EA201201203A1 20130430 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2013/PDF/201201203 Полный текст описания [**] EA201201203 20110301 Регистрационный номер и дата заявки US61/309,422 20100301 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2011/026701 Номер международной заявки (PCT) WO2011/109406 20110909 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [pdf] eaa21304 Номер бюллетеня [**] ТЕРПИМОЕ И МИНИМАЛЬНО ИНВАЗИВНОЕ УСТРОЙСТВО ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ КОЖИ Название документа [8] A61N 1/32 Индексы МПК [US] Бродерик Кейт, [US] Маккой Джей, [US] Кеммеррер Стефен В, [US] Линь Фэн, [US] Хьекен Руне Сведения об авторах [US] ИНОВИО ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201201203a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[**]

Новое устройство электропорации для доставки вакцин, которое является одновременно эффективным в создании защитного иммунного ответа и терпимым при доставке к субъекту (или почти безболезненным), а также способы практически безболезненного использования этого устройства для вакцинации субъекта против различных инфекционных заболеваний и типов рака.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Новое устройство электропорации для доставки вакцин, которое является одновременно эффективным в создании защитного иммунного ответа и терпимым при доставке к субъекту (или почти безболезненным), а также способы практически безболезненного использования этого устройства для вакцинации субъекта против различных инфекционных заболеваний и типов рака.


^ I
(19)
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201201203 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2013.04.30
(22) Дата подачи заявки 2011.03.01
(51) Int. Cl. A61N1/32 (2006.01)
ТЕРПИМОЕ И МИНИМАЛЬНО ИНВАЗИВНОЕ УСТРОЙСТВО ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ КОЖИ
(54)
(31) (32)
(72)
(74)
61/309,422 2010.03.01
(33) US
(86) PCT/US2011/026701
(87) WO 2011/109406 2011.09.09 (71) Заявитель:
ИНОВИО ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
Изобретатель:
Бродерик Кейт, Маккой Джей, Кеммеррер Стефен В, Линь Фэн, Хьекен Руне (US)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
(57) Новое устройство электропорации для доставки вакцин, которое является одновременно эффективным в создании защитного иммунного ответа и терпимым при доставке к субъекту (или почти безболезненным), а также способы практически безболезненного использования этого устройства для вакцинации субъекта против различных инфекционных заболеваний и типов рака.
ТЕРПИМОЕ И МИНИМАЛЬНО ИНВАЗИВНОЕ УСТРОЙСТВО ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ КОЖИ.
5 Эта работа была частично поддержана грантом армии США W23RYX-8141-N604: № 08023003.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
10 Изобретение относится, среди прочего, к устройствам электропорации и их
использованию для содействия внедрению биомолекул в клетки тканей кожи у млекопитающих.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Величина иммунного ответа на ДНК-вакцины зачастую зависит от трех основных критериев - оптимизированного дизайна вектора, использования подходящей адъювантной и успешной доставки и последующей экспрессии плазмиды в ткани-мишени. In vivo электропорация оказалась особенно эффективной в эффективной доставке ДНК
20 иммуногенов в мышцы и кожу, и даже несколько устройств прошли клинические испытания на человеке.
Доставка лекарств в кожные ткани (внутрикожно, ID) представляет собой привлекательный способ в клинической практике по ряду причин. Кожа является самым большим органом человеческого тела, наиболее доступна, наиболее легко контролируемая,
25 а также высоко иммунокомпетентна. Тем не менее, непроницаемость, барьерная функция кожи является одним из основных препятствий на пути эффективной трансдермальной доставки лекарств.
Кожа человека простирается примерно на 2 м2 площади и составляет около 2,5 мм по толщине в среднем, делая ее самым большим органом человеческого тела. Обычно
30 кожа имеет два основных типа ткани - эпидермис и дерму. Эпидермис - постоянно
ороговевающий многослойный эпителий. Самый внешний слой кожи - роговой слой (SC) - выступает в качестве основной барьерной функции для кожи. SC является 15-30 клеточным толстым слоем нежизнеспособных, но биохимически активных корнеоцитов. Остальные три слоя эпидермиса (S. granulosum, S. spinosum, S. basale) содержат
35 кетатиноциты на разных стадиях дифференцировки, а также иммунные клетки
Лангерганса и кожные дендридные клетки.
Физические и химические способы для трансдермальной доставки лекарств и доставки генов были детализированы группами по всему миру. Примерами являются Ионофорез, липидная доставка и генная пушка - такие примеры. Еще одним физическим 5 способом временного увеличения проницаемости кожи является электропорация.
Электропорация предусматривает применение кратких электрических импульсов, которые приводят к созданию водного пути в липидных двухслойных мембранах клеток млекопитающих. Это делает возможным прохождение больших молекул, в том числе ДНК, через клеточную мембрану, которая иначе была бы менее проницаемой. Таким 10 образом, электропорация увеличивает поглощение, а также степень, в которой лекарства и ДНК поступают в их ткани-мишени. Для электропорации причиной образования пор является пороговая энергия, которая должна быть достигнута, а движение производится по электрофоретическому эффекту, зависящему от электрического поля и длительности импульса.
15 В случае ДНК-вакцин электропорация показала количественно повышение
иммунного ответа, увеличение широты этих иммунных реакций, а также повышение эффективности дозы. Доставка в кожу имеет много преимуществ и привлекательна, в первую очередь, в связи с наличием различных релевантных иммунных клеток, легкой клинической доступностью как органа-мишени иммунизации и минимальной глубиной
20 доставки (минимально инвазивна), однако, остается один вопрос по поводу возможности достижения высокого уровня трансфекции, а затем - надежного иммунного ответа.
Доставка голой ДНК через стандартную внутримышечную (IM) инъекцию, как известно, неэффективна вне моделей грызунов. Это привело к неспособности обеспечить надежный иммунный ответ на крупных млекопитающих и людях. Некоторые стратегии
25 были разработаны для повышения экспрессии ДНК-вакцин, такие как кодон-оптимизация, оптимизация РНК, добавление лидер-последовательности и развитие оптимизированной консенсус-последовательности.
Несмотря на улучшения в дизайне вектора и использовании молекулярных адъювантов, по-прежнему сохраняется необходимость в эффективном способе введения
30 ДНК-вакцин, который приводит к высокому уровню экспрессии плазмиды в необходимом типе клетки желаемой ткани, чаще всего, мышц, опухоли или кожи. Кроме того, сохраняется необходимость в устройстве электропорации и способе доставки вакцин, который является одновременно эффективным в генерировании защитного иммунного ответа и терпимым (или почти безболезненным).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте изобретения представлены устройства электропорации, 5 способные доставлять к субъекту допустимый электрический потенциал в слои ткани
эпидермиса между роговым и базальным слоями, что приводит к электропорации клеток в названной ткани, которые включают: генератор напряжения, а также массив, имеющий множество электродов, в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов расположен отдельно от соседних электродов на расстоянии от
10 около 0,5 мм до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 вольт до примерно 50 вольт в эпидермальной ткани; а электроды имеют кончик на дистальном конце, такой, что тупой с острия электрод позволяет проникать в слои ткани эпидермиса между роговым и базальным слоями, и обеспечивает электрический потенциал от генератора напряжения к
15 эпидермальной ткани.
В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять к субъекту допустимый электрический потенциал к эпидермальной ткани, что приводит к электропорации клеток названной эпидермальной ткани, которые состоят из: генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в
20 электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов расположен отдельно от соседних электродов на расстояниие от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 вольт до примерно 50 вольт в эпидермальной ткани, а электроды приспособлены для проникновения в ткань эпидермиса на глубину 0,1
25 мм или менее.
В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять к субъекту допустимый электрический потенциал к эпидермальной ткани, что приводит к электропорации клеток названной ткани, которые состоят из: генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в
30 электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает в массиве электрическое поле примерно от 0,1 до около 50 вольт; при этом электроды доставки допустимого электрического потенциала в клетки эпидермальной ткани являются безболезненными при измерении по визуальной
аналоговой шкале.
В другом аспекте изобретения представлены три устройства электропорации, способные доставлять к субъекту допустимый электрический потенциал к эпидермальной ткани, что приводит к электропорации клеток названной ткани, которые состоят из: 5 генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в
электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает в массиве электрическое поле примерно от 0,1 до около 50 вольт, при этом электроды доставки допустимого электрического потенциала в
10 клетки эпидермальной ткани выступают в качестве доказательства минимального повреждения тканей в указанных клетках.
