[**]

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые связываются с рецептором NR1H4 (FRX) и действуют в качестве агонистов рецептора NR1H4 (FRX). Изобретение также относится к применению соединений для получения лекарственного средства для лечения заболеваний и/или состояний за счет связывания указанного ядерного рецептора указанными соединениями, а также к способу синтеза указанных соединений.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к соединениям, которые связываются с рецептором NR1H4 (FRX) и действуют в качестве агонистов рецептора NR1H4 (FRX). Изобретение также относится к применению соединений для получения лекарственного средства для лечения заболеваний и/или состояний за счет связывания указанного ядерного рецептора указанными соединениями, а также к способу синтеза указанных соединений.

---

Евразийское (21) 201290047 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.09.30
(22) Дата подачи заявки 2010.08.19
(51) Int. Cl. C07D 249/06 (2006.01) C07D 261/08 (2006.01) C07D 413/04 (2006.01) C07D 413/12 (2006.01) C07D 413/14 (2006.01) A61K31/4192 (2006.01) A61K31/42 (2006.01) A61K31/443 (2006.01) A61K31/4439 (2006.01) A61P1/16 (2006.01) A61P3/10 (2006.01) A61P35/00 (2006.01)
(54) НОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ ФАРНЕЗОИДНЫЙ Х-РЕЦЕПТОР (FXR) (NR1H4) И МОДУЛИРУЮЩИЕ ЕГО АКТИВНОСТЬ
(31) 09010676.6; 61/235,117
(32) 2009.08.19
(33) EP; US
(86) PCT/EP2010/005093
(87) WO 2011/020615 2011.02.24
(71) Заявитель:
ФЕНЕКС ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ АГ
(DE)
(72) Изобретатель:
Кремозер Клаус, Абель Ульрих, Штеенек Кристоф, Кинцель Олаф
(DE)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к соединениям, которые связываются с рецептором NR1H4 (FRX) и действуют в качестве агонистов рецептора NR1H4 (FRX). Изобретение также относится к применению соединений для получения лекарственного средства для лечения заболеваний и/или состояний за счет связывания указанного ядерного рецептора указанными соединениями, а также к способу синтеза указанных соединений.
К заявке № 201290047
НОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ ФАРНЕЗОИДНЫЙ Х-РЕЦЕПТОР (FXR) (NR1H4) И МОДУЛИРУЮЩИЕ ЕГО АКТИВНОСТЬ
Настоящее изобретение относится к соединениям, которые связываются с 5 рецептором NR1H4 (фарнезоидный Х-рецептор, FXR) и действуют как агонисты или модуляторы рецептора NR1H4 (FXR). Изобретение также относится к применению указанных соединений для лечения и/или профилактики заболеваний и/или состояний за счет связывания указанного ядерного рецептора указанными соединениями.
Многоклеточные организмы находятся в зависимости от сложных механизмов 10 передачи информации между клетками и частями тела. Передаваемая информация может быть весьма сложной, и результатом ее передачи может являться изменение генетических программ, вовлеченных в дифференцировку, пролиферацию или репродукцию клеток. Сигналы, или гормоны, часто представляют собой низкомолекулярные соединения, такие как пептиды, жирные кислоты или производные 15 холестерина.
Многие из данных сигналов оказывают свое действие за счет изменения в конечном счете транскрипции конкретных генов. Одной хорошо изученной группой белков, которые опосредуют ответ клетки на множество сигналов, является семейство транскрипционных факторов, известных как ядерные рецепторы, в дальнейшем часто
20 обозначаемые "ЯР". Члены данной группы включают рецепторы стероидных гормонов, витамина D, экдизона, цис- и транс-ретиноевой кислоты, тиреоидного гормона, желчных кислот, производных холестерина, жирных кислот (и других пролифераторов пероксисом), также как и так называемые "сиротские" рецепторы, представляющие собой белки, которые структурно сходны с другими членами данной группы, но лиганды для
25 которых неизвестны. Сиротские рецепторы могут указывать на неизвестные сигнальные пути в клетке или могут представлять собой ядерные рецепторы, функционирующие без активации лигандом. Активация транскрипции некоторыми из данных сиротских рецепторов может происходить в отсутствие экзогенного лиганда и/или через пути сигнальной трансдукции, начинающиеся от поверхности клетки (D. Mangelsdorf et al. "The
30 nuclear receptor superfamily: the second decade", Cell 1995, 83(6), 835-839, R. Evans "The nuclear receptor superfamily: a rosetta stone for physiology" Mol. Endocrinol. 2005, 19(6), 1429-1438).
В общем случае, в ЯР выделяют три функциональных домена. Аминоконцевой домен, как полагают, обладает некоторой регуляторной функцией. За ним следует ДНК-35 связывающий домен, в дальнейшем называемый "ДСД", который обычно содержит два цинковых пальца и распознает специфический элемент гормонального ответа, в дальнейшем называемый "ЭГО", в промоторах генов, отвечающих за указанный ответ. Конкретные аминокислотные остатки в "ДСД", как было показано, обеспечивают
специфичность связывания с последовательностью ДНК (М. Schena "Mammalian
glucocorticoid receptor derivatives enhance transcription in yeast", Science 1988, 241(4868),
965-967). Лигандсвязывающий домен, в дальнейшем называемый "ЛСД", расположен в
карбоксиконцевом участке известных ЯР.
5 В отсутствие гормона, ЛСД, по-видимому, препятствует взаимодействию ДСД с
ЭГО. Связывание гормона, по-видимому, приводит к конформационному изменению в ЯР и, таким образом, обуславливает это препятствование (A. Brzozowski et al. "Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor" Nature 1997, 389(6652), 753-758). ЯР без ЛСД конститутивно активирует транскрипцию, но на низком уровне.
10 Коактиваторы или транскрипционные активаторы, как полагают, выступают
связующим звеном между специфичными к последовательности факторами транскрипции, основным аппаратом транскрипции, и, кроме того, влияют на структуру хроматина целевой клетки. Несколько белков, таких как SRC-1, ACTR и Gripl, взаимодействуют с ЯР способом, при котором взаимодействие усиливается за счет
15 лиганда (D. Heery et al. "A signature motif in transcriptional co-activators mediates binding to nuclear receptors" Nature 1997, 387(6634), 733-736; T. Heinzel et al. "A complex containing N-CoR, mSin3 and histone deacetylase mediates transcriptional repression" Nature 1997, 387(6628), 16-17; K. Nettles, G. Greene "Ligand control of coregulator recruitment to nuclear receptors" Annu. Rev. Physiol. 2005, 67, 309-333).
20 Модуляторы ядерных рецепторов, такие как стероидные гормоны, влияют на рост
и функционирование конкретных клеток за счет связывания с внутриклеточными рецепторами и образования комплексов ядерных рецепторов с лигандами. Комплексы ядерных рецепторов с гормонами затем взаимодействуют с элементом гормонального ответа (ЭГО) в контрольной области конкретных генов и изменяют экспрессию
25 конкретных генов (A. Aranda, A. Pascual "Nuclear hormone receptors and gene expression" Physiol. Rev. 2001, 81(3), 1269-1304).
Фарнезоидный Х-рецептор альфа (в дальнейшем также часто называемый NR1H4, когда речь идет о рецепторе человека) представляет собой прототипный ядерный рецептор типа 2, который активирует гены при связывании с промоторным
30 участком целевых генов гетеродимерным образом с ретиноидным Х-рецептором (В. Forman et al. "Identification of a nuclear receptor that is activated by farnesol metabolites" Cell 1995, 81(5), 687-693). Соответствующими физиологичискими лигандами NR1H4 являются желчные кислоты (D. Parks et al. "Bile acids: natural ligands for an orphan nuclear receptor" Science 1999, 284(5418), 1365-1368; M. Makishima et al. "Identification of a nuclear receptor
35 for bile acids" Science 1999, 284(5418), 1362-1365). Наиболее сильным лигандом является хенодезоксихолевая кислота (ХДХК), которая регулирует экспрессию нескольких генов, участвующих в гомеостазе желчных кислот. Фарнезол и его производные, вместе называемые фарнезоидами, как сообщалось первоначально, активируют крысиный
ортолог в высокой концентрации, но они не активируют рецептор человека или мыши. FXR экспрессируется в печени, во всем желудчно-кишечном тракте, включая пищевод, желудок, двенадцатиперстную кишку, тонкий кишечник, толстую кишку, в яичниках, надпочечниках и почках. Помимо контролирования внутриклеточной экспрессии генов, 5 FXR, по-видимому, также вовлечен в паракринную и эндокринную передачу сигналов посредством повышающей регуляции экспрессии цитокина - фактора роста фибробластов 15 (грызуны) или 19 (обезьяны, люди) J. Holt et al. "Definition of a novel growth factor-dependent signal cascade for the suppression of bile acid biosynthesis" Genes Dev. 2003, 17(13), 1581-1591; T. Inagaki et al. "Fibroblast growth factor 15 functions as an
10 enterohepatic signal to regulate bile acid homeostasis" Cell Metab. 2005, 2(4), 217-225).
Существует одна публикация, в которой высказано предположение о прямом влиянии активации FXR на выживаемость возбудителей инфекции, таких как бактерии или протозойные паразиты, посредством активирования лизосомального фактора гибели/выживания Тасо-2 в макрофагах (P. Anandet al. "Downregulation of TACO gene
15 transcription restricts mycobacterial entry/survival within human macrophages" FEMS Microbiol. Lett. 2005, 250(1), 137-144). Это могло бы проложить путь для дальнейших исследований, направленных на оценку способности FXR выступать в качестве мишени для лекарственного средства для лечения внутриклеточных бактериальных или паразитарных инфекций, таких как туберкулез, проказа, лейшманиоз или трипаносомоз, например,
20 болезнь Чагаса.
Низкомолекулярные соединения, которые действуют как модуляторы FXR, были предложены в следующих публикациях: WO 2000/037077, WO 2003/015771, WO 2004/048349, WO 2007/076260, WO 2007/092751, WO 2007/140174, WO 2007/140183, WO 2008/051942, WO 2008/157270, WO 2009/005998, WO 2009/012125, WO 2008/025539 и
25 WO 2008/025540. Недавно вышел обзор дополнительных низкомолекулярных модуляторов FXR (R. С. Buijsman et al. "Non-Steroidal Steroid Receptor Modulators" Curr. Med. Chem. 2005, 12, 1017-1075).
В публикации WO 2000/037077 предложены соединения, имеющие следующую общую формулу
где Х1 представляет собой СН, N; Х2 представляет собой О или NH; R и независимо
представляют собой Н, низший алкил, галоген или CF3; R2 представляет собой низший
алкил; R3 и R4 независимо представляют собой Н, низший алкил, галоген, CF3, ОН,
О-алкил или О-полигалоалкил.
5 В более предпочтительном варианте реализации в публикации WO 2000/037077
предложено соединение GW4064,
которое было также впервые опубликовано в источнике Maloney et al. "Identification of a 10 chemical tool for the orphan nuclear receptor FXR" J. Med. Chem. 2000, 43(16), 2971-2974. Akwabi-Ameyaw et al. "Conformationally constrained Farnesoid X Receptor Agonists: Naphtoic acid-based analogs of GW4064", Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18(15), 4339-4343 упоминает возможные недостатки данного агониста FXR. Согласно этой публикации, GW4064 показывает плохую фармакокинетику с низкой пероральной биодоступностью и 15 низким содержанием вещества в плазме, а также короткий период полувыведения из плазмы.
Кроме того, транс-стильбеновый фрагмент этой молекулы и родственные агонисты FXR из публикации WO 2000/037077 ставят вопрос о возможном токсикофоре, обсуждаемый в Kuo et al. "Induction of drug-metabolizing enzymes and toxicity of trans-
20 stilbene oxide in rat liver and kidney." Toxicology 1981, 22(2), 149-160 и в Sugihara et al. "Metabolic activation of the proestrogens trans-stilbene and trans-stilbene oxide by rat liver microsomes.", Toxicol. Appl. Pharmacol. 2000, 167(1), 46-54. Наконец, авторы Akwabi-Ameyaw et al. упоминают, что транс-стильбеновый фрагмент GW4064 ответственен за нестабильность последнего в ультрафиолетовом свете. Фотонестабильность может
25 превратиться в фототоксичность, если соединение при введении его людям подвержено воздействию УФ-света, например, за счет отложения или накопления в коже (см. Colerangle JB. "Regulatory non-clinical photosafety evaluation - An attempt to merge the FDA and EMEA photosafety testing strategies." Regul. Toxicol. Pharmacol. 2009, Jul 16. [Электронная публикация перед печатью] и Henry et al. "Can light absorption and
30 photostability data be used to assess the photosafety risks in patients for a new drug molecule?" J. Photochem. Photobiol. B. 2009, 96(1), 57-62).
С другой стороны, данный конъюгированный транс-стильбен является основой
для активности GW4064, так как авторы упоминают, что простое восстановление двойной связи до этиленовой группы приводит к уменьшению лигандсвязывающих свойств FXR.
Соответственно, задачей настоящего изобретения является обеспечение технического решения позволяющего преодолеть недостатки агонистов FXR, содержащих 5 транс-стильбеновый фрагмент, предложенных в публикации WO 2000/037077, при сохранении или даже улучшении силы связывания с FXR в противоположность снижению FXR-связывающей активности, наблюдаемому у аналогов GW4064 на основе нафтойной кислоты, описанных в Akwabi-Ameyaw et al.
Эта задача была решена путем обеспечения соединений по п. 1 формулы
10 изобретения. Предпочтительные варианты реализации предложены в формуле изобретения, а также в приведенном далее описании. Согласно настоящему изобретению применяют превращение транс-стильбеновой двойной связи в циклопропильную группу, которое может быть достигнуто путем добавления карбена, с получением соединений, демонстрирующих неожиданное полное устранение вызываемой УФ фотолабильности, и,
15 в то же время, преодоление потенциально токсичных свойств транс-стильбена. Получаемые рацемические смеси проявляют свойства агонистов FXR, сходные со значениями, получаемыми для соответствующих молекул, содержащих транс-стильбен. Кроме того, хиральное разделение рацемических смесей позволило получить индивидуальные энантиомеры, которые демонстрировали даже лучшие FXR-
20 связывающие и трансактивационные свойства по сравнению с соответствующими молекулами, содержащим транс-стильбен, или родственными аналогами на основе нафтойной кислоты, сведения о которых опубликованы в Akwabi-Ameyaw et al. Следовательно, согласно настоящему изобретению предложено более совершенное решение проблемы, связанной с FXR-соединениями, содержащими транс-стильбен, в
25 противоположность другим техническим решениям, опубликованным Akwabi-Ameyaw et al.
Соединения согласно настоящему изобретению имеют общую химическую структуру в соответствии с формулой (1).
где
R выбран из группы, состоящей из COOR6, CONR7R8, тетразолила или Н, где R6 независимо выбран из группы, состоящей из Н или низшего алкила, и R7 и R8 независимо 35 друг от друга выбраны из группы, состоящей из Н, низшего алкила, Ci_6 галоалкила, Ci-6 алкилена-Rg, БОг-С^ алкила, где R9 выбран из группы, состоящей из СООН, ОН или
А выбран из группы, состоящей из фенила, пиридила, пиразолила, индолила, тиенила, бензотиенила, индазолила, бензизоксазолила, бензофуранила, бензотриазолила, фуранила, бензотиазолила, тиазолила, каждый из которых возможно замещен одной или 5 двумя группами, независимо выбранными из группы, состоящей из ОН, низшего алкила, низшего циклоалкила или галогена;
Q выбран из группы, состоящей из фенила, пиридила, тиазолила, тиофенила, пиримидила, каждый из которых возможно замещен одной или двумя группами, независимо выбранными из группы, состоящей из низшего алкила, галогена или CF3;
где
Х = СН, N, N0;
15 R-\ выбран из группы, состоящей из водорода, СгС3 алкила, С3-С6 циклоалкила, С4-С5 алкилциклоалкила, где С-\.3 алкил возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, гидрокси или С^алкокси;
R2 и R3 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, СгС3 алкила, СгС3
галоалкила, СгС3 алкокси, СгС3 галоалкокси и галогена.
20 В настоящем изобретении термин "низший алкил" обозначает алкильную группу,
которая может быть неразветвленной или разветвленной, предпочтительно
неразветвленной, и содержит от 1 до 6, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода.
Предпочтительные примеры представляют собой метил и этил, изопропил и т-бутил.
Термин "низший циклоалкил" обозначает циклоалкильную группу, содержащую от 3 до 6 25 атомов углерода. Циклопропил является особенно предпочтительным. Примеры атомов
галогена, применяемых в настоящем изобретении в качестве заместителей, как
перечислено выше, представляют собой F, CI и Вг, причем, CI является
предпочтительным.
В предпочтительном варианте реализации в комбинации с любыми выше- и 30 нижеприведенными вариантами реализации соединения согласно настоящему изобретению представлены структурой в соответствии с формулой (1).
где
R выбран из группы, состоящей из COOR6, CONR7R8, тетразолила или Н, где R6, R7 и R8 5 независимо выбраны из группы, состоящей из Н, низшего алкила;
А выбран из группы, состоящей из фенила, пиридила, индолила, тиенила, бензотиенила, индазолила, бензизоксазолила, бензофуранила, бензотриазолила, фуранила, бензотиазолила, тиазолила, каждый из которых возможно замещен одной или двумя группами, независимо выбранными из группы, состоящей из ОН, низшего алкила, низшего 10 циклоалкила;
Q выбран из группы, состоящей из фенила, пиридила, тиазолила, тиофенила, пиримидила, каждый из которых возможно замещен одной или двумя группами, независимо выбранными из группы, состоящей из низшего алкила, галогена или CF3;
где
Х = СН, N, N0;
R-i выбран из группы, состоящей из водорода, СгС3 алкила, СгС3 галоалкила, С3-С6 20 циклоалкила, С4-С5 алкилциклоалкила;
R2 и R3 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, СгС3 алкила, СгС3
галоалкила, СгС3 алкокси, СгС3 галоалкокси и галогена.
Предпочтительно R выбран среди COOR6 и CONR7R8, где R6, R7 и R8 имеют
значения, определенные выше, более предпочтительно R представляет собой COOR6, 25 где R6 имеет значения, определенные выше, предпочтительно R6 выбран среди Н и
низшего алкила.
В равной степени более предпочтительном варианте реализации R представляет собой CONR7R8, где R7 и R8 имеют значения, определенные выше, более предпочтительно R7 и R8 независимо друг от друга выбраны из Н, низшего алкила, Ci_6 30 алкилена-Rg и S02-Ci-6 алкила, где R9 выбран из группы, состоящей из СООН и S03H.
А предпочтительно выбран из тех групп, определенных выше, которые не замещены. Более предпочтительно А представляет собой фенил.
В альтернативном предпочтительном варианте реализации в комбинации с любыми выше- и нижеприведенными вариантами реализации А предпочтительно выбран из гетероциклических групп пиридила, пиразолила, бензизоксазолила и индазолила, при этом А является незамещенным или замещенным одной или двумя группами, независимо выбранными из ОН, низшего алкила, низшего циклоалкила и галогена.
Q предпочтительно выбран из тех групп, которые определены выше, замещенных одним заместителем. Предпочтительно заместитель представляет собой галоген, более предпочтительно CI. В частности, Q представляет собой фенил, замещенный одним атомом галогена, предпочтительно CI.
В альтернативном предпочтительном варианте реализации в комбинации с любыми выше- и нижеприведенными вариантами реализации Q представляет собой пиридильную группу, которая является незамещенной или замещенной одной или двумя группами, предпочтительно одной группой, независимо выбранной из группы, состоящей из низшего алкила, галогена и CF3.
Еще более предпочтительно, Z представляет собой следующую группу:
В предпочтительном варианте реализации в комбинации с любыми выше- и нижеприведенными вариантами реализации Z выбран из следующих групп:
Кроме того, Z предпочтительно выбран из структур, определенных выше, где X представляет собой СН. Более предпочтительно Z предпочтительно выбран из структур, определенных выше, где X представляет собой СН и R-\ представляет собой циклоалкильную группу, предпочтительно циклопропил. Еще более предпочтительно Z предпочтительно выбран из структур, определенных выше, где X представляет собой СН и Ft! представляет собой циклоалкильную группу, предпочтительно циклопропил, и R2 и R3 каждый представляет собой галоген, наиболее предпочтительно CI. Наиболее предпочтительным вариантом реализации для Z является определенный выше, где
главный гетероциклический скелет представляет собой третью структуру, определенную выше, содержащую пятичленное кольцо с фрагментом 0-N.
В равной степени предпочтительном варианте реализации в комбинации с любыми выше- и нижеприведенными вариантами реализации Z предпочтительно выбран 5 из структур, определенных выше, где X представляет собой N или N0, более предпочтительно X представляет собой N.
В предпочтительном варианте реализации в комбинации с любыми выше- и нижеприведенными вариантами реализации R-\ выбран из группы, состоящей из водорода, С-\.3 алкила, С3.6 циклоалкила и С4.5 алкилциклоалкила, где С-\.3 алкил
10 незамещен или замещен 1-3 заместителями, предпочтительно 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из галогена или гидроксигруппы.
Предпочтительные комбинации R, A, Q и Z имеют значения, определенные выше, и настоящее изобретение включает все комбинации предпочтительных вариантов реализации, перечисленных выше. В конкретном предпочтительном варианте
15 реализации R представляет собой COOR6, где R6 имеет значения, определенные выше, предпочтительно R6 выбран из Н и низшего алкила; А представляет собой фенил; Q выбран из тех групп, которые определены выше, замещенных одним заместителем, предпочтительно заместитель представляет собой галоген, более предпочтительно CI, и в частности Q представляет собой фенил, замещенный одним атомом галогена,
20 предпочтительно CI; и Z выбран среди структур, определенных выше, где X представляет собой СН и Ri представляет собой циклоалкильную группу, предпочтительно циклопропил, и R2 и R3 каждый представляет собой галоген, наиболее предпочтительно CI.
В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения 25 соединения имеют общую структуру в соответствии с формулой (2)
где
30 Х1 выбран из СН и N, предпочтительно СН;
R4 и R5 независимо выбраны из группы, состоящей из Н, низшего алкила, галогена или CF3, предпочтительно галогена, более предпочтительно CI.
Еще более предпочтительными являются соединения формул (1) или (2),
или
где в формуле (1) или (2) R^ выбран из группы, состоящей из изопропила, m-бутила и циклопропила;
R2 и R3 независимо выбраны из группы, состоящей из галогена, СгС3 алкила, метокси и трифторметокси, предпочтительно представляют собой галоген и наиболее 10 предпочтительно CI.
Наиболее предпочтительные соединения согласно изобретению представляют собой следующие.
3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота, 15 (-)-3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота,
(+)-3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота,
3-(2-(2-хлор-4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)фенил) 20 циклопропил)бензойная кислота,
3- (2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)изоксазол-4-ил)метокси) фенил)циклопропил)бензойная кислота,
4- (4-((4-(2-(3-карбоксифенил)циклопропил)-3-хлорфенокси)метил)-5-циклопропилизоксазол-3-ил)-3,5-дихлорпиридин-1-оксид,
25 3-(2-(2-хлор-4-((1 -(2,6-дихлорфенил)-4-изопропил-1 Н-1,2,3-триазол-5-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота,
4- ((4-(2-(6-(1 Н-тетразол-5-ил)пиридин-3-ил)циклопропил)-3-хлорфенокси)метил)-5-
циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол или
5- (2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)
30 циклопропил)пиколиновая кислота.
В равной степени наиболее предпочтительные соединения согласно изобретению представляют собой следующие.
3- (2-(6-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)-2-(трифторметил) пиридин-3-ил)циклопропил)бензойная кислота,
4- (2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота,
5 1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-аминия 4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)циклопропил)бензоат, (+)-4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота,
(-)-4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) 10 циклопропил)бензойная кислота,
6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1 -метил-1 Н-индазол-З-карбоновая кислота,
(+)-6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1 -метил-1 Н-индазол-З-карбоновая кислота, 15 (-)-6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1 -метил-1 Н-индазол-З-карбоновая кислота,
4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1\1-(метилсульфонил)бензамид,
2- (4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) 20 циклопропил)бензамидо)этансульфоновая кислота,
4-((4-(2-(4-(1 Н-тетразол-5-ил)фенил)циклопропил)-3-хлорфенокси)метил)-5-циклопропил-
3- (2,6-дихлорфенил)изоксазол,
4- (2-(2-хлор-4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-(2-гидроксипропан-2-ил)изоксазол-4-ил)метокси)
фенил)циклопропил)бензойная кислота,
25 5-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1-изопропил-1 Н-пиразол-З-карбоновая кислота, 6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1-изопропил-1 Н-индазол-З-карбоновая кислота, 4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)
30 циклопропил)-2,6-диметилбензойная кислота,
4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2-(трифторметокси)фенил)изоксазол-4-ил)метокси) фенил)циклопропил)бензойная кислота,
(+)-2-(4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси) фенил)циклопропил)бензамидо)этансульфоновая кислота, 35 (-)-2-(4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензамидо)этансульфоновая кислота,
2-(4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензамидо)уксусная кислота или
4-(2-(2-хлор-4-((4-(2,6-дихлорфенил)-1 -изопропил-1 Н-1,2,3-триазол-5-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота.
Соединения согласно настоящему изобретению могут быть в форме пролекарств. "Пролекарство" означает производное, которое превращается в соединение согласно 5 настоящему изобретению посредством реакции с ферментом, желудочным соком и т.п. при физиологических условиях в живом организме, например, посредством реакций окисления, восстановления, гидролиза и т.п., каждая из которых осуществляется ферментативным путем. Примерами пролекарств являются соединения, у которых аминогруппа в соединении согласно настоящему изобретению ацилирована,
10 алкилирована или фосфорилирована с образованием, например, эйкозаноиламиногруппы, аланиламиногруппы, пивалоилоксиметиламиногруппы, или у которых гидроксильная группа ацилирована, алкилирована, фосфорилирована или превращена в борат, например, ацетилоксигруппа, пальмитоилоксигруппа, пивалоилоксигруппа, сукцинилоксигруппа, фумарилоксигруппа, аланилоксигруппа, или у
15 которых карбоксильная группа этерифицирована или амидирована. Данные соединения могут быть получены из соединений согласно настоящему изобретению в соответствии с хорошо известными способами. Другие примеры пролекарств представляют собой соединения, где карбоксилат в соединении согласно настоящему изобретению превращен, например, в алкиловый, ариловый, холиновый сложный эфир, сложный эфир,
20 содержащий аминогруппу, ацилоксиметиловый сложный эфир, линоленоиловый сложный эфир.
Метаболиты соединений согласно настоящему изобретению также находятся в рамках настоящего изобретения.
Там, где возможна таутомерия, такая как, например, кето-енольная таутомерия, 25 соединений согласно настоящему изобретению или их пролекарств, индивидуальные формы, такие как, например, кето- и енольная форма, каждая находятся в рамках изобретения, также как и их смеси в любом соотношении. То же справедливо для стереоизомеров, таких как, например, энантиомеры, цис/транс изомеры, конформеры и т.п.
30 При необходимости изомеры могут быть разделены с помощью способов, хорошо
известных в данной области, например, с помощью жидкостной хроматографии. Разделение также выполнимо для энантиомеров путем применения, например, хиральных неподвижных фаз. Кроме того, энантиомеры могут быть выделены путем превращения их в диастереомеры, т.е. соединения с энантиомерно чистым
35 вспомогательным соединением, последующим разделением получающихся диастереомеров и отщеплением вспомогательного остатка. Альтернативно, любой энантиомер соединения согласно настоящему изобретению может быть получен в результате стереоселективного синтеза с применением оптически чистых исходных
веществ. Другой путь получения чистых энантиомеров из рацемических смесей заключался бы в применении энантиоселективной кристаллизации с хиральными противоионами.
