[**]

Изобретение относится к конъюгату лекарственного средства, содержащему биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина и аланина. Конъюгат содержит также лекарственное средство, представляющее собой либо биологически активный белок или полипептид, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую или опосредующую биологическую активность, либо низкомолекулярное лекарственное средство. Изобретение относится также к композиции, содержащей конъюгат, нуклеиновой кислоте, кодирующей спиральный пептид, входящий в состав конъюгата, и способам получения спирального пептида и конъюгата. Изобретение может быть использовано в медицине, пищевой промышленности, в бумажной промышленности, при добыче нефти и др.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к конъюгату лекарственного средства, содержащему биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина и аланина. Конъюгат содержит также лекарственное средство, представляющее собой либо биологически активный белок или полипептид, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую или опосредующую биологическую активность, либо низкомолекулярное лекарственное средство. Изобретение относится также к композиции, содержащей конъюгат, нуклеиновой кислоте, кодирующей спиральный пептид, входящий в состав конъюгата, и способам получения спирального пептида и конъюгата. Изобретение может быть использовано в медицине, пищевой промышленности, в бумажной промышленности, при добыче нефти и др.

---

Евразийское (21) 201291010 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K38/00 (2006.01)
2013.09.30 C07K 7/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2011.05.20
(54) БИОСИНТЕТИЧЕСКИЕ НЕРЕГУЛЯРНЫЕ СПИРАЛЬНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ПРОЛИНА/АЛАНИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 10163564.7; 61/428,016
(32) 2010.05.21; 2010.12.29
(33) EP; US
(86) PCT/EP2011/058307
(87) WO 2011/144756 2011.11.24
(71) Заявитель: ИксЭль-ПРОТЕИН ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Скерра Арне, Биндер Ули, Шлапши Мартин (DE)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU) (57) Изобретение относится к конъюгату лекарственного средства, содержащему биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина и аланина. Конъюгат содержит также лекарственное средство, представляющее собой либо биологически активный белок или полипептид, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую или опосредующую биологическую активность, либо низкомолекулярное лекарственное средство. Изобретение относится также к композиции, содержащей конъюгат, нуклеиновой кислоте, кодирующей спиральный пептид, входящий в состав конъюгата, и способам получения спирального пептида и конъюгата. Изобретение может быть использовано в медицине, пищевой промышленности, в бумажной промышленности, при добыче нефти и др.
РСТ/ЕР2011/058307 МПК: А61К38/00 (2006.01) С07К 7/00 (2006.01)
Биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды пролина/аланина и их применения
Настоящее изобретение относится к биосинтетическому нерегулярному спиральному полипептиду, либо к сегменту или конъюгату биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, указанный биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или сегмент или конъюгат биосинтетического нерегулярного спирального полипептида содержит аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере примерно из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala). Указанные по меньшей мере 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala) могут быть составной (составными) частью (частями) гетерологичного полипептида или гетерологичной полипептидной конструкции. Также описаны применения и способы применения этих биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов, указанных полипептидных сегментов или указанных конъюгатов. Эти применения могут включать, среди прочего, медицинские применения, диагностические применения или применения в пищевой промышленности, а также другие промышленные применения, например, в бумажной промышленности, при добыче нефти и тому подобное. Настоящее изобретение относится также к конкретному(ным) применению(ям) предложенного здесь биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, либо сегмента или конъюгатов биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, где указанный биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид, либо сегмент или конъюгаты биосинтетического нерегулярного спирального полипептида содержит аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина. Аминокислотная последовательность предложенного здесь биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, либо сегмента биосинтетического нерегулярного спирального полипептида состоит по меньшей мере примерно из 50, по меньшей мере примерно из 100, по меньшей мере примерно из 150, по меньшей мере примерно из 200, по меньшей мере примерно из 250, по
меньшей мере примерно из 300, по меньшей мере примерно из 350 или по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala). Указанные по меньшей мере примерно 50, по меньшей мере примерно 100, по меньшей мере примерно 150, по меньшей мере примерно 200, по меньшей мере примерно 250, по меньшей мере примерно 300, по меньшей мере примерно 350 или по меньшей мере примерно 400 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala) предпочтительно являются (а) составной частью гетерологичного полипептида или гетерологичной полипептидной конструкции, либо предпочтительно являются (Ь) составной частью конъюгата, такого как конъюгат лекарственного средства, такого как конъюгат с пищевым или косметическим ингредиентом или добавкой, такого как конъюгат с биологически активным соединением, или такого, как конъюгат со спектроскопически активным соединением. В частности, здесь предложены гетерологичные белки, которые содержат по меньшей мере два домена, где первый домен из указанных по меньшей мере двух доменов содержит аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую активность, такую как биологическая активность, а второй домен из указанных по меньшей мере двух доменов содержит биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид пролина/аланина или сегмент полипептида пролина/аланина по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится, в частности, к конъюгату лекарственного средства, содержащему (1) биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или сегмент полипептида, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), и (2) лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из (а) биологически активного белка или полипептида, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую активность, и (Ь) низкомолекулярного лекарственного средства. Следующим объектом настоящего изобретения является конъюгат лекарственного средства, содержащий биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид пролина/аланина или сегмент полипептида пролина/аланина, предложенного здесь, и, кроме того,
полезную(ые) в фармацевтике или медицине молекулу(ы), такую(ие) как малые молекулы, пептиды или биомакромолекулы (такие как белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липидные везикулы) и тому подобное, сшитую(ые) и/или связанную(ые) с указанным биосинтетическим нерегулярным спиральным полипептидом пролина/аланина или сегментом полипептида пролина/аланина. Кроме того, раскрыты молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент и/или биологически активные, гетерологичные белки, а также векторы и клетки, содержащие указанные молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, раскрыты способы получения описанных здесь биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов или полипептидных сегментов по изобретению и соответствующих конъюгатов лекарственных средств или пищевых продуктов, то есть конъюгатов, содержащих определенные здесь биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды или полипептидные сегменты и пищевой ингредиент или пищевую добавку. Также раскрыты соответствующие конъюгаты (содержащие в виде одной составной части раскрытый здесь биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент), которые содержат, среди прочего, косметический ингредиент или добавку, либо биологически или спектроскопически активное соединение. Кроме того, в настоящем изобретении предложены композиции, содержащие соединения по изобретению (то есть раскрытые здесь нерегулярные спиральные полипептиды или сегменты нерегулярных спиральных полипептидов, содержащие аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, и кодирующие их молекулы нуклеиновой кислоты), а также конкретные применения указанного нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента, биологически активных белков, содержащих указанные нерегулярные спиральные полипептиды или сегменты нерегулярных спиральных полипептидов, конъюгатов лекарственных средств, конъюгатов пищевых продуктов или молекул нуклеиновой кислоты, векторов и клеток по изобретению. Также предложены способы получения и/или изготовления биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов или полипептидных сегментов по изобретению, а также получения и/или изготовления биологически активных, гетерологичных белков и/или полипептидных конструкций или
конъюгатов лекарственных средств по изобретению. Кроме того, здесь предложены медицинские, фармацевтические, а также диагностические применения для биосинтетического нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента, содержащего аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина (или молекул или конъюгатов, содержащих их), как определено здесь. Такое медицинское или фармацевтическое применение может включать применение указанного биосинтетического нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента в качестве плазмозаменителя и тому подобного. Однако средства и способы, предложенные здесь, не ограничены фармацевтическими, медицинскими и биологическими применениями, но могут также применяться в других отраслях промышленности, например, в бумажной промышленности, при добыче нефти и т.д.
Быстрый клиренс из кровообращения за счет почечной фильтрации является типичным свойством малых молекул (включая малые белки и пептиды). Однако за счет увеличения кажущихся молекулярных размеров больше размера пор почечных клубочков, период полувыведения из плазмы терапевтических белков можно увеличить до полезного в медицине интервала нескольких суток. Одной из стратегий для достижения такого эффекта является химическая конъюгация биопрепаратов с синтетическим полимером полиэтиленгликолем (ПЭГ). Это привело к нескольким усовершенствованным лекарственным средствам, например, ПЭГ-интерферону альфа2а (Pegasys(r)), ПЭГ-G-CSF (Neulasta(r)) и к недавно пегилированному фрагменту альфа-TNF-Fab (Cimzia(r)). Тем не менее, технология "пегилирования" обладает несколькими недостатками: производные ПЭГ клинической чистоты являются дорогостоящими, и их ковалентное связывание с рекомбинантным белком требует дополнительных стадий последующей обработки и очистки, следовательно, снижая выход и повышая затраты. Кроме того, ПЭГ не является биоразлагаемым, что может вызвать побочные эффекты, такие как вакуолизация почечного эпителия при продолжительном лечении; см., например, Gaberc-Porekar (2008) Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-50; Knop (2010) Angew Chem Int Ed Engl 49:6288-308 или Armstrong в: Veronese (Ed.),
"PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Applications"; Birkhauser Verlag, Basel 2009.
С целью преодоления некоторых из недостатков ПЭГ технологии в данной области техники разработано несколько рекомбинантных полипептидных миметиков, некоторые из которых основаны на встречающихся в природе аминокислотных последовательностях или синтетических аминокислотных участках.
Большинство природных аминокислотных последовательностей не ведут себя как идеальная нерегулярная цепь в физиологическом растворе, поскольку они либо склонны принимать складчатую конформацию (вторичную структуру), либо, если не являются складчатыми, они обычно нерастворимы и образуют агрегаты. Действительно, большинство классических экспериментов по исследованию поведения нерегулярной цепи полипептидов было проведено в денатурирующих условиях, то есть в присутствии химических денатурирующих агентов, таких как мочевина или гуанидинхлорид (см., например, Cantor (1980) Biophysical Chemistry. W.H. Freeman and Company, New York). Следовательно, такие технологии обычно основаны на особых аминокислотных последовательностях, которые выдерживают укладку, агрегацию, а также неспецифическую адсорбцию и, следовательно, обеспечивают стабильные нерегулярные цепи в физиологических буферных и температурных условиях, даже если они сшиты генетическим путем со складчатым доменом терапевтического белка. В этих условиях такие рекомбинантные миметики ПЭГ могут придавать значительно большее увеличение размера, чем ожидалось бы только на основе их молекулярной массы, и, в конечном счете, задерживают почечную фильтрацию и эффективно увеличивают период полувыведения из плазмы присоединенных биопрепаратов со значительными показателями.
Однако множество этих технологий имеет следующие угрозы и недостатки.
Например, встречающиеся в природе повторяющиеся аминокислотные последовательности были протестированы на применимость в медицинских исследованиях и в фармацевтических подходах. Один из таких подходов относится к транс-сиалидазе Trypanosoma cruzi. Она содержит каталитический домен из 680 аминокислотных остатков, за которым следует С-концевой повторяющийся домен, получивший название "антиген острой фазы
слущивания" (SAPА), который содержит вариабельное число 12-мерных аминокислотных повторов. Фармакокинетические исследования (РК) транс-сиалидазы мышей, содержащей 13 гидрофильных и (при физиологическом рН) отрицательно заряженных соответствующих аминокислотных остатков, имеющей природную последовательность DSSAHSTPSTPA, выявили в пять раз более длительный период полувыведения из плазмы по сравнению с рекомбинантным ферментом, из которого была удалена С-концевая повторяющаяся последовательность (Buscaglia (1999) Blood 93:2025-32). Подобный эффект продления периода полувыведения наблюдали после сшивания такой же транс-сиалидазы, то есть ее 76 кДа каталитического домена, с 13 заряженными аминокислотными повторами последовательности EPKSA, которая была обнаружена в белке-антигене 13 Trypanosoma cruzi. Оба повтора, как из SAP А, так и из антигена 13, были способны удлинять период полувыведения из плазмы гетерологичного белка глутатион-8-трансферазы (GST) из Schistosoma japonicum с показателем 7-8, после генетического слияния с обоими С-концами такого гомодимерного фермента (см. Buscaglia, цит. выше). Однако, хотя эти природные повторяющиеся аминокислотные последовательности из патогенов человека, в принципе, могут казаться привлекательными для оптимизации фармакокинетики терапевтических белков, было обнаружено, что они являются высоко иммуногенными (см. Affranchino (1989), Mol Biochem Parasitol 34:221-8 или Buscaglia (1998), J Infect Dis 1998;177:431-6).
Другой метод относится к использованию желатина. Желатин, гидролизованный и денатурированный животный коллаген, содержит протяженные участки повторов Gly-Xaa-Yaa, где Хаа и Yaa, в основном, составляют пролин и 4-гидроксипролин, соответственно. Сукцинилирование желатина, прежде всего, посредством ?-аминогрупп рассеянных естественным путем боковых цепей лизина, увеличивает гидрофильность этого биополимера и снижает его изоэлектрическую точку (р/). Внутримолекулярное электростатическое отталкивание между отрицательно заряженными карбоксилатными группами модифицированных боковых цепей предположительно растягивает молекулу до более или менее расширенной конформации. Полученный в результате увеличенный объем делает сукцинилированный желатин макромолекулой для применения в качестве
плазмозаменителя у людей и, среди прочего, имеется в продаже как Volplex (Beacon Pharmaceuticals Ltd) или Gelofusine(r) (В. Braun Melsungen AG). Кроме того, эффект увеличения периода полувыведения был достигнут посредством генетического слияния гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) с искусственным желатиноподобным полипептидом (Huang (2010) Eur J Pharm Biopharm 74:435-41). С этой целью все гидрофобные боковые цепи в природном желатине были заменены гидрофильными остатками с получением 116-аминокислотного желатиноподобного белка (GLK), содержащего аминокислоты G, Р, Е, Q, N, S и К в различном порядке. G-CSF сшивали на его N-конце с 4 копиями такой GLK последовательности и секретировали в Pichia pastoris. Pichia pastoris оказался благоприятным организмом-продуцентом для слитых белков GLK; кроме того, остается определить, можно ли также продуцировать GLK в других организмах, поскольку известно, что рекомбинантные фрагменты желатина могут экспрессироваться только с низким выходом в Е. coli, например, как проиллюстрировано в Olsen (2003), Adv Drug Deliv Rev 55:1547-67.
Эластин является компонентом внеклеточного матрикса во многих тканях. Он образуется из растворимого предшественника тропоэластина, который состоит из гидрофильного Lys/Ala-богатого домена и гидрофобного эластомерного домена с повторяющейся последовательностью. Ферментативное перекрестное сшивание боковых цепей лизина внутри гидрофильного домена приводит к образованию нерастворимого эластина. Эластиноподобные полипептиды (ELPs) сконструированы искусственно, повторяющиеся аминокислотные последовательности получены из гидрофобного домена тропоэластина. Наиболее типичным повторяющимся мотивом последовательности ELPs является V-P-G-X-G, где "X" может представлять собой любую аминокислоту за исключением Pro (MacEwan (2010) Biopolymers 94:60-77; Kim (2010) Adv Drug Deliv Rev 62:1468-78). Подходящие ELPs могут быть подвергнуты слиянию с терапевтическими белками и синтезированы в Е. coli. Впоследствии способность ELPs к образованию гелеобразных депо после инъекции может значительно продлить период полувыведения присоединенного биопрепарата in vivo, хотя и по механизму, отличающемуся от других неструктурированных полипептидов. Однако присоединение ELP может препятствовать биологической активности партнера
слияния, как продемонстрировано для антагониста рецептора интерлейкина-1 в биологическом анализе IL-1-индуцированной пролиферации лимфоцитов (Shamji (2007) Arthritis Rheum. 11:3650-3661). Кроме того, ELPs подвергаются расщеплению эндогенными протеазами, такими как коллагеназа. Агрегированные белки, как правило, также более склонны к иммуногенности.
Следующие методы относятся к использованию полианионных полимеров. Например, полиглутамат (PG) был химически связан со слаборастворимыми цитотоксическими низкомолекулярными лекарственными средствами для лечения рака. Соответствующий препарат, предполагаемый Opaxio(tm), конъюгат лекарственного средства паклитаксел, в настоящее время находится вШ фазе клинических испытаний. Период полувыведения конъюгата PG-паклитаксела был продлен с показателем от 3 до 14 по сравнению с немодифицированным соединением (Singer (2005) J Control Release 109:120-6). Другие слитые белки, например, G-CSF, подвергнутый слиянию на N-конце с участком из 175 последовательных остатков Glu, или 1РЫ-альфа2, несущий на С-конце PG-хвост из 84 остатков, получали в растворимом состоянии в цитоплазме Е. coli (см. WO 2002/077036). Для эффективной трансляции N-концевое слияние требовало лидерного пептида, который впоследствии удаляли расщеплением протеазой вируса гравировки табака (TEV). Белки слияния полиглутамата с G-CSF и INFa2 показали биологическую активность в анализах на клеточной культуре. Однако до настоящего времени фармакокинетические данные для PG-слитых белков не были описаны. Кроме того, высокий отрицательный заряд PG-слитых белков является общим недостатком в отношении биомолекулярных взаимодействий (например, связывания рецептора-мишени или растворимого фактора) вследствие искусственных электростатических эффектов притяжения или отталкивания.
В WO 2006/081249 описана полипептидная последовательность с числом повторяющихся звеньев от примерно 2 до 500, из аминокислот в количестве от 3 до 6, где G, N или Q представляют собой основные составные части, тогда как минорными составными частями могут быть A, S, Т, D или Е. Этот аминокислотный состав позволяет интегрировать последовательности гликозилирования Asn-Xaa-Ser/Thr (где Хаа представляет собой любую аминокислоту за исключением Pro), для N-гликозилирования боковой цепи Asn в эукариотических экспрессионных системах. Увеличенный макромолекулярный
размер полученного слитого белка, включая посттрансляционную модификацию объемными сольватированными углеводными структурами, может продлить фармакокинетику этого генетически конъюгированного белка. Такие присоединения олигосахаридов ("гликоинженерия") в целом могут как снизить склонность к протеолизу, так и увеличить гидродинамический объем (Sinclair (2005) J Pharm Sci 94:1626-35). Недостатком является собственная молекулярная гетерогенность гликозилированной биомакромолекулы, которая требует дополнительных усилий в процессе биотехнологического производства и контроля качества.
В WO 2010/091122 (и WO 2007/103515) и статье Schellenberger (2009) Nat Biotechnol 27:1186-90 раскрыты неструктурированные неповторяющиеся аминокислотные полимеры, включающие и содержащие остатки Р, Е, S, Т, А и G. Данный набор аминокислот, который проявляет композицию, не сходную с повтором PSTAD, описанным выше, подвергали систематическому отбору на последовательности для получения сольватированного полипептида большого молекулярного размера, подходящего для биофармацевтической разработки, посредством устранения гидрофобных боковых цепей, в частности, F, I, L, М, V и W, которые могут вызывать агрегацию и опосредованный HLA/MHC-II иммунный ответ. Также исключали потенциально поперечно-сшиваемые остатки Cys, катионные аминокислоты К, R и Н, которые могли бы взаимодействовать с отрицательно заряженными клеточными мембранами, и амидные боковые цепи N и Q, которые потенциально склонны к гидролизу (см. Schellenberger (2009) цит. выше). Синтетические генные библиотеки, кодирующие не повторяющиеся последовательности, содержащие набор остатков PESTAG, которые были подвергнуты слиянию с зеленым флуоресцентным белком (GFP), подвергали отбору по уровню экспрессии в растворимом виде в Е. coli, и полученную в результате подгруппу исследовали далее на генетическую стабильность, растворимость белка, термостабильность, склонность к агрегации и профиль примесей. В конечном счете, 864-аминокислотную последовательность, содержащую 216 остатков Ser (25,0 моль%), 72 остатка Ala (8,3 моль%) и 144 аминокислоты (16,7 моль%), каждой из Pro, Thr, Glu и Gly, далее тестировали на слияние с агонистом рецептора GLP-1 эксендином-4 (E-XTEN) и несколькими другими биопрепаратами. Слитые белки, типично несущие домен связывания
целлюлозы, который впоследствии отщепляли, получали в растворимом состоянии в цитоплазме Е. coli и выделяли. Исследование E-XTEN посредством спектроскопии кругового дихроизма (CD) выявило отсутствие вторичной структуры, тогда как эксклюзионная хроматография (ЭХ) слитого белка показала существенно меньшее удерживание, чем ожидали для 84 кДа белка, демонстрируя, таким образом, увеличенный гидродинамический объем (Schellenberg (2009) цит. выше). Неупорядоченной структуре полипептида PESTAG и связанному с ней увеличению гидродинамического радиуса может способствовать электростатическое отталкивание между аминокислотами, несущими высокий общий отрицательный заряд, которые распределены по всей последовательности XTEN (см. WO 2010/091122). Однако в дополнительном исследовании Geething (2010) PLoS One 2010;5:е10175 продемонстрировано, что XTEN снижает эффективность своего терапевтического партнера слияния. В анализе на культуре клеток слияние глюкагона с XTEN проявляло только 15% биологической активности не модифицированного пептида. Даже более сильная потеря сродства к рецептору (17-кратное увеличение ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация)) была описана для слитого белка XTEN с гормоном роста человека (hGH); см. WO 2010/144502.
Глицин, как самую маленькую и структурно простейшую аминокислоту, также рассматривают как наиболее конформационно гибкую аминокислоту на теоретических основаниях; см., например, Schulz GE, Schirmer RH. Principles of Protein Structure. Springer, New York 1979. Кроме того, компьютерные моделирования показали, что у полимеров Gly отсутствует вторичная структура, и, вероятно, они образуют нерегулярную спираль в растворе, см. Shental-Bechor (2005) Biophys J 88:2391-402. С точки зрения химической перспективы полиглицин является линейным неразветвленным полиамидом, который проявляет определенное подобие полиэфиру ПЭГ, поскольку они оба являются по существу одномерными макромолекулами с множеством вращательных степеней свободы вдоль цепи, которая состоит из повторяющихся коротких углеводородных звеньев, которые регулярно прерваны водородными связываниями и в высокой степени сольватированными полярными группами. Следовательно, полиглицин должен составлять простейший генетически кодируемый миметик ПЭГ с перспективами
продления периода полувыведения из плазмы терапевтических белков. Данная концепция была использована в форме "гомоаминокислотного полимера (НАР)" или в виде глицин-богатой последовательности (GRS), соответственно; см. Schlapschy (2007) Protein Eng Des Sel 20:273-84; WO 2007/103515. Однако давно известно, что синтезированные химическим путем чистые полимеры Gly проявляют слабую растворимость в воде; см., среди прочего, в Bamford СН et al. Synthetic Polypeptides - Preparation, Structure, and Properties. Academic Press, New York 1956. Следовательно, были осуществлены различные попытки повысить гидрофильность, либо посредством введения водородсвязывающих спиртовых боковых цепей серина (WO 2007/103515, а также Schlapschy (2007) цит. выше), либо, в дополнение, отрицательно заряженных остатков глутамата (WO 2007/103515). Следует отметить, что пептидные спейсеры с композицией (Gly4Ser)n уже были описаны в данной области техники с целью сшивания доменов в слитых белках гибким способом. Значительно увеличенный гидродинамический объем был обнаружен для таких слитых белков в аналитической ЭХ. В случае варианта НАР из 200 остатков увеличение кажущегося размера составляло 120% по сравнению с несшитым Fab фрагментом, тогда как действительная масса была больше только на 29%, следовательно, проявляя эффект повышенного гидродинамического объема за счет сольватированной нерегулярной спиральной структуры полиглициновой метки. Кроме того, разностные CD спектры были характернымы для неупорядоченной вторичной структуры для группировки НАР. Наконец, конечный период полувыведения из плазмы Fab фрагмента, несущего НАР из 200 остатков, у мышей был продлен примерно с показателем 3. Этот эффект, хоть и является несильным, может быть пригоден для некоторых (специализированных) диагностических применений, таких как визуализация in vivo; см. Schlapschy (2007); цит. выше. К сожалению, получение слитых белков с более длинными повторяющимися последовательностями (Gly4Ser)n оказалось менее возможным за счет возрастающей склонности к образованию агрегатов, накладывая, таким образом, естественное ограничение на использование более или менее чистых полимеров глицина в качестве миметиков ПЭГ.
В WO 2008/155134 раскрыто, что последовательности с соответствующей смесью остатков Pro, Ala и Ser (то есть PAS) приводят к взаимному уничтожению их отчетливых предпочтений вторичной структуры и, таким
образом, приводят в результате к стабильному неупорядоченному полипептиду. Однако в WO 2008/155134 также документировано, что слитые белки с доменом, состоящим только из остатков серина и аланина (SA), то есть доменом, содержащим только два типа аминокислот, не образуют нерегулярную спираль, но вместо нее образуют складчатую структуру (3-слоя.
Химический синтез полипептидов хорошо известен и описан в уровне техники. Автором Izuka раскрыт химический синтез полипептидов, содержащих пролин (см. Izuka (1993), Bull. Chem. Soc. Jpn 66, 1269-1272). Эти сополимеры полипептидов содержат нерегулярные последовательности пролина и любого из глицина, L-аланина, L-a-аминомасляной кислоты (Abu), L-норвалина (Nva) или L-лейцина, соответственно, и их синтезируют посредством химической сополимеризации. Автором Izuka раскрыто, что такие сополимеры полипептидов, в основном, имеют определенную коллагеноподобную конформацию. Кроме того, в данной публикации описано, что сополимеры полипептидов пролина и аланина (или пролина и L-a-аминомасляной кислоты) частично растворимы в воде, тогда как другие сополимеры полипептидов были полностью нерастворимыми. В Izuka приведены рассуждения, что сополимеры полипептидов пролина/аланина могут иметь частично неупорядоченную конформацию. Izuka подчеркивает, что химически синтезированные полипептиды с нерегулярной последовательностью пролина/аланина встречаются преимущественно в коллагеноподобной конформации, то есть в структурированной конформации.
Таким образом, техническая задача, лежащая в основе настоящего изобретения, состоит в разработке больших полипептидов с достоверно нерегулярной спиральной конформацией. Эта техническая задача решена в результате разработки воплощений, охарактеризованных в формуле изобретения, и приведенных здесь.
Соответственно, изобретение относится к разработке и применению биосинтетического нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента, содержащего аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 50, в частности, по меньшей мере примерно из 100, в частности, по меньшей мере примерно из 150, в частности, по меньшей мере примерно из 200, в частности, по меньшей мере примерно из 250, в частности, по меньшей мере примерно из 300, в частности, по меньшей
мере примерно из 350, в частности, по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина и аланина. Таким образом, изобретение относится к разработке биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов или полипептидных сегментов, содержащих аминокислотную последовательность по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков, указанная аминокислотная последовательность состоит исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина и содержит по меньшей мере один пролин и по меньшей мере один аланин. В изобретении также предложен конъюгат лекарственного средства, содержащий (1) биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), и (2) лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из (а) биологически активного белка или полипептида, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую активность, и (Ь) низкомолекулярного лекарственного средства. Полипептиды с достоверно нерегулярной спиральной конформацией и полипептидные сегменты с достоверно нерегулярной спиральной конформацией, предложенные здесь, также полезны в контексте косметических применений, а также применений в пищевой промышленности и получении напитков. Большие полипептиды, предложенные здесь, которые проявляют достоверно нерегулярную спиральную конформацию, состоят только и исключительно из остатков пролина (Р, Pro) и аланина (A, Ala) и содержат более чем по меньшей мере 50 аминокислот, в частности, по меньшей мере примерно 100, в частности, по меньшей мере примерно 150, в частности, по меньшей мере примерно 200, в частности, по меньшей мере примерно 250, в частности, по меньшей мере примерно 300, в частности, по меньшей мере примерно 350, в частности, по меньшей мере примерно 400 аминокислотных остатков пролина и аланина. Обе аминокислоты, Р и А, должны быть представлены в предложенных здесь больших полипептидах с достоверно нерегулярной спиральной конформацией и полипептидных сегментах с достоверно нерегулярной спиральной конформацией. Здесь также предложены молекулы нуклеиновой кислоты,
которые кодируют раскрытые здесь биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды или полипептидные сегменты, а также конъюгаты лекарственных средств или пищевых продуктов, которые содержат указанные биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды или полипептидные сегменты и (ковалентно связанный) белок, представляющий интерес, такой как биологически активный белок.
Биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или биосинтетический нерегулярный спиральный полипептидный сегмент, описанный здесь, который используют в конъюгатах лекарственных средств или пищевых продуктов, предложенных здесь, и содержащий аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 50, по меньшей мере примерно из 100, по меньшей мере примерно из 150, по меньшей мере примерно из 200, по меньшей мере примерно из 250, по меньшей мере примерно из 300, по меньшей мере примерно из 350, по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина (Р) и аланина (А), предназначен для применения, среди прочего, в гетерологичном контексте, то есть в составе биологически активного гетерологичного белка, белковой конструкции, и/или в конъюгате лекарственного средства, содержащего указанный биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент и молекулы, полезные в фармацевтике или медицине, такие как малые молекулы, пептиды или биомакромолекулы, такие как белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липидные везикулы и тому подобное. Как проиллюстрировано в прилагаемых примерах, авторы изобретения смогли успешно разработать конъюгаты лекарственных средств, которые состоят из достоверно нерегулярных спиральных полипептидов, определенных здесь, и биологически активных белков или участков белков, а также конъюгаты лекарственных средств, которые состоят из малых молекул или низкомолекулярных лекарственных средств, которые содержат и/или сшиты с вышеописанными нерегулярными спиральными полипептидами, состоящими исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина (то есть из обеих аминокислот Р и А).
Соответственно, в настоящем изобретении предложен, среди прочего, биологически активный гетерологичный белок, содержащий по меньшей мере два домена, где (а) первый домен из указанных по меньшей мере двух доменов
содержит аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую биологическую активность; и (Ь) второй домен из указанных по меньшей мере двух доменов содержит биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, состоящий из аминокислотной последовательности, состоящей по меньшей мере примерно из 50, по меньшей мере примерно из 100, по меньшей мере примерно из 150, по меньшей мере примерно из 200, по меньшей мере примерно из 250, по меньшей мере примерно из 300, по меньшей мере примерно из 350, по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина и аланина. В соответствии с данным изобретением указанный "первый домен" и указанный "второй домен" не содержатся ни в природном (то есть встречающимся в природе) белке, ни в гипотетическом белке, который выведен из встречающихся в природе кодирующих последовательностей нуклеиновых кислот, таких как открытые рамки считывания и т.д.
Кроме того, в данном изобретении предложен конъюгат лекарственного средства, состоящий из биосинтетического нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента, содержащего аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 50, по меньшей мере примерно из 100, по меньшей мере примерно из 150, по меньшей мере примерно из 200, по меньшей мере примерно из 250, по меньшей мере примерно из 300, по меньшей мере примерно из 350, по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина и аланина, и фармацевтически, терапевтически полезной(ых) и/или полезной(ых) в медицине молекулы (молекул), такой(их) как малая(ые) молекула(ы), пептид(ы) или биомакромолекула(ы), такая(ие) как белок (белки), нуклеиновая(ые) кислота(ы), углевод(ы), липидная(ые) везикула(ы) и тому подобное, которая(ые) конъюгирована(ы) с указанным биосинтетическим нерегулярным спиральным полипептидом или полипептидным сегментом. Опять же, следует отметить, что термин "биологически активный" в контексте конъюгатов, раскрытых здесь, не ограничен чистыми биологическими молекулами, но также включает активные с медицинской точки зрения, терапевтически активные, фармацевтически активные молекулы и тому подобное. Специалисту в данной области техники очевидно, что средства и способы, предложенные здесь, не ограничены фармацевтическими и медицинскими применениями, но могут быть применены
в широком выборе технологий, включающих, но не ограниченных ими, косметические, пищевые технологии, технологии напитков и пищевых добавок, нефтяную промышленность, бумажную промышленность и тому подобное.
В противоположность химически синтезированным сополимерам полипептидов (таким как в Izuka, цит. выше), нерегулярные спиральные полипептиды, предложенные здесь, получают биосинтетическим путем. Термин "биосинтетический", употребляемый здесь, относится к синтезу биотехнологическими способами (в противоположность химическому синтезу). Такие биотехнологические способы хорошо известны в данной области техники, а также описаны здесь ниже. Биосинтез нерегулярных спиральных полипептидов по настоящему изобретению позволяет получать полипептиды с определенной последовательностью остатков пролина и аланина, определенной длиной и/или определенным соотношением остатков пролина и аланина. Кроме того, полипептиды, полученные в соответствии с настоящим изобретением, являются по существу чистыми, то есть полученные полипептиды являются по существу однородными и обладают вышеописанными характеристиками (то есть определенной последовательностью, определенной длиной и/или определенным соотношением аминокислот). Нерегулярные спиральные полипептиды, состоящие по меньшей мере примерно из 50, в частности, по меньшей мере примерно из 100, в частности, по меньшей мере примерно из 150, в частности, по меньшей мере примерно из 200, в частности, по меньшей мере примерно из 250, в частности, по меньшей мере примерно из 300, в частности, по меньшей мере примерно из 350, в частности, по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина и аланина, в соответствии с данным изобретением содержатся, например, в биологически активных, гетерологичных полипептидах/полипептидных конструкциях и/или в конъюгатах лекарственных средств или пищевых продуктов, а также в других конъюгатах, полезных в других отраслях промышленности, таких как, бумажная промышленность, нефтяная промышленность и тому подобное, но не ограниченных ими.
В целом вышеописанные признаки полипептидов по настоящему изобретению дают возможность образования стабильной нерегулярной спирали из полипептидов, и эти нерегулярные спиральные полипептиды обладают удивительными и предпочтительными свойствами. Например,
полипептиды по настоящему изобретению полностью растворимы в водном растворе и имеют увеличенный гидродинамический объем. Неожиданно, нерегулярные спиральные полипептиды, определенные здесь, также способны придавать повышенную стабильность in vivo/in vitro. Это особенно важно для медицинских применений, например, для биологически активных белков или конъюгатов лекарственных средств, содержащих нерегулярный спиральный полипептид по данному изобретению. Однако многочисленные предпочтительные свойства нерегулярных спиральных полипептидов по настоящему изобретению дают возможность применять их не только в области медицины, но также в других областях, например, в косметических средствах/косметических обработках, или в областях технологии продуктов питания и пищевых добавок, таких как молочная промышленность, или в обработке мяса. Примерами конъюгатов, полезных в пищевой промышленности и тому подобном, являются конъюгаты, которые содержат раскрытый здесь нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, и соединений, полезных в этих технологиях, таких как, например, полимеры полиоксипропилен или полиоксиэтилен, которые являются неионными поверхностно-активными веществами, используемыми в качестве эмульгаторов. Здесь также предусмотрено применение биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, определенного здесь, в биохимических способах и в технических процессах, таких как изготовление бумаги, добыча нефти и тому подобное. Удивительные и предпочтительные характеристики биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов, состоящих только из остатков пролина и аланина, предложенных здесь (а также раскрытых здесь конъюгатов и конструкций, таких как конъюгаты/конструкции лекарственных средств или пищевых продуктов, содержащие указанные биосинтетические, достоверно нерегулярные спиральные полипептиды), более подробно описаны ниже. Кроме того, иллюстративные применения, а также средства и способы, в которых используют эти биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды по изобретению, приведены ниже. Здесь также предложены средства и способы получения таких биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов, а также биологически активных, гетерологичных
полипептидов или полипептидных конструкций и раскрытых здесь конъюгатов и конструкций, таких как конъюгаты лекарственных средств, содержащих указанные нерегулярные спиральные полипептиды.
В контексте данного изобретения неожиданно обнаружено, что полимеры/полипептиды пролина-аланина с однородной композицией образуют стабильную нерегулярную спиральную конформацию. Это также продемонстрировано в прилагаемых примерах, где нерегулярная спиральная структура биосинтетических (со)полимеров/полипептидов пролина/аланина подтверждена спектроскопией кругового дихроизма (CD). Получение и применение таких биосинтетических, достоверно нерегулярных спиральных полипептидов/полимеров было неожиданным, поскольку установленный способ Чоу-Фасмана (Chou and Fasman (1974), Biochemistry 13, 223-245) предсказывает 100%-а-спиральную вторичную структуру полимеров/полипептидов (или их сегментов), состоящих из пролина и аланина, как показано на фиг. 7. Однако здесь было неожиданно обнаружено и показано экспериментально, что полимеры/полипептиды пролина-аланина с однородной композицией образуют стабильную нерегулярную спиральную конформацию. Это также продемонстрировано в прилагаемых примерах, где нерегулярная спиральная структура (со)полимеров/полипептидов пролина/аланина подтверждена экспериментальными методами, такими как спектроскопия кругового дихроизма (CD) и эксклюзионная хроматография (ЭХ).
В противоположность полипептидам/полимерам по настоящему изобретению, химически синтезированные полипептиды, описанные, например, в Izuka (1993), цит. выше, обладают произвольной/неопределенной и случайной последовательностью и различной длиной. Таким образом, химически синтезированные полипептиды содержат смесь полностью различных пептидов с различными соотношениями пролина/аланина, длинами и так далее. Как упомянуто в Izuka, химически синтезированные полипептиды такой смеси не образуют (или образуют только частично) нерегулярную спираль, и, соответственно, не обладают никакими предпочтительными свойствами биосинтетических полипептидов, предложенных и описанных здесь ниже. Соответственно, настоящее изобретение включает композиции и относится к композициям, содержащим биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды/полимеры по изобретению, раскрытые здесь, где указанные
биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды/полимеры определены, среди прочего, их последовательностью, содержащей исключительно остатки пролина и аланина. В одном конкретном воплощении настоящее изобретение относится к конъюгатам, таким как конъюгаты лекарственных средств или пищевых продуктов, содержащим в качестве одной составной части эти нерегулярные спиральные полипептиды/полимеры, раскрытые здесь. Эти биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды/полимеры по изобретению, содержащиеся в указанных композициях, в одном воплощении имеют однородную длину.
Как упомянуто выше, биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды (или нерегулярные спиральные полипептидные сегменты) по данному изобретению, состоящие исключительно из остатков пролина и аланина, неожиданно образуют стабильную нерегулярную спиральную конформацию. Термин "нерегулярная спиральная", употребляемый здесь, относится в целом к любой конформации полимерной молекулы, включая аминокислотные полимеры/аминокислотные последовательности/полипептиды, в которых индивидуальные мономерные элементы, образующие указанную полимерную структуру, по существу беспорядочно ориентированы по направлению к соседним мономерным элементам, при этом оставаясь химически связанными с указанными соседними мономерными элементами. В частности, полипептид, аминокислотная последовательность или аминокислотный полимер, который принимает/имеет/образует "нерегулярную спиральную конформацию", по существу не обладает определенной вторичной и третичной структурой. В контексте полипептидов по настоящему изобретению мономерные элементы, образующие полимерную структуру (то есть полипептид/аминокислотную последовательность), представляют собой либо отдельные аминокислоты, такие как пролин и аланин сами по себе, либо пептидные участки, такие как "аминокислотные повторы"/"аминокислотные кассеты"/"кассетные повторы"/"строительные блоки"/"модули" (или их фрагменты), которые описаны и определены ниже.
Природа полипептидных нерегулярных спиралей и способы их экспериментальной идентификации известны специалистам в данной области техники и были описаны в научной литературе (Cantor (1980) Biophysical Chemistry, 2nd ed., W. H. Freeman and Company, New York; Creighton (1993)
Proteins - Structures and Molecular Properties, 2nd ed., W. H. Freeman and Company, New York; Smith (1996) Fold Des 1:R95-R106). Термин "сегмент", употребляемый здесь, относится к части определенного здесь биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, где такая часть может представлять собой внутреннюю часть биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, описанного здесь. Такой "сегмент" может представлять собой, например, биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид, определенный здесь, где одна (или более чем одна) аминокислота удалена, например, с начала и/или с конца полипептида по изобретению. Кроме того, такой "сегмент" можно использовать как часть, либо он может составлять часть белка большего размера или полипептида, например, белка, подвергнутого слиянию с биологически активным белком. Такой "слитый белок" также будет являться примером гетерологичного, биологически активного полипептида/белка/полипептидной конструкции по настоящему изобретению. Термин "гетерологичный", употребляемый здесь, определен здесь ниже.
Нерегулярный спиральный полипептид (или его нерегулярный спиральный сегмент), который предложен в настоящем изобретении, и который предназначен для применения в контексте данного изобретения, принимает/образует нерегулярную спиральную конформацию, например, в водном растворе или в физиологических условиях. Термин "физиологические условия" известен в данной области техники и относится к тем условиям, в которых белки обычно принимают их нативную, складчатую конформацию. Более конкретно термин "физиологические условия" относится к биофизическим параметрам, которые типично действительны для высших форм жизни, и, в частности, для млекопитающих, наиболее предпочтительно людей. Термин "физиологические условия" может относиться к биохимическим и биофизическим параметрам, которые в норме обнаруживают в организме (в частности, в жидкостях организма) млекопитающих и, в частности, у людей. Указанные "физиологические условия" могут относиться как к соответствующим параметрам, обнаруживаемым в здоровом организме, так и к параметрам, обнаруживаемым при болезненных состояниях или у пациентов-людей. Например, больной пациент, представляющий собой млекопитающее или человека, может иметь более высокое, однако, "физиологическое"
состояние температуры, когда указанное млекопитающее или человек страдает лихорадкой. В отношении "физиологических условий", при которых белки принимают их нативную конформацию/состояние, важнейшими параметрами являются температура (37°С для человеческого организма), рН (7,35 - 7,45 для крови человека), осмолярность (280 - 300 ммоль/кг НгО) и при необходимости содержание белка (66 - 85 г/л сыворотки). Однако специалист в данной области техники осознает, что в физиологических условиях эти параметры могут варьировать, например, температура, рН, осмолярность и содержание белка могут быть различными в данном организме или тканевых жидкостях, таких как кровь, спинномозговая жидкость, перитонеальная жидкость и лимфа (Klinke (2005) Physiologie, 5th ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart). Например, в спинномозговой жидкости осмолярность может составлять около 290 ммоль/кг Н2О, и концентрация белка может составлять от 0,15 г/л до 0,45 г/л, тогда как в лимфе рН может составлять около 7,4, и содержание белка может составлять от 3 г/л до 5 г/л. При определении, принимает ли/образует ли полипептид (или его сегмент)/аминокислотная последовательность нерегулярную спиральную конформацию в экспериментальных условиях, применяя способы, описанные здесь ниже, биофизические параметры, такие как температура, рН, осмолярность и содержание белка, могут отличаться от физиологических условий, в норме обнаруживаемых in vivo. Температуры от 1°С до 42°С или предпочтительно от 4°С до 25°С можно считать пригодными для тестирования и/или проверки биофизических свойств и биологической активности белка в физиологических условиях in vitro.
Некоторые буферы, в частности, в экспериментальных установках
(например, при определении структур белков, в частности, в измерениях CD и
других способах, которые позволяют специалисту в данной области техники
определить структурные свойства белка/аминокислотного участка), либо
буферы, растворители и/или эксципиенты для фармацевтических композиций
рассматривают представляющими собой "физиологические
растворы"/"физиологические условия" in vitro. Примерами таких буферов являются, например, фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ: 115 мМ NaCI, 4 мМ КН2РО4, 16 мМ Na2HP04, рН 7,4), Трис буферы, ацетатные буферы, цитратные буферы или сходные с ними, такие как использованные в прилагаемых примерах. Обычно рН буфера, представляющего собой "условия
физиологического раствора", должен находиться в диапазоне от 6,5 до 8,5, предпочтительно в диапазоне от 7,0 до 8,0, наиболее предпочтительно в диапазоне от 7,2 до 7,7, а осмолярность должна находиться в диапазоне от 10 до 1000 ммоль/кг НгО, более предпочтительно в диапазоне от 50 до 500 ммоль/кг Н2О и наиболее предпочтительно в диапазоне от 200 до 350 ммоль/кг Н2О. Возможно, содержание белка буфера, представляющего собой условия физиологического раствора, может находиться в диапазоне от 0 до 100 г/л, не учитывая сам белок с биологической активностью, в соответствии с чем можно использовать типичные стабилизирующие белки, например, человеческий или бычий сывороточный альбумин.