В другом аспекте изобретения представлены допустимые способы доставки биомолекул в клетки эпидермальной ткани субъекта путем электропорации с помощью устройств электропорации, описанных здесь, которые включают: введение биомолекулы в
15 клетки; контакт электродов с эпидермальной тканью таким образом, что электроды проникают через роговой слой и находятся в слоях выше базальных слоев; а также доставку допустимого электрического потенциала от генератора напряжения к клеткам эпидермального слоя с помощью электродов.
20 КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Многочисленные цели и преимущества настоящего изобретения могут быть лучше поняты специалистам в данной области техники со ссылкой на сопроводительные фигуры, в которых:
Фигура 1 показывает инженерные фигуры одного из вариантов сборки минимально инвазивного устройства ЕР ("MIED").
Фигура 2 показывает трехмерные фигуры компонентов одного из вариантов воплощения 30 MIED. "а" показывает одноразовый стерильный корпус массива, "Ь" показывает прочный корпус и "с" показывает корпусный электрод с одноразовым массивом (2а).
Фигура 3 показывает трехмерные фигуры одного из вариантов воплощения MIED, то есть батареи с портативным питанием со съемным массивом (для стерилизации), "а"
показывает внешний вид. "Ь" показывает внутренний вид (включая батареи).
Фигура 4 показывает фотографии варианта воплощения MIED.
5 Фигура 5 показывает флуоресцентные изображения тканей кожи морской свинки для обнаружения GFP экспрессии после введенной электропорационным способом доставки GFP экспрессии, построенной на использовании MIED.
Фигура 6 показывает флуоресцентные изображения ткани из кожи различных животных 10 для обнаружения GFP экспрессии после введенной электропорационным способом доставки GFP экспрессии, построенной на использовании MIED.
Фигура 7 представляет фигуры, показывающие результаты иммуногенности в защите от гриппа, стимулированного у мышей.
Фигура 8 представляет фигуры, показывающие результаты иммуногенности в защите от гриппа, стимулированного у морских свинок.
Фигура 9 представляет фигуры, показывающие результаты иммуногенности в защите от 20 гриппа, стимулированного у нечеловеческих приматов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следующим аббревиатурам или сокращениям даны определения, чтобы 25 способствовать пониманию предпочтительных вариантов воплощения настоящего изобретения. Сокращенные определения, приведенные здесь, не являются исчерпывающими и они не противоречат определениям, определениям, принятым в данной области техники или представленным в словаре. Сокращенные определения приведены здесь, чтобы дополнить и более четко обозначить определения, известные в 30 данной области техники.
Термин "постоянный ток" используется здесь для определения тока, который получили или испытывают ткани или клетки определенных описанных тканей, в течение срока действия электрического импульса, доставленного в те же ткани. Электрический импульс поступает из устройств электропорации, описанных здесь. Этот ток остается с
постоянной силой тока в указанной ткани в течение срока действия электрического импульса, так как в устройстве электропорации есть элемент обратной связи, предпочтительно - с мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи может измерять сопротивление ткани (или клеток) в течение длительности импульса и вызывать 5 устройство электропорации изменять мощности его электрической энергии (например, увеличения напряжения), так, что ток в той же ткани остается постоянным в течение электрического импульса (порядка милисекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах воплощения элемент обратной связи состоит из контроллера. Текущие значения величины тока, описанные для устройств, представленных здесь, предпочтительно
10 являются значениями величины постоянного тока.
Термин "постоянное напряжение" используется здесь для определения напряжения или электрического потенциала, который получили или испытывают ткани или клетки определенной описанной ткани, в течение срока действия электрического импульса, доставленного в ту же ткань. Электрический импульс поступает из устройств
15 электропорации, описанных здесь. Это напряжение остается постоянным напряжением в указанной ткани в течение срока действия электрического импульса, так как в устройстве электропорации есть элемент обратной связи, предпочтительно - с мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи может измерять сопротивление ткани (или клеток) в течение длительности импульса и привести к изменению мощности электрической
20 энергии устройства электропорации, так, что напряжение в той же ткани остается
постоянным в течение электрического импульса (порядка милисекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах воплощения элемент обратной связи состоит из контроллера. Значения напряжения, описанные для устройств, представленных здесь, предпочтительно являются значениями постоянного напряжения.
25 Термины "обратная связь" или "ток обратной связи" используются как синонимы
и обозначают активную реакцию кожи при условии использования устройства ЕР, которое включает измерение тока в ткани между электродами и изменение выходной энергии в ЕР устройстве, соответственно, с целью поддержания тока на постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается пользователем перед началом последовательности
30 импульсов или электрическим лечением. Желательно, чтобы обратная связь
осуществлялась путем электропорационного компонента, например, контроллера прибора ЕР кожи, так как в нем электрическая цепь в состоянии постоянно контролировать ток в ткани между электродами и сравнивать текущий ток (или ток в ткани) с заданным током, и непрерывно делать изменение выходной энергии с целью поддержания контроля тока на
заданных уровнях. В некоторых вариантах воплощения обратная связь происходит мгновенно, когда это аналоговая замкнутая обратная связь.
Термин "биомолекула", используемый здесь, относится к последовательности нуклеиновых кислот, белкам, липидам, микропузырькам (например, 5 лекарствосодержащие везикулы), а также к фармацевтическим препаратам.
Предпочтительно биомолекула является вакциной, и более предпочтительно биомолекула является ДНК-вакциной, и даже более предпочтительно - ДНК-плазмидной вакциной.
Термины "электропорация", "электропермеабилизация" или "электрокинетическое усиление" ("ЕР") используются здесь как взаимозаменяемые и относятся к использованию 10 трансмембранного электрического импульса поля, вызывающего появление
микроскопических путей(поры) в биомембране; их присутствие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарства, ионы и вода, переходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.
Термин "децентрализованно текущий" используется здесь для определения 15 структуры электрического тока, поступающего из массива различных игольчатых
электродов устройств электропорации, описанных здесь, в которых минимизировано, а еще лучше - ликвидировано, возникновение электропорационного теплового стресса в любой области ткани во время электропорации.
Термин "механизм обратной связи", используемый здесь, относится к процессу 20 выполнения через программное или аппаратное обеспечение (или прошивку), когда в процессе получается и сравнивается сопротивление желаемой ткани (до, во время и/или после подачи импульса энергии) с текущей величиной, желательно тока, и регулирует импульс энергии, поставляемой для достижения заданного значения. Термин "сопротивление" используется здесь при обсуждении механизма обратной связи и может 25 быть преобразован в текущее значение в соответствии с законом Ома, что позволяет сравнения с заданным током. В предпочтительном варианте воплощения "механизм обратной связи" осуществляется аналоговым замкнутым петлевым контуром.
Термин "минимально инвазивный", используемый здесь, относится к ограниченному проникновению игл электродов при условии использования устройства 30 электропорации и может включать в себя неинвазивные электроды (или непроникающие иглы). Желательно, чтобы проникновение осуществлялось в такой степени, чтобы проникнуть через роговой слой, и, желательно, войти в наиболее живой слой ткани зернистого слоя, но не проникнуть в базальный слой. Глубина проникновения не должна превышать 0,1 мм, и, желательно, глубины должны быть в диапазоне от около 0,010 мм до
примерно 0,040 мм, чтобы проникнуть через роговой слой. Предпочтительно это достигается с помощью электрода, который имеет на конце форму острого троакара, что позволяет проникнуть через роговой слой, но избежать глубокого проникновения.
Термины "терпимый" или "безболезненный" используются здесь как синонимы и, 5 когда речь идет об электропорации, обозначают существенно более низкий уровень боли, связанный с электропорацией, чем обычные уровни с доступными устройствами электропорации. В частности, допустимая (или почти безболезненная) электропорация является результатом комбинации использования MIED, описанных здесь, избегая электропорации мышц, а также доставки низких электрических полей в слои эпидермиса
10 между роговым и базальным слоями. Предпочтительно электрические поля будут состоять из низких уровней напряжения, т.е., например, от 0,01 до 70 В, и предпочтительно - от 1 В до 15 В. При измерении с помощью VAS субъекты при MIED электропорации, в соответствии со способами, изложенными здесь, испытывают уровни боли, которые находятся в пределах 20% (от полной шкалы) от их безболезненности или
15 безболезненно отсчета, например, в пределах 2 очков по шкале от 0 до 10, и, желательно, в пределах 10% от их безболезненного отсчета.
