[**]

Изобретение относится к способам, наборам и фармацевтическим композициям для лечения рака с использованием 3-(имидазо[1,2-b]пиридазин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-(трифторметил)фенил)бензамида.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к способам, наборам и фармацевтическим композициям для лечения рака с использованием 3-(имидазо[1,2-b]пиридазин-3-илэтинил)-4-метил-N-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-(трифторметил)фенил)бензамида.

---

(19)
Евразийское (21) 201290255 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.04.30
(22) Дата подачи заявки
2010.11.01
(51) Int. Cl.
A61K31/00 (2006.01) A61K31/55 (2006.01) A61K31/535 (2006.01)
(54) СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
(31) 61/261,014; 61/256,669; 61/256,690
(32) 2009.11.13; 2009.10.30; 2009.10.30
(33) US
(86) PCT/US2010/055016
(87) WO 2011/053938 2011.05.05
(71) Заявитель:
АРИАД ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.
(US)
(72) Изобретатель:
Хуан Вэй-шэн, Ривера Виктор М., Клаксон Тимоти П., Шекспир Уилльям К., Скуиллэйс Рэйчел М., Гозджит Джозеф М. (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение относится к способам, наборам и фармацевтическим композициям для лечения рака с использованием 3-(имидазо[1,2-Ъ]пиридазин-3-илэтинил)-4-ме-тил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-(трифторметил)фенил)бензамида.
2420-185318ЕА/031 СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
Предшествующий уровень техники
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям и терапевтическим способам на основе мультикиназного ингибитора, понатиниба ("соединение 1") для лечения нарушений, ассоциированных с патологической клеточной пролиферацией, таких как неоплазии, рак и состояния, ассоциированные с патологическим ангиогенезом.
Протеинкиназы представляют собой большое семейство белков, играющих центральная роль в регуляции широкого спектра клеточных процессов. Частичный неограничивающий список таких киназ включает abl, Akt, BCR-ABL, Blk, Brk, c-KIT, c-met, c-src, CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK8, CDK9, CDK10, cRafl, CSK, EGFR, ErbB2, ЕгЬВЗ, ErbB4, Erk, Pak, fes, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5, Fgr, FLT1, FLT3, Fps, Frk, Fyn, Hck, IGF-1R, INS-R, Jak, KDR, Lck, Lyn, MEK, p38, PDGFR, PIK, PKC, PYK2, ros, tie, tie2, TRK и Zap70. Аномальная протеинкиназная активность связана с различными нарушениями в диапазоне от неопасных для жизни заболеваний, таких как псориаз, до очень опасных заболеваний, таких как рак.
Разработаны и с существенным успехом терапевтически используются ингибиторы киназ. Однако не все из подвергаемых лечению пациентов отвечают на эти ингибиторы киназ, а некоторые становятся устойчивыми к лечению данным ингибитором вследствие возникновения мутации в киназе или вследствие действия других механизмов. Одобренные в настоящее время ингибиторы киназ могут вызывать проблематичные побочные эффекты, а некоторые пациенты являются или становятся непереносящими данный ингибитор. К сожалению, сохраняется неудовлетворенная медицинская
необходимость в новых и улучшенных лекарственных средствах.
Аномальная тирозинкиназа, например, BCR-ABL, является характерным признаком хронического миелолейкоза (CML) и острый лимфобластный лейкоз, положительный на филадельфийскую хромосому (Ph+ ALL) . У некоторых пациентов, подвергаемых лечению иматинибом, ингибитором тирозиназы ("TKI") BCR-ABL,
развивается устойчивость к иматинибу. Устойчивость к иматинибу связана с возникновением в BCR-ABL ряда мутаций. Существенный вклад внесли и ингибируют множество мутантных видов BCR-ABL ингибиторы BCR-ABL второго поколения, дазатиниб и нилотиниб, но они все еще неэффективны по меньшей мере против одного такого мутанта, мутанта T315I. В настоящее время не существует стандартного лечения для пациентов с CML или острым миелолейкозом с Ph+ после неблагоприятного исхода лечения TKI второго поколения. Важным является то, что не существует направленной терапии для пациентов, несущих мутацию T315I мутанта, устойчивого ко всем одобренным в настоящее время TKI.
Другие примеры тирозинкиназ, вовлеченных в инициацию и прогрессирование множества раковых заболеваний, включают FMS-подобную тирозинкиназу 3 (FLT3), рецепторы фактора роста фибробластов (FGFR), рецепторы фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и рецептор ангиопоэтина, TIE2.
Приблизительно у одной трети пациентов с острым миелобластным лейкозом (AML) выявлена конститутивная активация FLT3 вследствие внутренней тандемной дупликации (ITD).
Известно, что в некоторых солидных опухолях, включая рак эндометрия, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легких (NSCLC) и рак желудка, а также множественную миелому, активированы рецепторы фактора роста фибробластов (FGFR).
В различные виды рака, такие как глиобластома и колоректальный рак, а также в ряд других острых пролиферативных нарушений вовлечен неадекватный ангиогенез, опосредуемый VEGFR и другими киназами.
Ввиду большого количества протеинкиназ и ассоциированных с ними заболеваний, существует постоянная необходимость в новых ингибиторах или комбинациях ингибиторов, являющихся селективными для различных протеинкиназ и способных являться пригодными для лечения связанных с ними заболеваний, наряду с другими включающих ингибиторы ABL, способные ингибировать BCR-ABLT3151.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к эффективному, перорально
активному ингибитору, понатинибу ("соединение 1") и его фармацевтическим композициям и применениям. На основе биохимического тестирования, экспериментов на клетках, исследованиях на животных и результатов клинических исследований у человека на настоящий момент определился очень многообещающий набор фармакологических характеристик соединения 1.
Как более подробно описано ниже, соединение 1 представляет собой перорально активный ингибитор киназ с несколькими мишенями. Оно является наиболее эффективным ингибитором BCR-ABL, из описанных до настоящего времени, и первым общим ингибитором BCR-ABL, способным ингибировать все известные мутантные формы мишени, включая неподдающегося в настоящее время лечению мутанта T315I, приводящего к устойчивости к другим лекарственным средствам. В 1 фазе клинических испытаний продемонстрирован приемлемый уровень безопасности и значительная противолейкозная активность у пациентов с устойчивыми гематологическими видами рака (включая большинство пациентов с CML и Ph+ ALL), включая пациентов, у которых являются неэффективными дазатиниб и нилотиниб.
Фармакокинетические и фармакодинамические характеристики соединения 1, представляющие сумму характеристик видов его киназной ингибирующей активности, всасывания, распределения, метаболизма и выведения в организме, представляют собой характеристики перорально биологически доступного соединения, способного достигать концентраций, эффективных для
ингибирования киназы-мишени, а в случае BCR-ABL, для подавления разрастания клеток, экспрессирующих устойчивых мутантов. Приемлемый профиль безопасности в настоящее время отражает успешное достижение задач без чрезмерного непредусмотренного ингибирования киназной активности, необходимой для нормального функционирования.
Значимость этих селективности и профиля безопасности подчеркиваются сильной активностью соединения 1 в отношении ингибирования диапазона киназ кроме BCR-ABL и ее мутантов. Например, соединение 1 ингибировало FLT3, все 4 представителя
семейства рецепторов FGF, все 3 рецептора VEGF, рецептор ангиопоэтина TIE2, но являлось неактивным в отношении многих других классов киназ, включая рецептор инсулина, киназу Aurora и семейств циклин-зависимых киназ.
Таким образом, изобретение относится к фармацевтическим композициям и наборам, содержащим 3-(имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-(трифторметил)фенил)бензамид (соединение 1), изображенное ниже:
или его фармацевтически приемлемую соль, и к его терапевтическим применениям для лечения рака и других заболеваний.
Таким образом, один из аспектов изобретения относится к фармацевтической композиции, подходящей для перорального введения, содержащей соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль в количестве, эффективном для лечения неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения при введении индивидууму, и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов. Соединение 1 или его фармацевтически приемлемая соль может представлять собой, например, гидрохлоридную соль. В конкретных вариантах осуществления фармацевтическую композицию формулируют в единичной дозированной форме. В определенных вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать от 3 0 до 300 мг соединения 1. Иллюстративные единичные дозированные формы содержат от 5 до 100 мг, от 5 до 80 мг, от 5 до 50 мг, от 5 до 20 мг, от 7 до 100 мг, от 7 до 80 мг, от 7 до 50 мг, от 7 до 20 мг, от 10 до 100 мг, от 10 до 80 мг, от 10 до 50 мг, от 15 до 100 мг, от 15 до 80 мг, от 15 до 60 мг, от 15 мг до 50 мг, от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг,
соединение 1
от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 140 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В других вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать 2 0±4 мг, 2 5±5 мг, 3 0±б мг, 4 0±8 мг, 4 5±9 мг. Иллюстративные единичные дозированные формы включают единичные дозированные формы, содержащие 5±1 мг, 7±1,5 мг, 10 + 2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию формулируют в твердой единичной дозированной форме (например, таблетка, мягкая капсула или твердая капсула). В определенных вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать от 3 0 до 300 мг соединения 1. Иллюстративные единичные дозированные формы содержат от 5 до 100 мг, от 5 до 80 мг, от 5 до 50 мг, от 5 до 20 мг, от 7 до 100 мг, от 7 до 80 мг, от 7 до 50 мг, от 7 до 20 мг, от 10 до 100 мг, от 10 до 80 мг, от 10 до 50 мг, от 15 до 100 мг, от 15 до 80 мг, от 15 до 60 мг, от 15 мг до 50 мг, от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 140 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В других вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать 5±1 мг, 7±1,5 мг, 10 + 2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 2 5±5 мг, 3 0±б мг, 4 0±8 мг, 4 5±9 мг. Иллюстративные
единичные дозированные формы включают единичные дозированные формы, содержащие 5±1 мг, 1 + 1,5 мг, 10 + 2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±б мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, б0±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±1б мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±3б мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 2б0±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения у нуждающегося в этом индивидуума посредством перорального введения указанному индивидууму от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. Иллюстративные единичные дозированные формы содержат от 5 до 100 мг, от 5 до 80 мг, от 5 до 50 мг, от 5 до 20 мг, от 7 до 100 мг, от 7 до 80 мг, от 7 до 50 мг, от 7 до 20 мг, от 10 до 100 мг, от 10 до 80 мг, от 10 до 50 мг, от 15 до 100 мг, от 15 до 80 мг, от 15 до 60 мг, от 15 мг до 50 мг, от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 140 до 300 мг или от 100 до 200 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В других вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать 5±1 мг, 7±1,5 мг, 10±2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг. Иллюстративные единичные дозированные формы включают единичные дозированные формы, содержащие 5±1 мг, 7±1,5 мг, 10±2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления индивидууму перорально в единичной дозированной форме вводят среднюю суточную дозу от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли (например, среднюю
суточную дозу от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли; или среднюю суточную дозу 2 0±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли). Соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить индивидууму чаще, чем одни сутки в неделю, или в среднем от 4 до 7 раз за каждый период 7 суток (например, 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, б раз в неделю или 7 раз в неделю) . В определенных вариантах осуществления соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят индивидууму ежедневно. В конкретных вариантах осуществления индивидуум страдает хроническим миелогенным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом, острым миелогенным лейкозом, миелодиспластическим синдромом, раком желудка, раком эндометрия, раком мочевого пузыря, множественной миеломой, раком молочной железы, раком предстательной железы, раком легких, колоректальным раком, раком почки или глиобластомой. В других вариантах осуществления индивидуум находится в состоянии устойчивости к лечению иматинибом, нилотинибом или дазатинибом. В дополнительных вариантах осуществления индивидуум находится в состоянии непереносимости лечения иматинибом, нилотинибом или дазатинибом. В других вариантах осуществления индивидуум находится в положительном по филадельфийской хромосоме состоянии. В других вариантах осуществления, у индивидуума присутствует солидный вид рака, устойчивый к лечению ингибитором или антагонистом VEGF или VEGF-R (например, бевацизумабом, сорафенибом или сунитинибом). В дополнительных вариантах осуществления индивидуум находится в состоянии
непереносимости лечения ингибитором или антагонистом VEGF или VEGF-R (например, бевацизумабом, сорафенибом или сунитинибом). В некоторых вариантах осуществления у индивидуума присутствует рак, экспрессирующий мутантную BCR-ABL (например, BCR-ABLT3151, BCR-ABL или BCR-ABL ) . В других вариантах осуществления у индивидуума присутствует рак, экспрессирующий мутанты FLT3, KIT, FGFR1 или PDGFRa (например, FLT3-ITD, c-KIT, FGFR10P2-FGFR1 или FlPlLl-PDGFRa). В дополнительном варианте осуществления соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят совместно или одновременно с ингибитором mTOR, каждый в таком количестве, что совместное количество эффективно для лечения указанной неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения. В некоторых вариантах осуществления ингибитор mTOR выбран из сиролимуса, эверолимус, темсиролимус, ридафоролимус, биолимус, зотаролимус, LY294002, Рр242, WYE-354, Ки-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, вортманнин, кверцетин, мирицентин и стауроспорин и их фармацевтически приемлемых солей.
В дополнительном аспекте изобретение относится к набору, содержащему (i) фармацевтическую композицию, подходящую для перорального введения соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, эффективном для лечения неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения при введении индивидууму, и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов; и (ii) инструкцию для введения фармацевтической композиции индивидууму для лечения неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает хроническим миелогенным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом, острым миелогенным лейкозом, миелодиспластическим синдромом, раком желудка, раком эндометрия, раком мочевого пузыря, множественной миеломой, раком молочной железы, раком предстательной железы, раком легких, колоректальным раком, раком почки или глиобластомой.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения у нуждающегося в этом индивидуума посредством перорального
введения указанному индивидууму от 5 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. Иллюстративные единичные дозированные формы содержат от 5 до 100 мг, от 5 до 8 0 мг, от 5 до 50 мг, от 5 до 20 мг, от 7 до 100 мг, от 7 до 80 мг, от 7 до 50 мг, от 7 до 20 мг, от 10 до 100 мг, от 10 до 80 мг, от 10 до
мг,
от 15 до 100 мг, от 15 до 80 мг, от 15 до
60 мг, от
50 мг, от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от
20 до 50
мг,
до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг,
от 50 до
100
мг,
60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80
мг, от 35
мг,
от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80
мг, от 50
300
, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг,
2 00 мг, от 7 0 до 2 00 мг, от 100 до 300 мг,
от 120 до
300
мг,
14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или
его
фармацевтически приемлемой соли. В других вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать 5±1 мг, 7±1,5 мг, 10±2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления индивидууму перорально в единичной дозированной форме вводят среднюю суточную дозу от 5 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли (например, среднюю суточную дозу от 5 до 100 мг, от 5 до 8 0 мг, от 5 до 50 мг, от 5 до 20 мг, от 7 мг до 100 мг, от 7 мг до 80 мг, от 7 до 50 мг, от 7 до 20 мг, от 10 мг до 100 мг, от 10 мг до 80 мг, от 10 до 50 мг, от 15 мг до 100 мг, от 15 мг до 80 мг, от 15 до 60 мг, от 15 мг до 50 мг, от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 140 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли; или среднюю суточную дозу 5±1 мг, 7±1,5 мг, 10 + 2 мг, 15±3 мг,
20±4 мг, 25±5 мг, 30±б мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, б0±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±1б мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±3б мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 2б0±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли). В дополнительных аспектах способ включает ингибирование пролиферации раковых клеток у индивидуума посредством введения индивидууму соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, с частотой дозирования и в течение периода времени, обеспечивающих среднюю минимальную стационарную концентрацию соединения 1 от 4 0 до 60 0 нМ; ингибирование ангиогенеза у индивидуума посредством введения индивидууму соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, с частотой дозирования и в течение периода времени, обеспечивающих среднюю минимальную стационарную концентрацию соединения 1 от 40 до 600 нМ; ингибирование ангиогенеза у нуждающегося в этом индивидуума посредством ежедневного перорального введения индивидууму от 30 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли; ингибирование пролиферации экспрессирующих BCR-ABL клеток у индивидуума посредством введения индивидууму соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, с частотой дозирования и в течение периода времени, обеспечивающих среднюю минимальную стационарную концентрацию соединения 1 от 4 0 до 60 0 нМ; ингибирование пролиферации экспрессирующих BCR-ABL клеток при подавлении возникновения устойчивых субклонов посредством приведения клеток в контакт с соединением 1 или его фармацевтически приемлемой солью в количестве, достаточном для подавления возникновения устойчивых субклонов; ингибирование пролиферации экспрессирующих BCR-ABL клеток при подавлении возникновения сочетанных мутантов, где способ включает приведение клеток в контакт с соединением 1 или его фармацевтически приемлемой солью в количестве, достаточном для подавления возникновения сочетанных мутантов; ингибирование пролиферации клеток, экспрессирующих BCR-ABL или ее мутантные формы, у нуждающегося в этом индивидуума посредством ежедневного перорального введения индивидууму от 3 0 до 300 мг
соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли; или ингибирование пролиферации клеток, экспрессирующих мутантные формы, у нуждающегося в этом индивидуума посредством ежедневного перорального введения указанному индивидууму от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли.
В любом из аспектов, описываемых в настоящем документе, количество соединения 1 в единичной дозированной форме и в средней суточной дозе можно изменять со снижением дозы (например, снижение дозы для ребенка). В некоторых вариантах осуществления единица дозирования содержит от 5 до 300 мг или средняя суточная доза составляет от 5 до 300 мг. В определенных вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать от 5 до 100 мг, от 5 до 80 мг, от 5 до 50 мг, от 5 до 20 мг, от 7 до 100 мг, от 7 до 80 мг, от 7 до 50 мг, от 7 до 20 мг, от 10 до 100 мг, от 10 до 80 мг, от 10 до 50 мг, от 15 до 100 мг, от 15 до 80 мг, от 15 до 60 мг, от 15 мг до 50 мг, от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 140 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. Иллюстративные единичные дозированные формы включают единичные дозированные формы, содержащие 5±1 мг, 7±1,5 мг, 10 + 2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 2 60±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли.
В одном из аспектов изобретение относится к фармацевтической композиции, сформулированной для перорального введения в единичной дозированной форме, содержащей от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В определенных вариантах осуществления единичная дозированная
форма может содержать от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать 2 0±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. Соединение 1 или его фармацевтически приемлемая соль могут представлять собой, например, гидрохлоридную соль.
В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования пролиферации раковых клеток у индивидуума посредством введения индивидууму соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, с частотой дозирования и в течение периода времени, обеспечивающих среднюю минимальную стационарную концентрацию соединения 1 от 4 0 до 60 0 нМ. В определенных вариантах осуществления средняя минимальная стационарная концентрация соединения 1 составляет от 40 до 200 нМ, от 50 до 200 нМ, от 60 до 200 нМ, от 70 до 200 нМ, от 80 до 200 нМ, от 90 до 200 нМ, от 40 до 120 нМ, от 50 до 120 нМ, от 60 до 120 нМ, от 70 до 120 нМ, от 80 до 120 нМ, от 200 до 600 нМ, от 220 до 600 нМ, от 240 до 600 нМ, от 250 до 600 нМ, от 270 до 600 нМ, от 280 до 600 нМ, от 200 до 400 нМ, от 200 до 300 нМ, от 250 до 400 нМ, от 300 до 500 нМ, от 350 до 550 нМ, от 400 до 600 нМ или от 450 до 600 нМ. Соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить индивидууму в среднем от 4 до 7 раз за каждый период 7 суток (например, 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, б раз в неделю или 7 раз в неделю). В определенных вариантах осуществления соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят индивидууму
ежедневно. В конкретных вариантах осуществления индивидууму перорально в единичной дозированной форме вводят среднюю суточную дозу от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли (например, среднюю суточную дозу от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли; или среднюю суточную дозу 2 0±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли). В конкретных вариантах осуществления индивидуум страдает раком желудка, раком эндометрия, раком мочевого пузыря, множественной миеломой, раком молочной железы или любым другим видом рака, описываемым в настоящем документе. В других вариантах осуществления индивидуум страдает хроническим миелогенным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом или острым миелогенным лейкозом. В других вариантах осуществления индивидуум страдает миелодиспластическим синдромом (например, рефракторной анемией с избытком бластов группы 1 (RAEBI) или рефракторной анемией с избытком бластов группы 2 (RAEBII)).
В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования пролиферации раковых клеток у нуждающегося в этом индивидуума посредством ежедневного перорального введения индивидууму от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В определенных вариантах осуществления индивидууму каждые сутки перорально вводят от 2 0 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до
80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 140 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления индивидууму каждые сутки перорально вводят 2 0±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления индивидуум страдает раком желудка, раком эндометрия, раком мочевого пузыря, множественной миеломой, раком молочной железы или любым другим видом рака, описываемым в настоящем документе. В других вариантах осуществления индивидуум страдает хроническим миелогенным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом или острым миелогенным лейкозом. В других вариантах осуществления индивидуум страдает миелодиспластическим синдромом (например, рефракторной анемией с избытком бластов группы 1 (RAEBI) или рефракторной анемией с избытком бластов группы 2 (RAEBII)).
В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования ангиогенеза у индивидуума посредством введения индивидууму соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, с частотой дозирования и в течение периода времени, обеспечивающих среднюю минимальную стационарную концентрацию соединения 1 от 4 0 до 60 0 нМ. В определенных вариантах осуществления средняя минимальная стационарная концентрация соединения 1 составляет от 40 до 200 нМ, от 50 до 200 нМ, от 60 до 200 нМ, от 70 до 200 нМ, от 80 до 200 нМ, от 90 до 200 нМ, от 40 до 120 нМ, от 50 до 120 нМ, от 60 до 120 нМ, от 70 до 120 нМ, от 80 до 120 нМ, от 200 до 600 нМ, от 220 до 600 нМ, от 240 до 600 нМ, от 250 до 600 нМ, от 270 до 600 нМ, от 280 до 600 нМ, от 200 до 400 нМ, от 200 до 300 нМ, от 250 до 400 нМ, от 300 до 500 нМ, от 350 до 550 нМ, от 400 до 60 0 нМ или от 4 50 до 60 0 нМ. Соединение 1 или его
фармацевтически приемлемую соль можно вводить индивидууму в среднем от 4 до 7 раз за каждый период 7 суток (например, 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, б раз в неделю или 7 раз в неделю). В определенных вариантах осуществления соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят индивидууму ежедневно. В конкретных вариантах осуществления индивидууму перорально в единичной дозированной форме вводят среднюю суточную дозу от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли (например, среднюю суточную дозу от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли; или среднюю суточную дозу 2 0±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли). В конкретных вариантах осуществления индивидуум страдает раком предстательной железы, раком легких, раком молочной железы, колоректальным раком, раком почки или глиобластомой. В других вариантах осуществления у индивидуума присутствует солидный вид рака, устойчивый к лечению ингибитором или антагонистом VEGF или VEGF-R (например, бевацизумабом, сорафенибом или сунитинибом). В других вариантах осуществления у индивидуума присутствует солидный вид рака, который неприемлемо лечить ингибитором или антагонистом VEGF или VEGF-R (например, бевацизумабом, сорафенибом или сунитинибом). В определенных вариантах осуществления индивидуум находится в состоянии, ассоциированном с аберрантным ангиогенезом, таким как диабетическая ретинопатия, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, хроническое воспаление, ожирение, дегенерация желтого пятна или сердечно-сосудистое
заболевание.
В другом аспекте изобретение также относится к способу ингибирования ангиогенеза у нуждающегося в этом индивидуума посредством ежедневного перорального введения индивидууму от 30 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В определенных вариантах осуществления индивидууму каждые сутки перорально вводят от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления индивидууму каждые сутки перорально вводят 2 0±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления индивидуум страдает раком предстательной железы, раком легких, раком молочной железы, колоректальным раком, раком почки или глиобластомой. В других вариантах осуществления у индивидуума присутствует солидный вид рака, устойчивый к лечению ингибитором или антагонистом VEGF или VEGF-R (например, бевацизумабом, сорафенибом или сунитинибом). В других вариантах осуществления у индивидуума присутствует солидный вид рака, который неприемлемо лечить ингибитором или антагонистом VEGF или VEGF-R (например, бевацизумабом, сорафенибом или сунитинибом). В определенных вариантах осуществления индивидуум находится в состоянии, ассоциированном с аберрантным ангиогенезом, таким как диабетическая ретинопатия, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, хроническое воспаление, ожирение, дегенерация желтого пятна или сердечно-сосудистое заболевание.
В другом аспекте изобретение относится к набору,
содержащему (i) фармацевтическую композицию, формулируемую для перорального введения в единичной дозированной форме, содержащей от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли, и (ii) инструкцию для введения фармацевтической композиции индивидууму для лечения рака или для лечения состояния, ассоциированного с аберрантным ангиогенезом. В определенных вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать от 2 0 до 100 мг, от 2 0 до 8 0 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 12 0 до 300 мг, от 14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать 20±4 мг, 25±5 мг, 30±б мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления индивидуум страдает раком желудка, раком эндометрия, раком мочевого пузыря, множественной миеломой, раком молочной железы, хроническим миелогенным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом, острым миелогенным лейкозом, миелодиспластическим синдромом (например, рефракторной анемией с избытком бластов группы 1 (RAEBI) или рефракторной анемией с избытком бластов группы 2 (RAEBII)) или любым другим видом рака, описываемым в настоящем документе. В определенных вариантах осуществления индивидуум страдает диабетической ретинопатией, ревматоидным артритом, псориазом, атеросклерозом, хроническим воспалением, ожирением, дегенерацией желтого пятна или сердечно-сосудистым заболеванием.
В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования пролиферации экспрессирующих BCR-ABL клеток у индивидуума посредством введения индивидууму соединения 1 или
его фармацевтически приемлемой соли в количестве, с частотой дозирования и в течение периода времени, обеспечивающих среднюю минимальную стационарную концентрацию соединения 1 от 4 0 до 60 0 нМ. В определенных вариантах осуществления средняя минимальная стационарная концентрация соединения 1 составляет от 40 до 200 нМ, от 50 до 200 нМ, от 60 до 200 нМ, от 70 до 200 нМ, от 80 до 200 нМ, от 90 до 200 нМ, от 40 до 120 нМ, от 50 до 120 нМ, от 60 до 120 нМ, от 70 до 120 нМ, от 80 до 120 нМ, от 200 до 600 нМ, от 220 до 600 нМ, от 240 до 600 нМ, от 250 до 600 нМ, от 270 до 600 нМ, от 280 до 600 нМ, от 200 до 400 нМ, от 200 до 300 нМ, от 250 до 400 нМ, от 300 до 500 нМ, от 350 до 550 нМ, от 400 до 600 нМ или от 450 до 600 нМ. Соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить в количестве, достаточном для подавления возникновения устойчивых субклонов или вводить в количестве, достаточном для подавления возникновения сочетанных мутантов. Соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить индивидууму в среднем от 4 до 7 раз за каждый период 7 суток (например, 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, б раз в неделю или 7 раз в неделю) и в течение периода, включающего 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 4 месяца, 8 месяца, 1 год или 18 месяцев непрерывного лечения. В определенных вариантах осуществления соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят индивидууму ежедневно. В конкретных вариантах осуществления индивидууму перорально в единичной дозированной форме вводят среднюю суточную дозу от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли (например, среднюю суточную дозу от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли; или среднюю суточную дозу 2 0±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг,
65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±1б мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±3б мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 2б0±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли). В конкретных вариантах осуществления индивидуум находится в состоянии, выбранном из хронического миелогенного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза или острого миелогенного лейкоза. В других вариантах осуществления состояние устойчиво к лечению ингибитором киназ, отличным от соединения 1 (например, состояние устойчиво к лечению иматинибом, нилотинибом или дазатинибом) . В других вариантах осуществления у индивидуума присутствует солидный вид рака, который неприемлемо лечить ингибитором или антагонистом VEGF или VEGF-R (например, бевацизумабом, сорафенибом или сунитинибом).
В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования пролиферации экспрессирующих BCR-ABL клеток при подавлении возникновения устойчивых субклонов посредством приведения клеток в контакт с соединением 1 или его фармацевтически приемлемой солью в количестве, достаточном для подавления возникновения устойчивых субклонов. Клетки можно приводить в контакт с соединением 1 или его фармацевтически приемлемой солью в количестве от 20 до 320 нМ, от 30 до 320 нМ, от 20 до 220 нМ, от 30 до 220 нМ, от 20 до 120 нМ, от 30 до 120 нМ, от 40 до 320 нМ, от 40 до 220 нМ, от 40 до 120 нМ, от 50 до 320 нМ, от 50 до 220 нМ, от 50 до 120 нМ, от 70 до 320 нМ, от 70 до 220 нМ, от 90 до 320 нМ, от 90 до 220 нМ, от 110 до 320 нМ или от 110 до 22 0 нМ. Клетки можно приводить в контакт с соединением 1 или его фармацевтически приемлемой солью в течение периода, включающего 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 4 месяца, 8 месяца, 1 год или 18 месяцев непрерывного воздействия.
В другом аспекте изобретение дополнительно относится к способу ингибирования пролиферации экспрессирующих BCR-ABL клеток при подавлении возникновения сочетанных мутантов, где способ включает приведение клеток в контакт с соединением 1 или его фармацевтически приемлемой солью в количестве, достаточном
для подавления возникновения сочетанных мутантов. Клетки можно приводить в контакт с соединением 1 или его фармацевтически приемлемой солью в количестве от 160 нМ до 1 мкМ, от 2 60 нМ до 1 мкМ, от 360 нМ до 1 мкМ, от 160 нМ до 800 мкМ, от 260 до 800 нМ, от 360 до 800 нМ, от 160 до 600 нМ, от 260 до 600 нМ, от 360 до 600 нМ, от 160 до 400 нМ, от 260 до 400 нМ, от 360 до 50 0 нМ или 4 60 до 60 0 нМ. Клетки можно приводить в контакт с соединением 1 или его фармацевтически приемлемой солью в течение периода, включающего 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 4 месяца, 8 месяца, 1 год или 18 месяцев непрерывного воздействия.
