиразол-4-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (151)
N- ( (2- (7-(4-(З-циклопропилуреидо-2-фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)-1-метил-1Н-имидазол-5-ил)метил)-2-гидрокси-Ы-(2-метоксиэтил)ацетамид (209)
Стадия lj 2- ( ( (2- (7- (2-фтор-4-нитрофенокси) тиено [3, 2-
Ь]пиридин-2-ил)-1-метил-1Н-имидазол-5-ил)метил)(2-метоксиэтил)амино)-2-оксоэтилацетат (206)
К раствору 158 (423 мг, 0, 925 ммоль) в ДМФА (18 мл) добавляли 2-ацетоксиуксусную кислоту (164 мг, 1,387 ммоль), DIPEA (0, 565 мл, 3,24 ммоль) и реагент HATU (1055 мг, 2,77 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, с последующим добавлением насыщенного раствора ЫаНСОз (200 мл) и EtOAc (300 мл). Образовывался белый осадок, который собирали фильтрацией и выбрасывали. Органический слой фильтрата собирали, сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали для получения желтоватого твердого остатка, который растирали с эфиром, получая заявленное в заголовке соединение 206 (570 мг, выход 111%, неочищенный) , которое применяли на следующей стадии без дополнительной очистки.
МС: 558 (МН)+.
Стадия 2_| 2- ( ( (2- (7- (4-амино-2-фторфенокси) тиено [3, 2-
Полученную в результате смесь, состоящую из 206 (300 мг,
Ь]пиридин-2-ил)-1-метил-1Н-имидазол-5-ил)метил)(2-метоксиэтил)амино)-2-оксоэтилацетат (207)
0,53 8 ммоль), хлорида аммония (24,75 мг, 0,463 ммоль) и порошка железа (255 мг, 4,57 ммоль), в смеси этанол (6 мл)/вода (3,0 мл) кипятили с обратным холодильником в течение 1 часа. Полученную в результате смесь фильтровали горячей и концентрировали. Остаток очищали Biotage (MeOH/DCM, 0-2 0%, картридж SNAP 2 5 г) , получая заявленное в заголовке соединение
207 (133 мг, 0, 252 ммоль, выход 47%) в виде белого твердого остатка.
МС: 528 (МН)+.
Стадия 3j 2- ( ( (2- (7- (4- (3-циклопропилуреидо) -2-
фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)-1-метил-1Н-имидазол-5-ил)метил)(2-метоксиэтил)амино)-2-оксоэтилацетат (208)
К раствору 207 (130 мг, 0,246 ммоль) в ТГФ (20 мл) при 0°С добавляли DIPEA (0,172 мл, 0,986 ммоль) и трифосген (43,9 мг, 0,148 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°С перед добавлением циклопропиламина (70,3 мг, 1,232 ммоль). Полученную в результате смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа перед концентрированием. Остаток очищали Biotage (MeOH/DCM, 0-20%, картридж SNAP 2 5 г) , получая заявленное в заголовке соединение
208 (104 мг, 0,170 ммоль, выход 69%) в виде белого твердого остатка.
МС: 611 (МН)+.
Стадия 4j N- ( (2- (7- (4- (3-циклопропилуреидо) -2-
К раствору 208 (104 мг, 0,170 ммоль) в ТГФ (18 мл) добавляли раствор LiOH (32,6 мг, 1,362 ммоль) в воде (6 мл), и смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре перед концентрированием. Остаток очищали Biotage (MeOH/DCM, 020%, картридж SNAP 25 г), получая заявленное в заголовке соединение 209 (40 мг, 0,070 ммоль, выход 41%) в виде белого твердого остатка.
гЕ-ЯМ.Р (400 МГц, ДМСО-de) 5 (м.д.): 8,75 (с, 1Н) , 8,55 (д, 1Н, J=5,3 Гц), 7,94 (с, 1Н) , 7,75 (дд, 1Н, Ji=2,3 Гц, J2=13,5 Гц), 7,41 (т, 1Н, J=9,0 Гц), 7, 24-7, 22 (м, 1Н) , 7,09 (с, 1Н) ,
фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)-1-метил-1Н-имидазол-5-ил)метил)-2-rnflpoKcn-N-(2-метоксиэтил)ацетамид (209)
6,70 (д, 1Н, J-5,5 Гц), 6,60 (м, 1Н) , 4,74 (с, 2Н) , 4,68-4,66 (м, 1Н) , 4,24 (д, 2Н, J=5,7 Гц), 3,87 (с, ЗН) , 3,45 (м, 2Н) , 3,35 (с, ЗН) , 3,28 (м, 2Н) , 2, 60-2, 57 (м, 1Н) , 0,71-0,67 (м, 2Н), 0,48-0,45 (м, 2Н). МС: 569, 6 (МН)+.