В одном аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять в субъект допустимый электрический потенциал в слои эпидермальной ткани между роговым и базальным слоями, что приводит к
20 электропорации клеток в указанной ткани, которые включают: генератор напряжения, а также массив, имеющий множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 вольта до 50 вольт в
25 эпидермальной ткани; и электроды имеют кончик на дистальном конце, такой, что острие электрода может проникать в слои эпидермальной ткани между роговым и базальным слоями, и обеспечивает электрический потенциал от генератора напряжения к эпидермальной ткани. В некоторых случаях электроды имеют кончик на дистальном конце, который, как правило, тупой, но в данном случае имеет острие, или, другими
30 словами, острие под пологим и тупым углом. Например, электрод может иметь на дистальном конце троакар, у которого кончик заточен под углом 10° от оси, почти перпендикулярно к оси иглы.
В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять в объект допустимый электрический потенциал к эпидермальной
ткани, что приводит к электропорации клеток указанной эпидермальной ткани, которые состоят из: генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм; 5 генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 вольта до примерно 50 вольт в эпидермальной ткани; и электроды приспособлены проникать в эпидермальные ткани на глубину 0,1 мм или менее.
В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять в объект допустимый электрический потенциал в эпидермальную
10 ткань, что приводит к электропорации клеток в указанной ткани, которые состоят из: генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает в массиве электрическое поле примерно от 0,1 до
15 около 50 вольт, при этом электроды доставки допустимого электрического потенциала в клетки эпидермальной ткани обеспечивают отсутствие боли, измеряемое по визуальной аналоговой шкале.
В другом аспекте изобретения представлены устройства электропорации, способные доставлять в субъект допустимый электрический потенциал в эпидермальную
20 ткань, что приводит к электропорации клеток в указанной ткани, которые состоят из: генератора напряжения, а также массива, имеющего множество электродов в электрической связи с генератором напряжения. Каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм; генератор напряжения обеспечивает в массиве электрическое поле примерно от 0,1 до
25 около 50 вольт; при этом электроды доставки допустимого электрического потенциала в клетки эпидермальной ткани выступают в качестве доказательства минимального повреждения ткани в указанных клетках.
В некоторых вариантах воплощения устройства имеют электроды, которые адаптированы к проникновению в эпидермальные ткани на глубину 0,1 мм или меньше, и,
30 желательно, на глубину примерно от 0,01 мм до около 0,04 мм. Предпочтительно, чтобы электроды находились на расстоянии около 1,5 мм от соседних электродов. Кроме того, предпочтительно, чтобы генератор напряжения поставлял в эпидермальные ткани электрический потенциал от около 1 вольта до примерно 15 вольт, а более предпочтительно - около 15 вольт.
В некоторых вариантах воплощения устройства доставки допустимого электрического потенциала дают электрический потенциал продолжительностью в пределах от примерно 5 мс до около 250 мс, где указанные значения характеризуют длительность диапазонов и время между ними. 5 В некоторых вариантах воплощения устройства доставки допустимого
электрического потенциала создают боль, по оценке указанного субъекта, которая находится рядом с безболезненным уровнем при измерении по визуальной аналоговой шкале. VAS представляет собой горизонтальную линию длиной 100 мм, на которой 0 мм указывает на отсутствие боли, а 100 мм указывает на сильную боль. Безболезненный
10 уровень определяется как оценка с использованием VAS-методологии, которая дает
средний балл примерно <20 мм (с 95% доверительным интервалом) и, предпочтительно, - <10 мм (в пределах 95% доверительного интервала).
В некоторых вариантах воплощения устройства доставки допустимого электрического потенциала дают электрический потенциал, который приводит к
15 минимальному повреждению ткани в указанных клетках субъекта и, желательно, без видимого повреждения тканей в гистопатологическом анализе тканей. Гистологический анализ может быть использован для оценки видимых повреждений.
Гистологический анализ показывает трансфекцию в верхних слоях эпидермиса
20 Гистопатологический анализ был сделан на ткани кожи морских свинок. Каждая
панель представляла ткань, которая была электропорирована с помощью MID. Все слайды были окрашены гематоксилином и эозином, а также изучены под флуоресцентным микроскопом (х 20 объектив) для визуализации GFP-позитивности. Гистопатология ткани кожи после сакрификации животных через 3 дня после лечения показала: анализ не
25 выявил связанных повреждений тканей после электропорации с минимально инвазивным устройством. Другими словами, гистопатологический анализ показал, что ткань после электропорации похожа на ткань без электропорации.
В другом аспекте изобретения представлены допустимые способы доставки 30 биомолекул в клетки эпидермальной ткани субъекта путем электропорации с помощью устройств электропорации, описанных здесь, которые включают: введение биомолекулы в клетки; контакт электродов с эпидермальной тканью таким образом, что электроды проникают через роговой слой и находятся в слоях выше базальных слоев; а также доставку допустимого электрического потенциала от генератора напряжения к клеткам
этшдермального слоя с помощью электродов.
В некоторых вариантах воплощения способы включают манипулирование электродами для проникновения в эпидермальные ткани на глубину около 0,1 мм или меньше и, желательно, на глубину примерно от 0,01 мм до около 0,04 мм. Массив может 5 быть приложен вручную туда и обратно (или пошевелен) в месте инъекции, чтобы
обеспечить хороший контакт, и в результате кончик электродов пробивает роговой слой. Предпочтительно этап доставки включает доставку допустимого электрического потенциала, который создает боль, по оценке указанного субъекта, которая находится рядом с безболезненным уровнем при измерении по визуальной аналоговой шкале. Кроме 10 того, предпочтительно этап доставки включает в себя доставку допустимого
электрического потенциала, который приводит к минимальным повреждениям тканей в указанных клетках субъекта. Этап доставки предпочтительно обеспечивает электрический потенциал от около 0,1 вольта до примерно 15 вольт в клетки.
В некоторых вариантах воплощения способы включают в себя этап доставки, 15 который состоит из доставки электрического потенциала длительностью от около 5 мс до примерно 250 мс, и длительностью диапазонов и подходов между ними, и предпочтительно 100 мс.
Основные устройства электропорации
20 Здесь предусмотрены генераторы или контроллеры устройства электропорации,
которые могут обеспечить импульс электрической энергии в эпидермальные ткани между роговым и базальным слоями при низких электрических полях и вызывают допустимую электропорацию. Предпочтительно электропорация будет происходить на уровне зернистого слоя, в основном или исключительно. Устройства доставляют импульс
25 энергии посредством MIED через игольчатые электроды, которые способны проникать через роговой слой.
В некоторых вариантах воплощения предусматривается реагирование настоящего MIED, которое предпочтительно поддерживает постоянный ток в обработанной ткани, достигаемое с помощью механизма обратной связи в устройстве ЕР кожи, что 30 предотвращает нагрев ткани и уменьшает повреждение ткани, боль и способствует
общему успеху технологии электропорации кожи. В некоторых вариантах воплощения MIED может дополнительно содержать контроллер, генератор сигналов в электронной связи с контроллером, сигнальный журнал в электронной связи с контроллером, а также батареи, электрически соединенные с генератором сигнала. Контроллер может получать
вводные данные от пользователя, поручить генератору сигналов доставить энергетический импульс к желаемой ткани, в соответствии с введенными данными, и передать данные с регистратора сигнала в зависимости от импульса энергии, который поставляется; при этом батарея посылает электрический заряд на генератор сигнала, 5 батарея может быть литий-ионной, никель-металл-гидридной, свинцовой или никель-кадмиевой батареей. Предпочтительно MIED (Фигура 3) является портативным. Портативное устройство может работать через батарею и подходит для массовой терапевтической вакцинации или целевой вакцинации.
MIED может быть сочетанием предусмотренного массива электродов и
10 аппликаторов, а также различных компонентов, генерирующих электрическое поле (или генерирующих электрический импульс), или генераторов. В некоторых примерах генераторы можно выбрать из одного из известных устройств электропорации, включая, но не ограничиваясь следующими: устройства электропорации, описанные в патенте США № 7245963 под названием "Сборка электродов постоянного тока для
15 электропорации" и в патенте США № 5273525, патенте США № 6110161, патенте США № 6261281, патенте США № 6958060 и патенте США № 6939862, среди прочих. В более предпочтительных примерах генераторы используются с устройством CELLECTRA(r) ЕР и устройством Elgen ЕР (оба из Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA). Указанные патентные ссылки здесь приведены в качестве ссылки во всей их полноте.