В любом из указанных выше способов клетки могут являться устойчивыми к лечению ингибитором киназ, отличным от соединения 1 (например, устойчивыми к лечению иматинибом, нилотинибом или дазатинибом). В любом из указанных выше способов обработка клеток ингибитором или антагонистом VEGF или VEGF-R (например, бевацизумабом, сорафенибом или сунитинибом) может являться неприемлемой.
В другом аспекте изобретение также относится к способу ингибирования пролиферации клеток, экспрессирующих BCR-ABL или ее мутантные формы, у нуждающегося в этом индивидуума посредством ежедневного перорального введения индивидууму от 30 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В определенных вариантах осуществления индивидууму каждые сутки перорально вводят от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления индивидууму каждые сутки перорально вводят 2 0±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44
мг, 240±48 мг или 2б0±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. Соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить в количестве, достаточном для подавления возникновения устойчивых субклонов или вводить в количестве, достаточном для подавления возникновения сочетанных мутантов. В конкретных вариантах осуществления индивидуум находится в состоянии, выбранном из хронического миелогенного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза или острого миелогенного лейкоза. В других вариантах осуществления состояние устойчиво к лечению ингибитором киназ, отличным от соединения 1 (например, состояние устойчиво к лечению иматинибом, нилотинибом или дазатинибом). В других вариантах осуществления состояние неприемлемо лечить ингибитором киназ, отличным от соединения 1 (например, состояние неприемлемо лечить иматинибом, нилотинибом или дазатинибом). Соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить индивидууму в среднем от 4 до 7 раз за каждый период 7 суток (например, 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, б раз в неделю или 7 раз в неделю) и в течение периода включающего 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 4 месяца, 8 месяца, 1 год или 18 месяцев непрерывного лечения. В определенных вариантах осуществления соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят индивидууму ежедневно.
В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему (i) фармацевтическую композицию, формулируемую для перорального введения в единичной дозированной форме, содержащей от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли, и (ii) инструкцию для введения фармацевтической композиции индивидууму, страдающему
состоянием, ассоциированным с пролиферацией экспрессирующих BCR-ABL клеток. В определенных вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать от 2 0 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от
70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 140 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать 20±4 мг, 25±5 мг, 30±б мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. Соединение 1 или его фармацевтически приемлемая соль могут представлять собой, например, гидрохлоридную соль. В конкретных вариантах осуществления индивидуум находится в состоянии, выбранном из хронического миелогенного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза или острого миелогенного лейкоза. В других вариантах осуществления состояние устойчиво к лечению ингибитором киназ, отличным от соединения 1 (например, состояние устойчиво к лечению иматинибом, нилотинибом или дазатинибом). В других вариантах осуществления состояние неприемлемо лечить ингибитором киназ, отличным от соединения 1 (например, состояние неприемлемо лечить иматинибом, нилотинибом или дазатинибом).
В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования пролиферации клеток, экспрессирующих мутантные формы, у нуждающегося в этом индивидуума посредством ежедневного перорального введения указанному индивидууму от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В определенных вариантах осуществления индивидууму каждые сутки перорально вводят от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 14 0 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления индивидууму каждые сутки перорально вводят 2 0±4
мг, 25±5 мг, 30±б мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, б0±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±1б мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±3б мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 2б0±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В определенных вариантах осуществления мутант представляет собой мутантный FLT3 (например, FLT3-ITD), мутантный KIT (например, c-KIT или N822K), мутантный FGFR (например, FGFR10P2-FGFR1), мутантный PDGFRa (например, FlPlLl-PDGFRa) или любой мутант, описываемый в настоящем документе. В других вариантах осуществления индивидуум страдает острым миелогенным лейкозом или миелодиспластическим синдромом (например, рефракторной анемией с избытком бластов группы 1 (RAEBI) или рефракторной анемией с избытком бластов группы 2 (RAEBII)). В других вариантах осуществления состояние устойчиво к лечению ингибитором киназ, отличным от соединения 1 (например, состояние устойчиво к лечению иматинибом, нилотинибом или дазатинибом). В других вариантах осуществления состояние неприемлемо лечить ингибитором киназ, отличным от соединения 1 (например, состояние неприемлемо лечить иматинибом, нилотинибом или дазатинибом). Соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить индивидууму в среднем от 4 до 7 раз за каждый период 7 суток (например, 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, б раз в неделю или 7 раз в неделю) и в течение периода, включающего 2 недели, 1 месяц, 2 месяца, 4 месяца, 8 месяца, 1 год или 18 месяцев непрерывного лечения. В определенных вариантах осуществления соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят индивидууму ежедневно.
В одном из аспектов изобретение относится к способу лечения рака у нуждающегося в этом индивидуума посредством введения индивидууму соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли совместно или одновременно с ингибитором mTOR, каждый в таком количестве, что совместное количество эффективно для лечения рака. В другом аспекте изобретение также относится к способу лечения неоплазии у нуждающегося в этом индивидуума посредством введения индивидууму соединения 1 или его
фармацевтически приемлемой соли совместно или одновременно с ингибитором mTOR, каждый в таком количестве, что совместное количество эффективно для лечения неоплазии. В другом аспекте изобретение дополнительно относится к способу ингибирования ангиогенеза у нуждающегося в этом индивидуума посредством введения индивидууму соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли совместно или одновременно с ингибитором mTOR, каждый в таком количестве, что совместное количество эффективно для ингибирования ангиогенеза. В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования пролиферации клеток посредством приведения клеток в контакт с соединением 1 или его фармацевтически приемлемой солью, совместно или одновременно с ингибитором mTOR, каждый в таком количестве, что совместное количество достаточно для ингибирования пролиферации.
В любом из указанных выше аспектов ингибитор mTOR представляет собой макролид рапамицин, выбранный из сиролимуса, эверолимуса, темсиролимуса, ридафоролимуса, биолимуса, зотаролимуса и их фармацевтически приемлемых солей. Желательно, чтобы ингибитор mTOR представлял собой ридафоролимус или его фармацевтически приемлемую соль. В других вариантах осуществления ингибитор mTOR представляет собой не являющееся аналогом рапамицина соединение, выбранное из LY294002, Рр242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, вортманнина, кверцетина, мирицентина, стауроспорина и их фармацевтически приемлемых солей.
Комбинированная терапия может включать схему лечения, в которой соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор mTOR вводят одновременно в пределах 12 суток, 8 суток, 5 суток, 4 суток, 3 суток, или 2 суток друг от друга; соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор mTOR вводят одновременно в пределах 24 часов друг от друга; или соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль и ингибитор mTOR вводят совместно. Соединение 1 и ингибитор mTOR можно вводить в качестве комбинированной терапии по изобретению с использованием любой схемы лечения, описываемой в настоящем документе.
В определенных вариантах осуществления соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в низкой дозе; ингибитор mTOR вводят в низкой дозе; или и соединение 1, и ингибитор mTOR вводят в низкой дозе.
В конкретных вариантах осуществления комбинированная терапия включает введение индивидууму соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, с частотой дозирования и в течение периода времени, обеспечивающих среднюю минимальную стационарную концентрацию соединения 1 от 4 0 до 60 0 нМ. Например, средняя минимальная стационарная концентрация соединения 1 может составлять от 10 до 100 нМ, от 10 до 60 нМ, от 15 до 100 нМ, от 15 до 70 нМ, от 20 до 100 нМ, от 40 до 200 нМ, от 50 до 200 нМ, от 60 до 200 нМ, от 70 до 200 нМ, от 80 до 200 нМ, от 90 до 200 нМ, от 40 до 120 нМ, от 50 до 120 нМ, от 60 до 120 нМ, от 70 до 120 нМ, от 80 до 120 нМ, от 200 до 600 нМ, от 220 до 600 нМ, от 240 до 600 нМ, от 250 до 600 нМ, от 270 до 600 нМ, от 280 до 600 нМ, от 200 до 400 нМ, от 200 до 300 нМ, от 250 до 400 нМ, от 300 до 500 нМ, от 350 до 550 нМ, от 400 до 600 нМ или от 450 до 600 нМ. Соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить индивидууму в среднем от 4 до 7 раз за каждый период 7 суток (например, 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, б раз в неделю или 7 раз в неделю). В определенных вариантах осуществления соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят индивидууму ежедневно. В конкретных вариантах осуществления индивидууму перорально в единичной дозированной форме вводят среднюю суточную дозу от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли (например, среднюю суточную дозу от 10 до 70 мг, от 10 до 50 мг, от 10 до 30 мг, от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 140 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически
приемлемой соли; или среднюю суточную дозу 1+1,5 мг, 10+2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 260±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли).
Комбинированная терапия по изобретению можно использовать для лечения индивидуума с карциномой мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почки, печени, легких, головы и шеи, желчного пузыря, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы, предстательной железы или кожи; плоскоклеточной карциномой; раком эндометрия; множественной миеломой; гемопоэтической опухолью лимфоидного происхождения (например, лейкозом, острым лимфоцитарным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом, В-клеточной лимфомой, Т-клеточной лимфомой, лимфомой Ходжкина, неходжкинской лимфомой, волосатоклеточной лимфомой или лимфомой Беркитта); гемопоэтическим раком миелогенного происхождения (например, острым миелогенным лейкозом, хроническим миелогенным лейкозом, множественным миелогенным лейкозом, миелодиспластическим синдромом или промиелоцитарным лейкозом); опухолью мезенхимального происхождения (например, фибросаркомой или рабдомиосаркомой); опухолью центральной или периферической нервной системы (например, астроцитомой, нейробластомой, глиомой или шванномой); меланомой; семиномой; тератокарциномой; остеосаркомой или саркомой Капоши. В определенных вариантах осуществления индивидуум страдает немелкоклеточным раком легких, раком молочной железы, раком яичников, раком мочевого пузыря, раком предстательной железы, раком слюнной железы, раком поджелудочной железы, раком эндометрия, колоректальным раком, раком почки, раком головы и шеи, раком желудка, множественной миеломой, фолликулярным раком щитовидной железы или мультиформной глиобластомой.
Комбинированная терапия по изобретению можно использовать для лечения индивидуума с состоянием, ассоциированным с аберрантным ангиогенезом. Состояние, ассоциированное с
аберрантным ангиогенезом, может представлять собой солидную опухоль (например, рак предстательной железы, рак легких, рак молочной железы, колоректальный рак, рак почки, глиобластому или любую солидную опухоль, описываемую в настоящем документе), диабетическую ретинопатию, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, хроническое воспаление, ожирение, дегенерацию желтого пятна или сердечно-сосудистое заболевание.
В родственном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль, ингибитор mTOR и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В определенных вариантах осуществления ингибитор mTOR представляет собой макролид рапамицин, выбранный из сиролимуса, эверолимуса, темсиролимуса, ридафоролимуса, биолимуса, зотаролимуса и их фармацевтически приемлемых солей. Желательно, чтобы ингибитор mTOR представлял собой ридафоролимус или его фармацевтически приемлемую соль. В других вариантах осуществления ингибитор mTOR представляет собой не являющееся аналогом рапамицина соединение, выбранное из LY294002, Рр242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, вортманнина, кверцетина, мирицентина, стауроспорина и их фармацевтически приемлемых солей.
Изобретение дополнительно относится к набору, содержащему (i) первую фармацевтическую композицию, формулируемую для перорального введения в единичной дозированной форме, содержащей от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли, и (ii) вторую фармацевтическую композицию, содержащую ингибитор mTOR, где первую фармацевтическую композицию и вторую фармацевтическую композицию формулируют раздельно в количествах индивидуальных доз.
Изобретение также относится к набору, содержащему фармацевтическую композицию, формулируемую для перорального введения в единичной дозированной форме, содержащей от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитор mTOR.
В определенных вариантах осуществления указанных выше
наборов единичная дозированная форма может содержать от 10 до 70 мг, от 10 до 50 мг, от 10 до 30 мг, от 20 до 100 мг, от 20 до 80 мг, от 20 до 50 мг, от 30 до 100 мг, от 35 до 100 мг, от 40 до 100 мг, от 50 до 100 мг, от 60 до 100 мг, от 70 до 100 мг, от 30 до 80 мг, от 35 до 80 мг, от 40 до 80 мг, от 50 до 80 мг, от 60 до 80 мг, от 50 до 300 мг, от 60 до 300 мг, от 70 до 300 мг, от 50 до 200 мг, от 60 до 200 мг, от 70 до 200 мг, от 100 до 300 мг, от 120 до 300 мг, от 140 до 300 мг или от 100 до 2 00 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли. В конкретных вариантах осуществления единичная дозированная форма может содержать 7±1,5 мг, 10 + 2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 40±8 мг, 45±9 мг, 55±11 мг, 60±12 мг, 65±13 мг, 70±14 мг, 75±15 мг, 80±16 мг, 90±18 мг, 100±20 мг, 120±24 мг, 140±28 мг, 160±32 мг, 180±36 мг, 200±40 мг, 220±44 мг, 240±48 мг или 2 60±52 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли.
В определенных вариантах осуществления указанных выше наборов, ингибитор mTOR представляет собой макролид рапамицин, выбранный из сиролимуса, эверолимуса, темсиролимуса, ридафоролимуса, биолимуса, зотаролимуса и их фармацевтически приемлемых солей. В других вариантах осуществления указанных выше наборов, ингибитор mTOR представляет собой не являющееся аналогом рапамицина соединение, выбранное из LY294002, Рр242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, вортманнина, кверцетина, мирицентина, стауроспорина и их фармацевтически приемлемых солей.
Наборы по изобретению дополнительно могут включать инструкции для введения соединение 1 или его фармацевтически приемлемой соли и ингибитора mTOR индивидууму для лечения рака
(например, индивидууму с карциномой мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почки, печени, легкого, головы и шеи, желчного пузыря, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы, предстательной железы или кожи; плоскоклеточной карциномой; раком эндометрия; множественной миеломой; гемопоэтической опухолью лимфоидного происхождения
(например, лейкозом, острым лимфоцитарным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом, В-клеточной лимфомы, Т-клеточной
лимфомой, лимфомой Ходжкина, неходжкинской лимфомой, волосатоклеточной лимфомой или лимфомой Беркитта); гемопоэтической опухолью миелогенного происхождения (например, острым миелогенным лейкозом, хроническим миелогенным лейкозом, множественным миелогенным лейкозом, миелодиспластическим синдромом или промиелоцитарным лейкозом); опухолью мезенхимального происхождения (например, фибросаркомой или рабдомиосаркомой); опухолью центральной или периферической нервной системы (например, астроцитомой, нейробластомой, глиомой или шванномой); меланомой; семиномой; тератокарциномой; остеосаркомой или саркомой Капоши) или индивидууму с состоянием, ассоциированным с аберрантным ангиогенезом (например, солидной опухолью, диабетической ретинопатией, ревматоидным артритом, псориазом, атеросклерозом, хроническим воспалением, ожирением или дегенерацией желтого пятна).
В способах по настоящему изобретению дозу и частоту введения соединения 1 и ингибитора mTOR можно контролировать независимо. Например, одно соединение можно вводить каждые сутки перорально, тогда как второе соединение можно вводить раз в сутки внутривенно. Соединения также можно формулировать совместно так, что при одном введении происходит доставка обоих соединений.
Иллюстративная доза mTOR и соединения 1 для введения зависит от таких факторов, как тип и степень нарушения, общее состояние здоровья индивидуума, терапевтический индекс выбранного ингибитора mTOR и пути его введения. Для оптимизации дозы и частоты дозирования для любой конкретной комбинации по изобретению можно использовать стандартные клинические испытания.
Соединения, пригодные по настоящему изобретению, включают соединения, описываемые в настоящем документе, в любой из их фармацевтически приемлемых форм, включая изомеры, такие как диастереомеры и энантиомеры, смеси изомеров и их соли.
Определения
Как применяют в настоящем документе, термин "экспрессирующие BCR-ABL клетки" относится к клеткам,
экспрессирующим природную BCR-ABL, устойчивые субклоны или сочетанные мутанты BCR-ABL.
Как применяют в настоящем документе, термин "средняя минимальная концентрация в стандартном состоянии" относится к средней концентрации в плазме соединения 1, наблюдаемой в группе индивидуумов в качестве части режима дозирования для лечения по изобретению, проводимого в течение периода времени, достаточного для обеспечения фармакокинетики в стационарном состоянии (т.е. периода 23 суток ежедневного дозирования), где средняя минимальная концентрация представляет собой среднюю циркулирующую концентрацию у всех субъектов в момент времени, непосредственно перед (т.е. в пределах 1 часа) следующим запланированным введением в схеме лечения (например, в течение схема лечениям с ежедневным введением минимальную концентрацию измеряют приблизительно через 24 часа после введения соединения 1 и непосредственно перед следующим ежедневным введением).
Под "количеством, достаточным для подавления возникновения сочетанных мутантов" подразумевают количество соединения 1, которое измеримо снижает возникновение сочетанных мутантов in vitro или in vivo по сравнению со скоростью возникновения сочетанных мутантов, которая существует при минимальной концентрации соединения 1, необходимой для ингибирования пролиферации экспрессирующих BCR-ABL клеток.
Под "количеством, достаточным для подавления возникновения устойчивых субклонов" подразумевают количество соединения 1, которое измеримо снижает возникновение устойчивых субклонов in vitro или in vivo по сравнению со скоростью возникновения устойчивых субклонов, которая существует при минимальной концентрации соединения 1, необходимой для ингибирования пролиферации экспрессирующих BCR-ABL клеток.
Под "ингибированием пролиферации экспрессирующих BCR-ABL клеток" подразумевают измеримое замедление, остановку или обращение скорости роста экспрессирующих BCR-ABL клеток in vitro или in vivo. Желательно, чтобы замедление скорости роста составляло по меньшей мере 20%, 30%, 50% или даже 70%, как определяют с использованием подходящего анализа определения
скоростей роста клеток (например, анализа роста клеток, описываемого в настоящем документе).
Под "ингибированием пролиферации раковых клеток" подразумевают измеримое замедление, остановку или обращение скорости роста раковых клеток in vitro или in vivo. Желательно, чтобы замедление скорости роста составляло по меньшей мере 2 0%, 30%, 50% или даже 70%, как определяют с использованием подходящего анализа определения скоростей роста клеток (например, анализа роста клеток, описываемого в настоящем документе).
Под "ингибированием пролиферации клеток" подразумевают измеримое замедление, остановку или обращение скорости роста клеток in vitro или in vivo. Желательно, чтобы замедление скорости роста составляло меньшей мере 20%, 30%, 50% или даже 7 0%, как определяют с использованием подходящего анализа определения скоростей роста клеток (например, анализа роста клеток, описываемого в настоящем документе).
Термин "введение" относится к способу введения дозы фармацевтической композиции млекопитающему, где способ является, например, пероральным, внутривенным,
интраперитонеальным, внутриартериальным или внутримышечным. Предпочтительный способ введения может варьировать в зависимости от различных факторов, например, компонентов фармацевтической композиции, участка потенциального или реального заболевания и тяжести заболевания. Хотя соединение 1, как правило, вводят перорально, при осуществлении способов по изобретению пригодными могут являться другие пути введения.
Термин "единичная дозированная форма" относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве однократных дозировок, таким как пилюля, таблетка, каплет, твердая капсула или мягкая капсула, где каждая единица содержит предопределенное количество соединения 1.
Как применяют в настоящем документе, термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к любой фармацевтически приемлемой соли, такой как нетоксичная соль присоединения кислоты или комплекс с металлом, обычно
используемые в фармацевтической промышленности. Примеры солей присоединения кислот включают органические кислоты, такие как уксусная, молочная, памовая, малеиновая, лимонная, яблочная, аскорбиновая, янтарная, бензойная, пальмитиновая, субериновая, салициловая, винная, метансульфоновая, толуолсульфоновая или трифторуксусная кислотаэ, и неорганические кислоты, такие как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота.
Как применяют в настоящем документе, термин "лечение" относится к введению фармацевтической композиции с профилактическими и/или терапевтическими целями.
"Предотвращение заболевания" относится к профилактическому лечению индивидуума, который еще не болен, но который восприимчив к конкретному заболеванию или иным образом подвержен его риску. "Лечение заболевания" или использование для "терапевтического лечения" относится к проведению лечения индивидууму, уже страдающему заболеванием, для улучшения или стабилизации состояния индивидуума. Таким образом, в формуле изобретения и в вариантах осуществления, лечение представляет собой введение индивидууму с терапевтическими или профилактическими целями.
Под введением ингибитора mTOR и соединения 1 "одновременно" подразумевают, что ингибитор mTOR и соединение 1 формулируют раздельно и вводят раздельно в пределах 2, 3, 4, 5, б или 7 суток друг от друга.
Под введением ингибитора mTOR и соединения 1 "совместно" подразумевают, что ингибитор mTOR и соединение 1 формулируют совместно в одной фармацевтической композиции и вводят совместно.
Как применяют в настоящем документе, "количество, эффективное для лечения" неоплазии, рака или
гиперпролиферативного нарушения, относится к количеству соединения 1, замедляющему рост, замедляющему метастазирование клеток из участка возникновения в другие отделы организма или облегчает симптомы, вызываемые неоплазией, раком или гиперпролиферативным нарушением. Симптомы, облегчаемые при
реакции неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения способы лечения, описываемые в настоящем документе, включают боль и другие типы дискомфорта.
Как применяют в настоящем документе, когда это относится к комбинированной терапии, "количество, эффективное для лечения" неоплазии или рака, относится к количествам соединения 1 и ингибитора mTOR, которые совместно замедляют рост, замедляют метастазирование клеток из участка возникновения в другие отделы организма, или облегают симптомы, вызываемые неоплазией или раком. Симптомы, облегчаемые при реакции неоплазии или рака на способы комбинированной терапии, описываемые в настоящем документе, включают боль и другие типы дискомфорта.
Термины "индивидуум" и "пациент" используют в настоящем документе взаимозаменяемо. Они относятся к человеку или другому млекопитающему (например, мыши, крысе, кролику, собаке, кошке, крупному рогатому скоту, свинье, овце, лошади или примату), которые у которых может присутствовать заболевание или нарушение (например, рак, неоплазия или аберрантный ангиогенез) или восприимчивы к ним, но у которых может или не может присутствовать заболевание или нарушение. В определенных вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека.
Термин "рак" относится к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры в качестве неограничивающих примеров включают карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретно, примеры таких видов рака включают плоскоклеточную карциному, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак поджелудочной железы, мультиформную глиобластому, рак пищевода/полости рта, рак шейки матки, рак яичников, рак эндометрия, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки или колоректальный рак, рак головы и шеи, рак желудка, множественную миелому, рак почки, хронический миелогенный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, миелодиспластический синдром и любой другой вид рака, описываемый в настоящем документе.
Термин "неоплазия" относится к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется аномальной клеточной пролиферацией. Неограничивающие примеры неоплазий включают любые опухоли, описываемые в настоящем документе, такие как солидные опухоли. Более конкретно, примеры неоплазий включают солидные опухоли из рака желудка или рака желудочно-кишечного тракта, рака эндометрия, рака мочевого пузыря, множественной миеломы, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака легких, колоректального рака, рака почки и мультиформной глиобластомы.
Термин "гиперпролиферативное нарушение" относится к нарушениям, ассоциированным с патологической клеточной пролиферацией или патологическим ангиогенезом. Неограничивающие примеры состояний, ассоциированных с аберрантным ангиогенезом, включают солидные опухоли, диабетическую ретинопатию, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, хроническое воспаление, ожирение, дегенерацию желтого пятна и сердечнососудистое заболевание.
Под "низкой дозой" подразумевают дозу, меньшую, чем доза средства, которую, как правило, можно вводить индивидууму при монотерапии для лечения неоплазии, рака или состояния, ассоциированного с аберрантным ангиогенезом (например, менее чем 70%, 60%, 50%, 40% или 30% от количества, вводимого в качестве монотерапии). Комбинации по изобретению можно использовать для снижения дозы отдельных компонентов комбинированной терапии по существу до значения, значительно ниже доз, которые могут являться необходимыми для достижения того же действия при введении ингибитора mTOR или соединения 1 отдельно в качестве монотерапии. Иллюстративные низкие дозы соединения 1 и ингибитора mTOR являются следующими: соединение 1 при 7-42 мг перорально ежедневно (например, 1+1,5 мг, 10+2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±б мг или 35±7 мг перорально ежедневно); ридафоролимус при 7-2 8 мг перорально ежедневнох5/неделю (например, 1 + 1,5 мг, 10 + 2 мг, 15±3 мг, 20±4 мг или 25±3 мг перорально ежедневнох5/неделю); эверолимус при 2-7 мг перорально ежедневно (например, 2±0,4 мг, 3±0,б мг,
4±0,8 мг, 5±0,9 мг или 6+1,2 мг перорально ежедневно); темсиролимус 3-21 мг в./в. инфузии еженедельно (например, 3±0,б мг, 5±1 мг, 7,5±1,5 мг, 10 + 2 мг, 15±3 мг или 18±3,5 мг в./в. инфузии еженедельно); сиролимус при 0,5-12 мг перорально ежедневно (например, 0,5±0,1 мг, 1+0,2 мг, 2±0,4 мг, 3±0,б мг, 4±0,8 мг, 5±0,9 мг, 6+1,2 мг, 8±1,5 мг или 10+2 мг перорально ежедневно); биолимус при 100-600 мкг в./в. инфузии ежедневно
(например, 10 0±20 мкг, 150±30 мкг, 200±40 мкг, 300±50 мкг, 400±50 мкг, или 500±50 мкг в./в. инфузии ежедневно); зотаролимус при 100-600 мкг в./в. инфузии ежедневно (например, 100±20 мкг, 150±30 мкг, 200±40 мкг, 300±50 мкг, 400±50 мкг, или 500±50 мкг в./в. инфузии ежедневно); NVP-BEZ235 при 5-50 мг перорально ежедневно (например, 5±1 мг, 10±1,5 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±6 мг, 35±7 мг, 40±8 мг, 45±9 мг или 50±10 мг перорально ежедневно); вортманнин при 10-7 0 мг перорально ежедневно (например, 10±2 мг, 15±5 мг, 20±б мг, 30±7 мг, 40±8 мг, 50±9 мг, 70±10 мг перорально ежедневно); кверцетин при 1-5 г перорально ежедневно (например, 1±0,1 мг, 2±0,2 мг, 3±0,3 мг, 4±0,5 мг или 5±1 мг перорально ежедневно); мирицентин при 15100 мг перорально ежедневно (например, 15±5 мг, 20±б мг, 30±7 мг, 40±8 мг, 50±9 мг, 75±10 мг или 100±25 мг перорально ежедневно), и стауроспорин при 10-50 мг перорально ежедневно
(например, 10±1,5 мг, 15±3 мг, 20±4 мг, 25±5 мг, 30±б мг, 35±7 мг, 40±8 мг, 45±9 мг или 50±10 мг перорально ежедневно) . При дозах, меньших, чем дозы, описанные в настоящее время для монотерапии, можно вводить следующие соединения: LY2 94 0 02, Рр242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055 и OSI-027.
Другие признаки и преимущества изобретения будут понятны из приведенных ниже подробного описания, рисунков и формулы изобретения.
Краткое описание рисунков
Фиг.1А и 1В представляют собой диаграммы, демонстрирующие, что соединение 1 ингибирует передачу сигнала BCR-ABL в клеточных линиях CML, экспрессирующих природную BCR-ABL или BCR-ABLT3151. На фиг. 1А изображен анализ посредством иммуноблоттинга фосфорилирования CrkL в клетках Ba/F3,
экспрессирующих природную BCR-ABL, обработанных иматинибом, нилотинибом, дазатинибомом или соединением 1. Клетки культивировали в течение 4 часов в присутствии ингибиторов, собирали, лизировали и анализировали посредством
иммуноблоттинга с использованием антитела к CrkL, субстрата BCR-ABL, фосфорилирование которого является установленным клиническим маркером киназной активности BCR-ABL.
Фосфорилированную и нефосфорилированную формы разделяли по электрофоретической подвижности, и проводили количественное определение в полосах посредством денситометрии и выражали в виде % фосфорилированного CrkL. На фиг.1В изображен анализ посредством иммуноблоттинга фосфорилирования CrkL в экспрессирующих BCR-ABLT3151 клетках Ba/F3, обработанных иматинибом, нилотинибом, дазатинибом или соединением 1. Испытания и анализы проводили, как описано выше для панели (А). Сокращения: б.о., без обработки. Фиг.1А и 1В демонстрируют, что соединение 1 ингибирует передачу сигнала BCR-ABL в клеточных линиях CML, экспрессирующих природную BCR-ABL или BCR-ABLT3151.
Фиг.2А-С демонстрирует, что обработка первичных клеток CML ex vivo соединением 1 ингибирует клеточную пролиферацию и опосредованную BCR-ABL передачу сигнала. Фиг.2А представляет собой график анализов клеточной пролиферации для обработанных ex vivo соединением 1 мононуклеарных клеток пациентов с миелогенным бластным кризом (М-ВС) CML, несущих природную BCR-ABL (N=3), и здоровых индивидуумов (N=3). Для сравнения пунктирная линия означает жизнеспособность 50% клеток относительно необработанных клеток. Фиг.2В представляет собой диаграмму, где изображен анализ посредством иммуноблоттинга фосфорилирования CrkL в мононуклеарных клетках пациента с лимфоидным бластным кризом (L-BC) CML, несущего BCR-ABLT3151 с последующей обработкой ex vivo соединением 1, иматинибом, нилотинибом или дазатинибом. Клетки культивировали в течение ночи в присутствии ингибиторов, собирали, лизировали и анализировали посредством иммуноблоттинга CrkL.