192: Пример 9
Пример 9
1-((2-(7-(4-изопропиламинокарбониламино-2-фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)-1-метил-1Н-имидазол-5-ил)метил)-З-изопропил-1-(2-метоксиэтил)мочевина (192)
Соединение 192 получали, следуя методикам, аналогичным методикам, применяемым в схеме 7 для получения соединения 2 09, с заменой 2-ацетоксиуксусной кислоты в присутствии DIPEA и реагента HATU трифосгеном, с последующим добавлением изопропиламина на стадии 1, и циклопропиламина изопропиламином на стадии 3.
^-ЯМР (400 МГц, flMCO-d6) 5 (м.д.): 8,67 (с, 1Н) , 8,49 (д, J=5,5 Гц, 1Н) , 7,89 (с, 1Н) , 7,68 (дд, Ji=2,6 Гц, J2=13,5 Гц, 1Н) , 7,34 (т, J=9,0 Гц, 1Н) , 7,12-7,09 (м, 1Н) , 6,94 (с, 1Н) , 6,64 (д, J=5,5 Гц, 1Н) , 6,14-6,09 (м, 2Н) , 4,55 (с, 2Н) , 3,83 (с, ЗН) , 3, 80-3, 74 (м, 2Н) , 3, 38-3, 27 (м, 4Н) , 3,21 (с, ЗН) , 2,06-1,04 (м, 12Н).
МС (m/z)=598,6 (М+Н).
Пример 1О
1-циклопропил-З-(З-фтор-4-(2-(5-(4-(4-метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-карбонил)пиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (234)
Стадия lj б- (7- (4- (3-циклопропилуреидо) -2-
фторфенокси)тиено[3,2-Ь]пиридин-2-ил)никотиновая кислота (225)
К суспензии альдегида 4 7 (2 00 мг, 0, 44 6 ммоль) в ДМФА (10 мл) добавляли Охопе(r) (330 мг, 0,535 ммоль) при комнатной температуре, и полученную в результате смесь перемешивали при 50°С в течение 16 часов. Полученную в результате смесь охлаждали до 0°С, обрабатывали водным 1 н. НС1 (20 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение дополнительного часа. Полученный в результате осадок собирали фильтрацией, промывали водой (30 мл) и сушили. Неочищенный продукт растирали с МеОН, получая заявленное в заголовке соединение 225 (165 мг, выход 80%) в виде бежевого твердого остатка.
Чт-ЯМР (400 МГц, CD3OD) 5 (м.д.): 9,66 (уш.с, 1Н) , 8,98 (дд, J=l,9, 0,9 Гц, 1Н) , 8,51 (д, J=5,5 Гц, 1Н) , 8,31 (с, 1Н) , 8,22 (дд, J=8,l, 1,9 Гц, 1Н) , 8,17 (дд, J=8,l, 0,9 Гц, 1Н) , 7,77 (дд, J=13,7, 2,5 Гц, 1Н) , 7,45 (уш.с, 1Н) , 7,37 (т, J=9, 1Гц, 1Н) , 7,26 (дд, J=8,9, 1,5 Гц, 1Н) , 6,62 (д, J=5,3, 0,8 Гц,
1Н) , 2, 60-2, 52 (м, 1H) , 0, 69-0, 56 (м, 2H) , 0, 50-0, 37 (м, 2Н) . [Карбоксильный ОН не замечен]. МС: 465, 3 (МН)+.