Здесь было обнаружено, что полипептиды (или их сегменты) образуют нерегулярную спиральную конформацию не только в физиологических условиях, но, более типично, в водном растворе. Термин "водный раствор" хорошо известен в данной области техники. "Водный раствор" может представлять собой раствор с содержанием воды (Н2О) по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80% или по меньшей мере примерно 90% Н2О (масс/масс). Соответственно, полипептид (или его сегмент) по настоящему изобретению может образовать нерегулярную спиральную конформацию в водном растворе, возможно, содержащем другие смешиваемые растворители, или в водных дисперсиях при более широком диапазоне температур, значений рН, осмолярности или содержания белка. Это особенно важно для применений нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента) помимо лекарственной терапии или диагностики in vivo, например, в технологии косметических средств, пищевых добавок или пищевых продуктов.
Соответственно, в контексте данного изобретения также рассмотрено, что нерегулярная спиральная конформация биосинтетического полипептида пролина/аланина (или его сегмента) по настоящему изобретению сохраняется и/или используется в контексте фармацевтических композиций, таких как жидкие фармацевтические препараты/биопрепараты или лиофилизированные фармацевтические композиции. Это особенно важно в контексте предложенных здесь биологически активных, гетерологичных белков или конъюгатов
лекарственных средств, содержащих, среди прочего, нерегулярный спиральный полипептид (или полипептидный сегмент) по изобретению. Предпочтительно, "физиологические условия" следует использовать в соответствующих буферных системах, растворителях и/или эксципиентах. Однако, например, в лиофилизированных или высушенных композициях (таких как, например, фармацевтические композиции/биопрепараты) рассмотрено, что нерегулярная спиральная конформация предложенного здесь нерегулярного спирального полипептида (или полипептидного сегмента) временно не присутствует и/или не может быть обнаружена. Однако указанный нерегулярный спиральный полипептид (или полипептидный сегмент) снова примет/образует свою нерегулярную спираль после восстановления в соответствующих буферах/растворах/эксципиентах/растворителях или после введения в организм. Способы определения, образует ли/принимает ли полипептид (или его сегмент) нерегулярную спиральную конформацию, известны в данной области техники (Cantor (1980) цит. выше; Creighton (1993) цит. выше; Smith (1996) цит. выше). Такие способы включают спектроскопию кругового дихроизма (CD), пример которой приведен здесь ниже. CD-спектроскопия представляет собой способ спектроскопии поглощения света, при котором измеряют разницу поглощения веществом лево- и право-циркулярно поляризованного света. Вторичную структуру белка можно определить посредством CD-спектроскопии, применяя дальние ультрафиолетовые области спектра с длиной волны примерно от 190 до 250 нм. При этих длинах волн можно анализировать различные вторичные структуры, обычно обнаруживаемые в полипептидах, поскольку и а-спираль, и параллельный и антипараллельный складчатый (3-слой, и нерегулярная спиральная конформация дают характерную форму и величину CD спектра. Соответственно, посредством применения CD-спектрометрии специалист в данной области техники способен легко определить, образует ли/принимает ли полипептид (или его сегмент) нерегулярную спиральную конформацию в водном растворе или в физиологических условиях. Другие установленные биофизические способы включают ядерную магнитно-резонансную (ЯМР) спектроскопию, абсорбционную спектроскопию, инфракрасную и рамановскую спектроскопию, измерение гидродинамического объема посредством эксклюзионной хроматографии, аналитического ультрацентрифугирования или
динамического/статического светорассеяния, а также измерения коэффициента трения или внутренней вязкости (Cantor (1980) цит. выше; Creighton (1993) цит. выше; Smith (1996) цит. выше).
В дополнение к вышеописанным экспериментальным способам были описаны теоретические способы предсказания вторичных структур в белках. Одним из примеров такого теоретического способа является способ Чоу-Фасмана (Chou and Fasman, цит. выше), который основан на анализе относительных частот каждой аминокислоты в а-спиралях, складчатых (3-слоях и поворотах на основе известных белковых структур, раскрытых, например, посредством рентгенокристаллографии. Однако известно, что теоретическое предсказание вторичной структуры белка ненадежно. Как приведено в примере здесь ниже, для аминокислотных последовательностей, для которых ожидают, что они принимают а-спиральную вторичную структуру согласно способу Чоу-Фасмана, было экспериментально обнаружено, что они образуют нерегулярную спираль. Соответственно, теоретические способы, такие как алгоритм Чоу-Фасмана, могут иметь только ограниченное предсказательное значение для определения, принимает ли данный полипептид нерегулярную спиральную конформацию, как проиллюстрировано также в прилагаемых примерах и графических материалах. Тем не менее, вышеописанное теоретическое предсказание часто является первоочередным подходом при оценке предполагаемой вторичной структуры данного полипептида/аминокислотной последовательности. Теоретическое предсказание нерегулярной спиральной структуры также часто указывает на то, что проверка вышеописанными экспериментальными способами, действительно ли данный полипептид/аминокислотная последовательность имеет нерегулярную спиральную конформацию, может быть целесообразной.
Гомополимеры большинства аминокислот, в частности гидрофобных аминокислот, обычно нерастворимы в водном растворе (Bamford (1956) Synthetic Polypeptides - Preparation, Structure, and Properties, 2nd ed., Academic Press, New York). Известно, что гомополимеры некоторых гидрофильных аминокислот образуют вторичные структуры, например, а-спираль в случае Ala (Shental-Bechor (2005) Biophys J 88:2391-2402) и складчатый (3-слой в случае Ser (Quadrifoglio (1968) J Am Chem Soc 90:2760-2765), тогда как полипролин, самый жесткий гомоолигопептид (Schimmel (1967) Proc Natl Acad Sci USA 58:52
59), образует спираль транс-формы типа II в водном растворе (Cowan (1955) Nature 176:501-503).
Применяя теоретические принципы биофизики полимеров, диаметр цепи нерегулярной спирали из 200 аминокислотных остатков составит в случае полиглицина, например, до примерно 75А, вычисленный как среднее квадратическое значение расстояния от одного до другого конца
равно 200 вращающихся связей длины I, равной 3,8 А
для каждого расстояния Са-Са, и "характеристическое отношение" С-приблизительно равно 2,0 для полису) (Brant (1967) J Mol Biol 23:47-65; Creighton, (1993) цит. выше). Это отношение показывает, что специалист в данной области техники ожидает, что гидродинамический объем нерегулярной цепи аминокислотного полимера может быть увеличен либо посредством (а) использования большей длины цепи, I, либо посредством (Ь) использования аминокислот, которые проявляют большее характеристическое отношение, С~. С- является мерой для свойственной жесткости молекулярной нерегулярной цепи и имеет общее значение 9 для большинства аминокислот (Brant (1967) цит. выше). Только Gly, у которого отсутствует боковая цепь, а также иминокислота Pro проявляют значительно меньшие значения. Следовательно, ожидают, что Gly и Pro (в денатурирующих условиях) вносят вклад в уменьшение размеров нерегулярных спиральных белков (Miller (1968) Biochemistry 7:3925-3935). Соответственно, ожидают, что аминокислотные последовательности, содержащие остатки пролина, имеют относительно компактный гидродинамический объем. В противоположность этой теории, однако, здесь показано, что гидродинамический объем аминокислотных полимеров/полипептидов по изобретению, которые содержат смесь остатков пролина и аланина, имеют резко увеличенный гидродинамический объем, как определено посредством аналитической гельпроникающей/эксклюзионной хроматографии, по сравнению с ожидаемым гидродинамическим объемом. Действительно, неожиданно, что полипептиды, содержащие смеси этих двух аминокислот (пролина и аланина), каждая из которых отдельно склонна к образованию гомоолигопептида с определенной вторичной структурой, принимают нерегулярную спиральную конформацию в физиологических условиях. Такие полипептиды пролина/аланина по изобретению имеют
больший гидродинамический радиус, чем гомополимеры, содержащие то же число, например, остатков Gly, и они придают лучшую растворимость биологически активным белкам или конструкциям, то есть биологически активным гетерологичным белкам или конъюгатам лекарственных средств, в соответствии с изобретением.
Как упомянуто выше, биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды пролина/аланина по настоящему изобретению отличаются от химически синтезированных полипептидов тем, что они могут принимать определенную однородную длину за счет простых средств и способов. Если на предшествующем уровне техники предложены смеси/композиции полипептидов с огромным количеством вариантов в отношении длины пептидов, настоящее изобретение может обеспечить смеси/композиции биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов с определенной длиной. Предпочтительно по существу все полипептиды по изобретению, содержащиеся в такой смеси/композиции, имеют одинаковую определенную длину, и, следовательно, обладают одинаковыми биохимическими характеристиками. Такая однородная композиция более предпочтительна в различных медицинских, косметических применениях, в пищевых добавках, где можно использовать биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды. Кроме того, в частности, в медицинском или фармацевтическом контексте, определенный здесь биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере примерно из 50, в частности, по меньшей мере примерно из 100, в частности, по меньшей мере примерно из 150, в частности, по меньшей мере примерно из 200, в частности, по меньшей мере примерно из 250, в частности, по меньшей мере примерно из 300, в частности, по меньшей мере примерно из 350, в частности, по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина и аланина, можно также применять в предупреждении, облегчении и/или лечении расстройств, обусловленных и/или связанных с нарушенным состоянием плазмы крови, например, после повреждений, ожогов, операции и тому подобного. Одним из медицинских применений указанных биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов или полипептидных сегментов является, соответственно, применение в качестве плазмозаменителя. Однако следует
отметить, что в соответствии с данным изобретением также описанные здесь конъюгаты лекарственных средств и гетерологичные полипептиды или гетерологичные полипептидные конструкции можно применять в контексте медицинского или фармацевтического вмешательства в расстройство, обусловленное нарушенным количеством плазмы крови или содержанием плазмы крови, или в расстройство, обусловленное нарушенным объемом крови.
Соответственно, настоящее изобретение относится в одном воплощении к биосинтетическому нерегулярному полипептиду (или его сегменту), который содержит аминокислотную последовательность, состоящую исключительно по меньшей мере примерно из 50 аминокислотных остатков пролина и аланина, по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков пролина и аланина, по меньшей мере примерно из 150 аминокислотных остатков пролина и аланина или по меньшей мере примерно из 200 остатков пролина и аланина, в частности, когда он содержится в гетерологичном белке/полипептиде/полипептидной конструкции или в конъюгате лекарственного средства. Настоящее изобретение также относится к биосинтетическим нерегулярным спиральным полипептидам, которые содержат аминокислотную последовательность, состоящую исключительно по меньшей мере примерно из 200 аминокислотных остатков пролина и аланина, даже более предпочтительно по меньшей мере примерно из 300 аминокислотных остатков пролина и аланина, особенно предпочтительно по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина и аланина, более конкретно предпочтительно по меньшей мере примерно из 500 аминокислотных остатков пролина и аланина и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно из 600 аминокислотных остатков пролина и аланина. Аминокислотная последовательность, образующая нерегулярную спиральную конформацию, может состоять из максимально примерно 3000 аминокислотных остатков пролина и аланина, из максимально примерно 2000 аминокислотных остатков пролина и аланина, из максимально примерно 1500 аминокислотных остатков пролина и аланина, из максимально примерно 1200 аминокислотных остатков пролина и аланина, из максимально примерно 800 аминокислотных остатков пролина и аланина. Соответственно, участок аминокислотной последовательности пролина/аланина может состоять примерно из 50,
примерно из 100, примерно из 150, примерно из 200, примерно из 250, примерно из 300, примерно из 350, примерно из 400, примерно из 500, примерно из 600, примерно из 700, примерно из 800, из примерно от 900 до примерно 3000 аминокислотных остатков пролина и аланина. В некоторых воплощениях биосинтетическая аминокислотная последовательность по изобретению содержит от примерно 200 до примерно 3000 остатков пролина и аланина, от примерно 200 до примерно 2500 остатков пролина и аланина, от примерно 200 до примерно 2000 остатков пролина и аланина, от примерно 200 до примерно 1500 остатков пролина и аланина, от примерно 200 до примерно 1000 остатков пролина и аланина, от примерно 300 до примерно 3000 остатков пролина и аланина, от примерно 300 до примерно 2500 остатков пролина и аланина, от примерно 300 до примерно 2000 остатков пролина и аланина, от примерно 300 до примерно 1500 остатков пролина и аланина, от примерно 300 до примерно 1000 остатков пролина и аланина, от примерно 400 до примерно 3000 остатков пролина и аланина, от примерно 400 до примерно 2500 остатков пролина и аланина, от примерно 400 до примерно 2000 остатков пролина и аланина, от примерно 400 до примерно 1500 остатков пролина и аланина, от примерно 400 до примерно 1000 остатков пролина и аланина, от примерно 500 до примерно 3000 остатков пролина и аланина, от примерно 500 до примерно 2500 остатков пролина и аланина, от примерно 500 до примерно 2000 остатков пролина и аланина, от примерно 500 до примерно 1500 остатков пролина и аланина, от примерно 500 до примерно 1000 остатков пролина и аланинал от примерно 600 до примерно 3000 остатков пролина и аланина, от примерно 600 до примерно 2500 остатков пролина и аланина, от примерно 600 до примерно 2000 остатков пролина и аланина, от примерно 600 до примерно 1500 остатков пролина и аланина, от примерно 600 до примерно 1000 остатков пролина и аланина, от примерно 700 до примерно 3000 остатков пролина и аланина, от примерно 700 до примерно 2500 остатков пролина и аланина, от примерно 700 до примерно 2000 остатков пролина и аланина, от примерно 700 до примерно 1500 остатков пролина и аланина, от примерно 700 до примерно 1000 остатков пролина и аланина, от примерно 800 до примерно 3000 остатков пролина и аланина, от примерно 800 до примерно 2500 остатков пролина и аланина, от примерно 800 до примерно 2000 остатков пролина и аланина, от примерно 800 до примерно 1500 остатков пролина и аланина, от примерно 800 до примерно
1000 остатков пролина и аланина. Как очевидно из содержания данного изобретения, биосинтетические аминокислотные последовательности большего размера (состоящие по существу из пролина и аланина) также находятся в объеме данного изобретения, и их можно легко использовать в определенных здесь биологически активных белках или белковых конструкциях, которые содержат в качестве одного домена из по меньшей мере двух доменов аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую указанную биологическую активность, и в качестве другого домена из по меньшей мере двух доменов биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, состоящий по меньшей мере примерно из 50 аминокислотных остатков пролина и аланина, по меньшей мере примерно из 100 аминокислотных остатков пролина и аланина, по меньшей мере примерно из 150 аминокислотных остатков пролина и аланина, по меньшей мере примерно из 200, по меньшей мере примерно из 250, по меньшей мере примерно из 300, по меньшей мере примерно из 350, по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина и аланина. Такой биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент соответствует биосинтетическому нерегулярному спиральному участку гетерологичного белка/белковой конструкции. Эти биосинтетические участки пролина/аланина состоят максимально примерно из 3000 аминокислотных остатков пролина и аланина. Эти аминокислотные последовательности (участки пролина/аланина) содержат пролин и аланин в качестве основных или уникальных остатков, как объяснено ниже.
Рассмотрено, что определенная здесь биосинтетическая аминокислотная
последовательность, состоящая исключительно из аминокислотных остатков
пролина (Р) и аланина (А), которая образует/принимает/имеет нерегулярную
спиральную конформацию. В простейшем случае биосинтетический полипептид
или полипептидный сегмент состоит из аминокислотной последовательности,
имеющей нерегулярную спиральную конформацию, определенную здесь.
Однако биосинтетический полипептид (или его сегмент) может, в дополнение к
описанной здесь аминокислотной последовательности,
образующей/принимающей/имеющей нерегулярную спиральную конформацию,
содержать дополнительные аминокислотные
последовательности/аминокислотные остатки, которые не вносят вклад в
образование нерегулярной спиральной конформации, или которые сами по себе не способны образовать/принимать/иметь нерегулярную спиральную конформацию. Без отклонения от сущности изобретения такие биосинтетические полипептиды (или их сегменты) также являются биосинтетическими "нерегулярными спиральными" полипептидами или полипептидными сегментами. Дополнительные аминокислотные последовательности/аминокислотные остатки могут быть, например, полезны в качестве линкеров. Среди прочего, димеры, тримеры, то есть в общем мультимеры биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, также рассмотрены в контексте настоящего изобретения, и такие мультимеры могут быть связаны аминокислотными последовательностями/остатками, которые не образуют нерегулярную спиральную конформацию. Примером белка, который может содержать такой нерегулярный спиральный полипептид, является предложенный здесь биологически активный белок, который может, в дополнение к нерегулярному спиральному полипептиду, состоящему из аминокислотных остатков пролина и аланина, определенного здесь, дополнительно содержать другой полипептид, имеющий/опосредующий биологическую активность. Опять же, такая конструкция может представлять собой гетерологичный, биологически активный белок или полипептидную конструкцию, описанную здесь.
Термин "по меньшей мере примерно
50/100/150/200/300/400/500/600/700/800/и т.д. аминокислотных остатков" не ограничен конкретным числом аминокислотных остатков, но также включает участки аминокислот, которые содержат либо дополнительно примерно 1-20%, как, например, от 10% до 20% остатков, либо примерно на 1-20%, как, например, примерно на 10%-20% меньше остатков. Например, "по меньшей мере примерно 100 аминокислотных остатков" может также включать примерно от 80 до 100 и примерно от 100 до 120 аминокислотных остатков без отклонения от сущности настоящего изобретения. Например, "по меньшей мере примерно 200 аминокислотных остатков" может также включать примерно от 160 до 200 и примерно от 200 до 240 аминокислотных остатков без отклонения от сущности данного изобретения. Определение и пояснения, приведенные выше, также применимы, с соответствующими изменениями, к термину "максимально примерно 3000/2000/1500/1200/800 аминокислотных
остатков" и т.д. Соответственно, термин "примерно" не ограничен конкретным числом аминокислотных остатков в контексте более длинных аминокислотных последовательностей (например, аминокислотных последовательностей, содержащих или состоящих из максимально 3000 аминокислотных остатков). Таким образом, термин "максимально примерно 3000/2000/1500/1200/800 аминокислотных остатков" может также включать участки аминокислот, которые содержат дополнительно от 10% до 20% или на 10%-20% меньше остатков без отклонения от сущности данного изобретения.
Кроме того, биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды (или их сегменты) характеризуются определенным содержанием или соотношением аминокислотных остатков, в частности, основных составляющих пролина и аланина. Как упомянуто выше, настоящее изобретение относится к биосинтетическому нерегулярному спиральному полипептиду или полипептидному сегменту, содержащему аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере примерно из 50, по меньшей мере примерно из 100, по меньшей мере примерно из 150, по меньшей мере примерно из 200, по меньшей мере примерно из 250, по меньшей мере примерно из 300, по меньшей мере примерно из 350, по меньшей мере примерно из 400 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), в частности, когда он содержится в гетерологичном биологически активном белке/белковой конструкции/полипептиде или конъюгате лекарственного средства. Термин "исключительно", употребляемый здесь, означает, что предпочтительно по меньшей мере примерно 90% или по меньшей мере примерно 95% аминокислот представляет собой пролин и аланин, где пролин и аланин составляют большинство, но могут быть не единственными аминокислотными остатками, то есть, эти аминокислотные последовательности по изобретению не обязательно являются аминокислотными участками на 100% пролина и аланина. Следовательно, биосинтетические полипептиды/аминокислотные последовательности по настоящему изобретению могут также содержать другие аминокислоты, отличные от пролина и аланина, в качестве минорных компонентов, если аминокислотная последовательность образует/принимает/имеет нерегулярную спиральную конформацию. Такую нерегулярную спиральную конформацию
можно легко определить предложенными здесь средствами и способами. Соответственно, в контекст термина "исключительно" может быть также включено минорное количество (менее чем примерно 10% или менее чем примерно 5%) других аминокислотных остатков. Указанные "другие" минорные аминокислотные остатки определены здесь ниже.
Соответственно, в одном воплощении настоящее изобретение относится к биосинтетическому нерегулярному спиральному полипептиду (или его сегменту), аминокислотная последовательность которого состоит, в основном, из пролина и аланина, и где остатки пролина составляют более чем примерно 10% и менее чем 75% аминокислотной последовательности. Остатки аланина составляют остальные по меньшей мере от 25% до 90% указанной аминокислотной последовательности (или нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента, если он состоит из этой аминокислотной последовательности).
Предпочтительно аминокислотная последовательность содержит более чем примерно 10%, предпочтительно более чем примерно 12%, даже более предпочтительно более чем примерно 14%, особенно предпочтительно более чем примерно 18%, более конкретно предпочтительно более чем примерно 20%, еще более конкретно предпочтительно более чем примерно 22%, 23% или 24% и наиболее предпочтительно более чем примерно 25% остатков пролина. Аминокислотная последовательность предпочтительно содержит менее чем примерно 75%, более предпочтительно менее чем 70%, 65%, 60%, 55% или 50% остатков пролина, где предпочтительны более низкие значения. Даже более предпочтительно аминокислотная последовательность содержит менее чем примерно 48%, 46%, 44%, 42% остатков пролина. Особенно предпочтительны аминокислотные последовательности, содержащие менее чем примерно 41%, 40%, 39%, 38%, 37% или 36% остатков пролина, где предпочтительны более низкие значения. Наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность содержит менее чем примерно 35% остатков пролина; см. также РА конструкции, приведенные здесь ниже.
Наоборот, аминокислотная последовательность предпочтительно содержит менее чем примерно 90%, более предпочтительно менее чем 88%, 86%, 84%, 82% или 80% остатков аланина, где предпочтительны более низкие значения. Даже более предпочтительно аминокислотная последовательность
содержит менее чем примерно 79%, 78%, 77%, 76% остатков аланина, где предпочтительны более низкие значения. Наиболее предпочтительно аминокислотная последовательность содержит менее чем примерно 75% остатков аланина.
В настоящей заявке также предпочтительна аминокислотная последовательность, содержащая более чем примерно 25%, предпочтительно более чем примерно 30%, даже более предпочтительно более чем примерно 35%, особенно предпочтительно более чем примерно 40%, более конкретно предпочтительно более чем примерно 45% или 50%, еще более конкретно предпочтительно более чем примерно 52%, 54%, 56%, 58% или 59% остатков аланина, где предпочтительны более высокие значения. Даже более предпочтительно аминокислотная последовательность содержит более чем примерно 60%, 61%, 62%, 63% или 64% остатков аланина, и наиболее предпочтительно более чем примерно 65% остатков аланина.
Соответственно, нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) может содержать аминокислотную последовательность, состоящую примерно из 25% остатков пролина и примерно 75% остатков аланина. Альтернативно нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) может содержать аминокислотную последовательность, состоящую примерно из 35% остатков пролина и примерно 65% остатков аланина. Термин "примерно Х%", употребляемый здесь выше, не ограничен конкретным числом процентов, но также включает значения дополнительно от 10% до 20% или на 10%-20% меньше остатков. Например, термин 10% может также относиться к 11% или 12% и к 9% и 8% соответственно.
Однако, как упомянуто выше и более подробно будет описано здесь ниже, указанный нерегулярный спиральный полипептид (или полипептидный сегмент) и, в частности, аминокислотная последовательность может также содержать дополнительные аминокислоты, отличающиеся от пролина и аланина, в качестве минорных составляющих. Как уже обсуждалось здесь выше, указанная(ые) минорная(ые) составляющая(ие), то есть аминокислота(ы) отличающаяся(иеся) от пролина или аланина, может(могут) составлять менее чем примерно 10%, менее чем примерно 9%, менее чем примерно 8%, менее чем примерно 7%, менее чем примерно 6%, менее чем примерно 5%, менее чем примерно 4%, менее чем примерно 4%, менее чем примерно 3% или менее
чем примерно 2% биосинтетического нерегулярного спирального полипептида/полимера по данному изобретению.
Специалисту очевидно, что аминокислотная
последовательность/полипептид (или его сегмент) может также образовать нерегулярную спиральную конформацию, когда другие остатки, отличающиеся от пролина и аланина, содержатся в качестве минорной составляющей в указанной аминокислотной последовательности/полипептиде (полипептидном сегменте). Термин "минорная составляющая", употребляемый здесь, означает, что максимально 5% или максимально 10% аминокислотных остатков отличаются от пролина или аланина в биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидах/полимерах по данному изобретению. Это означает, что максимально 10 из 100 аминокислот могут отличаться от пролина и аланина, предпочтительно максимально 8%, то есть максимально 8 из 100 аминокислот могут отличаться от пролина и аланина, более предпочтительно максимально 6%, то есть максимально 6 из 100 аминокислот могут отличаться от пролина и аланина, еще более предпочтительно максимально 5%, то есть максимально 5 из 100 аминокислот могут отличаться от пролина и аланина, особенно предпочтительно максимально 4%, то есть максимально 4 из 100 аминокислот могут отличаться от пролина и аланина, более конкретно предпочтительно максимально 3%, то есть максимально 3 из 100 аминокислот могут отличаться от пролина и аланина, даже более конкретно предпочтительно максимально 2%, то есть максимально 2 из 100 аминокислот могут отличаться от пролина и аланина, и наиболее предпочтительно максимально 1%, то есть максимально 1 из 100 аминокислот, которые содержатся в нерегулярном спиральном полипептиде (или его сегменте) могут отличаться от пролина и аланина. Указанные аминокислоты, отличающиеся от пролина и аланина, могут быть выбраны из группы, состоящей из Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Туг и Val, включая посттрансляционно модифицированные аминокислоты или неприродные аминокислоты (см., например, Budisa (2004) Angew Chem Int Ed Engl 43:64266463 или Young (2010) J Biol Chem 285:11039-11044). В случае, когда "минорная составляющая" (то есть другая аминокислота, отличающаяся от пролина и аланина) биосинтетического нерегулярного спирального полипептида/конструкции/полимера (или его фрагмента) включает Ser в
качестве "другой аминокислоты"/"отличающейся аминокислоты", указанная
аминокислота Ser/аминокислоты Ser составляют предпочтительно менее чем
50%, более предпочтительно менее чем 40%, менее чем 30%, менее чем 20%
или менее чем 10% этих (минорных) аминокислотных остатков. В наиболее
предпочтительном воплощении биосинтетический нерегулярный спиральный
полипептид/конструкция/полимер, описанный здесь, или часть нерегулярного
спирального полипептида, (например) слитого белка, описанного здесь, не
включает остаток (остатки) серина. Как правило, в данной заявке
предпочтительно, чтобы эти "минорные" аминокислоты (отличающиеся от
пролина и аланина) не присутствовали в предложенном здесь
биосинтетическом нерегулярном спиральном
полипептиде/конструкции/полимере, описанном здесь, или в части биосинтетического нерегулярного спирального полипептида (например) слитого белка. В соответствии с изобретением биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)/аминокислотная последовательность может, в частности, состоять исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина (то есть никакие другие аминокислотные остатки не присутствуют в нерегулярном спиральном полипептиде или в аминокислотной последовательности).
Если вышеописанное относится к общей длине и содержанию пролина/аланина в аминокислотной последовательности, содержащейся в нерегулярном спиральном полипептиде (или его сегменте), ниже описанное более подробно относится к конкретным иллюстративным аминокислотным последовательностям (или их фрагментам).
В одном воплощении аминокислотные последовательности/полипептиды, принимающие нерегулярную спиральную конформацию (нерегулярный спиральный полипептид или его сегмент, определенный здесь), например, в водном растворе или в физиологических условиях, могут содержать множество "аминокислотных повторов"/"аминокислотных кассет"/"кассетных повторов", где указанные "аминокислотные повторы"/"аминокислотные кассеты"/"кассетные повторы"/"строительные блоки"/"модули" (эти термины употребляются здесь взаимозаменяемо) большей частью или исключительно состоят из аминокислотных остатков пролина (Pro, Р) и аланина (Ala, А) (обозначенные здесь как "РА" или как "АР"), где не более чем 6
последовательных аминокислотных остатков являются идентичными.
Иллюстративным "строительным блоком" является, например, "АР", и это
также приведено в прилагаемых иллюстративных примерах как
функциональный биосинтетический нерегулярный спиральный домен по
настоящему изобретению. Таким иллюстративным примером является
последовательность "Р1А1", которая также представлена в форме
АРАРАРАРАРАРАРАРАРАР (SEQ ID NO: 51), то есть, "поли РА"
"аминокислотного повтора"/"аминокислотной кассеты"/"кассетного повтора".
В предпочтительном воплощении аминокислотная
последовательность/полипептид, содержащий определенные выше "аминокислотные повторы"/"аминокислотные кассеты"/"кассетные повторы" и тому подобное содержит не более чем 5 идентичных последовательных аминокислотных остатков. Другие альтернативные воплощения предложены здесь ниже в контексте иллюстративных, индивидуальных строительных блоков.
В пределах нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента) в соответствии с данным изобретением аминокислотные повторы могут быть идентичными или не идентичными. Не ограничивающие примеры "аминокислотных повторов", "строительных блоков", "модулей", "повторов", "аминокислотных кассет" и т.д., состоящих из остатков пролина и аланина, приведены здесь ниже; см., например, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 51 (Вложенный перечень последовательностей также включает иллюстративные последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют такие "повторы"/"модули" и т.д. Прилагаемые последовательности в указанном перечне последовательностей, которые поданы вместе с данной заявкой, составляют часть данной спецификации и описания). Здесь также рассмотрено применение (идентичных и/или не идентичных) фрагментов этих последовательностей, где "фрагмент" содержит по меньшей мере 2 аминокислоты и содержит по меньшей мере один пролин и/или аланин, предпочтительно по меньшей мере один пролин и один аланин. "Фрагменты" этих последовательностей для применения в соответствии с данным изобретением для создания нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента) могут состоять по меньшей мере из 3, предпочтительно по меньшей
мере из 4, более предпочтительно по меньшей мере из 5, даже более предпочтительно по меньшей мере из 6, еще более предпочтительно по меньшей мере из 8, особенно предпочтительно по меньшей мере из 10, более конкретно предпочтительно по меньшей мере из 12, даже более конкретно предпочтительно по меньшей мере из 14, еще более конкретно предпочтительно по меньшей мере из 16, и наиболее предпочтительно по меньшей мере из 18 последовательных аминокислот аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 51 (здесь следует отметить, что SEQ ID NO: 51 состоит из иллюстративного повтора "АР" или "РА").
На основании идей, приведенных здесь, специалист в данной области
техники способен легко создать дополнительные аминокислотные
последовательности/полипептиды, которые образуют нерегулярную
спиральную конформацию, например, в водных или в физиологических
условиях, и состоят, в основном, из пролина и аланина, как определено здесь.
Дополнительные примеры аминокислотных
последовательностей/полипептидов, образующих нерегулярную спиральную
конформацию, для применения в качестве строительных блоков или модулей
определенного здесь нерегулярного спирального полипептида (или его
сегмента) могут, среди прочего, включать комбинации и/или фрагменты или
варианты с круговыми перестановками конкретных "строительных блоков",
"полимерных кассет" или "полимерных повторов", показанных выше.
Соответственно, иллюстративные модули/звенья
последовательности/полимерные повторы/полимерные кассеты нерегулярного спирального полипептида/аминокислотной последовательности могут также представлять собой индивидуальные фрагменты, которые можно по-новому комбинировать с образованием дополнительных модулей/звеньев последовательности/полимерных повторов/полимерных кассет в соответствии сданным изобретением.
Термины "модуль(и)", "звено(звенья) последовательности", "полимерный(е) повтор(ы)", "полимерная(ые) кассета(ы)" и "строительный(е) блок(и)" употребляют здесь как синонимы, и относят к индивидуальным участкам аминокислот, которые можно использовать для образования
определенного здесь нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента)/аминокислотной последовательности.
Аминокислотный повтор (используемый в качестве "строительного блока" и т.п. биосинтетического нерегулярного спирального полипептида по настоящему изобретению) может состоять по меньшей мере из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или большего числа аминокислотных остатков, где каждый повтор содержит остаток (остатки) пролина и аланина. Однако, как проиллюстрировано в прилагаемой SEQ ID NO: 51, указанный "строительный блок" может также состоять только из 2 предложенных здесь аминокислотных остатков Р и А, а именно в форме "РА" или "АР". В одном воплощении аминокислотный повтор в соответствии с настоящим изобретением не содержит более чем 50 аминокислотных остатков. Однако специалисту в данной области техники очевидно, что такой "повтор" может содержать даже более чем 50 аминокислотных остатков, например, в случаях, когда указанный биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид/полимер по изобретению содержит более чем примерно, например, 100 аминокислот, более чем примерно 150 аминокислот, более чем примерно 200 аминокислот и т.д. Соответственно, максимальное количество аминокислотных остатков, содержащихся в таком "повторе", обусловлено общей длиной биосинтетического полипептида (или его сегмента)/полимера, предложенного здесь.
Однако следует отметить, что биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды/аминокислотные последовательности, содержащие вышеописанные повторы и т.д., предпочтительно должны иметь общую длину и/или содержание пролина/аланина, как определено и объяснено здесь выше, то есть состоять примерно из 50, примерно из 100, примерно из 150, примерно из 200, примерно из 250, примерно из 300, примерно из 350, примерно из 400 до примерно 3000 аминокислот и/или содержать более чем примерно 10% и менее чем примерно 75% остатков пролина. Все определения, приведенные здесь выше, также применимы в данном контексте, с соответствующими изменениями.
Как подробно обсуждено здесь, и как предложено здесь выше, в настоящем изобретении предложен(ы) биологически активный(е), гетерологичный(е) белок (белки) или белковая(ые) конструкция(и), которые
особенно полезны в фармацевтических, медицинских и/или лекарственных назначениях. Эти биологически активные, гетерологичные белки/белковые конструкции содержат в качестве по меньшей мере одного домена из указанных по меньшей мере двух доменов нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит примерно из 50, примерно из 100, примерно из 150, примерно из 200, примерно из 250, примерно из 300, примерно из 350, примерно из 400 до примерно 3000 остатков пролина (Pro) и аланина (Ala).
В контексте биологически активных, гетерологичных белков, полипептидов или белковых конструкций, раскрытых здесь, термин "гетерологичный" относится по меньшей мере к двум доменам в пределах указанных белков, полипептидов или белковых конструкций, где первый из указанных по меньшей мере двух доменов придает, имеет и/или опосредует определенную биологическую активность, и где второй из указанных по меньшей мере двух доменов содержит биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид, состоящий исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, и где указанные по меньшей мере два домена не находятся в оперативном сцеплении друг с другом в природе или не кодируются единой кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты (такой как открытая рамка считывания), существующей в природе. Биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид/полипептидный сегмент, состоящий исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, предложенный здесь, и который применяют в биологически активных, гетерологичных белках/белковых конструкциях по данному изобретению, предпочтительно не является дополнительно (химически) модифицированным, например, они предпочтительно не являются ни гликозилированными, ни гидроксилированными.
Следует отметить, что некоторые встречающиеся в природе белки или гипотетические белки, которые выведены из секвенированных участков нуклеиновых кислот, обнаруженных в природе, описаны как имеющие относительно высокое (то есть выше среднего) содержание пролина и аланина. Например, описан гомологичный гипотетический белок для основного штамма
Leishmania Friedlin (Ivens (2005) Science 309, 436-442.). Открытая рамка считывания, содержащая 1514 триплетных кодона, включает участок из 412 триплетов, состоящих из 240 кодонов Ala, 132 Pro, 34 Lys и 4 Val. Остатки Lys, которые являются положительно заряженными в физиологических буферных условиях, почти равномерно распределены по всей этой последовательности, что позволяет предположить солюбилизирующий эффект. Однако, как видно из описания, приведенного здесь, такой гомологичный гипотетический белок, который выведен из встречающейся в природе молекулы нуклеиновой кислоты или открытой рамки считывания, имеющий высокое содержание пролина и аланина выше среднего, не составляет часть данного изобретения. Изобретение основано на факте того, что предложен нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент относительно большого размера, который не встречается в природе в изолированном виде, и который содержит аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит примерно из 50, примерно из 100, примерно из 150, примерно из 200, примерно из 250, примерно из 300, примерно из 350, примерно из 400 до примерно 3000 остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), который особенно полезен в медицинском/фармацевтическом контексте. Описанные здесь изолированные биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды или полипептидные сегменты, которые не встречаются в природе в изолированном виде, также содержатся в раскрытом здесь биологически активном, гетерологичном белке (белках) или белковой конструкции(ях), которые особенно полезны в фармацевтических, медицинских и/или лекарственных назначениях. Эти биологически активные, гетерологичные белки/белковые конструкции содержат в качестве по меньшей мере одного домена из указанных по меньшей мере двух доменов нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит примерно из 50, примерно из 100, примерно из 150, примерно из 200, примерно из 250, примерно из 300, примерно из 350, примерно из 400 до примерно 3000 остатков пролина (Pro) и аланина (Ala).
Также белки арабиногалактаны (AGP), Pro-богатые белки и экстенсины принадлежат к обширной группе гликопротеинов, известных как гидроксипролин (Нур)-богатые гликопротеины (HRGP), которые экспрессируются во всем царстве растений. Один такой мотив AGP, содержащий повтор Ala-Pro (АР)51, экспрессировали в виде синтетического гликомодульного пептида с N-концевой сигнальной последовательностью и С-концевым зеленым флуоресцентным белком в трансгенном Arabidopsis thaliana и исследовали в качестве субстрата для пролилгидроксилаз и последующего О-гликозилирования остатков гидроксипролина (Estevez (2006) Plant Physiol. 142, 458-470). Опять же, раскрытые гидроксилированные и/или гликозилированные боковые цепи Pro, которые могут образовать водородные связи с молекулами воды, по-видимому, обладают солюбилизирующим эффектом.
Следует отметить, что описанные здесь "биологически активные белки или белковые конструкции, содержащие в качестве (по меньшей мере) одного домена биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или пептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина", относятся к белкам или белковым конструкциям, которые в норме не встречаются в природе и, следовательно, являются "гетерологичными". Кроме того, в противоположность пролин-богатым последовательностям, описанным в царстве растений, биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды/полипептидные сегменты, описанные здесь, предпочтительно не являются химически модифицированными, то есть они предпочтительно не являются гликозилированными или гидроксилированными.
Особым преимуществом биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов или полипептидных сегментов по данному изобретению является их по существу гидрофильный, но незаряженный характер. Соответственно, в качестве "минорных" аминокислот (отличающихся от пролина и аланина) в описанном здесь биосинтетическом нерегулярном спиральном полипептиде или полипептидном участке предпочтительны такие аминокислоты, которые не имеют гидрофобных боковых цепей, такие как Val, lie, Leu, Met, Phe, Туг или Тгр, и/или которые не имеют заряженных боковых цепей, такие как Lys, Arg, Asp или Glu. В соответствии с данным изобретением рассмотрено, что (в случаях, где такие индивидуальные аминокислоты, тем не менее, содержатся в
биосинтетическом нерегулярном спиральном полипептиде/полипептидном сегменте по изобретению) общее содержание каждой индивидуальной аминокислоты, имеющей гидрофобную боковую цепь, например, Val, lie, Leu, Met, Phe, Туг или Тгр, и/или имеющей заряженную боковую цепь, например, Lys, Arg, Asp или Glu, в пределах определенного здесь биосинтетического нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента) не превышает 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1%.
Биосинтетические нерегулярные спиральные
полипептиды/аминокислотные последовательности по настоящему изобретению могут содержать конкатемеры индивидуальных блоков, содержащих пролин/аланин комбинированные участки последовательности (Рго)х-(А1а)у, где х может иметь значение целого числа от 1 до предпочтительно 15, более предпочтительно от 1 до 10, даже более предпочтительно от 1 до 5, и у может иметь значение целого числа от 1 до предпочтительно 15, более предпочтительно от 1 до 10, даже более предпочтительно от 1 до 5, и х и у могут варьировать между последовательными блоками. Указанные х и у могут также представлять собой целое число 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.
Аминокислотные последовательности/полипептиды, образующие нерегулярную спиральную конформацию в водном растворе или в физиологических условиях, могут иметь формулу (I):
[РгохА1ау]п
где х независимо выбран из целого числа от 1 до 5. Кроме того, для
каждого п у независимо выбран из целого числа от 1 до 5. Наконец, п
представляет собой любое целое число, при условии, что нерегулярный
спиральный полипептид (или его сегмент)/аминокислотная последовательность
состоит предпочтительно по меньшей мере примерно из 50, по меньшей мере
примерно из 100, по меньшей мере примерно из 150, по меньшей мере
примерно из 200, по меньшей мере примерно из 250, по меньшей мере
примерно из 300, по меньшей мере примерно из 350, по меньшей мере
примерно из 400 аминокислотных остатков и вплоть до примерно 3000
аминокислотных остатков. В данном контексте также следует отметить, что
полипептиды/аминокислотные последовательности, содержащие
вышеописанные конкатемеры или имеющие приведенную выше формулу (I), предпочтительно должны иметь общую длину и/или содержание пролина/аланина, как определено и объяснено здесь выше, то есть состоять примерно из 50, примерно из 100, примерно из 150, примерно из 200, примерно из 250, примерно из 300, примерно из 350, примерно из 400 до примерно 3000 аминокислот и/или содержать более чем примерно 10% и менее чем примерно 75% остатков пролина. Опять же, все определения, приведенные здесь выше в этом контексте, также применимы здесь, с соответствующими изменениями.
Настоящее изобретение также относится к нерегулярным спиральным
полипептидам (полипептидному(ым) сегменту (сегментам))/аминокислотным
последовательностям, содержащим участок аминокислот, выбранный из
группы, состоящей из ААРААРАРААРААРАРААРА (SEQ ID NO: 1);
ААРАААРАРААРААРАРААР (SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ
ID NO: 3, являющейся примером для [Рго-|А1аз]5);
ААРААРААРААРААРААРААРААР (SEQ ID NO: 4);
APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5);
AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6) и APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
(SEQ ID NO: 51, являющейся примером для [Pro-|Ala-i]-m), либо вариантов с
круговыми перестановками, либо мультимера(ов) этих последовательностей
целиком или участков этих последовательностей. Соответственно,
нерегулярный спиральный полипептид (его полипептидный(е)
сегмент(ы))/аминокислотная последовательность может содержать участок
аминокислот ААРААРАРААРААРАРААРА (SEQ ID NO: 1),
ААРААРАРААРААРАРААРА (SEQ ID NO: 1); ААРАААРАРААРААРАРААР (SEQ
ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3);
ААРААРААРААРААРААРААРААР (SEQ ID NO: 4);
APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5);
AAAP AAP AAPP AAAAP AAP AAP PA (SEQ ID NO: 6) и APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51), а также комбинации этих мотивов или комбинации фрагментов и участков этих мотивов, если полученный в результате биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид состоит исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala).
Варианты с круговыми перестановками вышеописанных аминокислотных последовательностей также можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. Иллюстративные варианты с круговыми перестановками, например, ААРААРАРААРААРАРААРА (SEQ ID NO: 1) могут быть легко получены, например, посредством удаления первого аланина и присоединения другого аланина на конец приведенной выше последовательности. Такой вариант SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками, таким образом, будет представлять собой APAAPAPAAPAAPAPAAPAA (SEQ ID NO: 7). Кроме того, не ограничивающими примерами вариантов SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками являются:
РААРАРААРААРАРААРААА (SEQ ID NO: 8),
ААРАРААРААРАРААРАААР (SEQ ID NO: 9),
АР АР AAP AAP АР AAP AAAPA (SEQ ID NO: 10),
PAPAAPAAPAPAAPAAAPAA (SEQ ID NO: 11),
APAAPAAPAP AAP AAAP AAP (SEQ ID NO: 12),
PAAPAAPAPAAPAAAPAAPA (SEQ ID NO: 13),
AAPAAPAPAAPAAAPAAPAP (SEQ ID NO: 14),
APAAPAPAAPAAAPAAPAPA (SEQ ID NO: 15),
P AAP AP AAP AAAP AAPAPAA (SEQ ID NO: 16),
и тому подобное. На основании положений настоящего изобретения специалист в данной области техники способен легко создать соответствующие варианты круговых перестановок участков аминокислот, которые показаны в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 51 (где указанная SEQ ID NO: 51 полностью основана на повторах "АР", и вариант с круговыми перестановками может быть полностью основан на повторах/строительных блоках "РА" или "АР").
