[**]

Настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения производного хлорофилла, не содержащего фитол, в образце, включающий стадию обнаружения флуоресцентного сигнала, связанного с производным хлорофилла, не содержащим фитол, где флуоресцентный сигнал, связанный с хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, в образце гасится. Способ можно применять для количественного определения активности хлорофиллов и родственных ферментов в образце без фракционирования растворителем субстрата и продукта.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения производного хлорофилла, не содержащего фитол, в образце, включающий стадию обнаружения флуоресцентного сигнала, связанного с производным хлорофилла, не содержащим фитол, где флуоресцентный сигнал, связанный с хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, в образце гасится. Способ можно применять для количественного определения активности хлорофиллов и родственных ферментов в образце без фракционирования растворителем субстрата и продукта.

---

Евразийское (21) 201291015 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C12Q1/44 (2006.01)
2013.09.30
(22) Дата подачи заявки 2011.04.06
(54) АНАЛИЗ НА ПРОИЗВОДНЫЕ ХЛОРОФИЛЛА, НЕ СОДЕРЖАЩИЕ ФИТОЛ
(31) 10159327.5
(32) 2010.04.08
(33) EP
(86) PCT/IB2011/051474
(87) WO 2011/125028 2011.10.13
(71) Заявитель:
ДЮПОН НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АПС (DK)
(72) Изобретатель:
Миккельсен Рене, Йергенсен Тина, Сеэ Йерн Борх (DK)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения производного хлорофилла, не содержащего фитол, в образце, включающий стадию обнаружения флуоресцентного сигнала, связанного с производным хлорофилла, не содержащим фитол, где флуоресцентный сигнал, связанный с хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, в образце гасится. Способ можно применять для количественного определения активности хлорофиллов и родственных ферментов в образце без фракционирования растворителем субстрата и продукта.
2420-189002ЕА/032 АНАЛИЗ НА ПРОИЗВОДНЫЕ ХЛОРОФИЛЛА, НЕ СОДЕРЖАЩИЕ ФИТОЛ
ОБЛАСТЬ
Настоящее изобретение относится к способу обнаружения производных хлорофилла в образце. Способ является пригодным в анализе определения активности хлорофиллазы или родственных ферментов в образце.
ПРЕДПОСЫЛКИ
Хлорофилл представляет собой пигмент зеленого цвета, широко распространенный повсеместно в царстве растений. Хлорофилл необходим для фотосинтеза и является одним из наиболее часто встречающихся металлорганических соединений, обнаруженных на земле. Таким образом, многие продукты, полученные из растений, включая пищевые продукты и корма, содержат значительные количества хлорофилла.
Считается, что в растениях хлорофиллаза (chlase) участвует в разрушении хлорофилла и катализирует гидролиз сложноэфирной связи в хлорофилле с получением хлорофиллида и фитола. Хлорофилл может альтернативно разрушаться посредством удаления иона магния из порфиринового (хлоринового) кольца с образованием производного, известного как феофитин (см. фиг. 5) . В определенных условиях некоторые хлорофиллазы также способны гидролизовать феофитин с получением феофорбида и фитола. Феофорбид можно также получать посредством удаления иона магния из хлорофиллида, т.е. после гидролиза хлорофилла (см. фиг. 5).
Феофитин может далее разрушаться до пирофеофитина. Одним из возможных механизмов является ферментативный гидролиз связи сложного метилового эфира изоциклического кольца феофитина с последующим неферментативным превращением нестабильного промежуточного продукта в пирофеофитин. 2 8-2 9 кДа фермент из Chenopodium album, названный феофорбидаза, по имеющимся сведениям способен катализировать аналогичную реакцию на феофорбиде с получением производного пирофеофитина, не содержащего фитол, известного как пирофеофорбид (см. фиг. 5) .
Пирофеофитин могут также гидролизовать определенные ферменты с образованием пирофеофорбида и фитола.
Были разработаны различные анализы, чтобы определять хлорофиллазную активность в образце (см., например Khamessan et al. (1994), Journal of Chemical Technology & Biotechnology, Vol. 60 (1), pages 73-81). Наиболее широко применяемый способ определения хлорофиллазной активности описывают Klein и Vishniac в J. Biol. Chem. 1961 236: 2544-2547. Этот способ включает определение ферментной активности в водной буферной системе, содержащей ацетон. Ацетон добавляют для обеспечения растворимости субстрата (хлорофилла). После прохождения ферментативной реакции остаточный субстрат экстрагируют в гексане. Продукт реакции - хлорофиллид является более гидрофильным, чем хлорофилл из-за потери фитольной цепи. Таким образом, хлорофиллид остается в фазе вода/ацетон, и его можно определить количественно с помощью измерения на спектрофотометре. Хотя были описаны различные модификации этого способа, все опубликованные способы включают стадию фракционирования продуктов реакции гексаном. Эта стадия необходима, потому что сложно провести различие между хлорофиллом и хлорофиллидом с использованием спектроскопических методик. После экстракции гексаном субстрат и продукт реакции находятся в разных фазах, и поэтому для определения ферментной активности можно использовать измерение того и другого.
Однако фракционирование гексаном является неудобным, трудоемким и не очень хорошо подходит для применения в способе скрининга высокой производительности (HTS) хлорофиллазной активности. О попытке преодоления проблем с экстракцией гексаном в HTS хлорофиллазы сообщают Arkus и соавт. в Analytical Biochemistry 353 (2006) 93-98. Вместо использования в качестве субстрата хлорофилла в этом анализе используется сложный эфир п-нитрофенила, как искусственный субстрат в HTS хлорофиллазы. К сожалению, этот способ не очень надежен, потому что некоторые хлорофиллазы обладают довольно низкой активностью в отношении сложного эфира п-нитрофенила, несмотря на то, что обладают высокой активностью в отношении хлорофилла, что может
давать ложный отрицательный результат. Более того, микробные хлорофиллазы часто экспрессируются вместе с другими эстеразами, которые могут действовать в отношении сложного эфира п-нитрофенила, но не хлорофилла, таким образом, давая ложные положительные результаты.
Таким образом, все еще существует необходимость в усовершенствованном анализе хлорофиллазы и родственных ферментов. В частности, существует необходимость в способе, который обходится без недостатков экстракции растворителем и является надежным, точным и подходящим для скрининга высокой производительности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ обнаружения производного хлорофилла, не содержащего фитол, в образце, включающий стадию обнаружения флуоресцентного сигнала, связанного с производным хлорофилла, не содержащим фитол, где флуоресцентный сигнал, связанный с хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, в образце гасится.
В одном варианте осуществления флуоресцентный сигнал,
связанный с хлорофиллом или фитолсодержащим производным
хлорофилла, гасится посредством димеризации хлорофилла или
фитолсодержащего производного хлорофилла. Предпочтительно при
условиях, применяемых на стадии обнаружения, хлорофилл или
фитолсодержащее производное хлорофилла димеризуется
преимущественно по сравнению с производным хлорофилла, не содержащим фитол.
В одном варианте осуществления производное хлорофилла, не содержащее фитол, содержит хлорофиллид, феофорбид или пирофеофорбид. В одном варианте осуществления хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла содержит хлорофилл, феофитин или пирофеофитин.