Стадия 2_| 1-циклопропил-З- (З-фтор-4- (2- (5- (4- (4-
метилпиперазин-1-ил)пиперидин-1-карбонил)пиридин-2-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (2 34)
К перемешиваемому раствору кислоты 225 (300 мг, 0,646 ммоль) в ДМФА (10 мл) при 0°С добавляли НОВТ (198 мг, 1,2 92 ммоль), EDC (24 8 мг, 1,2 92 ммоль) и 1-метил-4-(пиперидин-4-ил)пиперазин (118 мг, 0,646 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, разбавляли насыщенным раствором ЫаНСОз и экстрагировали EtOAc. Экстракт сушили над безводным Na2S04 и концентрировали в вакууме. Остаток очищали три раза Biotage (MeOH/EtOAc, 0-50%, колонка 25 г) , с последующей очисткой на Gilson [МеОН/Н20, 5095%, НСООН (0,05%)], получая заявленное в заголовке соединение 234 (50 мг, 0,079 ммоль, выход 12,29%) в виде моноформиатной соли.
гЕ-ЯМ.Р (400 МГц, CD3OD) 5 (м.д.): 8,67 (дд, Ji=0,8 Гц, J2=2,l Гц, 1Н, ) , 8,48 (с, 1Н) , 8,47 (с, 1Н) , 8,19 (дд, Ji=0,8 Гц, J2=8,3 Гц, 1Н) , 8,16 (с, 1Н) , 7,97 (дд, Ji=2,2 Гц, J2=8,2 Гц, 1Н) , 7,65 (дд, Ji=2,4 Гц, J2=13,l Гц, 1Н) , 7,29 (т, 1Н, J=8,8 Гц, Н) , 7,20-7,18 (м, 1Н) , 6,65 (дд, Ji=0,8 Гц, J2=5,5 Гц, 1Н) , 3,83 (уш.с, 1Н) , 3,24 (уш.с, 1Н) , 3,01 (уш.с, 6Н) , 2,85 (уш.с, ЗН), 2,76-2,70 (м, 2Н), 2,67 (с, ЗН), 2,61-2,57 (м, 1Н), 2,02 (уш.с, 1Н) , 1,91-1,85 (уш.с, 1Н) , 1, 56-1, 49 (уш.с, 2Н) , 0, 78-0, 74 (м, 2Н) , 0,55-0,51 (м, 2Н) .
МС: 630, 4 (МН)+.
Схема 9
к2со3/дмсо, 1 ю°с ЕЮ-
пиридин, 0°С
2) Н2
Н Н
0xj о r
AcOH/NaBH(OAc)3
NMP ( N
Пример 11
1-циклопропил-З-(З-фтор-4-(2-(1-(2-морфолиноэтил)-1Н-имидазол-4-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (265)
Стадия 1. 1-(2,2-диэтоксиэтил)-4-йод-1Н-имидазол (260)
К перемешиваемому раствору 4-йодимидазола (10 г, 51,6 ммоль) и бромацетальдегиддиэтилацеталя (9,31 мл) в ДМСО (30 мл) добавляли К2СО3 (10,69 г, 77 ммоль). Полученную в результате смесь нагревали при 110°С в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры, полученную в результате смесь разбавляли водой и экстрагировали AcOEt. Органический экстракт промывали солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали Biotage (картридж SNAP 80 г; AcOEt/гексан: 0/100-50/50 в течение 20 CV). Требуемые фракции собирали и концентрировали, получая заявленное в заголовке соединение 260 (11,29 г, 36,4 ммоль, выход 71%) в виде желтого масла.
МС (m/z): 310,97 (М+Н).
Стадия 2. 7-хлор-2-(1-(2,2-диэтоксиэтил)-1Н-имидазол-4-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин (261)
К перемешиваемому раствору 7-хлортиено[3,2-Ь]пиридина (9,26 г, 54,6 ммоль) в ТГФ (88 мл) при -15°С добавляли H-BuLi (21,84 мл, 54,6 ммоль). Через 30 минут добавляли раствор ZnCl2 0,5М в ТГФ (109 мл, 54,6 ммоль) при -15°С, и полученную в результате смесь нагревали до комнатной температуры в течение 4 5 минут. Добавляли раствор тетракистрифенилфосфина палладия (0,841 г, 0,73 ммоль) и йодида 260 (1 1,29 г, 36,4 ммоль) в ТГФ (33 мл), и смесь кипятили с обратным холодильником в течение 3 часов, затем концентрировали. Остаток разбавляли водой и гидроксидом аммония и экстрагировали DCM. Органический экстракт промывали солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали Biotage (картридж SNAP 80 г; AcOEt/гексан: 0/100-100/0 в течение 20 CV) , получая вещество, которое при растирании с МТВЕ давало заявленное в заголовке соединение 261 (1,2 г, 3,41 ммоль, выход 9%) в виде светло-коричневого твердого остатка. МС (m/z): 437,45 (М+Н).