Соединения согласно настоящему изобретению могут находиться в форме 5 фармацевтически приемлемой соли или сольвата. Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, полученным из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований или кислот, включая неорганические основания или кислоты и органические основания или кислоты. В случае, если соединения согласно настоящему изобретению содержат одну или более кислотных или основных групп, изобретение также
10 включает их соответствующие фармацевтически или токсикологически приемлемые соли, в частности, их соли, применяемые в фармации. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению, которые содержат кислотные группы, могут быть представлены данными группами и могут быть применены согласно изобретению, например, в виде солей щелочных металлов, солей щелочноземельных металлов или
15 аммониевых солей. Более точные примеры таких солей включают натриевые соли, калиевые соли, кальциевые соли, магниевые соли или соли с аммиаком или органическими аминами, такими как, например, этиламин, этаноламин, триэтаноламин или аминокислоты. Соединения согласно настоящему изобретению, которые содержат одну или более основных групп, то есть групп, которые могут быть протонированы, могут
20 быть представлены и могут быть применены согласно изобретению в форме их аддитивных солей с неорганическими или органическими кислотами. Примеры подходящих кислот включают хлороводород, бромоводород, фосфорную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, метансульфоновую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, нафталиндисульфоновые кислоты, щавелевую кислоту, уксусную кислоту, винную
25 кислоту, молочную кислоту, салициловую кислоту, бензойную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту, триметилуксусную кислоту, диэтилуксусную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, пимелиновую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, яблочную кислоту, сульфаминовую кислоту, фенилпропионовую кислоту, глюконовую кислоту, аскорбиновую кислоту, изоникотиновую кислоту, лимонную
30 кислоту, адипиновую кислоту и другие кислоты, известные специалисту в данной области техники. Если соединения согласно настоящему изобретению одновременно содержат кислотные и основные группы в молекуле, изобретение также включает, наряду с упомянутыми формами солей, внутренние соли или бетаины (цвиттер-ионы). Соответствующие соли могут быть получены с помощью обычных способов, которые
35 известны специалисту в данной области техники, таких как, например, взаимодействие соединений согласно изобретению с органической или неорганической кислотой или основанием в растворителе или диспергирующем агенте или анионный обмен или катионный обмен с другими солями. Настоящее изобретение также включает все соли
соединений согласно настоящему изобретению, которые вследствие низкой физиологической совместимости непосредственно не подходят для применения в фармацевтических препаратах, но которые могут быть применены, например, в качестве промежуточных продуктов для химических реакций или для получения фармацевтически 5 приемлемых солей.
Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению могут присутствовать в форме сольватов, таких как те, которые включают в качестве сольвата воду или фармацевтически приемлемые сольваты, такие как спирты, в частности, этанол.
К тому же, согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические 10 композиции, содержащие по меньшей мере одно соединение согласно настоящему изобретению, или его пролекарство, или его фармацевтически приемлемую соль или сольват в качестве активного ингредиента совместно с фармацевтически приемлемым носителем.
"Фармацевтическая композиция" означает один или более активных
15 ингредиентов и один или более инертных ингредиентов, которые составляют носитель, также как и любой продукт, который получается, прямо или опосредованно, в результате объединения, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов, или в результате диссоциации одного или более ингредиентов, или в результате других типов реакций или взаимодействий одного или более ингредиентов. Соответственно,
20 фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают любую композицию, полученную путем смешивания по меньшей мере одного соединения согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемого носителя.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать одно или более других соединений в качестве активных
25 ингредиентов, таких как пролекарство или другие модуляторы ядерных рецепторов.
Композиции подходят для перорального, ректального, местного, парентерального (включая подкожное, внутримышечное и внутривенное), офтальмологического (глазного), легочного (назальная или буккальная ингаляция) или назального введения, хотя наиболее подходящий путь введения в любом данном случае будет зависеть от природы
30 и тяжести состояний, подлежащих лечению, и от природы активного ингредиента. Они могут быть удобно представлены в дозированной форме для однократного введения и получены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики.
Соединения согласно изобретению могут быть получены с помощью комбинации способов, известных в области техники, включая методики, описанные ниже. Схема I
35 изображает реакцию подходящего соединения формулы I с подходящим гетероциклическим соединением формулы II
FT ^
-A^n.OP JL R.A^Q.O^Z
' (1) p = защитная группа
Схема I
Таким образом, подходящее соединение формулы II, в котором R1, R2 и R3 5 имеют значения, определенные в формуле (1), и Y представляет собой уходящую группу, и подходящее соединение формулы I, в котором R, А и Q имеют значения, определенные в формуле (1), или представляют собой группу, которая приводит к R, как определено в формуле (1), например, путем образования сложного эфира, амида, тетразола или кислоты, подвергают реакции с образованием соединения формулы (1) с подходящими
10 постановками и/или снятиями защитных групп или другими стадиями, известными специалисту в данной области техники или описанными в настоящей заявке. Подходящие уходящие группы хорошо известны в данной области техники и включают галиды, в частности, хлорид, бромид и иодид, эфиры сульфокислоты, такие как брозил, тозил, метансульфонил и трифторметансульфонил. Соединение формулы I подвергают реакции
15 с соединением формулы II в подходящем растворителе, таком как ацетонитрил, диметилформамид, тетрагидрофуран и т.п. в присутствии избытка подходящего основания, такого как гидрид натрия, карбонат калия, карбонат натрия, триэтиламин, диизопропилэтиламин, mpem-бутоксид калия и т.д. Такие реакции обычно проводят при температурах от комнатной до кипения выбранного растворителя.
20 Альтернативно подходящее соединение формулы I, в котором R, А и Q имеют
значения, определенные в формуле (1), может быть сконденсировано с подходящим гетероциклическим соединением формулы II, в котором R1; R2 и R3 имеют значения, определенные в формуле (1), и Y представляет собой гидроксил, с применением реакции Мицунобу.
25 Соединения, в которых R представляет собой сложный эфир, можно превратить
в соединения формулы (1), в которых R представляет собой кислоту, посредством способов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Гидролиз простых алкиловых сложных эфиров можно проводить в подходящих растворителях, таких как
ацетонитрил, метанол, этанол, ТГФ и их смесей с водой при температурах от примерно 25-100 °С с подходящимми основаниями, такими как гидроксид натрия, гидроксид калия и гидроксид лития. В случае, когда R представляет собой mpem-бутиловый сложный эфир, соответствующая кислота может быть получена в кислых условиях, хорошо известных 5 специалистам в данной области техники.
Соединения формулы I и II можно легко получить с помощью способов, которые хорошо известны и установлены в области техники, включая способы и методики, описанные в настоящей заявке.
Соединения формулы I получают из олефиновых предшественников с помощью
10 стандартных реакций циклопропанирования, хорошо известных специалистам в данной области техники (см. Н. Lebel, J-F. Marcoux, С Molinaro, А. В. Charette, Chem. Rev. 2003, 103, 977-1050). Например, реакция возможно замещенного производного стильбена с реагентом Симмонса-Смита (IZnCH2l) в подходящих растворителях, таких как эфир, ТГФ, гексан, толуол, дихлорметан при температурах от -20 °С до примерно кипения
15 выбранного растворителя дает соединения формулы I. Возможно замещенные стильбены могут быть получены путем сочетания Хорнера-Эммонса арилальдегида и арилметиленфосфонового эфира или путем сочетания Хека возможно замещенного стирола с возможно замещенным арилбромидом, иодидом или трифлатом в присутствии палладиевого катализатора. Как изображено на схеме I, циклопропанирование возможно
20 замещенных стильбенов можно проводить после сочетания с возможно замещенным гетероциклом формулы II.
Соединения согласно изобретению имеют хиральные центры и могут существовать в оптически активных формах. Если требуется стереоизомер, его можно получить с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Например,
25 рацемическая смесь соединений формулы (1) может быть разделена с помощью хроматографии на хиральной колонке. Альтернативно, рацемическая смесь соединений формулы (1), в которой R представляет собой кислоту, может быть разделена путем кристаллизации с подходящими хиральными аминами, такими как а-фенэтиламин, бруцин, цинхонин. Рацемат может также быть химически дериватизирован с другим
30 энантиомерно чистым реагентом, таким как хиральный спирт, который может быть введен в реакцию с группой -СООН с превращением рацемических смесей в смеси диастереомерных эфиров, которые можно разделить с помощью традиционных хроматографических способов или других стандартных способов разделения. Разделение энантиомеров можно также выполнить на уровне рацемических соединений
35 формулы I. Оптически активные соединения формулы I могут далее быть подвергнуты реакции с гетероциклическим соединением формулы II, как изложено вкратце на схеме I, с получением оптически активных соединений формулы (1).
-,""*""м,,""и"м"""""" ' "¦ " ¦¦"¦' "ш"#*"*ш"*штттттт,ш,,,ы,м i, м """им, "дщ"",
Перечень фигур чертежей и иных материалов
На Фиг. 1а представлена зависимость средней концентрации соединения согласно Примеру 12 от времени после перорального введения обезъянам (12 мг/кг; п=3).
На Фиг. 1Ь представлена зависимость средней концентрации соединения 5 согласно Примеру 4 от времени после перорального введения (12 мг/кг; п=3).
На Фиг. 1с представлены уровни исходного соединения в плазме в [нМ] после
введения через желудочный зонд одной дозы 5 мг/кг GW4064 и соединения согласно
Примеру 4 по отдельности мышам С57 BLKS lepr"'" db/db. Данные отображают среднее из
3 индивидуальных измерений в плазме мыши.
10 На Фиг. 2а представлены химическая структура соединения GW4064 и его УФ-
спектр.
На Фиг. 2Ь представлены химическая структура соединения РХ20535 и его УФ-
спектр.
На Фиг. 2с представлены химическая структура соединения согласно Примеру 4 и 15 его УФ-спектр.
На Фиг. За представлен спектр 1Н-ЯМР соединения GW4064 при t=0, до УФ-облучения при 254 нм.
На Фиг. ЗЬ представлен спектр 1Н-ЯМР соединения РХ20535 при t=0, до УФ-облучения при 254 нм.
20 На Фиг. Зс представлен спектр 1Н-ЯМР соединения согласно Примеру 4 при t=0,
до УФ-облучения при 254 нм.
На Фиг. 3d представлен спектр 1Н-ЯМР соединения GW4064 при времени УФ-облучения при 254 нм t=44.
На Фиг. Зе представлен спектр 1Н-ЯМР соединения РХ20535 при времени УФ-25 облучения при 254 нм t=44.
На Фиг. 3f представлен спектр 1Н-ЯМР соединения согласно Примеру 4 при времени УФ-облучения при 254 нм t=44.
На Фиг. Зд представлен спектр 1Н-ЯМР соединения GW4064 при времени УФ-
облучения при 254 нм t=15ч.
30 На Фиг. Зп представлен спектр 1Н-ЯМР соединения РХ20535 при времени УФ-
облучения при 254 нм t=154.
На Фиг. 3i представлен спектр 1Н-ЯМР соединения согласно Примеру 4 при времени УФ-облучения при 254 нм t=15ч.
На Фиг. 3j представлен спектр 1Н-ЯМР соединения GW4064 при времени УФ-35 облучения при 254 нм t=704.
На Фиг. Зк представлен спектр 1Н-ЯМР соединения РХ20535 при времени УФ-облучения при 254 нм t=704.
На Фиг. 31 представлен спектр 1Н-ЯМР соединения согласно Примеру 4 при
времени УФ-облучения при 254 нм t=704.
40 На Фиг. Зт приведено сравнение УФ-стабильности, влияния облучения при А=366
нм на тонкую пленку с ДМСО.
Фиг. 4 иллюстрирует содержание холестерина и триглецеридов в плазме после 8 недель при рационе с высоким содержнием жира (РВСЖ) в присутствии или отсутствие соединений.
Фиг. 5 иллюстрирует содержание холестерина и триглицеридов печени после 8 недель на рационе с высоким содержанием жира (РВСЖ) в присутствии или отсутствие соединений.
Фиг. 6 иллюстрирует индукцию гена-мишени FXR в печени мыши. Способы синтеза
Соединения формулы (II) могут быть получены, как изображено на схемах 1а-1 <± Изоксазоловые соединения формулы II получают путем реакции возможно замещенных бензальдегидов с гидроксиламином в присутствии подходящего основания, такого как триэтиламин, с последующим хлорированием с подходящим хлорирующим агентом, таким как N-хлорсукцинимид. Полученные хлороксимы подвергают реакции с подходящим S-кетоэфиром в основных условиях с подходящим основанием, таким как триэтиламин или метоксид натрия, с получением сложных эфиров изоксазола. Данные сложные эфиры могут быть восстановлены до спиртов формулы II с помощью хорошо известных способов, таких как применение литийалюминийгидрида (LAH) или диизобутилалюминийгидрида (DIBAL), и превращены в уходящую группу. 1-Арил-4-алкилтриазоловые соединения формулы II могут быть получены путем добавления замещенных пропаргиловых спиртов к замещенным ароматическим азидам и последующего превращения гидроксигруппы в подходящую уходящую группу. 1-Арил-4-алкилтриазоловые соединения формулы II могут быть получены путем добавления возможно замещенного азида к ацетиленовому сложному эфиру с последующим восстановлением до спирта и превращением в уходящую группу. Пиразоловые соединения формулы II получают путем реакции возможно замещенного фенилгидразина с 1,3-дикетоэфиром с последующим восстановлением и превращением в уходящую группу.
Соединения согласно настоящему изобретению синтезировали по одной из Схем 2-14, начиная с различных хлорметиларильных (CI-CH2-Ar) структурных блоков, которые синтезировали в соответствии со Схемами 1a-d. Как изображено на Схеме 2, в результате реакции одного из хлорметиларильных (Cl-CH2-Ar) структурных блоков Аба-е с арилциклопропиларильным структурным блоком В13 и последующего омыления метилового эфира до свободной кислоты образовались соединения согласно примерам 1-6 (Схема 2). Реакция хлорметиларипа (С1-СН2-Аг) Абе с (гетеро)арилциклопропиларильным структурным блоком С6 (Схема 3) привела к получению нитрильного предшественника С7, который или превращали в тетразол (Пример 7) путем реакции с NaN3 и NH4CI, или омыляли до свободной кислоты (Пример 8, см. Схему 3). Соединение согласно примеру 9 получали в соответствии со схемой 4.
Пиридон D2 алкилировали с помощью структурного блока Абе до
промежуточного продукта D3. За двухстадийной трансформацией сложноэфирной группы в альдегид D5 следовала реакция Хорнера-Вадсворта-Эммонса (HWE) с получением стильбеноподобного промежуточного продукта D6. Циклопропанирование и гидролиз сложного эфира позволили получить конечное соединение согласно примеру 9. Синтез 5 соединения согласно примеру 10 показан на схеме 5. Фосфонат Е5 и 3-формилпиридин подвергали реакции с образованием стильбеноподобного промежуточного продукта Е12, который после снятия защиты и алкилирования с помощью Абе подвергали циклопропанированию. Конечный гидролиз сложного эфира позволил получить соединение согласно примеру 10. Соединение согласно примеру 11 синтезировали в
10 соответствии со схемой 6. Бензизоксазолкарбальдегид F5 подвергали реакции с фосфонатом F9 с образованием промежуточного продукта F10, содержащего стильбеновую структуру. Циклопропанирование и снятие защиты позволили получить соединение согласно примеру 11.
Соединения согласно примерам 12-14 получали в соответствии со схемой 7,
15 аналогичной схеме 2, но в которой применяли 4-метоксикарбонилфосфонат G1. На схеме 8 показан синтез соединения согласно примеру 15. Стильбеноподобный предшественник Н6 получают по реакции Хека кросс-сочетания броминдазола Н4 и олефина Н5. Циклопропанирование и гидролиз сложного эфира привели к получению конечного соединения согласно примеру 15. Соединение согласно примеру 16 получают в
20 соответствии со схемой 9. Транс-стильбен с защитной О-метильной группой сперва циклопропанируют и далее сложноэфирную группу превращают в цианогруппу. О-деметилирование и алкилирование с помощью Абе привели к получению промежуточного продукта 17, содержащего цианогруппу, который подвергают реакции с азидом натрия с получением тетразола согласно примеру 16. Синтез соединения
25 согласно примеру 17 показан на схеме 10. А5а ацетил провали с последующим бромированием в бензильное положение с применением N-бромсукцинимида (NBS). В результате обработки DBU и К2С03 образовался промежуточный продукт J3, гидроксигруппа которого была защищена с помощью TBSOTf. За окислением с применением Os04 и Nal04 последовало добавление метилмагнийхлорида (реактива
30 Гриньяра) и снятие защиты с гидроксигруппы с помощью тетрабутиламмонийфторида (TBAF) с получением J7. Реакция Мицунобу с 12а и омыление сложного эфира позволили получить конечное соединение согласно примеру 17. На схеме 11 показан синтез соединения согласно примеру 18. Реакция J6 с диазометаном и последующее снятие защиты TBS позволили получить промежуточный продукт К2. Данный промежуточный
35 продукт превращали в конечное соединение согласно примеру 18 способом, аналогичным тому, который описан для примера 17. На схеме 12 показан синтез соединения согласно примеру 19. Метил-З-оксобутаноат вводили в реакцию с АЗа с образованием изоксазола L1. Реакция с ДМФА-ДМА с последующей обработкой Si02 и HCI позволили получить альдегид L3, который восстановили до L4 с помощью NaBH4. За этим последовали
40 защита ОН-группы с помощью 3,4-дигидропирана, восстановление сложного эфира с
применением DIBAL-H и реакция Мицунобу с 12a с получением промежуточного продукта L7. Омыление сложного эфира и снятие защиты с гидроксигруппы позволили получить конечное соединение согласно примеру 19.
В итоге, настоящее изобретение относится к соединениям в соответствии с 5 общей формулой (I), которые связывают рецептор NR1H4 (FXR) и действуют как агонисты или модуляторы рецептора NR1H4 (FXR).
Изобретение также относится к применению указанных соединений для лечения и/или профилактики заболеваний и/или состояний за счет связывания указанного ядерного рецептора указанными соединениями. Кроме того, настоящее изобретение
10 относится к применению указанных соединений для получения лекарственного препарата для лечения и/или профилактики заболеваний и/или состояний за счет связывания указанного ядерного рецептора указанными соединениями. Конкретно, настоящее изобретение относится к применению соединений в соответствии с формулой (1) для получения лекарственного препарата для профилактики и/или лечения хронических
15 внутрипеченочных или некоторых форм внепеченочных холестатических состояний, фиброза печени, возникающего в результате хронических холестатических состояний, острых внутрипеченочных холестатических состояний, обструктивных или хронических воспалительных расстройств, которые являются результатом неправильного состава желчи, желудочно-кишечных состояний со сниженным поглощением входящего в рацион
20 жира и жирорастворимых входящих в рацион витаминов, воспалительных заболеваний кишечника, липидных и липопротеиновых расстройств, диабета II типа и клинических осложнений диабета I и II типов, состояний и заболеваний, возникающих в результате хронической жировой и фиброзной дегенерации органов из-за усиленного накопления липидов и конкретно триглицеридов и последующей активации профиброзных путей,
25 ожирения и метаболического синдрома (общие состояния дислипидемии, диабета и аномально высокого индекса массы тела), острого инфаркта миокарда, острого инсульта, тромбоза, который случается в качестве конечной стадии хронического обструктивного атеросклероза, хронических инфекций, вызываемых внутриклеточными бактериями или простейшими паразитами, незлокачественных гиперпролиферативных расстройств,
30 злокачественных гиперпролиферативных расстройств, аденокарциномы толстой кишки и гепатоцеллюлярной карциномы в частности, стеатоза печени и связанных синдромов, печеночной недостаточности или нарушения функции печени как результата хронических заболеваний печени или хирургической резекции печени, инфекции гепатита В, инфекции гепатита С и/или холестатических и фиброзных эффектов, которые связаны с вызванным
35 алкоголем циррозом или с передаваемыми вирусами формами гепатита.
Лекарственные средства, упоминаемые в настоящей заявке, могут быть получены традиционными способами, включая объединение соединения согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемого носителя.
FXR, как предполагают, является ядерным рецептором желчных кислот. В
40 результате, он модулирует как синтетическую выработку желчных кислот в печени, так и
их циркуляцию в кишечнике (путем регулирования белков, связывающих желчные кислоты). Но, помимо участия в физиологии желчных кислот, FXR, по-видимому, вовлечен в регуляцию многих разнообразных физиологических процессов, которые соответствуют в этиологии и для лечения заболеваний, таких разнообразных как 5 холестериновые желчные камни, метаболические расстройства, такие как диабет II типа, дислипидемии или ожирение, хронические воспалительные заболевания, такие как воспалительные заболевания кишечника или хронические внутрипеченочные формы холестаза и многие другие заболевания (Т. Claudel et al. "The Farnesoid X receptor: a molecular link between bile acid and lipid and glucose metabolism" Arterioscler. Thromb. Vase.
10 Biol. 2005, 25(10), 2020-2030; Y. D. Wang et al. "FXR: a metabolic regulator and cell protector." Cell Res. 2008, 18(11), 1087-1095.
FXR регулирует сложный набор генов ответа в печени и желудочно-кишечном тракте. Продукты генов оказывают влияние на разнообразные физиологические процессы. В ходе функционального анализа FXR первой проанализированной
15 регуляторной сетью была регуляция синтеза желчных кислот. В то время как печеночные Х-рецепторы (LXR) индуцируют ключевой фермент превращения холестерина в желчные кислоты, цитохром Р450 7А1 (Сур7А1), посредством индукции регуляторного ядерного рецептора LRH-1, FXR репрессирует индукцию Сур7А1 посредством активирования синтеза мРНК, кодирующей малый гетеродимерный партнер (SHP), дополнительный
20 ядерный рецептор, который доминантно репрессирует LRH-1. Так как FXR связывает конечные продукты данного пути, первичные желчные кислоты, такие как холевая кислота (ХК) или хенодезоксихолевая кислота (ХДХК), этот процесс можно рассматривать в качестве примера ингибирования по принципу обратной связи на уровне экспрессии генов (В. Goodwin et al. "A regulatory cascade of the nuclear receptors FXR, SHP-1, and LRH-1
25 represses bile acid biosynthesis" Mol. Cell 2000, 6(3), 517-526; T. Lu et al. "Molecular basis for feedback regulation of bile acid synthesis by nuclear receptors" Mol. Cell 2000, 6(3), 507-515). Параллельно репрессии синтеза желчных кислот посредством SHP, FXR индуцирует ряд так называемых АТФ-связывающих кассетных транспортеров (АВС-транспортеров), которые отвечают за экспорт токсичных желчных кислот из цитозоля гепатоцита в
30 канальцы, маленькие ответвления желчного протока, где образуется желчь. Данная гепатопротекторная функция FXR стала впервые очевидной с помощью анализа мышей с выключенным геном FXR (С. Sinai et al. "Targeted disruption of the nuclear receptor FXR/BAR impairs bile acid and lipid homeostasis" Cell 2000, 102(6), 731-744), где была показана пониженная или повышенная экспрессия нескольких АВС-транспортеров в
35 печени. В результате дальнейшего детального анализа обнаружили, что главный экскреторный насос солей желчных кислот BSEP или АВСВ11 (М. Ananthanarayanan et al. "Human bile salt export pump promoter is transactivated by the farnesoid X receptor/bile acid receptor" J. Biol. Chem. 2001, 276(31), 28857-28865; J. Plass et al. "Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt
40 export pump" Hepatology 2002, 35(3), 589-596), также как и ключевой фермент, который
опосредует перенос липидов от липопротеинов к фосфолипидам, PLTP (N. Urizar et al. "The farnesoid X-activated receptor mediates bile acid activation of phospholipid transfer protein gene expression" J. Biol. Chem. 2000, 275(50), 39313-39317) и два ключевых канальцевых мембранных транспортера для фосфолипидов, MRP-2 (АВСС4) (Н. Kast et al. "Regulation 5 of multidrug resistance-associated protein 2 (ABCC2) by the nuclear receptors pregnane X receptor, farnesoid X-activated receptor, and constitutive androstane receptor" J. Biol. Chem. 2002, 277(4), 2908-2915) и MDR-3 (ABCB4); L. Huang et al. "Farnesoid X receptor activates transcription of the phospholipid pump MDR3" J. Biol. Chem. 2003, 278(51), 51085-51090) являются прямыми мишенями для управляемой лигандом активации транскрипции
10 посредством FXR (кратко изложено в: М. Miyata "Role of farnesoid X receptor in the enhancement of canalicular bile acid output and excretion of unconjugated bile acids: a mechanism for protection against cholic acid-induced liver toxicity", J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 312(2), 759-766; G. Rizzo et al. "Role of FXR in regulating bile acid homeostasis and relevance for human diseases" Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 2005,
15 5(3), 289-303.)
Тот факт, что FXR, по-видимому, является главным рецептором метаболитов и регулятором синтеза, экспорта и рециркуляции желчных кислот, позволил предложить применение лигандов FXR для индукции выделения желчи и изменения состава желчных кислот в сторону более гидрофильного состава. С разработкой первого синтетического
20 лиганда FXR GW4064 (P. Maloney et al. "Identification of a chemical tool for the orphan nuclear receptor FXR" J. Med. Chem. 2000, 43(16), 2971-2974; T. Willson et al. "Chemical genomics: functional analysis of orphan nuclear receptors in the regulation of bile acid metabolism" Med. Res. Rev. 2001, 21(6) 513-522) в качестве модельного соединения и полу-синтетического искусственного лиганда на основе желчной кислоты 6-альфа-этил-
25 ХДХК могут быть проанализированы эффекты сверхстимуляции FXR мощными агонистами. Показано, что оба лиганда индуцируют выделение желчи у животных с перевязанным желчными протоками. Более того, кроме желчегонных эффектов также могут быть показаны гепатопротекторные эффекты (R. Pellicciari et al. "6alpha-ethyl-chenodeoxycholic acid (6-ECDCA), a potent and selective FXR agonist endowed with
30 anticholestatic activity" J. Med. Chem. 2002, 45(17), 3569-3572; Y. Liu et al. "Hepatoprotection by the farnesoid X receptor agonist GW4064 in rat models of intra- and extrahepatic cholestasis" J. Clin. Invest. 2003, 112(11), 1678-1687). Данный гепатопротекторный эффект был далее сужен до противофиброзного эффекта, который является результатом репресии тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ, TIMP-1 и 2, индукции
35 матриксной металлопротеиназы 2 (ММР-2), расщепляющей отложения коллагена в звездчатых клетках печени и последующего снижения уровня мРНК альфа-коллагена и мРНК трансформирующего ростового фактора бета (TGF-beta), которые оба являются профиброзными факторами, агонистами FXR (S. Fiorucci et al. "The nuclear receptor SHP mediates inhibition of hepatic stellate cells by FXR and protects against liver fibrosis",
40 Gastroenterology 2004, 127(5), 1497-1512; S. Fiorucci et al. "A farnesoid x receptor-small
heterodimer partner regulatory cascade modulates tissue metalloproteinase inhibitor-1 and matrix metalloprotease expression in hepatic stellate cells and promotes resolution of liver fibrosis"^ Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 314(2), 584-595). Кроме того, противохолестатическая активность была показана в моделях животных с перевязанным 5 желчными протоками, также как и в моделях животных с холестазом, индуцированном эстрогенами (S. Fiorucci et al. "Protective effects of 6-ethyl chenodeoxycholic acid, a farnesoid X receptor ligand, in estrogen-induced cholestasis" J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 313(2), 604612).
Генетические исследования показывают, что в наследственных формах
10 холестаза (прогрессивный семейный внутрипеченочный холестаз = ПСВХ, тип I-IV) или понижена ядерная локализация самого FXR как следствие мутации в гене FIC1 (в ПСВХ I типа, также называемой болезнью Байлера) (F. Chen et al. "Progressive familial intrahepatic cholestasis, type 1, is associated with decreased farnesoid X receptor activity" Gastroenterology. 2004, 126(3), 756-764; L. Alvarez et al. "Reduced hepatic expression of
15 farnesoid X receptor in hereditary cholestasis associated to mutation in ATP8B1" Hum. Mol. Genet. 2004, 13(20), 2451-2460), или понижены уровни целевого гена FXR, кодирующего экспортный насос фосфолипидов MDR-3 (в ПСВХ III типа). В совокупности, существует увеличивающаяся доказательная база, что соединения, связывающие FXR, будут показывать важное клиническое применение в программе лечения хронических
20 холестатических состояний, таких как первичный билиарный цирроз (ПБЦ) или первичный склерозирующий холангит (ПСХ) (рассмотрено в: G. Rizzo et al. Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 2005, 5(3), 289-303; G. Zollner "Role of nuclear receptors in the adaptive response to bile acids and cholestasis: pathogenetic and therapeutic considerations" Mol. Pharm. 2006, 3(3), 231-251; S. Cai et al. "FXR: a target for cholestatic syndromes?" Expert
25 Opin. Ther. Targets 2006, 10(3), 409-421).
Глубокое влияние, которое активация FXR имеет на метаболизм желчных кислот и экскрецию, значимо не только для холестатических синдромов, но даже больше для терапии против образования желчных камней. Холестериновые желчные камни образуются вследствие низкой растворимости холестерина, который активно
30 выкачивается из клетки печени в просвет канальцев. Именно относительное процентное содержание трех главных компонентов, желчных кислот, фосфолипидов и свободного холестерина, определяет образование смешанных мицелл и, следовательно, условное насыщение раствора свободного холестерина в желчи. Полиморфизмы FXR локализуются как локусы количественных признаков как один фактор, вносящий вклад в
35 возникновение желчекаменной болезни (Н. Wittenburg "FXR and ABCG5/ABCG8 as determinants of cholesterol gallstone formation from quantitative trait locus mapping in mice", Gastroenterology 2003, 125(3), 868-881). Применяя синтетическое модельное соединение GW4064 для FXR, можно показать, что активация FXR приводит к улучшению индекса насыщения желчи холестерином (= CSI) и прямо к отсутствию образования желчных
40 камней у мышей C75L, подверженных образованию желчных камней, в то время как
продемонстрировано, что лечение лекарственным средством мышей с выключенным
геном FXR не оказывает действия на образование желчных камней (A. Moschetta et al.