Электропорационные иглы
Различные известные электропорационные иглы, способные доставлять электрический заряд, могут быть включены в MIED. Электропорационные иглы минимально инвазивны, включая неинвазивные иглы. Желательно, чтобы иглы были
25 остры, например, в некоторых случаях используют заточенный троакар, так, чтобы они могли проникать через роговой слой и достигать зернистого слоя. Троакарный конец может быть основанием, чтобы оставить его острым, что позволяет проникнуть через роговой слой, но избежать глубокого проникновения. В некоторых примерах электроды имеют кончик на дистальном конце, который, как правило, тупой, но в данном случае
30 имеет острие или, другими словами, острие пологое или под тупым углом, например,
электрод может иметь на дистальном конце троакар, у которого кончик заточен под утлом 10° от оси, почти перпендикулярно к оси иглы.
Массивы
Множество известных массивов, образованных из игл, может быть использовано с текущим MIED. Эти массивы, образованные из игл, могут включать любое количество электродов, любой геометрический рисунок электродов в общем плоском расположении. Предпочтительно, чтобы электроды при расположении были равномерно распределены по 5 массиву электродов (или на основание или на подложке, к которой электроды
прикреплены). Более предпочтительно, чтобы игольчатые электроды были расположены на площади, подобно тому, как расположены соседние игольчатые электроды, которые разнесены друг от друга примерно на таком же расстоянии (за исключением электродов на краю площади).
10 В некоторых вариантах воплощения массив состоит из по меньшей мере трех игл,
разнесенных на равном расстоянии друг от друга в модели треугольника, по меньшей мере из четырех игл, разнесенных на равном расстоянии друг от друга по кругу, или игл, расположенных в 2x2, 3x3, 4x4, 5x5 или больше квадратном узоре. Кроме того, модель может быть прямоугольной или ромбовидной. Предпочтительно, чтобы иглы электродов
15 были расположены в 4x4 расположении массива игл. Пример 4x4 массива игл показан на Фигуре 1. На Фигуре 2 показан пример корпуса MIED, корпуса массива и корпуса электрода. Каждый игольчатый электрод может быть разнесен от соседних игольчатых электродов на расстояние 150 мм или меньше, от 100 мм до 1 мм, от 50 мм до 1 мм, от 40 мм до 1 мм, от 30 мм до 1 мм, с 20 мм до 1 мм, от 10 мм до 1 мм, от 5 мм до 1 мм, от 5 мм
20 до 2 мм, от 5 мм до 2 мм, а предпочтительно - 2 мм, а более предпочтительно - 1,5 мм.
Электрические импульсы (поставляемый электрический потенциал)
Представленные устройства работают при более низких напряжениях и токах, чем обычные способы ЕР для повышения переносимости во время поддерживаемых
25 успешных трансфекций биомолекулы (о чем свидетельствует экспрессия, а затем -
иммунный ответ). Устройство, как правило, используется с импульсным генератором, призванным обеспечить постоянное напряжение, ток или комбинацию обоих, при необходимости. Электрические импульсы, используемые MIED для осуществления трансфекций клеток в кожной ткани, являются любыми известными типами импульсов,
30 которые обеспечивают низкую электрическую энергию, необходимую для получения допустимой электропорации. В некоторых вариантах воплощения MIED обеспечивает электрический импульс к желаемой ткани по уровням напряжения от 0,01 В до 70 В, от 0,01 В до 50 В, от 0,01 В до 40 В, от 0,01 В до 30 В, от 0,01 В до 20 В, от 0,01 В до 15 В, от 0,1 В до 70 В, от 0,1 В до 50 В, от 0,1 В до 40 В, от 0,1 В до 30 В, от 0,1 В до 20 В, от 0,1 В
до 15 В и, предпочтительно, 1В-15 В. Более предпочтительные уровни напряжения составляют 15 В, когда соседние электроды MIED разнесены примерно на 2 мм, а предпочтительно - 1,5 мм.
В некоторых вариантах воплощения MIED обеспечивает допустимую 5 электрическую энергию, которая характеризуется электрическим импульсом доставки следующего тока в желаемую ткань: от 0,2 мА до 100 мА, от 0,1 мА до 100 мА, от 0,5 мА до 100 мА, от 1 мА до 100 мА, от 1 мА до 80 мА, от 1 мА до 60 мА, от 1 мА до 50 мА, от 1 мА до 40 мА, от 1 мА до 30 мА, но предпочтительно - от 1 мА до 100 мА, а более предпочтительно - от 1 мА до 30 мА, а еще более предпочтительно - 10 мА.
10 Для всех допустимых электрических импульсов, связанных с MIED, будет
характерна короткая продолжительность каждого импульса, в том числе длительностью от 5 мс до 250 мс, импульс от 10 мс до 250 мс, от 20 мс до 250 мс, от 40 мс до 250 мс, от 60 мс до 250 мс, от 80 мс до 250 мс, от 100 мс до 250 мс, от 20 мс до 200 мс, от 40 мс до 200 мс, от 60 мс до 200 мс, от 80 мс до 200 мс, от 100 мс до 200 мс, от 20 мс до 150 мс, от 40
15 мс до 150 мс, от 60 мс до 150 мс, от 80 мс до 150 мс, от 100 мс до 150 мс, от 100 мс до 140 мс, от 100 мс до 130 мс, от 100 мс до 120 мс, от 100 мс до 110 мс, а более предпочтительно
- 100 мс.
Допустимые электрические импульсы, связанные с MIED будут также характеризоваться низкой повторяемостью импульсов. Импульсы, поставляемые MIED, 20 повторяются при доставке со следующим числом импульсов для каждой вакцинации: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, а предпочтительно - от 1 до 6 импульсов, а более предпочтительно
- 2 импульса.
Ткань для введения вакцины + ЕР
25 MIED предназначен для доставки достаточной для электропорации электрической
энергии в клетки кожной ткани, чтобы обеспечить доставку биомолекул в ее клетки и, предпочтительно, вакцинацию ДНК-вакцинами. Предпочтительно, чтобы электроды проникали только в кожную ткань, которая является живым слоем ткани чуть ниже рогового слоя и выше базального слоя, и, предпочтительно, только в зернистые слои.
30 Биомолекулы, как правило, доставляются в ткани-мишени с помощью Манту-техники.
Версия с питанием от батареи с электроникой в рукоятке (см. Фигуру 3)
MIED может быть портативным устройством ЕР. Предусмотрено портативное автономное MIED устройство, которое является ручным устройством, а источником
электрической энергии для электрических импульсов является по меньшей мере одна батарея, имеющая потенциал напряжения между 1,5 В и 12 В.
Портативное MIED может включать в себя корпус, в котором содержится указанная батарея, плату, включающую электрическую цепь обратной связи с 5 электрическим питанием от указанной батареи, и по меньшей мере один конденсатор, способный удерживать емкость между 1000 и 100000 мкФ (микрофарад). В связи с этим вариантом воплощения компоненты (например, батареи, цепи и конденсатор), как правило, пространственно размещены в указанном корпусе в линейной последовательности или в компоновке бок о бок, а корпус может иметь прямоугольную или цилиндрическую форму,
10 и его может держать рукой лицо, эксплуатирующее устройство. Например, корпус будет иметь проксимальный конец и дистальный конец, такой как цилиндр или где длинная сторона указанного прямоугольника лежит между ними и где указанная батарея находится в пределах указанного проксимального конца указанного корпуса и доступна на таком конце с помощью съемной крышки. На дистальном конце указанного корпуса
15 могут быть расположены электрические каналы, которые находятся в электрической связи с этой цепью и служат в качестве разъема для подключения по меньшей мере с одним катодом и по меньшей мере с одним анодом, которые будут использоваться при комплектации цепи, состоящей из электропоративного импульса на базе указанной батареи через конденсатор и указанную цепь. Дистальный конец указанного корпуса
20 может также включать связанный с или как часть указанного корпуса механизм для крепления, полупостоянный или на постоянной основе, и/или отключения; главное устройство самой сборки, включающей любой из резервуаров для содержания жидкого терапевтического агента с отверстием для жидкости в указанном резервуаре, через которое указанная жидкость может быть направлена к телу ткани; источник энергии для
25 перемещения указанной жидкости из резервуара через указанное отверстие; и по меньшей мере один электрод, содержащий по меньшей мере один анод и один катод.