Стадия 3_. 4- (2 - (1- (2, 2-диэтоксиэтил) -1Н-имидазол-4-
ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)-3-фторанилин (262)
К перемешиваемому раствору гидрохлорида 4-амино-2-фторфенола (1,39 г, 8,53 ммоль) в ДМСО (20 мл) добавляли трет-ВиОК (1,99 г, 17,7 6 ммоль) . Через 30 минут добавляли хлорид 2 61 (2,5 г, 7,1 1 ммоль), и полученную в результате смесь нагревали при 100°С в течение 1 часа.
В отдельной колбе раствор гидрохлорида 4-амино-2-фторфенола (1,39 г, 8,53 ммоль) в ДМСО (20 мл) обрабатывали трет-ВиОК (1,99 г, 17,7 6 ммоль), и полученный в результате фенолятный раствор добавляли к ранее полученной реакционной смеси при 100°С. Через 3 0 минут смесь выливали в воду (30 0 мл) для получения осадка, который собирали фильтрацией, сушили при высоком вакууме, получая заявленное в заголовке соединение 2 62 (2,86 г, 6,46 ммоль, выход 91%) в виде светло-коричневого твердого остатка.
МС (m/z): 443,44 (М+Н).
Стадия 4. 1-циклопропил-З-(4-(2-(1-(2,2-диэтоксиэтил)-1Н-имидазол-4-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)-3-фторфенил)мочевина (263)
К перемешиваемому раствору амина 2 62 (2,86 г, 6,46 ммоль) и пиридина (1,04 мл, 12,93 ммоль) в ДМФА (50 мл) при 0°С добавляли фенилхлорформиат (97 3 мкл, 7,7 6 ммоль). Через 3 0 минут добавляли циклопропиламин (1,14 мл, 16,16 ммоль) при 0°С, и полученную в результате смесь нагревали при 60°С в течение 45 минут. Добавляли дополнительное количество циклопропиламина (1 мл, 14,18 ммоль), и полученную в результате смесь нагревали при 60°С в течение дополнительных 10 минут. После охлаждения до комнатной температуры, полученную в результате смесь гасили добавлением воды, получая осадок. Твердый остаток собирали фильтрацией, промывали водой и сушили в вакууме в течение 2 часов. Остаток очищали Biotage (картридж SNAP 8 0 г; MeOH/DCM: 0/100-10/90 в течение 20 CV). Требуемые фракции собирали, концентрировали, растирали с МТВЕ, сушили при высоком вакууме, получая заявленное в заголовке соединение 263 (2,95 г, 5,61 ммоль, выход 87%) в виде розового твердого остатка.
МС (m/z) : 526, 60 (М+Н) .
Стадия 5. 1-циклопропил-З-(З-фтор-4-(2-(1-(2-ОКСОЭТИЛ-1Н-имидазол-4-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (264)
К раствору ацеталя 263 (2,95 г, 5,61 ммоль) в АсОН/НгО (2 0/2 0 мл) добавляли концентрированную НС1 (2 мл), и полученную в результате смесь нагревали при 90°С в течение 1 часа. Полученную в результате смесь концентрировали, разбавляли водой и 4М NaOH до рН 10, получая осадок, который собирали фильтрацией, промывали водой, сушили в вакууме. Затем вещество очищали Biotage (картридж SNAP 100 г; 2% гидроксида аммония в MeOH/DCM: 0/100-15/85 в течение 20 CV), получая заявленное в заголовке соединение 2 64 (1,2 г, 2,66 ммоль, выход 47%) в виде коричневого твердого остатка.
МС (m/z): 484,51 (М+Н).