Стадию обнаружения можно осуществлять в растворе для обнаружения, содержащем поверхностно-активное вещество, спирт и щелочь. Предпочтительно спирт содержит изопропанол, более предпочтительно от 12 до 2 0% масс, спирта.
В одном варианте осуществления поверхностно-активное
вещество присутствует от 0,01 до 0,03% масс, от общего веса раствора для обнаружения и предпочтительно содержит 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоль.
В одном варианте осуществления стадию обнаружения осуществляют при 20-25°С и предпочтительно при рН больше 10,0. Флуоресцентный сигнал может обнаруживаться при, например, приблизительно 67 0 нм.
В одном варианте осуществления хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла присутствует в виде водного раствора димеров и/или других неколлоидных мультимеров.
В одном варианте осуществления стадию обнаружения осуществляют в отсутствие липосом.
В одном варианте осуществления поверхностно-активное
вещество содержит 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-
полиэтиленгликоль, спирт содержит изопропанол, и щелочь содержит гидроксид натрия.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ анализа для количественного определения ферментной активности в образце, где фермент способен гидролизовать хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла, причем способ анализа включает: а) контактирование образца и хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла; и Ь) обнаружение выработки производного хлорофилла, не содержащего фитол, способом, описываемым выше.
В одном варианте осуществления стадия (а) включает инкубацию образца и хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла в реакционном растворе, содержащем поверхностно-активное вещество, ацетон и/или буфер. Предпочтительно после стадии (а) и перед стадией (Ь) активность фермента ограничивают путем добавления реакционного раствора к раствору для обнаружения, определяемому выше.
В одном варианте осуществления фермент активен во время стадии (а) и фермент неактивен во время стадии (Ь).
В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор для количественного определения ферментной
активности в образце, где фермент способен гидролизовать хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла, причем набор содержит: а) реакционный раствор, в котором фермент активен; Ь) субстрат, включающий хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла; и с) раствор для обнаружения, в котором субстрат димеризуется преимущественно по сравнению с производным хлорофилла, не содержащим фитол, вырабатываемым ферментом.
В одном варианте осуществления реакционный раствор содержит поверхностно-активное вещество, ацетон и буфер. Предпочтительно субстрат содержит хлорофилл, феофитин или пирофеофитин. Раствором для обнаружения может быть раствор для обнаружения, описываемый выше. Предпочтительно фермент в растворе для обнаружения неактивен.
В одном варианте осуществления набор дополнительно содержит один или несколько стандартных растворов, причем каждый содержит известную концентрацию производного хлорофилла, не содержащего фитол.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1 показано образование димера из двух молекул феофитина. Димеризация происходит через порфириновое (хлориновое) кольцо и приводит к гашению флуоресценции при 67 0 нм.
На фиг. 2 показана стандартная (калибровочная) кривая относительной флуоресценции (ОЕФ) в зависимости от концентрации пирофеофорбида (мкМ).
На фиг. 3 показана стандартная (калибровочная) кривая относительной флуоресценции (ОЕФ) в зависимости от концентрации феофорбида (мкМ).
На фиг. 4 показан гидролиз феофитина, приводящий к выработке феофорбида и фитола, катализируемый феофитиназой.
На фиг. 5 показаны реакции с участием хлорофилла и производных, и ферментные активности, которые можно обнаруживать с использованием настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу
обнаружения производного хлорофилла, не содержащего фитол, в образце. При гашении флуоресцентного сигнала, производимого хлорофиллом или фитолсодержащим производными хлорофилла, в образце можно непосредственно обнаруживать производное хлорофилла, не содержащее фитол. Способ может быть количественным, т.е. способ можно применять для определения уровня или концентрации производного хлорофилла, не содержащего фитол, в образце. Способ, следовательно, особенно пригоден для определения активности хлорофиллазы или родственных ферментов в образце, поскольку он дает возможность отличать продукт от субстрата без физического разделения (т.е. без необходимости экстракции гексаном или другого фракционирования растворителем субстрата и продукта).
Хлорофилл и производные хлорофилла
Под "фитолсодержащим производным хлорофилла" обычно подразумевают соединения, которые содержат как порфириновое (хлориновое) кольцо, так и фитольную группу (хвост), в том числе не содержащие магния фитолсодержащие производные, такие как феофитин и пирофеофитин. Хлорофилл и фитолсодержащие производные хлорофилла обычно зеленоватого цвета, вследствие присутствия в молекуле порфиринового (хлоринового) кольца. Предпочтительно хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла представляет собой хлорофилл, феофитин или пирофеофитин, более предпочтительно феофитин или пирофеофитин. Хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла обычно применяется в качестве субстрата в способе анализа, описываемом в настоящем документе.
Под "производным хлорофилла, не содержащим фитол" обычно
подразумевают продукт ферментативного гидролиза
фитолсодержащего производного хлорофилла. Хлорофиллаза или родственные ферменты могут гидролизовать хлорофилл и фитолсодержащие производные хлорофилла для отщепления фитольного хвоста от хлоринового кольца. Эти соединения еще содержат несущее цвет порфириновое кольцо, причем хлорофиллид имеет зеленый, а феофорбид и пирофеофорбид красновато-коричневый цвет. Предпочтительно производное хлорофилла, не
содержащее фитол, представляет собой хлорофиллид, феофорбид или
пирофеофорбид, более предпочтительно феофорбид или
пирофеофорбид. Производное хлорофилла, не содержащее фитол, является обычно продуктом реакции в способе анализа, описываемом в настоящем документе.
Хлорофилл или производное хлорофилла могут находиться, например, в а, b или d формах. Таким образом, используемое в настоящем документе выражение "хлорофилл" содержит хлорофилл а, хлорофилл b и хлорофилл d. Подобным образом формы a, b и d охватываются, когда указывается феофитин, пирофеофитин, хлорофиллид, феофорбид и пирофеофорбид.
Способ обнаружения, описываемый в настоящем документе, обычно дает возможность различению хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла от соответствующего ему производного хлорофилла, не содержащего фитол. Например, способ может позволять отличать друг от друга субстрат и продукт реакции с хлорофиллазой или родственным ферментом. В особых вариантах осуществления парами субстрат/продукт (фитолсодержащий/не содержащий фитол) могут быть (а) хлорофилл и хлорофиллид; (Ь) феофитин и феофорбид; или (с) пирофеофитин и пирофеофорбид.
Образец
Настоящий способ можно применять для обнаружения производного хлорофилла, не содержащего фитол, присутствующего в образце. Образец может, например, включать препарат растительного происхождения, препарат на основе водорослей и препарат бактериального происхождения, полученный из любого типа растений, водорослей или бактерий (например, цианобактерий). В одном варианте осуществления образец содержит растительный материал, растительное масло или растительный экстракт. Например, образец может включать растительное масло, такое как масло из овощей, в том числе масла, переработанные из масличных семян или масличных плодов (например, масла из семян, такие как канола (рапсовое) масло, и масла из плодов, такие как пальмовое).