Фосфорилированную и нефосфорилированную формы разделяли по электрофоретической подвижности, и проводили количественное
определение в полосах посредством денситометрии и выражали в виде % фосфорилированного CrkL. Фиг.2С представляет собой диаграмму, где изображен анализ FACS общего фосфорилирования тирозина в мононуклеарных клетках пациента с L-BC CML с BCR-ABL1,3151 с фиг.2В. После культивирования в течение ночи в присутствии ингибиторов, клетки фиксировали и
пермеабилизировали, инкубировали с меченным FITC антителом к фосфорилированному тирозину и анализировали посредством FACS. Значения регистрировали в виде кратности увеличения средней интенсивности флуоресценции относительно неокрашенных контролей. Сокращения: б.о., без обработки.
Фиг.ЗА и ЗВ представляют собой диаграммы для анализов формирования колоний в присутствии соединения 1. Фиг.ЗА представляет собой диаграмму для анализов формирования колоний в присутствии соединения 1, нилотиниба и дазатиниба с использованием мононуклеарных клеток пациента с АР CML, несущего BCR-ABLT3151. Фиг. ЗВ представляет собой диаграмму для анализов формирования колоний в присутствии соединения 1 с использованием мононуклеарных клеток здорового индивидуума. Мононуклеарные клетки пациента с ускоренной фазой (АР) CML, несущего BCR-ABLT3151 и здорового индивидуума высевали в метилцеллюлозу, содержащую нилотиниб, дазатиниб или соединение 1, и культивировали в течение 14-18 суток. Колонии подсчитывали в инвертированном микроскопе, а результаты выражали в виде среднего трех повторений (величины ошибок представляют собой С.О.С.).
Фиг.4А-4С демонстрируют, что соединение 1 эффективно в моделях с ксенотрансплантатами управляемого BCR-ABL и управляемого BCR-ABLT3151 роста опухоли на мышах. Фиг. 4А и 4В представляют собой диаграммы, где представлено действие соединения 1 на выживаемость мышей SCID после внутривенной инъекции клеток Ba/F3, экспрессирующих природную BCR-ABL (фиг.4А) или BCR-ABLT3151 (фиг.4В) . Клетки Ba/F3, экспрессирующие природную BCR-ABL или BCR-ABLT3151, инъецировали в хвостовую вену мышей SCID, и животных ежедневно однократно обрабатывали посредством перорального принудительного кормления носителем,
соединением 1 или дазатинибом в течение указанного периода дозирования (3-21 сутки). На фиг.4С представлена эффективность in vivo и подавления фосфорилирования BCR-ABL соединения 1 в модели с подкожным ксенотрансплантатом с использованием клеток Ba/F3, экспрессирующих BCR-ABLT3151. Клетки подкожно
имплантировали в правый бок "голых" мышей, а затем средний объем опухоли достигал приблизительно 50 0 мм3, и животных ежедневно однократно обрабатывали посредством перорального принудительного кормления носителем или соединением 1 в течение 19 последовательных суток (указанный период дозирования). Каждую группу с обработкой соединением 1 сравнивали с группой с носителем с использованием критерия Даннета, и статистическая значимость (р <0,05) указана звездочкой. Фосфорилирование BCR-ABL оценивали у животных, обработанных однократной дозой носителя или 30 мг/кг соединения 1 посредством перорального принудительного кормления (N=3 на группу). Через шесть часов после дозирования мышей умерщвляли, и образцы опухоли анализировали в анализе посредством иммуноблоттинга с антителами к pBCR-ABL и eIF4E (контроль загрузки).
Фиг.5 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие дазатиниба в моделях на мышах с использованием клеток Ba/F3, экспрессирующих BCR-ABLT3151. Кривые выживаемости представлены для мышей, обрабатываемых в течение указанного периода дозирования носителем или дазатинибом. Среднюю выживаемость рассчитывали с использованием способа Каплана-Мейера и для каждой группы указаны значения статистической значимости.
Фиг.6А и 6В представляют собой диаграммы, где представлены мутантные BCR-ABL, восстанавливаемые в присутствии различных концентраций соединения 1. На фиг.6А представлены устойчивые субклоны, восстанавливаемые из обработанных ENU клеток Ba/F3, начиная от природной BCR-ABL, культивируемых в присутствии ступенчато изменяющихся концентраций соединения 1 (10, 20, 4 0 нМ) . Каждый столбец представляет собой относительный процент указанного мутанта киназного домена BCR-ABL среди восстанавливаемых субклонов. Так как процент выживающих
устойчивых клонов и концентрация соединения 1 обратно пропорциональны, для каждой концентрации соединения 1 на диаграмме представлены различные количества секвенированных субклонов (смотрите таблицу 2) . Справа от каждой диаграммы указан процент просмотренных лунок, содержащий разрастания. На фиг.6В представлены устойчивые субклоны, восстанавливаемые из обработанных ENU клеток Ba/F3, экспрессирующих BCR-ABLT3151, культивируемых в присутствии ступенчато изменяющихся концентраций соединения 1 (40, 80, 160, 32 0, 64 0 нМ) . Этот анализ начинали с клеток, экспрессирующих BCR-ABLT3151, все восстанавливаемые субклоны в дополнение к конкретной вторичной мутации, указанной на каждой диаграмме, содержали мутацию T315I. Данные демонстрируют, что соединение 1, в качестве единственного средства может подавлять разрастание устойчивых клеток в основанном на клетке скрининге мутагенеза.
Фиг.7А-7Б представляют собой диаграммы фармакокинетических данных для соединения 1. На фиг. 7А представлена СмаКс для различных доз соединения 1 в цикле 1, на сутки 1 (C1D1) и в цикле 2, на сутки 1 (C2D1) . На фиг.7В представлена AUC для различных доз соединения 1 в цикле 1, на сутки 1 (C1D1) и в цикле 2, на сутки 1 (C2D1) . На фиг.7С представлены профили зависимости концентрации от времени C1D1 после однократной пероральной дозы. На фиг.7Б представлены профили зависимости концентрации от времени C2D1 после нескольких пероральных доз.
На фиг.8А-8Е представлены фармакодинамические данные для соединения 1. Фиг.8А представляет собой диаграмму, демонстрирующую фармакодинамические данные для соединения 1 у всех пациентов в клиническом исследовании и у пациентов с мутацией T315I. Фиг.8В-8Е представляют собой диаграммы, демонстрирующие фармакодинамические данные для соединение 1 при 15 мг у пациента с мутацией F359C (фиг.8В), для соединение 1 при 30 мг у пациента без мутации (фиг.8С), для соединения 1 при 45 мг у пациента с мутацией F359C (фиг.8Б) и для соединения 1 при 60 мг у пациента с мутацией T315I (фиг.8Е).
Фиг.9 представляет собой диаграмму, демонстрирующую ингибирование фосфорилирования рецептора активированных
тирозинкиназ в клеточных линиях AML. Клетки AML инкубировали с увеличивающимися концентрациями соединения 1 в течение 72 часов, и жизнеспособность клеток оценивали с использованием анализа с MTS. Данные для MV4-11, Kasumi-1 и EOL-1 представлены как средние±БО из 3 экспериментов, а данные для KG1 представлены как средние±БО из 2 экспериментов.
Фиг.10 представляет собой диаграмму, демонстрирующую ингибирование роста и индукцию апоптоза в клетках MV4-11. Клетки MV4-11 высевали в 9б-луночные планшеты, обрабатывали увеличивающимися концентрациями соединения 1 и измеряли активность каспаз 3/7 в указанные моменты времени. Данные выражены в виде кратной индукции каспазной активности относительно обработанных носителем клеток и представлена как средние±БО из 3 отдельных экспериментов.
Фиг.НА и 11В демонстрируют эффективность и ингибирование мишени для ксенотрансплантата MV4-11. Фиг.НА представляет собой диаграмму роста опухоли для различных доз соединения 1. Ежедневное пероральное введение носителя или соединения 1 в течение 4 недель при дозах 1, 2,5, 5, 10 и 25 мг/кг/сутки начинали, когда ксенотрансплантаты опухолей MV4-11 в бок достигали приблизительно 200 мм3 (10 мышей/группу). На диаграмму наносили средние объемы опухолей (±SEM). Трех из десяти животных в контрольной группе с носителем умертвили перед последней обработкой на сутки 2 8 вследствие опухолевой нагрузки. Таким образом, ингибирование роста опухоли рассчитывали от суток 0 до суток 24 (что указано звездочкой), предпоследний момент времени для измерений опухоли в течение фазы дозирования. Фиг.11В представляет собой диаграмму, демонстрирующую ингибирование p-FLT3 и p-STAT5 различными дозами соединения 1. Мышам, несущим прижившиеся
ксенотрансплантаты опухолей MV4-11, вводили однократную пероральную дозу соединения 1 (4 мыши/группу) на указанном уровне; контрольные животные получали только носитель (5 мышей). Опухоли собирали через б часов и анализировали на уровни фосфорилирования и общие FLT3 и STAT5 посредством иммуноблоттинга. В качестве контроля анализировали GAPDH.
Представлено количественно определение относительного фосфорилирования FLT3 и STAT5 посредством денситометрии в виде среднего (±SEM) из двух независимых экспериментов. Фосфорилирование FLT3 нормализовали по GAPDH, а фосфорилирование STAT5 нормализовали по общему белку STAT5.
Фиг.12 представляет собой диаграмму, демонстрирующую, что обработка первичных клеток AML соединением 1 ex vivo селективно ингибирует клетки FLT3-ITD. Первичные лейкозные бластные клетки выделяли из периферической крови 4 независимых пациентов AML. Статус FLT3-ITD определяли по гистологическому заключению и подтверждали ПЦР. Первичные клеточные культуры обрабатывали указанными концентрациями соединения 1 в течение 72 часов, при этом оценивая жизнеспособность с использованием анализа с MTS. Все значения нормализовали по жизнеспособности клеток, инкубируемых в отсутствие лекарственного средства.
Фиг.13 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие соединения 1 на полученные из острого миелогенного лейкоза (AML) клетки KG1 в анализе роста клеток.
Фиг.14 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие соединения 1 на клетки рака желудка SNU16 с амплифицируемым FGFR2 по сравнению с клетками SNU1 с wtFGFR2 в анализе роста клеток.
Фиг.15 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие соединения 1 на клетки рака желудка SNU16 в анализе образования колоний в мягком агаре.
Фиг.16 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие соединения 1 на клетки рака эндометрия AN3CA с мутантным FGFR2 (N549К) по сравнению с клетками HeclB с wtFGFR2 в анализе роста клеток.
Фиг.17 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие соединения 1 на клетки MGH-U3, экспрессирующие мутантный FGFR3b (Y375C), по сравнению с клетками RT112 с wtFGFR3 в анализе роста клеток.
Фиг.18 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие соединения 1 на клетки множественной миеломы ("ММ") 0РМ2, несущие транслокацию t(4;14) и экспрессирующие мутантный
FGFR3 (К650Е), по сравнению с клетками NCI-H929 с wtFGFR3 в анализе роста клеток.
Фиг.19 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие соединения 1 на клетки рака молочной железы MDA-MB-453, экспрессирующие мутантный FGFR4 (Y367C), в анализе роста клеток.
Фиг.20 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие перорального дозирования соединения 1 на рост опухоли в модели с ксенотрансплантатом стимулируемых FGFR2 клеток рака эндометрия AN3CA.
Фиг.21 представляет собой диаграмму, демонстрирующую фармакодинамику и фармакокинетику перорального дозирования соединения 1 in vivo в модели с ксенотрансплантатом клеток рака эндометрия AN3CA.
Фиг.22 представляет собой диаграмму, демонстрирующую результаты анализа роста клеток с линиями клеток рака эндометрия (AN3CA и MFE-2 96) и линиями клеток с FGFR2 дикого типа (Нес-1-В и RL95-2) при обработке соединением 1.
Фиг.23 представляет собой диаграмму, демонстрирующую действие перорального дозирования соединения 1 на рост опухоли в ксенотрансплантате опухоли эндометрия AN3CA.
Фиг.24А и 24В представляют собой диаграммы, демонстрирующие действие комбинации соединения 1 с ридафоролимусом на клетки рака эндометрия с мутантным FGFR2 в анализе роста клеток. На фиг.24А представлены результаты анализа роста клеток с линией клеток рака эндометрия AN3CA. Концентрация lxECso соединения 1, используемая для обработки клеток AN3CA, составляет 30 нМ, а для ридафоролимуса она составляет 0,4 нМ. На фиг.24В представлены результаты анализа роста клеток с линией клеток рака эндометрия MFE-296. Концентрация lxECso соединения 1, используемая для обработки клеток MFE-296, составляет 100 нМ, а для ридафоролимуса она составляла 1 нМ. Данные представлены только для ридафоролимуса ("Ридафоролимус"), только для соединения 1 ("Соединение 1"), и для комбинации соединения 1 с ридафоролимусом ("Комбинация").
Фиг.2 5А и 2 5В представляют собой диаграммы,
демонстрирующие анализы среднего действия комбинации соединения 1 с ридафоролимусом. Данные представлены для клеточной линии AN3CA (фиг.25А) и клеточной линии MFE-296 (фиг.25В).
Фиг.2 б представляет собой диаграмму, демонстрирующую анализ клеточного цикла в клеточной линии AN3CA после обработки. Данные представлены для клеток без обработки ("необработанных") или клеток, обработанных одним
ридафоролимусом, одним соединением 1 или комбинацией соединения 1 с ридафоролимусом.
Фиг.27 представляет собой схему, демонстрирующую возможные путь FGFR2/MAPK и путь mTOR (модифицировано на основе Katoh М., J. Invest. Dermatol., 2009, 128: 1861-1867).
Фиг.2 8А и 2 8В представляют собой диаграммы, демонстрирующие действие перорального дозирования соединения 1 с ридафоролимус на ксенотрансплантат опухоли эндометрия AN3CA. На фиг.2 8А представлены данные для комбинации с низкой дозой 10 мг/кг соединения 1 с ридафоролимусом. На фиг.2 8В представлены данные для комбинации с высокой дозой 3 0 мг/кг соединения 1 с ридафоролимусом. Данные представлены для одного ридафоролимуса ("Рид."), одного соединения 1 ("Соединение 1") и комбинации соединения 1 с ридафоролимусом ("Соединение 1, Рид."). Дозировки предоставлены в скобках в виде единиц мг/кг.
На фиг.29 представлены фармакокинетические и фармакодинамические данные для перорального дозирования одного ридафоролимуса, одного соединения 1 и комбинации соединения 1 с ридафоролимусом. Данные представлены для различных концентраций ридафоролимуса ("Рид.") и соединения 1 ("Соединение 1").
Подробное описание
Изобретение относится к способам лечения рака, включающим введение соединения 1. Неограничивающие примеры видов рака включают виды рака, приводящие к солидным опухолям, таким как острый миелогенный лейкоз, рак желудка и желудочно-кишечного тракта, рак эндометрия, рак мочевого пузыря, множественную миелому или рак молочной железы. Другие примеры видов рака включают миелогенный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз или миелодиспластический синдром
(например, рефракторную анемию с избытком бластов группы 1 (RAEBI) или рефракторную анемия с избытком бластов группы 2 (RAEBII)).
В дополнение к видам рака, указанным выше, способы и композиции по изобретению можно использовать для лечения следующих типов рака, а также другого: рака кожи (например, плоскоклеточная карцинома, базально-клеточная карцинома или меланома), предстательной железы, головного мозга и нервной системы, головы и шеи, яичек, легких, печени (например, гепатома), почки, костей, эндокринной системы (например, опухоли щитовидной железы и гипофиза) и лимфатической системы (например, лимфома Ходжкина и неходжкинские лимфомы). Другие типы рака, которые можно лечить способами по изобретению, включают фибросаркому, нейроэктодермальную опухоль,
мезотелиому, плоскоклеточную карциному и саркому Капоши.
Выявлено, что соединение 1 обладает сильными антиангиогенными свойствами и, таким образом, может являться пригодным для лечения состояния, ассоциированного с аберрантным ангиогенезом, включая солидные виды рака (например, рак предстательной железы, рак легких, рак молочной железы, колоректальный рак, рак почки и глиобластому), диабетическую ретинопатию, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, хроническое воспаление, ожирение, дегенерацию желтого пятна и сердечно-сосудистое заболевание.
В частности, соединение 1 представляет собой общий ингибитор BCR-ABL. Ингибирование онкогенной тирозинкиназы BCR-ABL иматинибом индуцирует долговременный ответ у множества пациентов с хроническим миелогенным лейкозом (CML) в хронической фазе, тогда как при прогрессирующем CML и остром лимфобластном лейкозе Ph+ характерен рецидив. Устойчивость к иматинибу главным образом приписывают мутациям киназного домена BCR-ABL, и ингибиторы BCR-ABL второй линии нилотиниб и дазатиниб предоставляют этим пациентам альтернативы для
лечения. Однако клиническое значение продолжают сохранять перекрестная устойчивость мутации BCR-ABLT3151 и полирезистентные сочетанные мутанты, отбираемые при последовательной терапии
ингибиторами киназы ABL. В настоящем документе авторы приводят оценку соединения 1, мощного ингибитора BCR-ABLT3151 и других устойчивых мутаций, in vitro и in vivo. Выявлено, что соединение 1 ингибирует неактивную форму BCR-ABLT3151. В скрининге мутагенеза на основе клеток соединение 1 при определенных концентрациях полностью подавляло устойчивость, включая мутант T315I. Доступность перорально вводимого общего ингибитора тирозинкиназ BCR-ABL, такого как соединение 1 обеспечивает важные терапевтические преимущества возможностей первой линии при минимизации появления основанной на мутациях киназного домена BCR-ABL лекарственной устойчивости при лечении.
Кроме того, авторы выявили, что при лечении патологической клеточной пролиферации, ингибировании ангиогенеза и увеличения апоптоза раковых клеток комбинация mTOR и соединения 1 является более эффективной, чем монотерапия макролидом рапамицином или монотерапия соединением 1. Неограничивающие примеры видов рака, которые можно лечить с использованием композиций, способов или наборов по изобретению, включают карциному мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почки, печени, легкого, головы и шеи, желчного пузыря, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы, предстательной железы или кожи; плоскоклеточную карциному; рак эндометрия; множественную миелому; гемопоэтическую опухоль лимфоидного происхождения
(например, лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточной лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому или лимфому Беркитта); гемопоэтическую опухоль миелогенного происхождения (например, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, множественный миелогенный лейкоз, миелодиспластический синдром или промиелоцитарный лейкоз); опухоль мезенхимального происхождения
(например, фибросаркому или рабдомиосаркому); опухоль центральной или периферической нервной системы (например, астроцитому, нейробластому, глиому или шванному); меланому; семиному; тератокарциному; остеосаркому или саркому Капоши.
Неограничивающие примеры состояний, ассоциированных с аберрантным ангиогенезом, которые можно лечить с использованием композиций, способов или наборы по изобретению, включают солидные опухоли (например, рак предстательной железы, рак легких, рак молочной железы, колоректальный рак, рак почки или глиобластому), диабетическую ретинопатию, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, хроническое воспаление, ожирение, дегенерацию желтого пятна и сердечно-сосудистое заболевание. Синтез и композиция соединения 1
Соединение 1 можно синтезировать, как описано на схеме 1 и как описано в публикации РСТ № W0 2007/075869. Альтернативно, хлорангидрид, используемый на стадии, можно заменить сложным метиловым эфиром, как изображено на схеме 2, описывающей модификацию стадии 5.
Схема 1
Стадии 1 и 2
^Si(CH3)3
1. Pd(PPh3)4, Cul, ТГФ, DIPEA
2. обмен на EtOAc
3. отмывка NH3/H2O, отмывка NaCI/H20
Si(CH3)3
1. EtOAc / МеОН, К2СО3
2. отмывка Н2О
3. Обмен на гептан
CeH.BrNs
Молекулярная масса 198,02
TMS-ацетилен CeHnjSi
Молекулярная масса 98,22
CnH13N3Si
Молекулярная масса 215,33
С8Н6Мз
Молекулярная масса 143,15
Стадии 3 и 4
.он
1. Pd(PPh3)4, Cul, EtOAc, TEA
2. ЮН20
3. отмывка ACN
З-йод-4-метилбензойная кислота CsHsNj С8Н7Ю2
Молекулярная Молекулярная масса 143,15 масса 262,04
CeHniKsOz
Молекулярная масса 277,28
Молекулярная масса 332,18
Стадии 5 и 6
H,N
CF3
1. DCM, DIPEA .
2. отмывка, фильтр NH3/H20 Yu
3. отмывка ЫНэ/НгО, отмывка NaCI/H20
4. обмен на ACN
5. DCM, смола Lewatit
6. обмен на ACN
7. ресуспендирование BACN
EtOH, HCI
C^HnCbNaOj
Молекулярная масса 332,18
С^зНщРзМз
Молекулярная масса 273,30
Соединение 1 (в виде свободного основания)
C29H27F3NeO
Молекулярная масса 532,56
Соединение 1 HCI C^htsCIFaNsO
Молекулярная масса 569,02
Схема 2
Стадии 4 и 5
H,N
CF3
HCI
EtOH
&i7Hi3N302 C13H18F3N3
Молекулярная масса 291,30 Молекулярная масса 273,30
C29H27F3NgO
Молекулярная масса 532,56
C29H25CIF3N60
Молекулярная масса 569,02
Для проведения клинических испытаний вместо значительно менее водорастворимого свободного основания использовали моногидрохлоридную соль соединения 1. Выявлено, что моно-НС1 соль является кристаллическим, безводным твердым веществом, воспроизводимо образуемым из ряда растворителей. Гидрохлоридная соль соединения 1 обладает термодинамической растворимостью в небуферизованной воде 1,7 мг/мл при рН 3,7.
Дополнительная идентифицирующая информация для соединения 1 включает:
Химическое наименование: гидрохлоридная соль 3-(имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-(трифторметил)фенил)бензамида;
Наименование USAN: понатиниб (рассматриваемое в INN);
Регистрационный № CAS: 1114544-31-8 (НС1 соль) и 94331970-8 (свободное основание);
Индексное наименование CAS: гидрохлорид бензамид, 3-(2-имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-илэтинил)-4-MeTrai-N-[4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-3-(трифторметил)фенила] (1:1);
Молекулярная формула: C29H28CIF3N6O (HCI соль) и C29H27F3N6O (свободное основание) (отсутствие хиральных центров); и
Молекулярная масса: 569,02 г/моль (НС1 соль) и 532,56 г/моль (свободное основание).
Соединение 1 или предпочтительно его фармацевтически приемлем соль, такая как моно-HCl соль, можно формулировать для перорального введения с использованием любых материалов и способов, пригодных для таких целей. Фармацевтически приемлемые композиции, содержащие соединение 1, подходящие для перорального введения, можно формулировать с использованием общепринятых материалов и способов, широкое множество которых хорошо известно. Хотя композиция может находиться в форме раствора, суспензии или эмульсии, наибольший интерес в настоящее время вызывают твердые дозированные формы, такие как капсулы, таблетки, гелевые капсулы, каплеты и т.д. Способы получения композиций, включая указанные выше единичные дозированные формы, хорошо известные в данной области можно найти, например, в "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed. , ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins). Соединение 1 можно предоставлять в капсулах в чистом виде или в комбинации с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как наполнители, связывающие средства, стабилизаторы, консерванты, способствующие скольжению средства, дезинтегранты, красители, пленочные покрытия и т.д., как проиллюстрировано ниже.
Например, получали белые непрозрачные капсулы, номинально содержащие 2 мг свободного основания соединения 1, предоставленного в виде гидрохлоридной соли, без эксципиентов. Также получали белые непрозрачные капсулы, содержащие 5, 15 или 2 0 мг свободного основания соединения 1, предоставленного в виде гидрохлоридной соли, смешанного с общепринятыми эксципиентами. Неактивные ингредиенты, используемые в качестве эксципиентов в иллюстративной смеси для капсул, включают один или несколько из наполнителя, улучшителя текучести, лубриканта и дезинтегранта. Например, смесь для капсул получали для капсул
5, 15 и 2 0 мг, содержащих НС1 соль соединения 1 и коллоидный диоксид кремния (приблизительно 0,3% масс./масс, улучшитель текучести), безводную лактозу (приблизительно 44,6% масс./масс, наполнитель), стеарат магния (приблизительно 0,5% масс./масс, лубрикант), микрокристаллическую целлюлозу (приблизительно 44,6% масс/масс, наполнитель) и
крахмалгликолят натрия (приблизительно 5% масс/масс, дезинтегрант). Капсула должна содержать желатин и диоксид титана.
При получении композиций используют общепринятые способы и устройства для смешивания и инкапсулирования. Гидрохлоридную соль соединения 1 и все эксципиенты смеси за исключением стеарата магния смешивали в V-образном смесителе и растирали посредством просеивающей мельницы. Добавляли стеарат магния и материал снова перемешивали. Для определения однородности смеси из V-образного смесителя отбирали образец. Смесь тестировали на объемную плотность, насыпную плотность, текучесть и распределение частиц по размерам. Затем в зависимости от дозировки единичной дозированной формы смесь инкапсулировали в капсульные оболочки размера "3", размера "4" или размера "1".
Соединение 1 также формулировали в таблетки с использованием общепринятых фармацевтических эксципиентов, включая один или несколько из наполнителя или смесей наполнителей, дезинтегранта, способствующего скольжению средства, лубриканта, пленочного покрытия и растворителя для покрытия, в смеси, сходной со смесью, используемой для капсул с большей дозировкой. Например, таблетки можно получать с использованием следующих относительных количеств и соотношений (масса/масса): соединение 1 (90 г предоставленное в виде НС1 соли, 15,0% масс/масс), коллоидный диоксид кремния (1,2 г, 0,2% масс/масс), моногидрат лактозы (240,9 г, 40,15% масс/масс ) , стеарат магния (3 г, 0,5% масс/масс ) , микрокристаллическая целлюлоза (240,9 г, 40,15% масс/масс) и крахмалгликолят натрия (24 г, 4,0% масс/масс) , с количеством моногидрата лактозы, регулируемым на основе используемого количества лекарственного средства.
Соединение 1 и эксципиенты можно смешивать с использованием устройства и способы того же рода, что применяли в случае капсулы. Затем полученную однородную смесь можно общепринятыми способами прессовать в таблетки, такими как ротационный таблетировочный пресс, регулируемый на основе намеченной массы таблеток, например, 300 мг для таблеток 45 мг или 100 мг для таблеток 15 мг; средней жесткости, например, 13 кр (5,90 т) для таблеток 45 мг и 3 кр (1,36 т) для таблеток 15 мг и ломкости не более 1%. На получаемые таким образом сердцевины таблеток можно распылять общепринятое вещество для пленочного покрытия, например, водную суспензию Opadry(r) II White, что приводит, например, к приблизительно 2,5% увеличению массы относительно массы сердцевины таблетки.
Ингибиторы mTOR
Мишень рапамицина, у млекопитающих, общеизвестная как mTOR, представляет собой серин/треониновую протеинкиназу, регулирующую рост клеток, клеточную пролиферацию, клеточную подвижность, жизнеспособность клеток, синтез белка и транскрипцию. Ингибиторы mTOR, включая рапамицин и его аналоги, представляют собой класс терапевтических средств, которые специфично ингибируют передачу сигнала mTOR или комбинацию киназ, включая mTOR (например, такие средства, которые действуют как ингибиторы PI3K и mTOR). mTOR представляет собой ключевой посредник в различных митогенных путях передачи сигнала и играет центральную роль в модуляции пролиферации и ангиогенеза в нормальных тканях и при неопластических процессах. Существует два класса ингибирующих mTOR соединений: рапамициновые макролиды и не являющиеся аналогами рапамицина соединения.
Рапамицин (сиролимус) представляет собой
иммуносупрессорный лактамный макролид, продуцируемый
Streptomyces hygroscopicus. Смотрите, например, J.B. McAlpine et al., J. Antibiotics, 1991, 44: 688; S.L. Schreiber et al. , J. Am. Chem. Soc, 1991, 113: 7433 и патент США № 3929992, включенные в настоящий документ путем ссылки.
Вследствие того, что существует более одного принятого
соглашения нумерации атомов рапамицина и его аналогов, ниже приведено соглашение о нумерации, используемое в настоящем документе:
Для справки, в приведенной ниже таблице указана группа R для ряда соединений:
Соединение
Рапамицин
-он
АР23573
-0Р(0)(Me)2
Темсиролимус
-ОС (0) С (СН3) (СН20Н) 2
Эверолимус
-ОСН2СН2ОН
Биолимус
-OCH2CH2OEt
АВТ-578
-тетразол
Желательные рапамициновые макролиды для применения в комбинированной терапии по изобретению в качестве неограничивающих примеров включают, рапамицин (сиролимус или рапамун (Wyeth)), темсиролимус или CCI-779 (Wyeth, смотрите, патенты США №№ 5362718 и 6277983, содержание которых в полном объеме включено в настоящий документ путем ссылки), эверолимус или RAD001 (Novartis), ридафоролимус или АР23573 (Ariad), биолимус (Nobori) и зотаролимус или АВТ 578 (Abbott Labs.).
Темсиролимус представляет собой растворимое сложноэфирное пролекарственное средство рапамицина, сложный эфир рапамицина с З-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой в положении 42, описанный в патенте США № 5362718. Темсиролимус продемонстрировал значительное ингибирующее действие на рост опухоли в моделях in vitro и in vivo. Темсиролимус демонстрирует цитостатические, а не цитотоксические свойства, и
может задерживать время до прогрессирования опухолей или время до рецидива опухоли. Как описано в W0 00/240000, CCI-779 может являться пригодным для лечения рака различного происхождения, включая опухоли почки, молочной железы, шейки матки, матки, головы и шеи, легких, предстательной железы, поджелудочной железы, яичника, толстой кишки, лимфому и меланому.