Стадия б_. 1-циклопропил-З- (З-фтор-4- (2- (1- (2-
морфолиноэтил)-1Н-имидазол-4-ил)тиено[3,2-Ь]пиридин-7-илокси)фенил)мочевина (265)
К раствору 2 64 (2 00 мг, 0,443 ммоль), морфолина (46 мкл, 0, 532 ммоль) и АсОН (51 мкл, 0, 88 6 ммоль) в NMP (10 мл) добавляли триацетоксиборгидрид натрия (282 мг, 1,329 ммоль), и полученную в результате смесь перемешивали в течение 18 часов при комнатной температуре. Полученную в результате смесь гасили водой и экстрагировали DCM. Органический экстракт последовательно промывали насыщенным раствором хлорида аммония и солевым раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали Biotage (картридж SNAP 4 0 г; 2% гидроксида аммония в MeOH/DCM: 0/10 015/85 в течение 20 CV) и Gilson (Phenomenex, Luna 15 мкм, С18(2) 100А, 250x50,0 мм, 15 мкм; 0,05% муравьиной кислоты в МеОН/вода: 20/80-95/5 в течение 60 минут, скорость потока: 30 мл/мин), получая заявленное в заголовке соединение 265 (30 мг, 0,057 ммоль, выход 13%, формиатная соль) в виде белого твердого остатка.
гЕ-ЯМ.Р (400 МГц, ДМСО-de) 5 (м.д.): 9,52 (уш.с, 1Н) , 8,41 (д, J=5,6 Гц, 1Н) , 8,36 (уш.с, 1Н) , 7,92 (д, J=l,2 Гц, 1Н) ,
7,78 (д, J=l,2 Гц, 1Н) , 7,71 (дд, J=2,4 и 14,0 Гц, 1Н) , 7,65 (с, 1Н) , 7,33 (т, J=9,2 Гц, 1Н) , 7,32 (уш.с, 1Н) , 7,22 (дд,
J=l,6 и 8,8 Гц, 1Н) , 6,54 (д, J=5,6 Гц, 1Н) , 4,14 (т, J=6, 0 Гц,
2Н) , 3,57 (т, J=4,4 Гц, 4Н) , 2,66 (т, J=6,4 Гц, 2Н) , 2,58-2,51 (м, 1Н) , 2, 49-2, 40 (м, 4Н) , 0, 64-0, 59 (м, 2Н) , 0, 43-0, 39 (м,
2Н) .
МС (m/z): 523,55 (М+Н). Фармацевтические композиции
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель. Композиции настоящего изобретения можно составлять любым способом, хорошо известным в данной области техники, и можно получить для введения различными путями, включая местное, интравитреальное,
периорбитальное, внутриглазное и другие способы локального введения в глаз, глазные и/или окологлазные ткани и места, включая через устройства для доставки. В некоторых вариантах осуществления введение может осуществляться пероральным путем.
Характеристики носителя, вспомогательного вещества или разбавителя будут зависеть от пути введения. Как применяют в настоящем изобретении, термин "фармацевтически приемлемый" обозначает нетоксичный материал, который является совместимым с биологической системой, такой как клетка, клеточная культура, ткань или организм, и не будет препятствовать эффективности биологической активности активного ингредиента (ингредиентов) . Таким образом, композиции согласно настоящему изобретению могут содержать, в добавление к ингибиторам, разбавители, наполнители, соли, буферы, стабилизаторы, солюбилизаторы и другие вещества, хорошо известные в данной области техники. Получение фармацевтически приемлемых составов описывают, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990.
Активное соединение включено в фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества, не вызывая серьезных токсических эффектов у подвергаемого лечению пациента. Диапазон эффективных доз фармацевтически приемлемого производного можно рассчитать на основе веса исходного соединения, которое будут доставлять. Если производное само обладает активностью, эффективную дозу можно оценить как указано выше, применяя вес производного, или другими способами, известными специалистам в данной области техники.
ПРИМЕРЫ АНАЛИЗОВ
Ингибирование VEGF активности
Следующий протокол применяли для анализа соединений настоящего изобретения.
Пример анализа 1
In vitro анализ рецепторной тирозинкиназы (VEGF
Данный анализ измеряет активность соединений по ингибированию ферментативной активности рекомбинантного человеческого VEGF рецептора.
1,6-т.н. кДНК, соответствующую каталитическому домену VEGFR2 (KDR) (Genbank номер доступа AF035121 аминокислоты 8061356), клонировали в Pst I области вектора pDEST20 Gateway
(Invitrogen) для получения GST-маркированной версии данного фермента. Данный конструкт применяют для получения рекомбинантного бакуловируса, применяя систему Bac-to-BacTM согласно инструкции производителя (Invitrogen).