Описываемый в настоящем документе в некоторых вариантах
осуществления способ применяют для анализа ферментной активности (например, хлорофиллазы, феофитиназы и/или пирофеофитиназы) в образце. В таких вариантах осуществления образец может включать любой препарат, который предположительно содержит соответствующую ферментную активность. Образец может, например, включать растительный, водорослевый или бактериальный препарат или экстракт, или может включать очищенный или рекомбинантный белок, который необходимо протестировать на активность хлорофиллазы или родственного фермента. В этих вариантах осуществления производные хлорофилла, не содержащие фитол, могут отсутствовать в образце до стадии контактирования способа анализа, т.е. производные, не содержащие фитол, могут образовываться после добавления подходящего субстрата для фермента.
Обнаружение флуоресцентного сигнала
В вариантах осуществления настоящего изобретения обнаруживают флуоресцентный сигнал, связанный с производным хлорофилла, не содержащим фитол. Например, флуоресцентный сигнал, производимый или излучаемый производным, не содержащим фитол, можно обнаружить, измерить или определить количественно, предпочтительно в отсутствие флуоресцентного сигнала, производимого хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла.
Способы обнаружения флуоресцентных сигналов хорошо известны в настоящем уровне техники. Например, флуоресцентный сигнал, производимый производным хлорофилла, не содержащим фитол, можно обнаружить с помощью любого подходящего детектора, например, флуоресцентного спектрофотометра, флуоресцентного планшет-ридера или спектрофлуориметра. Детектор обычно содержит источник света, который вырабатывает свет при соответствующей длине волны для активации флуоресцентного материала, а также оптическую систему для направления источника света через окно обнаружения на материал, содержащийся в канале или камере. В качестве источников возбуждения можно применять различные источники света, в том числе лазеры, фотодиоды и ксеноновые или ртутные лампы. Свет можно пропускать через фильтр (например,
дифракционную решетку) или монохроматор для того, чтобы выбрать фиксированную длину волны перед пропусканием через образец. Излучаемый свет может пропускаться через фильтр или монохроматор, и специфическую длину волны обнаруживают с помощью фотодетектора обычно при 90 градусах от света возбуждения. Фотодетектор может включать, например, фотоэлектронный умножитель, фотодиод или детектор на устройстве с зарядовой связью (CCD). Фотодетектор обычно обеспечивает численное значение интенсивности флуоресцентного сигнала. Сигнал может также преобразовываться как вывод цифровых или аналоговых данных.
В вариантах осуществления настоящего изобретения выбирают длины волн возбуждения и излучения, подходящие для флуоресцентного обнаружения производных хлорофилла, например возбуждение при приблизительно 410 нм и излучение при приблизительно 670 нм. Как правило, интенсивность обнаруживаемого флуоресцентного сигнала пропорциональна концентрации производного хлорофилла, не содержащего фитол, в образце.
Гашение флуоресцентного сигнала от хлорофилла или фитолсодержащих производных хлорофилла
В вариантах осуществления настоящего изобретения флуоресцентный сигнал, связанный с хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, в образце гасится. Под "гасится" подразумевают, что интенсивность флуоресцентного сигнала, производимого хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, в образце уменьшается, ингибируется или подавляется. В предпочтительном варианте осуществления флуоресцентный сигнал, связанный с хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, гасится путем димеризации. Под "димеризацией" подразумевают, что по меньшей мере две молекулы фитолсодержащего производного хлорофилла ассоциируют с образованием по меньшей мере димера. Таким образом "димеризация", как используется в настоящем документе, содержит образование структур более высокого порядка, содержащих три или более молекулы фитолсодержащего производного
хлорофилла, таких как тримеры, тетрамеры или другие мультимеры, при условии, что флуоресцентный сигнал от таких структур гасится, и при условии, что димеры или другие мультимеры остаются в растворе (например, димеры или мультимеры представляют собой растворенные вещества в водном растворе). При этом подразумевается, что обычно хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла не образует твердых частиц в растворе для обнаружения, например, хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла не осаждается или не образует твердых коллоидных агрегатов в растворе для обнаружения. "Димеризация" и "мультимеризация" могут, таким образом, применяться взаимозаменяемо, и "димеризуется", "димеризованный", "димеризация" и "образование димера" должны также толковаться соответственно.
Из ВЭЖХ-исследования известно (Food Research International 38(8-9): 1067-1072 (2005)), что фитолсодержащие соединения, такие как хлорофилл, феофитин и пирофеофитин дают очень сильный сигнал флуоресценции при возбуждении при 410 нм и излучении при 667 нм. В определенных условиях порфириновое кольцо хлорофилла, феофитина и пирофеофитина способно к образованию димера, который сильно гасит сигнал флуоресценции (см. J. Photochem. Photobiol. В: Biol. 54 (2000) 194-200) . Производные хлорофилла, не содержащие фитол, такие как хлорофиллид, феофорбид и пирофеофорбид, также способны димеризоваться через порфириновое кольцо, что приводит к похожему уменьшению интенсивности флуоресценции. Однако условия, при которых фитолсодержащие и производные хлорофилла, не содержащие фитол, димеризуются, могут отличаться. В вариантах осуществления настоящего изобретения это отличие можно использовать для того, чтобы выбрать условия, при которых флуоресценция обнаруживается исключительно от производных, не содержащих фитол.
Таким образом, в одном варианте осуществления стадию
обнаружения осуществляют при таких условиях, что хлорофилл или
фитолсодержащее производное хлорофилла димеризуется
преимущественно по сравнению с производным хлорофилла, не содержащим фитол. Под "димеризуется преимущественно"
подразумевают, что при таких условиях доля димеризующегося хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла больше доли димеризующегося производного хлорофилла, не содержащего фитол.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50%,
по меньшей мере 7 0%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере
95% флуоресцентного сигнала, производимого хлорофиллом или
фитолсодержащим производным хлорофилла, гасится,
предпочтительно посредством димеризации. При этом
подразумевают, что при используемых условиях обнаружения
интенсивность флуоресцентного сигнала, производимого
хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, снижается в соответствии с установленной долей по сравнению с флуоресцентным сигналом, производимым хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, при контрольных условиях, в которых гашение не происходит, например, при условиях, где отсутствует значительная димеризация хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла. Например, негасящие условия могут включать высокую (например, > 0,1%) концентрацию поверхностно-активного вещества.
Предпочтительно флуоресцентный сигнал, производимый производным хлорофилла, не содержащим фитол, гасится незначительно или гасится в меньшей степени, чем флуоресцентный сигнал, производимый хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла. Например, в некоторых вариантах осуществления менее 50%, менее 25% или менее 10% флуоресцентного сигнала, производимого производным хлорофилла, не содержащим фитол, гасится по сравнению с флуоресцентным сигналом, производимым производным хлорофилла, не содержащим фитол, при контрольных условиях, в которых гашение не происходит, например, при условиях, где отсутствует значительная димеризация производного хлорофилла, не содержащего фитол.
Условия обнаружения
Стадию обнаружения настоящего изобретения можно осуществлять при таких условиях, что флуоресцентный сигнал,
связанный с хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, в образце гасится, предпочтительно посредством димеризации. Варьируя состав раствора, в котором обнаруживают сигнал, специалист может выбрать соответствующие условия для того, чтобы погасить флуоресцентный сигнал, например условия, при которых хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла преимущественно димеризуется, а производное хлорофилла, не содержащее фитол, не димеризуется.