"Prevention of cholesterol gallstone disease by FXR agonists in a mouse model" Nature
Medicine 2004, 10(12), 1352-1358).
5 Данные результаты определяют FXR как хорошую мишень для разработки
низкомолекулярных агонистов, которые можно применить для предотвращения образования холестериновых желчных камней или предотвращения повторного образования желчных камней после хирургического удаления или ударно-волновой литотрипсии (обсуждается в: S. Doggrell "New targets in and potential treatments for
10 cholesterol gallstone disease" Curr. Opin. Investig. Drugs 2006, 7(4), 344-348).
Таким образом, в одном варианте реализации изобретения соединение согласно формуле (I) и фармацевтические композиции, содержащие указанное соединение, применяют для профилактики и/или лечения обструктивных или хронических воспалительных расстройств, которые возникают вследствие неправильного состава
15 желчи, таких как холелитиаз, также известный как холестериновые желчные камни.
Помимо сильного гепатопротекторного и желчегонного, а также противофиброзного эффектов, которые демонстрирует FXR при стимулируемой низкомолекулярными соединениями активации в печени, FXR, вероятно, играет роль в защите кишечника от неопластической трансформации и от развития полипов и их
20 перехода в аденокарциному в кишке (S. Modica et al. "Nuclear bile acid receptor FXR protects against intestinal tumorigenesis" Cancer Res. 2008, 68(23), 9589 и R.R. Ma ran et al. "Farnesoid X receptor deficiency in mice leads to increased intestinal epithelial cell proliferation and tumor development" J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009, 328(2), 469). Подобно ситуации с кишечником, отсутствие FXR приводит к высокому увеличению в образовании
25 гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), наиболее распространенной формы рака печени (I. Kim et al. "Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice", Carcinogenesis 2007, 28(5), 940 и F. Yang et al." Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor." Cancer Res. 2007, 67(3), 863). В то время как функциональный FXR препятствует образованию аденокарциномы толстой
30 кишки и гепатоцеллюлярной карциномы, активация FXR индуцирует регенерацию печени после гепатэктомии (W. Huang et al. "Nuclear receptor-dependent bile acid signaling is required for normal liver regeneration" Science 2006, 312 (5771), 233).
Объединенные гепатопротекторный эффект, антинеопластический эффект и эффект регенерации печени, связанные с активацией FXR, могут быть терапевтически
35 задействованы для применения агонистов FXR в лечении тяжелых заболеваний печени. В одном варианте реализации соединения согласно изобретению и фармацевтические композиции, содержащие указанные соединения, применяют в лечении заболеваний печени, таких как гепатоцеллюлярный рак (ГЦК), стимулировании возобновления роста печени и уменьшения интенсивности побочных эффектов, связанных с обширной
40 резекцией печени, циррозом печени, независимо от этиологии, и предотвращении или
лечении ишемии печени при трансплантации печени или обширном оперативном вмешательстве на печени.
Со времени открытия первого синтетического агониста FXR и его введения грызунам стало очевидным, что FXR является ключевым регулятором триглицеридов 5 сыворотки (P. Maloney et al. J. Med. Chem. 2000, 43(16), 2971-2974; T. Willson et al. Med. Res. Rev. 2001, 21(6), 513-522). В течении прошедших шести лет было опубликовано накапливающееся доказательство того, что активация FXR с помощью синтетических агонистов приводит к значительному снижению уровня триглицеридов сыворотки, главным образом в форме сниженных ЛПОНП, но также к сниженному общему
10 холестерину сыворотки (Н. Kast et al. "Farnesoid X-activated receptor induces apolipoprotein C-ll transcription: a molecular mechanism linking plasma triglyceride levels to bile acids" Mol. Endocrinol. 2001, 15(10), 1720-1728; N. Urizar et al. "A natural product that lowers cholesterol as an antagonist ligand for FXR" Science 2002, 296(5573), 1703-1706; G. Lambert et al. "The farnesoid X-receptor is an essential regulator of cholesterol homeostasis" J. Biol. Chem. 2003,
15 278, 2563-2570; M. Watanabe et al. "Bile acids lower triglyceride levels via a pathway involving FXR, SHP, and SREBP-1c" J. Clin. Invest. 2004, 113(10), 1408-1418; A. Figge et al. "Hepatic overexpression of murine AbcM 1 increases hepatobiliary lipid secretion and reduces hepatic steatosis "J. Biol. Chem. 2004, 279(4), 2790-2799; S. Bilz et al. "Activation of the farnesoid X receptor improves lipid metabolism in combined hyperlipidemic hamsters" Am. J. Physiol.
20 Endocrinol. Metab. 2006, 290(4), E716-722).
Однако снижение количества триглицеридов сыворотки не является единственным эффектом. Лечение мышей db/db или ob/ob синтетическим FXR агонистом GW4064 привело к отмеченному и совместному уменьшению триглицеридов сыворотки, общего холестерина, свободных жирных кислот, кетоновых тел, таких как 3-ОН бутират.
25 Кроме того, активация FXR запускает внутриклеточный путь сигналинга инсулина в гепатоцитах, что приводит к снижению выхода глюкозы из глюконеогенеза в печени с сопутствующим увеличением гликогена в печени. Лечение FXR положительно влияло как на чувствительность к инсулину, так и на толерантность к глюкозе (К. Stayrook et al. "Regulation of carbohydrate metabolism by the farnesoid X receptor" Endocrinology 2005,
30 146(3), 984-991; Y. Zhang et al. "Activation of the nuclear receptor FXR improves hyperglycemia and hyperlipidemia in diabetic mice" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103(4), 1006-1011; B. Cariou et al. "The farnesoid X receptor modulates adiposity and peripheral insulin sensitivity in mice" J. Biol. Chem. 2006, 281, 11039-11049; K. Ma et al. "Farnesoid X receptor is essential for normal glucose homeostasis" J. Clin. Invest. 2006, 116(4), 1102-1109; D. Duran-
35 Sandoval et al. "Potential regulatory role of the farnesoid X receptor in the metabolic syndrome" Biochimie 2005, 87(1), 93-98). Действие на уменьшения массы тела также недавно наблюдали у мышей, которым в избытке давали питание с высоким содержанием липидов. (С. Lihong et al."FXR Agonist, GW4064, Reverses Metabolic Defects in High-Fat Diet Fed Mice" American Diabetes Association (ADA) 66th annual scientific sessions, June 2006,
40 Abstract Number 856-P). Данный эффект потери массы может быть результатом индукции
FXR на FGF-19, фактор роста фибробластов, что, как известно, приводит к снижению массы и атлетическому фенотипу (J. Holt et al. Genes Dev. 2003, 17(13), 1581-1591; E. Tomlinson et al. "Transgenic mice expressing human fibroblast growth factor-19 display increased metabolic rate and decreased adiposity" Endocrinology 2002, 143(5), 1741-1747). В 5 недавних заявках на патент было продемонстрировано действие агониста FXR на уменьшение массы тела (Stoffel W. et al. "Methods for inhibiting Adipogenesis and for treating Type 2 Diabetes" International Patent Application WO 2004/087076; S. Jones et al "Methods of using FXR Agonists" International Patent Application WO 2003/080803).
При совместном рассмотрении указанные фармакологические эффекты 10 агонистов FXR могут быть задействованы в различных терапевтических путях: компоненты, связывающие FXR, считаются подходящими для лечения диабета II типа благодаря их сенсибилизации инсулина, гликогеногенному и гиполипидемическому эффектам.
В одном варианте реализации соединения согласно изобретению и
15 фармацевтические композиции, содержащие указанные соединения, применяют для профилактики и/или лечения диабета II типа, который может быть преодолен за счет FXR-опосредованной повышающей регуляции системной инсулиновой чувствительности и внутриклеточного инсулинового сигналинга в печени, увеличеннного периферического потребления глюкозы и ее метаболизма, увеличенного запаса гликогена в печени,
20 уменьшенного выхода глюкозы в сыворотку в ходе печеночного глюконеогенеза.
В другом варианте реализации указанные соединения и фармацевтические композиции применяют для профилактики и/или лечения хронических внутрипеченочных состояний, таких как первичный билиарный цирроз печени (ПБЦ), первичный склерозирующий холангит (ПСХ), прогрессирующий семейный холестаз (ПСХ),
25 вызванный алкоголем цирроз и ассоциированный холестаз, и некоторые формы внепеченочных холестатических состояний, таких как холестазы, индуцированные эстрогеном или лекарственными средствами.
Настоящее изобретение также относится к соединению согласно формуле (I) или фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение, для профилактики
30 и/или лечения желудочно-кишечных заболеваний, характеризуемых уменьшенным поглощением жиров и жирорастворимых витаминов, которые могут преодолены за счет повышения уровней желчных кислот и фосфолипидов в кишечнике.
В другом варианте реализации указанные соединения и фармацевтические композиции применяют для предотвращения и/или лечения заболевания выбранного из
35 группы, которая состоит из липидных и липопротеиновых расстройств, таких как гиперхолестеринемия, гипертриглицеридемия и атеросклероз, в качестве клинически проявляющегося состояния, которое может быть улучшено за счет благотворного действия FXR по снижению общего холестерина в плазме, снижению триглицеридов сыворотки, увеличению превращения холестерина печени в желчные кислоты и
увеличению чистоты и метаболического превращения ЛПОНП и других липопротеинов в печени.
В другом варианте реализации указанные соединения и фармацевтические композиции применяют для профилактики и/или лечения заболеваний, где могут быть 5 совместно использованы гиполипидемические, антихолестатические и антифибротические эффекты медикаментов, нацеленных на FXR, которые могут быть использованы для лечения стеатоза печени и ассоциированных синдромов, таких как неалкогольный стеатогепатит ("НАСГ"), или для лечения холестатических и фибротических эффектов, которые связаны с вызванным алкоголем циррозом, или с
10 передаваемыми вирусами формами гепатита.
В сочетании с гиполипидемическими эффектами также было показано, что потеря функциональности FXR ведет к увеличению атеросклероза у мышей с выключенным белком АроЕ (Е. Hanniman et al. "Loss of functional farnesoid X receptor increases atherosclerotic lesions in apolipoprotein E-deficient mice" J. Lipid Res. 2005, 46(12),
15 2595-2604). Поэтому агонисты FXR могут иметь клиническое применение как антиатеросклеротические и кардиопротекторные лекарственные средства. Отрицательная регуляция эндотелина-1 в гладкомышечных клетках сосудов может также способствовать благоприятному терапевтическому эффекту (F. Не et al. "Downregulation of endothelin-1 by farnesoid X receptor in vascular endothelial cells" Circ. Res. 2006, 98(2),
20 192-199).
Изобретение также относится к соединению согласно формуле (I) или фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение, для предотвращения и посттравматического лечения сердечно-сосудистых расстройств, таких как острый инфаркт миокарда, острый инсульт, или тромбоз, который возникает как конечная точка
25 хронического обструктивного атеросклероза.
Помимо контролирования образования кишечных полипов, FXR, по-вероятно экспрессируется в раковых тканях груди и клеточных линиях, а не в здоровых тканях груди и, вероятно, взаимодействует с рецептором эстрогена в клетках РЭ, положительных на рак груди (К. Е. Swales et al. "The farnesoid X receptor is expressed in
30 breast cancer and regulates apoptosis and aromatase expression." Cancer Res. 2006, 66(20), 10120 и F. Journe et al. "Association between farnesoid X receptor expression and cell proliferation in estrogen receptor-positive luminal-like breast cancer from postmenopausal patients". Breast Cancer Res. Treat. 2009, 115(3), 523).
Это должно позволить рассматривать FXR также как потенциальную мишень для
35 лечения пролиферативных заболеваний, особенно метастазирующих раковых форм, которые дают метастазы, которые выделяют низкомолекулярную чувствительную форму FXR.
В другом варианте реализации указанные соединения и фармацевтические композиции применяют для профилактики и/или лечения злокачественных 40 гиперпролиферативных расстройств, таких как разные формы рака, в частности
конкретные формы рака груди, печени или рака толстой кишки, где взаимодействие с лигандом FXR будет иметь благотворное влияние.
Наконец, FXR, вероятно, также вовлечен в контроль антибактериальной защиты в кишечнике (Т. Inagaki et al. "Regulation of antibacterial defense in the small intestine by the 5 nuclear bile acid receptor" Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006, 103(10), 3920-3905), хотя точный механизм не установлен. Из этих опубликованных данных, тем не менее, можно заключить, что лечение с помощью агонистов FXR может иметь благотворное влияние при терапии воспалительных расстройств кишечника (ВРК), в частности таких форм, где поражена верхняя (подвздошная) часть кишечника (например, болезнь Крона
10 подвздошной кишки), поскольку это, по-видимому, место действия контроля FXR на бактериальный рост. При ВРК снижение чувствительности адаптивного иммунного ответа каким-то образом ослабляет в кишечнике иммунную систему. Бактериальное разрастание может затем стать причиной инициирования установления хронического воспалительного ответа. Таким образом, подавление бактериального роста механизмами, которые
15 основаны на FXR, может быть ключевым механизмом для предотвращения острых воспалительных случаев.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к соединению согласно формуле (I) или фармацевтической композиции, содержащей указанное соединение, для предотвращения и/или лечения заболевания, относящегося к воспалительным
20 заболеваниям кишечника, такого как болезнь Крона или язвенный колит. FXR-опосредованное восстановление внешней барьерной функции кишечника или снижение несимбиотической бактериальной нагрузки, как полагают, способствует снижению воздействия бактериальных антигенов на иммунную систему кишечника и может, таким образом, снижать воспалительные реакции.
25 Кроме того, изобретение относится к соединению или фармацевтической
композиции для профилактики и/или лечения ожирения и связанных с ним расстройств, таких как метаболический синдром (сочетание условий дислипидемии, диабета и аномально высокого индекса массы тела), которые могут быть преодолены за счет FXR-опосредованного снижения триглицеридов в сыворотке, глюкозы в крови и повышения
30 чувствительности к инсулину и FXR-опосредованной потери массы тела.
В одном варианте реализации изобретения, указанное соединение или фармацевтическая композиция предназначена для лечения устойчивых инфекций, вызванных внутриклеточными бактериями или простейшими-паразитами, такими как Mycobacterium spec, (лечение туберкулеза или проказы), Listeria monocytogenes (лечение
35 листериоза), Leishmania spec, (лейшманиоз), Trypanosoma spec, (болезнь Чагаса, трипаносомоз, сонная болезнь).
В другом варианте реализации соединения или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению подходят для предотвращения и/или лечения клинических осложнений диабета I типа и II типа. Примеры таких осложнений включают
40 диабетическую нефропатию, диабетическую ретинопатию, диабетические нейропатии
или периферический облитерирующий эндартериит (ПАОЗ). Другие клинические осложнения сахарного диабета также охвачены настоящим изобретением.
Кроме того, состояния и заболевания, возникающие в результате хронической жировой и фиброзной дегенерации органов вследствие усиленного накопления липидов и, в частности, триглицеридов и последующей активации профибротических путей, также могут быть предотвращены и/или подвергнуты лечению с применением соединений или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Такие состояния или заболевания включают неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и хронические холестатические состояния в печени, гломерулосклероз и диабетическую нефропатию в почках, вырождения макулы и диабетическую ретинопатию глаз, и нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера в мозге или диабетическую нейропатию в периферической нервной системе.
При практическом применении соединения согласно настоящему изобретению могут быть объединены в качестве активного ингредиента в однородную смесь с фармацевтическим носителем согласно традиционным методам приготовления фармацевтических композиций. Носитель может принимать различные формы в зависимости от формы препарата, предназначенного для введения, например, перорального или парентерального (в том числе внутривенного). При приготовлении композиций для пероральной дозированной формы могут быть применены любые из обычных фармацевтических сред, такие как, например, вода, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты, красители и т.п. в случае жидких препаратов для перорального введения, такие как, например, суспензии, эликсиры и растворы, или носители, такие как крахмалы, сахара, микрокристаллическая целлюлоза, разбавители, гранулирующие агенты, смазывающие агенты, связующие, разрыхляющие агенты и т.п. и в случае твердых препаратов для перорального введения, таких как, например, порошки, твердые и мягкие капсулы и таблетки, при этом твердые препараты для перорального введения являются предпочтительными по отношению к жидким препаратам.
Благодаря легкости введения, таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные пероральные единичные дозированные формы, в случае которых, очевидным образом, используют твердые фармацевтические носители. При необходимости на таблетки может быть нанесено покрытие посредством стандартных водных или неводных методов. Такие композиции и препараты должны содержать по меньшей мере 0,1 процент активного соединения. Процент активного соединения в этих композициях может, конечно, меняться и может соответственно находиться в пределах от примерно 2 процентов до примерно 60 процентов от массы единицы. Количество активного соединения в таких терапевтически подходящих композициях таково, чтобы обеспечить эффективную дозу. Активные соединения можно также вводить интраназально, например, в виде жидких капель или спрея.
Таблетки, пилюли, капсулы и т.п. могут содержать связующее, такое как трагакант, камедь, кукурузный крахмал или желатин; наполнители, такие как фосфат
дикальция; разрыхляющий агент, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота; смазывающий агент, такой как стеарат магния; и подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин. Если единичная дозированная форма представляет собой капсулу, она может содержать, в дополнение к веществам указанного выше типа, жидкий носитель, такой как жирное масло.
Различные другие материалы могут присутствовать в качестве покрытия или для изменения физической формы дозированной единицы. Например, таблетки могут быть покрыты шеллаком, сахаром или и шеллакком, и сахаром. Сироп или эликсир может содержать, в дополнение к активному ингредиенту, сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, красителей и вкусовую добавку, такую как вишневую или апельсиновую добавку.
Поскольку соединения согласно настоящему изобретению в основном представляют собой карбоновые кислоты или аналогичные анионные изостеры, и поскольку хорошо известно, что солевые формы ионных лекарственных соединений могут существенно повлиять на биодоступность лекарственных соединений, соединения согласно настоящему изобретению могут также быть применены в качестве солей в различных концентрациях, обеспечивая пероральную доступность состава. Такие фармацевтически приемлемые катионы могут быть выбраны из моно-или двухвалентных ионов, таких как аммоний, ионы щелочных металлов: натрия или калия, или щелочноземельных металлов: магния или кальция, некоторых фармацевтически приемлемых аминов, таких как трис(гидроксиметил)аминометан, этилендиамин, диэтиламин, пиперазин или других, или некоторых катионных аминокислот, таких как лизин или аргинин.
Соединения согласно настоящему изобретению могут быть также введены парентерально. Растворы или суспензии этих активных соединений могут быть приготовлены в воде, соответствующим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии могут быть также приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. В обычных условиях хранения и применения, полученные препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.
Фармацевтические формы, подходящие для применения для инъекций включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой в той степени, чтобы ее легко было набрать в шприц. Форма должна быть стабильной в условиях производства и хранения, а также должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), подходящие смеси и растительные масла.
Для обеспечения млекопитающих, особенно человека, эффективной дозой соединения согласно настоящему изобретению может быть использован любой подходящий способ введения. Например, могут быть использованы пероральные, ректальные, местные, парентеральные способы введения, введение в глаза, в легкие, в нос и т.п. Дозированные формы включают таблетки, пастилки, дисперсии, суспензии, растворы, капсулы, кремы, мази, аэрозоли и т. п. Предпочтительно соединения согласно настоящему изобретению вводят перорально.
Эффективная доза применяемого активного ингредиента может меняться в зависимости от конкретного используемого соединения, способа введения, состояния, подлежащего лечению, и тяжести состояния, подлежащего лечению. Такая доза может быть легко установлена специалистом в данной области.
При лечении или предотвращении FXR-опосредованных состояний, для которых показаны соединения согласно настоящему изобретению, как правило, достигают удовлетворительных результатов, когда соединения согласно настоящему изобретению вводят в суточной дозе от примерно 0,1 мг до примерно 100 мг на килограмм массы тела животного, предпочтительно в виде однократной дневной дозы или разделенных доз на от двух до шести приемов в день или в форме с замедленным высвобождением. Для большинства крупных млекопитающих, общая суточная доза составляет от примерно 1,0 мг до примерно 1000 мг, предпочтительно от примерно 1 мг до примерно 50 мг. В случае 70 кг взрослого человека, общая суточная доза обычно составляет от примерно 7 мг до примерно 350 мг. Указанный режим дозирования может быть скорректирован, чтобы обеспечить оптимальный терапевтический эффект.
Некоторые аббревиатуры, встречающиеся в настоящей заявке, представляют собой следующие.
Аббревиатуры
Аббревиатура Расшифровка
m-СРВА Мета-хлорбензойная кислота
ДХМ Дихлорметан
DIAD Диизопропил-азодикарбоксилат
ДМФА Диметилформамид
ДМСО Диметилсульфоксид
EtOAc (ЕА) Этилацетат
2-[2-(Бис(карбоксиметил)амино)этил-
EDTA
(карбоксиметил)амино]уксусная кислота
ИЭР Ионизация электрораспылением
FXR Фарсеноидный Х-рецептор
GST Глутатион-Б-трансфераза
ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография
IPTG Изопропил-p-D-l -тиогалактопиранозид
LBD Лигандсвязывающий домен
ЖХ/МС Жидкостная хроматомасс-спектрометрия
ЯМР Ядерный магнитный резонанс
РЕ Петролейный эфир
ро Перорально
R Фактор удерживания
СДС Додецилсульфат натрия
ТГФ Тетрагидрофуран
ТСХ Тонкослойная хроматография
TMS Триметилсилан
TBS Трет-бутилдиметилсилил
Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с методиками, представленными на следующих схемах и в примерах, с
применением соответствующих веществ и далее проиллюстрированы следующими конкретными примерами. Кроме того, используя методики, описанные в настоящей заявке, в сочетании со знаниями среднего специалиста в данной области могут быть легко получены дополнительные соединения, заявленные в настоящем изобретении. 5 Однако соединения, проиллюстрированные в примерах, не следует рассматривать как единственные соединения, заявленные в изобретении. Примеры дополнительно иллюстрируют подробное описание получения соединений согласно изобретению. Специалисты в данной области могут легко понять, что можно использовать известные изменения условий или процессов следующих препаративных методик для получения
10 указанных соединений. Настоящие соединения, как правило, выделяют в виде их фармацевтически приемлемых солей, таких, как описано выше.
Аминные свободные основания, соответствующие выделенным солям могут быть получены путем нейтрализации с подходящим основанием, таким как водный гидрокарбонат натрия, карбонат натрия, гидроксид натрия и гидроксид калия и
15 экстракцией выделенных аминных свободных оснований в органическом растворителе с последующим испарением. Аминное свободное основание, выделенное таким образом, могут быть в дальнейшем превращено в другую фармацевтически приемлемую соль путем растворения в органическом растворителе с последующим добавлением соответствующей кислоты и последующим испарением, осаждением или
20 кристаллизацией. Карбоновые свободные кислоты, соответствующие выделенным солям, могут быть получены путем нейтрализации с подходящей кислотой, такой как водная хлороводородная кислота, гидросульфат натрия, дигидрофосфат натрия, и экстракции выделенной карбоновой свободной кислоты добычу освобожденных карбоксильных свободной кислоты в органическом растворителе с последующим испарением.
25 Карбоновые кислоты, выделенные таким образом, могут быть в дальнейшем превращены в другую фармацевтически приемлемую соль путем растворения в органическом растворителе с последующим добавлением соответствующего основания и последующим испарением, осаждением или кристаллизацией.
Иллюстрация получения соединений согласно настоящему изобретению
30 представлена ниже. Если иное не указано на схемах, переменные имеют те же значения, как описано выше. Примеры, представленные ниже, предназначены для иллюстрации конкретных вариантов реализации изобретения. Подходящие исходные вещества, строительные блоки и реагенты, применяемые в синтезе, как описано ниже, коммерчески доступны в Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Мюнхен, Германия, Acros Organics, Бельгия или
35 в Fisher Scientific GmbH, 58239 Шверте, Германия, например, или могут быть в обычном порядке получены согласно методикам, описанным в литературе, например, в "March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure", 5th Edition; John Wiley & Sons или Theophil Eicher, Siegfried Hauptmann "The Chemistry of Heterocycles; Structures,
Reactions, Synthesis and Application", 2 издание, Wiley-VCH 2003; Fieser et al. "Fiesers' Reagents for organic Synthesis" John Wiley & Sons 2000.
Примеры
Синтез предшественников Схема 1а:
Раствор 2,6-дихлорбензальдегида А1а (25 г, 0,14 моль) в 200 мл этанола добавляли к раствору гидрохлорида гидроксиламина (11 г, 0,16 моль) и гидроксида натрия (6,3 г, 0,16
моль) в 100 мл воды. Полученную смесь перемешивали при 90°С в течение 24 часов.
Объем уменьшали в вакууме примерно на 30 мл, что вызывало осаждение. Далее колбу охлаждали до комнатной температуры, а твердое вещество собирали путем фильтрования и промывали водой (2 х 100 мл). Твердое вещество сушили под вакуумом с получением 25,9 г соединения А2а (белое твердое вещество, выход 96%).
Синтез Соединения АЗа:
В круглодонную колбу вместимостью 500 мл наливали раствор соединения А2а (25,9 г, 0,14 моль) в 300 мл ДМФА. Колбу помещали в водяную баню комнатной температуры. Далее в колбу помещали NCS (18,4 г, 0,14 моль). Реакционную смесь перемешивали еще в течение часа, далее содержимое колбы приливали к 400 мл воды и экстрагировали 5 продукт 500 мл Et20. Органический слой промывали водой (2 х 200 мл) и 100 мл солевого раствора, далее сушили над MgS04. После фильтрования растворитель удаляли при пониженном давлении с получением 29 г соединения АЗа в виде желтого масла, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
10 Синтез Соединения А4а:
Перемешанный раствор изобутирилацетата (16 г, 124,8 ммоль) в 120 мл сухого ТГФ обрабатывали раствором метоксида натрия (252 мл, 0,5 М в МеОН), а далее раствором соединения АЗа (28 г, 124,8 ммоль) в 40 мл сухого ТГФ. После перемешивания при 15 комнатной температуре в течение 16 ч растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток распределяли между 800 мл Et20 и 800 мл воды. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 24,8 г соединения А4а в виде белого твердого вещества (выход 62%).
Синтез Соединения А5а:
Раствор соединения А4а (24,8 г, 79,7 ммоль) в 180 мл сухого ТГФ охлаждали до 0°С в
атмосфере азота при добавлении по каплям LAH (3,1 г, 79,7 ммоль). Далее реакционной 25 смеси медленно давали нагреться до комнатной температуры в течение 2 часов. Колбу
снова охлаждали до 0°С и аккуратно добавляли 5 мл МеОН в течение 10 минут.
Добавляли насыщенный раствор Na2S04 и полученное твердое вещество фильтровали через слой целита. Концентрировали с получением 21 г соединения А5а в виде желтого твердого вещества (выход 93%).
К раствору бензотриазола (6,77 г, 73,7 ммоль) в 100 мл сухого ДХМ добавляли SOCI2(8,76 5 г, 73,7 ммоль) при 0°С и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа.
Полученную смесь добавляли к раствору соединения А5а (21 г, 73,7 ммоль) в 200 мл сухого ДХМ при комнатной температуре и перемешивали в течение 1,5 часов. К смеси добавляли 60 мл воды для того, чтобы погасить реакцию, и подвергали смесь экстракции с помощью ДХМ. Органический слой промывали 1н. водным раствором NaOH, сушили 10 над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 21,7 г соединения Аба в виде белого твердого вещества (выход 97,2%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3): 5 1,47 (d, J = 6,8 Гц, 6Н), 3,35 (m, 1Н), 4,31 (s, 2Н), 7,38-7,48 (т, ЗН).
Синтез Соединения А4е:
К раствору соединения АЗа (105 г, 0,47 моль) в 400 мл ТЭА добавляли этил-3-циклопропил-3-оксопропаноат (100 г, 0,70 моль). Смесь перемешивали при комнатной 20 температуре в течение ночи. Растворитель удаляли при пониженном давлении и проводили очистку посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 87 г соединения А4е в виде белого твердого вещества (выход 57%).
Синтез Соединения А5е:
К раствору соединения А4е (80 г, 0,26 моль) в 300 мл сухого ТГФ добавляли DIBAL-H (360 мл, 0,54 моль) при 0°С в атмосфере N2 и перемешивали при комнатной температуре в
течение 4 часов. Реакцию гасили МеОН (80 мл) и HCI (1 М), проводили экстракцию с помощью ЕА и органический слой промывали солевым раствором. Проводили 5 концентрирование при пониженном давлении с получением 55 г неочищенного соединения А5е, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения Абе:
К раствору бензотриазола (17,85 г, 194,3 ммоль) в 100 мл сухого ДХМ добавляли SOCI2 (23,09 г, 73,7 ммоль) при 0°С и перемешивали при комнатной температуре в течение 1
15 часа. Полученную смесь добавляли к раствору соединения А5е (55 г, 194,3 ммоль) в 500 мл сухого ДХМ при комнатной температуре и перемешивали в течение 1,5 часов. К смеси добавляли 120 мл воды, чтобы погасить реакцию, и подвергали смесь экстракции с помощью ДМФА. Органический слой промывали 1н. водным раствором NaOH, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на
20 силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 47,4 г соединения Абе в виде белого твердого вещества (выход 81%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3): 5 1,23-1,33 (m, 4Н), 2,14 (т, 1Н), 4,40 (s, 2Н), 8,31 (s, 2Н).