Белок GST-VEGFR2806-1356 экспрессировали в клетках Sf9
(Spodoptera frugiperda) после заражения рекомбинантным бакуловирусным конструктом. Вкратце, клетки Sf9, выращенные в суспензии и хранимые в бессывороточной среде (Sf900 II, снабженной гентамицином) при плотности клеток приблизительно 2х106 клетки/мл, заражали вышеприведенными вирусами при множественности заражения (MOI) 0,1 в течение 72 часов при 27°С при перемешивании при 12 0 об/мин на ротационном шейкере. Зараженные клетки собирали центрифугированием при 3 98хд в течение 15 минут. Дебрис замораживали при -8 0°С до проведения очистки.
Все стадии, описанные в выделении и очистки клеток, проводили при 4°С. Замороженный Sf9 дебрис, зараженный GST-VEGFR2 8 0 6-135 6 рекомбинантным бакуловирусом, размораживали и аккуратно суспендировали в буфере A (PBS рН 7,3, снабженный 1 мкг/мл пепстатином, 2 мкг/мл апротинином и леупептином, 50 мкг/мл PMSF, 50 мкг/мл TLC и 10 мкМ Е64 и 0,5 мМ DTT), применяя 3 мл буфера на грамм клеток. Суспензию Dounce гомогенизировали, и 1% Triton Х-100 добавляли к гомогенату после того, как его центрифугировали при 22500хд, 30 минут, 4°С. Супернатант (экстракт клеток) применяют в качестве исходного материала для очистки GST-VEGFR2806-1356.
Супернатант помещают на GST-агарозную колонку (Sigma),
рецепторный KDR)
уравновешенную PBS рН 7,3. После промывки четырьмя объемами колонки (CV) PBS рН 7,3+1% Triton Х-100 и 4 CV промывками буфером В (50 мМ Tris рН 8,0, 20% глицерин и 100 мМ NaCl), связанный белок ступенчато элюировали 5 CV буфера В, снабженного 5 мМ DTT и 15 мМ глютатиона. GST-VEGFR2806-1356 обогащенные фракции данной стадии хроматографии объединяли на основе УФ следов, т.е. фракции с большой O.D.280. Конечные концентрации препаратов белка GST-VEGFR2806-1356 составляли приблизительно 0,7 мг/мл с чистотой приблизительно 70%. Исходные растворы очищенного GST-VEGFR2806-1356 белка делили на аликвоты и замораживали при -8 0°С перед применением в ферментативном анализе.
Ингибирование VEGFR/KDR измеряли в DELFIATM анализе (Perkin Elmer). Субстрат поли(Glu4,Туг) иммобилизовали на черных полистирольных 9б-луночных планшетах с высоким связыванием. Планшеты с покрытием промывали и хранили при 4°С. В процессе анализа, фермент предварительно выдерживали с ингибитором и Mg-АТФ на льду в полипропиленовых 9б-луночных планшетах в течение 4 минут, и затем переносили в планшеты с покрытием. Последующие киназные реакции протекали при 3 0°С в течение 10-30 минут. АТФ концентрации в анализе составляли 0,6 мкМ для VEGFR/KDR (2> <Кт) . Концентрация фермента составляла 5 нМ. После выдерживания киназные реакции прекращали ЭДТА, и планшеты промывали. Фосфорилированный продукт обнаруживали выдерживанием с меченным европием анти-фосфотирозин МоАЬ. После промывки планшетов, связанный МоАЬ обнаруживали флуоресценцией с временным разрешением в Gemini SpectraMax ридере (Molecular Devices). Соединения оценивали в диапазоне концентраций, и определяли IC50 величины (концентрация соединений, дающая 50% ингибирование ферментативной активности). Результаты показаны в таблице 1. В таблице, "а" показывает IC50 величину, меньшую чем 50 нМ; "Ь" показывает IC50 величину, больше или равную 50, но меньше 100 нМ, "с" показывает IC50 величину, больше или равную 100, но меньше 250 нМ; и "d" показывает IC50 величину, больше или равную 250 нМ.
Пример анализа 2
VEGF-зависимое Erk фосфорилирование
Клетки и фактор роста: HUVEC клетки приобретали у Cambrex Bio Science Walkersville, Inc и выращивали согласно vendor инструкции. Кодирующую последовательность полной длины VEGFi65 клонировали, применяя Gateway Cloning Technology (Invitrogen) для бакуловирусной экспрессии Sf9 клеток. VEGFi65 очищали от кондиционированной среды, применяя NaCl градиентное элюирование из HiTrap гепариновой колонки (GE Healthcare Life Sciences), с последующим имидазольным градиентным элюированием из HiTrap хелатирующей колонки (GE Healthcare Life Sciences), затем буфер хранили в PBS, снабженном 0,1% BSA и фильтровали через фильтр.