Обычно стадию обнаружения осуществляют в водном растворе. Раствор, в котором осуществляют стадию обнаружения, называют в настоящем документе "раствор для обнаружения". Было обнаружено, что состав раствора для обнаружения можно варьировать для того, чтобы повлиять на димеризацию производных хлорофилла и гашение флуоресцентного сигнала. В частности, концентрация поверхностно-активного вещества, температура, рН, а также тип и концентрация растворителя в растворе для обнаружения могут повлиять на димеризацию, и их можно варьировать для того, чтобы выбрать подходящие условия для стадии обнаружения. Предпочтительно раствор для обнаружения содержит поверхностно-активное вещество, растворитель и/или щелочь.
Растворитель представляет собой обычно полярный протонсодержащий растворитель, такой как спирт, предпочтительно низший спирт (например, С1-С5 или С1-С3) , более предпочтительно алифатический одноатомный спирт. В особых вариантах осуществления спирт содержит метанол, этанол, пропанол, изопропанол или бутанол, более предпочтительно этанол или изопропанол, наиболее предпочтительно изопропанол. Раствор для обнаружения может содержать от 5 до 25% масс, спирта, например от 5 до 20%, от 5 до 15%, от 10 до 20%, от 12 до 20%, от 13 до 17% или приблизительно 15% масс, спирта, например, этанола или изопропанола.
Соответствующую концентрацию растворителя (например, спирта) можно выбирать исходя из конкретного спирта и других условий, т.е. концентрации поверхностно-активного вещества, рН, температуры и т.д. Если другие условия реакции поддерживаются постоянными, увеличение концентрации растворителя обычно
снижает димеризацию и, следовательно, уменьшает гашение флуоресцентного сигнала. В некоторых вариантах осуществления концентрацию растворителя можно титровать (например, постепенно увеличивать при поддержании других условий постоянными) до тех пор, пока не достигается концентрация, при которой производное хлорофилла, не содержащее фитол, больше не димеризуется, но при которой хлорофилл или фитолсодержащее производное остается в димеризованном состоянии. В этой точке флуоресцентный сигнал от хлорофилла или фитолсодержащего производного остается погашенным, с другой стороны сигнал от производного, не содержащего фитол, не гасится. Эту концентрацию растворителя можно затем применять на стадии обнаружения.
Природу поверхностно-активного вещества особенно не ограничивают. В особых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество может представлять собой, например, анионное поверхностно-активное вещество, катионное поверхностно-активное вещество, цвиттер-ионное поверхностно-активное вещество или неоионогенное поверхностно-активное вещество.
Подходящие анионные поверхностно-активные вещества
включают, например, карбоксилаты, такие как мыла и
полиалкоксикарбоксилаты, сульфонаты, такие как
алкилбензолсульфонаты, алкиларенсульфонаты, нафталинсульфонаты,
а-олефинсульфонаты, сульфонаты со сложноэфирными, амидными или
эфирными связями, включая амидосульфонаты, 2-сульфоэтиловые
сложные эфиры жирных кислот и сульфонаты сложных эфиров жирных
кислот; сульфаты, такие как сульфаты спиртов, этоксилированные
и сульфатированные спирты, этоксилированные и сульфатированные
алкилфенолы, сульфатированные кислоты, сульфатированные амиды,
сульфатированные сложные эфиры и сульфатированные натуральные
масла и жиры; сложные эфиры фосфорной кислоты, такие как
бутилфосфат, гексилфосфат, 2-этилгексилфосфат, октилфосфат,
децилфосфат, октилдецилфосфат, смешанный алкилфосфат,
гексилполифосфат, октилполифосфат, сложный моноэфир глицерина из смешанных жирных кислот (фосфатированных), 2-этилгексанол (этоксилированный и фосфатированный), додециловый спирт (этоксилированный и фосфатированный), тридециловый спирт
(разветвленный), 9-октадецениловый спирт (этоксилированный и
фосфатированный), многоатомные спирты (этоксилированные и
фосфатированные), фенол (этоксилированный и фосфатированный),
октилфенол (этоксилированный и фосфатированный), нонилфенол
(этоксилированный и фосфатированный), додецилфенол
(этоксилированный и фосфатированный) и динонилфенол (этоксилированный и фосфатированный); а также сложные эфиры фосфоновых кислот.
Подходящие катионные поверхностно-активные вещества
включают, например, амины, такие как бескислородные амины, в
том числе моно-, ди- и полиамины, кислородсодержащие амины, в
том числе оксиды аминов, этоксилированные алкиламины, 1- (2-
гидроксиэтил)-2-имидазолины и алкоксилаты этилендиамина,
этилендиаминалкоксилаты и амины с амидными связями; а также
соли четвертичного аммония, такие как соли
диалкилдиметиламмония, хлориды алкилбензилдиметиламмония, соли алкилтриметиламмония, алкилпиридиния галогениды и сложные эфиры четвертичного аммония.
Примеры цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ включают алкилбетаины, амидопропилбетайны, алкилдиметиламины, производные имидазолиния, а также аминокислоты и их производные.
Неоионогенные поверхностно-активные вещества, которые
можно применять, включают сложные эфиры карбоновых кислот,
такие как сложные эфиры глицерина и сложные эфиры
полиоксиэтилена; сложные эфиры ангидросорбита, такие как
сложные эфиры этоксилированного ангидросорбита;
полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества, такие как
этоксилаты спирта и этоксилаты алкилфенола; натуральные
этоксилированные жиры, масла и воски; гликолевые сложные эфиры
жирных кислот; алкилполигликозиды; амиды карбоновых кислот,
такие как конденсаты диэтаноламина, конденсаты
моноалканоламина, в том числе моноэтаноламиды кокосовой,
лауриновой, олеиновой и стеариновой кислот, и
моноизопропаноламиды, полиоксиэтиленовые амиды жирных кислот; глюкамиды жирных кислот и блоксополимеры полиоксиалкиленов.
Многие подходящие поверхностно-активные вещества имеются в продаже, в том числе: блоксополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена семейства Pluronic(r); полиэтиленгликоль-гидрогенизированные касторовые масла, доступные под торговым названием Cremophor(r), например, Cremophor(r) RH 4 0; продукты, доступные под торговым названием Nikkol(r) (например, Nikkol(r) НСО-40 и НСО-60); сложные эфиры полиоксиэтиленглицерина и жирных кислот, доступные под названием Tagat(r) (например, Tagat(r) RH 40; и Tagat(r) ТО); сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, например, сложные эфиры моно- и три- лауриновой, пальмитиновой, стеариновой и олеиновой кислот, коммерчески доступного типа под торговым названием Tween(r) (например, Tween(r) 20, Tween(r) 4 0 или Tween(r) 80); фосфолипиды, в частности лецитины, такие как лецитины соевых бобов; сложные эфиры сорбитана и жирных кислот, коммерчески доступные под торговой маркой Span(r), например, Span(r) 2 0 (монолаурат сорбитана) или Span(r) 80 (моноолеат сорбитана).