Синтез Соединения A2b:
К раствору соединения А1Ь (5,00 г, 28,4 ммоль) в 40 мл ЕЮН добавляли смесь NaOH (1,37 г, 34,1 ммоль) и NH2OH-HCI (2,37 г, 34,1 ммоль) в 15 мл Н20. Полученную смесь
перемешивали при 90°С в течение 12 часов. Полученный объем концентрировали при
пониженном давлении примерно на 10 мл и собирали твердое вещество путем 10 фильтрования. Твердые вещества промывали водой и сушили под вакуумом с получением 5,0 г соединения А2Ь в виде белого твердого вещества (выход 92%).
Синтез Соединения АЗЬ:
15 В круглодонную колбу вместимостью 100 мл наливали раствор соединения А2Ь (5,0 г, 26,2 ммоль) в 50 мл ДМФА. Колбу помещали в водяную баню комнатной температуры. Далее в колбу помещали NCS (4,13 г, 31,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивали еще в течение 12 часов, далее содержимое концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли Et20, промывали водой и солевым раствором, сушили над Na2S04,
фильтровали и концентрировали с получением 5,3 г соединения АЗЬ в виде желтого масла, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения А4Ь:
Перемешанный раствор этил-З-циклопропил-З-оксопропаноата (3,88 г, 24,5 ммоль) в 40 мл сухого ТГФ обрабатывали 15 мл Et3N, а далее раствором соединения АЗЬ (5 г, 22,25 ммоль) в 30 мл сухого ТГФ. После перемешивания при комнатной температуре в течение 18 часов растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученный остаток 10 распределяли между 100 мл Et20 и 40 мл воды. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 3,25 г соединения А4Ь в виде белого твердого вещества (выход 45%).
15 Синтез Соединения А5Ь:
К раствору соединения А4Ь (2,0 г, 6,10 ммоль) в 30 мл безводного ТГФ по каплям добавляли DIBAL-H (25,6 мл, 25,60 ммоль) при -10°С в течение 15 минут в атмосфере N2.
Полученную смесь перемешивали при той же температуре в течение 3 часов. Реакцию 20 гасили водой, и проводили экстракцию с помощью ЕА, органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, Растворитель испаряли, получая неочищенный продукт, который далее очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 2/1) с получением 0,44 г соединения А5Ь в виде белого твердого вещества (выход 25%).
К раствору бензотриазола (0,84 г, 9,1 ммоль) в 20 мл сухого ДХМ по каплям добавляли SOCI2(1,08 мг, 9,1 ммоль) при 0°С. Полученную смесь перемешивали в течение 30 минут
5 при комнатной температуре в атмосфере N2. Полученный раствор переносили в капельную воронку и по каплям добавляли в течение 10 минут к перемешанному раствору соединения А5Ь (2,0 г, 7,0 ммоль) в 20 мл сухого ДХМ. После перемешивания в течение 1 часа, полученную суспензию фильтровали с удалением гидрохлорида бензотриазола. Фильтрат последовательно промывали 30 мл воды дважды, 30 мл 1н. 10 раствора NaOH и 30 мл солевого раствора, сушили над безводным Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс =10/1) с получением 0,91 г соединения А6Ь в виде белого твердого вещества (выход 42,3%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3): 5 1,21-1,35 (m, 4Н), 2,14-2,18 (т, 1 Н), 4,38 (s, 2Н), 8,67 (s, 2Н).
Синтез Соединения Абе:
К перемешанному раствору А6Ь (0,53 г, 1,75 ммоль) в 10 мл ДХМ добавляли т-СРВА (0,65 мг, 3,60 ммоль) при комнатной температуре. После перемешивания в течение 18 20 часов при комнатной температуре реакцию гасили насыщенным раствором NaHC03, проводили экстракцию с помощью ДХМ, промывали водой и солевым раствором, сушили над безводным Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 5/1) с получением 318 мг соединения Абе в виде белого твердого вещества (выход 57%).
25 1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3): 5 1,23-1,33 (m, 4Н), 2,14 (m, 1Н), 4,40 (s, 2Н), 8,31 (s, 2Н).
Раствор 2,6-дихлорфенилазида (F, 25 г, 0,13 моль) в толуоле (100 мл) и ацетиленовом спирте (G, 52,1 г, 0,53 моль) кипятили с обратным холодильником в атмосфере аргона в течение 35 часов. Толуол удаляли под вакуумом, и полученные продукты очищали посредством тщательной колоночной хроматографии и выделяли два триазоловых 10 продукта в виде твердых веществ, Соединения A5d (4,5 г, 23%) и Соединения А5х (6,5 г, 34%).
Получение соединения A6d:
15 К раствору соединения A5d (2,00 г, 7,0 ммоль) в 20 мл ДХМ и 2 мл CCI4 добавляли PPh3 (3,67 г, 14,0 ммоль). Далее раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция завершилась. Концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш
хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 2,02 г соединения A6d в виде белого твердого вещества (выход 95%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3): 5 1,51-1,49 (d, 6Н), 3,24-3,21 (m, 1Н), 4,48 (s, 2Н), 7,52-7,50 (t, 1Н), 7,58-7,54 (d, 2Н).
Схема 1d
TMS
C02Et
CK^^CI ^ ci
.CI
A1f
K2C03 C|
n-BuLi ,CI CIC°2Et CI
A2f
CI A3f
4N'No ССЦ PPh3
Ci^^N --: HO.
N'N,4, LAH N
СI Et°2C \ CI
ci^ \ ci^n(
A5f A4f
A1f
Раствор 2-бром-1,3-дихлорбензола (13 г, 58 ммоль), 2,2-диметил-2-силабут-3-ин (90 мл, 64 ммоль), Cul (100 мг, 5,5 ммоль), PPh3 (200 мг, 0,75 ммоль) и Pd(PPh3)2CI2 (235 мг, 0,335 5 ммоль) в 35 мл NEt3 кипятили в запаянной трубке в атмосфере N2 в течение 24 часов. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция завершилась. Реакционную смесь концентрировали и добавляли ЕЮАс. Раствор промывали водой и солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 100/0) с получением 13 г неочищенного 10 соединения A1f в виде масла (выход 40%, чистота 70%).
Синтез Соединения A2f:
К раствору неочищенного соединения A1f (13 г, 48,4 ммоль) в 200 мл МеОН добавляли 15 К2С03 (13 г, 94,3 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение ночи в атмосфере N2. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 4,1 г соединения A2f в виде белого твердого вещества (выход 56,1%).
20 Синтез Соединения A3f:
К раствору соединения A2f (2 г, 12 ммоль) в 40 мл сухого ТГФ добавляли n-BuLi (5,6 мл, 2,5 М в гексане, 14 ммоль) при -78°С в атмосфере N2 и перемешивали раствор при
указанной температуре в течение 30 минут. Далее добавляли раствор этил-хлорацетата 25 (1,65 г, 15 ммоль) в 10 мл сухого ТГФ при -78°С. Смесь перемешивали в течение 4 часов.
Полученный раствор приливали к насыщенному раствору NH4CI раствор и добавляли ЕЮАс для экстракции дважды. Объединенные органические слои сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 50/1) с получением 1,25 г 5 соединения A3f в виде желтого твердого вещества (выход 44,5%).
Синтез Соединения A4f:
Раствор соединения A3f (3 г, 12,4 ммоль) и 2-азидопропан (20 мл) нагревали при 110°С в
10 течение 24 часов в автоклаве. Концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 4/1) с получением 1 г соединения A4f в виде желтого твердого вещества (выход 34,8%).
Синтез Соединения A5f:
К ледяному холодному раствору соединения A4f (1 г, 1,38 ммоль) в 10 мл безводного ТГФ по каплям добавляли LAH (2М в ТГФ, 2,76 ммоль). После добавления реакционный раствор перемешивали при указанной температуре в течение 2 часов. Данные ТСХ показали, что реакция завершилась. Медленно добавляли 10 мл МеОН, чтобы погасить 20 реакцию, с последующим добавлением насыщенного раствора Na2S04. Полученное твердое вещество отфильтровывали, а раствор концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 1/4) с получением 180 мг соединения A5f в виде желтого твердого вещества (выход 45,7%).
25 1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 7,41-7,43 (m, 2Н), 7,30-7,32 (m, 1Н), 4,91-4,97 (m, 1Н), 4,58-4,59 (d, J= 5,6 Гц, 2Н), 2,70-2,73 (br, 1Н), 1,72 (s, ЗН), 1,70 (s, ЗН).
Раствор соединения A5f (200 мг, 0,70 ммоль), ССЦ (1 мл, 10,4 ммоль) и PPh3 (368 мг, 1,40 ммоль) в 5 мл безводного ДХМ перемешивали при комнатной температуре в течение 2 5 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 3/1) с получением 100 мг соединения A6f в виде желтого масла (выход 47,1%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 7,45-7,47 (m, 2Н), 7,36-7,39 (т, 1Н), 4,81-4,85 (т, 1Н), 4,51 (s, 1Н), 1,78 (S, ЗН), 1,74 (s, ЗН).
Схема 2:
Синтез Соединения В2:
Н02С^^^_.С02Н SOCI2 Ме02С^^^-С02Ме МеОН
В1 В2
5 SOCI2 (113,3 г, 0,96 моль) медленно добавляли к 700 мл сухого метанола при 0°С. После
перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре, добавляли соединение В1 (80 г, 0,48 моль) и перемешивали в течение 1,5 ч. Смесь концентрировали и добавляли водный раствор NaHC03, чтобы погасить реакцию. Суспензию дважды подвергали экстракции с помощью ДХМ. Объединенные органические слои сушили над Na2S04, 10 фильтровали и концентрировали с получением 85 г соединения В2, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения ВЗ:
15 К раствору соединения В2 (60 г, 0,31 моль) в 500 мл МеОН добавляли раствор NaOH (12,4 г, 0,31 моль) в 200 мл МеОН. Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Смесь концентрировали, а остаток растворяли в 500 мл воды и
экстрагировали с помощью Et20. Водный раствор подкисляли концентрированным раствором HCI до рН = 2, образовавшийся белый осадок собирали и сушили под вакуумом с получением 46 г неочищенного соединения ВЗ в виде белого твердого вещества.
Синтез Соединения В4:
К раствору соединения ВЗ (46 г, 0,3 моль) в 700 мл сухого ТГФ добавляли раствор ВН3 в ТГФ (1 М, 600 мл, 0,60 моль) при 0°С в атмосфере N2 в течение 20 минут. Далее раствор
перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Для гашения реакции медленно добавляли 50% водный раствор уксусной кислоты (400 мл). Реакционную смесь концентрировали и далее распределяли между ЕЮАс и водой. Органическую фазу последовательно промывали 10% водным раствором Na2C03, Н20 и солевым раствором. Полученную смесь сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 28 г соединения В4 в виде белого твердого вещества (Выход за 3 стадии: 54%).
Синтез Соединения В5:
К раствору соединения В4 (28 г, 0,168 моль) в 700 мл Et20 по каплям добавляли РВг3 (17,4 мл, 0,185 моль). Раствор перемешивали в течение 2 часов, и далее реакционную смесь приливали к 500 мл ледяной воды. Водный слой экстрагировали с помощью Et20. Объединенные органические слои последовательно промывали насыщенным раствором NaHC03, водой, и солевым раствором. Органическую фазу сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 34 г соединения В5 в виде масла (выход 70%).
Синтез Соединения В6:
Смесь соединения В5 (34 г, 148 ммоль) в 34 мл триэтоксифосфина нагревали при 175°С в
течение 4 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении с получением 40 г соединения В6, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения В8:
К раствору соединения В7 (150 г, 1,17 моль), гидроксида кальция (375 г, 5,07 моль) и карбоната натрия (420 г, 3,96 моль) в 1,5 л воды добавляли хлороформ (270 г, 2,29 моль) в течение 80 минут и кипятили реакционную смесь в атмосфере N2 в течение 3 часов. Реакционную смесь охлаждали в ледяной бане. Добавляли 1 л концентрированного водного раствора HCI и 1 л хлороформа. Смесь перемешивали и после разделения фаз удаляли водный слой. Органический слой сушили над Na2S04, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 28 г соединения В8 в виде белого твердого вещества (выход 15,3%).
TBSCI
К раствору соединения В8 (11 г, 70,1 ммоль) в 300 мл сухого ДХМ добавляли TBDMSCI (12,7 г, 84,2 ммоль), ТЭА (19,6 мл, 140,2 ммоль) и ДМАР (100 мг, кат.). Реакционную смесь 5 перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали при пониженном давлении с получением 18,5 г неочищенного соединения В9, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения В10:
К раствору соединения В9 (23 г, 80,6 ммоль) в 320 мл сухого ТГФ добавляли гидрид
натрия (60% в минеральном масле, 5 г, 123 ммоль) при 0°С в течение 30 минут. К
полученной смеси добавляли раствор соединения В6 (18,5 г, 61,5 ммоль) в 160 мл сухого
ТГФ при 0°С, и перемешивали раствор при комнатной температуре в течение 3 часов.
15 Реакцию гасили насыщенным раствором NH4CI и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали с получением 23 г соединения В10, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
20 Синтез Соединения В11:
К раствору соединения В10 (23 г, 80,6 ммоль) в 450 мл сухого ДХМ добавляли TBDMSCI (12,7 г, 84,2 ммоль), ТЭА (19,6 мл, 161,2 ммоль) и ДМАР (0,5 г, кат.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали при 25 пониженном давлении и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 30/1) с получением 11,8 г соединения В11 в виде белого твердого вещества (выход за 3 стадии: 41,8%).
К раствору диэтилцинка (290 мл, 1М в гексане, 290 ммоль) в 600 мл сухого ДХМ 5 добавляли дийодэтан (46 мл, 580 ммоль) при -78°С. Раствор перемешивали в течение 30
минут, и далее смесь нагревали до -30°С. К смеси добавляли ТФУ (38 г, 290 ммоль) и
перемешивали в течение 30 минут. К смеси добавляли раствор соединения В11 (11,8 г, 29 ммоль) в 200 мл ДХМ и смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь гасили 500 мл 1н. водного раствора HCI. Органический 10 слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали досуха и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 20/1) с получением 4,5 г соединения В12 в виде масла (выход 36,9%).
15 Синтез Соединения В13:
Раствор соединения В12 (4,5 г, 10,8 ммоль) и TBAF Н20 (11 г, 42,1 ммоль) в 300 мл сухого ТГФ перемешивали в течение 10 минут при комнатной температуре. Добавляли воду (100 мл) и проводили экстракцию с помощью 500 мл ЕЮАс. Органический слой промывали 20 солевым раствором, сушили над Na2S04, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 2,0 г неочищенного соединения В13 с чистотой 80% (УФ-ВЭЖХ) в виде желтого масла.
К раствору неочищенного соединения В13 (200 мг, 0,66 ммоль) и соединения Аба (200 мг, 0,66 ммоль) в 5 мл ДМФА добавляли К2С03 (184 мг, 1,33 ммоль). Смесь нагревали в
течение ночи при 60°С, далее охлаждали до комнатной температуры, разбавляли водой
(10 мл) и экстрагировали 30 мл ЕЮАс. Органический слой дважды промывали солевым 5 раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 20/1) с получением 220 мг соединения В14а в виде белого твердого вещества (выход 59,8%).
Синтез Соединения В14Ь:
К раствору неочищенного соединения В13 (200 мг, 0,66 ммоль) и соединения А6Ь (200 мг, 0,66 ммоль) в 5 мл ДМФА добавляли К2С03 (184 мг, 1,33 ммоль). Смесь нагревали в
течение ночи при 60°С, далее охлаждали до комнатной температуры, разбавляли водой
(10 мл) и проводили экстракцию с помощью 30 мл ЕЮАс. Органический слой дважды 15 промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 20/1) с получением 100 мг соединения В14Ь в виде белого твердого вещества (выход 27,2%).
Синтез Соединения В14с:
К раствору неочищенного соединения В13 (200 мг, 0,66 ммоль) и соединения Абс (211 мг, 0,66 ммоль) в 5 мл ДМФА добавляли К2С03 (184 мг, 1,33 ммоль). Смесь нагревали в
25 течение ночи при 60°С, далее охлаждали до комнатной температуры, разбавляли водой (10 мл) и проводили экстракцию с помощью 30 мл ЕЮАс. Органический слой дважды
промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 8/1) с получением 140 мг соединения В14с в виде белого твердого вещества (выход 38,1%).
5 Синтез Соединения B14d:
К раствору неочищенного соединения В13 (200 мг, 0,66 ммоль) и соединения A6d (200 мг, 0,66 ммоль) в 5 мл ДМФА добавляли К2С03 (184 мг, 1,33 ммоль). Смесь нагревали в
10 течение ночи при 60°С, далее охлаждали до комнатной температуры, разбавляли водой
(10 мл) и проводили экстракцию с помощью 30 мл ЕЮАс. Органический слой дважды промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 103 мг соединения B14d в виде белого твердого вещества (выход 28,0%).
Синтез Соединения В14е:
20 К раствору неочищенного соединения В13 (1 г, 3,3 ммоль, 1,00 экв.) и Абе (1 г, 3,3 ммоль, 1 экв.) в 30 мл ДМФА добавляли К2С03 (1,4 г, 9,9 ммоль, 3,00 экв.). Смесь нагревали в
течение ночи при 60°С, далее охлаждали до комнатной температуры, разбавляли водой
(50 мл) и проводили экстракцию с помощью Et20 (200 мл). Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали 25 посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 20/1) с
получением 1,2 г соединения В14е, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез соединения согласно Примеру 1:
К раствору соединения В14Ь (100 мг, 0,18 ммоль) в 5 мл ТГФ и 2 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (74 мг, 1,8 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Смесь концентрировали и разбавляли 10 мл Н20, добавляли 1н.
10 водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 5. Смесь подвергали экстракции с помощью ЕЮАс и органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали, а остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс= 3/1) с получением 30 мг соединения согласно Примеру 1 (3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)изоксазол-4-
15 ил)метокси)фенил)циклопропил)-бензойной кислоты) в виде белого твердого вещества (выход 30,8%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,23 (m, 2Н), 1,31 (т, 2Н), 1,47 (т, 2Н), 2,09 (т, 1Н), 2,17 (т, 1Н), 2,39 (т, 1Н), 4,84 (s, 2Н), 6,65 (dd, J= 1,6 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,84 (d, J= 1,6 Гц, 1Н), 6,99 (d, J= 8,4 Гц, 1Н), 7,43-7,48 (т, 2Н), 7,97 (т, 2Н), 8,64 (s, 2Н).
20 ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,01% ТФУ): чистота > 95%, Rt = 3,304 мин.;
МС выч.: 554; МС найд.: 555 (М+Н)+. Синтез соединения согласно Примеру 2:
К раствору соединения В14с (140 мг, 0,24 ммоль) в 5 мл ТГФ и 2 мл Н20 добавляли
LiOH Н20 (100 мг, 2,4 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в
течение 24 часов. Смесь концентрировали и разбавляли 10 мл Н20, добавляли 1н.
5 водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 5. Смесь подвергали экстракции с
помощью ЕЮАс и органический слой промывали солевым раствором, сушили над
Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на
силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 1/1) с получением 40 мг соединения согласно Примеру
2 (4-(4-((4-(2-(3-карбоксифенил) циклопропил)-3-хлорфенокси)метил)-5-
10 циклопропилизоксазол-3-ил)-3,5-дихлорпиридин-1-оксида) в виде белого твердого вещества (выход 29,3%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,21-1,33 (m, 4Н), 1,44-1,50 (т, 2Н), 2,10-2,19 (т, 2Н), 2,39 (т, 1Н), 4,85 (s, 2Н), 6,67 (dd, J= 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,88 (d, J= 2,4 Гц, 1Н), 7,02 (d, J= 8,4 Гц, 1Н), 7,40-7,48 (т, 2Н), 7,95 (т, 2Н), 8,31 (s, 2Н).
15 ЖХ/МС (подвижная фаза: 40%-95% ацетонитрил-вода-0,01% ТФУ): чистота > 95%, Rt = 3,421 мин.;
МС выч.: 570; МС найд.: 571 (М+Н)+. Синтез соединения согласно Примеру 3:
К раствору соединения B14d (103 мг, 0,18 ммоль) в 10 мл ТГФ и 5 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (76 мг, 1,8 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Смесь концентрировали и разбавляли 10 мл Н20, добавляли 1н. водного раствора HCI для подкисления смеси до рН = 5. Смесь подвергали экстракции с
25 помощью ЕЮАс и органический слой промывали солевым раствором, сушили над
Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на
силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 2/1) с получением 80 мг соединения согласно Примеру
3 (3-(2-(2-хлор-4-((1 -(2,6-дихлорфенил)-4-изопропил-1 Н-1,2,3-триазол-5-ил)
метокси)фенил)циклопропил)бензойной кислоты) в виде белого твердого вещества
30 (выход 79,6%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,45 (m, 8Н), 2,08 (т, 1Н), 2,38 (т, 1Н), 3,24 (т, 1Н), 4,92 (s, 2Н), 6,67 (d, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,82 (s, 1Н), 7,00 (d, J = 8,8 Гц, 1Н), 7,41 -7,52 (т, 5Н), 7,94-7,98 (т, 2Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,01% ТФУ): чистота > 95%, Rt = 5 3,082 мин.;
МС выч.: 555; МС найд.: 556 (М+Н)+. Синтез соединения согласно Примеру 4:
10 К раствору соединения В14е в 30 мл ТГФ и 15 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (3 г) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Смесь концентрировали и разбавляли 30 мл Н20, добавляли 1н. водный раствор HCI для подкисления смеси. Смесь подвергали экстракции с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и
15 очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 20/1) с получением 320 мг соединения согласно Примеру 4 (рацемической 3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)-циклопропил)бензойной кислоты) в виде белого твердого вещества (выход 17,5%).
1Н ЯМР (CDCI3, 400 МГц) 5: 1,14-1,18 (m, 2Н), 1,24-1,31 (т, 2Н), 1,41-1,46 (т, 2Н), 2,07-2,08 20 (т, 1Н), 2,15-2,17 (т, 1Н), 2,35-2,37 (т, 1Н), 4,78 (s, 2Н), 6,67 (dd, J= 2,4 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 6,84 (d, J= 2,4 Гц, 1Н), 6,96 (d, J= 8,4 Гц, 1Н), 7,30-7,34 (т, 1Н), 7,38-7,45 (т, 4Н), 7,927,95 (т, 2Н).
ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,01% ТФУ): чистота > 97%, Rt = 3,699 мин.;
25 МС выч.: 553; МС найд.: 554 (М+Н)+.
Разделение рацемической 3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)-циклопропил)бензойной кислоты на энантиомеры:
290 мг рацемической 3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-30 ил)метокси)фенил)-циклопропил)бензойной кислоты разделяли посредством
препаративной хиральной ВЭЖХ на хиральной колонке (колонка: CHIRALPAK AD-H; размеры колонки: внутренний диаметр 0,46 см, длина 15 см; подвижная фаза: гексан/ЕЮН/НОАс=50/50/0,1 (об./об./об.); расход: 0,5 мл/мин.; длина волны: УФ 220 нм; прибор для ВЭЖХ: Shimadzu LC 20 с УФ-детектором SPD-20A) с получением 137 мг (-)-З-5 (2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-
ил)метокси)фенил)циклопропил)бензойной кислоты (Rt = 7,250 мин., э.и.%: > 98%) и 132 мг (+)-3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)-метокси)фенил)циклопропил)бензойной кислоты (Rt = 8,930 мин., э.и.%: > 98%).
(-)-3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)циклопропил)бензойная кислота (Пример 5а)
1Н ЯМР (CDCI3, 400 МГц) 5: 1,14-1,18 (m, 2Н), 1,24-1,31 (т, 2Н), 1,41-1,46 (т, 2Н), 2,07-2,08 (т, 1Н), 2,15-2,17 (т, 1Н), 2,35-2,37 (т, 1Н), 4,78 (s, 2Н), 6,67 (dd, J= 2,4 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 6,84 (d, J= 2,4 Гц, 1Н), 6,96 (d, J= 8,4 Гц, 1Н), 7,30-7,34 (т, 1Н), 7,38-7,45 (т, 4Н), 7,927,95 (т, 2Н).
ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,01% ТФУ): чистота > 97%, Rt = 3,692 мин.;
МС выч.: 553; МС найд.: 554 (М+Н)+. Оптическое вращение: [a]D25 = -92° (МеОН, с = 0,3) Абсолютную конфигурацию хиральных центров см. на схеме 14.
(+)-3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)циклопропил)бензойной кислоты (Пример 5Ь)
1Н ЯМР (CDCI3, 400 МГц) 5: 1,14-1,18 (m, 2Н), 1,24-1,31 (т, 2Н), 1,41-1,46 (т, 2Н), 2,07-2,08 25 (т, 1Н), 2,15-2,17 (т, 1Н), 2,35-2,37 (т, 1Н), 4,78 (s, 2Н), 6,67 (dd, J= 2,4 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 6,84 (d, J= 2,4 Гц, 1Н), 6,96 (d, J= 8,4 Гц, 1Н), 7,30-7,34 (т, 1Н), 7,38-7,45 (т, 4Н), 7,927,95 (т, 2Н).
ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,01% ТФУ): чистота > 97%, Rt = 3,690 мин.; 30 МС выч.: 553; МС найд.: 554 (М+Н)+.
Оптическое вращение: [a]D25 = +910 (МеОН, с = 0,3) Абсолютную конфигурацию хиральных центров см. на схеме 14.
К раствору соединения В14а (220 мг, 0,39 ммоль) в 6 мл ТГФ и 3 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (162 мг, 3,9 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в 5 течение 24 часов. Смесь концентрировали и разбавляли 10 мл Н20. добавляли 1н. водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 4 и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 3/1) с получением 80 мг соединения согласно Примеру 6 (3-(2-(2-10 хлор-4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропил-изоксазол-4-ил)метокси)
фенил)циклопропил)бензойной кислоты) в виде белого твердого вещества (выход 37,3%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,45 (m, 8Н), 2,09 (т, 1Н), 2,38 (т, 1Н), 3,35 (т, 1Н), 4,73 (s, 2Н), 6,67 (dd, J= 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,83 (d, J= 2,4 Гц, 1Н), 6,99 (d, J= 8,8 Гц, 1Н), 7,347,48 (т, 5Н),7,95 (т, 2Н).
15 ЖХ/МС (подвижная фаза: 80%-95% ацетонитрил-вода-0,01% ТФУ): чистота > 95%, Rt = 3,983 мин.;
МС выч.: 555; МС найд.: 556 (М+Н)+.
Синтез Соединения С2:
Раствор соединения С1 (78,0 г, 456 ммоль) и CuCN (45,2 г, 502 ммоль) в 400 мл ДМФА кипятили с обратным холодильником в течение 3 часов. Смесь концентрировали под вакуумом и остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 7,7 г соединения С2 в виде белого твердого вещества 10 (выход 14,3%).
NBS
С2 СЗ
Раствор соединения С2 (7,5 г, 63,6 ммоль), бензоилпероксида (0,54 г, 2,24 ммоль) и N-бромсукцинимида (12,5 г, 70,2 ммоль) в 100 мл ССЦ кипятили с обратным холодильником 5 в течение 2 часов. Полученную суспензию фильтровали и разбавляли фильтрат 400 мл ДХМ, промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия, сушили над MgS04, фильтровали, и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 3,3 г неочищенного соединения СЗ в виде желтого твердого вещества, 10 которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения С4:
Раствор соединения СЗ (3,3 г, 16,8 ммоль) в 30 мл триэтоксифосфина нагревали при 15 175°С в течение 4 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении с
получением 3,99 г соединения С4, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Синтез Соединения С5:
К раствору соединения С4 (3,90 г, 15,4 ммоль) в 40 мл сухого ТГФ добавляли гидрид
натрия (1,23 г, 60% в минеральном масле, 30,8 ммоль) при 0°С в течение 30 минут. К
полученной смеси добавляли раствор соединения В9 (4,15 г, 15,4 ммоль) в 40 мл сухого
ТГФ при 0°С и перемешивали раствор при комнатной температуре в течение 3 часов.
25 Реакцию гасили насыщенным раствором NH4CI и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04,
фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 2,11 г соединения С5 в виде белого твердого вещества (выход 37,1%).
5 Синтез Соединения С6:
К раствору соединения С5 (2,10 г, 5,68 ммоль) и Рс!(ОАс)2 (0,3 г) в 30 мл Et20 добавляли раствор CH2N2 в Et20 (70 мл, 280 ммоль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор
10 медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 4 часов. Реакционную смесь фильтровали, концентрировали и очищали остаток посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс =10/1) с получением 1,68 г соединения С6 в виде белого твердого вещества (выход 77,1%).