В некоторых вариантах воплощения портативное MIED способно передавать в ткани кожи млекопитающего электрический импульс, способный электропорировать клетки в указанной ткани, указанный электрический импульс с напряжением, обычно
30 составляющим от 0,1 В до 70 В, предпочтительно - от 0,1 В до 50 В, более
предпочтительно - от 1 В до 15 В. Кроме того, устройство способно доставлять электропоративный импульс указанной напряженности поля на период между 5 миллисекундами и 250 миллисекундами, а более типично - между 10 и 100 миллисекундами, еще чаще - между 30 и 70 миллисекундами, а более предпочтительно
50 миллисекунд. Более того, устройство способно с помощью своего микропроцессора доставлять биполярный импульс или монополярный импульс электропоративной электрической энергии, при этом биполярный или монополярный импульсы могут содержать предопределенный ход нескольких импульсов, и/или формируемых 5 напряжением импульсов, или даже по-прежнему экспоненциально разряжаемых импульсов. Такая разнообразная возможность пульсации обеспечивает потенциал оптимизации процесса электропорации, включая оптимизацию напряжения, формы импульса, длительности и полярности импульсов электропорации.
10 ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами. Следует понимать, что эти примеры, показывающие предпочтительные варианты воплощения изобретения, даны только в качестве иллюстрации. Исходя из вышеизложенного и этих примеров, специалист в данной области техники может установить основные
15 характеристики этого изобретения и, не отходя от его сути и объема, может сделать
различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны здесь, будут очевидны специалистам в данной области техники из предшествующего описания. Такие изменения также должны
20 находиться в пределах формулы изобретения.
Испытание может быть проведено с целью оценки переносимости и снижения боли, порожденной устройствами электропорации, описанными здесь. Персональное исследование можно начать с секундомера для каждого пациента во время применения электропорации. Каждый пациент будет выполнять стандартные оценки боли под
25 наблюдением квалифицированного персонала исследования, и они будут записывать эти оценки в дневнике-буклете в моменты: через пять, 10, 15, 20, 30 и 45 минут, один час и полтора часа после электропорации, через каждый час в течение 12 часов после электропорации и через 16 часов и 24 часа после электропорации. Пациенты измеряли интенсивность боли с использованием категорийной шкалы и VAS. Как уже говорилось
30 ранее, категорийная шкала включает в себя четыре категории: 0=нет, 1=легкая, 2=умеренная и 3=тяжелая.
VAS представляет собой горизонтальную линию длиной 100 мм, на которой 0 мм указывает на отсутствие боли, а 100 мм указывает на сильную боль. С помощью этой 100 мм шкалы практически безболезненным показателем был бы показатель, который
находится в пределах 20 мм от оценки, которая показывает безболезненность (не чувствовал боли). В некоторых случаях вблизи безболезненного будет показатель 10 мм от безболезненного показателя.
5 Способы
Следующие способы используются в каждом из примеров ниже, в случае необходимости в обсуждении.
Дизайн минимально инвазивного устройства. Массивы электродов, состоящие из 4x4 позолоченных троакарных игл 0,0175 дюймов в диаметре, размещенных на расстоянии 1,5 10 мм, которые будут использоваться в сочетании либо с ELGEN1000 (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) генератором импульсов, либо с батарейным питанием низкого напряжения холостого хода.
Подготовка плазмиды. GFP gWiz плазмиды были приобретены у Aldevron (Fargo ND).
15 NP плазмида кодирует NP полной длины, полученную из Puerto Rico 8 (H1N1) штамма вируса гриппа. М2 плазмида кодирует всю длину М2, полученную из New Caledonia /99 (H1N1) штамма вируса гриппа. Конструирование было сориентировано на сигналы мутированного ядра и было оптимизировано и синтезировано от Gene Art (Германия). Все плазмиды были разбавлены в lxPBS перед инъекцией. SYNCON(tm) (сконструированная
20 синтетическая ДНК) коктейль плазмид вакцины против гриппа (100 мкг/плазмиды), содержащий pGX2005 (сконструированная вакцина SYNCON(tm), которая кодирует консенсус-последовательность HI НА) и pGX2009 (сконструированная вакцина SYNCON(tm), которая кодирует консенсус-последовательность свиного HI НА) был разбавлен в lxPBS для инъекций.
Животные. Самки морских свинок Hartley (штамм код 051), самки новозеландских кроликов и самки Balb С мышей были получены от Charles River Laboratories. Самки крыс Wistar были приобретены у Charles River Laboratories. Самки йоркширских свиней были приобретены у S &S Farm's (Ramona, СА). Морские свинки, крысы, кролики, мыши были 30 размещены в BioQuant (San Diego, СА). Самцы (4) и самки (4) макак (Масаса mulatto) были размещены в индивидуальном BIOQUAL, Inc. (Rockville, MD), со свободным доступом к пище и воде. Макакам была дана возможность акклиматизироваться по меньшей мере в течение 30 дней на карантине до экспериментов. Все животные были размещены и обрабатывались в соответствии со стандартами Institutional Animal Care and
Use Committee (IACUC).
Подготовка животных. Наблюдаемые результаты GFP ответа на морских свинках Hartley после удаления волос такие же, как наблюдаемые результаты на голых морских свинках 5 IAF в предыдущих экспериментах. Удаление волос, по всей видимости, не влияет на результат трансфекций и из-за соображений стоимости мы решили провести остальные исследования на животных Hartley. Морские свинки Hartley были побриты, а щетина удалялась кремом для эпиляции (Veet) за 24 часа до начала лечения. Мыши, крысы, кролики, свиньи и макаки были побриты до начала лечения.
ДНК-инъекции. Макаки были успокоены инъекцией кетамина. Все остальные животные были успокоены ингаляционно изофлураном. Всем животным было введено внутрикожно (способ Манту - 29-калибровая инсулиновая игла) 50 мкл lxPBS, содержащих желаемую дозу плазмиды. Мышам вводили внутримышечно в четырехглавую мышцу 50 мкл lxPBS, 15 содержащих нужную дозу плазмиды. Макакам вводили внутримышечно в четырехглавую мышцу 400 мкл lxPBS, содержащих нужную дозу плазмиды. Пустой вектор был добавлен для поддержания равного количества ДНК для каждой группы.
Устройство кожной электропорации. Сразу же после инъекции ДНК кожное устройство 20 было применено к месту кожной инъекции. Массив "двигали" в месте инъекции, чтобы обеспечить хороший контакт, и электропередачу достигали за счет генерации импульса либо от Elgen 1000, либо от цепи батареи низкого напряжения. Используемые параметры: три импульса по 15 вольт длительностью 100 мс.
25 Электропорация мышц. Сразу же после IM инъекции была выполнена электропорация в месте инъецированной мышцы путем применения 27 G, массива из 2 игл с расстоянием между электродами 4 мм. Два 125 В/см импульса длительностью 60 мс каждый были доставлены с использованием Elgen 1000.
30 Визуализация кожи. Образцы кожи или биопсии были отобраны посмертно от животных после окончания и хранились на льду до визуализации с помощью визуализирующего микроскопа OV 100 (Anti Cancer Inc., San Diego, СА) при 480 нм.
Гистопатология. Образцы кожи или биопсии были отобраны посмертно от животных
после окончания и сразу же консервировались в 10% нейтральном буферном растворе формалина и были отправлены в Pacific Pathology, San Diego, СА, для обработки и гистопатологического анализа. Соответствующие ткани были отделены, обработаны, парафинированы, секционно нарезаны примерно по 5 мкм и окрашены гематоксилином и 5 эозином. В результате слайды были рассмотрены советом сертифицированных
патологоанатомов. Секции были визуализированы с помощью микроскопа Zeiss Axioplan с 1 Ох объективом в Burnham Institute, San Diego, СА.
Обнаружение NP антител в сыворотке иммунизированных мышей. Антитела против
10 NP были оценены способом ИФА с использованием сыворотки от иммунизированных мышей. У мышей брали кровь ретроорбитально через две недели после последней иммунизации. Nunc Maxi-Sorp Immuno Plates были покрыты NP (5 мкг/мл, Imgenex IMR-274) при 4°C в течение ночи. Несвязанные антигены были смыты в устройстве автоматического мытья пластин с использованием PBS с 0,05% Tween-20. Пластины были
15 заблокированы для неспецифического связывания добавлением 200 мкл PBS с 0,5% BSA в течение одного часа при температуре 37°С. После мытья, как указано выше, сыворотку развели 1:50 в PBS с 0,2% BSA и 0,05% Tween-20 и добавили в первую лунку. Серийное разведение было сделано путем разбавления 1:3 до 1:5 для каждой лунки. Сыворотку инкубировали в течение двух часов при температуре 37°С до мытья. Антитела мыши
20 против IgG-биотин (В9904-5мл; Sigma-Aldrich, St Louis, МО, USA) разбавляли 1:10000 и 50 мкл добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение одного часа при 37°С до мытья. Затем добавляли в каждую лунку 50 мкл разбавленного 1:1000 стрептавидин-HRP (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA) и инкубировали в течение одного часа при 37°С до мытья. Последним шагом было добавление 50 мкл субстрата HRP (Р-9187, Sigma-
25 Aldrich) и инкубация при комнатной температуре в темном месте в течение 10 минут перед определением оптической плотности (OD) при 450 нм. Определение считалось положительным, если OD в три раза выше, чем OD от необработанной сыворотки мышей. Результаты были представлены в качестве конечной точки титра, то есть последнего разбавления, где OD была больше или ровно в три раза выше, чем в необработанной
30 сыворотке.