Эверолимус представляет собой 40-О-(2-
гидрокси)этилрапамицин, структура и синтез которого описаны в WO 94/09010. Эверолимус, для которого показано, что он является мощным иммуносупрессирующим средством (патент США № 5665772), также демонстрирует признаки антинеопластических свойств (смотрите, например, A. Boulay et al. , Cancer Res., 2004, 64: 252-2 61) . Как результат этих свойств эверолимус в настоящее время в некоторых странах продается как иммуносупрессор для предотвращения отторжения аллотрансплантата (В. Nashan, Ther. Drug. Monit., 2002, 24: 53-58) и проходит клиническое тестирование в качестве средства против рака (S. Huang и P.J. Houghton, Curr. Opin. Invest. Drugs, 2002, 3: 295-304; M.M. Mita et al., Clin. Breast Cancer, 2003, 4: 126-137; и M. Hidalgo и E.J. Rowinsky, Oncogene, 2000, 19: 6680-6686) .
Зотаролимус представляет собой его 43-эпиизомер, например, как описано в WO 99/15530, или аналоги рапамицина, как описано в №. WO 98/02441 и WO 05/016252.
Ридафоролимус представляет собой содержащее фосфор производное рапамицина (смотрите WO 03/064383, пример 9 в ней) . Подобно темсиролимусу и эверолимусу, показано, что ридафоролимус обладает антипролиферативной активностью в ряде дефицитных по PTEN линий опухолевых клеток, включая глиобластому, опухли предстательной железы, молочной железы, поджелудочной железы, легких и толстой кишки (Е.К. Rowinsky, Curr. Opin. Oncol., 2004, 16: 564-575). Ридафоролимус определен U.S. Food and Drug Administration как продукт с ускоренной процедурой рассмотрения для лечения сарком мягких тканей и костей. Ридафоролимус тестировали в различных клинических испытаниях, где мишенью служили гематологические раковые новообразования (например, лейкозы и лимфомы) и солидные
опухоли (например, саркомы, рак предстательной железы и мультиформная глиобластома).
В данной области известно множество рапамициновых макролидов. Рапамициновые макролиды, которые можно использовать в способах, наборах и композициях по изобретению, включают 42-дезметоксипроизводные рапамицина и его различные аналоги, как описано, например, в W0 2006/095185 (в которой такие соединения обозначают как "39-дезметокси" соединения на основе их системы нумерации). Производные рапамицина являются особенно актуальными для практического применения настоящего изобретения.
Кроме того, в настоящее время описано большое количество других структурных вариантов рапамицина, как правило, получаемых в качестве продуктов альтернативной ферментации и/или на основе попыток синтеза. Например, обширная литература по аналогам, гомологам, производным и другим соединениям, структурно родственным рапамицину ("рапалоги"), наряду с другими, включает варианты рапамицина с одной или несколькими из следующих модификаций относительно рапамицина:
деметилирование, отщепление или замещение метокси в С7, С42 и/или С2 9; отщепление, дериватизация или замещение гидрокси в С13, С43 и/или С28; восстановление, отщепление или дериватизация кетона в С14, С24 и/или СЗО; замещение б-членного пипеколинового кольца 5-членным пролиловым кольцом; альтернативное замещение на циклогексильном кольце или замещение циклогексильного кольца замещенным циклопентильным кольцом; эпимеризация гидроксильной группы в С2 8 и замещение содержащими фосфор группами.
Таким образом, ингибиторы mTOR включают, например, сложные эфиры, простые эфиры, карбонаты, карбаматы и т.д. рапамицина по положениям 4 3 и/или 2 8 включая сложные эфиры, простые эфиры, карбонаты, карбаматы и т.д., описанные в перечисленых ниже патентах, которые, таким образом, все включены в качестве ссылки: сложные алкиловые эфиры (патент США № 4316885); сложные аминоалкиловые эфиры (патент США № 4650803); фторсодержащие сложные эфиры (патент США № 5100883); сложные амидные эфиры
(патент США № 5118677); сложные карбаматные эфиры (патент США № 5118678); сложные силиловые эфиры (патент США № 5120842); сложные аминодиэфиры (патент США № 5162333); сложные сульфонатные и сульфатные эфиры (патент США № 5177203); сложные эфиры (патент США № 5221670); сложные алкоксиэфиры (патент США № 5233036); простые О-ариловые, -алкиловые, -алкениловые и -алкиниловые эфиры (патент США № 5258389); сложные карбонатные эфиры (патент США № 5260300); арилкарбонил- и алкоксикарбонилкарбаматы (патент США № 5262423); карбаматы
(патент США № 5302584); сложные гидроксиэфиры (патент США № 5362718); пространственно-затрудненные сложные эфиры (патент США № 5385908); гетероциклические сложные эфиры (патент США №
5385909) ; гем-дизамещенные сложные эфиры (патент США №
5385910) ; сложные аминоалкановые эфиры (патент США № 5389639); фосфорилкарбаматые сложные эфиры (патент США № 5391730); сложные карбаматные эфиры (патент США № 5411967); сложные карбаматные эфиры (патент США № 5434260); сложные амидинокарбаматные эфиры (патент США № 5463048); сложные карбаматные эфиры (патент США № 5480988); сложные карбаматные эфиры (патент США № 5480989); сложные карбаматные эфиры (патент США № 5489680); сложные пространственно-затрудненные N-оксидные эфиры (патент США № 5491231); сложные биотиновые эфиры (патент США № 5504091); простые О-алкиловые эфиры (патент США № 5665772) и сложные PEG эфиры рапамицина (патент США № 5780462). Также включены восстановленные продукты, 24-дигидро-, 30-дигидро- и 24,30-тетрагидрорапамициновые аналоги и 28-эпи аналоги (смотрите, например, WO 01/14387) рапамицина или любого из указанных выше соединений, а также сложные эфиры или простые эфиры любого из указанного выше, а также оксимы, гидразоны и гидроксиламины невосстановленных соединений. Смотрите, например, патенты США №№ 5373014, 5378836, 5023264, 5563145 и 5023263.
Не являющийся аналогами рапамицина ингибирующие mTOR соединения в качестве неограничивающих примеров включают, LY294002, Рр242 (каталожный номер Chemdea CD0258), WYE-354 (каталожный номер Chemdea CD0270), Ku-0063794 (каталожный номер
Chemdea CD0274), XL765 (Exelixis; J. Clin. Oncol., 2008, 2008 ASCO Annual Meeting Proceedings 26:15S), AZD8055 (Astrazeneca) , NVP-BEZ235 (Sauveur-Michel et al., Mol. Cancer Ther., 2008, 7:1851), OSI-027 (OSI Pharmaceuticals), вортманнин, кверцетин, мирицентин, стауроспорин и конкурентные ингибиторы АТФ (смотрите патентные заявки США с серийными №№ 11/361213 и 11/361599, каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки).
WYE-354 Ки-0063794
NVP-BEZ235 OSI-027
Другие не являющиеся аналогами рапамицина ингибирующие mTOR соединения, которые можно использовать в способах, наборах и композициях по изобретению включают соединения, описанные в публикация РСТ №№ W02009008992; W02009007750; W02009007751;
W02009007749; W02009007748; W02О08032060; W02008032036; W02008032033; W02008032089; W02008032091; W02008032064; W02008032077; W02008032041; W02008023159; W02008023180; W02007135398; W02007129044; W02007080382; и W02006090169, каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки. Фармацевтические композиции
Композиции ингибиторов mTOR очень хорошо известны в данной области, включая, например, твердые дозированные формы, подходящие для перорального введения для сиролимуса, темсиролимуса, ридафоролимуса и эверолимуса, а также другие композиции темсиролимуса и ридафоролимуса для в./в. введения. Композиции немакролидных ингибиторов mTOR описаны в патентных документах, указанных выше. Соединение 1 можно формулировать вместе с ингибитором mTOR, но, как правило, их формулируют раздельно во избежание осложнения получения состава, и для обеспечения независимого планирования введения и режима дозирования двух средств, и для обеспечения более удобной последующей регуляции дозы каждого из средств.
Дозировка и введение
В соответствии со способами, наборами и композициями по изобретению лечение может состоять из одной дозы или нескольких доз в течение определенного периода времени. Соединение 1 можно вводить отдельно или одновременно с введением ингибитора mTOR. Альтернативно, соединение 1 и ингибитор mTOR можно вводить последовательно. Например, соединение 1 можно вводить до или после введения ингибитора mTOR (например, за один или несколько суток до и/или через одни или несколько суток после).
Введение можно проводить однократно или несколько раз ежедневно, еженедельно (или при каких-либо других интервалов в несколько суток) или в соответствии с периодической схемой, в которой цикл повторяют определенное количество раз (например, 2-10 циклов) или неограниченно.
В зависимости от пути введения эффективные дозы можно рассчитывать в зависимости от массы тела, площади поверхности тела или размера органа подлежащего лечению индивидуума. Специалист в данной области может легко проводить оптимизацию
соответствующих дозировок с учетом фармакокинетических данных, наблюдаемых при клинических испытаниях у человека. Конечный режим дозирования определяет лечащий врач, принимая во внимание различные факторы, которые модифицируют действие лекарственных средств, например, специфическая активность лекарственного средства, тяжесть повреждения и ответную реакцию индивидуума, возраст, состояние, массу тела, пол и диету индивидуума, тяжесть присутствующей инфекции, время введения, использование (или нет) сопутствующих способов лечения и другие клинических факторов. По мере проведения исследований с использований комбинаций по изобретению, появляется дополнительная информация о соответствующих уровнях дозирования и длительности лечения.
При комбинированной терапии по изобретению соединение 1, как правило, вводят в повторяющемся цикле общих суточных доз 10-500 мг соединения 1 перорально каждые сутки. Ингибитор mTOR можно вводить до, после или одновременно с соединением 1, и при тех же или различных схемах дозирования и посредством тех же или различных путей введения. Уровни дозирования для ингибитора mTOR при данной комбинированной терапии, как правило, находятся в диапазоне всего 10-800 мг за неделю лечения, например, в некоторых случаях 35-250 мг/неделю. Таких общих еженедельных уровней дозирования можно достигать с использованием множества путей введения и схем дозирования. Схема дозирования может являться периодической. "Периодическое" дозирование относится к схемам, обеспечивающим промежуточные периоды между дозами, например, дозирование каждые вторые сутки, дозирование каждые третьи сутки, или в более общем смысле, схемы, содержащие "каникулы" между периодами дозирования в течение одних или нескольких суток или недель. Неограничивающие примеры такого периодического дозирования включают дозирование менее семи суток в неделю, а также циклы дозирования из одной недели с дозированием ежедневно*4, ежедневно> <5, ежедневнохб или с ежедневным дозированием с последующим периодом без лекарственного средства, например, в течение одной, двух или трех недель, а затем возобновление лечения лекарственным средством в течение недели с последующей неделей (или неделями)
без лечения лекарственным средством, и т.д. Для дополнительной иллюстрации, введение 60 мг ежедневнохб через неделю обеспечивает еженедельную дозу 360 мг лекарственного средства на периодической основе (т.е. через неделю).
Например, в случае перорального введения, 2-160 мг лекарственного средства можно вводить одни или несколько суток в неделю, например, раз в сутки (ежедневнох7), шесть суток в неделю (ежедневнохб), пять суток в неделю (ежедневнох5) и т.д. Таким образом, эверолимус можно вводить ежедневнох7 при дозах 3-2 0 мг/сутки, например, 5 или 10 мг. Ридафоролимус можно вводить ежедневнох7 перорально при дозах 10-25 мг/сутки, например, 10, 12,5 или 15 мг/сутки; или сиролимус можно вводить при 2 или 4 мг перорально ежедневнох7, в некоторых случаях с ударной дозой б, 8 или 10 мг. Схема дозирования может являться периодической, что можно проиллюстрировать схемами ежедневнох4, ежедневнох5 и ежедневнохб. Примеры включают пероральное введение ингибитора mTOR при 30-100 мг ежедневнох5 или ежедневнохб. Например, в практическом осуществлении настоящего изобретения, ридафоролимус, эверолимус, темсиролимус или сиролимус вводят перорально на уровнях 10-50 мг ежедневнох5. Для определенных показаний желательным может являться введение ридафоролимуса ежедневнох5 на уровнях дозирования 30-50 мг перорально.
Альтернативно желаемого общего уровня воздействия ингибитора mTOR можно достигать посредством различных схем парентеральной доставки. В таких случаях, вводят 10-250 мг ингибитора mTOR, например, посредством в./в. инфузии в течение 15-60 минут, часто 30-60 минут, один или несколько раз в течение периода от 1 до 4 недель. В одном таком подходе ингибитор mTOR вводят посредством в./в. инфузии в течение 30-60 минут однократно каждую неделю в течение трех или четырех недель каждого 4-недельного цикла. Такая в./в. доставка представляет особый интерес в случае ридафоролимуса, сиролимуса и темсиролимуса, которые можно вводить, например, с еженедельными дозами 10-250 мг, например, 25, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 мг/неделю в течение трех или четырех недель каждого
4-недельного цикла. Особенно актуальными являются уровни дозирования 50 и 75 мг. В другом подходе ингибитор mTOR вводят посредством в./в. инфузии 5-25 мг лекарственного средства ежедневнох5 каждые две недели (например, посредством в./в. изфузий с понедельника по пятницу, каждую вторую неделю). Особенно актуальными являются дозы 10, 12,5, 15, 17,5 и 20 мг.
Интерес представляют уровни дозирования и схемы дозирования, уже одобренные или исследуемые для ингибитора mTOR при монотерапии, проводимой как часть комбинированной терапии с соединением 1, как описано в настоящем документе.
Также интерес представляют способы комбинированной терапии, в которых уровни дозирования и/или схемы дозирования приводят к низкой дозе (т.е. менее чем количества, используемые для монотерапии) ингибитора mTOR и/или соединения 1, вводимых индивидууму.
Показания
Способы, наборы и композиции по изобретению можно использовать для лечения нарушений, ассоциированных с патологической клеточной пролиферацией, таких как неоплазии, рак и состояния, ассоциированные с патологическим ангиогенезом. Неограничивающие примеры состояний, ассоциированных с аберрантным ангиогенезом, которые можно лечить с использованием композиций, способов или наборов по изобретению, включают солидные опухоли, диабетическую ретинопатию, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, хроническое воспаление, ожирение и дегенерацию желтого пятна.
Способы, наборы и композиции по изобретению можно использовать для лечения первичных и/или метастазирующих видов рака и других раковых состояний. Например, композиции и способы по изобретению должны быть полезны для уменьшения размера солидных опухолей, ингибирования роста или метастазирования опухолей, лечения различных лимфогенных видов рака и/или продление продолжительности выживания млекопитающих (включая людей), страдающих этими заболеваниями.
Конкретные примеры состояний, ассоциированных с пролиферацией экспрессирующих BCR-ABL клеток, включают рак,
такой как любой рак, описываемый в настоящем документе. Дополнительные виды рака включают хронический миелогенный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз и острый миелогенный лейкоз.
Конкретные примеры состояний, ассоциированных с пролиферацией клеток, экспрессирующих мутантный FLT-3, включают рак и состояния, ассоциированные с раком, такие как любой вид рака, описываемый в настоящем документе. Активирующие мутации в FLT3 являются наиболее общим типом генетической перестройки при остром миелогенном лейкозе (AML). Большинство этих мутаций возникают вследствие внутренней тандемной дупликации (ITD) в околомембранной области рецептора. Могут возникать активирующие точечные мутации в активирующей киназу петле, но с меньшей частотой. При лечении посредством стандартной терапии мутации FLT3-ITD ассоциированы с плохим прогнозом для пациентов с AML и в отношении рецидива, и в отношении общего выживания. Дополнительные состояния включают миелодиспластические синдромы (MDS), такие как рефракторная анемия, рефракторная анемия с избытком бластов (RAEB) (например, RAEBI с 5-9% бластов и RAEBII с 10-19% бластов), рефракторная анемия с кольцеобразными сидеробластами, хронический миеломоноцитарный лейкоз (CMML) и атипический хронический миелогенный лейкоз (a-CML).
Другие примеры состояний включают состояния, ассоциированные с FGFR1, PDGFRa и KIT. Транслокации, влияющие на активность FGFR1 и PDGFRa, найдены в подклассе редких миелопролиферативных неоплазий (MPN). Транслокации, включающие ген FGFR1 и ряд других партнеров по хромосоме, таких как ген FGFR10P2 являются характеристикой миелопролиферативного синдрома (EMS) 8pll, заболевания, при котором у большинства пациентов происходит окончательный и быстрый прогресс до AML. Приблизительно у 10-2 0% пациентов с хроническим эозинофильным лейкозом/идиопатической гиперэозинофилией (CEL/HEL) выявлен слитый белок FIP1L1-PDGFRa, и опубликовано, что эти пациенты хорошо отвечают на ингибирование PDGFR. Также, в положении, аналогичном ключевому остатку T315I BCR-ABL мутирует мутант T674I PDGFRa. Также при AML выявлены активирующие мутации в KIT
(например, cKIT или N822K). Мутации в KIT являются менее частыми и выявлены в конкретных цитогенетических подмножествах AML с общей частотой 2-8%.
Другие примеры состояний включают состояния, ассоциированные с пролиферацией раковых клеток, таких как раковые клетки, приводящие к солидным видам рака. Иллюстративные солидные виды рака включают рак желудка и желудочно-кишечного тракта, рак эндометрия, рак мочевого пузыря, множественную миелому, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак легких, колоректальный рак, рак почки и мультиформную глиобластому.
Примеры видов рака и раковых состояний, которые можно лечить, в качестве неограничивающих примеров включают опухоли головного мозга и центральной нервной системы (например, опухоли оболочек головного мозга, головного мозга, спинного мозга, черепных нервов и других частей ЦНС, такие как глиобластомы или медуллобластомы); рак головы и/или шеи; рак молочной железы; опухоли системы кровообращения (например, опухоли сердца, средостения и плевры и других органов грудной полости, сосудистые опухоли и ассоциированную с опухолью сосудистую ткань); опухоли кровеносной и лимфатической систем
(например, болезнь Ходжкина, болезнь неходжкинской лимфомой, лимфому Беркитта, связанные со СПИД лимфомы, раковые иммунопролиферативные заболевания, множественную миелому, раковые неоплазии из плазматических клеток, лимфоидный лейкоз, миелогенный лейкоз, острый или хронический лимфоцитарный лейкоз, моноцитарный лейкоз, другие лейкозы с конкретным типом клеток, лейкоз с неопределенным типом клеток, неуточненные раковые неоплазии лимфоидной, гемопоэтической и родственных тканей, такие как диффузная крупноклеточная лимфома, Т-клеточная лимфома или кожная Т-клеточная лимфома); опухоли выделительной системы (например, почки, почечной лоханки, мочеточника, мочевого пузыря и других органов системы мочевыделения); опухоли желудочно-кишечного тракта (например, пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстой кишки, колоректальную, соединения прямой и сигмовидной кишок, прямой
кишки, ануса и анального канала); опухоли, вовлекающие печень и внутрипеченочные желчные протоки, желчный пузырь и другие части желчных путей, поджелудочную железу и другие органы пищеварения; опухоли полости рта (например, губ, языка, десен, дна полости рта, твердого неба, околоушной железы, слюнных желез, миндалины, ротоглотки, носоглотки, грушевидного синуса, гортанной части глотки и других участков ротовой полости); опухоли репродуктивной системы (например, наружных половых органов, влагалища, шейки матки, матки, яичника и других участков, связанных с женскими половыми органами, плаценты, полового члена, предстательной железы, семенников и других участков, связанных с мужскими половыми органами); опухоли дыхательных путей (например, носовой полости, среднего уха, придаточных пазух, гортани, дыхательного горла, бронхов и легких, такие как мелкоклеточный рак легких и немелкоклеточный рак легких); опухоли костной системы (например, костей и суставного хряща конечностей, суставного хряща костей и других участков); опухоли кожи (например, меланома рака кожи, не являющаяся меланомой рака кожи, базально-клеточная карцинома кожи, плоскоклеточная карцинома кожи, мезотелиома и саркома Капоши) и опухоли, включающие другие ткани, включая опухоли периферических нервов и автономной нервной системы, опухоли соединительной и мягкой тканей, забрюшинного пространства и брюшной полости, глаз и смежных органов, щитовидной железы, надпочечник и другие эндокринные железы и связанные структуры, вторичные и неуточненные раковые неоплазии лимфоузлов, вторичную раковую неоплазию дыхательной и пищеварительной систем и вторичные раковые неоплазии других участков.
Более конкретно, наборы, композиции и способы по изобретению можно использовать для лечения сарком. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы по настоящему изобретению применяют для лечения рака мочевого пузыря, рака молочной железы, хронического лимфоидного лейкоза, рака головы и шеи, рака эндометрия, неходжкинской лимфомы,
немелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака поджелудочной железы и рака предстательной железы.
Опухоли, которые преимущественно можно лечить с использованием композиций и способов по настоящему изобретению, включают опухоли с дефицитом PTEN (смотрите, например, M.S. Neshat et al. , PNAS, 2001, 98: 10314-10319; К. Podsypanina et al., PNAS, 2001, 98: 101320-10325; G.B. Mills et al. , PNAS, 2001, 98: 10031-10033 и M. Hidalgo and E.K. Rowinski, Oncogene, 2000, 19: 6680-6686). Как уже указано выше, киназа FRAP/mTOR расположена ниже пути передачи сигнала фосфатидилинозитол-3-киназа/Akt, который активирован во многих видах рака вследствие потери гена опухолевого супрессора PTEN. Опухоли с дефицитом PTEN можно идентифицировать с использованием анализа генотипа и/или в культуре in vitro и исследования образцов биопсии опухоли. Неограничивающие примеры видов рака, включающих аномалии в пути фосфатидилинозитол-З-киназа/Akt-mTOR в качестве неограничивающих примеров включают глиому, лимфому и опухоли легких, мочевого пузыря, яичника, эндометрия, предстательной железы или шейки матки, которые ассоциированы с аномальными рецепторами факторов роста (например, EGFR, PDGFR, IGF-R и IL-2); опухоли яичника, которые ассоциированы с аномалиями в Р13-киназе; меланому и опухоли молочной железы, предстательной железы или эндометрия, которые ассоциированы с аномалиями в PTEN; раки молочной железы, желудка, яичника, поджелудочной железы и предстательной железы, ассоциированные с аномалиями в Akt; лимфому, рак молочной железы или мочевого пузыря и карциному головы и шеи, ассоциированные с аномалиями в elF-4E; лимфому мантийных клеток, рак молочной железы и карциномы головы и шеи, ассоциированные с аномалиями в циклине D; и семейную меланому и карциномы поджелудочной железы, ассоциированные с аномалиями в Р16.
Наборы, композиции и способы по изобретению также можно использовать для лечения заболеваний с аберрантным ангиогенезом, таких как диабетическая ретинопатия, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, хроническое воспаление, ожирение, дегенерация желтого пятна и сердечно-сосудистое заболевание.
Фармацевтические наборы
Для практического осуществления изобретения доступен широкий спектр других альтернатив для упаковки. Фармацевтические наборы по изобретению содержат один или несколько контейнеров (например, флаконы, ампулы, тестовые пробирки, колбы или бутылки), содержащих один или несколько ингредиентов фармацевтической композиции, включая соединение 1 и/или ингибитор mTOR, предусматривающие введение соединения 1 отдельно или ингибитора mTOR и соединения 1 совместно или одновременно. Наборы необязательно содержат инструкции для дозирования, введения и/или о группе пациентов, подлежащих лечению.
Различные ингредиенты фармацевтической упаковки можно поставлять в твердой (например, лиофилизированной) или жидкой форме. Каждый ингредиент, как правило, находится в виде аликвот в его соответствующем контейнере или его поставляют в концентрированной форме. Фармацевтические упаковки или наборы могут включать среды для восстановления лиофилизированных ингредиентов. Индивидуальные контейнеры набора предпочтительно содержать в закрытой оболочке для продажи.
Альтернативно, соединение 1 и ингибитор mTOR формулируют для перорального введения (например, наборы, содержащие соединение 1 в единичной дозированной форме для пероральной доставки и любой из ридафоролимуса, сиролимуса или эверолимуса, также в единичной дозированной форме для пероральной доставки). Продукты, формулируемые для перорального введения, например, капсулы, таблетки и т.д., можно упаковывать в блистерные упаковки, которые можно располагать и/или маркировать в соответствии с выбранной схемой дозирования.
Приведенные ниже примеры приведены для предоставления специалистам в данной области полного представления и описания осуществления, получения и оценки способов и соединений, заявляемых в настоящем документе, и предназначены исключительно для иллюстрации изобретения и не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения рассматривают как их изобретение.
Пример 1: Ингибирование BCR-ABL и мутантов при хроническом миелогенном лейкозе
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ
Ингибиторы: Иматиниб растворяли в PBS с получением 10,0 мМ исходного раствора, распределяли в 10-мкл аликвоты и хранили при -2 0°С. Соединение 1, нилотиниб и дазатиниб растворяли в ДМСО с получением 10,0 мМ исходных растворов, распределяли в 10-мкл аликвоты и хранили при -2 0°С. Непосредственно перед использованием в каждом эксперименте проводили серийные разведения 10,0 мМ исходных растворов. Соединение 1 (3-
(имидазо[1,2-Ь]пиридазин-3-илэтинил)-4-метил-Ы-(4-((4-метилпиперазин-1-ил)метил)-3-(трифторметил)фенил)бензамид) можно получать, как описано в настоящем документе.
Кристаллизация и определение структуры комплекса ABLT3151: соединение 1: Киназный домен ABLT3151 мыши (остатки 229515) коэкспрессировали с белком тирозинфосфатазы YopH в Е. coli и очищали как опубликовано ранее (ссылка) . Очистку ABLT3151 проводили в присутствии соединения 1 почти до гомогенности
(больше 95%) с использованием комбинации металлоаффинных, Mono Q и гель-фильтрационных хроматографических колонок. Стандартный выход конечной очищенной ABLT3151, связанной с соединением 1, составлял приблизительно 1 мг/л. Сокристаллы ABLT3151 и соединения 1 выращивали способом диффузии паров из висячей капли при 4°С посредством смешивания равных объемов комплекса соединения 1:ABLT3151 (25 мг/мл) и раствора для лунок (30% масс./об. полиэтилен 4000, 0,2 М ацетат натрия, 0,1 М Tris-HCl, рН 8,5) . Через 1-2 суток кристаллы достигали характерного размера 50x50x300 мкм3, и их собирали в маточный раствор, дополненный 30% об./об. глицерином в качестве криопротектора. Данные рентгенодифракции получали при 10 0К с пучком излучения с ВМ 19 (Advanced Photon Service, Argonne, IL) . Данные индексировали и масштабировали в пространственную группу Р21 с использованием пакета HKL2000. Структуру соединения 1 в комплексе с ABLT3151 определяли посредством молекулярного замещения AMoRe с использованием структуры природной ABL, связанной с иматинибом (код PDB: 1IEP) . Наблюдали две молекулы
ABLT3151 в ассиметричном блоке. Структуру уточняли с использованием CNX в комбинации с ручной перестройкой в Quanta (Accelrys Inc., San Diego, CA), и после нескольких циклов уточнений и построения модели в плотность встраивали соединение 1. Проводили дополнительное уточнение и построение модели до достижения совмещения. Конечная модель, уточненная до 1,95 А, состоит из остатков от 228 до 511, за исключением 386-397 в активационной петле, которые оставляют неупорядоченными. Электронная плотность связанного ингибирующего соединения 1, а также боковой цепи 1315, хорошо разрешалась в обоих комплексах, не оставляя неопределенности в отношении способа связывания ингибитора.
Анализы аутофосфорилирования ABLT3151: Анализы
аутофосфорилирования киназы с полноразмерными
дефоспорилированными по тирозину ABL и ABLT3151 (Invitrogen; San Diego, CA) проводили, как описано ранее (О'Hare et al., Blood 104:2532 (2004)) в присутствии иматиниба, нилотиниба, дазатиниба или соединения 1. Используемые концентрации ингибитора составляли: 0, 0,1, 1, 10, 100, 1000 нМ.
Клеточные линии: Трансфектантов Ba/F3 (экспрессирующих полноразмерную природную BCR-ABL или BCR-ABL с одной мутацией в киназном домене) содержали в RPMI 1640, дополненной 10% ЭТС, 1 единицей/мл пенициллина G и 1 мг/мл стрептомицина (полная среда) при 37°С и 5% СОг. Клеточная линия Ba/F3,
Т315А ^ ^
экспрессирующая BCR-ABL представляла собой любезный подарок Dr. Neil Shah, UCSF. Родительские клетки Ba/F3 дополняли IL-3, предусмотренного в кондиционированных средах WEHI. Перед анализами клеточной пролиферации, из каждой клеточной линии Ba/F3 выделяли РНК, и мутации в киназном домене подтверждали посредством ОТ-ПЦР с последующим анализом последовательности ДНК с использованием программного обеспечения Mutation Surveyor (SoftGenetics, State College, PA).
Анализы клеточной пролиферации: Клеточные линии Ba/F3 распределяли в 9б-луночные планшеты (4> <103 клеток/лунку) и инкубировали с возрастающими концентрациями соединения 1 в течение 72 час. Концентрации ингибитора, используемые для
определений IC50 в линиях, экспрессирующих природную или мутантную BCR-ABL составляли: 0, 0,04, 0,2, 1, 5, 25, 125 и 625 нМ. Концентрации ингибитора, используемые для определений IC50 в исходных клетках Ba/F3 составляли: 0, 1, 5, 25, 125, 625, 3125 и 10000 нМ. Пролиферацию определяли с использованием анализа жизнеспособности на основе метантиосульфоната (MTS) (реагент CellTiter96 Aqueous One Solution Reagent; Promega, Madison, WI) . Значения IC50 регистрируют как среднее трех независимых экспериментов, проводимых в четырех повторениях. Для экспериментов с пролиферацией клеток с клетками CML или нормальными первичными клетками, выделяли мононуклеарные клетки на градиентах фиколла (GE Healthcare) из периферической крови пациентов с миелогенным бластным кризом (М-ВС) CML или здоровых индивидуумов. Клетки высевали в 9б-луночные планшеты (5> <104 клеток/лунку) при ступенчато изменяющихся концентрациях соединения 1 (0-1000 нМ) в RPMI, дополненную 10% FBS, L-глутамином, пенициллином/стрептомицином и 100 мкМ р-меркаптоэтанолом. Через 72 часа инкубации, оценивали жизнеспособность клеток, подвергая клетки анализу с MTS. Все значения нормализовали на контрольные лунки с отсутствием лекарственного средства.