В одном варианте осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой полиоксиэтиленовое поверхностно-активное вещество, предпочтительно со степенью полимеризации полиоксиэтиленовой части от приблизительно 5 до приблизительно 50, например, от 8 до 12. Более предпочтительно поверхностно-активное вещество содержит алкиларилэтоксилат, такой как алкилфенолэтоксилат, например, октилфенол, полимеризованный с этиленоксидом. В одном варианте осуществления поверхностно-активное вещество содержит 4-октилфенолполиэтоксилат (4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоль) , например, доступный под торговым названием Тритон Х-100 от Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури.
Предпочтительно раствор для обнаружения содержит от 0,01 до 0,1% масс, например, от 0,01 до 0,05%, от 0,01 до 0,04%, от 0,01 до 0,03% или от 0,01 до 0,02% масс, поверхностно-активного вещества. Соответствующую концентрацию поверхностно-активного вещества можно выбирать исходя из конкретного поверхностно-активного вещества и других условий, т.е. концентрации поверхностно-активного вещества, рН, температуры и т.д. Если
другие условия реакции поддерживаются постоянными, увеличение концентрации поверхностно-активного вещества обычно снижает димеризацию и, следовательно, приводит к увеличению флуоресцентного сигнала. В некоторых вариантах осуществления концентрацию поверхностно-активного вещества можно титровать (например, постепенно увеличивать при поддержании других условий постоянными) до тех пор, пока не достигается концентрация, при которой производное хлорофилла, не содержащее фитол, больше не димеризуется, но при которой хлорофилл или фитолсодержащее производное остается в димеризованном состоянии. Эту концентрацию поверхностно-активного вещества можно затем применять на стадии обнаружения.
Стадию обнаружения можно осуществлять при любой подходящей температуре. Однако если другие условия реакции поддерживают постоянными, увеличение температуры обычно снижает димеризацию и, следовательно, уменьшает гашение флуоресцентного сигнала. Таким образом, температуру реакции можно выбрать таким образом, что при других применяемых условиях (например, концентрации растворителя и поверхностно-активного вещества, рН и т.д.) хлорофилл или фитолсодержащее производное димеризуется преимущественно по сравнению с производным хлорофилла, не содержащим фитол. В особых вариантах осуществления стадию
обнаружения можно осуществлять при 10-50°С, 15-40°С, 15-30°С или
предпочтительно при комнатной температуре, например 2 0-2 5°С.
Стадию обнаружения можно осуществлять при любом рН. Предпочтительно стадию обнаружения осуществляют при щелочном рН, т.е. при рН больше 7, предпочтительно 8,0 или выше, 9,0 или выше, 10,0 или выше, или 11,0 или выше. Желаемый рН можно достичь путем добавления подходящего количества щелочи, например гидроксида натрия, к раствору для обнаружения.
В одном варианте осуществления раствор для обнаружения не содержит липосом. Преимущественно, способ обнаружения настоящего изобретения можно осуществлять, не нуждаясь в липосомах для усиления флуоресценции от производного хлорофилла, не содержащего фитол.
Количественное определение уровней производного
хлорофилла, не содержащего фитол, в образце
Поскольку флуоресценция от хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла гасится на стадии обнаружения, значения интенсивности флуоресценции можно приравнивать к определенному уровню или концентрации производных хлорофилла, не содержащих фитол, в образце. Обычно стандартную (калибровочную) кривую получают добавлением известной концентрации производного хлорофилла, не содержащего фитол (например, хлорофиллида, феофорбида или пирофеофорбида) и получением значений флуоресценции. Значения флуоресценции от образцов, содержащих неизвестные количества производного хлорофилла, не содержащего фитол, можно затем сравнивать со стандартной кривой для обеспечения значения концентрации производного хлорофилла, не содержащего фитол, в образце.
Способ анализа
В одном аспекте настоящего изобретения способ обнаружения, описанный выше, можно применять в способе анализа для количественного определения ферментной активности в образце. В частности, способ можно применять для измерения ферментативного гидролиза хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла, путем отслеживания выработки производных хлорофилла, не содержащих фитол.
Любой фермент, который способен гидролизовать хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла, можно анализировать с использованием этого способа. Обычно "гидролизовать хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла" означает гидролизовать сложноэфирную связь в хлорофилле или фитолсодержащем производном хлорофилла, например, отщеплять фитольную группу от хлоринового кольца в хлорофилле или производном хлорофилла. Таким образом, фермент обычно обладает эстеразной или гидролазной активностью. Фермент может, например, представлять собой хлорофиллазу, феофитиназу или пирофеофитиназу.
Обычно способ анализа включает стадию контактирования образца и хлорофилла или фитолсодержащего производного
хлорофилла. Таким образом, образец можно приводить в контакт с субстратом для ферментной активности, которую желательно обнаружить. Например, в специальных вариантах осуществления образец можно приводить в контакт со следующими субстратами: хлорофилл (чтобы обнаружить хлорофиллазную активность), феофитин (чтобы обнаружить феофитиназную активность) или пирофеофитин (чтобы обнаружить пирофеофитиназную активность). Способ можно также применять для обнаружения любой комбинации вышеупомянутых активностей путем добавления более одного субстрата.
Стадию контактирования можно осуществлять, инкубируя образец и хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла в реакционном растворе. Под "реакционным раствором" подразумевают любой раствор, в котором ферменту в образце предоставлена возможность воздействовать на субстрат, т.е. до стадии обнаружения. Образец можно добавлять непосредственно в реакционный раствор и субстрат с последующей инкубацией в течение заранее определенного периода времени, в течение которого происходит ферментативная активность.
Стадию контактирования можно осуществлять при любых условиях, при которых фермент обладает гидролитической активностью. Условия, при которых хлорофиллазы и родственные ферменты активны, описываются, со ссылкой на известные способы анализа, например, в Khamessan et al. (1994), Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 60(1), pages 73-81; Khamessan et al. (1996), Journal of Biotechnology, 45(3) pages 253-264; Klein and Vishniac (1961), J. Biol. Chem. 236: 25442547; McFeeters et al., Plant Physiology 47:609-618 (1971) и McFeeters et al., Plant Physiology 55:377-381 (1975).
Предпочтительно реакционный раствор содержит поверхностно-активное вещество, растворитель и/или буфер. Поверхностно-активное вещество и растворитель способствуют повышению растворимости субстрата (например, хлорофилла, феофитина или пирофеофитина) в растворе. Поверхностно-активное вещество может представлять собой любое поверхностно-активное вещество, описываемое выше в связи с раствором для обнаружения, например,
полиоксиэтиленовое поверхностно-активное вещество, такое как Тритон Х-100. Однако реакционный раствор обычно содержит более высокую концентрацию поверхностно-активного вещества, чем присутствует в растворе для обнаружения. Например, реакционный раствор может содержать от 0,05 до 0,5%, от 0,1 до 0,5% или от 0,1 до 0,3% масс, поверхностно-активного вещества.