ELISpot анализ. Через две недели после вакцинации из каждой группы мышей были выделены спленоциты. Одноклеточные суспензии были очищены от красных клеток крови с помощью RBC буфера лизиса (eBioscience). Комплект ELISPOT анализа был
приобретен у R &D Systems. 96-луночные ELISPOT планшеты (Millipore) были покрыты моноклональным антителом против мышиного интерферона (IFN)-y. После инкубации в течение ночи при температуре 4°С лунки промыли и заблокировали блокирующим буфером в соответствии с протоколом от R &D Systems. Объединенные спленоциты из 5 каждой группы были добавлены в лунки и инкубированы с 1 мкг/мл NP147 (TYQRTRALV Biosynthesis Inc.) в течение 48 часов. Затем планшеты промывали и обрабатывали в соответствии с протоколом, описанным производителем. Точки были подсчитаны и проанализированы Cellular Technology Ltd.
10 Стимуляция интраназального гриппа. BALB/c мышей в группах из 10 были
иммунизированы на 0, 3 и 6 неделе. Мыши были иммунизированы: Prime 30+30 мкг неделя 0, Boost 30+30 мкг неделя 3, Boost 100+100 мкг неделя 10. На 12-й неделе эксперименты по контрольному заражению гриппом были проведены с использованием BSL IV протоколов в The National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada,
15 Winnipeg, MB, Canada, в соответствии с этическими принципами их этического комитета. 100xLD50 доза H5N1 A/Vietnam/1203/04 штамма была использована для назального контрольного заражения. Мышей контролировали по выживанию и массе тела ежедневно в течение 21 дня после заражения.
20 HAI-анализы. Образцы крови и сыворотки животных без промедления были помещены на хранение на сухом льду перед отправкой в BIOQUAL, Rockville, MD, для обработки. Сыворотку обрабатывали ферментом, разрушающим рецепторы, путем разбавления 1 части сыворотки 3 частями фермента и инкубировали в течение ночи при 37°С на водяной бане. Фермент инактивировали в течение 30 мин. инкубации при 56°С, после чего
25 добавляли 6 частей фосфатного буферного раствора для окончательного разведения 1/10. HAI-анализы были проведены в 96-луночном микропланшете с V-образным дном лунок, используя 4 единицы вируса гемагглютинации и 1 % красных кровяных клеток, как описано выше. Вирус, используемый для HAI-анализов, был получен из отделения гриппа CDC.
Пример 1
Результаты электропорации с помощью минимально инвазивного устройства в трудоемкой трансфекций гена-репортера
Устройство с минимально инвазивным электродом (MIED) было разработано для использования при доставке ДНК-вакцины. Этот новый аппликатор состоит из игольчатых электродов из позолоченной стали с заточенными троакарами (электроды имеют кончик на дистальном конце, который тупой, но с острием) на 1,5 мм расстоянии в 5 4x4 массиве (Фигуры 4а и 4с). Переменные ряды по четыре электрода могут быть
активированы с обратной полярностью: положительной или отрицательной. Электроды фиксируются в электрические розетки с пластиковой ручкой, что позволяет каждому электроду адресоваться индивидуально для альтернативной модели активации. Устройство предназначено только для вступления в контакт с поверхностью кожи, а не 10 для непосредственного проникновения в ткани. При надлежащем контакте острота электродов может позволить массиву устройства нарушить барьер рогового слоя, обеспечивая последовательное изменение импеданса в результате повторяемых процедур электропорации. Прототип устройства был построен с присоединением шнура для связи с генератором импульсов (Фигура 4Ь).
Изучались нижние пределы параметров напряжения, необходимые для успешной трансфекций и иммунного ответа с помощью этого нового устройства с минимально инвазивными иглами электрода (MIED). В отдельные участки кожи на боку морской свинки было введено 50 мкл 1 мг/мл плазмиды GFP с использованием техники Манту и
20 сразу использовано импульсное MIED с установкой на более низком напряжении 15 В (Фигура 5а). Надежная и воспроизводимая GFP-трансфекция была видна через 8 часов после лечения с максимумом через 3 дня. Минимальная GFP-трансфекция или ее отсутствие обнаруживалась после самостоятельной инъекции GFP-плазмиды (данные не представлены). В то время как целый ряд электрических параметров и напряжений в
25 результате трансфекций GFP, импульсы величиной 15 вольт, более воспроизводимы (данные не представлены). Воспроизводимость была количественной и оценивалась положительным числом пикселей после флуоресцентной микроскопии в стандартных условиях. Наиболее последовательное количество пикселей в пределах определенной области было получено при параметрах 10-15 вольт. Фактические модели трансфекций
30 GFP проявили различные "острова" вокруг точки контакта между электродами (Фигура 5Ь). Эффективная ЕР небольшая и сильно локализована около электрода при низком напряжении, таким образом, нет никакой серьезной трансфекций ниже базальных слоев эпидермиса.
Для того, чтобы показать, что надежная трансфекция не является специфическим явлением для морских свинок, GFP-локализация была проведена на ряде видов. В участки кожи мышей, кроликов, крыс и свиней вводили 50 мкл (30 мкл для мышей) 1 мг/мл плазмиды GFP и сразу использовали импульсный MIED. Все виды продемонстрировали 5 надежную кожную трансфекцию GFP после электропорации по сравнению с
минимальным или вообще необнаруженным уровнем после трансфекций плазмиды GFP при самостоятельной инъекции (Фигура 6). Для всех видов сильная положительность GFP была обнаружена во всех образцах кожи после электропорации. Однако, только образцы кролика показали картину своеобразного "острова", наблюдаемую в образцах морских
10 свинок (Фигура 5). GFP-локализация на коже крыс, мышей и свиней оказалась более
размытой. Фактически трансфицированная область была одинаковой у крыс, кроликов и свиней (около 4 мм2), так как это была функция от размера пузыря инъекции. Трансфицированная область на коже мышей была немного меньше из-за меньшего объема впрыска. На панели мышей показана вся кожа мышей, так, что относительный размер
15 может быть оценен. GFP-положительные клетки были обнаружены только на поверхности образцов кожи крыс, кроликов и свиней. Отсутствие сигнала GFP наблюдали на нижней стороне этих образцов. Нижняя часть кожи мыши имела, кажется, позитивный сигнал GFP. Однако, как представляется, это связано с тонкостью кожи образца.
Эти данные свидетельствуют, что MIED может эффективно передавать плазмиды в
20 кожу больших и малых моделей животных.
Пример 2
Электропорация с использованием минимально инвазивного устройства. Гистологический анализ показывает трансфекцию в верхние слои эпидермиса
Для рассмотрения эффекта электропорации с MIED на клеточном уровне было проведено гистологическое исследование. В участки кожи морских свинок вводили 50 мкл 1 мг/мл плазмиды GFP и сразу использовали импульсный MIED. Образцы биопсии были забраны через 3 дня после лечения, обработаны, зафиксированы, секционно 30 парафинированы и Н &Е окрашены (Слайд не показан). Патологический анализ не выявил связанных повреждений тканей после электропорации с минимально инвазивным устройством. Мощная микроскопия показала, что большинство трансфекций GFP произошло в зернистый слой эпидермиса (Слайд не показан). GFP-положительные клетки были также обнаружены в базальном слое. С другой стороны, лишь немногие GFP
положительные клетки были обнаружены в биопсии, которая получила самостоятельные инъекци GFP-плазмиды. Это было прямо противоположно надежному сигналу, наблюдаемому в образце биопсии ткани, которая получила электропорацию. Визуальная оценка повышения экспрессии будет превышать в 100-1000 раз, в зависимости от 5 количества GFP-положительных клеток по отношению к ДНК в одиночку.
Пример 3
Электропорация с использованием минимально инвазивного устройства приводит к надежной клеточной реакции и обеспечивает 100% защиту против летальной 10 стимуляции у мышей
Мыши были иммунизированы ДНК, кодирующей антигены гриппа NP и М2: Prime 30+30 мкг неделя 0, Boost 30+30 мкг неделя 3, Boost 100+100 мкг неделя 10. Соответствующий NP-антиген от штамма Puerto Rico/39 и соответствующий М2-антиген от штамма New Caledonia/99 были оптимизированы, синтезированы и потом клонированы в основу клинически утвержденного для млекопитающих вектора экспрессии, рМВ76.5. NP- и М2е-антигены были выбраны для оценки преимущественно клеточного иммунитета. Эти белки не способны индуцировать нейтрализующие антитела.