Такие варианты с круговыми перестановками можно также рассматривать как примеры дополнительного "модуля"/"строительного блока" и т.д. предложенных здесь полипептидов/аминокислотных последовательностей, которые можно использовать соответственно данной заявке.
Специалисту в данной области техники очевидно, что "модули" и (более короткие) фрагменты или варианты участков аминокислот с круговыми перестановками, предложенные здесь, можно также использовать в качестве "модулей", "повторов" и/или строительных блоков для определенного здесь нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента)/аминокислотной последовательности.
В соответствии с вышеописанным нерегулярный спиральный полипептид/аминокислотная последовательность, образующие нерегулярную спиральную конформацию, могут содержать мультимер любого из вышеописанных участков аминокислот (или их вариантов с круговыми перестановками или фрагментов), предпочтительно представленных в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 51. Следует отметить, что эти последовательности никоим образом не ограничены контекстом данного изобретения.
Опять же, полипептиды/аминокислотные последовательности, содержащие вышеописанные участки аминокислот (или их фрагменты), варианты с круговыми перестановками (или их фрагменты) предпочтительно должны иметь общую длину и/или содержание пролина/аланина, как определено и объяснено здесь выше, то есть состоять примерно из 50, примерно из 100, примерно из 150, примерно из 200, примерно из 250, примерно из 300, примерно из 350, примерно из 400 до примерно 3000 аминокислот и/или содержать более чем примерно 10% и менее чем примерно 75% остатков пролина. Все определения, приведенные здесь выше в этом контексте, также применимы здесь, с соответствующими изменениями. Термин "фрагмент" также был определен выше.
Как упомянуто выше, в контексте данного изобретения было неожиданно обнаружено, что биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды (или полипептидные сегменты)/полимеры, предложенные здесь, характеризуются относительно большим гидродинамическим объемом. Этот гидродинамический объем, также называемый кажущимся размером, можно легко определить посредством аналитической гель-хроматографии (также известной как эксклюзионная хроматография, ЭХ). Предпочтительно, нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) имеет кажущийся размер по меньшей мере 10 кДа, предпочтительно по меньшей мере 25 кДа,
более предпочтительно по меньшей мере 50 кДа, даже более предпочтительно по меньшей мере 100 кДа, особенно предпочтительно по меньшей мере 200 кДа и наиболее предпочтительно по меньшей мере 400 кДа. Специалист в данной области техники способен легко определить гидродинамический объем конкретных белков. Такие способы могут включать динамическое/статическое светорассеяние, аналитическое ультрацентрифугирование или аналитическую гель-хроматографию, примеры которых приведены здесь ниже. Аналитическая гель-хроматография представляет собой известный способ в данной области техники для измерения гидродинамического объема макромолекул. Альтернативно гидродинамический объем глобулярного полипептида можно оценить по его молекулярной массе (Creighton (1993) цит. выше). Как описано здесь, гидродинамический объем полипептидов по изобретению, состоящих предпочтительно по меньшей мере примерно из 50, по меньшей мере примерно из 100, по меньшей мере примерно из 150, по меньшей мере примерно из 200, по меньшей мере примерно из 250, по меньшей мере примерно из 300, по меньшей мере примерно из 350, по меньшей мере примерно из 400 до примерно 3000 аминокислотных остатков пролина и аланина, и имеющих нерегулярную спиральную конформацию, демонстрирует неожиданно высокие значения по отношению к гидродинамическому объему, который оценивали бы для соответствующего складчатого глобулярного белка на основании молекулярной массы. Нижеописанное относится к биологически активным, гетерологичным белкам или белковым конструкциям, содержащим, среди прочего, биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент), как описано и определено здесь выше, который представляет собой предпочтительное воплощение настоящего изобретения. Без привязки к теории, в контексте настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что участки биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, предложенного здесь, и состоящие исключительно из пролина и аланина, могут даже придавать более высокий гидродинамический объем, чем соответствующий биосинтетический нерегулярный спиральный участок, имеющий такое же суммарное число аминокислотных остатков, но состоящий исключительно из пролина, аланина и серина (как предложено в WO 2008/155134).
Обычные белки плазмы человека, такие как сывороточный альбумин (HSA) и иммуноглобулины (lg), включая ослабленные антитела, проявляют длительные периоды полувыведения, типично от 2 до 3 недель, что свойственно их специфичному взаимодействию с неонатальным рецептором Fc (FcRn), ведущему к эндосомальному рециклингу (Ghetie (2002) Immunol Res, 25:97-113). Напротив, большинство других белков, представляющих фармацевтический интерес, в частности, рекомбинантные фрагменты антител, гормоны, интерфероны и т.д., претерпевают быстрый клиренс (из крови). Это, в частности, верно для белков, размер которых ниже порогового значения для почечной фильтрации, примерно 70 кДа (Caliceti (2003) Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277). В этих случаях период полувыведения из плазмы немодифицированного фармацевтического белка может составлять значительно менее чем один час, делая его, таким образом, по существу бесполезным для большинства терапевтических применений. С целью достижения пролонгированного фармакологического действия, а также улучшенного соблюдения пациентом режима лечения с необходимыми интервалами дозирования, продолжающегося до нескольких суток или даже недель, ранее было установлено несколько стратегий для целей разработки биофармацевтических лекарственных средств.
Во-первых, использован механизм рециклинга природных белков плазмы путем получения слитых белков с Fc участком lg, например, Enbrel(r), гибрид между внеклеточным доменом рецептора TNFa и lgG1 человека (Goldenberg (1999) Clin Ther 21:75-87), или с сывороточным альбумином, например, Albuferon(r) (альбинтерферон альфа-2Ь, ZALBIN(tm), JOULFERON(r)), соответствующий слитый белок IFN альфа с HSA (Osborn (2002) J Pharmacol Exp Ther 303:540-548). Альбумин с его высокой концентрацией в плазме 600 мкМ также использован косвенно, служащий как носитель для биофармацевтических препаратов, которые обеспечены альбумин-связывающей функцией, например, посредством слияния с бактериальным альбумин-связывающим доменом (ABD) из белка G Streptococcal (Makrides (1996) J Pharmacol Exp Ther 277:534-542) или с пептидом, отобранным против HSA из библиотеки фагового дисплея (Dennis (2002) J Biol Chem, 277:3503535043; Nguyen (2006) Protein Eng Des Sel 19:291-297).
Во-вторых, фундаментально отличающейся методологией продления периода полувыведения биофармацевтических препаратов из плазмы является конъюгация с высоко сольватированными и физиологически инертными химическими полимерами, таким образом, эффективно увеличивающими гидродинамический радиус терапевтического белка больше размера клубочковых пор примерно на 3-5 нм (Caliceti (2003) цит. выше). Ковалентное связывание в биохимически мягких условиях с активированными производными полиэтиленгликоля (ПЭГ), либо случайно посредством боковых цепей Lys (Clark (1996) J Biol Chem 271:21969-21977), либо посредством специфично встроенных остатков Cys (Rosendahl (2005) BioProcess lnternational:52-60), было в средней степени успешным и применяется в настоящее время в нескольких одобренных лекарственных средствах. Соответствующие преимущества были достигнуты, главным образом, в связи с малыми белками, обладающими специфичной фармакологической активностью, например, Pegasys(r), химически пегилированным рекомбинантным IFNa-2a (Harris (2003) Nat Rev Drug Discov, 2:214-221; Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870).
Однако химическое связывание биологически активного белка с синтетическими полимерами имеет недостатки в отношении разработки и получения биофармацевтических препаратов. Подходящие производные ПЭГ являются дорогостоящими, главным образом потому что необходима их высокая чистота, и их конъюгация с рекомбинантным белком требует дополнительных стадий обработки и очистки in vitro, которые снижают выход и повышают затраты на изготовление. Действительно, ПЭГ часто содержит примеси альдегидов и пероксидов (Ray (1985) Anal Biochem 146:307-312), и сам по себе склонен к химическому разложению при хранении в присутствии кислорода. Фармацевтическое действие терапевтического белка также может быть затруднено, если боковые цепи аминокислот вблизи его биохимического активного центра становятся модифицированными за счет процесса пегилирования. Кроме того, химическое связывание с синтетическими полимерами обычно приводит к гетерогенной смеси молекул, которые могут проявлять значительное изменение активности in vivo.
В-третьих, для продления периода полувыведения из плазмы предложено применение гликозилирования аналогов биологически активных белков, в которых вводят новые консенсусные последовательности для N
гликозилирования; см. WO 02/02597; Perlman (2003) J Clin Endocrinol Metab 88:2327-2335; or Elliott (2003) Nat Biotechnol 21:414-420). Описанные белки, сконструированные посредством гликоинженерии, однако, проявляли измененную активность in vivo, что указывает на то, что новые углеводные боковые цепи влияют на биологическую активность сконструированного белка. Кроме того, дополнительные углеводные боковые цепи, вероятно, повышают антигенность полученных биологически активных молекул, что вызывает существенные проблемы безопасности. Кроме того, сообщили, что слитые белки, содержащие искусственную повторяющуюся последовательность PSTAD, происходящую из Trypanosoma cruzi, индуцируют пролонгированный период полувыведения из плазмы транс-сиалидазы (Alvarez (2004) JBC 279:3375-3381). Однако сообщили, что такие повторы, происходящие из Trypanosoma cruzi, индуцируют гуморальный иммунный ответ (Alvarez (2004) цит. выше). Соответственно, желательны альтернативные стратегии продления действия биологически активных белков.
Было неожиданно обнаружено, что биосинтетические аминокислотные последовательности/полипептиды, раскрытые здесь и состоящие исключительно из пролина и аланина в соответствии с изобретением, принимают нерегулярную спиральную конформацию, в частности, в физиологических условиях. Следовательно, они являются предпочтительными молекулами для получения определенного здесь ниже "второго домена" биологически активного(ых) белка(ов)/полипептида(ов), то есть включающими полипептидный участок, который образует в физиологических условиях нерегулярную спиральную конформацию, и за счет этого опосредует повышенную стабильность in vivo и/или in vitro биологически активного(ых) ("функционального(ых)") белка(ов) или полипептида(ов), в частности, увеличенный период полувыведения из плазмы. Гидродинамический объем функционального белка, который подвергают слиянию с указанным нерегулярным спиральным доменом, значительно возрастает, что можно оценить применением стандартных способов, упомянутых здесь. Поскольку считают, что нерегулярный спиральный домен не влияет на биологическую активность первого домена биологически активного белка, биологическая активность, опосредованная функциональным белком, представляющим интерес, с которым он подвергнут слиянию, по существу сохраняется. Кроме
того, считают, что аминокислотные полимеры/полипептиды, которые образуют нерегулярный спиральный домен, раскрытый здесь, являются биологически в значительной степени инертными, главным образом в отношении протеолиза в плазме крови, иммуногенности, изоэлектрической точки/электростатического поведения, связывания с рецепторами клеточной поверхности, а также интернализации, но, тем не менее, являются биоразлагаемыми, что обеспечивает явные преимущества по сравнению с синтетическими полимерами, такими как ПЭГ.
В соответствии с вышеописанным, настоящее изобретение относится к биологически активному белку, содержащему описанный здесь биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид. Такой биологически активный белок/белковая конструкция, содержащие биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид, описанный здесь, представляют собой гетерологичный биологически активный белок/белковую конструкцию. В частности, здесь также раскрыт(ы) биологически активный(ые), гетерологичный(е) белок (белки), содержащий(е) или состоящий(е) по меньшей мере из двух доменов, где
(a) первый домен из указанных по меньшей мере двух доменов содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей и/или опосредующей указанную биологическую активность; и
(b) второй домен из указанных по меньшей мере двух доменов содержит или состоит из описанного и определенного здесь нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента.
Следует отметить, что в соответствии с настоящим изобретением "первый домен" и указанный "второй домен" относятся к участкам белков, которые не встречаются в природе в пределах одного и того же белка, или для которых не ожидают, что они являются частью одного и того же гипотетического белка, кодируемого кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты (такой как открытая рамка считывания), которая обнаружена в природе.
Определения и объяснения, приведенные здесь выше в контексте нерегулярного спирального полипептида или его полипептидного сегмента применимы, с соответствующими изменениями, в контексте биологически активных белков, содержащих указанный нерегулярный спиральный полипептид (или его полипептидный(е) сегмент(ы)).
Предпочтительно, указанная нерегулярная спиральная конформация опосредует повышенную стабильность in vivo и/или in vitro указанного биологически активного белка, такую как стабильность in vivo и/или in vitro в биологических образцах или в физиологических окружающих средах.
Например, здесь рассмотрено, что белки, содержащие определенный здесь дополнительный "второй домен", принимающий нерегулярную спиральную конформацию в водном растворе или в физиологических условиях (например, полимеры, состоящие примерно из 200, или примерно из 400, или примерно из 600 аминокислотных остатков и содержащие PA#1/SEQ ID NO: 1, PA#2/SEQ ID NO: 2, PA#3/SEQ ID NO: 3, PA#4/SEQ ID NO: 4, PA#5/SEQ ID NO: 5, PA#6/SEQ ID NO: 6 и/или P1A1/SEQ ID NO: 51 в качестве "строительных блоков"), обладают преимуществами в стабильности в сыворотке или в периоде полувыведения из плазмы, даже in vivo (в частности, при внутривенном введении), по сравнению с контролем, где отсутствует нерегулярная спиральная конформация.
В WO 2008/155134 (как обсуждено здесь выше) показано, что биологически активные белки, которые содержат домен с аминокислотной последовательностью, принимающей нерегулярную спиральную конформацию, обладают повышенной стабильностью in vivo и/или in vitro. Нерегулярные спиральные домены, раскрытые в WO 2008/155134, состоят, в частности, из остатков пролина, аланина и серина (PAS). Присутствие этих трех остатков описано в данном документе предшествующего уровня техники как существенное требование к образованию стабильной и растворимой нерегулярной спирали в водном растворе.
Как обсуждено во введении, приведенном здесь выше, в WO 2007/103515 описаны неструктурированные рекомбинантные полимеры, которые содержат в качестве основных составляющих широкое разнообразие аминокислот, среди прочего, глицин, аспартат, аланин, серии, треонин, глутамат и пролин. Однако термин "неструктурированный рекомбинантный полимер", в противоположность терминам "биосинтетический" и "нерегулярный спиральный", не имеет признанного ясного значения.
Также здесь была упомянута WO 2006/081249. В этом документе описаны белковые конъюгаты, содержащие биологически активный белок, связанный с полипептидом, содержащим от 2 до 500 звеньев аминокислотного
повтора, содержащего Gly, Asn и Gin в качестве основной составляющей и Ser, Thr, Asp, Gin, Glu, His и Asn в качестве минорной составляющей. Описано, что указанные белковые конъюгаты обладают либо повышенным, либо пониженным периодом полувыведения из плазмы по сравнению с не конъюгированным биологически активным белком. Однако в WO 2006/081249 не приведено никакой теории для предсказания, уменьшает или увеличивает конкретный аминокислотный повтор период полувыведения конъюгата из плазмы. Кроме того, в WO 2006/081249 отсутствуют положения или предположения, что период полувыведения белков из плазмы можно увеличить, когда конъюгированный белок содержит аминокислотный повтор, который образует нерегулярную спиральную конформацию, как показано в настоящем изобретении. Кроме того, аминокислотные повторы, раскрытые в WO 2006/081249, содержат по меньшей мере два остатка, выбранных из Gly, Asn и Gin, что находится в явном противоречии с биосинтетическими нерегулярными спиральными полипептидами по настоящему изобретению, которые содержат аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина.
Было неожиданно обнаружено, что биосинтетические нерегулярные спиральные аминокислотные последовательности, предложенные здесь, которые, в противоположность предшествующему уровню техники, содержат исключительно остатки пролина и аланина (то есть, которые предпочтительно не содержат существенное количество какой-либо другой аминокислоты, а также не содержат существенное количество серина или не содержат серии вообще), действительно также образуют полезную нерегулярную спиральную структуру. Это особенно неожиданно с учетом того, что описание слитых белков в WO 2008/155134 с доменом, состоящим только из остатков серина и аланина (SA), то есть где остатки пролина отсутствовали, продемонстрировало, что такой домен, содержащий только два типа аминокислот, не образовывал нерегулярную спираль, но образовывал структуру складчатого (3-слоя. Эти домены серина-аланина также не проявляли такой увеличенный гидродинамический объем, как наблюдали с последовательностями "PAS" или, в частности, "Р/А", предложенными здесь.
Употребляемый здесь термин "биологическая активность" описывает биологический эффект вещества на живую материю. Соответственно, термин
"биологически активный белок", употребляемый здесь, относится к белкам, способным индуцировать биологический эффект в живых клетках/организмах, которые подвергаются воздействию указанного белка или полипептида. Однако следует отметить, что в контексте настоящего изобретения термин "биологически активный белок" относится ко всему белку по изобретению, который содержит как аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую указанную биологическую активность (указанный первый домен), так и аминокислотную последовательность по изобретению, принимающую/образующую нерегулярную спиральную конформацию и состоящую исключительно из пролина и аланина (указанный второй домен).
Соответственно, термины "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая биологическую активность" или "аминокислотная последовательность с биологической активностью", употребляемые здесь по отношению к определенному выше "первому домену" биологически активного белка по изобретению, который опосредует, или имеет, или способен опосредовать или иметь определенную выше "биологическую активность". В термины "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая биологическую активность" или "аминокислотная последовательность с биологической активностью" также включены любые белки, представляющие интерес (и их функциональные фрагменты, такие как фрагменты антител, фрагменты, содержащие внеклеточный или внутриклеточный домен(ы) мембранного рецептора, укороченные формы фактора роста или цитокина и тому подобное), период полувыведения которых, либо in vivo, либо in vitro, должен быть продлен. В одном воплощении данного изобретения аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая биологическую активность, в соответствии с настоящим изобретением может быть выведена из любого "белка, представляющего интерес", то есть любого белка, представляющего фармакологический или биологический интерес, или любого белка, который полезен в качестве терапевтического/диагностического агента.
Соответственно, биологически активные белки могут включать первый домен, содержащий биологически активную аминокислотную последовательность, которая происходит из полипептидов, полученных естественным путем, или полипептидов, полученных посредством технологии
рекомбинантной ДНК. В предпочтительном воплощении белок, представляющий интерес, может быть выбран из группы, состоящей из связывающих белков/связывающих молекул, иммуноглобулинов, фрагментов антител, транспортных белков, мембранных рецепторов, сигнальных белков/пептидов, таких как цитокины, факторов роста, гормонов или ферментов и тому подобного.
Как объяснено здесь выше, нерегулярный спиральный полипептид (или полипептидный сегмент), содержащийся во втором домене биологически активного белка, образует нерегулярную спиральную конформацию, в частности, в физиологических условиях. Это особенно важно в контексте биологически активных белков, которые могут составлять часть фармацевтической композиции, которая должна быть введена субъекту или пациенту.
Следует отметить, что биосинтетический нерегулярный спиральный домен по изобретению (указанный "второй домен") биологически активного белка нативно (то есть в физиологических условиях) принимает/образует/имеет нерегулярную спиральную конформацию, в частности, in vivo и при введении млекопитающим или пациентам-людям, нуждающимся в медицинском вмешательстве. Напротив, в данной области техники известно, что белки, не обладающие нерегулярной вторичной и/или третичной структурой в качестве нативной конформации, склонны принимать нерегулярную спиральную конформацию в не физиологических условиях (то есть в денатурирующих условиях). Однако такие денатурированные белки обладают полностью отличающимися характеристиками по сравнению с биологически активным белком, содержащим нерегулярный спиральный полипептид по настоящему изобретению. Следовательно, сущность данного изобретения состоит в том, что "биологически активный белок" и биологически активная часть слитых белков/слитых конструкций, предложенных здесь, также сохраняют свою биологическую функцию при объединении и/или связывании с биосинтетическим нерегулярным спиральным полипептидом (или полипептидным сегментом) по данному изобретению.
Кроме того, нерегулярный спиральный полипептид (или полипептидный сегмент) сохраняет растворимость в физиологических условиях. Соответственно, также рассмотрено, что белковая конструкция по настоящему
изобретению (содержащая определенные выше "первый" и "второй домен") может содержать "второй" домен, образующий/принимающий нерегулярную спираль, кратковременно или временно не находясь в нерегулярной спиральной конформации, например, во время нахождения в форме конкретной композиции, такой как лиофилизат или высушенная композиция. Однако важно, чтобы такой "второй домен" белковой конструкции по изобретению снова принимал после, например, восстановления в соответствующих буферах (предпочтительно "физиологических" буферах/эксципиентах и/или растворителях), определенную здесь нерегулярную спиральную конформацию. Указанный "второй домен" способен (при необходимости, после соответствующего восстановления) опосредовать повышенную стабильность in vivo и/или in vitro биологически активного белка по изобретению. В данной заявке предпочтительно, чтобы "второй домен", определенный здесь, состоял из нерегулярного спирального полипептида (или полипептидного сегмента) по настоящему изобретению.
Употребляемый здесь термин "домен" относится к любой области/участку аминокислотной последовательности, которая способна автономно принимать определенную структуру и/или функцию. В контексте настоящего изобретения, соответственно, "домен" может представлять собой функциональный домен или структурный домен. Как описано здесь, белки по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один домен/участок, имеющий и/или опосредующий биологическую активность, и по меньшей мере один домен/участок, образующий нерегулярную спиральную конформацию. Однако белки по изобретению могут также состоять из более чем двух доменов и могут содержать, например, дополнительную линкерную или спейсерную структуру между определенными здесь двумя доменами/участками, или другой домен/участок, такой как, например, сайт расщепления, чувствительный к протеазе, аффинную метку, такую как Hise-метка или Sfrep-метка, сигнальный пептид, пептид удержания, направляющий пептид, такой как пептид мембранного переноса, или дополнительные эффекторные домены, такие как фрагменты антител для опухолевой направленности, ассоциированные с противоопухолевым токсином, или фермент для активации пролекарства и т.д.
В другом воплощении биологически активный белок по изобретению имеет гидродинамический объем, определенный посредством аналитической
гель-хроматографии (также известной как эксклюзионная хроматография, ЭХ), по меньшей мере 50 кДа, предпочтительно по меньшей мере 70 кДа, более предпочтительно по меньшей мере 80 кДа, даже более предпочтительно по меньшей мере 100 кДа, особенно предпочтительно по меньшей мере 125 кДа и наиболее предпочтительно по меньшей мере 150 кДа. Специалист в данной области техники способен легко определить гидродинамический объем конкретных белков. Иллюстративные способы были описаны здесь выше в контексте нерегулярного спирального полипептида. Специалист в данной области техники способен легко адаптировать такие способы также в контексте биологически активного белка по настоящему изобретению. Как описано здесь ниже, показано, что гидродинамический объем биологически активных белков по изобретению, которые содержат определенный выше второй домен, то есть домен, содержащий или состоящий из предложенного здесь нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента), проявляет неожиданно большое значение гидродинамического объема по отношению к оцениваемому гидродинамическому объему для соответствующего складчатого глобулярного белка на основании его молекулярной массы или числа/состава аминокислотных остатков.
Следует отметить, что первый домен, содержащий "аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую биологическую активность", может также принимать свою биологическую активность в контексте или после связывания с другим полипептидом или аминокислотной последовательностью. Например, Fab фрагмент антитела, такого как одно из противоопухолевых антител Герцептин (Eigenbrot (1993) J. Mol. Biol. 229:969995), состоит из двух различных полипептидных цепей, легкой цепи иммуноглобулина и фрагмента тяжелой цепи иммуноглобулина, которые могут быть, кроме того, связаны посредством межцепочечной(ых) дисульфидной(ых) связи(связей). В соответствии с настоящим изобретением может быть достаточным связать одну из этих цепей (например, посредством слияния генов) с нерегулярным спиральным полипептидом (или полипептидным сегментом), тогда как полноразмерный биологически активный белок восстанавливают посредством связывания с другой цепью. Такое восстановление может быть достигнуто, например, посредством совместной экспрессии различных полипептидов (с одной стороны, слитого белка одной
цепи и, с другой стороны, нерегулярного спирального полипептида другой цепи) в одной и той же клетке-хозяине, как описано в прилагаемых примерах, либо посредством восстановления in vitro, например, как часть протокола рефолдинга.
Соответственно, такие белки (содержащие две отдельных полипептидных цепи) также рассматривают как биологически активные белки в соответствии с настоящим изобретением. В таком случае первый домен, определенный здесь, может содержать две отдельных полипептидных цепи, которые связаны только нековалентно. Кроме того, каждая из независимых цепей биологически активного белка/домена может быть связана с нерегулярным спиральным полипептидом (или полипептидным сегментом). Помимо фрагментов антител, существует много других гомо- или гетероолигомерных белков, представляющих интерес (например, инсулин, гемоглобин и тому подобное), которые состоят из нескольких связанных полипептидных цепей, и которые являются объектом данного изобретения.
Употребляемый здесь термин "связывающий белок" относится к молекуле, которая способна специфично взаимодействовать с потенциальным(и) партнером(ами) связывания, так что она способна отличить указанного(ых) потенциального(ых) партнера(ов) связывания от множества различных молекул в качестве указанного(ых) потенциального(ых) партнера(ов) связывания до такой степени, что из пула указанного множества различных молекул в качестве потенциального(ых) партнера(ов) связывания, связывается или значительно связывает только указанного(ых) потенциального(ых) партнера(ов) связывания. Способы измерения связывания между связывающим белком и потенциальным партнером связывания известны в данной области техники и могут быть осуществлены рутинно, например, посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), изотермической титрационной калориметрии, равновесного диализа, иммунопреципитации, поверхностного плазмонного резонанса или аппарата Биакор. Иллюстративные связывающие белки/связывающие молекулы, которые полезны в контексте настоящего изобретения, включают, но не ограничены ими, антитела, фрагменты антител, такие как Fab фрагменты, F(ab')2 фрагменты, одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), изолированные вариабельные области антител (VL и/или VH области), CDRs
(комплемент-распознающие участки), однодоменные
антитела/иммуноглобулины, пептидомиметики, происходящие из CDR, лектины, иммуноглобулиновые домены, фибронектиновые домены, домены белка А, домены SH3, домены анкириновых повторов, липокалины или различные типы связывающих белков каркасного происхождения, описанных, например, в Skerra (2000) J Mol Recognit 13:167-187, Gebauer (2009) Curr Opin Chem Biol 13:245-255, Binz (2005) Nat Biotechnol 23:1257-1268 или Nelson (2009) Nat Biotechnol 27:331-337.
Другие иллюстративные биологически активные белки, представляющие
интерес (в частности, белки, содержащиеся в первом домене или
составляющие/представляющие собой первый домен биологически активного
белка), которые полезны в контексте настоящего изобретения, включают, но не
ограничены ими, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гормон
роста человека, альфа-интерферон, бета-интерферон, гамма-интерферон,
лямбда-интерферон, фактор некроза опухоли, эритропоэтин, факторы
свертывания крови, такие как фактор свертывания крови VIII, фактор
свертывания крови Vila, фактор свертывания крови IX, gp120/gp160,
растворимый рецептор фактора некроза опухоли I и II, тромболитики, такие как
ретеплаза, пептиды с метаболическими эффектами, такие как GLP-1
(глюкагоноподобный пептид 1) или эксендин-4,
иммуносупрессивные/иммунорегуляторные белки, такие как антагонисты рецептора интерлейкина-1 или анакинра, интерлейкин-2 и липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов, или другие природные или сконструированные липокалины, либо белки или соединения, перечисленные, например, в Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870 или Walsh (2004) Eur J Pharm Biopharm 58:185-196, либо перечисленные в онлайн-базах данных, таких как http://www.biopharma.com/approvals.html или http://www.drugbank.ca. Дополнительными биологически активными белками (в частности, белками, содержащимися в первом домене или составляющими/представляющими собой первый домен биологически активного белка), которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, являются, среди прочего, фолликулостимулирующий гормон, глюкоцереброзидаза, тимозин альфа 1, глюкагон, соматостатин, аденозиндеаминаза, интерлейкин-11, гематид, лептин, интерлейкин-20, субъединица альфа рецептора интерлейкина-22 (IL-22ra),
интерлейкин-22, гиалуронидаза, фактор роста фибробластов 18, фактор роста фибробластов 21, глюкагоноподобный пептид 1, остеопротегерин, IL-18 связывающий белок, рилизинг-фактор гормона роста, растворимый рецептор TACI (рецептор фактора некроза опухоли суперсемейства 13В), тромбоспондин-1, растворимый рецептор VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) Flt-1, а-галактозидаза А, антагонист миостатина, желудочный ингибиторный полипептид, альфа-1 антитрипсин, IL-4 мутеин и тому подобное. Как очевидно из описания, приведенного здесь, настоящее изобретение также относится к содержанию биосинтетического нерегулярного спирального полипептида пролина/аланина или полипептидному сегменту пролина/аланина, и молекул, полезных в фармацевтике или медицине, таких как малые молекулы, пептиды или биомакромолекулы, такие как белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липидные везикулы и тому подобное, в частности, полезные в фармацевтике или медицине белки, такие как (но не ограниченны ими) связывающие белки/связывающие молекулы, иммуноглобулины, фрагменты антител, транспортные белки, мембранные рецепторы, сигнальные белки/пептиды, цитокины, факторы роста, гормоны или ферменты и тому подобное, которые могут содержаться в определенных здесь конструкциях лекарственных средств, но они также могут быть частью определенного здесь биологически активного, гетерологичного белка, содержащего или состоящего из указанных определенных по меньшей мере двух доменов. В таком случае, указанные конкретные полезные в фармацевтике или медицине белки (или их функциональные фрагменты) могут представлять собой "первый домен" из указанных по меньшей мере двух доменов, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей и/или опосредующей указанную биологическую активность. Функциональные фрагменты в данном контексте представляют собой фрагменты указанных полезных в фармацевтике или медицине белков, которые все еще способны вызывать желаемый биологический или фармацевтический ответ in vivo и/или in vitro и/или все еще имеют или опосредуют желаемую биологическую активность.
Вышеупомянутый полипептидный линкер/спейсер, встроенный между указанным первым и указанным вторым доменами, предпочтительно содержит множественные гидрофильные, связанные пептидными связями аминокислоты, которые ковалентно связаны с обоими доменами. В другом воплощении
указанный полипептидный линкер/спейсер содержит сайт расщепления протеазой плазмы, который дает возможность контролируемого высвобождения указанного первого домена, содержащего полипептид, имеющий и/или опосредующий биологическую активность. Линкеры различных типов или длин могут быть идентифицированы без чрезмерной нагрузки для получения оптимальной биологической активности конкретных белков.
В предпочтительном воплощении биологически активные белки по настоящему изобретению являются слитыми белками. Слитый белок, описанный здесь, может содержать по меньшей мере один домен, который может опосредовать биологическую активность, и по меньшей мере один другой домен, который содержит биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид (или полипептидный сегмент), описанный здесь, в едином мультидоменном полипептиде. Опять же, следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено слитыми белками, где один домен опосредует биологическую активность. Здесь также предложены "слитые белки"/"слитые конструкции", где одна часть/домен представляет собой или содержит нерегулярный спиральный полипептид/полимер пролина/аланина по изобретению, а другая часть/домен содержит другой участок/структуру белка.
В частности, в случае слитых белков, нерегулярный спиральный полипептид (или полипептидный сегмент) по данному изобретению не обязательно несет остатки Pro или Ala на своем амино- или карбокси-конце. В альтернативном воплощении биологически активный белок в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой белковый конъюгат, где белок, представляющий интерес, или полипептид/полипептидный участок/пептид/аминокислотная последовательность, имеющие и/или опосредующие биологическую активность, конъюгирован посредством непептидной связи с аминокислотной последовательностью, которая образует/принимает нерегулярную спиральную конформацию, в частности, нерегулярный спиральный полипептид (или полипептидный сегмент), предложенный здесь, и состоящий исключительно из остатков пролина и аланина. В данной области техники известны непептидные связи, которые полезны для образования поперечных сшивок белков с биосинтетическим нерегулярным спиральным полипептидом или полипептидным сегментом, содержащим аминокислотную последовательность, состоящую исключительно
из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), как предложено здесь. Такие непептидные связи могут включать дисульфидные связи, например, между боковыми цепями Cys, тиоэфирные связи или непептидные ковалентные связи, индуцированные химическими сшивающими агентами, такими как дисукцинимидилсуберат (DSS) или сульфосукцинимидил-4-[пара-малеидофенил]бутират (Sulfo-SMPB), хелатирующие металлы/комплексообразующие группы, а также нековалентные белок-белковые взаимодействия.
Следует отметить, что "биологически активный белок" по настоящему изобретению может также содержать более чем одну "аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую биологическую активность". Кроме того, биологически активный белок может также содержать более чем один биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент). В простейшем случае биологически активный белок состоит из двух доменов, то есть первого домена, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую биологическую активность, и второго домена, содержащего биосинтетический полипептид (или его сегмент). Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено "биологически или терапевтически активными белками", связанными с раскрытым здесь биосинтетическим нерегулярным спиральным полипептидом или полипептидным сегментом, содержащим аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala). Другие белки или молекулы, представляющие интерес, важные для других отраслей промышленности, таких как пищевая промышленность или производство напитков, косметическая промышленность и тому подобное, могут быть также получены средствами и способами, предложенными здесь.
Специалисту в данной области техники очевидно, что "домен, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую биологическую активность", и "второй домен, содержащий нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)", которые содержатся
в биологически активных белках по изобретению, могут быть организованы в определенном порядке.
Соответственно, и в контексте изобретения, порядок определенных здесь "первого" и "второго" домена биологически активного полипептида по изобретению может быть организован в таком порядке, что указанный "первый домен" (то есть белок, представляющий интерес; "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая указанную биологическую активность") локализован на амино (N-) конце, а указанный "второй домен" (то есть домен, который содержит предложенный здесь нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)), локализован на карбокси (С-) конце биологически активного белка. Однако этот порядок может быть также обратным, например, указанный "первый домен" (то есть белок, представляющий интерес; "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая указанную биологическую активность") локализован на карбокси (С-) конце, а указанный "второй домен" (то есть домен, который содержит предложенный здесь нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) локализован на амино (N-) конце биологически активного белка. Если биологически активный белок состоит только из одного первого домена и одного второго домена, порядок доменов может быть, соответственно, таким (от N-конца к С-концу): первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая биологическую активность) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)). Наоборот, порядок доменов может быть таким (от N-конца к С-концу): второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая биологическую активность).
Также рассмотрено, что более чем один домен, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей и/или опосредующей указанную биологическую активность, следует использовать в контексте белковой конструкции по изобретению. Например, биологически активный белок может содержать два "первых домена", то есть две специфичные аминокислотные последовательности, имеющие и/или опосредующие биологическую активность, где биологическая активность может представлять собой одинаковую или разную активность. Если биологически
активный белок состоит из двух таких "первых доменов", то есть двух специфичных аминокислотных последовательностей, имеющих и/или опосредующих биологическую активность, и одного "второго домена" (содержащего биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)), порядок доменов может быть таким (от N-конца к С-концу): первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную (возможно другую) биологическую активность).
Те же объяснения применимы в случаях, где биологически активный белок содержит более чем один "второй домен" (то есть биологически активный белок содержит более чем один нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)). Если биологически активный белок состоит из двух таких "вторых доменов", то есть двух доменов, содержащих биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент), и одного "первого домена" (содержащего аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую биологическую активность), порядок доменов может быть таким (от N-конца к С-концу): второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)). Если биологически активный белок содержит более чем один "второй домен", здесь рассмотрено, что такие "вторые домены" могут быть идентичными, либо могут быть различными.
Как упомянуто выше, биологически активный белок может содержать более чем один "первый домен", то есть более чем одну специфичную аминокислотную последовательность, имеющую и/или опосредующую биологическую активность, и более чем один "второй домен" (биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)), где такие "первые домены" могут быть идентичными или различными, и/или где указанные "вторые домены" могут быть идентичными или различными. В таких случаях можно предположить приведенные ниже иллюстративные порядки доменов (от N-конца к С-концу):
первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент));
второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент));
первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность);
второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность);
второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность); или
первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - первый домен (аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность) - второй домен (нерегулярный
спиральный полипептид (или его сегмент)) - второй домен (нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)).
Для специалиста в данной области техники легко представить дополнительные порядки соответствующих доменов (в частности, в случаях, где более чем два "первых домена" или более чем два "вторых домена" содержатся в биологически активном белке).
Как во всех воплощениях полипептида/биологически активного белка по настоящему изобретению, указанный(е) домен(ы), содержащий(е) аминокислотную последовательность, имеющую или опосредующую указанную биологическую активность, может(могут) также представлять собой биологически активный фрагмент данного белка с желаемой биологической функцией. Таким образом, определенный здесь "второй домен" (предпочтительно содержащий предложенный здесь нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент)) также может быть локализован между двумя биологически активными фрагментами белка, представляющего интерес, или между биологически активными фрагментами двух белков, представляющих интерес. Все объяснения и определения, приведенные здесь выше в контексте "полноразмерных" белков/полипептидов, представляющих интерес (то есть, когда аминокислотные последовательности имеют/опосредуют определенную собственную биологическую активность), применимы, с соответствующими изменениями, в контексте таких фрагментов.
Опять же, вышеописанное изобретение не ограничено конструкциями, которые содержат "домен" с "биологически активной функцией". Конструкции по настоящему изобретению могут также содержать домены с другими функциями, и не ограничены биологическими активностями. Они представляют собой только воплощения настоящего изобретения, и специалистам в данной области техники очевидно, что другие конструкции могут быть легко получены и использованы без отклонения от сущности настоящего изобретения. Соответственно, указанная здесь в контексте "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая специфичную биологическую активность", применима, с соответствующими изменениями, для других конструкций, например, конструкций для применения в других областях техники, например, в косметике, обработке пищевых продуктов, молочных продуктов, при изготовлении бумаги и т.д. Как упомянуто здесь выше,
биосинтетические полипептиды/полимеры по настоящему изобретению также можно использовать для связывания, например, с малыми молекулами и тому подобным.
Опять же, необходимо отметить, что термин "аминокислотная последовательность, имеющая и/или опосредующая первую биологическую активность" не ограничена полноразмерными полипептидами, которые имеют и/или опосредуют указанную биологическую активность или функцию, но также относится к их биологически и/или фармакологически активным фрагментам. Главным образом, но не только, в контексте, где два или более "первых домена", определенных здесь, содержатся в "биологически активном белке" по изобретению, также рассматривают, что эти "первые домены" составляют или представляют собой различные части белкового комплекса или фрагменты таких частей белкового комплекса.
Как приведено в примерах данной заявки ниже, биологически активные белки по изобретению, которые модифицированы таким образом, что содержат нерегулярный спиральный полипептид, неожиданно проявляют повышенную стабильность in vivo и/или in vitro по сравнению с немодифицированными биологически активными белками, в которых отсутствует нерегулярный спиральный домен. Употребляемый здесь термин "стабильность in vivo" относится к способности конкретного вещества, которое вводят в живой организм, сохраняться в биологически доступном и биологически активном виде. In vivo, вещество может быть удалено и/или инактивировано вследствие выведения, почечной фильтрации, захвата печенью, агрегации, разложения и/или других метаболических процессов. Соответственно, в контексте настоящего изобретения биологически активные белки, которые обладают повышенной стабильностью in vivo, могут менее быстро выводиться посредством почек (мочи) или посредством фекалий и/или могут быть более устойчивыми к протеолизу, в частности, к протеолизу in vivo в биологических жидкостях, таких как кровь, спинномозговая жидкость, жидкость брюшной полости и лимфа. В одном воплощении повышенная стабильность in vivo биологически активного белка проявляется в пролонгированном периоде полувыведения из плазмы указанного биологически активного белка. В частности, повышенная стабильность in vivo биологически активного белка представляет собой пролонгированный период полувыведения из плазмы
указанного биологически активного белка, содержащего указанный второй домен, по сравнению с биологически активным белком, в котором отсутствует второй домен.
Способы измерения стабильности in vivo биологически активных белков известны в данной области техники. Как приведено в примерах здесь ниже, биологически активные белки могут быть специфично обнаружены в плазме крови, методами Вестерн-блоттинга или твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Однако специалисту в данной области техники очевидно, что для специфичного измерения периода полувыведения из плазмы белка, представляющего интерес, можно использовать другие способы. Такие способы включают, но не ограничены ими, физическое обнаружение радиоактивно меченого белка, представляющего интерес. Способы радиоактивного мечения белков, например, посредством радиоактивного йодирования, известны в данной области техники.
Термин "повышенная стабильность in vitro", употребляемый здесь, относится к способности биологически активного белка выдерживать разложение и/или агрегацию и сохранять свою исходную биологическую активность в окружающей среде in vitro. Способы измерения биологической активности биологически активных белков хорошо известны в данной области техники.
Кроме того, предложен конъюгат лекарственного средства, который содержит определенный и описанный здесь нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент и низкомолекулярное лекарственное средство, которое конъюгировано с указанным нерегулярным спиральным полипептидом или полипептидным сегментом. Не ограничивающими примерами малых молекул являются дигоксигенин, флуоресцеин, доксорубицин, калихеамицин, камптотецин, фумагиллин, дексаметазон, гелданамицин, паклитаксел, доцетаксел, иринотекан, циклоспорин, бупренорфин, налтрексон, налоксон, виндезин, ванкомицин, рисперидон, арипипразол, палоносетрон, гранисетрон, цитарабин, NX1838, лейпролид, гозерелин, бузерелин, октреотид, тедуглутид, циленгитид, абареликс, энфувиртид, грелин и производные, тубулизины, производные платины, ингибиторы альфа-4 интегрина, антисмысловые нуклеиновые кислоты, малые интерферирующие РНК, микро РНК, стероиды, аптамеры ДНК или РНК,
пептиды, пептидомиметики. В целом настоящее изобретение также относится к конструкциям лекарственных средств, содержащим определенный здесь нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, и, в частности, молекулы, полезные в фармацевтике или медицине, такие как малые молекулы, пептиды или биомакромолекулы, такие как белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липидные везикулы и тому подобное. В прилагаемом иллюстративном экспериментальном разделе (см., например, Пример 22) предложено успешное создание конструкций/конъюгатов по настоящему изобретению, а также конструкций, где "малые химические молекулы" были конъюгированы с раскрытым здесь нерегулярным спиральным полипептидом. Таким образом, настоящие графические материалы и экспериментальная информация в соответствующих подписях к графическим материалам обеспечивают иллюстративные примеры, где раскрытые здесь конъюгаты лекарственных средств содержат (1) биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), и (2) малую молекулу, которая, в качестве иллюстрации, выбрана из дигоксигенина и флуоресцеина. Следует отметить, что эти примеры являются не только теоретическими. Флуоресцеин или производные флуоресцеина обычно используют в качестве диагностических средств, и медицинские растворы флуоресцеина имеются в продаже под торговыми названиями Fluoescite(r), AK-FLUOR(r) или Fluress(r). Такие соединения, конечно, могут извлечь выгоду от средств и способов, предложенных здесь. Дигоксигенин образует стероидную часть дигоксина, хорошо известного вторичного растительного метаболита с функцией, стимулирующей деятельность сердца, который, кроме того, содержит три сахара дигитоксозы. Дигоксин, и в меньшей степени близкородственное соединение дигитоксин, широко применяют для лечения желудочковых тахиаритмий и застойной сердечной недостаточности (Hauptman (1999) Circulation 99: 1265-1270). Все стимулирующие деятельность сердца стероиды являются эффективными и высокоспецифичными ингибиторами Ыа+/К+-АТФазы, локализованной в
клеточной плазматической мембране, посредством чего проявляют симпатолитические или положительные инотропные эффекты.