Клеточные анализы: Клетки высевали при 8 000 клеток/лунка в
9б-луночном планшете и выращивали в течение 4 8 часов. Затем
клетки выращивали в течение ночи в сыворотке и среде, не
содержащей фактор роста, и обрабатывали в течение 1,5 часа
разбавленными растворами соединений. После 15-минутного
выдерживания в среде, VEGF165 (150 нг/мл) клетки лизировали в
охлажденном на льде буфере для лизиса (50 мМ HEPES, рН 7,4, 150
мМ NaCl, 1,5 мМ МдС12, 1% Triton Х-100, 10% глицерин),
содержащем 1 мМ гидрохлорида 4 - (2-
аминоэтил)бензолсульфонилфторида, 200 мкМ орто-ванадата натрия,
1 мМ фторида натрия, 10 мкг/ил леупептина, 10 мкг/мл апротинина, 1 мкг/мл пепстатина и 50 мкг/мл гидрохлорида Na-n-тозил-Ъ-лизинхлорметилкетона и подвергали вестерн-блоттингу для определения анти-фосфо ERK 1/2 (T202/Y204) (Cell Signaling Technologies).
Вестерн-блоттинг: Образцы лизатов из лунок с одной обработкой выделяли на 5-2 0% SDS-PAGE геле и проводили имунноблоттинг, применяя Immobilon поливинилидендифторидные мембраны (Amersham) согласно инструкции производителя. Блоты промывали в Tris-забуференном соляном растворе с 0,1% Tween 20 детергентом (TBST) и исследовали на антитела против фосфо-Thr202/Tyr204-ERK (Cell signaling technologies). Обнаружение хемилюминесценции (Amersham, ECL plus) проводили согласно инструкции производителя, применяя Storm денсиометр (GE Healthcare; 8 00 РМТ, 100 нМ разрешение) для получения изображений и измерения оптической плотности. Величины для диапазона разбавлений применяют для получения IC50 кривых, применяя 4-параметрическую аппроксимирующую модель. Данные кривые рассчитывают, применяя GraFit 5.0 программное обеспечение.
Пример анализа 3
In vivo модель хориоидальной неоваскуляризации (CNV)
Данный анализ измеряет способность соединений ингибировать CNV развитие. CNV является основной причиной тяжелой потери зрения у пациентов, страдающих от возрастной макулярной дегенерации (AMD).
Мужских особей серых крыс (Japan Clea Co., Ltd.) применяли в данных исследованиях.
Крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией
пентобарбитала, и правый зрачок расширяли 0,5% тропикамидом и 0,5% гидрохлоридом фенилефрина. Правый глаз получал б лазерных лучей между сосудами сетчатки, применяя систему доставки с щелевой лампой Green laser Photocoagulator (Nidex Inc., Japan), и предметное стекло микроскопа с Healon(tm) (АМО Inc) применяли в качестве контактных линз. Мощность лазера составляла 100 или 200 мВт в течение 0,1 секунды, и диаметр светового пятна был
равен 100 мкм. В момент попадания луча лазера наблюдали образование пузырька, который является индикатором разрыва мембраны Бруха, который является важным для достижения CNV.
Крыс разделяли на группы на основе их веса тела, применяя SAS программное обеспечение (SAS institute Japan, R8.1) после лазерного облучения (день 0) . После анестезирования животных и расширения правого зрачка (как приводится выше), правый глаз животного обрабатывали соединением или средой инъекцией (10 мкл/глаз) при дозах 10 или 3 нмоль/глаз на 3 день. Соединения растворяли или суспендировали в CBS, PBS или других подходящих средах перед инъекцией.
На 10 день животных анестезировали эфиром, и высокомолекулярный флуоресцеинизотиоцианат (FITC)-декстран (SIGMA, 2х106 MW) вводили через хвостовую вену (20 мг/крыса). Приблизительно через 30 минут после FITC-декстран инъекции, животных умерщвляли эфиром или диоксидом углерода, и глаза удаляли и фиксировали 10% формалиновым нейтральным буферным раствором. После 1 часовой фиксации, RPE-хороид-склера плоские препараты получали удалением роговицы, хрусталика и сетчатки глаза из глазных яблок. Плоские препараты устанавливали в 50% глицерине на предметном стекле, и часть, облученную лазером, фотографировали, применяя флуоресцентный микроскоп (Nikon Corporation, фильтр возбуждения: 4 65-4 95 нм, фильтр поглощения: 515-555 нм). CNV площади получали измерением площади гиперфлуоресценции, полученной на фотографии, применяя Scion изображение.