15 Синтез Соединения С7:
К раствору соединения С6 (600 мг, 1,56 ммоль) в 10 мл ДМФА добавляли NaH (188 мг, 60% в минеральном масле, 4,68 ммоль) при 0°С и перемешивали в течение одного часа
при комнатной температуре. Далее при перемешивании добавляли соединение Абе (472 20 мг, 1,56 ммоль), после чего осуществляли перемешивание в течение ночи при комнатной температуре. Раствор приливали к 10 мл ледяной воды и проводили экстракцию с помощью 20 мл ДХМ. Органический слой последовательно промывали водой дважды и солевым раствором дважды и сушили над Na2S04, Растворитель удаляли при пониженном давлении и очищали остаток посредством хроматографии на силикагеле 25 (элюент: РЕ/ЕЮАс = 10/1) с получением 370 мг соединения С7 в виде белого твердого вещества (выход 44,2%).
5 К раствору соединения С7 (220 мг, 0,41 ммоль) в 5 мл ДМФА добавляли NaN3 (66 мг, 1,02 ммоль), NH4CI (54 мг, 1,02 ммоль) и далее смесь перемешивали при 100°С в течение
ночи. После охлаждения до комнатной температуры удаляли ДМФА и далее добавляли воду (10 мл) и подкисляли смесь 1н. водным раствором HCI до рН = 4. Полученное твердое вещество собирали фильтрованием и промывали ЕЮАс и Et20 с получением 29 10 мг соединения согласно Примеру 7 (4-((4-(2-(6-(1 Н-тетразол-5-ил)пиридин-3-ил)циклопропил)-3-хлорфенокси)метил)-5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазола) в виде желтого твердого вещества (выход 12,2%).
1Н-ЯМР (400 МГц, flMCO-d6) 5 1,12-1,22 (m, 4Н), 1,63 (s, 2Н), 2,19 (т, 1Н), 2,38 (т, 1Н), 2,43 (т, 1Н), 4,91 (s, 2Н), 6,76 (d, J= 8,4 Гц, 1Н), 6,94 (d, J= 1,2 Гц, 1Н), 7,14 (d, J= 8,4 Гц, 15 1Н),7,56(т, 1Н), 7,64 (т,2Н), 7,83 (d,J= 7,6 Гц, 1Н), 8,13 (d, J= 8,0 Гц, 1Н), 8,72 (s, 1Н).
ЖХ/МС (подвижная фаза: 60-95% ацетонитрил - вода - 0,1% ТФУ): чистота > 95%, Rt = 2,886 мин.; МС выч.: 578; МС найд.: 579 (М+1).
Синтез соединения согласно Примеру 8:
Раствор соединения С7 (150 мг, 0,28 ммоль), КОН (1,57 г, 28 ммоль) в 15 мл этанола и 6 мл воды перемешивали при 100°С в течение 4 часов. Смесь охлаждали до комнатной
температуры и концентрировали. Остаток растворяли в 30 мл воды, подкисляли 1н. водным раствором HCI до рН = 4 и полученное твердое вещество собирали посредством 25 фильтрования. Твердое вещество промывали ЕЮАс и сушили под вакуумом с
получением 45 мг соединения согласно Примеру 8 (5-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил) изоксазол-4-ил)метокси)-фенил)циклопропил)пиколиновой кислоты) в виде белого твердого вещества (выход 29%).
1Н ЯМР (400МГц, ДМСО-с/6) 5 8,52 (s, 1Н), 7,88 (d, J = 7,2 Гц, 1Н), 7,54-7,65 (m, 4Н), 7,11 5 (d, J= 8,8 Гц, 1Н), 6,93 (d, J = 2,8 Гц, 1Н), 6,74 (dd, J = 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 4,91 (s, 2Н), 2,45 (т, 1Н), 2,33 (т, 1Н), 2,11 (т, 1Н), 1,52-1,59 (т, 2Н), 1,11-1,20 (т, 4Н).
ЖХ/МС (подвижная фаза: 50-95% ацетонитрил-вода-0,1% ТФУ): чистота > 95%, Rt = 3,023 мин.;
МС выч.: 554; МС найд.: 555 (М+1).
5 К раствору соединения согласно Примеру 8 (460 мг, 0,83 ммоль) и Рс!(ОАс)2 (0,08 г) в 10 мл сухого ТГФ добавляли раствор CH2N2 в Et20 (5 мл, 20 ммоль) при комнатной температуре и далее раствор перемешивали при указанной температуре в течение 2 часов. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что метилирование завершилось, и добавляли АсОН для гашения. Проводили концентрирование при пониженном давлении и 10 очистку посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 5/1) с получением 345 мг соединения С8 в виде желтого масла (выход 73,1%).
340 мг соединения С8 разделяли посредством препаративной хиральной ВЭЖХ с применением хиральной колонки (колонка: CHIRALPAK AD-H; размеры колонки: 5 внутренний диаметр 0,46 см, длина 15 см; подвижная фаза: гексан / EtOH / НОАс = 60/40 / 0,1 (об./об./об.); расход: 1,0 мл/мин.; длина волны: УФ 220 нм; прибор для ВЭЖХ: Shimadzu LC 20 с УФ-детектором SPD-20A) с получением 106 мг соединения С8а (Rt = 6,923 мин., э.и.%: > 98%) и 119 мг соединения C8b (Rt = 8,907 мин., э.и.%: > 97%).
К раствору соединения С8а (106 мг, 0,19 ммоль) в 5 мл ТГФ и 2 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (8 мг, 1,9 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в 5 течение 4 часов. Концентрировали, разбавляли 5 мл Н20 и добавляли 1н. водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 5. Полученное твердое вещество собирали, и отфильтрованный осадок промывали 3 мл воды. Твердое вещество добавляли к 2 мл воды и перемешивали суспензию в течение 2 часов. Твердое вещество снова фильтровали, и отфильтрованный осадок промывали 2 мл воды. Фильтровали, 10 добавляли ЕЮАс, сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 98 мг соединения согласно Примеру 8а ( (-)-5-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)пиколиновой кислоты) в виде желтого твердого вещества (выход 93,6%).
1Н ЯМР (ДМСО-с!6, 400 МГц) 5: 1,12-1,22 (m, 4Н), 1,57-1,64 (т, 2Н), 2,16 (т, 1Н), 2,37 (т, 15 1Н), 2,48 (т, 1Н), 4,91 (s, 2Н), 6,75 (dd, J= 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,93 (d, J= 2,4 Гц, 1Н), 7,13 (d, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,56 (т, 1Н), 7,64 (т, 2Н), 7,73 (dd, J = 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 7,97 (d, J = 8,0 Гц, 1Н), 8,63 (d, J = 1,6 Гц, 1Н).
ЖХ/МС (подвижная фаза: 50%-95% ацетонитрил-вода-0,05% ТФУ): чистота > 97%, Rt = 3,124 мин.; 20 МС выч.: 554; МС найд.: 555 (М+1).
Оптическое вращение: [a]D25 = -127 °(CHCI3, с = 0,3).
Аналогичным образом, описанным для Примера 8а, получали 112 мг соединения
согласно Примеру 8Ь ( (+)-5-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-
5 дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)пиколиновой кислоты).
1Н ЯМР (ДМСО-с!6, 400 МГц) 5: 1,12-1,22 (m, 4Н), 1,57-1,64 (т, 2Н), 2,16 (т, 1Н), 2,37 (т, 1Н), 2,48 (т, 1Н), 4,91 (s, 2Н), 6,75 (dd, J= 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,93 (d, J= 2,4 Гц, 1Н), 7,13 (d, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,56 (т, 1Н), 7,64 (т, 2Н), 7,73 (dd, J = 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 7,97 (d, J = 8,0 Гц, 1Н), 8,63 (d, J= 1,6 Гц, 1Н).
10 ЖХ/МС (подвижная фаза: 40%-95% ацетонитрил-вода-0,05% ТФУ): чистота > 97%, Rt = 3,551 мин.;
МС выч.: 554; МС найд.: 555 (М+1).
Оптическое вращение: [a]D25 = +128 0 (CHCI3, с = 0,29).
"OEt
Синтез Соединения D2:
,NH,
00 II ^ О
E.O,C- -NH
CF3
5 D1 D2
Смесь акриламида (210 г, 1,14 моль), соединения D1 (700 мл, 4,73 моль) и п-толуолсульфоновой кислоты (7 г, 38,29 ммоль) в 3500 мл сухого толуола кипятили с обратным холодильником в течение 48 часов с азеотропным удалением воды. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и очищали остаток посредством флэш-10 хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 25 г соединения D2 в виде белого твердого вещества (выход 9,3 %).
Раствор соединения D2 (25 г, 105,48 ммоль) и NBS (22,53 г, 126,58 моль) в 250 мл CCI4 нагревали с обратным холодильником в течение 18 часов. Полученный осадок 5 отфильтровывали, а фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением твердого вещества, которое очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10:1) с получением 17,35 г соединения D3 в виде белого твердого вещества (выход 70%).
10 Синтез Соединения D4:
К раствору соединения D3 (4,34 г, 18,46 ммоль) в 20 мл ДМФА добавляли соединения Абе (5,56 г, 18,46 ммоль) и К2С03 (2,55 г, 18,46 ммоль). Смесь нагревали в течение ночи
при 60°С. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция завершилась. Смесь
15 концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 6/1) с получением 6,33 г соединения D4 в виде белого твердого вещества (выход 68%).
Синтез Соединения D5:
К суспензии LAH (0,46 г, 12,6 ммоль) в 50 мл сухого ТГФ, добавляли при 0°С раствор
соединения D4 (6,33 г, 12,6 ммоль) в 50 мл сухого ТГФ и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли МеОН к полученному раствору для гашения реакции с последующим добавлением насыщенного раствора Na2S04. 25 Полученное твердое вещество отфильтровывали, а фильтрат концентрировали и
очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА= 4/1) с получением 4,17 г соединения D5 в виде светло-зеленого твердого вещества (выход 72,0%).
Синтез Соединения D6:
К раствору соединения D5 (3 г, 6,55 ммоль) в 30 мл CHCI3 добавляли активированный Мп02 (2,28 г, 26,2 ммоль) и далее кипятили суспензию с обратным холодильником в течение 3 часов. Реакционную смесь фильтровали и отфильтрованный осадок промывали горячим CHCI3, далее фильтрат концентрировали с получением 2,81 г 10 соединения D6 в виде желтого твердого вещества, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения D7:
15 К раствору соединения В6 (2,3 г, 8,06 ммоль) в 30 мл сухого ТГФ добавляли гидрид натрия (0,5 г, 12,3 ммоль) при 0°С в течение 30 минут. К полученной смеси добавляли
раствор соединения D6 (2,81 г, 6,16 ммоль) в 20 мл сухого ТГФ при 0°С и перемешивали
раствор при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь гасили насыщенным раствором NH4CI и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический слой 20 промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 0,98 г соединения D7 в виде белого твердого вещества (выход 27,3%).
К раствору соединения D7 (970 г, 1,65 ммоль) и Рс!(ОАс)2 (150 мг) в 20 мл Et20 добавляли раствор CH2N2 в Et20 (20 мл, 80 ммоль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор
5 медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 4 часов. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция завершилась. Реакционную смесь фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА =10/1) с получением 378 мг неочищенного соединения D8 в виде белого твердого вещества (выход 38,6%).
К раствору соединения D8 (367 мг, 0,61 ммоль) в 10 мл ТГФ и 4 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (200 мг, 4,76 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре
15 в течение 24 часов. Реакционную смесь концентрировали и разбавляли 10 мл Н20, добавляли 1н. водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 5, который далее экстрагировали с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 1/3) с получением 140 мг соединения
20 согласно Примеру 9 (3-(2-(6-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)-2-(трифторметил)пиридин-3-ил)циклопропил) бензойной кислоты) в виде белого твердого вещества (выход 39,1%).
1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-С16) 5: 1,16 (m, 4Н), 1,60 (т, 2Н), 2,30 (т, ЗН), 5,28 (s, 2Н), 6,87 (d, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,44 (s, 2Н), 7,50 (т, 1Н), 7,55 (т, 2Н), 7,70 (т, 1Н), 7,76 (т, 2Н).
25 ЖХ/МС (подвижная фаза: 70%-95% ацетонитрил-вода-0,01% ТФУ): чистота > 97%, Rt = 3,033 мин.;
МС выч.: 588; МС найд.: 589 (М+1).
5 Синтез Соединения Е2:
К раствору соединения В8 (10 г, 64,1 ммоль) в 100 мл CH3CN добавляли К2С03 (18,0 г, 130,4 ммоль) и Mel (20 мл, 321,0 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь концентрировали при 10 пониженном давлении с получением 11 г неочищенного соединения Е2, которое использовали в следующей реакции восстановления без дополнительной очистки.
Синтез Соединения ЕЗ:
15 К раствору соединения Е2 (10 г, 61,8 ммоль) в 100 мл ЕЮН добавляли NaBH4 (5,0 г, 123,6 ммоль) и перемешивали смесь при комнатной температуре в течение 2 часов в атмосфере N2. Добавляли 1н. раствор HCI, чтобы погасить реакцию. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и добавляли ЕЮАс дважды для экстракции.
Объединенные органические слои последовательно промывали водой и солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 2/1) с получением 10 г соединения ЕЗ в виде масла (выход 94,2%).
Синтез Соединения Е4:
rf^r"0^ РВг3
HO^AJ * Br
ЕЗ CI Е4 CI
К раствору соединения ЕЗ (10 г, 58,1 ммоль) в 100 мл сухого ДХМ добавляли РВг3 (31,2 г, 116,2 ммоль) в атмосфере N2 при комнатной температуре, и раствор перемешивали при 10 указанной температуре в течение 2 часов. Полученный раствор приливали к ледяной воде и сушили органический слой над Na2S04, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 13,5 г соединения Е4 в виде коричневого масла, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
15 Синтез Соединения Е5:
Раствор соединения Е4 (13,5 г, 57,7 ммоль) в 50 мл триэтоксифосфина нагревали при 175°С в течение 4 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении
с получением 17 г соединения Е5, которое использовали в следующей реакции без 20 дополнительной очистки.
Синтез Соединения Е7:
К раствору соединения Е6 (50 г, 0,25 моль) в 400 мл безводного ТГФ по каплям 25 добавляли раствор ВН3 в ТГФ (1М, 500 мл, 0,50 моль) при охлаждении в ледяной бане. После добавления, реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Данные ТСХ показали, что восстановление завершилось. Медленно добавляли 400 мл МеОН для гашения. Смесь концентрировали при пониженном
давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 1/1) с получением 15 г соединения Е7 в виде белого твердого вещества (выход 32,2%).
Синтез Соединения Е8:
N p-TsOH N рЯ
5 Е7
Раствор соединения Е7 (15 г, 80,2 ммоль), 2Н-3,4-дигидропирана (26,9 г, 160,4 ммоль) и р-TsOH (1,5 г, 8,7 ммоль) в 200 мл безводного ДХМ перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Добавляли воду, а органическую фазу промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали при 10 пониженном давлении с получением 23 г неочищенного соединения Е8 в виде масла, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения Е9:
Вг^Ч^отнр CO/MeOH,T3A Ме°2С V^r^OTHP
^ PdCI2(dppf)2 ^
Е8 Е9
В сосуд автоклава загружали неочищенное соединение Е8 (23 г, 80,2 ммоль), PdCI2(dppf)2 15 (1,15 г, 2 мол.%) и триэтиламин (16,2 г, 160,4 ммоль) в 200 мл метанола. Сосуд продували азотом три раза и монооксидом углерода три раза. В сосуде создавали давление 2 МПа с
помощью монооксида углерода и нагревали до 100°С. Таким образом смесь
перемешивали в течение ночи, далее давали остыть до комнатной температуры. Полученный раствор фильтровали через слой диоксида кремния и промывали 20 отфильтрованный осадок 50 мл МеОН. Фильтрат концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 8/1) с получением 18 г соединения Е9 в виде желтого твердого вещества (Выход за 2 стадии: 89,4%).
Синтез Соединения ЕЮ:
К раствору соединения Е9 (18 г, 71,7 ммоль) в 200 мл МеОН добавляли p-TsOH (22,8 г, 120,0 ммоль). Далее раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Смесь концентрировали и последовательно добавляли воду и ЕЮАс. Органическую фазу промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали и
концентрировали с получением 40,8 г неочищенного соединения ЕЮ в виде бесцветной жидкости, которую использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения Е11:
К раствору неочищенного соединения ЕЮ (40,8 г, 71,7 ммоль) в 300 мл CHCI3 добавляли активированный Мп02 (31,2 г, 358,5 ммоль) и далее суспензию кипятили с обратным холодильником в течение 7 часов. Данные ТСХ показали, что окисление прошло успешно. Реакционную смесь фильтровали и отфильтрованный осадок промывали горячим CHCI3, 10 далее фильтрат концентрировали с получением 10,3 г соединения Е11 в виде белого твердого вещества (выход за 2 стадии: 87,1%).
Синтез Соединения Е12:
15 К раствору соединения Е5 (17 г, 58,2 ммоль) в 200 мл сухого ТГФ добавляли гидрид натрия (4,66 г, 116,4 ммоль) при 0°С в течение 30 минут. К полученной смеси добавляли
раствор соединения Е11 (9,6 г, 58,2 ммоль) в 80 мл сухого ТГФ при 0°С и перемешивали
раствор при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь гасили водой и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, 20 сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 5/1) с получением 9,55 г соединения Е12 в виде желтого твердого вещества (выход 54,2%).
Синтез Соединения Е13:
К раствору соединения Е12 (9,55 г, 31,5 ммоль) в 100 мл сухого ДХМ добавляли ВВг3 (29,8 мл, 315 ммоль) при -70°С в атмосфере N2 и далее раствор перемешивали при комнатной
температуре в течение 1 часа. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что деметилирование завершилось. Раствор снова охлаждали до -30°С и добавляли 50 мл
МеОН, чтобы погасить реакцию. Смесь концентрировали при пониженном давлении и к осадку добавляли воду и ДХМ. Органический слой сушили над Na2S04, фильтровали и 5 концентрировали с получением 10,1 г неочищенного соединения Е13 в виде коричневого твердого вещества, которое использовали в следующей реакции сочетания без дополнительной очистки.
Синтез Соединения Е14:
К раствору неочищенного соединения Е13 (10,1 г, 31,5 ммоль) и соединения Аба (9,51 г, 31,5 ммоль) в 50 мл ДМФА добавляли К2С03 (43,47 г, 315 ммоль). Смесь нагревали в
течение ночи при 60°С. Фильтровали, концентрировали при пониженном давлении,
разбавляли 100 мл Н20 и проводили экстракцию с помощью 300 мл ЕЮАс. Органический 15 слой последовательно промывали водой и солевым раствором дважды, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 5/1) с получением 4,75 г соединения Е14 в виде желтого твердого вещества (выход 27,2%).
К раствору соединения Е14 (4,0 г, 7,22 ммоль) и Рс!(ОАс)2 (0,4 г) в 60 мл Et20 добавляли раствор CH2N2 в Et20 (70 мл, 280 ммоль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор
5 медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще 4 часа. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция прошла успешно. Проводили фильтрование, концентрирование и очистку посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 4/1) с получением 1,53 г соединения Е15 в виде желтого твердого вещества (выход 37,3%).
Синтез соединения согласно Примеру 10:
К раствору соединения Е15 (1,53 г, 2,69 ммоль) в 40 мл ТГФ и 10 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (1,51 г, 36 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в
15 течение 24 часов. Концентрировали, разбавляли 50 мл Н20, и добавляли 1н. водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 5. Полученное твердое вещество собирали и осадок промывали 20 мл воды. Данное твердое вещество добавляли к 50 мл воды и перемешивали суспензию в течение 2 часов. Твердое вещество снова фильтровали, и промывали отфильтрованный осадок 20 мл воды. Далее полученное твердое вещество
20 очищали посредством препаративной ВЭЖХ с получением 705 мг соединения согласно Примеру 10 (5-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)циклопропил)никотиновой кислоты) в виде желтого твердого вещества (выход 47,3%).
1Н ЯМР (400 МГц, CD30D) 5: 1,23 (m, 4Н), 1,58-1,69 (т, 2Н), 2,20 (т, 1Н), 2,35 (т, 1Н), 25 2,45 (т, 1Н), 4,91 (s, 2Н), 6,74 (dd, J= 2,8 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 6,86 (d, J= 2,8 Гц, 1Н), 7,11 (d, J = 8,4 Гц, 1 Н), 7,45-7,54 (т, ЗН), 8,37 (s, 1Н), 8,77 (s, 1Н), 9,02 (s, 1Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 50%-95% ацетонитрил-вода-0,01% ТФУ): чистота > 97%, Rt = 3,007 мин.; МС выч.: 554; МС найд.: 555 (М+1).
Синтез Соединения F3
К раствору 5-бромсалицилкарбогидроксамовой кислоты F2 (21,6 г) в тетрагидрофуране 10 (60 мл) по каплям добавляли тионилхлорид (10 мл) при перемешивании при 10~20°С. После перемешивания в течение 2 часов при той же температуре реакционную смесь выпаривали при пониженном давлении, и остаток растворяли в диоксане (60 мл) и охлаждали до 0-5 °С. К реакционной смеси добавляли триэтиламин (38 мл) и осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа. 15 Растворитель выпаривали при пониженном давлении, а к остатку добавляли ледяную воду (300мл). Смесь доводили до рН 2 концентрированной соляной кислотой и осажденные кристаллы фильтровали и промывали водой. Получали соединение F3 (17,5
г, 88%) в виде бесцветных игольчатых кристаллов посредством рекристаллизации из этилацетата.
Синтез Соединения F4
момо
К суспензии соединения F3 (1 г, 4,67 ммоль) в ДМФА (10 мл) добавляли NaH (0,23 г, 9,35 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Далее смесь охлаждали до 5°С и добавляли хлорметил-метиловый эфир (0,45 г, 80,5 моль) с последующим перемешиванием при той же температуре в течение 1 часа. Смесь 10 приливали в ледяную воду и проводили экстракцию с помощью эфира. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над MgS04, концентрировали и очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле с получением соединения F4 (1,1 г, выход 92%).
1Н ЯМР (300МГц, ДМСО-с/6): 58,01-8,02 (d, 1Н), 7,79-7,82 (dd, 1Н), 7,64-7,67 (d, 1Н), 5,52 (s, 15 2Н), 3,51 (s, ЗН).
Синтез Соединения F5
К раствору соединения F4 (2 г, 7,7 ммоль) в безводном ТГФ (20 мл) по каплям добавляли 20 n-BuLi (2,5 М в гексане, 4,6 мл) при -78°С при защите N2 и перемешивали смесь при -7843
в течение 1 часа. Далее по каплям добавляли безводный ДМФА (11,6 ммоль, 0,9 мл) при -7843 и перемешивали смесь при -7843 в течение еще 1 часа. Добавляли насыщенный водный раствор NH4CI, чтобы погасить реакцию, и смесь подвергали экстракции с помощью этилацетата. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над 25 MgS04 и концентрировали. Остаток очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле с получением соединения F5 (800 мг, выход 50%).
1Н ЯМР (300МГц, flMCO-d6): 510,07 (s, 1Н), 8,38 (d, 1Н), 8,11-8,15 (dd, 1Н), 7,80-7,82 (d, 1Н),5,55 (s, 2Н), 3,53 (s, ЗН).
К раствору соединения F6 (5,1 г, 12,1 ммоль) в 10 мл ЕЮН добавляли NaBH4 (0,92 г, 24,2 ммоль). Далее раствор перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре. 5 Концентрировали и добавляли ЕЮАс. Раствор промывали водой и солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 4,19 г неочищенного соединения F7 в виде белого твердого вещества, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
10 Синтез Соединения F8:
К раствору соединения F7 (4 г, 9,46 ммоль) в 30 мл сухого Et20 добавляли РВг3 (2,56 г, 9,46 ммоль) в атмосфере N2 при 0°С. После перемешивания в течение 0,5 часа, данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция завершилась. Полученный раствор 15 приливали к насыщенному раствору NaHC03, и промывали органический слой водой и солевым раствором. Сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали с получением 3,99 г неочищенного F8 в виде желтого твердого вещества, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
20 Синтез Соединения F9:
Раствор соединения F8 (2 г, 4,12 ммоль) в 15 мл триэтоксифосфина при 175°С в течение 2 часов. Концентрировали при пониженном давлении с получением 2,3 г соединения F9 в виде масла, которое использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
25 Синтез Соединения F10:
К раствору соединения F9 (2,3 г, 4,12 ммоль) в 20 мл сухого ТГФ добавляли гидрид натрия (247 мг, 6,18 ммоль) при 0°С в течение 30 минут. К данной полученной смеси добавляли раствор соединения F5 (0,85 г, 4,12 ммоль) в 160 мл сухого ТГФ при 0°С и перемешивали раствор при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь гасили насыщенным раствором NH4CI и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали с получением 311 мг соединения F10 в виде коричневого твердого вещества (выход 12,7%).
Синтез Соединения F11:
К раствору соединения F10 (311 мг, 0,52 ммоль) и Pd(OAc)2 (0,1 г) в 10 мл сухого ТГФ добавляли раствор CH2N2 в Et20 (10 мл, 40 ммоль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще 4 часа. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция прошла успешно. Осуществляли фильтрование, концентрирование и очистку посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 4/1) с получением 214 мг соединения F11 в виде желтого твердого вещества (выход 67,5%).
Пример 11
К раствору соединения F11 (214 мг, 0,35 ммоль) в 5 мл 1,4-диоксана, добавляли ЗМ соляную кислоту (1 мл) и полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной
температуре. Далее к реакционной смеси добавляли воду и этилацетат. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над MgS04 и концентрировали. Остаток очищали посредством препаративной ТСХ с получением 22 мг соединения согласно Примеру 11 в виде желтого твердого вещества (выход 11,1%).
5 1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,18 (m, 2Н), 1,30 (т, 2Н), 1,45 (т, 2Н), 2,13-2,19 (т, 2Н), 2,35 (т, 1Н), 4,81 (s, 2Н), 6,70 (d, J= 6,4 Гц, 1Н), 6,87 (s, 1Н), 6,99 (d, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,36 (т, 2Н), 7,43 (т, 2Н), 7,50 (d, J= 8,8 Гц, 1Н) , 7,59 (s, 1Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 40%-95% ацетонитрил-вода): чистота 90%, Rt = 2,966 мин.; МС выч.: 566; МС найд.: 567 (М+1).
Схема 7:
Пример 12 Синтез Соединения G2:
К раствору соединения В9 (31 г, 110 ммоль) в 300 мл сухого ТГФ добавляли гидрид натрия (8,8 г, 220 ммоль) при 0°С в течение 30 минут. К данной полученной смеси добавляли раствор соединения G1 (20,1 г, 130 ммоль) в 160 мл сухого ТГФ при 0°С и перемешивали раствор при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь гасили 20 насыщенным раствором NH4CI и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический
слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 25 г соединения 3 в виде желтого твердого вещества (выход 78,9%).
Синтез Соединения G3
К раствору неочищенного соединения G2 (25 г, 86,8 ммоль) и соединения Абе (26,2 г, 86,8 ммоль) в 100 мл ДМФА добавляли К2С03 (56,9 г, 173,6 ммоль). Смесь нагревали в 10 течение ночи при 60°С. Охлаждали до комнатной температуры, разбавляли 10 мл Н20 и проводили экстракцию с помощью 300 мл ЕЮАс. Органический слой промывали дважды солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 20/1) с получением 30 г соединения 4 в виде белого твердого вещества (выход 62,5%).
Синтез Соединения G4
К раствору соединения G3 (30 г, 54,2 ммоль) и Рс!(ОАс)2 (3 г) в 300 мл Et20 добавляли раствор CH2N2 в Et20 (700 мл, 2,80 моль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор 20 медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще 4 часа. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция прошла успешно. Фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА =10/1) с получением 24 г соединения G4 в виде масла (выход 78%).
К раствору соединения G4 (24 г, 42,3 ммоль) в 200 мл ТГФ и 50 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (17,77 г, 423 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в 5 течение 24 часов. Концентрировали и разбавляли 200 мл Н20, добавляли 1н. водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 4, далее смесь подвергали экстракции с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 3/1) с получением 16,35 г соединения согласно Примеру 12 в виде 10 белого твердого вещества (выход 37,3%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,13 (m, 2Н), 1,18 (т, 2Н), 1,53 (т, 2Н), 2,10 (т, 1Н), 2,31 (т, 1Н), 2,46 (т, 1Н), 4,89 (s, 2Н), 6,73 (dd, J = 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,91 (d, J = 2,4 Гц, 1Н), 7,08 (d, J= 8,8 Гц, 1Н), 7,30 (d, J= 8,4 Гц, 2Н), 7,55 (т, 1Н), 7,63 (т, 2Н), 7,85 (d, J= 8,4 Гц, 2Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 30%-95% ацетонитрил-вода): чистота > 95%, Rt = 2,875 мин.; 15 МС выч.: 553; МС найд.: 554 (М+1).