Определения и пояснения, приведенные здесь выше в контексте нерегулярного спирального полипептида или его полипептидного сегмента применимы, с соответствующими изменениями, в контексте конъюгата лекарственного средства, содержащего нерегулярный спиральный полипептид (или его полипептидный сегмент) и лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из (а) биологически активного белка или полипептида, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую активность, и (Ь) низкомолекулярного лекарственного средства.
Аминокислотный полимер, образующий нерегулярную спиральную конформацию/нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент), определенный и предложенный здесь, можно конъюгировать с малой молекулой/низкомолекулярным лекарственным средством. Посредством этого, время полувыведения из плазмы и/или растворимость малой молекулы/низкомолекулярного лекарственного средства можно увеличить, неспецифическую токсичность можно уменьшить, и пролонгированное воздействие активного лекарственного средства на клетки-мишени или структуры-мишени в организме может привести к усиленной фармакодинамике.
Возможна сайт-специфическая конъюгация N-конца нерегулярного спирального полипептида с активированным производным лекарственного средства, например, таким как производное сложного эфира N-гидроксисукцинимида (NHS) (Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA). Как правило, N-концевую аминогруппу можно подвергать химическому связыванию с широким разнообразием функциональных групп, таких как альдегиды и кетоны (с образованием оснований Шиффа, которые можно восстанавливать до аминов, применяя, например, боргидрид натрия или цианоборгидрид натрия), или с активированными производными карбоновых кислот (ангидридами, хлоридами, сложными эфирами и тому подобным, с образованием амидов) или с другими реакционными химическими веществами, такими как изоцианаты, изотиоцианаты, сульфонилхлориды и т.д. N-конец аминокислотного полимера/полипептида также можно сначала модифицировать подходящей
защитной группой, например, ацетильной группой, группой ВОС (mpem-бутокси-карбонильная) или группой FMOC (флуоренилметилоксикарбонильная) (Jakubke (1996) Peptide. Spektrum Akdemischer Verlag, Heidelberg, Germany). Кроме того, амино-конец может быть защищен пироглутамильной группой, которую можно образовать из остатка кодируемой аминокислоты Gin, предшествующей полипептиду или полипептидному сегменту Pro/Ala. После активации С-концевой карбоксилатной группы, например, с использованием общепринятых реагентов EDC (Ы-(З-диметиламинопропил)-Ы'-этилкарбодиимида) и NHS, сайт-специфическое сочетание с С-концом защищенного нерегулярного спирального полипептида может быть достигнуто, например, если лекарственное средство несет свободную аминогруппу.
Альтернативно N-конец или С-конец аминокислотного полимера, образующего нерегулярную спиральную конформацию/нерегулярный спиральный полипептид, может быть модифицирован имеющимся в продаже линкерным реагентом, предоставляющим малеимидную группу, что, таким образом, дает возможность химического связывания с тиольной группой как с частью молекулы лекарственного средства. Таким способом можно легко получить однородные конъюгаты лекарственных средств. Подобные методы, которые хорошо известны в данной области техники (Hermanson (1996) цит. выше), можно использовать для связывания нерегулярного спирального полипептида с пептидным или даже с белковым лекарственным средством. Можно легко получить такие пептиды или белки, несущие боковую цепь Lys или Cys, что дает возможность их связывания in vitro с аминокислотным полимером, образующим нерегулярную спиральную конформацию, посредством активных групп сложного эфира NHS или малеимида. Как правило, подобные конъюгаты лекарственных средств могут быть получены со слитыми белками, содержащими нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент). Однако, как проиллюстрировано также в прилагаемых Примерах и графических материалах, в настоящем изобретении также предложено получение нерегулярных спиральных полипептидов или нерегулярных спиральных полипептидных сегментов, которые содержатся в изобретательских конъюгатах по настоящему изобретению.
В качестве альтернативы однократной сайт-специфической конъюгации, к нерегулярному спиральному полипептиду могут быть присоединены
дополнительные боковые цепи на N- или С-конец или внутрь цепи, подходящие для химической модификации, такие как остатки лизина с их ?-аминогруппами, остатки цистеина с их тиольными группами или даже неприродные аминокислоты, дающие возможность конъюгации множественных малых молекул посредством, например, активных групп сложного эфира NHS или малеимида.
Кроме стабильной конъюгации, пролекарство может быть кратковременно связано с нерегулярным спиральным полипептидом. Связь может быть сконструирована для предсказуемого расщепления in vivo, либо посредством ферментативного механизма, либо посредством медленного гидролиза, инициируемого при физиологическом рН, подобно, например, тому, как слаборастворимый противоопухолевый агент камптотецин был конъюгирован с полимером ПЭГ, таким образом, достигая повышенного биологического распределения, сниженной токсичности, усиленной эффективности и опухолевой аккумуляции (Conover (1998) Cancer Chemother Pharmacol, 42:407-414). Примерами дополнительных пролекарств являются химиотерапевтические агенты, такие как доцетаксел (Liu (2008) J Pharm Sci. 97:3274-3290), доксорубицин (Veronese (2005) Bioconjugate Chem. 16: 775-784) или паклитаксел (Greenwald (2001) J Control Release 74:159-171).
Кроме того, малая молекула может быть связана со слитым белком, содержащим аминокислотный полимер/полипептид, генетически слитый с целевым доменом, например, с фрагментом антитела, что, таким образом, приводит к специфичной доставке низкомолекулярного лекарственного средства. В последнем случае иммунотоксины могут быть легко получены посредством конъюгации с цитотоксической малой молекулой, если целевой домен направлен против рецептора клеточной поверхности, который претерпевает, например, интернализацию.
В соответствии с вышеописанным, настоящее изобретение также относится, таким образом, к разработке раскрытого здесь биосинтетического нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента, содержащего аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, для последующего и дополнительного связывания с другими выбранными соединениями. Это указанное последующее и/или дополнительное связывание может
представлять собой и/или может включать первоначальное связывание указанного биосинтетического нерегулярного спирального полипептида или биосинтетического нерегулярного спирального полипептидного сегмента с другим соединением.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим нерегулярные спиральные полипептиды (или их сегменты) или биологически активные белки, описанные здесь. Соответственно, указанная молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, обладающий биологической активностью, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент). Термин "молекула нуклеиновой кислоты", употребляемый здесь, подразумевает включение таких молекул нуклеиновой кислоты, как молекулы ДНК и молекулы РНК. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитевой или двунитевой, но предпочтительно представляет собой двунитевую ДНК. Предпочтительно указанная молекула нуклеиновой кислоты может содержаться в векторе.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, который содержится в конъюгатах, предложенных здесь, таких как конъюгат лекарственного средства, определенный здесь, или к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей белковый конъюгат, который содержит биологически активный белок, определенный выше, и который дополнительно содержит биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala).
В одном воплощении предложена молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует конъюгат, такой как конъюгат лекарственного средства или конъюгат пищевого продукта, как определено выше, содержащая
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транслируемую аминокислотную и/или лидерную последовательность;
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую
биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный
сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую
исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная
аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50
аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala);
(3) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую биологически активный белок или указанный полипептид, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую активность, или белок, представляющий интерес, такой как белок для применения в других отраслях промышленности, таких как пищевая промышленность; и
(4) последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой стоп-кодон трансляции.
Вышеупомянутая "транслируемая аминокислотная и/или лидерная последовательность" в п. (1) может представлять собой, например, стартовый "М", то есть метионин, происходящий из соответствующего стартового кодона, она может также содержать нетранслируемые последовательности мРНК, такие как 5' последовательность вплоть до стартового кодона, которая включает, например, сайт связывания рибосомы. Такая последовательность может, однако, также включать классические лидерные и/или сигнальные последовательности, например, для секреции экспрессируемого белка в периплазму или в культуральную среду. Прокариотическими сигнальными пептидами являются, например, OmpA, MalE, PhoA, DsbA, pelB, Afa, npr, STII. Эукариотическими сигнальными пептидами являются, например, сигнальная последовательность меллитина медоносной пчелы, сигнальная последовательность кислого гликопротеина др67, сигнальная последовательность IgM мыши, сигнальная последовательность hGH.
Биологически активные белки или полипептиды, которые содержат или представляют собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую активность, а также другие белки, представляющие интерес, такие как белок для применения в других отраслях промышленности, были предложены здесь выше. Указанные воплощения применимы, с
соответствующими изменениями, к молекуле нуклеиновой кислоты (участкам/сегментам (3)), как проиллюстрировано здесь выше.
Стоп-кодоны трансляции для применения в молекуле нуклеиновой кислоты, предложенной здесь, хорошо известны в данной области техники и представляют собой, например, кодоны UAA, UAG или UGA.
В одном воплощении молекулы нуклеиновой кислоты, предложенные здесь выше, участки/сегменты (2) и (3) указанной молекулы нуклеиновой кислоты заменены в своем положении на указанную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую конъюгат, такой как конъюгат лекарственного средства или конъюгат пищевого продукта. Указанная молекула нуклеиновой кислоты будет содержать следующий порядок участков/сегментов:
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая
транслируемую аминокислотную и/или лидерную последовательность;
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая биологически
активный белок или указанный полипептид, который содержит или
представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или
опосредует биологическую активность, или белок, представляющий интерес,
такой как белок для применения в других отраслях промышленности, таких как
пищевая промышленность;
(3) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая
биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный
сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую
исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная
аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50
аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala); и
(4) последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет
собой стоп-кодон трансляции.
Молекулы нуклеиновой кислоты, предложенные здесь выше, могут также
возможно содержать сайт расщепления протеазой и/или сайт химического
расщепления и/или сайт распознавания между участками/сегментами (1) и (2)
и/или между участками/сегментами (2) и (3). Такие сайты химического
расщепления хорошо известны в данной области техники и включают,
например, специфичные, индивидуальные аминокислотные
последовательности (см., например, Lottspeich and Engels (Hrsg.) (2006)
Bioanalytik. 2. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Elsevier, Munchen, Germany). Например, цианогенбромид или цианогенхлорид расщепляет пептидную связь, следующую за остатком Met; гидроксиламин расщепляет связь аспарагинил-глицил; муравьиная кислота расщепляет Asp-Pro; 2-(2'-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3-броминоленин, 2-йодозобензойная кислота или N-хлорсукцинимид после Тгр; 2-нитро-5-тиоцианатобензойная кислота после Cys. Также рассмотрено и возможно, что остаток, предшествующий полипептиду или полипептидному сегменту Pro/Ala, может быть замещен на Met посредством сайт-направленного мутагенеза, и полученный слитый белок может быть затем расщеплен BrCN. Подобным образом, другие аминокислотные последовательности, содержащие сайт расщепления, могут быть введены в рекомбинантный слитый белок или его кодирующую нуклеиновую кислоту посредством сайт-направленного мутагенеза.
Полезные сайты распознавания/расщепления протеазой также известны в данной области техники. Они включают, но не ограничены ими: трипсин, химотрипсин, энтерокиназу, протеазу вируса гравировки табака (TEV), протеазу PreScission, протеазу HRV ЗС, протеазу SUMO, сортазу А, гранзим В, фурин, тромбин, фактор Ха или саморасщепляемые интегрины. Фактор Ха гидролизует пептидную связь при С-конце аминокислотной последовательности HeGluGlyArg, которая может быть встроена между N-концевым партнером слияния и полипептидом или полипептидным сегментом Pro/Ala. Особенно простым способом достижения протеолитического расщепления была бы вставка или замещение боковой цепи Lys или Arg на N-конце полипептидом или полипептидным сегментом Pro/Ala с последующим расщеплением трипсином, который не расщепляет внутри полипептида Pro/Ala или полипептидного сегмента, если внутренние боковые цепи Lys или Arg исключены. Иллюстративными сайтами распознавания являются, не ограничиваясь ими, D-D-D-D-K (энтерокиназа), ENLYFQ(G/S) (протеаза TEV), l-(E/D)-G-R (фактор Ха), L-E-V-L-F-Q-G-P (HRV ЗС), R-X-(K/R)-R (фурин), LPXTG (сортаза A), L-V-P-R-G (тромбин) или I-E-X-D-X-G (гранзим В).
Как очевидно из описания, приведенного здесь выше, в настоящем изобретении предложены полученные рекомбинантным путем биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды и полипептидные сегменты, которые могут быть конъюгированы с выбранными молекулами,
такими как полезные белки, фармацевтически активные полипептиды или малые молекулы, диагностически полезные полипептиды или малые молекулы или, среди прочего, другие полезные белки или малые молекулы других отраслей промышленности, таких как пищевая или бумажная промышленность, или добыча нефти. Таким образом, в настоящем изобретении также предложена нуклеиновая кислота, кодирующая биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую
транслируемую аминокислотную и/или лидерную последовательность;
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина; и
(3) последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой стоп-кодон трансляции.
Такая молекула нуклеиновой кислоты может, возможно, содержать между (1) и (2) сайт расщепления протеазой и/или сайт химического расщепления и/или сайт распознавания.
Для данной молекулы нуклеиновой кислоты воплощения, представленные здесь выше в контексте первых двух описанных молекул нуклеиновой кислоты (то есть сайт расщепления протеазой и/или химического расщепления и/или распознавания), также применимы здесь, с соответствующими изменениями.
Полезные иллюстративные сигнальные последовательности для применения в контексте данного изобретения включают, но не ограничены ими, прокариотические последовательности, такие как: OmpA, MalE, PhoA, DsbA, pelB, Afa, npr, STII, или эукариотические последовательности, такие как: сигнальная последовательность меллитина медоносной пчелы, сигнальная
последовательность кислого гликопротеина др67, сигнальная последовательность IgM мыши, сигнальная последовательность hGH.
В частности, молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, кодирующая биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, полезна в способах, которые также предложены здесь ниже, и которые проиллюстрированы в прилагаемых Примерах и графических материалах. Такой экспрессированный нерегулярный спиральный полипептид или нерегулярный спиральный полипептидный сегмент может быть выделен, например, из клеток-хозяев, экспрессирующих такой нерегулярный спиральный полипептид или нерегулярный спиральный полипептидный сегмент. Такие клетки-хозяева могут представлять собой клетки, трансфицированные, например, вектором, предложенным здесь.
Таким образом, предложено трансфицировать клетки молекулами нуклеиновой кислоты или векторами, описанными здесь. В следующем воплощении настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые при экспрессии кодируют нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) или биологически активные белки по изобретению. Кроме того, в следующем воплощении настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые при экспрессии кодируют раскрытые здесь полипептиды, которые, полностью или частично, образуют/принимают нерегулярную спиральную конформацию в водном растворе или в физиологических условиях. Указанные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть подвергнуты слиянию с подходящими последовательностями контроля экспрессии, известными в данной области техники, чтобы обеспечить правильную транскрипцию и трансляцию полипептида, а также сигнальные последовательности, чтобы обеспечить клеточную секрецию или направленность на органеллы. Такие векторы могут содержать дополнительные гены, такие как маркерные гены, которые дают возможность селекции указанного вектора в подходящих клетках-хозяевах и в соответствующих условиях.
Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержится в рекомбинантном векторе, в котором молекула нуклеиновой
кислоты, кодирующая описанный здесь биологически активный белок, оперативно связана с последовательностями контроля экспрессии, дающими возможность экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках. Экспрессия указанной молекулы нуклеиновой кислоты включает транскрипцию молекулы нуклеиновой кислоты в транслируемую мРНК. Регуляторные элементы, дающие возможность экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах, включают, например, промоторы PL фага лямбда, lac, trp, tac, ага, phoA, tet или T7 в Е. coli. Возможные регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно в клетках млекопитающих или дрожжей, хорошо известны специалистам в данной области техники. Они обычно содержат регуляторные последовательности, обеспечивающие инициацию транскрипции, и возможно сигналы поли-А, осуществляющие терминацию транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы могут включать как транскрипционные, так и трансляционные энхансеры и/или природно ассоциированные или гетерологичные промоторные участки. Примерами регуляторных элементов, дающих возможность экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах, являются промоторы АОХ1 или GAL1 в дрожжах или промоторы CMV, SV40, RSV (вируса саркомы Рауса), энхансер CMV, энхансер SV40 или интрон глобина в клетках млекопитающих и других животных. Кроме элементов, которые ответственны за инициацию транскрипции, такие регуляторные элементы могут также содержать сигналы терминации транскрипции, такие как Э\/40-поли-А сайт или tk-поли-А сайт, ниже кодирующей области.
Способы, которые можно использовать для конструирования рекомбинантных векторов, хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, методы, описанные в Sambrook (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory NY и Ausubel (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY). В данном контексте подходящие экспрессионные векторы известны в области техники, такие как экспрессионные кДНК векторы Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3, pPICZ альфа A (Invitrogen) или pSPORTI (GIBCO BRL). Кроме того, в зависимости от используемой экспрессионной системы, лидерные последовательности,
способные направлять полипептид в клеточный компартмент или способствовать его секреции в культуральную среду, можно присоединять к кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению.
Настоящее изобретение также относится к векторам, в частности, к плазмидам, космидам, вирусам и бактериофагам, которые общепринято применяют в генной инженерии, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) или биологически активный белок по изобретению. Предпочтительно, указанный вектор представляет собой экспрессионный вектор и/или вектор переноса гена или вектор-мишень. Экспрессионные векторы, имеющие происхождение от вирусов, таких как ретровирусы, вирус коровьей оспы, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса или вирус бычьей папилломы, можно использовать для доставки полинуклеотидов или вектора по изобретению в клеточные популяции-мишени.
Векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, могут быть трансфицированы в клетку-хозяина хорошо известными способами, которые варьируют в зависимости от типа клетки. Соответственно, далее изобретение относится к клетке, содержащей указанную молекулу нуклеиновой кислоты или указанный вектор. Такие способы, например, включают методы, описанные в Sambrook (1989), цит. выше, и Ausubel (1989), цит. выше. Соответственно, трансфекцию посредством хлорида кальция или электропорации обычно используют для прокариотических клеток, тогда как обработку фосфатом кальция или электропорацию можно использовать для других клеточных хозяев (Sambrook (1989), цит. выше). В качестве следующей альтернативы молекулы нуклеиновой кислоты и векторы по изобретению могут быть восстановлены в липосомах для доставки в клетки-мишени. Молекула нуклеиновой кислоты или вектор по изобретению, которые присутствуют в клетке-хозяине, могут быть либо интегрированы в геном клетки-хозяина, либо могут поддерживаться внехромосомно. Соответственно, настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор по данному изобретению. Клетки-хозяева для экспрессии полипептидов хорошо известны в данной области техники и включают как прокариотические клетки, так и эукариотические клетки,
например, клетки Е. coli, клетки дрожжей, клетки беспозвоночных, клетки СНО (клетки яичника китайского хомячка), клетки СНО-К1, клетки НЕК 293 (эмбриональные клетки почек человека), клетки Hela, клетки обезьяны COS-1 (клетки африканской зеленой мартышки), клетки меланомы, такие как клетки Bowes, клетки мыши L-929, клеточные линии ЗТЗ, имеющие происхождение от мышей Swiss, клетки мышей линии Balb-c или NIH, клеточные линии ВНК (клетки почек новорожденного хомячка) или НаК хомяка и тому подобное.
В следующем аспекте настоящее изобретение включает способы получения конъюгатов по настоящему изобретению, а также биосинтетического нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента) или биологически активных белков, предложенных здесь, и они включают культивирование клеток (хозяина) по данному изобретению и выделение указанного нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента), либо конъюгата, либо биологически активного белка из культуры, как описано здесь. Как правило, нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) по изобретению, конъюгат или биологически активный белок, содержащий нерегулярный спиральный домен, могут быть получены посредством технологии рекомбинантной ДНК, например, посредством культивирования клеток, содержащих описанную молекулу нуклеиновой кислоты или векторы, которые кодируют биологически активный белок или нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) по изобретению, и выделения указанного белка/полипептида из культуры. Биологически активный белок или нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) по изобретению может быть получен в любой подходящей системе культивирования клеток, включая прокариотические клетки, например, клетки Е. coli BL21, KS272 или JM83, или эукариотические клетки, например, Pichia pastoris, дрожжевой штамм Х-33 или клетки СНО. Дополнительные подходящие клеточные линии, известные в данной области техники, могут быть получены из банков-хранителей клеточных линий, таких как Американская Коллекция Типовых Клеточных Культур (АТСС).
Термин "прокариотический" подразумевают как включающий бактериальные клетки, тогда как термин "эукариотический" подразумевают как включающий клетки дрожжей, высших растений, насекомых и млекопитающих. Трансформированных хозяев можно выращивать в ферментерах и культивировать в соответствии с методами, известными в данной области
техники, для достижения оптимального клеточного роста. В следующем воплощении настоящее изобретение относится к способу получения нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента) или биологически активного белка, описанного выше, включающему культивирование клеток по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии биологически активного белка или нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента) и выделение указанного белка/полипептида из клетки или из культуральной среды.
Сам по себе нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) по настоящему изобретению предпочтительно не содержит какую-либо химически реакционную группу, за исключением, возможно, одной N-концевой первичной (или, в случае пролина, вторичной) аминогруппы и одной карбоксилатной группы на С-конце полимера. Однако специалисту в данной области техники очевидно, что биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид/полимер, предложенный здесь, может содержать химически реакционную группу, например, когда указанный нерегулярный спиральный полипептид/полимер составляет часть "слитого белка"/"слитой конструкции". Как также описано выше, биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) может быть получен путем рекомбинантной экспрессии в трансформированной клетке несколькими путями в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, например: (1) прямой экспрессии в цитоплазме посредством N-концевого остатка Met/стартового кодона; (2) секреции посредством N-концевого сигнального пептида, например, OmpA, PhoA (Monteilhet (1993) Gene. 1993 125:223-228), меллитина (Tessier (1991) Gene 98: 177-183), интерлейкина 2 (Zhang (2005) J Gene Med 7: 354-365), hGH (Pecceu (1991) Gene 97(2):253-258) и тому подобного, с последующим внутриклеточным расщеплением, приводящим к зрелому N-концу, такому как Ala или Pro; (3) экспрессии в виде слитого белка с другим растворимым белком, например, белком, связывающим мальтозу, на N-конце и с сайтом расщепления протеазой между ними (Kapust and Waugh (2000) Protein Expr. Purif. 19:312-318), с последующим специфичным расщеплением протеазой in vitro или in vivo, с высвобождением, таким образом, аминокислотного полимера/полипептида с его зрелым N-концом, таким как Ala или Pro. Другим подходящим партнером для слияния является белок SUMO,
который может отщепляться протеазой SUMO, как описано в Примерах 20 и 21.
Следующие партнеры для слияния включают, без ограничения, глутатион-S-
трансферазу, тиоредоксин, целлюлозосвязывающий домен,
альбуминсвязывающий домен, флуоресцентный белок (такой как GFP), белок А, белок G, интеин и тому подобное (Malhotra (2009) Methods Enzymol. 463:239258).
Как объяснено выше, описанные нерегулярные спиральные полипептиды
(или полипептидные сегменты)/полимеры преимущественно состоят из
остатков аланина и пролина, тогда как серии, треонин или аспарагин, которые
требуются для О- или N-гликозилирования, предпочтительно отсутствуют.
Следовательно, продуцирование самого полипептида или биологически
активного белка, содержащего нерегулярный спиральный полипептид (или его
полипептидный сегмент), или, как правило, слитого белка, содержащего
нерегулярный спиральный полипептид (или его полипептидный сегмент),
неожиданно может привести к монодисперсному продукту, в котором
предпочтительно отсутствуют посттрансляционные модификации в пределах
последовательности Pro-Ala. Это является преимуществом для получения
рекомбинантного белка в эукариотических клетках, таких как клетки яичника
китайского хомячка (СНО) или дрожжей, которые часто выбирают для
биосинтеза сложных белков. Например, дрожжи были использованы для
получения одобренных терапевтических белков, таких как инсулин,
гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор,
тромбоцитарный фактор роста или гирудин (Gerngross (2004) Nat. Biotechnol. 22:1409-1414). Клетки СНО служили для получения терапевтических белков, таких как фактор свертывания крови IX, интерферон (3-1 а, тенектеплаза (Chu (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:180-187) или гонадотропины, где гликокомпонент может положительно влиять на некоторые аспекты, такие как функциональная активность, укладка, димеризация, секреция, а также взаимодействие с рецептором, преобразование сигнала и метаболический клиренс (Walsh (2006) Nat. Biotechnol. 24:1241-1252). Соответственно, получение конструкций по изобретению, нерегулярных спиральных полипептидов и конъюгатов в эукариотических экспрессионных системах также раскрыто в контексте настоящего изобретения.
Посредством средств и способов, предложенных здесь, в настоящее время возможно изготовить и предоставить раскрытые здесь конъюгаты и молекулы, содержащие (1) биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, и (2) другую молекулу, представляющую интерес, такую как полезный белок, белковый сегмент или малая молекула. В настоящем изобретении, таким образом, также предложены способы получения или изготовления таких конъюгатов, а также биосинтетических нерегулярных спиральных полипептидов и/или содержащих их молекул или конъюгатов. Соответственно, в настоящем изобретении также предложен способ получения и/или изготовления нерегулярного спирального полипептида или нерегулярного спирального полипептидного сегмента, который содержится в конъюгатах, таких как конъюгаты лекарственных средств, конъюгаты пищевых продуктов, диагностические конъюгаты и тому подобное. Также предложены способы получения и/или изготовления биологически активного белка или конъюгата, содержащего нерегулярный спиральный полипептид или нерегулярный спиральный полипептидный сегмент. Кроме того, предложены способы получения и/или изготовления полипептида, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую активность и которая дополнительно содержит указанный нерегулярный спиральный полипептид или нерегулярный спиральный полипептидный сегмент. Эти способы, в частности, включают (в качестве одной стадии) культивирование клеток (хозяина), как предложено здесь выше, и (в качестве следующей стадии) выделение указанного нерегулярного спирального полипептида или биологически активного белка и/или указанного биологически активного белка и/или указанного полипептидного конъюгата из культуры или из указанной клетки. Такой изолированный нерегулярный спиральный, биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, а также изолированный конъюгат может затем подвергаться дальнейшим превращениям. Например, указанный биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный
сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, может быть химически сшит или связан с молекулой, представляющей интерес, что также показано в прилагаемых примерах. Кроме того, и в качестве альтернативы, молекула, представляющая интерес, может быть конъюгирована ферментативным путем, например, посредством трансглутаминазы (Besheer (2009) J Pharm Sci. 98:4420-8) или других ферментов (Subul (2009) Org. Biomol. Chem. 7:3361-3371), с указанным биосинтетическим нерегулярным спиральным полипептидом или полипептидным сегментом, содержащим аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков пролина и аланина.
Нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) и/или белковый конъюгат, содержащий нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент) и белок, представляющий интерес, такой как биологически или терапевтически активный белок или белок для применения, например, в диагностических способах, можно выделить (среди прочего) из питательной среды, клеточных лизатов, периплазмы или клеточных мембранных фракций. (Опять же, настоящее изобретение не ограничено (белковыми) конъюгатами, которые полезны в медицинском или фармацевтическом назначении. Средства и способы, предложенные здесь, также полезны в других отраслях промышленности, таких как, но не ограниченных ими, пищевая промышленность и производство напитков, производство пищевых добавок, бумажная промышленность, производство биологических реагентов, производство инструментов и реагентов для исследований, промышленность, где применяются ферменты, косметическая промышленность, переработка нефти и добыча нефти, и тому подобное). Выделение и очистку экспрессированных полипептидов по изобретению можно осуществлять любыми общепринятыми средствами (Scopes (1982) "Protein Purification", Springer, New York, NY), включая осаждение сульфатом аммония, аффинную очистку, колоночную хроматографию, гель-электрофорез и тому подобное, и которые также могут включать применение моноклональных или поликлональных антител, направленных, например, против метки, подвергнутой слиянию с биологически активным белком по изобретению. Например, белок может быть очищен посредством Sfrep-метки II, посредством
аффинной хроматографии на стрептавидине (Skerra (2000) Methods Enzymol. 326:271-304), как описано в прилагаемых примерах. Предпочтительны по существу чистые полипептиды по меньшей мере примерно от 90 до 95% гомогенности (на уровне белка), и наиболее предпочтительна гомогенность от 98 до 99% или более, в частности, для фармацевтического использования/применения. В зависимости от клетки-хозяина/организма, используемого в методе получения, полипептиды по настоящему изобретению могут быть гликозилированными или могут быть не гликозилированными.
Далее изобретение относится к применению биологически активного белка, нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента) или конъюгатов, таких как конъюгаты лекарственных средств по изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, вектора по изобретению или клетки (хозяина) по изобретению для приготовления лекарственного средства, где указанный биологически активный белок или лекарственное средство (или любая другая малая молекула или белок, представляющие интерес) обладает повышенной стабильностью in vivo и/или in vitro по сравнению с контрольной молекулой, не связанной с или не содержащей биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala).
В другом воплощении настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний и/или расстройств, для которых полезна улучшенная стабильность указанного биологически активного белка или лекарственного средства, включающему введение биологически активного белка или конъюгата лекарственного средства, описанного здесь, млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении. В зависимости от биологической активности белка или конъюгата лекарственного средства по изобретению, специалист в данной области техники способен легко определить, какое заболевание/расстройство подлежит лечению конкретным биологически активным белком или конъюгатом лекарственного средства по изобретению. Такие не ограничивающие примеры приведены в нижеследующей таблице:
Биологически активный белок
(или его биологически активный
компонент/фрагмент) или лекарственное средство
Расстройство/заболевание, подлежащее лечению
Гранулоцитарный
колониестимулирующий
фактор
нейтропения, обусловленная раком и/или химиотерапией
Гормон роста человека
Гипогликемия, обусловленная дефицитом гормона роста, и/или недостаточность роста
Интерферон а
рак, вирусная инфекция, гепатит С
Интерферон (3
Аутоиммунное заболевание, рассеянный склероз
Интерферон у
Вирусная инфекция
Фактор некроза опухоли
Рак
Интерлейкин-20
Псориаз
а-галактозидаза А
Болезнь Фабри
Антагонист миостатина
Саркопения
Желудочный
ингибиторный полипептид
Диабет II типа
альфа-1 антитрипсин
Заместительная ферментная терапия, муковисцидоз, хронические обструктивные заболевания легких, острый респираторный синдром, тяжелая астма
Эритропоэтин
Анемия
Фактор свертывания крови VIII
Гемофилия
gp120/gp160
ВИЧ
Растворимый рецептор фактора некроза опухоли I и II
Воспалительное заболевание
Ретеплаза
Тромбоз, инфаркт миокарда
Эксендин-4
Диабет
Антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1 га; анакинра)
Аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит
Интерлейкин-2
Рак
Инсулин
Диабет
Аспарагиназа
Острый лимфобластный лейкоз, неходжкинская лимфома
Онконаза
Злокачественная мезотелиома и другие типы рака
Стрептокиназа
Тромботические расстройства
Липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов
Бактериальная инфекция, реперфузионное повреждение почек
Антитела и их фрагменты, включая однодоменные антитела,
Иммунологические, онкологические, неоваскулярные и инфекционные заболевания и т.д.
одноцепочечные и другие сконструированные фрагменты, включая пептиды-миметики CDR и CDR
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
нейтропения, обусловленная химиотерапией
Фолликулостимулирующий гормон
Бесплодие
Глюкоцереброзидаза
Болезнь Гоше
Тимозин альфа 1
Хронический гепатит В, рак
Глюкагон
Гипогликемия
Соматостатин
Акромегалия
Аденозиндеаминаза
Дефицит аденозиндеаминазы
Интерлейкин-11
Тромбоцитопения
Фактор свертывания крови Vila
Гемофилия
Фактор свертывания крови IX
Гемофилия
Гематид
Анемия
Интерферон А
Гепатит С
Лептин
Липодистрофия, ожирение, болезнь Альцгеймера, диабет I типа
Субъединица альфа рецептора интерлейкина-22 (IL-22ra)
Псориаз
Интерлейкин-22
Метастатическая меланома
Гиалуронидаза
Серьезные опухоли
Фактор роста фибробластов 18
Остеоартрит
Фактор роста фибробластов 21
Диабет II типа, ожирение, дислипидемия, метаболические расстройства
Глюкагоноподобный пептид 1
Диабет
Остеопротегерин
Рак, остеопороз, ревматоидный артрит
Белок, связывающий IL-18
Ревматоидный артрит
Рилизинг-фактор гормона роста
ВИЧ-ассоциированная липодистрофия
Растворимый рецептор TACI
Системная красная волчанка, рассеянный склероз, ревматоидный артрит
Тромбоспондин-1
Рак
Растворимый рецептор VEGF Flt-1
Рак
IL-4 мутеин (антагонист рецептора IL-4)
Астма
Циклоспорин
Отторжение органа
Фумагиллин
Рак
Налтрексон
Алкогольная зависимость
Октреотид
Акромегалия, карциноидные опухоли
Тедуглутид
Синдром короткого кишечника, болезнь Крона
Гозерелин
Прогрессирующий рак простаты, рак молочной железы
Камптотецин
Рак
Ванкомицин
Грамположительные пневмонии
В соответствии с вышеописанным биологически активный белок, нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент), конъюгат лекарственного средства, нуклеиновая кислота, вектор или клетка могут быть применены для получения лекарственного средства, которое предпочтительно имеет или придает повышенную стабильность in vivo и/или in vitro, в частности, для биологически активного белка и/или лекарственного компонента, например, для лечения гормональных недостаточностей или родственных расстройств, аутоиммунного заболевания, рака, анемии, неоваскулярных заболеваний, инфекционных/воспалительных заболеваний, тромбоза, инфаркта миокарда, диабета, бесплодия, болезни Гоше, гепатита, гипогликемии, акромегалии, дефицита аденозиндеаминазы, тромбоцитопении, гемофилии, анемии, ожирения, болезни Альцгеймера, липодистрофии, псориаза, метастатической меланомы, остеоартрита, дислипидемии, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, рассеянного склероза, астмы, остеопороза и реперфузионного повреждения или других заболеваний почек. В одном воплощении биологически активный белок, конъюгат лекарственного средства, нуклеиновая кислота, вектор или клетка предназначены для применения в качестве лекарственного средства, которое обладает повышенной стабильностью in vivo и/или in vitro указанного биологически активного белка/конъюгата лекарственного средства. Подобным образом, биологически активный белок, нерегулярный спиральный полипептид (или его сегмент), конъюгат лекарственного средства, нуклеиновая кислота, вектор или клетка предназначены для применения в лечении или для лечения, например, гормональных недостаточностей или родственных расстройств, аутоиммунного заболевания, пролиферативных расстройств, таких как рак, анемии, неоваскулярных заболеваний, инфекционных и/или воспалительных заболеваний, тромбоза, инфаркта миокарда, инсульта, диабета, бесплодия, дисфункции пениса, болезни Гоше, болезни Фабри, саркопении, муковисцидоза, обструктивных заболеваний легких, острого респираторного
синдрома, гепатита, гипогликемии, акромегалии, дефицита аденозиндеаминазы, тромбоцитопении, гемофилии, анемии, ожирения, болезни Альцгеймера, липодистрофии, псориаза, метастатической меланомы, остеоартрита, дислипидемии, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, рассеянного склероза, астмы, остеопороза и реперфузионного повреждения или других заболеваний почек.
Настоящее изобретение также относится к применению молекул нуклеиновых кислот, векторов, а также трансфицированных клеток, предложенных здесь и включающих молекулы нуклеиновых кислот или векторы по настоящему изобретению, в медицинских подходах, таких как, например, подходы генотерапии на основе клеток или подходы генотерапии на основе нуклеиновых кислот.
В следующем воплощении нерегулярный спиральный полипептид (или его полипептидный сегмент), предложенный здесь, биологически активный, гетерологичный белок/белковая конструкция или конъюгат лекарственного средства или пищевого продукта или другие конъюгаты, содержащие биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид (или его полипептидный сегмент) и/или молекула нуклеиновой кислоты, либо вектор, либо клетка-хозяин по настоящему изобретению составляет часть композиции. Указанная композиция может содержать один или более чем один нерегулярный спиральный полипептид (или его полипептидный сегмент), биологически активный белок, конъюгат пищевого продукта, конъюгат, представляющий интерес, конъюгат лекарственного средства или молекулу нуклеиновой кислоты, вектор и/или клетку-хозяина, кодирующую и/или экспресирующую его, по изобретению. Указанная композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, возможно, дополнительно содержащую фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. В следующем воплощении настоящее изобретение относится к применению описанного здесь биологически активного белка, нерегулярного спирального полипептида (или его сегмента) или конъюгата лекарственного средства для получения фармацевтической композиции для предупреждения, лечения или облегчения заболеваний, которые требуют приема такой фармацевтической композиции.
Как упомянуто здесь выше, не только раскрытые здесь конъюгаты, такие как конъюгаты лекарственных средств или диагностические конъюгаты, и/или биологические активные, гетерологичные белки/белковые конструкции (содержащие нерегулярный спиральный полипептид или его полипептидный сегмент по изобретению) имеют, в частности, медицинское или фармацевтическое применение. Указанный нерегулярный спиральный полипептид или его полипептидный сегмент можно также применять как таковой в таком медицинском контексте, например, в качестве "плазмозаменителя" или в качестве заменителя крови при облегчении, предупреждении и/или лечении расстройства, обусловленного нарушенным количеством плазмы крови или содержанием плазмы крови, либо в облегчении, предупреждении и/или лечении расстройства, обусловленного нарушенным объемом крови. Расстройствами, которые лечат плазмозаменителями, являются, но не ограничены ими, расстройства, включающие потерю крови, такие как повреждения, операции, ожоги, травма или критические состояния брюшной полости, инфекции, обезвоживания и т.д. Кроме того, такое медицинское применение не ограничено нерегулярным спиральным полипептидом или полипептидным сегментом по данному изобретению, но может также распространяться на определенные конъюгаты лекарственных средств, раскрытых здесь, или даже на определенные биологически активные, гетерологичные белки/белковые конструкции.
В одном воплощении композиция, описанная здесь, может представлять собой диагностическую композицию, например, реагент визуализации, возможно, дополнительно содержащий подходящие средства для обнаружения, где указанная диагностическая композиция обладает повышенной стабильностью in vivo и/или in vitro.
Композиции по изобретению могут находиться в твердой или в жидкой форме и могут, среди прочего, находиться в форме порошка(ов), таблетки(ток), раствора(ов) или аэрозоля (аэрозолей). Кроме того, рассмотрено, что лекарственное средство по изобретению может содержать дополнительные биологически активные агенты в зависимости от предназначенного применения фармацевтической композиции.
Введение подходящих (фармацевтических) композиций можно осуществлять различными путями, например, путем парентерального,
подкожного, внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, местного, внутрибронхиального, внутрилегочного и интраназального введения, и, если желательно локальное лечение, введения внутрь повреждения. Парентеральное введение включает внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрикожное, подкожное, внутривенное или внутриартериальное введение. Композиции по изобретению можно также вводить непосредственно в сайт-мишень, например, путем биолистической доставки в наружный или внутренний сайт-мишень, такой как специфически пораженный орган.
Примеры подходящих фармацевтических носителей, эксципиентов и/или разбавителей хорошо известны в данной области техники и включают фосфатно-солевые буферные растворы или другие буферные растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода, различные типы увлажняющих агентов, стерильные растворы и т.д. Композиции, содержащие такие носители, можно готовить хорошо известными общепринятыми способами. Подходящие носители могут включать любое вещество, которое при объединении с биологически активным белком/конъюгатом лекарственного средства по изобретению сохраняет свою биологическую и/или фармацевтическую активность (см. Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed, Mack Publishing Company, Easton, PA). Препараты для парентерального введения могут включать стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Буферы, растворители и/или эксципиенты, которые применяют в контексте фармацевтической композиции, предпочтительно являются "физиологическими", как определено здесь выше. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включающие физиологический раствор и забуференные среды. Парентеральные растворители могут включать раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Внутривенные растворители могут включать жидкость и питательные наполнители, электролитные наполнители (такие как, например, на основе декстрозы Рингера) и тому подобное. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, включая антибактериальные агенты, антиоксиданты,
хелатирующие агенты и/или инертные газы и тому подобное. Кроме того, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать белковые носители, такие как, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, предпочтительно человеческого происхождения.
Эти фармацевтические композиции можно вводить субъекту в соответствующей дозе. Режим дозирования будет определять лечащий врач и клинические факторы. Как хорошо известно в области медицины, дозировки для любого пациента зависят от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, подлежащее введению, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные средства, вводимые одновременно. Фармацевтически активное вещество может присутствовать в количествах от 1 мкг до 20 мг/кг массы тела на дозу, например, от 0,1 мг до 10 мг/кг массы тела, например, от 0,5 мг до 5 мг/кг массы тела. Если режим представляет собой непрерывную инфузию, он должен также находиться в диапазоне от 1 мкг до 10 мг на килограмм массы тела в минуту. Кроме того, также рассмотрены дозы ниже или выше указанных примерных диапазонов, особенно с учетом вышеупомянутых факторов.
Кроме того, рассмотрено, что фармацевтическая композиция по изобретению может содержать дополнительные биологически или фармацевтически активные агенты в зависимости от предназначенного применения фармацевтической композиции. Эти дополнительные биологически или фармацевтически активные агенты могут представлять собой, например, антитела, фрагменты антител, гормоны, факторы роста, ферменты, связывающие молекулы, цитокины, хемокины, молекулы нуклеиновых кислот и лекарственные средства.
Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено фармацевтическими композициями. Также рассмотрены композиции для применения в исследованиях или диагностике. Например, рассмотрено, что биологически активные белки или конъюгаты лекарственных средств, содержащие нерегулярный спиральный домен или компонент, определенный здесь, применяют в диагностическом назначении. Для такой цели изобретательский биологически активный белок или конъюгат лекарственного средства по данному изобретению может быть помечен для возможности обнаружения. Такие метки включают, но не ограничены ими, радиоактивные
метки (такие как [3Н]водород, [1251]йод или [1231]йод), флуоресцентные метки (включая флуоресцентные белки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или флуорофоры, такие как флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ)) или метки ЯМР (такие как хелаты гадолиния). Метки или маркеры, определенные здесь, никоим образом не являются ограничивающими и представляют собой исключительно иллюстративные примеры. Диагностические композиции по данному изобретению особенно полезны в экспериментах регистрации или визуализации или в диагностической медицинской установке. В прилагаемых Примерах и графических материалах приведено получение соответствующей конструкции, которая включает конъюгаты, содержащие (1) биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), и (2) флуоресцеин или дигоксигенин; см. прилагаемые фиг. 13 и 14 и соответствующие подписи к фигурам, а также иллюстративный Пример 22.