Группы мышей были подвергнуты электропорации или с минимально инвазивным кожным устройством, или с Elgen 1000 внутримышечным устройством (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA). Индукцию потенциального клеточного и гуморального ответа на мышиной модели измеряли по ELISpot тестам антигенспецифических Т-клеток, и титры антител были обнаружены у всех мышей. Антигенспецифические CTL-ответы были 200 +/- 57,9 SFU/10A6 спленоцитов против NP для MIED и 85 +/- 36,3 SFU/10A6 спленоцитов против NP для IM (Фигура 7А). Эти животные, электропорированные внутрикожно, показали более высокие титры антител и клеточных реакций, хотя эти данные не являются статистически значимыми.
В попытке определить, является ли индуцированный иммунный ответ способным к 30 воздействию на инфекцию, мышей заражали летальной дозой вируса гриппа
A/H5N1/Vietnam/1203/04 через интраназальную (i.n.) прививку (Фигура 7В). VN/1203/04 (H5N1) штамм гриппа, как известно, вызывает быструю заболеваемость и смертность. В то время как 100% необработанных мышей стали жертвой заражения на 11-й день, 100% мышей, иммунизированных MIED, были защищены от заболеваемости и смертности через
15 дней (конец эксперимента). Кроме того, на 15-й день 90% IM положительно иммунизированных контрольных животных выжили.
Пример 4
5 Электропорация с использованием минимально инвазивного устройства приводит к гуморальной иммуногенности и защитным HI-титрам
Морские свинки
Трудно использовать в качестве цели дерму у мышей в связи с чрезвычайно тонкой 10 структурой кожи и непосредственной близостью от основных мышц. По этой причине часто индуцированный иммунный ответ у мышей представляет собой сочетание кожи и мышц. Таким образом, MIED было протестировано на более крупной животной модели -морских свинках, у которых более четко определяется структура кожи.
Морские свинки были иммунизированы описанной ранее консенсус-вакциной 15 Syncon(tm) внутрикожно с помощью электропорации MIED. Животные были привиты вакциной коктейля плазмид (100 мкг/плазмиды), содержащей pGX2005 (вакцина конструкции SYNCON(tm), которая кодирует консенсус-последовательность HI НА) и pGX2009 (вакцина конструкции SYNCON(tm), которая кодирует консенсус-последовательность свиного HI НА), в объеме 50 мкл, разведенных в lxPBS. Через две 20 недели после двух прививок каждое животное выработало надежные HAI-титры около
1:40 против H1N1 пандемического штамма Mexico/2009, а также штамма A/H3N2 Brisbane, и частично - против штамма A/H5N1 Vietnam/2005 (Фигура 8).
25 Макаки
Макаки были привиты ранее описанной консенсус-вакциной против гриппа из коктейля плазмид (100 мкг/плазмиды), содержащей pGX2005 (вакцина конструкции SYNCON(tm), которая кодирует консенсус-последовательность HI НА) и pGX2009 (вакцина конструкции SYNCON(tm), которая кодирует консенсус-последовательность свиного 30 HI НА), в объеме 50 мкл либо внутрикожной (MIED), либо внутримышечной
электропорацией (Elgen 1000). После двух прививок у четырех из четырех животных развивались HAI-титры около 1:40 против штамма H1N1/Mexico/2009 и против штамма А/HINI/ New Caledonia, когда иммунизацию проводили внутрикожно с MIED (Фигура 9).
Пример 5
Исследование переносимости с минимально инвазивным устройством
Для оценки уровня боли ЕР с минимально инвазивным ЕР устройство применяется 5 для эпидермальных слоев между роговым слоем и базальным слоем. Визуальный ответ тестирования с животными, подвергнутыми анестезии, не производит мышечные подергивания, видимые при более высокой мощности импульсов или при использовании массивов инвазивных электродов, демонстрируя при этом эффективную трансфекцию корреспондентных генов и иммунный ответ с антигенными плазмидами. Импульсное 10 напряжение до 15 В и ток до примерно 30 мА производит только мягкие ощущения, но вызывает защитные иммунные реакции против гриппа у морских свинок и резус макак.
In vivo ЕР применялась с использованием устройства с инвазивным кожным массивом и показала выраженное снижение боли по сравнению с внутримышечным устройством с инвазивным массивом. Ожидается, что результаты MIED покажут еще 15 большее уменьшение боли.
In vivo ЕР применялась с использованием массива MIED после ID-инъекции 0,9% физиологического раствора в зернистый слой. Больным вводили 0,15 мл физиологического раствора в зернистый слой, а затем ЕР осуществлялась с помощью CELLECTRA(r) 2000 (Адаптивное Устройство Постоянного Тока или, альтернативно, 20 устройство Elgen 1000, Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA). ЕР-параметры: 15 В, импульс 100 мс и 3 импульса в целом.
Для каждого субъекта боль в месте инъекции будет оцениваться с использованием Визуальной Аналоговой Оценки (VAS), которая определяется сразу после ЕР.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
5 1. Устройство электропорации, способное доставлять в субъект допустимый
электрический потенциал в слои эпидермальной ткани между роговым и базальным слоями, что приводит к электропорации клеток в указанной ткани, включающее: генератор напряжения; и
массив, имеющий множество электродов в электрической связи с генератором 10 напряжения;
в котором каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм;
генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 вольта до примерно 50 вольт в эпидермальной ткани, а 15 электроды имеют кончик на дистальном конце, который тупой с острием,
что позволяет проникать в слои эпидермальной ткани между роговым и базальным слоями, и обеспечивает электрический потенциал от генератора напряжения к эпидермальной ткани.
20 2. Устройство электропорации, способное доставлять в субъект допустимый
электрический потенциал в эпидермальную ткань, что приводит к электропорации клеток в указанной эпидермальной ткани, включающее: генератор напряжения; и
массив, имеющий множество электродов в электрической связи с генератором 25 напряжения;
в котором каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм;
генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое напряжение от около 0,1 вольта до примерно 50 вольт в эпидермальной 30 ткани;и
электроды приспособлены для проникновения в эпидермальную ткань на глубину 0,1 мм или менее.
3. Устройство электропорации, способное доставлять в субъект допустимый
электрический потенциал в эпидермальную ткань, что приводит к электропорации клеток в указанной эпидермальной ткани, включающее: генератор напряжения; и
массив, имеющий множество электродов в электрической связи с генератором 5 напряжения;
в котором каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм;
генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое
напряжение от около 0,1 до примерно 50 вольт; и 10 в котором электроды доставляют допустимый электрический потенциал в клетки
эпидермальной ткани дают уровень боли, который расположен вблизи точки безболезненности,практически безболезненно , что было измерено по визуальной аналоговой шкале.
15 4. Устройство электропорации, способное доставлять в субъект допустимый
электрический потенциал в эпидермальную ткань, что приводит к электропорации клеток в указанной эпидермальной ткани, включающее: генератор напряжения; и
массив, имеющий множество электродов в электрической связи с генератором 20 напряжения;
в котором каждый из множества электродов разнесен от соседних электродов на расстояние от около 0,5 мм до примерно 2,5 мм;
генератор напряжения обеспечивает с помощью электродов электрическое
напряжение от около 0,1 до примерно 50 вольт; и 25 в котором электроды доставляют допустимый электрический потенциал в клетки
эпидермальной ткани, что выступает в качестве доказательства минимального повреждения ткани в указанных клетках.
30 5. Устройство по любому из пп. 1, 3 и 4, отличающееся тем. что электроды адаптированы для проникновения в эпидермальную ткань на глубину 0,1 мм или менее.
6. Устройство по любому из пп. 1-4, отличающееся тем. что электроды адаптированы для проникновения в эпидермальную ткань на глубину приблизительно от 0,01 мм до около
0,04 мм.
7. Устройство по любому из пп. 1, 2 и 4, отличающееся тем. что допустимый электрический потенциал создает боль, по оценке указанного субъекта, которая находится
5 рядом с точкой безболезненности, измеряемой по визуальной аналоговой шкале.
8. Устройство по любому из пп. 1-3, отличающееся тем. что допустимый электрический потенциал является электрическим потенциалом, который приводит к минимальному повреждению ткани в указанных клетках субъекта.