Пример 12а:
Соответствующее количество трометанамина добавляли к 1 г соединения согласно 20 Примеру 12 (свободная кислота), чтобы основное соединение и его противоион были бы в эквимолярном соотношении. Добавляли этанол (30 мл). Смесь перемешивали при 5543 до полного растворения (са. 1 час) далее растворитель удаляли под вакуумом. Медленно добавляли изопропанол до полного растворения пленки при перемешивании среды при 7543. Далее образец медленно охлаждали от 7543 до комнатной температуры, понижая 25 температуру на 2 градуса каждые 15 минут. Супернатант удаляли из колбы. Порошок
сушили в динамическом вакууме в течение 2 часов при 70°С. Далее порошок дополнительно сушили при 4043 в течение 4 часов.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,09-1,18 (m, 4Н); 1,39-1,46 (т, 2Н); 1,98-2,06 (т, 1Н); 2,21-2,28 (т, 1Н); 2,40-2,45 (т, 1Н); 3,44 (s, 6Н); 4,87 (s, 2Н); 6,15 (bs, 6Н); 6,70 (dd, Л=1 8,8 Гц, J2= 5 2,5 Гц, 1Н); 6,87 (d, J= 2,5 Гц, 1);7,01 (d, J= 8,8 Гц, 1Н); 7,14 (d, J=8,2 Гц, 2Н); 7,49-7,54 (т, 1Н); 7,57-7,61 (т, 2Н); 7,79 (d, J=8,2 Гц, 2Н);
ТПЛ=143°С.
Разделение посредством хиральной ВЭЖХ
Разделение посредством хиральной ВЭЖХ
Разделение посредством хиральной ВЭЖХ
3,5 г G4 (рацемат) разделяли посредством препаративной хиральной ВЭЖХ с хиральной колонкой (колонка: CHIRALPAK IA; размеры колонки: внутренний диаметр 0,46 см, длина 15 см; подвижная фаза: гексан / изопропиловый спирт = 70 / 30 (об./об.); расход: 1
мл/мин.; длина волны: УФ 254 нм; прибор для ВЭЖХ: Shimadzu LC 20 с УФ-детектором SPD-20A) с получением 1,5 г G4a (Rt = 4,262 минут, э.и.%: > 99%) и 1,5 г G4b (Rt = 5,008 мин., э.и.%: > 99%).
5 Синтез соединения согласно Примеру 12Ь
К раствору G4a (1,5 г, 2,65 ммоль) в 20 мл ТГФ и 15 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (800 мг, 19 ммоль) и далее перемешивали смесь при 50°С в течение ночи. Концентрировали при пониженном давлении, разбавляли 5 мл Н20, и добавляли 1н. водный раствор HCI для 10 подкисления смеси до рН = 4. Полученное твердое вещество фильтровали и сушили в вакууме с получением 1,1 г соединения согласно Примеру 12Ь ( (+)-4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)циклопропил)бензойной кислоты) в виде белого твердого вещества (выход 75,2%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,13 (m, 2Н), 1,18 (т, 2Н), 1,53 (т, 2Н), 2,10 (т, 1Н), 2,31 (т, 15 1Н), 2,46 (т, 1Н), 4,89 (s, 2Н), 6,73 (dd, J = 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,91 (d, J = 2,4 Гц, 1Н), 7,08 (d, J= 8,8 Гц, 1Н), 7,30 (d, J= 8,4 Гц, 2Н), 7,55 (т, 1Н), 7,63 (т, 2Н), 7,85 (d, J= 8,4 Гц, 2Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,05% ТФУ): чистота > 98%, Rt = 3,632 мин.;
МС выч.: 553; МС найд.: 554 (М+1);
20 Хиральная ВЭЖХ (колонка: Chiral рак AD-H 250*4,6; подвижная фаза: 93/7 гексан/ЕЮН): э.и.% 100%, Rt= 16,408;
Оптическое вращение: [a]D25 = +132 °(МеОН, с = 0,295).
К раствору G4b (1,5 г, 2,65 ммоль) в 20 мл ТГФ и 15 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (800 мг, 19 ммоль) и далее смесь перемешивали при 50°С в течение ночи. Концентрировали при пониженном давлении, разбавляли 5 мл Н20, и добавляли 1н. водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 4. Полученное твердое вещество фильтровали и сушили в 5 вакууме с получением 1,1 г соединения согласно Примеру 12с ( (-)-4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)циклопропил)бензойной кислоты) в виде белого твердого вещества (выход 75,2%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,13 (m, 2Н), 1,18 (т, 2Н), 1,53 (т, 2Н), 2,10 (т, 1Н), 2,31 (т, 1Н), 2,46 (т, 1Н), 4,89 (s, 2Н), 6,73 (dd, J = 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,91 (d, J = 2,4 Гц, 1Н), 7,08 10 (d, J= 8,8 Гц, 1Н), 7,30 (d, J= 8,4 Гц, 2Н), 7,55 (т, 1Н), 7,63 (т, 2Н), 7,85 (d, J= 8,4 Гц, 2Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,05% ТФУ): чистота > 98%, Rt = 3,632 мин.; МС выч.: 553; МС найд.: 554 (М+1);
Хиральная ВЭЖХ (колонка: Chiral рак AD-H 250*4,6; подвижная фаза: 93/7 гексан/ЕЮН): э.и.% 100%, Rt = 24,411; 15 Оптическое вращение: [a]D25 = -140,6 °(МеОН, с = 0,31).
Синтез Соединения Н2
Охлажденный (О °С) водный раствор NaN02 (6,1 г, 88,5 ммоль, 27 мл воды) добавляли к охлажденному (О °С) раствору коммерчески доступного соединения Н1 (20 г, 88,5 ммоль) в водном NaOH (96 мл, 96 ммоль, 1н.). Объединенные растворы медленно добавляли к охлажденному водному раствору H2S04 (9,2 мл концентрированной H2S04, 80 мл воды) с
10 помощью капельной воронки с концом ниже поверхности раствора кислоты. К реакционной смеси добавляли лед для поддержания 0 °С и для регулирования пены добавляли диэтиловый эфир, при необходимости. После перемешивания в течение еще 10 минут, медленно добавляли раствор диазония к охлажденной смеси SnCI2-2H20 (50 г, 221 ммоль) в концентрированной HCI (80 мл) с помощью капельной воронки с концом
15 ниже поверхности раствора кислоты. К реакционной смеси добавляли лед для поддержания 0 °С и для регулирования пены добавляли диэтиловый эфир, при необходимости. После перемешивания еще в течение часа при 0 °С, реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Фильтровали, порошок золотисто-желтого цвета растворяли в водном NaOH, промывали диэтиловым эфиром,
20 осаждали водном раствором HCI, фильтровали и сушили с получением 20 г
неочищенного соединения Н2 в виде желтого порошка, который использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения НЗ
К раствору соединения Н2 (20 г, 84 ммоль) в 200 мл сухого МеОН добавляли по каплям концентрированную H2S04 (15,4 г, 168 ммоль) при 0~5°С. Полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали, выпаривали и приливали к воде (50 мл). Раствор доводили до рН=7 насыщенным водным раствором 10 NaHC03, проводили экстракцию диэтиловым эфиром (50*3 мл), сушили над MgS04, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 1/1) с получением 7,1 г соединения НЗ в виде желтого твердого вещества (выход 35%).
15 Синтез Соединения Н4
К смеси соединения НЗ (7 г, 27,45 ммоль) и карбоната калия (45 г, 137,25 ммоль) в 200 мл CH3CN добавляли CH3I (19,60 г, 138 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 часов. Концентрировали 20 при пониженном давлении, разбавляли водой, и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс (10 мл*3). Объединенные органические слои сушили над Na2S04 и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенный остаток очищали посредством флэш-хроматографии (элюент: РЕ/ЕА = 4:1) с получением 4,9 г соединения Н4 в виде желтого твердого вещества (выход 70%).
Синтез Соединения Н5
К перемешанному раствору n-BuLi (4 мл, 2,5 М раствор в гексане, 10 ммоль) в 30 мл сухого ТГФ добавляли бромид метилтрифенилфосфония (3,57 г, 10 ммоль) в течение периода в 5 минут при -60°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при данной температуре. К полученному оранжевому раствору по каплям добавляли раствор 5 соединения F6 (4,21 г, 10 ммоль) в 5 мл сухого ТГФ при -60°С. Раствор становился бесцветным, и ему давали остыть до комнатной температуры. Добавляли 20 мл воды для гашения и дважды проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Объединенные органические слои промывали солевым раствором и далее сушили над безводным MgS04, Растворитель удаляли с получением 4,53 г неочищенного соединения Н5, которое 10 использовали в следующей реакции Хека без дополнительной очистки.
Синтез Соединения Н6
Смесь соединения Н5 (3,57 г, 10 ммоль), соединения Н6 (3,57 г, 10 ммоль), 15 три(ортотолил)фосфина (3,57 г, 10 ммоль) и ТЭА (3,57 г, 10 ммоль) в 5 мл ДМФА помещали в предварительно нагретую баню при 100°С. Добавляли Pd2(dba)3 (3,57 г, 10 ммоль) и смесь выдерживали при 100°С в течение 16 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь распределяли в ЕЮАс / воде / NaHS04 (рН < 4). Органические слои промывали водой, солевым раствором и далее сушили над MgS04, 20 После выпаривания растворителя неочищенное вещество очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 5/1) с получением 1,40 г соединения Н6 в виде белого твердого вещества (выход 23%).
Синтез Соединения Н7
К раствору соединения Н6 (400 мг, 0,66 ммоль) и Pd(OAc)2 (200 мг) в 20 мл Et20 добавляли раствор CH2N2 в Et20 (20 мл, 80 ммоль) при -50°С в атмосфере N2. Далее
раствор медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще в течение 4 часов. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция прошла успешно. Осуществляли фильтрование, концентрирование и очистку посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 278 мг неочищенного 5 соединения Н7 в виде белого твердого вещества (выход 68%).
Пример 13
К раствору соединения Н7 (278 мг, 0,45 ммоль) в 10 мл ТГФ и 4 мл Н20 добавляли 10 LiOH Н20 (188 мг, 4,48 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Концентрировали и разбавляли 10 мл Н20, добавляли 1н. водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 5, после чего проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством хроматографии на силикагеле 15 (элюент: РЕ/ЕА = 1/1) с получением 130 мг соединения согласно Примеру 13 в виде белого твердого вещества (выход 48%).
1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-С16) 5: 1,16 (m, 4Н), 1,59 (т, 2Н), 2,23 (т, 1Н), 2,39 (т, 1Н), 2,48 (т, 1Н), 4,09 (s, ЗН), 4,91 (s, 2Н), 6,75 (dd, J= 2,4 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 6,92 (d, J= 2,4 Гц, 1Н), 7,12 (d, J= 8,8 Гц, 1Н), 7,20 (d, J= 8,4 Гц, 1Н), 7,56 (т, 2Н), 7,64 (т, 2Н), 7,96 (d, J= 8,4 Гц, 20 1Н), 12,88 (s, 1Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 30%-95% ацетонитрил-вода): чистота > 95%, Rt = 3,258 мин.; МС выч.: 607; МС найд.: 608 (М+1).
600 мг Н7 (рацемат) разделяли посредством препаративной хиральной ВЭЖХ с хиральной колонкой (колонка: CHIRALPAK IA; размеры колонки: внутренний диаметр 0,46 см, длина 15 см; подвижная фаза: гексан / этиловый спирт / диэтиламин (DEA) = 50 / 50 / 0,1 (об./об./об.); расход: 1,0 мл/мин.; длина волны: УФ 254 нм; прибор для ВЭЖХ:
Shimadzu LC 20 с УФ-детектором SPD-20A) с получением 210 мг Н7а (Rt = 5,325 мин., э.и.%: > 99%) и 186 мг H7b (Rt = 6,804 мин., э.и.%: > 99%).
Синтез соединения согласно Примеру 13а
К раствору Н7а (210 мг, 0,35 ммоль) в 5 мл ТГФ и 2 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (8 мг, 1,9 ммоль) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смесь концентрировали, разбавляли 5 мл Н20 и добавляли 1н. водный раствор HCI для подкисления смеси до рН = 5, добавляли ЕЮАс для экстракции дважды, и объединенные
10 органические фазы сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 1/2) с получением 108 мг соединения согласно Примеру 13а ( (+)-6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)циклопропил)-1-метил-1 Н-индазол-З-карбоновой кислоты) в виде желтого твердого вещества (выход 50,8%).
15 1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,18 (m, 2Н), 1,32 (т, 2Н), 1,51 (т, 2Н), 2,19 (т, 1Н), 2,45 (т, 1Н), 4,18 (s, ЗН), 4,82 (s, 2Н), 6,71 (dd, J= 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,87 (d, J= 1,6 Гц, 1Н), 7,01 (d, J= 8,4 Гц, 1Н), 7,23 (т, 2Н), 7,36 (т, 1Н), 7,43 (т, 2Н), 8,17 (d, J= 8,4 Гц, 1Н); ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,05% ТФУ): чистота > 98%, Rt = 3,144 мин.;
20 МС выч.: 607; МС найд.: 608 (М+1);
Хиральная ВЭЖХ (колонка: Chiral рак AD-H 250*4,6; подвижная фаза: 65/35 гексан/ ЕЮН): э.и.% 100%, Rt = 13,101;
Оптическое вращение: [a]D25 = +159° (МеОН, с = 0,300). 25 Синтез соединения согласно Примеру 13Ь
Аналогично тому, как описано в Примере 13а, получали соединение согласно Примеру
13Ь ( (-)-6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-
ил)метокси)фенил) циклопропил)-1-метил-1 Н-индазол-З-карбоновую кислоту) (120 мг; выход 59,2%):
5 1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,10-1,21 (m, 6Н), 1,56 (т, 2Н), 2,20 (т, 1Н), 2,35 (т, 1Н), 2,45 (т, 1Н), 4,09 (s, ЗН), 4,89 (s, 2Н), 6,74 (dd, J= 2,4 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 6,91 (d, J= 2,0 Гц, 1Н), 7,12 (т, 2Н), 7,53 (т, 2Н), 7,62 (т, 2Н), 7,99 (d, J= 8,4 Гц, 1Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,05% ТФУ): чистота > 98%, Rt = 3,180 мин.;
10 МС выч.: 607; МС найд.: 608 (М+1);
Хиральная ВЭЖХ (колонка: Chiral рак AD-H 250*4,6; подвижная фаза: 65/35 гексан / ЕЮН): э.и.% 99,7%, Rt = 30,037;
Оптическое вращение: [a]D25 = -1610 (МеОН, с = 0,300). 15 Пример 14:
К раствору соединения согласно Примеру 12 (400 мг, 0,72 ммоль) и одной капле ДМФА в 10 мл безводного ДХМ добавляли 2 М раствор оксалилхлорида (0,75 мл, 1,5 ммоль) в
20 безводном ДХМ при 0°С, и далее раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Концентрировали при пониженном давлении и остаток разбавляли 10 мл безводного ТГФ. Добавляли DIEA (0,25 мл, 1,5 ммоль), метансульфонамид (14,3 мг, 1,5 ммоль) и ДМАР (10 мг). Раствор перемешивали в течение ночи. Концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством препаративной ВЭЖХ с получением 40 мг
25 соединения согласно Примеру 14 в виде белого твердого вещества (выход 8,8%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5 1,16-1,21 (m, 2Н), 1,24-1,34 (т, 2Н), 1,52 (т, 2Н), 2,04 (т, 1Н), 2,18 (т, 1Н), 2,44 (т, 1Н),3,47 (s, ЗН), 4,81 (s, 2Н), 6,69 (dd, J=2,8 Гц, 8,4 Гц, 1Н),6,86 (d, J = 2,4 Гц, 1Н), 6,98 (d, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,31 (т, 2Н), 7,35 (т, 1Н), 7,44 (т, 2Н), 7,80 (d, J = 8,4 Гц, 2Н), 8,57 (s, 1Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 60%-95% ацетонитрил-вода-0,05% ТФУ): чистота > 95%, Rt = 3,255 мин.; МС выч.: 630; МС найд.: 631 (М+1).
Раствор соединения согласно Примеру 12 (500 мг, 0,90 ммоль) и HATU (500 мг, 1,32 ммоль) в 20 мл сухого ДМФА перемешивали при 0°С в течение 30 минут, далее добавляли 2-аминоэтансульфоновую кислоту (150 мг, 1,2 ммоль) после чего добавляли DIEA (0,4 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 18 часов 10 реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством препаративной ВЭЖХ с получением 250 мг соединения согласно Примеру 15 в виде белого твердого вещества (выход 42%).
1Н ЯМР (400 МГц, CD30D) 5 1,17-1,24 (m, 4Н), 1,41-1,54 (т,2Н), 2,04 (т, 1Н), 2,346 (т, 2Н), 3,09 (т, 2Н), 3,82 (т, 2Н), 4,90 (s, 2Н), 6,72 (dd, J= 2,8 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 6,82 (d, J= 2,4 15 Гц, 1Н), 7,05 (d, J= 8,4 Гц, 1Н), 7,28 (d, J= 8,8 Гц, 2Н), 7,46-7,55 (т, ЗН), 7,77 (d, J= 8,0 Гц, 2Н),7,94 (s, 1Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 20%-95% ацетонитрил-вода): чистота > 95%, Rt = 4,099 мин.; МС выч.: 660; МС найд.: 659 (М-1).
К раствору соединения G1 (65 г, 240 ммоль) в 500 мл сухого ТГФ добавляли гидрид натрия (12 г, 288 ммоль) при 0°С в течение 30 минут. К полученной смеси добавляли раствор соединения Е2 (41 г, 240 ммоль) в 300 мл сухого ТГФ при 0°С и перемешивали 10 раствор при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь гасили насыщенным раствором NH4CI и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали дважды посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 72,5 г соединения И в виде белого твердого вещества (выход 100%).
К раствору соединения И (20 г, 66,2 ммоль) и Рс!(ОАс)2 (3,5 г) в 200 мл Et20 добавляли раствор CH2N2 в Et20 (250 мл, 1 моль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор 5 медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще 4 часа. Данные ЖХ/МС показали, что реакция не завершилась. Проводили фильтрование и концентрирование. К осадку добавляли 200 мл сухого Et20 с последующим добавлением Рс!(ОАс)2 (2 г). Далее добавляли раствор CH2N2 в Et20 (150 мл, 0,6 моль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор медленно нагревали до комнатной температуры, и 10 перемешивали еще 4 часа. Данные ЖХ/МС показали, что реакция завершилась, и продукт очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 50/1) с получением 9 г соединения 12 в виде твердого вещества грязно-белого цвета (выход 43%).
Данную реакцию повторно проводили в тех же количествах и при тех же условиях с 15 получением и 26 г соединения 12 (выход 43,2%).
Синтез Соединения 13
Перемешанную смесь соединения 12 (10,5 г, 33,23 ммоль) и LiOH-H20 (6,98 г, 166,1 20 ммоль) растворяли в 20 мл воды и 100 мл ТГФ перемешивали в течение ночи при 55°С. Смесь концентрировали при пониженном давлении, обрабатывали 6н. водным раствором HCI для доведения рН до 1 и перемешивали еще 30 минут. Полученный осадок собирали посредством фильтрования, промывали водой и сушили в вакууме с получением 9,1 г соединения 13 в виде белого твердого вещества (выход 90,7%).
Синтез Соединения 14
К раствору соединения 13 (4,5 г, 15,0 ммоль) в 30 мл безводного ДХМ добавляли SOCI2 (2 мл, 28,2 ммоль) и далее данный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Концентрировали при пониженном давлении и остаток разбавляли ТГФ. Данный раствор добавляли к 6н. раствору NH3 в ТГФ при 0°С, и далее данный 5 раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Концентрировали при пониженном давлении и добавляли 100 мл воды. Полученное твердое вещество собирали и сушили в вакууме с получением 4,0 г соединения 14 в виде белого твердого вещества (выход 88,6%).
10 Синтез Соединения 15:
К раствору соединения 14 (4,0 г, 13 ммоль) в 60 мл безводного ТГФ добавляли DIEA (4,0 г, 31 ммоль) и TFAA (ангидрида трифторуксусной кислоты) (5,5 г, 26 ммоль) и далее данную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре. Концентрировали 15 при пониженном давлении и разбавляли остаток 100 мл ЕЮАс. Раствор последовательно промывали водным раствором NaHC03 и солевым раствором. Сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 3,5 г соединения 15 в виде белого твердого вещества (выход 95,1%).
Синтез Соединения 16:
К раствору соединения 15 (3,5 г, 12 ммоль) в 70 мл безводного ДХМ добавляли ВВг3 (5 мл, 52,9 ммоль) при -78°С, и далее данный раствор перемешивали при -78°С в течение 1 часа. 25 К данной смеси добавляли МеОН для гашения и далее данный раствор приливали к 200 мл насыщенного раствора NaHC03. Осуществляли концентрирование при пониженном давлении и добавляли Et20 для экстракции дважды. Объединенные органические слои сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и
очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 8/1) с получением 2,2 г соединения 16 в виде белого твердого вещества (выход 68,2%).
Синтез Соединения 17:
К раствору соединения 16 (2,1 г, 8,0 ммоль) в 15 мл ДМФА добавляли соединения Абе (2,5 г, 8,3 ммоль) и K2C03 (2,2 г, 16 ммоль) и далее данный раствор перемешивали в течение ночи при 50°С. Охлаждали до комнатной температуры и разбавляли ЕЮАс. Раствор промывали водой и солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, 10 концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 1/10) с получением 2,1 г соединения 17 в виде белого твердого вещества (выход 49,2%).
К раствору соединения 17 (400 мг, 0,8 ммоль) в 5 мл ДМФА добавляли NH4CI (140 мг, 2,64 ммоль) и NaN3 (140 мг, 2,15 ммоль) и далее данный раствор нагревали в течение ночи 5 при 100°С. Охлаждали до комнатной температуры и концентрировали при пониженном давлении. Остаток разбавляли ЕЮАс и трижды промывали водой, органический слой сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством препаративной ВЭЖХ с получением 130 мг соединения согласно Примеру 16 в виде белого твердого вещества (выход 28,2%).
10 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-с/6) 5 1,12-1,22 (m, 4Н), 1,51-1,58 (т,2Н), 2,10-2,14 (т, 1Н),
2,32-2,36 (т, 1Н), 2,45-2,49 (т, 1Н), 3,18 (s, 1Н), 4,91 (s, 2Н), 6,73-6,76 (dd, J= 2,4 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 6,93 (d, J=2,0 Гц, 1Н), 7,11 (d, J=8,8 Гц, 1Н), 7,44 (d, J=8,4 Гц, 2Н), 7,56 (т, 1Н), 7,64 (d, J= 7,6 Гц, 2Н), 7,96 (d, J= 7,6 Гц, 2Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 50%-95% ацетонитрил-вода-0,05% ТФУ): чистота > 95%, Rt = 15 3,962 мин.; МС выч.: 577; МС найд.: 578 (М+1).
К раствору соединения 12 (5 г, 15,8 ммоль) в 40 мл сухого ДХМ добавляли ВВг3 (14,8 мл, 158 ммоль) при -70°С в атмосфере N2 и далее раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что деметилирование завершилось. Раствор снова охлаждали до -30°С и добавляли 50 мл 10 МеОН для гашения. Концентрировали при пониженном давлении и к остатку добавляли воду и ДХМ добавляли. Органический слой сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш
хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 3,9 г 12а в виде желтого твердого вещества (выход 81,7%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,49 (m, 2Н), 2,08 (т, 1Н), 2,41 (т, 1Н), 3,94 (s, ЗН), 6,74 (dd, J = 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,92 (d, J = 2,4 Гц, 1Н), 7,01 (d, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,25 (d, J = 8,0 Гц, 2Н), 5 8,00 (d, J= 8,4 Гц, 2Н).
Синтез Соединения Л:
К раствору соединения А5е (12 г, 42 ммоль), в 200 мл ДХМ добавляли Et3N (12 г, 120 10 ммоль) и далее (Ас)20 (12 г, 120 ммоль). Раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и далее оставшуюся смесь промывали водой и солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 15/1) с получением 13 г соединения Л в виде бесцветного масла (выход 94 15 %).
Синтез Соединения J2:
К раствору соединения Л (13 г, 40 ммоль) в 300 мл ССЦ добавляли NBS (7,8 г, 45 ммоль) 20 и данный раствор перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 1 часа. Полученный раствор концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 15/1) с получением 12,5 г соединения J2 в виде масла (выход 77 %).
Синтез Соединения J3:
К раствору соединения J2 (12,5 г, 30,8 ммоль) в 200 мл ТГФ добавляли DBU (10 г) и данный раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Данный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением остатка. К данной оставшейся смеси, которую растворяли в 80 мл МеОН и 40 мл Н20, добавляли К2С03 (6 г, 5 43,5 ммоль) и данный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученный раствор гасили водой и концентрировали при пониженном давлении. Суспензию три раза подвергали экстракции с помощью ЕЮАс и объединенные органические фазы сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: 10 РЕ/ЕЮАс = 5/1) с получением 8 г соединения J3 в виде масла (выход 90 %).
Синтез Соединения J4:
К раствору соединения J3 (8 г, 28 ммоль) и DIEA (24 мл) в 150 мл безводного ТГФ 15 добавляли TBSOTf (8,2 г, 31 ммоль) при 0°С, и далее раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Полученный раствор гасили водой при 0°С и трижды проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Объединенные органические фазы сушили над MgS04, фильтровали, концентрировали в вакууме и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 15/1) с получением 9 г соединения J4 20 в виде бесцветного масла (выход 90 %).
2,6-лутидин Nal04 Os04
Раствор соединения J4 (2 г, 5 ммоль), 2,6-лутидин (1 г, 10 ммоль), NaOI4(4,27 г, 20 ммоль) и Os04 (300 мг) в 40 мл 1,4-диоксана и 15 мл воды перемешивали при комнатной 5 температуре в течение 2 часов. Полученный раствор разбавляли водой и трижды проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Объединенные органические фазы промывали дважды водным раствором NaHC03, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕЮАс = 15/1) с получением 1,8 г соединения J5 в виде масла (выход 94 %).
Синтез Соединения J6:
К раствору соединения J5 (1,6 г, 4 ммоль) в 40 мл безводного ТГФ добавляли MeMrCI (3 М, 3,2 мл, 9,6 ммоль) в течение 30 минут при -30°С в атмосфере N2. Раствор
15 перемешивали при -30°С~-20°С в течение 3 часов. Добавляли 30 мл водного раствора NH4CI для гашения. Водный слой дважды подвергали экстракции с помощью ДХМ. Объединенные органические фазы сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 30/1) с получением 1,2 г соединения J6 в виде бесцветного масла
20 (выход 72,2%).
Синтез Соединения J7:
К раствору J6 (1,2 г, 2,9 ммоль) в 40 мл безводного ТГФ добавляли TBAF (1 М, 2,9 мл, 2,9 ммоль) в течение 30 минут при 0°С в атмосфере N2. Реакционную смесь перемешивали 25 при -5°С~0°С в течение 3 часов. Данные ТСХ показали, что реакция завершилась. Добавляли 30 мл водного раствора NH4CI для гашения. Водный слой дважды подвергали экстракции с помощью ДХМ. Объединенные органические слои сушили над Na2S04,
фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА=10/1) с получением 500 мг соединения J7 (выход 57%).
К смеси соединения J7 (500 мг, 1,65 ммоль), соединения 12а (500 мг, 1,65 ммоль) и Ph3P (875 мг, 3,7 ммоль) в 50 мл сухого ТГФ по каплям добавляли DEAD (675 мг, 3,7 ммоль) при 0°С в атмосфере N2 и перемешивали раствор в течение ночи при комнатной температуре. Далее медленно добавляли 10 мл МеОН. Раствор выпаривали, а осадок 10 очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА=5/1) с получением 600 мг соединения J8 в виде твердого вещества (выход 62%).
Синтез соединения согласно Примеру 17:
15 К раствору соединения J8 (200 мг, 0,34 ммоль) в 5 мл ТГФ и 2 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (42 мг, 1,0 ммоль) и далее смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Концентрировали и разбавляли Н20. Добавляли 1н. водный раствор HCI для доведения рН до 5, после чего раствор подвергали экстракции с помощью ДХМ. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали,
20 концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 2/1) с получением 50 мг соединения согласно Примеру 17 (4-(2-(2-хлор-4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-(2-гидроксипропан-2-ил)изоксазол-4-
ил)метокси)фенил)циклопропил)бензойной кислоты) в виде белого твердого вещества (выход 24%).