Но не только фармацевтические или диагностические применения средств и способов, предложенных здесь, находятся в пределах сущности настоящего изобретения. Соединения/конъюгаты, предложенные здесь, также полезны в некоторых других отраслях промышленности, таких как пищевая промышленность, производство напитков, косметическая промышленность, нефтяная промышленность, бумажная промышленность и тому подобное. Таким образом, в настоящем изобретении также предложены применения биосинтетического нерегулярного спирального полипептида, предложенного здесь, в таких отраслях промышленности. Также часть данного изобретения представляет собой, соответственно, способ получения косметического средства, соединения для применения в косметической обработке, пищевого продукта или напитка, включающий культивирование клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты (или вектор), кодирующую нерегулярный спиральный полипептид, определенный здесь, или кодирующую биологически активный белок и/или биологически активный белок и/или полипептид, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует активность. Такой способ также включает
выделение из культуры или из клетки указанного нерегулярного спирального полипептида, указанного биологически активного белка и/или указанного биологически активного белка или указанного полипептида, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует активность, такую как биологическая активность, и который дополнительно содержит указанный нерегулярный спиральный полипептид или нерегулярный спиральный полипептидный сегмент. В том же контексте могут быть получены другие конъюгаты, представляющие интерес, например, конъюгаты, полезные в различных отраслях промышленности, таких как нефтяная или бумажная промышленность. Специалист в данной области техники способен легко адаптировать предложенные здесь средства и способы создания соответствующих молекулярных/рекомбинантных конструкций, а также создания конъюгатов, которые содержат биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), и малую молекулу или полипептид, представляющий интерес.
В другом воплощении в настоящем изобретении предложен набор, содержащий нерегулярный спиральный полипептид (или его полипептидный сегмент), биологически активный белок, конъюгат лекарственного средства, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный биологически активный белок и/или кодирующую указанный биологически активный белок и/или кодирующую указанный полипептид, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует активность (например, биологическую активность), вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, или клетку, содержащую указанную молекулу нуклеиновой кислоты или указанный вектор, как описано здесь. Набор по настоящему изобретению может дополнительно содержать буфер(ы), растворы для хранения и/или дополнительные реагенты или материалы, необходимые для проведения медицинских, научных или диагностических анализов и целей. Кроме того, части набора по изобретению могут быть
упакованы индивидуально во флаконы или бутыли или в комбинации в контейнерах или многоконтейнерных устройствах.
Набор по настоящему изобретению можно преимущественно применять, среди прочего, для осуществления способа по изобретению, и его можно применять в разнообразных областях применения, упомянутых здесь, например, в качестве диагностических наборов, в качестве исследовательских инструментов или в качестве медицинских средств. Кроме того, набор по изобретению может содержать средства для обнаружения, пригодные для научных, медицинских и/или диагностических целей. При изготовлении наборов предпочтительно следуют стандартным методам, которые известны специалисту в данной области техники.
Далее изобретение проиллюстрировано приведенными ниже не ограничивающими графическими материалами и Примерами.
Фиг. 1. Конструирование гена полимерной/полипептидной последовательности РА#1 Pro/Ala
Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность строительного блока РА#1 (SEQ ID NO: 1), полученная посредством гибридизации двух комплементарных олигодезоксинуклеотидов (олигодезоксинуклеотид верхней/кодирующей нити SEQ ID NO: 17, олигодезоксинуклеотид нижней/некодирующей нити SEQ ID NO: 18). Полученная в результате нуклеиновая кислота имеет два липких конца (показанных строчными буквами), соответствующих кодону Ala и антикодону, соответственно, и они взаимно совместимы. При повторяющемся лигировании такого строительного блока могут быть получены конкатемеры, кодирующие Pro-Ala полипептиды различных длин, а затем клонированы, например, посредством сайта(ов) рестрикции Sapl.
Фиг. 2. Стратегии клонирования полимерной/полипептидной последовательности Pro/Ala в виде слитого белка с Fab фрагментом или с IFNa2b человека
(А) Участок нуклеотидной и кодируемой аминокислотной последовательности (верхняя/кодирующая нить SEQ ID NO: 19, нижняя/некодирующая нить SEQ ID NO: 20, кодируемая аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 21) около С-конца легкой цепи иммуноглобулина Fab фрагмента антитела, который кодируется на pASK88-
Fab-2xSapl (SEQ ID NO: 22), производном pASK75, используемого для субклонирования полимерных/полипептидных последовательностей Pro/Ala и экспрессии соответствующих биологически активных белков. Нуклеотидная последовательность несет два сайта распознавания Sapl во взаимно обратной ориентации, что приводит при расщеплении к выступающим концам ДНК, которые совместимы с синтетической генной кассетой, показанной на фиг. 1. Последовательности распознавания и С-концевые аминокислоты легкой цепи подчеркнуты.
(B) Нуклеотидная последовательность и кодируемая аминокислотная последовательность (верхняя/кодирующая нить SEQ ID NO: 23, нижняя/некодирующая нить SEQ ID NO: 24, кодируемая аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 25) полимера/полипептида РА#1 из 20 остатков после вставки одной кассеты, как показано на фиг. 1, в плазмиду pASK88-Fab-2xSapl. Подобное лигирование/вставка 10 таких повторяющихся кассет привела к плазмидному вектору pFab-PA#1 (200) (Seq ID NO: 28), кодирующему полимер/полипептид из 200 остатков (SEQ ID NO: 26 и 27). Сайты рестрикции Sapl, фланкирующие последовательность, кодирующую полимер Pro/Ala, отмечены (последовательности распознавания подчеркнуты).
(C) Карта плазмиды pFab-PA#1 (200) (SEQ ID NO: 28). Структурные гены для тяжелой цепи (НС) и легкой цепи (LC) Fab-PA#1 (200) находятся под транскрипционным контролем тетрациклинового промотора/оператора (tetp/0), и оперон заканчивается липопротеиновым терминатором (tipp). НС содержит бактериальный сигнальный пептид ОтрА, вариабельный домен (VH) и константный С домен первого lgG1 человека (СН), а также Hise-метку. LC содержит бактериальный сигнальный пептид PhoA, вариабельный домен (VL) и константный домен легкой цепи человека (CL), полимер/полипептид РА#1 из 200 остатков. Плазмидный каркас pFab-PA#1(200) снаружи экспрессионной кассеты, фланкированной сайтами рестрикции Xbal и Hind\\\, идентичен таковому у вектора для общепринятого клонирования и экспрессии pASK75 (Skerra (1994) Gene 151:131-135). Указаны уникальные сайты рестрикции.
(D) Участок нуклеотидной и аминокислотной последовательности
(верхняя/кодирующая нить SEQ ID NO: 29, нижняя/некодирующая нить SEQ ID
NO: 30, кодируемая аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 31) около
N-конца IFNa2b человека, клонированного на pASK-IFNa2b (SEQ ID NO: 32).
Единственный сайт рестрикции Sapl, который можно использовать для вставки последовательности, кодирующей Pro/Ala, отмечен (последовательность распознавания подчеркнута). Две С-концевые аминокислоты Sfrep-метки II подчеркнуты. Первая аминокислота зрелого IFNa2b отмечена +1.
(E) Участок нуклеотидной и кодируемой аминокислотной
последовательности (верхняя/кодирующая нить SEQ ID NO: 33,
нижняя/некодирующая нить SEQ ID NO: 34, кодируемая аминокислотная
последовательность SEQ ID NO: 35) N-конца IFNa2b после вставки одной
кассеты последовательности полимера РА#1, как показано на фиг. 1.
Единственный сайт рестрикции Sapl, который остается после вставки
последовательности, кодирующей полимер Pro/Ala, отмечен
(последовательности распознавания подчеркнуты). Первая аминокислота
IFNa2b в составе слитого белка отмечена (1), и две С-концевые аминокислоты
Sfrep-метки II подчеркнуты. Подобное лигирование/вставка 10 повторяющихся
кассет последовательности полимера РА#1 привело к плазмидному вектору
pPA#1(200)-IFNa2b, кодирующему полимер/полипептид из 200 остатков (SEQ ID
NO: 36)
(F) Карта плазмиды pPA#1(200)-IFNa2b (SEQ ID NO: 37). Структурный ген
для биологически активного белка PA#1(200)-IFNa2b (содержащий
бактериальный сигнальный пептид ОтрА, Sfrep-метку II,
полимер/полипептидный сегмент РА#1 из 200 остатков и IFNa2b человека)
находится под транскрипционным контролем тетрациклинового
промотора/оператора (tetp/0), и заканчивается липопротеиновым терминатором
(tipP). Плазмидный каркас pFab-PA#1(200) снаружи экспрессионной кассеты,
фланкированной сайтами рестрикции Xbal и Hind\\\, идентичен таковому у
вектора для общепринятого клонирования и экспрессии pASK75 (Skerra (1994)
цит. выше). Указаны уникальные сайты рестрикции.
Фиг. 3. Анализ очищенного рекомбинантного Fab фрагмента и очищенного рекомбинантного IFNa2b, а также их слитых белков с полипептидом/полимером Pro/Ala, посредством электрофореза в ДСН-ПААГ
Рекомбинантные белки получали в Е. coli KS272 (Strauch (1988) Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 85:1576-80) посредством периплазматической секреции и очищали посредством Швб-метки (Fab) или Sfrep-метки II (IFNa2b), применяя
аффинную хроматографию с иммобилизованными ионами металлов или стрептавидином, соответственно.
(A) Анализ очищенного рекомбинантного Fab и его слитого белка с РА#1 из 200 остатков посредством электрофореза в 12% ДСН-ПААГ. На геле представлены 2 мкг образца белка каждого из Fab и Fab-PA#1(200). Образцы слева были восстановлены 2-меркаптоэтанолом, тогда как повторяющиеся образцы справа были оставлены невосстановленными. Размеры белковых маркеров, нанесенных в восстанавливающих условиях, указаны по левому краю. При восстановлении межцепочечного дисульфидного мостика Fab фрагмент и его слитый белок с РА#1 из 200 остатков выглядят как две гомогенные полосы. В случае восстановленного Fab фрагмента две полосы с молекулярными размерами примерно 24 и 26 кДа, соответственно, соответствуют разделенным LC и НС. В случае восстановленного слитого белка Fab-PA#1 (200) полоса при 24 кДа соответствует НС, тогда как полоса примерно при 90 кДа соответствует LC, подвергнутой слиянию с полипептидным сегментом РА#1(200). В невосстанавливающих условиях Fab фрагмент и его слитый с РА#1(200) белок выглядят как единые гомогенные полосы с кажущимися молекулярными размерами примерно 45 кДа и 100 кДа, соответственно. Эти два значения кажущегося размера для слитого белка Fab-РА#1(200) значительно больше, чем вычисленные массы, 64,3 кДа для невосстановленного Fab-PA#1 (200) и 39,1 кДа для изолированного LC-РА#1(200). Этот эффект является следствием присоединения полимера/полипептидного сегмента Pro/Ala, поскольку сам Fab фрагмент с вычисленной массой 48,0 кДа или его не слитая легкая цепь проявляют по существу нормальную электрофоретическую подвижность.
(B) Анализ очищенного рекомбинантного IFNa2b и его слитого белка с РА#1 из 200 остатков посредством электрофореза в 12% ДСН-ПААГ. На геле представлены 2 мкг образца белка каждого из IFNa2b и PA#1(200)-IFNa2b. Образцы слева были восстановлены 2-меркаптоэтанолом, тогда как соответствующие образцы справа были оставлены невосстановленными. Размеры белковых маркеров, нанесенных в восстанавливающих условиях, указаны по левому краю. Два белка выглядят как единые гомогенные полосы с кажущимися молекулярными размерами примерно 20 кДа и примерно 80 кДа в восстановленной форме. Последнее значение значительно больше, чем
(A)
вычисленная масса 37,0 кДа для PA#1(200)-IFNa2b. Этот эффект является следствием присоединения полимера/полипептидного сегмента Pro/Ala, поскольку сам IFNa2b с вычисленной массой 20,9 кДа проявляет по существу нормальную электрофоретическую подвижность. IFNa2b в невосстановленном состоянии имеет несколько более высокую электрофоретическую подвижность, что указывает на более компактную форму в результате его двух внутримолекулярных дисульфидных мостиков.
Фиг. 4. Количественный анализ гидродинамических объемов очищенных рекомбинантных Fab и IFNa2b, а также их слитых с РА#1(200) белков
(A) Аналитическая эксклюзионная хроматография (ЭХ) Fab и Fab-РА#1(200). 250 мкл очищенного белка при концентрации 0,25 мг/мл наносили на колонку Superdex S200 10/300 GL, уравновешенную буфером ФСБ (фосфатно-солевой буфер). Проводили мониторинг поглощения при 280 нм, и пик каждого хроматографического пробега нормализовали до значения 1. Стрелкой указан пустой объем колонки (7,8 мл).
(B) Калибровочная кривая хроматограмм из (А) с использованием колонки Superdex S200 10/300 GL. Логарифм молекулярной массы (MW) маркерных белков (цитохром с, 12,4 кДа; карбоангидраза, 29,0 кДа; овальбумин, 43,0 кДа; бычий сывороточный альбумин, 66,3 кДа; алкогольдегидрогеназа, 150 кДа, (3-амилаза, 200 кДа, апоферритин, 440 кДа) наносили против их объемов элюирования (черные кружки) и выравнивали в соответствии с прямой линией. На основании наблюдаемых объемов элюирования Fab фрагмента и его слитого с РА#1 белка (черные квадраты) их кажущиеся молекулярные размеры были определены, как следующие: Fab: 31 кДа (действительная масса: 48,0 кДа); Fab-PA#1 (200): 237 кДа (действительная масса: 64,3 кДа). Эти данные демонстрируют, что слияние с полипептидом РА#1 придает значительно увеличенный гидродинамический объем.
(C) Аналитическая эксклюзионная хроматография IFNa2b и РА#1(200)-IFNa2b. 250 мкл каждого очищенного белка при концентрации 0,25 мг/мл наносили на колонку Superdex S200 10/300 GL, уравновешенную фосфатно-солевым буфером, ФСБ. Проводили мониторинг поглощения при 280 нм, и пик каждого хроматографического пробега нормализовали до значения 1. Стрелкой указан пустой объем колонки (7,8 мл).
(A)
(D) Калибровочная кривая хроматограмм из (С) с использованием колонки Superdex S200 10/300 GL. Логарифм молекулярной массы (MW) маркерных белков (см. В) наносили против их объемов элюирования (черные кружки) и выравнивали в соответствии с прямой линией. На основании наблюдаемых объемов элюирования IFNa2b и его слитого белка РА#1 (черные квадраты) их кажущиеся молекулярные размеры были определены, как следующие: IFNa2b: 22,5 кДа (действительная масса: 20,9 кДа); РА#1(200)-IFNa2b: 229,0 кДа (действительная масса: 37,0 кДа). Эти данные демонстрируют, что слияние с полипептидом РА#1 придает значительно увеличенный гидродинамический объем.
Фиг. 5. Экспериментальный анализ вторичной структуры рекомбинантных белков и их слитых с полимером/полипептидом РА#1 белков посредством спектроскопии кругового дихроизма (CD)
Спектры снимали при комнатной температуре в буфере 50 мМ K2SO4, 20 мМ К-фосфат рН 7,5 и нормализовали до молярной эллиптичности, (c)м, для каждого белка.
(A) Спектры CD очищенного рекомбинантного Fab и Fab-PA#1(200). Спектр CD для Fab фрагмента демонстрирует типичные признаки преобладающего р-складчатого белка с широким отрицательным максимумом около 216 нм (Sreerama in: Circular Dichroism - Principles and Applications (2000) Berova, Nakanishi and Woody (Eds.) Wiley, New York, NY, pp. 601-620), что указывает на правильную укладку получаемого в бактериях Fab фрагмента. Спектр его слитого белка с полимером/полипептидом Pro/Ala проявляет доминирующую отрицательную полосу ниже 200 нм, что является показателем нерегулярной спиральной конформации. Кроме того, присутствует плечо около 220 нм, которое является результатом вклада р-слоя Fab фрагмента и указывает на его правильную укладку даже в виде части слитого белка.
(B) Молярный разностный спектр CD для Fab-PA#1(200), полученный путем вычитания спектра для Fab фрагмента. Разностный спектр CD представляет вторичную структуру полимера/полипептидного сегмента РА#1 из 200 остатков и проявляет сильный минимум около 200 нм, что является четким указанием на нерегулярную спиральную конформацию в забуференном водном
(A)
растворе (Greenfield (1969) Biochemistry 8: 4108-4116; Sreerama (2000) цит. выше; Fandrich (2002) EMBO J. 21:5682-5690).
(C) Спектры CD очищенного рекомбинантного IFNa2b и PA#1(200)-IFNa2b. Спектр CD для IFNa2b демонстрирует типичные признаки преобладающего а-спирального белка с двумя отрицательными полосами около 208 нм и 220 нм (Sreerama (2000) цит. выше), что указывает на правильную укладку получаемого в бактериях IFNa2b человека. Спектр его слитого белка с полимером/полипептидом Pro/Ala проявляет характерные отклонения с доминантным минимумом около 200 нм, что является показателем нерегулярной спиральной конформации. Кроме того, присутствует плечо около 220 нм, которое является результатом а-спирального вклада IFNa2b и указывает на правильную укладку IFNa2b даже в виде части слитого белка.
(D) Молярный разностный спектр CD для PA#1(200)-IFNa2b, полученный путем вычитания спектра для IFNa2b. Разностный спектр CD представляет вторичную структуру полимера/полипептидного сегмента РА#1 из 200 остатков и проявляет сильный минимум около 200 нм, по существу идентичный представленному в (В). Это снова является четким показателем нерегулярной спиральной конформации в забуференном водном растворе для биологического полимера, содержащего остатки Pro и Ala, в соответствии с изобретением.
Фиг. 6. Секреторное получение слитого белка между гормоном роста человека (hGH) и генетически кодируемым полимером РА#1 в клетках СНО
(А) Участок нуклеотидной и аминокислотной последовательности (верхняя/кодирующая нить SEQ ID NO: 38, нижняя/некодирующая нить SEQ ID NO: 39, кодируемая аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 40) около N-конца hGH, клонированного на pASK75-His6-hGH (SEQ ID NO: 41). Единственные сайты рестрикции Nhe\, которые можно использовать вместе с Hind\\\ (не показан) для субклонирования, и Sapl, который можно использовать для вставки последовательности, кодирующей полимер Pro/Ala, отмечены (последовательность распознавания подчеркнута). Шесть аминокислот His6-метки подчеркнуто. Первая аминокислота hGH отмечена +1.
(B) Нуклеотидная и кодируемая аминокислотная последовательность (верхняя/кодирующая нить SEQ ID NO: 42, нижняя/некодирующая нить SEQ ID NO: 43, кодируемая аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 44) N-конца hGH после вставки одной кассеты последовательности полимера РА#1, как показано на фиг. 1. Единственные сайты рестрикции Nhe\, которые можно использовать для субклонирования, и Sapl, который сохраняется после вставки последовательности, кодирующей полимер Pro/Ala, отмечены (последовательности распознавания подчеркнуты). Первая аминокислота hGH в составе слитого белка отмечена (1), и аминокислоты Hise-метки подчеркнуты. Подобное лигирование/вставка 10 повторяющихся кассет последовательностей полимера РА#1 привела к плазмидному вектору pASK75-His6-PA#1(200)4nGH, кодирующему зрелый слитый белок SEQ ID NO: 45.
(C) Карта плазмиды pASK75-His6-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 46). Структурный ген для биологически активного белка His6-PA#1(200)4nGH (содержащего бактериальный сигнальный пептид ОтрА, Ывб-метку, полимер/полипептидный сегмент РА#1 из 200 остатков и GH человека) находится под транскрипционным контролем тетрациклинового промотора/оператора (tetp/0), и заканчивается липопротеиновым терминатором (tipP). Плазмидный каркас pFab-PA#1(200) снаружи экспрессионной кассеты, фланкированной сайтами рестрикции Xbal и Hind\\\, идентичен таковому у вектора для общепринятого клонирования и экспрессии pASK75 (Skerra (1994); цит. выше). Указаны уникальные сайты рестрикции.
(D) Карта плазмиды pCHO-PA#1(200)-hGH, которая кодирует слитый белок His6-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 47). Структурный ген, содержащий сигнальный пептид гормона роста человека (Sp), Hise-метку, последовательность полимера/полипептида РА#1 из 200 остатков (РА#1(200)), гормон роста человека (hGH), и содержащий сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH рА), находится под транскрипционным контролем промотора цитомегаловируса (CMVP). Указаны уникальные сайты рестрикции Nhe\ и Hind\\\. Ген устойчивости неомицинфосфотрансферазы (пео) находится под контролем промотора SV40 (SV40P), и за ним следует сигнал полиаденилирования SV40 (SV40 рА). Кроме того, плазмида содержит точку начала репликации бактерий ColE1 (ColEI-ori), точку начала репликации
(B)
бактериофага f1 (f 1 -ori) и ген (3-лактамазы (bla), чтобы дать возможность размножения и селекции в Е. coli.
(Е) Вестерн-блот-анализ слитого белка между hGH и генетически кодируемым полимером РА#1 из 200 остатков, полученного в клетках СНО, по сравнению с рекомбинантным hGH. Клетки СНО-К1 трансфицировали либо pCHO-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 48), либо pCHO-hGH (SEQ ID NO: 49), подобной плазмидой, кодирующей hGH без последовательности РА#1(200) (но также несущей Ыэб-метку). Через двое суток после трансфекции образец супернатанта клеточной культуры подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и вестерн-блоттингу с антителом против hGH, конъюгированным с пероксидазой хрена. Два белка выглядят как единственные полосы, указанные стрелками, с кажущимися молекулярными размерами примерно 23 кДа (His6-hGH) и примерно 90 кДа (His6-PA#1-hGH). Присутствует также слабая полоса около 60 кДа, образуемая сывороточными белками в культуральной среде. Если His6-меченый hGH выглядит на уровне вычисленной массы 23,5 кДа, кажущийся молекулярный размер His6-PA#1-hGH значительно больше, чем его вычисленная масса 39,5 кДа. Этот эффект является следствием гидрофильной нерегулярной спиральной природы полимера Pro-Ala.
Фиг. 7. Теоретическое предсказание вторичной структуры для последовательности РА#1 полипептида/полимера Pro/Ala
Данная иллюстрация демонстрирует результат компьютерного алгоритма CHOFAS в соответствии со способом Чоу-Фасмана (Chou and Fasman (1974) Biochemistry 13: 222-245), который применен на сервере Сравнения последовательностей и Предсказания вторичной структуры в Университете Вирджинии (URL: http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2). Во избежание пограничных эффектов на амино- и карбокси-концах 20-мерный аминокислотный повтор в соответствии с фиг. 1 был вклеен в виде трех последовательных копий (с получением конкатемера, подобного кодируемому после повторного лигирования/вставки синтетической генной кассеты), и учитывали результат только центрального 20-мерного блока последовательности (в прямоугольнике). В случае полипептидной последовательности/сегмента РА#1 (SEQ ID NO: 1) алгоритм Чоу-Фасмана предсказывает 100% а-спиральную вторичную структуру. Это противоречит экспериментально наблюдаемой преобладающей нерегулярной спиральной
конформации для полипептида/полипептидного сегмента РА#1 в виде части слитого белка (см. фиг. 5B/D).
Фиг. 8: Количественный анализ фармакокинетики очищенного рекомбинантного Fab фрагмента и его слитых белков с полимером РА#1 из 200 и 600 остатков у мышей BALB/c
Образцы плазмы из Примера 16 анализировали на концентрациях Fab, Fab-PA#1 (200) и Fab-PA#1 (600) с использованием сэндвич-анализа ELISA. Для оценки периода полувыведения из плазмы Fab, Fab-PA#1 (200) и Fab-PA#1 (600) измеренные значения концентрации наносили на график против времени после внутривенной инъекции и численно выравнивали, принимая би-экспоненциальный распад. Неслитый Fab фрагмент претерпевал очень быстрый клиренс с периодом полувыведения 1,3 ± 0,1 ч. Напротив, фаза элиминации, определенная для Fab-PA#1 (200) и Fab-PA#1(600), была значительно медленнее, с конечными периодами полувыведения 4,1 ± 1,8 ч и 38,8 ± 11,2 ч соответственно, что, таким образом, демонстрирует примерно 3-кратно и примерно 30-кратно пролонгированную циркуляцию за счет слияния с полимером Pro/Ala из 200 или 600 остатков по сравнению с неслитым Fab фрагментом.
Фиг. 9: Анализ очищенного рекомбинантного Fab фрагмента в виде слитого белка с полимером Р1А1 или Р1АЗ, имеющим 200 остатков
Рекомбинантные белки получали в Е. coli KS272 посредством периплазматической секреции и очищали посредством Hise-метки, применяя аффинную хроматографию с иммобилизованными ионами металлов. Очищенные белки анализировали посредством электрофореза в 12% ДСН-ПААГ. На геле представлены 2 мкг образца каждого белка из Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3(200), а также для сравнения неслитого Fab фрагмента (см. фиг. ЗА). Образцы слева были восстановлены 2-меркаптоэтанолом, тогда как аналогичные образцы справа были оставлены невосстановленными. Размеры белковых маркеров, нанесенных в восстанавливающих условиях, указаны по левому краю. После восстановления межцепочечных дисульфидных мостиков Fab фрагмент и его слитый белок из 200 остатков Pro/Ala выглядят как две гомогенные полосы. В случае восстановленного Fab фрагмента две полосы с молекулярными размерами примерно 24 и 26 кДа, соответственно, соответствуют отдельным фрагментам легкой цепи (LC) и тяжелой цепи (НС). В
случае восстановленного слитого белка Fab-P1A1(200) полоса при 24 кДа соответствует НС, тогда как полоса примерно при 90 кДа соответствует LC, подвергнутой слиянию с полипептидом Р1А1(200). В случае восстановленного слитого белка Fab-P1A3(200) полоса при 24 кДа соответствует НС, тогда как полоса примерно при 75 кДа соответствует LC, подвергнутой слиянию с полипептидом Р1А5(200). В невосстанавливающих условиях Fab фрагмент, его слитый с Р1А1(200) и с Р1АЗ(200) белок выглядят как единые отчетливые полосы с кажущимися молекулярными размерами примерно 45 кДа, 110 кДа и 90 кДа, соответственно. Кажущиеся размеры для слитых белков Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3(200) значительно больше, чем вычисленные массы 65,3 кДа для невосстановленного Fab-P1A1(200) и 64,0 кДа для невосстановленного Fab-Pi А3(200). Кажущиеся размеры для соответствующих восстановленных легких цепей также значительно больше, чем вычисленные массы 40,7 кДа для Р1А1(200) LC и 39,4 кДа для Р1АЗ(200) LC. Этот эффект является следствием присоединения полимера/полипептидного сегмента Pro/Ala, поскольку сам Fab фрагмент с вычисленной массой 48,0 кДа или его неслитая легкая цепь с вычисленной массой 23,4 кДа проявляют по существу нормальную электрофоретическую подвижность.
Фиг. 10. Количественный анализ гидродинамических объемов очищенных рекомбинантных слитых белков Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3(200)
Аналитическая эксклюзионная хроматография (ЭХ) Fab-P1A1(200) и Fab-Pi А3(200). 250 мкл очищенного белка при концентрации 0,25 мг/мл наносили на колонку Superdex S200 10/300 GL, уравновешенную буфером ФСБ. Проводили мониторинг поглощения при 280 нм, и пик каждого хроматографического пробега нормализовали до значения 1. Стрелкой указан пустой объем колонки (7,8 мл). На основании наблюдаемых объемов элюирования слитых белков их кажущиеся молекулярные размеры были определены с использованием похожей калибровочной кривой, показанной на фиг. 4В, как следующие: Fab-Р1А1(200): 180,7 кДа (действительная масса: 65,3 кДа); Fab-P1A3(200): 160,2 кДа (действительная масса: 64,0 кДа). Эти данные демонстрируют, что слияние белка с полипептидом Р1А1 и/или Р1А5 придает значительно увеличенный гидродинамический объем.
Фиг. 11. Экспериментальный анализ вторичной структуры слитых белков Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3(200) посредством спектроскопии кругового дихроизма (CD)
Спектры снимали при комнатной температуре в буфере 50 мМ K2SO4, 20 мМ К-фосфат рН 7,5 и нормализовали до молярной эллиптичности, @м, для каждого белка.
(A) Спектры CD очищенного рекомбинантного Fab-P1A1(200) и Fab-Pi А3(200). Каждый из спектров CD слитых белков Fab с обоими полимерами/полипептидами Pro/Ala проявлял доминирующую отрицательную полосу ниже 200 нм, что является показателем нерегулярной спиральной конформации. Кроме того, присутствует плечо около 220 нм, которое является результатом вклада р-слоя Fab фрагмента и указывает на его правильную укладку даже в составе слитого белка.
(B) Молярные разностные спектры CD для Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3 (200), полученные путем вычитания спектра для неслитого Fab фрагмента (см. фиг. 5А). Разностные спектры CD представляют вторичную структуру полимеров/полипептидных сегментов из 200 остатков Р1А1 (SEQ ID NO: 51) и Р1АЗ (SEQ ID NO: 3), соответственно, и проявляют сильный минимум около 200 нм, что является четким указанием на их нерегулярную спиральную конформацию в забуференном водном растворе (Greenfield (1969) Biochemistry 8: 4108-4116; Sreerama (2000) цит. выше; Fandrich (2002) EMBO J. 21:56825690).
Фиг. 12. Получение изолированного биосинтетического полимера/полипептида Pro/Ala
(А) Карта плазмиды pSUMO-PA#1(200) (SEQ ID NO: 60). Структурный ген для слитого белка MK-His(6)-SUMO-PA#1(200), содержащий стартовый кодон метионина, за которым следует кодон лизина, N-концевая метка аффинности из шести последовательных остатков His, отщепляемый малый белок-модификатор, подобный убиквитину (SUMO) Smt3p (Panavas (2009) Methods Mol Biol. 497: 303-17), и полимер/полипептидный сегмент PA#1 из 200 остатков (SEQ ID NO: 60), находится под транскрипционным контролем промотора гена 10 бактериофага Т7 и заканчивается терминатором \ф. Дополнительные элементы плазмиды включают точку начала репликации (ori), ген устойчивости
к ампициллину (bla) и точку начала репликации f1. Плазмидный каркас снаружи от экспрессионной кассеты фланкирован сайтами рестрикции Nde\ и Hind\\\, за исключением сайта рестрикции Sapl, который был элиминирован молчащей мутацией, идентичен таковому у вектора для общепринятого клонирования и экспрессии pRSET5a (Schoepfer (1993) 124: 83-85).
SEQ ID NO: 60 приведена во вложенном перечне последовательностей (который также составляет часть данного описания и спецификации) и воспроизведена в данной заявке ниже.
gcacttttcg
gggaaatgtg
cgcggaaccc
ctatttgttt
atttttctaa
atacattcaa
atatgtatcc
gctcatgaga
caataaccct
gataaatgct
tcaataatat
tgaaaaagga
120
agagtatgag
tattcaacat
ttccgtgtcg
cccttattcc
cttttttgcg
gcattttgcc
180
ttcctgtttt
tgctcaccca
gaaacgctgg
tgaaagtaaa
agatgctgaa
gatcagttgg
240
gtgcacgagt
gggttacatc
gaactggatc
tcaacagcgg
taagatcctt
gagagttttc
300
gccccgaaga
acgttttcca
atgatgagca
cttttaaagt
tctgctatgt
ggcgcggtat
360
tatcccgtat
tgacgccggg
caagagcaac
tcggtcgccg
catacactat
tctcagaatg
420
acttggttga
gtactcacca
gtcacagaaa
agcatcttac
ggatggcatg
acagtaagag
480
aattatgcag
tgctgccata
accatgagtg
ataacactgc
ggccaactta
cttctgacaa
540
cgatcggagg
accgaaggag
ctaaccgctt
ttttgcacaa
catgggggat
catgtaactc
600
gccttgatcg
ttgggaaccg
gagctgaatg
aagccatacc
aaacgacgag
cgtgacacca
660
cgatgcctgt
agcaatggca
acaacgttgc
gcaaactatt
aactggcgaa
ctacttactc
720
tagcttcccg
gcaacaatta
atagactgga
tggaggcgga
taaagttgca
ggaccacttc
780
tgcgctcggc
ccttccggct
ggctggttta
ttgctgataa
atctggagcc
ggtgagcgtg
840
ggtctcgcgg
tatcattgca
gcactggggc
cagatggtaa
gccctcccgt
atcgtagtta
900
tctacacgac
ggggagtcag
gcaactatgg
atgaacgaaa
tagacagatc
gctgagatag
960
gtgcctcact
gattaagcat
tggtaactgt
cagaccaagt
ttactcatat
atactttaga
1020
ttgatttaaa
acttcatttt
taatttaaaa
ggatctaggt
gaagatcctt
tttgataatc
1080
tcatgaccaa
aatcccttaa
cgtgagtttt
cgttccactg
agcgtcagac
cccgtagaaa
1140
agatcaaagg
atcttcttga
gatccttttt
ttctgcgcgt
aatctgctgc
ttgcaaacaa
1200
aaaaaccacc
gctaccagcg
gtggtttgtt
tgccggatca
agagctacca
actctttttc
1260
cgaaggtaac
tggcttcagc
agagcgcaga
taccaaatac
tgtccttcta
gtgtagccgt
1320
agttaggcca
ccacttcaag
aactctgtag
caccgcctac
atacctcgct
ctgctaatcc
1380
tgttaccagt
ggctgctgcc
agtggcgata
agtcgtgtct
taccgggttg
gactcaagac
1440
gatagttacc
ggataaggcg
cagcggtcgg
gctgaacggg
gggttcgtgc
acacagccca
1500
gcttggagcg
aacgacctac
accgaactga
gatacctaca
gcgtgagcta
tgagaaagcg
1560
ccacgcttcc
cgaagggaga
aaggcggaca
ggtatccggt
aagcggcagg
gtcggaacag
1620
gagagcgcac
gagggagctt
ccagggggaa
acgcctggta
tctttatagt
cctgtcgggt
1680
ttcgccacct
ctgacttgag
cgtcgatttt
tgtgatgctc
gtcagggggg
cggagcctat
1740
ggaaaaacgc
cagcaacgcg
gcctttttac
ggttcctggc
cttttgctgg
ccttttgctc
1800
acatgttctt
tcctgcgtta
tcccctgatt
ctgtggataa
ccgtattacc
gcctttgagt
1860
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 1920
cggagaagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1980
ggatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac ggtttccctc 2040
tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacat atgaaacatc accaccatca 2100
ccattcggac tcagaagtca atcaagaagc taagccagag gtcaagccag aagtcaagcc 2160
tgagactcac atcaatttaa aggtgtccga tggatcttca gaaatcttct ttaagatcaa 2220
aaagaccact cctttaagaa ggctgatgga agcgttcgct aaaagacagg gtaaggaaat 2280
ggactcctta agattcttgt acgacggtat tagaattcaa gctgatcaga cccctgaaga 2340
tttggacatg gaggataacg atattattga ggctcacaga gaacagattg gtggcgccgc 2400
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2460
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2520
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2580
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2640
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2700
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2760
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2820
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2880
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2940
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgcctg 3000
aagagcaagc ttgatccggc tgctaacaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 3060
accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt 3120
ttgctgaaag gaggaactat atccggatct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 3180
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat 3240
taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 3300
cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 3360
aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 3420
ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 3480
ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 3540
caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 3600
cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat 3660
taacgcttac aatttaggtg 3680
(В) Анализ получаемого в бактериях слитого белка His(6)-SUMO-РА#1(200) и его расщепления посредством электрофореза в 12% ДСН-ПААГ. На геле показан слитый белок SUMO-PAS#1(200), экстрагированный из Е. coli и очищенный посредством аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов (IMAC) и эксклюзионной хроматографии (ЭХ) до (дорожка 1) и после протеолитического расщепления Ubl-специфичной протеазой 1 (SUMO протеазой) (дорожка 2), как описано в Примере 21. Все образцы были восстановлены 2-меркаптоэтанолом. Размеры белковых маркеров (М),
нанесенных в восстанавливающих условиях, указаны по левому краю. Слитый белок His(6)-SUMO-PA#1(200) выглядит как одна гомогенная полоса с кажущимся молекулярным размером примерно 100 кДа. Таким образом, кажущийся размер для слитого белка His(6)-SUMO-PA#1(200), наблюдаемый при электрофорезе в ДСН-ПААГ, значительно больше, чем вычисленная масса 28,3 кДа, что является следствием присутствия полимера/полипептида Pro/Ala. После расщепления гидрофильный полипептид РА#1(200) обнаружимо не окрашивается Кумасси синим; следовательно, только небольшая остаточная фракция слитого белка и отщепленный белок His(6)-SUMO видны на ДСН полиакриламидном геле (дорожка 2). Белок His(6)-SUMO демонстрирует гомогенную полосу с кажущимся молекулярным размером примерно 16 кДа (дорожка 2), что находится в хорошем соответствии с его вычисленной молекулярной массой 12,2 кДа.
Фиг. 13. Конъюгация биосинтетического полимера/полипептида Pro/Ala с химическими соединениями и/или лекарственными средствами
(A-D) Мониторинг получения конъюгата флуоресцеина с биосинтетическим полимером/полипептидом РА#1(200) (SEQ ID NO: 61) проводили посредством аналитической эксклюзионной хроматографии (ЭХ). Панели демонстрируют (сверху вниз) пробеги ЭХ очищенного His(6)-SUMO-РА#1(200) (A), His(6)-SUMO-PA#1(200) после реакции расщепления в присутствии протеазы SUMO (В), порция расщепленного His(6)-SUMO-РА#1(200) после химического сочетания со сложным эфиром NHS флуоресцеина (С) и конъюгат флуоресцеин-РА#1 (200) после очистки IMAC (D). 250 мкл белка/полипептида при концентрации примерно 0,5 мг/мл наносили на колонку Superdex S200 10/300 GL, уравновешенную буфером ФСБ, на системе Akta Purifier. Мониторинг поглощения при 225 нм, 280 нм и 494 нм проводили, применяя детектор UV-900 UV/VIS (GE Healthcare), и выступающий пик каждой хроматограммы нормализовали до значения 1. Стрелкой указан пустой объем колонки (7,3 мл).
(Е-К) Характеристика свободного флуоресцеина, биосинтетического полимера/полипептида РА#1(200) и его конъюгата с флуоресцеином посредством ЭХ и спектроскопии UV/VIS. Три хроматограммы (сверху вниз) демонстрируют очищенный РА#1(200) (Е), химическое соединение флуоресцеин (F) и очищенный конъюгат флуоресцеин-РА#1 (200) (G). Четыре
спектра UV/VIS демонстрируют очищенный слитый белок His(6)-SUMO-РА#1(200) (Н), очищенный полимер/полипептид РА#1(200) (I), свободный флуоресцеин (J) и очищенный конъюгат флуоресцеин-РА#1 (200) (К) (все в ФСБ). Стрелками указаны характеристические полосы поглощения/плечи SUMO (280 нм), РА#1(200) (225 нм) и флуоресцеина (494 нм).
(L) Калибровочная кривая для хроматограмм из (A-G) с использованием колонки Superdex S200 10/300 GL. Логарифм молекулярной массы (MW) маркерных белков (апротинин, 6,5 кДа; цитохром с, 12,4 кДа; карбоангидраза, 29,0 кДа; бычий сывороточный альбумин, 66,3 кДа; алкогольдегидрогеназа, 150 кДа; |3-амилаза, 200 кДа; апоферритин, 440 кДа) наносили против их объемов элюирования (х) и выравнивали в соответствии с прямой линией. На основании наблюдаемых объемов элюирования His(6)-SUMO-PA#1(200) (10,81 мл), РА#1(200) (11,51 мл), флуоресцеин-РА#1 (200) (11,49 мл) и флуоресцеина (27,57 мл), их кажущиеся молекулярные размеры были определены, как следующие: His(6)-SUMO-PA#1(200): 215,6 кДа, РА#1(200): 154,1 кДа (действительная масса: 16,1 кДа), флуоресцеин-РА#1(200): 155,6 кДа (действительная масса: 16,6 кДа); SUMO: 25,7 кДа (действительная масса: 12,2 кДа); флуоресцеин: 0,09 кДа (действительная масса: 0,33 кДа). Эти данные демонстрируют, что слияние с полипептидом/полимером Pro/Ala придает значительно увеличенный гидродинамический объем конъюгированному лекарственному средству по сравнению с немодифицированным соединением.
(М) Характеристика химического конъюгата между биосинтетическим полипептидом/полимером РА#1(200) и стероидным соединением дигоксигенином посредством масс-спектроскопии с электрораспылительной ионизацией (МС-ЭРИ). Развернутый спектр МС-ЭРИ дигоксигенин-РА#1 (200) выявил массу 16671,4 Да, которая по существу совпадает с вычисленной массой для конъюгата дигоксигенин-РА#1 (200) (16670,6 Да).
Фиг. 14. Иллюстрация химических конъюгатов между
биосинтетическим полипептидом/полимером РА#1(200) и
низкомолекулярными лекарственными средствами
(A) Флуоресцеин, связанный с N-концом биосинтетического РА#1(200).
(B) Дигоксигенин, связанный с N-концом биосинтетического РА#1(200).
(A)
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение дополнительно описано нижеследующими иллюстративными не ограничивающими примерами, которые обеспечивают лучшее понимание настоящего изобретения и многих его преимуществ.
Если не указано иное, были использованы установленные способы рекомбинантной генной технологии, которые описаны, например, в Sambrook (2001) цит. выше.
Пример 1: Генный синтез для аминокислотных полимеров/полипептидов Pro/Ala
Как описано здесь выше, аминокислотные повторы, состоящие из остатков Pro и Ala, изображены здесь как Pro/Ala или "РА". Генные фрагменты, кодирующие повторяющуюся полимерную последовательность, содержащую Pro и Ala (РА#1, которая соответствует SEQ ID NO: 1), были получены путем гибридизации двух комплементарных олигодезоксинуклеотидов (SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18), показанных на фиг. 1, с последующим образованием конкатемера направленным способом посредством лигирования их взаимно совместимых, но не палиндромных липких концов ДНК. Олигодезоксинуклеотиды покупали у фирмы ThermoScientific (Ulm, Germany) и очищали посредством препаративного электрофореза в полиакриламидном геле с мочевиной. Последовательности нуклеиновых кислот этих олигодезоксинуклеотидов изображены на фиг. 1 (SEQ ID NO: 17 и 18, содержащие дополнительный кодон GCC для аланина, который становится частью следующего повтора последовательности РА#1 при лигировании соответствующих липких концов). Ферментативное фосфорилирование осуществляли смешиванием 200 пмоль обоих олигодезоксинуклеотидов в 100 мкл 50 мМ Трис/HCI рН 7,6, 10 мМ MgCI2, 5 мМ DTT, 1 мМ АТФ и инкубацией в течение 30 мин при 37°С в присутствии 10 ед. полинуклеотидкиназы (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany). После денатурации в течение 10 мин при 80°С смесь охлаждали до комнатной температуры в течение ночи для достижения гибридизации. Затем 50 мкл этого раствора лигировали добавлением 1 ед. ДНК лигазы Т4 (MBI Fermentas) и 10 мкл 100 мМ Трис/HCI рН 7,4, 50 мМ МдСЬ, 20 мМ DTT, 10 мМ АТФ, и в некоторых случаях 5 мМ каждого dATP, dCTP, dGTP и dTTP, в суммарном объеме 100 мкл и инкубации в течение 55 мин на льду. После 10 мин тепловой инактивации при 70°С продукты
лигирования разделяли посредством электрофореза в 1,5% (масс/об.) агарозном геле в присутствии буфера ТАЕ (40 мМ Трис, 20 мМ уксусная кислота, 1 мМ ЭДТА). После окрашивания бромистым этидием, полосу, соответствующую собранному генному сегменту длиной 300 п.о., вырезали и выделяли.