Реакционный раствор может содержать органический растворитель, такой как ацетон, этанол, пропанол, бутанол или т.п. Активность хлорофиллаз в различных органических растворителях описывается, например, в Khamessan et al. (1995) Process Biochemistry 30(2), pages 159-168. Предпочтительно реакционный раствор содержит ацетон в качестве растворителя. В некоторых вариантах осуществления реакционный раствор содержит от 1 до 10%, например, от 3 до 7% или приблизительно 5% масс, ацетона.
Реакционный раствор может содержать любой подходящий
буфер. Буферы, которые можно применять включают, например,
фосфатный или HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-
пиперазинэтансульфоновая кислота) буферы. Предпочтительно реакционный раствор имеет рН в диапазоне от 6,0 до 8,0, например от 6,5 до 7,5 или приблизительно 7, и специалист может легко выбрать буфер, соответствующий желаемому рН. Реакционный раствор может содержать одну или несколько дополнительных солей, таких как хлорид калия.
Образец можно инкубировать с субстратом и реакционным раствором в течение периода времени подходящего для того, чтобы обеспечить гидролиз поддающегося обнаружению количества продукта. Типичные сроки инкубации включают, например, от 10 секунд до 120 минут, например, от 1 до 60 минут, от 1 до 30 минут или от 5 до 2 0 минут. Стадию инкубации можно осуществлять при любой температуре, при которой фермент активен, например, при 10-50°С, 15-45°С, 20-25°С или 35-45°С, предпочтительно приблизительно 4 0°С.
После стадии контактирования ферментативную активность обычно ограничивают перед тем, как обнаруживают флуоресцентный
сигнал. Ферментативную активность можно ограничивать, например, увеличивая рН раствора, предпочтительно до по меньшей мере рН 10 или по меньшей мере рН 11. В одном варианте осуществления щелочь (например, гидроксид натрия) добавляют после стадии инкубации для того, чтобы остановить ферментную реакцию. В целях удобства ферментную активность можно ограничивать путем добавления реакционного раствора к раствору для обнаружения, описываемому выше, например, в котором раствор для обнаружения содержит щелочь, такую как гидроксид натрия. Обычно реакционный раствор разводится по меньшей мере в 5 раз, 10 раз, 50 раз или 100 раз в растворе для обнаружения.
После ферментативной реакцией способ анализа включает
стадию обнаружения выработки производного хлорофилла, не
содержащего фитол, посредством способа, описываемого выше.
Обычно определяют концентрацию производного хлорофилла, не
содержащего фитол, в растворе для обнаружения. Таким образом,
можно определять скорость гидролиза субстрата в единицу времени
(на стадии контактирования), что обеспечивает меру ферментной
активности в образце. Одна единица ферментной активности может
определяться как количество фермента, которое гидролизует один
микромоль субстрата (например, хлорофилла, феофитина или
пирофеофитина) в минуту при 40°С, например, в способе анализа,
описываемом в настоящем документе. Поскольку субстрат и продукт
эквимолярны, одна единица может альтернативно определяться как
количество фермента, которое вырабатывает один микромоль
продукта (например, хлорофиллида, феофорбида или
пирофеофорбида) в минуту при 4 0°С.
Преимущественно, как описано выше, способ анализа настоящего изобретения содержит две дискретные стадии, стадию реакции, в которой фермент активен, и стадию обнаружения, в которой фермент неактивен. Поскольку стадии реакции и обнаружения происходят отдельно, их можно осуществлять в разных растворах и при разных условиях. Это позволяет оптимизировать условия для каждой стадии. Таким образом, в одном варианте осуществления фермент активен в реакционном растворе, но
неактивен в растворе для обнаружения. Например, стадию реакции можно осуществлять с использованием любых условий, при которых фермент активен, например, при рН от 4 до 8. В отличие от этого, стадию обнаружения можно осуществлять с использованием условий, которые оптимизируют для способствования селективной димеризации хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла, но при которых фермент неактивен, например, при рН 10 или больше. Наборы
В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает наборы, подходящие для осуществления способа или способа анализа, описываемых в настоящем документе. Такие наборы могут содержать реактивы, описываемые в настоящем документе, для применения в способах, в частности реакционные растворы, растворы для обнаружения и субстраты, описываемые в настоящем документе. Каждый компонент может содержаться в подходящих флаконах или других контейнерах вместе с подходящей упаковкой и/или инструкциями для осуществления способа.
Реакционный раствор обычно представляет собой любой раствор, в котором фермент активен. Реакционный раствор может содержать поверхностно-активное вещество, растворитель и буфер или может представлять собой любой другой реакционный раствор, описанный выше в отношении способа анализа.
Предпочтительно субстрат содержит хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла, такое как хлорофилл, феофитин или пирофеофитин. Один, два или три, или более субстратов могут обеспечиваться в наборе в отдельных контейнерах или в комбинации. Например, в некоторых вариантах осуществления два или более субстратов могут присутствовать в том же самом контейнере, например, если желательно проанализировать активности двух или более ферментов. Обычно субстрат обеспечивается в виде водного раствора. В некоторых вариантах осуществления реакционный раствор и субстрат могут обеспечиваться в одном растворе.
Набор может содержать любой раствор для обнаружения, описываемый в настоящем документе. Предпочтительно
флуоресценция от хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла гасится в растворе для обнаружения, тогда как флуоресценция от производного хлорофилла, не содержащего фитол, не гасится, например, раствор для обнаружения выбирают так, что субстрат димеризуется преимущественно по сравнению с продуктом ферментативного гидролиза. В одном варианте осуществления раствор для обнаружения содержит поверхностно-активное вещество, спирт (например, изопропанол) и щелочь (например, гидроксид натрия). Обычно фермент неактивен в растворе для обнаружения.
В предпочтительном варианте осуществления набор дополнительно содержит один или несколько стандартов, например, для построения стандартной (калибровочной) кривой для применения в способе анализа. Обычно такие стандарты присутствуют в виде контейнеров, причем каждый содержит известную концентрацию продукта, т.е. производного хлорофилла, не содержащего фитол. Могут обеспечиваться один, два или более стандартов, содержащие разные продукты (например, хлорофиллид, феофорбид или пирофеофорбид) и/или отличающиеся концентрации каждого продукта.
Настоящее изобретение будет теперь дополнительно проиллюстрировано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
ПРИМЕРЫ
В этих примерах разработали способ анализа для измерения хлорофиллазной, феофитиназной и пирофеофитиназной активности. На первой стадии анализа подготавливали субстрат, составленный из хлорофилла, феофитина или пирофеофитина в буфере. Этот субстрат добавляли к раствору фермента, и осуществляли реакцию в течение 10 минут при 4 0°С. Через 10 минут времени реакции часть образца переносили в буфер для обнаружения. Измерение ферментной активности опирается на тот факт, что хлорофилл, феофитин или пирофеофитин в буфере для обнаружения образует димеры (см. фиг. 1). Образование димера гасит сигнал флуоресценции хлорофилла, феофитина или пирофеофитина. Буфер
для обнаружения составляют таким образом, что вырабатываемые хлорофиллид, феофорбид или пирофеофорбид не образуют димера и, таким образом, могут обнаруживаться посредством флуоресцентной спектроскопии.