25 1Н ЯМР (ДМСО, 400 МГц) 5: 1,47-1,61 (m, 8Н), 2,09-2,12 (т, 1Н), 2,29-2,34 (т, 1Н), 5,04 (s, 2Н), 5,98 (s, 1Н), 6,64-6,66 (т, 1Н), 6,81-6,82 (т, 1Н), 7,06-7,08 (т, 1Н) 7,29-7,32 (т, 2Н),
7,53-7,57 (m, 1H), 7,61-7,63 (m, 2H), 7,84-7,86 (m, 2H), 12,80 (s, 1H). ЖХ/МС (подвижная фаза: 30%-95% ацетонитрил-вода): чистота > 95%, Rt = 3,11 мин.;
МС выч.: 571; МС найд.: 572 (М+1). 5 Схема 11
К раствору соединения J6 (600 мг, 1,45 ммоль) и TsOH-H20 (6 мг, 0,034 ммоль) в 20 мл ТГФ добавляли CH2N2 (5М, 14,5 ммоль в Et20) при 0°С, далее смесь перемешивали в 5 течение ночи при комнатной температуре. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 300 мг соединения К1 в виде желтого масла (выход 50%).
10 Синтез Соединения К2
К раствору соединения К1 (300 мг, 0,7 ммоль) в 40 мл безводного ТГФ добавляли TBAF (1 М, 0,7 мл, 0,7 ммоль) в течение 30 минут при 0°С в атмосфере N2. Реакционную смесь перемешивали при -5°С~0°С в течение 3 часов. Данные ТСХ показали, что реакция 15 завершилась. Добавляли 30 мл водного раствора NH4CI для гашения. Водный слой дважды подвергали экстракции с помощью ДХМ. Объединенные органические слои сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 2/1) с получением 150 мг соединения К2 в виде бесцветного масла (выход 68%).
К смеси соединения К2 (150 мг, 0,47 ммоль), 12а (142 мг, 0,47 ммоль) и Ph3P (247 мг, 0,94 ммоль) в 30 мл сухого безводного ТГФ по каплям добавляли DEAD (172 мг, 0,94 ммоль) 5 при 0°С в атмосфере N2 и перемешивали раствор в течение ночи при комнатной температуре. Далее медленно добавляли 5 мл МеОН. Раствор концентрировали, а остаток очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 5/1) с получением 150 мг соединения КЗ в виде твердого вещества (выход 53%).
10 Синтез соединения согласно Примеру 18:
К раствору соединения КЗ (150 мг, 0,25 ммоль) в 5 мл ТГФ и 2 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (42 мг, 1,0 ммоль) и далее смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Концентрировали и разбавляли Н20. Добавляли 1н. водный раствор HCI
15 для доведения рН до 5, после чего проводили экстракцию с помощью ДХМ. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 2/1) с получением 45 мг соединения согласно Примеру 18 4-(2-(2-хлор-4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-(2-метоксипропан-2-ил)изоксазол-4-
20 ил)метокси)фенил)циклопропил)бензойной кислоты (выход 30%).
1Н ЯМР (CD30D, 400 МГц) 5: 1,48-1,54 (m, 2Н), 1,67 (s, 6Н), 2,06-2,08 (т, 1Н), 2,37-2,39 (т, 1Н), 3,29 (s, ЗН), 4,97 (s, 2Н), 6,65-6,67 (т, 1Н), 6,75-6,76 (т, 1Н), 7,03-7,05 (т, 1Н) 7,287,30 (т, 2Н), 7,47-7,54 (т, ЗН), 7,95-7,97 (т, 2Н);
ЖХ/МС (подвижная фаза: 40%-95% ацетонитрил-вода): чистота > 95%, Rt = 3,27 мин.; 25 МС выч.: 587; МС найд.: 586 (М-1).
К раствору метил-3-оксобутаноата (8,9 г, 40 ммоль, 1,0 экв.) и соединения АЗа (4,64 г, 40 ммоль, 1,0 экв.) в 70 мл ТГФ добавляли MeONa (2,16 г, 40 ммоль, 1,0 экв.) и далее смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакционную смесь промывали 1н. раствором HCI, проводили экстракцию с помощью ЕЮАс, сушили над 10 Na2S04, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 4,3 г соединения L1 в виде желтого твердого вещества (выход 38%).
Раствор соединения L1 (4,3 г, 15 ммоль, 1 экв.) в 60мл ДМФА и 60мл ДМФА-ДМА нагревали при 110°С в течение 3 часов. Реакционную смесь концентрировали при 5 пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (РЕ/ЕА = 10/1) с получением 3,86 г соединения L2 в виде желтого твердого вещества (выход 76%).
Синтез Соединения L3
К раствору соединения L2 (2,16 г, 6,3 ммоль, 1,0 экв.) и Si02 (в 22 мл воды) в 54 мл ТГФ, далее по каплям добавляли 44 мл концентрированного раствора HCI при 40°С в течение 1 часа. Реакционную смесь фильтровали, подвергали экстракции с помощью ЕЮАс, промывали водой, сушили над Na2S04, концентрировали при пониженном давлении с 15 получением 1,99 г соединения L3 в виде желтого масла (выход 99%).
Синтез Соединения L4
К раствору соединения L3 (1,99 г, 6,4 ммоль, 1,0 экв.) в 20 мл ЕЮН добавляли NaBH4 (266 20 мг, 7 ммоль, 1,1 экв.) при 0°С в течение 20 минут. Далее добавляли водный раствор HCI (1 моль/л) до обесцвечивания реакционной смеси. Реакционную смесь промывали водой, проводили экстракцию с помощью ЕЮАс, сушили над Na2S04, концентрировали при пониженном давлении с получением 2,01 г соединения L4 в виде желтого твердого вещества (выход 99%).
К раствору соединения L4 (2,0 г, 6,3 ммоль, 1,0 экв.) и лара-толуолсульфоновой кислоты 5 (16 мг, 0,06 ммоль, 0,01 экв.) в 80 мл безводного ДХМ по каплям добавляли 3,4-дигидро-2Н-пиран (800 мг, 9,5 ммоль, 1,5 экв.) в атмосфере N2 и перемешивали раствор в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь дважды промывали 40 мл водного раствора NaHC03 и водный слой трижды подвергали экстракции с помощью 100 мл ДХМ. Объединенные органические слои сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и 10 очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 1,0 г соединения L5 в виде масла (выход 40%).
К раствору L5 (1,0 г, 2,5 ммоль, 1,00 экв.) в 40 мл безводного ТГФ добавляли DIBAL-H (1 М, 10 мл, 3,75 экв.) в течение 30 минут при -30°С в атмосфере N2. Реакционную смесь 5 перемешивали при -5°С~0°С в течение 3 часов. Данные ТСХ показали, что реакция завершилась. Добавляли 30 мл водного раствора NH4CI для гашения. Водный слой подвергали экстракции дважды с помощью ДХМ. Объединенные органические слои сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 5/1) с получением 800 мг соединения L6 10 в виде бледно-желтого масла (выход 86%).
Синтез Соединения L7
К смеси соединения L6 (372 мг, 1 ммоль, 1,0 экв.), 12а (302 мг, 1 ммоль, 1,0 экв., полученного согласно методике для В13) и Ph3P (524 мг, 2 ммоль, 2,0 экв.) в 20 мл сухого безводного ТГФ по каплям добавляли DEAD (348 мг, 2 ммоль, 2,0 экв.) при 0°С в атмосфере N2 и перемешивали раствор в течение ночи при комнатной температуре. 20 Далее медленно добавляли 10 мл МеОН. Раствор выпаривали, а остаток очищали посредством колоночной флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 10/1) с получением 170 мг соединения L7 в виде твердого вещества (выход 26%).
К раствору соединения L7 (170 мг, 0,26 ммоль, 1,00 экв.) в 5 мл ТГФ и 1 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (110 мг, 2,6 ммоль, 10 экв.) и далее смесь перемешивали в течение 5 ночи при комнатной температуре. Концентрировали и разбавляли Н20. Добавляли 1н. водный раствор HCI для доведения рН до 5, после чего проводили экстракцию с помощью ДХМ. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали с получением 150 мг соединения L8 в виде белого твердого вещества (выход 90%).
Синтез соединения согласно Примеру 19:
К раствору соединения L8 (150 мг, 0,23 ммоль, 1,00 экв.) в 5 мл МеОН добавляли TsOH-H20 (65 мг, 0,34 ммоль, 1,5 экв.) и далее смесь перемешивали в течение ночи при
15 комнатной температуре. Концентрировали и разбавляли Н20, далее проводили экстракцию с помощью ДХМ. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 2/1) с получением 50 мг соединения согласно Примеру 19 (4-(2-(2-хлор-4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-(2-гидроксиэтил)изоксазол-
20 4-ил)метокси)фенил)-циклопропил)бензойной кислоты) в виде белого твердого вещества (выход 34%).
1НЯМР(ДМСО, 400 МГц) 5: 1,48-1,55 (m, 2Н), 2,01 -2,11 (т, 1Н), 2,31-2,32 (т, 1Н),3,09-3,12 (т, 2Н), 3,74-3,78 (т, 2Н), 4,87 (s, 2Н), 4,99-5,01 (т, 1Н), 6,67-6,70 (т, 1Н), 6,84-6,85 (т, 1Н), 7,07-7,09 (т, 1Н) 7,30-7,32 (т, 2Н), 7,55-7,64(т, ЗН), 7,85-7,87(т, 2Н);
25 ЖХ/МС (подвижная фаза: 10%-95% ацетонитрил-вода): чистота > 95%, Rt = 3,19 мин.;
МС выч.: 557; МС найд.: 556 (М-1).
Me02C
HN М1
МаН,ДМФАМе°2С
Л- С02Ме
/)- С02Ме N
/У-С02Ме
ВНо НО'
л> -С02Ме
N М4
(С0С1)2
дмсо
/)- С02Ме
Синтез Соединения М2:
,Вг
NaH,flMOAMe°2Cv
Me02C *¦ I ^-C02Me
Г> С02Ме ^ ~N
5 М1 N 1 М2
К раствору соединения М1 (5 г, 27,2 ммоль) в 30 мл ДМФА добавляли 60% NaH (1,20 г, 30 ммоль) при 0°С, и раствор перемешивали в течение 0,5 часа. Далее по каплям добавляли раствор 2-йодпропана (5,1 г, 30 ммоль) в 10 мл ДМФА при 0°С и перемешивали смесь в течение 2,5 часов при комнатной температуре. Добавляли воду, чтобы погасить реакцию, 10 и раствор подвергали экстракции с помощью ЕЮАс трижды. Объединенные органические слои последовательно промывали водой трижды и солевым раствором дважды, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 5/1) с получением 2 г соединения М2 (выход 18%).
Синтез Соединения МЗ:
Ме02Сх_ МеОН Н0?С
^-С02Ме I /)- С02Ме
М2 1
К раствору соединения М2 (2 г, 8,85 ммоль) в 20 мл МеОН добавляли раствор КОН в МеОН (10 мл 2,2 М раствора) и перемешивали раствор при 20°С в течение 24 часов. 20 После удаления растворителя под вакуумом при низкой температуре остаток растворяли в 20 мл воды и нейтрализовали раствор 1н. водным раствором HCI (10 мл, 10 ммоль). После перемешивания в течение 20 часов при 0°С полученное твердое вещество фильтровали, а отфильтрованный осадок промывали водой с получением 1,16 г соединения МЗ в виде белого твердого вещества (выход 62%).
К перемешанному раствору соединения МЗ (1 г, 4,8 ммоль) в 10 мл безводного ТГФ 5 добавляли BH3-Me2S (1 мл, 2М в ТГФ) при 0°С в атмосфере N2 и данный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, добавляли воду, чтобы погасить реакцию, и полученный раствор подвергали экстракции с помощью ЕЮАс дважды. Объединенные органические слои промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали 10 посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 3/1) с получением 578 мг соединения М4 в виде бесцветного масла (выход 70%).
Синтез промежуточного соединения М5:
15 К перемешанному раствору оксалилхлорида (0,4 мл, 5,28 ммоль) в 5 мл безводного ДХМ добавляли раствор ДМСО (0,38 мл, 5,28 ммоль) в 1 мл безводного ДХМ при -30°С. После перемешивания в течение 20 минут, по частям добавляли раствор соединения М4 (578 мг, 2,92 ммоль) в 2 мл безводного ДХМ при -30°С. Раствор перемешивали еще в течение 1 часа и далее добавляли Et3N (1,4 мл, 10,2 ммоль) при -30°С. После перемешивания в
20 течение ночи при комнатной температуре, добавляли 20 мл ДХМ для разбавления реакционной смеси, промывали лимонной кислотой и далее солевым раствором. Раствор сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 5/1) с получением 400 мг соединения М5 в виде белого твердого вещества (выход 69,4%).
Другие примеры:
Пример получения
Структура
Пример,
согласно ММ Измеренное
которому отношение m/z
получали v ; [М+Н]+
соединения
Получено из М5, согласно Примеру 11 с 586,89
гидролизом сложного эфира в конце
636,95
590,83
582,90
569,96
586
636
590
582
570
570
569,96
15, из 12Ь 661,98 659, [M-HV
NaH
CH2N2 Pd(OAc)2
N2b
Сравнение хиральной ВЭЖХ
N3b
Рентгеновская кристаллография
абсолютная конфигурация циклопропана (S,S)
CH2N2 Pd(OAc)2
К раствору соединения В6 (14,3 г, 50 ммоль) в 70 мл сухого ТГФ добавляли гидрид натрия (2,4 г, 60 ммоль) при 0°С в течение 30 минут. К данной полученной смеси добавляли 5 раствор соединения Е2 (8,5 г, 50 ммоль) в 50 мл сухого ТГФ при 0°С и перемешивали раствор при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь гасили насыщенным раствором NH4CI и проводили экстракцию с помощью ЕЮАс. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 50/1) с 10 получением 7,7 г соединения N1 в виде белого твердого вещества (выход 51%).
Синтез Соединения N2
К раствору соединения N1 (7,7 г, 25,5 ммоль) и Рс!(ОАс)2 (1 г) в 50 мл безводного ТГФ 15 добавляли раствор CH2N2 в Et20 (25 мл, ~ 100 ммоль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение еще 4 часов. Данные как ТСХ, так и ЖХ/МС показали, что реакция прошла успешно. Концентрировали и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА = 50/1) с получением 5,1 г соединения N2 в виде масла (выход 63,3%).
Разделение посредством хиральной ВЭЖХ
1,7 г соединения N2 (рацемат) разделяли посредством препаративной хиральной ВЭЖХ с хиральной колонкой (колонка: CHIRALPAK IA; размеры колонки: внутренний диаметр 0,46 5 см х длина 15 см; подвижная фаза: гексан / изопропиловый спирт = 80 / 20 (об./об.); расход: 1,0 мл/мин.; длина волны: УФ 254 нм; прибор для ВЭЖХ: Shimadzu LC 20 с УФ-детектором SPD-20A) с получением 534 мг соединения N2a (Rt = 5,143 минут, э.и.%: > 99%) и 577 мг соединения N2b (Rt = 6,325 минут, э.и.%: > 99%).
10 Синтез Соединения N3
К раствору соединения N2b (500 мг, 1,58 ммоль) в 10 мл ТГФ и 3 мл Н20 добавляли LiOH Н20 (664 мг, 15,8 ммоль) и далее смесь перемешивали при 40°С в течение 4 часов. Концентрировали, разбавляли 5 мл Н20 и добавляли 1н. водный раствор HCI для 15 подкисления смеси до рН = 4, дважды добавляли ЕЮАс для экстракции, и объединенные органические фазы сушили над Na2S04, фильтровали, концентрировали при пониженном давлении и очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (элюент: РЕ/ЕА =1/3) с получением 430 мг соединения N3 в виде белого твердого вещества (выход 90,1%).
Синтез Соли N3b
толуол
Раствор соединения N3 (200 мг, 0,66 ммоль) и (5)-1-фенилэтиламин (80 мг, 0,66 ммоль) в 5 мл сухого толуола кипятили с обратным холодильником в течение ночи. Охлаждали до 5 комнатной температуры и собирали полученное твердое вещество. Твердое вещество промывали 1 мл охлажденного толуола, сушили в вакууме с получением 137 мг соли N3b с чистотой > 99% по данным ВЭЖХ и ЯМР.
1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-С16) 5: 1,37 (d, J= 6,4 Гц, ЗН), 1,47 (m, 2Н), 2,15 (т, 1Н), 2,30 (т, 1Н), 3,77 (s, ЗН), 4,17 (т, 1Н), 6,90 (dd, J= 2,4 Гц, 8,8 Гц, 1Н), 7,04 (d, J= 2,4 Гц, 1Н), 7,16 10 (d, J= 8,8 Гц, 1Н), 7,26 (t, J= 7,2 Гц, 1Н), 7,33 (т, 4Н), 7,44 (d, J= 7,2 Гц, 2Н), 7,73 (т, 2Н).
РОСТ кристаллов и определение абсолютной конфигурации N3b
Соль N3b (100 мг) растворяли в 30 мл безводного ЕЮН с последующим добавлением 1,8 15 мл н-гексана (гексан добавляли до тех пор, пока раствор не стал слегка мутным). Раствор фильтровали и отставляли на полку для выдерживания в сухой емкости (20°С). Через 3 дня образовывались бесцветные кристаллы.
Согласно исследованию при малом увеличении (10Х), отбирали кристалл.
Размеры кристалла 0,35 х 0,15 х 0,14 мм
20 Параметры элементарной ячейки
со стандартным отклонением а = 11,898(5)А а = 90°
6,801 (3)А (3 = 92,725(5)° 13,836(5)А у = 90°
Объем элементарной ячейки 25 Символ группы симметрии
1118,3(7) А3
Р21
Значение Z
Вычисленная плотность
1,259 г/см3
Температура исследования (К) 293(2)К
R-фактор Ri = 0,0992 wR2 = 0,1918
По данным рентгеновского кристаллографического анализа для соли N3a, ее абсолютная 5 конфигурация (S,S).
Синтез Соединения N2b из N4
К раствору неочищенной кислоты N4 (120 мг, 0,21 ммоль) в 5 мл ТГФ добавляли раствор 10 CH2N2 в Et20 (0,7 мл, 2,80 ммоль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали еще 4 часа. Данные ТСХ показали, что реакция прошла успешно. Проводили концентрирование и очистку посредством препаративной ТСХ с получением 21 мг соединения N2b в виде белого твердого вещества (выход за 2 стадии: 32,3%).
15 1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,47 (m, 2Н), 2,12 (т, 1Н), 2,40 (т, 1Н), 3,82 (s, ЗН), 3,95 (s, ЗН), 6,80 (dd, J = 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,97 (d, J = 2,4 Гц, 1Н), 7,06 (d, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,41 (т, 2Н), 7,89 (dd, J= 2,4 Гц, 6,4 Гц, 2Н).
Хиральная ВЭЖХ (хиральная колонка: CHIRALCEL OD; размеры колонки: 4,6*250 мм; подвижная фаза: гексан/ЕЮН/АсОН = 60/40/0,1 (об./об./об.)); расход: 0,8 мл/мин.): Rt = 20 9,312 мин. (первым элюируется энантиомер по сравнению с рацематом).
25 Раствор соединения согласно Примеру 5Ь ((+)-изомер) (50 мг, 0,09 ммоль) и 6н. раствор HCI (5 мл) в 5 мл диоксана нагревали при 85°С в течение 4 часов и добавляли ЕЮАс для
Синтез Соединения N5
экстракции. Органический слой промывали солевым раствором, сушили над Na2S04, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 51 мг неочищенной кислоты N5, которую использовали в следующей реакции без дополнительной очистки.
Синтез Соединения N2b из N5
К раствору неочищенной кислоты N5 (51 мг, 0,09 ммоль) в 5 мл ТГФ добавляли раствор CH2N2 в Et20 (1 мл, 4,00 ммоль) при -50°С в атмосфере N2. Далее раствор медленно 10 нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи. Данные ЖХ/МС показали, что реакция прошла успешно. Концентрировали и очищали методом препаративной ТСХ с получением 23 мг N2b в виде белого твердого вещества (Выход за 2 стадии: 80,9%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 5: 1,47 (m, 2Н), 2,12 (т, 1Н), 2,40 (т, 1Н), 3,82 (s, ЗН), 3,95 (s, 15 ЗН), 6,80 (dd, J = 2,4 Гц, 8,4 Гц, 1Н), 6,97 (d, J = 2,4 Гц, 1Н), 7,06 (d, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,41 (т, 2Н), 7,89 (dd, J= 2,4 Гц, 6,4 Гц, 2Н).
Хиральная ВЭЖХ (хиральная колонка: CHIRALCEL OD; размеры колонки: 4,6*250 мм; подвижная фаза: гексан/ЕЮН/АсОН = 60/40/0,1 (об./об./об.)); расход: 0,8 мл/мин.): Rt = 9,466 мин. (первым элюируется энантиомер по отношению к рацемату).
Анализы
Анализ активности FRET
Определение лиганд-опосредованного взаимодействия кофактора и пептида для количественной оценки связывания лиганда с ядерным рецептором FXR проводили
25 следующим образом: Подготовка лиганд-связывающего домена FXR-альфа человека: ЛСД FXR-альфа человека экспрессировали в штамме BL21(DE3) Е. coli как гибридный белок, который помечен N-концевой GST. ДНК, которая кодирует домен связывания лиганда FXR, клонировали в вектор pDEST15 (Invitrogen). Экспрессия была под контролем промотора Т7, который индуцируется IPTG. Аминокислотные границы лиганд-
30 связывающего домена представляли собой аминокислоты 187-472 в записи базы данных NM 005123 (RefSeq). Экспрессия и очистка FXR-ЛСД: Предварительно культивируемую в течение ночи культуру трансформированного штамма Е. coli разбавляли 1:20 в среде LB
с ампициллином и выращивали при 30°С до оптической плотности ОП600=0,4-0,6. Экспрессия гена затем была индуцирована посредством добавления 0,5 мМ IPTG. Клетки инкубировали еще 6 часов при 30°С, 180 об/мин. Клетки собирали центрифугированием (7000 х д, 7 мин, при комнатной температуре). Клетки были ресуспензированы в 10 мл 5 лизирующего буфера (50 мМ глюкозы, 50 мМ Tris рН 7,9, 1 мМ ЭДТА и 4 мг/мл лизоцима) на литр исходной культуры клеток и оставлены в льде на 30 мин. Затем клетки подвергали обработке ультразвуком, и остатки клеток удаляли центрифугированием (22000 х д, 30 мин, 4°С). На 10 мл супернатанта добавляли 0,5 мл предварительно промытой суспензии глутатион 4В сефарозы (Qiagen), и полученную суспензию
10 выдерживали, медленно вращая в течение 1 ч при 4°С. Гранулы глутатион 4В сефарозы осаждали центрифугированием (2000 х д, 15 сек, 4°С) и дважды промыты в промывочном буфере (25 мМ Tris, 50 мМ KCI, 4 мМ MgCI2 and 1М NaCI). Осадок ресуспензировали в 3 мл буфера для элюирования на литр исходной культуры (буфер для элюирования: 20 мМ Tris, 60 мМ KCI, 5 мМ MgCI2 and 80 мМ глутатиона, который добавили непосредственно
15 перед тем, как использовать в качестве порошка). Суспензию оставили вращаться в течение 15 мин при 4°С, гранулы осаждали и снова элюировали половиной объема буфера для элюирования по сравнению с первым разом. Элюаты объединяли и подвергали диализу в течение ночи в 20 мМ буфере Hepes (рН 7,5), который содержал 60 мМ KCI, 5 мМ MgCI2, а также 1 мМ дитиотриетола и 10% (об/об) глицерина. Белок был
20 анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии СДС-ПААГ.
Данный метод позволяет измерить способность предполагаемых лигандов модулировать взаимодействие между очищенным лиганд-связывающим доменом (ЛСД) FXR, который был экспрессирован в бактериях, и синтетическим биотинилированным
25 белком на основе остатков 676-700 SRC-1 (LCD2, 676-700). Последовательность использованного белка представляла собой Б-CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS-COOH, где N-конец был биотинилирован (Б). Лиганд-связывающий домен (ЛСД) FXR экспрессировали как гибридный белок с GST в клетках BL-21 с использованием вектора pDEST15. Клетки лизировали ультразвуком, а гибридные белки очищали через глутатион-
30 сефарозу (Pharmacia) в соответствии с инструкциями производителя. Для определения влияния соединений на взаимодействие FXR-белок применяли технологию Perkin Elmer LANCE. В основе указанного метода лежит зависимый от связывания переноса энергии от донора к акцептору флюорофора, который присоединен к исследуемому веществу-партнеру, связывание которого предстоит определить. Для упрощения манипуляций и
35 уменьшения фона из соединения флуоресцентная технология LANCE использует универсальные метки флюорофора, и исследования с временным разрешением проводили в конечном объеме 25 мкл в 384 лунках планшета, в буфере на основе Tris (20 мМ Tris-HCI рН 7,5; 60 мМ KCI, 5 мМ MgCI2; 35 нг/мкл БСА), который содержит 20-60 нг на
лунку рекомбинантно экспрессированного FXR-ЛСД, гибридного с GST, 200-600 нМ биотинилированного на N-конце белка, который представляет 676-700аминокислоты SRC1, 200 нг на лунку конъюгата стрептавидин-xlAPC (Prozyme) и 6-10 нг на лунку Ей W1024 - aHTnGST (Perkin Elmer). Содержание ДМСО в пробах поддерживали на 1%. 5 После получения испытуемой смеси и разбавления потенциальных лигандов, которые модулируют FXR, испытание было уравновешено в течении часа в темноте при комнатной температуре в 384-луночном FIA-планшете (Greiner). Сигнал LANCE детектировали с помощью Perkin Elmer VICTOR2VTM Multilabel Counter. Результаты были визуализированы при построении диаграммы отношений между излученным светом при
10 665 и 615 нм. Базовый уровень образования комплекса FXR-белок наблюдался в отсутствии добавленного лиганда. Лиганды, которые активируют образование комплекса, вызывают зависимое от концентрации увеличение сигнала флуоресции с временным разрешением. Ожидается, что соединения, которые связываются одинаково хорошо и с мономерным FXR, и с комплексом FXR-белок, не будут давать изменений в сигнале, в то
15 время как лиганды, которые связываются преимущественно с мономерным рецептором, как ожидается, вызовут зависимое от концентрации уменьшение наблюдаемого сигнала.
Для оценки ингибиторного потенциала соединений, определяли значения ЕС50 для соединений, представленных в примерах, а также для соединений сравнения, перечисленные ниже в Таблице 1.
Анализ гибрида 1 млекопитающего (М1Н).
Определение управляемой трансактивации промотора Gal4, которая опосредована лигандом, для измерения активации FXR, которая опосредована связыванием лиганда, проводили: часть кДНК, которая кодирует домен, связывающий
25 лиганд FXR, была клонирована в вектор pCMV-BD (Stratagene), в виде гибрида ДНК-связывающего домена дрожжей GAL4 под контролем промотора ЦМВ. Аминокислотные границы лиганд-связывающего домена представляли собой аминокислоты 187-472 в записи базы данных NM 005123 (RefSeq). В качестве репортерной плазмиды использовали плазмиду pFR-Luc (Stratagene), которая содержит синтетический промотор
30 с пятью тандемными повторами в дрожжевых GAL4-cвязывaющиx сайтах, управляющий экспрессией гена люциферазы Photinus pyralis (американский светлячок), в качестве репортерного гена. Для увеличения экспериментальной надежности плазмида pRL-CMV (Promega) была котрансфецирована. pRL-CMV содержит конститутивный CMV промотор, который контролирует экспрессию люциферазы Renilla reniformis. Анализы всех Gal4
35 репортерные гены были сделаны на клетках НЕК293 (полученных из DSMZ, Брауншвейг, Германия), выращенных в МОС с L-глутамином и ССР Эрла, дополненные 10% эмбриональной бычьей сывороткой, 0,1 мМ неосновных аминокислот, 1 мМ пируватом
натрия и 100 единицами пенициллина/стрептавидина на мл при 37°С в 5% С02. Среда и добавки были получены из Invitrogen. Для анализа 5 х 105 клеток на лунку были помещены в лунки 96-луночных планшетов в 100 мкл на лунку МОС без фенола красного и L-глутамина и с ССР Эрла с добавлением ЭБС (HyClone, Южный Логан, Юта), 5 обработанной 10% уголя/декстрана, 0,1 мМ неосновных аминокислот, 2 мМ глутамина, 1 мМ пируват натрия и 100 единиц пенициллина/стрептавидина на мл при 37°С в 5% С02. Следующий день клетки были соединены > 90%. Среда была удалена и клетки были кратковременно трансфецированы с использованием 20 мкл на лунку OptiMEM -полиэтилен-имин-основанный трансфекционный реагента (OptiMEM, Invitrogen;
10 Polyethyleneimine, Aldrich кат. № 40,827-7) включая три плазмиды, описанные выше. МОС вместе с той же композицией, которая использовалась для выращивания клеток, была добавлена через 2-4 ч после добавления трансфекционной смеси. Затем был добавлена совокупная смесь, предварительно растворенная в МОС (конечная концентрация среды не превышала 0,1%). Клетки были дополнительно инкубированы 16 ч перед
15 последовательным измерение активности люцифераз светляка и renilla в тех же самых клеточных экстрактах с использованием системы двойного анализа света люциферазы (Dyer et al., Anal. Biochem. 2000, 282, 158-161). Все эксперименты были проведены трижды.