Фосфорилирование CrkL в клеточных линиях Ba/F3: Клетки Ba/F3, экспрессирующие природную BCR-ABL или BCR-ABLT3151 (5хЮ6 на лунку) культивировали 4 часа в RPMI, дополненной 10% FBS, L-глутамином и пенициллином/стрептомицином в отсутствие ингибитора или в присутствии иматиниба (2 000 нМ) , дазатиниба (50 нМ) , нилотиниба (500 нМ) или соединения 1 (0, 1-1000 нМ) . Клетки сразу же лизировали в кипящий буфер для нанесения на SDS-PAGE, дополненный ингибиторами протеаз и фосфатаз. Лизаты подвергали SDS-PAGE и проводили иммуноблоттинг с антителом к CrkL С-2 0 (Santa Cruz). Фосфорилированные и нефосфорилированные CrkL различали на основе различающейся подвижности полос и интенсивности сигнала полос количественно определяли посредством денситометрии на Lumi Imager (Roche) и выражали в виде % фосфорилированного CrkL.
Воздействие соединения 1 на полученные у пациентов образцы
BCR-ABLT3151 ex vivo: После получения информированного согласия посредством центрифугирования на фиколле выделяли мононуклеарные клетки периферической крови у пациента с CML в лимфоидном бластном кризе (L-BC CML) с мутацией BCR-ABLT3151. 0Т-ПЦР и анализ последовательности подтвердил, что образец преимущественно содержал мутантную BCR-ABLT3151. Мононуклеарные клетки (5x106 клеток/лунку) культивировали в течение ночи в не содержащей сыворотку среде IMDM (Invitrogen), дополненной 20% BIT (StemCell), 40 мкг/мл липопротеином человека низкой плотности и 100 мкМ р-меркаптоэтанолом, в отсутствие ингибитора или в присутствии иматиниба (1000 нМ) , дазатиниба (50 нМ) , нилотиниба (200 нМ) или соединения 1 (50 нМ, 500 нМ) . Клетки сразу же лизировали в кипящий буфер для нанесения на SDS-PAGE, ингибиторами протеаз и фосфатаз. Лизаты подвергали SDS-PAGE и проводили иммуноблоттинг с антителом к CrkL С-2 0 (Santa Cruz). Фосфорилированные и нефосфорилированные CrkL различали на основе различающейся подвижности полос. Интенсивности сигнала полос количественно определяли посредством денситометрии на Lumi Imager (Roche).
Общее фосфорилирование тирозина посредством FACS: Мононуклеарные клетки (2хЮ5) культивировали в течение ночи в не содержащей сыворотку среде в отсутствие ингибитора или в присутствии иматиниба (1000 нМ) , дазатиниба (50 нМ), нилотиниба (2 00 нМ) или ступенчато изменяющихся концентраций соединения 1 (50, 500 нМ). Клетки фиксировали и пермеабилизировали по инструкциям производителя (Caltag; San Diego, CA), инкубировали с 2 мкг антитела к фосфотирозину 4G10-FITC (BD Biosciences, San Jose, CA) в течение 1 часа, дважды отмывали PBS, дополненным 1% BSA и 0,1% азидом натрия, и фиксировали в 1% формальдегиде. Интенсивность сигнала FITC анализировали на устройстве FACSAria (BD) и рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Значения регистрируют как кратность увеличения MFI относительно неокрашенных контролей.
Анализы гемопоэтических колониеобразующих первичных клеток CML и нормального костного мозга: Для оценки действия соединения 1 на первичные клетки CML, несущие BCR-ABLT3151 и
нормальные гемопоэтические предшественники, мононуклеарные клетки костного мозга, выделяемые центрифугирование на градиенте плотности фиколла, культивировали со ступенчато изменяющимися концентрациями соединения 1 (пациент с CML: О, 10, 25, 50 нМ; здоровый индивидуум: 0, 100, 200, 500, 1000 нМ). Клетки высевали в трех повторениях (5x104 клеток/чашку) в 1 мл среды IMDM:метилцеллюлоза (1:9 об./об.), содержащей 50 нг/мл SCF, 10 нг/мл GM-CSF и 10 нг/мл IL-3 (Methocult GF Н4534; Stem Cell Technologies, Vancouver, British Columbia, Canada) для оценки образования колоний гранулоцитов/макрофагов (КОЕ-ГМ). Клетки культивировали при 37°С в увлажненном инкубаторе в течение 14-18 суток. В качестве критерия положительной оценки колоний подсчитывали колонии с больше 50 клеток/колонию. Результаты регистрируют в виде процента колоний относительно необработанного контроля±ЭЕМ.
Фармакокинетика: Фармакокинетический профиль соединения 1 (в цитратном буфере, рН 2,74) оценивали у самок мышей CD-I после однократной дозы, вводимой посредством перорального принудительного кормления. В различные моменты времени получали образцы крови, и определяли концентрации соединения 1 в плазме по внутреннему стандарту способом LC/MS/MS с использованием осаждение белков и калибровочных стандартов, получаемых из плазмы контрольных мышей. Регистрируемые концентрации представляют собой средние значения из 3 мышей/момент времени/группу дозирования.
Модель выживания с Ba/F3: Клетки Ba/F3, экспрессирующие природную BCR-ABL или BCR-ABLT3151, инъецировали в хвостовую вену самок мышей SCID (100 мкл суспензии 1хЮ7 клеток/мл в не содержащей сыворотку среде). Начиная с 72 часов после этого, мышей ежедневно однократно обрабатывали посредством перорального принудительного кормления носителем (25 мМ цитратный буфер, рН 2,75), соединением 1 или дазатинибом в течение срока до 19 последовательных суток. Животных умерщвляли при наступлении агонии в соответствии руководствами IACUC и оценка мышей при вскрытии согласовывалась с гибелью вследствие спленомегалии, вызываемой инфильтрацией опухолевых клеток.
Данные о выживании анализировали с использованием способа Каплана-Мейера, а статистическую значимость оценивали с использованием логарифмического рангового критерия (GraphPad PRISM), сравнивая время выживания в каждой обработанной группе с группой с носителем. Статистически значимым считали значение р <0,05, и р <0,01 считали статистически высокозначимым.
Модель опухоли Ba/F3: Клетки Ba/F3, экспрессирующие BCR-ABL1,3151, подкожно имплантировали в правый бок самок "голых" мышей (100 мкл клеточной суспензии 1> <107 клеток/мл в не содержащей сыворотку среде). Для анализа эффективности, когда средний объем опухоли достигал 500 мм3, мышей случайным образом распределяли в различные группы обработки. Мыши ежедневно однократно обрабатывали посредством перорального
принудительного кормления носителем (25 мМ цитратный буфер, рН 2,75) или соединением 1 в течение срока до 19 последовательных суток. Объем опухоли (мм3) рассчитывали с использованием следующей формулы: объем опухоли^хЭД2х 0,5. Для определения ингибирование роста опухоли после окончания периода обработки, у всех животных рассчитывали объем опухоли с использованием формулы AV= (Тконечный-Тисходный)/ТИСходныйх100, где Тисходный представляет собой объем опухоли в начале лечения и Тконечный представляет собой объем в момент умерщвления животного. Среднее изменение объема опухоли в каждой группе обработки сравнивали с другими группами с использованием одностороннего критерия ANOVA (GraphPad PRISM) и с группой мышей, обработанных носителем, для определения статистической значимости с использованием критерия Даннета, где статистически значимым считали значение р <0,05, а р <0,01 считали статистически высокозначимым. Для анализа уровней фосфорилированных по тирозину BCR-ABL и CrkL, несущих опухоль животных (средний размер опухоли: 50 0 мм3) обрабатывали однократной дозой носителя или 30 мг/кг соединения 1 посредством перорального принудительного кормления. Через шесть часов после дозирования мышей (N=3/rpynny), животных умерщвляли и собирали образцы опухолей для анализа вестерн-блоттингом с антителами к pBCR-ABL и eIF4E (Cell Signaling Technology) и ко всему CrkL (С-20; Santa Cruz).
Ускоренный мутагенез на основе скрининга клеток с соединением 1 в качестве единственного средства: Клетки Ba/F3, экспрессирующие природную BCR-ABL, обрабатывали в течение ночи Ы-этил-Ы-нитрозомочевиной (ENU; 50 мкг/мл), осаждали, ресуспендировали в свежей среде и распределяли в 9б-луночные планшеты при плотности 1> <105 клеток/лунку в 2 00 мкл полной среды, дополненной ступенчато изменяющимися концентрациями соединения 1. На всем протяжении эксперимента
продолжительностью 2 8 суток каждые двое суток проводили наблюдение за ростом клеток в лунках посредством визуального осмотра в инвертированном микроскопе и за изменением окраски среды. Содержимое лунок, в которых наблюдали разрастание клеток, переносили в 24-луночный планшет, содержащий 2 мл полной среды, дополненной соединением 1 в той же концентрации, как исходный 9б-луночный планшет. Если рост наблюдали одновременно во всех лунках при данных условиях, проводили наращивание в 2 4 характерных лунках для дополнительного анализа. При достижении конфлуэнтности клетки из 24-луночных планшетов собирали посредством центрифугирования. Из клеточных осадков выделяли ДНК с использованием набора DNEasy Tissue
(QIAGEN, Inc., Valencia, CA). Киназный домен BCR-ABL амплифицировали с использованием праймеров В2А (5'-TTCAGAAGCTTCTCCCTGACAT-3') и ABL4317R (5'-AGCTCTCCTGGAGGTCCTC-3' ) , продукты ПЦР секвенировали в двух направлениях у коммерческого партнера (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA) с использованием праймеров ABL3335F (5'-ACCACGCTCCATTATCCAGCC-3 ' ) и ABL4275R (5'-CCTGCAGCAAGGTAGTCA-3')/ и хроматограммы анализировали на мутации с использованием программного обеспечения Mutation Surveyor (SoftGenetics, State College, PA). Результаты этого скрининга регистрируют как суммарные данные из трех независимым экспериментов (смотрите таблицу 2). Также, в одиночных независимых экспериментах, проводили скрининг мутагенеза, как описано выше, для соединения 1 в качестве единственного средства, начиная с клеток Ba/F3, экспрессирующих BCR-ABL (смотрите таблицу 3) или BCR-ABL
(смотрите таблицу 4).
РЕЗУЛЬТАТЫ
(1) Рентгеноструктурный анализ соединения 1 в комплексе с ABLT3151
Недавние рентгеноструктурные исследования позволили выявить, что мутация T315I в киназном домене мутантной ABL действует как простая точковая мутация, предотвращающая формирование каждым из иматиниба, нилотиниба и дазатиниба водородной связи, в ином случае образующейся с боковой цепью Т315 в природной ABL. Режим связывания DFG-out соединения 1 и общая сеть контактов с белком сходны с таковыми у иматиниба, за исключением по меньшей мере одного важного различия: этинильная связь в соединении 1 располагает молекулу с устранением стерического препятствия, наблюдаемого у других ингибиторов, и позволяет эффективные ван-дер-ваальсовые взаимодействия с 1315.
(2) Соединение 1 ингибирует каталитическую активность ABLT3151
Авторы тестировали активность соединения 1 по сравнению с иматинибом, нилотинибом и дазатинибом в биохимических анализах с очищенными дефосфорилированными полноразмерными белками природной киназы ABL и киназы ABLT3151. В то время как ферментативную активность природной ABL снижал каждый из ингибиторов, против мутанта ABLT3151 эффективным являлось только соединение 1, как измеряли посредством аутофосфорилирования in vitro [у-32Р]-АТФ полноразмерной киназы ABLT3151. Сходное эффективное ингибирование соединением 1 наблюдали для дополнительных тестируемых клинически значимых устойчивых к иматинибу мутантных ABL, включая ABLG250E, ABLY253F и ABLE255K. Эти результаты доказывают, что соединение 1 непосредственно направлено на природную и мутантную по киназному домену киназу ABL, включая мутантную киназу ABLT3151.
(3) Соединение 1 ингибирует рост клеток Ba/F3, экспрессирующих природную или мутантную BCR-ABL, включая BCR-ABLT3151
Проводили анализы клеточной пролиферации с исходными клетками Ba/F3 и клетками Ba/F3, экспрессирующими природную BCR-ABL или BCR-ABL с одной мутацией в киназном домене (M2 4 4V,
G250E, Q252H, Y253F, Y253H, Е255К, E255V, Т315А, T315I, F317L, F317V, М351Т, F359V или Н396Р). Соединение 1 эффективно ингибировало пролиферацию клеток Ba/F3, экспрессирующих природную BCR-ABL (IC50: 0,5 нМ) . Характерно, что чувствительными к соединению 1 оставались все тестируемые мутантные BCR-ABL (IC50: 0,5-36 нМ; таблица 1), включая мутантную BCR-ABLT3151 (IC50: 11 нМ) . Окрашивание аннексином V продемонстрировало, что ингибирование пролиферации соединением 1 коррелировало с индукцией апоптоза (данные не показаны). Ингибирование роста исходных клеток Ba/F3 не достигало IC50 до концентрации соединения 1 1713 нМ, указывая на то, что ингибирующее действие связано с ингибированием BCR-ABL.
Авторы также тестировали соединение 1 против панели полученных у пациентов клеточных линий, положительных и отрицательных по BCR-ABL. В то время как авторы наблюдали эффективное ингибирование роста клеток К562, KY01 и LAMA (полученных у пациентов с CML в бластном кризе), значимой активности против трех различных отрицательных по BCR-ABL лейкозных клеточных линий, где IC50 была сравнима с IC50 исходных клеток Ba/F3 или большей нее (таблица 1), не наблюдали.
Таблица 1
Значения IC50 для соединения 1 в анализах клеточной
пролиферации
Клеточные линии
АР24534 1С50 (нМ)
Клетки Ba/F3
Природная BCR-ABL
0,5
M2 4 4V
2,2
G250E
4,1
Q252H
2,2
Y253F
2, 8
Y253H
б, 2
Е255К
E255V
Т315А
1, б
T315I
F317L
1,1
F317V
М351Т
1,5
F359V
Н396Р
1,1
Исходные
1713
Лейкозные клетки CML
К562
3,9
KY01
0,4
LAMA
0,3
Лейкозные клетки не из CML
Marimo
2215
HEL
2522
СМК
1652
(4) Соединение 1 ингибирует опосредованную BCR-ABL передачу сигналов в клетках, экспрессирующих BCR-ABLT3151
Для подтверждения направленного ингибирования в клетках Ba/F3, экспрессирующих природную BCR-ABL или BCR-ABLT3151, авторы исследовали состояние фосфорилирования тирозина у BCR-ABL и непосредственного субстрата BCR-ABL CrkL (фиг.1). Контроль за состоянием фосфорилирование тирозина у CrkL обеспечивает подходящие средства оценки киназной активности BCR-ABL в первичных клетках человека, и представляет собой предпочтительный фармакодинамический анализ при клинических испытаниях CML, включающих новые BCR-ABL (Druker et al., N. Engl. J. Med. 344:1031 (2001); Talpaz et al., N. Engl. J. Med. 354:2531 (2006)), так как прямое измерение состояние фосфорилирования тирозина у фосфорилированной BCR-ABL в лизатах первичных клеток невозможно вследствие неустойчивости к протеолизу. Для сравнения включали клинические ингибиторы ABL иматиниб, нилотиниб и дазатиниб. В анализе смещения CrkL в геле процент фосфорилированного по тирозину CrkL в прямой ответ на ингибирование BCR-ABL снижался. Хотя против клеток Ba/F3, экспрессирующих природную BCR-ABL были эффективны все из
тестируемых ингибиторов (фиг.1А), только соединение 1 продемонстрировало активность против мутанта T315I (фиг.1В). Ингибирование фосфорилирования BCR-ABL наблюдали в параллельных экспериментах в клетках Ba/F3, экспрессирующих природную BCR-ABL или BCR-ABLT3151. Фосфорилирование BCR-ABL оценивали в клетках Ba/F3, экспрессирующих природную BCR-ABL или BCR-ABL1,3151, обрабатываемых в течение ночи иматинибом, нилотинибом, дазатинибом или соединением 1. Образцы анализировали в анализе посредством иммуноблоттинга с антителами к pBCR-ABL и eIF4E (контроль загрузки).
(5) Обработка первичных клеток CML соединением 1 ингибирует клеточную пролиферацию
Для оценки эффективности соединения 1 в отношении первичных клеток, полученных у пациентов с контролируемым BCR-ABL лейкозом, авторы подвергали мононуклеарные клетки пациентов с миелогенным бластным кризом CML или здоровых индивидуумов воздействию ступенчато изменяющихся концентраций соединения 1 и оценивали жизнеспособные клетки через 72 часа. В соответствии с биохимическими данными и данными о жизнеспособности клеточных линий соединение 1 индуцировало селективное снижение количества жизнеспособных клеток со значениями IC50 приблизительно в 500 раз меньшими для первичных клеток CML по сравнению с нормальными клетками (фиг.2А).
(6) Соединение 1 ингибирует киназную активность BCR-ABLT3151 и формирование колоний у первичных клеток CML с минимальной токсичностью для нормальных клеток
Для оценки направленного ингибирования после воздействия ex vivo соединения 1 на мононуклеарные клетки, полученные у пациента с лимфоидным бластным кризом CML с мутацией T315I, авторы проводили анализ, сходный с анализом, описанным для клеточных линий Ba/F3, где клетки инкубировали в течение ночи в присутствии ингибиторов, собирали и лизировали и анализировали на наличие фосфорилирования CrkL посредством иммуноблоттинга. Воздействие соединением 1 приводило к восстановлению сигнала фосфорилированного CrkL, тогда как ни один из других трех клинических ингибиторов ABL эффекта не продемонстрировали
(фиг.2В), и сходные результаты получали при анализе общего фосфорилирования тирозина клеток этого пациента посредством FACS (фиг.2С).
Авторы также оценивали эффективность соединения 1 в анализах формирования миелогенных колоний с использованием мононуклеарных клеток пациента с CML в ускоренной фазе, несущих BCR-ABLT3151, и здорового индивидуума. Клетки высевали в метилцеллюлозу в присутствии ингибитора, культивировали в течение приблизительно 14-18 суток и подсчитывали под инвертированным микроскопом. В то время как ни нилотиниб, ни дазатиниб не продемонстрировали на клетки пациента с T315I никакого эффекта, соединение 1 ингибировало формирование колоний зависимым от концентрации образом (фиг.ЗА). В отличие от этого, соединение 1 в отношении нормальных гемопоэтических клеток при концентрациях ниже 500 нМ токсичности не продемонстрировало (фиг.ЗВ), что согласовывалось с анализами клеточной пролиферации, проводимыми с использованием нормальных клеток (фиг.2А).
(7) Пероральный прием соединения 1 продлевает выживание и снижает опухолевую нагрузку у мышей с зависимым от BCR-ABLT3151 заболеванием
Для исследования фармакокинетического профиля соединения 1 in vivo мышам CD-I вводили одну дозу соединения 1 (2,5 или 3 0 мг/кг) посредством перорального принудительного кормления и измеряли концентрации соединения 1 в плазме посредством LC/MS/MS через 2, б и 24 часа после дозирования. Соединение 1 являлось перорально биодоступным с достижением средних уровней в плазме у мышей, обработанных дозой 2,5 мг/кг 89,6, 58,2 и 1,9 нМ через 2, б и 24 часа, соответственно. При повышении дозы до 30 мг/кг, средние уровни в плазме достигали 781,7, 561,3 и 7,9 нМ через 2, б и 24 часа, соответственно. Между дозами 2,5 мг/кг (AUCo-24 чаС: 767 нмоль -час/мл) и 30 мг/кг (AUC0-24 чаС: 7452 нмоль-час/мл) наблюдали пропорциональность доза-воздействие. Вместе эти данные демонстрируют, что уровни соединения 1 в крови, превышающие значения IC50 in vitro для всех тестируемых мутантных BCR-ABL, можно поддерживать в течение нескольких
часов с использованием умеренных пероральных доз.
Затем авторы оценивали активность соединения 1 in vivo в нескольких общепринятых моделях CML на мышах. Сначала активность исследовали в модели выживания, в которой клетки Ba/F3, экспрессирующие природную BCR-ABL, инъецировали внутривенно в хвостовые вены мышей. Как показано на фиг.4А, обработка соединением 1 или дазатинибом продлевала выживание по сравнению со средней выживаемостью у обработанных носителем мышей 19 суток. Ежедневное пероральное дозирование 5 мг/кг дазатиниба, для которого опубликовано, что оно является эффективной схемой лечения (Lombardo et al., J. Med. Chem. 47:6658 (2004)), продлевало среднюю выживаемость до 27 суток (р <0,01). Подобным образом, ежедневное пероральное дозирование 2,5 и 5 мг/кг соединения 1 продлевало время средней выживаемости до 27,5 и 30 суток, соответственно (р <0,01 для обоих уровней дозирования).
Затем активность соединения 1 оценивали в этой же модели выживания с использованием клеток Ba/F3, экспрессирующих BCR-ABL1,3151. По сравнению с обработанными носителем мышами, средняя выживаемость у которых составляла 16 суток, обработка соединением 1 (в течение срока до 19 суток) продлевала выживание зависимым от дозы образом (фиг.4В). В то время как ежедневное пероральное дозирование 2,5 мг/кг соединения 1 увеличивало среднюю выживаемость только на 0,5 суток (р> 0,05), соединение 1, дозируемое при 5, 15 и 2 5 мг/кг, значимо продлевало среднюю выживаемость до 19,5, 26 и 30 суток, соответственно (р <0,01 для всех трех уровней дозирования). В отличие от этого, независимое параллельное исследование с использованием этой модели выживания с T315I подтвердило отсутствие различий в средней выживаемости у мышей обработанных носителем или дазатинибом (фиг.5).
Противоопухолевую активность соединения 1 дополнительно анализировали в модели с ксенотрансплантатом, в которой клетки Ba/F3, экспрессирующие BCR-ABLT3151, подкожно инъецировали мышам. Рост опухоли по сравнению с обработанными носителем мышами ингибировался соединением 1 зависимым от дозы образом (фиг.4С)
со значимым ингибированием роста опухоли при ежедневном пероральном дозировании 10 и 30 мг/кг (%Т/С=68% и 20%, соответственно; р <0,01 для обоих уровней дозирования). Ежедневное пероральное дозирование 50 мг/кг соединение 1 вызывало значимый регресс опухоли (%Т/С=0,9%, р <0,01), с 96% снижением среднего объема опухоли при последнем измерении по сравнению с началом лечения. Для подтверждения направленного ингибирования оценивали уровни фосфорилированной BCR-ABLT3151 и фосфорилированного CrkL в опухолях мышей, получаемых через б часов после однократного дозирования носителя или соединения 1. Как представлено на фиг.4С, однократное пероральное дозирование 3 0 мг/кг заметно снижало уровни фосфорилированной BCR-ABL и фосфорилированного CrkL.
(8) Соединения 1 в качестве единственного средства достаточно для полного подавления разрастания устойчивых субклонов
Для исследования на потенциальные участки восприимчивости к устойчивости, не исследованные в панели клеточной пролиферации Ba/F3, в особенности на специфичные для соединения 1 мутации (например, в остатках контакта ингибитор-фермент) и для определения того, обеспечивает ли соединение 1 преимущество над остальными ингибиторами в качестве единственного средства, авторы тестировали это соединение в разработанном авторами анализе ускоренного мутагенеза, который они предварительно проверили на иматинибе, нилотинибе и дазатинибе.
В ряде экспериментов, начиная с клеток Ba/F3, экспрессирующих природную BCR-ABL, авторы устанавливали профиль устойчивости при различных концентрациях соединения 1 (5-4 0 нМ) и выявили зависимое от концентрации снижение в проценте лунок с разрастанием и в диапазоне наблюдаемых мутаций (фиг.бА). При 5 нМ соединения 1, все лунки (576/576) демонстрировали разрастание и 90% секвенированных характерных субклонов экспрессировали природную BCR-ABL (таблица 2) . Увеличение концентрации соединения 1 до 10 нМ приводило к заметному снижению разрастания (168/1440 лунок; 11,7%) и увеличению частоты мутантных субклонов (33,1%; таблица 2). Выявляемые
мутации включали их возникновение в нескольких остатках Р-петли (G250, Q252, Y253 и Е255), кластер в С-спирали или рядом с ней (К285, Е292 и L298) и Т315 (T315I), F317, V339, F359, L387 и S438. Среди выявляемых мутаций почти все ранее выявляли при устойчивости к иматинибу (или при устойчивости к нилотинибу или дазатинибу) (рассмотрено в О'Hare et al., Blood 110:2242 (2007)). Новых мутаций, специфичных для соединения 1 не выявляли. Положения Y2 53, Т315 и F317 представляют собой остатки контакта, а К285 расположен рядом с ключевым участником в водородной связи, Е286.
Так как мутации, сохраняющиеся при концентрации, которая полностью подавляет T315I, вероятно представляют собой основные проблемы в отношении устойчивости к соединению 1, авторы затем исследовали 2 0 нМ соединения 1 и выявили, что разрастание резко сокращалось (3/144 0 лунок; 0,2%; фиг.бА, таблица 2), с сохранением только двух мутаций, E255V и T315I. Таким образом, в пределах обширного исследования авторов изобретения не идентифицировано ни одной ранее неизвестной мутации, способной обеспечивать высокий уровень устойчивости к соединению 1. При 4 0 нМ соединения 1, которая более чем в 4 0 раз ниже IC50 для исходных клеток BaF/З, достигали полного подавления устойчивости in vitro. Это отсутствие разрастания устойчивых форм дополнительно подтверждали при более высоких концентрациях соединения 1 (80, 160, 32 0 нМ; данные не показаны). К сведению, ни для одного другого ингибитора BCR-ABL в качестве единственного средства не продемонстрирована такая способность.
Таблица 2
Анализ мутагенеза на основе клеток под действием соединения 1, начиная с природной BCR-ABL
Клетки Ba/F3, экспрессирующие природную BCR-ABL
Концентрация
Анализируемые лунки
Секвенированные клоны (количество)
По конкретной
мутации
По остатку
Лунки с разрастанием
Мутант(ы)
Случаи возникновения (количество)
Частота среди клонов (%)
Частота среди мутантов (%)
Остаток
Случаи возникновения (количество)
Частота по остатку (%)
5 нМ
570
576
Природная BCR-ABL
90,2
G250E
2, 0
G250
20, 0
Y253H
2, 0
Y253
20, 0
Е255К
2, 0
Е255
20, 0
T315I
2, 0
Т315
20, 0
F317I
2, 0
F317
20, 0
10 нМ
1440
168
157
Природная BCR-ABL
105
66, 9
G250E
0, 6
1,9
G250
1,9
Q252H
2,5
7,7
Q252
7,7
Y253F
0, 6
1,9
Y253
13,5
Y253H
3, 8
11,5
Е255К
7, б
23, 1
Е255
36, 5
E255V
4,5
13,5
K2 8 5N
0, б
1,9
К2 8 5
E292V
0, б
1,9
Е292
L298V
1,3
3, 8
L298
T315I
4,5
13,5
Т315
13,5
F317I
0, б
1,9
F317
1,9
V339G
0, б
1,9
V339
1,9
F359C
1,3
3, 8
F359
9, б
F359I
1,9
5, 8
L387F
1,3
3, 8
L387
3, 8
S438C
0, б
1,9
S438
1,9
2 0 нМ
1440
E255V
33,3
33,4
Е255
33,3
T315I
бб, 7
100, 0
Т315
68,7
4 0 нМ
1440
(9) Действие соединения 1 на сочетанные мутанты Поскольку лечение соединением 1, вероятно, будут тестировать в условиях неудачи лечения иматинибом и по меньшей мере одного резервного лечения (такого как один из одобренных FDA ингибиторов киназ ABL второй линии), существует значительная возможность предварительного присутствия T315I или другой придающей устойчивости мутации. Хотя происходящая до настоящего времени в редких и задокументированных в небольшом количестве случаях, у пациентов также может произойти неудача с сочетанной мутацией BCR-ABL, включающей вторичную мутацию киназного домена в сочетании с предварительно существующей мутацией в том же аллеле (Khorashad et al., Blood 111: 2378 (2008); Shah et al. , J. Clin. Invest. 117: 2562 (2007); Stagno et al. , Leuk. Res. 32: 673 (2008)) . Выявив очень ограниченный профиль восприимчивости к устойчивости на уровне единичных мутаций в киназном домене, авторы захотели исследовать восприимчивость соединения 1 к сочетанным мутациям.
Для имитации ситуации, в которой соединение 1 применяют для лечения пациента с преобладающим субклоном T315I, авторы снова провели анализ ускоренного мутагенеза, в этот раз, начиная с уровня существующей мутации T315I (фиг.8В и таблица 3) . Авторы выявили, что все еще существовала зависимая от концентрации иерархия, и что ингибитор все еще мог контролировать все тестируемые сочетанные мутанты. При концентрации соединения 1 160 нМ происходило устранение всех сочетанных мутантов за исключением Y253H/T315I и E255V/T315I. При 32 0 нМ, единственным остающимся сочетанным мутантом оставался E255V/T315I, в котором сочетались два наиболее устойчивых одиночных мутанта, и полное подавление разрастания происходило при наибольшей тестируемой концентрации (640 нМ) , все еще почти в 3 раза меньшей IC50 для исходных клеток Ba/F3. Этот профиль устойчивости подтверждали в последующем скрининге,
рос Су
начиная с уровня BCR-ABL , наиболее устойчивой к соединению 1 одиночной мутации киназного домена BCR-ABL, с сочетанным мутантом E255V/T315I, сохраняющимся при 320 нМ и устраняемом при 64 0 нМ (таблица 4).