Пример 1 - Разработка анализа на пирофеофитиназную активность
100 мМ фосфатный буфер, рН 7, содержащий 50 мМ КС1, 0,2% Тритона Х-100 и 5,17% ацетона, подготавливали для применения в качестве реакционного буфера. Подготавливали следующие растворы, содержащие пирофеофитин, пирофеофорбид или их смесь, и добавляли к реакционному буферу:
1) раствор пирофеофитина: 500 мкл реакционного буфера + 50 мкл воды + 30 мкл пирофеофитина (1 мг/мл в ацетоне),
2) раствор пирофеофорбида: 500 мкл реакционного буфера + 50 мкл воды + 15 мкл пирофеофорбида (2 мг/мл в ацетоне) + 15 мкл ацетона,
3) раствор пирофеофитина: пирофеофорбида 1:1: 500 мкл реакционного буфера + 50 мкл воды + 15 мкл пирофеофитина (1 мг/мл в ацетоне) + 7,5 мкл пирофеофорбида (2 мг/мл в ацетоне) + 7,5 мкл ацетона.
Подготавливали различные растворы для обнаружения (A-G), содержащие отличающиеся концентрации Тритона Х-100 (поверхностно-активное вещество) и этанола или изопропанола (растворитель), как показано в таблицах 1 и 2 ниже. 10 мкл раствора 1, 2 или 3 добавляли к 1000 мкл каждого раствора для обнаружения A-G, перемешивали на мешалке Whirley, и 2 00 мкл переносили в черный титрационный микропланшет. Через 10 минут после перемешивания сигнал флуоресценции (возбуждение 410 нм, излучение 670 нм) измеряли при комнатной температуре.
Измерения анализировали для того, чтобы определить условия, при которых флуоресценция от субстрата (хлорофилл, феофитин или пирофеофитин) гасилась, с другой стороны флуоресценция от продукта реакции (хлорофиллид, феофорбид или пирофеофорбида) не гасилась, и ее можно было измерить посредством измерения флуоресценции.
Первоначально тестировали комбинации этанола, Тритона Х
100 и 50 мМ NaOH в качестве раствора для обнаружения. Результаты показаны ниже в таблице 1:
Таблица 1
Раствор для обнаружения
Состав
Пирофеофитин
Пирофеофорбид
Смесь
100 мМ фосфатного буфера 0,2% Тритона Х-100 5 0 мМ КС1
1513
2132
1606
0,03% Тритона Х-100 10% EtOH 0,05 М NaOH
214
209
0,05% Тритон Х-100 10% EtOH 0,05М NaOH
894
1800
1288
0,04% Тритон Х-100 10% EtOH 0,05М NaOH
455
777
718
Значения в таблице 1 представляют собой относительные значения флуоресценции (ОЕФ), возбуждение при 410 нм и излучение при 67 0 нм, для каждого раствора для обнаружения A-D в комбинации с каждым из растворов 1, 2 и 3.
Результаты в таблице 1 показывают, что концентрация поверхностно-активного вещества (Тритон Х-100) является очень важной для сигнала. В растворе для обнаружения В флуоресцентный сигнал пирофеофитина почти элиминируется, потому что пирофеофитин образует димер, который приводит к гашению флуоресценции. Сигнал от пирофеофорбида, однако, также сильно гасится. Сигнал в растворах для обнаружения С и D гасится меньше как для пирофеофитина, так и пирофеофорбида, и, следовательно, растворы для обнаружения С и D также не подходят для различения сигнала от пирофеофитина и пирофеофорбида.
Затем вместо этанола применялся изопропанол (IPA), результаты этого показаны в таблице 2:
Результаты в таблице 2 показывают намного более сильное гашение пирофеофитина в присутствии изопропанола, с другой стороны пирофеофорбид дает очень высокий сигнал флуоресценции. Смесь пирофеофитина и пирофеофорбида (3) дает почти половину сигнала пирофеофорбида, что подтверждает, что возможно различать эти два компонента.
На основе вышеупомянутых результатов было принято решение применять раствор для обнаружения Е в анализе на пирофеофитиназную активность. Для того чтобы проанализировать количество пирофеофорбида, вырабатываемого ферментативной реакцией, строили калибровочную кривую путем добавления меняющихся количеств пирофеофорбида в раствор для обнаружения Е и измерения флуоресценции как описано выше. Калибровочная кривая иллюстрируется на фиг. 2.
Пример 2 - Разработка анализа на феофитиназную активность На основе результатов примера 1 разрабатывали анализ на феофитиназную активность. При добавлении к раствору для обнаружения Е (0,015% Тритона Х-100; 15% IPA; 0,05М NaOH), флуоресценция от феофитина большей частью гасилась (как и в случае пирофеофитина), с другой стороны феофорбид давал высокий сигнал флуоресценции при комнатной температуре. Соответственно, строили калибровочную кривую для феофорбида (см. фиг. 3).
Пример 3 - Разработка анализа на хлорофиллазную активность На основе результатов примера 1 разрабатывали анализ на
хлорофиллазную активность.
Используя реакционный раствор, описываемый в примере 1, подготавливали следующий раствор:
4) раствор хлорофилла: 500 мкл реакционного буфера + 50 мкл воды + 30 мкл хлорофилла (1 мг/мл в ацетоне).
Растворы для обнаружения А, В и Е подготавливали, как описано в примере 1. 10 мкл раствора 4 хлорофилла добавляли к 1000 мкл каждого из растворов для обнаружения А, В и Е, перемешивали и измеряли флуоресценцию при комнатной температуре, как описано в примере 1. Результаты показаны в таблице 3 ниже:
В таблице 3 показано, что хлорофилл дает высокий сигнал флуоресценции в реакционном буфере (раствор для обнаружения А), с другой стороны сигнал гасится при разведении в растворах для обнаружения Е и В.
В отличие от этого хлорофиллид показал высокий сигнал флуоресценции в растворе для обнаружения Е.
На основании вышеупомянутых наблюдений выбрали раствор для обнаружения Е (0,015% Тритон Х-100; 15% изопропанол; 0,05М NaOH) для применения в анализе на хлорофиллазную, феофитиназную и пирофеофитиназную активность. В растворе для обнаружения Е хлорофиллид, феофорбид и пирофеофорбид каждый генерируют высокие флуоресцентные сигналы, тогда как сигналы от
хлорофилла, феофитина и пирофеофитина гасятся. Пример 4 Анализ пирофеофитиназы
100 мМ фосфатного буфера, рН 7, содержащего 50 мМ КС1,
0. 2% Тритона Х-100 и 5,17% ацетона, применяют в качестве
реакционного буфера. Субстрат (пирофеофитин) добавляют к
реакционному буферу в концентрации 5 6 мМ. 130 мкл реакционного
буфера, содержащего субстрат, переносят в пробирку Эппендорфа и
помещают в инкубатор при 4 0°С на 5 минут.
10 мкл тестируемого образца, который предположительно содержит пирофеофитиназную активность, добавляют в пробирку, содержащую реакционный буфер и субстрат. Пробирку инкубируют при 40°С в течение 10 минут со встряхиванием при 900 об./мин.