Среднюю CNV площадь б ожогов применяли в качестве индивидуальной величины CNV площади, и среднюю CNV площадь группы, обработанной соединением, сравнивали с площадью группы, обработанной средой. Результаты с некоторыми соединениями настоящего изобретения показаны в таблице 2 и показаны как % ингибирования CNV развития ("А" показывает большее чем или равное 60% ингибирование, и "В" показывает большее чем или равное 40% - меньше 60% ингибирование).
Пример анализа 4
Проницаемость сосудов сетчатки, вызванная VEGF, у кроликов МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Данный анализ измеряет способность соединений ингибировать проницаемость сосудов сетчатки, вызванную VEGF. Проницаемость сосудов является причиной тяжелой потери зрения у пациентов, страдающих от возрастной макулярной дегенерации (AMD). Женские особи голландских кроликов (приблизительно 2 кг; Kitayama LABES CO., LTD, Nagano, Japan) анестезировали пентобарбиталом и местно 0,4% гидрохлоридом оксибупрокаина. Испытуемые образцы или среду инъецировали в стекловидную полость после расширения зрачков глазными каплями 0,5% тропикамида. Рекомбинантный человеческий VEGF165 (500 нг; Sigma-Aldrich Co., St Louis, МО) инъецировали интравитреально за 4 8 часов до измерения концентрации флуоресцеина в стекловидном теле. Кроликов анестезировали пентобарбиталом, и затем инъецировали им флуоресцеин натрия (2 мг/кг) через ушную вену. Зрачки расширяли глазными каплями 0,5% тропикамида, и концентрации флуоресцеина в глазах измеряли, применяя FM-2 fluorotron Master (Ocumetrics, Mountain View, CA) через 30 минут после инъекции флуоресцеина. Концентрации флуоресцеина в стекловидном теле получали в опорных точках, которые находятся на расстоянии 0,25 мм от заднего конца вдоль оптической оси. Концентрацию флуоресцеина в
стекловидном теле считали утечкой флуоресцеина из сосудистой системы сетчатки. Средние пики флуоресценции групп, обработанных испытуемыми образцами, сравнивали со средними пиками флуоресценции группы, обработанной средой. Соединение 2 6 и 74 показали значительное ингибирование утечки флуоресцениа по сравнению с группой, обработанной средой.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение, выбранное из группы, состоящей из
Н Н
ГУ yv
1 он
?ПГ>
и его гидраты, сольваты, фармацевтически приемлемые соли, пролекарства и комплексы, а также рацемические и скалемические смеси, диастереомеры и энантиомеры.
2. Соединение по п.1, которое представляет собой
3. Соединение по п.1, которое представляет собой
4. Соединение по п.1, которое представляет собой
XrVv
7. Соединение по п.1, которое представляет собой
9. Соединение по п.1, которое представляет собой
10. Соединение по п.1, которое представляет собой
О ^NH N
8. Соединение по п.1, которое представляет собой
12. Соединение по п.1, которое представляет собой
rxYv
13. Композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый носитель.
14. Способ лечения глазного заболевания, состояния или расстройства, включающий введение нуждающемуся в лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения по любому из пп.1-12 или его композиции, где глазное заболевание, расстройство или состояние выбрано из группы, состоящей из (а) заболевания, расстройства или состояния, вызванного хориоидальным ангиогенезом, (Ь) диабетической ретинопатии и (с) отека сетчатки.
15. Способ по п.14, где глазное заболевание, расстройство или состояние представляет собой возрастную макулярную дегенерацию.
По доверенности
(19)
(19)
(19)
5. Соединение по п.1, которое представляет собой
5. Соединение по п.1, которое представляет собой
5. Соединение по п.1, которое представляет собой
5. Соединение по п.1, которое представляет собой
5. Соединение по п.1, которое представляет собой
5. Соединение по п.1, которое представляет собой
11. Соединение по п.1, которое представляет собой
11. Соединение по п.1, которое представляет собой