Таблица 3
Анализ мутагенеза на основе клеток под действием соединения 1, начиная с BCR-ABLT3151
Клетки Ba/F3, экспрессирующие BCR-ABLT3151
Концентрация
Анализируемые лунки
Лунки с разрастанием
Секвенированные клоны (количество)
По конкретной мутации
По остатку
Мутант(ы)
Случаи возникновения (количество)
Частота среди клонов (%)
Частота среди мутантов (%)
Остаток
Случаи возникновения (количество)
Частота по остатку (%)
10 нМ
480
480
Только T315I
90, 0
A3 65V
10, 0
100, 0
А365
100, 0
2 0 нМ
480
480
Только T315I
100, 0
4 0 нМ
480
192
140
Только T315I
4,3
G250E
2,1
2,2
G250
2,2
Q252H
3, б
3,7
Q252
3,7
Y253F
2,1
2,2
Y253
34,3
Y253H
29, 3
30, б
Y253N
1,4
1,5
Е255К
5, 0
5, 2
Е255
9, 0
E255V
3, б
3,7
Е281К
0,7
0,7
Е281
0,7
K2 8 5N
1,4
1,5
К2 8 5
1,5
I293N
2,9
3, 0
N293
3, 0
F311I
17, 1
17, 9
F311
29, 1
F311V
10,7
11,2
I315L
2,1
2,2
1315
3, 0
I315M
0,7
0,7
L327M
0,7
0,7
L327
0,7
F359C
5, 0
5, 2
F359
6,7
F359I
0,7
0,7
F359V
0,7
0,7
А380$
2,1
2,2
A3 8 0
2,2
Н396Р
2,9
3, 0
Н396
3,7
H396R
0,7
0,7
8 0 нМ
480
Q252H
4,2
4,2
Q252
4,2
Y253H
71, 8
71, 8
Y253
71, 8
IE255K
11,3
11,3
Е255
11,3
F311I
2, 8
2, 8
F311
4,2
F311V
1,4
1,4
I315L
4,2
4,2
1315
4,2
A380S
4,2
4,2
A3 8 0
4,2
160 нМ
480
Y253H
90, 6
90, 6
Y253
90, 6
E255V
9, 4
9, 4
Е255
9, 4
32 0 нМ
480
E255V
100, 0
100, 0
Е255
100, 0
54 0 нМ
480
Таблица 4
E255V
Анализ мутагенеза на основе клеток под действием соединения 1, начиная с BCR-ABL
Клетки Ba/F3, экспрессирующие BCR-ABLE255V
Концентрация
Анализируемые лунки
Лунки с разрастанием
Секвенированные клоны (количество)
По конкретной мутации
По остатку
Мутант(ы)
Случаи возникновения (количество)
Частота среди клонов (%)
Частота среди мутантов (%)
Остаток
Случаи возникновения (количество)
Частота по остатку (%)
8 0 нМ
480
152
123
Только E255V
104
84, 6
G250E
1, 6
10,5
G250
10,5
Q252H
0, 8
5, 3
Q252
5, 3
Y253H
4, 1
26,3
Y253
26,3
E292V
0, 8
5, 3
Е292
5, 3
F311L
1, 6
10,5
F311
10,5
T315I
0, 8
5, 3
Т315
5, 3
E355G
0, 8
5, 3
Е355
5, 3
F359C
2,4
15, 8
F359
26,3
F359I
1, 6
10,5
H396R
0, 8
5, 3
Н396
5, 3
160 нМ
480
Y253F
16,7
16,7
Y253
50, 0
Y253H
33,3
33,3
T315I
50, 0
50, 0
Т315
32 0 нМ
480
T315I
100, 0
100, 0
Т315
100, 0
64 0 нМ
480
ОБСУЖДЕНИЕ
Соединение 1 представляет собой ингибитор киназы ABL, связывающийся с неактивной конформацией DFG-out киназного домена ABL и ABLT3151 и образующий тройную связью углерод-углерод рядом с мутацией T315I. Рентгеноструктурные исследования подтвердили, что соединение 1 связывается с ABLT3151 в режиме связывания DFG-out. Соединение 1 поддерживает существование обширной сети водородных связей, а также занимает область киназы, которая в значительной степени перекрывается с участком связывания иматиниба. Соединение 1 формирует с киназой пять водородных связей вместе с многочисленными вандерваальсовыми контактами, что приводит к эффективному ингибированию киназы
(IC50 ABLT3151: 2,0 нМ; 1С50 природной ABL: 0,37 нМ) . Кроме того, сама тройная связь располагается оптимально для обеспечения эффективного гидрофобного контакта с боковой цепью 1315, в то время как ее линейная форма и жесткая геометрия принудительно обеспечивают конформационное ограничение, устраняя стерическое препятствие и действуя в качестве несгибаемого соединителя, который располагает другие два участка соединения 1 в их установленные связывающие карманы.
Оценка соединения 1 в анализах клеточной пролиферации подтвердила его эффективное общее ингибирование BCR-ABL в клетках, экспрессирующих природную или мутантную по киназному домену BCR-ABL, включая BCR-ABLT3151, а также высокую степень селективности для положительных по филадельфийской хромосоме
(Ph) клеток по сравнению с Ph-негативными клетками (таблица 1). В клетках Ba/F3 различие в чувствительности между клетками, экспрессирующими природную BCR-ABL, и исходными клетками было более чем в 3000 раз (IC50 клеток, экспрессирующих природную BCR-ABL: 0,5 нМ; IC50 исходных клеток: 1713 нМ) . Результаты исследований соответствовали первичным клеткам CML по сравнению с нормальными клетками, обрабатываемым ex vivo соединением 1 в клеточных анализах (фиг.2А), а также в анализах формирования колоний гемопоэтических клеток (фиг.З). Среди тестируемых BCR-ABL, мутантных по киназному домену, наиболее устойчивым к соединению 1 (IC50: 3 6 нМ) являлся мутант E2 55V, и опубликовано,
что эта мутация придает высокоуровневую устойчивость к иматинибу и устойчивость среднего уровня к нилотинибу и дазатинибу (O'Hare et al. , Blood 110: 2242 (2007)). Однако следует отметить, что мутации по остаткам Y253 и F359 (которые опубликовали при неудаче с нилотинибом (Kantarjian et al., Blood 110: 3540 (2007)), а также F317 (вовлеченная в клиническую устойчивость к дазатинибу (Burgess et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 3395 (2005)) соединение 1 эффективно ингибирует при значениях IC50, сравнимых со значениями IC50 или ниже чем для клеток T315I (таблица 1).
Так как реактивация передачи сигнала BCR-ABL является часто наблюдаемым признаком опосредуемой мутациями в киназном домене устойчивости к клиническим ингибиторам ABL, особенно у пациентов с хронической фазой заболевания, авторы анализировали экспрессирующие BCR-ABLT3151 клетки в анализе посредством иммуноблоттинга на фосфорилирование CrkL, установленного непосредственного субстрата природной и мутантной BCR-ABL. В клетках Ba/F3 in vitro и в первичных клетках CML с BCR-ABLT3151 ex vivo обработка соединением 1 приводила к заметному снижению % pCrkL, хотя ни один из трех клинических ингибиторов ABL не продемонстрировал никакого эффекта (фиг.1В и 2В). Сходное ингибирование наблюдали при исследовании уровней pBCR-ABL и pBCR-ABLT3151 в клетках Ba/F3, подтверждая обоснованность данных % pCrkL. предпочтительным средством исследования
фармакодинамической эффективности ингибиторов киназ ABL является анализ смещения CrkL, и он будет использован для соединения 1 в фазе 1 его оценки.
Соединение 1 демонстрировало сильную активность после перорального введения в ряде моделей CML, контролируемого природной BCR-ABL или BCR-ABLT3151, на мышах. В модели выживания с использованием клеток Ba/F3, экспрессирующих природную BCR-ABL, соединение 1 значимо продлевало выживание при низких дозах 2,5 и 5 мг/кг (фиг.4А). Подобную эффективность наблюдали при использовании дазатиниба при 5 мг/кг, что позволяет предположить, что при том же уровне дозирования, активность соединения 1 in vivo у мышей против природной BCR-ABL сравнима
с активностью дазатиниба. Важно, что и в модели выживания при CML и подкожной модели CML с использованием клеток Ba/F3, экспрессирующих BCR-ABLT3151, соединение 1 значимо продлевало выживание мышей при 5, 15 и 25 мг/кг (фиг.4В). Остановка роста и регресс опухоли в подкожной модели CML происходили при 3 0 и 50 мг/кг, а подавление передачи сигнала BCR-ABL наблюдали при дозе 30 мг/кг (фиг.4С). Соединение 1 хорошо переносилось на всех уровнях дозирования, используемых в этих исследованиях. Эти результаты позволяют сделать несколько выводов. Во-первых, тот факт, что соединение 1 является перорально биодоступным обеспечивает преимущество над другими ингибиторами T315I, которые ранее испытывали в клинике. В частности, ингибиторы киназ ABL/Aurora МК-0457 и РНА-739358 для достижения доз, достаточных для ингибирования активности BCR-ABL, требуют внутривенного введения (Giles et al. , Blood 109: 500 (2007); Gontarewicz et al. , Blood 111: 4355 (2008) ) . Кроме того, оба этих ингибитора ингибируют и нормальные клетки, и клетки BCR-ABL1,3151 при сравнимых концентрациях. В отличие от этого, данные авторов in vivo позволяют предположить, что соединение 1 в моделях CML, зависимого от BCR-ABLT3151, на животных обладает широким терапевтическим диапазоном от 5 до 50 мг/кг.
Ранее авторы использовали свой скрининг ускоренного мутагенеза на основе клеток для предсказания спектра мутаций BCR-ABL в киназном домене, придающих клиническую устойчивость к иматинибу, нилотинибу и дазатинибу (Bradeen et al., Blood 108:2332 (2006)). По мере того, как становилась доступна дополнительная информация о пациентах с CML, подвергаемых лечению каждым из ингибиторов ABL второй линии, опубликовано несколько мутаций, ассоциированных с неудачным применением нилотиниба (L248R, Y253H, E255K/V, T315I, F359I/V; (Kantarjian et al., Blood 110: 3540 (2007)) или дазатиниба (V299L, T315I, F317I/L; (Shah et al. , J. Clin. Invest. 117: 2562 (2007)), что в основном согласуется с профилированием авторов in vitro. В скринингах ускоренного мутагенеза авторов изобретения для соединения 1 авторы выявили зависимое от концентрации снижение процента лунок с разрастанием и диапазона наблюдаемых мутаций.
В то время как при 10 нМ соединения 1 авторы наблюдали 16 различных замен по 13 различным остаткам, увеличение концентрации до 2 0 нМ резко снижало общее наблюдаемое разрастание (11,7% при 10 нМ; 0,2% при 20 нМ) и выделение типов мутантов (фиг.бА и таблица 2). Устойчивые клоны, выделяемые при 20 нМ несли только мутации T315I или E255V, а при 40 нМ соединения 1 и выше наблюдали полное подавление разрастания
(фиг.бА и таблица 2) . Данные авторов позволяет предположить, что соединение 1, вводимое при подходящих уровнях, может устранять восприимчивость к основанной на одиночной мутации устойчивости. Этот результат с использованием соединения 1 в качестве единственного средства, ранее в этом анализе достигали только в присутствии двухкомпонентных комбинаций нилотиниба или дазатиниба с доклиническим ингибитором T315I (О'Hare et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 5507 (2008)).
Для дополнительного исследования величины способности соединения 1 подавлять разрастание устойчивых опухолей, авторы проводили скрининги ускоренного мутагенеза, начиная с уровня Ba/F3, экспрессирующих любой из двух отдельных наиболее устойчивых мутантов, BCR-ABLT3151 или BCR-ABLE255V. Этот предиктивный анализ позволил выявить определенные сочетанные мутации, особенно мутации, включающие любые два представителя набора, состоящего из Y253H, E255V и T315I, с уровнем устойчивости к соединению 1 от умеренного до высокого (таблицы 3 и 4) . Среди них предсказано, что Y253H/T315I и E255V/T315I являются наиболее устойчивыми парами в отношении соединение 1
(фиг.бВ и таблицы 3 и 4) . Следует отметить, что присутствие компонента T315I означает, что ни один из одобренных в настоящее время клинических ингибиторов BCR-ABL не будет активен против этих мутантов. Таким образом, соединение 1 обладало способностью устранять сочетанные мутации, содержащие T315I и E255V, для которых предсказано, что они являются высокоустойчивыми ко всем другим ингибиторам. В настоящее время, сочетанные мутации в киназном домене BCR-ABL являются редкими (таблица 5), но можно предположить, что их распространенность будет увеличиваться с продлением выживания
пациентов и при увеличении пациентов, проходящих последовательное лечение ингибиторами киназ ABL, а в настоящее время они представляют огромную проблему для пациентов, у которых они присутствуют. Хотя ни один скрининг мутагенеза не может являться полностью исчерпывающим, данные авторов позволяет предположить, что мутации, которые полностью устраняют связывание соединения 1, не могут быть совместимыми с сохранением достаточной киназной активности. В этом сценарии избегание ингибирования может происходить за счет "функционального суицида".
Таблица 5
Сочетанные мутанты BCR-ABL, содержащие E255V или T315I, придающие уровень устойчивости к соединению 1 от умеренного
до высокого
Сочетанный мутант
Концентрация соединения 1 при которой происходило выявление при скрининге
Описан в клинике (ссылки)
80 нМ
160 нМ
320 нМ
T315I/Q252H
н. о.
T315I/Y253H
(1), (2)
T315I/E255K
(3)
T315I/E255V
н. о.
T315I/F3111
(2)
T315I/F311V
н. о.
T315I/A380S
н. о.
E255V/G250E
н. о.
E255V/Q252H
н. о.
E255V/Y253F
н. о.
E255V/Y253H
н. о.
E255V/E292V
н. о.
E255V/F3111
н. о.
E255V/E355G
н. о.
E255V/F35SC
н. о.
E255V/F359 л
н. о.
E255V/H396R
н. о.
(1) Shah et al., (2007). JCI 117, 2562-2569.
(2) Khorashad et al., (2008). Blood 111, 2375-2381.
(3) Stagno et al., (2008). Leuk. Res. 32, 673-674. ПРИМЕЧАНИЕ В этом скрининге не детектировали следующие клинически описанные сочетанные мутанты: V2 9SL/E2 55V. Сокращения: и.о., не описан.
Объединенные результаты биохимических, клеточных исследований и исследований in vivo авторов изобретения позволяет предположить, что соединение 1, вводимое в подходящих количествах, проявляет достаточную активность против природной BCR-ABL и всех тестируемых мутантов BCR-ABL для гарантирования рассмотрения использования в качестве единственного средства в качестве общего ингибитора BCR-ABL. Кроме того, результаты авторов свидетельствуют, что соединение 1 является многообещающим в отношении контроля сочетанных мутантов, содержащих T315I, а также увеличивают понимание, что оно является предпочтительным для устранения устойчивых субклонов на стадии единственной мутации.
Пример 2: Клиническое исследование
Соединение 1 представляет собой перорально доступный ингибитор тирозинкиназ, который эффективно ингибирует ферментативную активность BCR-ABLT3151, природного фермента и всех других тестируемых вариантов. Он также подавляет выживание клеточных линий, экспрессирующих эти варианты BCR-ABL с 1С5о <4 0 нМ.
Проводили 1 фазу клинических испытаний для оценки безопасности соединения 1 и предоставления предварительной оценки клинической активности. В испытаниях использовали открытую схему повышения дозы. Соединение 1 синтезировали и формулировали, как описано в настоящем документе.
Пригодными являлись пациенты с гематологическими раковыми новообразованиями, устойчивыми к лечению (или рецидивирующие или для которых нет доступного стандартного лечения), статусом ECOG^2, QTcF <450 мс, достаточной функцией печени и почек и
нормальной сердечной функцией, и они получали одну ежедневную пероральную дозу соединения 1. Гематологические раковые новообразования включали CML (любую фазу), ALL, AML, MDS, MM или CLL. Кроме того, пациенты до зачисления не должны были проходить химиотерапию > 21 суткам или получать исследуемые средства > 1А суткам.
Зачисляли и подвергали лечению пятьдесят семь пациентов (30 мужчин), средний возраст 61 лет (диапазон 26-85) и среднее количество лет от постановки диагноза 5,4 (0-21) . Диагнозы включали 50 CML (37 в хронической [CP], 7 в ускоренной [АР], б в бластной фазе [BP] ) , 3 Ph+ ALL и 4 других раковых новообразования (2 миелофиброза, 1 миелома и 1 MDS) . Статус мутаций BCR-ABL у 4 8 пациентов с Ph+ включал 14 пациентов с отсутствием мутаций и 34 пациента с мутациями (14 с T315I, 5 с F317L, 4 с G250E, 3 с 2 или более мутациями, а у оставшиеся выявляли другие мутации, включая F359C и F359V. Другие конкретные мутации представляли собой М351Т, L273M/F359V, G250E, Е279К, F359C, L387F и Е453К). Предшествующие способы лечения у 53 пациентов с Ph+ (CML и ALL) включали иматиниб (9 6% пациентов), дазатиниб (87%) и нилотиниб (57%), где 35 пациентов получали > 3 предшествующих TKI и 50 пациентов получали > 2 предшествующих TKI.
Пациентов лечили на следующих уровнях дозирования: 2 мг (3 пациентов), 4 мг (6 пациентов), 8 мг (7 пациентов), 15 мг (8 пациентов), 30 мг (7 пациентов), 45 мг (13 пациентов) и 60 мг (13 пациентов). 4 5 мг идентифицировали как максимальную переносимую дозу (MTD) для дальнейшего исследования. Допускалось повышение дозы у одного и того же пациента.
Предварительные данные о безопасности и эффективности продемонстрировали следующее: для групп с введением от 2 до 3 0 мг: отсутствие DLT; для группы с введением 4 5 мг: у одного из пациентов наблюдали преходящую сыпь; а для группы с введением 60 мг: у четырех пациентов развилась связанная с поджелудочной железой обратимая DLT (панкреатит). Наиболее распространенными связанными с лекарственным средством побочными эффектами любой степени (АЕ) являлись тромбоцитопения (25%), анемия, увеличение
липаз, тошнота и сыпь (по 12% каждое) и артралгия, усталость и панкреатит (11% каждое).
Фармакокинетические и фармакодинамические (PK/PD) исследования включали анализ плазмы крови с использованием дейтерированного соединения 1 в качестве внутреннего стандарта (РК) и измерения уровней фосфорилирования субстрата BCR-ABL CRKL (p-CRKL) относительно общих уровней (PD) . Отбор образцов проводили на протяжении первых 2 4 часов и до дозирования на сутки (D) 8, 15 и 22 цикла 1 (С1), и Dl С2 (цикл=28 суток) . Классификация эффектов PD включала не поддающиеся оценке (р-CRKL <2 0% от исходного уровня или слишком мало образцов для анализа), транзиторные (ингибирование p-CRKL> 50%* в 2 или более моментах времени после дозирования, но не длящееся на всем протяжении цикла 1), длительные (ингибирование p-CRKL> 50%* в 2 или более моментах времени после дозирования, которое длится на всем протяжении цикла 1) или отсутствие эффекта (отсутствие ингибирования p-CRKL по указанным выше критериям). * означает, что приемлемым является ингибирование ^2 5%, если исходный уровень p-CRKL является слишком низким (например, 35%) для достоверного количественного определения увеличения > 50%.
Фармакокинетические данные продемонстрировали, что время полужизни соединения 1 составляет 19-45 часов. При дозах > 30 мг, время полужизни составляет 18 часов. На фиг.7А и 7В представлена линейная зависимость СмаКс и AUC от дозы в диапазоне. На фиг.7С и 7D представлены профили зависимости концентрации от времени. СмаКс на сутки 1 при дозе 3 0 мг приблизительно составляла 55 нМ. При повторном дозировании у оцениваемых пациентов наблюдали накопление в размере от 1,5- до 3-кратного.
В таблице б предоставлены фармакокинетические данные для пациентов, ежедневно получавших 60 мг соединения 1.
Таблица 6
Профиль соединения 1, перорально вводимого при 60 мг (нг/мл)
Период (часы)
Индивидуум
0,5
BQL
0,31
6,21
15, 6
46,9
71,4
80,2
43, 1
BQL
2, 92
8,35
12,2
29, 5
22,7
17, 9
BQL
3, 95
48,5
60, 6
41, 8
33, 2
BQL
11, 6
27, 8
151
151
135
51, 6
BQL
3,25
13, 8
63, 3
79, 2
78,5
28,2
BQL
22, 1
39, 7
56, 6
65, 6
56, 4
46,9
22, 3
BQL
BQL
0,59
4, 94
35, 4
52, 7
49, 8
26, 2
Среднее
Отсутствует
7,355
17,635
36,734
68,871
71,443
63,343
31,786
77, 6
79, 1
76,7
108
138
137
80,7
30, 1
36, 8
Отсутствует
57, 1
109
87, 1
70,2
35, 8
61,5
67, 4
78,5
94, 8
94, 7
85, 3
72, 1
47, 6
13, 1
14, 6
17, 9
33, 8
54, 3
50, 8
19, 1
Среднее
46,675
49,1
58,5
65,6
91,5
90,3
80,075
45,8
Средний стационарный минимальный уровень при ежедневном дозировании 60 мг (уровень через 24 часа после дозирования после одного 28-суточного цикла) составляет приблизительно 45 нг/мл, что соответствует циркулирующей плазматической концентрации приблизительно 90 нМ, циркулирующей концентрации, которая может быть подходящей для подавления возникновения устойчивых субклонов у этих индивидуумов. При дозах 3 0 мг или выше минимальные уровни превосходили 4 0 нМ (21 нг/мл), концентрацию, при которой анализ мутаций продемонстрировал полное подавление возникающих клонов (как на фиг.бА).
Данные PD демонстрируют ингибирование фосфорилирования CrkL при дозах 8 мг и выше. Как представлено на фиг. 8А, устойчивое направленное ингибирование наблюдали при дозах > 8 мг в общей группе, а при дозах > 15 мг у пациентов с T315I. На фиг.8В-8Е представлены фармакодинамические данные для различных доз и у пациентов с различными мутациями. Общими наилучшими гематологическими ответами являлись полный гематологический ответ (CHR) у 22 из 22 пациентов с CP (85%), включая новый и исходный CHR, и значительный гематологический ответ (MHR) у 5 из 12 пациентов с АР, BP или ALL. Цитогенетические ответы представлял себе 8 полных цитогенетических ответов (CCyR) и 12 MCyR. Наилучшими гематологическими ответами в подгруппе с T315I являлись CHR у 8 из 9 пациентов с CP (89%), включая новый и исходный CHR, и MHR у 3 из 8 пациентов с АР, BP или ALL. Девять из 12 пациентов с T315I оценивали на CyR: 5 пациентов с CP и 1 с АР, BP или ALL достигали CCyR, а б пациентов с CP и 3 с АР, BP или ALL достигали MCyR. Молекулярные ответы включали 8 MMR у 32 пациентов с CP AML (4 у пациентов с T315I на исходном уровне).
Выводы: При дозах соединения 1 до 3 0 мг DLT не наблюдали, а при более высоких дозах наблюдали обратимую DLT. РК и PD демонстрируют, что уровни в крови при 3 0 мг превосходят уровни, необходимые для ингибирования устойчивых мутантных изоформ BCR-ABL, включая T315I, in vitro. Предварительный анализ выявил свидетельства клинической противоопухолевой активности у пациентов с устойчивостью к одобренным TKI второй линии
дазатинибу и нилотинибу, включая пациентов с мутацией T315I BCR-ABL. Полученные до настоящего времени результаты демонстрируют, что (1) в общей группе наблюдается устойчивое длительное направленное ингибирование при дозах 8 мг и более, (2) длительное направленное ингибирование у пациентов с T315I наблюдается на уровне дозирования 15 мг или более, (3) 4 5 мг соединения 1 идентифицированы как MTD и (4) более высокие дозы, необходимые для подавления возникновения устойчивых субклонов у пациентов, подвергаемых лечению, переносятся без значительных побочных эффектов. Минимальные концентрации лекарственного средства, превосходящие порог общей активности соединения 1 в отношении BCR-ABL, наблюдали при дозах > 30 мг. При дозах > 15 мг, наблюдали длительное ингибирование BCR-ABL у пациентов с рядом мутаций, включая T315I. Вместе эти результаты хорошо коррелируют с клиническими данными о противолейкозной активности у устойчивых пациентов с Ph+, у которых потерпело неудачу применение доступных в настоящее время TKI.
Пример 3: Ингибирование мутантных FLT3 при остром миелогенном лейкозе
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ
Клеточные линии, антитела и реагенты: Клетки MV4-11, RS4;11, Kasumi-1 и KG1 получали из American Type Culture Collection (Manassas, VA) , а клетки E0L1 получали из DSMZ (Braunschweig, Germany). Клетки поддерживали и культивировали стандартными способами при 37 °С в 5% (об./об.) СОг с использованием RPMI 1640, дополненной 10% FBS (20% FBS для клеток Kasumi-1). Соединение 1 синтезировали в ARIAD Pharmaceuticals (Cambridge, MA) , а сорафениб и сунитиниб приобретали в American Custom Chemical Corporation (San Diego, CA). Все соединения получали в виде 10 мМ исходных растворов в ДМСО. Используемые антитела включали: антитела к фосфо-PDGFRa, PDGFRa, FLT3, FGFR1 и GAPDH из Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) ; к STAT5, KIT, фосфо-KIT, фосфо-FGFR и фocфo-FLTЗ из Cell Signaling Technology (Beverly, MA) ; к фосфо-ЭТАТ5 из BD Biosciences (San Jose CA).
Анализы жизнеспособности клеток: Жизнеспособность клеток
оценивали с использованием анализа Cell Titer 9 6 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison WI). Клеточные линии в фазе экспоненциального роста высевали в 9 6-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи при 37°С. Через двадцать четыре часа после посева клетки обрабатывали соединением или носителем (ДМСО) в течение 72 часов. Флуоресценцию измеряли с использованием микроспектрофотометра для чтения планшетов Wallac Victor (PerkinElmer, Waltham, MA) . Данные наносили на график в виде процента процент жизнеспособных клеток относительно клеток, обработанных носителем, а значения IC50 (концентрацию, вызывающую 50% ингибирование) рассчитывали с использованием XLfit версии 4.2.2 для Microsoft Excel. Данные представлены в виде среднего (±SD) из 3 отдельных экспериментов, где каждый проводили в трех повторениях.
Анализ посредством иммуноблоттинга: Для исследования ингибирования передачи сигнала рецепторной тирозинкиназой, клетки обрабатывали соединением 1 в диапазоне концентраций
(0,03-100 нМ) в течение 1 часа. Клетки лизировали в ледяном буфере для лизиса с SDS (0,06 М Tris-HCl. 1% SDS и 10% глицерин) и концентрацию белка определяли с использованием анализа белков ВСА (Thermo Scientific, Rockford, IL) . Клеточные лизаты (50 мкг) разрешали электрофорезом и переносили на нитроцеллюлозные мембраны с использованием реагентов NuPage
(Invitrogen, Carlsbad, CA) . Мембраны подвергали иммуноблоттингу с антителами к фосфорилированным белкам, а затем проводили удаление с использованием буфера Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) и подвергали иммуноблоттингу с общими антителами к белку. Значения IC50 рассчитывали, нанося на график процент фосфорилированного белка в обработанных соединением 1 клетках относительно клеток, обработанных носителем.
Анализы апоптоза: Для измерения каспазной активности клетки MV4-11 высевали в 9б-луночные планшеты с черными стенками при 1> <104 клеток/лунку на 24 часа, а затем в указанные моменты времени обрабатывали соединением 1. По протоколу
производителя добавляли реагент Apo-One Homogeneous Caspase 3/7 (Promega, Madison, WI) и измеряли флуоресценцию в микроспектрофотометре для чтения планшетов Wallac Victor. Для измерения расщепления PARP клетки MV4-11 высевали в б-луночные планшеты и через сутки в течение 2 4 часов обрабатывали соединением 1. В конце обработки клетки лизировали буфером с SDS и подвергали иммуноблоттингу для измерения экспрессии общей PARP и расщепленной PARP (Cell Signaling Technology).
Модель с подкожным ксенотрансплантатом: Исследование эффекта на ксенотрансплантат опухоли человека MV4-11 проводили в Piedmont Research Center (Morrisville, NC) . В кратком изложении, ксенотрансплантаты опухолей получали посредством подкожной имплантации клеток MV4-11 (1x107 в 50% матригеле) в правый бок самок мышей SCID СВ.17 и дозирование начинали, когда средний объем опухоли достигал приблизительно 2 00 мм3. Соединение 1 разбавляли в носителе в виде 25 мМ цитратного буфера (рН=2,75) и мышам ежедневно однократно перорально дозировали в течение 4 недель. Опухоли измеряли в миллиметрах в двух направлениях (длина и ширина) с использованием циркуля. Объем опухоли (мм3) рассчитывали по следующей формуле: объем опухоли=(длинахширина2)/2. Ингибирование роста опухоли (TGI) рассчитывали следующим образом: TGI=(1-ДТ/ДС)х100, где ДТ означает среднее изменение объема опухоли в каждой из обрабатываемых групп, а ДС означает среднее изменение объема опухоли в контрольной группе. Данные по объему опухолей собирали и анализировали с использованием одностороннего критерия ANOVA (GraphPad Prism, San Diego, CA) с определением общего различия в группах. Каждую обработанную соединением 1 группа дополнительно сравнивали с контрольной группе с носителем для статистической значимости с использованием критерия множественных сравнений Даннета. Статистически значимыми считали значения р <0,05, а значения р <0,01 считали статистически высокозначимыми.
Фармакокинетика и фармакодинамика: После получения ксенотрансплантата опухоли MV4-11 мышам вводили однократную пероральную дозу соединения 1 и через б часов собирали опухоли.