После 10 минут инкубации 10 мкл смеси образца/реакционного буфера/субстрата переносят в другую пробирку Эппендорфа, содержащую 1 мл раствора для обнаружения, включающего 0,015% Тритона Х-100, 15% изопропанола и 0,05 М NaOH. Пробирку немедленно закрывают и перемешивают на мешалке Whirley в течение 5 секунд. 2 аликвоты, по 200 мкл каждая, разведенного образца переносят в черный титрационный микропланшет. Через 10 минут после того как взяли последний образец, образцы измеряют на флуоресцентном планшет-ридере при возб. 410 нм и излуч. 67 0 нм при комнатной температуре (от 2 0°С до 2 5°С) .
Стандартную кривую можно построить, как описано в примере
1, и применить для определения концентраций пирофеофорбида в
каждом образце после 10 минут инкубации при 4 0°С. Например, угол наклона стандартной кривой представляет собой относительную флуоресценцию (ОЕФ) как функцию концентрации пирофеофорбида в мкМ. Следовательно, для конкретного образца, [пирофеофорбид] (мкМ) = ОЕФ/угол наклона стандартной кривой. Пирофеофитиназную активность в тестируемом образце можно рассчитать как число микромолей пирофеофорбида, вырабатываемых за минуту инкубации при 4 0°С, принимая в расчет разведение образца в анализе.
Пример 5 Анализ феофитиназы
Пример 4 повторяют, заменяя пирофеофитин в качестве
субстрата на феофитин (при концентрации 56 мМ). Стандартную кривую можно построить, как описано в примере 2. Феофитиназную активность в тестируемом образце можно рассчитать как число микромолей феофорбида, вырабатываемых за минуту инкубации при
4 0°С, принимая в расчет разведение образца в анализе. Пример 6 Анализ хлорофиллазы
Пример 4 повторяют, заменяя пирофеофитин в качестве субстрата на хлорофилл (в концентрации 5 6 мМ) . Стандартную кривую можно построить с использованием меняющихся концентраций хлорофиллида. Хлорофиллазную активность в тестируемом образце можно рассчитать как число микромолей хлорофиллида, вырабатываемых за минуту инкубации при 4 0°С, принимая в расчет разведение образца в анализе.
Все публикации, упомянутые в вышеприведенном описании, включены в данный документ посредством ссылки. Различные модификации и изменения описанных способов и систем настоящего изобретения будут очевидными для специалистов в данной области без отклонения от объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано в связи со специфическими предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение, как заявляется, не должно чересчур ограничиваться такими специфическими вариантами осуществления. Действительно, различные модификации описанных направлений осуществления настоящего изобретения, которые очевидны специалистам в биохимии или родственных областях, подразумевают, как находящиеся в рамках следующей формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ обнаружения производного хлорофилла, не
содержащего фитол, в образце, включающий стадию обнаружения
флуоресцентного сигнала, связанного с производным хлорофилла,
не содержащим фитол, где флуоресцентный сигнал, связанный с
хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, в
образце гасится.
2. Способ по п. 1, где флуоресцентный сигнал, связанный с
хлорофиллом или фитолсодержащим производным хлорофилла, гасится
посредством димеризации хлорофилла или фитолсодержащего
производного хлорофилла.
3. Способ по п. 1 или п. 2, где хлорофилл или
фитолсодержащее производное хлорофилла димеризуется
преимущественно по сравнению с производным хлорофилла, не
содержащим фитол.
4. Способ по любому предшествующему пункту, где производное хлорофилла, не содержащее фитол, содержит феофорбид или пирофеофорбид, и/или фитолсодержащее производное хлорофилла содержит феофитин или пирофеофитин.
5. Способ по любому предшествующему пункту, где стадию обнаружения осуществляют в растворе для обнаружения, содержащем поверхностно-активное вещество, спирт и/или щелочь.
6. Способ по п. 5, где спирт содержит изопропанол или этанол.
7. Способ по п. б, где раствор для обнаружения содержит от 12 до 20% масс, спирта.
8. Способ по любому из п.п. 5-7, где поверхностно-активное
вещество содержит 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-
полиэтиленгликоль .
9. Способ по любому из п.п. 5-8, где раствор для обнаружения содержит от 0,01 до 0,03% масс. поверхностно-активного вещества.
10. Способ по любому предшествующему пункту, где стадию обнаружения осуществляют при 2 0-2 5°С.
11. Способ по любому предшествующему пункту, где стадию
обнаружения осуществляют при рН больше 10,0.
12. Способ по любому предшествующему пункту, где обнаруживают флуоресцентный сигнал с длиной волны приблизительно 67 0 нм.
13. Способ анализа для количественного определения ферментной активности в образце, где фермент способен гидролизовать хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла, включающий:
a) контактирование образца и хлорофилла или
фитолсодержащего производного хлорофилла; и
b) обнаружение выработки производного хлорофилла, не
содержащего фитол, способом, описываемым в любом предыдущем
пункте.
14. Способ анализа по п. 13, где стадия (а) включает инкубацию образца и хлорофилла или фитолсодержащего производного хлорофилла в реакционном растворе, содержащем поверхностно-активное вещество, ацетон и/или буфер.
15. Способ анализа по п. 13 или п. 14, включающий после стадии (а) и перед стадией (Ь) ограничение ферментной активности путем добавления реакционного раствора к раствору для обнаружения, определяемому в любом из п.п. 5-9.
16. Набор для количественного определения ферментной активности в образце, где фермент способен гидролизовать хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла, включающий:
a) реакционный раствор, в котором фермент активен;
b) субстрат, включающий хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла; и
c) раствор для обнаружения, в котором субстрат димеризуется преимущественно по сравнению с производным хлорофилла, не содержащим фитол, вырабатываемым ферментом.
17. Набор по п. 16, где реакционный раствор содержит поверхностно-активное вещество, ацетон и буфер.
18. Набор по п. 16 или п. 17, где субстрат содержит феофитин или пирофеофитин.
19. Набор по любому из п.п. 16-18, где раствор для
17.
обнаружения представляет собой определяемый в любом из п.п. 59.
20. Набор по любому из п.п. 16-19, где фермент неактивен в
растворе для обнаружения.
21. Набор по любому из п.п. 16-2 0, дополнительно включающий один или несколько стандартных растворов, причем каждый содержит известную концентрацию производного хлорофилла, не содержащего фитол.
22. Способ по любому из п. п. 1-12, где хлорофилл или фитолсодержащее производное хлорофилла присутствует в виде водного раствора димеров и/или других неколлоидных мультимеров.
23. Способ по любому из п.п. 1-12 и 22, где стадию обнаружения осуществляют в отсутствие липосом.
24. Способ по любому из п.п. 5-12, где поверхностно-активное вещество содержит 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоль, спирт содержит изопропанол, и щелочь содержит гидроксид натрия.
25. Способ анализа по любому из п.п. 13-15, где фермент активен во время стадии (а) и фермент неактивен во время стадии (Ь) .
По доверенности
1/3
Димер феофитина
' \ v ФИГ. 1
189002
2/3
Феофорбид
у = 2337,1х R2 = 0,9925
Потеря Mg
*¦ Феофитин
\ Феоф *- Феофорбид СН2
с'й СН3
РИ:
СН2
Феофорбидаза