Чтобы анализировать активность агониста FXR приведенных соединений, так же 20 как эталонных соединений из WO 2000/037077, уровни активности были определены в анализах РПЭФ и М1Н как указано в Таблице 1.
Соединение
FRET
Gal4 (М1Н)
GW4064
Рх20535
Пример 1
Пример 2
Пример 3
Пример 4
Пример 5а
Пример 5Ь
Пример 6
Пример 7
Пример 8
Пример 12
Пример12Ь
Пример 12с
Пример 13
Пример 13а
Пример 13Ь
Пример 14
Пример 15
Пример 16
Пример 17
Пример 20
Пример 21
Пример 23
Пример 24
Пример 28
(А= ЕС50 < 10 нМ; В = 10 < ЕС50 < 100 нМ; С = ЕС50 > 100
Определение фармакокинетики на крысах, мышах и обезьянах.
Соединения вводили перорально через желудочный зонд по 5 мг/кг каждое и путем внутривенной инъекции по 1 мг/кг каждая 12-недельному самцу C57BI/6J или крысам линии Спраг-Доули, и определяли концентрации тестируемых объектов в плазме с помощью ЖХ-МС/МС после указанных моментов времени. В случае с яванскими макаками (Масасса mulatta), доза была скорректирована до 12 мг/кг перорально, внутривенную инъекцию не вводили (Фигура 1а, 1Ь или Таблица 2).
Раствор 2,5 мг/мл для каждого тестируемого объекта получали путем их растворения в носителе, 0,5% гидроксипропилметилцеллюлозе (масс/об.) в 20 мМ фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,4. Растворы перемешивали в течение ночи 15 при комнатной температуре и нагревали до 40°С в течение 10 минут, в результате получали полностью гомогенную суспензию. Введение осуществляли путем перорального введения мыши раствора в объеме 5 мл/кг. Для каждого момента времени были использованы по три мыши или крысы. В случае с яванскими макаками пробы крови были получены повторной пункцией вены. Пробы крови были обработаны Li-гепарином в ходе
процедуры забора и помещены на лед до центрифугирования при 645 g (5 мин, 4°С). Плазму собирали и хранили при -20°С до анализа. К 50 мкл пробы плазмы добавляли 6 мкл ацетонитрила, содержащего внутренний стандарт. Пробы интенсивно перемешивали и центрифугировали в течение 10 минут при 6000 g и 20°С. Аликвоту свободного от 5 частиц надосадка перемещали в 200 мкл виалы для проб и последовательно подвегали ЖХ/МС/МС для количественного анализа. Концентрации в плазмы в различные моменты времени определяли и наносили на диаграмму в зависимости от времени отбора проб, как показано на Фигуре 2.
Неожиданно, было обнаружено, что агонисты FXR, описанные в настоящем 10 изобретении, демонстрируют повушенные уровни в плазме после перорального введения in vivo по сравнению с известными агонистами FXR, известными из уровня техники.
15 GW4064 (1 мг/кг внутривенно)
Пример 4 (1 мг/кг внутривенно)
Время (ч)
Средняя
концентрация
(нг/мл)
%CV
0,083
1188,90
149,9
12,60
0,25
748,71
197,6
26,39
0,50
450,93
49,8
11,04
1,00
201,63
39,3
19,51
2,00
78,93
[16,1
20,41
4,00
44,48
3,2
7,21
Пример 12 (1 мг/кг внутривенно)
Время (ч)
Средняя
концентрация
(нг/мл)
%CV
0,083
660,89
60,6
9,17
0,25
358,74
21,5
5,99
0,50
174,34
20,8
11,92
1,00
84,63
12,3
14,49
2,00
37,69
6,3
16,67
4,00
19,24
2,3
11,95
Приведенные в качестве примера соединения согласно Примеру 4 и Примеру 12 показали по существу более высокие уровни в плазме у С57/Ы6 и самцов крыс линии Спраг-Доули по сравнению с GW4064, как отмечено на Фигуре 1с и Таблице 3.
5 Абсолютная пероральная биодоступность для соединения согласно Примеру 4 -
8,8% и для соединения согласно Примеру 12 - 30,95%.
Определение гиполипидемических эффектов на мышах db/db.
Соединения вводили перорально через желудочный зонд 2х 5 мг/кг каждого 10 C57BLKS мышам lepr/_ db/db, начиная с возраста 12 недель. Животных содержали на рационе с высоким содержанием жира (ssniff EF R/M 12330 с 59% (ккал) жира из Ssniff, Зост, Германия) две недели перед началом кормления через желудочный зонд. Базис крови был взят посредством ретроорбитального кровоизвлечения. Пробы крови обрабатывали Li-гепарином в ходе процедуры забора и помещали на лед перед 15 центрифугированием при 645 g (5 мин, 4°С). Плазму собирали и хранили при -20°С перед анализом. Общие триглицериды и общий холестерин измеряли в алеквоте 3 мкл плазмы
с использованием коммерческого набора LabAssayTM триглицерид (Кодовый № 29063701) и LabAssayTM холестерин (Кодовый № 294-65801) от Wako Diagnostics (Нейсе, Германия). Для анализа фармакологического эффекта соединений, проводили сравнение средних значений для триглицеридов и холестерина в плазме на группу дозирования 5 между базисом и после 8 недель лечения.
Несмотря на то, что результаты лечения GW4064 показали незначительное сокращение -6% на фоне носителя в глюкозе крови натощак после 3 дней введения доз 2 х 5 мг/кг/день, лечение соединением согласно Примеру 5 показало понижение -16% по сравнению с носителем в этом наборе. Кроме того, Пример 5 показал значительное 10 уменьшение липидов плазмы после 3 дней введения дозы 2x5 мг/кг/день с 24,0% уменьшением общего холестерина и 24,2% уменьшения общих триглицеридов по сравнению с контролем в виде носителя.
Активность выбранных соединений в экспериментах на животных in vivo.
15 Мыши линии С57/Ы6 (Elevage Janvier, Франция) в возрасте 8 недель 4 недели
содержали на рационе с высоким содержанием жира (добавлено 60% ккал из жира, Sniff, Зост, Германия, кат. № Е15771-30 (Mod. Surwit) + 0,5 % холестерина (Sigma-Aldrich, Германия). Базисные пробы крови были взяты после ночного голодания и глюкоза плазмы натощак были определены с использованием прибора Roche Accucheck.
20 Параллельно была сформирована Li-гепариновая плазма для определения базисных уровней общих триглицеридов (ОТ) и общего холестерина (ОХ). Животных содержали на РВСЖ + 0,5% холестериновом рационе 8 недель и еженедельно брались пробы крови для мониторинга уровней ОТ и ОХ плазмы с использованием обычных наборов для ферментативных анализов (Wako Diagnostics, Нейсе, Германия). Тестируемые
25 соединения растворяли в 100% пальмовом масле и затем примешивали в жидкую еду с ежедневным приблизительным поглощением 30 мг/кг, основанным на усредненном потреблении пищи в течение 4 недель адапционного периода РВСЖ. На Фигуре 4 и 5 показано развитие значений ОТ и ОХ.
После умерщвления мышей определяли печеночные триглицериды и холестерин 30 с использованием модифицированного метода Фолкха (J. Folch et al. "A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues." J. Biol. Chem. 1957, 226, 497509). Вкратце, замороженные ткани печени были гомогенизированы и дважды экстрагированы с использованием гексан/2-пропанола (3:2) (30 мг тканей / 1 мл органического растворителя). Органический слой удаляли и сушили. Полученные гранулы 35 растворяли в 0,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора, который содержал 0,1%
(масс/об.) СДС. Содержание триглицеридов и холестерина измеряли с помощью специальных ферметных реагентов (Wako Diagnostics, Нейсе, Германия).
РНК выделяли с применением реагента RNAzol RT (Fermentas) и определяли уровни мРНК посредством количественной полимеразной цепной реакции с обратной 5 транскрипцией (кОТ-ПЦР) с применением Absolute QPCR Rox Mix (Invitrogen) и прибора для ПЦР в реальном времени от Applied Biosystems (СА). Использованные последовательности праймеров и пробы (от 5' к 3') представляли собой: SHP, прямой CACCAG ACTCCATTCCACG; обратный СТАСССТС AAG AACATTCCAGG; проба 56-FAM/CAGTGATGTCAACGTCTCCCATGATAG и BSEP, прямой CTGACTGTTGAT
10 AGGCGATGG; обратный CCTCATACGGAAACCCAAGATC; проба 56-FAM/ATGGCT
ACCTCAGCACTGGACAAT. Все пробы были проведены дважды. Экспрессия гена (Фигура
6) была выражена в условных единицах и нормализована относительно гена домашнего
хозяйства ТАТА-бокс-связывающего белка (ТСБ , Прямой
AAGAAAGGGAGAATCATGGACC; Обратный GAGTAAGTCCTGTGCCGTAAG; проба:56-
15 FAM/CCTGAGCAT /Zen/AAGGTGGAAGGCTGTT). Экспрессия генов ЭПЖК и КГП была 6-кратно выше в мыши, которые была обработана Примером 12.
Определение УФ-фотостабильности
Испытуемые соединения растворяли, используя этанол, и анализировали их УФ-спектр для определения Атах, чтобы установить длину волны излучения, которая будет
20 использована в исследовании (см. Фиг. 2). Определили, что наиболее подходящей длиной волны для тестирования УФ-стабильности двойной связи -СН=СН- была длина волны 254 нм. Дальнейший материал соединений далее растворяли в дейтерированном этаноле и анализировали (Т=0) 1Н ЯМР (400 МГц). Каждую проба затем восстановливали из трубы ЯМР и подвергали УФ-облучению (254 нм) в течение 4 ч, 15 ч и 70 ч. В
25 соответствующие моменты времени индивидуальные пробы повторно анализировали с использованием 1Н ЯМР и измеряли сигнал протонов -СН=СН- для оценки процента двойной связи, который остался интактным. Другие изменения в химически измененных сигналах также анализировали для дальнейших изменений в во всей структуре молекул.
В отличие от Примера 4 (рацемическая 3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-30 дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)циклопропил)бензойной кислоты), соединения GW4064 и РХ20535 подверглись значительным изменениям в спектре 1Н ЯМР после продолжительного УФ облучения. Основываясь на относительной интеграции сигналов 1Н ЯМР, менее чем 30% GW4064 и 45% РХ20535 все еще присутствуют в смеси, что предполагает в свою очередь, что 70% GW4064 распалось после 70 ч. Пример 4, 35 вероятно, инертен к 70 ч УФ облучению при лямбда = 254 нм (см. Фиг. За-1).
Другую, более быструю экспериментальную установку использовали для исследования широкого круга соединений в сравнении с GW4064. Вещества были растворены в реагенте класса ДМСО (99,5%, Karl Roth) при концентрации 250 мкМ. Раствор ДМСО распределяли по слайду кварцевого стекла на глубину около 2 мм и 5 облучали с использованием УФ-лампы с излучением 366 нм (Benda Instruments, Вислох, Германия) с использованием лампы8 Вт, установленной на расстоянии около 2,5 см от облучаемых материалов. Раствор отбирали перед облучением (Т = 0 мин) и в различные интервалы впоследствии. Исходный материал и пробы сохраняли от прямого освещения в обернутых фольгой трубках. Пробы вводили (2 мкл) прямо в ЖХМС систему для 10 анализа без дальнейшей подготовки. Результаты отражены на Фигуре Зт, показана высокая фотостабильность соединений согласно настоящему изобретению (Примеры 12, 12с, 20, 16, 14) по сравнению с соединением GW4064, содержащим стильбеновый фрагмент.
R выбран из группы, состоящей из COOR6, CONR7R8, тетразолила или Н, где R6 независимо выбран из группы, состоящей из Н или низшего алкила, и R7 и R8 независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из Н, низшего алкила, Ci_6 галоалкила, 10 Ci-6 алкилена-Rg, S02-Ci-6 алкила, где R9 выбран из группы, состоящей из СООН, ОН или S03H;
А выбран из группы, состоящей из фенила, пиридила, пиразолила, индолила, тиенила, бензотиенила, индазолила, бензизоксазолила, бензофуранила, бензотриазолила, фуранила, бензотиазолила, тиазолила, каждый из которых возможно замещен одной или 15 двумя группами, независимо выбранными из группы, состоящей из ОН, низшего алкила, низшего циклоалкила или галогена;
Q выбран из группы, состоящей из фенила, пиридила, тиазолила, тиофенила, пиримидила, каждый из которых возможно замещен одной или двумя группами, независимо выбранными из группы, состоящей из низшего алкила, галогена или CF3;
где
Х = СН, N, N0;
25 Ri выбран из группы, состоящей из водорода, СгС3 алкила, С3-С6 циклоалкила, С4-С5 алкилциклоалкила, где О-э алкил возможно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, гидрокси или О-балкокси;
R2 и R3 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, СгС3 алкила, СгС3 галоалкила, СгС3 алкокси, СгС3 галоалкокси и галогена.
2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что R выбран из группы, состоящей из COOR6, CONR7R8, тетразолила или Н, где R6, R7 и R8
независимо выбраны из группы, состоящей из Н, низшего алкила;
А выбран из группы, состоящей из фенила, пиридила, индолила, тиенила, бензотиенила, индазолила, бензизоксазолила, бензофуранила, бензотриазолила, фуранила, бензотиазолила, тиазолила, каждый из которых возможно замещен одной или двумя 5 группами, независимо выбранными из группы, состоящей из ОН, низшего алкила, низшего циклоалкила;
Q выбран из группы, состоящей из фенила, пиридила, тиазолила, тиофенила, пиримидила, каждый из которых возможно замещен одной или двумя группами, независимо выбранными из группы, состоящей из низшего алкила, галогена или CF3;
где
Х = СН, N, N0;
Ri выбран из группы, состоящей из водорода, СгС3 алкила, СгС3 галоалкила, С3-С6 15 циклоалкила, С4-С5 алкилциклоалкила;
R2 и R3 независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, СгС3 алкила, СгС3 галоалкила, СгС3 алкокси, СгС3 галоалкокси и галогена.
где
Х1 представляет собой СН или N;
R4 и R5 независимо выбраны из группы, состоящей из Н, низшего алкила, галогена или 25 CF3;
R-A выбран из
или
выбран из группы, состоящей из изопропила, m-бутила и циклопропила; 5 R2 и R3 независимо выбраны из группы, состоящей из галогена, СгС3 алкила, метокси и трифторметокси.
4. Соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что А представляет собой фенил;
10 Q представляет собой возможно замещенный фенил, предпочтительно замещенный одним заместителем, предпочтительно галогеном; X представляет собой СН; R-i представляет собой циклоалкил; и каждый из R2 и R3 представляет собой галоген.
5. Соединение по любому из пп. 1-4, выбранное из следующих: 3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота
(-)-3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) 20 циклопропил)бензойная кислота
(+)-3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота
3- (2-(2-хлор-4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-изопропилизоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота
25 3-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)изоксазол-4-ил)метокси) фенил)циклопропил)бензойная кислота
4- (4-((4-(2-(3-карбоксифенил)циклопропил)-3-хлорфенокси)метил)-5-циклопропилизоксазол-3-ил)-3,5-дихлорпиридин-1-оксид
3- (2-(2-хлор-4-((1 -(2,6-дихлорфенил)-4-изопропил-1 Н-1,2,3-триазол-5-ил)метокси)фенил)
30 циклопропил)бензойная кислота
4- ((4-(2-(6-(1 Н-тетразол-5-ил)пиридин-3-ил)циклопропил)-3-хлорфенокси)метил)-5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол
5- (2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)
6. Соединение по любому из пп. 1-4, выбранное из следующих:
3- (2-(6-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)-2-(трифторметил)
5 пиридин-3-ил)циклопропил)бензойная кислота
4- (2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)
циклопропил)бензойная кислота
1,3-дигидрокси-2-(гидроксиметил)пропан-2-аминия 4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)циклопропил)бензоат 10 (+)-4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота
(-)-4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензойная кислота
6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) 15 циклопропил)-1-метил-1 Н-индазол-З-карбоновая кислота
(+)-6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1 -метил-1 Н-индазол-З-карбоновая кислота
(-)-6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1 -метил-1 Н-индазол-З-карбоновая кислота 20 4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1\1-(метилсульфонил)бензамид
2-(4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензамидо)этансульфоновая кислота
4-((4-(2-(4-(1 Н-тетразол-5-ил)фенил)циклопропил)-3-хлорфенокси)метил)-5-циклопропил-25 3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол
4- (2-(2-хлор-4-((3-(2,6-дихлорфенил)-5-(2-гидроксипропан-2-ил)изоксазол-4-ил)метокси) фенил)циклопропил)бензойная кислота
5- (2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1-изопропил-1 Н-пиразол-З-карбоновая кислота
30 6-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-1-изопропил-1 Н-индазол-З-карбоновая кислота 4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)-2,6-диметилбензойная кислота
4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2-(трифторметокси)фенил)изоксазол-4-ил)метокси) 35 фенил)циклопропил)бензойная кислота
(+)-2-(4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси) фенил)циклопропил)бензамидо)этансульфоновая кислота
(-)-2-(4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил)
циклопропил)бензамидо)этансульфоновая кислота
2-(4-(2-(2-хлор-4-((5-циклопропил-3-(2,6-дихлорфенил)изоксазол-4-ил)метокси)фенил) циклопропил)бензамидо)уксусная кислота
4-(2-(2-хлор-4-((4-(2,6-дихлорфенил)-1 -изопропил-1 Н-1,2,3-триазол-5-ил)метокси)фенил) 5 циклопропил)бензойная кислота.
7. Соединение по любому из пп. 1-6 для применения в профилактике и/или лечении заболеваний, опосредованных FXR.
8. Соединение по п. 7 для применения в профилактике и/или лечении хронических внутрипеченочных состояний или некоторых форм внепеченочных холестатических состояний, или фиброза печени, возникающего в результате хронических холестатических состояний или острых внутрипеченочных холестатических состояний; и/или
для применения в профилактике и/или лечении обструктивных или хронических воспалительных расстройств печени; и/или
для применения в профилактике и/или лечении цирроза печени; и/или для применения в профилактике и/или лечении стеатоза печени и связанных синдромов, холестатических или фиброзных эффектов, которые связаны с вызванным алкоголем циррозом или с передаваемыми вирусами формами гепатита; и/или для применения в профилактике и/или лечении печеночной недостаточности или ишемии печени после обширной резекции печени; и/или
для применения в профилактике и/или лечении стеатогепатита, связанного с химиотерапией (CASH); и/или
для применения в профилактике и/или лечении острой печеночной недостаточности; и/или
для применения в профилактике и/или лечении воспалительных заболеваний кишечника.
9. Соединение по п. 7 для применения в профилактике и/или лечении
30 липидных и липопротеиновых расстройств; и/или
для применения в профилактике и/или лечении диабета II типа и клинических осложнений диабета I и II типов, включая диабетическую нефропатию, диабетическую нейропатию, диабетическую ретинопатию и другие наблюдаемые эффекты клинического проявления длительного диабета; и/или 35 для применения в профилактике и/или лечении состояний и заболеваний, возникающих в результате хронической жировой и фиброзной дегенерации органов вследствие усиленного накопления липидов и конкретно триглицеридов и последующей активации профиброзных путей, таких как неалкогольная жировая болезнь печени (НЖБП), или
неалкогольный стеатогепатит (НАСГ); и/или
для применения в профилактике и/или лечении ожирения или метаболического синдрома (комбинированные состояния дислипидемии, диабета или аномально высокого индекса массы тела); и/или
5 для применения в профилактике и/или лечении острого инфаркта миокарда, острого инсульта или тромбоза, возникающего в качестве конечной стадии хронического обструктивного атеросклероза.
10. Соединение по п. 7 для применения в профилактике и/или лечении
10 незлокачественных гиперпролиферативных расстройств и злокачественных
гиперпролиферативных расстройств, в частности гепатоцеллюлярной карциномы, аденомы и полипоза толстой кишки, аденокарциномы толстой кишки, рака груди, аденокарциномы поджелудочной железы, пищевода Барретта и других форм неопластических заболеваний желудочно-кишечного тракта и печени.
11. Применение соединения по любому из пп. 1-6 для получения
лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболеваний, опосредованных
FXR.
20 12. Применение по п. 11 для профилактики и/или лечения хронических
внутрипеченочных или некоторых форм внепеченочных холестатических состояний или фиброза печени, возникающего в результате хронических холестатических состояний или острых внутрипеченочных холестатических состояний; и/или
для профилактики и/или лечения обструктивных или хронических воспалительных 25 расстройств печени; и/или
для профилактики и/или лечения цирроза печени; и/или
для профилактики и/или лечения стеатоза печени и связанных синдромов, холестатических или фиброзных эффектов, которые связаны с вызванным алкоголем циррозом или с передаваемыми вирусами формами гепатита; и/или 30 для профилактики и/или лечения печеночной недостаточности или ишемии печени после обширной резекции печени; и/или
для профилактики и/или лечения стеатогепатита, связанного с химиотерапией (CASH); и/или
для профилактики и/или лечения острой печеночной недостаточности; и/или 35 для профилактики и/или лечения воспалительных заболеваний кишечника.
13. Применение по п. 11 для профилактики и/или лечения липидных и липопротеиновых расстройств; и/или
для профилактики и/или лечения диабета II типа и клинических осложнений диабета I и II типов, включая диабетическую нефропатию, диабетическую нейропатию, диабетическую ретинопатию и другие наблюдаемые эффекты клинического проявления длительного диабета; и/или
5 для профилактики и/или лечения состояний и заболеваний, возникающих в результате хронической жировой и фиброзной дегенерации органов вследствие усиленного накопления липидов и конкретно триглицеридов и последующей активации профиброзных путей; таких как неалкогольная жировая болезнь печени (НЖБП), или неалкогольный стеатогепатит (НАСГ); и/или 10 для профилактики и/или лечения ожирения или метаболического синдрома (общие состояния дислипидемии, диабета и аномально высокого индекса массы тела); и/или для профилактики и/или лечения острого инфаркта миокарда, острого инсульта или тромбоза, который случается в качестве конечной стадии хронического обструктивного атеросклероза.
14. Применение по п. 11 для профилактики и/или лечения незлокачественных гиперпролиферативных расстройств и злокачественных гиперпролиферативных расстройств, в частности гепатоцеллюлярной карциномы, аденомы и полипоза толстой кишки, аденокарциномы толстой кишки, рака груди, аденокарциномы поджелудочной
20 железы, пищевода Барретта и других форм неопластических заболеваний желудочно-кишечного тракта и печени.
15. Соединение по любому из пп. 1-6 для применения в качестве лекарственного средства.
Фигуры 1а и b: Зависимость средней концентрации от времени согласно Примеру 12 (а) и Примеру 4 (Ь) после перорального введения обезьянам (12 мг/кг; п=3).
10000.0
Q IX
zr л о
1000.0
100.0
10.0
-¦-Среднее
1.0
-I 1 1 1-
240 480 720 960 Время (мин)
1200
1440
100000.0 п
10000.0
1000.0 -
100.0 -
10.0
? 240 4SD 720 960 1200 1440
Время (мин)
-Среднее
Фигура 1с: Уровни исходного соединения в плазме в [нМ] после введения через желудочный зонд одной дозы 5 мг/кг GW4064 и Примера 4 по отдельности мышам С57 BLKS lepr_/" db/db. Данные отображают среднее из 3 индивидуальных измерений в плазме мыши.
Уровни GW4064 и Примера 4 в плазме
3 500
" 3 000
| 2 500
m го ¦5 с
т. 2 000
01 О и
| 1500
? 1000
-GW4064
¦Пример
о ас
500
DH/4O00U S/N; 011OU00039J5 3 2 .40 Фб-авг-ОЭ 11:-19 :2? сканирование нм шаг 1 . 0 нм
Партия WCW4064
G- 006 I
-Я. 1?П-
ОБ-авг-ой ii; Ьв ¦- 20 сканирование 200-400 нм шаг I -0 нм
Партия
-О. J26J ¦ -i ~ м "I
?00.О Лнм 100.0
DR/4000U S/K: О11ОЦ00О3953 2.40 06-jaBr-09 12:10:51 сканирование 200-400 нм шаг 1.0 нм
Фигура За-I: Спектр 1Н-ЯМР GW4064, РХ20535 и Примера 4 при t=0 и после 4, 15 и 70 ч
УФ-облучения при 254 нм.
Фигура За: GW4064 при t=0, перед УФ-облучением.
Фигура Зс: Пример 4 при t=0, перед УФ-облуч
Фигура 3d: GW4064 при t=4 УФ-облучения.
Фигура Зе: РХ20535 при t=4 УФ облучения.
Фигура 3f: Пример 4 при t=4 УФ-облучения.
Фигура Зк: Рх20535 при t=70 УФ-облучения.
Эффект облучения при Л=366нм на тонкую пленку с ДМСО.
Фигура Зт: сравнительная УФ-стабильность, влияние облучения при Л=366 нм на
тонкую пленку с ДМСО.
-100J
ш о. О
;г/день Примера 12
Эзетимиба
Орлистата
¦/день
¦/день
10 МП
30 мп
Фигура 4: Влияние на холестерин и триглицериды плазмы после 8 недель на рационе с высоким содержанием жира (РВСЖ) в присутствии или отсутствии соединений.
Холестерин Гщ Триглицериды 150-1
Носитель ГЯ|30 мг/кг/день Примера 12
(19)
(19)
(19)
S03H;
Синтез Соединения Аба:
Схема 1 b
Схема 1 b
Синтез Соединения A6b:
Синтез Соединения A6b:
Схема 1 с
Схема 1 с
Синтез Соединения A1f:
Синтез Соединения A1f:
Синтез Соединения A1f:
Синтез Соединения A1f:
Синтез Соединения A1f:
Синтез Соединения A1f:
Синтез Соединения A6f:
Синтез Соединения A6f:
Синтез Соединения В9:
Синтез Соединения В9:
Синтез Соединения В12:
Синтез Соединения В12:
Схема 3:
Схема 3:
Синтез Соединения СЗ:
Синтез Соединения СЗ:
Схема За
Схема За
Разделение посредством хиральной ВЭЖХ
Разделение посредством хиральной ВЭЖХ
Синтез соединения согласно Примеру 8а
Синтез соединения согласно Примеру 8а
Синтез соединения согласно Примеру 8Ь
Синтез соединения согласно Примеру 8Ь
Схема 4:
Схема 4:
Синтез Соединения D3:
Синтез Соединения D3:
Синтез Соединения D8:
Синтез Соединения D8:
Схема 5:
Схема 5:
Синтез Соединения Е15:
Синтез Соединения F7:
Синтез Соединения F7:
Синтез Соединения F7:
Синтез соединения согласно Примеру 12
Схема 7а
Схема 7а
Схема 7а
Схема 7а
Схема 7а
Схема 7а
Схема 7а
Схема 7а
Схема 8:
Схема 8а
Схема 9
Схема 9
100
Синтез соединения согласно Примеру 16:
100
Синтез соединения согласно Примеру 16:
101
Схема 10
101
Схема 10
102
102
103
104
Синтез Соединения J5:
103
104
Синтез Соединения J5:
103
104
Синтез Соединения J5:
106
106
107
Синтез Соединения К1
107
Синтез Соединения К1
108
Синтез Соединения КЗ
108
Синтез Соединения КЗ
109
Схема 12
109
Схема 12
110
Синтез Соединения L2
110
Синтез Соединения L2
111
Синтез Соединения L5
111
Синтез Соединения L5
112
Синтез Соединения L6
112
Синтез Соединения L6
Синтез Соединения L8
Синтез Соединения L8
114
Схема 13
114
Схема 13
114
Схема 13
114
Схема 13
114
Схема 13
114
Схема 13
115
Синтез Соединения М4:
115
Синтез Соединения М4:
116
116
118
Схема 14. Пояснение абсолютной конфигурации примеров
118
Схема 14. Пояснение абсолютной конфигурации примеров
118
Схема 14. Пояснение абсолютной конфигурации примеров
118
Схема 14. Пояснение абсолютной конфигурации примеров
119
Синтез Соединения N1
119
Синтез Соединения N1
121
120
121
120
121
120
121
120
121
120
121
120
121
120
121
122
123
123
127
Таблица 1
126
127
Таблица 1
126
127
Таблица 1
128
129
129
130
133
133
135
136
138
R-A=
138
R-A=
139
циклопропил)пиколиновая кислота.
139
циклопропил)пиколиновая кислота.
140
140
1/21
1/21
1/21
1/21
1/21
1/21
2/21
2/21
2/21
2/21
3/21
3/21
4/21
4/21
5/21
5/21
6/21
6/21
8/21
8/21
9/21
9/21
10/21
10/21
11/21
11/21
12/21
12/21
17/21
17/21
19/21
19/21
19/21
20/21
20/21
21/21
21/21