Пример 2: Конструирование pFab-PA#1(200) в качестве экспрессионного вектора для слитого белка Fab-PA#1
Для клонирования 10-мерного повтора синтетического генного фрагмента, кодирующего 20 аминокислотных последовательностей РА#1 из Примера 1, использовали плазмидный вектор pASK88-Fab-2xSapl (SEQ ID NO: 22), экспрессионную плазмиду для Fab фрагмента (Schlapschy (2007) Protein Eng. Des. Sel. 20:273-284), несущую нуклеотидную последовательность с двумя сайтами рестрикции Sapl в обратной комплементарной ориентации на З'-конце легкой цепи (фиг. 2А). Этот вектор, который является производным pASK75 (Skerra, А. (1994) Gene 151:131-135), подвергали рестрикции Sapl, дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки (USB, Cleveland, ОН) и лигировали с кассетой синтетического фрагмента ДНК из 300 п.о., полученного из Примера 1. Полученную промежуточную плазмиду pFab-PA#1(100) снова подвергали рестрикции Sapl, дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки и лигировали с кассетой синтетического фрагмента ДНК из 300 п.о., полученного из Примера 1 (как приведено в примере на фиг. 2В, но только с кассетой полимера/полипептида РА#1(20)). Полученная плазмида была обозначена pFab-PA#1(200) (SEQ ID NO: 28) (фиг. 2C). Следует отметить, что на этой плазмиде кодирующий участок для повторяющейся последовательности РА#1 из 200 остатков фланкирован двумя сайтами рестрикции Sapl, что обеспечивает точное вырезание и последующее субклонирование всей последовательности кассеты, несущей 5'-GCC нуклеотидные выступающие концы.
После трансформации Е. coli XL1-Blue (Bullock (1987) Biotechniques 5: 376-378) готовили препарат плазмиды, и последовательность клонированной вставки синтетической нуклеиновой кислоты подтверждали рестрикционным анализом и двунитевым секвенированием ДНК (ABI-Prism(tm)310 Genetic analyzer, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany), применяя
набор терминаторов BigDye(tm), а также олигодезоксинуклеотидные праймеры, которые обеспечивают секвенирование с обеих сторон.
Пример 3: Конструирование pASK-PA#1(200)-IFNa2b в качестве экспрессионного вектора для слитого белка PA#1(200)-IFNa2b
Для конструирования экспрессионной плазмиды, кодирующей IFNa2b в виде слитого белка с повтором последовательности РА#1 из 200 остатков, РА#1(200), pASK-IFNa2b (SEQ ID NO: 32) (фиг. 2D) подвергали рестрикции Sapl, дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки и лигировали с генным фрагментом, кодирующим полипептид РА#1 из 200 остатков, вырезанный из ранее сконструированной плазмиды pFab-PA#1 (200) (Пример 2) расщеплением рестриктазой Sapl (как приведено в примере на фиг. 2Е, но только с кассетой полимера/полипептида РА#1(20)). После трансформации Е. coli JM83 (Yanisch-Perron. (1985) Gene 33:103-119) готовили препарат плазмиды, и присутствие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом. Полученная в результате плазмида была обозначена pPA#1(200)-IFNa2b (SEQ ID NO: 37) (фиг. 2F).
Пример 4: Получение в бактериях и очистка слитых белков между Fab фрагментом и генетически кодируемым полимером/полипептидом РА#1
Fab фрагмент (вычисленная масса: 48,0 кДа) и слитый белок Fab-РА#1(200) (вычисленная масса: 64,3 кДа) получали при 22°С в Е. coli KS272, несущей соответствующие экспрессионные плазмиды из Примера 3, вместе с хелперной плазмидой укладки pTUM4 (Schlapschy (2006) Protein Eng. Des. Sel. 19:385-390), применяя культуры в качалочных колбах в 2 л среды LB (среда Лурия-Бертани), содержащей 100 мг/л ампициллина и 30 мг/л хлорамфеникола. Индукцию экспрессии рекомбинантного гена осуществляли добавлением 0,4 мг ангидротетрациклина при OD550 0,5 в течение ночи (типично с получением в результате OD550 примерно 1,0 при сборе). Периплазматическую экстракцию в присутствии 500 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис/HCI рН 8,0, содержащих 50 мкг/мл лизоцима, осуществляли, как описано в другом месте (Breustedt (2005) Biochim. Biophys. Acta 1764:161-173), с последующей очисткой посредством Hise-метки, применяя аффинную хроматографию с иммобилизованными ионами металлов (Skerra (1994) Gene 141: 79-84) с
градиентом имидазола от 0 до 200 мМ в 500 мМ бетаине, 50 мМ Na-фосфате рН 7,5.
Гомогенные препараты белка были получены для обоих рекомбинантных Fab фрагментов (фиг. ЗА) с выходами 0,2 мг л"1 OD"1 для неслитого Fab и 0,1 мг л"1 OD"1 для Fab-PA#1(200). Электрофорез в ДСН-ПААГ проводили, применяя систему Трис буфера высокой молярности (Fling (1986) Anal. Biochem. 155: 8388). Концентрации белка определяли в соответствии с поглощением при 280 нм, применяя вычисленные коэффициенты экстинкции (Gill (1989) Anal. Biochem. 182: 319-326) 68290 М"1 см"1 как для неслитого Fab, так и для его слитого с полимером РА#1 белка, поскольку полимер Pro/Ala не вносит вклад в УФ поглощение в связи с отсутствием ароматических аминокислот.
Пример 5: Получение в бактериях и очистка слитых белков между IFNa2b и генетически кодируемыми полимерами/полипептидами РА#1
IFNa2b (вычисленная масса: 20,9 кДа) и PA#1(200)-IFNa2b (вычисленная масса: 37,0 кДа) получали при 22°С в Е. coli KS272, несущей соответствующие экспрессионные плазмиды из Примера 3, вместе с хелперной плазмидой укладки pTUM4 (Schlapschy (2006) цит. выше), применяя культуры в качалочных колбах в 2 л среды LB, содержащей 100 мг/л ампициллина и 30 мг/л хлорамфеникола. Индукцию экспрессии рекомбинантного гена осуществляли добавлением 0,4 мг ангидротетрациклина при OD550 0,5 в течение ночи (типично с получением в результате OD550 примерно 1,0 при сборе). Периплазматическую экстракцию в присутствии 500 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис/HCI рН 8,0, содержащих 50 мкг/мл лизоцима, осуществляли, как описано в другом месте (Breustedt (2005) цит. выше), с последующей очисткой посредством Sfrep-метки II, применяя аффинную хроматографию на стрептавидине (Schmidt (2007) Nat. Protoc. 2:1528-1535) в присутствии 150 мМ NaCI, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис/HCI, рН 8,0.
Гомогенные препараты белка были получены для обоих рекомбинантных белков IFNa2b (фиг. ЗВ) с выходами 0,15 мг л"1 OD"1 для IFNa2b и 0,1 мг л"1 OD"1 для PA#1(200)-IFNa2b. Электрофорез ДСН-ПААГ проводили, применяя систему Трис буфера высокой молярности (Fling (1986) цит. выше). Концентрации белка определяли в соответствии с поглощением при 280 нм, применяя вычисленные коэффициенты экстинкции (Gill (1989) цит. выше) 23590
М"1 см"1 как для неслитого IFNa2b, так и для его слитого с полимером РА#1 белка.
Пример 6: Измерение гидродинамического объема для рекомбинантного слитого белка между Fab фрагментом и генетически кодируемым полимером РА#1 из 200 остатков посредством аналитической гель-фильтрации
Эксклюзионную хроматографию (ЭХ) осуществляли на колонке Superdex S200 HR 10/300 GL (GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany) при скорости тока 1 мл/мин, применяя систему Akta Purifier 10 (GE Healthcare) с ФСБ (115 мМ NaCI, 4 мМ КН2Р04, 16 мМ Na2HP04; рН 7,4) в качестве буфера пробега. Образцы 250 мкл очищенного Fab фрагмента и его слитого белка с РА#1 из 200 остатков, полученные из аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов, как описано в Примере 4, наносили индивидуально при концентрации 0,25 мг/мл в ФСБ. Оба белка элюировали в виде одного гомогенного пика, как показано на фиг. 4А.
Для калибровки колонки (фиг. 4В) 250 мкл соответствующей смеси приведенных ниже глобулярных белков (Sigma, Deisenhofen, Germany) наносили в ФСБ при концентрациях белка от 0,2 мг/мл до 0,5 мг/мл: цитохром с, 12,4 кДа; карбоангидраза, 29,0 кДа; овальбумин, 43,0 кДа; бычий сывороточный альбумин, 66,3 кДа; алкогольдегидрогеназа, 150 кДа; р-амилаза, 200 кДа; апоферритин, 440 кДа.
В результате слитый белок с полимером/полипептидом РА#1 из 200 остатков проявлял значительно больший размер, чем соответствующие глобулярные белки с той же молекулярной массой. Увеличение кажущегося размера для Fab-PA#1 (200) было 7,4-кратным по сравнению с неслитым Fab фрагментом, тогда как действительная масса была больше только в 1,3 раза. Это наблюдение четко указывает на значительно увеличенный гидродинамический объем, придаваемый биологически активному Fab фрагменту полипептидным сегментом Pro/Ala в соответствии с данным изобретением.
Пример 7: Измерение гидродинамического объема для рекомбинантного слитого белка между IFNa2b и генетически кодируемым полимером РА#1 из 200 остатков посредством аналитической гель-фильтрации
Эксклюзионную хроматографию осуществляли с IFNa2b и РА#1(200)-IFNa2b на колонке Superdex S200 HR 10/300 GL (GE Healthcare) при скорости тока 1 мл/мин, применяя систему Akta Purifier 10 (GE Healthcare) подобно тому, как описано в Примере 6. Оба белка элюировали в виде одного гомогенного пика, как показано на фиг. 4С.
В результате слитый белок с полимером/полипептидом РА#1 из 200 остатков проявлял значительно больший размер, чем соответствующие глобулярные белки с той же молекулярной массой (фиг. 4D). Увеличение кажущегося размера для PA#1(200)-IFNa2b было 10,2-кратным по сравнению с неслитым белком IFNa2b, тогда как действительная масса была больше только в 1,8-раза. Это наблюдение четко указывает на значительно увеличенный гидродинамический объем, придаваемый биологически активному интерферону полипептидным сегментом Pro/Ala в соответствии с данным изобретением.
Пример 8: Определение нерегулярной спиральной конформации для биосинтетического полимера РА#1, подвергнутого слиянию с Fab фрагментом, посредством спектроскопии кругового дихроизма
Вторичную структуру анализировали, применяя спектрополяриметр J-810 (Jasco, Groft-Umstadt, Germany), оборудованный кварцевой кюветой 106-QS (длина пути 0,1 мм; Hellma, Mullheim, Germany). Спектры записывали от 190 до 250 мм при комнатной температуре путем аккумуляции 16 пробегов (ширина полосы 1 нм, скорость сканирования 100 нм/мин, ответ 4 с), применяя растворы белка от 3,12 до 15,4 мкМ, полученные из Примера 4, в 50 мМ K2SO4, 20 мМ К-фосфате рН 7,5. После коррекции на контрольные растворы спектры выравнивали, применяя программное обеспечение прибора, и молярную эллиптичность (c)м вычисляли в соответствии с уравнением:
где (c)obs обозначает измеренную эллиптичность, с концентрацию белка [моль/л], d длину пути кварцевой кюветы [см]. Значения (c)м наносили на график против длины волны, применяя программу Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA).
Измеренный спектр кругового дихроизма (CD) для рекомбинантного Fab находился в соответствии с доминирующей укладкой иммуноглобулинов в виде
Р-слоя, тогда как спектр слитого белка Fab-PA#1 (200) выявил значительный вклад нерегулярной спиральной конформации (фиг. 5А). Для более подробного анализа спектроскопического вклада полипептидного сегмента Pro/Ala вычисляли молярный разностный спектр CD по отношению к неслитому Fab фрагменту (фиг. 5В) вычитанием последнего спектра из спектра Fab-PA#1(200). В результате наблюдали сильный минимум около 200 нм, характерный для нерегулярной спиральной конформации. Следовательно, последовательность Pro/Ala в составе рекомбинантного слитого белка, по-видимому, присутствует в виде нерегулярного спирального полимера в условиях физиологического буфера.
Пример 9: Определение нерегулярной спиральной конформации для генетически кодируемого полимера РА#1, подвергнутого слиянию с IFNa2b, посредством спектроскопии кругового дихроизма
Вторичную структуру анализировали посредством измерений CD для IFNa2b и PA#1(200)-IFNa2b (полученных из Примера 5), как описано в Примере 8, применяя растворы белка от 3,6 до 38,7 мкМ. Спектр PA#1(200)-IFNa2b выявил значительные вклады как а-спиральной вторичной структуры, характерной для известной укладки интерферона а-спиральной гармошкой, так и нерегулярной спиральной конформации (фиг. 5С). Чтобы более подробно проанализировать спектроскопические вклады партнера слияния полимера Pro/Ala, вычисляли молярный разностный спектр CD по отношению к неслитому IFNa2b вычитанием двух индивидуальных спектров (фиг. 5D). В результате наблюдали сильный минимум около 200 нм, характерный для нерегулярной спиральной конформации. Следовательно, полипептидный сегмент Pro/Ala в составе рекомбинантного слитого белка, по-видимому, присутствует в виде нерегулярного спирального полимера в условиях водного буфера.
Пример 10: Количественный анализ вторичной структуры Fab фрагмента, IFNa2b и их слитых белков с полимером РА#1 из 200 остатков
Содержание вторичной структуры Fab фрагмента, Fab-PA#1(200), IFNa2b и PA#1(200)-IFNa2b определяли индивидуально количественно на основании соответствующих CD спектров, измеренных в Примерах 8 и 9, применяя программу развертывания вторичной структуры CDNN версия 2.1 (Bohm (1992) Protein Eng. 5:191-195) с серией 33 базовых спектров для развертывания
сложных спектров CD. Результаты этого анализа представлены в приведенной ниже таблице:
Fab
Fab-РА#1(200)
Разность: РА#1(200)
IFNa2b
РА#1 (100)-IFNa2b
Разность: РА#1(200)
а-спираль
9,5 %
7,5 %
2,1 %
38,2 %
31,0 %
0,7 %
Антипараллельный Р-слой
40,4 %
3,1 %
0 %
1,8 %
0,2 %
4,6 %
Параллельный Р-слой
6,9 %
1,3 %
0,3 %
8,4 %
0,7 %
0,6 %
Р-поворот
6,2 %
50,4 %
78,6 %
19,2 %
75,2 %
69,7 %
Нерегулярная спираль
37,2 %
63,4 %
94,8 %
35,9 %
64,4 %
97,5 %
? сумма
100,2
125,8 %
175,8 %
103,5 %
171,4 %
170,0 %
? Р-поворота и
нерегулярной
спирали
43,4 %
113,8 %
173,4 %
55,1 %
139,6 %
169,1 %
По сравнению с преобладающим содержанием вторичной структуры |3-слоя рекомбинантного Fab фрагмента, что находится в соответствии с его известной иммуноглобулиновой укладкой (см. Eigenbrot (1993) J. Mol. Biol. 229:969-995), доля неструктурированной конформации (содержащая нерегулярную спираль и р-поворот) явно возрастает, если полимер РА#1 подвергнут слиянию с Fab фрагментом. Разностный CD спектр для полипептидного сегмента Pro/Ala выявил четкую нерегулярную спиральную конформацию. Анализ вторичной структуры демонстрирует присутствие высокой доли неструктурированных конформаций (включающих нерегулярную спираль и р-поворот), которая составляет почти 100% суммарной вторичной структуры. Подобным образом, по сравнению с преобладающим содержанием а-спиральной вторичной структуры рекомбинантного IFNa2b, которое находится в соответствии с его известной трехмерной структурой в виде а-спирального белка, уложенного гармошкой (Radhakrishnan (1996) Structure 4:1453-1463), доля неструктурированной конформации для всего белка явно возрастает, если полимер РА#1 подвергнут слиянию с IFNa2b. Разностный CD спектр для
полипептидного сегмента Pro/Ala выявил четкую нерегулярную спиральную конформацию. Анализ вторичной структуры демонстрирует присутствие высокой доли неструктурированных конформаций (включающих нерегулярную спираль и (3-поворот), которая составляет почти 100% суммарной вторичной структуры.
Другие результаты были получены, когда проводили теоретический анализ последовательности полимера РА#1, применяя алгоритм Чоу-Фасмана (Chou and Fasman (1974) Biochemistry 13: 222-245). Результаты этого анализа проиллюстрированы на фиг. 7. Данный алгоритм предсказывает 100% а-спиральную вторичную структуру, что находится в явном противоречии с экспериментальными данными. Таким образом, данный алгоритм неприменим для надежного предсказания неструктурированной конформации для аминокислотного полимера в соответствии с изобретением.
Пример 11: Конструирование pASK75-His6-PA#1(200)-hGH в качестве экспрессионного вектора для слитого белка His6-PA#1(200)-hGH
Для конструирования экспрессионной плазмиды, кодирующей hGH в виде слитого белка с повтором последовательности РА#1 из 200 остатков, РА#1(200), pASK75-His6-hGH (SEQ ID NO: 41) (фиг. 6A) подвергали рестрикции Sapl, дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки и лигировали с генным фрагментом, кодирующим полипептид РА#1 из 200 остатков, вырезанный из ранее сконструированной плазмиды pFab-PA#1 (200) (Пример 2) посредством расщепления рестриктазой Sapl (как приведено в примере на фиг. 6В, только с кассетой полимера/полипептида РА#1(20)). После трансформации Е. coli JM83 (Yanisch-Perron (1985) цит. выше) готовили препарат плазмиды, и присутствие правильной вставки подтверждали рестрикционным анализом. Полученная в результате плазмида была обозначена pASK75-His6-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 46) (фиг. 6C).
Пример 12: Конструирование экспрессионного вектора для секреторного получения гормона роста человека, подвергнутого слиянию с полимером/полипептидом РА#1 из 200 остатков, в клетках яичника китайского хомячка
Вектор pASK75-His6-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 46), производное pASK75 (Skerra (1994) цит. выше), дающий возможность прокариотического получения слитого белка hGH РА#1, подвергали рестрикции Nhe\ и Hind\\\. Этот
фрагмент очищали посредством электрофореза в агарозном геле и лигировали с соответственно рестрицированным вектором рСНО (SEQ ID NO: 50). После трансформации Е. coli XL1 -Blue (Bullock (1987) цит. выше) готовили препарат плазмиды, и правильную вставку фрагмента проверяли посредством рестрикционного анализа. Полученная в результате плазмида, которая кодирует сигнальный пептид hGH, подвергнутый слиянию с Hise-меткой, полипептидным сегментом РА#1(200) и гормоном роста человека (hGH), была обозначена pCHO-PA#1(200)-hGH SEQ ID NO: 48) и изображена на фиг. 6D.
Пример 13: Секреторное получение слитого белка между гормоном роста человека (hGH) и генетически кодируемым полимером РА#1 в клетках СНО
Клетки СНО-К1 АТСС No. CCL-61 культивировали в среде Quantum 263 (РАА Laboratories, Colbe, Germany) в 100 мм пластмассовой чашке до достижения 50% конфлюентности. Клетки трансфицировали 8 мкг рСНО-PA#1(200)-hGH (SEQ ID NO: 48) или для контроля pCHO-hGH (SEQ ID NO: 49), похожей плазмидой, кодирующей hGH без последовательности РА#1(200), применяя набор Nanofectin Kit (РАА Laboratories, Colbe, Germany). Через 6 ч клеточную культуральную среду заменяли 7 мл среды с пониженным содержанием сыворотки Opti-MEM(r)-l (Invitrogen, Darmstadt, Germany), и клетки инкубировали при 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СОг. Через двое суток 20 мкл супернатанта клеточной культуры отбирали и разводили 5 мкл буфера для электрофореза в ДСН-ПААГ, содержащего В-меркаптоэтанол. После 5 мин нагревания при 95°С 15 мкл каждого образца подвергали электрофорезу в 12% ДСН-ПААГ. После электропереноса на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) посредством аппарата для полусухого блоттинга, мембрану промывали 3 раза по 15 мин 10 мл ФСБТ (ФСБ, содержащего 0,1% об./об. Твин 20). Мембрану инкубировали с 10 мл разведенного 1:1000 антитела против гормона роста человека аЬ1956, конъюгированного с пероксидазой хрена (Abeam, Cambridge, UK). После инкубации в течение 1 ч и отмывки мембраны дважды по 5 мин 20 мл ФСБТ и дважды по 5 мин ФСБ, хромогенную реакцию проводили в присутствии 15 мл раствора 3,3-диаминобензидина SIGMAFAST(tm) (Sigma-Aldrich Chemie, Munich, Germany). Реакцию останавливали промыванием водой и высушиванием мембраны на воздухе. На блоттинге выявили сигналы для обоих образцов
рекомбинантного белка (фиг. 6Е), что, таким образом, доказывает секреторное получение слитого белка hGH с полипептидом РА#1 в клетках СНО.
Пример 14: Получение в бактериях и очистка слитых белков между hGH и генетически кодируемым полимером/полипептидом РА#1
Гормон роста человека (hGH) (вычисленная масса: 23,4 кДа), РА#1(200)-hGH (вычисленная масса: 39,6 кДа), PA#1(400)-hGH (вычисленная масса: 55,8 кДа) и PA#1(600)-hGH (вычисленная масса: 72,0 кДа) получали в Е. coli KS272, несущей соответствующие экспрессионные плазмиды из Примера 11, или их производные с двойными (кодирующими 400 остатков) или тройными (600 остатков) кассетами последовательности РА#1, соответственно. Бактериальное получение осуществляли при 22°С в культурах в качалочных колбах в 2 л среды LB, содержащей 2,5 г/л глюкозы, 0,5 г/л пролина и 100 мг/л ампициллина. Индукцию экспрессии рекомбинантного гена осуществляли путем добавления 0,4 мг ангидротетрациклина при OD550 0,5 в течение 3 ч. Периплазматическую экстракцию в присутствии 500 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис/HCI рН 8,0, содержащих 50 мкг/мл лизоцима, осуществляли, как описано в другом месте (Breustedt (2005) цит. выше) с последующей очисткой посредством Hise-метки, применяя аффинную колонку высокого разрешения HisTrap (GE Healthcare) с 40 мМ Na-фосфатом рН 7,5, 0,5 М NaCI в качестве буфера. Белки элюировали, применяя градиент концентрации имидазола от 0 до 150 мМ (растворенного в буфере пробега и доведенного HCI до рН 7,5), и дополнительно очищали эксклюзионной хроматографией, применяя колонку Superdex 200-HR10/30 (GE Healthcare), уравновешенную ФСБ (115 мМ NaCI, 4 мМ КН2Р04, 16 мМ Na2HP04, рН 7,4).
После эксклюзионной хроматографии гомогенные препараты белка были получены для всех рекомбинантных слитых белков hGH без признаков агрегации и с выходами 1 мг л"1 OD"1 для hGH, 0,3 мг л"1 OD"1 для РА#1(200)-hGH, 0,3 мг л"1 OD"1 для PA#1(400)-hGH и 0,2 мг л"1 OD"1 для PA#1(600)-hGH. Электрофорез в ДСН-ПААГ осуществляли, применяя Трис буферную систему высокой молярности (Fling (1986) цит. выше). Концентрации белка определяли в соответствии с поглощением при 280 нм, применяя вычисленные коэффициенты экстинкции (Gill (1989) цит. выше) 16050 М"1 см"1 для неслитого hGH и всех его слитых с полипептидом РА#1 белков.
Пример 15: Измерение связывающего сродства гормона роста человека и его слитых с полимером РА#1 белков в отношении внеклеточного домена рецептора гормона роста человека с использованием поверхностного плазмонного резонанса
Сродство hGH и его слитых с полипептидом РА#1 белков к слитому белку рецептора гормона роста человека Fc (hGHR-Fc; R &D Systems) определяли посредством измерений поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в реальном времени на системе Biacore 2000 (GE Healthcare). Сначала 15 мкл иммобилизующего антитела мыши против IgG-Fc человека (Jackson Immuno Research), при концентрации 100 мкг/мл в 10 мМ Na-ацетате рН 5,0, иммобилизовали на поверхности двух проточных каналов CMDP чипа (ХапТес bioanalytics), применяя набор для аминного сочетания (GE Healthcare). Это привело к примерно 2700 единицам ответа (RU). После уравновешивания ФСБ/Т (ФСБ, содержащим 0,05% (об./об.) Твин 20) в качестве проточного буфера в один канал чипа загружали 2 мкг/мл hGHR-Fc при скорости тока 5 мкл/мин до достижения дополнительного сигнала примерно 300 RU. Затем 75 мкл hGH или его слитых с полипептидом РА#1 белков в ФСБ/Т впрыскивали при разичных концентрациях, и фазы ассоциации и диссоциации измеряли при непрерывном токе буфера при 20 мкл/мин. Для регенерации применяли три импульса по 6 мкл 10 мМ глицин/HCI рН 2,7. Сенсограммы корректировали посредством двойного вычитания соответствующих сигналов, измеренных для канала без иммобилизованного рецептора, и средний базовый уровень определяли на основании нескольких впрыскиваний контрольного буфера (Myszka (1999) Mol. Recognit. 12: 279-284). Оценку кинетических данных проводили посредством глобального соответствия следов по меньшей мере от семи впрыскиваний различных образцов в соответствии с моделью связывания Лангмюра 1:1, применяя программное обеспечение BIAevaluation, версия 3.1 (GE Healthcare). Значения, полученные в результате измерений SPR для кинетики и выведенных констант равновесия комплексов между hGH или его слитыми с РА#1 белками и рецептором гормона роста человека, суммированы в приведенной ниже таблице:
hGH вариант
kon [10й М"1 с1]
kOff[10 b с1]
KD [пМ]
hGH
10,2
10,6
10,4
PA#1(200)-hGH
4,75
9,18
19,3
PA#1(400)-hGH
3,26
14,0
42,9
PA#1(600)-hGH
3,29
12,5
38,0
Эти данные демонстрируют, что слитые белки hGH с полипептидами РА#1 различных длин значительно не препятствуют связыванию с рецептором. Все слитые белки hGH с полипептидом РА#1 сохраняют активность связывания с рецептором с коэффициентом 5 по сравнению с рекомбинантным hGH без полипептида РА#1.
Пример 16: Определение пролонгированного периода полувыведения из плазмы in vivo для рекомбинантных слитых белков между Fab фрагментом и генетически кодируемыми полимерами РА#1
Взрослых мышей BALB/c (разведение SPF; TU Munchen, Freising, Germany) внутривенно инъецировали в соответствии с приведенной ниже таблицей:
Временные точки взятия образцов крови после инъекции
Исследуемый препарат
Подгруппа
10 мин
30 мин
1 ч
2 ч
3 ч
6 ч
8 ч
12 ч
24 ч
36 ч
48 ч
Fab
Fab-PA#1 (200) Fab-PA#1 (600)
Для каждого вещества (исследуемого препарата) суммарно инъецировали девять животных, разделенных на три подгруппы 1-3, в каждой по 3 животных, и от каждого получали четыре образца в различные моменты времени. Образцы крови (примерно 50 мкл) брали из хвостовой вены и хранили при 4°С в течение 30 мин. После центрифугирования в течение 10 мин при 10000 g и 4°С, супернатант (плазму) немедленно замораживали и хранили при -20°С.
Для количественного определения слитого белка Fab в ELISA лунки 96-луночного микротитрационного планшета (Maxisorb, NUNC, Denmark) покрывали в течение ночи при 4°С 50 мкл раствора 10 мг/мл рекомбинантного антигена внеклеточного домена Her2/ErbB2 в 50 мМ NaHCOs, рН 9,6. Затем лунки блокировали 200 мкл 3% (масс/об.) БСА (бычий сывороточный альбумин) в ФСБ в течение 1 ч и промывали три раза ФСБ/Т (ФСБ, содержащим 0,1% (об./об.) Твин 20). Образцы плазмы наносили в серийных разведениях в ФСБ/Т, содержащем 0,5% (об./об.) мышиной плазмы от необработанного животного, и инкубировали в течение 1 ч. Затем лунки промывали три раза ФСБ/Т и инкубировали в течение 1 ч с 50 мкл разведенного 1:1000 раствора конъюгата антитела против Ск человека со щелочной фосфатазой в ФСБ/Т. После отмывки дважды в ФСБ/Т и дважды в ФСБ хромогенную реакцию начинали добавлением 50 мкл 0,5 мкг/мл пара-нитрофенилфосфата в 100 мМ Трис/HCI рН 8,8, 100 мМ NaCI, 5 мМ MgCI2 в качестве субстрата, и после 15 мин при 25°С измеряли поглощение при 405 нм. Концентрации Fab, Fab-PA#1 (200) и Fab-PA#1 (600) в образцах плазмы количественно определяли сравнением измеренных сигналов со стандартными кривыми, которые определяли для серий разведения соответствующих очищенных белков при определенных концентрациях в ФСБ/Т, содержащем 0,5% (об./об.) мышиной плазмы от необработанных животных.
Для оценки периода полувыведения из плазмы Fab, Fab-PA#1 (200) и Fab-РА#1(600), значения концентрации, c(t), определяли для каждой временной точки на основании измерений ELISA и наносили на график против времени после внутривенной инъекции, t. Эти данные приводили в численное соответствие, применяя программное обеспечение KaleidaGraph, принимая би-экспоненциальный распад в соответствии с уравнением
-1п2- <- Чп21Г
c(t) = c e %h +(c -c )e %V2
4 ' a 4 0 a'
где xai/2 и тР1/2 представляют собой значения периода полувыведения фазы распределения а и фазы элиминации 8, соответственно. Со представляет собой суммарную концентрацию в крови в нулевой момент времени, тогда как са представляет собой амплитуду концентрации для фазы распределения.
На фиг. 8 изображена фармакокинетика для трех исследуемых препаратов у мышей BALB/c. Если рекомбинантный Fab проявляет быстрый клиренс из крови с периодом полувыведения только примерно 1,3 ч, слитые белки Fab-PA#1 (200) и Fab-PA#1 (600) имеют более чем 3-кратно и 29-кратно пролонгированный период полувыведения с соответствующими значениями примерно 4,1 ч и 38,8 ч, соответственно. Эти данные доказывают, что период полувыведения из плазмы in vivo Fab фрагмента значительно пролонгирован за счет слияния с полимером/полипептидом Pro/Ala, причем период полувыведения становится длиннее с возрастанием длины аминокислотного полимера.
Пример 17: Генный синтез для аминокислотных полимеров/полипептидов Р1А1 и Р1АЗ и конструирование pFab-P1A1(200) и pFab-P1A3(200) в качестве экспрессионных векторов для слитых белков Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3(200)
Генные фрагменты, кодирующие повторяющуюся последовательность полимера, содержащие полипептиды/полимеры Pro/Ala Р1А1 (SEQ ID NO: 51) и P1A3, также обозначенный РА#3, (SEQ ID NO: 3), были получены посредством гибридизации пар комплементарных олигодезоксинуклеотидов, соответственно, SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 53 для P1A1 и SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 55 для P1A3, как описано в Примере 1. pFab-P1A1(200) (SEQ ID NO: 58) и pFab-P1A3(200) (SEQ ID NO: 59), кодирующие Fab фрагменты с соответствующими полимерами/полипептидными сегментами Pro/Ala из 200 остатков на С-конце легкой цепи (LC) (аминокислотная последовательность LC Fab-P1A1(200): SEQ ID NO: 56; аминокислотная последовательность LC Fab-P1A3(200): SEQ ID NO: 57) были сконструированы аналогично pFab-PA#1(200), который был описан в Примере 2.
Далее SEQ ID NOs: 56, 57, 58 и 59 также воспроизведены. Однако эти последовательности также включены в прилагаемый перечень последовательностей, который составляет специальную часть данного изобретения и описания настоящего изобретения.
SEQ ID NO: 56
Asp lie Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
210 215 220
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
260 265 270
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
275 280 285
Ala Pro Ala 290
Pro Ala
Pro Ala 295
Pro Ala Pro Ala
Pro Ala 300
Pro Ala Pro
Ala Pro Ala 305
Pro Ala
Pro Ala 310
Pro Ala
Pro Ala 315
Pro Ala
Pro Ala Pro 320
Ala Pro Ala
Pro Ala 325
Pro Ala Pro Ala
Pro Ala 330
Pro Ala
Pro Ala Pro 335
Ala Pro Ala
Pro Ala 340
Pro Ala
Pro Ala 345
Pro Ala Pro Ala
Pro Ala Pro 350
Ala Pro Ala 355
Pro Ala Pro Ala
Pro Ala 360
Pro Ala
Pro Ala 365
Pro Ala Pro
Ala Pro Ala 370
Pro Ala
Pro Ala 375
Pro Ala Pro Ala
Pro Ala 380
Pro Ala Pro
Ala Pro Ala 385
Pro Ala
Pro Ala 390
Pro Ala
Pro Ala 395
Pro Ala
Pro Ala Pro 400
Ala Pro Ala
Pro Ala 405
Pro Ala Pro Ala
Pro Ala 410
Pro Ala
Pro Ala Pro 415
Ala
SEQ ID NO: 57
Asp lie Glu Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
210 215 220
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
245 250 255
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
260 265 270
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
275 280 285
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
290 295 300
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
305 310 315 320
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
325 330 335
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
340 345 350
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
355 360 365
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
370 375 380
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
385 390 395 400
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
Ala
SEQ ID NO: 58
acccgacacc atcgaatggc cagatgatta attcctaatt tttgttgaca ctctatcatt 60
gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaatga atagttcgac 120
aaaaatctag ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac 180
tggctggttt cgctaccgta gcgcaggccg aagttaaact gcaggaatcc ggtggtggtc 240
tggttcagcc aggtggttcc ctgcggctct cgtgtgctgc ttccggtttc aacatcaaag 300
acacctacat ccactgggtt cgtcaggctc cgggtaaagg cctggaatgg gttgctcgta 360
tctacccgac caacggttac accaggtatg ccgattcagt taaaggtcgt ttcaccatct 420
cggccgacac ttccaaaaac accgcttacc tccagatgaa ctccctgcgt gctgaagaca 480
cagctgttta ttattgctcc cgttggggtg gtgacggttt ctacgctatg gactactggg 540
gtcagggtac cctggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc 600
tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 660
actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc 720
acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg 780
tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgttaatcac aaacccagca 840
acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgcca tcaccaccat caccattaat 900
aaccatggag aaaataaagt gaaacaaagc actattgcac tggcactctt accgttactg 960
tttacccctg tgacaaaagc cgacatcgag ctcacccaat ccccgtcctc cctgtccgct 1020
tccgttggcg accgtgttac catcacgtgt agggcctcgc aagacgtaaa caccgccgta 1080
gcgtggtatc agcagaaacc cgggaaagct ccgaaactgc tgatctatag cgcttccttc 1140
ctgtattccg gagttccgag caggttcagt ggttcccgtt ccggtaccga cttcaccctg 1200
acgatatcct ccctccagcc ggaagacttc gctacctact actgtcaaca gcactacacc 1260
accccgccga ccttcggtca gggtaccaaa ctcgagatca aacggactgt ggctgcacca 1320
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 1380
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 1440
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 1500
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 1560
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttcg cccgtcacaa agagcttcaa ccgcggagag 1620
tgctcttctg cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1680
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1740
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1800
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1860
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1920
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1980
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2040
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2100
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2160
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2220
cctgcaccag cctgaagagc ttaagcttga cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg 2280
cgacattttt tttgtctgcc gtttaccgct actgcgtcac ggatctccac gcgccctgta 2340
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2400
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2460
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 2520
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 2580
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 2640
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 2700
cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 2760
acaaaatatt aacgtttaca atttcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 2820
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 2880
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 2940
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 3000
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 3060
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 3120
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 3180
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 3240
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 3300
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 3360
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 3420
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 3480
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaattg atagactgga 3540
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 3600
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gctctcgcgg tatcattgca gcactggggc 3660
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 3720
atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaggaat 3780
taatgatgtc tcgtttagat aaaagtaaag tgattaacag cgcattagag ctgcttaatg 3840
aggtcggaat cgaaggttta acaacccgta aactcgccca gaagctaggt gtagagcagc 3900
ctacattgta ttggcatgta aaaaataagc gggctttgct cgacgcctta gccattgaga 3960
tgttagatag gcaccatact cacttttgcc ctttagaagg ggaaagctgg caagattttt 4020
tacgtaataa cgctaaaagt tttagatgtg ctttactaag tcatcgcgat ggagcaaaag 4080
tacatttagg tacacggcct acagaaaaac agtatgaaac tctcgaaaat caattagcct 4140
ttttatgcca acaaggtttt tcactagaga atgcattata tgcactcagc gcagtggggc 4200
attttacttt aggttgcgta ttggaagatc aagagcatca agtcgctaaa gaagaaaggg 4260
aaacacctac tactgatagt atgccgccat tattacgaca agctatcgaa ttatttgatc 4320
accaaggtgc agagccagcc ttcttattcg gccttgaatt gatcatatgc ggattagaaa 4380
aacaacttaa atgtgaaagt gggtcttaaa agcagcataa cctttttccg tgatggtaac 4440
ttcactagtt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 4500
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 4560
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4620
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4680
tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4740
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4800
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4860
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4920
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4980
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 5040
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 5100
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 5160
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 5210
SEQ ID NO: 59
acccgacacc atcgaatggc cagatgatta attcctaatt tttgttgaca ctctatcatt 60
gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaatga atagttcgac 120
aaaaatctag ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac 180
tggctggttt cgctaccgta gcgcaggccg aagttaaact gcaggaatcc ggtggtggtc 240
tggttcagcc aggtggttcc ctgcggctct cgtgtgctgc ttccggtttc aacatcaaag 300
acacctacat ccactgggtt cgtcaggctc cgggtaaagg cctggaatgg gttgctcgta 360
tctacccgac caacggttac accaggtatg ccgattcagt taaaggtcgt ttcaccatct 420
cggccgacac ttccaaaaac accgcttacc tccagatgaa ctccctgcgt gctgaagaca 480
cagctgttta ttattgctcc cgttggggtg gtgacggttt ctacgctatg gactactggg 540
gtcagggtac cctggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc 600
tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 660
actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc 720
acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg 780
tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgttaatcac aaacccagca 840
acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgcca tcaccaccat caccattaat 900
aaccatggag aaaataaagt gaaacaaagc actattgcac tggcactctt accgttactg 960
tttacccctg tgacaaaagc cgacatcgag ctcacccaat ccccgtcctc cctgtccgct 1020
tccgttggcg accgtgttac catcacgtgt agggcctcgc aagacgtaaa caccgccgta 1080
gcgtggtatc agcagaaacc cgggaaagct ccgaaactgc tgatctatag cgcttccttc 1140
ctgtattccg gagttccgag caggttcagt ggttcccgtt ccggtaccga cttcaccctg 1200
acgatatcct ccctccagcc ggaagacttc gctacctact actgtcaaca gcactacacc 1260
accccgccga ccttcggtca gggtaccaaa ctcgagatca aacggactgt ggctgcacca 1320
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 1380
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 1440
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 1500
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 1560
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttcg cccgtcacaa agagcttcaa ccgcggagag 1620
tgctcttctg ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1680
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1740
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1800
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1860
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1920
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1980
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2040
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2100
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2160
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2220
gcagctccag cctgaagagc ttaagcttga cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg 2280
cgacattttt tttgtctgcc gtttaccgct actgcgtcac ggatctccac gcgccctgta 2340
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2400
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2460
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 2520
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 2580
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 2640
aaactggaac cgatttcggc acaaaatatt ctatttgttt gataaatgct cccttattcc tgaaagtaaa tcaacagcgg cttttaaagt tcggtcgccg agcatcttac ataacactgc ttttgcacaa aagccatacc gcaaactatt tggaggcgga ttgctgataa cagatggtaa atgaacgaaa taatgatgtc aggtcggaat ctacattgta tgttagatag tacgtaataa tacatttagg ttttatgcca attttacttt aaacacctac accaaggtgc aacaacttaa ttcactagtt cttaacgtga cttgagatcc cagcggtggt tcagcagagc tcaagaactc ctgccagtgg aggcgcagcg cctacaccga ggagaaaggc agcttccagg ttgagcgtcg acgcggcctt aacactcaac ctattggtta aacgtttaca atttttctaa tcaataatat cttttttgcg agatgctgaa taagatcctt tctgctatgt catacactat ggatggcatg ggccaactta catgggggat aaacgacgag aactggcgaa taaagttgca atctggagcc gccctcccgt tagacagatc tcgtttagat cgaaggttta ttggcatgta gcaccatact cgctaaaagt tacacggcct acaaggtttt aggttgcgta tactgatagt agagccagcc atgtgaaagt taaaaggatc gttttcgttc tttttttctg ttgtttgccg gcagatacca tgtagcaccg cgataagtcg gtcgggctga actgagatac ggacaggtat gggaaacgcc atttttgtga tttacggttc cctatctcgg aaaaatgagc atttcaggtg atacattcaa tgaaaaagga gcattttgcc gatcagttgg gagagttttc ggcgcggtat tctcagaatg acagtaagag cttctgacaa catgtaactc cgtgacacca ctacttactc ggaccacttc ggtgagcgtg atcgtagtta gctgagatag aaaagtaaag acaacccgta aaaaataagc cacttttgcc tttagatgtg acagaaaaac tcactagaga ttggaagatc atgccgccat ttcttattcg gggtcttaaa taggtgaaga cactgagcgt cgcgtaatct gatcaagagc aatactgtcc cctacatacc tgtcttaccg acggggggtt ctacagcgtg ccggtaagcg tggtatcttt tgctcgtcag ctggcctttt tctattcttt tgatttaaca gcacttttcg atatgtatcc agagtatgag ttcctgtttt gtgcacgagt gccccgaaga tatcccgtat acttggttga aattatgcag cgatcggagg gccttgatcg cgatgcctgt tagcttcccg tgcgctcggc gctctcgcgg tctacacgac gtgcctcact tgattaacag aactcgccca gggctttgct ctttagaagg ctttactaag agtatgaaac atgcattata aagagcatca tattacgaca gccttgaatt agcagcataa tcctttttga cagaccccgt gctgcttgca taccaactct ttctagtgta tcgctctgct ggttggactc cgtgcacaca agctatgaga gcagggtcgg atagtcctgt gggggcggag gctggccttt tgatttataa aaaatttaac gggaaatgtg gctcatgaga tattcaacat tgctcaccca gggttacatc acgttttcca tgacgccggg gtactcacca tgctgccata accgaaggag ttgggaaccg agcaatggca gcaacaattg ccttccggct tatcattgca ggggagtcag gattaagcat cgcattagag gaagctaggt cgacgcctta ggaaagctgg tcatcgcgat tctcgaaaat tgcactcagc agtcgctaaa agctatcgaa gatcatatgc cctttttccg taatctcatg agaaaagatc aacaaaaaaa ttttccgaag gccgtagtta aatcctgtta aagacgatag gcccagcttg aagcgccacg aacaggagag cgggtttcgc cctatggaaa tgctcacatg gggattttgc gcgaatttta cgcggaaccc caataaccct ttccgtgtcg gaaacgctgg gaactggatc atgatgagca caagagcaac gtcacagaaa accatgagtg ctaaccgctt gagctgaatg acaacgttgc atagactgga ggctggttta gcactggggc gcaactatgg tggtaggaat ctgcttaatg gtagagcagc gccattgaga caagattttt ggagcaaaag caattagcct gcagtggggc gaagaaaggg ttatttgatc ggattagaaa tgatggtaac accaaaatcc aaaggatctt ccaccgctac gtaactggct ggccaccact ccagtggctg ttaccggata gagcgaacga cttcccgaag cgcacgaggg cacctctgac aacgccagca
2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5210
Пример 18: Измерение гидродинамического объема для рекомбинантного слитого белка между Fab фрагментом и генетически кодируемым полипептидом/полимером Р1А1 или Р1АЗ посредством аналитической гель-фильтрации
ЭХ проводили на колонке Superdex S200 HR 10/300 GL (GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany) при скорости тока 1 мл/мин, применяя систему Akta Purifier 10 (GE Healthcare) с ФСБ в качестве буфера пробега. Образцы 250 мкл слитых белков Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3(200), которые были получены и очищены (фиг. 9) подобно тому, как описано для Fab-PA#1 (200) в Примере 4,
индивидуально наносили при концентрации 0,25 мг/мл в ФСБ. Оба белка элюировали в виде одного гомогенного пика, как показано на фиг. 10.