100
Индивидуальные опухоли гомогенизировали в ледяном буфере RIPA, содержащем ингибиторы протеаз и фосфатаз, и очищали посредством центрифугирования. Образцы разрешали посредством SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и подвергали иммуноблоттингу с антителами к общим и фосфорилированным FLT3 и STAT5. Концентрации соединения 1 в плазме определяли по внутреннему стандарту способом LC/MS/MS с использованием осаждения белка и калибровочных стандартов, получаемых из плазмы контрольных мышей. Нижний предел количественного определения (BQL)= <1,2 нг/мл соединения 1. Регистрируемыми концентрациями являлись средние значения для четырех мышей/группу.
Обработка образцов, полученных у пациентов с первичным AML ex vivo: Все образцы, полученные у пациентов, обезличивали и собирали с информированного согласия с одобрения Institutional Review Board of Oregon Health & Science University. Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови пациентов с острым миелогенным лейкозом на градиенте фиколла с последующим лизисом красных клеток. Клетки количественно определяли с использованием реагента Guava ViaCount и проточного цитометра Guava Personal Cell Analysis (Guava Technologies, Hayward, CA). Клетки высевали в 9б-луночные планшеты (5x104 на лунку) со ступенчато изменяющимися концентрациями соединения 1 (1-1000 нМ) в RPMI, дополненной 10% FBS, пенициллином/стрептомицином, L-глутамином, фунгизоном и 10~4 М 2-меркаптоэтанолом. Через 72 часа инкубации клетки подвергали анализу с MTS (Cell Titer Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega) для оценки жизнеспособности клеток. Все значения нормализовали на выживание клеток, высеваемых без какого-либо лекарственного средства, и для определения IC50 соединения 1 для каждого образца использовали процент выживания. Статус FLT3 определяли посредством ПЦР на геномной ДНК каждого пациента.
101
РЕЗУЛЬТАТЫ
(1) Соединение 1 ингибировало передачу сигнала и пролиферацию в линиях гемопоэтических клеток, находящихся под контролем мутантных, конститутивно активных FLT3, KIT, FGFR1 и PDGFRa
Соединение 1 ингибирует киназную активность FLT3, KIT, FGFR1 и PDGFRa in vitro с IC50 13, 13, 2 и 1 нМ, соответственно. Здесь активность соединения 1 оценивали в панели лейкозных клеточных линий, несущих активирующие мутации в FLT3 (FLT3-ITD; клетки MV4-11) и KIT (N822K; клетки Kasumi-1) или активирующие слияния FGFR1 (FGFR10P2-FGFR1; клетки KG-1) и PDGFRa (FIP1L1-PDGFRa; клетки EOL-1). Соединение 1 ингибировало фосфорилирование всех 4 RTK зависимым от дозы образом, с IC50 от 0,3 до 2 0 нМ (таблица 7).
102
Таблица 7
Ингибирование пролиферации и передачи сигнала в клеточных линиях AML
Клеточная линия
Статус RTK
Анализ
1С50 (нМ)
Соединение 1
Сорафениб
Сунитиниб
MV4-11
FLT3-ITD
Фосфорилирование RTK
0,3
Жизнеспособность клеток
Kasumi-1
c-KIT (N822K)
Фосфорилирование RTK
Жизнеспособность клеток
KG1
FGFR10P2-FGFR1
Фосфорилирование RTK
Жизнеспособность клеток
> 100
> 100
E0L1
FIP1L1-PDGFRa
Фосфорилирование RTK
0, б
Жизнеспособность клеток
0,5
0,5
RS4;11
дикий тип
Фосфорилирование RTK
Жизнеспособность клеток
> 100
> 100
> 100
103
В соответствии с тем, что эти активированные рецепторы являются важными для контроля лейкемогенеза (Chalandon et al., Haematologica. 90: 949-968 (2005)), соединение 1 также эффективно подавляло выживание всех 4 клеточных линий с IC50 0,5-17 нМ (фиг. 9, таблица 7) . В отличие от этого, 1С50 для подавления клеток RS4;11, у которых отсутствуют активирующие мутации этих 4 рецепторов, составляла больше 100 нМ. Эти данные позволяет предположить, что соединение 1 селективно направлено на лейкозные клетки, экспрессирующие одну из этих аберрантных RTK.
Затем активность и профиль активности соединения 1 сравнивали с активностью и профиль активности двух других многоцелевых ингибиторов киназ, сорафениба и сунитиниба, посредством параллельного исследования их действия на выживаемость в той же панели клеточных линий. Хотя наблюдали сильную ингибирующую активность сорафениба и сунитиниба в отношении FLT3 (IC50 4 и 12 нМ, соответственно) и PDGFRa (0,5 и 3 нМ) , ни одно из соединений не продемонстрировало такой высокой активности против KIT (59 и 56 нМ) или FGFR1 (> 100 и > 100 нМ), как соединение 1 (таблица 7).
(2) Сильное апоптотическое действие соединения 1 на клетки MV4-11
Принимая во внимание большую клиническую значимость мутации FLT3-ITD для AML, дальнейшие исследования были сфокусированы на характеристике активности соединения 1 против этой мишени. Для исследования основы для действия соединения 1 на жизнеспособность клеток MV4-11 под контролем FLT3-ITD, определяли его действие на 2 маркера апоптоза. Наблюдали зависимое от дозы и времени увеличение активности каспаз 3/7 с максимальной индукцией (до 4-кратной), наблюдаемой с 10-30 нМ соединения 1 и в пределах 16 часов обработки (фиг.10). Подобным образом, при концентрациях > 10 нМ, соединение 1 продемонстрировало почти максимальную индукцию расщепления PARP и сопутствующее ингибирование фосфорилирования STAT5, непосредственного нижележащего субстрата мутантной киназы FLT3-ITD (Choudhary et al. , Blood. 110: 370-374 (2007)) и важного
104
регулятора выживания клеток. Взятые вместе, эти данные подтверждают заключение, что ингибирование FLT3-ITD соединением 1 подавляет выживание клеток MV4-11 посредством индукции апоптоза.
(3)_Эффективность_in vivo и фармакодинамические
исследования
Для исследования действия соединения 1 на рост опухоли под контролем FLT3-ITD in vivo соединение 1 (1-25 мг/кг) или носитель ежедневно однократно перорально в течение 2 8 суток вводили мышам с ксенотрансплантатами MV4-11. Как представлено на фиг.НА, соединение 1 эффективно ингибировало рост опухоли зависимым от дозы образом. Введение 1 мг/кг, наименьшей тестируемой дозы, приводило к значимому ингибированию роста опухоли (TGI=46%, р <0,01), а дозы 2,5 мг/кг или более приводили к регрессу опухоли. Следует отметить, что дозирование 10 или 25 мг/кг приводило к полному и длительному регрессу опухоли без детекции опухоли посредством пальпации в течение последующих 31 суток.
Для подтверждения модуляции мишени in vivo, мышам с ксенотрансплантатами MV4-11 вводили однократную пероральную дозу носителя или соединения 1 при 1, 2,5, 5 или 10 мг/кг. Опухоли собирали через б часов и уровни фосфорилированных FLT3 и STAT5 оценивали в анализе посредством иммуноблоттинга. Однократная доза 1 мг/кг соединения 1 оказывала умеренное ингибирующее действие на передачу сигнала FLT3, снижая уровни p-FLT3 и p-STAT5 приблизительно на 30%. Увеличенные дозы соединения 1 приводили к усиленному ингибированию передачи сигнала с ингибированием передачи сигнала дозами 5 и 10 мг/кг приблизительно на 75 и 80%, соответственно. Фармакокинетический анализ продемонстрировал положительную ассоциацию между концентрацией соединения 1 в плазме и ингибированием передачи сигнала FLT3-ITD (фиг.11В). Эти данные демонстрируют, что ингибирование передачи сигнала соединением 1 ассоциировано со степенью эффективности (фиг.НА) и подтверждают заключение, что ингибирование передачи сигнала FLT3-ITD объясняет
противоопухолевую активность соединения 1 в данной модели.
105
(4) Активность соединения 1 в первичных клетках AML Для оценки активности соединения 1 в первичных клетках пациентов с AML, авторы получали бласты периферической крови у четырех пациентов; трех, экспрессирующих FLT3 дикого типа и одного с мутацией FLT3-ITD. Статус FLT3 подтверждали посредством ПЦР на геномной ДНК каждого пациента. Жизнеспособность клеток измеряли после воздействия соединения 1 в течение 72 часов (фиг.12). В соответствии с результатами, полученными на клеточных линиях, соединение 1 снижало жизнеспособность положительных по FLT3-ITD первичных бластов с IC50 4 нМ, тогда как бласты дикого типа не демонстрировали снижения жизнеспособности при тестируемых концентрациях (до 100 нМ). Взятые вместе, эти результаты подтверждают заключение, что соединение 1 является селективно цитотоксическим для лейкозных клеток с мутацией FLT3-ITD. Обсуждение
В данном примере с использованием лейкозных клеточных линий, содержащих активированные формы каждого из этих рецепторов, авторы продемонстрировал, что соединение 1 демонстрирует активность против киназ, дискретного множества киназ, вовлеченных в патогенез гематологических раковых новообразований (FLT3, KIT и представители семейств FGFR и PDGFR) с активностью, сходной с активностью, наблюдаемой для BCR-ABL, т.е. IC50 ингибирования фосфорилирование белков-мишеней и выживания клеток находилась в диапазоне 0,3-20 нМ и 0,5-17 нМ, соответственно. Ранее показано, что другие многоцелевые ингибиторы киназ, такие как сорафениб и сунитиниб, обладают ингибирующей активностью против подмножества этих киназ. Однако авторы выявили, что соединение 1 обладает уникальной способностью с высокой активностью ингибировать активность всех четырех киназ. Так как соединение 1 в тестируемых в данном примере моделях демонстрирует сравнимую активность против FLT3, KIT, FGFR1 и PDGFRa, соединение 1 может быть пригодным для лечения заболеваний, в которых играют роль эти киназы.
Считается, что MPN с генетическими перестановками в FGFR1 и PDGFRa являются редкими; однако показано, что образующиеся в
106
результате слитые белки играют большую роль в патогенезе этих заболеваний (Gotlib et al. , Leukemia 22: 1999-2010 (2008); Macdonald et al. , Acta Haematol. 107: 101-107 (2002)). EMS представляет собой агрессивное заболевание, которое в отсутствие лечения может быстро трансформироваться в AML. Авторы в данном примере показали, что соединение 1 эффективно подавляет жизнеспособность клеточной линии AML KG1, находящейся под контролем слитого белка FGFR10P2-FGFR1, что подтверждает клиническую применимость соединения 1 для этого типа заболеваний. У пациентов с HEL/CEL со слиянием PDGFRa при лечении ингибитором PDGFR иматинибом достигают значительных гематологических ответов (Gotlib et al., Leukemia 22:1999-2010 (2008)), и авторы показали, что соединение 1 обладает сильной активностью против слитого белка FIPlLl-PDGFRa, как показано на лейкозной клеточной линии EOL. Однако показано, что мутант T674I PDGFRa, мутантный в положении, аналогичном ключевому остатку T315I в BCR-ABL, придает пациентам устойчивость к иматинибу (Gotlib et al., Leukemia 22: 1999-2010 (2008)). Существенным является то, что соединение 1 обладает сильной активностью против мутантной киназы PDGFRa с T674I с IC50 3 нМ, что подтверждает применимость соединения 1 для лечения пациентов, несущих этот слитый белок.
Частота возникновения и прогностическое значение перестроек FLT3-ITD при AML демонстрируют, что эта киназа играет критическую роль в патогенезе заболевания (Levis et al., Leukemia 17: 1738-1752 (2003)) и по существу представляет собой основную мишень терапевтического воздействия. В исследованиях, описанных в данном примере, с использованием экспрессирующей FLT3-ITD клеточной линии MV4-11 авторы продемонстрировали тесную взаимосвязь между ингибированием активности FLT3 in vitro и in vivo и подавлением выживания опухолевых клеток. In vitro, низкие нМ концентрации соединения 1 (т.е. меньше 10 нМ) приводили к снижению фосфорилирования FLT3, снижению жизнеспособности и возрастанию концентрации маркеров апоптоза. В модели с ксенотрансплантатом in vivo ежедневная пероральная доза 1 мг/кг соединения 1 приводила к значительному
107
ингибированию роста опухоли, а доза 5 мг/кг или большая приводила к регрессу опухоли. В соответствии с действием на рост опухоли, являющемуся результатом ингибирования FLT3, однократная доза 1 мг/кг соединения 1 приводила к частичному ингибированию FLT3-ITD и фосфорилированию STAT5, тогда как дозы 5 и 10 мг/кг приводили к значительному ингибированию. Наконец, соединение 1 эффективно подавляло жизнеспособность первичных бластов, выделенных у положительного по FLT3-ITD пациента с AML (IC50 4 нМ) , но не бластов, выделенных у трех пациентов с FLT3 дикого типа (1С5о> 100 нМ) .
Описано несколько соединений с активностью в отношении FLT3 и некоторые из них уже испытаны у пациентов с относительно слабой клинической активностью, описанной до настоящего времени (например, Stirewalt et al. , Nat. Rev. Cancer 3: 650-665 (2003); Chu et al., Drug Resist. Updat. 12: 8-16 (2009); Weisberg et al., Oncogene, 12 июля 2010 года). На основе преклинических исследований, демонстрирующих, что для осуществления уничтожения зависимых от FLT3 клеток AML необходимо, чтобы ингибирование FLT3 было длительным, появилось мнение, что для достижения максимальной терапевтической пользы может понадобиться постоянное и почти полное ингибирование киназы FLT3 (Pratz et al. , Blood 113:3938-3946 (2009)). Исследования авторов in vitro демонстрируют, что полное, т.е. значительное длительное ингибирование фосфорилирования и функции FLT3 можно получать при концентрациях <10 нМ. Существенным является то, что предварительный анализ фармакокинетических свойств соединения 1 при дозировании на переносимых уровнях подтвердил минимальные уровни, превосходящие 4 0 нМ (т.е. до следующей суточной дозы). Эти данные подтверждают заключение, что активность и фармакологические свойства соединения 1 обеспечивают длительное и почти полное ингибирование FLT3 у пациентов.
Соединение 1 представляет собой ингибитор киназ с несколькими мишенями, демонстрирующий эффективное ингибирование FLT3 и являющийся цитотоксическим для клеток AML, несущих мутацию FLT3-ITD. Существенным является то, что это средство
108
проявляет активность против дополнительных RTK, FGFR1, KIT и PDGFRa, для которых также показано, что они играют роли в патогенезе гематологических раковых новообразований. Следует отметить, что активность соединения 1 против этих RTK in vitro и уровни соединения 1 в плазме наблюдаемые у людей подтверждают клиническую роль соединения 1 против этих мишеней. Взятые вместе, эти наблюдения предоставляют убедительное доклиническое подтверждение для гарантии разработки соединения 1 в качестве нового лечения AML и других гематологических раковых новообразований, таких как гематологические раковые новообразования под контролем KIT, FGFR1 или PDGFRa.
Пример 4: Предварительные результаты у пациентов с AML с мутацией FLT3
Кроме высокозначимых результатов на основе клеток в примере 3, результаты предварительных клинических испытаний включают полный ответ у устойчивых пациентов с AML с мутацией FLT3-ITD после лечения 45 мг соединения 1, вводимых перорально ежедневно. В целом эти результаты обосновывают разработку соединения 1 для пациентов с AML под контролем FLT3-ITD и с другими гематологическими раковыми новообразованиями. Кроме того, ввиду его профиля ингибирования в отношении других киназ, понатиниб также может играть важную роль против различных видов рака под контролем KIT, FGFR1, PDGFRa или других киназ, природных или мутантных.
Пример 5: Профиль киназной селективности соединения 1
Реагенты: Соединение 1 синтезировали, как описано в настоящем документе. Приобретали следующие соединения: PD173074 (Calbiochem, Gibbstown, NJ) , BMS-540215 (American Custom Chemical, San Diego, CA) , CHIR-258 и BIBF-1120 (Selleck Chemical Co, London ON, Canada).
Анализ киназ: Анализы ингибирования киназ с определением IC50 проводили в Reaction Biology Corporation (RBC, Malvern, PA USA) . Соединения тестировали с 10 мкМ АТФ с использованием 10-точковой кривой с 3-кратными серийными разведениями, начиная от 1 мкМ. Представлены усредненные данные из 2 анализов.
Анализ роста клеток: Рост клеток оценивали с
109
использованием анализа Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI) или анализа CyQuant Cell proliferation Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Клетки обрабатывали соединением через 24 часа после высевания и выращивали в течение 72 часов. Концентрацию, вызывающую 50% ингибирование роста (GI50) , определяли посредством коррекции количества клеток на начало отсчета (время лечения) и нанося данные на график в виде процента роста относительно обработанных носителем (диметилсульфоксид, ДМСО) клеток с использованием XLfit версии 4.2.2 для Microsoft Excel. Данные представлены в виде среднего (±SD) из 3 отдельных экспериментов, проводимых в трех повторениях.
Анализ образования колоний в мягком агаре: Анализ в мягком агаре проводили с использованием анализа CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay (Cell Biolabs, San Diego, CA) . В кратком изложении, клетки ресуспендировали в 0,08% агаре и высевали на 0,06% агар в 9б-луночные планшеты. Клетки однократно обрабатывали соединением 1 во время высевания и инкубировали в течение 8-10 суток. Клетки окрашивали йоднитротетразолийхлоридом (Sigma, St. Louis, МО) или растворяли и количественно подсчитывали с красителем CyQuant Dye по протоколу производителя, "н.о." означает не определено.
Вестерн-иммуноблоттинг: Клетки обрабатывали через 24 часа после высевания и инкубировали с ингибитором в течение 1 часа. Клетки лизировали в буфере с SDS буфер или буфере Phospho-Safе(tm)
(Novagen, Gibbstown, NJ) и белковые лизаты подвергали иммунопреципитации в течение ночи и/или подвергали иммуноблоттингу с указанными антителами. Экспрессию белка количественно определяли с использованием программного обеспечения Quantity One (BioRad, Hercules, CA) . Значения IC50
(концентрация, вызывающая 50% ингибирование) рассчитывали, нанося на график процент ингибирования сигнала фосфо-формы, нормализованного на общий сигнал белка с использованием XLfit4. Данные, представленные в таблице, представляют собой средние значения 2-3 анализов.
Подкожные модели опухолей: Клетки AN3CA имплантировали в
правый бок "голых" мышей. Для анализа эффективности, по достижении среднего объема опухоли приблизительно 200 мм3, вводили ингибитор посредством ежедневного перорального дозирования в течение 12 суток. Для каждой обрабатываемой группы рассчитывали средние (±SE; объем опухоли=Ъ> <1л/2х0, 5) .
Фармакодинамика/Фармакокинетика: Для фармакодинамического анализа образцы опухолей после сбора замораживали, гомогенизировали в буфере Phospho-Safе(tm) и анализировали посредством вестерн-иммуноблоттинга. Концентрации ингибитора в плазме определяли по внутреннему стандарту способом LC/MS/MS с использованием осаждение белков и калибровочных стандартов, получаемых из плазмы контрольных мышей. Представленные данные представляют собой средние значения 3 мышей/момент времени/группу.
Активность и селективность соединения 1 in vitro оценивали в анализе киназ с несколькими рекомбинантными киназными доменами и пептидными субстратами (таблица 8) . Выявлено, что соединение 1 ингибирует представителей семейств рецепторных тирозинкиназ PDGFR, FGFR и VEGFR (таких как FLT1, FLT4 и KDR) (таблица 1). Соединение 1 является эффективным ингибитором всех четырех рецепторов FGF: FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, а также FGFR1(V561M) и FGFR2(N54 9Н) (таблица 8), что является уникальным при сравнении с другими многоцелевыми ингибиторами киназ, которые не ингибируют всех четырех FGFR (например, сунитинибом, сорафенибом и дазатинибом). Однако следует отметить, что соединение 1 не ингибирует представителей семейств киназ Aurora или инсулина, а также не ингибирует циклин-зависимую киназа 2 (CDK2)/циклин Е.
Ill
Таблица 8
Профиль киназной селективности соединения 1
1С5о <Ю нМ
IC5o <50 нМ
IC5o^250 нМ
IC5o^250 нМ
Киназа
IC50 нМ
Киназа
IC50 нМ
Киназа
IC50 нМ
Киназа
IC50 нМ
ABL
0,37
BMX
47,2
BRK
50, 6
АКТ 2
> 1000
ABLG252H
0,44
CSK
12,7
EGFRL558R
211
ALK
> 1000
ABLY252F
0,3
PDR2
16,1
EPHA1
143
Aurora A
> 1000
ABLT315I
EPHB4
10,2
ERBB4
176
Aurora В
543
АВЪмзб1т
0,3
FGFR3
18,2
JAK2
169
Aurora С
> 1000
ABLH396P
0,34
FLT3
12, 6
JAK3
91, 1
AXL
> 1000
ARG
0,76
JAK1
32, 2
j^-|-rpV654A
77, 8
ВТК
849
BLK
6,1
C-KIT
12,5
^¦-j-rpDSlSV
152
BTKE41K
> 1000
EPHA2
2,1
^¦-j-rpDSieH
TYK2
177
CDK2/CyclinE
> 1000
EPHA3
6,7
PDGFRaD542v
15, 6
CTK
> 1000
EPHA4
1,1
PYK2
35, 1
EGFR
> 1000
EPHA5
0, 69
TIE2
14,3
EGFRL651Q
536
EPHA7
8,5
TRKA
11,4
EGFRT750M
> 1000
EPHA8
2,5
TRKB
15, 1
ERBB2
> 1000
EPHB1
1,2
TRKC
13,2
FAK
> 1000
EPHB2
0, 63
FER
560
EPHB3
1,1
FES
768
FGFR1
2,23
FLT3D835Y
948
112
FGFR1V561M
7,3
IGF-1R
> 1000
FGFR2
1, 6
> 1000
FGFR2N516H
0,45
IRR
> 1000
FGFR4
7,7
ITK
> 1000
FGR
0,45
C-MER
406
FLT1
3,7
C-MET
> 1000
FLT4
2,3
mTOR
> 1000
FMS
8, 6
MUSK
694
FRK
1,3
PI3Ka
> 1000
FYN
0,36
PKA
613
HCK
0, 11
PKC8
> 1000
KDR
1,5
RON
> 1000
j?jrriV550G
0,41
ROS
> 1000
LCK
0,28
SRCT341M
> 1000
LYN
0,24
SYK
> 1000
LYNB
0,21
TEC
> 1000
PDGFRa
1,1
TYK1
> 1000
PDGFRav561Q
0, 84
TYR03
> 1000
PDGFRaT674
ZAP 7 0
> 1000
PDGFRp
7,7
RET
0,16
RFrpV504L
3,7
113
RgrpV504M
1,4
c-SRC
5,4
YES
0, 89
114
Пример 6: Действие соединения 1 в клеточных моделях рака
Соединение 1 воздействует на клеточную активность в различных линиях раковых клеток. Экспериментальные способы проводили, как описано в пример 5. В клеточной линии KG1, полученной из острого миелогенного лейкоза, экспрессирующей слитый ген FGFR1-FGFR10P2, соединение 1 ингибировало рост клеток и фосфорилирование FGFR1. На фиг.13А представлено ингибирование роста соединением 1 в клеточной линии KG1 с определенной величиной GI50 10 нМ. Соединение 1 ингибировало фосфорилирование FGFR1 при IC50 10 нМ, которую определяли посредством анализа вестерн-иммуноблоттингом экспрессии Р-FGFR1, T-FGFR1 и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ("GADPH") в клетках KG1, обработанных соединением 1. В качестве контроля использовали данные о GAPDH.
Соединение 1 также может селективно воздействовать на клеточную активность раковых клеток по сравнению с нормальными клетками. Соединение 1 селективно ингибировало клетки рака желудка SNU16 с амплифицированным FGFR2 по сравнению с клетками SNU1 с wtFGFR2 (фиг.14). Соединение 1 ингибировало передачу сигнала в SNU16, как определяли посредством анализа экспрессии белка вестерн-иммуноблоттингом по сниженному присутствию фосфорилированных FGFR2, FRS2a и Erk 1/2 в клетках рака желудка SNU16. Соединение 1 также селективно ингибировало формирование колоний SNU16 в мягком агаре по сравнению с клетками SNU1 с wtFGFR2 (фиг.15). В таблице 9 представлена итоговая информация об активности соединения 1 в линиях клеток рака желудка SNU16 и KatoIII по сравнению с клеточной линией SNU1 с wtFGFR2. Соединение 1 селективно ингибировало рост клеток и фосфорилирование FRS2a и Erk 1/2 в клетках рака желудка SNU16 и KatoIII по сравнению с SNU1 дикого типа.
115
Таблица 9
Итоговая информация об активности соединения 1 в линиях клеток рака желудка
Соединение 1
Клеточная линия
Статус FGFR2
Рост клеток GI50 (нМ)
Мягкий агар IC50 (нМ)
Фосфо-РКБ2а 1С50 (нМ)
Фосфо-Егк1/2 1С50 (нМ)
SNU16
Ампл
KatoIII
Ампл/укороченный
н. о.
SNU1
дикий тип
500
> 1000
> 1000
> 1000
116
Соединение 1 селективно ингибировало клетки рака эндометрия AN3CA с мутантным FGFR2 (N549К) по сравнению с клеткам HeclB с wtFGFR2. Соединение 1 ингибировало рост клеток AN3CA с GI50 30 нМ по сравнению с клетками HeclB с GI50 490 нМ (фиг.16). Соединение 1 также ингибировало передачу сигнала в клетках AN3CA, особенно фосфорилирование FRS2a и Erk 1/2, как определяли посредством анализа экспрессии белка в клетках рака эндометрия AN3CA, обработанных соединением 1 вестерн-иммуноблоттингом. В таблице 10 представлена итоговая информация об активности соединения 1 в линии клеток рака эндометрия AN3CA по сравнению с клеточными линиями HeclB и RL95 с wtFGFR2.
117
Таблица 10
Итоговая информация об активности соединения 1 в линиях клеток рака эндометрия
Соединение 1
Клеточная линия
Статус FGFR2
Рост клеток GI50 (нМ)
Мягкий агар IC50 (нМ)
Фосфо-РКБ2а 1С50 (нМ)
Фосфо-Егк1/2 1С50 (нМ)
AN3C7A
N549K
3,7
5, 8
HeclB
дикий тип
490
> 1000
> 1000
> 1000
RL95
дикий тип
428
н. о.
> 1000
> 1000
н.о: не определено
118
Соединение 1 ингибировало FGFR3 в клеточных моделях рака мочевого пузыря и множественной миеломы (ММ) . Соединение 1 селективно ингибировало рост клеток рака мочевого пузыря MGH-U3, экспрессирующих мутантный FGFR3b (Y375C), по сравнению с клетками RT112 с wtFGFR3 (фиг.17). Соединение 1 также ингибировало передачу сигнала FRS2a в MGH-U3 (1С5о=41 нМ для Р-FRS2a), как определяли посредством анализа экспрессии белка в клетках MGH-U3, обработанных соединением 1, вестерн-иммуноблоттингом. Соединение 1 селективно ингибировало рост клеток MM 0РМ2, несущих транслокацию t(4;14) и экспрессирующих мутантный FGFR3 (К650Е), по сравнению с клетками NCI-H92 9 с wtFGFR3 (фиг.18). Передачу сигнала FGFR3 ингибировали соединением 1 в клетках 0РМ2, как определяли посредством анализа экспрессии белка в клетках MM 0РМ2, обработанных соединением 1, вестерн-иммуноблоттингом (данные не показаны). Кроме того, соединение 1 ингибировало в 0РМ2 передачу сигнала FRS2a (1С50=65 нМ для P-FRS2a) .
Соединение 1 ингибировало FGFR4 в клеточной модели рака молочной железы. Действие соединения 1 на клетки рака молочной железы MDA-MB-453, экспрессирующие мутантный FGFR4 (Y367C), включало ингибирование роста клеток (фиг.19) и передачу сигнала FGFR4 и FRS2a в клетках, как определяли посредством анализа экспрессии белка в клетках MDA-MB-453, обработанных соединением 1, вестерн-иммуноблоттингом (1С5о=12 нМ для P-FGFR4 и 14 нМ для P-FRS2a).
В таблице 11 представлено сравнение активности ингибирования RTK в моделях FGFR для различных ингибиторов киназ, включая CHIR-258, BIBF-1120, BMS-540215 и PD173074. Данные о IC50 (нМ) представлены для анализа киназ, проводимого в RBC, а данные о GI50 (нМ) представлены для анализа роста клеток.
119
Таблица 11
Сравнение активности ингибирования RTK в моделях FGFR
Рецептор FGF
Анализ
Клеточная линия
Генотип
Соединение 1
CHIR-258
BIBF1120
BMS-540215
PD173074
FGFR1
Киназа
165
Рост клеток
KG1
Слияние
221
900
FGFR2
Киназа
202
Рост клеток
SNU16
Амплификация
138
496
> 1000
Рост клеток
AN3CA
N549K
122
684
> 1000
187
FGFR3
Киназа
122
530
Рост клеток
MGH-U3
Y375C
163
340
> 1000
> 1000
850
Рост клеток
0РМ2
К650Е
120
319
297
6198
FGFR4
Киназа
341
451
2023
367
Рост клеток
MDA 4 53
Y367C
275
4227
1542
> 10000
1655
120
Выводы
Соединение 1 представляет собой перорально активный ингибитор киназ, демонстрирующий в анализах киназ и клеточных анализах мощную активность против всех четырех рецепторов FGF. Передачу сигнала и рост ингибировали в моделях, экспрессирующих в четыре FGFR, с наиболее сильной активностью, наблюдаемой против FGFR1 и FGFR2. Активность соединения 1 наблюдали в различных типах рака, включая рак желудка, эндометрия, мочевого пузыря и множественную миелому. Активность соединения 1 предпочтительно сравнивали с другими ингибиторами RTK с известной активностью в отношении FGFR, которые оценивали в клинике.