9. Устройство по любому из пп. 1-8, отличающееся тем. что электроды разнесены на расстоянии около 1,5 мм от соседних электродов.
10. Устройство по любому из пп. 1-9, отличающееся тем. что генератор напряжения 15 поставляет в эпидермальную ткань электрический потенциал от около 1 вольта до
примерно 15 вольт.
11. Устройство по любому из пп. 1-10, отличающееся тем. что генератор напряжения поставляет в эпидермальную ткань электрический потенциал при токе в диапазоне от 1
20 мА до примерно 50 мА.
12. Устройство по любому из пп. 1-10, отличающееся тем. что генератор напряжения поставляет в эпидермальную ткань электрический потенциал на период в пределах от примерно 5 мс до около 250 мс.
13. Допустимый способ доставки биомолекул в клетки эпидермальной ткани субъекта путем электропорации с помощью устройства электропорации по п.1, включающий в себя:
введение биомолекулы в клетки;
контакт электродов с эпидермальной тканью, так, чтобы электроды проникли 30 через роговой слой и находились в слоях выше базальных слоев; и
доставку допустимого электрического потенциала от генератора напряжения к клеткам эпидермального слоя с помощью электродов.
14. Способ по п. 13, отличающееся тем. что этап контакта включает в себя
манипулирование электродами для проникновения в эпидермальную ткань на глубину 0,1 мм или менее.
15. Способ по п.13, отличающееся тем. что этап контакта включает в себя
5 манипулирование электродами для проникновения в эпидермальную ткань на глубину приблизительно от 0,01 мм до около 0,04 мм.
16. Способ по любому из пп. 13-15, отличающееся тем. что этап доставки включает доставку допустимого электрического потенциала, который создает боль, по оценке
10 указанного субъекта, которая находится рядом с точкой безболезненности, измеряемой по визуальной аналоговой шкале.
17. Способ по любому из пп. 13-15, отличающееся тем. что этап доставки включает доставку допустимого электрического потенциала, который приводит к минимальному
15 повреждению ткани указанных клеток субъекта.
18. Способ по любому из пп. 13-17, отличающееся тем. что этап доставки включает доставку электрического потенциала от около 0,1 вольта до примерно 15 вольт к клеткам.
20 19. Способ по любому из пп. 13-18, отличающееся тем. что этап доставки включает
доставку электрического потенциала в текущем диапазоне от примерно 1 мА до около 50 мА в клетки.
20. Способ по любому из пп. 13-19, отличающееся тем. что этап доставки включает 25 доставку электрического потенциала на период в пределах от около 5 мс до примерно 250 мс.
WO 2011/109406
1/10
PCT/US2011/026701
Фигура 1. Сборка минимально инвазивного устройства ЕР
WO 2011/109406 PCT7US2011/026701
2/10
Фигура 2. Компоненты MIED. "а" показывает одноразовый стерильный корпус массива, "Ь" показывает прочный корпус и "с показывает корпусный электрод с одноразовым массивом (2а)
WO 2011/109406
3/10
PCT7US2011/026701
Фигура 3. Батарея питания минимально инвазивного устройства ЕР со съемным массивом (для стерилизации).
"а" показывает внешний вид. "Ь" показывает внутренний вид (включая батареи)
WO 2011/109406
4/10
PCTYUS2011/026701
Фигура 4. Минимально инвазивное устройство электропорации.
(A) CAD фигура прототипа минимально инвазивного устройства, состоящего из троакара с золотым покрытием игольчатых электродов на 1,5 мм расстоянии в 4 х 4 схеме массива. (В) Массив крепится к ручке устройства и подключается непосредственно к генератору импульсов, в данном случае, Elgen 1000. ЕР может быть вызвана либо посредством активации ножной педалью или триггерной кнопкой на экране. (С) Построенный работающий прототип.
WO 2011/109406
5/10
PCT7US2011/026701
Фигура 5. Результаты электропорации с помощью минимально инвазивного устройства в трудоемкой трансфекций гена-репортера.
Экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) после ID введения плазмиды с последующей электропорациеи (ЕР) с помощью минимально инвазивного устройства в кожу морской свинки. (А) Плазмиды были доставлены в несколько участков (14) и модель сравнивали с размером массива. (В) Увеличенный пример одного участка лечения показывает, что трансфекция происходит в точке контакта с электродами.
WO 2011/109406
6/10
PCT/US2011/026701
Кролики
No ЕР ЕР
Поверхность кожи
Поверхнос ть кожи
Крыса
No ЕР
Свинья
No ЕР ЕР
Фигура 6. Результаты минимально инвазивной электропорации в позитивных транзакциях в спектре видов.
Экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) после ID введения плазмиды с или без последующей электропорацией (ЕР^ с помощью минимально инвазивного устройства в кожу кроликов, мышей и свиней. Панели показывают ткань кожи после сакрификации животных через 3 дня после обработки. Панели показывают либо кожу, в которую вводилась GFP плазмида одиночно или сразу после введения применялась ЕР. Только верхняя часть (поверхность кожи) показала результат. Нижняя часть (подслойные мышцы) кожи не показала положительной трансфекций.
WO 2011/109406
7/10
PCT/US2011/026701
lOOOOOl
Результаты гуморальной и клеточной иммуногенности в защите от гриппа, стимулированного у мышей. Электропорация с минимально инвазивным устройством приводит к надежному гуморальному (антитела) и клеточному ответу, который дает защиту мышам после стимулирования летального гриппа. (7А) Мышей иммунизировали плазмидой (3 мкг)3 экспрессирующей антигенный белок NP против гриппа через или интрадермальныи путь (минимально инвазивное устройство), или интрамускулярный (Elgen Twin injector). Титры антител и антиген специфических Т-клеток с помощью ELlSpot анализа были измерены.
WO 2011/109406
8/10
PCT/US2011/026701
100-
80-
* 60-
О. CZ 40-
гоpM2+pNP ID
pM2+pNP IM
|He подвергнутый
какому-либо
воздействию
т-I-I-I-I-I-I-I-I-I-f-I-|-|-| 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12131415
Дни
Фигура 7В.
Результаты гуморальной и клеточной иммуногенности в защите от гриппа, стимулированного у мышей. Электропорация с минимально инвазивным устройством приводит к надежному гуморальному (антитела) и клеточному ответу который дает защиту мышам после стимулирования летального гриппа. (7В) Иммунизированные животные были защищены от заболеваемости и смертности когда стимулировались штаммом гриппа VN/1203/04 (H5N1).
WO 2011/109406
9/10
PCT/US2011/026701
1S0CH A/H1H1 /Mexico/2009
_ 1QOO-)
o. i-
500
4CKK
300-
s 200-
O M X ffl J3 о
с; о. аз *
а.*
100-
Титр HI
A/H1N1/New
Caledonia
•ж*
ш ш ш чт
Титр HI
зсхкь
2500-
2000-
1500-
S 1_
1000-
600-
А/ИЗН2 Brisbane
зоось
2500-
2000-
О. Ь
1500-
1000-
500-
"Щт mi iw т рп ,г -
о л
X CD
м о с; а. со *
ГО х
С о
|!Е
I.*
к О
Титр HI
A/H5N1 VfetnanV2005
Титр HI
с о
Фигура 8. Результаты гуморальной иммуногенности защитных HAI титров v морских свинок.
HAI титры отдельных макак через 2 недели после третьей иммунизации против гриппа H1N1 штаммов (Mexico/2009 and New Caledonia), H3N2 [Brisbane) и H5N1 (Vietnam/2005). Животные были привиты ранее описанной SynCon плазмидной вакциной против гриппа через или интрадермальный путь (минимально инвазивное устройство), или интрамускулярный путь (Elgen Twininjector)
WO 2011/109406
10/10
PCT/US2011/026701
о. is
40Ch
300-
200
100-
A/H1H1/Mexico/2009
о л X ш А О К О.
Ч. о
|х а*
си о 41 со л а. с;
I- со 5
S х
го ?-о о;
700-j A/H1N1/N < &w Caledonia
300-
200-
ТитрН! 100-
o -о x m А О С a.
со i
9-о
Q-Ш О
со -о о. с; I- со
СО g-
Титр HI
Фигура 9. Результаты гуморальной иммуногвпности защитных HAI титров v нечеловеческих приматов.
HAI титры отдельных макак через 2 недели после второй иммунизации против двух штаммов H1N1 (Mexico/2009 и New Caledonia). Животные были привиты ранее описанной SynCon плазмидной вакциной против гриппа через или интрадермальный путь (минимально инвазивное устройство) или интрамускулярный путь (Elgen Twininjector).