В результате, слитые с 200 остатками полимера/полипептида Р1А1 или Р1АЗ белки проявляли значительно большие размеры, чем соответствующий неслитый Fab фрагмент. Увеличение кажущегося размера для Fab-P1A1(200) и Fab-P1 А3(200) было 5,8-кратным и 5,2-кратным, соответственно, по сравнению с Fab фрагментом (см. фиг. 4В), тогда как действительная масса была больше только в 1,4 раза и в 1,3 раза. Это наблюдение четко указывает на значительно увеличенный гидродинамический объем, придаваемый биологически активному Fab фрагменту биосинтетическими полипептидными сегментами Р1А1 и Р1АЗ в соответствии сданным изобретением.
Пример 19: Определение нерегулярной спиральной конформации для биосинтетических полимеров/полипептидов Р1А1 и Р1АЗ, подвергнутых слиянию с Fab фрагментом, посредством спектроскопии кругового дихроизма (CD)
Спектры CD для Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3(200) записывали, как описано в Примере 8, применяя 4,2 и 6,5 мкМ растворы белков, соответственно, приготовленных подобно тому, как описано в Примере 4, применяя 50 мМ K2SO4, 20 мМ К-фосфат рН 7,5, в качестве буфера.
Спектры для слитых белков Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3(200) выявили значительную долю нерегулярной спиральной конформации (фиг. 11 А). Для более подробного анализа спектроскопического вклада полипептидного сегмента Pro/Ala вычисляли молярный разностный спектр CD по отношению к неслитому Fab фрагменту (см. Пример 8) (фиг. 11 В) посредством вычитания последнего спектра из спектра для Fab-P1A1(200) и Fab-P1A3(200), соответственно, после нормализации до одинаковой молярной концентрации. В результате, наблюдали сильный минимум при длине волны примерно 200 нм, который характерен для нерегулярной спиральной конформации. Таким образом, последовательности Р1А1 и Р1АЗ в составе рекомбинантного слитого белка, по-видимому, имеют нерегулярную спиральную конформацию в условиях физиологического буфера.
Пример 20: Конструирование pSUMO-PA#1(200) в качестве экспрессионного вектора для слитого белка His(6)-SUMO-PA#1(200)
Для конструирования экспрессионной плазмиды, кодирующей His-метку из шести остатков и малый белок-модификатор, подобный убиквитину (SUMO) (Panavas (2009) Methods Mol. Biol. 497: 303-17), подвергнутый слиянию с повторяющейся последовательностью РА#1 из 200 остатков, белок SUMO из Saccharomyces cerevisiae [также известный как Smt3p; Uniprot: Q12306] амплифицировли посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с клонированной кДНК. 5'-праймер вводил сайт рестрикции Nde\, содержащий стартовый кодон Met (ATG) и дополнительный кодон Lys, а также кодирующую последовательность ЬПэб-метки, тогда как З'-праймер вводил сайт рестрикции Hind\\\ и Sapl в продукт ПЦР. Полученный в результате фрагмент ДНК расщепляли Nde\ и Hind\\\ и лигировали с расщепленным соответствующим образом производным плазмиды pSA1 (Schmidt (1994) J. Chromatogr. 676: 337345), в которой сайт рестрикции Sapl был удален посредством молчащей мутации. Полученную плазмиду рестрицировали Sapl, дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки и лигировали с генным фрагментом, содержащим полипептидный сегмент РА#1 из 200 остатков, вырезанный из плазмиды pFab-PA#1 (200) (описанной в Примере 2) расщеплением рестриктазой Sapl (аналогично тому, как приведено в примере на фиг. 2Е). Полученная в результате плазмида была обозначена pSUMO-PA#1(200) (SEQ ID NO: 60) и изображена на фиг. 12А.
Пример 21: Бактериальная экспрессия и выделение генетически кодируемого полимера/полипептида РА#1(200)
Полипептид РА#1(200) (вычисленная масса: 16,1 кДа) исходно получали в виде слитого белка с малым белком-модификатором, подобным убиквитину (SUMO) (вычисленная масса: 12,2 кДа), в цитоплазме Е. coli BLR(DE3) (NEB, Ipswich, MA, USA), несущей экспрессионную плазмиду pSUMO-PA#1(200) (описанную в Примере 21) вместе с плазмидой pLysE (Studier (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44), которая супрессирует промотор Т7. Получение в бактериях осуществляли при 30°С в культурах в качалочных колбах в 2 л среды LB, содержащей 2,5 г/л D-глюкозы, 0,5 г/л L-пролина, 100 мг/л ампициллина и 30 мг/л хлорамфеникола. Экспрессию рекомбинантного гена индуцировали добавлением изопропил-З-О-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 0,5 мМ. Бактерии собирали через 3 ч после индукции, ресуспендировали в 100 мМ NaCI, 40 мМ Na-фосфат, рН 7,5 и лизировали,
применяя ячейку френч-пресса (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). После центрифугирования лизата (15 мин, 15000 g) тельца включения не наблюдали.
Супернатант, содержащий растворимый слитый белок, инкубировали при 70°С в течение 15 мин и центрифугировали (15 мин, 15000 д) для удаления термически нестабильных белков клетки-хозяина. Слитый белок His(6)-SUMO-РА#1(200) очищали от супернатанта посредством IMAC (Skerra (1994) Gene 141: 79-84), применяя 12 мл колонку высокого разрешения HisTrap, загруженную Ni2+ (GE Healthcare), соединенную с системой Akta Purifier (GE Healthcare), и элюировали градиентом имидазола от 0 до 150 мМ в 500 мМ NaCI, 40 мМ Na-фосфат, рН 7,5. После следующей стадии препаративной ЭХ был получен гомогенный препарат слитого белка His(6)-SUMO-PA#1(200) (фиг. 12В) с выходом примерно 5 мг на 1 л бактериальной культуры с OD550 1. Концентрацию белка определяли в соответствии с поглощением при 280 нм, применяя вычисленный коэффициент экстинкции (Gill (1989) цит. выше) 1280 М"1 см"1 для слитого полипептида His(6)-SUMO-PA#1(200). Следует отметить, что полипептидный сегмент РА#1(200) не вносит вклад в поглощение при 280 нм вследствие отсутствия ароматических или серосодержащих боковых цепей аминокислот.
Биосинтетический полипептид РА#1 (200) высвобождали из слитого белка посредством сайт-специфического протеолитического расщепления (ниже мотива Gly-Gly, предшествующего полипептидному сегменту Pro/Ala), 2 ед./мг Ubl-специфичной протеазы 1 из Saccharomyces cerevisiae (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в течение 1 ч при 30°С в буфере расщепления (0,2% масс/об. Igepal, 1 мМ DTT (дитиотреитол), 150 мМ NaCI, 50 мМ Трис-HCI рН 8,0). Процесс расщепления проверяли посредством электрофореза в ДСН-ПААГ (фиг. 12В), применяя систему Трис буфера высокой молярности (Fling (1986) Anal. Biochem. 155: 83-88). С целью удаления отщепленного белка His(6)-SUMO, остаточного нерасщепленного слитого белка, а также протеазы SUMO, где все они несут Hise-метку, реакционную смесь подвергали другой IMAC, применяя 5 мл колонку высокого разрешения HisTrap, загруженную Ni2+ (GE Healthcare) и 500 М NaCI, 20 мМ фосфат, рН 7,5 в качестве буфера пробега. В это время проточная фракция содержала чистый биосинтетический полипептид РА#1(200) (фиг. 13 Е). Следует отметить, что биосинтетический полипептид/полимер РА#1(200) (SEQ ID NO: 61), полученный таким путем, содержит суммарно 201
аминокислотный остаток, который образуется из кодируемого комбинированного генного продукта из 10 лигированных двунитевых олигодезоксинуклеотидных строительных блоков, каждый из них кодирует 20 аминокислотных остатков, как показано на фиг. 1, и дополнительного остатка Ala, кодируемого триплетом ДНК, выступающим из расположенного ниже сайта рестрикции Sapl, который использовали для клонирования.
Пример 22: Получение и характеристика конъюгатов малых молекул/лекарственных средств с РА#1(200)
Неочищенную реакционную смесь протеолитического расщепления слитого белка His(6)-SUMO-PA#1(200) из Примера 21 дважды подвергали диализу при 4°С против 50 мМ ЫаНСОз рН 8,3 и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч после смешивания с 10-кратным молярным избытком раствора N-гидроксисукцинимидного сложного эфира 6-[флуоресцеин-5(6)-карбоксамидо]гексановой кислоты (флуоресцеин-NHS сложного эфира; Sigma-Aldrich) в сухом диметилформамиде (ДМФ). С этой целью 200 мкл раствора 2,5 мг/мл расщепленной смеси His(6)-SUMO-PA#1(200) добавляли к 17,6 мкл 10 мМ раствора флуоресцеин-NHS сложного эфира, растворенного в ДМФ. Полученную в результате смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч и наносили на IMAC, как описано в Примере 21, чтобы удалить отщепленный белок His(6)-SUMO, остаточный нерасщепленный слитый белок и протеазу SUMO, и дополнительно очищали препаративной ЭХ на колонке Superdex S200 10/300 GL, уравновешенной ФСБ, при скорости тока 0,5 мл/мин.
Затем образцы с различных стадий анализировали посредством аналитической ЭХ на колонке Superdex S200 10/300 GL, уравновешенной ФСБ, при скорости тока 0,5 мл/мин. Белок SUMO обнаруживали за счет его ароматических боковых цепей при 280 нм, а пептидные связи, включающие связи полипептида или полипептидного сегмента Pro/Ala, обнаруживали при 225 нм, тогда как флуоресцеин обнаруживали при 494 нм (фиг. 13 A-G). Для сравнения спектры UV/VIS раствора свободного флуоресцеина (Sigma-Aldrich) и фракций из каждого отдельного пика, обнаруженные в ЭХ, измеряли, применяя прибор Lambda 9 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) (фиг. 13 H-K). Для калибровки размеров на хроматографической колонке (фиг. 13 L) 250 мкл соответствующей смеси следующих глобулярных белков (Sigma-Aldrich)
наносили в ФСБ при концентрациях от 0,2 до 0,5 мг/мл: апротинин, 6,5 кДа; цитохром с, 12,4 кДа; карбоангидраза, 29,0 кДа; бычий сывороточный альбумин, 66,3 кДа; алкогольдегидрогеназа, 150 кДа; 8-амилаза, 200 кДа; апо-ферритин, 440 кДа.
В результате, после сочетания биосинтетического полипептида/полимера РА#1(200) с флуоресцеин-NHS сложным эфиром, посредством IMAC и ЭХ был выделен макромолекулярный конъюгат, который по существу проявляет свойства размера полипептида/полимера РА#1(200) и характерную спектроскопическую черту малой молекулы, то есть флуоресцеиновой группы. Это демонстрирует, что малая молекула была успешно связана с биосинтетическим полипептидом/полимером Pro/Ala, что, в соответствии с данным изобретением, резко увеличивает гидродинамический объем конъюгированного низкомолекулярного лекарственного средства или соединения.
Для получения подобного конъюгата между биосинтетическим полипептидом/полимером Pro/Ala и растительным стероидом дигоксигенином 0,1 мг очищенного полипептида РА#1(200) из Примера 21 подвергали диализу против 50 мМ NaHCOs рН 8,3, как описано выше. Концентрацию очищенного полипептида РА#1(200) определяли в соответствии с поглощением при 205 нм (Gill (1989) цит. выше). Полипептид РА#1(200) подвергали сочетанию с 10-кратным молярным избытком NHS сложного эфира дигоксигенин-З-О-метилкарбамоил-?-аминокапроновой кислоты (DIG-NHS сложным эфиром; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Для этой цели 100 мкл раствора 1 мг/мл очищенного полипептида РА#1(200) в 50 мМ NaHCOs рН 8,3 добавляли к 2 мкл 30 мМ раствора DIG-NHS сложного эфира, растворенного в сухом ДМФ, и реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Полученный раствор конъюгата очищали, применяя микроцентрифужную обессоливающую колонку для очистки фрагментов ДНК от примесей Zeba(tm) с отсечением 7 кДа (Thermo Scientific), дважды подвергали диализу против 10 мМ буфера ацетата аммония рН 6,8 и анализировали посредством масс-спектрометрии ЭРИ на приборе Q-Tof Ultima (Waters, Eschbronn, Germany), применяя режим положительного иона. В результате, спектр конъюгата дигоксигенин-РА#1 (200) выявил массу 16671,4 Да, которая по существу совпадает с вычисленной массой 16670,6 Да (фиг. 13М). Это четко
демонстрирует, что биосинтетический полипептид/полимер Pro/Ala, в частности, РА#1(200), можно эффективно конъюгировать с низкомолекулярным лекарственным средством.
Настоящее изобретение относится к приведенным ниже иллюстративным последовательностям, где прилагаемый перечень последовательностей представлен как часть описания и, соответственно, составляет часть данного описания изобретения.
SEQ ID NO: 1 показывает аминокислотную последовательность РА#1.
SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность РА#2.
SEQ ID NO: 3 показывает аминокислотную последовательность РА#3.
SEQ ID NO: 4 показывает аминокислотную последовательность РА#4.
SEQ ID NO: 5 показывает аминокислотную последовательность РА#5.
SEQ ID NO: 6 показывает аминокислотную последовательность РА#6.
SEQ ID NO: 7 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 8 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 9 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 10 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 11 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 12 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 13 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 14 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 15 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 16 показывает аминокислотную последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками.
SEQ ID NO: 17 показывает последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида верхней/кодирующей нити, используемую для создания строительного блока РА#1.
SEQ ID NO: 18 показывает последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида нижней/некодирующей нити, используемую для создания строительного блока РА#1.
SEQ ID NO: 19 показывает участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхней/кодирующей нити) около С-конца легкой цепи иммуноглобулина Fab фрагмента антитела, кодируемый на pASK88-Fab-2xSapl.
SEQ ID NO: 20 показывает участок последовательности нуклеиновой кислоты (нижней/некодирующей нити) около С-конца легкой цепи иммуноглобулина Fab фрагмента антитела, кодируемый на pASK88-Fab-2xSapl.
SEQ ID NO: 21 показывает аминокислотную последовательность С-конца легкой цепи Fab фрагмента, кодируемую на pASK88-Fab-2xSapl.
SEQ ID NO: 22 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pASK88-Fab-2xSapl.
SEQ ID NO: 23 показывает участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхней/кодирующей нити), кодирующий аминокислотную последовательность С-конца легкой цепи Fab после вставки одного полимера РА#1(20).
SEQ ID NO: 24 показывает участок последовательности нуклеиновой кислоты (нижней/некодирующей нити), кодирующий аминокислотную последовательность С-конца легкой цепи Fab после вставки одного полимера РА#1(20).
SEQ ID NO: 25 показывает участок аминокислотной последовательности С-конца легкой цепи Fab после вставки одного полимера РА#1(20).
SEQ ID NO: 26 показывает аминокислотную последовательность тяжелой цепи Fab, кодируемую на pFab-PA#1(200).
SEQ ID NO: 27 показывает аминокислотную последовательность легкой цепи Fab, подвергнутой слиянию с полимером РА#1(200), кодируемую на pFab-РА#1(200).
SEQ ID NO: 28 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pFab-PA#1 (200).
SEQ ID NO: 29 показывает последовательность нуклеиновой кислоты (верхней/кодирующей нити), кодирующую аминокислотную последовательность N-конца INFa2b и Sfrep-метки II (только две последние аминокислоты).
SEQ ID NO: 30 показывает последовательность нуклеиновой кислоты
(нижнюю/некодирующую нить), кодирующую аминокислотную
последовательность N-конца INFa2b и Sfrep-метки II (только две последние аминокислоты).
SEQ ID NO: 31 показывает аминокислотную последовательность С-конца Strep-метки II и N-конца INFa2b.
SEQ ID NO: 32 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pASK-IFNa2b.
SEQ ID NO: 33 показывает участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхнюю/кодирующую нить), кодирующий С-конец Strep-метки II и N-конец IFNa2b после вставки одной кассеты последовательности полимера РА#1.
SEQ ID NO: 34 показывает участок последовательности нуклеиновой кислоты (нижнюю/некодирующую нить) С-конца Strep-метки II и N-конца IFNa2b после вставки одной кассеты последовательности полимера РА#1.
SEQ ID NO: 35 показывает участок аминокислотной последовательности С-конца Strep-метки II и N-конца IFNa2b после слияния с одной кассетой последовательности полимера РА#1.
SEQ ID NO: 36 показывает аминокислотную последовательность IFNa2b и Sfrep-метки II, подвергнутой слиянию с полимером РА#1(200), кодируемую на pPA#1(200)-IFNa2b.
SEQ ID NO: 37 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pPA#1(200)-IFNa2b.
SEQ ID NO: 38 показывает участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхнюю/кодирующую нить) на pASK75-His6-hGH, кодирующий аминокислотную последовательность около N-конца His6-hGH.
SEQ ID NO: 39 показывает участок последовательности нуклеиновой кислоты (нижнюю/некодирующую нить) на pASK75-His6-hGH, кодирующий аминокислотную последовательность около N-конца hGH.
SEQ ID NO: 40 показывает участок аминокислотной последовательности N-конца His6-hGH, кодируемый на pASK75-His6-hGH.
SEQ ID NO: 41 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pASK75-His6-hGH.
SEQ ID NO: 42 показывает участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхнюю/кодирующую нить), кодирующий аминокислотную последовательность N-конца His6-hGH после вставки полимера РА#1(20).
SEQ ID NO: 43 показывает последовательность нуклеиновой кислоты (нижнюю/некодирующую нить), кодирующую N-конец hGH после вставки одной кассеты последовательности полимера РА#1.
SEQ ID NO: 44 показывает аминокислотную последовательность N-конца His6-hGH после вставки полимера РА#1(20).
SEQ ID NO: 45 показывает аминокислотную последовательность зрелого His6-PA#1(200)-hGH, кодируемую на pASK75-His6-PA#1(200)-hGH.
SEQ ID NO: 46 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pASK75-His6-PA#1 (200)-hGH.
SEQ ID NO: 47 показывает аминокислотную последовательность His6-PA#1(200)-hGH, кодируемую на pCHO-PA#1(200)-hGH.
SEQ ID NO: 48 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pCHO-PA#1(200)-hGH.
SEQ ID NO: 49 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pCHO-hGH.
SEQ ID NO: 50 показывает последовательность нуклеиновой кислоты
рСНО.
SEQ ID NO: 51 показывает аминокислотную последовательность Р1А1.
SEQ ID NO: 52 показывает последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида верхней/кодирующей нити, используемую для создания строительного блока Р1А1.
SEQ ID NO: 53 показывает последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида нижней/некодирующей нити, используемую для создания строительного блока Р1А1.
SEQ ID NO: 54 показывает последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида верхней/кодирующей нити, используемую для создания строительного блока Р1АЗ.
SEQ ID NO: 55 показывает последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида нижней/некодирующей нити, используемую для создания строительного блока Р1АЗ.
SEQ ID NO: 56 показывает аминокислотную последовательность легкой цепи Fab, подвергнутую слиянию с полимером Р1А1(200), кодируемую на pFab-Р1А1 (200).
SEQ ID NO: 57 показывает аминокислотную последовательность легкой цепи Fab, подвергнутую слиянию с полимером Р1АЗ(200), кодируемую на pFab-Р1АЗ(200).
SEQ ID NO: 58 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pFab-P1A1(200).
SEQ ID NO: 59 показывает аминокислотную последовательность pFab-Р1АЗ(200).
SEQ ID NO: 60 показывает последовательность нуклеиновой кислоты pSUMO-PA#1(200).
SEQ ID NO: 61 показывает полипептид/полимер РА#1(200), используемый для получения конъюгатов лекарственных средств, полученный путем лигирования 10-20-мерных кодирующих генных кассет, включая один дополнительный С-концевой остаток Ala, являющийся результатом сайта лигирования, находящегося ниже.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ИксЭль-ПРОТЕИН ГМБХ
ТЕХНИШЕ УНИВЕРЗИТЕТ МЮНХЕН СКЕРРА, Арне БИНДЕР, Ули ШЛАПШИ, Мартин
<120> Биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды пролина/аланина и их применения
<130> S1467 PCT S3
<160> 61
<170> PatentIn версия 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность PA#1
<400> 1
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala 20
20 ПРТ
<210> <211> <212>
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность PA#2
<400> 2
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro 20
<210> <211> <212>
20 ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность PA#3
<400> 3
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Ala Pro 20
<210> <211> <212>
ПРТ
<220> <221>
s о о о ^
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность PA#4
<400> 4
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro 20
<210> <211> <212>
24 ПРТ
<220> <221>
^ о о о ^
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность PA#5
<400> 5
Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Pro 20
<210> <211> <212>
24 ПРТ
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность PA#6
<400> 6
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ala 20
<210> <211> <212>
20 ПРТ
<220> <221>
^ о о -> ^
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 7
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala 20
20 ПРТ
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 8
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Ala 20
<210> <211> <212>
? О 1 О ^
20 ПРТ
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 9
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Ala Pro 20
<210> <211> <212>
/01 Q\
10 20 ПРТ
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 10
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala 20
<210> <211> <212>
/01 0\
11 20 ПРТ
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 11
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala 20
<210> <211> <212>
/01 0\
12 20 ПРТ
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 12
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro 20
<210> 13
<211> 20
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 13
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala 20
<210> 14
<211> 20
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 14
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro 20
15 20 ПРТ
<210> <211> <212>
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 15
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala 20
<210> 16
<211> 20 <212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность варианта SEQ ID NO: 1 с круговыми перестановками
<400> 16
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala 20
<210> <211> <212>
17 60 ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида верхней/кодирующей нити, используемая для создания строительного блока PA#1
<400> 17
gccgctccag ctgcacctgc tccagcagca cctgctgcac cagctccggc tgctcctgct 60
<210> 18
<211> 60
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида нижней/некодирующей нити, используемая для создания строительного блока PA#1
<400> 18
ggcagcagga gcagccggag ctggtgcagc aggtgctgct ggagcaggtg cagctggagc 60
<210> 19
<211> 49
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхняя/кодирующая нить) около C-конца легкой цепи иммуноглобулина Fab фрагмента антитела, кодируемый на pASK8 8-Fab-2xSapI
<400> 19
aagagcttca accgcggaga gtgctcttct gcctgaagag cttaagctt
<210> 20
<211> 49
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок последовательности нуклеиновой кислоты (нижняя/некодирующая нить) около C-конца легкой цепи иммуноглобулина Fab фрагмента антитела, кодируемый на pASK8 8-Fab-2xSapI
<400> 20
aagcttaagc tcttcaggca gaagagcact ctccgcggtt gaagctctt 49
<210> 21 <211> 11
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная
последовательность C-конца легкой цепи Fab фрагмента, кодируемая на pASK88-Fab-2xSapI
<400> 21
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 4610
<212> ДНК
ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой
<223>
кислоты pASK8 8-Fab-2xSapI
actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc 720
acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg 780
tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgttaatcac aaacccagca 840
acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgcca tcaccaccat caccattaat 900
aaccatggag aaaataaagt gaaacaaagc actattgcac tggcactctt accgttactg 960
tttacccctg tgacaaaagc cgacatcgag ctcacccaat ccccgtcctc cctgtccgct 1020
tccgttggcg accgtgttac catcacgtgt agggcctcgc aagacgtaaa caccgccgta 1080
gcgtggtatc agcagaaacc cgggaaagct ccgaaactgc tgatctatag cgcttccttc 1140
ctgtattccg gagttccgag caggttcagt ggttcccgtt ccggtaccga cttcaccctg 1200
acgatatcct ccctccagcc ggaagacttc gctacctact actgtcaaca gcactacacc 1260
accccgccga ccttcggtca gggtaccaaa ctcgagatca aacggactgt ggctgcacca 1320
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 1380
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 1440
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 1500
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 1560
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttcg cccgtcacaa agagcttcaa ccgcggagag 1620
tgctcttctg cctgaagagc ttaagcttga cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg 1680
cgacattttt tttgtctgcc gtttaccgct actgcgtcac ggatctccac gcgccctgta 1740
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 1800
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 1860
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 1920
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 1980
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 2040
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 2100
cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 2160
acaaaatatt aacgtttaca atttcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 2220
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 2280
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 2340
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 2400
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 2460
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 2520
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 2580
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 2640
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 2700
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 2760
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 2820
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 2880
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaattg atagactgga 2940
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 3000
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gctctcgcgg tatcattgca gcactggggc 3060
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 3120
atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaggaat 3180
taatgatgtc tcgtttagat aaaagtaaag tgattaacag cgcattagag ctgcttaatg 3240
aggtcggaat cgaaggttta acaacccgta aactcgccca gaagctaggt gtagagcagc 3300
ctacattgta ttggcatgta aaaaataagc gggctttgct cgacgcctta gccattgaga 3360
tgttagatag gcaccatact cacttttgcc ctttagaagg ggaaagctgg caagattttt 3420
tacgtaataa cgctaaaagt tttagatgtg ctttactaag tcatcgcgat ggagcaaaag 3480
tacatttagg tacacggcct acagaaaaac agtatgaaac tctcgaaaat caattagcct 3540
ttttatgcca acaaggtttt tcactagaga atgcattata tgcactcagc gcagtggggc 3600
attttacttt aggttgcgta ttggaagatc aagagcatca agtcgctaaa gaagaaaggg 3660
aaacacctac tactgatagt atgccgccat tattacgaca agctatcgaa ttatttgatc 3720
accaaggtgc agagccagcc ttcttattcg gccttgaatt gatcatatgc ggattagaaa 3780
aacaacttaa atgtgaaagt gggtcttaaa agcagcataa cctttttccg tgatggtaac 3840
ttcactagtt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 3900
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 3960
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4020
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4080
tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4140
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4200
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4260
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4320
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4380
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 4440
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 4500
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 4560 acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 4610
<210> 23
<211> 85
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхняя/кодирующая нить), кодирующий аминокислотную последовательность C-конца легкой цепи Fab после вставки одного полимера PA#1(20)
<400> 23
gagtgctctt ctgccgctcc agctgcacct gctccagcag cacctgctgc accagctccg 60 gctgctcctg ctgcctgaag agctt 85
<210> 24
<211> 85
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок последовательности нуклеиновой кислоты (нижняя/некодирующая нить), кодирующий аминокислотную последовательность C-конца легкой цепи Fab после вставки одного полимера
PA#1(20) <400> 24
aagctcttca ggcagcagga gcagccggag ctggtgcagc aggtgctgct ggagcaggtg 60 cagctggagc ggcagaagag cactc 85
<210> 25 <211> 25
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок аминокислотной последовательности C-конца легкой цепи Fab после вставки одного полимера
PA#1(20) <400> 25
Glu Cys Ser Ser Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala 20 25
<210> 26
<211> 229
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная
последовательность тяжелой цепи Fab, кодируемая на pFab-PA#1(200)
<400> 26
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys His
210 215 220
His His His His His
225
<210> 27
<211> 417
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная
последовательность легкой цепи Fab, подвергнутая слиянию с полимером PA#1(200), кодируемая на pFab-PA#1(200)
<400> 27
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
210 215 220
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
225 230 235 240
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
245 250 255
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
260 265 270
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
275 280 285
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
290 295 300
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
305 310 315 320
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
325 330 335
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
340 345 350
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
355 360 365
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
370 375 380
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
385 390 395 400
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
405 410 415
Ala
<210> 28
<211> 5210
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой
кислоты pFab-PA#1(200)
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttcg cccgtcacaa agagcttcaa ccgcggagag 1620
tgctcttctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 1680
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 1740
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 1800
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 1860
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 1920
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 1980
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 2040
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 2100
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 2160
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 2220
gctcctgctg cctgaagagc ttaagcttga cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg 2280
cgacattttt tttgtctgcc gtttaccgct actgcgtcac ggatctccac gcgccctgta 2340
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2400
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2460
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 2520
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 2580
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 2640
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 2700
cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 2760
acaaaatatt aacgtttaca atttcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 2820
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 2880
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 2940
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 3000
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 3060
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 3120
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 3180
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 3240
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 3300
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 3360
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 3420
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 3480
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaattg atagactgga 3540
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 3600
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gctctcgcgg tatcattgca gcactggggc 3660
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 3720
atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaggaat 3780
taatgatgtc tcgtttagat aaaagtaaag tgattaacag cgcattagag ctgcttaatg 3840
aggtcggaat cgaaggttta acaacccgta aactcgccca gaagctaggt gtagagcagc 3900
ctacattgta ttggcatgta aaaaataagc gggctttgct cgacgcctta gccattgaga 3960
tgttagatag gcaccatact cacttttgcc ctttagaagg ggaaagctgg caagattttt 4020
tacgtaataa cgctaaaagt tttagatgtg ctttactaag tcatcgcgat ggagcaaaag 4080
tacatttagg tacacggcct acagaaaaac agtatgaaac tctcgaaaat caattagcct 4140
ttttatgcca acaaggtttt tcactagaga atgcattata tgcactcagc gcagtggggc 4200
attttacttt aggttgcgta ttggaagatc aagagcatca agtcgctaaa gaagaaaggg 4260
aaacacctac tactgatagt atgccgccat tattacgaca agctatcgaa ttatttgatc 4320
accaaggtgc agagccagcc ttcttattcg gccttgaatt gatcatatgc ggattagaaa 4380
aacaacttaa atgtgaaagt gggtcttaaa agcagcataa cctttttccg tgatggtaac 4440
ttcactagtt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 4500
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 4560
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4620
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4680
tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4740
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4800
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4860
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4920
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4980
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 5040
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 5100
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 5160
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 5210
<210> 29
<211> 57
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты (верхняя/кодирующая нить), кодирующая аминокислотную последовательность N-конца INFa2b и Strep-метки II (только две последние аминокислоты)
<400> 29
gaaaaaggcg ccagctcttc tgcctgtgat ctgcctcaaa cccacagcct gggtagc 57
<210> 30 <211> 57
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты (нижняя/некодирующая нить), кодирующая аминокислотную последовательность N-конца INFa2b и Strep-метки II (только две последние аминокислоты)
<400> 30
gctacccagg ctgtgggttt gaggcagatc acaggcagaa gagctggcgc ctttttc 57
<210> <211> <212>
/01 0\
31 19
ПРТ
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность C-конца Strep-метки II и N-конца INFa2b
<400> 31
Glu Lys Gly Ala Ser Ser Ser Ala Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ser
<210> 32
<211> 3721
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты pASK-IFNa2b
<400> 32
ccatcgaatg gccagatgat taattcctaa tttttgttga cactctatca ttgatagagt 60
tattttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaat gaatagttcg acaaaaatct 120
agataacgag ggcaaaaaat gaaaaagaca gctatcgcga ttgcagtggc actggctggt 180
ttcgctaccg tagcgcaggc cgctagctgg agccacccgc agttcgaaaa aggcgccagc 240
tcttctgcct gtgatctgcc tcaaacccac agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc 300
ctggcacaga tgaggagaat ctctcttttc tcctgcttga aggacagaca tgactttgga 360
tttccccagg aggagtttgg caaccagttc caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat 420
gagatgatcc agcagatctt caatctcttc agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat 480
gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc 540
tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag actcccctga tgaaggagga ctccattctg 600
gctgtgagga aatacttcca aagaatcact ctctatctga aagagaagaa atacagccct 660
tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatctt tttctttgtc aacaaacttg 720
caagaaagtt taagaagtaa ggaataagct tgacctgtga agtgaaaaat ggcgcacatt 780
gtgcgacatt ttttttgtct gccgtttacc gctactgcgt cacggatctc cacgcgccct 840
gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 900
ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 960
gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 1020
ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 1080
gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 1140
tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 1200
tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 1260
ttaacaaaat attaacgctt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 1320
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 1380
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 1440
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 1500
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 1560
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 1620
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 1680
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 1740
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 1800
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 1860
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 1920
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 1980
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttgatagact 2040
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 2100
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggctctcg cggtatcatt gcagcactgg 2160
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 2220
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtagg 2280
aattaatgat gtctcgttta gataaaagta aagtgattaa cagcgcatta gagctgctta 2340
atgaggtcgg aatcgaaggt ttaacaaccc gtaaactcgc ccagaagcta ggtgtagagc 2400
agcctacatt gtattggcat gtaaaaaata agcgggcttt gctcgacgcc ttagccattg 2460
agatgttaga taggcaccat actcactttt gccctttaga aggggaaagc tggcaagatt 2520
ttttacgtaa taacgctaaa agttttagat gtgctttact aagtcatcgc gatggagcaa 2580
aagtacattt aggtacacgg cctacagaaa aacagtatga aactctcgaa aatcaattag 2640
cctttttatg ccaacaaggt ttttcactag agaatgcatt atatgcactc agcgcagtgg 2700
ggcattttac tttaggttgc gtattggaag atcaagagca tcaagtcgct aaagaagaaa 2760
gggaaacacc tactactgat agtatgccgc cattattacg acaagctatc gaattatttg 2820
atcaccaagg tgcagagcca gccttcttat tcggccttga attgatcata tgcggattag 2880
aaaaacaact taaatgtgaa agtgggtctt aaaagcagca taaccttttt ccgtgatggt 2940
aacttcacta gtttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 3000
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 3060
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 3120
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 3180
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 3240
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 3300
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 3360
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 3420
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 3480
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 3540
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 3600
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 3660
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgacccgac 3720
a 3721
<210> 33
<211> 90
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхняя/кодирующая нить), кодирующий C-конец Strep-метки II и N-конец IFNa2b после вставки одной кассеты последовательности полимера PA#1
<400> 33
gaaaaaggcg ccagctcttc tgccgctcca gctgcacctg ctccagcagc acctgctgca 60 ccagctccgg ctgctcctgc tgcctgtgat 90
<210> 34 <211> 90
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок последовательности нуклеиновой кислоты (нижняя/некодирующая нить) C-конца Strep-метки II и N-конца IFNa2b после вставки одной кассеты последовательности полимера PA#1
<400> 34
atcacaggca gcaggagcag ccggagctgg tgcagcaggt gctgctggag caggtgcagc 60 tggagcggca gaagagctgg cgcctttttc 90
<210> 35
<211> 30
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок аминокислотной последовательности C-конца Strep-метки II и N-конца IFNa2b после слияния с одной кассетой полимера PA#1
<400> 35
Glu Lys Gly Ala Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Cys Asp
20 25 30
<210> 36
<211> 381
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность IFNa2b и Strep-метки II, подвергнутая слиянию с полимером
PA#1(200), кодируемая на pPA#1(200)-IFNa2b <400> 36
Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Ser Ser Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
35 40 45
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
85 90 95
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
115 120 125
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala
145 150 155 160
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
165 170 175
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
195 200 205
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser
210 215 220
Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile
225 230 235 240
Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln
245 250 255
Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu
260 265 270
His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser
275 280 285
Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu
290 295 300
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
325 330 335
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser
340 345 350
Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser
355 360 365
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
370 375 380
<210> 37
<211> 4321
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой
кислоты pPA#1(200)-IFNa2b
cctgctgccg ctccagctgc acctgctcca gcagcacctg ctgcaccagc tccggctgct 780
cctgctgccg ctccagctgc acctgctcca gcagcacctg ctgcaccagc tccggctgct 840
cctgctgcct gtgatctgcc tcaaacccac agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc 900
ctggcacaga tgaggagaat ctctcttttc tcctgcttga aggacagaca tgactttgga 960
tttccccagg aggagtttgg caaccagttc caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat 1020
gagatgatcc agcagatctt caatctcttc agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat 1080
gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc 1140
tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag actcccctga tgaaggagga ctccattctg 1200
gctgtgagga aatacttcca aagaatcact ctctatctga aagagaagaa atacagccct 1260
tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatctt tttctttgtc aacaaacttg 1320
caagaaagtt taagaagtaa ggaataagct tgacctgtga agtgaaaaat ggcgcacatt 1380
gtgcgacatt ttttttgtct gccgtttacc gctactgcgt cacggatctc cacgcgccct 1440
gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 1500
ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 1560
gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 1620
ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 1680
gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 1740
tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 1800
tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 1860
ttaacaaaat attaacgctt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 1920
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 1980
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg 2040
tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 2100
tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 2160
atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga 2220
gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 2280
aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag 2340
aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 2400
gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 2460
cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 2520
atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt 2580
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttgatagact 2640
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 2700
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggctctcg cggtatcatt gcagcactgg 2760
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 2820
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtagg 2880
aattaatgat gtctcgttta gataaaagta aagtgattaa cagcgcatta gagctgctta 2940
atgaggtcgg aatcgaaggt ttaacaaccc gtaaactcgc ccagaagcta ggtgtagagc 3000
agcctacatt gtattggcat gtaaaaaata agcgggcttt gctcgacgcc ttagccattg 3060
agatgttaga taggcaccat actcactttt gccctttaga aggggaaagc tggcaagatt 3120
ttttacgtaa taacgctaaa agttttagat gtgctttact aagtcatcgc gatggagcaa 3180
aagtacattt aggtacacgg cctacagaaa aacagtatga aactctcgaa aatcaattag 3240
cctttttatg ccaacaaggt ttttcactag agaatgcatt atatgcactc agcgcagtgg 3300
ggcattttac tttaggttgc gtattggaag atcaagagca tcaagtcgct aaagaagaaa 3360
gggaaacacc tactactgat agtatgccgc cattattacg acaagctatc gaattatttg 3420
atcaccaagg tgcagagcca gccttcttat tcggccttga attgatcata tgcggattag 3480
aaaaacaact taaatgtgaa agtgggtctt aaaagcagca taaccttttt ccgtgatggt 3540
aacttcacta gtttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 3600
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 3660
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 3720
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 3780
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 3840
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 3900
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 3960
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 4020
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 4080
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 4140
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 4200
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 4260
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgacccgac 4320
a 4321
<210> 38
<211> 54
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхняя/кодирующая нить) на pASK75-His6-hGH, кодирующий аминокислотную последовательность около N-конца His6-hGH
<400> 38
gccgctagcc atcaccacca tcaccatggc gccagctctt ctgccttccc aacc 54
<210> 39
<211> 54
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок последовательности нуклеиновой кислоты (нижняя/некодирующая нить) на pASK75-His6-hGH, кодирующий аминокислотную последовательность около N-конца hGH
<400> 39
ggttgggaag gcagaagagc tggcgccatg gtgatggtgg tgatggctag cggc 54
<210> 40 <211> 18
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок аминокислотной последовательности N-конца His6-hGH, кодируемый на pASK75-His6-hGH
<400> 40
Ala Ala Ser His His His His His His Gly Ala Ser Ser Ser Ala Phe
1 5 10 15
Pro Thr
<210> 41
<211> 3793
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты pASK75-His6-hGH
<400> 41
acccgacacc atcgaatggc cagatgatta attcctaatt tttgttgaca ctctatcatt 60
gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaatga atagttcgac 120
aaaaatctag ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac 180
tggctggttt cgctaccgta gcgcaggccg ctagccatca ccaccatcac catggcgcca 240
gctcttctgc cttcccaacc attcccttat ccaggctttt tgacaacgct atgctccgcg 300
cccatcgtct gcaccagctg gcctttgaca cctaccagga gtttgaagaa gcctatatcc 360
caaaggaaca gaagtattca ttcctgcaga acccccagac ctccctctgt ttctcagagt 420
ctattccgac accctccaac agggaggaaa cacaacagaa atccaaccta gagctgctcc 480
gcatctccct gctgctcatc cagtcgtggc tggagcccgt gcagttcctc aggagtgtct 540
tcgccaacag cctggtgtac ggcgcctctg acagcaacgt ctatgacctc ctaaaggacc 600
tagaggaagg catccaaacg ctgatgggga ggctggaaga tggcagcccc cggactgggc 660
agatcttcaa gcagacctac agcaagttcg acacaaactc acacaacgat gacgcactac 720
tcaagaacta cgggctgctc tactgcttca ggaaggacat ggacaaggtc gagacattcc 780
tgcgcatcgt gcagtgccgc tctgtggagg gcagctgtgg cttctaagct tgacctgtga 840
agtgaaaaat ggcgcacatt gtgcgacatt ttttttgtct gccgtttacc gctactgcgt 900
cacggatctc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 960
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 1020
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 1080
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 1140
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 1200
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 1260
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 1320
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 1380
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 1440
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 1500
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 1560
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 1620
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 1680
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 1740
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 1800
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 1860
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1920
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1980
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 2040
tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 2100
ccggcaacaa ttgatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 2160
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggctctcg 2220
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 2280
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 2340
actgattaag cattggtagg aattaatgat gtctcgttta gataaaagta aagtgattaa 2400
cagcgcatta gagctgctta atgaggtcgg aatcgaaggt ttaacaaccc gtaaactcgc 2460
ccagaagcta ggtgtagagc agcctacatt gtattggcat gtaaaaaata agcgggcttt 2520
gctcgacgcc ttagccattg agatgttaga taggcaccat actcactttt gccctttaga 2580
aggggaaagc tggcaagatt ttttacgtaa taacgctaaa agttttagat gtgctttact 2640
aagtcatcgc gatggagcaa aagtacattt aggtacacgg cctacagaaa aacagtatga 2700
aactctcgaa aatcaattag cctttttatg ccaacaaggt ttttcactag agaatgcatt 2760
atatgcactc agcgcagtgg ggcattttac tttaggttgc gtattggaag atcaagagca 2820
tcaagtcgct aaagaagaaa gggaaacacc tactactgat agtatgccgc cattattacg 2880
acaagctatc gaattatttg atcaccaagg tgcagagcca gccttcttat tcggccttga 2940
attgatcata tgcggattag aaaaacaact taaatgtgaa agtgggtctt aaaagcagca 3000
taaccttttt ccgtgatggt aacttcacta gtttaaaagg atctaggtga agatcctttt 3060
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 3120
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 3180
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 3240
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 3300
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 3360
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 3420
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 3480
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 3540
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3600
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3660
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3720
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 3780
ttttgctcac atg 3793
<210> 42
<211> 114
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: участок последовательности нуклеиновой кислоты (верхняя/кодирующая нить), кодирующий аминокислотную последовательность N-конца His6-hGH после вставки полимера PA#1(20)
<400> 42
gccgctagcc atcaccacca tcaccatggc gccagctctt ctgccgctcc agctgcacct 60 gctccagcag cacctgctgc accagctccg gctgctcctg ctgccttccc aacc 114
<210> 43 <211> 114
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты (нижняя/некодирующая нить), кодирующая N-конец hGH после вставки одной кассеты последовательности полимера PA#1
<400> 43
ggttgggaag gcagcaggag cagccggagc tggtgcagca ggtgctgctg gagcaggtgc 60 agctggagcg gcagaagagc tggcgccatg gtgatggtgg tgatggctag cggc 114
<210> 44 <211> 38
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность N-конца His6-hGH после вставки полимера PA#1(20)
<400> 44
Ala Ala Ser His His His His His His Gly Ala Ser Ser Ser Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala
20 25 30
Pro Ala Ala Phe Pro Thr 35
<210> 45
<211> 405
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность зрелого His6-PA#1(200)-hGH, кодируемая на pASK75-His6-
PA#1(200)-hGH
<400> 45
Ala Ser His His His His His His Gly Ala Ser Ser Ser Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
100 105 110
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
115 120 125
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
130 135 140
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
180 185 190
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
210 215 220
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
225 230 235 240
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
245 250 255
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
260 265 270
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
275 280 285
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
290 295 300
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
305 310 315 320
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
325 330 335
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
340 345 350
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
355 360 365
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
370 375 380
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
385 390 395 400
Gly Ser Cys Gly Phe 405
<210> 46
<211> 4393
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой
кислоты pASK75-His6-PA#1(200)-hGH
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 480
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 540
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 600
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 660
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 720
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 780
gctcctgctg ccgctccagc tgcacctgct ccagcagcac ctgctgcacc agctccggct 840
gctcctgctg ccttcccaac cattccctta tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc 900
gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac acctaccagg agtttgaaga agcctatatc 960
ccaaaggaac agaagtattc attcctgcag aacccccaga cctccctctg tttctcagag 1020
tctattccga caccctccaa cagggaggaa acacaacaga aatccaacct agagctgctc 1080
cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc 1140
ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac 1200
ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg aggctggaag atggcagccc ccggactggg 1260
cagatcttca agcagaccta cagcaagttc gacacaaact cacacaacga tgacgcacta 1320
ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc 1380
ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag ggcagctgtg gcttctaagc ttgacctgtg 1440
aagtgaaaaa tggcgcacat tgtgcgacat tttttttgtc tgccgtttac cgctactgcg 1500
tcacggatct ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 1560
gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 1620
cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 1680
ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 1740
cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 1800
tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 1860
cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 1920
aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttca ggtggcactt 1980
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 2040
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 2100
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 2160
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 2220
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 2280
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 2340
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 2400
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 2460
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 2520
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 2580
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 2640
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 2700
cccggcaaca attgatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 2760
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtggctctc 2820
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 2880
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 2940
cactgattaa gcattggtag gaattaatga tgtctcgttt agataaaagt aaagtgatta 3000
acagcgcatt agagctgctt aatgaggtcg gaatcgaagg tttaacaacc cgtaaactcg 3060
cccagaagct aggtgtagag cagcctacat tgtattggca tgtaaaaaat aagcgggctt 3120
tgctcgacgc cttagccatt gagatgttag ataggcacca tactcacttt tgccctttag 3180
aaggggaaag ctggcaagat tttttacgta ataacgctaa aagttttaga tgtgctttac 3240
taagtcatcg cgatggagca aaagtacatt taggtacacg gcctacagaa aaacagtatg 3300
aaactctcga aaatcaatta gcctttttat gccaacaagg tttttcacta gagaatgcat 3360
tatatgcact cagcgcagtg gggcatttta ctttaggttg cgtattggaa gatcaagagc 3420
atcaagtcgc taaagaagaa agggaaacac ctactactga tagtatgccg ccattattac 3480
gacaagctat cgaattattt gatcaccaag gtgcagagcc agccttctta ttcggccttg 3540
aattgatcat atgcggatta gaaaaacaac ttaaatgtga aagtgggtct taaaagcagc 3600
ataacctttt tccgtgatgg taacttcact agtttaaaag gatctaggtg aagatccttt 3660
ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 3720
ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 3780
tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 3840
ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag 3900
tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 3960
tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 4020
actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 4080
cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat 4140
gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 4200
tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 4260
ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 4320 ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 4380 cttttgctca cat 4393
<210> 47 <211> 404 <212> ""m
ПРТ
<220> <221>
s о о о ^
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность His6-PA#1(200)-hGH, кодируемая на pCHO-PA#1(200)-hGH
<400> 47
Ser His His His His His His Gly Ala Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
165 170 175
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
195 200 205
Ala Ala Pro Ala Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp
210 215 220
Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr
225 230 235 240
Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser
245 250 255
Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro
260 265 270
Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu
275 280 285
Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln
290 295 300
Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp
305 310 315 320
Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr
325 330 335
Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe
340 345 350
Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala
355 360 365
Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp
370 375 380
Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly
385 390 395 400
Ser Cys Gly Phe
<210> 48
<211> 6653
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты pCHO-PA#1(200)-hGH
<400> 48
ctattctata gtgtcaccta aatgctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta 60
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 120
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 180
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 240
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 300
gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 360
ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 420
tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cggggcatcc 480
ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg 540
atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 600
ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 660
tctattcttt tgatttataa gggattttgg ggatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 720
tgatttaaca aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg 780
aaagtcccca ggctccccag gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 840
caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 900
tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 960
ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 1020
aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 1080
gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt cggatctgat caagagacag 1140
gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 1200
gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 1260
ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 1320
gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 1380
ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 1440
gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 1500
tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 1560
accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 1620
aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 1680
aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 1740
atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 1800
cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 1860
aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 1920
ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga 1980
ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 2040
gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct 2100
catgctggag ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 2160
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 2220
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag 2280
cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 2340
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 2400
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 2460
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 2520
cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 2580
tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 2640
gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 2700
ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 2760
aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 2820
tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 2880
ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 2940
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 3000
tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 3060
caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 3120
ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 3180
cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 3240
ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 3300
cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 3360
gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 3420
aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 3480
acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 3540
gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 3600
cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 3660
cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 3720
tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 3780
cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 3840
gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 3900
cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 3960
ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 4020
gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 4080
taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 4140
gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 4200
acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 4260
aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 4320
cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 4380
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 4440
gccacctgac gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtcgac tctcagtaca 4500
atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc 4560
gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc 4620
atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat 4680
acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 4740
catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 4800
ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 4860
atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca 4920
gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 4980
cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 5040
tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 5100
ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 5160
ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 5220
acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta 5280
actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc 5340
caagctgcca ccatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc 5400
tgcctgccct ggcttcaaga gggcagcgct agccatcacc accatcacca tggcgccagc 5460
tcttctgccg ctccagctgc acctgctcca gcagcacctg ctgcaccagc tccggctgct 5520
cctgctgccg ctccagctgc acctgctcca gcagcacctg ctgcaccagc tccggctgct 5580
cctgctgccg
ctccagctgc
acctgctcca
gcagcacctg
ctgcaccagc
tccggctgct
5640
cctgctgccg
ctccagctgc
acctgctcca
gcagcacctg
ctgcaccagc
tccggctgct
5700
cctgctgccg
ctccagctgc
acctgctcca
gcagcacctg
ctgcaccagc
tccggctgct
5760
cctgctgccg
ctccagctgc
acctgctcca
gcagcacctg
ctgcaccagc
tccggctgct
5820
cctgctgccg
ctccagctgc
acctgctcca
gcagcacctg
ctgcaccagc
tccggctgct
5880
cctgctgccg
ctccagctgc
acctgctcca
gcagcacctg
ctgcaccagc
tccggctgct
5940
cctgctgccg
ctccagctgc
acctgctcca
gcagcacctg
ctgcaccagc
tccggctgct
6000
cctgctgccg
ctccagctgc
acctgctcca
gcagcacctg
ctgcaccagc
tccggctgct
6060
cctgctgcct
tcccaaccat
tcccttatcc
aggctttttg
acaacgctat
gctccgcgcc
6120
catcgtctgc
accagctggc
ctttgacacc
taccaggagt
ttgaagaagc
ctatatccca
6180
aaggaacaga
agtattcatt
cctgcagaac
ccccagacct
ccctctgttt
ctcagagtct
6240
attccgacac
cctccaacag
ggaggaaaca
caacagaaat
ccaacctaga
gctgctccgc
6300
atctccctgc
tgctcatcca
gtcgtggctg
gagcccgtgc
agttcctcag
gagtgtcttc
6360
gccaacagcc
tggtgtacgg
cgcctctgac
agcaacgtct
atgacctcct
aaaggaccta
6420
gaggaaggca
tccaaacgct
gatggggagg
ctggaagatg
gcagcccccg
gactgggcag
6480
atcttcaagc
agacctacag
caagttcgac
acaaactcac
acaacgatga
cgcactactc
6540
aagaactacg
ggctgctcta
ctgcttcagg
aaggacatgg
acaaggtcga
gacattcctg
6600
cgcatcgtgc
agtgccgctc
tgtggagggc
agctgtggct
tctaagcttg
gcc
6653
<210> 49 <211> 6041
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты pCHO-hGH
<400> 49
ctattctata gtgtcaccta aatgctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta 60
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 120
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 180
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 240
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 300
gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 360
ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 420
tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cggggcatcc 480
ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg 540
atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 600
ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 660
tctattcttt tgatttataa gggattttgg ggatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 720
tgatttaaca aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg 780
aaagtcccca ggctccccag gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 840
caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 900
tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 960
ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 1020
aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 1080
gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt cggatctgat caagagacag 1140
gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 1200
gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 1260
ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 1320
gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 1380
ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 1440
gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 1500
tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 1560
accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 1620
aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 1680
aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 1740
atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 1800
cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 1860
aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 1920
ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga 1980
ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 2040
gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct 2100
catgctggag ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 2160
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 2220
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag 2280
cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 2340
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 2400
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 2460
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 2520
cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 2580
tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 2640
gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 2700
ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 2760
aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 2820
tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 2880
ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 2940
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 3000
tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 3060
caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 3120
ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 3180
cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 3240
ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 3300
cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 3360
gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 3420
aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 3480
acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 3540
gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 3600
cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 3660
cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 3720
tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 3780
cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 3840
gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 3900
cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 3960
ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 4020
gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 4080
taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 4140
gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 4200
acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 4260
aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 4320
cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 4380
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 4440
gccacctgac gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtcgac tctcagtaca 4500
atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc 4560
gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc 4620
atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat 4680
acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 4740
catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 4800
ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 4860
atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca 4920
gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 4980
cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 5040
tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 5100
ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 5160
ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 5220
acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta 5280
actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc 5340
caagctgcca ccatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc 5400
tgcctgccct ggcttcaaga gggcagcgct agccatcacc accatcacca tggcgccttc 5460
ccaaccattc ccttatccag gctttttgac aacgctatgc tccgcgccca tcgtctgcac 5520
cagctggcct ttgacaccta ccaggagttt gaagaagcct atatcccaaa ggaacagaag 5580
tattcattcc tgcagaaccc ccagacctcc ctctgtttct cagagtctat tccgacaccc 5640
tccaacaggg aggaaacaca acagaaatcc aacctagagc tgctccgcat ctccctgctg 5700
ctcatccagt cgtggctgga gcccgtgcag ttcctcagga gtgtcttcgc caacagcctg 5760
gtgtacggcg cctctgacag caacgtctat gacctcctaa aggacctaga ggaaggcatc 5820
caaacgctga tggggaggct ggaagatggc agcccccgga ctgggcagat cttcaagcag 5880
acctacagca agttcgacac aaactcacac aacgatgacg cactactcaa gaactacggg 5940
ctgctctact gcttcaggaa ggacatggac aaggtcgaga cattcctgcg catcgtgcag 6000
tgccgctctg tggagggcag ctgtggcttc taagcttggc c 6041
<210> 50
<211> 5449
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты pCHO
<400> 50
ctattctata gtgtcaccta aatgctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta 60
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 120
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 180
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 240
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 300
gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 360
ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 420
tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cggggcatcc 480
ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg 540
atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 600
ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 660
tctattcttt tgatttataa gggattttgg ggatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 720
tgatttaaca aaaatttaac gcgaattaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg 780
aaagtcccca ggctccccag gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 840
caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 900
tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 960
ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 1020
aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 1080
gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt cggatctgat caagagacag 1140
gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 1200
gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 1260
ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 1320
gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 1380
ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 1440
gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 1500
tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 1560
accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 1620
aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 1680
aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 1740
atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 1800
cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 1860
aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 1920
ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga 1980
ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 2040
gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct 2100
catgctggag ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 2160
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 2220
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag 2280
cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 2340
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 2400
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 2460
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 2520
cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 2580
tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 2640
gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 2700
ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 2760
aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 2820
tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 2880
ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 2940
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 3000
tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 3060
caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 3120
ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 3180
cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 3240
ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 3300
cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 3360
gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 3420
aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 3480
acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 3540
gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 3600
cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 3660
cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 3720
tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 3780
cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 3840
gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 3900
cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 3960
ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 4020
gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 4080
taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 4140
gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 4200
acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 4260
aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 4320
cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 4380
atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 4440
gccacctgac gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtcgac tctcagtaca 4500
atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc 4560
gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc 4620
atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat 4680
acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 4740
catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 4800
ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 4860
atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca 4920
gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 4980
cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 5040
tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 5100
ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 5160
ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 5220
acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta 5280
actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc 5340
caagctgcca ccatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc 5400
tgcctgccct ggcttcaaga gggcagcgct agctctagaa agcttggcc 5449
<210> 51 <211> 20
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность <220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная последовательность P1A1
<400> 51
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Pro Ala Pro 20
<210> <211> <212>
52 60 ДНК
<220> <221>
s о о о ^
<213> искусственная последовательность
источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида верхней/кодирующей нити, используемая для создания строительного блока P1A1
<400> 52
gcccctgctc ctgctccagc acctgcacca gcacctgctc cagcaccagc tcctgcacca 60
<210> 53
<211> 60
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида нижней/некодирующей нити, используемая для создания строительного блока P1A1
<400> 53
ggctggtgca ggagctggtg ctggagcagg tgctggtgca ggtgctggag caggagcagg 60
<210> 54
<211> 60
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида верхней/кодирующей нити, используемая для создания строительного блока P1A3
<400> 54
gccgctgcac ctgctgcagc acctgctgca gctccagcag ctgctcctgc agcagctcca 60
<210> 55
<211> 60 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты олигодезоксинуклеотида нижней/некодирующей нити, используемая для создания строительного блока P1A3
<400> 55
ggctggagct gctgcaggag cagctgctgg agctgcagca ggtgctgcag caggtgcagc 60
<210> 56
<211> 417 <212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
источник
<220> <221>
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная
последовательность легкой цепи Fab, подвергнутая слиянию с полимером P1A1(200), кодируемая на pFab-P1A1(200)
<400> 56
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145
150
155
160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
210 215 220
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
225 230 235 240
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
260 265 270
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
275 280 285
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
290 295 300
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
305 310 315 320
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
325 330 335
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
340 345 350
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
355 360 365
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
370 375 380
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
385 390 395 400
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro
405 410 415
Ala
<210> 57
<211> 417
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: аминокислотная
последовательность легкой цепи Fab, подвергнутая слиянию с полимером P1A3(200), кодируемая на pFab-P1A3(200)
<400> 57
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
210 215 220
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
245 250 255
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
260 265 270
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
275 280 285
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
290 295 300
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
305 310 315 320
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
325 330 335
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
340 345 350
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
355 360 365
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
370 375 380
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
385 390 395 400
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
405 410 415
Ala
<210> 58
<211> 5210
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты pFab-P1A1(200)
<400> 58
acccgacacc atcgaatggc cagatgatta attcctaatt tttgttgaca ctctatcatt 60
gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaatga atagttcgac 120
aaaaatctag ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac 180
tggctggttt cgctaccgta gcgcaggccg aagttaaact gcaggaatcc ggtggtggtc 240
tggttcagcc aggtggttcc ctgcggctct cgtgtgctgc ttccggtttc aacatcaaag 300
acacctacat ccactgggtt cgtcaggctc cgggtaaagg cctggaatgg gttgctcgta 360
tctacccgac caacggttac accaggtatg ccgattcagt taaaggtcgt ttcaccatct 420
cggccgacac ttccaaaaac accgcttacc tccagatgaa ctccctgcgt gctgaagaca 480
cagctgttta ttattgctcc cgttggggtg gtgacggttt ctacgctatg gactactggg 540
gtcagggtac cctggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc 600
tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 660
actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc 720
acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg 780
tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgttaatcac aaacccagca 840
acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgcca tcaccaccat caccattaat 900
aaccatggag aaaataaagt gaaacaaagc actattgcac tggcactctt accgttactg 960
tttacccctg tgacaaaagc cgacatcgag ctcacccaat ccccgtcctc cctgtccgct 1020
tccgttggcg accgtgttac catcacgtgt agggcctcgc aagacgtaaa caccgccgta 1080
gcgtggtatc agcagaaacc cgggaaagct ccgaaactgc tgatctatag cgcttccttc 1140
ctgtattccg gagttccgag caggttcagt ggttcccgtt ccggtaccga cttcaccctg 1200
acgatatcct ccctccagcc ggaagacttc gctacctact actgtcaaca gcactacacc 1260
accccgccga ccttcggtca gggtaccaaa ctcgagatca aacggactgt ggctgcacca 1320
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 1380
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 1440
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 1500
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 1560
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttcg cccgtcacaa agagcttcaa ccgcggagag 1620
tgctcttctg cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1680
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1740
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1800
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1860
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1920
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1980
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2040
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2100
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2160
cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2220
cctgcaccag cctgaagagc ttaagcttga cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg 2280
cgacattttt tttgtctgcc gtttaccgct actgcgtcac ggatctccac gcgccctgta 2340
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2400
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2460
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 2520
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 2580
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 2640
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 2700
cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 2760
acaaaatatt aacgtttaca atttcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 2820
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 2880
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 2940
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 3000
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 3060
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 3120
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 3180
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 3240
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 3300
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 3360
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 3420
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 3480
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaattg atagactgga 3540
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 3600
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gctctcgcgg tatcattgca gcactggggc 3660
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 3720
atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaggaat 3780
taatgatgtc tcgtttagat aaaagtaaag tgattaacag cgcattagag ctgcttaatg 3840
aggtcggaat cgaaggttta acaacccgta aactcgccca gaagctaggt gtagagcagc 3900
ctacattgta ttggcatgta aaaaataagc gggctttgct cgacgcctta gccattgaga 3960
tgttagatag gcaccatact cacttttgcc ctttagaagg ggaaagctgg caagattttt 4020
tacgtaataa cgctaaaagt tttagatgtg ctttactaag tcatcgcgat ggagcaaaag 4080
tacatttagg tacacggcct acagaaaaac agtatgaaac tctcgaaaat caattagcct 4140
ttttatgcca acaaggtttt tcactagaga atgcattata tgcactcagc gcagtggggc 4200
attttacttt aggttgcgta ttggaagatc aagagcatca agtcgctaaa gaagaaaggg 4260
aaacacctac tactgatagt atgccgccat tattacgaca agctatcgaa ttatttgatc 4320
accaaggtgc agagccagcc ttcttattcg gccttgaatt gatcatatgc ggattagaaa 4380
aacaacttaa atgtgaaagt gggtcttaaa agcagcataa cctttttccg tgatggtaac 4440
ttcactagtt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 4500
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 4560
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4620
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4680
tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4740
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4800
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4860
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4920
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4980
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 5040
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 5100
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 5160
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 5210
<210> 59
<211> 5210
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой кислоты pFab-P1A3(200)
<400> 59
acccgacacc atcgaatggc cagatgatta attcctaatt tttgttgaca ctctatcatt 60
gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaatga atagttcgac 120
aaaaatctag ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac 180
tggctggttt cgctaccgta gcgcaggccg aagttaaact gcaggaatcc ggtggtggtc 240
tggttcagcc aggtggttcc ctgcggctct cgtgtgctgc ttccggtttc aacatcaaag 300
acacctacat ccactgggtt cgtcaggctc cgggtaaagg cctggaatgg gttgctcgta 360
tctacccgac caacggttac accaggtatg ccgattcagt taaaggtcgt ttcaccatct 420
cggccgacac ttccaaaaac accgcttacc tccagatgaa ctccctgcgt gctgaagaca 480
cagctgttta ttattgctcc cgttggggtg gtgacggttt ctacgctatg gactactggg 540
gtcagggtac cctggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc 600
tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 660
actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc 720
acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg 780
tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgttaatcac aaacccagca 840
acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgcca tcaccaccat caccattaat 900
aaccatggag aaaataaagt gaaacaaagc actattgcac tggcactctt accgttactg 960
tttacccctg tgacaaaagc cgacatcgag ctcacccaat ccccgtcctc cctgtccgct 1020
tccgttggcg accgtgttac catcacgtgt agggcctcgc aagacgtaaa caccgccgta 1080
gcgtggtatc agcagaaacc cgggaaagct ccgaaactgc tgatctatag cgcttccttc 1140
ctgtattccg gagttccgag caggttcagt ggttcccgtt ccggtaccga cttcaccctg 1200
acgatatcct ccctccagcc ggaagacttc gctacctact actgtcaaca gcactacacc 1260
accccgccga ccttcggtca gggtaccaaa ctcgagatca aacggactgt ggctgcacca 1320
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 1380
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 1440
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 1500
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 1560
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttcg cccgtcacaa agagcttcaa ccgcggagag 1620
tgctcttctg ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1680
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1740
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1800
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1860
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1920
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1980
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2040
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2100
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2160
gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2220
gcagctccag cctgaagagc ttaagcttga cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg 2280
cgacattttt tttgtctgcc gtttaccgct actgcgtcac ggatctccac gcgccctgta 2340
gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2400
gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2460
ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 2520
acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 2580
agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 2640
aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 2700
cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 2760
acaaaatatt aacgtttaca atttcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 2820
ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 2880
gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 2940
cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 3000
tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 3060
tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 3120
cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 3180
tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 3240
agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 3300
ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 3360
ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 3420
aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 3480
gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaattg atagactgga 3540
tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 3600
ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gctctcgcgg tatcattgca gcactggggc 3660
cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 3720
atgaacgaaa
tagacagatc
gctgagatag
gtgcctcact
gattaagcat
tggtaggaat
3780
taatgatgtc
tcgtttagat
aaaagtaaag
tgattaacag
cgcattagag
ctgcttaatg
3840
aggtcggaat
cgaaggttta
acaacccgta
aactcgccca
gaagctaggt
gtagagcagc
3900
ctacattgta
ttggcatgta
aaaaataagc
gggctttgct
cgacgcctta
gccattgaga
3960
tgttagatag
gcaccatact
cacttttgcc
ctttagaagg
ggaaagctgg
caagattttt
4020
tacgtaataa
cgctaaaagt
tttagatgtg
ctttactaag
tcatcgcgat
ggagcaaaag
4080
tacatttagg
tacacggcct
acagaaaaac
agtatgaaac
tctcgaaaat
caattagcct
4140
ttttatgcca
acaaggtttt
tcactagaga
atgcattata
tgcactcagc
gcagtggggc
4200
attttacttt
aggttgcgta
ttggaagatc
aagagcatca
agtcgctaaa
gaagaaaggg
4260
aaacacctac
tactgatagt
atgccgccat
tattacgaca
agctatcgaa
ttatttgatc
4320
accaaggtgc
agagccagcc
ttcttattcg
gccttgaatt
gatcatatgc
ggattagaaa
4380
aacaacttaa
atgtgaaagt
gggtcttaaa
agcagcataa
cctttttccg
tgatggtaac
4440
ttcactagtt
taaaaggatc
taggtgaaga
tcctttttga
taatctcatg
accaaaatcc
4500
cttaacgtga
gttttcgttc
cactgagcgt
cagaccccgt
agaaaagatc
aaaggatctt
4560
cttgagatcc
tttttttctg
cgcgtaatct
gctgcttgca
aacaaaaaaa
ccaccgctac
4620
cagcggtggt
ttgtttgccg
gatcaagagc
taccaactct
ttttccgaag
gtaactggct
4680
tcagcagagc
gcagatacca
aatactgtcc
ttctagtgta
gccgtagtta
ggccaccact
4740
tcaagaactc
tgtagcaccg
cctacatacc
tcgctctgct
aatcctgtta
ccagtggctg
4800
ctgccagtgg
cgataagtcg
tgtcttaccg
ggttggactc
aagacgatag
ttaccggata
4860
aggcgcagcg
gtcgggctga
acggggggtt
cgtgcacaca
gcccagcttg
gagcgaacga
4920
cctacaccga
actgagatac
ctacagcgtg
agctatgaga
aagcgccacg
cttcccgaag
4980
ggagaaaggc
ggacaggtat
ccggtaagcg
gcagggtcgg
aacaggagag
cgcacgaggg
5040
agcttccagg
gggaaacgcc
tggtatcttt
atagtcctgt
cgggtttcgc
cacctctgac
5100
ttgagcgtcg
atttttgtga
tgctcgtcag
gggggcggag
cctatggaaa
aacgccagca
5160
acgcggcctt
tttacggttc
ctggcctttt
gctggccttt
tgctcacatg
5210
<210> 60
<211> 3680
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность нуклеиновой
кислоты pSUMO-PA#1(200)
<400> 60
gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 120
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 180
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 240
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 300
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 360
tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 420
acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 480
aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 540
cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 600
gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 660
cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 720
tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 780
tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 840
ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 900
tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 960
gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1020
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1080
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1140
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1200
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1260
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 1320
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1380
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1440
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1500
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1560
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1620
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1680
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1740
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1800
acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 1860
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 1920
cggagaagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1980
ggatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac ggtttccctc 2040
tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacat atgaaacatc accaccatca 2100
ccattcggac tcagaagtca atcaagaagc taagccagag gtcaagccag aagtcaagcc 2160
tgagactcac atcaatttaa aggtgtccga tggatcttca gaaatcttct ttaagatcaa 2220
aaagaccact cctttaagaa ggctgatgga agcgttcgct aaaagacagg gtaaggaaat 2280
ggactcctta agattcttgt acgacggtat tagaattcaa gctgatcaga cccctgaaga 2340
tttggacatg gaggataacg atattattga ggctcacaga gaacagattg gtggcgccgc 2400
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2460
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2520
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2580
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2640
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2700
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2760
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2820
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2880
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2940
tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgcctg 3000
aagagcaagc ttgatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 3060
accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt 3120
ttgctgaaag gaggaactat atccggatct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 3180
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat 3240
taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 3300
cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 3360
aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 3420
ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 3480
ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 3540
caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 3600
cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat 3660
taacgcttac aatttaggtg 3680
<210> 61
<211> 201
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> Описание искусственной последовательности: полипептид/полимер PA#1(200), используемый для получения конъюгатов лекарственных средств (полученный путем лигирования 10-2 0-мерных кодирующих генных кассет, включающий один дополнительный C-концевой остаток Ala, являющийся результатом сайта лигирования, находящегося ниже)
<400> 61
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala 195 200
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Конъюгат лекарственного средства, содержащий
(1) биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), и
(2) лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из (а) биологически активного белка или полипептида, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую активность, и (Ь) низкомолекулярного лекарственного средства.
2. Конъюгат лекарственного средства по п. 1, где указанный
нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент содержит
аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков
в количестве от примерно 50 до примерно 3000.
3. Конъюгат лекарственного средства по п. 1 или 2, где указанные остатки
пролина составляют более чем примерно 10% и менее чем примерно 75%
аминокислотной последовательности.
4. Конъюгат лекарственного средства по любому из п.п. 1-3, где указанный нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент содержит множество аминокислотных повторов, где указанный повтор состоит из остатков пролина и аланина, и где не более чем 6 последовательных аминокислотных остатков идентичны.
5. Конъюгат лекарственного средства по любому из п.п. 1-4, где указанный нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из
ААРААРАРААРААРАРААРА (SEQ ID NO: 1); AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP(SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3); ААРААРААРААРААРААРААРААР (SEQ ID NO: 4); APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5); AAAP AAP AAPP AAAAP AAP AAP PA (SEQ ID NO: 6); и
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51),
либо вариантов с круговыми перестановками, либо мультимера(ов) этих последовательностей полностью, либо участков этих последовательностей.
6. Конъюгат лекарственного средства по любому из п.п. 1-5, где
указанный полипептид с биологической активностью, указанный биологически
активный белок или указанный полипептид, который содержит или
представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или
опосредует биологическую активность, выбран из группы, состоящей из
связывающих белков, фрагментов антител, цитокинов, факторов роста,
гормонов или ферментов.
7. Конъюгат лекарственного средства по п. 6, где указанный полипептид с
биологической активностью представляет собой связывающий белок, и где
указанная связывающая молекула выбрана из группы, состоящей из антител,
Fab фрагментов, F(ab')2 фрагментов, пептидомиметиков, происходящих из
CDR, одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), доменных антител,
лектинов, иммуноглобулиновых доменов, фибронектиновых доменов, доменов
белка А, доменов SH3, доменов анкириновых повторов и липокалинов.
8. Конъюгат лекарственного средства по любому из п.п. 1-7, где
указанный биологически активный белок выбран из группы, состоящей из
гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, гормона роста человека,
альфа-интерферона, бета-интерферона, гамма-интерферона, фактора некроза
опухоли, эритропоэтина, фактора свертывания крови VIII, gp120/gp160,
растворимого рецептора фактора некроза опухоли I и II, ретеплазы, эксендина-
4, анакинра, интерлейкина-2, липокалина, ассоциированного с желатиназой
нейтрофилов, фолликулостимулирующего гормона, глюкоцереброзидазы,
тимозина альфа 1, глюкагона, соматостатина, аденозиндеаминазы,
интерлейкина 11, фактора свертывания крови Vila, фактора свертывания крови
IX, гематида, лямбда-интерферона, лептина, альфа-субъединицы рецептора
интерлейкина-22 (IL-22ra), интерлейкина-22, гиалуронидазы, фактора роста
фибробластов 18, фактора роста фибробластов 21, глюкагоноподобного
пептида 1, остеопротегерина, белка, связывающего IL-18, рилизинг-фактора
гормона роста, растворимого рецептора TACI (рецептор фактора некроза
опухоли суперсемейства 13В), тромбоспондина-1, растворимого рецептора
VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) Flt-1 и мутеина IL-4.
9. Конъюгат лекарственного средства по любому из п.п. 1-8, где указанный биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент опосредует повышенную стабильность in vivo и/или in vitro указанного конъюгата лекарственного средства.
10. Конъюгат лекарственного средства по п. 9, где указанная повышенная стабильность in vivo представляет собой пролонгированный период полувыведения из плазмы указанного конъюгата лекарственного средства, который содержит указанный биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala), по сравнению со стабильностью контрольного полипептида или контрольного конъюгата без указанного нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента.
11. Конъюгат лекарственного средства по любому из п.п. 1-10, где указанная малая молекула выбрана из группы, состоящей из дигоксигенина, флуоресцеина, доксорубицина, калихеамицина, камптотецина, фумагиллина, дексаметазона, гелданамицина, паклитаксела, доцетаксела, иринотекана, циклоспорина, бупренорфина, налтрексона, налоксона, виндезина, ванкомицина, рисперидона, арипипразола, палоносетрона, гранисетрона, цитарабина, NX1838, лейпролида, гозерелина, бузерелина, октреотида, тедуглутида, циленгитида, абареликса, энфувиртида, грелина, ингибиторов альфа-4 интегрина, антисмысловых нуклеиновых кислот, малых интерферирующих РНК, микро РНК, стероидов, аптамеров ДНК или РНК и пептидов и/или пептидомиметиков.
12. Композиция, содержащая конъюгат лекарственного средства по любому из п.п. 1-11.
13. Композиция по п. 12, которая представляет собой фармацевтическую композицию, возможно дополнительно содержащую фармацевтически приемлемый(е) носитель(и), или которая представляет собой диагностическую композицию, возможно дополнительно содержащую носитель(и), приемлемый(е) в диагностических композициях.
9.
14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, который содержится в конъюгате лекарственного средства, как он определен в любом из п.п. 1-11, или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белковый конъюгат, который содержит биологически активный белок, как он определен в любом из п.п. 6-8, и который содержит биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala).
15. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конъюгат лекарственного средства, как он определен в любом из п.п. 1-10, содержащая
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую транслируемую аминокислотную и/или лидерную последовательность;
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков пролина (Pro) и аланина (Ala);
(3) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую биологически активный белок или указанный полипептид, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую и/или терапевтическую активность; и
(4) последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой стоп-кодон трансляции.
16. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 15, где участки или сегменты молекулы нуклеиновой кислоты, как они определены в (2) и в (3), взаимозаменяемы в своих положениях в указанной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей конъюгат лекарственного средства.
17. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 15 или 16, которая возможно содержит сайт расщепления протеазой и/или сайт химического расщепления и/или сайт распознавания между участками или сегментами, как они
16.
определены в (1) и в (2), и/или между участками или сегментами, как они определены в (2) и (3).
18. Нуклеиновая кислота, кодирующая биосинтетический нерегулярный
спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий
аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из
аминокислотных остатков пролина и аланина, где указанная аминокислотная
последовательность состоит по меньшей мере из 50 аминокислотных остатков
пролина (Pro) и аланина (Ala), где указанная молекула нуклеиновой кислоты
содержит
(1) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую
транслируемую аминокислотную и/или лидерную последовательность;
(2) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный биосинтетический нерегулярный спиральный полипептид или полипептидный сегмент, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую исключительно из аминокислотных остатков пролина и аланина; и
(3) последовательность нуклеиновой кислоты, которая представляет собой стоп-кодон трансляции.
19. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 18, которая возможно содержит между (1) и (2) сайт расщепления протеазой и/или сайт химического расщепления и/или сайт распознавания.
20. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из п.п. 14-19.
21. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из п.п. 14-19 или вектор по п. 20.
22. Клетка-хозяин по п. 21, представляющая собой эукариотическую клетку-хозяина.
23. Клетка-хозяин по п. 22, где указанная эукариотическая клетка-хозяин представляет собой грибковую или животную клетку.
24. Способ получения нерегулярного спирального полипептида или нерегулярного спирального полипептидного сегмента, который содержится в конъюгате лекарственного средства по любому из п.п. 1-11, для получения конъюгата биологически активного белка, либо лекарственного средства, либо пищевого продукта, содержащего указанный нерегулярный спиральный полипептид или указанный нерегулярный спиральный полипептидный сегмент, и/или для получения полипептида, который содержит или представляет собой
19.
аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую активность, как определено в любом из п.п. 1-8, и который дополнительно содержит указанный нерегулярный спиральный полипептид или нерегулярный спиральный полипептидный сегмент,
включающий культивирование клетки по любому из п.п. 21-23 и выделение указанного нерегулярного спирального полипептида или биологически активного белка и/или указанного биологически активного белка или указанного полипептида из культуры или из указанной клетки.
25. Конъюгат лекарственного средства по любому из п.п. 1-11, композиция по п. 12 или 13, нуклеиновая кислота по любому из п.п. 14-19, вектор по п. 20, клетка по любому из п.п. 21-23 или биологически активный белок или полипептид, который содержит указанный нерегулярный спиральный полипептид или нерегулярный спиральный полипептидный сегмент и который получен способом по п. 24, для лечения расстройств, обусловленных гормональной недостаточностью, аутоиммунного заболевания, пролиферативных расстройств, рака, анемии, неоваскулярных заболеваний, инфекционных/воспалительных заболеваний, аллергических расстройств, тромбоза, инфаркта миокарда, рестеноза, диабета, бесплодия, болезни Гоше, хронического гепатита В, гепатита С, гипогликемии, акромегалии, дефицита аденозиндеаминазы, тромбоцитопении, гемофилии, анемии, ожирения, болезни Альцгеймера, липодистрофии, псориаза, метастатической меланомы, остеоартрита, дислипидемии, ревматоидного артрита, системной красной волчанки, рассеянного склероза, астмы, остеопороза и реперфузионного повреждения или других заболеваний почек.
26. Конъюгат лекарственного средства по любому из п.п. 1-11, композиция по п. 12 или 13, нуклеиновая кислота по любому из п.п. 14-19, вектор по п. 20 или клетка по любому из п.п. 21-23 для применения в качестве лекарственного средства, которое обладает повышенной стабильностью in vivo и/или in vitro указанного нерегулярного спирального полипептида или полипептидного сегмента, биологически активного белка или конъюгата лекарственного средства.
27. Применение нерегулярного спирального полипептида или нерегулярного спирального полипептидного сегмента, как они определены в любом из п.п. 1-5, или который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты или
25.
ее участками по любому из п.п. 14-19, в косметических средствах, в косметических обработках, в технологии пищевых добавок или пищевых продуктов или в бумажной промышленности.
28. Способ получения конъюгата, как он определен в любом из п.п. 1-11,
косметического средства, соединения для применения в косметических
обработках, пищевого продукта или напитка, или конъюгата, представляющего
интерес в промышленности,
включающий культивирование клетки по любому из п.п. 21-23 и выделение указанного нерегулярного спирального полипептида, указанного биологически активного белка и/или указанного биологически активного белка или указанного полипептида, который содержит или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет или опосредует биологическую активность или активность, представляющую интерес, и который дополнительно содержит указанный нерегулярный спиральный полипептид или нерегулярный спиральный полипептидный сегмент, из культуры или из указанной клетки.
29. Способ по п. 28, где указанный нерегулярный спиральный
полипептид, указанный биологически активный белок и/или указанный
биологически активный белок или указанный полипептид, который содержит
или представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет
или опосредует биологическую активность или активность, представляющую
интерес, и который дополнительно содержит указанный нерегулярный
спиральный полипептид или нерегулярный спиральный полипептидный
сегмент, выделяют из питательной среды или культуральной среды, клеточных
лизатов, клеточных мембранных фракций, периплазмы указанной клетки
(хозяина).
30. Способ по п. 28 или 29, где указанный нерегулярный спиральный полипептид связывают и/или подвергают сочетанию с молекулой, представляющей интерес.
31. Способ по п. 30, где указанное связывание или указанное сочетание представляет собой химическое связывание или сочетание.
30.
Биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды пролина/аланина и их применения
Фиг.1
gccGCTCCAGCTGCACCTGCTCCAGCAGCACCTGCTGCACCAGCTCCGGCTGCTCCTGCT
CGAGGTCGACGTGGACGAGGTCGTCGTGGACGACGTGGTCGAGGCCGACGAGGACGAcgg AlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAla
Фиг.2 А
Sapl Sapl I I
AAGAGCTTCAACCGCGGAGAGTGCTCTTCTGCCTGAAGAGCTTAAGCTT
TTCTCGAAGTTGGCGCCTCTCACGAGAAGACGGIACTTCTCGAATTCGAA
LysSerPheAsnArgGlyGluCysSerSerAlaEnd
Sapl Sapl
I I GAGTGCTCTTCTGCCGCTCCAGCTGCACCTGCTCCAGCAGCACCTGCTGCACCAGCTCCGGCTGCTCCTGCT|GCCTGAAGAGCTT
CTCACGAGAAGACGGCGAGGTCGACGTGGACGAGGTCGTCGTGGACGACGTGGTCGAGGCCGACGAGGACGACGGPlCTTCTCGAA GluCysSerSerAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAla
Биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
3 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
Фиг. 2 (продолжение) D
Sapl
GAAAAAGGCGCCAGCTCTTCTGCCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGC,
- +
- +
- +
- + -
CTTTTTCCGCGGTCGAGAAGACGG|ACACTAGACGGAGTTTGGGTGTCGGACCCATCG ,
GluLysGlyAlaSerSerSerAlaCysAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlySer,
+ 1
Sapl
- + -
- + -
- + -
- + -
- + -
- + -
- + -
GAAAAAGGCGCCAGCTCTTCTGCCGCTCCAGCTGCACCTGCTCCAGCAGCACCTGCTGCACCAGCTCCGGCTGCTCCTGCTGCCTGTGAT
+
CTTTTTCCGCGGTCGAGAAGACGGCGAGGTCGACGTGGACGAGGTCGTCGTGGACGACGTGGTCGAGGCCGACGAGGACGACGGACACTA. GluLysGlyAlaSerSerSerAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAlaCysAsp.
(1)
4 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
H/ndlll
5 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
Фиг.З А
о о см о о см
CM CO о о см.
CM CO о о
CM,
116.0 kDa 66.2 kDa
45.0 kDa
35.0 kDa
25.0 kDa 18.4 kDa 14.4 kDa
Восстановленные Невосстановленные
6 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
Фиг.4 А
Fab
Fab-PA#1(200) -г
8 10 12 14 16
Объем элюирования (мл)
8 10 12 14 16 18
Объем элюирования (мл)
10ОО г-1-1-1-I-1-1-1-I-1-1-1-I-1-1-1-г
7 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
8 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/аланина и их применения
. 5
-8x104 I 1 1 1 1 1
190 200 210 220 230 240 250
Длина волны (нм)
3x10 -
IFNa2b
PA#1(200)-IFNa2b
о 5
5 о
-3x10*
-6x10 -
-9x10*
190 200 210 220 230 Длина волны (нм)
240
250
о 5
5 о
С[ ГО CL
Длина волны (нм)
10 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
Фиг. 6 А
Nhel Sapl I I
GCCGCTAGCCATCACCACCATCACCATGGCGCCAGCTCTTCTGCCTTCCCAACC. CGGCGATCGGTAGTGGTGGTAGTGGTACCGCGGTCGAGAAGACGG|AAGGGTTGG,
AlaAlaSerHisHisHisHisHisHisGlyAlaSerSerSerAlaPheProThr,
+ 1
11 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
Фиг. 6 (продолжение) В
Nhel Sapl I I GCCGCTAGCCATCACCACCATCACCATGGCGCCAGCTCTTCTGCCGCTCCAGCTGCACCTGCTCCAGCAGCACCTGCTGCACCAGCTCCG
CGGCGATCGGTAGTGGTGGTAGTGGTACCGCGGTCGAGAAGACGGjCGAGGTCGACGTGGACGAGGTCGTCGTGGACGACGTGGTCGAGGC AlaAlaSerHisHisHisHisHisHisGlyAlaSerSerSerAlaAlaProAlaAlaProAlaProAlaAlaProAlaAlaProAlaPro
GCTGCTCCTGCTGCCTTCCCAACC...
CGACGAGGACGACGGAAGGGTTGG... AlaAlaProAlaAlaPheProThr...
(1)
12 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/аланина и их применения
Xba\ Nhe\
H/ndlll
НШ\\\
X CD
о о см
100 kDa 70 kDa
55 kDa 40 kDa
15 kDa-
35 kDa 25 kDa
14 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
Фиг. 7
Диаграмма Чоу-Фасмана, 60 аа:
ААРААРАРААРААРАРААРА|ААРААРАРААРААРАРААЁА]ААРААРАРААРААРАРААРА
спираль < >
р-слой (З-повороты
Всего остатков: Н: 59 Е: 0 Т: 0
процент: Н: 98.3 Е: 0.0 Т: 0.0
15 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
Время (ч)
Фиг.8
0.6
йГ 0.8 го
го ш о
го 5
CL О I
Fab-P1A1(200) Fab-P1A3(200)
0.2
10 12 14 16
Объем элюирования (мл)
17 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/аланина и их применения
Фиг.11
-6x104 I 1 1 1 i i
190 200 210 220 230 240 250 Длина волны (нм)
-8x104 I 1 1 1 i i
190 200 210 220 230 240 250 Длина волны (нм)
1 2
кДа
116.0 -
66.3 -
45.0 - 35.0 -
SUMO
25.0 - 16 4 -
14.4 -
1: SUMO-PA#1(200) до расщепления
2: SUMO-PA#1(200) после расщепления протеазой SUMO
0) 5 X Q)
|_ о
Q) 5 X Q)
|_ о
1 ,
l I
SUMO-PA#1(200)
(расщепленный)
1 1
1 • г-" * _ ¦ ¦ ¦
I I I I
15 20 25
I I I SUMO-PA#1(200) А
'1 Г
0.8
(расщепленный, М
0.6
связанный) I \ I
0.4
А 11 ¦¦'
0.2
¦- ¦*-..,,- , -Is > Ыу с*-^
1 1 1
А.
А.
Q) 5 X Q)
? О
|_ О
0.8 0.6 0.4 0.2 0
15 1-
10 15 20 Объем элюирования (мл)
Биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
1 1
0.8
•i ¦ 1
РА#1(200)
0.6
¦ ';
о Е
0.4
¦ ';
о п.
0.2
¦ 1
i i i i
225 494
5 t
0) S Z 0)
3 о
Е о п.
0.8 0.6 0.4 0.2 0
1 1
Флуоресцеин
J \ I L
J L
'280 ^225
М94
4 |8
12 16 20 24 28 32
О) S Z 0)
Е о п.
0.8 0.6 0.4 0.2 0
Флуоресцеин-РА#1(200)
t 10 15 20 25 и Объем элюирования (мл)
л225 ^494
21 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/ аланина и их применения
250 300 350 400 450 500 550 600
250 300 350 400 450 500 550 600
250 300 350 400 450 500 550 600
250 300 350 400 450 500 550 600
Длина волны (нм)
22 Биосинтетические нерегулярные
спиральные полипептиды пролина/аланина и их применения
100
16671.4
ч-Дигоксигенин-РА#1 (200)
10000
14000
16723.3 16739.8
18000
22000
26000
Масса
30000
Pro/Ala-полимер
(19)
109
112
112
124
124
125
125
128
128
129
129
<220>
<220>