Пример 7: Пероральная доставка соединения 1 являлась эффективной для замедления роста солидной опухоли в модели с ксенотрансплантатом AN3CA под контролем FGFR2
Соединение 1 ингибировало рост опухоли AN3CA на 36% и 62% при пероральных дозах 10 и 30 мг/кг, соответственно (фиг.20). Хотя предоставлены ежедневные режимы дозирования, также эффективными могут являться периодические режимы дозирования.
Также определяли зависимость фармакодинамики и фармакокинетики in vivo, где уровни соединения 1 в плазме определяли через б часов после дозирования посредством анализа вестерн-иммуноблоттингом (фиг.21). Пероральное дозирование соединения 1 ингибировало передачу сигнала FRS2a и Lrkl/2 в ксенотрансплантате AN3CA (фиг.21).
Пероральная доставка соединения 1 сильно ингибировала рост опухоли в модели рака эндометрия, экспрессирующей клинически значимую мутацию FGFR2 (N549К). Ингибирование роста клеток коррелировало с ингибированием нисходящей передачи сигнала в опухоли. Эти данные обосновывают применение соединения 1 для лечения ряда типов опухолей, характеризующихся изменениями в рецепторах FGF.
Пример 8: Комбинированная терапия соединением 1 и рида ф оролимусом
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ
Реагенты: Соединение 1 и ридафоролимус (АР23573, МК-8669)
121
синтезировали в ARIAD Pharmaceuticals. Приобретали следующие соединения: BMS-540215 (American Custom Chemical, San Diego, CA) , CHIR-258 и AZD2171 и BIBF-1120 (Selleck Chemical Co., London ON, Canada).
Анализ киназ: Анализы ингибирования киназ для определения IC50 проводили в Reaction Biology Corporation (RBC, Malvern, PA USA) . Соединения тестировали при 10 мкМ АТФ с использованием 10-точковой кривой с 3-кратными серийными разведениями, начиная от 1 мкМ. Представлены усредненные данные из 2 анализов.
Анализ роста клеток: Рост клеток оценивали с использованием анализа Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI) или анализа CyQuant Cell proliferation Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Клетки обрабатывали соединением через двадцать четыре часа после высевания и выращивали в течение 72 часов. Концентрацию, вызывающую 50% ингибирование роста (GI50), определяли посредством коррекции количества клеток на начало отсчета
(время лечения) и нанося данные на график в виде процента роста относительно обработанных носителем (диметилсульфоксид, ДМСО) клеток с использованием XLfit версии 4.2.2 для Microsoft Excel.
Оценка и анализ комбинации: Для каждого тестируемого соединения определяли эффективную дозу при 50% от максимума ингибирования (ED50) и определяли как 1*. Используемые концентрации лекарственного средства находились в диапазоне от 0,125х до 8х при фиксированном соотношении ED. Комбинаторное действие на рост клеток анализировали с использованием способа Chou и Talalay (программное обеспечение CalcuSyn, Biosoft).
Вестерн-иммуноблоттинг: Клетки обрабатывали через 24 часа после высевания и инкубировали с ингибитором в течение 1 часа. Клетки лизировали в буфере с SDS буфер или буфере Phospho-Safe
(Novagen, Gibbstown, NJ) и белковые лизаты подвергали иммунопреципитации в течение ночи и/или подвергали иммуноблоттингу с указанными антителами. Экспрессию белка количественно определяли с использованием программного обеспечения Quantity One (BioRad, Hercules, CA) . Значения IC50
(концентрация, вызывающая 50% ингибирование) рассчитывали,
122
нанося на график процент ингибирования сигнала фосфо-формы, нормализованного на общий сигнал белка с использованием XLfit4. Данные, представленные в таблице, представляют собой средние значения 2-3 анализов.
Подкожные модели опухолей: клетки AN3CA имплантировали в правый бок "голых" мышей. Для анализа эффективности, по достижении среднего объема опухоли приблизительно 200 мм3, вводили ингибитор посредством ежедневного перорального дозирования в течение 21 суток для соединения 1 или и./п. дозирования ежедневнох5 в течение 3 недель. Для каждой обрабатываемой группы рассчитывали средние объемы опухолей (±SE; объем опухоли=Ъ> <1л/2х0, 5) .
Фармакодинамика/Фармакокинетика: Для фармакодинамического анализа образцы опухолей после сбора замораживали, гомогенизировали в буфере Phospho-Safe и анализировали посредством вестерн-иммуноблоттинга. Концентрации ингибитора в плазме определяли по внутреннему стандарту способом LC/MS/MS с использованием осаждение белков и калибровочных стандартов, получаемых из плазмы контрольных мышей. Представленные данные представляют собой средние значения 3 мышей/момент времени/группу.
Соединение 1 воздействовало на клеточную активность в различных линиях раковых клеток. В таблице 12 представлено сравнение активности ингибиторов RTK в клеточных моделях FGFR для различных ингибиторов киназ, включая AZD2171, CHIR-258, BIBF-1120 и BMS-540215. Соединение 1 является эффективным ингибитором FGFR1-FGFR4. Данные о IC50 (нМ) для анализа киназ получали в RBC. В таблице 12 представлены данные о GI50 (нМ) для анализа роста клеток и данные о IC50 (нМ) для передачи сигнала.
123
Таблица 12
Сравнение активности ингибиторов RTK в моделях FGFR
Рецептор FGF
Клеточная линия
Генотип
Анализ
Соединение 1
AZD 2171
CHIR-258
BIBF 1120
BMS-540215
FGFR1
дикий тип
Киназ
165
KG1
Слияние
Передачи сигнала
Лейкоз
Роста клеток
221
900
FGFR2
дикий тип
Киназ
202
SNU16
Амплифицированный
Передачи сигнала
Рак желудка
Роста клеток
148
138
496
> 1000
AN3CA
N549K
Передачи сигнала
Рак эндометрия
Роста клеток
122
684
> 1000
FGFR3
дикий тип
Киназ
122
530
MGH-U3
Y375C
Передачи сигнала
Рак мочевого пузыря
Роста клеток
204
296
251
> 1000
> 1000
ОРМ2
К650Е
Передачи сигнала
Миелома
Роста клеток
120
296
319
297
6198
FGFR4
дикий тип
Киназ
697
341
451
2023
MDA-453
Y367C
Передачи сигнала
Рак молочной железы
Роста клеток
275
> 1000
4227
1542
> 10000
124
Соединение 1 селективно ингибировало рост и передачу сигнала в мутантных по FGFR2 линиях клеток рака эндометрия. Соединение 1 ингибировало линии клеток рака эндометрия AN3CA и MFE-296 по сравнению с клеточными линиями Нес-1-В и RL95-2 с wtFGFR2 (фиг.22). Соединение 1 ингибировало передачу сигнала в клетках AN3CA, в частности фосфорилирование FRS2a и Erk 1/2, как определяли посредством анализа действия различных концентраций соединения 1 на клетки AN3CA вестерн-иммуноблоттингом. В таблице 13 представлена итоговая информация об активности соединения 1 в линиях клеток рака эндометрия AN3CA и MFE-296 по сравнению с клеточными линиями Нес-1-В и RL95-2 с wtFGFR2.
Таблица 13
Итоговая информация об активности соединения 1 в линиях
клеток рака эндометрия
Клеточная линия
Статус FGFR2
Соединение 1
Фосфо-РКБ2а 1С50 (нМ)
Фосфо-Егк1/2 1С50 (нМ)
Рост GI50 (нМ)
AN3CA
N549K
3,7
5, 8
MFE-296
N549K
2,7
5, 5
НЕС-1-В
дикий тип
> 1000
> 1000
490
RL95-2
дикий тип
> 1000
> 1000
428
Пероральная доставка соединения 1 ингибировала рост ксенотрансплантата мутантной по FGFR-2 опухоли эндометрия AN3CA. Соединение 1 ингибировало рост опухоли AN3CA на 4 9% и 82% при 10 и 30 мг/кг, соответственно (фиг.23) . Через б часов после дозирования соединение 1 ингибировало фармакодинамические маркеры. Пероральное дозирование соединения 1 ингибировало передачу сигнала FRS2a и Erk 1/2 в ксенотрансплантате AN3CA, как через б часов после дозирования определяли посредством анализа вестерн-иммуноблоттингом фосфорилированного и нефосфорилированного FRS2a, фосфорилированной и
нефосфорилированной Erkl/ и глицеральдегид-3-
фосфатдегидрогеназы в качестве контроля (данные не показаны).
Эти данные демонстрируют, что соединение 1 является
125
эффективным перорально доступным общим ингибитором FGFR. Активность наблюдали в нескольких типах рака, включая рак желудка, эндометрия, мочевого пузыря и множественную миелому. Активность соединения 1 предпочтительно сравнивали с другими ингибиторами с известной активностью в отношении FGFR, где эти ингибиторы оценивали в клинике. Кроме того, пероральное введение соединения 1 эффективно ингибирует рост опухоли в модели рака эндометрия, экспрессирующей клинически значимую мутацию FGFR2 N549К.
Пример 9: Синергическая противоопухолевая активность соединения 1 с ингибитором mTOR в моделях рака
На фиг.24А представлено ингибирование соединением 1 роста клеточной линии AN3CA для различных концентраций ридафоролимуса, соединения 1 и комбинации соединения 1 с ридафоролимусом. На фиг.24В представлено ингибирование соединением 1 роста клеточной линии MFE-2 9 6 для различных концентраций ридафоролимуса, соединения 1 и комбинации соединения 1 с ридафоролимусом. Концентрации приведены в виде функции от ЕС50. Комбинация соединения 1 с ридафоролимусом обеспечивала синергическое действие по сравнению с одним соединением на обе мутантные по FGFR2 линии клеток рака эндометрия AN3CA и MFE-2 96. Для клеточной линии AN3CA (фиг.2 5А) и клеточной линии MFE-2 9 6 (фиг.2 5В) приведены анализы среднего действия комбинации соединения 1 с ридафоролимусом на клеточную линию AN3CA. Для клеточной линии AN3CA синергическое действие наблюдали в диапазоне концентраций от 4,3 до 1000 нМ соединения
1 с ридафоролимусом от 0,05 до 13 нМ (фиг.25А) . Для клеточной линии MFE-2 9 6 синергическое действие наблюдали в диапазоне концентраций от 14 до 750 нМ соединения 1 с ридафоролимусом от 0,14 до 7,5 нМ (фиг.2 5В).
Анализы клеточного цикла проводили в клетках AN3CA через
2 4 часа обработки ридафоролимусом, соединением 1 и комбинацией соединения 1 с ридафоролимусом. При обработке комбинацией соединения 1 с ридафоролимусом по сравнению с клетками, необработанными или обработанными только одним соединением, наблюдали усиленный арест клеточного цикла в течение цикла G0-
126
G1 (фиг.26).
Также определяли действие соединения 1 и ридафоролимуса на различные сигнальные молекулы в клеточной линии AN3CA посредством анализа вестерн-иммуноблоттингом через 24 часа после дозирования. Комбинация соединения 1 (при 30 или 300 нМ) с ридафоролимусом (при 0,5 или 5 нМ) приводила к ингибированию передачи сигнала FRS2a, Erkl/2 и S6 (данные не показаны).
Фиг.27 представляет собой схему, демонстрирующую возможную модель пути FGFR2 и mTOR. Без желания быть ограниченным теорией полагают, что в этой модели соединение 1, по-видимому, ингибирует путь FGFR2/MAPK, а ридафоролимус, по-видимому, ингибирует путь mTOR.
После пероральной доставки комбинации соединения 1 с ридафоролимусом в ксенотрансплантате опухоли, мутантной по FGFR2 AN3CA, наблюдали увеличенную противоопухолевую активность. На фиг.2 8А представлено ингибирование роста опухоли AN3CA комбинацией низкой дозы соединения 1 (10 мг/кг) с ридафоролимусом (0,3 или 1,0 мг/кг). На фиг.2 8В представлено ингибирование AN3CA роста опухоли комбинацией высокой дозы соединения 1 (30 мг/кг) с ридафоролимусом (0,3 или 1,0 мг/кг). Результаты представлены для ежедневного перорального дозирования соединения 1 (черные линии на фиг.2 8А и 2 8В) и ежедневного дозирования ридафоролимуса в течение пяти суток в неделю (серые линии на фиг.2 8А и 2 8В) . В таблице 14 предоставлена итоговая информация об эффективности соединения 1 и ридафоролимуса в модели с ксенотрансплантатом AN3CA, где "TGI" означает ингибирование роста опухоли относительно носителя.
Таблица 14
Эффективность соединение 1 и ридафоролимуса в модели с
ксенотрансплантатом AN3CA
Соединение 1 (мг/кг)
Рида ф оролимус (мг/кг)
TGI (%)
Регресс (%)
0,3
127
0,3
0,3
Зависимость фармакодинамики и фармакокинетики in vivo также определяли через б часов после дозирования (фиг.29). Также приведены уровни соединения 1 в плазме через б часов после дозирования (фиг.29).
В отношении роста мутантных по FGFR2 клеток рака эндометрия наблюдали синергическую активность соединения 1 и ридафоролимуса. Эти данные свидетельствуют, что соединение 1 и ридафоролимус обладают сильной комбинаторной активностью в моделях мутантного по FGFR2 рака эндометрия. Без желания быть ограниченным теорией полагают, что сильного двойного ингибирования достигают через пути FGFR2/MAPK и mTOR посредством соединения 1 и ридафоролимуса, соответственно. Синергическое действие комбинации соединения 1 с ридафоролимусом наблюдали посредством анализов роста клеток in vitro и регресса опухоли, индуцируемого in vivo.
Соединение 1 представляет собой общий ингибитор FGFR с сильной активностью в различных моделях опухолей под контролем FGFR. Двойное ингибирование передачи сигнала FGFR2 соединением 1 и передачи сигнала mTOR ингибитором mTOR, таким как ридафоролимус, приводит к синергической активности в моделях рака эндометрия под контролем FGFR2 in vitro и регрессу опухоли in vivo.
Эти данные предоставляют основание для использования соединения 1 в комбинации с ингибитором mTOR для лечения нарушений, ассоциированных с патологической клеточной пролиферацией, такой как неоплазии, рак и состояния, ассоциированные с патологическим ангиогенезом. Неограничивающие примеры видов рака, которые можно лечить с использованием композиций, способов или наборов по изобретению, включают карциному мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки,
128
почки, печени, легкого, головы и шеи, желчного пузыря, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы, предстательной железы или кожи; плоскоклеточную карциному; рак эндометрия; множественную миелому; гемопоэтическую опухоль лимфоидного происхождения (например, лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластным лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому или лимфому Беркитта); гемопоэтическую опухоль миелогенного происхождения (например, острый миелогенный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, множественный миелогенный лейкоз, миелодиспластический синдром или промиелоцитарный лейкоз); опухоль мезенхимального происхождения (например, фибросаркому или рабдомиосаркому); опухоль центральной или периферической нервной системы (например, астроцитому, нейробластому, глиому или шванному); меланому; семиному; тератокарциному; остеосаркому и саркому Капоши. Неограничивающие примеры состояний, ассоциированных с аберрантным ангиогенезом, которые можно лечить с использованием композиций, способов или наборов по изобретению, включают солидные опухоли, диабетическую ретинопатию, ревматоидный артрит, псориаз, атеросклероз, хроническое воспаление, ожирение, дегенерацию желтого пятна и сердечно-сосудистое заболевание.
Другие варианты осуществления
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этом описании включены в настоящий документ путем ссылки в той же степени как если бы каждая независимая публикация или патентная заявка были конкретно и индивидуально указаны для включения в качестве ссылки. Предварительные патентные заявки США №№ 61/256669, поданная 30 октября 2009 года, 61/256690, поданная 30 октября 2009 года, и 61/261014, поданная 13 ноября 2 009 года, включены в настоящий документ путем ссылки.
Хотя изобретение описано применительно к конкретным вариантам его осуществления, следует понимать, что возможны дополнительные модификации и эта заявка предназначена для включения любых вариаций, применений или адаптаций изобретения,
129
которые в целом соответствуют характеру изобретения и включают такие отклонения от настоящего описания, которые соответствуют известному или общепринятому практическому осуществлению в области, к которой принадлежит изобретение, и которые можно применять к существенным признакам, указанным выше в настоящем документе и входящим в область формулы изобретения.
Другие варианты осуществления определяются формулой изобретения.
131
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтическая композиция, подходящая для перорального введения, содержащая соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль в количестве, эффективном для лечения неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения при введении индивидууму, и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, содержащая гидрохлоридную соль соединения 1.
3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, которую формулируют в единичной дозированной форме.
4. Фармацевтическая композиция по п.З, содержащая от 30 до 300 мг соединения 1.
5. Фармацевтическая композиция по п.З, содержащая 20±4 мг, 25±5 мг, 30±б мг, 40±8 мг или 45±9 мг соединения 1.
6. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, которую формулируют в твердой единичной дозированной форме.
7. Фармацевтическая композиция по п.б, где указанная твердая единичная дозированная форма представляет собой таблетку, мягкую капсулу или твердую капсулу.
8. Фармацевтическая композиция по п.б, содержащая от 30 до 300 мг соединения 1.
9. Фармацевтическая композиция по п.б, содержащая 20±4 мг, 25±5 мг, 30±б мг, 40±8 мг или 45±9 мг соединения 1.
10. Способ лечения неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения у нуждающегося в этом индивидуума, где указанный способ включает пероральное введение указанному индивидууму от 3 0 до 300 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли.
11. Способ по п.10, где указанному индивидууму перорально вводят среднюю суточную дозу 20±4 мг, 25±5 мг, 30±б мг, 40±8 мг или 4 5±9 мг соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли в единичной дозированной форме.
12. Способ по п.10, где соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят указанному индивидууму чаще, чем одни сутки в неделю или в среднем от 4 до 7 раз за
132
каждый 7-суточный период.
13. Способ по п.12, где соединение 1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят указанному индивидууму ежедневно.
14. Способ по любому из пп.10-13, где указанный индивидуум страдает хроническим миелогенным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом, острым миелогенным лейкозом, миелодиспластическим синдромом, раком желудка, раком эндометрия, раком мочевого пузыря, множественной миеломой, раком молочной железы, раком предстательной железы, раком легких, колоректальным раком, раком почки или глиобластомой.
15. Способ по п.14, где указанный индивидуум страдает хроническим миелогенным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом или острым миелогенным лейкозом.
16. Способ по любому из пп.10-15, где указанный индивидуум находится в состоянии, устойчивом к лечению иматинибом, нилотинибом или дазатинибом.
17. Способ по любому из пп.10-16, где указанный индивидуум находится в положительном по филадельфийской хромосоме состоянии.
18. Способ по любому из пп.10-14, где у указанного индивидуума присутствует солидный рак, устойчивый к лечению ингибитором или антагонистом VEGF или VEGF-R.
19. Способ по п.18, где указанный солидный рак устойчив к лечению бевацизумабом, сорафенибом или сунитинибом.
20. Способ по любому из пп.10-17, где у указанного индивидуума присутствует рак, экспрессирующий мутантную BCR-ABL.
21. Способ по п.20, где указанная мутантная BCR-ABL представляет собой BCR-ABLT3151, BCR-ABLF317L или BCR-ABLF359C.
22. Способ по любому из пп.10-19, где у указанного индивидуума присутствует рак, экспрессирующий мутанты FLT3, KIT, FGFR1 или PDGFRa.
23. Способ по п.22, где указанные мутанты представляет собой FLT3-ITD, c-KIT, FGFR10P2-FGFR1 или F1P1L1-PDGFRa.
24. Способ по любому из пп.10-23, где указанное соединение
133
1 или его фармацевтически приемлемую соль вводят совместно или одновременно с ингибитором mTOR, каждый в таком количестве, что совместное количество эффективно для лечения указанной неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения.
25. Способ по п.24, где указанный ингибитор mTOR выбран из группы, состоящей из сиролимуса, эверолимуса, темсиролимуса, ридафоролимуса, биолимуса, зотаролимуса, LY294002, Рр242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, вортманнина, кверцетина, мирицентина и стауроспорина, и их фармацевтически приемлемых солей.
26. Набор, содержащий (i) фармацевтическую композицию, подходящую для перорального введения соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, эффективном для лечения неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения при введении индивидууму, и один или несколько фармацевтически приемлемых эксципиентов; и (ii) инструкцию для введения указанной фармацевтической композиции индивидууму для лечения указанной неоплазии, рака или гиперпролиферативного нарушения.
27. Набор по п.2 6, где указанный индивидуум страдает хроническим миелогенным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом, острым миелогенным лейкозом, миелодиспластическим синдромом, раком желудка, раком эндометрия, раком мочевого пузыря, множественной миеломой, раком молочной железы, раком предстательной железы, раком легких, колоректальным раком, раком почки или глиобластомой.
По доверенности
185318
1/27
100
ю _ ю II i 2 i ^
го 2 о° го о
I CM s 10 го 14
Соединение 1 (нМ) ФИГ.1А
100 -I
lUUlllu
? 60
i i Ё 2 15 ° ^ ° S
- i| ix ii - о
го 2 ой то о
5 О с 2 Й Щ
CM s 10 го
i =с Соединение 1 (нМ)
ФИГ.1В
Здоровые индивидуумы (N=3) CML М-ВС (N=3)
ФИГ.2А
2/27
ФИГ.2В
ФИГ.2С
3/27
ФИГ.ЗВ
4/27
Природная
О 10 20 30
Сутки после инъекции клеток Ba/F3
ФИГ.4А
Носитель
Соединение 1 при 2,5 мг/кг Соединение 1 при 5 мг/кг Дазатиниб при 5 мг/кг
T315I
Носитель
Соединение 1 при 2,5 мг/кг Соединение 1 при 5 мг/кг Соединение 1 при 15 мг/кг Соединение 1 при 25 мг/кг
О 10 20 30 40
Сутки после инъекции клеток Ba/F3
ФИГ.4В
5/27
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 -- Период дозирования
5 10 15
Сутки после исходной обработки
ФИГ.4С
jfo Носитель
Соединение 1 при 2,5 мг/кг Соединение 1 при 5 мг/кг -О(tm) Соединение 1 при 10 мг/кг Соединение 1 при 30 мг/кг Ж~- Соединение 1 при 50 мг/кг
100
0) 5 X ГО
Период дозирования
"1 -I
-1 I
wwerat Носитель
--- Дазатиниб при 30 мг/кг
......Дазатиниб при 100 мг/кг
- Дазатиниб при 300 мг/кг
Сутки после инъекции клеток Ba/F3
среднее выживание (сутки)
значение р
Носитель
Дазатиниб при 30 мг/кг
<0.01
Дазатиниб при 100 мг/кг
<0.01
Дазатиниб при 300 мг/кг
14,5
Я3.05
ФИГ.5
6/27
Мутанты BCR-ABL, выявляемые в присутствие соединения 1
(Начиная с природной BCR-ABL)
Разрастание (% лунок)
со о
о с;
X Л
ф тс с; ш
Е со
ее ф
Q. О
100 80 60 40 20 0
100 80 60 40 20 0
100 80 60 40 20 0 10 нМ
(N = 157)
Е Н / Н /у N v V I I G /1 F С
о ю
емпююсмеоюг^оог^оо юююооспаз-^-^пюооп
(NCM(NCM(NCMP)P)COnP)*
О^Ш5?:ш-||-|-1_> и__1сл
1-v
20 нМ
(N = 3)
ос\1соююс\1союг^а> а> г^со
ЮЮЮЮСОСПСП-^-^ГОЮСОСО 00> Ш^Ш-II- LL> LL_IC/3
40 нМ
(N = 0)
* ОТСУТСТВИЕ ВЫЯВЛЯЕМЫХ КЛОНОВ"
осчсоююсмсоюг^аэаэг^со ююююсоота> 1-ч-союсосо
00> ш^ш-1ни-> и--1со 11.7%
0.2%
0.0%
ФИГ.6А
7/27
Мутанты BCR-ABL, выявляемые в присутствие соединения 1
(Начиная с природной BCR-ABL13151)
Разрастание (% лунок)
100 80 60 40 20 0
Е Н
40 нМ
(N = 140)
N N|
CMCOLO-s-LOCOT-LOr^OOCO
г-ююююооооаз-^-^смюооа)
oCMCMCMCNICMCMCMCOcOCOCOCOCO
- оо^шш^: - ll - _iu_ СО 40.0%
100 80 60 40 20 0
ю со
I К
PJ 80 нМ
(N = 71)
осмсоют-юсот-юг^а> осо
ЮЮЮЮСОСООЭ'*- СМ Ю СО ОЭ
СМСМСМСМСМСМСМСОсОСОСОСОСО СЭО^ШШ^ - Ll_ - _I Ll_ < I
15.6%
100 80 60 40 20
I v 160 нМ
(N = 32)
юиоююсооого-^-^смюсоа)
СМСМСМСМСМСМСМСОсОСОСОСОСО
ща^шш^: - и. - j и. < i
8.8%
100 80 60 40 20
о 320 нМ
(N = 1)
OCNCOLOt-LOCO't-LOr^CTJOCO
ююююсосоа> ч-т-смюсосл
СМСМСМСМСМСМСМСОсОСОСОСОСО 00> ШШ^ - LL - _I 1L < I
0.2%
100 80 60 40 20
о 640 нМ
(N = 0)
* ОТСУТСТВИЕ ВЫЯВЛЯЕМЫХ КЛОНОВ *
О СМ СО Ю т- Ю СО Ю Ю Ю Ю СО СО О)
Ю N О) О (О
см ю со о
СОСМСМСМСМСМСМСМСОсОСОСОСОСО
о а > -
< X
0.0%
ФИГ.6В
8/27
140
Доза (мг) ФИГ.7А
Доза (мг) ФИГ.7В
9/27
Время (час)
ФИГ.7С
Время (час)
ФИГ.70
10/27
ш о н
и 8
5 ГО
0 6 со
I-о
1 4
ц о
И Длительное Ш Транзиторное Отсутствует
Все пациенты
Пациенты с T315I
ФИГ.8А
70 60 50 Й 40
а, 30
10 О
СТ.
т со
СТ. ¦
Моменты времени сбора
ФИГ.8В
11/27
Моменты времени сбора ФИГ.8А
Моменты времени сбора ФИГ.8Р
12/27
ФИГ.9
13/27
"(tm)#"(tm)4 часа H^8 часов 16 часов ая#яв24 часа
Q I I I I 111 IT"
тп-
0.01
0.1
100
Соединение 1 (нМ)
ФИГ.10
14/27
ФИГ.11А
ФИГ.11В
15/27
ФИГ.13
16/27
ФИГ.14
Соединение 1 (нМ)
ФИГ.15
17/27
RT112 GI50 > 1000 нМ
Соединение 1 (нМ)
ФИГ.17
18/27
NCI-H929 GI50 > 1000 нМ
0.1 10 1000
Соединение 1 (нМ)
ФИГ.18
19/27
2000
I 1500
s с: о
5 1000
500
0 2
Период ежедневного перорального --¦ дозирования
4 6 8 10
Время (сутки)
Г | Соединение 1, 3 мг/кг
\ Носитель
# \ Соединение 1,10 мг/кг
* \ Соединение 1, 30 мг/кг
р <0.01
12 -I
ФИГ.20
20/27
AN3CA MFE-296 Нес-1-В RL95-2
10 100
Соединение 1 (нМ) ФИГ.22
2500.00
2000.00 -
S [ 500.00 С
> с о
5 1000.00 ш
500.00 -
0.00
5 10 15
Время (сутки)
1000
Носитель
Соединение 1: 3 мг/кг Соединение 1:10 мг/кг Соединение 1: 30 мг/кг
*Р <0.05
Период ежедневного перорального дозирования
ФИГ.23
21/27
100 -
н I
zr о
# Ридафоролимус а Соединение 1
# Комбинация
0.125 0.25
ФИГ.24А
юо -
с5 о
Н I CD
zr о
# Ридафоролимус а Соединение 1
# Комбинация
0.125 0.25
ФИГ.24В
22/27
Антагонизм
Аддитивность
Синергия
0.05 0.15 0.25 0.35 0.45 0.55 0.65 0.75
Задействованная фракция
0.85
0.95
кчччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччччч
Соединение 1: 4,3-1000 нМ Ридафоролимус: 0,05-13 нМ
ФИГ.25А
23/27
Антагонизм
Аддитивность
Синергия
- -
i i i i i i i i
1.05 0.15 0.25 0.35 0.45 0.55 0.65 0.75 0.85 0.95
Задействованная фракция КЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧЧ
Соединение 1: 14-750 нМ Ридафоролимус: 0,14-7,5 нМ
ФИГ.25В
100
Sub G1
G0-G1 S Фаза клеточного цикла
G2-M
? Необработанные
? Ридафоролимус (5 нМ) Ш Соединение 1 (30 нМ)
¦ Ридафоролимус (5 нМ) + Соединение 1 (30 нМ)
ФИГ.26
25/27
FGFR2
(Модифицировано на основе Katoh М., J. Invest. Dermatol., 2009,128 1861-1867)
ФИГ.27
26/27
2500 -,
Схема дозирования: Соединение 1 (черная линия) - ежедневно;
Рид. (серая линия) - ежедневнохб/неделю, 21 сутки
ФИГ.28А
2500 -,
Схема дозирования: Соединение 1 (черная линия) - ежедневно;
Рид. (серая линия) - ежедневнохб/неделю, 21 сутки
ФИГ.28В
27/27
Концентрации лекарственного средства в плазме
Рид. (мг/кг): Соединение 1 (мг/кг):
F-FRS2
F-ERK
T-ERK
P-S6
T-S6
Рид. (нг/кг): Соединение 1 (нг/кг):
1.0
......... -- :
^SSS^' "-^Si^*:
¦,^^}^y.v,\y№№!v.vA%WA^
\ч\ч^х- "WW^
_____________________
521 415 31 - - - 588 IS 4Ж 161 141 130 30 12$ 1S ФИГ.29